JPS6211095A - リンホトキシン - Google Patents
リンホトキシンInfo
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- JPS6211095A JPS6211095A JP60147371A JP14737185A JPS6211095A JP S6211095 A JPS6211095 A JP S6211095A JP 60147371 A JP60147371 A JP 60147371A JP 14737185 A JP14737185 A JP 14737185A JP S6211095 A JPS6211095 A JP S6211095A
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- JP
- Japan
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- dna
- dna sequence
- cells
- gene
- Prior art date
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- Granted
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Toxicology (AREA)
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は、ヒト・リンホトキシン遺伝子を含むＤＮＡ配
列及びそのＤＮＡ配列を有するＤＮＡによって形質転換
された培養細胞、更にその形質転換細胞を利用したヒト
・リンホトキシンの製造法に係る。
列及びそのＤＮＡ配列を有するＤＮＡによって形質転換
された培養細胞、更にその形質転換細胞を利用したヒト
・リンホトキシンの製造法に係る。
リンホトキシン（ＬＴ）は直接あるいは間接的に癌細胞
のみを攻撃し、壊死させろ作用を持ち（Ｅｖａｎｓ Ｏ
．Ｈ．ら（１９７７年）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．）、 ８７巻，８９８頁）、制癌剤と
しての臨床応用が期待されている。
のみを攻撃し、壊死させろ作用を持ち（Ｅｖａｎｓ Ｏ
．Ｈ．ら（１９７７年）キャンサー・リサーチ（Ｃａｎ
ｃｅｒ Ｒｅｓ．）、 ８７巻，８９８頁）、制癌剤と
しての臨床応用が期待されている。
、（従来の技術）
リンホトキシン（ＬＴ ）は、ヒト或いはマウス等の動
物のリンパ球細胞をフィトヘマグルチニン。
物のリンパ球細胞をフィトヘマグルチニン。
コンカナバリンＡ等のし゜クチン或いはフォルボールエ
ステルで刺激することにより誘導されるリンホカインの
一種である（ Ｄｅｖｌｉｎ 、 Ｊ． Ｊ．’（ １
９ ８ ４’ｆ３リンホカインズ（ Ｌｙｍｐｈｏｋｉ
ｎｅｓ ）＊ ９巻，８１３頁）。
ステルで刺激することにより誘導されるリンホカインの
一種である（ Ｄｅｖｌｉｎ 、 Ｊ． Ｊ．’（ １
９ ８ ４’ｆ３リンホカインズ（ Ｌｙｍｐｈｏｋｉ
ｎｅｓ ）＊ ９巻，８１３頁）。
代表的生産細胞としてヒトではヒツジ赤血球とのロゼツ
ト形成で選択されたＴ細胞あるいはＢ細胞株ＲＤＭＩ
１７８８（Ａｇｇａｒｗａｌ．Ｂ．Ｂ．ら（１９８４
年）ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・・ケミス
トリ−（Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｏｈｅｍ．）、 ２５９巻，
６８６頁）が知られている。ＬＴは糖蛋白であるが（’
ｒｏｔｈ 、 Ｍ． Ｋ．とＧｒａｎｇｅｒ， Ｇ．
Ａ． （１９７９年）。
ト形成で選択されたＴ細胞あるいはＢ細胞株ＲＤＭＩ
１７８８（Ａｇｇａｒｗａｌ．Ｂ．Ｂ．ら（１９８４
年）ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・・ケミス
トリ−（Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｏｈｅｍ．）、 ２５９巻，
６８６頁）が知られている。ＬＴは糖蛋白であるが（’
ｒｏｔｈ 、 Ｍ． Ｋ．とＧｒａｎｇｅｒ， Ｇ．
Ａ． （１９７９年）。
モリキュラー・イミュノロジー（Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ．）。
ｏｌ．）。
１６巻，６７１頁）、種々の形態構成をとりうる。
ＬＴの蛋白化学的研究はいくつかのグループで研究され
ているが、分子量約２ ０， ０ ０ ０の成分がその
最小単位であり、その単位成分が会合したものや他の成
分との複合体があるとされている（Ａｇｇａｒｗａｌ，
Ｂ． Ｂ．ら（１９８４年）ザ・ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー，２５９巻。
ているが、分子量約２ ０， ０ ０ ０の成分がその
最小単位であり、その単位成分が会合したものや他の成
分との複合体があるとされている（Ａｇｇａｒｗａｌ，
Ｂ． Ｂ．ら（１９８４年）ザ・ジャーナル・オブ・
バイオロジカル・ケミストリー，２５９巻。
６８６頁）。
ＬＴは、フオルボールエステル，マイト−ジエン等で刺
激されたリンパ球が産生ずることが知られているが、こ
のような生産法では生産されるＬＴは極めて微量であり
、また大量の新鮮なリンパ球が必要となり量産には不向
きである。また株化されたリンパ球由来の細胞（株化細
胞，）をマイト−ジエン等で刺激するとＬＴが誘導的に
産生されることが知られているが、生産能は用いる細胞
の能力に大きく依存しており、やはり量産に適した系と
は言えない。近年ＬＴのｃＤＮＡがクローニングされ、
大腸菌でＬＴ様蛋白の生産が可能になった（ Ｇｒａｙ
、 Ｐ． Ｗ．ら（１９８４年）ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）、 ８ １ ２巻，７２１頁）。しかし微生物
でつくられるＬＴ様蛋白は、動物細胞と微生物との蛋白
合成機構が多少異なる為に、つくられる蛋白の７ミノ末
端が天然のそれと異なる場合が多い。
激されたリンパ球が産生ずることが知られているが、こ
のような生産法では生産されるＬＴは極めて微量であり
、また大量の新鮮なリンパ球が必要となり量産には不向
きである。また株化されたリンパ球由来の細胞（株化細
胞，）をマイト−ジエン等で刺激するとＬＴが誘導的に
産生されることが知られているが、生産能は用いる細胞
の能力に大きく依存しており、やはり量産に適した系と
は言えない。近年ＬＴのｃＤＮＡがクローニングされ、
大腸菌でＬＴ様蛋白の生産が可能になった（ Ｇｒａｙ
、 Ｐ． Ｗ．ら（１９８４年）ネイチャー（Ｎａｔ
ｕｒｅ）、 ８ １ ２巻，７２１頁）。しかし微生物
でつくられるＬＴ様蛋白は、動物細胞と微生物との蛋白
合成機構が多少異なる為に、つくられる蛋白の７ミノ末
端が天然のそれと異なる場合が多い。
更に微生物によってつくられるＬＴ様蛋白は、天悠のＬ
Ｔが糖鎖を有しているのに対し、糖鎖が結合していない
。このように微生物の蛋白合成系によってつくられたＬ
Ｔ様蛋白と天然のＬＴとは物質として明らかに異なり、
治療薬として長期間使用したり、頻回使用する場合には
、抗原抗体反応の問題が懸念される。
Ｔが糖鎖を有しているのに対し、糖鎖が結合していない
。このように微生物の蛋白合成系によってつくられたＬ
Ｔ様蛋白と天然のＬＴとは物質として明らかに異なり、
治療薬として長期間使用したり、頻回使用する場合には
、抗原抗体反応の問題が懸念される。
（発明が解決しようとする問題点）
蛋白のアミノ末端が天然のＬＴと同じで且つ糖鎖を有す
るＬＴを生産する為には、動物培養細胞を宿主とした遺
伝子組換えの手法の適用が考えられる。この場合、単に
ＬＴ遺伝子を動物培養細胞に導入してもＬＴの産生を観
ることはできないと推定される。すなわちＬＴは誘導蛋
白であり、その発現は遺伝子のレベルで制限されている
からである。従って遺伝子導入の手法により、動物培養
細胞に効果的なＬＴ産生能を付与する為には、用いる遺
伝子に改良を加える必要がある。
るＬＴを生産する為には、動物培養細胞を宿主とした遺
伝子組換えの手法の適用が考えられる。この場合、単に
ＬＴ遺伝子を動物培養細胞に導入してもＬＴの産生を観
ることはできないと推定される。すなわちＬＴは誘導蛋
白であり、その発現は遺伝子のレベルで制限されている
からである。従って遺伝子導入の手法により、動物培養
細胞に効果的なＬＴ産生能を付与する為には、用いる遺
伝子に改良を加える必要がある。
高等生物の多くの蛋白は、核ＤＮＡ配列上に、いくつか
に分断されてコードされていることが知られている。成
熟型のメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ ）の配列をコ
ードしているＤＮＡ配列はエクソン（ｅｘｏｎ ）＊分
断している配列は介在配列またはイントロン（１ｎｔｒ
ｏｎ ）と呼ばれている。
に分断されてコードされていることが知られている。成
熟型のメツセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ ）の配列をコ
ードしているＤＮＡ配列はエクソン（ｅｘｏｎ ）＊分
断している配列は介在配列またはイントロン（１ｎｔｒ
ｏｎ ）と呼ばれている。
イントロンの生物学的な意義や機能は現在不明な点も多
