JP2682858B2 - 白血病抑制性因子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は、白血病抑制性因子（LIF）、実質的に純粋
な形態のLIFの製法、並びに組換LIFのクローニングおよ
び発現に関する。

発明の背景 成熟血球は、幼弱前駆細胞のクローン増殖および付随
する分化によって生成する［メトカルフ（Metcalf,
D.）、（1984）、ザ・ヘモポイエティック・コロニー・
スティミュレーティング・ファクターズ（The Hemopoie
tic Colony Stimulating Factors）、エルセヴィール
（Elsevier）、アムステルダム（Amsterdam）］。正常
な造血細胞には、増殖および分化の２過程が密接に関連
しており、それによって短命の成熟細胞が連続的に補充
される。少なくとも４種の生化学的に異なる成長因子、
すなわちコロニー刺激因子（CSF）（Ｇ−CSF、Ｍ−CS
F、GM−CSFおよびMulti−CSF（IL−３））が、イン・ビ
トロで顆粒球およびマクロファージの前駆細胞の増殖お
よび分化を促進することがわかっている［メトカルフ、
（1987）、プロシーディングス・オブ・ザ・ロイヤル・
ソサイアティ・オブ・ロンドン、シリーズＢ（Proc.R.S
oc.B.）、230、389〜423］。

正常細胞と比べて、白血病性骨髄細胞は、増殖および
分化が関連しておらず、幼弱前駆細胞が蓄積し、その増
殖能を保持し、分化しないという特徴を有する。イン・
ビトロで骨髄性白血病細胞の分化を誘導し得る生物学的
因子の性質、および特定の因子が増殖を伴わずに分化を
誘導し得るかどうかに関する議論がさかんであった。増
殖および分化には、異なる因子の介在が必須であること
が提案されている［サッチス（Sachs,L.）、（1982）、
ジャーナル・オブ・セルラー・フィジオロジー（J.Cel
l.Physiol.）補遺、１、151〜164］。一方では、２つの
グループが、マウス骨髄性白血病細胞系M1の分化を誘導
し得、正常前駆細胞の増殖を促進しない活性物質（MGI
−２またはＤ−因子）について記載し、これを精製した
［リプトン（Lipton,J.H.）およびサッチス、（198
1）、ビオヒミカ・エト・ビオフィジカ・アクタ（Bioch
em.Biophys.Acta.）、673、552〜569;トミダ（Tomida.
M.）、ヤマモト−ヤマグチ（Yamamoto−Yamaguchi,Y.）
およびホズミ（Hozumi,M.）、（1984）、ジャーナル・
オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.Che
m.）、259、10978−10982］。他方では、本発明者ら
が、CSFの１種であるＧ−CSFが、マウス骨髄性白血病細
胞系WEHI−3BD⁺の強力な分化誘導促進物質であり、かつ
正常細胞の増殖および分化の促進物質でもあることを既
に示している［ニコラ（Nicola,N.A.）、メトカルフ、
マツモト（Matsumoto,M.）およびジョンソン（Johnson,
G.R.）、（1983）、ジャーナル・オブ・バイスオロジカ
ル・ケミストリー、258、9017〜9023］。更に、トミダ
ら［トミダ、ヤマモト−ヤマグチ、ホズミ、オカベ（Ok
abe,T.）およびタカカ（Takaka,F.）、（1986）、フェ
ブス・レターズ（FEBS Lett.）、207、271〜275］は、
組換Ｇ−CSFも、M1細胞のマクロファージ分化を誘導し
得ることを示している。これらの因子間の関連は、論争
の的であった。腫瘍壊死因子α（TNFα）はヒト骨髄芽
球細胞系ML−１の分化を促進し得るという知見［タケダ
（Takeda,K.）、イワモト（Iwamoto,S.）、スギモト（S
ugimoto,H.）、タクマ（Takuma,T.）、カワタニ（Kawat
ani,N.）、ノダ（Noda,M.）、マサキ（Masaki,A.）、モ
リセ（Morise,H.）、アリムラ（Arimura,H.）およびコ
ンノ（Konno,K.）、（1986）、ネイチャー（Nature）、
323、338〜340］によって、状況は更に複雑なものとな
った。

これらのグループのデータの不一致を解明するための
試みにおいて、本発明者らは、従来の種々の研究に用い
られたクレブスII腹水癌細胞を培養したならし培地を生
化学的に分別し、正常前駆細胞に対してもWEHI−3BD⁺細
胞に対しても活性な真正Ｇ−CSFおよびGM−CSFだけでな
く、生化学的には異なるが機能的には同様の、M1細胞の
分化を誘導し得る２種の因子をも含むことを示した。後
者の因子は、イン・ビトロでM1白血病細胞の増殖を抑制
する能力を有するので、白血病抑制性因子（LIF）−Ａ
およびLIF−Ｂと呼ばれ、これらはWEHI−3BD⁺細胞の分
化を誘導せず、正常顆粒球／マクロファージ前駆細胞の
増殖を促進しないことがわかった。

本発明の要約 本発明において、LIFは、以下の２つの性質を有する
分子として定義される：（１）白血病細胞の分化に関連
して、骨髄性白血病細胞、例えばM1細胞の増殖を抑制す
る能力を有し、（２）本発明において記載するマウスLI
FまたはヒトLIFの特定の配列を有する分子と、M1細胞ま
たはマウスもしくはヒトマクロファージの特異的な細胞
レセプターへの結合を競合する。LIFは、種々の形態の
骨髄性白血病を抑制する非増殖性治療剤として、並びに
マクロファージの機能および感染に対する他の応答を改
良する試薬、およびこれらに関する臨床試験および研究
用の試薬として使用する可能性を有する。

本発明において、「LIF活性を有するポリペプチド」
とは、前記のようなLIFの性質を有するポリペプチドま
たはグリコポリペプチドを意味し、本発明において開示
するマウスまたはヒトのLIFのアミノ酸配列と完全にま
たは部分的に相同のアミノ酸配列を有するポリペプチド
を包含するが、これに限定されるものではない。前記LI
Fの性質を有するものであれば、マウスまたはヒトのLIF
のアミノ酸配列の一部のみと完全にまたは部分的に相同
のポリペプチドをも包含する。更に、宿主細胞において
発現によって生成し、発現時には不活性であるが、宿主
細胞によって処理されて活性分子となるポリペプチドま
たはグリコポリペプチド、並びに発現時には不活性であ
るが、イン・ビトロまたはイン・ビボで選択的に分解さ
れて活性分子となるポリペプチドまたはグリコポリペプ
チドをも包含する。

マウスLIFは、以下のような生物学的性質を有する分
子である： （ａ）マウス骨髄性白血病細胞系M1の細胞において、増
殖能の喪失およびそのクローン原白血病細胞の死滅を伴
ってマクロファージ分化を誘導し、作用はＧ−CSFによ
って増強される。

（ｂ）M1細胞、並びに腹腔、脾臓および骨髄からの正常
マウス単球およびマクロファージの高親和性レセプター
（マクロファージ成熟または機能的活性化につれてレセ
プターの数は増加する。）に選択的に結合するが、それ
らの組織からの顆粒球、赤血球またはリンパ球には結合
しない。

（ｃ）¹²⁵I−LIFの、高親和性レセプターへの特異的結
合は、Ｇ−CSF、GM−CSF、Multi−CSF（インターロイキ
ン−３）、Ｍ−CSF、インターロイキン１、２、４もし
くは６、内毒素または種々の他の成長因子と競合しない
が、ラベルされていないLIFとは競合する。

（ｄ）正常または麻酔マウスの血清中の菌体内毒素によ
り上昇するが、内毒素耐性C3H/HeJマウスにおいては上
昇しない。

（ｅ）肺、唾液腺、腹膜細胞および骨幹を含む種々の組
織によって生成する。

（ｆ）CSFの不存在下に成長する場合の、イン・ビトロ
での、正常顆粒球−マクロファージ前駆細胞の生存時間
を短縮する。

（ｇ）WEHI−3BD⁺マウス骨髄性白血病細胞、GM−CFSま
たはMulti−DSFを発現するレトロウイルスの感染によっ
て形質転換して白血病誘発性となったマウス骨髄細胞、
マウス白血病細胞系WEHI265およびWE19の増殖を抑制す
るか、または分化を誘導する能力は無い。

（ｈ）顆粒球、マクロファージ、好酸球、巨核球、赤血
球および肥満細胞系の正常前駆細胞の増殖を促進する能
力が無く、正常顆粒球、マクロファージ、巨核球、好酸
球または天然細胞毒性細胞の前駆細胞のクローン増殖を
抑制するか、またはイン・ビトロにおけるCSFによる促
進に対する定量的応答、もしくは連続細胞系32CD1.13お
よびFDCP−１の細胞の増殖を変える能力が無い。

（ｉ）特異的細胞レセプターへの結合を、顆粒球コロニ
ー刺激因子（Ｇ−CSF）のヨウ化誘導体と競合する能力
が無い。ただし、Ｇ−CSFは、M1およびWEHI−3BD⁺マウ
ス骨髄性白血病細胞において分化を誘導し、LIFのM1細
胞に対する作用を増強する能力を有する。

（ｊ）腫瘍壊死因子（TNF）に対して特異的に上昇する
抗血清によってLIF活性が阻害されることが無い。

（ｋ）マウスLIFの転写が、LB3およびE9.D4T細胞の細胞
質の構成成分として存在し、これら細胞中の細胞内のレ
クチン・コンカナバリンＡによって誘導されず、他の多
くの種類の細胞中に存在する。

マウスLIFは、以下のような性質をも有する： （ｌ）還元剤（２−メルカプトエタノールまたはジチオ
トレイトール）存在下または不存在下にドデシル硫酸ナ
トリウムを含有する８〜25％勾配ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動によって測定した分子量58,000±5,000、エ
ンドグリコシダーゼ（Ｎ−グリカナーゼ）による処理後
の分子量23,000±5,000の単一のサブユニットの糖タン
パク質である。

（ｍ）等電点8.6〜9.3である。

（ｎ）主要なアミノ酸配列は、第10図、第11図および第
15図に示す通りである。

（ｏ）第10図、第11図および第15図に示すヌクレオチド
配列によってコード化されている。

（ｐ）特異活性１〜２×10⁸ユニット/mg（50ユニットと
は、1ml中でM1骨髄性白血病細胞によるクローン形成の5
0％の減少を導くLIFの量であると定義する）である。

（ｑ）第19図に示す制限エンドヌクレアーゼ分解部位に
よって区切られたマウス染色体11上の特有の遺伝子によ
ってコード化されている（マウス／チャイニーズ・ハム
スター卵巣体細胞ハイブリッドのパネルの分析により決
定）。

（ｒ）第27図に示す制限エンドヌクレアーゼ分解部位に
よって区切られた染色体DNA中のヒト遺伝子配列と相同
である。

ヒトLIFは、天然および／または酵母誘導組換体の以
下のような生物学的性質を有する分子である： （ａ）マウス骨髄性白血病細胞系M1の細胞において、増
殖能の喪失およびクローン原白血病細胞の死滅を伴って
マクロファージ分化を誘導する。

（ｂ）顆粒球、マクロファージ、好酸球および赤血球系
の正常ヒト前駆細胞の増殖を促進する能力は無い。

（ｃ）Ｇ−CSFと組み合わせると、ヒト白血病細胞系U93
7の細胞の増殖を部分的に抑制し、GM−CSFと組み合わせ
ると、ヒト白血病細胞系U937およびLH60の増殖を抑制す
る能力を有する。

（ｄ）M1細胞およびマウスマクロファージのマウスLIF
レセプターに特異的に結合し、そのような細胞に対する
マウス¹²⁵I−LIFの結合と完全に競合する。

（ｅ）ヒト肝癌細胞系Hep−2Gの特異的細胞レセプター
に結合する。

ヒトLIFは、以下のような性質をも有する： （ｆ）成熟タンパク質中のアミノ酸残基の約80％がマウ
スLIFと同じである。

（ｇ）主要なアミノ酸配列は、第25図、第26図および第
29図に示す通りである。

（ｈ）第27図に示すように制限エンドヌクレアーゼ分解
部位によって区切られた染色体DNA中特有の遺伝子によ
ってコード化されている。

（ｉ）遺伝子配列の一部として、第25図に示すヌクレオ
チド配列を有する。

本発明の第１の態様においては、白血病抑制性因子
（LIF）を実質的に純粋な形態で提供する。本発明は、
実質的に純粋なLIFの製法、とりわけ、クレブスII腹水
癌細胞から精製することによる実質的に純粋なマウスLI
Fの製法、およびヒト膀胱癌細胞系5637（ATCC No.HTB
9）から精製することによる実質的に純粋なヒトLIFの製
法をも提供する。実質的に純粋なLIFは、LIFのアミノ酸
配列またはその一部をコード化する組換DNA分子を含む
酵母細胞、哺乳動物細胞および大腸菌のような宿主細胞
から製造することもできる。

