JP2002524103A - 胃ポリペプチドｚｓｉｇ２８ - Google Patents

胃ポリペプチドｚｓｉｇ２８

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JP2002524103A JP2000570197A JP2000570197A JP2002524103A JP 2002524103 A JP2002524103 A JP 2002524103A JP 2000570197 A JP2000570197 A JP 2000570197A JP 2000570197 A JP2000570197 A JP 2000570197A JP 2002524103 A JP2002524103 A JP 2002524103A
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zsig28
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seq
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オー． シェパード，ポール
ピー． フォレー，ケビン
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ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＲＰＶファミリー蛋白質の新規メンバーであるｚｓｉｇ２８に関するポリヌクレオチド及びポリペプチド分子に関する。ｚｓｉｇ２８をコードするポリヌクレオチドは、ヒト疾患状態に関連するゲノム領域の特定に利用できる。本発明は更に、この蛋白質を産生する方法、その利用、及びそれに対する抗体を含む。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 発明の背景 細胞増殖対最終分化及びアポトーシスによるプログラム死という相対するプロ
セスの適切なコントロールは、正常発生及び恒常性の重要な観点であり（Raff,
M.C., Cell 86:173-175, 1996）、また多くのヒトの病気で変化が認められてい
る。例えばSawyers, C.L.ら、Cell 64:337-350, 1991; Meyaard, L.ら、Science
257:217-219, 1992; Guo, Q. ら、Nature Med. 4:957-962, 1998; Barinaga, M
., Science, 273:735-737, 1996; Solary, E.ら、Eur. Respir. J., 9: 1293-13
05, 1996; Hamet, P.ら、J.Hypertension, I4:S65-S70, 1996; Roy, N.ら、Cell
, 80:167-178, 1995; 及びAmbrosini、G., Nature Med., 8:917-921, 1997を参
照せよ。
【０００２】 このバランスに制御の理解は大きく進んだ。例えば、成長因子、ペプチドホル
モン及び細胞−細胞相互作用の様な細胞外刺激による前駆細胞の特定の細胞系列
への拘束、およびそれに続くそれら細胞の増殖拡大を制御するシグナル伝達カス
ケードが解明されている（Morrison、S.J.ら、Cell 88:287-298, 1997)。更に細
胞周期からでることと最終分化は大部分の種類の細胞では対になっている。例え
ばCoppola, J.A,ら、Nature 320:760-763, 1996; Freytag, S.O, Mol. Cell. Bi
ol. 8:1614-1624, 1988; Lee, E. Yら、Genes Dev. 8:2008-2021, 1994; Morgen
besser, S.D.ら、Nature 371:72-74, 1994; Fasaccia-Bonnefil, Pら、Genes De
v. 11:2335-2346, 1996; Zacksenhaus, E.ら、Genes Dev. 10:3051-3064, 1996;
及びZhang, P.ら、Nature 387:151-158, 1997を参照せよ。
【０００３】 アポトーシスもまた多くの発生及び恒常性のプロセスに重要な役割を果たして
おり（Raff.M.C. Nature 356:397-400, 1992; Raff, M.C., 上記）、しばしば最
終分化により協調的に制御されている（Jacobsen, K.A.ら、Blood 84:2784-2794
; Morgenbesserら、上記；Yan, Y.ら、Genes Dev. 11:973-983, 1997; Zacksenh
ausら、上記）。従って、個々の系列、組織、器官の発生、又は時に完全な多細
胞生物体の発生さえ、増殖の結果による細胞産生の増加と最終分化及びアポトー
シスの結果である細胞数の減少との間の微妙に調製されたバランスの結果である
。このバランスは主に複数の制御経路の収斂により協調的に制御されていると思
われる。 これらネットワークの新規メンバーを特定することは、正常な細胞プロセスな
らびにヒト疾患状態の病因及び治療に関す重要な洞察を提供できる。
【０００４】 即ち、引き続き増殖、分化及びアポトーシスの経路を制御する新規蛋白質を発
見する必要がある。これら経路の誘導体、又は阻害体のインビボ活性は、新規増
殖、分化及びアポトーシス蛋白質、ならびにそれらのアゴニストとアンタゴニス
トの持つ数多い臨床上の可能性、及びそれらに対する需要を描写している。本発
明は、ここでの教示より当業熟練者に明らかである上記及びその他の利用に適し
たポリペプチドを提供することで、その需要に応えるものである。
【０００５】 発明の要約 ある観点では、本発明は以下より成るグループから選択されるアミノ酸配列に
対し少なくとも９０％同一であるアミノ酸残基の配列を含むポリペプチドをコー
ドする分離されたポリヌクレオチドを提供する；（ａ）配列番号２に示すアミノ
酸番号24（Ala）ないしアミノ酸番号261のアミノ酸配列；及び（ｂ）配列番号２
に示すアミノ酸番号１（Met）ないしアミノ酸番号261（Val）のアミノ酸配列で
あり、前記アミノ酸％同一性はktup=1、ギャップオープニングペナルティー（ga
p opening penalty）=10, ギャップエクステンションペナルティー（gap exten
sion penalty）=1 、置換マトリックス＝BLOSUM62であり、その他のパラメータ
ーはデフォルトにセットされたFASTAプログラムを用い、決定される。
【０００６】 実施態様の１つでは、上記の分離ポリヌクレオチドは以下より成るグループか
ら選択される：（ａ）配列番号１に示すヌクレオチド139ないし853のポリヌクレ
オチド配列；及び（ｂ）配列番号１に示すヌクレオチド70ないしヌクレオチド85
3のポリヌクレオチド配列。別の実施態様では、上記の分離ポリヌクレオチドは
配列番号10のヌクレオチド１ないしヌクレオチド783のヌクレオチドを含む。別
の実施態様では、上記の分離ポリヌクレオチドは以下より成るグループから選択
されるアミノ酸残基の配列を含む：（ａ）アミノ酸番号24（Ala）ないしアミノ
酸番号261(Val)の配列番号２に示すアミノ酸配列；及び（ｂ）アミノ酸番号１（
Met）ないしアミノ酸番号261（Val）の配列番号２に示すアミノ酸配列。
【０００７】 第２の観点では、本発明は以下の作用可能に連結されたエレメントを含む発現
ベクターを提供する；配列番号２に示すアミノ酸番号24（Ala）ないしアミノ酸
番号261のzsig28ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片；及びプロモーターが作
用可能にＤＮＡ断片に連結され、そのＤＮＡ断片が作用可能に転写ターミネータ
ーに連結されている転写ターミネータ。ある実施態様では、上記の発現ベクター
は更にＤＮＡ断片と作用可能に連結された分泌シグナル配列を含む。 第３の観点では、本発明は上記の発現ベクターを含む培養細胞にあって、その
細胞がＤＮＡ断片によりコードされているポリペプチドを発現する培養細胞を提
供する。
【０００８】 別の観点では本発明は以下を含む、融合蛋白質をコードするＤＮＡ構築体を提
供する：以下より成るグループより選択されるポリペプチドをコードする第１Ｄ
ＮＡ断片： （ａ）アミノ酸番号１（Met）ないしアミノ酸番号23（Ala）の配列番号２のア
ミノ酸配列； （ｂ）アミノ酸番号24（Ala）ないしアミノ酸番号82（Leu）の配列番号２のア
ミノ酸配列； （ｃ）アミノ酸番号101（Leu）ないしアミノ酸番号122（Gly）の配列番号２の
アミノ酸配列； （ｄ）アミノ酸番号141（Asn）ないしアミノ酸番号174（Ala）の配列番号２の
アミノ酸配列； （ｅ）アミノ酸番号193（Cys）ないしアミノ酸番号261（Val）の配列番号２の
アミノ酸配列；及び （ｆ）アミノ酸番号24（Ala）ないしアミノ酸番号261（Val）の配列番号２の
アミノ酸配列；並びに 第１ＤＮＡ断片とその他のＤＮＡ断片がフレーム内に接続されており、且つそ
の第１及びその他ＤＮＡ断片が融合蛋白質をコードしている、追加のポリペプチ
ドをコードしている、少なくとも１つのその他ＤＮＡ断片。
【０００９】 別の観点では、本発明は以下の作用可能に連結されたエレメントを含む発現ベ
クターを提供する：転写プロモーター；上記融合蛋白質をコードするＤＮＡ構築
体；及びプロモーターが作用可能にＤＮＡ構築体に連結され、そのＤＮＡ構築体
が作用可能に転写ターミネーターに連結されている融合蛋白質をコードするＤＮ
Ａ構築体。
【００１０】 別の観点では、本発明は細胞がＤＮＡ構築体によりコードされるポリペプチド
を発現する、上記発現ベクターを含む培養細胞を提供する。 別の観点では、本発明は以下を含む融合蛋白質を産生する方法を提供する：上
記細胞を培養すること；及び細胞により産生されたポリペプチドを分離すること
。
【００１１】 別の観点では、本発明は以下より成るグループから選択されたアミノ酸配列に
少なくとも90％同一であるアミノ酸配列を含む分離ポリペプチドを提供する：（
ａ）配列番号２に示すアミノ酸番号24（Ala）ないしアミノ酸番号261のアミノ酸
配列；及び（ｂ）配列番号２に示すアミノ酸番号１（Met）ないしアミノ酸番号2
61（Val）のアミノ酸配列であり、前記アミノ酸％同一性はktup=1、ギャップオ
ープニングペナルティー（gap opening penalty）=10, ギャップエクステンシ
ョンペナルティー（gap extension penalty）=1 、置換マトリックス＝BLOSUM62
であり、その他のパラメーターはデフォルトにセットされたFASTAプログラムを
用いて決定される。
【００１２】 実施態様の１つでは、上記分離ポリペプチドは更に以下より成るグループから
選択される配置で、Ｎ末端からＣ末端にかけて分散するモチーフ１から４を含む
：（ａ）Met-[47-50]-M1-[21-22]-M2-[73-92]-M3；及び（ｂ）Met-[47-50]-M1-[
21-22]-M2-[73-92]-M3-[3]-M4、前記M1は配列番号２のアミノ酸48ないし54に示
されるアミノ酸配列である”モチーフ１”であり、M2は配列番号２のアミノ酸72
ないし82に示されるアミノ酸配列である”モチーフ２”であり、M3は配列番号２
のアミノ酸174ないし180に示されるアミノ酸配列である”モチーフ３”であり、
M4は配列番号２のアミノ酸184ないし189に示されるアミノ酸配列である”モチー
フ４”であり、（#)はモチーフ間のアミノ酸の数を示す。
【００１３】 別の実施態様では、上記の分離ポリペプチドは以下より成るグループから選択
されたアミノ酸残基の配列を含む：（ａ）アミノ酸番号24（Ala）ないしアミノ
酸番号261（Val）の配列番号２に示すアミノ酸配列；及び（ｂ）アミノ酸番号１
（Met）ないしアミノ酸番号261（Val）の配列番号２に示すアミノ酸配列。
【００１４】 別の観点では、本発明は以下を含むzsig28ポリペプチドを産生する方法を提供
する；上記細胞を培養すること；及び細胞により産生されたzsig28ポリペプチド
を分離すること。 別の観点では、本発明は以下を含むzsig28ポリペプチドに対する抗体産生方法
において、 （ａ）アミノ酸番号24（Ala）ないしアミノ酸番号261（Val）の配列番号２の
連続アミノ酸配列に同一なポリペプチド； （ｂ）アミノ酸番号24（Ala）ないしアミノ酸番号82（Leu）の配列番号２のア
ミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｃ）アミノ酸番号101（Leu）ないしアミノ酸番号122（Gly）の配列番号２の
アミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｄ）アミノ酸番号141（Asn）ないしアミノ酸番号174（Ala）の配列番号２の
アミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｅ）アミノ酸番号193（Cys）ないしアミノ酸番号261（Val）の配列番号２の
アミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｆ）上記ポリペプチド： （ｇ）アミノ酸番号245（Ala）ないしアミノ酸番号250（Glu）の配列番号２の
アミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｈ）アミノ酸番号234（Asn）ないしアミノ酸番号239（Lys）の配列番号２の
アミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｉ）アミノ酸番号202（Glu）ないしアミノ酸番号207（Lys）の配列番号２の
アミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｊ）アミノ酸番号254（Lys）ないしアミノ酸番号259（Asp）の配列番号２の
アミノ酸配列より成るポリペプチド；及び （ｋ）アミノ酸番号110（Glu）ないしアミノ酸番号115（Ala）の配列番号２の
アミノ酸配列より成るポリペプチド； より成るグループから選択されたポリペプチドを接種し、そして動物体内に抗体
を産生する免疫反応を惹起せしめ； そして動物から抗体を分離する； ことを含んで成る方法を提供する。
【００１５】 別の観点では、本発明はxsig28ポリペプチドに結合する、上記方法により産生
される抗体を提供する。実施態様の１つでは、上記抗体はモノクローナル抗体で
ある。 別の観点では、本発明は上記ポリペプチドに特異的に結合する抗体を提供する
。 別の観点では、本発明は、試験サンプルが存在する状態、又は存在しない状
態でＤＮＡ断片によりコードされたzsig28蛋白質を発現する、上記発現ベクター
が導入された細胞を培養し； 及び生物学的又は生化学的アッセイにより試験サンプルが存在する場合と存在
しない場合のzsig28の活性レベルを比較し；そして その比較より、サンプル中のzsig28活性変調体の存在を決定する； ことを含んでなる試験サンプル中のzsig28蛋白質活性の変調体の存在を検出する
方法を提供する。 発明のこれら、及び別の観点は以下の発明の詳細な説明及び添付図面を参照す
ることで明らかになるだろう。
【００１６】 発明の詳細な説明 発明を詳細に記載する前に、以下用語を定義することはその理解に役立つだろ
う： “親和性タグ”という用語は、ここでは第２ポリペプチドの精製又は検出に供
される第２ポリペプチドに結合できるポリペプチド断片、又は基質への第２ポリ
ペプチドの結合に関する部位を提供するポリペプチド断片を意味するために用い
られる。具体的には抗体、又はその他特異的結合作用物質が利用できるペプチド
又はポリペプチドは親和性タグとして利用できる。
【００１７】 親和性タグには、ポリ−ヒスチジントラクト、プロテインＡ（Nilssonら、 EM
BO J. 4: 1075, 1985; Nilssonら、 Methods Enzymol. 198: 3, 1991）、グルタ
チオンＳトランスフェラーゼ（SmithとJohnson, Gene 67:31, 1988）、Glu-Glu
親和性タグ（Grussenmeyerら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952-4, 1985）
、サブスタンスＰ、FlagTMペプチド（Hoppら、Biotechnology 6; 1204-10, 1988
）、ストレプトアビジン結合ペプチド、又はその他抗原性エピトープ又は結合ド
メインを含む。一般には、Fordら、Protein Epression and Purification 2: 95
-107, 1991を見よ。親和性タグをコードするＤＮＡは市販品が利用できる（例え
ばファルマシアバイオテック社（Pharmacia Biotech）、Piscataway、NJ）。
【００１８】 “対立遺伝子変異体”はここでは同一染色体座を占有する遺伝子の２つ又はそ
れ以上の別の型を意味するのに用いられる。対立遺伝子変異体は自然では突然変
異によって生じ、集団内に表現形多形をもたらすこともある。遺伝子突然変異は
サイレントでも（コードされるポリペプチドに変化は無い）良く、また別のアミ
ノ酸配列を持つポリペプチドをコードすることもあるだろう。対立遺伝子変異体
という用語は、ここでは遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされる蛋白質を
意味するためにも用いられる。
【００１９】 “アミノ末端”及び”カルボキシル末端”という用語は、ここではポリペプチ
ド内の位置を示すために用いられる。文脈より可能な場合、これら用語は特定の
配列を引用して、近接する位置又は相対位置を示すために用いられる。例えば、
ポリペプチド内の参照配列のカルボキシル末端に位置する特定配列とは、参照配
列のカルボキシル末端に隣接し位置するものであるが、必ずしも完全なポリペプ
チドのカルボキシル末端にある必要はない。
【００２０】 “相補体／抗相補体対”という用語は、適当な条件の下に非共有結合的に結合
した、安定した対を形成する非同一成分を意味する。例えば、ビオチンとアビジ
ン（又はストレプトアビジン）は相補体／抗相補体対の原型メンバーである。そ
の他の相補体／構想補体対の例には、受容体／リガンド対、抗体／抗原（又はハ
プテンあるいはエピトープ）対、センス／アンチセンスポリヌクレオチド対等が
含まれる。相補体／構想補体対が後に分離することが望まれる場合、相補体／構
想補体値は＜１０9Ｍ-1の結合親和性を持つことが好ましい。
【００２１】 “ポリヌクレオチド分子の相補体”という用語は、参照配列に比べ相補的な配
列と逆向きの方向性を持つポリヌクレオチド分子を意味する。例えば、配列5'AT
GCACGGG3'は5'CCCGTGCAT3'に相補的である。 “コンティグ”という用語は、他のポリヌクレオチドに対し同一又は相補的で
ある配列の連続する架橋を有するポリヌクレオチドを意味する。コンチグ配列と
は、ポリヌクレオチドのある伸張部分が、あるポリヌクレオチドの伸張部分全体
または一部と”重複”することを意味する。例えば、ポリヌクレオチド配列5'-A
TGGAGCTT-3'に対する代表的コンチグは5'-AGCTTgagt-3'及び3'-tcgacTACC-5'で
ある。
【００２２】 用語“縮重ヌクレオチド配列”は、１又はそれ以上の縮重コドン（ポリペプチ
ドをコードする参照ポリヌクレオチド分子に比べ）を含むヌクレオチドの配列を
意味する。縮重コドンは、ヌクレオチドの別のトリプレットを含むが、同一アミ
ノ酸残基をコードする（即ち、GAUとGACトリプレットは共にAspをコードする）
。 “DNA断片”は、特定の属性を有するより大きなDNA分子を意味する。例えば、
5'から3'方向に読んだ時、特定のポリペプチドのアミノ酸配列をコードする特定
ポリペプチドをコードするDNA断片はプラスミド又はプラスミド断片の様な大き
なDNA分子の一部である。
【００２３】 用語“発現ベクター”は、その転写体を提供する為の追加の断片と作用可能に
連結された所望ポリペプチドをコードする断片を含む、直鎖状又は環状のDNA分
子を意味するのに用いられる。この様な追加断片は、プロモーター及びターミネ
ーター配列を含み、又１またはそれ以上の複製起点、１又はそれ以上の選択可能
マーカー、エンハンサー、ポリアデニレーションシグナル等を含むだろう。発現
ベクターは、一般にプラスミド又はウイルスＤＮＡに由来するか、又はその両方
のエレメントを含むだろう。
【００２４】 用語“分離された”とは、ポリヌクレオチドに用いる場合には、ポリヌクレオ
チドがその天然環境より取り出され、従ってその他外部の、又は不要なコーディ
ング配列は含まず、そして遺伝的に加工された蛋白質産生システム内での利用に
好適な形状にあることを意味する。この様な分離された分子は、それらの天然環
境より分離され、そしてcDNA及びゲノム性クローンを含むものである。本発明の
分離されたDNA分子は、それらが通常結合している他の遺伝子を含まないが、し
かし天然に生ずるプロモーターやターミネーターの様な5'及び3'非翻訳域は含む
だろう。結合領域の特定は当分野熟練者にとって明瞭であろう（例えばDynanとT
ijan、Nature 316:774-78、1985）。
【００２５】 “分離された”ポリペプチド又は蛋白質は、例えば血液及び動物組織から離れ
ている様な、その天然環境以外の状態にて見いだされるポリペプチド又は蛋白質
である。好ましい形態では、分離されたポリペプチドは本質的にその他のポリペ
プチド、特に動物起源のその他ポリペプチドを含まない。高度に精製された形状
のポリペプチド、即ち95％以上、より好ましくは99％以上の純度であるポリペプ
チドを提供することが好ましい。この関連で利用される場合は、用語”分離され
た”は例えばダイマー、又は別の形に糖化もしくは誘導された形状の様な、別の
物理形状の同一ポリペプチドの存在を排除しない。
【００２６】 用語“作用可能に連結された”は、DNA断片を参照する場合には、断片がそれ
らが意図する目的、例えばプロモーター内にて転写が開始し、コーディング断片
を通りターミネーターに至る様な目的に関し機能する様に配置されていることを
意味している。 用語“オルトログ”は、ある種より得たポリペプチド又は蛋白質であり、それ
らが異なる種に由来するポリペプチド又は蛋白質の機能的な対応体であることを
意味する。オルトログ間の配列の差は、種分化の結果である。 “パラログ”とは、生物体により作られる別種ではあるが構造的に関連した蛋
白質である。パラログは遺伝子複製を介して生まれると考えられている。例えば
α−グロブリン、β−グロブリン及びミオグロビンは相互にパラログである。
【００２７】 “ポリヌクレオチド”は5'から3'末端に読みとられるデオキシリボヌクレオチ
ド又はリボヌクレオチド塩基の単−又は２本鎖ポリマーである。ポリヌクレオチ
ドはRNA及びDNAを含み、そして天然資源より分離されるか、インビトロで合成さ
れるか、又は天然及び合成分子の組合せより調製される。ポリヌクレオチドの大
きさは塩基対（"bp"と略される）、ヌクレオチド（"nt"）又はキロベース（"kb"
）により表される。文脈より可能な場合、後者２用語は単鎖又は２本鎖であるポ
リヌクレオチドを記述する。本用語を２本鎖分子に用いる場合、これは全長を意
味する時に用いられ、用語”塩基対”に等しいことが理解されるだろう。当業者
は、２本鎖ポリヌクレオチドの２本の鎖は長さが僅かに異なること、及び酵素切
断の結果としてその端部がずれることがあることを理解するだろう；即ち２本鎖
ポリヌクレオチド分子内の全ての鎖が対をなすこともあるだろう。
【００２８】 “ポリペプチド”は、天然または合成的に産生されられるかに関わらず、ペプ
チド結合により連結されたアミノ酸残基のポリマーである。約10アミノ酸残基未
満のポリペプチドは通常”ペプチド”と呼ばれる。 用語“プロモーター”は、ここでは当分野にて認識される意味に関し用いられ
、RNAポリメラーゼの結合及び転写の開始に供される遺伝子含有ＤＮＡ配列の一
部を意味する。プロモーター配列は、絶対ではないが通常遺伝子の5'非翻訳域内
に存在する。
【００２９】 “蛋白質”は、１またはそれ以上のポリペプチド鎖を含む高分子である。蛋白
質は、炭水化物の様な非ペプチド成分も含むだろう。炭水化物及びその他非ペプ
チド性基質は、その蛋白質が産生される細胞により蛋白質に付加され、また細胞
の型により変わるだろう。ここでは蛋白質はそれらのアミノ酸主鎖構造により定
義される；炭水化物基の様な基質は一般には明記されていないが、その場合でも
存在することがある。
【００３０】 用語“受容体”は、生物活性分子（即ちリガンド）に結合し、そして細胞にリ
ガンドの作用を伝達する細胞結合蛋白質を意味する。膜結合受容体は、細胞外リ
ガンド結合ドメインと典型的にはシグナル伝達に関係する細胞内エフェクタード
メインを含む多ペプチドドメイン構造により特徴付けられる。受容体へのリガン
ドの結合は、受容体内に立体構造の変化を招き、これがエフェクタードメインと
細胞内の他分子との間に相互作用を誘導する。
【００３１】 次にこの相互作用は細胞の代謝に変化を招く。受容体−リガンド相互作用に連
結した代謝事象には、遺伝子の転写、リン酸化、脱リン酸化、環状AMP産生上昇
、細胞カルシウムの代謝、イノシトール脂質の加水分解及びリン脂質の加水分解
が含まれる。一般に、受容体は膜結合性、細胞質性又は核性；単量体（例えば甲
状腺刺激ホルモン受容体、ベータアドレナリン性受容体）又は多量体（例えばPD
GF受容体、成長ホルモン受容体、IL-3受容体、GM-CSP受容体、G-CSF受容体、エ
リスロポイエチン受容体及びIL-6受容体）である。
【００３２】 用語“分泌性シグナル配列”は、大きなポリペプチドの成分の場合に、それが
合成される細胞内の分泌経路をその大きなポリペプチドが通過する様に向かわせ
るポリペプチド（”分泌ペプチド”）をコードするDNA配列を意味する。大形ポ
リペプチドは通常分泌経路通過中に分断され、分泌ペプチドが除かれる。
【００３３】 用語“スプライス変異体”はここでは遺伝子から転写されるRNAの別形状を意
味するのに用いられる。スプライス変異は天然には、転写されたRNA分子内、又
は一般的ではないが別々に転写されたRNA分子間にある別のスプライシング部位
が利用されることで生じ、その結果同一遺伝子より複数のmRNAが生じるだろう。
スプライス変異体は、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードす
るだろう。スプライス変異体という用語は、ここでは遺伝子より転写されたmRNA
のスプライス変異体によりコードされる蛋白質を意味する場合にも用いられる。
【００３４】 不正確な分析方法（例えばゲル電気泳動法）により決定されたポリマーの分子
量及び長さは、おおよその値と理解されるだろう。この様な値を”約”Ｘ又は”
おおよそ”Ｘと表される場合には、記載された値Ｘは±10％の正確性であると理
解されるだろう。
【００３５】 ここに引用された参考資料は、その全てが参照されて取り込まれている。 本発明はヒトクラウジン（claudin）１及び２（Furuse, M.ら、J. Cell Biol.