いが、オバルブミン（Ｗｉｃｋｅｎｓ ｌ Ｍ、 Ｐ、
ら（１９８０年）ネイチャー、２８５巻、６２８頁）や
ウィルス蛋白（Ｌａｉ 、 Ｃ−Ｊ、ら（１９７９年）
プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オフ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ。
いが、オバルブミン（Ｗｉｃｋｅｎｓ ｌ Ｍ、 Ｐ、
ら（１９８０年）ネイチャー、２８５巻、６２８頁）や
ウィルス蛋白（Ｌａｉ 、 Ｃ−Ｊ、ら（１９７９年）
プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オフ・サイエンス・ニーニスニー（Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ ） 、
７６巻、７１頁）のイントロンを含まない遺伝子配列
は、イントロンを含む配列に比べ、導入した動物細胞内
での蛋白の生産が極めて少ないことが知られている。ま
た、イントロンを欠落させたＳＶ４０の遺伝子にβ−ｇ
ｌｏｂｉｎ遺伝子のイントロンを加えることにより、安
定なｍＲＮＡの蓄積が起こる事が知られた（Ｈａｍｅｒ
、 Ｄ、 Ｈ，ら（１９７９年）セル（Ｃｅ１ｌ ）。
７６巻、７１頁）のイントロンを含まない遺伝子配列
は、イントロンを含む配列に比べ、導入した動物細胞内
での蛋白の生産が極めて少ないことが知られている。ま
た、イントロンを欠落させたＳＶ４０の遺伝子にβ−ｇ
ｌｏｂｉｎ遺伝子のイントロンを加えることにより、安
定なｍＲＮＡの蓄積が起こる事が知られた（Ｈａｍｅｒ
、 Ｄ、 Ｈ，ら（１９７９年）セル（Ｃｅ１ｌ ）。
１８巻、１２９９頁）。
遺伝子から転写された初期ＡＮＡからのイントロン部分
の配列の除去をスプライシング（、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ）
と呼ぶが、スプライシングは安定なｍＲＮＡの蓄積ある
いはｍＲＮＡの核から細胞質への移行の為に必要な事象
と推定される。
の配列の除去をスプライシング（、Ｓｐｌｉｃｉｎｇ）
と呼ぶが、スプライシングは安定なｍＲＮＡの蓄積ある
いはｍＲＮＡの核から細胞質への移行の為に必要な事象
と推定される。
正常で機能のある蛋白の発現の為には、イントロンの正
しい位置でのスプライシングが不可欠であるが、インシ
ュリン遺伝子とシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のプ
ロモーター領域を結合し、００Ｓ細胞に導入した場合の
異常なスプライシングが報告されている（Ｌａｕｂ、
Ｏ，ら（１９８８年）ザ・ジャーナル・オフ・バイオロ
ジカル・ケミストリー、２５８巻、６０４８頁）。また
アミラーゼの発現においては、組織特異的なスプライシ
ングが存在し、同一の遺伝子から２つの異ったスプライ
シングを経て、唾液腺アミラーゼと肝臓アミラーゼが合
成されることが知られている（ Ｙ Ｏｕ ｎ ｇ ＋
Ｒ，Ａ、ら（１９８１年）セル、２３巻、４５１頁）。
しい位置でのスプライシングが不可欠であるが、インシ
ュリン遺伝子とシミアンウィルス４０（ＳＶ４０）のプ
ロモーター領域を結合し、００Ｓ細胞に導入した場合の
異常なスプライシングが報告されている（Ｌａｕｂ、
Ｏ，ら（１９８８年）ザ・ジャーナル・オフ・バイオロ
ジカル・ケミストリー、２５８巻、６０４８頁）。また
アミラーゼの発現においては、組織特異的なスプライシ
ングが存在し、同一の遺伝子から２つの異ったスプライ
シングを経て、唾液腺アミラーゼと肝臓アミラーゼが合
成されることが知られている（ Ｙ Ｏｕ ｎ ｇ ＋
Ｒ，Ａ、ら（１９８１年）セル、２３巻、４５１頁）。
また、Ｓ Ｖ ４０ （Ｂｅｒｋ、 Ａ、 Ｊ、ら（１
９７８年）プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル
・アカデＥ−・オフ・サイエンス・ニーニスニー、７５
巻、１２７４頁）、アデノウィルス（Ｃｈｏｗ、 Ｌ、
Ｔ。
９７８年）プロシーデイングズ・オフ・ザ・ナショナル
・アカデＥ−・オフ・サイエンス・ニーニスニー、７５
巻、１２７４頁）、アデノウィルス（Ｃｈｏｗ、 Ｌ、
Ｔ。
（１９７７年）セル、１２巻、１頁）等においても、同
一の遺伝子から異ったスプライシングを経て複数のｍＲ
ＮＡ及び蛋白が合成されている。従って、動物培養細胞
にイントロンを含むＬＴ遺伝子を導入し、ＬＴを産生ず
るには正常なスプライシングが起こる必要があるが、本
発明者らはＬＴをコードしている染色体ＤＮＡ配列に動
物培養細胞で機能する、すなわちｍＲＮＡ合成を開始す
る事が可能なプロモーター領域のＤＮＡ配列を結合させ
、種々の動物培養細胞に導入した場合、正常にスプライ
シングが起こり、ＬＴが培地中に著量分泌される事を見
い出した。
一の遺伝子から異ったスプライシングを経て複数のｍＲ
ＮＡ及び蛋白が合成されている。従って、動物培養細胞
にイントロンを含むＬＴ遺伝子を導入し、ＬＴを産生ず
るには正常なスプライシングが起こる必要があるが、本
発明者らはＬＴをコードしている染色体ＤＮＡ配列に動
物培養細胞で機能する、すなわちｍＲＮＡ合成を開始す
る事が可能なプロモーター領域のＤＮＡ配列を結合させ
、種々の動物培養細胞に導入した場合、正常にスプライ
シングが起こり、ＬＴが培地中に著量分泌される事を見
い出した。
−ＬＴは糖蛋白である。現在ＬＴの糖鎖の構造について
は不明な点が多く、ヒト以外の細胞でつくられたＬ＋Ｐ
とヒト由来細胞でつくられたＬＴの糖鎖の構造及び抗原
性に違いがあるかは不明である。
は不明な点が多く、ヒト以外の細胞でつくられたＬ＋Ｐ
とヒト由来細胞でつくられたＬＴの糖鎖の構造及び抗原
性に違いがあるかは不明である。
しかしヒト由来細胞でつくられるＬＴは、天然のＬＴと
極めて類似しているものと考えられ、ヒト以外の細胞で
つくられたＬＴに比して、より安全性が高いと考えられ
る。またヒト以外の細胞でＬＴをつくる場合は、ＬＴの
製品中にヒト以外の生物の蛋白等の構成成分や分泌成分
が混入する事が考えられ、治療薬としての長期間の投与
におけるアレルギー反応、ショック等の問題が予想され
るが、ヒト由来細胞を用いて作った製品中には本質的に
ヒトの成分、すなわちヒト血液中に存在している物質以
外は含まれず生産物の安全性の向上が期待される。
極めて類似しているものと考えられ、ヒト以外の細胞で
つくられたＬＴに比して、より安全性が高いと考えられ
る。またヒト以外の細胞でＬＴをつくる場合は、ＬＴの
製品中にヒト以外の生物の蛋白等の構成成分や分泌成分
が混入する事が考えられ、治療薬としての長期間の投与
におけるアレルギー反応、ショック等の問題が予想され
るが、ヒト由来細胞を用いて作った製品中には本質的に
ヒトの成分、すなわちヒト血液中に存在している物質以
外は含まれず生産物の安全性の向上が期待される。
本発明により、安全性の高いＬＴを大量に供給する事が
可能になるものと考えられる。以下に、本発明を更に詳
細に説明する。
可能になるものと考えられる。以下に、本発明を更に詳
細に説明する。
（問題点を解決するための手段）
ＬＴをコードしている染色体遺伝子領域は、本発明者ら
のクローニング及び解析の結果初めて明らかになり、第
１図に示したような制限酵素認識部位を有している。Ｌ
Ｔ染色体ＤＮＡ配列上はＬＴの蛋白合成の開始のアミノ
酸であるメチオニンのコドンＡＴＧから終止コドンＴＡ
Ｇまでの塩基配列を含むＤＮＡ配列で、例えば第２図に
示したプラスミドｐＬＴＢ４．２に含まれるＢａｍＨＩ
４．２Ｋｂ（キロベース）の配列をさす。
のクローニング及び解析の結果初めて明らかになり、第
１図に示したような制限酵素認識部位を有している。Ｌ
Ｔ染色体ＤＮＡ配列上はＬＴの蛋白合成の開始のアミノ
酸であるメチオニンのコドンＡＴＧから終止コドンＴＡ
Ｇまでの塩基配列を含むＤＮＡ配列で、例えば第２図に
示したプラスミドｐＬＴＢ４．２に含まれるＢａｍＨＩ
４．２Ｋｂ（キロベース）の配列をさす。
ＬＴをコードする染色体ＤＮＡ配列は、ヒトＤＮＡから
クローン化される。ヒトＤＮＡは、例えばヒト白血球細
胞培養細胞或いは組織などを用い、Ｂ１１ｎらの方法（
Ｂｌｉｎ、Ｎ、ら（１９７６年）ヌクレイツク・アシツ
ズ・リサーチ（ＮｕＣｌｅｉＣＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、
）、 ８巻、２３０Ｂ頁）により調製される。ＬＴ遺伝
子のクローニングに用いるベクターはＣｈａｒｏｎ ２
８に代表されるλファージベクタ＋、 ｐＢＲ１２２に
代表されるプラスミドベクター或いはｐＨ０７９に代表
されるニスミツドなどが利用できるが、一般的には、高
率で長鎖のＤＮＡ断片をクローニングできるλファージ
をベクターとして用いる遺伝子操作法が用いられる。す
なわちヒト高分子ＤＮＡを適切な制限酵素で切断後、λ
フアージＤＮＡの置換可能領域の代りに挿入し、リコン
ビナントファージＤＮＡをつくる。次にインビトロパッ
ケージングの手法を用い、感染性のあるファージ粒子を
作製する。次に宿主大腸菌とともにプレートにまき、組
換え型ファージのプラークを形成させる（Ｅｎｑｕｉｓ
ｔ、Ｌ、ら（ｔ９７９ｊｌメソッズ・イン・エンザイモ
ロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
＊ ６８巻、２８１頁ｉ ＨＯｒｎ 。
クローン化される。ヒトＤＮＡは、例えばヒト白血球細
