JP2645785B2 - ヒト・リンホトキシンの製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒト・リンホトキシン
遺伝子を含むＤＮＡ配列及びそのＤＮＡ配列を有するＤ
ＮＡによって形質転換された培養細胞を利用したヒト・
リンホトキシンの製造法に係る。

【０００２】リンホトキシン（ＬＴ）は直接あるいは間
接的に癌細胞のみを攻撃し、壊死させる作用を持ち（Ev
ans C.H.ら（１９７７年）キャンサー・リサーチ(Cance
r Res.) ，３７巻，８９８頁）、制癌剤としての臨床応
用が期待されている。

【０００３】

【従来の技術】リンホトキシン（ＬＴ）は、ヒト或いは
マウス等の動物のリンパ球細胞をフイトヘマグルチニ
ン、コンカナバリンＡ等のレクチン或いはフオルボール
エステルで刺激することにより誘導されるリンホカイン
の一種である（Devlin, J.J.（１９８４年）リンホカイ
ンズ(Lymphokines) ，９巻，３１３頁）。代表的生産細
胞としてヒトではヒツジ赤血球とのロゼット形成で選択
されたＴ細胞あるいはＢ細胞株ＲＤＭＩ１７８８（Agga
rwal, B.B.ら（１９８４年）ザ・ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー(J. Biol. Chem.)，２５９
巻，６８６頁）が知られている。ＬＴは糖蛋白であるが
（Toth, M.K.とGranger, G.A. （１９７９年），モリキ
ュラー・イミュノロジー(Mol. Immunol.) ，１６巻，６
７１頁）、種々の形態構成をとりうる。ＬＴの蛋白化学
的研究はいくつかのグループで研究されているが、分子
量約２０，０００の成分がその最小単位であり、その単
位成分が会合したものや他の成分との複合体があるとさ
れている（Aggarwal, B.B.ら（１９８４年）ザ・ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー，２５９
巻，６８６頁）。

【０００４】ＬＴは、フオルボールエステル，マイトー
ジェン等で刺激されたリンパ球が産生することが知られ
ているが、このような生産法では生産されるＬＴは極め
て微量であり、また大量の新鮮なリンパ球が必要となり
量産には不向きである。また株化されたリンパ球由来の
細胞（株化細胞）をマイトージェン等で刺激するとＬＴ
が誘導的に産生されることが知られているが、生産能は
用いる細胞の能力に大きく依存しており、やはり量産に
適した系とは言えない。近年ＬＴのｃＤＮＡがクローニ
ングされ、大腸菌でＬＴ様蛋白の生産が可能になった
（Gray, P.W.ら（１９８４年）ネイチャー(Nature)，３
１２巻，７２１頁）。しかし微生物でつくられるＬＴ様
蛋白は、動物細胞と微生物との蛋白合成機構が多少異な
る為に、つくられる蛋白のアミノ末端が天然のそれと異
なる場合が多い。更に微生物によってつくられるＬＴ様
蛋白は、天然のＬＴが糖鎖を有しているのに対し、糖鎖
が結合していない。このように微生物の蛋白合成系によ
ってつくられたＬＴ様蛋白と天然のＬＴとは物質として
明らかに異なり、治療薬として長期間使用したり、頻回
使用する場合には、抗原抗体反応の問題が懸念される。

【０００５】

【発明が解決しようとする問題点】蛋白のアミノ末端が
天然のＬＴと同じで且つ糖鎖を有するＬＴを生産する為
には、動物培養細胞を宿主とした遺伝子組換えの手法の
適用が考えられる。この場合、単にＬＴ遺伝子を動物培
養細胞に導入してもＬＴの産生を観ることはできないと
推定される。すなわちＬＴは誘導蛋白であり、その発現
は遺伝子のレベルで制限されているからである。従って
遺伝子導入の手法により、動物培養細胞に効果的なＬＴ
産生能を付与する為には、用いる遺伝子に改良を加える
必要がある。

【０００６】高等生物の多くの蛋白は、核ＤＮＡ配列上
に、いくつかに分断されてコードされていることが知ら
れている。成熟型のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）
の配列をコードしているＤＮＡ配列はエクソン(exon)，
分断している配列は介在配列またはイントロン(intron)
と呼ばれている。イントロンの生物学的な意義や機能は
現在不明な点も多いが、オバルブミン（Wickens, M.P.
ら（１９８０年）ネイチャー，２８５巻，６２８頁）や
ウイルス蛋白（Lai, C-J. ら（１９７９年）プロシーデ
ィングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・
サイエンス・ユーエスエー（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA），７６巻，７１頁）のイントロンを含まない遺伝子
配列は、イントロンを含む配列に比べ、導入した動物細
胞内での蛋白の生産が極めて少ないことが知られてい
る。また、イントロンを欠落させたＳＶ４０の遺伝子に
β−globin遺伝子のイントロンを加えることにより、安
定なｍＲＮＡの蓄積が起こる事が知られた（Hamer, D.
H. ら（１９７９年）セル(Cell)，１８巻，１２９９
頁）。

【０００７】遺伝子から転写された初期ＲＮＡからのイ
ントロン部分の配列の除去をスプライシング(Splicing)
と呼ぶが、スプライシングは安定なｍＲＮＡの蓄積ある
いはｍＲＮＡの核から細胞質への移行の為に必要な事象
と推定される。

