JPS6214783A - ヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子（以下
ＴＰＡと略す）をコードする染色体ＤＮＡ配列と動物細
胞内で機能するプロモーター領域のＤＮＡ配列とを連結
したＤＮＡ配列、及びそのＤＮＡ配列を有するＤＮＡで
形質転換されＴＰＡを産生ずるようになった異種及び同
種の細胞、更にその細胞を利用したＴＰＡの製造法に係
る。

プラスミノーゲン活性化因子は、血液中に存在するプラ
スミノーゲンをフィブリン溶解活性を有するプラスミン
に変換する作用を有し、種々の血栓症の治療薬として用
いられている。

（従来の技術） 現在プラスミノーゲン活性化因子として、主に人尿から
調製されるウロキナーゼ及び連鎖球菌から得られるスト
レプトキナーゼが用いられている。

しかしながら、人尿からのウロキナーゼの生産は、原料
の品質の不安定性や健康人の尿の大量確保の困難さなど
の欠点を有している。又、ストレプトキナーゼは細菌由
来の蛋白であり、ヒトへの頻回投与は免疫学的な危険性
と効果の減少を伴うと推定され、実際連鎖球菌の既感染
者には、ストレプトキナーゼに対する抗体を有している
者がおり、結果的に効果の減少が観察されている。

１９６９年にＢｅｒｎｉｋらは、ヒトの腎、膀胱、肺或
いは心臓等の組織からウロキナーゼと抗原性を同じくす
るプラスミノーゲン活性化因子を見い出した（　Ｍ、　
Ｂ、　ＢｅｒｎｉｋとＨ，Ｏ，Ｋｗａａｎ　（１９６９
年）ジャーナル・オブ・クリニカル・インベステイゲー
ション（Ｊ、　（１１ｉｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　）　、
　４８巻。

１７４０頁）。またヒトの胃、膀胱、肺、乳腺、脳、腎
、膵臓等の組織由来の培養細胞が、上記ウロキナーゼ型
のプラスミノーゲン活性化因子を分泌することが明らか
にされた（　Ｅ、　Ｌ、　Ｗｉｌｓｏｎら（１９８０年
）キャンサー・リサーチ（ＣａｎｃｅｒＲｅｓ、　）＋
　４０巻、９３３頁）。他方、ウロキナーゼと抗原性を
異にするＴＰＡがヒト黒色腫、脳腫、咽頭腫、神経芽腫
、その他の組織由来の培養細胞から分泌される事が見い
出された（　Ａ、　Ｇｒａｎｅｌｌｉ−ｐ　１ｐｅｒｎ
ｏとＥ、　Ａ、　Ｒｅ１ｃｈ（１９７８年）ジャーナル
・オブ・エクスペリメンタル・メデイスン（Ｊ、　Ｅｘ
ｐ、　Ｍｅｄ、　）、　１４８巻、２２３頁ｉＷ、ｓ。

Ｔｕｃｋｅｒら（１９７８年）キャンサー・リサーチ。

３８巻、２９７頁；　Ｄ、　Ｖｅｔｔｅｒｌｅｉｎら（
１９７９年）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　、　　
２５４巻、５７５頁；Ｅ、　Ｌ、　Ｗｉｌｓｏｎら（１
９８０年）キャンサー・リサーチ、４０巻、９３３頁）
。

ＴＰＡの５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によ
る推定分子量は約７（１６）（１６）であり、ウロキナ
ーゼ型プラスミノーゲン活性化因子に比べ大きい。ＴＰ
Ａは血液中にも見い出され、ウロキナーゼに比ベフイブ
リン親和性が強く、又その活性はフィブリンによって増
強されるなどの理由から、治療薬としてウロキナーゼよ
り優れていると考えられている。またプラスミノーゲン
活性化因子投与後の出血傾向などの副作用が少ないとも
考えられている。

’Ｉ”ＰＡの製造法として、本因子を生産する細胞株を
培養し、培養液から精製する方法がある（Ｄ。

Ｃ０几ｉｊ　ｋｅ　ｎとり、　Ｃｏ１１ｅｎ　（１９８
１年）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー。

２５６巻、７０８５頁）。この方法は、生産細胞のＴＰ
Ａ生産能に大きく依存し、大量生産が困難である。ＴＰ
ＡのｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）がクローニングされ、大腸
菌でＴＰＡ様蛋白の生産が可能になった（　Ｄ、　Ｐｅ
ｎｎ１ｃａら（１９８３年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ
）、　３（１１巻、２１４頁）。

しかし微生物によってつくられるＴＰＡ様蛋白は、微生
物の蛋白合成機構が動物細胞のそれと多少異なる為に、
つくられる蛋白のアミノ末端が天然のそれと異なる場合
が多い。更に微生物によってつくられるＴＰＡ様蛋白は
、天然のＴＰＡが糖鎖を有しているのに対し、糖鎖を含
んでいない。このように微生物の蛋白合成系を通してつ
くられた’１１’ＰＡ様蛋白と天然の’Ｉ’ＰＡとは物
質として明らかに異なり、治療薬として長期間或いは頻
回使用する場合には、抗原抗体反応による力価の減少、
ショック等のアレルギー反応の問題が懸念される。

またＴＰＡのＤＮＡ配列にＳＶ４０の初期プロモーター
を接続したＤＮＡ配列とジヒドロ葉酸還元酵素をコード
するＤＮＡ配列から成るプラスミドでＣＨＯ（チャイニ
ーズ　ハムスター卵巣）ｍ胞を形質転換し、更にメソト
ロキセートを含む培地で遺伝子の増幅した細胞を選択す
ることによりＴＰＡの生産が試みられた（特開昭５９−
４２８２１）。

しかし、この生産法に用いられた’Ｉ’ＰＡのＤＮＡは
ｃＤＮＡであり、また細胞はヒト以外の動物由来の株化
細胞であった。更にその細胞は強力に撹拌しないかぎり
浮遊培養できない細胞であった。

また、ヒトＴＰＡ染色体ＤＮＡをクローニングし、マウ
スの細胞を形質転換し、Ｔ　Ｐ　Ａ生産細胞を育種した
例がある。しかし、その方法はＴＰＡ遺伝子のプロモー
ター活性が低いため形質転換株のＴＰＡ生産能は制限さ
れたものであった。

（発明が解決しようとする問題点） 高等生物の多くの蛋白は、核ＤＮＡ配列上に、いくつか
に分断されてコードされていることが知られている。成
熟型のメツセンジャーＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）の配列をコ
ードしているＤＮＡ配列はエクソン（ｅｘｏｎ　）、分
断している配列は介在配列またはイントロン（１ｎｔｒ
ｏｎ　）と呼ばれている。

イントロンの生物学的な意義や機能は現在不明な点も多
いが、オバルブミン（Ｗｉｃｋｅｎｓ　、　Ｍ、　Ｐ、
ら（１９８０年）ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、　２
３５巻、６２８頁）やウィルス蛋白（Ｌａｉ、　Ｃ−Ｊ
、ら（１９７９年）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニ
ー（Ｐ　ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、
　Ｕ　Ｓ　Ａ）　。

７６巻、７１頁）のイントロンを含まない遺伝子配列は
、イントロンを含む配列に比べ、導入した動物細胞内で
の蛋白の生産が極めて少ないことが知られている。また
、イントロンを欠落させたＳＶ４０の遺伝子にβ−ｇｌ
ｏｂｉｎ遺伝子のイントロンを加えることにより、安定
なｍＲＮＡの蓄積が起こる事が知られている（　Ｈａｍ
ｅｒ、　Ｄ、　Ｈ，ら（１９７９年）セル（Ｃｅ１ｌ　
）、　１８巻、１２９９頁）。

また多くの遺伝子の培養細胞での発現にイントロンの配
列が必要であることが知られている。

遺伝子から転写された初期ＲＮＡからのイントロン部分
の配列の除去をスプライシング（Ｓｐｌｉｃｉｎｇ）と
呼ぶが、スプライシングは安定なｍＲＮＡの蓄積あるい
はｍＲＮＡの核から細胞質への移行の為に必要な事象と
推定される。

ＴＰＡ遺伝子は第１図に示すように、少なくとも１３の
エクソンと１２のイントロン、５′側隣接配列及び３′
側隣接配列から構成されている。本発明者らは、本来の
イントロンを有すＴＰＡの遺伝子から転写されスプライ
シングを受けたｍＲＮＡは、ｃＤＮＡ配列から転写され
ただけのｍＲＮＡよりも、より安定で高濃度に細胞質内
に蓄積される可能性があると推定した。

ＴＰＡ遺伝子をそのまま培養細胞に導入してもＴＰＡの
発現は殆んど見られなかった。このことは培養細胞で有
効な発現をみるには、培養細胞でｍＲＮＡの合成を開始
する事が可能にする他の遺伝子のプロモーター領域の配
列を付加する必要があることを示している。

正常で機能のある蛋白の発現の為には、イントロンの正
しい位置でのスプライシングが不可欠であるが、インシ
ュリン遺伝子とシミアンウィルス４０　（ＳＶ４０　）
のプロモーター領域を結合し、ＣＯ８細胞に導入した場
合の異常なスプライシングが報告されている（　Ｌａｕ
ｂ、　Ｏｌら（１９８３年）ジャーナル・オブ・バイオ
ロジカル・ケミストリー、２５８巻、６（１４３頁）。