胞培養細胞或いは組織などを用い、Ｂ１１ｎらの方法（
Ｂｌｉｎ、Ｎ、ら（１９７６年）ヌクレイツク・アシツ
ズ・リサーチ（ＮｕＣｌｅｉＣＡｃｉｄｓ Ｒｅｓ、
）、 ８巻、２３０Ｂ頁）により調製される。ＬＴ遺伝
子のクローニングに用いるベクターはＣｈａｒｏｎ ２
８に代表されるλファージベクタ＋、 ｐＢＲ１２２に
代表されるプラスミドベクター或いはｐＨ０７９に代表
されるニスミツドなどが利用できるが、一般的には、高
率で長鎖のＤＮＡ断片をクローニングできるλファージ
をベクターとして用いる遺伝子操作法が用いられる。す
なわちヒト高分子ＤＮＡを適切な制限酵素で切断後、λ
フアージＤＮＡの置換可能領域の代りに挿入し、リコン
ビナントファージＤＮＡをつくる。次にインビトロパッ
ケージングの手法を用い、感染性のあるファージ粒子を
作製する。次に宿主大腸菌とともにプレートにまき、組
換え型ファージのプラークを形成させる（Ｅｎｑｕｉｓ
ｔ、Ｌ、ら（ｔ９７９ｊｌメソッズ・イン・エンザイモ
ロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）
＊ ６８巻、２８１頁ｉ ＨＯｒｎ 。
Ｂ、（１９７９３１−）メソツズ・イン・エンザイモロ
ジー、６８巻、２９９頁）。ＬＴをコードするＤＮＡ断
片を持つ組換え型ファージのプラークの検出には、ｃＤ
ＮＡや合成りＮＡをプローブとしたプラークハイブリダ
イゼーションの手法（Ｗｏｏ 、 Ｓ、Ｌ。
ジー、６８巻、２９９頁）。ＬＴをコードするＤＮＡ断
片を持つ組換え型ファージのプラークの検出には、ｃＤ
ＮＡや合成りＮＡをプローブとしたプラークハイブリダ
イゼーションの手法（Ｗｏｏ 、 Ｓ、Ｌ。
Ｃ，（１９７９年）メソツズ・イン・エンザイモロジー
、６８巻、３８９頁； ５ｚｏｓｔａｋ、 Ｊ、Ｗ、ら
（１９７９年） メソツズ・イン・エンザイモロジー
、６８巻、４１９頁）が利用できる。またＬＴの遺伝子
を持つ組換え型ファージは、プラークハイブリダイゼー
ションによって選択されたプラークから回収し宿主大腸
菌と共に培養することにより大量に調製できる。また組
換え型ファージのＤＮＡはフェノール法等により調製で
きる（ Ｍａｎｉａｔｉｓ。
、６８巻、３８９頁； ５ｚｏｓｔａｋ、 Ｊ、Ｗ、ら
（１９７９年） メソツズ・イン・エンザイモロジー
、６８巻、４１９頁）が利用できる。またＬＴの遺伝子
を持つ組換え型ファージは、プラークハイブリダイゼー
ションによって選択されたプラークから回収し宿主大腸
菌と共に培養することにより大量に調製できる。また組
換え型ファージのＤＮＡはフェノール法等により調製で
きる（ Ｍａｎｉａｔｉｓ。
Ｔ、ら（１９８２年） Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｏｌｏｎ
ｉｎｇ ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ
１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）。
ｉｎｇ ａＬａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｃｏ
１ｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ）。
動物培養細胞へのＤＮＡの導入法として、トランスフェ
クション効率に差はあるが、リン酸カルシウム法（Ｗｉ
ｇｌｅｒ、 Ｍ、ら（１９７７年）セル。
クション効率に差はあるが、リン酸カルシウム法（Ｗｉ
ｇｌｅｒ、 Ｍ、ら（１９７７年）セル。
１１Ｌ ２２３頁）、マイクロインジェクション法（Ａ
ｎｄｅｒｓｏｎ 、 Ｗ、 Ｆ、ら（１９８０年）プロ
シーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス・ニーニスニー、７７巻、５３９９頁
）、リポゾーム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法或いは細
胞融合法（５ｃｈｏｆｆｎｅｒ、 Ｗ、ら（１９８０年
）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー。
ｎｄｅｒｓｏｎ 、 Ｗ、 Ｆ、ら（１９８０年）プロ
シーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・
オブ・サイエンス・ニーニスニー、７７巻、５３９９頁
）、リポゾーム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法或いは細
胞融合法（５ｃｈｏｆｆｎｅｒ、 Ｗ、ら（１９８０年
）プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデ
ミ−・オブ・サイエンス・ニーニスニー。
７７巻、２１６３頁）等が用いられている。リン酸カル
シウム法として用いるＤＮＡ材料としては、ＤＮＡ溶液
の他に大腸菌などの微生物、ファージなども利用できる
。細胞融合法では目的ＤＮＡ配・列をプラスミドとして
保有している微生物のプロトプラストが用いられている
。
シウム法として用いるＤＮＡ材料としては、ＤＮＡ溶液
の他に大腸菌などの微生物、ファージなども利用できる
。細胞融合法では目的ＤＮＡ配・列をプラスミドとして
保有している微生物のプロトプラストが用いられている
。
ＬＴは誘導蛋白であり、ヒト白血球細胞を種々のマイト
−ジエン等で刺激することにより誘導される。現在マイ
ト−ジエンの刺激が、どのような形でＬＴの遺伝子に働
き、ＬＴを誘導するかは不明であるが、そのような誘導
機構のない細胞にＬＴの調節部位を含む遺伝子を導入し
てもＬＴの生産は微弱なものであろう。本発明者らは、
動物培養細胞内で機能する他の遺伝子のプロモーター領
域の配列をＬＴの染色体ＤＮＡ配列の５′側に接続し、
細胞に導入することによりＬＴの非生産細胞を高生産細
胞に形質転換できることを見い出した。この場合、ＬＴ
のｍＲＮＡ合成は接続したプロモーター領域の制御下に
おかれ、たとえば接続したプロモーター領域が構成的な
蛋白の遺伝子のプロモーター領域であれば、細胞内でＬ
ＴのｍＲＮＡは常時合成され、従って細胞はＬＴの構成
的生産細胞になる。もし接続するプロモーター領域が、
誘導蛋白のものであれば、形質転換細胞は、ＬＴ誘導蛋
白として生産する。
−ジエン等で刺激することにより誘導される。現在マイ
ト−ジエンの刺激が、どのような形でＬＴの遺伝子に働
き、ＬＴを誘導するかは不明であるが、そのような誘導
機構のない細胞にＬＴの調節部位を含む遺伝子を導入し
てもＬＴの生産は微弱なものであろう。本発明者らは、
動物培養細胞内で機能する他の遺伝子のプロモーター領
域の配列をＬＴの染色体ＤＮＡ配列の５′側に接続し、
細胞に導入することによりＬＴの非生産細胞を高生産細
胞に形質転換できることを見い出した。この場合、ＬＴ
のｍＲＮＡ合成は接続したプロモーター領域の制御下に
おかれ、たとえば接続したプロモーター領域が構成的な
蛋白の遺伝子のプロモーター領域であれば、細胞内でＬ
ＴのｍＲＮＡは常時合成され、従って細胞はＬＴの構成
的生産細胞になる。もし接続するプロモーター領域が、
誘導蛋白のものであれば、形質転換細胞は、ＬＴ誘導蛋
白として生産する。
動物培養細胞で機能するプロモーターとしてＳＶ４０の
初期遺伝子プロモーターが知られている。コノプロモー
ターは５Ｖ４０ＤＮＡのＨｉｎｄｌ−Ｐｖｕｌ［フラグ
メント、約３５０ベースペア（ｋ＋ｐ）ＤＮＡ断片に含
まれている。また、このＤＮＡ断片は逆向きにＳＶ４０
の後期遺伝子のプロモーターとしての活性を有している
。ＳＶ４０の後期プロモーターからの転写活性は、一般
的にＳＶ４０のＴ抗原の存在下で増強される。従ってＳ
Ｖ４０の後期プロモーターを接続したＬＴの遺伝子が導
入される細胞は、Ｔ抗原が発現している細胞が望ましい
。Ｔ抗原が発現している細胞を作製するには、Ｔ抗原を
コードしている遺伝子を細胞に導入すればよい。またＳ
Ｖ４０のＴ抗原をコードするＤＮＡ配列上ＳＶ４０の後
期プロモータ 。
初期遺伝子プロモーターが知られている。コノプロモー
ターは５Ｖ４０ＤＮＡのＨｉｎｄｌ−Ｐｖｕｌ［フラグ
メント、約３５０ベースペア（ｋ＋ｐ）ＤＮＡ断片に含
まれている。また、このＤＮＡ断片は逆向きにＳＶ４０
の後期遺伝子のプロモーターとしての活性を有している
。ＳＶ４０の後期プロモーターからの転写活性は、一般
的にＳＶ４０のＴ抗原の存在下で増強される。従ってＳ
Ｖ４０の後期プロモーターを接続したＬＴの遺伝子が導
入される細胞は、Ｔ抗原が発現している細胞が望ましい
。Ｔ抗原が発現している細胞を作製するには、Ｔ抗原を
コードしている遺伝子を細胞に導入すればよい。またＳ
Ｖ４０のＴ抗原をコードするＤＮＡ配列上ＳＶ４０の後
期プロモータ 。
−配列上を接続したＬＴ遺伝子配列が同一の配列上に存
在するＤＮＡ配列で培養細胞を形質転換した場合、多種
の細胞株でＬＴの高発現株が得られるであろう。
在するＤＮＡ配列で培養細胞を形質転換した場合、多種
の細胞株でＬＴの高発現株が得られるであろう。
ヘルペス・シンプレックス・ウィルスＣＨ８Ｖ）タイプ
ＩのチミジンキナーゼプロモーターモＳ■４０初期遺伝
子プロモーターと同様に構成的なプロモーターであり、
領域の構造はＷａｇｎｅｒらによって示されている（Ｗ
ａｇｎｅｒ、 Ｍ、 Ｊ−ら（１９８１＋）プロシーデ
イングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス・ニーニスニー。
