JPH07106144B2 - ヒト免疫インターフェロン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、組換えDNA技術の領域に係る。

より詳細には本発明は、ヒト免疫インターフェロンをコ
ードするDNA配列を単離及び同定し、このDNA配列を発現
プロモーター配列に有効に発現し得るように（正しく読
み取られるように）結合させて組換えDNA発現ベヒクル
を調製し、この発現ベヒクルで形質転換することによっ
て得られる前記DNA配列を発現し得る培養系、例えば種
々の微生物及び脊椎動物細胞培養（セルカルチャー）に
係る。

本発明は、部分的には、ヒト免疫インターフェロンをコ
ードするDNA配列及びそれらから推定される構成アミノ
酸配列を知見したことを端緒とする。更に本発明は、ヒ
ト免疫インターフェロン遺伝子の３′−及び５′−フラ
ンキング（flanking）配列に関する配列情報を提供す
る。その結果、インビトロ（in vitro）で該配列を発現
ベヒクルへ結合することが容易になる。特に本発明は、
所謂成熟ヒト免疫インターフェロンのアミノ酸配列の直
前に位置する所謂内因性（endogenous）シグナルポリペ
プチドをコードする５′−DNAセグメントを提供する。
これらの知見に基いて、組換えDNA技術を用いることに
より十分な量のヒト免疫インターフェロンの産生手段及
び方法の開発が次第に可能となり、従ってこの物質の生
化学的特性及び生物活性の測定も可能になった。

本発明のバックグラウンドを明らかにし且つ特定の場合
には本発明の実施に関する詳細を補う目的で、本文中に
多くの刊行物及び学術論文を参考として引用した。便宜
上、これらの参考文献に参照番号を付し、目録として本
明細書末尾に添付した。本文中では参考文献を参照番号
で示す。

ヒトインターフェロンは抗原性、生物学的特性、生化学
的特性の違いに基いて３つのグループに分類し得る。

第１グループはヒト白血球インターフェロン（α−イン
ターフェロン、LeIF又はIFN−α）類である。このグル
ープのインターフェロンは、通常、ヒト血液の成分細胞
のウィルス誘発によって主として産生する。IFN−α
は、既に、微生物で産生され、生物学的に活性であるこ
とが知見され（後記参考文献１、２及び３参照。以下、
同様に、括弧でくくった参照番号によって後掲の参考文
献を引用して示す）、ウィルス感染症及び悪性腫瘍状態
の治療薬としての臨床使用が促進されている（４）。

第２グループはヒト線維芽細胞インターフェロン（β−
インターフェロン、FIF又はIFN−β）である。このグル
ープのインターフェロンは、通常、線維芽細胞のウィル
ス誘発によって産生する。IFN−βも同じく微生物で産
生され、広い範囲の生物学的活性を示すことが知見され
た（５）。臨床試験もIFN−βの潜在的治療価値を示唆
している。

IFN−αとIFN−βは、アミノ酸レベルでの相同（homolo
gy）の程度が比較的低いにもかかわらず、生物学的特性
が極めて類似している。更に、これらのインターフェロ
ンはいずれも、165乃至166個のアミノ酸を含み且つ酸に
対して安定なタンパクである。

本発明の目的たるヒト免疫インターフェロン（IFN−
γ、ヒトガンマインターフェロンともいう）は、IFN−
α及びIFN−βと対照的にpH 2で不安定であり、主とし
てリンパ球のマイトゲン誘発によって産生し、しかも明
らかに異なった抗原性を示す。すなわちヒトIFN−γは
ヒトIFN−γ抗血清により中和されるが、ヒトIFN−αに
対する抗体またはヒトIFN−βに対する抗体のいずれに
よっても中和されない。

最近まで、ヒトIFN−γは極めて低いレベルでしか検出
されなかったため、特性決定が困難であった。最近にな
って、ヒトIFN−γのかなり進んだ精製が報告された
（６）が、この精製もまだ部分的なものである。この報
告によれば、フイトヘムアグルチニン（phytohaemagglu
tin）とホルボールエステル（phorbol ester）との組合
せを用いてリンパ球培地（カルチャー）を刺激して化合
物（IFN−γ）を産生し、一連のクロマトグラフ分離に
よってこの化合物を精製した。この方法で分子量58,000
の産生物が得られた。

mRNAを卵母細胞中で翻訳するとヒトIFN−γに特有のイ
ンターフェロン活性を示す極めて少量のヒトIFN−γが
産生した。これにより、IFN−γ cDNAの合成及びクロー
ニングが可能であると予想された（７）。

これまでは、十分な量のIFN−γが得られなかったた
め、精製した成分の特性決定及び生物学的特性を明らか
にするための実験を行なうことができなかった。しかし
乍ら、粗製剤を用いたインビトロ（in vitro）テスト及
びネズミIFN−γ製剤を用いたインビボ（in vivo）テス
トにより、IFN−γの主たる作用は免疫調節剤たる作用
であろうと推定されていた（8,9）。IFN−γは、全ての
ヒトインターフェロンに共通の抗ウィルス活性及び抗細
胞活性を有しており、加えて、IFN−α及びIFN−βの活
性に相乗効果を与える（10）。更に、腫瘍細胞に対する
IFN−γのin vitro抗増殖効果は、他のグループのイン
ターフェロンの約10乃至100倍であると報告された（8,1
1,12）。この結果と顕著な免疫調節作用（8,9）とを合
せて考慮すると、IFN−γはIFN−α及びIFN−βよりも
遥かに顕著な抗腫瘍作用を有すると推定される。事実、
マウス及びネズミIFN−γ製剤を用いたin vivoテストで
は、骨肉腫に対する抗腫瘍作用が、抗ウィルス的に誘発
されたインターフェロンよりも明らかにすぐれているこ
とが証明された（13）。

IFN−γが極めて入手し難いため本発明以前の前記の如
きテストではいずれも、かなり粗な製剤を使用せざるを
得なかった。にもかかわらず、これらのテストからIFN
−γの極めて重要な生物学的作用を確信することができ
た。IFN−γは、抗ウィルス活性を保有するのみでな
く、多分強力な免疫調節剤及び抗腫瘍活性を有してお
り、極めて有望な治療薬になり得る筈である。

以上をまとめるならば、本発明以前にIFN−γの存在は
知られその生物学的作用面における有効性が期待されて
いたにもかかわらず、IFN−γは純粋なかたちで単離さ
れていなかった。

組換えDNA技術を応用した方法によって、必要な量のヒ
トIFN−γを極めて有効に産生し得ることが判明した。
産生される物質は、天然のヒト由来物質の特徴であると
思われるグリコシレーション（glycosylation）を含む
か否かに関わり無く、ウィルス，新生（腫瘍）及び免疫
抑制の見られる種々の症状又は病気の治療のために臨床
使用することが可能な生物活性を示すであろう。

組換えDNA技術は、かなり複雑な応用の段階に到達し
た。分子生物学者は、種々のDNA配列をかなり容易に組
換えて、形質転換微生物中で大量の外因性（exogenou
s）タンパク産物を産生し得る新しいDNA完全体を作成し
得る。種々の平滑末端又は“付着”末端を有するDNA断
片をin vitroで結合し、特定微生物の形質転換に使用し
得る有効な発現ベヒクルを製造し、これらのベヒクルに
所望の外因性産物を有効に合成させるための一般的な手
段及び方法はすでに開発されている。しかし乍ら、個々
の産物に関しては、技術がまだ開発途上であり、常に成
功を予測し得るほどには技術は進歩していない。実際、
実験による裏付けをもたずに結果の成功を予言した学者
もいるが、彼等の方法は、実行不能である危険を含む。

プラスミド、すなわちしばしば細胞１個当りマルチコピ
ーとして細菌又は他の微生物中に見出される二本鎖DNA
の非染色体ループは依然として組替えDNA技術の基本的
要素である。プラスミドDNAがコードする情報には、娘
細胞内でプラスミドを再生するのに必要な情報、すなわ
ち複製の開始点（オリジン）が含まれ、さらに通常は、
所望のプラスミドを含有する宿主細胞のクローンを識別
し且つ選択倍地で優先的に増殖させうるような１つもし
くはそれ以上の選択特性、たとえば抗生物質に対する耐
性が含まれる。プラスミドの有用性は、それぞれプラス
ミドDNA以上の異なる部位を識別する或る種の制限エン
ドヌクレアーゼすなわち「制限酵素」により特異的に開
裂させうる点にある。その後、開裂部位またはこの開裂
部位に隣接して再構成した末端における末端−末端結合
により、異種遺伝子もしくは遺伝子断片をプラスミド中
に挿入することができる。このようにして、いわゆる複
製可能な発現ベヒクルが形成される。DNAの組換えは細
胞の外部で行なわれ、得られた「組換え体」である複製
可能な発現ベヒクル、すなわちプラスミドを形質転換と
して知られる過程により細胞中に導入し、この形質転換
体を増殖させることにより組換えベヒクルを多量に得る
ことができる。さらに、コードされているDNAメッセー
ジの転写及び翻訳を支配するプラスミドの部分に対して
遺伝子が適正に挿入されれば、得られる発現ベヒクルを
使用して挿入遺伝子がコードするポリペプチド配列を実
際に産生させることができる。この過程を発現と名付け
る。

発現は、プロモーターとして知られる領域で開始され
る。RNAポリメラーゼがこのプロモーターを識別し結合
する。発現の転写期において、DNAはほどけて（unwindi
ng）、DNA配列からメッセンジャーRNAを合成する鋳型と
して露出させる。次いで、メッセンジャーRNAは、メッ
センジャーRNAがコードしていたアミノ酸配列を有する
ポリペプチドに翻訳される。各アミノ酸はヌクレオチド
トリプレットすなわち「コドン」によりコードされ、こ
のコドンが集合して「構造遺伝子」すなわち発現される
ポリペプチド産生物のアミノ酸配列をコードする部分を
構成する。翻訳は「開始」信号（通常ATGであって、こ
れは得られるメッセンジャーRNAにおいてはAUGになる）
において開始する。いわゆる停止コドンは翻訳の終了を
規定し、従ってそれ以後アミノ酸ユニットは産生されな
い。産生した産生物は、必要に応じ微生物系で宿主細胞
を溶菌しかつ他の細胞蛋白質を適当に精製除去して産生
物を回収することにより得られる。

実際、組換えDNA技術の使用により、いわゆる直接的発
現法により全く異種のポリペプチドの発現が可能にな
り、或いは同種ポリペプチドのアミノ酸配列の一部と融
合した異種ポリペプチドを発現させることもできる。後
者の場合、目的とする生物活性産生は、時に、融合した
同種／異種ポリペプチド中で、細胞外環境において開裂
されるまで、生物的に不活性の形で存在する。英国特許
出願公開第2007676A号及びWetzel,American Scientist,
68,664（1980）参照。

遺伝学及び細胞生理学を研究するための細胞培養又は組
織培養技術は十分に確立している。単離した正常細胞か
ら連続トランスファ処理により永久細胞系（permanent
cell line）を得てこれを維持する手段及び方法もすで
に知られている。研究に使用するためには、これらの細
胞系を液体培地中の固体担体上に維持するか、又は栄養
支持体を含む懸濁液中で増殖させる。機械的な問題さえ
解決できれば量産は容易である。技術の現状を更に十分
に理解するために、Microbiology,第２版、Harper and
Row,Publishers,Inc,Hagerstown,Maryland（1973）、特
に1122頁以降、及び、Scientific American,245,66頁以
降（1981）を参考文献として引用する。