【０００８】正常で機能のある蛋白の発現の為には、イ
ントロンの正しい位置でのスプライシングが不可欠であ
るが、インシュリン遺伝子とシミアンウイルス４０（Ｓ
Ｖ４０）のプロモーター領域を結合し、ＣＯＳ細胞に導
入した場合の異常なスプライシングが報告されている
（Laub, O.ら（１９８３年）ザ・ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー，２５８巻，６０４３
頁）。またアミラーゼの発現においては、組織特異的な
スプライシングが存在し、同一の遺伝子から２つの異っ
たスプライシングを経て、唾液腺アミラーゼと肝臓アミ
ラーゼが合成されることが知られている（Young, R.A.
ら（１９８１年）セル，２３巻，４５１頁）。また、Ｓ
Ｖ４０（Berk, A.J.ら（１９７８年）プロシーディング
ズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンス・ユーエスエー，７５巻，１２７４頁），アデノウ
イルス（Chow, L.T.（１９７７年）セル，１２巻，１
頁）等においても、同一の遺伝子から異ったスプライシ
ングを経て複数のｍＲＮＡ及び蛋白が合成されている。
従って、動物培養細胞にイントロンを含むＬＴ遺伝子を
導入し、ＬＴを産生するには正常なスプライシングが起
こる必要があるが、本発明者らはＬＴをコードしている
染色体ＤＮＡ配列に動物培養細胞で機能する、すなわち
ｍＲＮＡ合成を開始する事が可能なプロモーター領域の
ＤＮＡ配列を結合させ、種々の動物培養に導入した場
合、正常にスプライシングが起こり、ＬＴが培地中に著
量分泌される事を見い出した。

【０００９】ＬＴは糖蛋白である。現在ＬＴの糖鎖の構
造については不明な点が多く、ヒト以外の細胞でつくら
れたＬＴとヒト由来細胞でつくられたＬＴの糖鎖の構造
及び抗原性に違いがあるかは不明である。しかしヒト由
来細胞でつくられるＬＴは、天然のＬＴと極めて類似し
ているものと考えられ、ヒト以外の細胞でつくられたＬ
Ｔに比して、より安全性が高いと考えられる。またヒト
以外の細胞でＬＴをつくる場合は、ＬＴの製品中にヒト
以外の生物の蛋白等の構成成分や分泌成分が混入する事
が考えられ、治療薬としての長期間の投与におけるアレ
ルギー反応、ショック等の問題が予想されるが、ヒト由
来細胞を用いて作った製品中には本質的にヒトの成分、
すなわちヒト血液中に存在している物質以外は含まれず
生産物の安全性の向上が期待される。

【００１０】本発明により、安全性の高いＬＴを大量に
供給する事が可能になるものと考えられる。以下に、本
発明を更に詳細に説明する。

【００１１】

【問題点を解決するための手段】ＬＴをコードしている
染色体遺伝子領域は、本発明者らのクローニング及び解
析の結果初めて明らかになり、図１に示したような制限
酵素認識部位を有している。ＬＴ染色体ＤＮＡ配列とは
ＬＴの蛋白合成の開始のアミノ酸であるメチオニンのコ
ドンＡＴＧから終止コドンＴＡＧまでの塩基配列を含む
ＤＮＡ配列で、例えば図２に示したプラスミドｐＬＴＢ
４．２に含まれるＢａｍＨＩ４．２Ｋｂ（キロベース）
の配列をさす。

【００１２】ＬＴをコードする染色体ＤＮＡ配列は、ヒ
トＤＮＡからクローン化される。ヒトＤＮＡは、例えば
ヒト白血球細胞培養細胞或いは組織などを用い、Blinら
の方法（Blin, N.ら（１９７６年）ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ(Nucleic Acids Res.)，３巻，２３０３
頁）により調製される。ＬＴ遺伝子のクローニングに用
いるベクターはCharon２８に代表されるλファージベク
ター、ｐＢＲ３２２に代表されるプラスミドベクター或
いはｐＨＣ７９に代表されるコスミッドなどが利用でき
るが、一般的には、高率で長鎖のＤＮＡ断片をクローニ
ングできるλファージをベクターとして用いる遺伝子操
作法が用いられる。すなわちヒト高分子ＤＮＡを適切な
制限酵素で切断後、λファージＤＮＡの置換可能領域の
代りに挿入し、リコンビナントファージＤＮＡをつく
る。次にインビトロパッケージングの手法を用い、感染
性のあるファージ粒子を作製する。次に宿主大腸菌とと
もにプレートにまき、組換え型ファージのプラークを形
成させる（Enquist, L. ら（１９７９年）メソッズ・イ
ン・エンザイモロジー(Methods in Enzymology) ，６８
巻，２８１頁；Horn, B.（１９７９年）メソッズ・イン
・エンザイモロジー，６８巻，２９９頁）。ＬＴをコー
ドするＤＮＡ断片を持つ組換え型ファージのプラークの
検出には、ｃＤＮＡや合成ＤＮＡをプローブとしたプラ
ークハイブリダイゼーション手法（Woo, S.L.C. （１９
７９年）メソッズ・イン・エンザイモロジー，６８巻，
３８９頁；Szostak, J.W. ら（１９７９年）メソッズ・
イン・エンザイモロジー，６８巻，４１９頁）が利用で
きる。またＬＴの遺伝子を持つ組換え型ファージは、プ
ラークハイブリダイゼーションによって選択されたプラ
ークから回収し宿主大腸菌と共に培養することにより大
量に調製できる。また組換え型ファージのＤＮＡはフェ
ノール法等により調製できる（Maniatis, T.ら（１９８
２年）Molecular Cloning a Laboratory manual, Cold
Spring Harbor Laboratory）。

