JPS6188875A - ヒトインタ−フエロン−γ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒトインターフエロン−γ（ＨｕＩＦＮ−γ
）遺伝子を含むＤＮＡ配列を用い、ヒト由来培養細胞を
形質転換することによって作製される継代培養可能な形
質転換培養細り包、更にその形質転換細胞を利用したＨ
ｕＩＦＮ−γの製造法に係る。

（従来の技術） インターフェロン（ＩＦＮ）は、抗ウィルス作用を持つ
物質として発見され、少くとも同種の細胞内におけるウ
ィルスには非特異的な抗ウイルス状態を誘導する蛋白で
あるうヒトインターフェロン（ＨｕＩＦＮ）は、蛋白の
生理学的、生化学的、免疫学的或いは、生産細胞と誘発
方法の差異により３つの種類に分類されており、それぞ
れインターフェロン−α（ＩＦＮ−σ）、インターフェ
ロン−β（ＩＦＮ−β）及びインターフェロン−γ（Ｉ
ＦＮ−γ）と命名されている（Ｓｔｅｗａｒｔ口。

Ｗ、Ｅ、ら（１９８０年）　Ｎａｔｕｒｅ、　２８６巻
。

１１０頁）。最近これら３種のヒ）ＩＦＮの相補ＤＮＡ
（ｃＤＮＡ　）がクローニングされ、ｃＤＮＡの塩基配
列並びに塩基配列から推定されるアミノ酸配列が決定さ
れた。

ＩＦＨの抗ウィルス作用は種持異的であり、ヒト細胞を
用いたウィルス感染試験では、ＨｕｌＦＮは抗ウィルス
作用を示すが、マウスＩＦＮは示さない。しかし、ＩＦ
Ｈのウィルスに対する特異性はかなり広く、種々のウィ
ルスに対して活性を示す。

また、ＩＦＮか種々の生物学的及び免疫学的活性を持つ
物質であることも示された。ＩＦＮはかなり古くから細
胞の増殖を抑制する作用があることが知られ（Ｒｕｂｉ
ｎ、Ｂ、Ｙ、ら（１９８０年）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａ
ｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７７巻。

５９２８頁）、また最近になり免疫学の進歩とともにＩ
ＦＮがいわゆる癌の免疫監視機構に関与していると考え
られているナチュラルキラー細胞や抗体依存性の細胞傷
害活性を持つ細胞を活性化し、これらの細胞の持つ抗腫
瘍活性を高める事が知られるようになった（Ｃａｔａｌ
ｏｎａ、Ｗ、Ｊ、ら（１９８１年）Ｎａｔｕｒｅ、　２
９１巻、７７頁）。

また細胞傷害性Ｔ細胞の活性増強（Ｌｉｎｄａｈｌ。

Ｐ、ら（１９７２年）　Ｐｒｏｃ　、Ｎａｔ　１　、Ａ
ｃａｄ　。

Ｓｃｉ、、６９巻、７２１頁）やマクロファージを活性
化し抗腫瘍性の活性化マクロファージにする作用をＩＦ
Ｎが持っている事が示された（Ｌｅ、Ｊら（１９８：３
年）　Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３１巻ν２８２
１頁）。これらの結果はＩＦＨの抗腫瘍剤としての可能
性を示すものであったが、現在すてにＩＦＮは種々の腫
瘍に対し治験か行なわれつつあり、多発性骨髄腫、非ホ
ジキンリンパ腫、腎癌或いは乳腺その池で有効例も知ら
れるようになっている。

ＩＦＨの中でもＩＦＮ−γは、ＩＦＮ−α。

ＩＦＮ−βに比べ、はるかに低濃度で細胞の増殖を抑制
する事ができ（Ｒｕｂ　ｉ　ｎ、　Ｂ　、Ｙ　、ら（１
９８０年）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、
ＵＳＡ、　７７巻。

５９２８頁）、またナチュラルキラー細胞、キラーＴ細
胞、に細胞及びマクロファージ等のいわゆる癌の免疫監
視機構に働いている細胞群の活性化を行うことができ、
臨床応用面での期待は大きい。

ヒトインターフエロン−γ（ＨｕｌＦＮ−γ）は、ヒト
のリンパ球をフィトヘマグルチニン、スタフイロコツ力
ルエンテロトキシンＡ１コンカナバリンＡ或いは、ガラ
クトース酸化酵素での刺激に対して誘導される事が知ら
れている（Ｗｈｅｅｌｏｃｋ。

Ｅ、Ｆ、（１９６５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、１４９巻、３
１０頁；　Ｌａｎｇｆｏｒｄ、Ｍ、Ｐ、ら（１９７９年
）　Ｉ　ｎｆｅｃｔ　。

Ｉｍｍｕｎ、、　２６巻、３６頁；　ｄｅ　Ｌａｙ、　
Ｍ、ら（１９８０年）Ｅｕｒ、Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ
、、　１０巻、８７７頁；Ｄｉａｎｚａｎｉ、Ｆ、ら（
１９７９年）　Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｏｎ、、２５巻、８７９頁）。しかし以上のよう
な生産法は新鮮なリンパ球が大量に必要となり、治療薬
としてのＨｕＩＦＮ−γの大量生産を困難にしている。

近年ＨｕｌＦＮ−γのｃＤＮＡがクローニングされ、大
腸菌でＨｕｌＦＮ−γ様蛋白の生産が可能になった（Ｇ
ｒａｙ、Ｐ、Ｗ、ら（１９８２年）Ｎａｔｕｒｅ、２９
５巻、５０３頁）。しかし微生物でつくられるＩＦＮ−
γは動物細胞と微生物との蛋白合成機構が多少異なる為
に、つくられる蛋白のアミン末端が天然のそれと異なる
場合が多い。