本発明において、「実質的に純粋な形態」とは、適当
なドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲルで
電気泳動すると、少なくとも90％が、LIF活性に対応し
た単一のバンドとして現れるポリペプチドまたはグリコ
ポリペプチドの形態を意味する。

他の態様においては、完全にまたは部分的にLIFタン
パク質をコード化するヌクレオチド配列を有する組換DN
Aクローンの単離方法を提供する。本発明は、LIF固有の
アミノ酸配列をコード化し、更に、LIFの完全なアミノ
酸配列を推定させるヌクレオチド配列にも関する。

更に他の態様においては、本発明は、LIF（または実
質的に同様のその類縁体）をコード化する前記ヌクレオ
チド配列を完全にまたは部分的に有し、そのヌクレオチ
ド配列がLIFを完全にまたは部分的に合成および製造で
きる形態である組換DNA分子にも関する。本発明のこの
態様は、クローニングベクター（例えばプラスミド）お
よび前記組換DNA分子が挿入された宿主細胞にも関す
る。更に、本発明は、前記組換DNA分子の発現またはペ
プチド合成によって、完全もしくは部分的に合成された
LIF、または実質的に同様のその類縁体にも関する。

発明の詳細な記載 LIFに関する本発明の研究において、とりわけマウス
およびヒト由来のこの糖タンパク質の他の原料を、臨床
的用途および他の用途に使用可能にするという観点か
ら、クレブスII腹水癌細胞から有効な精製方法によって
マウスLIFを精製し、これを、この因子の化学的または
正合成的製造のための最初の過程として、部分的なアミ
ノ酸配列分析に付した。

レセプター競合アッセイにおいて、I¹²⁵で放射性ラベ
ルしたLIFを使用して、LIFを合成および製造するマウス
およびヒト由来の細胞および組織を同定した。この試験
の結果、これらの原料の１種のmRNAによるDNAコピーの
組換DNAライブラリーをスクリーニングし、予め決定し
たマウスLIFアミノ酸配列の部分をコード化する放射性
ラベルされたオリゴヌクレオチドと共にハイブリッド形
成することによって、マウスLIF−コード化クローンを
同定し、そのマウスLIFcDNAクローンをヌクレオチド配
列分析に付した。更に、クローン化マウスLIFコード化
配列を、ハイブリッド形成プローブとして使用して、マ
ウスLIF類縁体をコード化するヒト遺伝子を同定し、前
記種交差性ハイブリッド形成を有効に行うことのできる
ハイブリッド形成条件を確立した。その結果、ヒトのマ
ウスLIF類縁体をコード化するDNA配列を有する組換DNA
クローンが同定された。

このようなLIF−コード化配列の確立の結果、クロー
ン化されたマウスまたはヒトのLIF−コード化DNA配列を
用いて、培養哺乳動物細胞、酵母またはバクテリアにお
いてクローン的に純粋なLIFを完全にまたは部分的に合
成するための組換DNA分子が構成された。本発明は、こ
のようにして製造される実質的に純粋なLIFにも関す
る。

本発明の一態様においては、本発明は、酵母細胞、繊
維芽細胞および大腸菌におけるクローン化されたヒトお
よびマウスのLIF遺伝子の発現、そのように発現するた
めのクローン化遺伝子の修飾、並びに組換ヒトおよびマ
ウスLIFの生物学的および生化学的性質の確立に関す
る。

この態様においても、本発明は、完全にまたは部分的
にヒトまたはマウスLIF（または実質的に同様のその類
縁体）をコード化するヌクレオチド配列を有し、そのヌ
クレオチド配列により酵母細胞、繊維芽細胞または大腸
菌において完全にまたは部分的にヒトまたはマウスLIF
が合成および製造される形態の組換DNA分子に関する。
本発明は、クローニングベクター（例えばプラスミド）
および前記のような組換DNA分子を挿入された宿主細胞
をも提供する。更に、本発明は、酵母細胞におけるその
ような組換DNA分子の発現によって、完全にまたは部分
的に合成されたヒトまたはマウスLIF、または実質的に
同様のその類縁体にも関する。LIFに関する本発明の研
究の一態様において、ヒトおよびマウスLIF遺伝子配列
を修飾し、酵母発現ベクターYEpseclに組み入れた。酵
母細胞は、その組換体で形質転換され、そのように形質
転換された酵母細胞のならし培地は、天然ヒトおよびマ
ウスLIFと同様の生物学的性質を有する因子を含有する
ことがわかった。

骨髄性白血病患者および感染症患者の処置におけるLI
Fの使用の可能性の観点から、本発明は、完全または部
分的に、例えばクローン化LIF−コード化DNA配列を用い
てまたは化学的合成によって製造されたLIF、とりわけ
ヒトLIFを含有する薬剤組成物、並びに例えば化学合成
によって、または前記クローン化LIF−コード化DNA配列
の突然変異によって製造されたLIF類縁体の薬剤組成物
にも関する。本発明の薬剤組成物は、少なくとも１種の
他の生物学的血球レギュレーター、例えばＧ−CSFまた
はGM−CSFをも含有し得る。更に、本発明は、血球形成
疾患、例えば白血病および感染の疑いのある先天性疾患
におけるヒトLIF遺伝子の関連した遺伝子移動、変化ま
たは障害の検出に使用するための診断用試薬にも関す
る。

実施例１ 第１〜５図は、以下に記載する精製法の種々の工程に
関し、各分別工程におけるLIFの貯留部およびその純度
を示す。

第１図:DEAE−セファロースCL−6BによるLIFの精製の工
程２に関する。バーは、工程３のためにプールされるフ
ラクションを示す。

第２図：レンチル（Lentil）・レクチン・セファロース
4BによるLIFの精製の工程３に関する。バーは、工程４
のためにプールされるフラクションを示す。

第３図:CM−セファロースCL−6BによるLIFの精製の工程
４に関する。バーは、工程５のためにプールされるフラ
クションを示す。

第４図：脂肪酸分析HPLCカラムによるLIFの精製の工程
５に関する。アセトニトリル39.6〜41.3％のフラクショ
ンをプールする。

第５図：精製したLIFの分子量および純度を示す。上図
は、８〜25％ポリアクリルアミドSDSゲル上の、タンパ
ク質標準（分子量93,000;67,000;43,000;30,000;20,000
および14,000）および精製LIF（２調製）の泳動を示
す。タンパク質および生物学的活性はいずれも分子量5
8,000のタンパク質に関連している。

工程１ クレブスII癌細胞（１×6⁶）を、C57B16/6fj/WEHIマ
ウスに腹腔内注射し、７日後にマウスを殺し、腹水を採
った。細胞を遠心し、大腸菌リポポリサッカライド（20
0ng/ml）を含有するダルベッコ改良イーグル培地に細胞
５×10⁶個/mlを再懸濁させ、空気中にCO₂を10％含有す
る湿式インキュベーターで37℃で24時間インキュベート
する。細胞を再び遠心し、ならし培地を採り、アジ化ナ
トリウムを0.02％（w/v）とし、４℃で貯蔵する。アミ
コン（Amicon）DC2A濃縮器でHIP10−８中空繊維カート
リッジを用いてならし培地36を100mlに濃縮し、1mMフ
ェニルメチルスルホニルフロリド（PMSF）、アジ化ナト
リウム（0.02％w/v）およびトゥイーン（Tween）20（0.
02％v/v）を含有するpH8.0の10mMトリス−HCl緩衝液に
入れ、アミコン撹拌容器でYM−10メンブラン上で再び20
mlに濃縮する。

工程２ 濃縮物を、同じ緩衝液で平衡化したDEAE−セファロー
スCL−6B［ファルマシア（Pharmacia）］のカラム（2.5
×30cm）に通し、平衡緩衝液200mlおよび次いで同じ緩
衝液中の0.3MまでのNaCl直線勾配400mlで溶出する。流
速は25ml/時であり5.8mlのフラクションを集めて、アッ
セイに付す。（第１図参照） 工程３ 勾配前段階でゲルに結合せず、マウスM1細胞に対する
活性を有するタンパク質のフラクションをプールし、YM
−10メンブランで濃縮し、1mM MgCl₂、1mM PMSF、0.2％
アジ化ナトリウムおよび0.02％トゥイーン20を含有する
100mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH6.0）に入れ、同じ緩衝
液で平衡化したレンチル・レクチン−セファロース４
（ファルマシア）のカラム（１×4cm）に通す。カラム
を、平衡緩衝液25mlおよび次いで同じ緩衝液中の0.5Mま
でのα−メチル−Ｄ−マンノピラノシド直線勾配100ml
で、流速10ml/時で溶出する。3mlのフラクションを集
め、アッセイに付す。（第２図参照） 工程４ ゲルに結合し、糖で溶出され、M1細胞に対する活性を
有するタンパク質のフラクションをプールし、濃縮し、
1mM PMSF、0.02％アジ化ナトリウムおよび0.02％トゥイ
ーン20を含有する100mM酢酸ナトリウム緩衝液（pH5.0）
に入れ、同じ緩衝液で平衡化したCM−セファロースCL−
6B（ファルマシア）のカラム（1.0×4.0cm）に通す。カ
ラムを、平衡緩衝液25mlおよび次いで同じ緩衝液中の1.
0MまでのNaCl直線傾斜100mlおよび次いでNaOHでpH10に
調節した1.0M NaCl25mlで溶出する。流速は2.0ml/時で
あり、3.0mlのフラクションを集める。（第３図参照） 工程５ ゲルに結合し、NaCl勾配で溶出され、M1細胞に対する
活性を有するタンパク質のフラクションをプールし、YM
−10メンブランで2mlに濃縮し、0.02％トゥイーン20を
含有する20mM酢酸アンモニウム緩衝液（pH5.0）に入
れ、0.45μミリポア（Millipore）・フィルターで濾過
する。ウォーターズ（Waters）脂肪酸分析カラムおよび
勾配プログラマー付き二重ポンプを取り付けた高速液体
クロマトグラフィー装置［ベックマン（Beckman）］の
インジャクターにプールを入れる。カラムを、トリフル
オロ酢酸（TFA）0.1％（w/v）を含有する水で平衡化
し、試料を注入し、次いで水および0.1％TFA中の34.8％
（v/v）までのアセトニトリル５分直線勾配でカラムを
溶出し、次いで水および0.1％TFA中の49.8％（v/v）ま
でのアセトニトリル50分直線勾配で溶出する。流速は1m
l/分であり、100mM炭酸水素アンモニウム50μおよび
0.4％トゥイーン20を含有するポリプロピレンチューブ
内に1mlのフラクションを集める。（第４図参照） 工程５で得られた、M1細胞に対して活性を有するフラ
クションは、２つの重複する紫外吸収ピークを有してい
た。それぞれのピークは、M1細胞に対する活性に関連し
ており、それぞれ銀染色法によるドデシル硫酸ナトリウ
ム・ポリアクリルアミドゲル上のMr58,000の単一のタン
パク質バンドに対応していた。各場合において、（LIF
も存在する）ゲルの平行のトラックを1mmのストリップ
に切断し、ゲルストリップからタンパク質を抽出し、抽
出したタンパク質の、半固形寒天培地面内のM1細胞に対
する増殖抑制および分化誘導能力をアッセイして評価す
ることにより、Mr58,000のタンパク質バンドがM1細胞に
対して生物学的活性を有していることがわかった。（第
５図参照） 実施例２ 以下の実施例は、Ｎ−末端アミノ酸配列、およびトリ
プシンまたはブドウ球菌V8プロテアーゼによるタンパク
質分解によって生じる種々のペプチドのアミノ酸配列を
調べる工程を説明する。