141; 1539-1550, 1998) 、ヒト及びラット乏突起神経膠細胞特異蛋白質(OSP)(B
ronstein, J. M.ら、Neurology 47: 772-778, 1996), ラットアンドロゲン離脱
アポトーシス蛋白質RVP.1 (Briehl, M.M., Miesfeld, R.L., Mol. Endocrinol.
5: 138101388, 1991)及びその他の様な蛋白質を含む広範な受容体ファミリーに
対し相同性を持つポリペプチドをコードする新規DNA配列の発見に一部基づいて
いる。本新規DNAに対応するmRNAの組織分布分析は、胃での高発現及び肺での低
発現を示した。ポリペプチドはzsig28と命名された。
【００３６】 本発明の新規zsig28ポリペプチドは、分泌シグナル配列を有する蛋白質に相同
な蛋白質に関するESTデータベースの検索によりまず特定された。これら蛋白質
は、上流にあるメチオニン開始部位、及び約13アミノ酸の疎水性領域、それに続
くペプチドシグナルペプチダーゼ開裂部位によって特徴付けられている。ESTデ
ータベースを、その転写体がこれら検索基準に合致する新規DNA配列について検
索した。
【００３７】 対応するcDNAによりコードされた新規ペプチドはラットRVP.1に相同性を示し
た。この相同性に拠れば、zsig28ヌクレオチド配列は予想蛋白質の全コーディン
グ配列をコードする。Zsig28はアポトーシス細胞経路、細胞−細胞シグナル伝達
分子、成長因子受容体、または成長因子ホルモン活性を持つ細胞外マトリックス
結合蛋白質等に関係する新規蛋白質であり、またクラウジン／OSPファミリー蛋
白質の新規メンバーであろう。
【００３８】 zsig28ポリペプチドの配列は、その対応ポリペプチド配列を含む単一クローン
より得られた。このクローンは肺ライブラリーより得た。この様な配列が検索あ
れるであろう他のライブラリーには胃、胎児肺、上皮組織等が含まれる。 代表的なzsig28をコードするDNAは配列番号１に記載されており、それから演
繹された261アミノ酸配列は配列番号２に記載される。その全体に於いて、zsig2
8ポリペプチド（配列番号２）は完全長ポリペプチド断片（配列番号２の残基１
（Met)から残基261（Val））を表す。zsig28のドメイン及び構造上の特徴を以下
詳細に記す。
【００３９】 配列番号１のDNA配列によりコードされたzsig28ポリプチドの分析は、23アミ
ノ酸残基の推定分泌シグナルペプチド（配列番号２の残基１（Met）ないし残基2
3（Ala））を含む261アミノ酸（配列番号２）をコードするオープンリーディン
グフレーム、及び２３８アミノ酸の成熟ポリペプチド（配列番号の残基24（Ala
）ないし残基261（Val））を表した。zsig28ポリペプチドは以下３種類の膜貫通
ドメインを含む：
【００４０】 （１）第１膜貫通ドメインは、配列番号２のアミノ酸83（Met）ないしアミノ
酸100（Ala）であり； （２）第２膜貫通ドメインは、配列番号２のアミノ酸123（Ile）ないしアミノ
酸140（Ala）であり； そして （３）第３膜貫通ドメインは、配列番号２のアミノ酸175（Leu）ないしアミノ
酸192（Met）である。
【００４１】 これら膜貫通ドメインはzsig28疎水性プロット（図２参照）により確認される
。 これら膜貫通ドメインの間、及び隣接し、リガンドへの結合、細胞−細胞相互
作用、細胞シグナル伝達機能等を付与するであろうzsig28の領域が存在する。更
にこれら領域及びその中の疎水性アミノ酸領域は、ここに論じる様に抗体の産生
に関する好適抗原性エピトープとして機能するだろう。これら領域には以下が含
まれる：
【００４２】 （１）アミノ酸24（Ala）ないしアミノ酸82（Leu)のアミノ末端領域である”
領域１”； （２）アミノ酸101（Leu）ないしアミノ酸122（Gly)の”領域２”； （３）アミノ酸141（Asn）ないしアミノ酸174（Ala)の”領域３”；及び （４）アミノ酸193（Cys）ないしアミノ酸261（Val)のカルボキシ末端領域で
ある”領域４”である。
【００４３】 zsig28内には、ファミリーのメンバー間の比較に基づく保存アミノ酸の複数の
モチーフが存在する（図１参照）。更に、zsig28ポリペプチド内には複数の低変
異性領域も存在する。低変異性領域の決定に関してはSeppard,F.ら、Gene 150:1
63-167、1994を参照せよ。複数の既知ファミリーの複数のアラインメントを検討
（例えば図１を見よ）からは、保存されると同時に低縮重性も有する以下のモチ
ーフが表された。
【００４４】 １）”モチーフ１”（配列番号２のアミノ酸48ないし54に相当する図１内の情
報を包含するコンセンサスモチーフパターン）； ２）”モチーフ２”（配列番号２のアミノ酸77ないし82に相当する図１内の情
報を包含するコンセンサスモチーフパターン）； ３）”モチーフ３”（配列番号２のアミノ酸174ないし180に相当する図１内の
情報を包含するコンセンサスモチーフパターン）； モチーフ１から３は、Ｎ末端からＣ末端に向かい、以下に表す構造中に分離さ
れている： Met-[47-50]-M1-[21-22]-M2-[73-92]-M3 上記のMetは開始メチオニン残基であり、M#は上記特異的モチーフを表し（例
えばM1はモチーフ１等）そして (#)は、モチーフ間のアミノ酸数を示す。
【００４５】 更に、zsig28の第３膜貫通ドメイン中に別の保存モチーフが存在している： ４）”モチーフ４”（配列番号２のアミノ酸184ないし189に相当する図１内の
情報を包含するコンセンサスモチーフパターン）； モチーフ１から４は、Ｎ末端からＣ末端に向かい、以下で表される構造中に分
離し存在している： Met-[47-50]-M1-[21-22]-M2-[73-92]-M3-[3]-M4 上記のMetは開始メチオニン残基であり、M#は上記特異的モチーフを表し（例
えばM4はモチーフ４等）そして (#)は、モチーフ間のアミノ酸数を示す。
【００４６】 膜貫通領域の存在、及び保存された低変異性モチーフの存在は一般に、蛋白質
内の重要な構造領域に関連するか、又はこれを規定している。低変異性領域（例
えば疎水性クラスター）は、一般には構造上重要な領域に存在している（Sheppa
rd、Pら、上記）。この様な低変異性領域は、しばしばトリプトファンの様な稀
又は低頻度アミノ酸を含む。これら保存された低変異性モチーフに隣接する、及
びその間にある領域は、結合ドメイン、生物学的及び酵素的活性、シグナル伝達
、細胞−細胞相互作用、組織局在ドメイン等の様な重要な構造及び活性に関連ま
たは規定していることから、より多様性であるが、しばしば機能的には重要であ
ろう。例えば、上記の領域１から４は機能的に重要であろう。
【００４７】 更に、配列番号２内にあるzsig28ポリペプチド全体には以下のアミノ酸番号の
場所に複数の個々に保存されたアミノ酸が存在している：30（Trp）、48（Gly）
、49（Leu）、50（Trp）、53（Cys)、59（Gly）、63（Cys)、72（Leu）、103(Cy
s)及び114(Lys)。 上記のzsig28内の保存アミノ酸残基領域は、新規ファミリーメンバーの同定の
ツールに利用できる。例えば逆転写ポリメラーゼチェインリアクション（RT-PCR
)を使い、各種組織源又は細胞株より得たRNAから保存域をコードする配列を増幅
できる。特にこの目的に関しては、zsig28配列より設計された高度に縮重された
プライマーが有用であろう。この様な縮重プライマーの設計及び利用は、当業者
に容易に実施されるだろう。
【００４８】 上記のzsig28ポリペプチド領域、ドメイン、モチーフ、残基及び配列をコード
する対応ポリヌクレオチドは図１に示される。 本発明は更に、ここに開示されたzsig28ポリペプチドをコードするDNA及びRNA
分子を含む、ポリヌクレオチド分子を提供する。当分野熟練者は、遺伝子コード
の縮重性の観点に於いて、これらポリヌクレオチド分子には相当の配列多様性が
あることを容易に理解するだろう。配列番号１０は、配列番号２のzsig28ポリペ
プチドをコードする全てのDNAを包含する縮重DNA配列である。
【００４９】 当分野熟練者は、配列番号10の縮重配列はＴをＵに置換することで配列番号２
をコードする全てのRNA配列も提供することを理解するだろう。即ち、zsig28ポ
リペプチドをコードする、配列番号10のヌクレオチド１ないしヌクレオチド783
ポリヌクレオチド及びそれらのRNA等価体は本発明に包含される。表１は、縮重
ヌクレオチド位置を示すための配列番号10内で使用された１文字コードを示して
いる。”リソリューション”は、コード文字で表されたヌクレオチドである。”
相補体”は、相補的ヌクレオチドのコードを示す。例えばコードＹは、Ｃ又はＴ
であり、その相補体ＲはＡ又はＧであり、ＡはＴに対し相補的であり、そしてＧ
はＣに相補的であることを表している。
【００５０】
【表１】 あるアミノ酸に関し考え得る全てのコドンを包含する配列番号10に用いられる
縮重コドンを表２に示す。
【００５１】
【表２】
【００５２】 当業熟練者は、各アミノ酸をコードする考え得る全てのコドンを代表する縮重
コドンの決定には、若干の多義性が導入されることを認識するだろう。例えば、
セリン（WSN）の縮重コドンは、ある条件ではアルギニン（AGR）をコードでき、
アルギニン(MGM)の縮重コドンはある場合にはセリン（AGY）をコードできる。同
様の関係は、フェニルアラニンとロイシンをコードするコドンの間にも存在する
。即ち縮重コドンにより包含される幾つかのポリヌクレオチドは、変異体アミノ
酸配列コードすることがあるが、当業者は配列番号２に示すアミノ酸配列を参照
することで、この様の変異体配列を特定することができる。変異体配列はここに
記す機能性に関し容易に試験することができる。
【００５３】 当業熟練者は、別種が”優先的コドン利用”を示すことを理解するだろう。一
般にはGranthamら、Nuc. Acids Res. 8:1393-912, 1980; Hassら、 Curr. Biol.
6:315-24, 1996; Wain-Hobsonら、Gene 13: 355-64, 1981; Wain-Hobsonら、Ge
ne 13:355-64, 1981; GrosjeanとFiers, Gene 18: 199-209, 1982; Holm, Nuc.
Acids Res. 14:3075-87, 1986;ならびにIkemura, J. Mol. Biol. 158:573-97;19
82を見よ。ここでの使用に於いては、”優先的コドン利用”又は”好ましいコド
ン”とは、特定の細胞内に最も頻繁に利用される蛋白質翻訳コドン、即ち核アミ
ノ酸をコードする考え得るコドンの中にある１または若干数の好都合例を示す用
語である（表２参照）。
【００５４】 種に好ましいコドンは、当分野既知の各種方法により、本発明のポリペプチド
内に取り込むことができる。組換え体DNAに好適コドン配列を導入することで、
例えば特定のタイプ又は種の細胞に於ける蛋白質の翻訳をより効率化することに
より、蛋白質の産生を促進する。例えばアミノ酸のスレオニン（Thr）はACA、AC
C、ACG、又はACTによりコードされるが、哺乳動物細胞ではACCが最も一般的に利
用されるコドンである；別の種、例えば昆虫細胞、酵母、ウイルス、又は細菌で
は、別のTHrコドンが優先するだろう。特定種に関する優占コドンは、当分野既
知の各種方法により、本発明のポリヌクレオチド内に導入できる。
【００５５】 優先コドン配列の組換え体DNA内への導入は、例えば特定の細胞型又は種内で
より効率的な蛋白質翻訳を行うことで、蛋白質の産生を増強する。従って、配列
番号10に開示されている縮重コドン配列は、当分野に通常用いられここに開示さ
れている各種タイプの細胞及び種に於けるポリヌクレオチドの発現を最適化する
為の鋳型として機能する。優先コドンを含む配列は、様々な種に於ける発現に関
し試験及び最適化でき、またここに開示された機能性に関しても試験できる。
【００５６】 発明の好適実施態様では、分離されたポリヌクレオチドは配列番号１の同様の
大きさの領域、又はそれに相補的な配列と厳密条件下にハイブリダイズするだろ
う。一般に、厳密条件は、所定のイオン強度及びpHに於ける特定配列に関する熱
融解点(Tm）より約５℃低くなる様に選択される。Tmは、標的配列の50％が好ま
しく適合するプローブにハイブリダイズする温度（所定イオン強度とpHに於いて
）である。典型的な厳密条件は、塩濃度はpH7に於いて約0.03Mまであり、温度が
少なくとも約60℃である条件である。
【００５７】 各種Tm温度計算法が当分野既知であり、またDNA、RNA及びDNA-RNAハイブリッ
ド及び各種長さのポリヌクレオチドプローブ配列に特異的である（Sambrookら、 Molecular Cloning: A Laboratory Manual , Second Edition(Cold Spring Harbo
r Laboratory Press 1989); Ausubelら、(編集)Current Protocols in Molecula
r Biology,(John Wiley and Sons, Inc. 1987)Guide to Molecular Cloning Tec
hniques, (Academic Press, Inc. 1987);及びWetmur、Crit. Rev. Biochem. Mol
. Biol. 26:227 (1990)）。
【００５８】 OLIGO 6.0（LSR;Long Lake, MN)及びPrimer Premier 4.0(Premier Biosoft In
ternational; Palo Alto, CA）の様な配列分析ソフトウエアー、ならびにインタ
ーネントサイトは、特定配列の分析とユーザーが規定した基準に基づくTmの計算
に利用可能なツールである。この様なプログラムは特定配列を一定条件下に分析
することも、また好適なプローブ配列を特定することもできる。典型的には、長
さの長い配列のハイブリダイゼーション（例えば＞50塩基対）は、計算されたTm
に比べ約20-25℃低い温度で実施される。
【００５９】 より小さいプローブ（例えば＜50塩基対）のハイブリダイゼーションは、典型
的にはTm又はそれより5-10℃低い温度で実施される。これによりDNA-DNA及びDNA
-RNAハイブリッドに関し、ハイブリダイゼーション率は最大になる。低温に於け
る高厳密性は、緩衝液中のフィルムアミド濃度１％について、ハイブリッド温度
を焼く１℃下げることで達成される。好適厳密ハイブリダイゼーション条件は、
以下を含む溶液に於ける42℃、５時間から一晩のインキュベーションである：約
40-50%のフォルムアミド、約６×までのSSC、約５×Denhardt溶液、０から10%ま
での硫酸デキストラン、及び約10-20μg/mlの変性された市販のキャリアーDNA。
【００６０】 一般にこの厳密条件は、20-70℃の温度、及び６×までのSSC及び0-50%のフォ
ルムアミドを含むハイブリダイゼーション液を含む；ハイブリダイゼーション後
、フィルターは更に約２×までのSSCにて洗浄される。例えば、好適な洗浄条件
は、0.1×SSCから２×SSC、0.1%SDS、55℃から65℃である。標的配列への最大の
特異結合を達成することを目的とし、様々な厳密度を利用することができる。典
型的には、ハイブリダイゼーション後の洗浄では、厳密度を高めることによって
ハイブリダイズ複合体から非ハイブリダイズポリヌクレオチドプローブを除く。
ハイブリダイゼーション及び洗浄の厳密条件は、Tmの温度を反映し、プローブの
長さ及び使用するハイブリダイゼーション液と洗浄液に依存し、そして日常的に
は当業者により経験的に決定される。
【００６１】 前述の様に、分離された本発明のポリヌクレオチドはDNA及びRNAを含む。DNA
及びRNAの調製方法は当分野公知である。一般にRNAは大量のzsig28RNAを産生す
る組織、又は細胞から分離される。これら組織及び細胞は、ノーザンブロッティ
ングにより特定され（Thomas、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:5201, 1980）、そし
て胃及び肺が含まれる。
【００６２】 総RNAはグアニジンイソチオシアネート抽出法と、それに続くCsCl勾配中での
遠心分離による分離によって調製できる（Chirgwinら、Biochemistry 18: 52-94
, 1979）。相補的DNA（cDNA)は既知の方法を利用し、ポリ(A)+RNAより調製され
る。あるいは、ゲノムDNAが分離できる。次にzsig28ポリペプチドをコードする
ポリヌクレオチドは、例えばハイブリダイゼーション法又はポリメラーゼチェイ
ンリアクション（PCR）（Mullis、米国特許第4,683,202号）により特定され、ま
た分離される。
【００６３】 zsig28をコードする全長クローンは、通常のクローニング法により得ることが
できる。相補的DNA（cDNA）クローンが好ましいが、幾つかの応用では（例えば
、トランスジェニック動物での発現）ゲノムクローンを利用すること、又は少な
くとも１つの同遺伝子又は別遺伝子に由来するゲノミックイントロンを含む様に
cDNAを変更することが好ましい。cDNA又はゲノミッククローンの調製方法は当分
野公知であり、熟練者のレベル内であり、またライブラリーをプロービングし、
又はプライミングすることへのここに開示された配列又はその一部の利用を含む
。発現ライブラリーは、zsig28ポリペプチド、受容体断片、又はその他特異的結
合相手に対する抗体を用い探索できる。
【００６４】 本発明ポリヌクレオチドは、DNA合成装置を使用して合成することもできる。
今回選択された方法は、フォスフォルアミダイト法である。遺伝子又は遺伝子断
片の合成の様な応用に化学的に合成された２本鎖DNAが必要な場合、各相補鎖は
別々に合成される。短いポリヌクレオチド（60ないし80bp）の製造は、技術的に
は直線的に行われ、相補鎖を合成し、次にそれらをアニーリングすることで達成
できる。しかし、より長い鎖を作る場合（＞300bp）には、DNAの化学合成中の各
サイクルの結合効率が100%になることは殆どないことから、特別な方策が通常用
いられる。この問題を克服するために、20ないし100ヌクレオチド長の１本鎖断
片から合成遺伝子（２本鎖）をモジュラー形式が組み立てられる。
【００６５】 合成遺伝子を形成するための方法の１つでは、まずそれぞれが20ないし60ヌク
レオチドの長さである重複する相補的オリゴヌクレオチドのセットを合成するこ
とを必要とする。遺伝子のそれぞの内部部分は、近接する部分と正確に塩基対を
形成する様に設計された相補的な3'末端及び5'末端突起を有している。即ち、こ
の遺伝子を組み立てた場合、その工程は２本の鎖の骨格にそって存在している切
れ目をT4DNAライゲーズを用いて埋めることで完了する。蛋白質コーディング域
に加え、合成遺伝子はクローニングベクターの制限エンドヌクレアーゼ部位内へ
の挿入を促進する、ターミナル配列を持つように設計できる。更に、適当な転写
及び翻訳の開始及び停止に関するシグナルを含む別の配列を加えることができる
。
【００６６】 完全長遺伝子を調製する別の方法は、重複するオリゴヌクレオチド（40ないし
100ヌクレオチド）の特異的セットを合成することである。3'及び5'の短い重複
した相補域（６ないし10ヌクレオチド）をアニーリングすると大きなギャップが
まだ残っているものの、構造を一つに保持するのに十分な長さと安定性を持つ短
い塩基対域ができる。このギャップを埋め、大腸菌DNAポリメラーゼＩにより酵
素的にDNAを合成することでDNA２重鎖を完成させる。酵素による合成が終了した
後、切れ目はT4DNAリガーゼにより埋められる。
【００６７】 続いて２本鎖構築体は相互に結合され、全遺伝子が形成され、更にDNA配列分
析により確認される。GlickとPasternak、 Molecular Biotechnology, Principl
es & Applications of Recombinant DNA, ASM Pres, Washington, D.C., 1994;
Itakuraら、Annu. Rev. Biochem, 53: 323-356, 1984;及びClimieら、Proc. Nat
l. Acad. Sci. USA 87: 633-637, 1990を見よ。
【００６８】 ここに開示されたzsig28ポリヌクレオチド配列は、zsig28遺伝子のクローン5'
非コーディング域に対するプローブ又はプライマーとして利用する事もできる。
ノーザンブロッティングによるzsig28に関し観察された組織特異的発現の観点に
於いて、本遺伝子域は胃特異的発現を提供することが期待される。zsig28遺伝子
由来のプロモーターエレメントは、例えばトランスジェニック動物、又は遺伝子
治療にて治療を受ける患者での、異種遺伝子の組織特異的発現に向け利用できる
だろう。5'隣接配列のクローニングも、米国特許第5,641,670号に開示される様
に、”遺伝子活性化”によりzsig28蛋白質の産生を促進する。
【００６９】 簡単に述べると、細胞内の内因性zsig28遺伝子の発現は、zsig28座内に少なく
とも標的配列、制御配列。エクソン、及び非対合型スプライスアンカー部位を含
むDNA構築体を挿入することで、変化する。標的配列は、内因性zsig28座と構築
体との相同的組み換えを可能にし、それにより構築体内の配列が内因性のzsig28
コーディング配列と作用可能に連結できる様にするzsig28の5'非コーディング配
列である。この様にして、内因性のzsig28プロモーターは、その他制御配列によ
り置き換わられ、又は補充されすることができ、促進された組織特異的発現、又
は別の制御発現を提供することができる。
【００７０】 本発明は更に別種（オルトログ）由来の対応するポリペプチド及びポリヌクレ
オチドも提供する。これら他種には哺乳動物、鳥類、両生類、は虫類、魚類、昆
虫及びその他脊椎動物、並びに無脊椎動物が含まれるが、これに限定されない。
特に興味深いものは、ネズミ、ブタ、ヒツジ、ウシ、イヌ、ネコ、ウマ及びその
他霊長類ポリペプチドを含む、他哺乳動物種由来のzsig28ポリペプチドである。
ヒトzsig28のオルトログは、本発明により提供される情報と組成物を、通常のク
ローニング技術と組み合わせることでクローン化できる。例えば、cDNAはここに
開示されるzsig28を発現するタイプの組織又は細胞より得たmRNAを用い、クロー
ン化できる。
【００７１】 mRNAの好適供給源はここに開示された配列より設計されるプローブを用いたノ
ーザンブロットをプロービングすることで特定できる。次に、陽性組織、又は細
胞株のmRNAよりライブラリーが調整できる。zsig28をコードするcDNAは、完全又
は部分ヒトcDNAを用いたプロービング、又は開示配列に基づく１またはそれ以上
の変性プローブのセットを用いたプロービングの如くの各種方法により分離でき
る。cDNAもここに開示された代表的ヒトzsig28配列より設計されたプライマーを
利用するポリメラーゼチェインリアクション又はPCR（Mullis、上記）を用いク
ローン化できる。その他の方法としては、cDNAライブラリーを用い宿主細胞を形
質転換、又はトランスフェクトでき、また所望cDNAの発現はzsig28ポリペプチド
に対する抗体により検出することができる。
【００７２】 当業者は配列番号１開示の配列がヒトzsig28の１対立遺伝子を表すものである
こと、そして対立遺伝子及び変更スプライシングを含む自然変異の生起が予想さ
れることを認識するだろう。この配列の対立遺伝子変異体は、cDNA又は各種個体
より通常法によって得たゲノムライブラリーをプロービングすることでクローン
化できる。
【００７３】 サイレント変異及びアミノ酸配列を変化させる突然変異を含む、配列番号１に
示すDNA配列の対立遺伝子変異体は、そのタンパク質が配列番号２の対立遺伝子
変異体であることから本発明の範囲である。zsig28のポリペプチドの特性を保持
する、別の形にスプライシングされたmRNAより生じたcDNAは、これらcDNA及びmR
NAによりコードされるポリペプチドが上記である場合は本発明の範囲である。こ
れら配列の対立遺伝子変異及びスプライス変異は、当分野公知の標準的方法によ
り各種個体又は組織より得たcDNA又はゲノムライブラリーをプロービングするこ
とで、クローン化できる。
【００７４】 本発明は配列番号２のポリペプチド及びそれらのオルトログに本質的に類似で
ある分離されたzsig28ポリペプチドも提供する。用語”本質的に類似”とは、こ
こでは配列番号２に示す配列又はそのオルトログに対し少なくとも70％、より好
ましくは少なくとも80％の配列同一性を持つポリペプチドを意味するのに用いら
れる。この様なポリペプチドはより好ましくは配列番号２又はそのオルトログに
対し少なくとも90％、最も好ましくは95％同一である。％配列同一性は通常の方
法によって決定される；例えばAltschulら、Bull. Math. Bio. 48:603-16, 1986
, 及びHenikoffとHenikoff. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-9, 1992を
参照せよ。
【００７５】 簡単に述べると、２つのアミノ酸配列を、ギャップオープニングペナルティー
10、ギャップエクステンションペナルティー１、そして表３（アミノ酸は通常の
１文字コードで示している）に示すHenikoffとHenikoff（上記）の”blosum62"
スコアリングマトリックスを用い、アラインメントスコアが最適になるよう整列
させる。次に同一性％を次式より計算する：
【００７６】
【数１】
【００７７】