本発明は、ヒトIFN−γが組換えDNA技術によって、好ま
しくは直接的な形態で、且つ市場で認可されるための動
物実験及び臨床試験を開始し且つ実施するに充分な量
で、上手く産生し得るという知見に基いている。産生物
は、その全ての形態において、人間のウィルス感染、悪
性腫瘍及び免疫抑制又は免疫欠如状態に対する予防又は
治療処置での使用に適している。その形態は、様々な可
能性のあるオリゴマーの形態を含んでおり、又、グリコ
シレーション（associated glycosylation）を含むこと
もある。産生物は遺伝学的に操作された微生物又は細胞
培養系（セルカルチャーシステム）により産生される。
従って、従来よりも有効にヒトIFN−γを産生し、単離
し得る可能性がある。その最適具体例は、単離し得る量
且つ成熟形態（mature form）でヒトIFN−γが産生され
て宿主細胞から分泌されるように微生物又はセルカルチ
ャーを遺伝学的に製造する方法である。

本発明は、このように産生されるヒトIFN−γ並びにそ
の産生手段及び方法を含む。本発明は更に、発現可能な
形態でヒトIFN−γをコードする遺伝子配列を含む複製
可能なDNA発現ベヒクルに係る。更に本発明は、前記発
現ベヒクルで形質転換した微生物菌株又はセルカルチャ
ーに係り、又、ヒトIFN−γを産生し得る前記の如く形
質転換された菌株又はカルチャーの微生物カルチャー又
はセルカルチャーに係る。更に本発明は、前記IFN−γ
遺伝子配列、DNA発現ベヒクル、微生物菌株及びセルカ
ルチャーを調製するのに有用な種々の方法並びに特定の
具体例に係る。更に本発明は、前記微生物及びセルカル
チャーの醗酵カルチャー（培地）の調製に係る。さらに
本発明は、直接発現産物として成熟形態で宿主細胞から
分泌されるヒトIFN−γの製造に係る。この方法は、成
熟ヒトIFN−γの配列をコードする遺伝子に加えて、シ
グナルポリペプチドをコードする５′−フランキングDN
A配列を使用する。シグナルポリペプチドは、宿主細胞
の細胞壁への分子を運搬する際に補助的役割を果し、こ
の細胞壁において成熟ヒトインターフェロン産生物の分
泌過程中に開裂されると信じられている。この具体例に
より、細胞内宿主タンパク質又は細胞砕片の汚染物を除
去するように設計された関連方法を用いなくても、意図
する成熟IFN−γを単離且つ精製し得るようになる。

本明細書中、「成熟ヒトIFN−γ」とは、シグナルペプ
チド又はプレシーケンスペプチドを伴わないヒトIFN−
γの微生物又はセルカルチャー産生物を示し、このシグ
ナルペプチド又はプレシーケンスペプチドはヒトIFN−
γ mRNAの翻訳の際に常に存在するものである。従って
本発明は、第一アミノ酸としてのメチオニンを有してい
る（構造遺伝子の前にATG開始シグナルコドンを挿入す
ることにより存在する）か、或いはメチオニンが細胞内
で又は細胞外で開裂されている場合は第一アミノ酸とし
てのメチオニンを欠いている成熟ヒトIFN−γを提供す
る。成熟ヒトIFN−γは通常のシグナルポリペプチド以
外のものとの複合タンパク質として産生され得、この複
合体は細胞外環境で特定的に開裂され得る（英国特許出
願公開第2007676A号参照）。最後に、成熟ヒトIFN−γ
は外因性の余分のポリペプチドを開裂除去する必要もな
く直接発現により産生され得る。発現ベヒクルがシグナ
ルペプチドと成熟ヒトインターフェロンとを一緒に発現
し且つ所与の宿主がシグナルペプチドを除去できないか
或いは有効的に除去できない場合にはこのことは特に重
要である。このように産生された成熟ヒトIFN−γは、
ウィルス病、悪性腫瘍及び免疫抑制又は免疫欠如状態の
治療に使用し得る適合レベルにまで回収、精製される。

本発明の生理活性ポリペプチドは次のようにして得られ
た。

1. ヒト組織、例えばヒト脾組織又は末梢血液リンパ球
をIFN−γの産生を刺激するためマイトゲンと共に培養
した。

2. 前記セルカルチャーからのセルペレットについて、
全細胞質RNAを単離するためリボヌクレアーゼ阻害剤の
存在下で抽出した。

3. オリゴdT−カラムによりポリアデニル酸形態の全メ
ッセンジャーRNA（mRNA）を単離した。このmRNAをショ
糖密度勾配と酸−尿素ゲル電気泳動法とを用いてサイズ
分画した。

4. 適当なmRNA（12乃至18S）を対応する一本鎖相補DNA
（cDNA）に転換し、これから二本鎖のcDNAを産生した。
ポリ−dCテーリング（poly−dC tailing）の後、前記DN
Aを一つ又は複数の表現型マーカーを有するプラスミド
のようなベクターの中に挿入した。

5. このように調製されたベクターを使用してコロニー
ライブラリを提供する細菌細胞を形質転換した。前記の
ように誘導された誘発及び非誘発mRNAから調製された同
位体標識cDNAを複数に移されたコロニーライブラリ（du
plicate colony libraries）を個別に試験するために用
いた。次に余分のcDNAを除去し、誘発cDNAクローンを同
定するためコロニーをＸ線フィルムに露出させた。

6. 誘発cDNAクローンから対応するプラスミドDNAを単
離し、配列決定した。

7. 次に配列決定されたDNAを適当な発現ベヒクルの中
に挿入するためにin vitro処理し、この発現ベヒクルを
適当な宿主細胞を形質転換するために用い、この宿主細
胞を今度は培地の中で増殖させ、所望のヒトIFN−γ産
生物を発現させた。

8. このようにして産生したヒトIFN−γは確かにシス
テインで始まるその成熟形態で146個のアミノ酸を有し
ており、その特性は非常に塩基性である。その単量体分
子量は17,140と計算された。恐らく多くの塩基性残基、
疎水性，塩ブリッジ形成等が存在するため、分子はオリ
ゴマーの形で例えば二量体、三量体又は四量体の形でそ
れ自身会合する。天然物質で以前に観察された高分子量
（６）は、アミノ酸配列のみに基づいて計算され得なか
ったものであり、翻訳後のグリコシレーションによる炭
水化物の寄与と同様そのようなオリゴマーの存在に基づ
くものかもしれない。

9. 幾つかの宿主細胞システムでは、特に20個のアミノ
酸のシグナルペプチドと共に発現されるように発現ベヒ
クルに結合したとき、ヒトIFN−γの成熟形態はセルカ
ルチャー培地の中に運ばれ、回収及び精製方法において
測り知れないほど助けとなる。

A. 微生物／セルカルチャー 1. 細菌株／プロモーター ここに記載する本発明の好適具体例は、とりわけ、英国
特許出願公開第2055382A号に記載の微生物E.coli K−12
株294（end A,thi^- hsr^- k^hsm+）を用いて実施した。こ
の菌株はブタペスト条約に基づいてアメリカン タイプ
カルチャー コレクションに、ATCC寄託番号第31446
号で寄託されている。しかし、他の種々の微生物菌株、
例えば、E.coli B,E.coli X 1776（ATCC第31537号）,E.
coli W 3110（F^- λ⁻原始栄養株protrophic）（ATCC第
27325号）のような公知のE.coli菌株或いは他の微生物
菌株も有用であり、これらの微生物菌株の多くは寄託さ
れており、アメリカンタイプカルチャーコレクション
（ATCC）のような認可された微生物寄託施設から入手し
うる（可能性がある）。ATCCカタログリスト参照。又、
ドイツ公開公報第2644432号参照。これらの他の微生物
には、例えばBacillus subtilisのようなBacilli並びに
Salmonella typhimurium及びSerrantia marcesansのよ
うな他の腸内菌等があり、これらは異種遺伝子配列を複
製し、発現し得るプラスミドを用いて使用される。

例えば、ベータラクタマーゼ及びラクトースプロモータ
ーシステムが、異種ポリペプチドの微生物的産生を開始
させ且つ維持するために有利に用いられた。これらのプ
ロモーターシステムの構成と構造に関する詳細はChang
et al.,Nature,275,617（1978）及びItakura et al.,Sc
ience,198,1056（1977）を参照されたい。最近、トリプ
トファンに基くシステム、いわゆるtrpプロモーターシ
ステムが開発された。このシステムの構成と構造に関す
る詳細はGoeddel et al.,Nucleic Acids Research,8,40
57（1980）及び1980年３月24日付で出願されたKleid et
al.の米国特許出願U.S.S.N.第133,296号を参照された
い。他の多くの微生物プロモーターが発見され利用され
ており、当業者がプラスミドベクター中に機能的にそれ
らを結合し得るようにそのヌクレオチド配列に関する詳
細が発表されている。例えばSiebenlist et al.,Cell,2
0,269（1980）参照。

2. 酵母菌株／酵母菌プロモーター ここで用いる発現システムはE.coliと酵母菌のSaccharo
myces cerevisiaeとの両方において選択と複製が可能な
プラスミドYR p7（14,15,16）でもよい。酵母菌での選
択のため、プラスミドはTRP1遺伝子（14,15,16）を含有
し、この遺伝子は酵母菌の第IV染色体に見い出されるこ
の遺伝子上の突然変異（17）を含む酵母菌を補足する
（すなわちトリプトファンの不存在下での増殖を許容す
る）。ここではアメリカンタイプカルチャーコレクショ
ンに制限なしに寄託されているSaccharomyces cerevisi
ae菌株RH218（ATCC寄託番号第44076号）（18）を用い
た。しかし、菌体をtrp 1にする突然変異を含むどのSac
charomyces cerevisiae菌株も発現システムを含むプラ
スミドの発現のための有効な環境となり得るということ
が理解されよう。他の菌株pep 4−１（19）も用い得
る。このトリプトファン栄養要求菌株も又TRP1遺伝子上
に点突然変異を有している。

（アルコール脱水素酵素１用の）酵母菌遺伝子由来５′
−フランキングDNA配列（プロモーター）を非酵母菌遺
伝子の５′−側に配置し、外来遺伝子をプラスミド中に
配置し、これを用いて酵母菌を形質転換すると、酵母菌
中で異種遺伝子の発現を促進（プロモート）し得る。プ
ロモーターの他に更に、酵母菌での非酵母菌遺伝子の適
正な発現には第二の酵母菌配列を必要とし、この第二の
配列は酵母菌での適正な転写終了とポリアデニル化とを
許容するためプラスミド上で非酵母菌遺伝子の３′−末
端に配置される。このプロモーターも他のものと同様に
本発明で好適に用いられ得る（以下参照）。好ましい具
体例では、酵母菌３−ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝
子（20）の５′−フランキング配列を構造遺伝子の上流
に配置し、この構造遺伝子に続いて更に終了−ポリアデ
ニル化シグナル含有DNA、例えばTRP1遺伝子（14,15,1
6）又はPGK遺伝子（20）を配置して使用する。