現に大腸菌で作られた組換え型のＨｕｌＦＮ−γのアミ
ノ末端は天然のＨｕＩＦＮ−γと異なりメチオニンにな
っている。更に微生物によってつくられるＩＦＮ−γは
、天然のＨｕＩＦＮ−γが糖鎖を有しているのに対し、
糖鎖か結合していない。このように微生物の蛋白合成系
によってつくられたＩＦＮ−γと天然のＨｕｌＦＮ−γ
とは物質として異なり、治療薬として長期間使用したり
頻回使用する場合には、抗原抗体反応による力価の減少
、ショック等のアレルギー反応の問題が懸念される。Ｌ
ｅらは天然のＨｕＩＦＮ−γと大腸菌でつくられたＩＦ
Ｎ−γとではモノクローナル抗体を用いた抗原抗体反応
の反応性か異なる事を報告しており、この反応性の違い
は糖鎖の有無に起因するものではないことを示した（Ｌ
ｅら（１９８４年）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１３２巻、１３００頁）。一方、株化されたＴ＠胞ツク
ローンＮａｔｈａｎ、Ｈ，ら（１９８１年）Ｎａｔｕｒ
ｅ、２９２巻、８４２頁）、Ｔ細胞ハイブリドーマ（Ｌ
ｅら（１９８２年）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、　７９巻、７８５７頁）、
成人型白血病ウィルスで形質転換したＴ細胞（Ｓｕｇａ
ｍｕｒａ、にら（１９８３年）Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、。

１３１巻、１６１１頁）によるＨｕＩＦＮ　　７の生産
が報告されているか、これらの細胞はヒト白血病ウィル
スをプロウィルスとして含み、或いはウィルス粒子を細
胞外に放出しているものと思われ、生物的危険の問題が
残されている（Ｓｕｇａｍｕｒａら。（１９８３年）　
Ｊ　、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３１巻。

１６１１頁）。

また、ＨｕＩＦＮ−７のｃＤＮＡ配列にＳＶ４０のプロ
モーターを接続し、動物細胞でのＨｕＩＦＮ−γの生産
が試みられた（Ｇｒａｙ、Ｐ、Ｗ、ら（１９８２年）Ｎ
ａｔｕｒｅ、　２９５巻、５０３頁；Ｈａｙｎｅｓ　、
　Ｊ　、ら（１９８３年）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　
Ｒｅｓ、、　１１巻、６８７頁；５ｃａｈｉｌｌ。

Ｓ、Ｊ、ら（１９８３年）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ　、Ａｃ
ａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　、　８０巻、４６５４頁；Ｄｅｖｏ
ｓ。

Ｒ１ら（１９８２年）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒ
ｅｓ、。

１０巻、２４８７頁）。しかしごれらの生産に使用され
た細胞は全てヒト以外の哺乳動物由来の株化細胞であっ
た。

（発明が解決しようとする問題点） ＨｕＩＦＮ−７は糖蛋白である。現在ＨｕＩＦＮ−γの
糖鎖の′構造については不明な点が多く、ヒト以外の細
胞でつくられたＨＬＩＩＦＮ−γとヒト由来細胞でつく
られたＨｕｌＦＮ−γの糖鎖の構造及び抗原性に違いか
あるかは不明である。しかしヒト由来細刷てつくられる
ＨｕＩＦＮ−γは、天然のＨｕＩＦＮ−γと同一のもの
と考えられ、ヒト以外の細胞でつくられたＨｕｌＦＮ−
γに比してより安全性が高いと考えられる。またヒト以
外の細胞でＨｕＩＦＮ−γをつくる場合はＨｕｌＦＮ−
γの製品中にヒト以外の生物の蛋白等の構成成分や分泌
成分が混入する事が考えられ、治療薬としての長期間の
投与におけるアレルギー反応、ショック等の問題が予想
されるが、ヒト由来細胞を用いて作った製品中には本質
的にヒトの成分、すなわちヒト血液中に存在している物
質以外は含まれず生産物の安全性の向上か期待される。

ＨｕＩＦＮ−γをヒト由来の培養細胞につくらせる場合
、高率に発現するように改良したＨｕｌＦＮ−γ遺伝子
を含むＤＮＡ配列で形質転換する方法が考えられるが、
一般にＨｕＩＦＮ−γはヒト由来細胞に強い毒性を有す
る為に、形質転換された細胞は自らつくるＨｕＩＦＮ−
γの為に死滅してしまい継代培養が可能な形質転換株を
得ることは極めて困難なことと思われる。つまりハムス
ター由来の細胞を形質転換し継代培養可能なＨｕｌＦＮ
−γ産生能のある形質転換株を得ることはできるが、ヒ
ト由来培養細胞からは継代培養可能な形質転換株は得ら
れない。本発明者らは高率に発現するように改良したＨ
ｕｌＦＮ−γ遺伝子を含むＤＮＡ配列で形質転換株を得
る場合、ＨｕｌＦＮ−γ感受性株を用いた場合は極端に
形質転換効率が低下するかＨｕＩＦＮ−γに耐性を示す
ヒト由来培養細胞或いはＨｕＩＦＮ−γに対する耐性変
異株を用いることにより初めて継代培養可能な形質転換
株を得、本発明を完成するに至った。本発明により基本
的にはどのようなヒト由来培養細胞からでも継代培養可
能なＨｕＩＦＮ−γ生産株かでき、従って極めて安全性
の高い天然型のＨｕＩＦＮ−γを供給する事が可能にな
るものと考えられる。以下に本発明を更に詳細に説明す
る。

（発明の構成２問題点を解決するだめの手段）ＨｕＩＦ
Ｎ−γをコードする核ＤＮＡ配列は、ヒトＤＮＡからク
ローン化される。ヒトＤＮＡは、例えばヒト白血球細胞
培養細胞或いは組織などを用い、Ｂ１１ｎらの方法（Ｂ
ｌｉｎ、Ｎら（１９７６年）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
ｓ　Ｒｅｓ、、　３巻２３０３頁）により調製される。