実施例１の操作によって精製したLIF（15μｇ）を、
ブラウンリー（Brownlee）RP300ビーズ（C8）を充填し
たミクロボア（2mm）カラムに通し、HPLC系において0.1
％トリフルオロ酢酸中の０〜60％アセトニトリル直線勾
配で溶出した。タンパク質は、100μの体積で単一の
ピークとして溶出された。これを、ガラスファイバーデ
ィスクに適用し、乾燥させ、次いで、アプライド・バイ
オシステム（Applied Biosystem）（モデル470A）気相
タンパク質シークエンサーのシークエンス室に入れた。
エドマン法によりタンパク質の配列分析を行い、個々の
アミノ酸のフェニルチオヒダントイン誘導体を、アプラ
イド・バイオシステム120A PTHアナライザーでHPLCによ
って同定した。

前記操作により精製したLIFの別の試料（20μｇ）
を、6Mグアニジン塩酸塩、0.2Mトリス−HCl緩衝液（pH
8.5）、2mMジチオトレイトールで希釈して2mlとし、37
℃で２時間インキュベートした。次いで、30倍モル過剰
のヨード酢酸を加え、溶液を37℃で更に15分間インキュ
ベートした。溶液を同じミクロボアHPLCカラムに通し、
前記のように溶出した。還元され、カルボキシメチル化
されたLIF誘導体（RCM−LIF）は、未処理LIFの３分後に
カラムから溶出され、RCM−LIF（200μ）を、0.02％
トゥイーン20、1mM CaCl₂およびTPCK−処理トリプシン
２μｇを含有する0.1Mトリス−HCl緩衝液（pH8.0）で希
釈して1mlとした。これを37℃で18時間インキュベート
し、混合物を再びミクロボアカラムに入れ、前記と同様
に溶出した。個々のペプチドはUV吸収ピークとしてあら
われ、個々に集めた。これらのペプチドのいつくかは、
前記と同様に直接配列分析に付したが、他のものは同じ
カラムで0.9％NaCl（pH6.0）中の０〜60％アセトニトリ
ル勾配を用いて再精製した後に配列分析に付した。

RCM−LIFの別の試料（200μ＝10μｇ）を、0.002M
EDTAおよび0.02％トゥイーン20を含有する0.05Mリン酸
ナトリウム緩衝液（pH7.8）で希釈して1mlとし、黄色ブ
ドウ球菌V8プロテアーゼ２μｇにより37℃で18時間分解
した。反応混合物を同じミクロボアカラムに通し、前記
のように溶出した。

LIFを同定する、アミノ末端からの26個のアミノ酸の
配列は以下の通りである： Ｎ−Pro−Leu−Pro−Ile−Thr−Pro−Val−Ｘ−Ala−Th
r−Ｘ−Ala−Ile−Arg−His−Pro−Cys−His−Gly−Asn
−Leu−Met−Asn−Gln−Ile−Lys 数種のトリプシンペプチドのアミノ酸配列は以下の通
りである： 1.His−Pro−Cys−His−Gly−Asn−Leu−Met−Asn−Gln
−Ile−Lys 2.Met−Val−Ala−Tyr… 3.Gly−Leu−Leu−Ser−Asn−Val−Leu−Cys… 4.Leu−Gly−Cys−Gln−Leu−Leu−Gly−Thr−Tyr−Lys 5.Val−Leu−Asn−Pro−Thr−Ala−Val−Ser−Leu−Gln
−Val−Lys 6.Asn−Gln−Leu−Ala−Gln−Leu−Ｘ−Gly−Ser−Ala
−Asn−Ala−Leu−Phe−Leu−Val−Glu−Leu−Tyr… 7.Leu−Val−Ile−Ser−Tyr… 8.Val−Gly−His−Val−Asp−Val−Pro−Val−Pro−Asp
−His−Ser−Asp−Lys−Glu−Ala−Phe−Gln 9.Leu−Ｘ−Ala−Thr−Ile−Asp−Val−Met−Arg 10.Gln−Val−Ile−Ser−Val−Val−Ｘ−Gln−Ala−Phe V8プロテアーゼによるLIFの分解によって生じるペプ
チドのアミノ酸配列は以下の通りであった： Ala−Phe−Gln−Arg−Lys−Lys−Ieu−Gly−Cys−Gln−
Leu−Leu−Gly−Thr−Tyr−Lys−Gln−Val−Ile−Ser−
Val−Val−Val−Gln−Ala−Phe 実施例３ 以下の実施例は、放射性ラベルしたLIFを得るため、
およびレセプター競合アッセイによってLIF原を同定す
るための工程を説明する。

第６図は、実施例３に関する:0℃における、放射性ヨ
ウ素化純LIF（２×10⁵cpm/ng）の、M1骨髄性白血病細胞
への結合。競合因子の存在下または不存在下に、M1細胞
（５×10⁶）を¹²⁵I−LIF（４×10⁵cpm）と２時間インキ
ュベートし、その後、ウシ胎児血清の遠心によって、結
合した放射能を未結合放射能から分離した。A.非標識純
LIFおよび競合因子としての純Multi−CSF、GM−CSF、Ｇ
−CSFまたはＭ−CSFの、所定の希釈における滴定（各希
釈10μを加えて最終体積80μとした）。最高濃度
は、それぞれ10⁴ユニット/ml;3.5×10⁴ユニット/ml;3×
10⁴ユニット/ml;5×10⁴ユニット/ml;4×10⁴ユニット/ml
であった。B.純LIFまたはリポポリサッカライド（LPS）
または種々の細胞の濃縮（４〜８倍）ならし培地または
内毒素注射マウスの血清の、前記¹²⁵I−LIFのM1細胞へ
の結合を競合する能力。

クレブスII腹水細胞ならし培地から実施例１に記載の
ように精製したLIFを、文献に記載の方法でチロシン残
基において¹²⁵Iで放射性ラベルし［ニコラ（Nicola,N.
A.）およびメトカルフ、ジャーナル・オブ・セルラー・
フィジオロジー（J.Cell.Physiol.）、128:180〜188、1
986］、比放射能約２×10⁵cpm/ngの¹²⁵I−LIFを調製し
た。¹²⁵I−LIFは、M1骨髄性白血病細胞並びにマウス成
熟骨髄、脾臓、胸腺および腹腔滲出細胞に特異的に結合
した。細胞オートラジオグラフィー分析により、¹²⁵I−
LIFは、マクロファージおよびその前駆細胞（細胞の成
熟につれてレセプター数が増加する）のみに特異的に結
合し、他の造血細胞には結合しなかったことがわかっ
た。このことは、LIFが、種々の疾病におけるマクロフ
ァージ機能の調節のための臨床的適用に有用であり得る
ことを示唆している。¹²⁵I−LIFのM1骨髄性白血病細胞
および腹腔マクロファージへの特異的結合は、非標識LI
Fによって阻害されたが、他の造血成長因子、例えばＧ
−CSF、GM−CSF、Ｍ−CSF（CSF−１）、Multi−CSF（イ
ンターロイキン３）、インターロイキン１、２、４、
６、内毒素または他の血成長因子によっては阻害されな
かった（第６図参照）。細胞ならし培地または細胞抽出
物は、そのような細胞への¹²⁵I−LIFの結合を阻害する
能力を有するので、種々の細胞および組織によって製造
または貯蔵されるLIFの存在を特異的アッセイすること
ができる。例えば、レクチン活性化LB3 T細胞のならし
培地は、¹²⁵I−LIFのM1細胞に対する特異的結合を強力
に阻害したので、LB3細胞はLIFを製造することがわか
る。

実施例４ 以下の実施例は、マウスLIFをコード化するmRNAのク
ローン化相補的DNAコピーを得るための工程を説明す
る。

第７〜10図は、以下に記載する方法の種々の工程に関
する。

第７図:LIFcDNAクローンのクローニングの工程１に関す
る。レクチン・コンカナバリンＡ刺激による、LB3細胞
の細胞質における造血成長レギュレーターのmRNAの蓄
積。WEHI−3B D^-細胞の細胞質ポリアデニル化RNA（５
μｇ）（トラック１）、５μg/mlコンカナバリンＡを用
いて10⁶細胞/mlとして５時間培養したＴ細胞クローンLB
3細胞（トラック２）、および非刺激LB3細胞（トラック
３）を、ホルムアミドアガロースゲル上で電気泳動し、
ニトロセルロースに移し、³²P−GM−CSFプローブ（パネ
ル１）または³²P−Multi−CSFプローブ（パネルｂ）と
ハイブリッド形成した［ケルソ（kelso,A.）、メトカル
フおよびゴー（Gough,N.M.）、ジャーナル・オブ・イム
ノロジー（J.Immunol.）、136:1718〜1725、1986］。

第８図:LIFcDNAクローンのクローニングの工程３に関す
る。:LIFクローンの同定に使用した合成オリゴヌクレオ
チド。Ｎ−末端近傍のマウスLIFアミノ酸の部分（残基1
5〜26、実施例２参照）を最初の行に示し、このペプチ
ドをコード化するmRNA配列の可能な組み合わせを次の行
に示し、このmRNA配列に相補的なオリゴヌクレオチドプ
ローブを下行に示す。Cys17およびHis18を除く全てのア
ミノ酸残基について、このオリゴヌクレオチドは、哺乳
動物コード化領域に最も頻繁に使用されるコドンのみに
相補的である［グランサム（Grantham,R.）ら、ヌクレ
イック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Res.）、
９43〜73、1981］。Cys17については、この配列はいず
れのコドンにも相補的である。His18については、この
オリゴヌクレオチドは、頻度の低いCAUコドンに相補的
である。隣接するGlyコドン（頻度の低いCpGジヌオクレ
オチド）と共に、CACコドンが用いられることはないと
考えられた［シュヴァルツ（Swartz,M.N.）ら、ジャー
ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（J.Biol.C
hem.）、238:1961〜1967、1962］。

第９図:LIFcDNAクローンのクローニングの工程４に関す
る。：第８図に示すオリゴヌクレオチドとのハイブリッ
ド形成によるLIFcDNAクローンの同定。

第10図:LIFcDNAクローンのクローニングの工程５に関す
る。:cDNAクローンpLIF7.2bのヌクレオチド配列およびL
IFアミノ酸配列。mRNA類似鎖の配列を、前記LIFの予想
したアミノ酸配列と共に５′から３′に記載する；行の
端の数は、その行の最後の残基（アミノ酸またはヌクレ
オチド）の位置を示す。アミノ酸配列は、このクローン
においてコード化された最初の残基から連続して番号を
付けた。タンパク質分析により決定したアミノ酸配列の
領域には上線を付した；これら２つの間には不一致がな
い。Pro9は、直接アミノ酸分析（実施例２）により決定
されたＮ−末端残基であった。Ｎ−結合グリコシル化の
可能性のある７個の部位は星印で示し［ノイバーガー
（Neuberger,A.）ら、グリコプロテインズ（Glycoprote
ins）、ゴットシャルク（Gottschalk,A.）編、エルセヴ
ィール、アムステルダム、450〜490頁、1972］、Ｏ−結
合グリコシル化の可能性のある４個の部位は井桁印で示
す［タカハシ（Takahashi,N.）ら、プロシーディングス
・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシー
ズ（Proc.Natl.Acad.Sci.）、米国、81:2021〜2025、19
84］。

工程1:LIFmRNA含有RNAの調製 クローン化マウスＴ細胞系LB3の細胞［ケルソおよび
メトカルフ、エクスペリメンタル・ヘマトロジー（Expt
l.Hematol.）、13:7〜15、1985］を、レクチン・コンカ
ナバリンＡで６時間刺激して、造血細胞の成長および分
化を調整する種々の因子をコード化するmRNAの細胞質に
おける蓄積を向上した［ケルソ、メトカルフおよびゴ
ー、ジャーナル・オブ・イムノロジー、136:1718〜172
5、1986］。（例えば、第７図は、そのような刺激によ
り、細胞中における造血成長因子GM−CSFおよびMulti−
CSFをコード化するmRNAの製造が上昇することを示
す。）細胞質RNAは、文献に記載の方法［ゴー、ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（J.Mol.Bio
l.）、165:683〜399、1983］で、５×10⁸コンカナバリ
ンＡ−刺激LB3細胞から調製した。ポリアデニル化mRNA
分子は、標準的な方法［マニアティス（Maniatis,T.）
ら、モレキュラー・クローニング（Molecular Clonin
g）、コールド・スプリング・ハーバー（Cold Spring H
arbor）、ニューヨーク、1982］により、２サイクルの
オリゴ−dTセルロースクロマトグラフィーによりリボソ
ームRNAから分取した。

後に、ノザン分析により、GM−CSFおよびMulti−CSF
のmRNAとは異なり、LIFmRNAは、LB3細胞中に構成成分と
して存在し、その量はコンカナバリンＡ刺激により向上
しないことがわかった［ギアリング（Gearing,D.P.）
ら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オー
ガニゼーション・ジャーナル（EMBO J.）、６:3995〜40
02、1987］。