【表３】 ポリヌクレオチド分子の配列同一性は上記に開示した割合を利用し、同様の方
法によって決定される。
【００７８】 当業者は２種類のアミノ酸配列の整列に利用できる確立されたアルゴリズムが
多く存在することを認識している。PearsonとLipmanによる"FASTA"類似性検索ア
ルゴリズムは、ここに開示されたアミノ酸配列と推定変異体zsig28ポリペプチド
の持つ同一性レベルの検討に適した好適な蛋白質整列法である。FASTAアルゴリ
ズムはPearsonとLipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, (1988）及びPe
arson、Meth. Enzymol. 183:63（1990）により記述されている。
【００７９】 簡単に述べると、FASTAはまず保存的なアミノ酸置換、挿入、あるいは欠失を
考慮せずに同一体（ktup変数が１の場合）、あるいは同一ペア（ktup=2の場合）
の密度が最大になる様に、対象配列（例えば配列番号２）と試験配列間に共有さ
れる領域を特定して配列の類似性を特徴付ける。次にアミノ酸置換マトリックス
を用い、対合する全てのアミノ酸の類似性を比較し、最高のスコアになる様に残
基を切断し領域端部を“切りそろえ”、最高の同一性密度を示す10カ所の領域を
再度スコア化する。
【００８０】 “カットオフ”値（配列の長さとktup値より前もって定めれられた式に従い計
算された）よりも大きなスコアを示す領域が複数ある場合には、続いて切りそろ
えられた最初の領域を再度検討、領域を連結してギャップを持つ適当なアライン
メントができるか調べる。最後に、アミノ酸挿入と欠失を考慮したNeedlema-Wun
sh-Sellersのアルゴリズム（NeedlemanとWuncsch, J. Mo;. Biol. 48:444 (1970
); Sellers, SIAM J. Appl. Math. 26: 787 (1974））の変法を利用し、２アミ
ノ酸配列の最高スコア域を揃え並べる。
【００８１】 FASTA分析の好適パラメータは：ktup=1、ギャップオープニングペナルティー
＝10、ギャップエクステンションペナルティー＝１、置換マトリックス＝BLOSUM
62である。これらパラメータは、Pearson、Meth. Enzymol. 183:63(1990)の付録
２内に説明されているスコア化マトリックスファイル（"SMATRIX"）を改良する
ことで、FASTAプログラム内に導入することができる。 FASTAは、上記同様に比率を利用した核酸分子の配列同一性決定にも利用でき
る。ヌクレオチド配列の比較では、ktup値は１から６の間の範囲であり、好まし
くは３から６、最も好ましくは３であり、その他のパラメータはデフォルトであ
る。
【００８２】 BLOSUM62表（表３）は蛋白質配列断片の約2,000の局所置換整列に基づくアミ
ノ酸置換マトリックスであり、500以上の関連蛋白質グループに於ける高度に保
存された領域を表している（HenikoffとHenikoff, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA
89:10915(1992))。従って、BLOSUM62置換頻度を利用し、本発明のアミノ酸配列
内に導入できる保存的アミノ酸置換を規定することができる。化学的特性のみに
基づきアミノ酸置換を設計することも可能である（以下考察の如く）が、“保存
的アミノ酸置換”という語は望ましくはBLOSUM62の値が−１以上である置換を表
す。
【００８３】 例えば、アミノ酸置換は、その置換がBLOSUM62の値０、１、２又は３で特徴付
けられる場合に保存的である。このシステムによれば、好ましい保存的アミノ酸
置換は、少なくとも１（例えば１、２又は３）のBLOSUM62値により特徴付けられ
るが、より好ましい保存的アミノ酸置換は少なくとも２（例えば２又は３）のBO
SUM62値により特徴付けられる。
【００８４】 変異体zsig28ポリペプチド又は本質的に相同なzsig28ポリペプチドは、１又は
それ以上のアミノ酸置換、欠失、又は付加を持つことで特徴付けられる。これら
変化は、好ましくは保存的アミノ酸置換（表４参照）又は歩理恵ペプチドの畳み
込み、又は活性に大きく影響しないその他の置換；小さな欠失、典型的には１な
いし約30アミノ酸；及び例えばアミノ末端メチオニン残基の様なアミノ−あるい
はカルボキシル末端の延長、約20-25残基までの小リンカーペプチド又は親和性
タグの様な軽微な性質のものである。
【００８５】 従って本発明は、少なくとも80%、好ましくは少なくとも90%、及びより好まし
くは95%またはそれ以上、配列番号２の対応領域と相同である約208ないし約291
アミノ酸残基のポリペプチドを含む。親和性タグを含むポリペプチドは更に、zs
ig28ポリペプチドと親和性タグとの間に蛋白質分解性切断部位を含むことができ
る。好ましい部位は、トロンビン切断部位及び第Xa因子切断部位を含む。
【００８６】
【表４】
【００８７】 本発明は更に、各種ポリペプチド融合体及び１又はそれ以上のポリペプチド融
合体を含む関連多量体蛋白質も提供する。例えば、zsig28ポリペプチドは米国特
許第5,5155,027号及び5,567,584号に開示の如くにして融合体ないし２量体とし
て調製することができる。この観点での好ましい２量体蛋白質は免疫グロブリン
の定常域ドメインを含む。免疫グロブリン-zsig28ポリペプチド融合体は遺伝的
に加工された細胞内にて発現し、多量体型のzsig28類似体を産生することができ
る。補助ドメインをzsig28ポリペプチドに融合させ、それらに特異的細胞、組織
、又は高分子（例えばコラーゲン）に狙わせることができる。
【００８８】 例えば、zsig28ポリペプチド又は蛋白質は、zsig28ポリペプチドを、標的細胞
の表面上の受容体に特異的に結合するリガンドと融合することで、前もって決め
られた型の細胞を標的にできるだろう。zsig28ポリペプチドは、例えば精製の為
のタグ又は標的化もしくは２量体化ドメインの様な２又はそれ以上の成分と融合
することができる。ポリペプチド融合体は、更に１又はそれ以上の切断部位を、
特にドメイン間に具備することもできる。Tuanら、 Connective Tissue Researc
h 34: 1-9, 1996参照。
【００８９】 同様に、これら融合体は、ここに記したzsig28ポリペプチド域１，２，３又は
４、又はそれらの領域内の小断片を分泌できる様に構築することもできる。２量
体化蛋白質に結合した可溶性zsig28域１，２，３又は４は、例えば２量体化ある
いは多量体化を阻害することで、zsig28ポリペプチドに関する天然リガンド、又
はzsig28ポリペプチド自体の拮抗剤として機能できる。この様な可溶性zsig28領
域１，２，３又は４を含む拮抗剤は、ここに開示された様にして機能性について
試験することができる。
【００９０】 本発明の蛋白質は、非天然に生じるアミノ酸残基を含む事ができる。非天然に
生ずるアミノ酸には、トランス-3-メチルプロリン、2,4-メタノプロリン、シス-
4-ヒドロキシプロリン、トランス-4-ヒドロキシプロリン、N-メチルグリシン、
アロ-スレオニン、メチルスレオニン、ヒドロキシエチルシステイン、ヒドロキ
シエチルホモシステイン、ニトログルタミン、ホモグルタミン、ピペコリン酸、
チアゾリジンカルボン酸、デヒドロプロリン、3-及び4-メチルプロリン、3,3-ジ
メチルプロリン、t-ロイシン、ノルバリン、2-アザフェニルアラニン、3-アザフ
ェニルアラニン、4-アザフェニルアラニン及び4-フルオロフェニルアラニンが含
まれるが、これに限定されるものではない。
【００９１】 当分野では、非天然に生ずるアミノ酸残基を蛋白質内に取り込ませるための方
法が複数知られている。例えば化学的にアミノアシルかした抑制性tRNAsを利用
してナンセンス変異を抑制するインビトロシステムが利用される、アミノ酸合成
及びtRNAをアミノアシル化する方法は当分野既知である。ナンセンス変異を含む
プラスミドの転写及び翻訳は大腸菌S30抽出物、及び市販の酵素及びその他試薬
を含む無細胞系内で実施される。蛋白質はクロマトグラフィーにより精製される
。
【００９２】 例えば、Robertsonら、J. Am, Chem. Soc. 113:2722, 1991; Ellmanら、Metho
ds Enzymol. 202: 301, 1991; Chungら、Science 259; 806-9, 1993: Chungら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10145-9, 1993）を参照せよ。第２の方法では
、翻訳は変異mRNA及び化学的にアミノアシル化された抑制tRNAsをマイクロイン
ジェクションを用い、Xenopus卵細胞内にて実施される（Turcattiら、J. Biol.
Chem. 271:19991-8, 1996）。第３の方法では、大腸菌細胞は、置き換えられる
予定の天然アミノ酸（例えばフェニルアラニン）が無い状態、もしくは所望する
非天然に作製されるアミノ酸（例えば2-アザフェニルアラニン、3-アザフェニル
アラニン、4-アザフェニルアラニン又は4-フルオロフェニルアラニン）存在下に
培養される。非天然型アミノ酸は、対応する天然型アミノ酸に代わって蛋白質内
に取り込まれる。
【００９３】 Koideら、Biochem. 33: 7470-6, 1994参照せよ。天然に生ずるアミノ酸残基は
、インビトロでの化学的修飾により非天然型に変換することができる。化学修飾
は、部位特異的変異誘導と組合せることで、置換基の範囲を更に拡張できる（Wy
nnとRichards、Protein Sci. 2: 395-403, 1993）。 限定数の非保存的アミノ酸、遺伝子コードによりコードされていないアミノ酸
、非天然に作製されたアミノ酸、及び非天然型アミノ酸は、zsig28アミノ酸残基
に関し置換されるだろう。
【００９４】 本発明のポリペプチド内にある必須アミノ酸は、部位特異的変異誘導又はアラ
ニンスキャニング変異誘導法の様な当分野既知の方法により特定できる（Cunnin
ghamとWells、Science 244: 1081-5, 1989; Bassら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 88: 4498-502m 1991）。後者の技術では、単一のアラニン変異を分子内の全
ての残基について導入し、得られた変異体分子を以下に開示する様な生物活性に
ついて試験し、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定する。Hiltonら、J.
Biol. Chem. 271; 4699-708, 1996も参照せよ。
【００９５】 蛋白質−蛋白質又はその他生物学的相互作用部位も、核磁気共鳴、血漿分析、
電子分散又はフォトアフィニティーラベリングの様な技術を、推定接触部位のア
ミノ酸の変異体と組合せることで決定される構造の物理分析より決定することが
できる。例えばde Vosら、Science 255:306-12, 1992; Smithら、J. Mol. Biol.
224:859-904, 1992; Wlodaverら、 FEBS Lett. 309: 59-64, 1992を参照せよ。
必須アミノ酸の同定は、クラウジン１（claudin1）（配列番号３）、ヒトOSP-様
蛋白質（配列番号５）等の様な関連蛋白質との相同性を分析することで推論する
こともできる。
【００９６】 Reidhaar-Olson及びSauer（Science 241:53-7, 1988）又はBowie及びSauer（P
roc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6, 1989）により開示されている様な、既知突
然変異法を用いることで、多アミノ酸置換を行い、また試験することができる。
簡単に述べると、これら著者らはポリペプチド中の２又はそれ以上の部位を同時
に無作為化すること、機能的ポリペプチドを選別すること、そしてその後変異し
たポリペプチドの配列を分析し、部位毎に可能な置換基のスペクトルを決定する
方法を開示している。利用可能なその他の方法には、ファージディスプレー（例
えば、Lowmanら、Biochem. 30: 10832-7, 1991; Ladnerら、米国特許第5,223,40
9号；Huse、WIPO公開WO92/06204）及び部位特異的変異誘導（Derbyshireら、Gen
e 46:145, 1986; Nerら、DNA 7:127, 1988）が含まれる。
【００９７】 開示されたzsig28DNAの変異体及びポリペプチド配列はStemmer、Nature 370,3
89-91、1994、Stemmer, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-51, 1994及びWIP
O公開WO97/20078に開示されているようなDNAシャッフリング法により作製するこ
とができる。簡単に述べると、変異型DNAは、親DNAを無作為に断片化した後にPC
Rを使って組立直し、その結果無作為に導入された点突然変異体を得るインビト
ロでの相同的組み換え法により作製される。この技術は、対立遺伝子変異体又は
異なる種に由来するDNAの様な親DNAのファミリーを利用することで、工程に更に
多様性を加える様に変更できる。更に変異導入とアッセイを繰り返し所望活性に
関し選別し、又はスクリーニングすることで、有害な変化について同時に選別し
ながら所望変異を選別し、その結果迅速な”評価”が提供される。
【００９８】 ここに開示される変異導入法は、大量処理可能な、自動化されたスクリーニン
グ法と組み合わせることができ、宿主細胞内にクローン化され、変異導入された
ポリペプチドの活性を検出することができる。活性なポリペプチド（例えばシグ
ナル伝達、又は結合活性）をコードする変異導入DNA分子は宿主細胞より回収で
き、現代的装置を利用し迅速に配列決定することができる。これら方法は、問題
のペプチド内の個々のアミノ酸残基の重要を迅速に決定でき、構造不明なポリペ
プチドにも応用できる。
【００９９】 ここに考察された方法を利用することで、当業者は配列番号２の、又は例えば
野生型zsig28蛋白質の結合、細胞−細胞連絡、又はシグナル伝達活性を保持して
いる各種ポリペプチド断片又はその変異種を同定し、及び／又は調製することが
できる。例えば、上記方法を利用することで。zsig28上のリガンド結合ドメイン
；ヘテロダイマー及びホモダイマー結合ドメイン；その他機能又は構造ドメイン
；もしくは蛋白質−蛋白質相互作用；細胞−細胞相互作用、又はシグナル伝達に
とって重要なその他ドメインを同定できる。この様なポリペプチドは一般的にこ
こに開示される様に、アフィニティータグの様な追加のポリペプチド断片も含む
だろう。
【０１００】 変異体及び融合蛋白質を含むzsig28ポリペプチドに関し、当業者は上記表１及
び２記載の情報を利用し、この変異体をコードする完全な縮重ポリヌクレオチド
配列を容易に作成することができる。 全長ポリペプチド、生物学的に活性な断片、及び融合ポリペプチドを含む本発
明のzsig28ポリペプチドは、通常技術を用い遺伝的に作られた宿主細胞内にて産
生させることができる。好適宿主細胞は、外因性DNAで形質転換又はトランスフ
ェクションでき、培地中にて増殖できる細胞であり、そして細菌、真菌細胞なら
びに培養高等真核細胞を含む。
【０１０１】 真核細胞、特に多細胞生物の培養細胞が好ましい。クローン化DNA分子を取り
扱い、外因性DNAを各種宿主細胞に導入するための技術は、Sambrookら、Molecul
ar Clonign: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989,及びAusubelら、編集、Current Protoco
ls in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc., NY, 1987に開示されて
いる。
【０１０２】 一般に、zsig28ポリペプチドをコードしているDNA配列は、一般には転写プロ
モーター及びターミネーターを含む、発現ベクター内でのその発現に必要なその
他の遺伝的要素に作用可能に連結されている。一般に、プロモーターはDNA配列
又は断片に作用可能に連結され、DNA断片は転写ターミネーターと作用可能に連
結される。
【０１０３】 ベクターはまた通常１またはそれ以上の選択可能なマーカー、及び１又はそれ
以上の複製起点を有しているが、当業者はあるシステム内では選択可能マーカー
が別のベクター上に供給され、そして外因性DNAの複製が宿主ゲノム内への組み
込みによって提供されることを認識するだろう。プロモーター、ターミネーター
、選択可能マーカー、ベクター及びその他要素の選択は、当分野通常技術の範囲
にある通常設計の問題である。多くのこれら要素は文献中に記載されており、ま
た販売会社を通じ入手できる。
【０１０４】 zsig28ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に乗せる為には、分泌シグナル配列
（リーダー配列、プレプロ配列、又はプレ配列としても知られる）が発現ベクタ
ー内に供給される。分泌シグナル配列はzsig28の分泌シグナル配列、又はその他
の分泌蛋白質（例えばt-PA）に由来する、又は新たに合成された分泌シグナル配
列である。分泌シグナル配列は、zsig28DNA配列と作用可能に連結し、即ち２配
列は正しい読みとり枠内に結合し、新たに合成されたポリペプチドを宿主細胞内
の分泌経路内に向かわせる位置に配置される。分泌シグナル配列は通常所望する
ポリペプチドをコードするDNA配列の5'側に位置するが、特定のシグナル配列は
所望するDNA配列内の何れかの場所に位置することもある（Welchら、米国特許第
5,037,743号；Hollandら、米国特許第5,143,830号を参照せよ）。
【０１０５】 あるいは、本発明のポリペプチド内に含まれる分泌シグナル配列は他のポリペ
プチドを分泌経路に向かわせるのに利用される。本発明はこの様な融合ポリペプ
チドを提供する。シグナル融合ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基１（
Met)ないし残基23（Ala)に由来する分泌シグナル配列は、当分野既知及びここに
開示される方法を使い、作用可能に別のポリペプチドをコードするDNA配列に連
結される。
【０１０６】 本発明の融合ポリペプチド内に含まれる分泌シグナル配列は、追加のペプチド
にアミノ末端を介して好ましく融合し、追加ペプチドを分泌経路内に導く。この
様な構築体は当分野既知の多くの応用を持っている。例えばこれら新規分泌シグ
ナル配列融合構築体は、通常は非分泌型である蛋白質の活性成分を分泌に導くこ
とができる。この様な融合体は、インビボ又はインビトロでのペプチドの分泌経
路への方向付けに用いられる。
【０１０７】 培養した哺乳動物細胞は本発明での利用に好適な宿主である。外因性DNAを哺
乳動物細胞内に導入する方法には、リン酸カルシウム伝達トランスフェクション
法（Wiglerら、Cell 14:725, 1978; CorsaroとPearson, Somatic Cell Genetics
7:603, 1981: GrahamとVan der Eb, Virology 52:456, 1973）、エレクトロポ
レーション法（Neumannら、EMBO J. 1:841-845, 1982）、DEAE-デキストラン伝
達トランスフェクション法（Ausubelら、上記）、及びリポソーム伝達トランス
フェクション法（Hawley-Nelsonら、Foucs 15:73, 1993; Ciccaroneら、Focus 1
5:80, 1993、及びウイルスベクター（MillerとRosman, BioTechniques 7:980-90
, 1989; WangとFiner, Nature Med. 2: 714-6, 1996）が含まれる。
【０１０８】 培養哺乳動物細胞内での組換え体ポリペプチドの産生は、例えばLevinsonら、
米国特許第4,713,339号；Hagenら、米国特許第4,784,950号；Palmiterら、米国
特許第4,579,821号；及びRingold、米国特許第4,656,134号にて考察されている
。好適培養哺乳動物細胞にはCOS-1（ATCC No.CRL 1650), COS-7(ATCC No. CRL 1
651), BHK(ATCC No. CRL 1632), BHK 570(ATCC No.CRL 10314)、293(ATCC No. C
RL 1573; Grahamら、J. Gen. Virol. 36:59-72,1977）及びチャイニーズハムス
ター卵巣（CHO-K1；ATCC No. CCl61）細胞株が含まれる。
【０１０９】 追加の好適細胞株は当分野既知であり、米国標準培養体コレクション、マナサ
ス、バージニア州、（American Type Culture Collection, Manassas, VA ）の
様な公的供託機関より入手することができる。一般に、SV-40またはサイトメガ
ロウイルス由来のプロモーターの様な強い転写プロモーターが好まれる。米国特
許4,956,268号参照。その他好適プロモーターには、メタロチオネン遺伝子（米
国特許第4,579,821号及び、4,601,978号）及びアデノウイルス主後期プロモータ
ーが含まれる。
【０１１０】 外来DNAが挿入された培養哺乳細胞に関しては、薬物選択を用い選別が行われ
る。この様な細胞は一般には”トランスフェクタント”と呼ばれる。選択薬剤存
在下に培養され、所望遺伝子をその子孫に伝達することができる細胞は、”安定
トランスフェクタント”と呼ばれる。好適選択マーカーは抗生物質であるネオマ
イシンに対する耐性をコードしている遺伝子である。選択は、G-418等のネオマ
イシン型薬物の存在下に行われる。選択システムは所望遺伝子の発現レベルの増
加にも利用でき、この工程は”増幅”と呼ばれている。
【０１１１】 増幅はトランスフェクタントを低レベルの選択薬剤存在下に培養し、続いて選
択薬剤の量を増加し、導入遺伝子の産物を高レベルに産生する細胞を選択するこ
とで、実施される。好ましい増幅可能な選択マーカーはジヒドロ葉酸還元酵素で
あり、メトトレキセートに対する耐性を付与する。その他薬剤耐性遺伝子（例え
ばヒグロマイシン耐性、多剤耐性、ピューロマイシンアセチルトランスフェラー
ゼ）も利用できる。別の表現形を導入する、例えば緑色蛍光蛋白質、又はCD4、C
D8、クラスＩMHCの様な細胞表面蛋白質、胎盤性アルカリフォスファターゼの様
な別のマーカーを利用し、FACSソーティング、又は磁性ビーズ分離法の様な手段
により、非トランスフェクト細胞からトランスフェクトされた細胞を選別できる
だろう。
【０１１２】 昆虫細胞、植物細胞及び鳥類細胞を含む他の高等真核細胞も宿主として利用で
きる。植物細胞での遺伝子発現に関するベクターとしてのAgrobacterium rhizog
enesの利用はSinkarら, J. Biosci. (Bangalore)11:47-58,1987にレビューされ
ている。昆虫細胞の形質転換、及びその中での外来性ポリペプチドの酸性はGuar
inoら；米国特許第5,162,222号及びWIPO公開WO94/06463により開示されている。
昆虫細胞も、一般にAutographa californica多核性ポリヘドロシスウイルス（Ac
MNPV）に由来する組換え体バキュロウイルスベクターを使って感染させることが
できる。King, L.A.及びPossee、R.D., The Baculovirus Expression System; A
Laboratory Guide, London, Chapman & Hall; O'Reilly, D.R.ら、Baculovirus
Expression Vectors; A Laboratory Manual, New York, Oxford University Pr
ess., 1994;及び、Richardson, C. D.,編集., Baculovirus Expression Protcol
s. Methods in Molecular Biology, Totowa, NJ, Humana Press, 1995を参照せ
よ。
【０１１３】 組換え体zsig28バキュロウイルスを作製する第２の方法は、Luckow（Luckow,
V.Aら、J Virol 67: 4566-79, 1993)記載のトランスポゾンをベースとした系を
利用する。トランスファーベクターを利用するこの系はBac-to-BacTMキットとし
て市販されている（Life Technologies,Rockwille、MD）。このシステムはTn7ト
ランスポゾンを含むトランスファーベクターpFastBac1TM（Life Technologies）
を利用し、zsig28ポリペプチドをコードするDNAを、大腸菌中に維持されている
”bacmid"と呼ばれる大形プラスミドであるバキュロウイルスゲノム中に移す。p
FastBac1TMトランスファーベクターはAcNPVポリヘドリンプロモーターを利用し
て、所望遺伝子、本例ではzsig28の発現を誘導する。しかし、pFastBac1TMはあ
る程度変更することができる。
【０１１４】 ポリヘドリンプロモーターを除き、そしてバキュロウイルス感染に於いてより
早く発現するバキュロウイルス塩基性蛋白質プロモーター（Pcor、p6.9、又はMP
プロモーターとしても知られる）に交換することができ、また分泌型蛋白質の発
現に遊離であることが示されている。Hill-Perkins, M.S及びPossee, R.D., J.