ＨｕＩＦＮ−γ遺伝子のクローニングに用いるベクター
はＣｈａｒｏｎ２８に代表されるλフアージベクター、
ｐＢＲ３２２に代表されるプラスミドベクター或いはｐ
ＨＣ７９に代表されるコスミツドなどが利用できるか、
一般的には、高率で長鎖のＤＮＡ断片をクローニングで
きるλフアージベクターをベクターとして用いる遺伝子
操作法が用いられる。すなわちヒト高分子ＤＮＡを適切
な制限酵素で切断後、人ファージベクターの置換可能領
域の代りに挿入し、リコンビナントファージＤＮＡをつ
くる。次にインビトロパンケージングの手法を用い、感
染性のあるファージ粒子を作製する。次に宿主大腸菌と
ともにプレートにまき、組換え型ファージのプラークを
形成させる（Ｅｎｑｕｉｓｔ、’Ｌら（１９７９）　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　６８巻２８
１頁；Ｈｏｒｎ、Ｂ（１９７９）Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉ
ｎ　　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ６８巻　２９９頁）ｏＨｕ
ｌＦＮ−７をコードするＤＮＡ断片を持つ組換え型ファ
ージのプラークの検出には、ｃＤＮＡや合成りＮＡをプ
ローブとしたプラークハイブリダイゼーションの手法（
Ｗｏｏ。

Ｓ、Ｌ、Ｃ，（１９７９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎＥ
ｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、６８巻　３８９頁；　５ｚｏｓｔ
ａｋ。

）、Ｗ、ら（１９７９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅ
ｎｚｙ　−ｍｏｌｏｇｙ、６８巻　４１９頁）が利用で
きる。またＨｕｌＦＮ−γの遺伝子を持つ組換え型ファ
ージは、プラークハイブリダイゼーションによって選択
されたプラークから回収し宿主大腸菌と共に培養するこ
とにより大量に調製できる。また組換え型ファージのＤ
ＮＡはフェノール法等により調製でき　′る（Ｍａｎｉ
ａｔｉｓ、Ｔら（１９８２年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　　ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎ
ｕａｌ、Ｃｏ１ｄ　　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　
　Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｙ）。

このようにして得られた核ＨｕｌＦＮ−γ遺伝子を導入
し、安定に発現する細胞のみを選択的に増殖させる為に
は、機能するプロモーター配列とＨｕＩＦＮ−γ遺伝子
か接続した配列と選択マーカーを同−ＤＮＡ配列上に持
つＤＮＡ配列が適切である。動物、細胞での選択マーカ
ーとしてはＥｃｏｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ，Ｃ，
ら（１９８０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、　２０９巻、１４２
２頁）、＋１　ｅ　０（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、Ｐ、Ｊ　、
ら（１９８２年）Ｊ、Ｍｏｌ。

Ａｐｐｌ、Ｇｅｎｅｔ−、１巻　３２７頁）、ｄｈｆｒ
（Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ、ら（１９８０年）Ｐｒｏｃ、Ｎａ
ｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、７７巻、３５６７頁）など
の遺伝子が用いられる。また、そのようなり　Ｎ　、Ａ
配列を大量に調製する為には、そのようなり　Ｎ　Ａ配
列が、大腸菌で複製し且つ大量調製可能なプラスミドや
ファージであることが望ましい。実施例３に示したプラ
スミドｐｓＶｅｓｍａｌγやｐＳＶ２ｐＴＫγは、以上
のような目的にかなうプラスミドである。すなわち大腸
菌で複製可能にするＤＮＡ複製開始点（ｏｒｉ）と、選
択マーカー（アンピシリン耐性遺伝子）及び動物゛培養
訓胞での選択マーカー（Ｅｃｏｇｐｔ）及び機能するプ
ロモーターと接続したＨｕＩＦＮ−γの核ＤＮＡ配列か
同一のＤＮＡ配列上に存在している事を特徴としたプラ
スミドである。

ヒト培養細胞としてはアメリカンタイプカルチャーコレ
クション（ＡＴＣＣ）から入手可能なヒト由来の細胞例
えは、ＨｅＬａ（ヒト子宮頚ｉ１’ｆｆ細胞）、ＦＬ（
ヒト羊膜細胞）、Ｗ　Ｉ　Ｓ　Ｈ（ヒト羊膜細胞）、Ｗ
Ｉ　−２６ＶＡ４　（ＳＶ４０で形質転換したヒト１１
ｉ１ｉ　！Ｄ　肥）を使用することができる。

多くのヒト由来培養細胞株からＨｕＩＦＮ−γ耐性株あ
るいは、ＨｕＩＦＮ−γ耐性変異株を選択する方法とし
てはＨｕＩＦＮ−γを１ユニット乃至数万ユニット含む
培地で培養細胞を継代培養すればよい。ＨｕＩＦＮ−γ
感受性ヒト由来培養細胞はＨｕＩＦＮ−γの毒性の為に
培養生変性変型し更には死滅するか、ＨｕＩＦＮ−７耐
性株は何ら変化かなく生育しつづける為に容易に選択で
きる。またＨｕＩＦＮ−γ感受性株はＨｕｌＦＮ−γ処
理すると著しく二本ｍｌ　ＲＮ　Ａであるポリ■：Ｃに
対して感受性になりポＩＪ　Ｉ　：　Ｃを含む培地で培
養すると細胞は著しく変性し死滅する為にＨｕＩＦＮ−
γ感受性株と識別される。

このようにして得られたＨｕ−ＩＦＮ−γ耐性株もしく
はＨｕ−ＩＦＮ−γ・耐性変異株へのＤＮＡの導入法と
して、トランスフェクション効率に差はあるが、リン酸
カルシウム法（Ｗｉｇｌｅｒ、Ｍ。

ら（１９７７年）Ｃｅｌｌ、１１巻、２２３頁）、マイ
クロインジェクション法（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、Ｗ。

Ｆ、ら（１９８０年）Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７７巻、５３９９頁）、リポゾーム法、ＤＥＡ
Ｅ−デキストラン法或いは細胞融合法（Ｓｃｈｏｆｆｎ
ｅｒ、　Ｗ、ら（１９８０年）Ｐｒｏｃ。

Ｎｏｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　、　７７巻２１
６３頁）等の方法が用いられている。