酵母菌５′−フランキング配列は（３′−酵母菌終了DN
Aと共に使用すると、後述）酵母菌での外来遺伝子の発
現を促進し得るため、高度に発現されたいかなる酵母菌
遺伝子の５′−フランキング配列も重要な遺伝子産物の
発現に用い得る。或る環境の下で酵母菌は糖分解酵素と
しての可溶性蛋白質を65％まで発現し（21）、且つこの
高レベルは個々のmRNAの高レベル産生の結果と思われる
（22）から、いかなる他の糖分解遺伝子の５′−フラン
キング配列もそのような発現目的に使用し得る筈であ
る。例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−燐
酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸脱炭
酸酵素、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−燐
酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピ
ルビン酸キナーゼ、三炭糖燐酸イソメラーゼ、ホスホグ
ルコースイソメラーゼ及びグルコキナーゼ等。これらの
遺伝子の３′−フランキング配列のいずれも上述のよう
な発現システムで適正な終了及びmRNAポリアデニル化に
用いられ得る。他の幾つかの高度に発現された遺伝子は
酸性ホスファターゼ（23）遺伝子であり、５′−フラン
キング領域での突然変異（発現を高める突然変異体）、
通常TY1転移可能要素（transposable element）（24）
の存在により高レベルの産生を発現する遺伝子である。

前記遺伝子は全て酵母菌RNAポリメラーゼII（24）によ
り転写されると考えられる。リボゾームRNA,5S RNA及び
tRNA（24,25）に対する遺伝子を転写するRNAポリメラー
ゼＩ及びIIIに対するプロモーターも又そのような発現
構成で有用であり得る。

最後に、多くの酵母菌プロモーターは又転写制御作用を
有しており、従って増殖条件の変化によりオフにしたり
オンにしたりし得る。そのような酵母菌プロモーターは
例えば次の蛋白質を産生する遺伝子である。即ち、アル
コールデヒドロゲナーゼII,イソチトクロム−c,酸性ホ
スファターゼ、窒素代謝と関連した分解酵素、グリセル
アルデヒド−３−燐酸デヒドロゲナーゼ、麦芽糖とガラ
ククトース利用に関係する酵素（22）等である。そのよ
うな制御領域はタンパク産生物の発現を制御するのに、
特にそれらの産生が酵母菌に対し有毒であるとき、非常
に有用であろう。又高度に発現された遺伝子由来のプロ
モーター含有５′−フランキング配列を一つの５′−フ
ランキング配列の制御領域と組み合わせることも可能で
あろう。この結果ハイブリッドプロモーターが生じ、制
御領域とプロモーターは物理的に別個のDNA配列である
と思われるためこの組み合わせは可能であろう。

3. セルカルチャーシステム／セルカルチャーベクター 培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は最近では通
常の方法となった（Tissue Culture,Academic Press,Kr
use and Patterson eds.,1973参照）。ここではIFN−γ
産生用宿主としてCOS−７系サル腎線維芽細胞を用いた
（25a）。しかし、ここに詳細に説明する実験は、適合
性のベクターを複製及び発現し得るいかなる細胞系でも
遂行され得る。例えば、WI38,BHK,3T3,CHO,VERO,及びHe
La細胞系等。更に発現ベクターに必要とされるものは、
複製のオリジン（開始点）並びに発現されるべき遺伝子
の前に配置されたプロモーターであり、これらは必要な
リボゾーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニ
ル化部位、及び転写終了配列と共に配置される。本発明
ではSV40のこれらの本質的な要素を使用し、好ましい具
体例として本発明を説明するが、本発明はこれらの配列
に限定されるべきでないことが理解されよう。例えば、
宿主DNAに組み込まれていない状態で機能し得るDNA複製
の細胞性オリジンと同様、他のウィルス（例えば、Poly
oma,Adeno,VSV,BPV等）性ベクターの複製オリジンも用
い得る。

B. ベクターシステム 1. E.coliでの成熟IFN−γの直接発現 成熟インターフェロンポリペプチド（マイナスシグナル
配列）としてE.coliでIFN−γを直接発現させるために
用いた方法は、それが合成Ｎ−末端とcDNAの結合を含ん
でいるので、ヒト成長ホルモン（26）とヒトIFN−α
（１）に対して以前に用いた方法の変形である。

後述されるp69のヌクレオチド配列から、並びに幾つか
のIFN−α（２）のシグナルペプチドと成熟ポリペプチ
ドとの間の公知の開裂部位との比較により推論されるよ
うに、IFN−γは、20個のアミノ酸から成る疎水性シグ
ナルペプチド及びそれに続く成熟IFN−γの146個のアミ
ノ酸を有している（第５図）。第７図に示されているよ
うに、BstN I制限エンドヌクレアーゼ部位は、好都合な
ことに、成熟IFN−γの第四アミノ酸に位置している。A
TG翻訳開始コドン、第一、二、三アミノ酸（システイン
−チロシン−システイン）のコドンを、導入し且つEcoR
I付着末端を創出するために、２つの合成デオキシオリ
ゴヌクレオチドが設計された。これらのデオキシオリゴ
ヌクレオチドをp69の1100塩基対BstN I−Pst I断片に結
合し、IFN−γをコードし且つEcoR I及びPst I制限部位
を末端に有する1115塩基対の合成−天然ハイブリッド遺
伝子を構成した。この遺伝子をEcoR IとPst I部位間で
プラスミドpLeIF A trp 103に挿入し、発現プラスミドp
IFN−γ trp 48を構成した。このプラスミドではIFN−
γ遺伝子はE.coli trpプロモーターの制御下で発現さ
れ。（pLeIF A trp 103はpLeIF A 25の誘導体であり、L
eIF A遺伝子から遠位のEcoR I部位が除去されている。
このEcoR I部位を除去するために用いられた方法につい
ては既に公表されている（27）。尚、プラスミドpLeIF
A 25は、大腸菌中でヒト白血球インターフェロン（ヒト
LeIF）を高レベルで発現させるのに適しており、pBR322
から構成されたものである（１）。） 2. 酵母菌での発現 IFN−γをコードするcDNAのような異種遺伝子を酵母菌
で発現するため、４つの成分を含むプラスミドベクター
を構成することが必要であった。最初の成分はE.coliと
酵母菌の両方の形質転換を可能にする部分であり、従っ
て各菌の選択し得る遺伝子を含んでいなければならな
い。（ここでは、これはE.coliのアンピシリン耐性遺伝
子及び酵母菌のTRP1遺伝子である。）この成分は又両方
の生体中でプラスミドDNAとして維持されるために両方
の生体の複製オリジンを必要とする。（ここでは、これ
はpBR322のE.coliオリジン及び酵母菌の第III染色体のa
rs1オリジンである。） プラスミドの第二の成分は、下流に位置する構造遺伝子
の転写をプロモートするための、高度に発現された酵母
菌遺伝子の５′−フランキング配列である。ここで用い
た５′−フランキング配列は酵母菌３−ホスホグリセリ
ン酸キナーゼ（PGK）遺伝子の配列である。断片はPGK構
造遺伝子配列のATGからこのATGから上流の8bpまでを切
り出すようにして構成された。５′−フランキング配列
に構造遺伝子がうまく結合するように、この５′−フラ
ンキング配列はXba I及びEcoR I制限部位の両方を含む
配列で置換されている。

システムの第三の成分はATG翻訳開始シグナルと翻訳停
止シグナルの両方を含むように構成された構造遺伝子で
ある。そのような遺伝子の単離と構成については以下で
説明する。

第四の成分は酵母菌遺伝子の３′−フランキング配列を
含む酵母菌DNA配列であり、これは転写終了とポリアデ
ニル化の適正なシグナルを含んでいる。これらの成分が
全て存在した場合に、IFN−γが酵母菌で産生された。

3. 哺乳動物セルカルチャーでの発現 哺乳動物細胞培養（セルカルチャー）の免疫インターフ
ェロンの合成方法は、異種転写ユニットの制御下で外来
遺伝子の自律的複製と発現の両方が可能なベクターの開
発に依存していた。組織培養でのこのベクターの複製
は、ベクターに（SV40ウィルス由来の）DNA複製オリジ
ンを提供することと、ヘルパー機能としてＴ抗原を内因
的に発現する細胞系（28,29）へベクターを導入するこ
とで達成された。SV40ウィルスの後期プロモーターはイ
ンターフェロンの構造遺伝子の上流に存在し、遺伝子の
転写を確保していた。

IFN−γを発現させるために用いたベクターは、DNA複製
のE.coliオリジンとともにE.coliでの選択のために選択
し得るマーカー（アンピシリン耐性）を提供するpBR322
配列で構成されていた。これらの配列は、プラスミドpM
L−１（28）から誘導され、EcoR I及びBamH I制限部位
に及ぶ領域を含んでいた。SV40オリジンはこの領域（3
0,31）を含む342塩基対Pvu II−Hind III断片から誘導
される（両方の末端はEcoR I末端に転換される）。これ
らの配列は、DNA複製のウィルス性オリジンを含むのに
加えて、初期及び後期転写ユニットの両方に対するプロ
モーターをコードしている。SV40オリジン領域の方向性
は、後期転写ユニットに対するプロモーターがインター
フェロンをコードする遺伝子の近くに配置されるように
した。

第１図は、誘発末梢血リンパ球（PBL）ポリ（Ａ）＋RNA
の蔗糖密度勾配遠心分離の結果を示している。インター
フェロン活性を有する２つのピークが12Sと16Sのサイズ
で観察された（斜線を付したヒストグラムにより示され
ている）。リボソームRNAマーカー（別個に遠心分離し
た）の位置は吸収プロフィールの上方に示した。

第２図は、誘発PBLポリ（Ａ）＋RNAの酸−尿素−アガロ
ース電気泳動の結果を示している。18S RNAと共に移動
するたった一つの活性ピークが観察された。隣接するレ
ーンで電気泳動にかけ且つ臭化エチジウム染色により可
視化したリボソームRNAマーカーの位置は活性プロフィ
ールの上方に示した。

第３図は、誘発及び非誘発の³²P−標識cDNAプローブと9
6個のコロニーとのハイブリダイゼーションパターンを
示す。96個の個々の系質転換体をマイクロタイタープレ
ートで成育させ、レプリカ（replica）を２枚のニトロ
セルロース膜上に移し、次にフィルターを誘発mRNA（第
３図Ａ）か或いは非誘発PBLカルチャーから単離したmRN
A（誘発されていない、第３図Ｂ）から調製した³²P−cD
NAプローブとハイブリダイズした。フィルターをハイブ
リダイズしていないRNAを除去するため洗浄し、次にＸ
線フィルムに露出させた。このフィルターのセットはそ
のような86個のセット（8300個の独立したコロニー）の
典型例を表わしている。「誘発」クローンの例はH12と
して示されている。

第４図は、クローン69cDNA挿入物の制限エンドヌクレア
ーゼマップである。cDNA挿入物はPst I部位（両端に点
で示す）とオリゴdC−dGテール（１本線で示す）を末端
に有している。制限ヌクレアーゼ開裂により生成する断
片の数と大きさは６％アクリルアミドゲル電気泳動によ
り評価した。部位の位置は核酸配列（第５図に表示）に
より確認された。最大のオープン解読フレームのコード
領域は箱型に囲われており、斜線領域は推定した20残基
シグナルペプチゾ配列を表わし、他方点の領域は成熟IF
N配列（146アミノ酸）を表わしている。mRNAの５′末端
は左側にあり、３′末端は右側にある。