またアミラーゼの発現においては、組織特異的なスプラ
イシングが存在し、同一の遺伝子から２つの異ったスプ
ライシングを経て、唾液腺アミラーゼと肝臓アミラーゼ
が合成されることが知られている（　Ｙｏｕｎｇ。

几、Ａ、ら（１９８１年）セル、２３巻、４５１頁）。

また、Ｓ　Ｖ　４０　（Ｅｅｒｋ、　Ａ、　Ｊ、ら（１
９７８年）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー。

７５巻、１２７４頁）、アデノウィルス（Ｃｈｏｗ。

Ｌ、Ｔ、（１９７７年）セル、１２巻、１頁）等におい
ても、同一の遺伝子から異ったスプライシングを経て複
数のｍＲＮＡ及び蛋白が合成されている。従って、動物
培養細胞にイントロンを含むＴＰＡ遺伝子を導入し、Ｔ
ＰＡを産生ずるには正常なスプライシングが起こる必要
があるが、本発明者らは、複数のイントロンを有するＴ
ＰＡの染色体ＤＮＡ配列に培養細胞で機能する、すなわ
ちｍＲＮＡ合成を開始する事が可能なプロモーター領域
のＤＮＡ配列を結合させ、種々の培養細胞に導入した場
合、正常にスプライシングされ’Ｉ’ＰＡが著量分泌さ
れる事を見い出し、本発明に至った。

ＴＰＡは糖蛋白である。現在ＴＰＡの糖鎖の構造につい
ては不明な点が多く、ヒト以外の細胞でつくられたＴＰ
Ａとヒト由来の細胞でつくられたＴＰＡの糖鎖の構造及
び抗原性に違いがあるかどうかは不明である。しかしヒ
ト細胞でつくられるＴＰＡは、天然のＴＰＡと区別でき
ないと考えられ、ヒト以外の培養細胞でつくられたＴＰ
Ａに比して、より安全性が高いと考えられる。またヒト
以外の細胞でＴＰＡを生産する場合は、ＴＰＡの製品中
にヒト以外の生物の蛋白等の構成成分が混入する恐れが
ある。適切な培養液によりヒト細胞を用いて作った’Ｉ
’ＰＡの製品中には、本質的にはヒトの成分、すなわち
ヒト血液中に存在している物質以外は含まれず、製品の
安全性の向上が期待される。

本発明者らは、ヒト由来の株化細胞を形質転換し、ＴＰ
Ａの高生産細胞を得ることに成功した。

この場合、細胞が’Ｉ’ＰＡの非生産細胞であれば、Ｔ
ＰＡ生産細胞に形質転換できる。まｔコ細胞がＴＰＡの
生産細胞であれば、形質転換して、より高度にＴＰＡを
生産する細胞を得ることができる。

多くの細胞は、器壁に付着する性質を有している。この
ような性質を有する細胞は、培養液を強制的に撹拌しな
がら培養した場合でさえ、細胞は単独な細胞として増殖
しｌこ＜＜、細胞の凝集塊を生じやすい。細胞の凝集塊
の大きさは不均一である為に、培地中での細胞密度は均
一にならない。

また撹拌の制御が困難で、撹拌が緩い場合ｔこは細胞は
器壁に付着する傾向にあり、逆に撹拌が強い場合には細
胞を傷つける恐れがある。本発明者らは、本来培養時に
器壁Ｉこ付着せず、細胞の凝集塊を生じにくく、単独な
細胞として増殖可能な血球由来の株化細胞を形質転換し
、ＴＰＡ０′）産生株を分離することに成功した。これ
らのＴＰＡ産生株は、非常に容易に浮遊培養を行え、大
量培養を容易に行うことができる。

本発明により、極めて安全性の高い天然型のＴＰＡを大
量に供給する事が可能である。以下に、本発明を更に詳
細に説明する。

（問題点を解決する為の手段） ＴＰＡのアミノ酸配列をコードしている遺伝子領域は、
遺伝子のクローニングの結果、約１８キロベース（ｋｂ
）の長さを持つことが確認された。

またＮｙらはその遺伝子が最低１４のエクソンと１３の
イントロンから構成されている事を示した（Ｎ、Ｙら（
１９８４年）プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、８１
巻、５３５５頁）。

ＴＰＡをコードする染色体ＤＮＡ配列とは、第１図に示
したＴＰＡの翻訳開始アミノ酸であるメチオニンのコド
ンＡＴＧから終止コドンＴＧＡまでの配列を含むＤＮＡ
配列を示す。

ＴＰＡをコードする染色体ＤＮＡは、ヒ１−ＤＮＡから
クローン化される。ヒトＤＮＡは、例えばヒト白血球細
胞培養細胞或いは組織などを用い、Ｅｌｉｎらの方法（
Ｂ１１ｎ、　Ｎ、ら（１９７６年）ヌクレイツク・アシ
ッズ・リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、
）、　　８巻、２３（１３）頁）により調製される。Ｔ
ＰＡ遺伝子のクローニングに用いるベクターはＣｈａｒ
ｏｎ　２８に代表されるλフアージベクター、ｐＢＲ３
２２に代表されるプラスミドベクター或いはｐＩ■Ｃ７
９に代表されるコスミッドなどが利用できる。−例とし
て、λファージをベクターとして用いる遺伝子操作法を
示す。ヒト高分子ＤＮＡを適切な制限酵素で切断後、λ
フアージベクターの置換可能領域の代りに挿入し、リコ
ンビナントファージＤ　Ｎ　Ａをつくる。次にインビト
ロパッケージングの手法を用い、感染性のあるファージ
粒子を作製する。次に宿主大腸菌とともにプレートにま
き、組換え型ファージのプラークを形成させる【Ｅｎｑ
ｕｉｓｔ、　Ｌら（１９７９）メソッズ・イン・エンザ
イモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇ
ｙ　）、　６８巻、２８１頁；Ｈｏｒｎ、　Ｂ（１９７
９）メソッズ・イン・エンザイモロシー。

６８巻、２９９頁）。ＴＰＡをコードするＤＮＡ断片を
持つ組換え型ファージのプラークの検出には、ＴＰＡを
コードするｃＤＮＡやＴＰＡ遺伝子の一部のＤＮＡ配列
を持つ合成りＮＡをプローブとしたプラークハイブリダ
イゼーションの手法（Ｗｏｏ、　Ｓ、Ｌ、Ｃ，（１９７
９年）メソッズ・イン・エンザイモロシー、６８巻、３
８９頁；　５ｚｏｓｔａｋ。

Ｊ、Ｗ、ら（１９７９年）メソッズ・イン・エンザイモ
ロジー、６８巻、４１９頁）が利用できる。またＴＰＡ
の遺伝子を持つ組換え型ファージは、プラークハイブリ
ダイゼーションによって選択されたプラークから回収し
宿主大腸菌と共に培養することにより大量に調製できる
。また組換え型ファージのＤＮＡはフェノール法等によ
り調製できる（　Ｍａｎｉａｔｉｓ　、　Ｔら（１９８
２年）　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　ａ　Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌａＳｐｒｉ
ｎｇ　Ｉ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）。

ＴＰＡ遺伝子が複数のＤＮＡ断片にクローニングされた
場合は、それぞれの断片から完全なＴ　Ｐ　Ａ遺伝子を
再構成することができた。

動物培養細胞へのＤＮＡの導入法として、トランスフェ
クション効率に差はあるが、リン酸カルシウム法（Ｗｉ
　ｇ　１　ｅ　ｒ　、　Ｍ、ら（１９７７年）セル。

Ｉ　１巻、　２２；［）、マイクロインジェクション法
（Ａｎｃｌｅｒｓｏｎ　、　Ｗ、　Ｆ、ら（１９８０年
）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、７７巻。

５３９９頁）、リボゾーム法、ＤＥＡＥ−デキストラン
法或いは細胞融合法（５ｃｈｏｆｆｎｅｒ、　Ｗ、ら（
１９８０年）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、７
７巻、２１６３頁）等が用いられている。リン酸カルシ
ウム法として用いるＤＮＡ材料としては、ＤＮＡ溶液の
他に大腸菌などの微生物、ファージなども利用できる。

細胞融合法では目的ＤＮＡ配列をプラスミドとして保有
している微生物のプロトプラストが用いられている。

本発明者らは、動物培養細胞内で機能する他の遺伝子、
すなわちＴＰＡ遺伝子以外のプロモーター領域の配列を
ＴＰＡ染色体ＤＮＡ配列の５′側に接続し、細胞に導入
することによりＴＰＡの非生産細胞を高生産細胞に形質
転換できることを見い出した。この場合、ＴＰＡのｍＲ
ＮＡ合成は、接続したプロモーター領域の制御下におか
れ、たとえば接続したプロモーター領域が構成的な蛋白
の遺伝子のプロモーター領域であれば、細胞内でＴＰＡ
のｍＲＮＡは常時合成され、従って細胞はＴＰＡの構成
的生産細胞になる。もし接続するプロモーター領域が、
誘導蛋白のものであれば、形質転換細胞は、ＴＰＡを誘
導蛋白として生産する。