ＩのチミジンキナーゼプロモーターモＳ■４０初期遺伝
子プロモーターと同様に構成的なプロモーターであり、
領域の構造はＷａｇｎｅｒらによって示されている（Ｗ
ａｇｎｅｒ、 Ｍ、 Ｊ−ら（１９８１＋）プロシーデ
イングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ−・オブ・
サイエンス・ニーニスニー。
７９巻、１４４１頁）。機能するプロモーター領域、と
は、ｍＲＮＡの合成開始点は含むが、それらのプロモー
ターが調節している蛋白の最初のアミノ酸であるメチオ
ニンのコドンは含まないプロモーター領域の配列をさす
。機能するプロモーター領域の配列上ＬＴ染色体ＤＮＡ
配列上が接続したＤＮＡ配列（ＬＴ発現ベクター）の作
製を実施例３に示した。
は、ｍＲＮＡの合成開始点は含むが、それらのプロモー
ターが調節している蛋白の最初のアミノ酸であるメチオ
ニンのコドンは含まないプロモーター領域の配列をさす
。機能するプロモーター領域の配列上ＬＴ染色体ＤＮＡ
配列上が接続したＤＮＡ配列（ＬＴ発現ベクター）の作
製を実施例３に示した。
ＬＴのアミノ酸配列は、クローニングされたＬＴ遺伝子
のエクソン部分の塩基配列から推定可能である。塩基配
列はマキサム−ギルバート法（Ｍａｘａｍ、 Ａ、Ｍ、
ら（１９８０年）メソッズ・イン・エンザイモロジー、
６５巻、４９９頁）、或いはＳａｎｇｅｒのグイデオキ
シ法（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、（１９８１１サイエンス（
５ｃｉｅｎｃｅ ）、 ２１４巻、１２０５頁）等で決
定される。
のエクソン部分の塩基配列から推定可能である。塩基配
列はマキサム−ギルバート法（Ｍａｘａｍ、 Ａ、Ｍ、
ら（１９８０年）メソッズ・イン・エンザイモロジー、
６５巻、４９９頁）、或いはＳａｎｇｅｒのグイデオキ
シ法（Ｓａｎｇｅｒ、 Ｆ、（１９８１１サイエンス（
５ｃｉｅｎｃｅ ）、 ２１４巻、１２０５頁）等で決
定される。
遺伝子を細胞に導入した場合、導入遺伝子は宿主染色体
ＤＮＡに安定に組み込まれる場合がある。
ＤＮＡに安定に組み込まれる場合がある。
遺伝子が組み込まれる染色体上の位置は一見でたらめで
あり、また組み込まれるＤＮＡのコピー数も不規則であ
る。ＬＴ遺伝子を細胞に導入した場合、組み込まれた位
置やコピー数が細胞ごとに異なり、各々の細胞のＬＴ生
産量は異なる。従って細胞をクローン化することにより
種々の生産量を有する細胞を得ることができる。目的遺
伝子を導入し、安定に発現する細胞のみを選択的に増殖
させる為には、機能するプロモーター配列上ＬＴ遺伝子
が接続した配列上選択マーカー遺伝子を同一ＤＮＡ配列
上に持つＤＮＡ配列が適切である。動物細胞での選択マ
ーカー遺伝子としてはＥＣｏｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ
、 Ｒ，Ｏ，ら（１９８０年）サイエンス。
あり、また組み込まれるＤＮＡのコピー数も不規則であ
る。ＬＴ遺伝子を細胞に導入した場合、組み込まれた位
置やコピー数が細胞ごとに異なり、各々の細胞のＬＴ生
産量は異なる。従って細胞をクローン化することにより
種々の生産量を有する細胞を得ることができる。目的遺
伝子を導入し、安定に発現する細胞のみを選択的に増殖
させる為には、機能するプロモーター配列上ＬＴ遺伝子
が接続した配列上選択マーカー遺伝子を同一ＤＮＡ配列
上に持つＤＮＡ配列が適切である。動物細胞での選択マ
ーカー遺伝子としてはＥＣｏｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ
、 Ｒ，Ｏ，ら（１９８０年）サイエンス。
２０９巻、１４２２頁）、ｎｅｏ （５ｏｕｔｈｅｒｎ
、 Ｐ、 Ｊ。
、 Ｐ、 Ｊ。
ら（１９８２年）ジャーナル・オブ・モレキュラー・ア
ンド・アプライド・ジエネテイツクス（Ｊ、Ｍｏｌ。
ンド・アプライド・ジエネテイツクス（Ｊ、Ｍｏｌ。
Ａｐｐｌ、 Ｇｅｎｅｔ、 ）、 １巻、３２７頁）、
ｄｈｆｒ （Ｗｉｇｌｅｒ 、 Ｍ、ら（１９８０年）
プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、７７巻、８５６
７頁） などの遺伝子が用いられる。また、そのような
りＮＡ配列を大量に調製する為には、そのようなりＮＡ
配列が、大腸菌で複製し且つ大量調製可能なプラスミド
やファージであることが望ましい。実施例ｅ乃至５に示
したＬＴ発現ベクターは、以上のような目的にかなうプ
ラスミドである。すなわち大腸菌で複製可能にするＤＮ
Ａ複製開始点（ｏｒｉ）と、選択マーカー（アンピシリ
ン耐性遺伝子）及び動物培養細胞での選択マーカー遺伝
子（Ｅｃｏｇｐｔ）及び機能するプロモーターと接続し
たＬＴの染色体ＤＮＡ配列が同一のＤＮＡ配列上に存在
している事を特徴としたプラスミドである。
ｄｈｆｒ （Ｗｉｇｌｅｒ 、 Ｍ、ら（１９８０年）
プロシーデイングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス・ニーニスニー、７７巻、８５６
７頁） などの遺伝子が用いられる。また、そのような
りＮＡ配列を大量に調製する為には、そのようなりＮＡ
配列が、大腸菌で複製し且つ大量調製可能なプラスミド
やファージであることが望ましい。実施例ｅ乃至５に示
したＬＴ発現ベクターは、以上のような目的にかなうプ
ラスミドである。すなわち大腸菌で複製可能にするＤＮ
Ａ複製開始点（ｏｒｉ）と、選択マーカー（アンピシリ
ン耐性遺伝子）及び動物培養細胞での選択マーカー遺伝
子（Ｅｃｏｇｐｔ）及び機能するプロモーターと接続し
たＬＴの染色体ＤＮＡ配列が同一のＤＮＡ配列上に存在
している事を特徴としたプラスミドである。
機能する他の遺伝子のプロモーター領域を接続したＬＴ
の染色体ＤＮＡ配列を導入された細胞がＬＴを産生ずる
為には、該ＤＮＡ配列が、用いた細胞固有のＲＮＡ合成
系、ＲＮＡの成熟、蛋白合成系、蛋白の成熟、分泌等の
機能に適合している必要がある。導入されたＤＮＡから
はｍＲＮＡが合成されるが、ｍ Ｒ’Ｎ Ａの５′末端
はキャップ構造の付加、正常な位置でのスプライシング
及び８′末端へのポリアゾニレ−ジョンが必要である。
の染色体ＤＮＡ配列を導入された細胞がＬＴを産生ずる
為には、該ＤＮＡ配列が、用いた細胞固有のＲＮＡ合成
系、ＲＮＡの成熟、蛋白合成系、蛋白の成熟、分泌等の
機能に適合している必要がある。導入されたＤＮＡから
はｍＲＮＡが合成されるが、ｍ Ｒ’Ｎ Ａの５′末端
はキャップ構造の付加、正常な位置でのスプライシング
及び８′末端へのポリアゾニレ−ジョンが必要である。
また活性のあるＬＴの発現には、合成されるＬＴペプタ
イドの正常な高次構造の形成と維持、更にはシグナルペ
プタイドの切断、細胞からの分泌が正確に行なわれる必
要がある。本発明者らが試用した動物培養細胞はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣｊＣ
）から入手可能なハムスター、サル、ヒト由来の細胞で
あるが、本明細書に示されているＬＴの製造法を用いれ
ば、少なくともを椎動物由来の培養細胞、融合細胞、正
常及び変異細胞、ウィルスによる形質転換細胞等におい
て活性あるＬＴを産生ずることが可能である。またヒト
の細胞をＳＶ４０で形質転換した株化細胞を生産細胞と
して用いる事は、原因不明で癌化或いは株化した細胞に
比して、適切な手段を講じることにより生産物の安全性
の向上が期待される。
イドの正常な高次構造の形成と維持、更にはシグナルペ
プタイドの切断、細胞からの分泌が正確に行なわれる必
要がある。本発明者らが試用した動物培養細胞はアメリ
カン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣｊＣ
）から入手可能なハムスター、サル、ヒト由来の細胞で
あるが、本明細書に示されているＬＴの製造法を用いれ
ば、少なくともを椎動物由来の培養細胞、融合細胞、正
常及び変異細胞、ウィルスによる形質転換細胞等におい
て活性あるＬＴを産生ずることが可能である。またヒト
の細胞をＳＶ４０で形質転換した株化細胞を生産細胞と
して用いる事は、原因不明で癌化或いは株化した細胞に
比して、適切な手段を講じることにより生産物の安全性
の向上が期待される。
５ｖ４０の形質転換細胞としてＷＩ−２６ＶＡ４が知ら
れている。
れている。
機能するプロモーターを接続したＬＴ染色体ＤＮＡ配列
を、例えばリン酸カルシウム法で動物培養細胞に導入し
、ＬＴを産生ずるようになった細胞は、通常細胞の培養
に用いられる血清を含んだ培地ばかりでなく、全く血清
を含まない無血清培地でもＬＴを産生ずる事を見い出し
た。ＬＴの生産に無血清培地を用いる事はＬＴの培地か
らの回収精製をより容易にするばかりでなく、製品への
血清成分の混入を防ぐことになる。
を、例えばリン酸カルシウム法で動物培養細胞に導入し
、ＬＴを産生ずるようになった細胞は、通常細胞の培養
に用いられる血清を含んだ培地ばかりでなく、全く血清
を含まない無血清培地でもＬＴを産生ずる事を見い出し
た。ＬＴの生産に無血清培地を用いる事はＬＴの培地か
らの回収精製をより容易にするばかりでなく、製品への
血清成分の混入を防ぐことになる。
（実施例）
以下に実施例を示すが、本発明に係る諸実験は内閣総理
大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」に従って行った