機能するプロモーターを接続したＨｕｌＦＮ−γ核ＤＮ
Ａ配列を、例えはリン酸カルシウム法て動Ｈｕ−ＩＦＮ
−７耐性株あるいは、ＨｕｉＦＮ−７−耐性変異株に導
入し、ＨｕＩＦＮ−γを産生ずるようになった細胞は、
通常細胞の培養に用いられる血清を含んだ培地はかりて
なく、全く血清を含まない無血清培地でもＨｕｌＦＮ−
γを産生ずる事ができる。ＨｕＩＦＮ−γの生産に無血
清培地を用いる事はＨｕＩＦＮ−γの培地からの回収精
製をより容易にするものである。

またＨｕｌＦＮ−γ遺伝子と動物細胞選択マーカーを同
−ＤＮＡ配列上にもつプラスミドをＨｕ−ＩＦＮ−γに
感受性である培養細胞に導入し、選択マーカー例えばミ
コフェノール酸耐性などの耐殴味を取得することによっ
て、Ｈｕ−ＩＦＮ−γに耐性となり、かつ継代培養可能
な形質転換細胞を得ることも可能であり該培養細胞を培
養して、ＨｕｉＦＮ−γを回収・精製することもできる
。

Ｈｕ−ＩＦＮ−γの培地からの回収・精製は公知の方法
が適用できる。即ちコントロールトポアグラス（エレク
トロヌクレオニクス社製）にＨｕ−ＩＦＮ−γを吸着さ
せＰ　Ｂ　Ｓ　、（０，１５Ｍ−Ｎａｃｌ−０，１５Ｍ
　ＩＪン酸バッファーｐＨ７，４）で洗った後、５０％
ポリエチレングリコールを含むＰＢＳで溶出し、Ｃｏｎ
Ａ−３ｅｐｈａｒｏｓｅでＩＦＮを吸着後０．１５　Ｍ
Ｎａｃｌと０．１．５　Ｍａ−メチル−Ｄ−マンノシド
を含むリン酸バッファーで溶出し、Ｂｉｏｇｅｌ−Ｐ−
１００を通過させて、ＩＦＮを回収することができる。

なおインターフェロンの活性は、ＦＬ細細胞パスキュラ
ー・ストマチチス・ウィルス（ＶａｓｃｕｌａｒＳｔｏ
ｍａｔｉｔｉｓ　　Ｖｉｒｕｓ　）或いはシンドビス・
ウィルス（Ｓｉｎｄｏｂｉｓ　　Ｖｉｒｕｓ）　　を用
いたＣＰＥ阻止法（Ｐｈｉｌｉｐ、Ｃ，ら（１９８１年
）　Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、　７
８巻、３８７頁）で測定した。

（実施例） 以下に実施例を示すが、本発明に係る詫実験は内閣総理
大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」に従って行った
。また実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、　皿
々の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげる
雑誌、成書を参考とした。

１、蛋白質　核酸　酵素、２６巻、４号、　（１９８１
年）臨時増刊　遺伝子操作（共立出版）２、遺伝子操作
実験法、高木康敬　編著（１９８０年）講談社 ３　遺伝子操作マニュアル、高木康敬　編著（１９８２
年）講談社 ４、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　ａ　
　Ｉａｂｏｒａｔ−ｏｒｙ　　ｍａｎｕａｌ、Ｔ、　Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ　　ら編（１９３２年）　Ｃｏ１ｄ　Ｓ
ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａ　−ｔｏｒｙ ５．　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、　６５巻。

Ｌ、Ｇｒｏｓｓｍａｎら編（１９８０年）Ａｃａｄｅ−
ｍｉｃ　　Ｐｒｅｓｓ ６、　　Ｍｅｔｈ’ｏｄｓ　　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ、　６８巻。

Ｒ，Ｗｕ編（１９７９年）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓ
ｓ実施例Ｉ ＨｕＩＦＮ−γ遺伝子のクローニング 複数の健康成人から採血し、バフィーコートを採取後、
０．８３係ＮＨ４Ｃｌを約ｌＯ倍量加えて溶血後、イー
グルＭ　Ｅ　Ｍ借地で洗浄し白血球を得た。

１０１０個の白血球を、５０ｍｅの０．５　Ｍ　　Ｅ　
Ｄ　Ｔ　Ａ　。

０．５％ザルコシル、１００μ９７ｍｅプロテアーゼに
の溶液５０ｍｅに５０°Ｃ，３時間振盪して溶解させた
つフェノール抽出を３回行い、水層を２０ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣＪ（ｐＨ８，０）　、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　。

１０　ｍ、Ｍ　ＮａＣ１に対し透析した。透析物を３７
”Ｃ、３，５時間リボヌクレアーゼ（１００ｐｆＺ／　
ｍｅ）で処理し、フェノール抽出後、２０ｍＭ　Ｔｒｉ
ｓ・ＨＣｇ（ｐＨ８，０）、１　ｍＭ　　ＥＤＴＡ、、
　１０　ｍＭＮａＣｌに対して透析し、約３３ｍｑの高
分子ヒトＤＮＡを得た。ヒトＤＮＡを制限酵素Ｂ　ａｍ
Ｈ１で切断後、蔗糖密度勾配遠心により約８〜９キロベ
ースの大きさのＢａｍＨＩ　　Ｄ　Ｎ　Ａ断片を調製し
たつラムダファージベクターＣｈａｒｏｎ　２８　ＤＮ
ＡをＢａｍＨｌで切断後、蔗糖密度勾配遠心によりＣｈ
ａｒｏｎ　　２８の左端断片及び右端断片を含む画分を
集め、エタノール沈澱により回収した。