第５図は、プラスミドp69 cDNA挿入物のヌクレオチド配
列を示している。しかしながら、この配列はIFN−γ中
の最も普遍的な相同形（allelic form）を示している。
最大のオープン解読フレームの推定アミノ酸配列も示さ
れている。推定シグナル配列はS1からS20まで示す残基
により表わされている。

第６図は、IFN−γ mRNA構造とIFN−α及びIFN−βの構
造との比較図である。クローン69 mRNA（IFN−γ）はか
なり多量の翻訳されない配列を含んでいる。

第７図は、IFN−γ発現プラスミドpIFN−γ trp 48の構
成を示す模式図である。出発物質はプラスミドp69から
の1250塩基対Pst I cDNA挿入物である。

第８図は、サル細胞でのIFN−γの発現に用いられるプ
ラスミドの構造を示す図である。

第９図は、８種のEcoR I消化ヒトゲノムDNAをp69のcDNA
挿入物からの³²P−標識600塩基対Dde I断片とハイブリ
ダイズするSouthernハイブリダイゼーションの結果を示
す。２つのEcoR I断片は明らかに各々のDNAサンプル中
でプローブとハイブリダイズする。

第10図は、６種の制限エンドヌクレアーゼで消化したヒ
トゲノムDNAをp69由来³²P−標識プローブとハイブリダ
イズするSouthernハイブリダイゼーションの結果を示
す。

第11図は、PGKプロモーターが単離されたベクターpB1の
3.1 kbp Hind III挿入物の制限マップを示す。PGK遺伝
子の５′−フランキングDNAへのEcoR I部位及びXba I部
位の挿入が示されている。

第12図は、Xba I部位及びEcoR I部位の挿入前のPGK遺伝
子に対する初期コード配列を加えた５′−フランキング
配列を示す。

第13図は、PGKプロモーター上の位置−８にXba I部位を
挿入するために、及びこのXba 末端及びSau3A末端を含
むPGKの５′−フランキング配列の39bp断片を単離する
ために用いられた技術を図式的に示す。

第14図は、上記39bp断片、Pvu IからSau3Aまでの付加PG
K 5′−フランキング配列（265bp）（第11図参照）とXb
a Iに隣接するEcoR I部位とを含む300bp断片の構成を図
式的に示す。

第15図は、第14図で構成された断片に加えて、PGK 5′
−フランキング配列のHind IIIからPvu Iまでの1300bp
断片（第11図参照）を含む1500bpPGKプロモーター断片
（Hind III/EcoR I）の構成を図式的に示す。

第16図は、改良PGKプロモーター、IFN−γ cDNA及び酵
母菌PGK遺伝子の終了領域とを含む酵母菌でのヒトIFN−
γに対する発現ベクターの構成を示す。これについては
以下に詳細に説明する。

A. IFN−γ mRNAの起源 末梢血リンパ球（PBL）を白血球泳動法により人間の提
供者から採取した。PBLを更にフイコール−ハイパック
（Ficoll−Hypaque）勾配遠心法により精製し、次にRPM
I1640、１％Ｌ−グルタミン,25mMのHEPES（Ｎ−２−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン
酸）及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（Gi
bco,Grand Island,NY）中５×10⁶個/mlの細胞濃度で培
養した。これらの細胞をマイトゲンぶどう球菌のエンテ
ロトキシンＢ（１μg/ml）により誘発してIFN−γを産
生させ、５％のCO₂中37℃で24時間から48時間培養し
た。IFN−γ活性の相対収率を増加させるためデスアセ
チルチモシン−α−１（0.1μg/ml）をPBL培養物に加え
た。

B. メッセンジャーRNAの単離 PBL培養物からの全RNAを本質的にBerger,S.L.et al.（3
3）により報告されているようにして抽出した。細胞を
遠心によってペレットにし、次に10mMのNaCl,10mMのト
リス−HCl（pH7.5）、1.5mMのMgCl₂及び10mMのリボヌク
レオシドバナジル複合体中に再懸濁した。細胞をNP−40
（最終濃度１％）の添加により溶解し、核を遠心により
ペレットにした。上澄みは全RNAを含んでおり、これを
多数回のフェノール及びクロロホルム抽出により更に精
製した。水相をNaCl 0.2Mにし、次に全RNAを２倍量のエ
タノールの添加により沈殿させた。非誘発（刺激しな
い）培養物からRNAを同じ方法により単離した。オリゴ
−dTセルロースクロマトグラフィーを全RNA標本（34）
からmRNAを精製するために用いた。培養したPBL1〜２
からの典型的な収量は、全RNAが５乃至10mgであり、ポ
リ（Ａ）＋RNAが50乃至200μｇであった。

C. mRNAのサイズ分画 mRNA標本を分画するため２つの方法を用いた。これらの
方法は（一緒によりむしろ）別々に用いられ、その結果
各々でかなりの量のIFN−γ mRNAが得られた。

mRNAを分画するために、変性剤ホルムアミドの存在下で
のショ糖勾配遠心法を用いた。70％のホルムアミド中の
５％乃至25％のショ糖勾配（32）を20℃で１時間154,00
0×ｇで遠心した。次に連続画分（0.5ml）を勾配の頂部
から除去し、エタノール沈殿し、その一定量をmRNAの翻
訳のためXenopus laevis卵母細胞の中に注入した（3
5）。室温に24時間置いた後、Stewart（36）により説明
されたWISH（ヒト羊膜）細胞上でVesicular Stomatitis
ウィルス（インディアナ株）又はEncephalomyocarditis
ウィルスを用いる標準的細胞変性効果抑制試験でインキ
ュベーション培地の抗ウィルス活性を分析した。ただ
し、ここでは、ウィルス感染に先立ち（４時間のかわり
に）24時間サンプルを細胞とインキュベートした。２つ
の活性ピークが常にショ糖密度勾配分画RNAで観察され
た（第１図）。片方のピークは12Sの計算値（サイズ）
で沈降し、注入RNA 1μｇにつき（IFN−α基準で）100
−400ユニット/mlの抗ウィルス活性を有していた。活性
の他方のピークはサイズ16Sで沈降し、遅い沈殿ピーク
の活性の約半分を有していた。ヒトIFN−γが効果を有
しないウシ細胞系（MDBK）で同じ画分を分析しても活性
が観察されなかったことから、これらの各々の活性ピー
クはIFN−γによるものと思われる。IFN−α活性とIFN
−β活性の両方ともMDBK分析で容易に検出される筈であ
る（５）。

mRNA（200μｇ）の分画を、酸−尿素−アガロースゲル
電気泳動法でもおこなった。スラブアガロースゲル（3
7,38）を、1.75％アガロース、0.025Mクエン酸ナトリウ
ム（pH3.8）及び6M尿素で構成した。電気泳動を25ミリ
アンペア、４℃で７時間おこなった。次にゲルをかみそ
りの刃で細分した。個々の薄片を70℃で溶解し、フェノ
ールで二度、クロロホルムで一度抽出した。次に画分を
エタノール沈殿させ、その後Xenopus laevis卵母細胞に
注入し抗ウィルス分析によりIFN−γ mRNAを分析した。
たった一つの活性ピークがゲル分画サンプルで観察され
た（第２図）。このピークは18S RNAと共に移動し、注
入RNA 1μｇにつき600ユニット/mlの活性を有してい
た。この活性は、又MDBK細胞を保護せず、IFN−γに特
異的と思われる。

ショ糖密度勾配（12Sおよび16S）と酸−尿素ゲル（18
S）で観察された活性ピーク間のサイズの相異はこれら
の別々の分画方法が全く同一の変性条件下では遂行され
ないことにより説明され得る。

D. IFN−γ配列を含むコロニーライブラリの調製 ゲル分画した３μｇのmRNAを使用し、標準操作法（26,3
9）で二本鎖cDNAを調製した。６％ポリアクリルアミド
ゲルでcDNAをサイズ分画した。２種のサイズ画分800−1
500bp（138ng）と＞1500bp（204ng）とを電気泳動溶出
した。各サイズのcDNAのサンプル35ngにターミナルデオ
キシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（40）を用いて
デオキシ−Ｃ残基をつなぎ、同様にPst I部位（40）に
デオキシ−Ｇ残基をテーリングした300ngのプラスミドp
BR322（41）とアニール（anneal）した。アニール後の
各混合物を用いてE.coli K−12株 294を形質転換した。
800−1500bp cDNAから約8000株，＞1500bpのcDNAから約
400株の形質転換体が得られた。

E. 誘発cDNAのコロニーライブラリのスクリーニング 各コロニーを、LB（58）＋５μg/mlのテトラサイクリン
を入れたマイクロタイタープレートのウエル（well）に
別々に接種し、DMSO（ジメチルスルホキシド）を７％ま
で加えた後−20℃で貯蔵した。コロニーライブラリの２
種のコピーをニトロセルロースフィルター上で増殖さ
せ、各コロニーから得られるDNAをGrunstein−Hogness
法（42）でフィルターに固定した。

誘発および非誘発PBL培地からゲル分画したmRNAのサイ
ズ18S画分を用いて³²P−標識cDNAプローブを調製した。
プライマーとしてオリゴdT_12-18を使用し既報（１）の
反応条件を用いた。600−1500bpサイズのcDNA画分から
得た8000株の形質転換体と＞1500bpサイズのcDNA画分か
ら得た400株の形質転換体とを含む１組のフィルター
を、20×10⁶cpmの誘発³²P−標識cDNAとハイブリダイズ
させた。もう１組のフィルターを20×10⁶cpmの非誘発³²
P−標識cDNAとハイブリダイズさせた。Fritsch等（43）
が示した条件でハイブリダイゼーションを16時間継続し
た。フィルターをよく洗浄し（43）、Dupont Lightning
−Plus増感板を密着させたKodak XR−5 X線フィルムに1
6〜48時間露出した。２種のプローブに関して各コロニ
ーのハイブリダイゼーションパターンを比較した。約40
％のコロニーは明らかに双方のプローブとハイブリダイ
ズし、約50％のコロニーはいずれのプローブともハイブ
リダイズしなかった（第３図）。124個のコロニーは誘
発プローブとかなりハイブリダイズしたが、非誘発プロ
ーブについては検出不能な程弱いものであった。これら
の各コロニーもマイクロタイタープレートのウエルに個
別に接種し、増殖させてニトロセルロースフィルターに
移し、前記と同様に２種のプローブとハイブリダイズさ
せた。同様に各コロニーから急速法（rapid method）
（44）によって単離したプラスミドDNAをニトロセルロ
ースフィルターに付着させ、誘発及び非誘発プローブと
ハイブリダイズさせた（45）。22個のコロニーから得た
DNAは誘発プローブのみとハイブリダイズした。これら
を“誘発”コロニーと名付けた。