動物培養細胞で機能するプロモーターの一つとしてＳＶ
４°Ｏのアーリープロモーターが知られている。このプ
ロモーターはＳＶ４０ＤＮＡの１−Ｉｉｎｄ　１ｌＩ−
Ｐｖｕ　ｌ　７ラグメント、約３４０ベースペア（ｂｐ
）に含まれている。またこのＤＮＡフラグメントは逆向
きにＳＶ４０の後期遺伝子プロモーターとしての活性を
有している。

ヘルペスシンプレックスウィルス（Ｈ８Ｖ）タイプ１の
チミジンキナーゼプロモーターもＳＶ４０初期遺伝子プ
ロモーターと同様に構成的なプロモーターであり、領域
の構造はＷａｇｎｅｒらによって示されている（　Ｗａ
ｇｎｅｒ、　Ｍ、　Ｊ、ら（１９８１年）プロシーデイ
ングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サ
イエンス・ニーニスニー。

７９巻、１４４１頁）。

機能するプロモーター領域とは、ｍＲＮＡの合成開始点
は含むが、それらのプロモーターが調節している蛋白の
最初のアミノ酸であるメチオニンのコドンは含まないプ
ロモーター領域の配列をさす。

以上のような観点からプロモーター領域の配列とＴＰＡ
染色体ＤＮＡ配列の接続したＤＮＡ（ＴＰＡ発現ベクタ
ー）の作製を後記実施例に示した。

遺伝子を細胞に導入した場合、導入遺伝子は、宿主染色
体ＤＮＡに安定に組み込まれる場合がある。遺伝子が組
み込まれる染色体との位置は一見でたらめであり、また
組み込まれるＤＮＡのコピー数も不規則である。ＴＰＡ
遺伝子を細胞に導入した場合、組み込まれた位置やコピ
ー数が細胞ごとに異なり、各々の細胞のＴＰＡ生産生産
界なる。

従って細胞をクローン化することにより種々の生産量を
有する細胞を得ることができる。目的遺伝子を導入し、
安定に発現する細胞のみを選択的に増殖させる為には、
機能するプロモーター配列とＴＰＡ遺伝子が接続した配
列と選択マーカー遺伝子を同一ＤＮＡ配列上に持つＤＮ
Ａ配列が適切である。動物細胞での選択マーカー遺伝子
としてはＥｃｏｇｐｔ　（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｏ
，ら（１９８０年）サイエンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）　
、　　２０９巻、１４２２頁）、ｎｅｏ　（５ｏｕｔｈ
ｅｒｎ、　Ｐ、　Ｊ、ら（１９８２年）ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・アンド・アプライド・ジエネティク
ス（Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、）。

１巻、３２７頁）、ｄｈｆｒ　（Ｗｌｇｌｅｒ、　Ｍ、
ら（１９８０年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナシ
ョナル・アカデミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー
、７７巻、３５６７頁）などの遺伝子が用いられる。ま
た、そのようなりＮＡ配列を大量に調製する為には、そ
のようなりＮＡ配列が、大腸菌で複製し且つ大量調製可
能なプラスミドやファージであることが望ましい。実施
例に示したプラスミドｐｓＶｅＰＡ−１，ｐｓＶ、９Ｌ
ＰＡ　　及びｐｓＶｐＴＫＰＡは、以上のような目的に
かなうプラスミドである。すなわち大腸菌で複製可能に
するＤＮＡ複製開始点（ｏｒｉ　）と、選択マーカー遺
伝子（アンピシリン耐性遺伝子）及び動物培養細胞での
選択マーカー遺伝子（Ｅｃｏｇｐｔ　）及び機能するプ
ロモーターと接続したＴＰＡの染色体ＤＮＡ配列が同一
のＤＮＡ配列上に存在している事を特徴としたプラスミ
ドである。

機能する他の遺伝子のプロモーター領域を接続したＴＰ
Ａ染色体ＤＮＡ配列を導入された細胞がＴＰＡを産生ず
る為には、該ＤＮＡ配列が、用いた細胞固有のＲＮＡ合
成系、ＲＮＡの成熟、蛋白合成系、蛋白の成熟、分泌等
の機能に適合している必要がある。導入されたＤＮＡか
らはｍＲＮＡが合成されるが、ｍ　ＲＮ　Ａの５′末端
はキャップ構造の付加、正常な位置でのスプライシング
及び３′末端へのポリアゾニレ−ジョンが必要である。

また活性のあるＴＰＡの発現には、合成されるＴＰＡペ
ブタイドの正常な亮次構造の形成と維持、更にはシグナ
ルペプタイドの切断、細胞からの分泌が正確に行なわれ
る必要がある。本発明者らが試用した動物培養細胞はア
メリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）か
ら入手可能なハムスター、サル、マウス或いはヒト由来
の細胞であるが、本明細書に示されているＴＰＡの製造
法を用いれば、少なくともを椎動物由来の培養細胞、融
合細胞、正常及び変異細胞、ウィルスによる形質転換細
胞等において活性あるＴＰＡを産生ずることが可能であ
る。

現在ＴＰＡの糖鎖の構造については不明な点が多く、た
とえばハムスターの細胞でつくられたＴＰＡとヒト細胞
でつくられたＴＰＡの糖鎖の構造及び抗原性に違いがあ
るかは不明である。しかしヒト細胞での生産は天然のＴ
ＰＡであり、治療薬としての長期間の投与におけるアレ
ルギー反応、る事は、原因不明で癌化或いは株化した細
胞に比して、適切な手段をｉ１１！しることにより生産
物の安全性の向上が期待される。ＳＶ４０の形質転換株
として、ヒト細胞Ｗｉ−２６ＶＡ４（ＣＣＩ！Ｌ−９５
，１）が知られている。

ＴＰＡの発現が可能なように構成されたＤＮＡを血球由
来の株化細胞に導入することにより、形質転換株が得ら
れることを見い出した。血球由来の株化細胞とは、哺乳
類に於いては、幹細胞から派生したリンパ芽球、骨髄芽
球、単芽球、赤芽球及びそれらの細胞から更に分化或い
は派生した細胞から樹立された株化細胞を示す。血球由
来の株化細胞は通常用いられる培地で増殖した場合、形
態的には、主として球形を示し、浮遊培養に好適である
。また、これらの株化細胞のある細胞は、グロブリンを
産生じており、蛋白の合成及び分泌の能力が高いと考え
られ、そのような細胞を宿主とすることはＴＰＡ生産上
有利である。試用した血球由来の株化細胞は、アメリカ
ン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手したＭ
ＯＰＣ−１１（マウス　プラストサイトーマ：ＣＣＬ−
１３０）、ＭＰＣ−１１（マウス　ミエローマ二〇〇Ｌ
−１６７）であるが、本明細書に示されているＴＰＡの
製造法を用いれば、ヒトを含む、少なくとも哺乳類の血
球由来の株化細胞、ハイブリドーマ変異細胞、ウィルス
による形質転換細胞等において活性あるＴＰＡを生産す
ることが可能である。

機能するプロモーターを接続したＴＰＡ染色体ＤＮＡ配
列を、例えばリン酸カルシウム法或いは細胞融合法で動
物培養細胞に導入し、ＴＰＡを産生するようになった細
胞は、通常細胞の培養に用いられる血清を含んだ培地ば
かりでなく、全く血清を含まない無血清培地でもＴＰＡ
を産生ずる事を見い出した。’Ｉ’ＰＡの生産に無血清
培地を用いる事はＴＰＡの培地からの回収精製をより容
易にするものである。ＴＰＡの培地からの回収精製は公
知の方法が適用できる。即ちキレ−ティング・セファロ
ース、リジン−セファロース、ＣｏｎＡ−セファロース
、イオン交換体或いはセファデックス・ゲル等でのクロ
マトグラフィーや電気泳動で回収、精製できる。

ＴＰＡの活性は、プラスミノーゲン含有フィブリン平板
を用いる方法（Ｍａｃｋｉｅ、　Ｍら（１９８１年）ブ
リティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジ−（Ｂｒ
１ｔｉｓｈ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈａｅｍａｔｏｌ
ｏｇｙ）。

４７巻、７７頁）やプラスミンの合成発色基質５２２５
１の分解を測定する方法（Ａ１１ｅｎ、几６Ａ。

とＰｅｐｐｅｒ、　Ｄ、　Ｓ、　（１９８１年）　Ｔｈ
ｒｏｍｂｏｓ。

Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　４５巻、４３頁）によって測定
できる。ある種の細胞はウロキナーゼを生産する能力を
持っている。そのような細胞のＴＰＡの生産は、サンプ
ルを予め抗つロキナーセ抗体で処理し測定できる。また
形質転換細胞によってつくられたプラスミノーゲン活性
化因子は、サイモグラフイーによる推定分子量、抗ＴＰ
Ａ抗体による中和試験により確認できる。

（発明の効果） 以上のように遺伝子導入によりＴＰＡの生産株になった
細胞は、現在の知見からは、ヌードマウス或いはハムス
ター等の動物体内で増殖させることが可能である。又そ
れらの動物の腹腔液や血清中からＴＰＡを回収する事も
可能なことと思われる。また細胞を動物体内で増殖させ
、細胞を回収し、培養液中で培養することによりＴＰＡ
を産生ずる事も可能と思われる。