Ｃｈａｒｏｎ　２８の両端のＤＮＡ断片とヒト８〜９キ
ロベースＢａｍＨ１断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで結合後
、エンキストとスタンバーブの方法（Ｌ、Ｅｎｑｕｉｓ
ｔとＮ、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ（１９７９年）Ｍｅｔｈｏ
ｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏ＋、、６８巻、２８１頁）によりイ
ンビトロパンケージングを行い、大腸菌ＬＥ３９２　　
を宿主として組換え型ファージのプラークを形成させた
。次にプラークハイブリダイゼーションの手法（Ｂｅｎ
ｔｏｎ、Ｗ、Ｄ、、Ｄａｖｉｓ、Ｒ。

Ｗ、　（１９７７）　５ｃｉｅｎｃｅ、　１９６巻１８
０頁）によりＨｕｌＦＮ　　７の遺伝子を持つ組換え型
ファージクローンを選択した。プローブとしては、Ｈｕ
ＩＦＮ−γの遺伝子に存在する配列を持つオリゴヌクレ
オチドＣＴＴＧＧＣＴＧＴＴＡＣ、ＣＣＴＧＧＣＡＧＴ
ＡＡＣ及びＧＣＴＣＴＴＣＧＡＣＣＴＣＧをホスホトリ
エステル法（Ｍｉｙｏｓｈｉ。

Ｋ　　ｅｔ　　ａｌ　、（１９８０）Ｎｕｃｌｅｉｃ　
　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、８巻、５５０７頁）で合成し、５
−ＯＨを〔γ−Ｐ、ＪＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼで標識して用いた。

約２００万の組換え型ファージクローンから用いた３種
の合成りＮＡプローブすべてとハイブリクイズするファ
ージクローンＳ８−１１，５１８−６，５１９−５及び
５２０−１の４株を得た。

それぞれのファージクローンからＤＮＡを調製し、制限
酵素ＢａｍＨＩで切断した結果、すべてのファージクロ
ーンに約８，６キロベースのＤＮＡ断片が含まれており
、種々の制限酵素による切断４片の大きさの分析及び後
記のＤＮＡ配列の分析から選択された・１株の組換え型
ファージが、ＨｕｌＦＮ−γのＢａ　ｍＨ［８，６キロ
ベ一ス断片を含むファージと同定された。

実施例２ ｐＢＲ７８，６−１、ｐｓＶ２ｒ８．６−１及びｐｓＶ
２７８．６−２の作製 ＨｕＩＦＮ−γの遺伝子を含むファージクローンＳ８−
１１のＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ１で切断後、同じ（Ｂ
ａｍＨＩで開環し、バクテリアアルカリホスファターゼ
処理したプラスミドｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒ、Ｆ
、ら（１９７７年）Ｇｅｎｅ、２巻。

９５頁）に繁ぎ、大腸菌Ｃ６００ｒ−靜本形質転換した
。アンピシリン耐性、テトラサイクリン感受性の形質を
持つ形質転換株の中からｐＢＲ３２２のＢａｍＨ１部位
に約８６キロベースのＨｕｌＦＮ−γの遺伝子が挿入し
たプラスミドを持つ形質転換株を選び、そのプラスミド
をｐＢＲγ８．６−１とした。第１図にｐＢＲγ８．６
−１の構造を示した（図中、Ｂ、Ｅ及びＭは、それぞれ
制限酵素ＢａｍＨＩ　、ＥｃｏＲＩ、ＭｓｔＩＩの認識
部位を示す。

Ａｍｐγ　はアンピシリン耐性遺伝子、ＨｕＩＦＮ−γ
はＨｕＩＦＮ−γ遺伝子を示す）。ｐＢＲγ８．６−１
をＢａｍＨＩで切断し、約８．６キロベースのＤＮＡ断
片をアガロースゲル電気泳動により調製し、同じ＜Ｂａ
ｍＨＩで開環し、バクテリアアルカリホスファターゼ処
理したプラスミドｐＳＶ２ｇｐｔ１１ｕｌｌｉｇａｎ、
Ｒ，Ｃ，とＢｅｒｇ、Ｐ、（１９８０年）Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ、　２０９巻、１４２２頁）に７４　ＤＮＡＮカリゼ
で接続し、大腸菌Ｃ６Ｃ６００ｒを形質転換した。っ形
質転換株の中から第２図に構造を示したプラスミドｐＳ
Ｖ２７８．６−１及びｐｓＶ２７８．６−２を持つ株を
分離した（図中、Ｂ　、　Ｅ　、　Ｍ及びＰはそれぞれ
制限酵素Ｂａ　ｍＨＩ　、　ＥｃｏＲＩ　、　Ｍｓｔ　
ＩＩ及びＰｖｕＵのＰｌ　ａ部位を示すっＡｍｐγはア
ンピシリン耐性遺伝子、Ｅｃｏｇｐｔ　　は大腸菌のグ
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、Ｈｕ
ｌＦＮ　　ｒはＨｕｌＦＮ　　７遺伝子を示す。）ｐｓ
Ｖ２７８．６−１とｐＳＶ２７８，６−２はｐＳＶ２ｇ
ｐｔのＢａｍ）（１部位にＨｕ）ＦＮ−７遺伝子を含む
約８．６キロベースのＤＮＡ断片が、それぞれ時計方向
及び反時計方向に入ったプラスミドである。それぞれの
プラスミドＤＮＡはセシウムクロライド平衡密度勾配遠
心法により調製した。

またプラスミドＤＮＡは、必要に応じ、犬Ｉ揚菌ＧＭ３
３ｄａイを宿主菌として調製した。

実施例３ ｐＳＶｅＳｍａＥ７−及びｐＳＶ２ｐＴＫ７の作製ＳＶ
４０のプロモーター領域の配列とＨｕＩＦＮ−γ核ＤＮ
Ａ配列が接続した配列を持つプラスミドであるｐＳＶｅ
ＳｍａＥ７はｐＢＲ８，６−１゜ｐｓＶ２ｇｐｔ及びｐ
ＳＶ３ｇｐｔ（ＭｕｌＩｉｇａｎ、Ｒ，Ｃ。

とＢｅｒｇ、Ｐ、（１９８０年）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０
９９゜１４２２頁）を出発材料として、第３図−ｆａ）
、−（ｂ）に示した方法により作製した（図中、Ｂ、Ｅ
、Ｈ。