F. 誘発コロニーの特性決定 22個の誘発コロニーのうちから任意に選択した５つのコ
ロニーからプラスミドDNAを調製し（46）、これを用い
て挿入cDNAの特性決定を行なった。５つの誘発プラスミ
ド（p67,p68,p69,p71及びp72）の制限エンドヌクレアー
ゼマッッピングによれば４つのプラスミドが同様の制限
ヌクレアーゼマップを有すると推定された。これらの４
種のプラスミド（p67,p69,p71,p72）は夫々、挿入cDNA
中に４個のDde I部位と２個のHinf I部位と１個のRsa I
部位とを有していた。第５のプラスミド（p68）は共通
のDde I断片を有しており、他の４種に比較して短いcDN
Aクローンであると思われた。制限ヌクレアーゼマッピ
ングによって推定された相同性（homology）はハイブリ
ダイゼーションによって確認された。プラスミドp67の6
00bpのDde I断片から³²P−標識DNAプローブを調製し（4
7）、これを使用して他の誘発コロニーとのハイブリダ
イゼーション（42）を実施した。制限ヌクレアーゼでマ
ッピングされた５つのコロニー全部がこのプローブとク
ロスハイブリダイズした。誘発／非誘発スクリーニング
に選択した124個のうち他の17個のコロニーも同様であ
った。クロスハイブリダイズするこれらのプラスミドの
各個における挿入cDNAの長さを、Pst I消化及びゲル電
気泳動法によって測定した。最長の挿入cDNAを有するク
ローンは挿入物長1200−1400bpのクローン69と考えられ
る。以後の実験全部にこのDNAを使用した。この制限エ
ンドヌクレアーゼマップを第４図に示す。

p69の挿入cDNAは、３つの独立発現系で産生された発現
産物によって抗ウィルス活性を生ずるIFN−γ cDNAであ
ることが証明された。これに関して以下に詳述する。

G. p69の挿入cDNAの配列解析 プラスミドp69の挿入cDNAの完全ヌクレオチド配列を決
定するために、断片をM13ベクターmp7（49）でサブクロ
ーニング後にジデオキシヌクレオチドチェーンターミネ
ーションメソッド（48）で処理しMaxam−Gilbert法（5
2）で処理した。最長のオープン解読フレームは、第５
図に示す166個のアミノ酸から成るタンパクをコードし
ている。コードされた第一残基は、cDNAの５′−末端の
第一metコドンである。アミノ末端の最初の20個の残基
は残りの146個のアミノ酸の分泌のためのシグナル配列
として機能すると推定される。この推定シグナル配列
は、別の特性付けされたシグナル配列と共通の特徴、例
えばサイズ及び疎水性を有する。更に、推定された開裂
配列に見られる４個のアミノ酸（ser−leu−gly−cys）
は、数種のIFN−α（LeIF B,C,D,FおよびH,（２））の
開裂点で見られる４個の残基に等しい。146個のアミノ
酸から成るコードされた成熟アミノ酸配列は分子量17,1
40である。

コードされたタンパク配列中のアミノ酸28−30（asn−g
ly−thr）及びアミノ酸100−102（asn−tyr−ser）にグ
リコシレーションが可能な２個の位置（50）が存在す
る。このような位置の存在は、ヒトIFN−γ（6,51）の
周知のグリコシレーションに一致する。更に、２個しか
ないシステイン残基（位置１及び３）は立体配置から見
て余りにも近接しているためジスルフィドブリッジを形
成し得ない。このことは、β−メルカプトエタノール
（51）の如き還元剤の存在中でのIFN−γの周知の安定
性に一致する。推定された成熟アミノ酸配列はほぼ完全
に塩基性であり、全部で30個のリジン，アルギニン，ヒ
スチジン残基を有しており、アスパラギン酸及びグルタ
ミン酸残基は全部で19しかない。

プラスミドp69のDNA配列から推定されたIFN−γのmRNA
構造は、IFN−α（1,2）又はIFN−β（５）のmRNAとは
明らかに異なる。第６図に示す如く、IFN−α又はIFN−
βに比較してIFN−γのコード領域はより短く、５′及
び３′の末翻訳領域はより長い。

H. E.coli内での成熟IFN−γの直接発現 第７図に示す如く、50μｇのプラスミドp69をPst Iで消
化し、６％ポリアクリルアミドゲル上の電気泳動で1250
bpの挿入物を単離した。約10μｇの挿入物がゲルから電
気泳動溶出した。このPst I断片５μｇを３ユニットのB
stN I（Bethesda Research Labs）で37℃で15分間部分
消化し、６％ポリアクリルアミドゲルを用いて反応混合
物を精製した。所望の1100塩基対BstN I−Pst I断片約
0.5μｇを回収した。ホスホトリエステル法（53）によ
って図示の２個のデオキシオリゴヌクレオチド即ち５′
−dAATTCATGTGTTATTGTCと５′−dTGACAATAACACATG（第
７図）とを合成し、下記の如くリン酸化した。30μの
60mMのトリス−HCl（pH8）と10mMのMgCl₂と15mMのβ−
メルカプトエタノールと240μ Ci（γ−³²P）ATP（Amer
sham,5000 Ci/mmole）中で各デオキシオリゴヌクレオチ
ド100pmoleを合せた。12ユニットのT4ポリヌクレオチド
キナーゼを添加し、37℃で30分間反応させた。10mMのAT
Pを１μ添加し更に20分間反応させた。φ−OH/CHCl₃
抽出後、オリゴマーを0.25μｇのBstN I−Pst I 1100塩
基対断片と合せてエタノール沈殿した。30μの20mMト
リス−HCl（pH7.5）と10mMのMgCl₂と10mMジチオスレイ
トールと0.5mMのATPと10ユニットのT4 DNAリガーゼ中で
前記の断片を20℃で２時間結合した。（付着末端の結合
による重合体を排除すべく）混合物を30ユニットのPst
Iと30ユニットのEcoR Iとによって１時間消化し、６％
ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動にかけた。電
気泳動溶出により1115塩基対の産生物（110,000cpm）を
回収した。

プラスミドpLeIF A trp 103（第７図）はLeIF A遺伝子
から離れたEcoR I部位が除去された（27）プラスミドpL
eIF A 25（１）の誘導体である。３μｇのpLeIF A trp
103を20ユニットのEcoR Iと20ユニットのPst Iとを用い
て37℃で90分間消化し、６％ポリアクリルアミドゲルを
用いて電気泳動にかけた。（〜3900塩基対の）大きいベ
クター断片を電気泳動溶出により回収した。このように
調整した0.15μｇのベクターに1115塩基対のEcoR I−Ps
t I IFN−γ DNA断片を結合した。E.coli K−12株294
（ATCC No.31446）を形質転換して120個のテトラサイク
リン耐性コロニーを得た。これらの形質転換体60個から
プラミドDNAを調整し、EcoR IおよびPst Iで消化した。
これらのプラスミドのうちの３個が所望の1115塩基対Ec
oR I−Pst I断片を含んでいた。DNA配列の解析により、
これらのプラスミドが、trpプロモーター、合成DNA及び
cDNA間の結合部に所望のヌクレオチド配列を有すること
が確認された。これらのプラスミドの１つpIFN−γ trp
48を選択して更に研究を続けた。該プラスミドを用い
てE.coli K−12株W3110（ATCC No.27325）を形質転換し
た。

I. IFN−γをコードする配列の遺伝子構造 IFN−γをコードする遺伝子の構造をSouthernハイブリ
ダイゼーションによって解析した。この方法（54）で
は、５μｇの高分子量ヒトリンパ球DNA（55の如く調
製）を種々の制限エンドヌクレアーゼで完全消化し、1.
0パーセントのアガロースゲルを用いて電気泳動にかけ
（56）、ニトロセルロースフィルター（54）に塗沫し
た。³²P−標識DNAプローブをp69の挿入cDNAの600bp Dde
I断片から調製し（47）、ニトロセルロースに移したDN
Aとハイブリダイズした（43）。１分間当り10⁷カウント
のローブを16時間ハイブリダイズし、前記（43）の如く
洗浄した。別々の提供者から得た８個のゲノムDNAサン
プルを制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで消化し、p69³²P
−標識プローブとハイブリダイズした。第９図に示す如
く、２個の明白なハイブリダイゼーションシグナルが見
られた。Hind III消化λDNAとの移動度比較によれば、
これらは夫々、8.8キロ塩基対（kbp）及び2.0kbpを有す
ると推定された。これは２個のIFN−γ遺伝子がある
か、又は１個の遺伝子がEcoR I部位によって切断（spli
nt）された結果であろう。p69 cDNAがEcoR I部位を含ま
ないので、１個の遺伝子を発現させるには内部EcoR I部
位を有する介在配列（イントロン）が必要であった。こ
れらの可能性を見分けるために、異なる他の５種のエン
ドヌクレアーゼで消化した１個のヒトDNA（第10図）に
対して同じプローブを用いてSouthernハイブリダイゼー
ションを実施した。２種の他のエンドヌクレアーゼPvu
II,Hinc IIでは夫々２個のハイブリダイズDNA断片（Pvu
IIでは6.7kbpと4.0kbp,Hinc IIでは2.5kbpと2.2kbp）
が見られた。しかし乍ら３種のエンドヌクレアーゼHind
III,Bgl II,BamH Iによる消化パターンでは夫々１個の
ハイブリダイズDNA断片（Hind IIIでは9.0kbp,Bgl IIで
は11.5kbp,BamH Iでは9.5kbp）しか得られなかった。同
一Hind IIIハイブリダイズ断片に含まれるためには２個
のIFN−γ遺伝子が異常に接近して（9.0kbp未満）結合
していなければならない。この結果より、ヒトゲノムDN
Aには（多数存在したIFN−α遺伝子と違って）ひとつの
同質の（homologous）IFN−γ遺伝子が存在しておりこ
の遺伝子がEcoR I,Pvu II,Hinc II部位を含む１個以上
のイントロンによって切断されると推定される。この推
定を確認するために、p69から得たcDNAの３′−未翻訳
領域のみから調製した³²P標識断片（第５図の860番目か
ら990番目までの130塩基対のDde I断片）をEcoR I消化
したヒトゲノムDNAにハイブリダイズした（47）。2.0kb
p EcoR I断片のみがこのプローブにハイブリダイズし
た。このことは、この断片が３′−未翻訳配列を含んで
おり8.8kbp EcoR I断片が５′−配列を含むことを示
す。IFN−γの遺伝子構造（少くとも１個のイントロン
を有する１個の遺伝子）は、IFN−α（イントロン（5
6）を有さない多数遺伝子（multiple genes）（２））
又はIFN−β（イントロン（57）を有さない１個の遺伝
子）と明らかに異なっている。

J. 細菌抽出物の調製 ５μg/mlのテトラサイクリンを加えたLuriaブロスで１
晩培養したE.coli W3110/pIFN−γ trp 48を、0.2％の
グルコースと0.5％のカザミノ酸と５μg/mlのテトラサ
イクリンとを含むM9（58）培地に希釈度1:100で接種し
た。A₅₅₀が0.1乃至0.2のときに最終濃度20μg/mlになる
までインドールアクリル酸を添加した、A₅₅₀＝1.0で遠
心して10mlのサンプルを採取し、1mg/mlのウシ血清アル
ブミンを含む1mlの燐酸塩緩衝食塩水（PBS−BSA）に直
ちに再懸濁させた。超音波で細胞を破砕し残渣を遠心で
除去した。アッセイ（分析）を行なうまで上清を４℃で
保存した。細胞変性効果（CPE）阻止アッセイで標準IFN
−αと比較すると、上清中のインターフェロン活性は25
0ユニット/mlと測定された。