【００１３】動物培養細胞へのＤＮＡの導入法として、
トランスフェクション効率に差はあるが、リン酸カルシ
ウム法（Wigler, M.ら（１９７７年）セル，１１巻，２
２３頁）、マイクロインジェクション法（Anderson, W.
F.ら（１９８０年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナ
ショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエ
ー，７７巻，５３９９頁）、リポゾーム法、ＤＥＡＥ−
デキストラン法或いは細胞融合法（Schoffner.W.ら（１
９８０年）プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル
・アカデミー・オブ・サイエンス・ユーエスエー，７７
巻，２１６３頁）等が用いられている。リン酸カルシウ
ム法として用いるＤＮＡ材料としては、ＤＮＡ溶液の他
に大腸菌などの微生物、ファージなども利用できる。細
胞融合法では目的ＤＮＡ配列をプラスミドとして保有し
ている微生物のプロトプラストが用いられている。

【００１４】ＬＴは誘導蛋白であり、ヒト白血球細胞を
種々のマイトージェン等で刺激することにより誘導され
る。現在マイトージェンの刺激が、どのような形でＬＴ
の遺伝子に働き、ＬＴを誘導するかは不明であるが、そ
のような誘導機構のない細胞にＬＴの調節部位を含む遺
伝子を導入してもＬＴの生産は微弱なものであろう。本
発明者らは、動物培養細胞内で機能する他の遺伝子のプ
ロモーター領域の配列をＬＴの染色体ＤＮＡ配列の５′
側に接続し、細胞に導入することによりＬＴの非生産細
胞を高生産細胞に形質転換できることを見い出した。こ
の場合、ＬＴのｍＲＮＡ合成は接続したプロモーター領
域の制御下におかれ、たとえば接続したプロモーター領
域が構成的な蛋白の遺伝子のプロモーター領域であれ
ば、細胞内でＬＴのｍＲＮＡは常時合成され、従って細
胞はＬＴの構成的生産細胞になる。もし接続するプロモ
ーター領域が、誘導蛋白のものであれば、形質転化細胞
は、ＬＴ誘導蛋白として生産する。

【００１５】動物培養細胞で機能するプロモーターとし
てＳＶ４０の初期遺伝子プロモーターが知られている。
このプロモーターはＳＶ４０ＤＮＡのHind III−Pvu II
フラグメント、約３５０ベースペア（ｂｐ）ＤＮＡ断片
に含まれている。また、このＤＮＡ断片は逆向きにＳＶ
４０の後期遺伝子のプロモーターとしての活性を有して
いる。ＳＶ４０の後期プロモーターからの転写活性は、
一般的にＳＶ４０のＴ抗原の存在下で増強される。従っ
てＳＶ４０の後期プロモーターを接続したＬＴの遺伝子
が導入される細胞は、Ｔ抗原が発現している細胞が望ま
しい。Ｔ抗原が発現している細胞を作製するには、Ｔ抗
原をコードしている遺伝子を細胞に導入すればよい。ま
たＳＶ４０のＴ抗原をコードするＤＮＡ配列とＳＶ４０
の後期プロモーター配列とを接続したＬＴ遺伝子配列が
同一の配列上に存在するＤＮＡ配列で培養細胞を形質転
換した場合、多種の細胞株でＬＴの高発現株が得られる
であろう。

【００１６】ヘルペス・シンプレックス・ウイルス（Ｈ
ＳＶ）タイプＩのチミジンキナーゼプロモーターもＳＶ
４０初期遺伝子プロモーターと同様に構成的なプロモー
ターであり、領域の構造はWagnerらによって示されてい
る（Wagner, M.J.ら（１９８１年）プロシーディングズ
・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス・ユーエスエー，７９巻，１４４１頁）。機能するプ
ロモーター領域とは、ｍＲＮＡの合成開始点は含むが、
それらのプロモーターが調節している蛋白の最初のアミ
ノ酸であるメチオニンのコドンは含まないプロモーター
領域の配列をさす。機能するプロモーター領域の配列と
ＬＴ染色体ＤＮＡ配列とが接続したＤＮＡ配列（ＬＴ発
現ベクター）の作製を実施例３に示した。

【００１７】ＬＴのアミノ酸配列は、クローニングされ
たＬＴ遺伝子のエクソン部分の塩基配列から推定可能で
ある。塩基配列はマキサム−ギルバート法（Maxam, A.
M. ら（１９８０年）メソッズ・イン・エンザイモロジ
ー，６５巻，４９９頁）、或いはSangerのダイデオキシ
法（Sanger, F.（１９８１年）サイエンス(Science) ，
２１４巻，１２０５頁）等で決定される。

【００１８】遺伝子を細胞に導入した場合、導入遺伝子
は宿主染色体ＤＮＡに安定に組み込まれる場合がある。
遺伝子が組み込まれる染色体上の位置は一見でたらめで
あり、また組み込まれるＤＮＡのコピー数も不規則であ
る。ＬＴ遺伝子を細胞に導入した場合、組み込まれた位
置やコピー数が細胞ごとに異なり、各々の細胞のＬＴ生
産量は異なる。従って細胞をクローン化することにより
種々の生産量を有する細胞を得ることができる。目的遺
伝子を導入し、安定に発現する細胞のみを選択的に増殖
させる為には、機能するプロモーター配列とＬＴ遺伝子
が接続した配列と選択マーカー遺伝子を同一ＤＮＡ配列
上に持つＤＮＡ配列が適切である。動物細胞での選択マ
ーカー遺伝子としてはEcogpt（Mulligan, R.C.ら（１９
８０年）サイエンス，２０９巻，１４２２頁）、neo
（Southern, P.J.ら（１９８２年）ジャーナル・オブ・
モレキュラー・アンド・アプライド・ジェネティックス
(J.Mol, Appl. Genet.)，１巻，３２７頁）、dhfr（Wig
ler, M.ら（１９８０年）プロシーディングズ・オブ・
ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・ユー
エスエー，７７巻，３５６７頁）などの遺伝子が用いら
れる。また、そのようなＤＮＡ配列を大量に調製する為
には、そのようなＤＮＡ配列が、大腸菌で複製し且つ大
量調製可能なプラスミドやファージであることが望まし
い。実施例３乃至５に示したＬＴ発現ベクターは、以上
のような目的にかなうプラスミドである。すなわち大腸
菌で複製可能にするＤＮＡ複製開始点(ori) と、選択マ
ーカー（アンピシリン耐性遺伝子）及び動物培養細胞で
の選択マーカー遺伝子(Ecogpt)及び機能するプロモータ
ーと接続したＬＴの染色体ＤＮＡ配列が同一のＤＮＡ配
列上に存在している事を特徴としたプラスミドである。