Gen. Virol. 71:971-6, 1990; Bonning, B.Cら、J.Gen.Virol. 75:1551-6, 1994
;及びChazenbalk, g.D.,とRapoport, B., J. Biol. Chem. 270,1543-9, 1995参
照。これらトランスファーベクター構築体では、塩基性蛋白質プロモーターの短
縮または延長型も利用できる。
【０１１５】 更に、天然のzsig28分泌シグナル配列を昆虫蛋白質由来の分泌性シグナル配列
と交換したトランスファーベクターを構築することもできる。例えば、脱皮ステ
ロイドグリコシルトランスフェラーゼ（EGT）、ミツバチメリチン（Invitrogen
、Carlsbad、CA）又はバキュロウイルスgp67（PharMingen、San Diego, CA）由
来の分泌シグナル配列を利用して、構築体の天然のzsig28分泌シグナル配列を交
換することができる。更に、トランスファーベクターは発現したzsig28ポリペプ
チドのＣ−又はＮ−末端にエピトープタグ、例えばGlu-Gluエピトープタグ（Gru
ssenmeyer, Tら、Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 7952-4, 1985） をコードするDN
Aのインフレーム融合体を含むことができる。
【０１１６】 当分野既知の技術を用い、zsig28を含むトランスファーベクターは大腸菌何に
導入され、組換え体バキュロウイルスの指標である切断されたlacZ遺伝子を含む
bacmidsについてスクリーニングされる。組換え体バキュロウイルスゲノムを含
むbacmidDNAは、一般的方法により分離され、これを用いSpodoptera frugiperda
細胞、例えばSf9細胞をトランスフェクトする。これによりzsig28を発現する組
換え体ウイルスが作られる。組換え体ウイルスのストックは、当分野一般的に用
いられる方法により作成される。
【０１１７】 組換え体ウイルスは、宿主細胞、典型的にはアワヨトウ、Spodoptera frugipe
rdaの幼虫より得た細胞株の感染に用いられる。一般にはGlick及びPasternak, M
olecular Miotechnology: Principles and Applications of Recombinant DNA,
ASM Press, Washington, D.C., 1994を見よ。別の好適細胞株はTrichoplusia ni
(米国特許第5,300,435号）由来のHigh FiveO（商標）細胞株（Invitrogen）であ
る。市販の無血清培地を使い、細胞を増殖及び維持する。好適な培地は、Sf9細
胞についてはSf900II（商標）（Life Technologies）又はEST921（商標）（Expr
ession Systems)である；T.ni細胞に関してはEx-cell0405（商標）（JBH Biosci
ences, Lenexa, KS)又はExpress FiveO（商標）(Life Technologies)である。
【０１１８】 細胞はおよそ2〜5×105細胞の接種密度から、1-2×106細胞の密度まで増殖さ
れ、この時点で組換え体ウイルスストックを多重度0.1から1.0で、より典型的に
は３にて加える。用いる方法は市販の研究室マニュアルに一般的に記述されてい
る（King, L.A.とPossee,R.D.,上記、；O'Reilly, D.R.ら、上記；Richardson,
C. D.,上記）。上清からのzsig28ポリペプチド精製は、ここに記述した方法を用
い行うことができる。
【０１１９】 酵母細胞を含む真菌細胞も本発明に利用できる。この観点において特に興味あ
る酵母種には、サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）,
ピチア・パストリス（Pichia pastoris）及びピチア・メタノリカ（Pichia meth
anolica）が含まれる。サッカロミセス・セレビシエー（S. cerevisiae）細胞を
外因性DNAにて形質変換し、それより組換え体ポリペプチドを産生する方法は、
例えばKawasaki、米国特許第4,599,311号、Kawasakiら、米国特許第4,931,373号
；Brake、米国特許第4,870,008号；Welchら、米国特許第5,037,743号；及びMurr
ayら、米国特許第4,845,075号により開示されている。形質転換細胞は選択可能
マーカー、一般的には薬剤耐性、あるいは特定栄養素（例えばロイシン）欠損状
態での増殖能によって決定される表現形により選別される。
【０１２０】 サッカロミセス・セレビシエー（Saccharomyces cerevisiae）での利用に適し
た好適ベクターシステムはKawasakiらにより開示されている（米国特許第4,931,
373号）、グルコース含有培地中の増殖により形質変換細胞が選択できるPCT1ベ
クターシステムである。酵母での利用に適した好適プロモーター及びターミネー
ターには、糖分解酵素遺伝子由来（例えばKawasaki、米国特許第4,599,311号；K
ingsmanら、米国特許第4,615,974号；及びBitter、米国特許第4,977,092号を見
よ）及びアルコール脱水素酵素遺伝子由来のものが含まれる。米国特許第4,990,
446号、5,063,154号、第5,139,936号及び第4,661,454号も参照せよ。
【０１２１】 当分野ではハンゼヌラ・ポリモルフ（Hansenula polymorpha）, シゾサッカロ
ミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）, クルイベロミセス・ラクチス
（Kluyveromyces lactis）, クルイベロミセス・フラギリス（Kluyveromyces fr
agillis）, ウスチラゴ・マイディス（Ustilago maydis）, ピチア・パストリス
（Pichia pastoris）, ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）, ピチア・
グリレルモンジー（Pichia guillermondii）及びキャンジダ・マルトサ（Candid
a maltosa）を含むその他酵母に適した形質変換システムが知られている。例え
ば、Gleesonら、J. Gen. Microbiol, 132: 3459-3465, 1986及びCregg、米国特
許第4,882,279号を参照せよ。アスペルギルス細胞はMcKnightら、米国特許第4,9
35,349号の方法に従い利用されるだろう。Acremonium chrysogenumを形質変換す
る方法は、Suminoら、米国特許第5,162,228号により開示されている。ニューロ
スポラを形質転換する方法はLambowitz、米国特許第4,486,533号により開示され
ている。
【０１２２】 ピチア・メタノリカ（Pichia methanolica）の組換え体蛋白質産生に関する宿
主としての利用はWIPO公開WO97/17450、WO97/17452、WO98/02536及びWO98/02565
に開示されている。 P.methanolicaの形質転換への利用に適したDNA分子は、一般には２本鎖の環状
プラスミドとして調製され、これは形質転換前に直鎖化することが好ましい。P.
methanolicaでのポリペプチド産生に関しては、プラスミド中のプロモーター及
びターミネーターは、ピチア・メタノリカ（P.methnaolica）遺伝子、例えばピ
チア・メタノリカ（P.methnaolica）アルコール利用遺伝子（AUG1又はAUG2）の
プロモーター及びターミネーターが好ましい。
【０１２３】 その他の有用なプロモーターには、ジヒドロキシアセトン合成酵素（DHAS）、
蟻酸脱水素酵素（FMD）、及びカタラーゼ（CAT）遺伝子のプロモーターが含まれ
る。宿主染色体へのDNAの組み込みを促進するには、プラスミドの全発現断片が
両端で宿主DNA配列により連結されることが好ましい。ピチア・メタノリカ（Pic
hia methanolica）の利用に関する好適な選択可能マーカーは、ade2宿主細胞を
アデニン無しの状態で増殖させるフォスフォリボシル-5-アミノイミダゾールカ
ルボキシラーゼ（AIRC;EC4.1.1.21）をコードするピチア・メタノリカ（P.metha
nolica）のADE2遺伝子である。
【０１２４】 メタノールの利用を最小化することが望まれる大規模な工業工程に関しては、
メタノール利用遺伝子（AUG1及びAUG2）が欠失した宿主細胞の利用が好ましい。
分泌蛋白質の産生に関しては空胞性プロテアーゼ遺伝子（PEP4及びPRB1）を欠く
宿主細胞が好ましい。目的のポリペプチドをコードするDNAを含むプラスミドの
ピチア・メタノリカ（P.methanolica）細胞内への導入を促進するために、エレ
クトロポレーションが利用される。ピチア・メタノリカ（P.metanolica）は対数
的に減衰する、2.5ないし4.5kV/cm、好ましくは約3.75kV/mの強度と１ないし40
ミリ秒、最も好ましくは約20ミリ秒である一定時間のパルス状電場を用いたエレ
クトロポレーションにより形質転換されることが好ましい。
【０１２５】 大腸菌（Escherichia coli）, バチルス（Bacillus）及びその他の属の細菌株
を含む前核生物宿主細胞も、本発明での有用な宿主細胞である。これら宿主を形
質転換し、その中にクローン化された外来性DNA配列を発現させる技術はあ当分
野公知である（Sambrookら、上記参照）。E.coliの様な細菌に於いてzkun6ポリ
ペプチドを発現させる場合、ポリペプチドは典型的には不溶性の顆粒球として細
胞質内に保持されるか、細菌由来の分泌配列によって細胞周辺腔内に送られる。
【０１２６】 前者の場合、細胞は溶解され、顆粒を回収し、例えばグアニジンイソチオシア
ネート又は尿素により変性させられる。次に尿素及び還元型ならびに酸化型グル
タチオンの溶液に透析し、続いて緩衝生理食塩水に対し透析する様にし、変性剤
を希釈して変性したポリペプチドを再度折り畳ませ、ダイマー化させる。後者の
場合、細胞を破壊し（例えば超音波処理、又は浸透圧ショックにより）細胞周辺
腔含有物を放出させ、蛋白質を回収することでポリペプチドを可溶性及び機能的
な形で回収することができるため、変性や再折りたたみの必要がない。
【０１２７】 形質転換又はトランスフェクトされた宿主細胞は、通常の方法に従い栄養素及
び選択した細胞の増殖に必要とされるその他成分とを含む培地中にて培養される
。限定培地や複合培地を含む各種好適培地が当分野既知であり、一般には炭素源
、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン及びミネラルが含まれる。培地は更に成長因
子又は血清の様な成分を随意含むだろう。一般に増殖培地は、例えば薬剤選択に
より、あるいは発現ベクター上に乗せられ、又は宿主細胞にコトランスフェクト
された選択マーカーによって補償されている必須栄養素の欠失により、外来性に
加えられたDNAを含む細胞を選別する。
【０１２８】 ピチア・メタノリカ（P.methanolica）細胞は適当な炭素源、窒素源、微量栄
養素源を含む培地中、約25℃ないし50℃の温度にて培養される。液体培地には、
小型フラスコの振盪、又はファーメンターの噴霧散布の様な通常の方法によって
十分な通気が行われる。ピチア・メタノリカ（P.methanolica）に取って好まし
い培地はYEPD（2%D-グルコース、2%Bacto（商標）ペプトン（Difco Laboratorie
s, Detroit, MI),1% BactoTM 酵母抽出物（Difco Laboratories)、0.004%アデニ
ン及び0.006%L-ロイシンである）。
【０１２９】 本発明の蛋白質は純度≧80％、より好ましくは≧90％、さらにより好ましくは
≧95％に精製することが好ましく、そして特に汚染高分子、特に他種蛋白質及び
核酸に関しての純度が99.9％以上であり、感染及び発熱物質を含まない、医薬品
としての純粋状態が特に好ましい。好ましくは、精製蛋白質は他種蛋白質、特に
動物起源の他種蛋白質を実質上含まない。
【０１３０】 発現された組換え体zsig28蛋白質（又はキメラzsig28ポリペプチド）は、分画
法、及び／又は通常の蛋白質精製法及び媒体を利用し精製することができる。硫
安沈殿及びSan又はカオトロープ抽出はサンプルの分画に利用できるだろう。精
製段階の例には、ハイドロキシアパタイト、分子篩、FPLC、及び逆送高性能液体
クロマトグラフィーが含まれる。好ましいクロマトグラフィー媒体には、誘導化
デキストラン、アガロース、セルロース、ポリアクリルアミド、特殊シリカ等が
含まれる。PEI、DEAE、QAE及びＱ誘導体が好ましい。
【０１３１】 クロマトグラフィー媒体の例には、フェニル、ブチル、又はオクチル基により
誘導化されたこれら媒体、例えばフェニル−セファロースFF（Pharmacia）、Toy
opearlブチル650（Toso、Hass、Montgomeryville、PA）、オクチル−セファロー
ス（Pharmacia）等；又はAmberchrom CG71(Toso Hass)等の様なポリアクリル性
樹脂が含まれる。好適な固相支持体には、ガラスビーズ、シリカベース樹脂、セ
ルロース性樹脂、アガロースビーズ、架橋アガロースビーズ、ポリスチレンビー
ズ、架橋ポリアクリルアミド樹脂及び、それらが用いられる条件下に不溶性であ
る同等のものが含まれる。
【０１３２】 これら支持体は、アミノ基、カルボキシルキ、スルフィジル基、ヒドロキシル
基及び／又は炭水化物成分により蛋白質の結合を可能にする反応基により修飾さ
れるだろう。共役化学の例にはブロモシアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ
ミド活性化、エポキシド活性化、スルフィジル活性化、ヒドラジド活性化及びカ
ルボジイミド共役化学に関するカルボキシル及びアミノ誘導体が含まれる。
【０１３３】 これら及びその他固体媒体は当分野公知であり、また広く利用されており、市
販品より入手できる。支持媒体への受容体ポリペプチドを結合させる方法は、当
分野既知である。具体的な方法の選択は通常業務の問題であり、選択される支持
体の特性により一部決定される。例えば、Affinity Chromatograpy: Principles
& Methods, Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden, 1988を参照せよ
。
【０１３４】 本発明のポリペプチドは、その生化学的、構造的、及び生物学的特性を活用す
ることで分離できる。例えば、固定化された金属イオン吸収（IMAC)クロマトグ
ラフィーを利用し、ポリヒスチジンタグを含む富ヒスチジン蛋白質を精製するこ
とができる。要約すると、まずゲルに２か金属イオンを付加し、キレートを形成
させる（Sulkowski、Trends in Biochem. 3:1-7,1986)。富ヒスチジン−蛋白質
は、使用する金属イオンに依存し、マトリックスに様々な親和性で吸着され、そ
して競合溶出、pHの低下、又は強キレート剤の利用によって溶出されるだろう。
【０１３５】 その他の精製方法には、レシチン親和性クロマトグラフィー及びイオン交換ク
ロマトグラフィーによるグリコしレート蛋白質の精製が含まれる（Mehtods in E
nzymol., Vol. 182, "Guide to Protein Purification", M. Deutscher,(ed), A
cad. Press, San Diego, 1990, pp.529039)。発明の別の実施態様では、精製を
容易にするために目的のポリペプチド及びアフィニティータグ（例えばマルトー
ス結合蛋白質、免疫グロブリンドメイン）の融合体が構築される。
【０１３６】 更に、当分野記載の方法を用い、ポリペプチド融合体、又はハイブリッドzsig
28蛋白質は、発明のzsig28の領域又はドメインをパラログ（例えば、ヒトOSP-様
蛋白質、オルトログ（例えばマウスOSP又はRVP.1）又は異種蛋白質（Sambrookら
、上記；Altschulら、上記；Picard、 Cur. Opin, Biology, 5:511-5, 1994,及
びその中の参考文献）と組合せ利用することで構築される。これら方法により、
目的のポリペプチド中にあるより大きなドメイン、又は領域の生物学的重要性を
決定できる。これらハイブリッドは、反応動態、結合を変化させ、基質特異性を
抑制し、又は拡張し、ポリペプチドの組織及び細胞局在を変え、また未知構造の
ポリペプチドに応用できる。
【０１３７】 融合蛋白質は、融合蛋白質の成分及びそれらを化学的に結合する成分を別々に
調製することで、当分野熟練者既知の方法により調整できる。あるいは、適当な
リーディングフレーム内にある融合蛋白質の両成分をコードするポリヌクレオチ
ドを既知技術により作製し、ここに記載の方法により発現することもできる。例
えば、生物学的機能を付与するドメインの一部又は全ては、発明のzsig28と別の
ファミリーメンバー由来の機能的に等価なドメインとの間で交換できるだろう。
【０１３８】 この様なドメインには、ここに記載の分泌シグナル配列、膜貫通ドメイン、領
域１ないし４、及びモチーフ１から４が含まれるが、もとよりこれに限定されな
い。この様な融合蛋白質は、構築された融合体に依存して本発明のポリペプチド
、またはそれが融合する蛋白質と同一、又は近似している生物学的に機能的なプ
ロフィールを持つと考えられている。更に、これら融合蛋白質はここに開示され
た様なその他特性を示す。
【０１３９】 標準的分子生物学及びクローニング技術を利用することで、zsig28ポリペプチ
ドおよびそれが融合する相手との間で所望ドメインを交換することができる。 一般に所望ドメイン、例えば上記ドメインをコードするDNA断片は、作用可能
にフレーム内に連結され、ここに記した様な適当な発現ベクター内に挿入される
。この様な融合蛋白質は、こきに記した活性に対し発現でき、分離でき、そして
アッセイできる。
【０１４０】 zsig28ポリペプチド、またはその断片は、化学的合成によっても調製できる。
zsig28ポリペプチドは、モノマー又は多量体である；グリコシル化されているか
非グリコシル化型であり；ペギル化又は非ペギル化状態；及び開始メチオニンア
ミノ酸残基を含まないだろう。
【０１４１】 本発明のポリペプチドは、専用固相合成法、部分固相法、断片濃縮又は古典的
液相合成法によっても合成できる。ポリペプチドの合成方法は当分野公知である
。例えばMerrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149,1963; Laiserら、Anal/ Bioc
hem. 34:595, 1970を参照せよ。固相支持体上での所望ペプチドの全合成後、ペ
プチド−樹脂は樹脂とからポリペプチドを切り離す試薬により処理され、側鎖保
護基の大部分が取り除かれる。この様な方法は当分野でよく確立されている。
【０１４２】 本発明の分子の活性は、特定の型の細胞の増殖及び／又は分化、走化性、接着
、イオンチャンネル流入、pH流、第２メッセンジャーレベルの制御、及び神経伝
達物質放出、細胞運動性、蛋白質結合、アポトーシス等を測定する、各種アッセ
イを利用し測定することができる。例えば“Basic & Clinical Endocrinology S
er., Vol. Vol.3, " Cytochemical Bioassyas: Techniques & Applications, Ch
ayen; Chayen, Bitensky, 編集., Dekker, New York, 1983を参照せよ。
【０１４３】 本発明の分子の活性は、胃腸肝細胞の収縮性の促進、蠕動性、栄養取り込みの
変化、及び／又は消化酵素の分泌を測定する各種アッセイを利用することで測定
できる。特に興味深いことは、平滑筋細胞の収縮性の変化である。例えば、哺乳
動物の十二指腸またはその他胃腸管の平滑筋組織の断片の収縮性反応である（De
poortereら、 J. Gastrointestinal Motility 1:150-159, 1989, 参照され、こ
こに取り込まれている）。インビボアッセイの例では、超音波マイクロメーター
を利用して、弁基部面に対し横方向及び縦方向に、放射状の寸法変化を測定して
いる。
【０１４４】 胃の運動性は、一般に臨床現場においては、胃排出時間、及びその後の胃腸管
を通過する時間として測定される。胃排出スキャンは当業者公知であり、要約す
るとバリウム又は放射性食物の様な経口造影剤を利用する。固形物と液体を別々
に測定でき（例えば99mTc）、接触又は投与後、胃腸管内を通過し、胃が空にな
る時間をガンマカメラを使って視覚化し、測定する（Meyerら、Am.J.Dig.Dis.21
:296,1976;Collinsら、But 24:1117, 1983; Maughanら、Diabet. Med. 13 9 Sup
p. 5:S6-10, 1996及びHorowitzら、Arch. Intern. Med. 145:1467^1472, 1985)
。これら研究は、運動促進剤を投与する前後に実施され、薬物の効果が測定され
る。更に、以下論ずるようにこれらアッセイを使ってインビボでのzsig28アゴニ
スト及びアンタゴニストが試験できる。
【０１４５】 zsig28ポリペプチドの胃内での発現は、zsig28活性の変化が治療的に有効であ
ることを示唆している。この様な変調剤はそれぞれzsig28ポリペプチド活性を促
進又は阻害するアゴニスト又はアンタゴニストである。zsig238活性の変調の効
果は、当分野公知の方法によりアッセイできる。
【０１４６】 Zsig28アゴニスト又はそのアンタゴニストは、例えば胃内に於ける創傷の治癒
の促進に有用である。これら能力を持つzsig28の変調体の存在を証明するために
、本発明のアゴニスト又はアンタゴニストについて、当分野既知の方法により創
傷治癒を促進に関するそれらの能力にに関し評価された。必要であれば、本観点
に関するzsig28ポリペプチドの性能を成長因子受容体、例えばEGF、NGF、TGF-α
、TGF-β、インシュリン、IGF-I、IGF-II、繊維芽細胞成長因子(FGF)等と比較で
きる。更に、zsig28ポリペプチドアゴニスト又はアンタゴニストは、１またはそ
れ以上の成長因子と組合せ評価し、zsig28活性に及ぼす相乗効果を特定すること
ができるだろう。
【０１４７】 更に、zsig28アゴニスト又はアンタゴニストは、抗菌応用に関し治療的に有用
であろう。これら能力を持つzsig28の変調体の存在を検証するために、本発明の
アゴニスト又はアンタゴニストは、当分野既知の方法によってそれらの抗菌特性
に関し評価される。例えばBarsumら、Eur. Respir. J. 8(5): 709-14, 1995; Sa
ndovski-Losicaら、 J. Med. Vet. Mycol.(England) 28(4):279-87, 1990; Mehe
nteeら、J. Gen. Microbiol (England) 135 (pt.8):2181-8,1989; SegalとSavag
e, J.Med. Vet. Mycol. 24:477-479, 1986等を見よ。更に、zsig28アゴニスト又
はそのアンタゴニストは、１またはそれ以上の抗菌剤と組合せ評価し、zsig28ポ
リペプチドを変調に及ぼす相乗効果を特定することができるだろう。
【０１４８】 Zsig28ポリペプチド又はその断片は、zsig28受容体への接着に関し病原菌を遮
断する抗菌剤として、又は細菌性毒素抑制剤として機能できる。この様な膜に関
連、あるいは孔形成メカニズムを開始機能する抗菌剤は、細菌に直接接着し、こ
れを防ぐ。抗菌剤は酵素的メカニズム、砂金の保護物質を破壊すること、又は細
胞壁／その膜を破壊することでも機能できる。上記何れかのメカニズムによる細
菌増殖または機能を阻害することができる、又は細菌の完全性を破壊することが
できる能力は、この抗菌活性に対し感受性である細菌による細胞培養体汚染の防
止方法に於いて有用である。この様な技術は、有効量の該zsig28ポリペプチド、