工程2:LB3cDNA分子のライブラリーの合成およびクロー
ング 前記のように調製したLB3mRNAの２本鎖DNAコピーを標
準的な方法［マニアティスら、モレキュラー・クローニ
ング、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨー
ク、1982およびゴーら、ネイチャー（Nature）、309:76
3〜767、1984］で合成した。トリ骨髄芽球症ウイルス逆
転写酵素で触媒され、オリゴ−dTを用いる反応におい
て、細胞質ポリアデニル化LB3mRNA10μｇを、１本鎖相
補的DNA（cDNA）合成の鋳型として使用した。この反応
の完了後、0.3M NaOH、1mM EDTA中で65℃で１時間イン
キュベートすることによってmRNAを分解した。塩基を中
和し、エタノール沈澱によってcDNAを回収した後、大腸
菌DANポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで触媒さ
れた反応において、１本鎖cDNAを２本鎖の形態に変換し
た。次いで、１本鎖特異的ヌクレアーゼS1で処理するこ
とにより、cDNAの「ヘアピン・ループ」構造を切断し、
酵素末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
［マイケルソン（Michelson,A.M.）およびオーキン（Or
kin,S.）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミス
トリー（J.Biol.Chem.）、257:14773〜14782、1982］を
用いて、デオキシシチジン残基末端（残基約20〜30）を
２本鎖cDNAの各端に付加した。dC−末端cDNAを、1.5％
アガロースゲル電気泳動により分画し、長さ500bpを越
える分子を回収し、アニーリングしてプラスミドDAN分
子（pJL3、ゴーら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイ
オロジー・オーガニゼーション、４:645:653、1984）と
し、これを制限エンドヌクレアーゼSac1で切断し、それ
にデオキシグアノシン残基末端を付加した（マイケルソ
ンおよびオーキン、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー、257:14773〜14782、1982）。末端付加
cDNAおよびプラスミド分子を文献に記載の方法でアニー
リングし［ゴーら、バイオケミストリー（Biochemistr
y）、19:2702〜2710、1980］、アニーリングしたcDNA/
プラスミド混合物で大腸菌MC1050［カサダバン（Casada
ban,M.）およびコーヘン（Cohen,S.）、ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジー、138:179〜207、198
0］を形質転換し、約50,000の独立して形質転換された
バクテリアコロニーを、10μg/mlアンピシリン含有寒天
プレート上で増殖させて選択した。50μg/mlアンピシリ
ン含有液体増殖培地で洗浄することにより、形質転換し
たバクテリアコロニーを寒天プレートから回収し、10％
グリセロール中の10個のプールとして−70℃で貯蔵し
た。

工程3:オリゴヌクレオチド・プローブのデザイン LIFのアミノ末端の26個のアミノ酸配列と、トリプシ
ンおよびV8プロテアーゼによるLIF分解により生じる11
の異なるペプチドの残基とを決定した（実施例２参
照）。これらのアミノ酸配列は、LIFmRNAに対応するcDN
Aクローンを同定するためのハイブリッド形成プローブ
として使用する、LIFをコード化するmRNAの特定の領域
に相補的なオリドヌクレオチドのデザインの基礎を供給
した。

各天然アミノ酸は、その対応するmRNAにおいて、３個
のリボヌクレオシドトリホスフェートの特定の組み合わ
せ（コドン）によりコード化される［例えば、ワトソン
（Watson,J.）、モレキュラー・バイオロジー・オブ・
ザ・ジーン（Molecular Biology of the Gene）、第３
版、ベンジャミン／カミングス（Benjamin/Cumming
s）、メンロ・バーク（Menlo Park）、カリフォルニ
ア、1976）］。あるアミノ酸は、唯一のコドンによって
のみ特定されるが、６種ものコドンによって特定される
アミノ酸もある（例えば、前掲のワトソン、モレキュラ
ー・バイオロジー・オブ・ザ・ジーン）。従って、ヌク
レオチド配列の多数の異なる組み合わせが実際に特定の
アミノ酸配列をコード化するので、そのペプチドをコー
ド化し得るすべての可能な配列を提供するためには多数
の異なる退化オリドヌクレオチドが構成される必要があ
る。しかし、高度に退化したオリドヌクレオチドをハイ
ブリッド形成プローブとして使用することは技術的に困
難である。しかし、特定のアミノ酸のためにすべてのコ
ドンが等しい頻度で用いられているのではなく［グラン
サムら、ヌクレイック・アシッズ・リサーチ、９43〜7
3、1981］、哺乳動物のゲノムにおいてCpGジヌクレオチ
ドは表現不十分であり、塩基組み合わせから予想される
頻度の20〜25％しか起こらない［シュヴァルツら、ジャ
ーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー、238:19
61〜1967、1962］ので、特定のペプチドをコード化する
あり得るヌクレオチド配列を予測し、特定のオリドヌク
レオチドプローブの複雑さを軽減することがしばしば可
能である。前記のように考慮して、異なるLIFペプチド
に対応する多数のオリドヌクレオチドを標準的な方法に
よってデザインおよび合成した。

工程4:LIF−コード化クローンのLB3cDNAライブラリーの
スクリーニング オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成に
よってバクテリアのコロニーをスクリーニングするため
に、前記LB3cDNAライブラリーの各プールからの10,000
〜15,000個のバクテリアコロニーを寒天プレート（50μ
g/mlアンピシリン含有）上で増殖させ、ニトロセルロー
スフィルターディスクに移し、フィルターを200μg/ml
クロラムフェニコール含有寒天プレート上でインキュベ
ートすることによって増幅した［ハナハン（Hanahan,
D.）およびメセルソン（Meselson,M.）、ジーン（Gen
e）、10:63〜64、1980］。コロニーを元のプレート上で
再増殖させた後、第２のニトロセルロースフィルターを
前記のように調製した。このマスタープレートを短時間
増殖させ、次いで４℃で貯蔵した。プラスミドDNAをバ
クテリアコロニーから遊離し、前記のようにニトロセル
ロースフィルターに固定した（マニアティスら、モレキ
ュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク、1982）。ハイブリッド形成の前に、
0.9M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム、0.2％フィコ
ル、0.2％ポリビニル−ピロリドン、0.2％ウシ血清アル
ブミン、50μg/ml熱変成サケ精子DNA、50μg/ml大腸菌t
RNA、0.1M ATPおよび2mMピロリン酸ナトリウム中でフィ
ルターを37℃で数時間インキュベートした。0.1％NP40
を更に添加した同じ溶液中で、37℃で18時間ハイブリッ
ド形成を行った。ポリヌクレオチドキナーゼによって触
媒され、［γ−³²P］APT500μCi（比活性2,000〜3,000C
i/mmol）を含有する反応において、第８図に示す合成オ
リゴヌクレオチド500ngを放射性ラベルした。次いで、N
ACS−PREPACカラム［ベテスダ・リサーチ・ラボラトリ
ーズ（Bethesda Research Laboratories）］をその製造
者の指示に従って使用したイオン交換クロマトグラフィ
ーによって、取り込まれなかった［γ−³²P］APTを、放
射性ラベルされたオリゴヌクレオチドから分離した。放
射性ラベルしたオリゴヌクレオチドを、約20ng/mlの濃
度でハイブリッド形成反応に用いた。ハイブリッド形成
後、0.9M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム、0.1％ドデ
シル硫酸ナトリウム中で種々の温度（以下に記載する）
でフィルターを広範囲に洗浄し、各洗浄後、オートラジ
オグラフィーに付した。

洗浄を連続的に行うことの背後にある根本原理は、低
温において、オリゴヌクレオチドと少しでも相同性（約
15のヌクレオチド）を有する全てのクローンが２重フィ
ルター上にオートラジオグラフィーのスポットとして現
れることである。温度が上昇すると、オリゴヌクレオチ
ドプローブが相同性レベルの低いクローンから融解し、
それ故対応するオートラジオグラフィーシグナルが無く
なる。相同性レベルの最も高いクローン（すなわちLIFc
DNA配列を有する可能性の最も高いクローン）は、最も
高い温度でハイブリッド形成を保持する。この方法によ
って、最も可能性の高いクローンを直接得ることが可能
となる。第９図は、洗浄温度を46℃から66℃℃に上昇し
た際の、15,000のLB3cDNAクローンを含有する１対のフ
ィルター上における１組のクローンの挙動を示す。いく
つかのクローンは、低温においてのみオリゴヌクレオチ
ドへのハイブリッド形成を保持したが、66℃においても
ハイブリッド形成を保持したものもあった（例えばクロ
ーン１および２）。更に分析するために後者のクローン
を選択し、対応するバクテリアコロニーをマスタープレ
ートから取り、生成し、標準的な方法で各バクテリアク
ローンからプラスミドDNAを調製した（マニアティス
ら、モレキュラー・クローニング、コールド・スプリン
グ・ハーバー、1982）。これらのクローンの予備構造分
析（挿入cDNAのサイズの評価、種々の制限エンドヌクレ
アーゼの切断部位のマッピング、および異なるLIFペプ
チドに対応する種々のオリゴヌクレオチドとのハイブリ
ッド形成の試験による）によると、これらのクローンの
各々は実際には同じであった；すなわち、これらは、同
じクローニング例からの異なった単離物であった。従っ
て、唯一のクローンpLIF7.2bについて更に詳細な分析を
行った。

工程5:pLIF7.2bのヌクレオチド配列の決定 ジデオキシ法［サンガー（Sanger,F.）ら、プロシー
ディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サ
イエンシーズ、米国、74:5463〜5467、1977］によっ
て、シークエンジング反応において、アルカリ性または
熱変性２本鎖プラスミドDNAを鋳型として使用し、そのc
DNAに沿うベクター（pJL3）の領域にも、cDNAインサー
ト中の配列にも相補的な種々のオリゴヌクレオチドをプ
ライマーとして使用し、大腸菌DNAポリメラーゼＩのク
レノウフラグメントおよびトリ骨髄芽球症ウイルス逆転
写酵素をポリメラーゼとして使用して、クローンpLIF7.
2bのcDNA部分のヌクレオチド配列分析を行った。このよ
うに決定したクローンpLIF7.2bのcDNA部分の配列を、第
10図に示す。このような分析により、終止コドンによっ
て中断されていない全cDNAに及ぶ唯一の翻訳リーディン
グフレーム中で、LIF分子の種々のペプチドに対して予
め決定された全てのアミノ酸配列がわかり得るので、こ
のクローンが、LIF分子をコード化する能力を有するmRN
AのDNAコピーを含有することが確認された。しかし、こ
のクローンは、（ａ）５′末端においてメチオニンコド
ンによって開始される推定される疎水性リーダー配列を
コード化する領域を伸長せず、（ｂ）３′末端において
イン−フレーム翻訳終止コドンを含まないので、LIFコ
ード化領域の完全なコピーを含有する。しかし、成熟タ
ンパク質をコード化する領域の開始を５′末端において
伸長することが、予め決定したアミノ末端アミノ酸配列
との比較によりわかった（第10図のPro9残基）。

実施例５ 以下に、マウスLIFコード化領域の全コピーを構成
し、このコピー化領域を酵母発現ベクターに挿入し、マ
ウスLIFを製造する工程を説明する。

第11図：酵母細胞におけるマウスLIFの発現の工程１に
関する:LIFのＣ−末端アミノ酸配列。pLIF7.2bリーディ
ングフレームのＣ−末端におけるアミノ酸配列を示し、
その下にはブドウ球菌V8プロテアーゼおよびクレブス腹
水癌細胞から精製されたLIFから誘導されるトリプシン
ペプチドの配列を示す。後２者のペプチドは、pLIF7.2b
LIF配列に更に９個のアミノ酸を加えたものであり、末
端が同じ残基である。クローンpLIFNK1の対応する領域
のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、最下行に示し、
直接アミノ酸シークエンシングによって決定されたＣ−
末端を確認する。番号付けは第10図の通りである。