【００１９】機能する他の遺伝子のプロモーター領域を
接続したＬＴの染色体ＤＮＡ配列を導入された細胞がＬ
Ｔを産生する為には、該ＤＮＡ配列が、用いた細胞固有
のＲＮＡ合成系、ＲＮＡの成熟、蛋白合成系、蛋白の成
熟、分泌等の機能に適合している必要がある。導入され
たＤＮＡからはｍＲＮＡが合成されるが、ｍＲＮＡの
５′末端はキャップ構造の付加、正常な位置でのスプラ
イシング及び３′末端へのポリアデニレーションが必要
である。また活性のあるＬＴの発現には、合成されるＬ
Ｔペプタイドの正常な高次構造の形成と維持、更にはシ
グナルペプタイドの切断、細胞からの分泌が正確に行な
われる必要がある。本発明者らが試用した動物培養細胞
はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａ
ＴＣＣ）から入手可能なハムスター、サル、ヒト由来の
細胞であるが、本明細書に示されているＬＴの製造法を
用いれば、少なくとも脊椎動物由来の培養細胞、融合細
胞、正常及び変異細胞、ウイルスによる形質転換細胞等
において活性あるＬＴを産生することが可能である。ま
たヒトの細胞をＳＶ４０で形質転換した株化細胞を生産
細胞として用いる事は、原因不明で癌化或いは株化した
細胞に比して、適切な手段を講じることにより生産物の
安全性の向上が期待される。ＳＶ４０の形質転換細胞と
してＷＩ−２６ ＶＡ４が知られている。

【００２０】機能するプロモーターを接続したＬＴ染色
体ＤＮＡ配列を、例えばリン酸カルシウム法で動物培養
細胞に導入し、ＬＴを産生するようになった細胞は、通
常細胞の培養に用いられる血清を含んだ培地ばかりでな
く、全く血清を含まない無血清培地でもＬＴを産生する
事を見い出した。ＬＴの生産に無血清培地を用いる事は
ＬＴの培地からの回収精製をより容易にするばかりでな
く、製品への血清成分の混入を防ぐことになる。

【００２１】

【実施例】以下に実施例を示すが、本発明に係る諸実験
は内閣総理大臣の定める「組換えＤＮＡ実験指針」に従
って行った。また実施例中のファージ、プラスミド、Ｄ
ＮＡ、種々の酵素、大腸菌等を扱う詳しい諸操作は以下
にあげる雑誌、成書を参考とした。

【００２２】１．蛋白質 核酸 酵素，２６巻，４号
（１９８１年）臨時増刊 遺伝子操作（共立出版） ２．遺伝子操作実験法，高木康敬 編著（１９８０年）
講談社 ３．遺伝子操作マニュアル，高木康敬 編著（１９８２
年） 講談社 ４．Molecular Cloning a laboratory manual, T. Mani
atisら編（１９８２年）Cold Spring Harbor Laborator
y ５．Methods in Enzymology ，６５巻，L. Grossman ら
編（１９８０年）Academic Press ６．Methods in Enzymology ，６８巻，R. Wu 編集（１
９７９年）AcademicPress

【００２３】実施例１ ＬＴ遺伝子のクローニング 複数の健康成人からヘパリン採血し、市販のリン酸緩衝
液（ＰＢＳ）（フローラボラトリー社製）で２倍希釈
後、フィコールパック（ファルマシア社製）液に上層
し、２０００回転、３０分遠心し白血球層を分離し、更
にＰＢＳで２回洗浄した。１０⁸ 個の細胞に対し２０ｍ
ｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡ−０．５％ザルコシル溶液を加
え、２ｍｇのプロテアーゼＫを入れ、５０℃で３時間イ
ンキュベートした。フェノール抽出を２回行い、水層を
５０ｍＭトリス−１０ｍＭ ＥＤＴＡ−１０ｍＭ塩化ナ
トリウム（ｐＨ８．０）に１晩透析した。ＲＮａｓｅＡ
を１００μｇ／ｍｌになるように加え、３７℃で３時間
処理後、フェノール抽出を２回行い、水層を５０ｍＭト
リス−１０ｍＭ ＥＤＴＡに透析し、高分子ヒトＤＮＡ
を得た。ヒトＤＮＡを制限酵素Ｓａｕ３ＡＩで部分切断
後、蔗糖密度勾配遠心により約１５〜２０キロベースの
大きさのＳａｕ３ＡＩＤＮＡ断片を調製した。ラムダフ
ァージベクターCharon２８ＤＮＡをＢａｍＨＩで切断
後、蔗糖密度勾配遠心によりCharon２８の左端断片及び
右端断片を含む画分を集め、エタノール沈澱により回収
した。