ポリペプチド断片、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの存在下に細胞を培
養することを含む。あるいは以下記す様に、この様な抗菌剤は直接原因細菌毒素
に結合し、これを効果的に不活性化できる。
【０１４９】 発明のzsig28ポリペプチドは、ヒトの胃及び腸感染の病原菌に役割をはたして
いるかもしれない。Zsig28はClostridium perfringens内毒素（CPE）受容体及
びCPEを結合する関連蛋白質に対し相同性を有している（Katahara, J.ら、J. Ce
ll. Biol. 136:1239-1247, 1998;及びKatahira, J.ら、 J.Biol. Chem. 272:265
2-26658, 1997)。同様に、zsig28はCPE又は、ここではまとめて”細菌毒素”と
して期されるその他細菌内毒素、又は外毒素に結合する。例えば、これら細菌毒
素は食物毒、ボツリヌス中毒、重症の下痢、炎症、痙攣等の様な病気を起こす細
菌によって産生される（例えば、ブドウ球菌、腸毒素性大腸菌、キャンビロバク
ター、Clostridium botulinum等）。
【０１５０】 更に受容体としてzsig28はコロニー形成の部位となり、その結果胃内の病原性
細菌の病原作用を生ずるだろう。例えば、Helicoacter pyloriは胃潰瘍の原因菌
であるが、zsig28に対する結合及びアポトーシス及びその他メカニズムによる細
胞死の誘導により、その作用を発揮するだろう。zsig28に関するこの様な役割は
、当業者により推測できるだろう。例えば、通常は細菌毒素に対し非感受性であ
る哺乳動物細胞をzsig28でトランスフェクトし、細菌毒素に対する感受性につい
て試験できる（Katahara, J.ら、上記、及びKatahara, J.ら、上記を見よ）。
【０１５１】 非トランスフェクト細胞と平行的に比較することにより、感受性であるzsig28
発現細胞は、（小胞化）の様な細胞死に特異的な形態変化、溶解、及び非トラン
スフェクトコントロールに比べ細胞数が少ないことから測定できる。あるいは、
放射性標識又は蛍光標識された細菌毒素の直接結合を測定するアッセイを実施し
、zsig28発現細胞への直接結合を測定することができる。同様に、上記に開示し
たこれらアッセイを利用し、全細菌細胞に関し、その結合能力又はzsig28ポリペ
プチド発現細胞の溶解能力について試験できる。
【０１５２】 即ち、zsig28ポリペプチド又はそのアゴニストは、細菌、ウイルス又は真菌感
染の様な外来性細菌感染のインビトロ研究に於いて、細胞培養試薬として利用で
きるだろう。これら成分は感染のインビボ動物モデルにも利用できるだろう。ま
た、zsig28ポリペプチド又はそのアゴニストの細菌−接着特性を結合アッセイ等
に於いて各種条件下に研究できる。
【０１５３】 受容体として、zsig28ポリペプチドの活性は、細胞外の酸度、又は受容体結合
に関連したプロトン分泌及びその後の生理学的細胞反応を測定するシリコンをベ
ースとするバイオセンサーマイクロフィジオメーターにより測定できる。装置の
例としてはMolecular Devices, Sunnyvale, CA製造のCytosensorTMマイクロフィ
ジオメーター がある。細胞増殖、イオン輸送、エネルギー産生、炎症反応、制
御又は受容体活性化等の各種細胞反応は、この方法で測定できる。例えばMcConn
ell, H.M.ら、Science 257: 1906-1912, 1992: Pitchford, Sら、Meth. Enymol.
228:84-108, 1997; Arimilli, S.ら、J.Immunol. Meth. 212:40-59, 1998; Van
Liefde, I.ら、Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998を見よ。
【０１５４】 マイクロフィジオメーターは真核生物、前核生物、接着性又は非接着性細胞の
アッセイに利用できる。細胞培地中の細胞外酸度変化を経時的に測定することで
、マイクロフィジオメーターはzsig8ポリペプチドのアゴニスト、リガンド、又
はアゴニストを含む各種刺激に対する細胞反応を直接測定する。好ましくは、マ
イクロフィジオメーターを用い、zsig28発現真核細胞の反応を、コントロールの
zsig28ポリペプチドを発現していないコントロールの真核細胞と比較し測定する
。Zsig28発現真核細胞は、ここに記した如くに、その中にzsig28がトランスフェ
クトされた細胞を含み、zsig28変調刺激に対し反応する細胞を作り、又は胃組織
由来のzsig28発現細胞の様なzsig28を天然に発現する細胞である。
【０１５５】 細胞外酸度の増加又は減少として測定される、コントロールとzsig28を発現し
ている細胞の反応の差は、zsig28変調細胞反応の直接測定値である。更に、この
様なzsig28変調反応は各種刺激下にアッセイできる。また、マイクロフィジオメ
ーターを利用し、zsig28ポリペプチドを発現している細胞を提供し、試験化合物
が存在しない状態で細胞の第１部分を培養し、試験化合物が存在する状態で細胞
の第２部分を培養し、そして細胞の第１部分に比べた細胞の第２部分の細胞反応
の増加又は減少を検出することを含む、zsig28ポリペプチドのアゴニスト及びア
ンタゴニストを同定する方法が提供される。この方法を利用することで、zsig28
ポリペプチドの天然リガンドを含むアンタゴニスト及びアゴニストを同定できる
。
【０１５６】 本発明の蛋白質をアッセイするインビボの方法は、ウイルス供給システムを含
む。本牧的のウイルスの例には、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニ
アウイルス、レトロウイルス、及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）が含まれる。
アデノウイルスは２本鎖DNAウイルスで、現在最も研究されている異種核酸の供
給に関する遺伝子輸送ベクターである（レビューとしては、Beckerら、Meth. Ce
ll Biol. 43: 161-189, 1994;及びDouglasとGuriel、Sciuence & Medicine 4: 4
4-53, 1997を見よ）。
【０１５７】 アデノウイルスシステムは、幾つかの利点を有する：アデノウイルスは(i)比
較的大きなDNA挿入体に適合しており；(ii)高力価まで増殖し、(iii)広範囲の哺
乳動物細胞に感染し、そしてIiV)各種プロモーターを含む数多くの入手可能なベ
クターに利用できる。また、アデノウイルスは血液中で安定であることから、そ
れらは静脈注射により投与することができる。
【０１５８】 アデノウイルスゲノムの一部を欠失させることで、より大きな異種DNA挿入体
（7kbまで）に適合できる。これら挿入体は、直接接続、又はコトランスフェク
トしたプラスミドとの相同的組み換えによってウイルスDNA内に取り込ませるこ
とができる。例示的システムでは、必須E1遺伝子をウイルスベクターより欠失さ
せると、E1遺伝子が宿主細胞（例えばヒト293細胞株）から提供されるまでウイ
ルスは複製しなくなる。
【０１５９】 無償の動物に静脈投与した場合、アデノウイルスは主に肝臓を標的とする。ア
デノウイルス供給システムがE1遺伝子を欠失している場合、ウイルスは宿主細胞
内では複製できない。しかし、宿主組織（例えば肝臓）は異種蛋白質を発現し、
また加工（ならびにシグナル配列がある場合には分泌し）するだろう。分泌され
た蛋白質は高度に血管形成された肝臓内の血流に入り、そして感染動物に対する
作用を決定することができる。
【０１６０】 更に、各種ウイルス遺伝子の欠失を持つアデノウイルスベクターを利用し、ベ
クターに対する免疫反応を除く試みができる。この様なアデノウイルスはE1欠失
であり、また更にE2A又はE4の欠失も含む（Lusky、Mら、J. Virol. 72:2022-203
2,1998, Raper, S.E.ら、Human Gene Therapy 9:671-679, 1998)。更に、E2bの
欠失は免疫反応を低下させると報告されている（Amalfitano, A.ら、J. Virol.
72:926-933,1998)。更に、全アデノウイルスゲノムを欠失させることで、非常に
大きな異種DNAの挿入に対応できる。全てのウイルス遺伝子が欠失した”gutless
"と呼ばれるアデノウイルスの生成は、異種DNAの大きな挿入には特に有益である
。レビューとしては、Yeh、P.とPerricaudet, M., FASEB J. 11:615-623, 1997
を見よ。
【０１６１】 アデノウイルスシステムはインビトロでの蛋白質産生にも利用できる。アデノ
ウイルスを感染させた非293細胞を、細胞が迅速に分裂しない条件下に培養する
ことで、細胞は長時間にわたり蛋白質を産生することができる。例えば、BHK細
胞は細胞向上内にて周密的に増殖され、次に問題の分泌蛋白質をコードするアデ
ノウイルスベクターに曝される。続いて細胞は、感染細胞が数週間明瞭な細胞分
裂なしに生存できる無血清状態下に増殖される。
【０１６２】 あるいは、アデノウイルスベクターが感染した293細胞は、比較的高細胞密度
で接着細胞として、又は懸濁細胞中に増殖し、大量の蛋白質を産生することがで
きる（Garnierら、Cytotechnol.15:145-55, 1994参照)。いずれのプロトコール
でも、発現され、分泌された異種蛋白質は、発現蛋白質の細胞内での蓄積状態に
よって細胞培養上清、溶解体、または膜分画から繰り返し分離できる。感染293
細胞産生プロトコールでは、非分泌型蛋白質も効果的に得ることができるだろう
。
【０１６３】 受容体として、zsig28ポリペプチドの活性化は、細胞外の酸度、又は受容体結
合に関連したプロトン分泌及びその後の生理学的細胞反応を測定するシリコンを
ベースとするバイオセンサーマイクロフィジオメーターにより測定できる。装置
の例としてはMolecular Devices, Sunnyvale, CA製造のCytosensorTMマイクロフ
ィジオメーター がある。細胞増殖、イオン輸送、エネルギー産生、炎症反応、
制御又は受容体活性化等の各種細胞反応は、この方法で測定できる。
【０１６４】 例えばMcConnell, H.M.ら、Science 257: 1906-1912, 1992: Pitchford, Sら
、Meth. Enymol. 228:84-108, 1997; Arimilli, S.ら、J.Immunol. Meth. 212:4
0-59, 1998; Van Liefde, I.ら、Eur. J. Pharmacol. 346:87-95, 1998を見よ。
マイクロフィジオメーターは接着性又は非接着性の真核生物、前核生物のアッセ
イに利用できる。細胞培地中の細胞外酸度変化を経時的に測定することで、マイ
クロフィジオメーターはzsig8ポリペプチドのアゴニスト、リガンド、又はアゴ
ニストを含む各種刺激に対する細胞反応を直接測定する。
【０１６５】 好ましくは、マイクロフィジオメーターを用い、zsig28発現真核細胞の反応を
、コントロールのzsig28ポリペプチドを発現していないコントロールの真核細胞
と比較し測定する。Zsig28発現している真核細胞は、ここに記した如くに、その
中にzsig28がトランスフェクトされた細胞を含み、zsig28変調刺激に対し反応す
る細胞を作り、又は胃組織由来のzsig28発現細胞の様なzsig28を天然に発現する
細胞である。細胞外酸度の増加又は減少として測定される、コントロールとzsig
28を発現している細胞の反応の差は、zsig28変調細胞反応の直接測定値である。
更に、この様なzsig28変調反応は各種刺激下にアッセイできる。
【０１６６】 また、マイクロフィジオメーターを利用し、zsig28ポリペプチドを発現してい
る細胞を提供し、試験化合物が存在しない状態で細胞の第１部分を培養し、試験
化合物が存在する状態で細胞の第２部分を培養し、そして細胞の第１部分に比べ
た細胞の第２部分の細胞反応の増加又は減少を検出することを含む、zsig28ポリ
ペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストを同定する方法が提供される。この方
法を利用することで、zsig28ポリペプチドの天然リガンドを含むアンタゴニスト
及びアゴニストを迅速に同定できる。
【０１６７】 zsig28ポリペプチド、又はそのポリペプチド断片は、免疫グロブリン重鎖定常
域、典型的には２カ所の定常域ドメインを持ち、可変域を欠いているFc断片との
融合体として発現できる。この様な融合体の調整方法は米国特許第5,155,027号
及び5,567,584号に開示されている。この様な融合体は、典型的にはFc部分が相
互にジスルフィド結合し、２つの非Igポリペプチドが相互に基部で近接して整列
している多量体分子として分泌される。このタイプの融合体は、インビトロアッ
セイの道具として親和性精製様のリガンドとして利用できる。アッセイでの利用
に関しては、キメラがFc域を開始支持体に結合され、酵素結合免疫吸着アッセイ
（ELISA）形式に利用される。
【０１６８】 zsig28ポリペプチドは、それが結合するリガンドの精製にも利用できる。zsig
28ポリペプチド又はそのリガンド結合ポリペプチド断片が利用できる。ポリペプ
チドはアガロースのビーズ、交叉結合アガロース、ガラス、セルロース製樹脂、
シリカをベースとする樹脂、ポリスチレン、交叉結合ポリアクリアルアミド、又
は利用条件下に安定である同等物質の様な個体支持体上に固定される。
【０１６９】 個体支持体へポリペプチドを結合するための方法はあ当分野既知であり、アミ
ン化学、臭化シアン活性化、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化、エポキシ活
性化、スルフヒドリル活性化、及びヒロラジド活性化を含む。得られた媒体は一
般にはカラム形状に成形され、リガンドを含む溶液をカラム内に１回またはそれ
以上の回数通し、リガンドを受容体ポリペプチドに結合させる。次にリガンドは
、塩濃度、カオトロピック剤（グアニジン塩酸）又はpHを変化しリガンド−受容
体結合を破壊することで溶出される。
【０１７０】 zsig28の様なリガンド結合受容体（又は抗体、相補体／抗相補体対の一方）又
はその結合断片を利用するアッセイシステム、ならびに市販のバイオセンサー装
置（BIAcore、Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ)は、有益に利用されるだ
ろう。この様な受容体、抗体、相補体／抗相補体対のメンバー、又は断片は受容
体チップ表面に固定化される。本装置の利用は、Karlsson、 J. Immunol. Metho
ds, 145:229-40, 1991及びCunninghamとWells、 J. Mol. Biol. 234:554-63, 19
93により開示されている。
【０１７１】 受容体、抗体、メンバー又は断片は、アミン又はスルフヒドリル化学を利用し
、フローセル内に金製フィルムに結合されているデキストランフィルターに共有
結合する。試験サンプルはセル内を通過する。リガンド、エピトープ、又は相補
体／抗相補体対の反対のメンバーがサンプル内に存在しているれば、それはそれ
ぞれ固定化された受容体、抗体又はメンバーに結合し、媒体の屈折性に変化をも
たらし、その変化は金製フィルムの表面のプラスモン共鳴の変化として検出され
る。このシステムによりオン及びオフ速度が決定でき、それより結合親和性を計
算し、結合の化学量論を検討することができる。
【０１７２】 リガンド結合受容体ポリペプチドは、当分野既知のその他アッセイシステム内
に利用できる。この様なシステムには、結合親和性の決定に関するスキャチャー
ドプロット分析（Scatchard, Ann. NY Acad. Sci. 51: 660-72, 1949参照）熱量
計アッセイ（Cunnighamら、Science 253;545-48, 1991; Cunnighamら、Science
245:821-25, 1991）。
【０１７３】 Zsig28ポリペプチドはzsig28エピトープ、ペプチド又はポリペプチドに結合す
る抗体の調製にも利用できる。zsig28ポリペプチド又はその断片は、抗原（免疫
源）として機能し、動物に接種され、免疫反応を誘導する。当業者は、抗原性の
あるエピトープを持ったポリペプチドが、zsig28ポリペプチドの（例えば配列番
号２）の少なくとも６、好ましくは少なくとも９，そしてより好ましくは少なく
とも15ないし約30の連続するアミノ酸残基を含むことを認識するだろう。zsig28
のより大きな部分、即ち30ないし10残基からアミノ酸配列の全長を含むポリペプ
チドが含まれる。
【０１７４】 抗原又は免疫原性エピトープは、ここに記す様な結合されたタグ、アジュバン
ト、及びキャリアーも含むことができる。好適抗原は、アミノ酸番号24（Ala)な
いし261（Val)、又は連続する９ないし238AAのそのアミノ酸断片 。抗原としての利用に好ましいペプチドは、ここに開示した領域１、２，３及び
４ 、ならびに疎水性プロットより当業者により推測される様なzsig28の親水性
ペプチドである（図２参照）。
【０１７５】 Zsig28親水性ペプチドには、（１）配列番号２のアミノ酸番号245（Ala）ない
しアミノ酸番号250（Glu）；（２）配列番号２のアミノ酸番号234（Asn）ないし
アミノ酸番号239（Lys）：（３）配列番号２のアミノ酸番号202（Glu）ないしア
ミノ酸番号207（Lys）；（４）配列番号２のアミノ酸番号254（Lys）ないしアミ
ノ酸番号259（Asp）；及び（５）配列番号２のアミノ酸番号110（Glu）ないしア
ミノ酸番号115（Ala）より成るグループから選択されるアミノ酸配列を含むペプ
チドを右組む。更に、保存モチーフ、及びzsig28保存モチール間の可変域は好適
抗原である。
【０１７６】 これら交点を動物に接種し生じた免疫反応より得た抗体は、ここに記すように
して分離、精製できる。ポリクローナル及びモノクローナル抗体の調製方法は当
分野公知である。例えばCurrent Protocols in Immunology, Cooligan,ら、（編
集）、National Institutes of Heaoth, John Wiley and Sons, Inc., 1995; Sa
mbrookら、Molecular Clonign: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold S
pring Harbor, NY, 1985;及びHurell, J. G.R., Ed., Monoclonal Hybridoma An
tibodies: Techniques and Applications, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL,
1982を見よ。
【０１７７】 当業者に明らかなように、ポリクローナル抗体は、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ
、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス及びラットの様な各種温血動物からzsig28ポ
リペプチド又はその断片を使い作製できる。zsig28ポリペプチドの免疫原性は、
アルム（水酸化アルミニウム）又はフレンドの完全又は不完全アジュバントの様
なアジュバントを利用することで、高められるだろう。
【０１７８】 免疫化に有用なポリペプチドには、zsig28融合体又はその一部と免疫グロブリ
ンポリペプチドとの、あるいはマルトース結合蛋白質との融合体の様な融合ポリ
ペプチドも含まれる。ポリペプチド免疫源は完全長分子又はその部分であろう。
ポリペプチド部分が”ハプテン様”部分である場合、それら部分は免疫化に適し
た高分子キャリアー（スカシガイヘモシアニン（KLH）、ウシ血清アルブミン（B
SA）又は破傷風毒素）に有利に結合、あるいは連結されるだろう。
【０１７９】 ここで使用される場合、用語”抗体”にはポリクローナル抗体、アフィニティ
ー精製ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、及びF(ab')2やFab断片の様な
その抗原結合性断片がふくまれる。一般にキメラ抗体やFv断片、単鎖抗体等の遺
伝的に加工された抗体又は断片、ならびに合成抗原結合ペプチド及びポリペプチ
ドも含まれる。
【０１８０】 非ヒト抗体は、非ヒト型CDRsだけをヒト型フレームワーク及び定常域に移植す
るか、又は全非ヒト型可変ドメイン（随意露出残基を地下してヒト型の表面で“
覆い”、“化粧”した抗体とする）を取り込むことによ、ヒト化することができ
る。幾つかの例では、ヒト化抗体はヒト型可変域フレームワークドメイン中に非
ヒト化残基を保持することで、適当な結合特性を増強するだろう。抗体のヒト化
を通じて、生物学的半減期が延長し、ヒトへの投与に関する有害免疫反応の可能
性が減る。
【０１８１】 更に、ヒト抗体はWIPO公開WO98/24893号に開示の如くの特定のヒトの免疫グロ
ブリン遺伝子を含む様に加工されたトランスジェニック、非ヒト動物に作らせる
こともできる。これら動物の内因性の免疫グロブリン遺伝子は不活性化されるか
、相同的組み換えにより取り除かれることが望ましい。抗体は１）それらが結合
活性の閾値を示し、そして２）それらが関連ポリペプチド分子と交叉反応しない
場合に特異的に結合すると考えられる。
【０１８２】 結合の閾値は、ここに開示した抗zsig28抗体がコントロール（非zsig28）ポリ
ペプチドに対する結合親和性に比べ、少なくとも10倍以上の親和性を持ってzsig
28ポリペプチド、ペプチド、又はエピトープに結合した場合に決定できる。抗体
は特異的に結合するとされる。抗体が106/M以上、好ましくは107/M以上、より好
ましくは108/M以上、最も好ましくは109/M以上の結合親和性（Ka）を持つことが
好ましい。抗体の親和性は、当業者により、例えばScatchard分析（Scatchard,
G., Ann. NY Acad. Sci. 51:660-672, 1949）によって容易に決定できる。
【０１８３】 抗zsig28抗体が関連ポリペプチド分子と交叉反応するか否かは、例えば標準的
ウエスタンブロット法（Ausubelら、上記）により、抗体がzsig28ポリペプチド
は検出されるが既知関連ポリペプチドは検出されないことで示される。既知関連
ポリペプチドの例は、例えば既知オルトログ及びパラログの様な従来技術により
開示されたもの、及び蛋白質ファミリーの類似性が知られているメンバー、ポリ
ペプチド、又は断片等である。
【０１８４】 例えばzsig28特異的抗体は、ヒトOSP-様蛋白質、クラウジン１、クラウジン２
マウスCPE受容体等とは結合しないだろう。更に、抗体は、既知ポリペプチドに
対し”スクリーニング”でき、発明のポリペプチドに特異的に結合する集団を分
離することができる。例えば、zsig28に対し作製された抗体は不溶性マトリック
スに接着された関連ポリペプチドに吸収される；zsig28に特異的である抗体は適
当な緩衝液条件によりマトリックスを流れ出る。
【０１８５】 スクリーニングにより、既知の近い関係にあるポリペプチドと交叉反応しない
ポリクローナル及びモノクローナル抗体の分離ができる（Antibodies: A Labora
tory Manual, HarlowとLane(編集）、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1
988； Current Protocols in Immunology, Cooliganら、（編集）、National In
stitutes of Heaoth, John Wiley and Sons, Inc., 1995)。
【０１８６】 特異抗体のスクリーニング及び分離は当分野公知である。Fundamental Immuno
logy, Paul（編集） Raven Press, 1993; Getzoffら、Adv. in Immunol. 43: 1-
98, 1988; Monoclonal Anitbodies: Princip;les and Practice, Goding, J. W.