第12図：酵母細胞におけるマウスLIFの発現の工程２に
関する：酵母発現ベクターYEpseclに挿入するpLIF7.2bc
DNAの再構成。pLIF7.2bcDNAの部分ヌクレオチド配列お
よびそれによってコード化されたアミノ酸配列を上の行
に示す。番号付けは第10図および第11図に従う。第２行
および第３行は、それぞれpLIFmut1およびpLIFmut2の配
列を示す。星印は、終止コドンを示す。YEpsecl［バル
ダリ（Baldari,C.）ら、ヨーロピアン・モレキュラー・
バイオロジー・オーガニゼーション・ジャーナル、６:2
29〜234、1987］およびpGEX−2T［スミス（Smith,D.
B.）およびジョンソン（Johnson,K.G.）、ジーン、198
8］中にクローニングするための制限部位（BamH I、Hin
d IIIおよびEcoR I）を示す。最下行には、YEpsecl中の
クルイヴェロミセス・ラクティスのキラー毒素シグナル
配列の部分配列を示す。BamH I制限部位のGly−Serコー
ド化配列は、シグナルペプチドによって有効に認識され
る（バルダリら、ヨーロピアン・モレキュラー・バイオ
ロジー・オーガニゼーション・ジャーナル、６:229〜23
4、1987）。

第13図：酵母細胞におけるマウスLIF発現の工程４に関
する:M1白血病細胞の培養における酵母誘導組換LIFの生
物学的活性。酵母誘導組換LIF（−●−）および精製天
然LIF−Ａ（−○−）のM1培養への滴定は、M1コロニー
の分化（パネルＡ）およびコロニー生成の抑制（パネル
Ｂ）の同様の濃度依存性誘導を示す。各ポイントは、２
培養の平均値を表す。

第14図：酵母細胞におけるマウスLIF発現の工程５に関
する：種々の希釈度における、真正天然マウスLIF−Ａ
（−○−）、ガラクトースで誘導されたLIFmut1/YEpsec
l組換体を含有する酵母細胞のならし培地（−●−）お
よびガラクトースで誘導されていない同じ酵母細胞の培
地（−＋−）の、天然¹²⁵I−LIF−Ａとマウス腹腔細胞
上の細胞レセプターを競合する能力を示す。

工程1:マウスLIFのＣ−末端におけるアミノ酸配列の決
定 実施例４のcDNAクローンpLIF7.2bは、マウスLIFmRNA
の不完全なコピーを含有する。５′末端において、cDNA
は、Ｎ−末端アミノ酸配列分析によって決定した最初の
残基（第10図におけるPro9）に結合するＮ−末端の８個
の残基をコード化する。しかし、３′末端においては、
pLIF7.2bは、イン−フレーム翻訳終止コドンを含まない
ので不完全である。直接アミノ酸シークエンシング（実
施例２）によって決定された２種のLIFペプチドのアミ
ノ酸配列の調査により、pLIF7.2bは３′末端においてコ
ード化領域のわずかに27のヌクレオチドを欠くことが示
唆された。第11図に示すように、V8−誘導ペプチドは、
cDNA配列の残基Ala162に始まり、９個の残基によってcD
NAクローンから推測されるアミノ酸配列に至っていた。
V8ペプチド中に含まれるトリプシンペプチドの末端が同
じ残基であり、このことは、Phe187がタンパク質のＣ−
末端残基であることを示唆している。この推定を確認す
るために、pLIF7.2bと重複し、３′方向に伸長するLIFc
DNAクローンを単離し、ヌクレオチド配列分析に付し
た。

そのようなクローンを単離するための適当なcDNAライ
ブラリーを構成し、スクリーニングするために、ノザン
法により一連の異なるmRNA試料をスクリーニングして、
LIFmRNA分子濃度が最高であるRNA試料を同定した。実質
的に文献に記載の方法（ゴー、ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー、165:683〜699、1983）で調製
した細胞質ポリアデニル化RNAを、20mMモルホリノプロ
パンスルホン酸（MOPS）、5mM酢酸ナトリウム、1mM EDT
A（pH7.0）および６％v/vホルムアルデヒドを含有する
１％アガロースゲル上で分画し、RNA含有フィルター
を、0.2％フィコル、0.2％ポリビニル−ピロリドン、0.
2％ウシ血清アルブミン、2mMピロリン酸ナトリウム、1m
M ATP、80μg/ml変性サケ精子DNAおよび50μg/ml大腸菌
tRNAを含有する２×SSCに、67℃で数時間浸漬した。0.1
％SDSを加えた同じ緩衝液中で67℃でハイブリッド形成
を行った。LIF転写を検出するために使用したプローブ
は、pSP65中でサブクローン化されたpLIF7.2bのcDNAイ
ンサートを含有する約750bpのEocR I−Hind IIIフラグ
メントから成っていた。このフラグメントは、cDNA配列
を有するだけでなく、Ｇ−Ｃ末端およびpJL3ベクター配
列の約150bpをも有していた。約２×10⁹cpm/μｇのリボ
プローブは、BRESA［アデライド（Adelaide）］の試薬
を用いるSDP6サブクローンの転写により誘導した。この
プローブは、約２×10⁷cpm/mlでハイブリッド形成に用
いた。フィルターを、オートラジオグラフィーに付す前
に、２×SSC、2mM EDTA、0.1％SDS中で67℃で、および
最後に0.2×SSC中で67℃で広範に洗浄した。

このような分析により、LIF転写物は種々の造血細胞
系中に底レベルで存在し、クレブスRNAのバッチによっ
てLIFmRNAのレベルには大きな差があることがわかっ
た。クレブス腹水癌細胞RNAの２つのバッチを選択し
て、２つのcDNAライブラリーを合成した。cDNAライブラ
リーは、アメルシャム（Amersham）の試薬（製造番号RP
N.1256およびRPN.1257）を、その製造者の指示に従って
用いて構成した；クローニングベクターはλGT10であっ
た。約４×10⁵の組換クローンが得られ、pLIF7.2bの
３′末端における36残基の配列に対応するオリゴヌクレ
オチドとのハイブリッド形成によってスクリーニングし
た：第10図のヌクレオチド500〜535（両端を含む）。

クレブスcDNAライブラリーに相当するファージプラー
クを、10cmのペトリ皿当たり約50,000のプラークの密度
で増殖させ、ニトロセルロースに移し、標準的な方法で
処理した（マニアティスら、モレキュラー・クローニン
グ、コールド・スプリング・ハーバー、1982）。ハイブ
リッド形成の前に、６×SSC（SSC＝0.15M NaCl、0.015M
クエン酸ナトリウム）、0.2％フィコル、0.2％ポリビニ
ル−ピロリドン、0.2％ウシ血清アルブミン、2mMピロリ
ン酸ナトリウム、1mM ATP、50mg/ml変性サケ精子DNAお
よび50μg/ml大腸菌tRNA中で、フィルターを37℃で数時
間インキュベートした。0.1％NP40を含有する同じ溶液
中で、37℃で16〜18時間ハイブリッド形成を行った。
［γ−³²P］ATPおよびポリヌクレオチドキナーゼで比活
性約10⁹cpm/μｇに放射性ラベルし、取り込まれなかっ
たラベルからNACSカラム（ベテスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ）を用いるイオン交換クロマトグラフィーによ
り分離した前記オリゴヌクレオチドプローブを、約20ng
/mlの濃度でハイブリッド形成に用いた。ハイブリッド
形成後、６×SSC、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム中で60
℃でフィルターを洗浄した。前記のように、フィルター
上で陽性のクローンλLIFNK1に相当する１個のプラーク
を取り、低密度で再スクリーニングした。

前記オリゴヌクレオチドとハイブリッド形成したλLI
FNK1中の約950bpのcDNAインサートを、プラスミドベク
ター［pEMBL8＋、デンテ（dente,L.）ら、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ、11:1645〜1655、1983］中にサ
ブクローン化してクローンpLIFNK1を生成した。pLIFNK1
のcDNAインサートのヌクレオチド配列分析は、ジデオキ
シ法（サンガーら、プロシーディングス・オブ・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ、米国、74:5
463〜5467、1977）によって、アルカリ性変性２本鎖プ
ラスミドDNAを鋳型として用い［チェン（Chen,E.Y.）お
よびシーバーグ（Seeburg,P.H.）、DNA、４:165〜170、
1985］、cDNAに沿うベクターにもcDNA内の配列にも相補
的な種々のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用
い、大腸菌DNAポリメラーゼのクレノウフラグメントお
よびAMV逆転写酵素をポリメラーゼとして用いて行っ
た。pLIFNK1中のcDNAインサートの部分のヌクレオチド
配列を第11図に示す。pLIFNK1によって特定されるアミ
ノ酸配列は、Ｃ−末端において、直接アミノ酸シークエ
ンシングによってLIFのＣ−末端を構成すると予測され
る９個のアミノ酸と同じであり、pLIFNK1cDNA配列にお
いて、このPhe187のコドンが直接にイン−フレーム翻訳
終止コドンにつながっているので、Phe187がLIFのＣ−
末端残基であることが確認された。

工程2:酵母発現ベクター中のLIFコドン領域の構成 LIFcDNAクローンによってコード化されたタンパク質
の最初の製造が真核系（酵母）において達成され、発現
された生成物はグリコシル化され、分泌され、正確に折
り畳まれた。用いた発現ベクターYEpseclは、クルイヴ
ェロミセス・ラクティスのキラー毒素遺伝子から誘導さ
れ、イオンターロイキン１の有効に分泌することが示さ
れており（バルダリら、ヨーロピアン・モレキュラー・
バイオロジー・オーガニゼーション・ジャーナル、６:2
29〜234、1987）、ガラクトース誘導性ハイブリッドGAL
−CYCプロモーターから転写されたＮ−末端リーダー配
列を提供する。

このベクター中のpLIF7.2bによってコード化されたタ
ンパク質を発現するために、cDNAを幾つかの手段で修飾
する必要があった（第12図参照）。５′末端において、
部分的な哺乳動物のリーダー配列を特定する数個のヌク
レオチドを除去するだけでなく、適当な制限エンドヌク
レアーゼ切断部位（BamH I）を設けて、クルイヴェロミ
セス・ラクティスリーダーを挿入させ、適当なシグナル
ペプチダーゼ切断部位（Gly−Ser）を保持することが必
要であった。３′末端においては、LIFのコード化領域
の２種の構成がなされた。１種（LIFmut1）は、pLIF7.2
bの最後のコドン（Gln178）に終止コドンがつながるよ
うに構成された。他方（LIFmut2）は、pLIF7.2b（前記
参照）に欠損していることが知られている９個のアミノ
酸残基をコード化する配列を付加し、これに翻訳終止コ
ドンがつながるように構成された。適当な制限エンドヌ
クレアーゼ切断部位（Hind III）は、いずれの構造にお
いても構成された。これらの修飾はすべてオリゴヌクレ
オチド介在突然変異誘発により達成された:pLIF7.2bの5
35bpのcDNAインサートを持ち、Ｇ−Ｃ末端およびpJL3ベ
クターの部分によって制限された約750bpのEcoR I−Hin
d IIIフラグメントは、プラスミドpEMBL8＋中にサブク
ローン化し（デンテら、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ、11:1645〜1655、1983）、１本鎖DNAは、文献に記
載の方法で調製した［セサリーニ（Cesarini,G.）およ
びマーレイ（Murray,J.A.H.）、セトロウ（Setlow,J.
K.）およびホレンダー（Hollaender,A.）編、ジェニテ
ィック・エンジニアリング：プリンシプルズ・アンド・
メソッズ（Genetic Engineering:Principles and Metho
ds）、プレナム・プレス（Plenum Press）、ニューヨー
ク、第８巻、1987］。イン・ビトロの突然変異誘発は、
文献に記載のようにして［ニスベット（Nisbet,I.T.）
およびベイルハルツ（Beilharz,M.W.）、ジーン・アナ
リシス・テクニークス（Gene Anal.Techn.）、２:23〜2
9、1985］、35、51および61塩基のオリゴヌクレオチド
を用いて行い、概略を示したcDNAの５′末端および３′
末端を修飾した。修飾されたLIFcDNA配列を含むBamH I
−Hind IIIフラグメントを、プラスミドYEpseclに入
れ、得られる組換体中のインサートのヌクレオチド配列
を決定した。

工程3:YEpsecl/LIF組換体の、酵母細胞への導入 ビール酵母菌株GY41［leu2 ura3 ade1 his4 met2 trp
5 gal1 cir＋;x 4003−5b、イースト・ジェネティック
・ストック・センター（Yeast Genetic Stock Centr
e）、バークレイ（Berkeley）］を、ポリエチレングリ
コール法によって形質転換した［クレベ（klebe,R.J.）
ら、ジーン、25:333〜341、1983］。形質転換体は、ウ
ラシル不存在下に合成最少培地［必要なアミノ酸50μg/
mlを追加した、２％炭素原、0.67％酵母窒素成分（ディ
フコ;Difco）］上で選択および保持した。プラスミドYE
psecl中のインサート配列の発現は、非選択的完全培地
（１％酵母抽出物、２％ペプトン）または合成最少培地
（いずれも２％ガラクトースを含有する）中で、形質転
換体を増殖することによって達成された。