【００２４】Charon２８の両端のＤＮＡ断片とヒト１５
〜２０キロベースＳａｕ３ＡＩ断片をＴ₄ ＤＮＡリガー
ゼで結合後、エンキストとスタンバーグの方法（L. Enq
uistとN. Sternberg（１９７９年）メソッズ・イン・エ
ンザイモロジー，６８巻，２８１頁）によりインビトロ
パッケージングを行い、大腸菌ＬＥ３９２を宿主として
組換え型ファージのプラークを形成させた。次にプラー
クハイブリダイゼーションの手法（Benton, W.D., Davi
s, R.W. （１９７７）サイエンス，１９６巻，１８０
頁）によりＬＴの遺伝子を持つ組換え型ファージクロー
ンを選択した。プローブとしては、ＬＴの遺伝子に存在
する配列を持つオリゴヌクレオチドＡＴＧＡＣＡＣＣＡ
ＣＣＴＧＡＡＣＧＴ，ＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＧ
ＴＣ及びＡＣＴＧＴＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＣ（これ
らの配列はＬＴのアミノ酸配列−３４から−２９，７５
から８０及び１６３から１６８に対応している：Gray,
P.W.ら（１９８４年）ネイチャー，３１２巻，７２１
頁）をホスホトリエステル法（Miyoshi. K. ら（１９８
０）ヌクレイック・アッシズ・リサーチ，８巻，５５０
７頁）で合成し、５′−ＯＨを〔γ−32_Ｐ〕ＡＴＰ及び
Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識して用いた。

【００２５】約６０万の組換え型ファージクローンから
用いた３種の合成ＤＮＡプローブすべてとハイブリダイ
ズするファージクローン１１株を得た。このうちの１つ
のファージクローン４−１を種々の制限酵素で切断し、
アガロース電気泳動を行い、ニトロセルロースフィルタ
ーにトランスファー後、３種の合成ＤＮＡプローブを用
いたサザーンハイブリダイゼーション（Southern. E.M.
（１９７５年）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイ
オロジー(J. Mol. Biol.) ９８巻，５０３頁）を行った
ところ、ＢａｍＨＩ ４．２Ｋｂ，ＥｃｏＲＩ ２．３
ＫｂおよびＳｍａＩ ２．７Ｋｂ断片が３種のプローブ
とハイブリダイズし、これらの断片の中にＬＴのアミノ
酸配列をコードしているＤＮＡ配列が含まれていること
が明らかになった。また、いくつかのファージクローン
のＤＮＡの制限酵素解析の結果、ＬＴ染色体ＤＮＡ配列
及び隣接した配列の制限酵素認識部位は図１のようにマ
ップされた。

【００２６】実施例２ ＬＴ遺伝子のサブクローニング ファージクローン４−１のＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ
で切断し、生じた４．２Ｋｂの断片をプラスミドｐＵＣ
９（Vieira, J とMessing, J（１９８２年）ジーン(Gen
e)，１９巻，２５９頁）のＢａｍＨＩ部位に挿入しｐＬ
ＴＢ４．２を作製した（図２）。

【００２７】市販されているｐＵＣ９のプライマーＣＡ
ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ，ＡＧＴＣＡＣＧＡＣ
ＧＴＴＧＴＡ（以上宝酒造製）及びＬＴのアミノ酸−２
３から−２８，７５から８０，１６３から１６８に対応
するオリゴマー−ＡＣＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＡ
Ｇ，ＴＣＴＡＣＴＣＣＣＡＧＧＴＧＧＴＣ，ＡＣＴＧＴ
ＣＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＣをプライマーとしたダイデ
オキシ法による塩基配列決定（Wallace, R.B. ら（１９
８１年）ジーン，１６巻，２１頁）をｐＬＴＢ４．２に
実施した。その結果ＬＴの５′側は、配列番号１の配列
を有し３′側は配列番号２の配列を有していることが分
った。

【００２８】実施例３ ｐＳＶｅＳｍａＩＬＴ，ｐＳＶｐＴＫＬＴ，ｐＳＶ２Ｌ
ＬＴ及びｐＳＶ３ＬＬＴの作製 ＳＶ４０の初期遺伝子プロモーター領域の配列とＬＴ染
色体ＤＮＡ配列とが接続した配列を持つプラスミドであ
るｐＳＶｅＳｍａＩＬＴはｐＬＴＢ４．２，ｐＳＶ２ｇ
ｐｔ及びｐＳＶ３ｇｐｔ（Mulligan, R.C.とBerg, P.
（１９８０年）サイエンス，２０９巻，１４２２頁）を
出発材料として、図３、図４に示した手順により作製し
た。

【００２９】すなわちｐＳＶ３ｇｐｔをＨｉｎｄIII で
切断し、最も大きいＤＮＡ断片をＴ４ＤＮＡリガーゼで
環状化しｐＨＩを作製した。次にｐＨＩのＰｖｕII部位
をＳａｌＩリンカーを用いてＳａｌＩ部位に改め、ｐＨ
IIを作製した。更にｐＨIIのＨｉｎｄIII 部位をＨｉｎ
ｄIII −ＳｍａＩアダプターを用いてＳｍａＩ部位を導
入し、ｐＨＳｍａＩを作製した。ｐＨＳｍａＩをＳａｌ
Ｉ，ＥｃｏＲＩ切断しｐＳＶ２ｇｐｔのＢａｍＨＩ部位
をＢａｍＨＩで切断後、ＤＮＡポリメラーゼＩ(Klenow)
で平滑末端にしてＴ４ＤＮＡリガーゼで環状化して作製
したｐＳＩを同じくＳａｌＩ，ＥｃｏＲＩ切断し、アン
ピシリン耐性遺伝子を持つＤＮＡ断片とＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで結合させｐＳＶｅＳｍａＩをつくった。次にｐＬ
ＴＢ４．２をＳｍａＩで切断し、ＬＴ遺伝子配列を持つ
ＤＮＡ断片を得、これをＳｍａＩ切断したｐＳＶｅＳｍ
ａＩに導入し、ｐＳＶｅＳｍａＩＬＴを作製した。