。また実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、種々
の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげる雑
誌、載置を参考とした。
大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」に従って行った
。また実施例中のファージ、プラスミド、ＤＮＡ、種々
の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下にあげる雑
誌、載置を参考とした。
■、蛋白質 核酸 酵素、２６巻、４号、（１９８１年
）臨時増刊 遺伝子操作（共立出版）２、遺伝子操作実
験法、高木東歌編著（１９８０年）講談社 ３、遺伝子操作マニュアル、高木東歌編著（１９８２年
） 講談社 ４、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ 、 Ｔ、 Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら編（１９８２年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ５、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ６５
巻。
）臨時増刊 遺伝子操作（共立出版）２、遺伝子操作実
験法、高木東歌編著（１９８０年）講談社 ３、遺伝子操作マニュアル、高木東歌編著（１９８２年
） 講談社 ４、 Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ、Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ
ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ 、 Ｔ、 Ｍａｎ
ｉａｔｉｓら編（１９８２年）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎ
ｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ５、
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、 ６５
巻。
Ｌ、 Ｇｒｏｓｓｍａｎら編（１９８０年） Ａｃａｄ
ｅｍｉｃｒｅｓｓ ６、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｕｎＺｙｍｏｌｏｇｙ
、 ６８巻。
ｅｍｉｃｒｅｓｓ ６、 Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ ｕｎＺｙｍｏｌｏｇｙ
、 ６８巻。
Ｒ，Ｗｕ編（１９７９年） Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅ
ｓｓ実施例Ｉ 実施例示子のクローニング 複数の健康成人からヘパリン採血し、市販のリン酸緩衝
液（ＰＢＳ）（フローラボラトリー社製）で２倍希釈後
、フィコールパック（ファルマシア社製）液に上層し、
２０００回転、３０分遠心し白血球層を分離し、更にＰ
ＢＳで２回洗浄した。
ｓｓ実施例Ｉ 実施例示子のクローニング 複数の健康成人からヘパリン採血し、市販のリン酸緩衝
液（ＰＢＳ）（フローラボラトリー社製）で２倍希釈後
、フィコールパック（ファルマシア社製）液に上層し、
２０００回転、３０分遠心し白血球層を分離し、更にＰ
ＢＳで２回洗浄した。
１０８個の細胞に対し２０ｍ／の０．５Ｍ ＢＤ’ｌ
”Ａ −０，５％ザルコシル溶液を加え、２１ｆのプロ
テアーゼＫを入れ、５０°Ｃで３時間インキュベートし
た。
”Ａ −０，５％ザルコシル溶液を加え、２１ｆのプロ
テアーゼＫを入れ、５０°Ｃで３時間インキュベートし
た。
フェノール抽出を２回行い、水層を５０ｍＭトリス−１
０ｍＭ ＥＤＴＡ−１０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ８
，０）に１晩透析した。ＲＮａ５ｅ Ａを１００μｆ／
ｍｌになるように加え、３７°Ｃで３時間処理後、フェ
ノール抽出を２回行い、水層を５０ｍＭ ｌ−リス−１
０ｍＭ ＥＤＴＡｉｉｎ透析し、高分子ヒトＤＮＡを
得た。ヒトＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａｌで部分切断後
、蔗糖密度勾配遠心により約１５〜２０キロベースの大
きさの５ａｕ３ＡＩＤＮＡ断片を調製した。ラムダファ
ージベクター０ｈａｒｏｎ ２８ Ｄ Ｎ ＡをＢａｍ
Ｈｌで切断後、蔗糖密度勾配遠心により０ｈａｒｏｎ
２８の左端断片及び右端断片を含む両分を集め、エタノ
ール沈澱により回収した。
０ｍＭ ＥＤＴＡ−１０ｍＭ塩化ナトリウム（ｐＨ８
，０）に１晩透析した。ＲＮａ５ｅ Ａを１００μｆ／
ｍｌになるように加え、３７°Ｃで３時間処理後、フェ
ノール抽出を２回行い、水層を５０ｍＭ ｌ−リス−１
０ｍＭ ＥＤＴＡｉｉｎ透析し、高分子ヒトＤＮＡを
得た。ヒトＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａｌで部分切断後
、蔗糖密度勾配遠心により約１５〜２０キロベースの大
きさの５ａｕ３ＡＩＤＮＡ断片を調製した。ラムダファ
ージベクター０ｈａｒｏｎ ２８ Ｄ Ｎ ＡをＢａｍ
Ｈｌで切断後、蔗糖密度勾配遠心により０ｈａｒｏｎ
２８の左端断片及び右端断片を含む両分を集め、エタノ
ール沈澱により回収した。
Ｃｈａｒｏｎ ２８の両端のＤＮＡ断片とヒト１５〜２
０キロベース５ａｕ３Ａｉ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで
結合後、エンキストとスタンバーブの方法（Ｌ、Ｅｎｑ
ｕｉｓｔとＮ、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ （１９７９’年）
メソツズ・イン・エンザイモロジー、６ＳＳ。
０キロベース５ａｕ３Ａｉ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで
結合後、エンキストとスタンバーブの方法（Ｌ、Ｅｎｑ
ｕｉｓｔとＮ、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ （１９７９’年）
メソツズ・イン・エンザイモロジー、６ＳＳ。
２８１頁）によりインビトロパッケージングを行い、大
腸菌ＬＥ３９２を宿主として組換え型ファージのプラー
クを形成させた。次にブラークツ１イブリダイゼーシヨ
ンの手法（Ｂｅｎｔｏｎ 、 Ｗ、 Ｄ、 。
腸菌ＬＥ３９２を宿主として組換え型ファージのプラー
クを形成させた。次にブラークツ１イブリダイゼーシヨ
ンの手法（Ｂｅｎｔｏｎ 、 Ｗ、 Ｄ、 。
Ｄａｖｉｓ、 Ｒ，Ｗ、 （１９７７）サイエンス、１
９６巻。
９６巻。
１８０頁）によりＬＴの遺伝子を持つ組換え型ファージ
クローンを選択した。プローブとしては、ＬＴの遺伝子
に存在する配列を持つオリゴヌクレオチドＡＴＧＡＣＡ
ＣＣＡＣＣＴＧＡＡＯＧＴ、ＴＯＴＡＣ！ＴＣＣ（：！
ＡＧＧＴＧＧＴＯ及びＡＣ’ｌ’ＧＴＯＴ’ｒＣＴＴＴ
ＧＧＡＧＣｏ （これらの配列はＬＴのアミノ酸配列
−３４から−２９，７５から８０及び１６３から１６８
に対応している： Ｇｒａｙ、 Ｐ、 Ｗ、ら（１９８
４年）ネイチャー、３１２巻、７２１頁）をホスホトリ
エステル法（Ｍｉｙｏｓｈｉ 、 Ｋ、ら（１９８０）
ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、８巻、５５０７頁
）で合成し、５’−ＯＨを〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰ及びＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼで標識して用いた。
クローンを選択した。プローブとしては、ＬＴの遺伝子
に存在する配列を持つオリゴヌクレオチドＡＴＧＡＣＡ
ＣＣＡＣＣＴＧＡＡＯＧＴ、ＴＯＴＡＣ！ＴＣＣ（：！
ＡＧＧＴＧＧＴＯ及びＡＣ’ｌ’ＧＴＯＴ’ｒＣＴＴＴ
ＧＧＡＧＣｏ （これらの配列はＬＴのアミノ酸配列
−３４から−２９，７５から８０及び１６３から１６８
に対応している： Ｇｒａｙ、 Ｐ、 Ｗ、ら（１９８
４年）ネイチャー、３１２巻、７２１頁）をホスホトリ
エステル法（Ｍｉｙｏｓｈｉ 、 Ｋ、ら（１９８０）
ヌクレイツク・アシツズ・リサーチ、８巻、５５０７頁
）で合成し、５’−ＯＨを〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰ及びＴ
４ポリヌクレオチドキナーゼで標識して用いた。
約６０万の組換え型ファージクローンから用いた３種の
合成りＮＡプローブすべてとハイブリダイズするファー
ジクローン１１株を得た。このうちの１つのファージク
ローン４−１を種々の制限酵素で切断し、アガロース電
気泳動を行い、ニトロセルロースフィルターにトランス
ファー後、３種の合成りＮＡプローブを用いたサザーン
ハイブリダイゼーシＥ ン（５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｅ、