Ｍ、Ｐ、Ｓａｌ及びＳｍａは制限酵素Ｂ　ａ　ｍ　ＨＩ
　　。

ＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄ　■、ＭｓｔＩＩ、Ｐｖｕロ、５
ａｌＩ及びＳｍａｌ　　による認識部位を示す。Ａ、ｍ
ｐη、Ｔ−ａｇｒＥｃｏｇｐｔ、ＳＶｅ及びＨｕＩＦＮ
　　７はアンピシリン耐性遺伝子、Ｔ−抗原遺伝子、大
腸菌グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子
、ＳＶ４０のプロモーター領域及びＨｕＩＦＮ−γ遺伝
子を示す。ｏｒｉ　　は大腸菌の中でのプラスミドの複
製起点を示す）。

すなわちｐｓＶ３ｇＩ）ｔをＨｉｎｄ　ＩＩＩで切断し
、最も大きいＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡＩＪガーゼで環状
化しｐＨ１を作製した。次にｐＨ１のＰｖｕ口部位をＳ
ａｌ　　１！Ｊンカーを用いてＳａｌ　　１部位に改め
、ｐＨ２を作製した。更にｐＨ２のＨｉｎｄ　Ｉ１１部
位をＨｉｎｄｍ−Ｓｍａ　Ｉアダプターを用いてＳｍａ
■部位を導入し、ｐＨ５ｍａＩを作製した。ｐ　ＨＳ　
ｍ　ａ■をＳａｌ　Ｉ　、　ＥｃｏＲＩ切断しｐｓＶ２
ｇｐｔのＢａｍＨＩ部位をＢａｍＨＩで切断後、ＤＮＡ
ポリメラーゼＩ（Ｋｌｅｎｏｗ）で平滑末端にしＴ４Ｄ
ＮＡリガーゼで環状化して作製したｐＳｌを同じくＳａ
ｌ　Ｉ、ＥｃｏＲＩ切断し、アンピシリン耐性遺伝子を
持つＤ　Ｎ　Ａ断片とＴ　４　Ｄ　Ｎ　Ａ　！Ｊガーゼ
で結合させｐＳＶｅＳｍａＥをつくった。次にｐＢＲγ
ｇ、６−１をＭ　ｓ　ｔ　ＩＩ　　で切断し、末端をＤ
ＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ）で平滑末端にし
、次にＢａｍＨＩで切断し、ＨｕｌＦＮ−γ配列を持つ
ＤＮＡ断片を得、これをＳｍａＩ、ＢａｍＨＩ切断した
ｐＳＶｅＳｍａＩに導入しｐＳＶｅＳｍａＥ７を作製し
た。

ヘルペスンンプレツクスウイルスタイプｌのチミジンキ
ナーゼのプロモーター領域の配列とＨｕＩＦＮ−γ遺伝
子が接続した配列を持つプラスミドであるｐＳＶ２ｐＴ
Ｋγは、ｐＢＲγ８．６−１゜ｐＨ５Ｖ１０６（ＭｃＫ
ｎｉｇｈｔ、Ｓ、Ｌ、とＧａｂｉｓ。

Ｅ、Ｒ，（１９８０年）Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅｓ　。

８巻、５９３１頁）及びｐｓＶ２ｇｐｔ　　を出発Ｆｖ
！ｔＥ４にして第４図に示した方法により作製した（図
中、Ｂ、ＢｃｌＩ、Ｂｇｌ、Ｅ、Ｓａｔはそれぞれ制限
酵素ＢａｍＨＩ、　Ｂｃｌ　ｒ、　Ｂｇｌ　Ｕ、　Ｅｃ
ｏＲＩ、　Ｓａｌ　Ｉによる認識部位を示す。Ａｍｐ　
　、ｐＴＫ、ＴＫ。

ＨｕＩＦＮ　−γ、Ｅｃｏｇｐｔ　　はアンピンリン耐
１生４点伝子、チミジンキナーゼのプロモーター領域、
チミジンキナーゼ遺伝子、ＨｕＩＦＮ−Ｔａｉ子、大腸
菌ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を示す。ｏ
ｒｉは大腸菌の中でのプラスミドの復製起点を示す）。

用いた５ａｌＩリンカ−とＳｍａＩアダプターはそれぞ
れｄ　（ｐＧＧＴＣＧＡＣＣ）及びｄ　（ｐ　ＡＧＣＴ
ＣＣＣＧＧＧ　）の配列を持つものを使用した。またＤ
ＮＡポリメラーゼ■はＫｌｅｎｏｗ　フラグメントを用
いた３、 実施例４ ＨｕｌＦＮ−γ耐性株の選択 ＨｅＬａ、ＦＬ、ＷＩＳＨ，ＷＩ−２６ＶＡ４　なとの
ヒト由来培養細胞を１００ユニット−／　ｍｅのＨ１１
１Ｆ　Ｎ−−γ及び５弘Ｆ　ＣＳを含むＭＥＭ培地で２
４穴マルチデイツシユプレートを用い２４時間培養後、
培養液を除き、ＰＢＳで１回洗った後、１０　／（！；
／／　ｍ（ポリＩ：Ｃを含むＭ　Ｅ　Ｍを加え、３７°
Ｃで更多こ培養をつつけた。１６〜２４時間後、細胞の
形態を観察した結果、ＨｅＬａ、ＦＬ及びＷ　Ｉ　Ｓ　
Ｈは細胞が円形化しプレート底面より剥離しているかＷ
ｌ−２６ＶＡ４はそのような細胞の変性はみられなかっ
た。このことはＷｌ−２６ＶＡ４がＨｕＩＦＮ−γに対
して耐性を有することを示している。