工程4:酵母誘導LIFの生物学的性質の決定 酵母ならし培地の分化誘導活性および白血病抑制活性
のアッセイを、ウシ胎児血清20％および寒天0.3％の最
終濃度のダルベッコ改良イーグル培地中にM1細胞300個
を含有する培養液（ホズミ博士、サイタマ・カンサー・
リサーチ・センター（Saitama Cancer Research Centr
e）、日本により提供）1ml中で行った。アッセイに付す
材料は、連続的希釈物0.1mlとして、寒天培地中の細胞
懸濁液を添加する前に培養器に加えた。培養は、10％CO
₂の水蒸気飽和雰囲気中で７日間インキュベートした。
培養は、顕微鏡を用いて倍率35で記録し、分散した細胞
を有するコロニーまたは分散した細胞のみから成るコロ
ニーは、分化されたと記録した。形態学的観察は、全培
養を2.5％グルタルアルデヒド1mlで固定し、次いで顕微
鏡のスライド上で乾燥した培養を、アセチルコリンエス
テラーゼ／ルクソール・ファスト・ブルー（Luxol Fast
Blue）／ヘマトキシリンで染色することによって行っ
た。

コロニー刺激活性のアッセイは、75,000個のC57BL骨
髄細胞を用いて文献に記載の方法で行った（メトカル
フ、ザ・ヘモポイエティック・コロニー・スティミュレ
ーティング・ファクターズ、エルセヴィール、アムステ
ルダム、1984）。WEHI−3BD⁺細胞に対する分化誘導活性
のアッセイは、文献に記載のように行った（ニコラら、
ザ・ヘモポイエティック・コロニー・スティミュレーテ
ィング・ファクターズ、258:9017〜9023、1983）。

非形質転換酵母、ベクターYEpseclのみを有する酵母
または不完全なコード化領域（LIFmut1）を有する酵母
の培養のものではなく、全コード化領域（LIFmut2）を
有する酵母の培養の培地は、M1コロニーの培養において
典型的なマクロファージ分化を誘導することができた
（第13A図）。精製した天然LIFを用いた場合と同様に、
酵母誘導物質も、濃度を増すと、分化するM1コロニーの
数およびサイズを徐々に低下させた（第13B図）。精製
した天然LIFとの比較により、酵母ならし培地は、16,00
0ユニット/ml（約130ng/ml）までのLIFを含有すること
が示唆された。酵母誘導LIFは、精製した天然LIF−Ａと
同様に、正常顆粒球−マクロファージ前駆細胞によるコ
ロニーの形成を刺激すること、またはWEHI−3B D⁺白血
病コロニーの分化の誘導もしくは増殖の抑制を行うこと
はない。

セファクリル（Sephacryl）ｓ−200カラムによるサイ
ズ分画により、クレブス細胞から誘導されるLIFには58,
000ダルトンであるのに対して、酵母誘導LIFは見掛けの
分子量が67,000〜150,000ダルトンのタンパク質と共に
溶出されることがわかった。

不完全なコード化領域（LIFmut1）を有する酵母のな
らし培地にLIF活性が無いことは、この構造に欠損して
いる９個の疎水性Ｃ−末端残基がLIF機能に必要である
ことを示唆している。これらの残基はレセプターと相互
作用し得るが、タンパク質中で疎水性のコアの部分の形
成もし、それ故その欠如は、適当な折り畳みの妨害とな
り得る。または、そのような残基は、LIFの有効な分泌
に何等かの形式で必要なのであろう。

工程5:酵母誘導マウスLIFおよびクレブスII腹水細胞な
らし培地から精製した天然LIF−Ａのレセプター結合特
異性 精製したマウスLIF−Ａ（実施例１）を前記のように
ヨウ素化した（実施例３）。腹腔内でチオグリコーレー
トにより高レベルのマクロファージを誘導したマウスか
ら、洗浄によって腹腔細胞を採った。これらの細胞を洗
浄し、10％ウシ胎児血清含有Hepes−緩衝PRMI培地に、
2.5×10⁶/50μで再懸濁させた。細胞懸濁液50μを2
00,000cpmの¹²⁵I−LIF−Ａ（10μ、同じ培地中）およ
び10μ中の対照培地または非ラベル純マウスLIF−Ａ
もしくは酵母誘導マウスLIFの連続２倍希釈物と共にイ
ンキュベートした。適当な濃度において、LIFmut2構造
（第12図）含有ガラクトース誘導酵母の上澄は、腹腔細
胞レセプターへの結合を¹²⁵I−LIF−Ａと競合したが、
非誘導酵母上澄は競合しなかった（第14図）。競合の度
合いは、真正天然LIF−Ａのそれと同じくらいであり、
このことは、酵母誘導LIF−Ａが、LIF−Ａ細胞レセプタ
ーへの結合に必要なすべての情報を有することを示唆し
ている。

実施例６ 本実施例は、哺乳動物細胞における組換マウスLIFの
発現のための工程を説明する。

第15図は、以下に記載する方法の工程１に関する：ク
ローンpLIFNK3のcDNA部分のヌクレオチド配列。mRNA同
義鎖のヌクレオチド配列を、上部に示すLIFの推定アミ
ノ酸配列と共に５′から３′方向に示す。予め決定した
Ｎ−末端アミノ酸残基を＋１として示す。cDNAの５′末
端のEcoR I部位および終止コドンにかかるXba I部位
（工程２においてLIFコード化領域をpMP−Zenに挿入す
るのに使用した。）を示す。

工程1:マウスLIFのＮ−末端リーダー配列のアミノ酸配
列の決定 cDNAクローンpLIF7.2bおよびpLIFNK1（前記）は、LIF
mRNAの不完全なコピーを含有する。これらは、LIFタン
パク質の成熟部分の完全なコード化領域をも有するが、
哺乳動物細胞からのLIFの分泌に要する完全な疎水性リ
ーダー配列を持たない。

疎水性リーダーをコード化する領域を含有するcDNAク
ローンを単離するためにクレブスmRNAの同じバッチを鋳
型として用いて前記（実施例５）のように構成した更に
10⁶のcDNAクローンを、pLIF7.2b配列の５′末端の35残
基および３′末端の36残基の配列に対応する２つのオリ
ゴヌクレオチド（第10図における、ヌクレオチド67〜10
2および500〜535）をプローブとして用いて（前記のよ
うに）スクリーニングした。

複製フィルター上で陽性のクローンλLIFNK2およびλ
LIFNK3を表す２つのプラークを採り、前記のように低密
度でスクリーニングした。λLIFNK3は、用いた２種のオ
リゴヌクレオチドの各々と共にハイブリッド形成するこ
とが示されたので、これを更に分析した。

λLIFNK3中の約1400bpのcDNAインサートを、プラスミ
ドベクターpEMBL8⁺（デンテら、ヌクレイック・アシッ
ド・リサーチ、11:1645〜1655、1983）中にサブクロー
ニングして、クローンpLIFNK3を生成した。pLIFNK3のcD
NAインサートのヌクレオチド配列分析は、（前記）pLIF
7.2bおよびpLIFNK1の場合と同様に行った。

pLIFNK3のcDNAインサートのヌクレオチド配列を第15
図に示し、pLIFNK3は完全なLIFコード化領域を含むこと
を示す:pLIFNK3配列中の23〜25の位置に開始コドン（AU
G）があり、次いで、24個のアミノ酸残基の疎水性リー
ダ配列をコード化する配列がある。コード化領域は、pL
IFNK1によって予め決定されたものと同じ翻訳終止コド
ン（前記）に至る。

工程2:LIFコード化領域の、哺乳動物発現ベクターへの
導入 最初に選択した哺乳導入発現ベクターは、レトロウイ
ルス発現ベクターpMP−Zenであった。このベクターは、
モノニーマウス白血病ウイルス系ベクターpZIPNeoSV
（Ｘ）から、Xho I発現部位を残して、近傍のSV40およ
びプラスミド配列と共にneo^R遺伝子を削除することによ
り誘導した。ベクターの３′領域も修飾して、骨髄増殖
性肉腫ウイルス（MPSV）のLTR由来のエンハンサーを組
み込んだ［ボウテル（Bowtel,D.D.L.）ら、モレキュラ
ー・バイオロジー・アンド・メディシン（Mol.Biol.Me
d.）、４:229〜250、1987］。第１に、LIF/PMP−Zen組
換体は、ψ２細胞を通ってヘルパー−フリー感染性レト
ロウイルス粒子中に入れられるので、このベクターを選
択した［マン（Mann,R.）ら、セル（Cell）、33:153〜1
59、1983］。このようなウイルス粒子は、次いで、LIF/
pMP−Zen組換体を種々のマウス細胞に（感染により）有
効に導入するために使用される（マンら、セル、33:153
〜159、1983］。第２に、外来のコード化領域の発現の
ためのMPSV LTRを有するこのベクターは、GM−CSFを含
む特定の他の造血増殖および分化因子の有効な発現を起
こすことがわかっている。

pMP−Zenへの挿入のために選択したpLIFNK3のセグメ
ントは、位置１（EcoR I部位）から位置630（終止コド
ンにかかるXba1部位）に至る−第15図参照。このセグメ
ントは、プレーLIFのコード化領域以外はあまり含有せ
ず、mRNAの不安定性をもたらす配列を有し得る３′非翻
訳領域のすべてを有していないので選択した［例えば、
シャウ（Shaw,G.）およびカメン（Kamen,R.）、セル、4
6:659〜667、1986;ヴェルマ（Verma,I.M.）およびサッ
ソン−コルシ（Sassone−Corsi,P.）、セル、51:513〜5
14、1987］。このフラグメントをpMP−Zenに挿入するた
めに、標準的な方法（マニアティスら、1982、前掲書）
によって、pIC20H［マーシュ（Marsh,J.L.）ら、ジー
ン、32:481〜485、1984］のEcoR IおよびXba I部位の間
にまず挿入した。次いで、このcDNAインサートを、pIC2
0Hプラスミドのポリリンカーから、Sal IおよびXho I分
解により回収することによって、pMP−ZenのXho Iクロ
ーニング部位に挿入するのに適当な結合端を有するLIFc
DNAを生成した。このLIFcDNAフラグメントのpMP−Zenへ
の挿入は、標準的な方法（マニアティスら、1982、前掲
書）によって行った。

工程3:pMP−Zen/LIF組換体の、マウス繊維芽球への導入 pMP−Zen/LIF DNAを、ψ２繊維芽球にエレクトロポレ
ーションによって導入した［ポッター（Potter）ら（PN
AS）、81:7161〜7165、1984］。pMP−Zen/LIF DNA30μ
ｇおよびpSV2Neo DNA［サザン（Southern,P.J.）および
バーグ（Berg,P.）、ジャーナル・オブ・モレキュラー
・アンド・アプライド・ジェネティクス（J.Mol.App.Ge
net.）、１:327〜341、1982］３μｇを、DME/10％FCS
（10％ウシ胎児血清を含有するダルベッコ改良イーグル
培地）1ml中の１×10⁶個のψ２繊維芽球と混合し、キャ
パシタンス25μＦで500vの電流をかけた［バイオラド・
ジーン・パルサー（BioRad Gene−Pulser）モデルNo.16
52078を使用］。形質転換体は、まず、pSV2Neo DNAの抗
生物質G418に対する耐性に基づいて選択した。G418耐性
ψ２細胞は、標準的な方法（マンら、セル、33:153〜15
9、1983）によって、400μg/mlで選択した。試験した19
個のG418耐性クローンのうちの２個は、pMP−Zen/LIF構
造をも有しており、これはψ２ならし培地中において検
出し得るLIF活性によって評価された。

工程4:ψ２誘導LIFの生物学的性質の決定 pMP−Zen/LIF含有ψ２細胞のならし培地の分化誘導活
性および白血病抑制活性のアッセイを、前記のように行
った。DME/10％FCS3ml中の10⁶個のψ２細胞の培養から
の培地の分化誘導活性をアッセイした。２つの陽性の培
養の結果を次の表に示す： このように、この発現系において、生物学的に活性な
組換マウスLIFの有意のレベルが達成できた。