Ｍ、 （１９７５年）ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 ）
９８巻、５０３頁）を行ったところ、ＢａｍＨＩ ４
．２ Ｋｂ 、 ＥｃｏＲ１２，８ＫｂおよびＳｍａ）
２．７Ｋｂ 断片が３種のプローブとハイブリクイ
ズし、これらの断片の中にＬＴのアミノ酸配列をコード
しているＤＮＡ配列が含まれていることが明らかになっ
た。また、いくつかのファージクローンのＤＮＡの制限
酵素解析の結果、ＬＴ染色体ＤＮＡ配列及び隣接した配
列の制限酵素認識部位は第１図のようにマツプされた。
合成りＮＡプローブすべてとハイブリダイズするファー
ジクローン１１株を得た。このうちの１つのファージク
ローン４−１を種々の制限酵素で切断し、アガロース電
気泳動を行い、ニトロセルロースフィルターにトランス
ファー後、３種の合成りＮＡプローブを用いたサザーン
ハイブリダイゼーシＥ ン（５ｏｕｔｈｅｒｎ、 Ｅ、
Ｍ、 （１９７５年）ジャーナル・オブ・モレキュラ
ー・バイオロジー（Ｊ、 Ｍｏ１． Ｂｉｏｌ、 ）
９８巻、５０３頁）を行ったところ、ＢａｍＨＩ ４
．２ Ｋｂ 、 ＥｃｏＲ１２，８ＫｂおよびＳｍａ）
２．７Ｋｂ 断片が３種のプローブとハイブリクイ
ズし、これらの断片の中にＬＴのアミノ酸配列をコード
しているＤＮＡ配列が含まれていることが明らかになっ
た。また、いくつかのファージクローンのＤＮＡの制限
酵素解析の結果、ＬＴ染色体ＤＮＡ配列及び隣接した配
列の制限酵素認識部位は第１図のようにマツプされた。
実施例２
ＬＴ遺伝子のサブクローニング
ファージクローン４−１のＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨｉ
で切断し、生じた４、２Ｋｂの断片をプラスミドｐＵｏ
９ （Ｖｉｅｉｒａｅ ＪとＭｅｓｓｉｎｇ＋ Ｊ
（１９８２年）ジーン（Ｇｅｎｅ ）、 １９巻、２５
９頁）のＥａｍＨ１部位に挿入しｐＬＴＢ４．２を 作
製した（第２図）。
で切断し、生じた４、２Ｋｂの断片をプラスミドｐＵｏ
９ （Ｖｉｅｉｒａｅ ＪとＭｅｓｓｉｎｇ＋ Ｊ
（１９８２年）ジーン（Ｇｅｎｅ ）、 １９巻、２５
９頁）のＥａｍＨ１部位に挿入しｐＬＴＢ４．２を 作
製した（第２図）。
市販されているｐＵＣ９のプライマー（：！ＡＧＧＡＡ
ＡＣ！ＡＧＣ！’Ｉ’ＡＴＧＡＣ！、 ＡＧＴＣＡＣＧ
ＡＣＧＴＴＧＴＡ （以上宝酒造製）及びＬＴのアミノ
酸−２３から７２８゜７５から８０，１６３から１６８
に対応するオリゴ−マーＡＣＩＣＯＴＴＧＧＧＡＧＧＡ
ＡＧＡＧ、ＴＣＴＡＯＴＣＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣ，ＡＯ
ＴＧＴＯＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＣをプライマーとした
ダイデオキシ法による塩基配列の決定（Ｗａｌｌａｃｅ
、 Ｒ，Ｂ、ら（１９８１年）ジーン、１６巻、２１頁
汀ｐＬＴＢ４．２に実施した。
ＡＣ！ＡＧＣ！’Ｉ’ＡＴＧＡＣ！、 ＡＧＴＣＡＣＧ
ＡＣＧＴＴＧＴＡ （以上宝酒造製）及びＬＴのアミノ
酸−２３から７２８゜７５から８０，１６３から１６８
に対応するオリゴ−マーＡＣＩＣＯＴＴＧＧＧＡＧＧＡ
ＡＧＡＧ、ＴＣＴＡＯＴＣＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣ，ＡＯ
ＴＧＴＯＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＣをプライマーとした
ダイデオキシ法による塩基配列の決定（Ｗａｌｌａｃｅ
、 Ｒ，Ｂ、ら（１９８１年）ジーン、１６巻、２１頁
汀ｐＬＴＢ４．２に実施した。
その結果ＬＴの５′側は、
ＧＧＡＴＣＣ！０ＣＧＧＯＣＴＧＣＩＣＴＧＧＧＣＩＣ
ＴＧＧＧＣＴＣＯＣＯＡＴＧＡＣＡＣＯＡＯＣＴＧＡＡ
ＯＧＴ・・・ＭｅｔＴｈｒＰｒｏＰｒｏＧｌｕＡｒｇ−
の配列を有し、３′側は、 ＬｅｕＳｅｒＳｅｒＧ１ｎＬｙｓＭｅｔＶａｌＴｙｒＰ
ｒｏＧ１ｙＧＡＡＡＡＡＴＯＯＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡ
ＡＴＡＡＴＴＧＡＴＴＴＯＡＡＧＡＣＣ’Ｉ’ＴＣＴＯ
ＣＣＯＡＴＴＣ’Ｉ’ＧＣＣＴＯＣＡＴ’ｌ’ＯＴＧＡ
ＣｊＯＡＴ’ｆ’ＴＣｊＡＧＧＧＧＴＯＧＴＣＡＯＯＡ
Ｏ（ＥＴＯ’ｌ’ＣｏＴＴ’Ｉ’ＧＧＣＣＡＴＴＯＯＡ
ＡＯＡＧＯＴＯＡＡＧＴＣＴＴＣＣ！Ｃ！ＴＧＡＴＯＡ
ＡＧＴＣＡＯＯＧＧＡＧＯＴＴＴＯＡＡＡＧＡＡＧＧＡ
Ａ’ｒＴＣＴＡＧＧＣ！ＡＴＣＯＣ！ＡＧＧＧＧＡＣＣ
Ｃ！ＡＣＡＣＴＯＣＣＴＧＡＡＣＣＡＴＯＣＣＴＧＡＴ
ＧＴＣＴＧＴＯＴＧＧＯＴＧＡＧＧＡＴＴ’ｌ’ＯＡＡ
ＧＣＯＴＧＣ！Ｃ！ＴＡＧＧＡＡＴＴＯＣＣＡＧ の配列を有していることが分った。． 実施例３ ｐｓＶｅｓｍａｌＬＴ． ｐｓＶｐＴＫＬＴ， ｐｓＶ
２ＬＬＴ及びｐｓ’ｌＬＬＴ （Ｄ作製 ＳＶ４ ０の初期改伝子プロモーター領域の配列上ＬＴ
染色体ＤＮＡ配列上が接続した配列を持つプラスミドで
あるｐｓＶｅｓｍａ ＩＬＴはｐＬＴＢ４．２．ｐｓＶ
２ｇＰｔ及びｐＳ Ｖ３ ｇｐｔ （ Ｍｕｌｌｉｇａ
ｎ． Ｒ．Ｃ．とＢｅｒｇ．Ｐ．（１９８０年）サイエ
ンス，２０９巻，１４２２頁）を出発材料として、第３
図一＜ａ）． −（ｂ）に示した手順により作製した。
ＴＧＧＧＣＴＣＯＣＯＡＴＧＡＣＡＣＯＡＯＣＴＧＡＡ
ＯＧＴ・・・ＭｅｔＴｈｒＰｒｏＰｒｏＧｌｕＡｒｇ−
の配列を有し、３′側は、 ＬｅｕＳｅｒＳｅｒＧ１ｎＬｙｓＭｅｔＶａｌＴｙｒＰ
ｒｏＧ１ｙＧＡＡＡＡＡＴＯＯＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡ
ＡＴＡＡＴＴＧＡＴＴＴＯＡＡＧＡＣＣ’Ｉ’ＴＣＴＯ
ＣＣＯＡＴＴＣ’Ｉ’ＧＣＣＴＯＣＡＴ’ｌ’ＯＴＧＡ
ＣｊＯＡＴ’ｆ’ＴＣｊＡＧＧＧＧＴＯＧＴＣＡＯＯＡ
Ｏ（ＥＴＯ’ｌ’ＣｏＴＴ’Ｉ’ＧＧＣＣＡＴＴＯＯＡ
ＡＯＡＧＯＴＯＡＡＧＴＣＴＴＣＣ！Ｃ！ＴＧＡＴＯＡ
ＡＧＴＣＡＯＯＧＧＡＧＯＴＴＴＯＡＡＡＧＡＡＧＧＡ
Ａ’ｒＴＣＴＡＧＧＣ！ＡＴＣＯＣ！ＡＧＧＧＧＡＣＣ
Ｃ！ＡＣＡＣＴＯＣＣＴＧＡＡＣＣＡＴＯＣＣＴＧＡＴ
ＧＴＣＴＧＴＯＴＧＧＯＴＧＡＧＧＡＴＴ’ｌ’ＯＡＡ
ＧＣＯＴＧＣ！Ｃ！ＴＡＧＧＡＡＴＴＯＣＣＡＧ の配列を有していることが分った。． 実施例３ ｐｓＶｅｓｍａｌＬＴ． ｐｓＶｐＴＫＬＴ， ｐｓＶ
２ＬＬＴ及びｐｓ’ｌＬＬＴ （Ｄ作製 ＳＶ４ ０の初期改伝子プロモーター領域の配列上ＬＴ
染色体ＤＮＡ配列上が接続した配列を持つプラスミドで
あるｐｓＶｅｓｍａ ＩＬＴはｐＬＴＢ４．２．ｐｓＶ
２ｇＰｔ及びｐＳ Ｖ３ ｇｐｔ （ Ｍｕｌｌｉｇａ
ｎ． Ｒ．Ｃ．とＢｅｒｇ．Ｐ．（１９８０年）サイエ
ンス，２０９巻，１４２２頁）を出発材料として、第３
図一＜ａ）． −（ｂ）に示した手順により作製した。
すなわちｐＳＶ８ｇｐｔをＨｉｎｄ ｌで切断し、最も
大きいＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ’Ｊガーゼで環状化しｐ
ＨＩを作製した。次にｐＨＩのＰｖｕ１部位をＳａｌ
ｌリンカーを用いてＳａ１１部位に改め、ｐＨＩＩを作
製した。更にｐＨＩＩのＨｉｎｄｌｌ１部位をＨｉｎｄ
ｍ−Ｓ ｍａ Ｉ アダプターを用いてＳｍａ｝部位
を導入し、ｐＩ｛Ｓｍａｌを作製した。ｐＨｓｍａｌを
Ｓａｌ Ｉ， ＥｃｏＲ ｌ切断しｐＳＶ２ｇｐｔのＢ
ａｍＨＩ部位をＥａｍＨｌで切断後、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ（ Ｋｌｅｎｏｗ ）で平滑末端にしＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで環状化して作製したｐＳＩを同じ＜Ｓａｌｌ，
ＥｃｏＲＩ切断し、アンピシリン耐性遺伝子を持つＤＮ
Ａ断片とＴ ４ ＤＮＡ ！Ｊガーゼで結合させｐｓＶ
ｅｓｍａＩをツ＜ッた。次にｐＬＴＢ４．２をＳｍａｒ
で切断し、ＬＴ遺伝子配列を持つＤＮＡ断片を得、これ
をＳｍａｉ切断したｐｓＶｅｓｍａＩに導入し、ｐｓＶ
ｅｓ ｍａ Ｉ ：Ｌ Ｔを作製した。
大きいＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡ’Ｊガーゼで環状化しｐ
ＨＩを作製した。次にｐＨＩのＰｖｕ１部位をＳａｌ
ｌリンカーを用いてＳａ１１部位に改め、ｐＨＩＩを作
製した。更にｐＨＩＩのＨｉｎｄｌｌ１部位をＨｉｎｄ
ｍ−Ｓ ｍａ Ｉ アダプターを用いてＳｍａ｝部位
を導入し、ｐＩ｛Ｓｍａｌを作製した。ｐＨｓｍａｌを
Ｓａｌ Ｉ， ＥｃｏＲ ｌ切断しｐＳＶ２ｇｐｔのＢ
ａｍＨＩ部位をＥａｍＨｌで切断後、ＤＮＡポリメラー
ゼＩ（ Ｋｌｅｎｏｗ ）で平滑末端にしＴ４ＤＮＡリ
ガーゼで環状化して作製したｐＳＩを同じ＜Ｓａｌｌ，
ＥｃｏＲＩ切断し、アンピシリン耐性遺伝子を持つＤＮ
Ａ断片とＴ ４ ＤＮＡ ！Ｊガーゼで結合させｐｓＶ
ｅｓｍａＩをツ＜ッた。次にｐＬＴＢ４．２をＳｍａｒ
で切断し、ＬＴ遺伝子配列を持つＤＮＡ断片を得、これ
をＳｍａｉ切断したｐｓＶｅｓｍａＩに導入し、ｐｓＶ
ｅｓ ｍａ Ｉ ：Ｌ Ｔを作製した。
用いたＳａｌｉリンカーとｓｍａＩアダプターは、それ
ぞれｄ（ｐＧＧＴＣＧＡＣ！Ｇ！）及びｄ （ｐＡＧＯ
’ｌ”ｃＯ（！ＧＧＧ）の配列を持つものを使用した。
ぞれｄ（ｐＧＧＴＣＧＡＣ！Ｇ！）及びｄ （ｐＡＧＯ
’ｌ”ｃＯ（！ＧＧＧ）の配列を持つものを使用した。
またＤＮＡポリメラーゼＩはＫｌｅｎｏｗフラグメント