(編集）、Academic Press Lte., 1996, Benjaminら、 Ann. Rev. Immunol, 2: 6
7-101,1984を見よ。特異的結合抗zsig28抗体は、当分野既知、及び以下開示され
る多くの方法により検出できる。
【０１８７】 zsig28蛋白質又はポリペプチドに結合する抗体の検出に利用できる数多くの方
法が当分野で知られている。アッセイの例はAntibodies: A Laboratory Manual,
HarlowとLane(編集）、Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988に詳細に
記載されている。この様なアッセイの代表例には、対抗免疫電気泳動法、放射−
免疫アッセイ、放射−免疫沈降法、酵素−結合免疫吸着アッセイ（ELISA）、ド
ットブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、阻害又は競合アッセイ、
及びサンドイッチアッセイが含まれる。更に、抗体は野生型対変異型zsig28蛋白
質又はポリペプチドへの結合についてスクリーニングできる。
【０１８８】 ここで有用な抗体の作製又は選別に適した別の方法には、リンパ細胞をzsig28
蛋白質又はペプチドにインビトロ曝露、及びファージ又は同様のベクターの抗体
ディスプレーライブラリーの選別（例えば、固定化された、又は標識されたzsig
28蛋白質又はペプチドを使った）が含まれる。潜在的なzsig28ポリペプチド結合
ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージディ
スプレー）又は大腸菌のような細菌上に提示されるランダムペプチドライブラリ
ーをスクリーニングすることで得ることができる。ポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列は、ランダム突然変異導入法やランダムポリヌクレオチド合成法
の様な幾つかの方法によって得ることができる。
【０１８９】 これらランダムペプチドディスプレーライブラリーは、リガンド又は重油体の
様な蛋白質、又はポリペプチド、生物学的又は合成による高分子、もしくは有機
又は無機基質である既知標的と相互茶寮するペプチドのスクリーニングに利用で
きる。この様なランダムペプチドディスプレーライブラリーを作製し、スクリー
ニングする技術は当分野既知である（Ladnerら、米国特許第5,223,409号；Ladne
rら。
【０１９０】 米国特許第4,946,778号、Ladner米国特許第5,571,698号）、またランダムペプ
チドディスプレーライブラリー及びこれらライブラリーをスクリーニングするキ
ットは、例えばClontech（Palo Alto, CA）、Invitrogen Inc.(San Diego, CA),
New England Biolabs, Inc.(Beverly, MA及びPharmacia LKB Biotechnology In
c. (Piscataway, NJ)から市販されている。ランダムペプチドディスプレーライ
ブラリーは、ここに開示されたzsig28配列を利用しスクリーニングし、zsig28に
結合右する蛋白質を特定することができる。
【０１９１】 zsig28ポリペプチドと相互作用するこれら”結合ポリペプチド”は細胞の標的
化；親和性精製によるホモログポリペプチドの分離に利用でき；それらは薬物、
毒素、放射性核種等に直接又は間接的に結合させることができる。これら結合ポ
リペプチドは、発現ライブラリーのスクリーニングの様な分析法にも、また活性
の中和、例えばリガンドと受容体間の相互作用の遮断、又はウイルスの受容体へ
の結合の遮断にも利用できる。結合ポリペプチドは基礎病理又は疾患のマーカー
として可溶性zsig28ポリペプチドを検出又は定量化するのに適した、zsig28ポリ
ペプチドの血中レベルを決定するための診断アッセイにも利用できる。これら結
合ポリペプチドは、zsig28”アンタゴニスト”としても機能でき、インビトロ及
びインビボでのzsig28結合、及びシグナル伝達を遮断できる。
【０１９２】 これら抗zsig28結合ポリペプチドは、zsig28活性又は蛋白質結合の阻害に有用
であろう。zsig28に対する抗体は、zsig28を発現する細胞の標的化、親和性精製
によるzsig28の分離；正常組織中のzsig28ポリペプチドのレベルを決定する診断
アッセイ；基礎病理又は疾患のマーカーとしてのzsig28の検出又は定量；FACSを
利用した分析方法；発現ライブラリーのスクリーニング；抗イディオタイプ抗体
の作製；及びインビボ及びインビトロに於けるzsig28活性を遮断する中和抗体又
はアンタゴニストとして利用することができるだろう。
【０１９３】 好適な直接タグ又は標識体には、放射線核種、酵素、基質、コファクター、阻
害剤、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子等が含まれる；間接タグ又は
標識体としては中間体としてビオチン−アビジン、又はその他相補体／抗相補体
対を利用するだろう。ここの抗体は、薬物、毒素、放射線核種等により直接又は
間接に標識され、これら標識体はインビボでの診断又は治療応用に用いられるだ
ろう。更に、zsig28又はその断片に対する抗体は、インビトロで用いられ、変性
zsig28又はその断片を、例えばウエスタンブロットの様なアッセイ、あるいはそ
の他当分野既知のアッセイにて検出するだろう。
【０１９４】 ここの抗体又はポリペプチドは薬物、毒素、放射性核種を直接、又は間接に標
識でき、そしてこれら標識体はインビボ診断又は治療応用に用いられるだろう。
例えば、ポリペプチド又は抗体、あるいは本発明のzsig28を認識する結合ポリペ
プチドは対応する抗相補的分子（例えばzsig28受容体）を発現する組織又は器官
の同定、又は治療に利用できる。より具体的には、抗zsig28抗体、又はその生物
活性断片あるいは一部は、検出可能な、あるいは細胞傷害性分子に結合でき、zs
ig28分子を発現している細胞、組織又は器官を持つ哺乳動物に供給される。
【０１９５】 好適な検出可能分子は、zsig28に結合するポリペプチド（“結合ポリペプチド
”）、抗体又はその生物活性断片あるいは一部に直接又は間接に結合されるだろ
う。好適な検出可能分子には、放射線核種、酵素、基質、コファクター、阻害剤
、蛍光マーカー、化学発光マーカー、磁性粒子等が含まれる。好適な細胞障害性
分子は、ポリペプチド又は抗体に直接又は間接に結合され、細菌又は植物性毒素
（例えばジフテリア毒素、シュードモナス外毒素、リシン、アルビン等）及びヨ
ード131、レニウム188、またはイットリウム-90の様な治療放射線核種（ポリペ
プチド又は抗体に直接結合するか、又は例えばキレート成分を開始間接的に結合
する）が含まれる。
【０１９６】 結合ポリペプチド又は抗体は、アドリアマイシンの様な細胞傷害性薬物にも結
合されるだろう。検出可能又は細胞障害性分子の間接結合に関しては、検出可能
又は細胞傷害性分子は、相補体／抗相補体対の一方のメンバーに結合され、もう
一方のメンバーは結合ポリペプチド、又は抗体部分に結合される。これらの目的
には、ビオチン／ストレプトアビジンが相補体／抗相補体対の例である。
【０１９７】 別の実施態様では、結合ポリペプチド−毒素融合蛋白質又は抗体−毒素融合蛋
白質が細胞の標的化、又は組織阻害もしくは除去（例えば、癌細胞又は組織の治
療）に利用できる。あるいは、結合ポリペプチドが複数の機能ドメイン（即ち、
活性化ドメイン又はリガンド結合ドメイン＋標的ドメイン）を持つ場合には、標
的ドメインのみを持つ融合蛋白質は、検出可能分子、細胞傷害性分子又は相補的
分子を問題の細胞又は組織に対する方向付けするのに好適であろう。融合蛋白質
が相補的分子のみを含む場合、抗相補的分子は、検出可能又は細胞傷害性分子に
結合できる。この様なドメイン−相補性分子融合蛋白質は、一般的な構想補体-
検出可能／細胞傷害性分子共役体の細胞／組織特異的供給に関する、包括的な標
的ビークルである。
【０１９８】 別の実施態様では、zsig28結合ポリペプチド−サイトカイン又は抗体サイトカ
イン融合蛋白質は、結合ポリペプチド−サイトカイン又は抗zsig28抗体が増殖性
に富む血液又は骨髄細胞を標的とする場合には、インビボに於ける標的組織の殺
滅の促進に利用できる（例えば、血液、胃、結腸、及び骨髄癌）（一般的にはHo
rnickら、Blood 89:443-47, 1997。例えばHornickらは、サイトカインを作用が
望まれる部位に方向付けでき、それによりサイトカインの局所濃度を上げること
ができる融合蛋白質を報告している。
【０１９９】 好適な抗zsig28抗体は、望ましくない細胞又は組織を標的とし（即ち、腫瘍又
は白血病）、融合サイトカインはエフェクター細胞による改善された標的細胞溶
解を伝達した。この目的に適した好適サイトカインには例えばインターロイキン
２及び顆粒球−マクロファージコロニー形成刺激因子（GM-CSF）が含まれる。 あるいは、ここに記したzsig28結合ポリペプチド又は抗体融合蛋白質は、zsig
28変調アポトーシス経路を直接刺激することで、標的組織のインビボでの殺滅を
促進し、結果としてzsig28を発現している低増殖性細胞に細胞死を起こさせるこ
とに利用できる。
【０２００】 ここに記した生物学的結合ポリペプチド又は抗体標識体は経口、静脈内、動脈
内、又は管内に供与でき、あるいは作用の目的部位に局所的に導入できるだろう
。本発明の分子は、胃腸管機能、蠕動運動、粘液分泌等に関係っするリガンドの
同定及び分離に利用できる。例えば本発明の蛋白質及びペプチドは結腸及び結腸
上に置かれた組織標本上に固定することができる (Immobilized Affinity Ligan
d Techniques, Hermanson et al., eds., Academic Press, San Diego, CA, 199
2, pp.195-202)。蛋白質及びペプチドは放射線標識(Methods in Enzymol.,vol.
182, "Guide to Protein Purification", M.Deutscher, ed., Acad. Press, San
Diego, 1990, 721-37)又はフォトアフィニティー標識もでき(Brunner et al., Ann. Rev. Biochem.62 :483-514, 1993 and Fedan et al., Biochem. Pharmacol.
33:1167-80, 1984)、また特異的リガンド蛋白質も同定できる。
【０２０１】 本発明のポリペプチド、核酸及び／又は抗体は、胃腸管細胞の収縮性、消化酵
素及び酸の分泌、胃腸管運動、消化酵素の補充に伴う疾患の治療；炎症、特に胃
腸管系に影響する炎症；逆流性疾患及び栄養吸収制御に関する疾患の治療に利用
できる。本発明の分子による治療が有益である具体的状態は、糖尿病性胃不全麻
痺、手術後胃不全麻痺、迷走神経切離、慢性本態性偽腸閉塞及び胃食道逆流疾患
を含むが、これに限定されない。その他の利用としては、放射線検査時の胃の排
泄、胆嚢収縮の刺激、幽門洞切除が含まれる。
【０２０２】 本発明の分子の運動性及び神経性作用は、肥満及び神経フィードバックが栄養
吸収を変えるその他の代謝性疾患の治療に有用である。本発明の分子は、満腹感
、グルコース吸収及び代謝、ならびに神経疾患関連胃腸管障害の制御に有用であ
る。 本発明の分子はグルコースを含む低血糖治療薬の添加物、及び迅速な栄養作用
が求められる経口薬の吸収促進剤としても有用である。更に、本発明の分子は、
グルコース誘導インシュリン放出の促進にも利用できる。
【０２０３】 本発明のポリペプチド、核酸及び／又は抗体は、胃潰瘍、細菌性疾患、胃排出
及び機能、粘膜修復、及び分泌、胃癌、悪心（例えば癌治療又はオピエート疼痛
管理により誘導される）、胃酸分泌、胃炎、外傷、憩室炎、胃粘膜炎、又は空腹
感を伴う疾患の治療、診断又は予防に利用できる。本発明の分子は、天然のリガ
ンドを含むzsig28の変調剤の分離、遺伝子治療、又は胃及び肺の様な各種組織中
の病的状態の発生の治療又は防止に利用できる。
【０２０４】 更に、zsig28ポリペプチド又はそのアゴニストもしくはアンタゴニストは、粘
膜の増殖、組成、又は健全性、あるいは粘膜清浄機能にも有用であると考えられ
る。この様な変調剤は、粘膜の健全性を下げ、細菌−粘液相互作用へのその関わ
りを評価する様な、インビトロ研究に於ける粘液組成又は健全性の変更にとって
有用であろう。更に、この様な変調剤は、不適当な粘液産生、組成又は健全性を
特徴とする疾患状態の治療に有用であろう。例えば、嚢胞性繊維症は粘液の脱水
を伴い、それが粘膜を薄くする（粘度の低下）。慢性閉塞性肺疾患、喘息等のそ
の他の疾患には、慢性的な粘液分泌亢進が認められる。
【０２０５】 例えばPrescott ら、 Ugeskr Laeger 158(45): 6456-60, 1996; Gordon, Ear
Nose Throat J. 75(2): 97-101, 1996; and Jeffery, Am. J. Respir. Crit. Ca
reMed. 150(5 Pt 2): S6-13, 1994を見よ。また、慢性閉塞性肺疾患及び鼻腔内
炎症性疾患には粘液の流体学又は厚さの変化が伴う。例えばAgliati, J. Int. M
ed. Res. 24(3): 302-10, 1996 及び Wippold et al.,Allergy Proc. 16(4): 16
5-9, 1995を見よ。更に、粘液の構造健全性は、恐らく蛋白質分解性の亢進を介
した、炎症性大腸疾患により悪影響を受ける。例えばPlayford ら、 Amer. J. P
athol. 146(2): 310-6, 1995を見よ。慢性の閉塞性肺疾患の特定の型には酸性粘
液の増加が伴う。例えばJeffery、上記を見よ。粘液清浄化は、これら疾患の多
くで有用であろう。
【０２０６】 zsig28ポリペプチドは胃内で発現している。受容体として、zsig28は正常胃上
皮と機能の維持に重要な役割を果たすことができる。即ち、本発明のzsig28ポリ
ペプチド医薬組成体、アゴニスト、及びアンタゴニストは、胃粘膜炎の予防又は
治療にも有用であろう。粘膜炎は、口腔内又は胃の上皮の健全性の損傷、及び消
失により現れる。粘膜炎は化学療法及び放射線治療によってしばしば誘導され、
またこれら治療を受けている癌患者では、しばしば投薬制限をもたらす副作用で
あり、同時に死亡率の原因でもある。
【０２０７】 zsig28ポリペプチド及び本発明のアゴニスト及びアンタゴニストは、幾つかの
成長因子及びサイトカイン、例えばインターロイキンと類似の様式にて胃粘膜炎
に対する保護を提供するだろう(Orazi, A. et al., Lab.Invest. 75:33-42, 199
6)。胃粘膜炎の予防又は治療に於けるzsig28、アゴニスト及びアンタゴニストの
作用は例えば当分野記載の方法を利用したシリアンハムスターモデル、又はマウ
スモデルの様なインビボ動物モデルで測定できる(Sonis, S.T.ら、 Oral Surg.