実施例５ ＨｕＩＦＮ−γに耐性変異株の分離 ＦＬ細胞を７５ｉの底面積を持つ培養フラスコに底面全
面に培養後、１００ユニツト／　ｍｅのＨｕＩＦＮ−７
及び１０　μｙ／　ｍｅのポリ■：Ｃを含むＭ　Ｅ　Ｍ
培地に更新し４８時間培養した。殆んどのＦＬ細胞は底
面から剥離したか、培地を１００ユニツト／　ｍｅのＨ
ｕＩＦＮ−７を含むＭ　Ｅ　Ｍに替え、更に約１ケ月培
養をつつけ、ＨｕｌＦＮ−γ耐性ＦＬ細胞のコロニーを
出現させたつコロニーを増殖させＨｕＩＦＮ−γ耐性Ｆ
Ｌ細胞を得た。

実施例６ 形質転換株の取得 実施例３てＨｕＩＦＮ−γの発現か可能なように作製さ
れたｐＳＶｅＳｍａＩｒ、ｐＳＶ２ｐＴＫ７或いはＨｕ
ＩＦＮ−７遺伝子を含まないｐＳＶ２ｇｐｔをＨｕ　Ｉ
　Ｆ　Ｎ　−７に感受性細胞であるＨｅＬａ、ＦＬ。

Ｗ　Ｉ　Ｓ　Ｈ細胞酸いはＨｕＩＦＮ−γ耐性株である
ＷＩ−２６ＶＡ４細胞及びＨｕＩＦＮ−７耐性ＦＬ細胞
にリン酸カルシウム法（Ｗｉ　ｇ　ｌ　ｅ　ｒら（１９
７７年）Ｃｅｌｌ、１１巻、２２３頁）に準じて導入し
た。１．４４μｙのプラスミドを含むプラスミド−リン
酸カルシウム共沈澱物を予めＩＯ幅牛新生児血清を含む
イーグルＭ　Ｅ　Ｍ培地で生育させた上記の細胞（３Ｘ
１０　細胞／　８．６　ｍｅ培地／直径６ｃｍｎ培養皿
）に加え１５時間後に培地を更新し、培養をつづけ４８
時間後に２５μｇＬ／　ｍｅ　ミコフェノール酸。

２５０ｔｔ！／ｍｅキサンチン、　０．１　ｆｉ？／Ｔ
ｎｅアミノプテリン、２５μＶｍｅアデニン及び５μＶ
ｍｅのチミジンを含む培地に更新し、更に、２週間培養
をつづけ、出現した形質転換株のコロニー数を測定した
。

表に示したようにｐＳＶ２ｇｐｔを用いた場合、全ての
細胞から形質転換株が得られたが、ＨｕＩＦＮ−γ遺伝
子を含むｐＳＶｅＳｍａＩｒ或いはｐＳＶ２ｐＴＫγを
用いた場合はＨｕＩＦＮ−γ感受性材からは形ｒ了転換
株はわずかじか得られず、ＨｕＩＦＮ−７耐性を示すＷ
ｌ−２６ＶＡ４及びＨｕＩＦＮ−γ耐性ＦＬ細胞からは
多数の形質転換株のコロニーの出現がみられた。

実施例７ ＷＩ−２６ＶＡ４によるＨｕＩＦＮ−γの生産実施例６
で分離したＷｌ−２６ＶＡ４のｐＳＶｅＳｍａＩｒ或い
はｐＳＶ２ｐＴＫγの形質転換株のコロニーを分離し、
５ＺＦＣ５を含む、’ｖｆ　Ｅ　）、ｆ培地で増殖させ
た。２４穴のマルチプレートの底面全面に増殖させ、培
地を更新後２４時間培養し培養液に含まれるＩＦＮ活性
をＦＬ細胞とバスキュラー・ストマチチス・ウィルス（
ＶａｓｃｕｌａｒＳｔｏｍａｔｉｔｉｓ　　Ｖｉｒｕｓ
）或いはシンドビス・ウィルス（Ｓｉｎｄｏｂｉｓ　　
Ｖｉｒｕｓ）を用いたｃｐＥｐ且止法て測定した。その
結果、ｐＳＶｅＳｍａＩｒによる形質転換株からは：３
２．　：３ユニツト／２４　ｈ／１０　　ｃｅｌｌｓの
ＩＦＮ活性、ｐＳＶ２Ｔ）ＴＫ７　　による形質転換５
株からは５２４ユニツト’／’　２４　ｈ　／１０　ｃ
ｅｌｌｓのＩＦＮ活性の発現かみられた。

実施例８ プラスミドとして、ｐＳＶ２γ８．６〜１ｐＳＶ２ｐＴ
Ｋγ、ｐｓＶｅｓｍａｉγを各１．４４７ｚ、７　　用
いて実施例６（！：同様の方法て〜Ｖｌ　　２６　　Ｖ
Ａ４株に形質転換を行い、以下の結果を得た。

実施例９ Ｈｕ−ＩＦＮ−７耐性ＦＬ、細胞にょるＨｕＩＦＮ−γ
の生産 実施例６で分離したＨｕ４ＦＮ−γ　耐性ＦＩ、のｐＳ
Ｖ２ｐＴＫγの形質転換株のコロニーを分離し、５％Ｆ
Ｃ５を含むＭ　Ｅ　Ｍ培地で増殖させた。２４大のマル
チプレートの底面全面に増殖させ、培地を更新後２４時
間培養し培養液に含まれるＩＦＮ活性をＦＬ細胞とパス
チュラー・ストマチチス・ウィルス（Ｖａｓｃｕｌａｒ
　　Ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ　　Ｖｉｒｕｓ或いはシンド
ビス・ウィルス（Ｓｉｎｄｏｂｉｓ　Ｖｉｒｕｓ）を用
いたＣＰＥ阻止法で測定した。その結果、３Ｕｎｉｔ／
２４　ｈｒ／　１０　　ｃｅｌｌｓのＩＦＮ活性の発現
かみられた。っ 実施例１０ ＨｕｌＦＮ−γの精製と性質 実施例６て分離したＷ　Ｉ　−２６Ｖ　Ａ　４のｐＳＶ
２ｐＴＫγの形質転換株のコロニーを分■トシ、ｓ　％
　Ｆ　ＣＳを含むＭ　Ｅ　Ｍ培地で増殖させた。