（実施例） 以下に実施例を示すが、本発明に係る諸実験は内閣総理
大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」に従って行った
。また実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、種々
の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげる雑
誌、成書を参考としｔこ　。

１、蛋白質　核酸　酵素、２６巻、４号、（１９８１年
）臨時増刊　遺伝子操作（県立出版）２、遺伝子操作実
験法、高木康敬編著（１９８０年）講談社 ３、遺伝子操作マニュアル、高木康敬編著（１９８２年
）　講談社 ４、　　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａ　　
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ、Ｔ、Ｍａｎｉａｔ
ｉｓ　ら編（１９８２年）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ５、　　ＭｅｔｈＯ
ｄＳ　ｉｎ　ＥｎｚｙｍＯＩＯｇｙ、　ｅ　５巻、Ｌ。

Ｇｒｏｓｓｍａｎら編（１９８０年）　Ａｃａｄｅｍｉ
ｃｒｅｓｓ ６、　　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ
、　６５巻、几。

Ｗｕ編（１９７９年）Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ実
施例Ｉ ＴＰＡ遺伝子のクローニング 遺伝子のクローニングに用いたヒトＤＮＡは次のように
調製した。複数の健康人から採血し、バフィーコートを
採取後、０．８３％ＮＨ４Ｃｌを約１０倍量加えて溶血
後、イーグルＭＥＭ倍地で洗浄し白血球を得た。１０　
個の白血球を、５０ｍ１の０．５Ｍ　　ＥＤＴＡ、０．
５％ザルコシル、１（１６）　ｔｔｆ／屑ｔプロテアー
セにの溶液５０ｍ１に５０°Ｃ，３時間振盪して溶解さ
せた。フェノール抽出を３回行い、水層を２０　ｍＭ　
　Ｔｒｉｓ−ＨＯＩ　（ｐＨ８，０）　。

１０ｍＭ　　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　　Ｎａ１ｌに対し透
析した。透析物を３７°Ｃ，３，５時間リボヌクレアー
セ（１（１６）μＩ／ｍｌ）で処理し、フェノール抽出
後、２　Ｑ　ｍＭ　　Ｔｒｉｓ４（Ｃ１（ｐＨ８，０）
、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｍＭ　　ＮａＣ１に対して透析
し、約３３ダの高分子ヒトＤＮＡを得た。またλフアー
ジベクターとしては、Ｃ！ｈａｒｏｎ　２８及びλｇｔ
ｗｅｓ・λＢを用いた。ファージＤＮＡは目的に応じ、
制限酵素ＢａｍＨｌ　、　ＥｃｏＲｌ或いは５ｓｔｌで
切断後、蔗糖密度勾配遠心によりファージＤＮＡの左右
の断片（アーム）を含む両分を集め、エタノール沈殿に
より回収した。

ＴＰＡ遺伝子は以下に記述したように、部分的に４ｆｌ
ｉの組換え型ファージＤ　Ｎ　Ａ　中にクローニングさ
れた。第１図に示した４種のＤＮＡ断片は、それらの組
換え型ファージ）、ＰＡＢｇ１５．７゜λＰＡＥｃｏ１
１．λＰＡＳｓｔ９．Ｏ及びλＰＡＢｇ１６．０に含ま
れるＴＰＡ遺伝子断片を示す。

ａ、Ｂｇ１ｍ５．７キロベ一ス断片のクローニングヒ）
ＤＮＡを制限酵素Ｂｇｌｌで切断し、蔗糖密度勾配遠心
により約４．５〜７．５キロベース（ｋｂ）のＤＮＡ断
片を回収した。それを、ＢａｍＨＩ切断した０ｈａｒｏ
ｎ　２８のアームと’［’４ＤＮＡリガーゼで結合後、
ＥｎｑｕｉＳｔとＳ　ｔｅｒｎｂｅｒｇの方法（Ｌ。

ＥｎｑｕｉＳｔとＮ、　Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ　（１９７
９年）メソツズ・イン・エンザイモロジー、６８巻、２
８１頁）によりインビトロパッケージングを行い、大腸
菌ＬＥ３９２を宿主として組換え型ファージのプラーク
を形成させた。次にプラークハイブリダイゼーションの
手法（Ｅｅｎｔｏｎ　、　Ｗ、　Ｄ、　、　Ｄａｖｉｓ
　。

ＬＷ、（１９７７）サイエンス、１９６巻、１８０頁）
によりＴＰＡの遺伝子を持つ組換え型ファージクローン
を選択した。プローブとしては、ＴＰＡの遺伝子に存在
する配列を持つ４種のオリゴヌクレオチド ５３′ ＧＴＯＯＴ（：！ＧＴＡＧ（：！ＡＣＧＴＡＧＯＴＧＡ
ＴＧＣＧＩＣＴＧ ＴＯＣＡＯＧＴＧＣＣＩＣＣＴＧ ＡＣＴＯＴＯＣＧＣＴＧＴＧＣ をホスホトリエステル法（Ｍｉｙｏｓｈｉ、　Ｋ、　ｅ
ｔ　ａｌ。

（１９８０）ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ。

８巻、５５０７頁）で合成し、５’−ＯＨを〔γ−８２
Ｐ〕ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識し
て用いた。

約３２万の組換え型ファージクローンから用いた４種の
合成りＮＡプローブすべてとハイブリダイズするファー
ジクローンλＰＡＢｇｌ　５．７を得た。

ン、ＰＡＢｇｌ　５．７のＤＮＡからＢｇｌ　ｎ　５．
７　ｋｂＤＮＡ断片を調製した。このＢｇｌ　ＩＩ　５
．７　ｋｂの５ａｕ８ＡＩ切断断片についてＭ１３法（
Ｍｅｓｓｉｎｇ。

Ｊ、とＶｉｅｉｒａ、　Ｊ、　（１９８２年）ジーン（
ｇｅｎｅ）。

１９巻、２６９頁）１こより塩基配列の決定を行つたと
ころＴＰＡのｃＤＮＡの配列（、Ｄ、　ｐｅｎｎｊ−ｃ
ａら（１９８８年）ネイチャー、３（１１巻、２１４頁
）の一部を有する配列 Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｌ
／５ＧＴＧＧＴＧＯＡＴＧＯＯＴＧＴＧＡＴＯが見い出
された。また、種々の制限酵素による解析から′ＸＰＡ
Ｂｇｌ　５．７が、第１図に示した’Ｉ’ＰＡ遺伝子の
Ｂｇｌｆ１５．７ｋｂのＤＮＡ断片を含むことが明らか
になった。

ｂ、ＥｃｏＲｌ　　１ｌｋｂ及び５ｓｔｌ　　９ｋｂ断
片のクローニング ＨｕＴＰＡ遺伝子のＢｇｌｌｌ　５．７　ｋｂのＤＮＡ
断片をＰｓｔｌで切断した場合に生じる第４エクソンを
含む約３５０ｂｐＤＮＡ断片をニックトランスレーショ
ンで　Ｐ標識し、これをプローブとして皿々の制限酵素
処理したヒトＤＮＡとのサザーン・ハイブリダイゼーシ
ョンを行った結果、Ｐｓｔｌ約３５０ｂｐＤＮＡ断片は
ＥｃｏＲＩ約１１ｋｂのＤＮＡ断片及び５ｓｔｌ　　９
ｋｂのＤＮＡ断片とハイブリダイスすることが判った。

ヒ１−ＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、蔗糖密度
勾配遠心により約１１ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。そ
れを、ＥｃｏＲ１切断したλｇｔｗｅｓ・λＢのアーム
とＴ４ＤＮＡリガーゼで結合後、インビトロパッケージ
ングを行い、大腸１ＬＥ３９２を宿主として組換えファ
ージのプラークを形成させた。次に、ニックトランスレ
ーションにより　Ｐで標識したＰｓｔｌ約３５０ｂｐＤ
ＮＡ断片をプローブとしてプラークハイブリダイゼーシ
ョンを行った。約４０万株の組換え型ファージクローン
からプローブとハイブリダイズするファージクローン３
株を得た。これらのファージクローンは、制限酵素によ
る解析の結果、全て第１図に示したＴＰＡ遺伝子の１ｃ
ｏＲ１約１１ｋｂのＤＮＡ断片を含むことが明らかにな
った。そのうちの１種のファージクローンをλＰＡＥｃ
ｏ１１　　とした。

λＰＡＥｃｏ１１のＤＮＡは、’Ｉ”ＰＡの開始アミノ
酸からはじまるアミノ酸配列Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ａｌａ−
Ｍｅｔ−Ｌｙｓ−に対応する合成りＮＡオリゴマー５’
　　ＡＴＧＧＡ’Ｉ’ＧＣＡＡＴＧＡＡＧ　　８をプロ
ーブとしたプラークハイブリダイゼーション及びサザー
ンハイブリダイゼーションの結果、このＤＮＡ配列を含
むことが明らかになった。

λＰＡＥｃｏ１１のＤＮＡに含まれるＨｕＴＰＡのＥｃ
ｏＲＩ　　１ｌｋｂ　　ＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ
９（Ｖｉｅｉｒａ、　Ｊ、とＭｅｓｓｉｎｇ、Ｊ、（１
９８２年）ジーン、１９巻、２５９頁）のＥｃｏＲ１部
位にサブクローニングし、ｐＰＡＥｃｏ　１１を作製し
た。