Oral Med. Oral Pathol. 69:437-443, 1990;Farrell, C.L. ら、 Cancer Res. 58 :933-939, 1998; Orazi, A. et al.,上記)。
【０２０８】 更に、zsig28トランスジェニック又はノックアウトマウスは、胃粘膜炎に関す
る別のインビボモデルを提供するだろう。 本発明のzsig28ポリペプチド、アゴニスト、又はアンタゴニストのこれら能力
を検証するために、当分野既知の方法により粘膜健全性維持活性についてzsig28
ポリペプチド、アゴニスト、又はアンタゴニストを評価した。例えば粘液の粘度
特性と表面特性を測定し、さらに咳と繊毛活動度から粘液移動を評価する方法を
記しているZahm ら、 Eur. Respir. J. 8:381-6, 1995を見よ。粘液の特性を評
価するその他方法は当業者に知られている。これらあっせいには、ムチン含有量
、水分含有量、炭水化物含有量、内因性の緩衝能、酸性度、バリアー特性、水吸
収能等の測定が含まれる。
【０２０９】 更に不適切な粘液蓄積、組成又は特性を特徴とする疾患、例えば嚢胞性繊維症
、喘息、気管支炎、炎症性腸疾患、クローン病、慢性閉塞性肺疾患等の病気に関
する評価を受けている患者の血清中、粘液、又は組織生検中でのzsig28ポリペプ
チド検出は、本発明の診断応用に利用できるだろう。この様なzsig28ポリペプチ
ドは免疫アッセイ技術及びzsig28ポリペプチドエピトープを認識できる抗体を利
用することで検出できる。例示として、本発明は、以下を含むzsig28ポリペプチ
ド検出法を包含する：
【０２１０】 zsig28ポリペプチドを含む可能性のあるサンプルを、個体支持体に結合された
、zsig28ポリペプチドのエピトープに結合する抗体に曝すこと； 前記固定された個体−ポリペプチドを洗浄し、未結合汚染物質を除去すること
； 前記固定された個体−ポリペプチドを、検出可能な標識が結合した、zsig28ポ
リペプチドの第２エピトープに対する二次抗体に曝すこと；そして 検出可能な標識体を検出すること。試験サンプル中のzsig28ポリペプチド濃度
の（その正常濃度と比較しての）増減は機能不全を指示すると思われる。当業者
は、当分野既知の別の方法、例えば標識抗zsig28抗体を用いたサンプル液アッセ
イを利用し、試験サンプル中のzsig28が検出できることを認識するだろう。
【０２１１】 更に、この様な粘膜変調剤を含む医薬組成物は、上記の様な粘膜増殖、組成又
は健全性の変化を伴う病気の治療に利用できるだろう。この様な患者には、一般
には粘膜増殖、組成又は健全性がその正常生理状態に向かって変化することで表
される治療効果が達成できる粘膜変調活性を有するzsig28ポリペプチド又は、そ
のアゴニストあるいはアンタゴニストが治療有効量投与されるだろう。
【０２１２】 また、本発明のzsig28ポリペプチドは例えば胃のような消化組織に大量に存在
している。即ち、zsig28ポリペプチドの発現は、消化機能に関するマーカーとし
て機能し、あるいは消化性器官の増殖又は分化に関するマーカーとして機能する
だろう。同様に、zsig28ポリペプチド、又はそのアゴニストあるいアンタゴニス
トは、消化器官粘膜の潤滑性又はバリアー特性の変調に有用であろう。
【０２１３】 本発明のzsig28ポリペプチド、又はそのアゴニストあるいアンタゴニストは、
微生物の病原作用から保護する抗菌剤として利用できるだろう。この様な抗菌剤
は、C.albicans, pneumonus, hemophilus, Helicobacter pylori等の粘膜関連微
生物に好ましく作用する。ヒトに於ける粘膜関連の微生物関性疾患の例としては
、潰瘍形成につながる可能性のあるH.pyloriによる胃十二指腸粘膜の防御機能の
低下がある。例えばBeligotskii ら、 Klin. Khir. 8: 3-6, 1994を見よ。
【０２１４】 これら抗菌防御剤は、直接作用的又は間接作用的であろう。これら膜に関連し
た、あるいは孔形成に関係したメカニズムを開始作用する薬剤は、病原菌を直接
攻撃する。抗菌剤は、細菌の保護基質、その細胞壁／膜を破壊する酵素メカニズ
ムを介して作用することもできる。微生物の増殖を阻害し、又は上記の何れかの
メカニズムにより細菌の健全性を破壊することができる抗菌剤は、その抗菌活性
に対し感受性である細菌による細胞培養体汚染の防止法に有用である。この様な
技術には、該zsig28分泌域１，２，３又は４のポリペプチド断片、又はzsig28ア
ゴニスト、又はアンタゴニストの有効量存在下に細胞を培養することが含まれる
。zsig28ポリペプチド、又はそのアゴニストあるいアンタゴニストの抗菌剤とし
ての効果を評価するアッセイは当分野既知である。
【０２１５】 更に微生物疾患に関する評価を受けている患者の血清中、粘液、又は組織生検
中に於けるzsig28ポリペプチド検出は、本発明の診断応用に利用できるだろう。
この様なzsig28ポリペプチドは免疫アッセイ技術及びzsig28ポリペプチドエピト
ープを認識できる抗体を利用することで検出できる。血清、汗、唾液、生検等の
試験サンプル中でのzsig28ポリペプチドレベル変化は、正常コントロールと比較
することで消化機能、胃潰瘍の指標、又は癌又は疾患の指標としてモニターでき
る。
【０２１６】 更に、これら抗菌剤を含む医薬組成体は、微生物疾患、特に粘液に関連した疾
患の治療に利用できるだろう。この様な患者には、一般には病原性微生物の増殖
又は機能の低下により表される治療効果が達成できる抗菌活性を有するzsig28ポ
リペプチド又は、そのアゴニストあるいはアンタゴニストが治療有効量投与され
るだろう。本発明に関する別の疾患は、粘膜及び／又は病原性微生物、粘膜に影
響する化学療法副作用、粘膜に関係したAIDS合併症等を含む眼、鼻、口腔及び直
腸疾患である。
【０２１７】 zsig28可溶性ポリペプチド断片の抗菌活性は、既知アッセイ法を利用し決定で
きるだろう。例えば、Barsum ら、 Eur. Respir. J. 8(5): 709-14, 1995; Sand
ovsky-Losica ら、 J. Med. Vet. Mycol (England) 28(4): 279-87, 1990; Mehe
ntee ら、J. Gen. Microbiol (England) 135 (Pt. 8): 2181-8, 1989; Segalと
Savage, Journal of Medical and Veterinary Mycology 24: 477-479, 1986等を
見よ。
【０２１８】 又、本発明のzsig28ポリペプチドは、追加の接着性及び／又は抗菌特性をそれ
に付与する既知組織膠成分を含むだろう。この様な応用では、精製されたzsig28
ポリペプチドがコラーゲン又はゼラチン様物質、筋肉接着蛋白質、フィブリノー
ゲン、トロンビン、第XIII因子等と組合せ利用されるだろう。組織膠のタイプの
差及びその成分は当分野既知である。
【０２１９】 Zsig28はその活性の変調剤（例えばアンタゴニスト）の特定にも利用できる。
試験化合物は、ここに開示されたアッセイに加えられ、zsig28の活性を阻害する
化合物が同定される。ここに開示されたこれらアッセイに加え、差ヌルはzsig28
結合、オリゴマー形成、又はzsig28依存型細胞反応の刺激／阻害を測定するため
に作られた各種アッセイ内でのzsig28活性の阻害についても試験できる。例えば
、zsig28発現細胞株は、zsig28刺激細胞経路に反応するレポーター遺伝子構築体
でトランスフェクトできる。
【０２２０】 このタイプのレポーター遺伝子構築体は当分野公知であり、一般にはルシフェ
ラーゼの様なアッセイ検出可能な蛋白質をコードする遺伝子と作用可能に連結さ
れたzsig28-DNA反応エレメントを含むだろう。DNA反応エレメントは、環状AMP反
応エレメント（CRE）、ホルモン反応エレメント（HRE)、インシュリン反応エレ
メント（IRE)(Nasrin ら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5273-7, 1990)及
び血清反応エレメント（SRE)(Shaw ら、 Cell 56: 563-72, 1989)を含むことが
できるが、これに限定されるものではない。
【０２２１】 環状AMP反応エレメントはRoestlerら、 J. Biol. Chem. 263 (19):9063-6; 19
88及び Habener, Molec. Endocrinol.4 (8):1087-94; 1990にレビューされてい
る。ホルモン反応エレメントはBeato, Cell 56:335-44; 1989 によりレビューさ
れている。候補化合物、溶液、混合体、又は抽出物は、レポーター遺伝子発現の
zsig28による促進を低下させることで証明される、標的細胞に対するzsig28活性
の阻害能力について試験される。このタイプのアッセイはzsig28の細胞表面受容
体への結合を、例えば２量体形成を通じ直接遮断する化合物、ならびにこれら結
合に続く細胞経路の工程を遮断する化合物を検出するだろう。
【０２２２】 この様に、zsig28ポリペプチドにたいし反応性である細胞を提供すること、zs
ig28ポリペプチドの存在下に細胞の第一部を培養すること、zsig28及び試験化合
物存在下に細胞の第２部を培養すること、そして細胞の第一部と比較し細胞の第
２部の細胞反応の減少を検出すること、を含むzsig28ポリペプチドのアンタゴニ
ストを同定する方法が提供される。更に検出可能なタグ（例えば125I、ビオチン
、西洋ワサビパーオキシダーゼ、FITC等）の付いたzsig28を用い、zsig28の遮断
、又は他の細胞表面細胞分子へのzsig28結合の遮断を目的として、化合物又はそ
の他サンプルを試験することができる。
【０２２３】 このタイプのアッセイでは、標識化されたzsig28の他蛋白質への結合を阻害す
る試験サンプルの能力を示すことができ、これは第２アッセイにより確認するこ
とができる。従って、アンタゴニストはzsig28ポリペプチド機能を阻害又は低下
させるのに有用である。あるいは、上記のzsig28ポリペプチドを発現する細胞を
提供すること、試験化合物存在下に細胞を培養すること、zsig28ポリペプチド存
在下に培養された細胞と細胞反応を比較すること、そして細胞反応が同一タイプ
である試験化合物を選択することを含むzsig28ポリペプチドのアゴニストを同定
する方法が提供される。
【０２２４】 zsig28に関し観察された組織分布の観点では、アゴニスト（天然リガンド／置
換基／コファクター等を含む）及びアンタゴニストはインビトロ及びインビボ両
方の応用に多くの可能性を有している。zsig28アゴニストとして同定された化合
物は腫瘍細胞の様に、インビトロ及びインビボにてsig58を過剰発現している細
胞のアポトーシスの促進に有用である。zsig28アゴニストとして同定された化合
物はまた、各種細胞の細胞増殖又は分化の促進に関し有用である。
【０２２５】 例えば、zsig28アゴニスト化合物は、限定細胞培養培地の成分として有用であ
り、そして単独又は多のサイトカイン及びホルモンと組合せ、細胞培養に通常利
用されている血清の置き換えに有用である。また、zsig28ポリペプチドは加水分
解されることで、培養細胞にアミノ酸源を提供することができる。更に、zsig28
ポリペプチドお帯zsig28アゴニストポリペプチドは、胃由来細胞又は腸細胞の拡
大に関する様な研究用試薬として有用である。zsig28アゴニストはzsig28ポリペ
プチドを発現している細胞に関する組織培養培地に加えることができる。
【０２２６】 zsig28活性の阻害剤（zsig28アンタゴニスト）には抗zsig28抗体及びポリペプ
チド結合断片、ならびにその他ペプチド性及び非ペプチド性作用物質（リボザイ
ムを含む）が含まれる。zsig28はその活性に関する阻害剤（アンタゴニスト）の
同定にも利用できる。試験化合物はここに開示されたアッセイに加えられ、zsig
28の活性を阻害する化合物が同定される。これらここに開示されたアッセイに加
え、サンプルは受容体結合又はzsig28依存性細胞反応の促進／阻害を測定するた
めに工夫された各種アッセイを使い、zsig28の阻害について試験することができ
る。
【０２２７】 例えば、zsig28反応性細胞株は、zsig28刺激細胞経路に反応するレポーター遺
伝子構築体でトランスフェクトすることができる。このタイプのレポーター遺伝
子構築体は当分野公知であり、そして一般にはルシフェラーゼの様なアッセイ可
能な蛋白質をコードする遺伝子と作用可能に連結されたzsig28-DNA反応エレメン
トを含むだろう。DNA反応エレメントは、環状AMP反応エレメント（CRE）、ホル
モン反応エレメント（HRE)、インシュリン反応エレメント（IRE)(Nasrin ら、 P
roc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5273-7, 1990)及び血清反応エレメント（SRE)(
Shaw ら、 Cell 56: 563-72, 1989)を含むことができるが、これに限定されるも
のではない。
【０２２８】 環状AMP反応エレメントはRoestlerら、 J. Biol. Chem. 263 (19):9063-6; 19
88及び Habener, Molec. Endocrinol.4 (8):1087-94; 1990にレビューされてい
る。ホルモン反応エレメントはBeato, Cell 56:335-44; 1989 によりレビューさ
れている。候補化合物、溶液、混合体、又は抽出物は、レポーター遺伝子発現の
zsig28による促進を低下させることで証明される標的細胞に対するzsig28活性の
阻害能力について試験される。このタイプのアッセイは、zsig28ポリペプチド受
容体への結合、または受容体の多量体形成より、zsig28リガンドを直接遮断する
化合物、及びこれら結合に続く細胞経路の工程を遮断する化合物を検出するだろ
う。
【０２２９】 本発明の分子は、癌転移に関係する又は存在するzsig28受容体を同定し、及び
分離するのに利用できる。即ち、zsig28ポリペプチドは癌転移に関する診断法と
して機能する。例えば、本発明の蛋白質、及びペプチドはカラム上に固定でき、
膜標本はこのカラム上に流される(Immobilized Affinity Ligand Techniques, H
ermanson ら、., 編集.,Academic Press, San Diego, CA, 1992, pp.195-202)。
(Methods in Enzymol., vol.182, "Guide to Protein Purification", M.Deuts
cher, ed., Acad. Press, San Diego, 1990, 721-737)か、又はフォトアフィニ
ティーラベル(Brunner ら、 Ann. Rev. Biochem. 62:483-514, 1993 and Fedan
ら、Biochem. Pharmacol.33:1167-1180, 1984)され、そしてzsig28細胞表面蛋白
質が同定される。
【０２３０】 更に、当分野既知の方法を利用し、zsig28に対する抗体を放射線標識でき、ま
た蛍光あるいは化学的に標識し、組織アッセイに用い生検標本内に於けるzsig28
の増加を検出できる。本発明のポリペプチドはzsig28ポリペプチドの発現レベル
の変化の測定に有用である。zsig28発現は特定の組織に限定されていることから
（即ち胃及び肺）、発現レベルの変化を利用することでこれら組織内の代謝をモ
ニターすることができる。例えばzsig28ポリペプチド及びポリヌクレオチドの発
現及び／又は転写の増加は腫瘍細胞の細胞増殖の増加を予測するだろう。更に、
通常zsig28を発現していない組織内でのzsig28発現は、腫瘍細胞の転移を示唆す
るだろう。
【０２３１】 zsig28は特定の上皮組織内、及び癌、特に胃、結腸、食道及び小腸に於ける癌
に示差的に発現されることが示されている。この示差発現は、細胞又は組織の成
熟の過程で起こる特定遺伝子、蛋白質、又はその他表現形特質（分化マーカーと
して知られる）の一過性の発現又は消失である。分化マーカーの組合せは、特定
のタイプの細胞に同定され、また特異的である１又はそれ以上の表現形特性とし
て規定される。
【０２３２】 即ち、特定の細胞系列への拘束なしに増殖できる多能性幹細胞は、細胞系列へ
の拘束が成立した時点で失われる分化マーカーのセットを発現している。前駆細
胞は、細胞が成熟に向かう細胞系列の経路を進みながら持続して、あるいは持続
せずに発現する分化マーカーのセットを発現する。成熟細胞のみに発現される分
化マーカーは通常細胞産物、細胞産物を生ずる酵素及び受容体の様な機能特性を
持っている。
【０２３３】 zsig28発現は、正常及び腫瘍組織に於ける腫瘍ステージまたは細胞成熟度を規
定する分化マーカーとして利用できる。zsig28は特に上皮細胞及び上皮起源の腫
瘍のマーカーとして有用であり、さらに特に胃組織の上皮細胞及び上皮由来腫瘍
のマーカーとして有用である。 分化マーカーのセットは、特定のタイプの細胞に同定され、また特異的である
１またはそれ以上の表現形特性として規定される。分化マーカーは細胞系列の様
々な段階で一過性に提示される。特定の細胞系列への拘束なしに増殖できる多能
性幹細胞は、細胞系列への拘束が成立した時点で失われる分化マーカーのセット
を発現している。前駆細胞は、細胞が成熟に向かう細胞系列の経路を進みながら
持続して、あるいは持続せずに発現する分化マーカーのセットをい発現している
。
【０２３４】 成熟細胞のみに発現される分化マーカーは通常細胞産物、細胞産物を生ずる酵
素及び受容体の様な機能特性を持っている。本発明の分子の活性は、特定タイプ
の細胞の増殖及び／又は分化、走化性、接着、イオンチャンネル流入の変化、第
２メッセンジャーレベルの制御及び神経伝達物質の放出を測定する各種アッセイ
を利用し、測定できる。この様なアッセイは当分野公知であり、またここに記載
されている。
【０２３５】 例えばここに開示されたヌクレオチド配列に由来するプローブ又はプライマー
を使った別の方法を利用し、例えば腫瘍生検標本、胃、肺、血液、唾液、組織サ
ンプル等の患者サンプル中のzsig28の発現を検出することができる。例えば、プ
ローブは腫瘍組織にハイブリダイズでき、またハイブリダイズした複合体はイン
サイチューハイブリダイゼーションにより検出できる。zsig28配列はサンプルmR
NAを鋳型とする逆転写により作製されたcDNAを利用したPCR増幅によって検出す
ることができる(PCR Primer A Laboratory Manual, Dieffenbach and Dveksler,
eds., Cold Spring Harbar Press, 1995)。正常コントロールと比較した場合、
患者サンプル中のzsig28発現のコントロールのそれに対する増加または低下は共
にモニターすることができ、病気の指標または診断に利用できる。
【０２３６】 zsig28ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、zsig28活性を増加又は
阻害することが望まれる遺伝子治療応用に有用である。哺乳動物が変異したzsig
28遺伝子を持つか、これを欠いている場合、zsig28遺伝子を哺乳動物の細胞内に
導入することができる。更に遺伝子治療応用を利用する場合、zsig28は化学療法
剤として直接使用することもできる。例えば、ここに開示された方法を利用すれ
ば、zsig28は直接癌細胞内に導入でき、アポトーシス及び細胞死を誘導できる。
実施態様の一つでは、zsig28ポリペプチドをコードする遺伝子は、インビボにて
ウイルスベクター内に導入される。
【０２３７】 この様なベクターは弱化された、又は破壊されたDNAウイルス、例えば単純ヘ
ルペスウイルス（HSV）、パピローマウイルス、エプスタインバーウイルス（EBV
)、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス（AAV)等を含むが、これに限定されな
い。ウイルス遺伝子を感染に又はほぼ感染に欠いている欠失型ウイルスが好まし
い。欠失ウイルスは細胞内に導入された後感染性を示さない。欠失ウイルスベク
ターの利用により、ベクターが他の細胞に感染することを危惧することなく、細
胞を特定の局所に投与することができる。
【０２３８】 ベクターの具体例には欠失単純ヘルペスウイルス１型（HSV1)ベクター(Kaplit
tら、 Molec. Cell. Neurosci. 2:320-30, 1991)、Stratford-Perricaudetら、J
. Clin. Invest. 90:626-30. 1992記載の様な弱化アデノウイルスベクター、及
び欠失型アデノ関連ウイルスベクター(Samulskiら、 J. Virol. 61:3096-101. 1
987: Samulskiら、 J. Virol. 63:3822-8. 1989)が含まれるが、これに限定され
るものではない。
【０２３９】 別の実施態様では、zsig28遺伝子は、例えばAnderson ら、米国特許第5.399,3
46号: Mann ら、 Cell 33:153. 1983: Temin ら、米国特許第 4.650.764号: Tem
in ら、米国特許第4.980.289号: Markowitz ら、J. Virol. 62:1120. 1988: Tem
in ら、米国特許第 5.124.263号: Dougherty ら、国際特許公開WO 95/07358号
、1955年５月16日公開、及び Kuo ら、Blood 82:845. 1933に記載の様にレトロ
ウイルスベクター内に導入できる。あるいは、ベクターはリポゾームを利用して
、インビボのリポフェクションにより導入できる。
【０２４０】 マーカーをコードする遺伝子のインビボトランスフェクションに適したリポゾ
ームの調製には合成カチオン性脂質が利用できる(Felgner ら、.. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 84:7413-7. 1987: Mackey ら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85
:8027-31. 1988)。インビボに於ける特定器官への外来遺伝子導入に関するリポ
フェクションの利用は実際上の利点を持っている。特定細胞に対するリポゾーム
の分子標的化は、１つの利点である。
【０２４１】 より具体的には、特定細胞に方向付けられたトランスフェクションは利点の１
つである。例えば、特定のタイプの細胞にトランスフェクションを方向付けるこ
とは、膵臓、肝臓、腎臓及び脳の様な細胞的に不均一な組織では特に有益である
。脂質は標的化の目的に適した別の分子と化学的に結合できる。標的となるペプ
チド（例えばホルモン又は神経伝達物質）、抗体の様な蛋白質、又は非ペプチド
性分子は、リポソームに化学的に結合することができる。
【０２４２】 体部より標的細胞を取り出すこと；裸のDNAプラスミドとしてベクターを導入
すること；及び続いて形質転換した細胞を体部に再度戻すことも可能である。遺
伝子治療に適した裸のDNAベクターは、当分野既知の方法、例えばトランスフェ
クション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、トランスダク
ション、細胞融合、DEAEデキストラン、リン酸カルシウム沈殿、遺伝子ガンの利
用、又はDNAベクタートランスポーターの利用により所望の宿主細胞内に導入で
きる。
【０２４３】 例えば、 Wu ら、J. Biol. Chem. 267:963-7. 1992; Wu ら、 J. Biol. Chem. 26 3:14621-4,1988を参照せよ。 アンチセンス法を利用し、インビボに於ける細胞増殖の阻害の様な、zsig28遺
伝子の転写阻害が可能である。zsig28をコードするポリヌクレオチド（例えば、
配列番号１記載のポリヌクレオチド）の断片に相補的であり、zsig28をコードす
るmRNAに結合し、その様なmRNAの翻訳を阻害するポリヌクレオチドが設計される
。この様なアンチセンスポリヌクレオチドを利用し、細胞培養体又は被験体中の
zsig28ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を阻害する。
【０２４４】 更に、細胞表面分子としてzsig28ポリペプチドは、遺伝子治療を細胞内に導入
する再の標的として利用できる。この応用はzsig28が正常に発現されている細胞
、例えば胃及び肺の組織、zsig28ポリペプチドを発現している癌細胞内に治療遺
伝子を導入するのに特に適している。例えば、上記の様なウイルス遺伝子治療に
ついて、ウイルス受容体ではなくzsig28ポリペプチドの様な細胞受容体を発現し
ている特定の細胞に狙いを定めることができる。
【０２４５】 標的細胞上のzsig28分子を認識する抗体又はその他の分子を利用し、ウイルス
を標的細胞に感染させ、そして遺伝子治療材料を投与することができる。Woo, S
.L.C, Nature Biotech. 14:1538, 1996; Wickham, T.J. ら、 Nature Biotech.
14:1570-1573, 1996; Douglas, J.T ら、Nature Biotech. 14:1574-1578,1996;
Rihova, B., Crit. Rev. Biotechnol. 17:149-169, 1997;及び Vile, R.G. ら
、 Mol. Med. Today 4:84-92, 1998を参照せよ。
【０２４６】 例えば、zsig28特異的抗体と結合したウイルス中和Fab断片を含む二重特異性
抗体を利用し、ウイルスをzsig28受容体を発現している細胞に方向付けること、
そして遺伝子エレメントを含むウイルスを細胞内に効率的に侵入させることがで
きる。例えば、Wickham, T.J.ら、J. Virol.71:7663-7669, 1997;及び Wickham,
T.J.,ら、J. Virol. 70:6831-6838, 1996を見よ。
【０２４７】 本発明はまた、診断応用に利用できる試薬も提供する。例えば、zsig28遺伝子
、zsig28DNA又はRNAを含むプローブ、あるいはその一部配列は、zsig28遺伝子が
第３染色体上に存在するか、又は変異が生じているか決定するのに利用できる。
zsig28は第３染色体の3q22.1-3q22.2域に存在している（実施例３参照）。zsig2
8遺伝子座に検出可能な染色体異常としては、異数性、遺伝子コピー数の変化、
挿入、決心、制限酵素部位の変化及び再配置があるが、これに限定されない。こ
の様な以上は本発明のポリヌクレオチドを利用し、制限酵素断片長多形（RFLP）
分析、PCRを利用したショートタンデムリピート（STR)分析、その他の当分野既
知の遺伝的連鎖分析技術を利用することで検出できる。（Sambrook ら、上記; A
usubel ら、上記; Marian, Chest 108:255-65, 1995)
【０２４８】 遺伝子の位置に関する正確な情報は、以下を含む様々な目的にとって有用であ
る：１）配列が既存コンティグの一部であり、YACs、BACs又はcDNAクローンとい
った様々な形態にある追加の周辺遺伝子配列を得ることができるか決定する；２
）同一染色体域に関連性を示す遺伝性疾患に関する候補遺伝子を提供すること；
及び３）ある遺伝子が持つ機能を決定する上で役立つマウスの様な相互参照モデ
ル。
【０２４９】 zsig28遺伝子は第３染色体の3q22.1-3q22.2領域に局在している。この領域に
は機能が判明している幾つかの遺伝子がマッピングされている。例えば、アンジ
オテンシン受容体Ｉは3q21-q25にマップされ、それが血圧をコントロールするこ
とから、ヒトに於ける高血圧と関連している。更にzsig28ポリヌクレオチドプロ
ーブを用いることで、3q21-q25にマップされ、肺乳ガン及び結腸癌において強く
発現してい腫瘍関連抗原L6と関係する異常または遺伝子型を検出することができ
る(Markenら、Proc. Nat. Acad. Sci. 89:3503-3507, 1992)。
【０２５０】 更に、その他遺伝子座のなかでアルカプトン尿症（3q21-q23）、メービウス２
症候群（3q21-q22）、開放隅角緑内障（3q21-q24）、カルシウム感受性受容体（
3q21-q24）に関する座全てがヒトに於いては病気を示すこと、そしてヒト遺伝子
のこの領域にマッピングされる。ヒト遺伝子マップ（OMIM）のオンラインメンデ
ル遺伝及び、wwwサーバー（http://www3.ncbi.nl,.nih.gov/htbin-post/Omim/ge
tmap?chromosome=3q22.1)で公開され、ここでに参照されている第３染色体の本
領域に関する事項を見よ。これらはzsig28遺伝子と同一の染色体領域に連鎖を示
す遺伝性の病気に関する候補遺伝子と考えられる。
【０２５１】 更にzsig28と関連する遺伝子、ベロ−カーディアック−フェーシャル（velo-c
aridc-facial）症候群（TMVCF）に欠失しているヒト膜貫通蛋白質（Sirotkin H.