K. 酵母の形質転換／菌株及び培地 酵母菌を既報（59）に準じて形質転換した。E.coli株JA
300（ATCC No.33588）（thr leu B6 thi thy A trp C11
17 hsdm^-hsd R^- str^R（20）を用いて発現能のあるTRP I
遺伝子を含むプラスミドを選択した。遺伝子型（a trp
1 gal 2 SUC 2 mal CUP I）（18）を有する酵母菌Sacch
aromyces cerevisiaeRH218を酵母形質転換宿主として使
用した。S.ceevisiaeRH218は、アメリカン・タイプ・カ
ルチャー・コレクション（ATCC No.44076）に寄託され
ている。0.25％のカザミノ酸（CAA）を含むM9（最小栄
養培地）およびLB（リッチ培地）は、Miller（58）によ
って記載されているように、培地をオートクレーブで処
理し冷却してから20μg/mlのアンピシリン（Sigma）を
添加して得られた。下記の培地によって酵母を増殖させ
た。１％の酵母抽出物と２％のペプトンと２％のグルコ
ース、これに所望により３％Difco寒天とを含むYEPD。
１中に6.7gの酵母窒素塩基（アミノ酸非含有）（YN
B）（Difco）と10mgのアデニンと10mgのウラシルと5gの
CAAと20gのグルコース、これに所望により30gの寒天と
を含むYNB＋CAA。

L. 酵母発現ベクターの構成 1. 10μｇのYRp7（14,15,16）をEcoR Iで消化した。得
られたDNAの付着末端をDNAポリメラーゼＩ（Klenow断
片）で平滑末端化した。ベクターと挿入物とを１％のア
ガロース（Seakem）ゲルに流し、ゲルから切り取り、電
気泳動溶出して等容量のクロロホルムとフェノールとで
２回抽出し、エタノール沈殿した。得られた平滑末端DN
A分子を最終容量50μで12℃で12時間結合させた。こ
の結合混合物（ligation mix）でE.coli株JA300をアン
ピシリン耐性及びトリプトファン原栄養性に形質転換し
た。夫々反対の方向を向いたTRP I遺伝子を含むプラス
ミドを単離した。pFRW1はYRp7と同方向のTRP I遺伝子を
有しており、pFRW 2はYRp7と反対方向を向いたTRP I遺
伝子を有していた。

20μｇのpFRW 2をHind IIIで直線化し、１％のアガロー
スゲルを用いて電気泳動にかけた。直線状分子をゲルか
ら溶出し、次に200ngを、酵母３−ホスホグリセリン酸
キナーゼ遺伝子を含む制限断片であるプラスミドpB1（1
3）の3.1kb Hind III挿入物500ngと結合させた。結合混
合物を用いてE.coli株294をアンピシリン耐性及びテト
ラサイクリン感受性に形質転換した。このような組換体
の１つから調製したプラスミドは、テトラサイクリン耐
性遺伝子のHind III部位にpB1挿入DNAの3.1kbp Hind II
I断片を有する完全なTRP I遺伝子を有していた。このプ
ラスミドはpFRM 31である。５μｇのpFRM 31をEcoR Iで
完全に消化し、フェノール及びクロロホルムで２回抽出
しエタノール沈殿した。夫々250μＭのデオキシヌクレ
オシドトリホスフェートを用いた反応でDNAポリメラー
ゼＩ（Klenow断片）を用いて分子の付着末端を充填し
た。反応を14℃で20分間継続後、フェノール−クロロホ
ルムで２回抽出し、DNAをエタノールで沈殿させた。次
にDNAを含む再懸濁駅をCla Iで完全に消化し、６％アク
リルアミドゲルを用いて電気泳動にかけた。ベクター断
片をゲルから溶出し、フェノール−クロロホルム抽出
し、エタノール沈殿した。

ヒトから精製した３−ホスホグリセリン酸キナーゼ酵素
の６個のＮ−末端アミノ酸は下記の配列を有していた。

141塩基対のSau3A−Sau3A制限断片のDNA配列から生成し
た翻訳解読フレームの１個は、（内部Hinc II部位を含
む。第11図のPGK制限マップ参照）下記のアミノ酸配列
を生成する。

イニシエーターたるメチオニンを除くとPGKのＮ−末端
アミノ酸配列は、ヒトPGKのＮ−末端アミノ酸配列と５
乃至６個のアミノ酸の相同性（homology）を示した。

この配列決定により酵母PGK構造遺伝子の起点が、pB1の
141塩基対Sau3A制限断片中のDNAによりコードされると
推定できる。従来の研究（20）では、PGK mRNAを特定化
するDNA配列がHind III断片のこの領域に存在するであ
ろうと推定されていた。更に141塩基対Sau3A断片の配列
にはより多くのPGKプロモーターのDNA配列が含まれてい
る（第12図）。

配列５′−ATTTGTTGTAAA−３′を有する合成オリゴヌク
レオチドを標準法により合成した（Crea他、Nucleic Ac
ids Res.,8,2331（1980）。100ngのプライマーの５′−
末端を20μの反応液中で200μCiの［γ−³²P］ATP及
び10ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼで標識し
た。この標識プライマー溶液を用いてプライマー修復反
応（primer−repair reaction）を実施した。この反応
は、PGK構造遺伝子配列の直前に位置するPGK 5′−フラ
ンキングDNAにEcoR I制限部位を入れる多段階プロセス
の第１段階である。

100μｇのpB1（20）をHae IIIで完全消化し６％のポリ
アクリルアミドゲルで電気泳動する。エチジウム染色ゲ
ル上の最上部のバンド（PGKプロモーター領域を含む）
を前記の如き電気泳動溶出により単離した。このDNAの1
200塩基対Hae III断片をHinc IIで消化し、次に６％ア
クリルアミドゲルで電気泳動した。電気泳動溶出により
650塩基対のバンドを単離した。５μｇのDNAを単離し
た。DNAの650塩基対Hae III−Hinc II断片を20μのH₂
Oに再度懸濁させ、次に20μの前記の燐酸化プライマ
ー溶液と混合した。この混合物をフェノール−クロロホ
ルムで１回抽出し次にエタノール沈殿させた。乾燥した
DNAを50μのH₂Oに再度懸濁させ、次に沸騰水浴で７分
間加熱した。この溶液をドライアイス−エタノール浴で
（10乃至20秒間）急冷し、氷水浴に移した。次に、この
溶液に、10μのDNAポリメラーゼＩの10倍緩衝液（Boe
hringer Mannheim）とデオキシヌクレオシドトリホスフ
ェーロ（dATP,dTTP,dGTP及びdCTP）を夫々2.5mMにした1
0μの溶液と25μのH₂Oと５ユニットのDNAポリメラ
ーゼI Klenow断片とを含む溶液50μを添加した。この
100μの反応溶液を37℃で４時間インキュベートし
た。次に溶液をフェノール−クロロホルム抽出し、エタ
ノール沈殿し、凍結乾燥して10ユニットのSau3Aで完全
に消化した。溶液を６％アクリルアミドゲルで電気泳動
した。39塩基対のサイズに相当するバンドをゲルから切
取り前記の電気泳動溶出で単離した。この39塩基対のバ
ンドは１個の平滑末端と１個のSau3A付着末端とを有す
る。この断片を改造したpFIF trp 69ベクター（５）に
クローニングした。10μｇのpFIF trp 69をXba Iで直線
化し、フェノール−クロロホルムで１回抽出し、エタノ
ール沈殿した。ヌクレオシドトリホスフェートを夫々25
0μＭ含む50μの反応溶液中でDNAポリメラーゼI Klen
ow断片を使用してXba I付着末端を充填した。このDNAを
BamH Iで切取り６％アクリルアミドゲルで電気泳動し
た。ベクター断片を電気泳動溶出によってゲルから単離
し次に20μのH₂Oに再度懸濁させた。20ngのこのベク
ターと前記で調製した20ngの39塩基対断片とを室温で４
時間結合させた。結合混合物の1/5量を使用してE.coli
株294を（LB＋20μg/ml ampプレート上で）アンピシリ
ン耐性に形質転換した。形質転換体から得たプラスミド
をクイックスクリーンプロセス（quick screen procedu
re）（44）でテストした。配列解析のためにプラスミド
pPGK−39を選択した。20μｇのプラスミドをXba Iで消
化し、エタノール沈殿後1000ユニットの細菌由来アルカ
リ性ホスファターゼと共に68℃で45分間処理した。DNA
を３回フェノール−クロロホルム抽出し、エタノール沈
殿させた。200μCiの［γ−³²P］ATPと10ユニットのT₄
ポリヌクレオチドキナーゼとを含む20μの反応溶液中
で脱リン酸末端を標識した。プラスミドをSal Iで切断
し６％のアクリルアミドゲルで電気泳動した。

標識した挿入バンドをゲルから単離し、Maxam−Gilbert
法（52）によって配列を決定した。このプロモーター断
片の３′−末端のDNA配列は予想通りであった。

2. 312塩基対Pvu I−EcoR I PGKプロモーター断片の構
成 25μｇのpPGK−39（第13図）を（夫々５ユニットの）Sa
l IとXba Iとで同時に消化し６％ゲルを用いて電気泳動
にかけた。39塩基対のプロモーター断片を含む390塩基
対のバンドを電気泳動溶出により単離した。再懸濁DNA
をSau3Aで消化し、８％アクリルアミドゲルを用いて電
気泳動にかけた。39塩基対PGKプロモーターバンドを電
気泳動溶出により単離した。このDNAは、Sau3A−Xba I
断片にPGKプロモーターの５′−末端の39塩基対を含ん
でいた。

25μｇのpB1をPvu IとKpn Iとで消化し、６％アクリル
アミドゲルを用いて電気泳動にかけた。DNAの0.8kbpバ
ンドを電気泳動溶出により単離し、Sau3Aで消化して、
６％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動にかけた。PG
Kプロモーターから得た265bpバンド（第11図）を電気泳
動溶出により単離した。

次に、このDNAと前記の39bpプロモーター断片とを室温
で２時間結合した。結合混合物をXba IとPvu Iとで消化
し、６％アクリルアミドゲルを用いて電気泳動にかけ
た。304bp Xba I−Pvu I断片を電気泳動溶出により単離
し、これを200ngの（先に単離したPvu I−Pst I 162塩
基対断片の欠如した）pBR322（41）と、200ngのXba I−
Pst I LeIF A cDNA遺伝子とを含む結合混合物に添加し
た。このLeIF A cDNA遺伝子は先に20μｇのpLeIF trp A
25から単離されている。この３因子結合混合物を用い
てE.coli株294をテトラサイクリン耐性に形質転換し
た。形質転換体コロニーをミニスクリーニングし（4
4）、コロニーの１つ、即ちpBR322をベースとするベク
ター中でLeIF A遺伝子に融合した304塩基対のPGK 5′−
フランキングDNAを有するpPGK300を単離した。LeIF A遺
伝子の５′−末端は、配列５′−CTAGAATTC−３′を有
する。従ってこの配列にPGKプロモーター断片からXba I
部位が融合すると、Xba I部位にEcoR I部位が付加する
ことが可能になる。従ってpPGK−300はPvu I−EcoR I断
片中に単離されたPGKプロモーター部分を含む。