ｐＰＡＥｃｏｌ　１の構造を第２図−（ａ）に示した。

更にｐＰＡＥｃＯｌｌを制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＢａｍ
Ｈｌで切断して得られるＥｃｏＲ１−ＢａｍＨ１約１．
５ｋｂＤＮＡ断片が’Ｉ’ＰＡの開始アミノ酸につづく
アミノ酸配列に対応する合成りＮＡオリゴマー５　　Ａ
ＴＧＧＡＴＧＣＡＡＴＧＡＡＧ　　３とハイブリダイズ
することをサザーンハイブリダィゼーションによって確
かめ、このＤＮＡ断片の配列をＭ２Ｓ法によって決定し
た。その結果、ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨｌ　　１．５　
ｋｂ断片中に含まれるＸ　ｂａ　Ｉ　−ＢａｍＨ（断片
が下記のようにＴＰＡのシグナルペプチドの一部をコー
ドしていることが判った。

Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　Ｇ
ｌｙＬｅｕＴＧＣ！　ＴＧＴ　ＧＴＧ　Ｏ貿ＯＴＧ　Ｏ
ＴＧ　ＴＧ’Ｉ’　ＧＧＡ　ＧＣＡ　ＧＴＯＴＴＯＧＴ
’Ｉ’　ＴＣＧＣｙｓ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｌｅ
ｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ
　Ｖａｌ　５ｅｒＥｃｏＲｌ　−ＢａｍＨｌ約１．５ｋ
ｂＤＮＡ断片を更に制限酵素Ａｌｕ　ｌで切断し、ＴＰ
Ａシグナルペプチドの一部をコードする配列を含むＡｌ
ｕ　ｌ　−ＢａｍＨ１１３７ｂｐ断片をＭｌｌファージ
ベクターであるＭ１３ｍｐＨ（Ｍｅｓｓｉｎｇ、Ｊ　　
（１９８３年）メソッズ・イン・エンザイモロジー、１
（１１巻、２０頁）のＨｉｎｃ　［−ＢａｍＨ１部位に
結合しＭ１３ＥＡ１３７を作製した。Ｍ１３ＢＡ１３７
の構造を第２図−（′ｂ）に示した。

またヒ１−ＤＮＡを制限酵素５ｓｔ）で切断し、蔗糖密
度勾配遠心により約９ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。そ
れを５ｓｔｌ切断したλｇｔｗｅ　Ｓ・λＢのアームに
Ｔ４ＤＮＡリガーゼで結合後、インビトロパッケージン
グ及びプラークハイブリダイゼーションの手法により、
約５０万のファージクローンの中から、Ｐｓｔｌ約８５
０ｂｐＤＮＡ断片とハイブリダイズするクローンを２株
得た。これらのファージクローンは、制限酵素による解
析の結果、第１図に示した、ＴＰＡ遺伝子の５ｓｔ１９
ｋｂのＤＮＡ断片を含むことが明らかになった。そのう
ちの１種のファージクローンをλＰＡＳｓｔ　９．　Ｏ
とした。λＰＡＳｓｔ９．ＯのＤＮＡに含まれるＴＰＡ
の５ｓｔ１９ｋｂのＤＮＡ断片をプラスミドｐＵｃ１２
にサブクローニングし、ｐ　ＰＡＳ　ｓｔ　９を作製し
た。ｐＰＡＳｓｔ９の構造を第２図−（Ｃ）に示した。

ｃ、　　Ｂｇｌｌｌ　６．Ｏｋｂのクローニング’Ｉ’
ＰＡ遺伝子の５Ｓｔ１９ｋｂのＤＮＡ断片を制限酵素Ｈ
ｉｎｄｌｌ［及びＥｃｏＲｌで切断すると第１０エクソ
ンを含む０．８ｋｂのＤＮＡ断片が生じる。

このＤＮＡ断片をプローブとして種々の制限酵素処理し
たヒトＤＮＡとのサザーンハイブリダイゼーションを行
った結果、Ｂｇｌ［約６．０ｋｂのＤＮＡ断片とハイブ
リダイズすることが判った。

ヒＩ−ＤＮＡｅＢｇｌｌで切断し、蔗糖密度勾配遠心に
より約６．ＯｋｂのＤＮＡ断片を中心に回収した。それ
をＢａｍＨ１切断したＣｈａｒｏｎ　２８のアームとＴ
４ＤＮＡリガーゼで結合後、インビトロパッケージング
及びプラークハイブリダイゼーションの手法により、約
５０万のファージクローンの中からＨｉｎｄｌｌ−Ｅｃ
ｏＲｌ　　Ｏ，８ｋｂ断片とハイブリダイズするクロー
ン２株を得た。これらのファージクローンは、制限酵素
による解析の結果、第１図に示した、ＴＰＡ遺伝子のＢ
ｇｌｌ　６．ＯｋｂのＤＮＡ断片を含むことが明らかに
なった。そのうちの１つのクローンをλＰＡＢｇ１６．
Ｏとした。

λＰＡＢｇｌ　６．０のＤＮＡはポリペブタイドのＣ端
に近い５１５から５１９のアミノ酸配列Ｔｈｒ−Ａｓｎ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　及び５２４から５２７のア
ミノ酸配列Ａｓｎ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ　−〇Ｐに
対応する合成りＮＡオリゴマー ５　　ＡＣ！ＡＴＧＯＧＡＣＩＣ！ＧＴＧＡ　　３ＡＯ
ＣＡＡＯＴＡＣＣ！ＴＡＧＡ をプローブとしたプラークハイブリダイゼーション及び
サザーンハイブリダイゼーションの結果、ＴＰＡポリペ
ブタイドのＣ端に対応する配列を含むことが明らかにな
った。′ＡＰＡＢｇ１６．０のＤＮＡを５ａｃｌ及びＢ
ｇｌｌで切断し、第１２乃至１４エクソンを含むＳａｃ
ｌ−Ｂｇｌｌｌ約４．３ｋｂＤＮＡ断片をｐＵＯ１２の
ＢａｍＨｌ　−Ｓａｃ　１部位にサブクローニングし、
ｐＰＡｌを作製した。ｐＰＡｌの構造を第２図−（ｄ）
に示した。またλＰＡＢｇ１６．ＯのＤＮＡをＨｉｎｄ
ｌｌｌで切断し、第１（１７）至１３エクソンを含む約
８．３ｋｂのＨｉｎｄｌｌ［ＤＮＡ断片をプラスミドｐ
Ｕｃ１２のＨｉｎｄｌ　　部位にサブクローニングし、
ｐＰ　ＡＨｉｎ　３．８を作製した。第２図−（ｅ）に
ｐ　Ｐ　ＡＨｉｎ　３．３の構造を示した。

実施例２ ＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｅＰＡ−１の作製ＴＰＡ発現
ベクターｐＳＶｅＰＡ−１は、以下に記述するａからｅ
までの各ステップにより作製した。

ａ、　　ｐｓＶｅＢａｌ　ｌ−Ｈｌｎｄｌｌｌ及びｐｓ
Ｖｅｓａｌｌの作製 ｐｓＶｅＢａｌ　１−Ｈｉｎｄ　Ｉ及びｐｓＶｅｓａｌ
ｌは、ｐＳＶ２ｇｐｔ及びｐｓＶ８　ｇｐｔ　ＣＭｕｌ
ｌｉｇａｎ、　Ｒ，Ｃ。

とＢｅｒｇ、　Ｐ、　（１９８０年）サイエンス、２０
９巻、１４２２頁）を出発材料として第３図に示した手
順により作製した。すなわちｐｓｖａｇｐｔ　　を制限
酵素Ｈｉｎｄ　Ｉｌｌで切断し、最も大きいＤＮＡ断片
をＴ４ＤＮＡ！Ｊガーゼで環状化しｐＨ１を作製した。

次にｐＨ１のＰｖｕ１１部位を５ａｌｌリンカ−を用い
て５ａｌ（部位に改め、ｐＨ２を作製した。

更にｐＨ２をＨｉｎｄ　ｌ切断し、ＤＮＡポリメラーゼ
ｌ　（Ｋｌｅｎｏｗ　　フラグメント）で切断、末端を
修復し、Ｂａｌ［ンカーを用いてＢａ１１部位を導入し
、ｐＨＢａ１ｌを作製した。一方ｐｓＶ２ｇｐｔをＢａ
ｍＨｌで切断後、５ａｌｌリンカ−を用いて５ａｌ１部
位に改め、ｐＳｌを作製した。更にｐＳｌをＨｉｎｄ　
ｍ、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ）処理し、
Ｈｉｎｄｌ１１部位のないｐｓＨｏを作製した。

ｐＩ−ＩＢａｌｌをＳａｌ　ｌ　、　ＥｃｏＲｌ　　切
断し、ＳＶ４０のプロモーター領域を含むＤＮＡ断片と
、同じくｐｓＩＩｏをＳａｌ　ｌ　、　ＥｃｏＲｌ切断
して得られアンピシリン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片と
をＴ４ＤＮＡリガーゼで接続し、ｐｓＶｅＢａｌ　ｌ−
Ｈｌｎｄｌｌｌを作製しｔこ。

ｐｓＶｅｓａｌｌはｐｓＶｅＢａｌ　１Ｈｉｎｃｉｌ［
をＢａ１ｌ切断し、リン酸化していないＳａｌ　ｌリン
カ−をＴ４ＤＮＡ’Ｊガーゼで接続後、大腸菌を形質転
換し作製した。