ら、 Genomics 42:245-251, 1997)は、顔面変形、精神薄弱及び心臓欠損を有す
る他の症候群にあって特徴的なヒト常染色体性優性障害であるベロ−カーディア
ック−フェーシャル症候群（VCFS)のマーカーであり、そしてこの症候群の患者
の80-85%に欠失が認められる。
【０２５２】 更に別のzsig28関連遺伝子の変異である、末梢ミエリン蛋白質-22（PMP-22）
は、表現形的にはPMP-22トランスジェニックマウスモデルの神経症に似た症状を
示すヒトシャルコーマリーツース神経症（CMT)に存在している。(Erdem S. ら、 J. Neuropathol. Exp. Neurol . 57:635-642, 1998;Fabbretti, Eら、Genes Dev
. 15:1846-1856, 1995; Magyar, J.P. ら、J Neurosci. 16:5351-5360, 1996; A
dlkofer, K.ら、Nat. Genet. 11:274-280, 1995) 同様に、zsig28座そのものの欠失は、遺伝性のヒト疾患をもたらすだろう。本
発明のポリペプチド、アンタゴニスト、アゴニスト、ポリヌクレオチド及び抗体
の様な本発明の分子は、zsig28の遺伝的欠失に関連する検出、診断、予防及び治
療に役立つだろう。
【０２５３】 zsig28遺伝子を発現するように加工された”トランスジェニックマウス”と呼
ばれるマウス、及び”ノックアウトマウス”と呼ばれるzsig遺伝子の機能を完全
に持っていないマウスも作れるだろう(Snouwaert ら、Science 257:1083, 1992;
Lowell ら、Nature 366:740-42, 1993; Capecchi, M.R., Science 244: 1288-1
292, 1989; Palmiter, R.D. ら、 Annu Rev Genet. 20: 465-499, 1986)。例え
ば、普遍的又は組織特異的又は組織拘束プロモーターの下にzsigを過剰発現する
トランスジェニックマウスは、過剰発現が表現形の原因であるか調べるのに利用
できる。
【０２５４】 例えば、野生型zsig28ポリペプチド、ポリペプチド断片、又はその変異体の過
剰発現は、zsig28の発現が機能に関連性している組織を特定する表現形をもたら
し、zsig28、そのアゴニスト、又はアンタゴニストの治療対象を示唆するだろう
。例えば、加工に適したトランスジェニックマウスは、zsig28成熟ポリペプチド
（配列番号２のアミノ酸番号24（Ala）ないし261（Val）にほぼ等しい）を過剰
発現するマウスである。さらに、この様な過剰発現はヒトの病気に似た表現形を
もたらすだろう。同様にノックアウトzsig28マウスは、zsiog28がインビボで絶
対に必要とされているかの決定に利用できる。
【０２５５】 ノックアウトマウスの表現形は、ここに記載した様なzsig28アンタゴニストが
持つインビボでの作用を予測する。ヒトzsig28cDNAは、後のノックアウトマウス
作製に利用できるマウスzsig28mRNA、cDNA及びゲノムDNAの分離に利用できる。
これらマウスはインビボシステムでのzsig28遺伝子及びそれにコードされている
蛋白質の研究に利用でき、またヒト疾患モデルに相当するインビボモデルとして
利用できる。更にここに記載のzsig28アンチセンスポリヌクレオチド又はzsig28
に対するリボザイムを発現するトランスジェニックマウス、上記記載のトランス
ジェニックマウスと同様に利用することができる。
【０２５６】 発明を以下の非限定的実施例により更に例示する。 実施例 実施例１．zsig28の同定 A:完全長zsig28を得るためのEST配列の利用 問い合わせによる一段階トラップを利用し、翻訳肺ライブラリーDNAデータベ
ースをスクリーニングしたところ、ヒト分泌シグナル配列に相同である発現配列
タグ（EST)が特定された。 EST起源から得たcDNAの配列を分析し、EST配列を確認した。このcDNAはプラス
ミドに含まれており、以下のプライマーを利用し配列決定された：ZC447（配列
番号11）、ZC12501（配列番号12）、ZC12502（配列番号13）、及びZC976（配列
番号14）。クローンは全長と考えられた。
【０２５７】 実施例２．組織分布 ヒトMultiple Tissue Nortern（商標）Blots(MTN I, MTN II, MTN III)(Clont
ech)を利用しノーザンブロット分析を行った。実施例１記載の完全長クローンの
挿入体をEcoRI及びNotI（Boehringer）を用い切り出し、市販のキット（QiaexII
TM、Qiagen)を利用してゲル精製し、次にランダムプライムラベリングシステム
であるRediprime（商標）（Amersham)をメーカーの指示にしがたい利用し、32P-
dCTPで放射線標識した。次にNucTrapTMカラム（Stratagene)をメーカー指示書に
従い用い、プローブを精製した。ExpressHyb（商標）（Clontech)液をプレハイ
ブリダイゼーション液及びノーザンブロット用のハイブリダイゼーション液に用
いた。
【０２５８】 ハイブリダイゼーションは3×106cpm/mlの標識プローブを用い42℃で一晩行っ
た。次にブロットを２×SSC/1%のSDSで室温洗浄し、続いて65℃にて0.1×SSC/0.
1%SDSで洗浄した。およそ4kbの転写体が胃では強く、そして肺で弱く検出された
。ブロット上にあるその他の組織ではシグナルは観察されなかった。 ヒトRNA Master Blot（商標）(Clontec)を利用してドットブロットも実施した
。ドットブロットの方法及び条件は上記Multiple Tissue Blotsと同一である。
成人及び胎児で胃に強いシグナル強度が観察され、肺では検出されたものの発現
は低かった。
【０２５９】 実施例３．zsig28遺伝子のPCRをベースとした染色体マッピング zsig28は市販の“GeneBridge 4 Radiatin Hybrid Pnael"(Research Genetics,
Inc., Huntsville, AL）を用い、第３染色体上にマッピングされた。GeneBridg
e 4 Radiatin Hybrid Pnaelは93種類の放射ハイブリッドクローン由来のDNA及び
２種類のコントロールDNA（HFLドナーとA23レシピエント）を含んでいる。公開
されているWWWサーバー（http://www-genome.wi.mit.edu/cgi-bin/contig/rhmap
per.pl）により、GeneBridge 4 Radiatin Hybrid Pnaelを持ち作製されたゲノム
研究所ホワイトヘッド（Whitehead）研究所／MITセンターのヒトゲノムの放射ハ
イブリッドマップ（"WICGR"放射ハイブリッドマップ）に比較したマッピングが
可能となる。
【０２６０】 “GeneBridge 4 Radiatin Hybrid Pnael”によるzsig28のマッピングでは、20
μｌの反応液を96ウエル型マイクロタイタープレート（Stratagene、La Jolla,
CA)にセットし,次に“RoboCycler Gradient 96"サーマルサイクラー（Stratagen
e）にかけた。95のPCR反応液はそれぞれ２μlの10×KlenTaq PCR反応バッファー
（Clontech Laboratories, Inc, Palo Alto, CA), 1.6μｌのdNTPs混合液（各2.
5mM、PERKIN-ELMER, Foster City, CA), 1μｌセンスプライマー、ZC19,410（配
列番号15）、１μｌのアンチセンスプライマー、AC19,411（配列番号16）、２μ
lの“ReadLoad"（Research Genetics)、0.4μｌの50×Advantae KlenTaq（商標
）ポリメラーゼミックス（Clonetech）、各ハイブリッドクローン又はコントロ
ールのDNA25ng、及び合計容積20μｌになるddH2Oから構成された。
【０２６１】 反応液には等量のミネラルオイルが重層され、密封された。PCRサイクラーの
条件は次のとおりである：５分間、95℃変性１サイクル、95℃変性１分、60℃ア
ニーリング１分、72℃延長1.5分を35サイクル、続いて72℃７分間の延長、１サ
イクル。反応液は２％のアガロースゲル（Life Technologies, Gaithersburg, M
D)にかけて分離した。
【０２６２】 結果より、Zsig28はWICGR染色体３放射ハイブリッドマップ上のフレームワー
クマーカーD3S1576から4.40cR＿3000の位置にマップされた。近位及び遠位フレ
ームワークマーカーはそれぞれD3S1576及びWI-3522であった。周辺マーカーを利
用したところ、Zsig28は統合LDB第３染色体マップ上の3q22.1-3q22.2域内に位置
付けられた（The Genetic Location Database, Univeristy of Southhampton, w
ww server; http://cedar.genetics.soton.ac.uk/public#html/1)。 上記より、発明の具体的実施態様が例示の目的でここに記載されているが、発
明の精神及び範囲から逸脱することなく多くの変更が可能であることが理解され
るだろう。従って、発明は添付のクレーム以外に制限を受けない。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１はzsig28（配列番号２）；マウスクラウジン１（CLAUD1）（配列番号３）
（Furuse,M.ら、J. Cell Biol. 141;1539-1550, 1998); ジーンバンク登録番号A
F072127）；マウスCPE受容体（AB007）（配列番号４）（ジーンバンク登録番号A
B00713）；ヒト乏突起神経膠細胞特異蛋白質（OSP)-様蛋白質（HSU899）（配列
番号５）（ジーンバンク登録番号U89916）；Belo-Cardio-Facial症候群にて欠失
するヒト膜貫通蛋白質（AF0009）（配列番号６）（ジーンバンク登録番号AF0009
59）；ヒトOSP（AF0688）（配列番号７）（ジーンバンク登録番号AF068863）；
マウスクラウジン２（AF0721）（配列番号８）（Furuse、M.ら、上記；ジーンバ
ンク登録番号AF072128）；及びラットアンドロゲン離脱蛋白質RVP.1（PIR#A3）
（配列番号９）（Briehl. M.Mら、Mol.Endocrinol. 5: 1381-1388, 1991）のア
ラインメントである。
【図２】 図２はzsig28ポリペプチドの疎水性プロットである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 1/14 Ａ６１Ｐ 5/50 ４Ｃ０８４ 3/08 31/04 ４Ｃ０８５ 5/50 31/10 ４Ｈ０４５ 31/04 35/00 31/10 Ｃ０７Ｋ 14/47 35/00 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｎ 1/15 16/18 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 1/21 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 1/68 Ａ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ Ｃ１２Ｑ 1/02 33/50 Ｚ 1/68 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/15 33/577 Ｂ 33/50 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/53 5/00 Ａ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ ，ＺＷ (72)発明者 フォレー，ケビン ピー． アメリカ合衆国，ワシントン 98102，シ アトル，ボイルストン アベニュ イース ト 605 ＃206 Ｆターム(参考） 2G045 AA40 BB20 CB01 DA36 FB03 4B024 AA01 AA11 BA80 CA04 DA02 FA02 FA07 FA18 GA11 HA11 HA17 4B063 QA19 QQ08 QQ43 QR08 QR32 QR42 QR56 QS25 QS34 QX07 4B064 AG01 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 DA13 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA02 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 BA01 BA22 BA23 NA14 ZA66 ZA68 ZA69 ZA71 ZB26 ZB35 ZC35 4C085 AA13 AA14 CC32 DD61 EE01 4H045 AA10 AA11 AA20 AA30 CA40 DA76 EA20 EA50 FA72 FA74

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 以下より成る群： （ａ）配列番号２のアミン酸番号２４（Ａｌａ）ないしアミノ酸番号２６１（
    Ｖａｌ）に示されるアミノ酸配列；及び （ｂ）配列番号２のアミン酸番号１（Ｍｅｔ）ないしアミノ酸番号２６１（Ｖ
    ａｌ）に示されるアミノ酸配列； から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であり、前記アミノ酸同一
    度％がｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティー＝１０、ギャップエク
    ステンションペナルティー＝１であり、置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２で
    あり、その他パラメーターがデフォルトであるＦＡＳＴＡプログラムにより決定
    されるアミノ酸残基の配列を含むポリペプチドをコードする分離されたポリヌク
    レオチド。
  2. 【請求項２】 ポリヌクレオチドが以下より成る群： （ａ）配列番号１のヌクレオチド１３９ないしヌクレオチド８５３に示される
    ポリヌクレオチド；及び （ｂ）配列番号１のヌクレオチド７０ないしヌクレオチド８５３に示されるポ
    リヌクレオチド； から選択されるポリヌクレオチドである請求項１の分離されたポリヌクレオチド
    。
  3. 【請求項３】 ポリヌクレオチドが配列番号１０のヌクレオチド１ないしヌ
    クレオチド７８３を含む請求項１の分離されたポリヌクレオチド。
  4. 【請求項４】 Ｚｓｉｇ２８ポリペプチドが以下より成る群： （ａ）配列番号２のアミノ酸番号２４（Ａｌａ）ないしアミノ酸番号２６１（
    Ｖａｌ）に示されるアミノ酸配列；及び （ｂ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）ないしアミノ酸番号２６１（Ｖ
    ａｌ）に示されるアミノ酸配列； から選択されるアミノ酸残基の配列を含む請求項１の分離されたポリヌクレオチ
    ド。
  5. 【請求項５】 以下の作用可能に連結されたエレメント： 転写プロモーター 配列番号２のアミノ酸番号２４（Ａｌａ）ないしアミノ酸番号２６１（Ｖａｌ
    ）に示されるｚｓｉｇ２８をコードするＤＮＡ断片；及び 転写ターミネーター、 を含み、 前記プロモーターが作用可能にＤＮＡ断片に連結し、さらにＤＮＡ断片が作用可
    能に転写ターミネーターに連結されている発現ベクター。
  6. 【請求項６】 更にＤＮＡ断片に作用可能に連結された分泌シグナル配列を
    含む、請求項５の発現ベクター。
  7. 【請求項７】 細胞がＤＮＡ断片によりコードされたポリペプチドを発現す
    る、請求項５に記載の発現ベクターを含む培養細胞。
  8. 【請求項８】 以下より成る群： （ａ）配列番号２のアミノ酸番号１（Ｍｅｔ）ないしアミノ酸番号２３（Ａｌ
    ａ）のアミノ酸配列； （ｂ）配列番号２のアミノ酸番号２４（Ａｌａ）ないしアミノ酸番号８２（Ｌ
    ｅｕ）のアミノ酸配列； （ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１０１（Ｌｅｕ）ないしアミノ酸番号１２２
    （Ｇｌｙ）のアミノ酸配列； （ｄ）配列番号２のアミノ酸番号１４１（Ａｓｎ）ないしアミノ酸番号１７４
    （Ａｌａ）のアミノ酸配列； （ｅ）配列番号２のアミノ酸番号１９３（Ｃｙｓ）ないしアミノ酸番号２６１
    （Ｖａｌ）のアミノ酸配列；及び （ｆ）配列番号２のアミノ酸番号２４（Ａｌａ）ないしアミノ酸番号２６１（
    Ｖａｌ）のアミノ酸配列； から選択されたアミノ酸残基の配列を含むポリペプチドをコードする第１ＤＮＡ
    断片；並びに 別のポリペプチドをコードする少なくとも１つの別のＤＮＡを含むＤＮＡ構築
    体にあって、さらに上記第１及び他のＤＮＡ断片がインフレームに接続し、かつ
    第１及び他のＤＮＡ断片が融合蛋白質をコードしている、融合蛋白質をコードす
    るＤＮＡ構築体。
  9. 【請求項９】 以下の作用可能に連結された要素： 転写プロモーター 請求項８に記載の融合蛋白質をコードするＤＮＡ構築体；及び 転写ターミネーター、 を含み、 前記プロモーターが作用可能にＤＮＡ構築体に連結し、さらにＤＮＡ構築体が作
    用可能に転写ターミネーターに連結されている発現ベクター。
  10. 【請求項１０】 請求項９による発現ベクターを含む培養細胞にあって、細
    胞がＤＮＡ構築体によりコードされたポリペプチドを発現する培養細胞。
  11. 【請求項１１】 融合蛋白質を製造する方法において、 請求項１０に記載の細胞を培養し；そして 細胞により産生されたポリペプチドを分離する； ことを含んで成る方法。
  12. 【請求項１２】 以下より成る群： （ａ）配列番号２のアミン酸番号２４（Ａｌａ）ないしアミノ酸番号２６１（
    Ｖａｌ）に示されるアミノ酸配列；及び （ｂ）配列番号２のアミン酸番号１（Ｍｅｔ）ないしアミノ酸番号２６１（Ｖ
    ａｌ）に示されるアミノ酸配列； から選択されるアミノ酸配列に少なくとも９０％同一であり、前記アミノ酸同一
    度％がｋｔｕｐ＝１、ギャップオープニングペナルティー＝１０、ギャップエク
    ステンションペナルティー＝１であり、置換マトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２で
    あり、その他パラメーターがデフォルトであるＦＡＳＴＡプログラムにより決定
    されるアミノ酸残基の配列を含む分離されたポリペプチド。
  13. 【請求項１３】 ポリペプチドがさらに以下より成る群： （ａ）Ｍｅｔ−｛４７−５０｝−Ｍ１−｛２１−２２｝−Ｍ２−｛７３−９２
    ｝−Ｍ３；及び （ｂ）Ｍｅｔ−｛４７−５０｝−Ｍ１−｛２１−２２｝−Ｍ２−｛７３−９２
    ｝−Ｍ３−｛３｝−Ｍ４、 （Ｍ１は配列番号２のアミノ酸４８ないし５４に示されるアミノ酸配列である”
    モチーフ１”であり、 Ｍ２は配列番号２のアミノ酸７２ないし８２に示されるアミノ酸配列である”
    モチーフ２”であり、 Ｍ３は配列番号２のアミノ酸１７４ないし１８０に示されるアミノ酸配列であ
    る”モチーフ３”であり、 Ｍ４は配列番号２のアミノ酸１８４ないし１８９に示されるアミノ酸配列である
    ”モチーフ４”であり、 （#)はモチーフ間のアミノ酸の数を示す） から選択される配置でＮ末端からＣ末端に向けて１から４の空間的に隔てられた
    モチーフを含む、請求項１２による分離されたポリペプチド。
  14. 【請求項１４】 以下より成る群： （ａ）配列番号２のアミン酸番号２４（Ａｌａ）ないしアミノ酸番号２６１（
    Ｖａｌ）に示されるアミノ酸配列；及び （ｂ）配列番号２のアミン酸番号１（Ｍｅｔ）ないしアミノ酸番号２６１（Ｖ
    ａｌ）に示されるアミノ酸配列； から選択されるアミノ酸残基の配列を含む請求項１２の分離されたポリペプチド
    。
  15. 【請求項１５】 ｚｓｉｇ２８ポリペプチドの作製方法において、 請求項７に記載の細胞を培養し：そして 細胞が産生したｚｓｉｇ２８ポリペプチドを分離する； ことを含んで成る方法。
  16. 【請求項１６】 ｚｓｉｇ２８ポリペプチドに対する抗体の作成方法におい
    て、 以下より成る群： （ａ）配列番号２のアミノ酸番号２４（Ａｌａ）ないしアミノ酸番号２６１（
    Ｖａｌ）のアミノ酸の連続配列に同一なポリペプチドである、９ないし２３８個
    のアミノ酸を含むポリペプチド； （ｂ）配列番号２のアミノ酸番号２４（Ａｌａ）ないしアミノ酸番号８２（Ｌ
    ｅｕ）のアミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｃ）配列番号２のアミノ酸番号１０１（Ｌｅｕ）ないしアミノ酸番号１２２
    （Ｇｌｙ）のアミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｄ）配列番号２のアミノ酸番号１４１（Ａｓｎ）ないしアミノ酸番号１７４
    （Ａｌａ）のアミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｅ）配列番号２のアミノ酸番号１９３（Ｃｙｓ）ないしアミノ酸番号２６１
    （Ｖａｌ）のアミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｆ）請求項１２に記載のポリペプチド； （ｇ）配列番号２のアミノ酸番号２４５（Ａｌａ）ないしアミノ酸番号２５０
    （Ｇｌｕ）のアミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｈ）配列番号２のアミノ酸番号２３４（Ａｓｎ）ないしアミノ酸番号２３９
    （Ｌｙｓ）のアミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｉ）配列番号２のアミノ酸番号２０２（Ｇｌｕ）ないしアミノ酸番号２０７
    （Ｌｙｓ）のアミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｊ）配列番号２のアミノ酸番号２５４（Ｌｙｓ）ないしアミノ酸番号２５９
    （Ａｓｐ）のアミノ酸配列より成るポリペプチド； （ｋ）配列番号２のアミノ酸番号１１０（Ｇｌｕ）ないしアミノ酸番号１１５
    （Ａｌａ）のアミノ酸配列より成るポリペプチド； から選択されたポリペプチドを動物に接種し、このポリペプチドにより動物に免
    疫反応を惹起せしめ、抗体を産生せしめ；そして 動物から抗体を分離すること； ことを含んで成る方法。
  17. 【請求項１７】 請求項１６の方法により産生された、ｚｓｉｇ２８ポリペ
    プチドに結合する抗体。
  18. 【請求項１８】 抗体がモノクローナル抗体である請求項１７の抗体。
  19. 【請求項１９】 請求項１２のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
  20. 【請求項２０】 試験サンプル中のｚｓｉｇ２８蛋白質活性変性体の存在を
    検出する方法において、 請求項５に記載の発現ベクターが導入される細胞を培養し、試験サンプルが存
    在する場合と存在しない場合でＤＮＡ断片によりコードされたｚｓｉｇ２８蛋白
    質を発現させ；そして 生物学的、又は生化学的アッセイにより、試験サンプルがある場合と無い場合
    のｚｓｉｇ２８活性のレベルを比較し：そして 比較より、試験サンプル中のｚｓｉｇ２８活性変調体の存在を決定する； ことを含んで成る方法。
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