工程5:ψ２細胞から造血細胞へのpMP−Zen/LIFレトロウ
イルスの伝播 感染性pMP−Zen/LIFレトロウイルスは、共培養によ
り、親ψ２細胞系から系FDC−P1の造血細胞［デクスタ
ー（Dexter,T.M.）ら、ジャーナル・オブ・エクスペリ
メンタル・メディシン（J.Exp.Med.）、152:1036〜104
7、1980］に移ることができた。FDC−P1細胞の増殖のた
めの最適濃度のWEHI−3BD^-ならし培地を含有するDME/10
％FCS10ml中で、10⁶個のψ２細胞を、10⁶個のFDC−P1細
胞と混合した。２日間インキュベートした後、非付着FD
C−P1細胞を除去し、すべての付着ψ２細胞を洗い落と
し、同じ培地3ml中で16時間増殖させた。ならし培地を
採り、前記のように分化誘導および白血病抑制活性のア
ッセイに付した。結果を次の表に示す。

このように、ψ２クローンであるψ２−11aおよびψ
２−11dは、生物学的活性pMP−Zen/LIFレトロウイルス
を造血細胞に透過させることができる。従って、これら
のクローンは、Zen/GM−CSFウイルス感染のために使用
したものと同様に、正常マウス造血に対する天然LIF高
レベル発現の効果の研究のために、照射マウスの造血系
を再構成するのに使用し得る正常マウス造血前駆細胞の
感染に適用可能である。

実施例７ 以下に、大腸菌細胞における組換マウスLIFの発現の
ための工程を説明する。

第16図は、以下に記載する方法の工程１に関する：グ
ルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／トロンビン切断部
位/LIF接合部におけるヌクレオチド配列、その接合部に
おけるコード化された融合タンパク質の配列。３者融合
タンパク質の、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼの
Ｃ−末端、トロンビン切断部位およびマウスLIF部分の
Ｎ−末端を、このアミノ酸配列をコード化するヌクレオ
チド配列と共に示す。トロンビンによって切断されると
考えられる部位を矢印で示す。

工程1:LIFコード化領域の大腸菌発現ベクターへの導入 大腸菌におけるLIF発現に用いた発現ベクターは、Sj2
6（寄生蠕虫日本住血吸虫によってコード化された25kD
グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（E.C.2.5.1.1
8））のＣ−末端との融合として外来ペプチドを合成す
るための、pGEX−2Tであった（スミスおよびジョンソ
ン、ジーン、1988）。多くの場合、融合タンパク質は、
水溶液に可溶であり、非変性条件下に固定化グルタチオ
ンアフィニティクロマトグラフィーによって粗溶菌液か
ら生成し得ることがわかっている。このベクターpGEX−
2Tは、部位特異性プロテアーゼであるトロンビンによる
分解によってグルタチオンＳ−トランスフェラーゼキャ
リヤーが融合タンパク質から切断され得るように設計さ
れている。

プラスミドpLIFmut2から誘導されるマウスLIFの完全
なコード化領域（前記実施例５および第12図参照）は、
BamH I−EcoR IフラグメントとしてpGEX−2Tの多重クロ
ーニング部位に導入し、グルタチオンＳ−トランスフェ
ラーゼおよびトロンビン切断部位と同じ翻訳リーディン
グフレームのLIFコード化領域３′を配置した。このよ
うに、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ／トロンビ
ン切断部位/LIFの３者融合タンパク質において、LIFタ
ンパク質のＣ−末端をこれらの要素に配置した（第16図
参照）。トロンビン切断部位の位置は、トロンビン切断
の後に２個のアミノ酸（Gly−Ser）がLIFタンパク質の
Ｎ−末端に付属するような位置である。前記プラスミド
の構成pGEX−2T/LIFは、標準的な方法によって行い、標
準的な方法によってプラスミドを大腸菌NM522に導入し
た（ゴーおよびマーレイ、ジャーナル・オブ・モレキュ
ラー・バイオロジー、166：（Ｉ）〜（19、1983）。

工程2:グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ/LIF融合タ
ンパク質の発現および精製 グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ/LIF融合タンパ
ク質の発現を誘導するために、、pGEX−2T/LIF含有大腸
菌NM522細胞の培養10mlをルリアブイヨン中で対数増殖
させ、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを
0.1mMの濃度に加えた。更に４時間増殖（その間にグル
タチオンＳ−トランスフェラーゼ/LIF遺伝子が発現す
る）後、遠心によって細胞を採り、マウスリン酸緩衝生
理食塩液（MTPBS:150mM NaCl、16mM Na₂HPO₄、4mM NaH₂
PO₄、pH7.3）1mlに再懸濁させた。氷上で穏やかに超音
波処理することによって細胞を溶解し、トリトン（Trit
on）Ｘ−100を１％に添加した後、遠心（10,000g、５分
間、４℃）により細胞屑を除去した。透明となった上澄
を、室温で回転プラットフォーム上の50mlポリプロピレ
ンチューブ内で、50％グルタチオナガロースビーズ［イ
オウ結合、シグマ（Sigma）］200μと混合した。（使
用前に、ビーズをMTPBSに予備浸漬し、同じ緩衝液で２
回洗浄し、50％溶液v/vとしてMTPBS中で４℃で貯蔵し
た。）吸収（５分間）後、ビーズを遠心（500g、１分
間）によって集め、MTPBS/トリトンＸ−100で３回洗浄
した。次いで、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ/L
IF融合タンパク質を、遊離グルタチオンとの競合によっ
て溶出した：ビーズは、100μの50mMトリスHCl、5mM
還元グルタチオン（pH7.5）と共に、室温で２分間イン
キュベートし、遠心によってビーズを除去した。溶出工
程は２回行い、100μずつの２つの溶出物をプールし
た。

グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ/LIF融合タンパ
ク質100μをトロンビンで処理した（スミスおよびジ
ョンソン、前掲書）。

非切断およびトロンビン切断グルタチンＳ−トランス
フェラーゼLIF融合タンパク質１μを、ファルマシア
・ファスト・ゲル（Pharmacia Phast Gel）（８〜25％
ポリアクリルアミド勾配ゲル）上で電気泳動した。クー
マシー・ブルーで染色後、非切断試料においては、相対
分子量〜46kDaの単一の主要なタンパク質種があらわ
れ、トロンビン切断試料においては、〜26kDaおよび〜2
0kDaの２つの主要なバンドが現れた［それぞれ、融合タ
ンパク質（46kDa）、グルタチオンＳ−トランスフェラ
ーゼ（26kDa）およびLIFタンパク質（20kDa）の推定さ
れるサイズに相当する］。このゲル上のクーマシー染色
バンドの分子量の計算によって、元の10mlの大腸菌培養
からのグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ/LIFタンパ
ク質の収量は、〜1.5μｇであったことがわかった。

グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ/LIF融合タンパ
ク質およびトロンビン切断LIF試料の分化誘導活性およ
び白血病抑制活性のアッセイは、マウスM1細胞を用いて
（前記のように）行った。いずれのLIF試料も、生物学
的に活性であり、非活性は７×10⁶ユニット/mgを越える
ことがわかった。

実施例８ マウスゲノムが、クローンpLIF7.2b中に存在する配列
をコード化する遺伝子（実施例４）に関連した他の遺伝
子を含有するかどうかを決定するための工程、およびLI
F遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断部位の位置のマ
ップの確定を以下に説明する。

図面は、以下に記載する方法の種々の工程に関する： 第17図：工程１に関する：高および低ストリンジェンシ
ー条件下におけるマウスDNAのpLIF7.2b誘導プローブと
のハイブリッド形成。所定の制限酵素で分解したBALB/c
肝DNAについて、実施例８の工程１に記載するようにLIF
遺伝子配列を調べた。左図において、２×SSC中で65℃
でハイブリッド形成を行い、最終洗浄は0.2×SSC中で65
℃で行った。右図においては、ハイブリッド形成および
洗浄はいずれも６×SSC中で65℃で行った。左図におい
て、線状pLIF7.2bプラスミドDNA（5.6kb）は、単相マウ
スゲノムの分子量を３×10⁹bpとして単相マウスゲノム
当たり10および１コピーに相当する量（それぞれ400pg
および40pg）で用いた［レアード（Laired,C.D.）、ク
ロモソーマ（Chromosoma）、32:378〜406、1971］。ハ
イブリッド形成ゲノムフラグメントのサイズを示す。

第18図：工程２に関する：種々の制限エンドヌクレアー
ゼで分解した、１本鎖および２本鎖のマウスDNAと、マ
ウスLIFプローブとのハイブリッド形成。分解したDNA
は、0.8％アガロースゲル上で電気泳動し、実施例８の
工程１に記載のように、高ストリンジェンシー条件下に
pLIF7.2bcDNAフラグメントとハイブリッド形成させた。

第19図：工程２に関する：マウスLIF遺伝子の制限エン
ドヌクレアーゼ切断マップ。cDNAクローンpLIF7.2bに対
応する配列を含有する染色体DNAの領域をボックスで示
す。中心線の上部（EcoR5）および下部（Xba I、BamH
I、Pst IおよびStu I）に示された制限部位は、中心線
上に配置できなかった。線の下部の複合群の部位の相対
配置は図に示す通りである。

第20図：工程３に関する：マウスLIF遺伝子の染色体配
置。レーン１においては、BALB/cマウス胚DNAを電気泳
動し、レーン２においては、チャイニーズ・ハムスター
卵巣細胞DNAを電気泳動し、レーン３〜８においては、
ハイブリッドクローンＩ−18A HAT、Ｉ−18A−2a−8AG;
EBS58;EBS11;EBS4;およびＩ−13A−1a−8AGのDNAを電気
泳動した［コリー（Cory,S.）ら、ヨーロピアン・モレ
キュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジャー
ナル、２:213〜216、1983］。これらのハイブリッドの
マウス染色体内容は、コリーら、ヨーロピアン・モレキ
ュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジャーナ
ル、２:213〜216、1983に記載されている。すべてのDNA
は、BamH Iで分解される。マウスLIF遺伝子を有する3kb
BamH Iフラグメントの位置を示す。

工程1:マウスゲノム中のLIF関連遺伝子の数の決定 グレブスII細胞のならし培地が、M1細胞の分化を誘導
し得る、２つの生化学的に異なるが、機能的には同様の
因子（LIF−ＡおよびLIF−Ｂ）を含有するというデータ
（実施例１）に基づいて、我々は、精製およびクローン
化した種に関連するマウスゲノム中に何個の遺伝子があ
るかを決定しようとした。種々の制限エンドヌクレアー
ゼによって切断したマウスゲノムDNAのサザンブロット
を、高および低ストリンジェンシーの条件下に、pLIF7.
2bから誘導したプローブと共にハイブリッド形成した。

BALB/cマウス肝臓からの高分子量ゲノムDNA20μｇを
種々の制限エンドヌクレアーゼで完全に分解し、0.8％
アガロースゲル電気泳動により分画し、ニトロセルロー
スに移した。ハイブリッド形成の前に、６×SSC（低ス
トリンジェンシー）または２×SSC（高ストリンジェン
シー）（SSC＝0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウ
ム）、0.2％フィコル、0.2％ポリビニルピロリドン、0.
2％ウシ血清アルブミン、2mMピロリン酸ナトリウム、1m
M ATP、50μg/ml変性サケ精子DNAおよび50μg/ml大腸菌
tRNA中で、フィルターを65℃で数時間インキュベートし
た。ハイブリッド形成は、0.1％SDSを含有する同じ溶液
中で、65℃で16〜18時間行った。次いで、第17図に詳細
に示すように、６×SSC、0.1％SDS中で65℃において
（低ストリンジェンシー）、または２×SSC、0.1％SDS
中で65℃において、次いで0.2×SSCにより65℃で（高ス
トリンジェンシー）フィルターを洗浄した。使用したハ
イブリッド形成プローブは、前記のように、ニックトラ
ンスレーションにより比活性約４×10⁸cpm/μｇに放射
性ラベルしたpLIF7.2bのcDNAインサートの約750bpのEco
R I−Hind IIIフラグメントであり、約２×10⁷cpm/mlの
濃度でハイブリッド形成に使用した。