【００３０】用いたＳａｌＩリンカーとＳｍａＩアダプ
ターは、それぞれｄ（ｐＧＧＴＣＧＡＣＣ）及びｄ（ｐ
ＡＧＣＴＣＣＣＧＧＧ）の配列を持つものを使用した。
またＤＮＡポリメラーゼＩはKlenowフラグメントを用い
た。

【００３１】ヘルペスシンプレックスウイルスタイプ１
のチミジンキナーゼのプロモーター領域の配列とＬＴ遺
伝子が接続した配列を持つプラスミドであるｐＳＶｐＴ
ＫＬＴは、ｐＬＴＢ４．２，ｐＨＳＶ１０６（McKnigh
t, S.L.とGabis, E.R. （１９８０年）ヌクレイック・
アッシズ・リサーチ，８巻，５９３１頁）及びｐＳＶｅ
ＳｍａＩを出発材料にして図５に示した方法により作製
した。すなわちｐＬＴＢ４．２に含まれるＬＴ遺伝子Ｂ
ａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片をｐＨＳＶ１０６のＢｇｌII−
ＳｍａＩ部位に挿入しｐＨＳＶＬＴを作製した。次にｐ
ＨＳＶＬＴからＴＫプロモーターのついたＬＴ遺伝子Ｂ
ａｍＨＩ−ＳｍａＩ断片をｐＳＶｅＳｍａＩのＢａｍＨ
Ｉ−ＳｍａＩ部位に導入しｐＳＶｐＴＫＬＴを作製し
た。

【００３２】またＳＶ４０の後期遺伝子プロモーター領
域の配列とＬＴ遺伝子が接続した配列を持つプラスミド
であるｐＳＶ２ＬＬＴ及びｐＳＶ３ＬＬＴはｐＬＴＢ
４．２，ｐＳＶ２ｇｐｔ及びｐＳＶ３ｇｐｔを出発材料
にして、図６、図７に示した方法により作製した。すな
わちｐＬＴＢ４．２に含まれるＬＴ遺伝子ＳｍａＩ−Ｓ
ｍａＩ２．５Ｋｂ断片をｐＳＶ２ｇｐｔのＰｖｕII部位
に結合させｐＳＶ２ＬＬＴを作製した。次にｐＳＶ２Ｌ
ＬＴをＢａｍＨＩで部分切断し、そこへｐＳＶ３ｇｐｔ
の持つＴ抗原遺伝子ＢａｍＨＩ断片を結合させｐＳＶ３
ＬＬＴを作製した。

【００３３】実施例４ ｐＳＶｅＳｍａＩＬＴ，ｐＳＶｐＴＫＬＴ，ｐＳＶ２Ｌ
ＬＴ及びｐＳＶ３ＬＬＴの培養細胞への導入とＬＴの産
生 形質発現ベクターｐＳＶｅＳｍａＩＬＴ，ｐＳＶｐＴＫ
ＬＴ，ｐＳＶ２ＬＬＴ及びｐＳＶ３ＬＬＴに含まれるＬ
Ｔ遺伝子の発現を調べる為に、種々の動物培養細胞へWi
glerらの方法（Wiglerら（１９７７年）セル，１１巻，
２２３頁）に準じてプラスミドの導入を行った。プラス
ミド−リン酸カルシウム共沈澱物を予め１０％牛新生児
血清を含むイーグルＭＥＭ培地で生育させた細胞（２×
１０⁵ 細胞／３ｍｌ培地／直径６ｃｍ培養皿）に加え、
１５時間後に培地を更新し、培養をつづけ４８時間後の
培地に含まれるＬＴを、Ｌ９２９細胞を標的細胞とする
細胞致死効果で測定した（Ruff, M.R.とGifford, G.E.
（１９８１年）リンホカインズ，２巻，２３５頁）。す
なわち９６穴マルチディッシュに２×１０⁴ 細胞／well
／１００μｌ培地で１日培養後、培養液を除き、アクチ
ノマイシンＤ １μｇ／ｍｌ、５％牛胎児血清を含むイ
ーグルＭＥＭ培地で種々の濃度に希釈したサンプルを１
００μｌ加え、２０時間後の細胞の変性致死効果を測定
した。ＬＴ１ユニットは５０％の致死率を与える濃度と
した。表１に示すようにｐＳＶｅＳｍａＩＬＴ，ｐＳＶ
ｐＴＫＬＴ，ｐＳＶ２ＬＬＴ或いはｐＳＶ３ＬＬＴを導
入した全ての培養細胞でＬＴの発現がみられた。また全
ての培養細胞でｐＳＶ２ＬＬＴよりもｐＳＶ３ＬＬＴの
発現が高かった。

【００３４】

【表１】

【００３５】 参考例 ＬＴの通常培地及び無血清培地での生産 実施例４でｐＳＶｅＳｍａＩＬＴ，ｐＳＶｐＴＫＬＴ或
いはｐＳＶ３ＬＬＴを導入したＢＨＫ−２１（Ｃ−１
３）の培地を１０％牛胎児血清、２５μｇ／ｍｌミコフ
ェノール酸、２５０μｇ／ｍｌキサンチンを含むＭＥＭ
培地に更新し、ミコフェノール酸耐性株を分離した。ミ
コフェノール酸耐性株を２４穴マルチディッシュの底面
全面に生育させ、５％牛胎児血清（ＦＣＳ）を含むＭＥ
Ｍ培地と牛胎児血清を全く含まないＭＥＭ培地で２４時
間培養し、培地中に含まれるＬＴ活性を測定した。表２
に示すように、分離された細胞株は血清の有無にかかわ
らずＬＴを生産した。