を用いた。
を用いた。
ヘルペスシンプレックスウィルスタイプ１のチミジンキ
ナーゼのプロモーター領域の配列上ＬＴ遺伝子が接続し
た配列を持つプラスミドであるｐｓＴｐＴＫＬＴ は、
ｐＬＴＢ４．２．ｐＨｓＶ１０６（ＭｃＫｎｉｇｈｔ．
Ｓ． Ｌ．とＧａｂｉｓ， Ｅ． Ｒ− （ １ ９
８ ０年）ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，８巻
，５９３１頁）及びｐｓＶｅｓｍａＩを出発材料にして
第４図に示した方法により作製した。すなわちｐＬＴＢ
４．２に含まれるＬ’ｒ遺伝子ＢａｍＨｌ−Ｓｍａｌ断
片をｐＨＳＶ１０６の：ｓｇｌ Ｉ［ − Ｓｍａ Ｉ
部位に挿入しｐＨｓＶＬＴを作製した。次にｐＨＳＶＬ
ＴからＴＫプロモーターのついたＬＴ遺伝子ＢａｍＨＩ
−Ｓｍａ Ｉ断片をｐｓＶｅｓｍａＩのＢａｍＨ Ｊ
−Ｓｍａ １部位に導入しｐｓＶｐＴＫＬＴ を作
製した。
ナーゼのプロモーター領域の配列上ＬＴ遺伝子が接続し
た配列を持つプラスミドであるｐｓＴｐＴＫＬＴ は、
ｐＬＴＢ４．２．ｐＨｓＶ１０６（ＭｃＫｎｉｇｈｔ．
Ｓ． Ｌ．とＧａｂｉｓ， Ｅ． Ｒ− （ １ ９
８ ０年）ヌクレイック・アシッズ・リサーチ，８巻
，５９３１頁）及びｐｓＶｅｓｍａＩを出発材料にして
第４図に示した方法により作製した。すなわちｐＬＴＢ
４．２に含まれるＬ’ｒ遺伝子ＢａｍＨｌ−Ｓｍａｌ断
片をｐＨＳＶ１０６の：ｓｇｌ Ｉ［ − Ｓｍａ Ｉ
部位に挿入しｐＨｓＶＬＴを作製した。次にｐＨＳＶＬ
ＴからＴＫプロモーターのついたＬＴ遺伝子ＢａｍＨＩ
−Ｓｍａ Ｉ断片をｐｓＶｅｓｍａＩのＢａｍＨ Ｊ
−Ｓｍａ １部位に導入しｐｓＶｐＴＫＬＴ を作
製した。
またＳＶ４ ０の後期遺伝子プロモーター領域の配列上
ＬＴ遺伝子が接続した配列を持つプラスミトテあるｐｓ
Ｖ２ＬＬＴ及びｐｓＶ３ＬＬＴはｐＬＴＢ４．２，ｐＳ
Ｖ２ｇｐｔ及びｐｓＶ３ｇｐｔを出発材料にして、第５
図，第６図に示した方法により作製した。すなわちｐＬ
ＴＢ４．２に含まれるＬＴ遺伝子Ｓｍａ Ｉ −Ｓｍａ
Ｉ ２． ５ Ｋｂ断片をｐＳＶ２ｇｐｔのＰｖｕ１
部位に結合させｐｓＶ２ＬＬＴを作製した。
ＬＴ遺伝子が接続した配列を持つプラスミトテあるｐｓ
Ｖ２ＬＬＴ及びｐｓＶ３ＬＬＴはｐＬＴＢ４．２，ｐＳ
Ｖ２ｇｐｔ及びｐｓＶ３ｇｐｔを出発材料にして、第５
図，第６図に示した方法により作製した。すなわちｐＬ
ＴＢ４．２に含まれるＬＴ遺伝子Ｓｍａ Ｉ −Ｓｍａ
Ｉ ２． ５ Ｋｂ断片をｐＳＶ２ｇｐｔのＰｖｕ１
部位に結合させｐｓＶ２ＬＬＴを作製した。
次にｐｓＶ２ＬＬＴをＢａｍＨＪで部分切断し、そこへ
ｐＳＶ３ｇｐｔの持つＴ抗原遺伝子ＢａｍＨｌ断片を結
合させｐｓＶ３ＬＬＴを作製した。
ｐＳＶ３ｇｐｔの持つＴ抗原遺伝子ＢａｍＨｌ断片を結
合させｐｓＶ３ＬＬＴを作製した。
実施例４
ｐｓＶｅｓｍａｌＬＴ．ｐｓＶｐＴＫＬＴ，ｐｓＶ２Ｌ
ＬＴ及びｐｓＶ８ＬＬＴの培養細胞への導入とＬＴの産
生形質発現ベクターｐｓＶｅｓｍａ ＩＬＴ． ｐｓＶ
ｐＴＫＬＴ．ｐｓＶ２ＬＬＴ及びｐｓＶ８ＬＬＴに含ま
れるＬＴ遺伝子の発現を調べる為に、揮々の動物培養細
胞へＷｉｇｌｅｒらの方法（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７７
年）セル。
ＬＴ及びｐｓＶ８ＬＬＴの培養細胞への導入とＬＴの産
生形質発現ベクターｐｓＶｅｓｍａ ＩＬＴ． ｐｓＶ
ｐＴＫＬＴ．ｐｓＶ２ＬＬＴ及びｐｓＶ８ＬＬＴに含ま
れるＬＴ遺伝子の発現を調べる為に、揮々の動物培養細
胞へＷｉｇｌｅｒらの方法（Ｗｉｇｌｅｒら（１９７７
年）セル。
１１巻、２２３頁）に準じてプラスミドの導入を行った
。プラスミド−リン酸カルシウム共沈澱物を予め１０％
牛新生児血清を含むイーグルＭＥＭ培地で生育させた細
胞（２Ｘ１０５細胞／ ８ ｙｔｔｔ培地／直径６（７
）培養皿）に加え、１５時間後に培地を更新し、培養を
つづけ４８時間後の培地に含まれるＬＴを、Ｌ９２９細
胞を標的細胞とする細胞致死効果で測定した（ Ｒｕｆ
ｆ、 Ｍ−Ｒ−とＧｉｆｆｏｒｄ。
。プラスミド−リン酸カルシウム共沈澱物を予め１０％
牛新生児血清を含むイーグルＭＥＭ培地で生育させた細
胞（２Ｘ１０５細胞／ ８ ｙｔｔｔ培地／直径６（７
）培養皿）に加え、１５時間後に培地を更新し、培養を
つづけ４８時間後の培地に含まれるＬＴを、Ｌ９２９細
胞を標的細胞とする細胞致死効果で測定した（ Ｒｕｆ
ｆ、 Ｍ−Ｒ−とＧｉｆｆｏｒｄ。
Ｇ、Ｅ、（１９８１午）リンホカインズ、２巻、２３５
頁）。すなわち９６穴マルチデイツシユに２×１０４細
胞／ｗｅｌｌ／ １００μｅ培地で１日培養後、培養液
を除き、アクチノマイシンＤ １μｆ ／ｍｌ、５％牛
脂児血清を含むイーグルＭＥＭ培地で種々の濃度に希釈
したサンプルを１００μｌ加え、２０時間後の細胞の変
性致死効果を測定した。ＬＴ１ユニットは５０％の致死
率を与える濃度とした。
頁）。すなわち９６穴マルチデイツシユに２×１０４細
胞／ｗｅｌｌ／ １００μｅ培地で１日培養後、培養液
を除き、アクチノマイシンＤ １μｆ ／ｍｌ、５％牛
脂児血清を含むイーグルＭＥＭ培地で種々の濃度に希釈
したサンプルを１００μｌ加え、２０時間後の細胞の変
性致死効果を測定した。ＬＴ１ユニットは５０％の致死
率を与える濃度とした。
下表に示すようにｐｓＶｅｓｍａＩＬＴ、ｐｓＶｐＴＫ
ＬＴ。
ＬＴ。
ｐｓＶ２ＬＬＴ或イハ、ｐｓＶ３ＬＬＴを導入した全て
の培養細胞でＬＴの発現がみられた。また全ての培養細
胞でｐＳＶ２ＬＬＴよりもｐｓＶ３ＬＬＴｃ７）発現が
高かった。
の培養細胞でＬＴの発現がみられた。また全ての培養細
胞でｐＳＶ２ＬＬＴよりもｐｓＶ３ＬＬＴｃ７）発現が
高かった。
以下余白
実施例５
ＬＴの通常培地及び無血清培地での生産実施例４でｐｓ
ＶｅＳｍａ［ＬＴ、ｐｓＶｐＴＫＬＴ或いはｐｓＶ’３
ＬＬ’ｒ を導入したＢ）ｆＫ−２１（Ｇ！−１３）
の培地を１０％牛脂児血清、２５μｆ／ｍｔＥコフェノ
ール酸、２５０μｆ／＃Ｉｌキサンチンを含むＭＥＭ、
培地に更新し、ミコフェノール酸耐性株を分離した。ミ
コフェノール酸耐性株を２４穴マルチデイツシユの底面
全面に生育させ、５％牛脂児血清（Ｆｅ２）を含むＭＥ
Ｍ培地と牛胎児血清を全く含まないＭＥＭ培地で２４時
間培養し、培地中に含まれるＬＴ活性を測定した。下表
に示すように、分離された細胞株は血清の有無にかかわ
らずＬＴを生産した。
ＶｅＳｍａ［ＬＴ、ｐｓＶｐＴＫＬＴ或いはｐｓＶ’３
ＬＬ’ｒ を導入したＢ）ｆＫ−２１（Ｇ！−１３）
の培地を１０％牛脂児血清、２５μｆ／ｍｔＥコフェノ
ール酸、２５０μｆ／＃Ｉｌキサンチンを含むＭＥＭ、
培地に更新し、ミコフェノール酸耐性株を分離した。ミ
コフェノール酸耐性株を２４穴マルチデイツシユの底面
全面に生育させ、５％牛脂児血清（Ｆｅ２）を含むＭＥ
Ｍ培地と牛胎児血清を全く含まないＭＥＭ培地で２４時
間培養し、培地中に含まれるＬＴ活性を測定した。下表
に示すように、分離された細胞株は血清の有無にかかわ
らずＬＴを生産した。
第１図は、ＬＴ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片をクロー
ニングした組換えファージＤＮＡを示す模式図、第２図
はプラスミドｐＬＴＢ４．２を示す模式図、第３図−（
ａ）はプラスミドｐｓＶｅｓｍａ Ｉ作製の模式図、第
３図−〇）はプラスミドｐｓＶｅｓｍａＩＬＴ作製の模
式図、第４図はプラスミドｐｓＶｐＴＫＬＴ作製の模式
図、第５図はプラスミドｐＳＶ２ＬＬＴ作製の模式図、
第６図はプラスミドｐｓＶ３ＬＬＴ作製の模式図である
。 第１図中、Ｅは制限酵素ＥｃｏＲ１の認識部位をＢは制
限酵素ＢａｍＨＩの認識部位を示す。 第２〜６図中、Ｓｍａｆ、Ａｖａｌ、ＢａｍＨｌ、Ａｃ
ｃｌＳｃａ（、ＥｃｏＲｌ、 ５ａｃ１． Ｈｉｎｄｌ
、 Ｐｖｕｌ、 Ｓａｌ ｌ及びＢｇｌ…は夫々の制限
酵素の認識部位を示す。 ＨｕＬＴ はヒトＬＴ遺伝子、ｐＵｃ９はベクタープ
ラスミドｐＵ０９由来の領域、Ａｍｐγはアンピシリン
耐性遺伝子、Ｅ ＣＯｇｐｔは大腸菌のグアニンホスホ
リボシルトランスフェラーゼ遺伝子、５Ｖ（−はＳＶ４
０ウィルスの初期遺伝子プロモーター領域、Ｔ−ａｇは
ＳＶ４０のＴ−抗原遺伝子、ｐＴＫはチミジンキナーゼ
のプロモーター領域、ＴＫはチミジンキナーゼ遺伝子、
（Ｐｖｕ…／Ｓｍａｌ） は制限酵素Ｐｖｕｌ切断部
位とＳｍａ Ｉ切断部位を結６したものを示す。
ニングした組換えファージＤＮＡを示す模式図、第２図
はプラスミドｐＬＴＢ４．２を示す模式図、第３図−（
ａ）はプラスミドｐｓＶｅｓｍａ Ｉ作製の模式図、第
３図−〇）はプラスミドｐｓＶｅｓｍａＩＬＴ作製の模
式図、第４図はプラスミドｐｓＶｐＴＫＬＴ作製の模式
図、第５図はプラスミドｐＳＶ２ＬＬＴ作製の模式図、
第６図はプラスミドｐｓＶ３ＬＬＴ作製の模式図である
。 第１図中、Ｅは制限酵素ＥｃｏＲ１の認識部位をＢは制
限酵素ＢａｍＨＩの認識部位を示す。 第２〜６図中、Ｓｍａｆ、Ａｖａｌ、ＢａｍＨｌ、Ａｃ
ｃｌＳｃａ（、ＥｃｏＲｌ、 ５ａｃ１． Ｈｉｎｄｌ
、 Ｐｖｕｌ、 Ｓａｌ ｌ及びＢｇｌ…は夫々の制限
酵素の認識部位を示す。 ＨｕＬＴ はヒトＬＴ遺伝子、ｐＵｃ９はベクタープ
ラスミドｐＵ０９由来の領域、Ａｍｐγはアンピシリン
耐性遺伝子、Ｅ ＣＯｇｐｔは大腸菌のグアニンホスホ
リボシルトランスフェラーゼ遺伝子、５Ｖ（−はＳＶ４
０ウィルスの初期遺伝子プロモーター領域、Ｔ−ａｇは
ＳＶ４０のＴ−抗原遺伝子、ｐＴＫはチミジンキナーゼ