用いたＳａｌ　（リンカ−及びＢａｌ　ｌリンカ−は、
それぞれｄ（ｐＧＧＴｃＧＡＯｃり及びｄ（ｐＴＴＧＧ
ＯＯＡＡ）である。

ｂ、ｐＰＡｅｌ−３の作製 ｐＰＡｅｌ−３は第４図に示した手順により作製した。

Ｍ１’１ＢＡ１３７の二本鎖ＤＮＡから得たＴＰＡのＮ
端をコードする約１５０塩基のＨｉｎｄＩＩＩ−Ｂａｍ
Ｈｌ　　断片を、プラスミドｐ　ＳＶｅＢ　ａｌ　Ｉ　
・ｌ−ｌ１ｎｄｌｌｌのＨｉｎｄ　ｌ　−Ｂ　ａｍＨ１
部位に結合し、プラスミドｐＰＡｅｌ−１を作製した。

次にｐＰＡｅｉ−１に含まれる約５（１６）　ｂｐのＳ
ａｌ　Ｉ　−ＢａｍＨｌ断片をｐＰＡＥｃｏｌｌの５ａ
ｌ（及びＢａｍＨｉ部位の間に挿入し、ｐＰＡｅ）−２
を作製した。ｐＰＡｅｉ−２のＢａｍＨ［部位にｐＰＡ
Ｅｃｏ　１１から得られる約３ｋｂ　ＢａｍＨＩ　−Ｂ
ａｍＨｌ断片を結合しｐＰｆｅｌ　　３を作製した。

ｃ、ｐＰＡＩＩ−２の作製 ｐＰＡｌ−２は第５図に示した手順により作製した。ｐ
ＰＡＳｓｔ９　　からＴＰＡ遺伝子の第７エクソンから
第９エクソンを含む約４．６　ｋｂ　Ｈｐａ　ｌ−Ｈｌ
ｎｄｌ［ｌ断片をｐＳＶ２ｇｐｔのＨｐａ　Ｉ　−Ｈｌ
ｎｄ　１１部位に結合し、ｐＰＡｌ−１を作製した。つ
ぎにｐＰＡｌ−１のＨｉｎｄｌ［部位にｐ　ＰＡＨｉｎ
　３．３から単離される約８．３　ｋｂ　Ｈｉｎｄｌ［
［−Ｈｌｎｄｌｌ　断片を導入しｐＰＡ［−２を作製し
た。

ａ、　　ｐｐＡｅｌＶ−２の作製 ｐＰＡｅｌｖ−２は第６図に示した手順により作製した
。ｐＰＡｌ−Ｊに含まれ、’Ｉ’ＰＡ遺伝子の第２エク
ソンから第６エクソンをコードする５ａｌ（−Ｈｐａｌ
約８ｋｂ断片及びｐＰＡｌに含まれ、ＴＰＡ遺伝子の第
１３エクソン及び第１４エクソンをコードする約Ｈｐａ
ｌ−８ａｌＩ約３．６ｋｂ断片の２つのＤＮＡ断片を単
離し、ｐＵｃ１２の５ａ１１　部位に導入しｐＰＡｅｌ
ｖ　１　を作製した。次にｐＰＡｌｌ−２に含まれ、Ｔ
ＰＡ遺伝子の第７エクソンから第１２エクソンをコード
する約６．　Ｏｋｂ　Ｈｐａ　Ｉ　−Ｈｐａ　１断片を
ｐＰＡｅｌＶ−１のＩ−Ｉｐａ１部位に結合しｐＰＡｅ
ｌＹ−２を作製した。

ｅ、ｐｓＶｅＰＡ−１の作製 発現ベクターｐｓＶｅＰＡ−１は第７図に示した手順に
よッテ作製した。ｐＰＡｅｌＶ−２から、５ｖ４０のプ
ロモーター領域及びＴＰＡの第２エクソンから第１４エ
クソンを含む約１８ｋｂＳａｌｌ断片をｐｓＶｅｓａｌ
ｌの５ａｌ１部位に導入し、ｐｓＶｅＰＡ−１を作製し
た。ＴＰＡ遺伝子の５′側にはＳＶ４０のｏｒｉを含む
プロモーター領域が、３′側にはＳＶ４０のポリ・アデ
ニル化・シグナルを含む配列が接続している。

実施例３ ＴＰＡ発現ベクターｐＳＶ８ＬＰＡの作製ＴＰＡ発現ベ
クターｐｓＶ８ＬＰＡは、以下に記述するａ及びｂのス
テップにより作製した。

ａ、ｐＰＡＩＶ−２の作製 ｐＰＡｅ）−８をＨｉｎｄｌ［切断し、ＤＮＡポリメラ
ーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ）で末端を平滑末端にした後、
Ｓａｌ［リンカ−を接続し、大腸菌に１２０６０Ｏｒ−
ｍ−を形質転換しｐＰＡｌ−４を得た。用いた５ａｌｌ
リンカ−はｄ　（ＧＧ’ｌ’Ｇ！ＧＡＣＣ）である。

ｐＰＡｌ−４に含まれ、ＴＰＡ遺伝子の第２エクソンか
ら第６エクソンの配列を持つ５ａｌｔ−Ｃ１ａｌ約７．
０ｋｂ断片及びｐＰＡｅｌｖ　２　に含まれ、ＴＰＡ遺
伝子の第７エクソンから第１４エクソンの配列を持ツＳ
ａｌ　ｌ　−Ｃ！ｌａ　Ｉ約１０．５ｋｂ断片の２つの
ＤＮＡ断片を単離し、ｐＵＣ！１２の５ａ１１　　部位
に導入シ、ｐＰＡＩＶ−１を作製シタ。ｐＰＡＩＹ−１
（”作製手順を第８図−（ａ）に示した。

ｂ、ｐｓ’Ｖ３ＬＰＡの作製 発現ベクターｐｓＶ３ＬＰＡは、第８図−〇）に示した
手順によって作製した。ｐｓｖａｇｐｔ　　に含まれる
ＳＶ４０のＴ抗原をコードしている約８．ＯｋｂＥａｍ
Ｈｌ断片をｐｓＶｅＢａｌ　１ＩＩｉｎｄｌｌｌのＢａ
ｍＨ１部位に挿入し、ｐｓＶ３Ｂａｌ　１Ｈｉｎｄｌ［
ｌを作製した。

次に、ｐｓＶ３Ｂａｌ　１−Ｈｉｎｄ　ＩＩＩのＳａｌ
１部位に、ｐＰＡｆｆ−１に含まれ、ＴＰＡの第２エク
ソンから第１４エクソンをコードする約１８ｋｂＳａｌ
ｌ−８ａｌｔ断片を導入し、ｐＳＶ８ＬＰＡを作製した
。

実施例４ ＴＰＡ発現ベクターｐＳＶｐＴＫＰＡの作製発現ベクタ
ーｐＳＶｐＴＫＰＡの作製の手順を第９図に示した。ｐ
Ｉ（ＳＶ　１０６　（ＭｃＫｎｉｇｈｔ、　Ｓ、　Ｌ。

とＧａｂｉ＝ｓ、　Ｅ、　Ｒ，（１９８０年）ヌクレイ
ツク・アシッズ・リサーチ、８巻、５９３１頁）は単純
ヘルペスウィルスのチミジンキナーゼ遺伝子ヲ有してイ
ル。ｐＨ８Ｖ１０６をＥｇｌｌ切断し、ＤＮＡポリメラ
ーゼ（（Ｋｌｅｎｏｗ）で末端を平滑末端にした後、リ
ン酸化していない５ａｌｌリンカ−を用イＢｇｌｌ［部
位をＳａｌ　１部位に改めたｐＨ８Ｖｓａｌｌを作製し
た。ｐｓＩ（ＶＳａｌｌから、チミジンキナーゼ遺伝子
のプロモーター領域を含むＢａｍＨ（−８ａｌｌ約７７
０　ｂｐ断片を単離し、ｐｓＶｅＢａｌｌＨｉｎｄ　ｌ
のＢａｍＨ１部位とＳａｌ１部位の間に接続しｐｓＶｐ
ＴＫを作製した。ｐＰＡ■−１から’ｒＰＡの第２エク
ソ°ンから第１４エクソンを含むＳａｌ　ｌ約１８ｋｂ
断片を単離し、ｐｓＶｐＴＫのＳａｌ　ｉ部位に接続し
、発現ベクターｐｓＶｐＴＫＰＡ　を作製した。

実施例５ ＴＰＡ発現ベクターの動物培養細胞への導入とＴＰＡの
生産 ＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅＰＡ−１，ｐｓＶ３ＬＰＡ
及びｐｓＶｐＴＫＰＡ　を種々の培養細胞へＷｉｇｌｅ
ｒらの方法（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７７年）セル、１１
巻、２２３頁）に準じてプラスミドの導入を行った。プ
ラスミド−リン酸カルシウム共沈澱物を予め５％牛脂児
血清（ＦＣ８）を含むイーグルＭＥＭ培地で生育させた
細胞（２Ｘ１０５細胞／　８．６　ｍｌ培地／直径６ｃ
！１１培養皿）に加え、１５時間後に培地を更新し、２
４時間培養した。培地を、５％ＦＯ８゜２５μｙ／肩ｔ
ミコフェノール酸、２５０　ＩＩＩ／肩ｌキサンチンを
含むＭＥＭ培地に変え、更に３週間培養をつづけ、ミコ
フェノール酸耐性株を分離した。