【００３６】

【表２】

【００３７】

【図面の簡単な説明】

【図１】ＬＴ遺伝子を含む染色体ＤＮＡ断片をクローニ
ングした組替えファージＤＮＡを示す模式図である。Ｅ
は制限酵素ＥｃｏＲＩの認識部位を、Ｂは制限酵素Ｂａ
ｍＨＩの認識部位を示す。

【図２】プラスミドｐＬＴＢ４．２を示す模式図であ
る。

【図３】プラスミドｐＳＶｅＳｍａＩ作製の模式図であ
る。

【図４】プラスミドｐＳＶｅＳｍａＩＬＴ作成の模式図
である。

【図５】プラスミドｐＳＶｐＴＫＬＴ作成の模式図であ
る。

【図６】プラスミドｐＳＶ２ＬＬＴ作成の模式図であ
る。

【図７】プラスミドｐＳＶ３ＬＬＴ作成の模式図であ
る。図２〜図７中、ＳｍａＩ，ＡｖａＩ，ＢａｍＨＩ，
ＡｃｃＩ，ＳｃａＩ，ＥｃｏＲＩ，ＳａｃＩ，Ｈｉｎｄ
III ，ＰｖｕII，ＳａｌＩ及びＢｇｌIIは夫々の制限酵
素の認識部位を示す。ＨｕＬＴはヒトＬＴ遺伝子、ｐＵ
Ｃ９はベクタープラスミドｐＵＣ９由来の領域、Ａｍｐ
r はアンピシリン耐性遺伝子、Ｅｃｏｇｐｔは大腸菌の
グアニン・ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子、
ＳＶｅはＳＶ４０のウイルスの初期遺伝子プロモーター
領域、Ｔ−ａｇはＳＶ４０のＴ−抗原遺伝子、ｐＴＫは
チミジンキナーゼのプロモーター領域、ＴＫはチミジン
キナーゼ遺伝子、（ＰｖｕII／ＳｍａＩ）は制限酵素Ｐ
ｖｕII切断部位とＳｍａＩ切断部位を結合したものを示
す。

【配列表】

配列番号：１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic ＤＮＡ 配列 ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧ ＣＣＴＧＣＣＴＧＧＧ ＣＣＴＧＧＧＣＣＴＴ ＧＧＴＧＧＧＴ…イントロン… ＧＴＴＣＴＣＣＣＣ ＡＴＧ ＡＣＡ ＣＣＡ ＣＣＴ ＧＡＡ ＣＧＴ… Ｍｅｔ Ｔｈｒ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ａｒｇ… 配列番号：２ 配列の型：核酸 鎖の数：２本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic ＤＮＡ 配列 ＧＣＣ ＴＡＣ ＴＣＴ ＣＣＣ ＡＡＧ ＧＣＣ ＡＣＣ ＴＣＣ ＴＣＣ Ａｌａ Ｔｙｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｌｙｓ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ｓｅｒ ＣＣＡ ９０ Ｐｒｏ ＣＴＣ ＴＡＣ ＣＴＧ ＧＣＣ ＣＡＴ ＧＡＧ ＧＴＣ ＣＡＧ ＣＴＣ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ａｌａ Ｈｉｓ Ｇｌｕ Ｖａｌ Ｇｌｎ Ｌｅｕ ＴＴＣ １００ Ｐｈｅ ＴＣＣ ＴＣＣ ＣＡＧ ＴＡＣ ＣＣＣ ＴＴＣ ＣＡＴ ＧＴＧ ＣＣＴ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｔｙｒ Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｐｒｏ ＣＴＣ １１０ Ｌｅｕ ＣＴＣ ＡＧＣ ＴＣＣ ＣＡＧ ＡＡＧ ＡＴＧ ＧＴＧ ＴＡＴ ＣＣＡ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｇｌｎ Ｌｙｓ Ｍｅｔ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｐｒｏ ＧＧＧ Ｇｌｙ ＣＴＧ ＣＡＧ ＧＡＡ ＣＣＣ ＴＧＧ ＣＴＧ ＣＡＣ ＴＣＧ ＡＴＧ Ｌｅｕ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｔｒｐ Ｌｅｕ Ｈｉｓ Ｓｅｒ Ｍｅｔ ＴＡＣ １３０ Ｔｙｒ ＣＡＣ ＧＧＧ ＧＣＴ ＧＣＧ ＴＴＣ ＣＡＧ ＣＴＣ ＡＣＣ ＣＡＧ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｌａ Ｐｈｅ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｔｈｒ Ｇｌｎ ＧＧＡ １４０ Ｇｌｙ ＧＡＣ ＣＡＧ ＣＴＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＣＡＣ ＡＣＡ ＧＡＴ ＧＧＣ Ａｓｐ Ｇｌｎ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｈｒ Ａｓｐ Ｇｌｙ ＡＴＣ １５０ ｌｌｅ ＣＣＣ ＣＡＣ ＣＴＡ ＧＴＣ ＣＴＣ ＡＧＣ ＣＣＴ ＡＧＴ ＡＣＴ Ｐｒｏ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｓｅｒ Ｔｈｒ ＧＴＣ １６０ Ｖａｌ ＴＴＣ ＴＴＴ ＧＧＡ ＧＣＣ ＴＴＣ ＧＣＴ ＣＴＧ Ｐｈｅ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｐｈｅ Ａｌａ Ｌｅｕ ＴＡＧＡＡＣＴＴＧＧ １７０ ＳＴＯＰ ＡＡＡＡＡＴＣＣＡＧ ＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡ ＴＡＡＴＴＧＡＴＴＴ ＣＡＡＧＡＣＣＴＴＣ ＴＣＣＣＣＡＴＴＣＴ ＧＣＣＴＣＣＡＴＴＣ ＴＧＡＣＣＡＴＴＴＣ ＡＧＧＧＧＴＣＧＴＣ ＡＣＣＡＣＣＴＣＴＣ ＣＴＴＴＧＧＣＣＡＴ ＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴ ＣＡＡＧＴＣＴＴＣＣ ＣＴＧＡＴＣＡＡＧＴ ＣＡＣＣＧＧＡＧＣＴ ＴＴＣＡＡＡＧＡＡＧ ＧＡＡＴＴＣＴＡＧＧ ＣＡＴＣＣＣＡＧＧＧ ＧＡＣＣＣＡＣＡＣＴ ＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡ ＴＣＣＣＴＧＡＴＧＴ ＣＴＧＴＣＴＧＧＣＴ ＧＡＧＧＡＴＴＴＣＡ ＡＧＣＣＴＧＣＣＴＡ ＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡ Ｇ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 渡辺 清 兵庫県明石市松が丘５の15の41 (56)参考文献 特開 昭56−160993（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．312（1984) Ｐ．721−724 Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．209（1980) Ｐ．1422−1427