3. 1500塩基対のEcoR I−EcoR I PGKプロモーター断片
の構造 10μｇのpB1をPvu I及びEcoR Iで消化し６％アクリルア
ミドゲルで電気泳動した、1.3kbのPvu I−EcoR I DNAバ
ンドをPGK 5′−フランキングDNAから電気泳動溶出によ
り単離した。10μｇのpPGK−300をEcoR I及びPvu Iで消
化し、６％アクリルアミドゲルを用いて消化混合物（di
gestion mix）を電気泳動にかけ、次に電気泳動溶出し
て312bpのプロモーター断片を単離した、５μｇのpFRL
4をEcoR Rで切断し、エタノール沈殿させ、６℃で細菌
由来アルカリ性ホスファターゼで45分間処理した。フェ
ノール／クロロホルムで３回抽出し、DANをエタノール
沈殿させ、20mlのH₂Oに再懸濁させた。200ngのベクター
を、pPGK−300から単離した100ngの312bpのEcoR I−Pvu
I DNA−pB1から単離した100ngのEcoR I−Pvu I DNAと
結合させた。結合混合物を用いてE.coli株294をアンピ
シリン耐性に形質転換した。得られた形質転換体の１つ
がpPGK−1500であった。このプラスミドは、DNAのEcoR
I−EcoR I又はHind III−EcoR I断片として1500bpのPGK
プロモーター断片を含んでいた。

10μｇのpPGK−1500をCla I及びEcoR Iで完全消化し、
消化混合物を６％アクリルアミドゲル電気泳動にかけ
た。電気泳動溶出によりPGKプロモーターを含む900bpの
断片を単離した。10μｇのpIFN−γ trp 48をEcoR I及
びHinc IIで完全消化し、６％アクリルアミドゲル電気
泳動にかけた。電気泳動溶出により直接発原できるIFN
−γ cDNAを含む938bpのバンドがゲルから単離された。

（Cla I−EcoR I断片上の）PGKプロモーター断片と欠失
pFRM−31と前記の単離IFN−γ cDNAとを３断片結合反応
によって酵母発現ベクターを構成した。結合反応は14℃
にて12時間行なわれた。次にこの結合混合物を用いてE.
coli K−12株294をアンピシリン耐性に形質転換した。
形質転換体を分析し、適正な構成の発現プラスミドpPGK
−IFN−γの存在を確認した（第16図）。発現系を含む
プラスミドを用い、トリプトファン欠失寒天中で酵母菌
RH218のスフェロプラストをトリプトファン原栄養性に
形質転換した。これらの組換え酵母に対し、IFN−γの
存在を調べるアッセイを実施した。

酵母抽出物を下記の如く調製した。10mlの培養液をYNB
＋CAA中でA₆₆₀１−２まで増殖させ、遠心により集
め、500μのPBS緩衝液（20mMのNaH₂PO₄,pH＝7.4,150m
MのNaCl）に再懸濁させた。等容量のガラスビーズ（0.4
5−0.5mm）を添加し、混合物を２分間撹拌した。抽出物
を14,000rpmで30秒間遠心し、上清を取出した。CPE阻止
アッセィを用いて標準IFN−αと比較すると、上清中の
インターフェロン活性の測定値は16,000ユニット/mlで
あった。

M. セルカルチャーベクターpSVγ 69の構成 SV40オリジンを含む342bpのHind III−Pvu II断片をEco
R I制限部位末端を有する断片に変えた。Hind III部位
に合成オリゴマー（５′−dAGCTGAATTC）を添加して、
ポリメラーゼＩ（Klenow断片）を作用させて充填し、Pv
u II部位は平滑末端結合によってEcoR I部位に変えた。
得られたEcoR I断片をpML−１（28）のEcoR I部位に挿
入した。amp^R遺伝子に逆向きとなるSV40後期プロモータ
ーを有するプラスミドに於て、pML−１（27）のamp^R遺
伝子に最も近いEcoR I部位を除去してこのamp^R遺伝子を
更に改造した。

クローンHBV DNA（60）の1023bpのHpa I−Bgl II断片を
単離し、Ｂ型肝炎ウィルス（HBV）のHpa I部位を合成オ
リゴマー（５′−dGCGAATTCGC）でEcoR I部位に転換し
た。このEcoR I−Bgl IIの付いた断片をSV40のオリジン
をもつ前記プラスミドのEcoR I−BmH I部位に直接クロ
ーニングした。

p69の1250bp Pst I断片に於いてPst I末端をEcoR I末端
に転換し、残りのEcoR I部位にIFN−γの構造遺伝子を
挿入した。IFN−γの構造遺伝子の前にSV40後期プロモ
ーターを有するクローンを単離した。DEAE−デキストラ
ンの存在中でトランスフェクションを８時間行なうよう
に改変したDEAE−デキストラン法（61）を用いて、前記
で得られたプラスミドを組織培養細胞（29）に導入し
た。細胞培地を２〜３日毎に交換した。毎日200μず
つ取出してインターフェロンのバイオアッセイを行なっ
た。トランスフェクションの３〜４日後に検定したサン
プルでの典型的な収率は50乃至100ユニット/mlであっ
た。

N. サル細胞由来IFN−γの部分精製 サル細胞がつくるヒトIFN−γをより多量に製造するた
めに、10個の10cmプレート内の新しい単層COS−７に、1
10mlのDEAE−デキストラン（200μg/mlのDEAEデキスト
ラン500,000MW、0.05Mのトリス、pH7.5、DMEM中）中の
総量30μｇのpDLIF3をトランスフェクトした。37℃で16
時間維持し、プレートをDMEMで２回洗浄した。10％のf.
b.s.と2mMのグルタミンと50μg/mlのペニシリンＧを加
えた15mlの新しいDMEMを補充し、次に50mg/mlのストレ
プトマイシンを各プレートに添加した。翌日、培地を血
清を含まないDMEMに代えた。以後、この血清を含まない
培地を毎日新しく添加した。収集した培地をアッセイを
行なう迄又はCPGに結合する迄４℃に維持した。トラン
スフェクションの３〜４日後のサンプルからプールした
画分は活性をほぼ全部含むことが判明した。

0.5のCPG（コントロールド−ポアガラス、Electronucle
nics、CPG350、メッシュサイズ120/200）を100mlの細胞
上清に添加し、混合物を４℃で３時間撹拌した。ベンチ
トップ遠心機で短時間遠心し、沈降ビーズをカラムに詰
め、20mMリン酸ナトリウム（Na₃PO₄,Na₂HPO₄,NaH₂PO₄又
はPBS）、1M NaCl、0.1％β−メルカプトエタノール（p
H7.2）で完全に洗浄した。30％のエチレングリコールを
含む前記緩衝液及び50％のエチレングリコールを含む前
記緩衝液を順次用いて活性を溶出させた。ほぼ全部の活
性がCPGに付着していた。75％の溶出活性は、30％エチ
レングリコールで溶出した画分中に存在した。これらの
画分をプールし20mMリン酸ナトリウム、1MのNaCl、pH7.
2で希釈し最終濃度をエチレングリコール10％にして、1
0mlのCon Aセファロース（Pharmacia）カラムに直接か
けた。2mMリン酸ナトリウム、1MのNaCl、pH7.2で完全洗
浄後、20mMリン酸ナトリウム、1MのNaCl、0.2Mのα−メ
チル−Ｄ−マンノサイドで活性を溶出した。かなりの量
の活性（55％）がこのレクチンに付着しなかった。α−
メチル−Ｄ−マンノサイドによって45％の活性が溶出し
た。

薬剤組成物 薬剤として有用な組成物を製造するための公知の方法に
準じて本発明物質を製剤化し得る。即ち、本発明により
得られたヒトIFN−γ産生物を、薬剤上許容し得る賦形
剤と混合組合せる。適当な賦形剤及びその製剤化はE.W.
Martin,RemingtonのPharmaceutical Sciencesに記載さ
れている。この書物を参考文献としてここに引用する。
このような組成物は、宿主に有効投与するのに適した薬
剤上許容し得る組成物を調製するために有効量の本発明
のインターフェロンタンパク質を適正量の賦形剤と組合
せて得られる。

A.非経口投与 本発明のヒトIFN−γを、抗腫瘍治療又は抗ウィルス治
療を要する患者、又は、免疫抑制状態を示す患者に非経
口投与し得る。用法及び用量は、他のヒトインターフェ
ロンの臨床研究で常用の用法及び用量に準じる。例えば
日用量約１乃至10×10⁶ユニットで使用され、純度１％
より下と考えられる物質は従来と同様に例えば50×10⁶
ユニット／日で使用される。IFN−γ以外のヒトタンパ
ク質即ちヒト由来物質中に存在すると有る種の好ましく
ない作用を生じる恐れのあるタンパク質がほぼ全く混在
しないので、効能を良くするためにIFN−γの用量をか
なり増すことができる。

ほぼ同型のIFN−γの非経口投与に適した剤形の一例と
しては、特異的比活性例えば２×10⁸ユニット/mgのIFN
−γ 3mgを25mlの5N血清アルブミン（ヒト）−USPに溶
解し、溶液を滅菌フィルターに通し、過した溶液を無
菌的に100本のバイアルに分注する。各バイアルは、非
経口投与に適した純インターフェロン６×10⁶ユニット
を収容している。使用するまでバイアルを低温（−20
℃）保存するのが好ましい。

バイオアッセイデータ A.抗ウィルス活性の特性決定 抗体中和のために、必要ならば、サンプルをPBS−BSAで
500〜1000ユニット/mlの濃度まで希釈する。希釈度を順
次増加したラビットの抗ヒトIFN−γ抗血清、抗ヒトIFN
−β抗血清又は抗ヒトIFN−γ抗血清を夫々用い、等容
量ずつのサンブルを４℃にて２〜12時間インキュベート
した。National Institute of Allergy and Infections
Diseasesから抗IFN−αと抗IFN−βとを入手した。刺
激末梢血リンパ球から精製した（純度５〜20％）の標準
IFN−γを用いて抗IFN−γを調製した。アッセイを行な
う前にサンプルを12,000×ｇで３分間遠心した。pH2の
安定度をテストするためにアッセイ以前に1NのHClを添
加してサンプルをpH2に調整し、４℃にて２〜12時間イ
ンキュベートし、1NのNaOHを添加して中和した。ドデシ
ル硫酸ナトリウム（SDS）感受性をテストするためにア
ッセイ以前にサンプルを等容量の0.2％SDSと共に４℃で
２〜12時間インキュベートした。

B.E.coli及びCOS−７細胞により産生したIFN−γの特性
決定 この表は、種々の処理後の標準IFN−α、β、γの作用
特性を示す。E.coli W3110/pIFN−γ trp 48及びCOS−7
/pSVγ69により産生したインターフェロン活性は、酸感
受性、SDS感受性でありIFN−γ抗血清により中和される
が、IFN−α又はβに対する抗体によって中和されな
い。これらのデータより、前記の系に於いて産生したイ
ンターフェロンがIFN−γでありプラスミドp69の挿入cD
NAがIFN−γをコードしていることが確認される。