プレートの底面全面に増殖させ、培地を更新後２４時間
培養し活性か１２８　ｕｎｉ　ｔｓ　／　ｍｅの培養液
１６０ｍ１’を得た。培養液６０ｍｅにコンドロールド
−ポアーグラス（エレクトロヌレクレニクス社製）ＣＰ
Ｇ３５０（メツシュサイズ１２０／２００　）を１．０
ｙを加え、４°Ｃ３時間撹拌後、コンドロールド−ポア
ーグラスをカラムにつめ、］、　５０　ｍＲ１リン酸２
１液（ｐＨ７，４）　０．１５　Ｍ　　ＮａＣ１で洗浄
後、５０％のエチレングリコールを含む同ｆｉ　＋％ｒ
液で溶出した、次に活性画分を２０ｍλ１１Ｊン酸媛衡
液で１０倍に希釈し５ｍｅのＣｏｎＡ−５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅカラムに通しＩＦＮを吸着後、０．１５　Ｍ　　Ｎ
ａＣ１と０．１５　Ｍ　　α−メチルＤ−マンノシドを
含む２０　ｍＭ　’）ン酸緩衝液で溶出した。活性フラ
クションを集めて０．２Ｍ１ｎｉＪ７ンモ＝７（ｐＨ６
，０）、０、１５　Ｍ　　ＮａＣ１に透析し、ポリエチ
レングリコール２００００　　で濃縮し、同１■衡液で
平衡化したＢｉｏｇｅｌ　　Ｐ−１００（２，６Ｘ６０
ｃｍ）を通しＩＦＮサンプルを得た。

得られたサンプルは酸（ｐＨ２，０）或いは０．１％Ｓ
ＤＳ処理により活性を失った。また精製ＩＦＮのポＩＪ
　Ｉ　：　Ｃの細胞毒性に対する感受性促進効果を調べ
たところ、ヒト細胞のみに促進効果かみられた。すなわ
ち、予め２４穴マルチデイツシユに単層形成させた種々
の細胞を３００ユニツト／　ｍｅ、２０時間のＩＦＮ処
理をし、次にポＩＪ　Ｉ　：　Ｃを１０μｑ／ｍｅで含
むＭＥＭ培地で２４時間培養したところＣＨＯ、ＢＨＫ
　（ハムスター細胞）は何ら変化しなかったか、ＦＬ、
ＷＩＳＨ，ＨｅＬａは細胞の円形化、剥ｒ１１［か観察
された。

（発明の効果） 従来Ｈｕ・■ＦＮ−γに感受性であり、１Ｉｕ−ＩＦＮ
−γ生産には不向きであると思われていたヒト細胞にＨ
ｕ−ＩＦＮ−γ遺伝子を導入し、ヒト・インターフェロ
ン−γを生産させることが可能となった。

即ちヒト−インターフェロン−γに耐性トナったヒト培
養細胞にヒト−インターフェロン−Ｔ　　ｔＫＤＮＡ配
列を導入し、得られた形質転換培養細弛を培養すること
により、天然型と同一のＨｕ　　ＩＦＮ−γを得ること
ができた。

また現在の知見からは、ヌードマウス或いはハムスター
等の動物体内で増殖させることか可能である。又それら
の動物の腹腔液や血清中からＨｕＩＦＮ−γを回収する
事も可能なことと思われる。また細胞を動物体内で増殖
させ、細胞を回収し、培養液中で培養することによりＨ
ｕＩＦＮ−γを産生ずる事も可能と思われる。

特許出願人　　鐘！Ｊ：：ｉ化学工業株式会社代理人　
弁理士　　　浅　　野　　真　　−手続油止ＮＣ方式９ 昭和ご０年２１７２日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ヒト由来培養細胞をヒトインターフエロン−γの
   遺伝子配列を含むＤＮＡ配列で形質転換することによつ
   て作製される継代培養可能な培養細胞。 （２）ヒト由来培養細胞がヒトインターフエロン−γ耐
   性である特許請求の範囲第１項記載の培養細胞。 （３）ヒト由来培養細胞がヒトインターフエロン−γ耐
   性変異株である特許請求の範囲第１項記載の培養細胞。 （４）ヒト由来培養細胞がＷＩ−２６ＶＡ４である特許
   請求の範囲第１項もしくは第２項記載の培養細胞。 （５）ヒト由来培養細胞がヒトインターフエロン−γ耐
   性ＦＬ細胞である特許請求の範囲第１項もしくは第３項
   記載の培養細胞。 （６）ヒト由来培養細胞をヒトインターフエロン−γの
   遺伝子配列を含むＤＮＡ配列で形質転換することによつ
   て作製される継代培養可能な培養細胞を培養培地中で培
   養してヒトインターフエロン−γを生成せしめ、これを
   採取するヒトインターフエロン−γの製造方法。 （７）ヒト由来培養細胞がヒトインターフエロン−γ耐
   性である特許請求の範囲第６項記載の製造方法。 （Ｓ）ヒト由来培養細胞がヒトインターフエロン−γ耐
   性変異株である特許請求の範囲第６項記載の製造方法。 （９）ヒト由来培養細胞がＷＩ−２６ＶＡ４である特許
   請求の範囲第６項もしくは第７項記載の製造方法。 （１０）ヒト由来培養細胞がヒトインターフエロン−γ
   耐性ＦＬ細胞である特許請求の範囲第６項もしくは第８
   項記載の製造方法。 （１１）培養培地が無血清培地である特許請求の範囲第
   ６乃至第１０項のいづれかの項記載の製造方法。 １２）形質転換ヒト由来培養細胞を動物体内で増殖させ
   、ヒトインターフエロン−γを該動物から回収する特許
   請求の範囲第６乃至第１０項のいづれかの項記載の製造
   方法。 （１３）形質転換ヒト由来培養細胞を動物体内で増殖さ
   せた後、細胞を回収し、培養液中で培養する特許請求の
   範囲第６乃至第１０項のいづれかの項記載の製造方法。