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ５′側において ＧＧＡＴＣＣＣＣＧＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＧＧ ＣＣＴＴＧＧＴＧＧＧＴ…イントロン… ＧＴＴ ＣＴＣＣＣＣＡＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴ… ＮｅｔＴｈｒＰｒｏＰｒｏＧｌｕＡｒｇ… の配列を有し、３′側は、 ＧＣＣＴＡＣＴＣＴＣＣＣＡＡＧＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡ ＡｌａＴｙｒＳｅｒＰｒｏＬｙｓＡｌａＴｈｒＳｅｒＳｅｒＰｒｏ ９０ ＣＴＣＴＡＣＣＴＧＧＣＣＣＡＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣ ＬｅｕＴｙｒＬｅｕＡｌａＨｉｓＧｌｕＶａｌＧｌｎＬｅｕＰｈｅ １００ ＴＣＣＴＣＣＣＡＧＴＡＣＣＣＣＴＴＣＣＡＴＧＴＧＣＣＴＣＴＣ ＳｅｒＳｅｒＧｌｎＴｙｒＰｒｏＰｈｅＨｉｓＶａｌＰｒｏＬｅｕ １１０ ＣＴＣＡＧＣＴＣＣＣＡＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＴＡＴＣＣＡＧＧＧ ＬｅｕＳｅｒＳｅｒＧｌｎＬｙｓＭｅｔＶａｌＴｙｒＰｒｏＧｌｙ ＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＴＣＧＡＴＧＴＡＣ ＬｅｕＧｌｎＧｌｕＰｒｏＴｒｐＬｅｕＨｉｓＳｅｒＭｅｔＴｙｒ １３０ ＣＡＣＧＧＧＧＣＴＧＣＧＴＴＣＣＡＧＣＴＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡ ＨｉｓＧｌｙＡｌａＡｌａＰｈｅＧｌｎＬｅｕＴｈｒＧｌｎＧｌｙ １４０ ＧＡＣＣＡＧＣＴＡＴＣＣＡＣＣＣＡＣＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＴＣ ＡｓｐＧｌｎＬｅｕＳｅｒＴｈｒＨｉｓＴｈｒＡｓｐＧｌｙｌｌｅ １５０ ＣＣＣＣＡＣＣＴＡＧＴＣＣＴＣＡＧＣＣＣＴＡＧＴＡＣＴＧＴＣ ＰｒｏＨｉｓＬｅｕＶａｌＬｅｕＳｅｒＰｒｏＳｅｒＴｈｒＶａｌ １６０ ＴＴＣＴＴＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣＧＣＴＣＴＧＴＡＧ ＡＡＣＴＴＧ ＰｈｅＰｈｅＧｌｙＡｌａＰｈｅＡｌａＬｅｕ ＳＴＯＰ １７０ ＧＡＡＡＡＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＡＴＡＡＴＴＧＡＴＴ ＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＣＴＣＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＣＴＣＣＡＴＴ ＣＴＧＡＣＣＡＴＴＴＣＡＧＧＧＧＴＣＧＴＣＡＣＣＡＣＣＴＣＴ ＣＣＴＴＴＧＧＣＣＡＴＴＣＣＡＡＣＡＧＣＴＣＡＡＧＴＣＴＴＣ ＣＣＴＧＡＴＣＡＡＧＴＣＡＣＣＧＧＡＧＣＴＴＴＣＡＡＡＧＡＡ ＧＧＡＡＴＴＣＴＡＧＧＣＡＴＣＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＣＡＣ ＴＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＴＣＣＣＴＧＡＴＧＴＣＴＧＴＣＴＧＧＣ ＴＧＡＧＧＡＴＴＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＴＡＧＧＡＡＴＴＣＣＣ ＡＧ の配列を有するヒト・リンホトキシン染色体ＤＮＡ配列
   とＢＨＫ−２１（Ｃ−１３）細胞で機能するＳＶ４０の
   初期遺伝子プロモーター領域の配列とが接続したＤＮＡ
   配列を有するＤＮＡによって形質転換されたＢＨＫ−２
   １（Ｃ−１３）動物細胞を培養して、ヒトリンホトキシ
   ンを生成せしめ、これを採取することを特徴とするヒト
   ・リンホトキシンの製造方法。
2. 【請求項２】 動物培養細胞を培養液中で培養し、培養
   液からヒト・リンホトキシンを回収する請求項１記載の
   製造方法。