精 製 たとえば細菌等からIFN−γを精製する一方法を以下に
述べる一般的な大要に従って記載する。

1. 高電導性の溶菌バッファー（pH約8.0）中で細胞を
高圧力でホモゲナイザー中を通過させ、次いで氷浴中で
流出物を冷却することによる、細胞からの抽出、 2. 撹拌下例えば約４℃でのポリエチレン−イミン添加
によるDNAの沈殿、 3. 溶液中にIFN−γを再び残しつつ細菌タンパク質のp
Hによる沈殿除去、 4. ４℃での遠心分離による固相分離、 5. （pHの再調整後）限外濾過等による上澄みの濃縮、 6. 低伝導性バッファーによる濃縮物の透析、 7. 遠心分離による固相除去によって、溶液中にIFN−
γを残すこと、 8. イオン強度を順次増加する溶出法による、カルボキ
シメチルセルロース上でのイオン交換クロマトグラフィ
ー、 9. イオン強度を順次増加する溶出法による、燐酸カル
シウムゲル上でのクロマトグラフィー、 10. イオン強度を順次増加する溶出法による、弱い変
性条件下でのカルボキシメチセルロース上イオン交換ク
ロマトグラフィー、 11. ゲル透過クロマトグラフィーによる分離。

この方法によれば、90％以上、更には95％以上の純度を
有する物質の精製が可能である。

本発明のIFN−γタンパク質の構造は、DNA遺伝子を決定
し、それに基いてアミノ酸配列を決定することによって
解明された−第５図参照。本文に記載したこの特定イン
ターフェロンについて自然に起こった相同異変（alleli
c variation）が存在しこの変異が個々人の間で起こる
ことが理解されるであろう。これらの相同変異は、ある
場合には全体配列中の１個（又は複数）のアミノ酸の違
いにより示され、又ある場合には該配列中の１個（又は
複数）のアミノ酸の欠失、置換、挿入、転位又は付加に
より示される。このような相同変異の全部が本発明の範
囲内に包含される。実際、種々のヒトIFN−γ誘導体の
製造に組換えDNA技術を使用することに大きな可能性が
存在する。この誘導体は単一の又は多数のアミノ酸の置
換、欠失、付加又は順序の起き換えによって種々修飾さ
れたものである。これらヒトIFN−γ誘導体を生成する
前記のごとき修飾は全て、基本的な特性であるヒトIFN
−γ活性が不変のまま残っている限り、本発明の範囲に
含まれる。

上記IFN−γのDNA及びアミノ酸配列（第５図参照）を用
いて、本発明を疑いを残さずに追試するのに最適な方法
は、（例えば26に示すごとき）合成手段による完全な遺
伝子の製造であり、又は合成デオキシオリゴヌクレオチ
ドを製造し、この合成デオキシオリゴヌクレオチドをプ
ローブに使って、ヒトゲノムライブラリ又は他のcDNAソ
ースから、標準的なハイブリダイゼーション技術によっ
て目的遺伝子を単離する方法である。必要とするIFN−
γタンパク質をコードしているヌクレオチド配列が一旦
既知となれば発現をさせ、単離し、高度の純化したIFN
−γの製剤を製造する方法は上記記載の方法に従って実
施し得る。

好ましい特定具体例に基いて本発明を説明してきたが、
本発明はこれらの特定具体例に限定されること無く、む
しろ特許請求の範囲の適法範囲に限定されると解釈すべ
きであることも理解されよう。

参考文献 1. Goeddel et al.,Nature,287,411（1980）． 2. Goeddel et al.,Nature,290,20（1981）． 3. Yelverton et al.,Nucleic Acids Research,9,731
（1981）． 4. Gutterman et al.,Annals of Int.Med.,93,399（19
80）． 5. Goeddel et al.,Nucleic Acids Research,8,4057
（1980）． 6. Yip et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,78,1601
（1981）． 7. Taniguchi et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,7
8,3469（1981）． 8. Bloom,Nature,289,593（1980）． 9. Sonnenfeld et al.,Cellular Immunol.,40,285（19
78）． 10. Fleishmann,et al.,Infection and Immunity,26,24
8（1979）． 11. Blalock et al.,Cellular Immunology,49,390（198
0）． 12. Rudin et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,77,592
8（1980）． 13. Crane et al.,J.Natl.Cancer Inst.,61,871（197
8）． 14. Stinchcomb et al.,Nature,282,39（1979）． 15. Kingsman et al.,Gene,7,141（1979）． 16. Tschumper et al.,Gene,10,157（1980）． 17. Mortimer et al.,Microbiological Reviews,44,519
（1980）． 18. Miozzari et al.,Journal of Bacteriology,134,48
（1978）． 19. Jones,Genetics,85,23（1977）． 20. Hitzeman,et al.,J.Biol.Chem.,255,12073（198
0）． 21. Hess et al.,J.Adv.Enzyme Regul.,7,149（196
8）． 22. Holland et al.,Biochemistry,17,4900（1978）． 23. Bostian et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）,77,4
504（1980）． 24. The Molecular Biology of Yest（Aug.11−18,198
1）,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harb
or,New York. 25. Chambon,Ann.Rev.Biochemistry,44,613（1975）． 25a.Gluzman,Cell,23,175（1981）． 26. Goeddel et al.,Nature,281,544（1979）． 27. Itakura et al.,Science,198,1056（1977）． 28. Lusky et al.,Nature,293,79（1981）． 29. Gluzman et al.,Cold Spring Harbor Symp.Quant,B
iol.,44,293（1980）． 30. Fiers et al.,Nature,273,113（1978）． 31. Reddy et al.,Science,200,494（1978）． 32. Boedtker et al.,Prog.in Nucleic Acids Res.Mol.
Biol.,19,253（1976）． 33. Berger et al.,Biochemistry,18,5143（1979）． 34. Aviv et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,69,1408（19
72）． 35. Gurdon et al.,J.Molec.Biol.,80,539（1975）． 36. Stewart,The Interferon System.Springir,New Yor
k,p.13−26（1979）． 37. Lehrach et al.,Biochemistry,16,4743（1977）． 38. Lynch et al.,Virology,98,251（1979）． 39. Wickens et al.,J.Biol.Chem.,253,2483（1978）． 40. Chang et al.,Nature,275,617（1978）． 41. Boliver et al.,Gene,2,95（1977）． 42. Grunstein et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,72,
3961（1975）． 43. Fritsch et al.,Cell,19,959（1980）． 44. Birnboim et al.,Nucleic Acids Res.,7,1513（197
9）． 45. Kafatos et al.,Nucleic Acids Res.,7,1541（197
9）． 46. Clewell et al.,Biochemistry,9,4428（1970）． 47. Taylor et al.,Biochim.Biophys.Acta,442,324（19
76）． 48. Smith,Methods Enzymol.,65,560（1980）． 49. Messing et al.,Nucleic Acids Res.,9,309（198
1）． 50. Winzler,Hormonal Proteins and Peptides,（ed.L
i）Academic Press,New York,p.1（1973）． 51. Nathan et al.,Nature,292,842（1981）． 52. Maxam et al.,Methods in Enzymol.,65,490（198
0）． 53. Crea et al.,Proc.Acad.Sci.（USA）,75,5765（197
8）． 54. Southern,J.Molec.Biol.,98,503（1975）． 55. Blin et al.,Nucleic Acids Res.,3,2303（197
6）． 56. Lawn et al.,Science,212,1159（1981）． 57. Lawn et al.,Nucleic Acids Res.,9,1045（198
1）． 58. Miller,EXperiments in Molecular Genetics,p.431
−3,Cold Spring Harbor Lab.,Cold Spring Harbor,New
York（1972）． 59. Beggs,Nature,275,104（1978）． 60. Valenzuela et al.,Animal Virus Genetics（ed.Fi
elds,Jaenisch and Fox）p.57,Academic Press,New Yor
k（1980）． 61. McCuthan et al.,J.Natl.Cancer Inst.,41,351（19
68）．

【図面の簡単な説明】

第１図は、誘発末梢血リンパ球ポリ（Ａ）＋RNAの70％
ホルムアミド中５〜25％ショ糖密度勾配遠心分離の結果
を示す図、 第２図は、誘発末梢血リンパ球ポリ（Ａ）＋RNAの6M尿
素中1.75％アガロースゲル電気泳動の結果を示す図、 第３図Ａは、誘発³²P−標識cDNAとコロニーとのハイブ
リダイゼーションパターンを示す粒子構造の写真、 第３図Ｂは、非誘発³²P−標識cDNAとコロニーとのハイ
ブリダイゼーションパターンを示す粒子構造の写真、 第４図は、クローン69の挿入cDNAの制限エンドヌクレア
ーゼマップ、 第５図は、プラスミドp69挿入cDNAのヌクレオチド配列
図、 第６図は、３種のインターフェロン、IFN−α、IFN−β
及びIFN−γの構造の比較図、 第７図は、IFN−γ発現プラスミドpIFN−γ trp 48の構
成を示す説明図、 第８図は、サル細胞でのIFN−γ発現に用いられるプラ
スミドの構成を示す図、 第９図は、８種のEcoR I消化ヒトゲノムDNAとp69の挿入
cDNA³²P−標識プローブとのSouthernハイブリダイゼー
ションの結果を示す粒子構造の写真、 第10図は、６種の制限エンドヌクレアーゼで消化したヒ
トゲノムDNAとp69由来³²P−標識プローブとのSouthern
ハイブリダイゼーションの結果を示す粒子構造の写真、 第11図は、ベクターpB1の3.1Kbp Hind III挿入物の制限
マップ 第12図は、酵母３−ホスホグリセリン酸キナーゼ構造遺
伝子の５′−末端部及び５′−フランキングDNAのDNA配
列を示す図、 第13図は、PGKプロモーターにXba I部位を挿入し且つPG
K 5′−フランキング配列の39bp断片を単離する工程
図、 第14図は、プラスミドpPGK−39から得た39から得た39bp
断片とpB1から得た265bp Pvu I−Sau3A付加PGK 5′−フ
ランキング配列とpLeIF trp Aから得たXba Iに隣接する
EcoR I部位とを有する300bp断片の構成を示す図、 第15図は、第14図の300bp断片に加えてPGK 5′−フラン
キング配列から得た1300bp Hind III−Pvu I断片を有す
る1500bp PGKプロモーター断片の構成を示す図、 第16図は、酵母菌中でヒトIFN−γを発現するベクターp
PGK−IFN−γの構成を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｎ 15/09 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭55−98118（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，292（1981．８）Ｐ．842 −844 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，78（３）（1981．３）Ｐ. 1601−1605

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記の成熟ヒト免疫インターフェロンのア
   ミノ酸配列を含むポリペプチドを発現し得る複製可能な
   発現ベヒクルで形質転換された微生物又は哺乳動物細
   胞：
2. 【請求項２】発現ベヒクルが、pIFN−γ−trp 48、pSV
   −γ−69及びpPGK−IFN−γからなるグループから選択
   されることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項に記
   載の微生物又は哺乳動物細胞。
3. 【請求項３】COS−７系サル腎線維芽細胞である特許請
   求の範囲第（１）項又は第（２）項に記載の哺乳動物細
   胞。
4. 【請求項４】大腸菌（E.coli）株を形質転換することに
   より得られることを特徴とする特許請求の範囲第（１）
   項又は第（２）項に記載の微生物。
5. 【請求項５】酵母菌株を形質転換することにより得られ
   ることを特徴とする特許請求の範囲第（１）項又は第
   （２）項に記載の微生物。