ミコフェノール酸耐性株を９６穴マルチデイツシユの底
面全面に生育させ、５％ＦＯ８を含むＭＥＭ培地で４８
時間培養し、培地中に含まれるＴＰＡ活性をプラスミノ
ーゲン含有フィブリン平板を用いて測定した（　Ｍａｃ
ｋｉｅ、　Ｍら（１９８１年）ブリティッシュ・ジャー
ナル・オブ・ヘマトロジ−（Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｊ□ｕｒ
ｎａｌ　ｏｆ　Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ）。

４７巻、７７頁）。活性はウロキナーゼ（ミドリ十字）
の活性に換算してユニットで示した。表−１に示した様
に用いた細胞の全てで、ＴＰＡ生産株が分離された。な
おＬ９２９（マウス、ＣＣＬ−１）は、ＴＰＡ遺伝子を
含まないベクターｐｓＶｅｓａｌｌを導入した場合、分
離されたミコフェノール酸耐性株の１０％が２ユニツト
の活性を示したが、これはザイモグラフイ−（Ｇｒａｎ
ｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ　、　Ａ、とＲｅ１ｃｈ、　
Ｅ、　（１９７８年）ジャーナル・オブ・エキスペリメ
ンタル・メデイスン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、）、　
　１４８巻、２２３頁）の結果、ヒトＴＰＡと分子量が
明らかに異なり、マウスのプラスミノーゲン活性化因子
（Ｍａｒｏｔｔｉ。

Ｋ、Ｒ，Ｉ”＋、　１９８２年）デベロップメンタル・
バイオロジー（Ｄｅｖｅｌｏｐ、　Ｂｉｏｌ、）、　９
０巻、１５４頁）と推定された。ＴＰＡ発現ベクターを
導入した細胞では分離した細胞の約３０％が１ユニット
以上のＴＰＡを産生じており、ザイモグラフイーの結果
推定分子！６５，（１６）０であり、ＴＰＡであること
を示した。

Ｃｌ−ｌｏ−Ｋｌ（ハムスター、　０ＣＬ−６１）、　
Ｖｅｒ。

（サル、　ＣＣＬ−８１）或い１ｔＷＩ−２６ＶＡ４　
（ヒト：ＳＶ４０でトランスフオームした肺細胞。

Ｃ０Ｌ−９５，１）でも分離したミコフェノール酸耐性
株は、サイモグラフイーでの推定分子量６５．（１６）
０のＴＰＡを産生じた。ＣＨＯ−Ｋｌ及びＷ＋−２６Ｖ
Ａ４は非形質転換株がわずかにプラスミノーゲン活性化
因子を産生じたが（０，５ユニット以下）形質転換株は
明らかに著量のＴ　Ｐ　Ａｆ！−産生した。

以下余白 実施例６ 無血清培地でのＴＰＡ生産 実施例５に示したＴＰＡ発現ベクターｐｓＶｅＰＡ−１
，ｐｓＶ３ＬＰＡ或いはｐＳＶｐＴＫＰＡを導入して得
たＬ　９２９　、　ＣＨＯ−Ｋ　１　、　Ｖｅｒｏ或い
はＷＪ−２６ＶＡ４のミコフェノール酸耐性形質転換株
を５％ＦＯ８を含むＭＥＭ培地で、２４穴マルチデイツ
シユの底面全面に生育させ血清を全く含まないＭ　Ｅ　
Ｍ培地で洗浄後、同培地で４８時間培養し、培地中に含
まれるＴＰＡ活性をプラスミノーゲン含有フィブリン平
板を用いて測定した。その結果、実施例５に示したミコ
フェノール酸耐性形質転換株の全てが５％ＦＣ８を含む
培地で培養した場合の等量から１０分のｌのＴＰＡを生
産しｔこ。

実施例７ ＴＰＡ発現ベクターのＭＯＰＣ−３ＩＣ及びＭＰＣ−１
１−＼の導入と’Ｉ’ＰＡの生産Ｔ　Ｐ　Ａ発現ベクタ
ーｐＳＶｅＰＡ−１，ｐｓＶ３ＬＰＡ及びｐＳＶｐＴＫ
ＰＡを血球由来の株化細胞ＭＯＰＣ−８１Ｃ（ＯＣＬ−
１３０）及びＭＰＣ！−Ｉ　Ｌ　（ＣＣＬ−１６７）に
Ｏｉらの方法（Ｏｉ、　Ｖ、　Ｔ、ら（１９８３年）プ
ロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカテミー
・オブ・サイエンス・ニーニスニー。

８０巻、８２５頁）で導入した。プラスミドを保持する
大腸菌に一１２株ＨＢ　１（１１を、Ｌ培地で６（１６
）ｎｍの吸光度が０．６から０．８になるまで３７°Ｃ
で培養した。クロラムフェニコールを１２５μｆｈｌに
なるように加え、更に１２から１６時間培養し、遠沈、
集菌した。２５ｍ１の培地あたり、冷却した２０％蔗糖
を含む０．０５Ｍ１−！Ｊスス−酸（ｐＨ８，０）を加
え、バクテリアを分散させた。

５〜／耐濃度のリゾチーム液０．２５　ｙｔｔｌを加え
、更に５分水中に放置した。０．５　ｙｅｔの０．０５
Ｍト！Ｊスー塩酸（ｐＨ８，０）を加え、３７°ｃで１
０分から１５分インキュベートして、大腸菌をプロトプ
ラストにした。プロトプラストを１０％蔗糖を含むダル
ベツコ変法ＭＥＭ培地１０＋ｌで希釈し、更に室温に１
０分装いた。１０％ＦＯ８を含むダルベツコ変法ＭＥＭ
培地で細胞を１０６ｃｅｌｌｓ／ｍ／に増殖させ、２×
１０６の細胞に対して、プロトプラストけん内液を５ｍ
ｌ加え、室温で約５（１６）ＸＦで遠心した。上澄をの
ぞき沈澱にダルベツコ変法ＭＥＭ培地に溶かした５０％
ポリエチレングリコール液（ｐｉ−Ｉ　８．０　）を２
肩を加え、ゆっくりと撹拌し、３分間５（１６）Ｘ５１
で遠心した。７ｔｎｌのダルベツコ変法ＭＥＭ培地で細
胞を洗浄後、１０％のＦＣ８を含むタルペッコ変法ＭＥ
Ｍ培地に分散させ、２４穴マルチデイツシユプレートで
細胞濃度２×１ｏ５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ　・ｍｌ　　
で培養した。４８時間後に培地を１０％Ｆ　Ｃ８、２５
ｌノ９７ｍｅミコフェノミコフェノール酸ｆ／ｘｉキサ
ンチン、５μ！／ｍｌチミジン。

０、１　ｌｉｙ／ｍｔアミノプテリン及び２５　ｔｉｆ
／ｍｌアデニンを含むダルベツコ変法ＭＥＭ培地にし３
乃至４週間培養をつづけ、ミコフェノール酸耐性株を分
離した。ミコフェノール酸耐性株を２４穴マルチデイツ
シユプレートの底面全面に培養し、５％ＦＯ８を含むダ
ルベツコ変法ＭＥＭ培地で４８時間培養し、培地中に含
まれるＴＰＡ活性をプラスミノーゲン含有フィブリン平
板を用いて測定した。

表−２に示すように、いずれの発現ベクターを導入した
形質転換株もＴＰＡを生産した。

以下余白 表−２形質転換された血球由来株化 細胞によるＴＰＡの生産 ８細胞と導入プラスミドの組合せで全て１０株以上のミ
コフェノール酸耐性株を分離したが、そのうちのＴＰＡ
を生産した代表的な３株のＴＰＡ生産量を活性（ユニッ
ト）で示した。

実施例８ ＴＰＡの精製 実施例５に示したｐｓｖｅｐＡ−ｔのＬ９２９形質転換
株ＬＥ−６２及びＬＥ１０５を夫々１％ＦＯ８を含むＭ
ＥＭ培地で培養し、培養液３（１６）肩ｔを得た。この
培養液にＴｗｅｅｎ　８０を０．（１１％加え、Ｐｏｒ
ａｔｈらの方法（Ｐｏｒａｔｈ、　Ｊ、ら（１９７５年
）ネイチャー、２５８巻、５９８頁）で金属キレートア
フィニティークロマトグラフィー、次にリジンセファロ
ス４Ｂ（ファルマシア社）によるクロマトグラフィーを
行った。活性画分を０．１　Ｍ塩化ナトリウム、０．（
１１％Ｔｗｅｅｎ　８０を含む０．０５ＭＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃ！１に透析し、それぞれ約４，（１６）０−Ｌ＝ニッ
トＴＰＡを得た。これらの’［”ＰＡは抗ウロキナーゼ
抗体で中和されず、ヒト・メラノーマＧ３６１　（ＣＲ
Ｌ−１４２４）から得られた’ｒＰＡｌこ対するウサギ
抗体で完全に中和された。またこれらＴＰＡはザイモグ
ラフイーの結果、メラノーマ（１３）６１のつくる’Ｉ
’ＰＡと推定分子蛍（６５，（１６）０）が完全に一致
した。