のプロモーター領域、ＴＫはチミジンキナーゼ遺伝子、
（Ｐｖｕ…／Ｓｍａｌ） は制限酵素Ｐｖｕｌ切断部
位とＳｍａ Ｉ切断部位を結６したものを示す。
Claims (19)
- （１）ヒト・リンホトキシンをコードする染色体ＤＮＡ
配列。 - （２）ヒト・リンホトキシンをコードする染色体ＤＮＡ
配列と動物培養細胞で機能するプロモーター領域の配列
とが接続したＤＮＡ配列。 - （３）プロモーター領域が構成的な発現をしている遺伝
子のプロモーター領域である特許請求の範囲第２項記載
のＤＮＡ配列。 - （４）プロモーター領域がＳＶ４０の初期遺伝子或いは
単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ− I ）のチミジンキナ
ーゼ遺伝子のプロモーター領域である特許請求の範囲第
２項記載のＤＮＡ配列。 - （５）プロモーター領域がＳＶ４０の後期遺伝子のプロ
モーター領域である特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡ
配列。 - （６）ＤＮＡ配列がＳＶ４０のＴ抗原遺伝子配列と同一
ＤＮＡ配列上に存在する特許請求の範囲第５項記載のＤ
ＮＡ配列。 - （７）動物培養細胞での選択マーカー遺伝子が同一ＤＮ
Ａ配列に存在する特許請求の範囲第２項乃至第６項の何
れかの項記載のＤＮＡ配列。 - （８）微生物での選択マーカー遺伝子及び微生物でのＤ
ＮＡ複製起点が同一ＤＮＡ配列に存在する特許請求の範
囲第２項乃至第７項の何れかの項記載のＤＮＡ配列。 - （９）ＤＮＡ配列がプラスミドｐＳＶｅＳｍａ I ＬＴ
、ｐＳＶｐＴＫＬＴ、ｐＳＶ２ＬＬＴ或いはＰＳＶ３Ｌ
ＬＴのＤＮＡ配列である特許請求の範囲第２項乃至第８
項の何れかの項記載のＤＮＡ配列。 - （１０）ヒト・リンホトキシンをコードする染色体ＤＮ
Ａ配列と動物細胞で機能するプロモーター領域の配列と
が接続したＤＮＡ配列を有するＤＮＡによって形質転換
された動物培養細胞。 - （１１）細胞の由来が脊椎動物である特許請求の範囲第
１０項記載の動物培養細胞。 - （１２）細胞の由来が哺乳類動物である特許請求の範囲
第１０項記載の動物培養細胞。 - （１３）細胞の由来がヒトである特許請求の範囲第１０
項記載の動物培養細胞。 - （１４）細胞がＳＶ４０で形質転換された細胞である特
許請求の範囲第１０項乃至第１３項の何れかの項記載の
動物培養細胞。 - （１５）細胞がＣＨＯ−Ｋ１、Ｖｅｒｏ、Ｗ I −２６
ＶＡ４、ＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）或いはＬ９２９であ
る特許請求の範囲第１０項記載の動物培養細胞。 - （１６）ヒト・リンホトキシンをコードする染色体ＤＮ
Ａ配列と動物培養細胞で機能するプロモーター領域の配
列とが接続したＤＮＡ配列を有するＤＮＡによって形質
転換された動物培養細胞を培養して、ヒト・リンホトキ
シンを生成せしめ、これを採取することを特徴とするヒ
ト・リンホトキシンの製造方法。 - （１７）動物培養細胞を培養液中で培養し、培養液から
ヒト・リンホトキシンを回収する特許請求の範囲第１６
項記載の製造方法。 - （１８）培養液が無血清培養液である特許請求の範囲第
１７項記載の製造方法。 - （１９）ヒト・リンホトキシンをコードする染色体ＤＮ
Ａ配列と動物培養細胞で機能するプロモーター領域とが
接続したＤＮＡ配列を有するＤＮＡを含有する微生物。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60147371A JPH0834725B2 (ja) | 1985-07-04 | 1985-07-04 | リンホトキシン |
| AU59453/86A AU603768B2 (en) | 1985-07-04 | 1986-07-01 | Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, lymphotoxin resistant cell, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin |
| CA000512923A CA1302921C (en) | 1985-07-04 | 1986-07-02 | Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, lymphotoxin resistant cell, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin |
| US06/882,109 US4988624A (en) | 1985-07-04 | 1986-07-03 | Lymphotoxin DNA, lymphotoxin expression vector |
| DE8686109069T DE3686909T2 (de) | 1985-07-04 | 1986-07-03 | Lymphotoxin-dns, lymphotoxin-expressionsvektor, lymphotoxin-expressionsvektor enthaltender transformant und verfahren zur herstellung von lymphotoxin. |
| EP86109069A EP0207518B1 (en) | 1985-07-04 | 1986-07-03 | Lymphotoxin dna, lymphotoxin expression vector, transformant with lymphotoxin expression vector and process for preparing lymphotoxin |
| JP4306012A JP2645785B2 (ja) | 1985-07-04 | 1992-10-19 | ヒト・リンホトキシンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP60147371A JPH0834725B2 (ja) | 1985-07-04 | 1985-07-04 | リンホトキシン |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4306012A Division JP2645785B2 (ja) | 1985-07-04 | 1992-10-19 | ヒト・リンホトキシンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6211095A true JPS6211095A (ja) | 1987-01-20 |
| JPH0834725B2 JPH0834725B2 (ja) | 1996-03-29 |
Family
ID=15428715
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP60147371A Expired - Fee Related JPH0834725B2 (ja) | 1985-07-04 | 1985-07-04 | リンホトキシン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0834725B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993014203A1 (en) * | 1992-01-21 | 1993-07-22 | Tsumura & Co. | Lymphotoxins, expression vector therefor, and production of lymphotoxins with said vector |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56160993A (en) * | 1980-04-07 | 1981-12-11 | Univ California | Cloned dna segment derived from human genom |
-
1985
- 1985-07-04 JP JP60147371A patent/JPH0834725B2/ja not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS56160993A (en) * | 1980-04-07 | 1981-12-11 | Univ California | Cloned dna segment derived from human genom |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1993014203A1 (en) * | 1992-01-21 | 1993-07-22 | Tsumura & Co. | Lymphotoxins, expression vector therefor, and production of lymphotoxins with said vector |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0834725B2 (ja) | 1996-03-29 |
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