【図面の簡単な説明】

第１図はＴＰＡをコードしている遺伝子領域及び組換え
型７７−ジλＰＡＢｇ１５．７．　　λＰＡＥｃｏ　１
１　。 λＰＡＳ　Ｓｔ９及びλＰＡＢｇ１６．Ｏにクローニン
グされたＴＰＡの遺伝子断片を示す。第２図−（ａ）は
プラスミドｐＰＡＥｃｏ　Ｌ　１の構造、第２図−（ｂ
）はファージＭ１３ＢＡ１３７のＤＮＡ構造、第２図−
（ｃ）はプラスミドｐＰＡｓｓｔ９の構造、第２図−（
ｄ）はプラスミドｐＰＡＩｌｌの構造及び第２図−（ｅ
）はｐ　Ｐ　ＡＨ１１３，３の構造を示す。第３図はプ
ラスミドｐｓＶｅＢａｌｌ−ｌ−ｌ１ｎｄ　ＩＩＩ及び
ｐｓＶｅｓａｌ　Ｉの作製法を示す模式図、第４図はプ
ラスミドｐＰＡｅｌ−３の作製法を示す模式図、第５図
はプラスミドｐＰＡｌ−２の作製法を示す模式図、第６
図はプラスミドｐＰＡｅｌｎ−１の作製法を示す模式図
、第７図はプラスミドｐＳＶｅＰＡ−１の作製法を示す
模式図、第８図−（ａ）はプラスミドｐＰＡＩＹ−１の
作製法を示す模式図、第８図−（ｂ）はプラスミドｐＳ
Ｖ３ＬＰＡ　　の作製法を示す模式図及び第９図はプラ
スミドｐＳＶｐＴＫＰＡの作製法を示す模式図を示す。 第１０図はａ、ｂ。 ｃ、ｄ４種のザイモグラフイーの　　写真を示す。 第１図中、黒く塗った部分はエクソンで、左から右へ第
２エクソンから第１４エクソンを示し、エクソンの番号
はＮ’Ｙら（Ｎｙら（１９８４年）プロシーデイングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
ス・ニーニスニー、８１巻、５３頁）の番号付けに従っ
た。 第１図から第９図の全ての図中、Ｅ、Ｅａ、Ｂｇ。 Ｓｓ、　Ｃ，Ｈｐ、Ｈｉ、に、Ｘｂ、Ｓｃ、Ｓａ、Ａｃ
及びＢａ１ｌは、それぞれ制限酵素ＥｃｏＲ（。 Ｂａｍ１−１１　、　Ｂｇｌｌｌ　、　５ｓｔｌ（Ｓａ
ｃｌ　）、　Ｃ１ａｎ。 Ｈｐａ　ｌ　、　Ｈｉｎｄｌ、　Ｋｐｎｌ　、　Ｘｂａ
ｌ　、　５ｃａ１．５ａｌｌ。 Ａｃｃ　ｌ及びＢａ１ｉの認識部位を示す。また’Ｉ’
ＰＡ。 Ａｍｐ、　ＳＶｅ、　ｏｒｉ、　、　Ｅｃｏｇｐｔ、　
Ｔ　−ａｇ、　、　ｐＡ。 ＴＫ及びｐＴＫは、それぞれＴＰＡ遺伝子或いはＴＰＡ
遺伝子の一部、アンピシリン耐性遺伝子、ＳＶ４０のＤ
ＮＡ複製起点を含む初期遺伝子プロモーター領域、プラ
スミドの複製起点、ＥＣｏｇｐｔ遺伝子、ＳＶ４０のＴ
抗原遺伝子、ＳＶ４０のポリ（３）付加シグナルを含む
領域、Ｈ８Ｖ−１のチミジンキナーセ遺伝子及びチミジ
ンキナーセ遺伝子のプロモーター領域を示す。 第１０図のａ及びｂはそれぞれｐＳＶｅＰＡ−１のＬ９
２９形質転換株ＬＥ−６２及びＬＥ−１０５の産生じた
ＴＰＡのザイモグラフイーを示す。Ｃ及びｄは標準サン
プルとして同時に電気泳動したウロキナーゼ（ミドリ十
字）及びＴＰＡ　（メラノーマ（１３）６１の産生じた
ＴＰＡ　）のザイモグラフイーを示す。Ｔ　Ｐ　Ａ　、
ウロキナーゼ（ＵＫ）の相対分子量を示した。

Claims (25)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子をコードす
   る染色体ＤＮＡ配列に、培養細胞で機能する他の遺伝子
   のプロモーター領域の配列を接続したＤＮＡ配列。
2. （２）プロモーター領域が、構成的な発現をしている遺
   伝子のプロモーター領域である特許請求の範囲第１項記
   載のＤＮＡ配列。
3. （３）プロモーター領域が、単純ヘルペス・ウィルスの
   チミジンキナーゼ遺伝子或いはＳＶ４０の初期遺伝子の
   プロモーター領域である特許請求の範囲第１項記載のＤ
   ＮＡ配列。
4. （４）プロモーター領域が、ＳＶ４０の後期遺伝子のプ
   ロモーター領域である特許請求の範囲第１項記載のＤＮ
   Ａ配列。
5. （５）ＤＮＡ配列が、ＳＶ４０のＴ抗原遺伝子配列と同
   一のＤＮＡ配列上に存在する特許請求の範囲第４項記載
   のＤＮＡ配列。
6. （６）培養細胞での選択マーカー遺伝子が、同一ＤＮＡ
   配列に存在する特許請求の範囲第１項乃至第５項の何れ
   かの項記載のＤＮＡ配列。
7. （７）選択マーカー遺伝子がＥｃｏｇｐｔである特許請
   求の範囲第６項記載のＤＮＡ配列。
8. （８）微生物でのＤＮＡ複製起点が同一のＤＮＡ配列に
   存在する特許請求の範囲第１項乃至第７項の何れかの項
   記載のＤＮＡ配列。
9. （９）微生物での選択マーカー遺伝子が同一ＤＮＡ配列
   に存在する特許請求の範囲第１項乃至第８項の何れかの
   項記載のＤＮＡ配列。
10. （１０）ＤＮＡ配列がプラスミドｐＳＶｅＰＡ−１、ｐ
    ＳＶ３ＬＰＡ或いはｐＳＶｐＴＫＰＡのＤＮＡ配列であ
    る特許請求の範囲第１項乃至第８項の何れかの項記載の
    ＤＮＡ配列。
11. （１１）ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子をコード
    する染色体ＤＮＡ配列に、培養細胞で機能する他の遺伝
    子のプロモーター領域の配列を接続したＤＮＡ配列を有
    するＤＮＡによつて形質転換された培養細胞。
12. （１２）細胞の由来が脊椎動物である特許請求の範囲第
    １１項記載の培養細胞。
13. （１３）細胞の由来が哺乳類動物である特許請求の範囲
    第１１項記載の培養細胞。
14. （１４）細胞の由来がヒトである特許請求の範囲第１１
    項記載の培養細胞。
15. （１５）細胞がウィルスで形質転換された細胞である特
    許請求の範囲第１１項乃至第１４項の何れかの項記載の
    培養細胞。
16. （１６）細胞がＳＶ４０で形質転換された細胞である特
    許請求の範囲第１１項乃至第１５項の何れかの項記載の
    培養細胞。
17. （１７）細胞の由来が血球由来の株化細胞である特許請
    求の範囲第１１項乃至第１６項の何れかの項記載の培養
    細胞。
18. （１８）細胞の由来がリンパ系の株化細胞である特許請
    求の範囲第１１項乃至第１６項の何れかの項記載の培養
    細胞。
19. （１９）細胞がグロブリン産生株化細胞である特許請求
    の範囲第１７項乃至第１８項の何れかの項記載の培養細
    胞。
20. （２０）細胞がＬ９２９、ＣＨＯ−Ｋ１、ＷＩ−２６、
    ＶＡ４、ＭＯＰＣ−３１Ｃ、ＭＰＣ−１１或いはＶｅｒ
    ｏ、及びそれらの細胞から派生した細胞の何れかの細胞
    である特許請求の範囲第１１項記載の培養細胞。
21. （２１）ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子をコード
    する染色体ＤＮＡ配列に、培養細胞で機能する他の遺伝
    子のプロモーター領域の配列を接続したＤＮＡ配列を有
    するＤＮＡによつて形質転換された培養細胞を培養して
    ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を生成せしめ、こ
    れを採取するヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の製
    造方法。
22. （２２）培養細胞を培養液中で培養し、培養液からヒト
    組織プラスミノーゲン活性化因子を回収する特許請求の
    範囲第２１項記載の製造方法。
23. （２３）培養細胞を動物体内で増殖させた後、細胞を回
    収し、培養液中で培養する特許請求の範囲第２１項記載
    の製造方法。
24. （２４）培養液が無血清培養液である特許請求の範囲第
    ２２項もしくは第２３項記載の製造方法。
25. （２５）ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子をコード
    する染色体ＤＮＡ配列と動物培養細胞で機能する他の遺
    伝子のプロモーター領域の配列を接続したＤＮＡ配列を
    有するＤＮＡを含有する微生物。