マウス肝臓DNA（第17図）においても、クレブスII細
胞、LB3 T細胞およびWEHI265単核細胞由来のDNA（図示
せず）においても、LIFプローブは、それぞれ約11、３
および13kbpの独特のEcoR I、BamH IおよびHind IIIフ
ラグメントを検出した。ハイブリッド形成の同じパター
ンは、高ストリンジェンシー（0.2×SSC、65℃）および
低ストリンジェンシー（６×SSC、65℃）のいずれにお
いても明らかであった（第17図）；低ストリンジェンシ
ーハイブリッド形成および洗浄条件下には、他の明らか
なバントは無かった。同様に独特のハイブリッド形成フ
ラグメントは、Pst I、Stu I、Sac I、EcoR5およびBgl
II−切断ゲノムDNAにおいても検出された（第17図）。
更に、第16図に示す実験においては、pLIF7.2bプラスミ
ドDNAは、単相マウスゲノム当たり10および１コピー当
量の濃度で含まれていた（トラック１および２）；ゲノ
ムLIF配列のハイブリッド形成強度は、独特の遺伝子標
準強度と有意に異なってはいなかった（トラック２）。

以上のデータより、マウスゲノム中でLIF遺伝子は独
特であり、類縁体は存在しないことがわかる。すなわ
ち、LIFの２つの種は、異なる遺伝子の産物であるが、
同じ遺伝子産物の転写後または翻訳後の変種と考えられ
る。

工程2:マウスLIF遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断
マップの確定 マウスLIF遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断部位
の位置を決定し、この遺伝子の分子フィンガープリント
を提供するために、マウス肝またはクレブス腹水癌細胞
のDNAを種々の制限エンドヌクレアーゼで分解し、工程
１に記載のようにサザン分析に付した（高ストリンジェ
ンシーハイブリッド形成および洗浄条件下）。このよう
な実験の例を第18図に示す。この分解産物のサイズの分
析により、LIF遺伝子の各切断部位の位置のマップを作
成することができる（第19図）。

工程3:マウスLIF遺伝子の染色体配置 マウスLIF遺伝子が位置している染色体を決定するた
めに、種々のマウス染色体を有する６つのマウス−チャ
イニーズ・ハムスター卵巣体細胞ハイブリッド細胞系の
DNAを試験した［コリー（Cory,S.）ら、ヨーロピアン・
モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジ
ャーナル、２:213〜216、1983;フランケ（Francke,U.）
ら、サイトジェネティクス・アンド・セル・ジェネティ
クス（Cytogenet.Cell.Genet.）、19:57〜84、1977］。
（高ストリンジェンシーハイブリッド形成および洗浄条
件下に）工程１に記載のように行ったサザン分析によ
り、マウスLIF遺伝子を含む3kbp BamH Iフラグメント
は、すべてのハイブリッド存在しないことがわかった
（第20図）。染色体11は、これらの系（コリーら、ヨー
ロピアン・モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼー
ション・ジャーナル、2:213〜216、1983）のいずれにも
保持されていない唯一のマウス染色体であるので［マウ
ス−チャイニーズ・ハムスターハイブリッドの特性（フ
ランケら、サイトジェネティクス・アンド・セル・ジェ
ネティクス、19:57〜84、1977）］、LIF遺伝子がこの染
色体上に存在すると考えられる。同様に、マウスGM−CS
F遺伝子［バーロウ（Barlow,D.P.）ら、ヨーロピアン・
モレキュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジ
ャーナル、６:617〜623、1987］およびMulti−CSF遺伝
子［イーレ（Ihle,J.N.）およびコザック（kozak,C.
A.）、ナショナル・カンサー・インスティテュート、フ
レデリック・カンサー・リサーチ・ファシリティ、アニ
ュアル・レポート（National Cancer Institute,Freder
ick Cancer Research Facility,Annual Report）、198
4］も染色体11に存在することが、遺伝子結合の研究に
より確認されている（バーロウら、ヨーロピアン・モレ
キュラー・バイオロジー・オーガニゼーション・ジャー
ナル、６:617〜623、1987）。

実施例９ 本実施例は、クローンマウスLIFcDNAを、ヒト遺伝子
もしくはmRNAまたはヒトLIFコード化配列含有DANクロー
ンのハイブリッド形成による同定のために使用すること
のできる条件を確立する工程を説明する。

第21図は、以下に記載する方法の工程２に関する：マ
ウスおよびヒト由来のゲノムDNAに対する種々の条件下
におけるクローンpLIF7.2bのcDNAの³²P−ラベルフラグ
メントのハイブリッド形成。各場合において、トラック
１はマウス（LB3）DNA15μｇを含有し、トラック２およ
び３はヒトDNA［それぞれ細胞系ラジ（Raji）またはラ
モス（Ramos）由来］15μｇを含有する。各フィルター
に適用されたハイブリッド形成および洗浄条件は、工程
２に記載する。マウスLIF遺伝子を含有する約10kbpのEc
oR IフラグメントおよびヒトLIF遺伝子を含有する約9kb
pのEcoR Iフラグメントを矢印で示す。分子量標準を左
に示す。２つの異なるオートファジオグラフィー照射を
示す（16時間および62時間）。

工程1:pLIF7.2bのcDNAのフラグメントの調製および放射
性ラベル pLIF7.2bプラスミドDNAを大腸菌MC1061中で増殖させ
（カサダバンおよびコーヘン、ジャーナル・オブ・モレ
キュラー・バイオロジー、138:179〜207、1980）、標準
的な方法で大腸菌から抽出し（マニアティスら、モレキ
ュラー・クローニング、コールド・スプリング・ハーバ
ー、ニューヨーク、1982）、CsCl勾配遠心によって精製
した。このように精製したpLIF7.2bプラスミドDNAを、
制限エンドヌクレアーゼEcoR IおよびHind IIIで切断し
て、〜770bpのcDNA含有フラグメントをベクター（pJL
3）から遊離させ、これを1.5％アガロースゲル電気泳動
によってベクター配列から分画した。

このように精製したpLIF7.2bcDNAフラグメント200ng
を、100μCi［α³²P］−dATP含有反応においてニックト
ランスレーションにより放射性ラベルして、比活性約３
×10⁸cpm/μｇとした［リグビー（Rigby,P.W.J.）、デ
ィックマン（Dieckmann,M.）、ローデス（Rhodes,C.）
およびバーグ（Berg,P.）、ジャーナル・オブ・モレキ
ュラー・バイオロジー、113:237〜251、1977］。1M過塩
素酸ナトリウムおよび33％イソプロパノールの存在下に
沈澱することにより、放射性ラベルしたcDNAフラグメン
トを、取り込まれなかったラベルから精製した。

工程2:マウスおよびヒトゲノムDNAのサザンブロットとp
LIF7.2bcDNAプローブとのハイブリッド形成 制限エンドヌクレアーゼEcoR Iで切断した、マウスＴ
細胞系LB3（レーン１）および２種のヒトＢ細胞系（ラ
ジおよびラモス；レーン２および３）由来の高分子量ゲ
ノムDNA（15μｇ）を、標準的な方法で0.8％アガロース
ゲル電気泳動し、ニトロセルロースに移した（サザン、
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー、98:5
03〜517、1975）。これらの３種のDNAのそれぞれを含有
する５個の同じサザンブロットを調製した。ハイブリッ
ド形成前に、0.9M NaCl、0.09Mクエン酸ナトリウム、0.
2％フィコル、0.2％ポリビニルピロリドン、0.2％ウシ
血清アルブミン、50μg/ml熱変性サケ精子DNA、50μg/m
l大腸菌tRNA、0.1mM ATPおよび2mMピロリン酸ナトリウ
ム（フィルターａ、ｂ、ｃ、ｄ）、または0.3M NaCl、
0.03Mクエン酸ナトリウムおよび同じ他の成分（フィル
ターｅ）中で、55℃で数時間フィルターをインキュベー
トした。工程１において調製した³²P−ラベルpLIF7.2bc
DNAのハイブリッド形成は、0.1％ドデシル硫酸ナトリウ
ムを更に含有する前ハイブリッド形成と同じ溶液中で、
55℃（フィルターａ、ｂ、ｃ）または65℃（フィルター
ｄ、ｅ）で16時間行った。³²P−ラベルcDNAは、ハイブ
リッド形成前に沸騰によって変性し、〜10⁷cpm/mlでハ
イブリッド形成に使用した。

ハイブリッド形成後、0.9M NaCl、0.09Mクエン酸ナト
リウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム中で55℃（フィ
ルターａ）、60℃（フィルターｂ）もしくは65℃（フィ
ルターｃ、ｄ）で、または0.3M NaCl、0.03Mクエン酸ナ
トリウム、0.1％ドデシル硫酸ナトリウム中で65℃で
（フィルターｅ）、フィルターを洗浄した。完全に洗浄
後、コダックXAE−５フィルムおよび２つの増幅スクリ
ーンを用いて−70℃でフィルターをオートラジオグラフ
ィーに付した。第21図は、このような実験の結果を示
し、２つのハイブリッド形成／洗浄条件（フィルターｄ
およびｅ）において、マウスLIF遺伝子（約10kbpのEcoR
Iフラグメント上に存在）およびヒトLIF遺伝子の両方
（約9kbpのEcoR Iフラグメント上に存在）が、残留バッ
クグラウンド非特異的ハイブリッド形成の上に検出され
た。試験した他のすべての条件においては、バックグラ
ウンドハイブリッド形成のレベルが高く、許容不可能で
あった（フィルターａ、ｂ、ｃ）。

実施例10 本実施例は、マウスLIF類似クローン化ヒト遺伝子を
得るための工程を説明する。

図面は、以下に記載する方法の種々の工程に関する。

第22図：ヒトLIF遺伝子のクローニングの工程１に関す
る：マウスLIFcDNAプローブを使用するサザンブロット
ハイブリッド形成によるLIF遺伝子の検出。ヒト細胞系R
AMOSのゲノムDNAを、所定の制限エンドヌクレアーゼで
切断し、実施例19の工程１に記載の条件下に、pLIF7.2b
から誘導したマウスcDNAフラグメントとハイブリッド形
成させた。

第23図：ヒトLIF遺伝子のクローニングの工程１に関す
る：種々のハイブリッド形成条件下における、マウスLI
FcDNAプローブを用いるサザンブロットハイブリッド形
成によるLIF遺伝子の検出。制限エンドヌクレアーゼBam
H Iで切断したヒト細胞系RAMOS（Ｈ）またはマウス肝DN
A（Ｍ）のゲノムDNAを、種々のハイブリッド形成および
洗浄条件下に、マウスLIFcDNAプローブ（pLIF7.2b）と
ハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成のための温
度およびSSC濃度を上行に、洗浄条件を次行に示す（実
施例10の工程１参照）。

第24図：ヒトLIF遺伝子のクローニングの工程２に関す
る:LIF遺伝子クローンの３試料の制限エンドヌクレアー
ゼ切断。クローンλHGLIF1、λHGLIF2およびλHGLIF3の
λファージのDNA1μｇを、Sal I、BamH IまたはPst Iで
分解し、0.8％アガロースゲルで電気泳動し（左図）、
ニトロセルロースに移し、（前記のように）pLIF7.2cDN
Aとハイブリッド形成させた。ハイブリッド形成フラグ
メントのおよそのサイズを示す。

第25図：ヒトLIF遺伝子のクローニングの工程３に関す
る：ヒトLIF遺伝子（Ｈ）にかかるλHGLIF1の1.3kbpの
セグメントのmRNA類似鎖のヌクレオチド配列を５′から
３′方向に示す。cDNAクローンpLIF7.2b、pLIFNK1およ
びpLIFNK3から誘導されるマウスLIFmRNA（Ｍ）の相当す
るヌクレオチド配列をヒト遺伝子の下に小文字で示す。
マウスおよびヒトの配列が同じ箇所は、ダッシュで示
す。相違はアミノ酸で示す。マウスLIFと同様に推定さ
れた成熟ヒトLIFのＮ−末端残基を＋１とする。

第26図：ヒトLIF遺伝子のクローニングの工程３に関す
る：ヒトLIFのアミノ酸配列およびマウスLIFとの比較。
直接アミノ酸シークエンシング、およびcDNAクローンpL
IF7.2b、pLIFNK1およびpLIFNK3の分析によって決定した
成熟マウスLIF（Ｍ）のアミノ酸配列を上行に示し、λH
GLIF1の配列から推測されるヒトLIF（Ｈ）の相当する配
列を下に示す。同一箇所は星印で示す。

第27図：ヒトLIF遺伝子のクローニングの工程４に関す
る：ヒトLIF遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断地
図。pLIF7.2b類似ヒト遺伝子（第25図）のエクソンをボ
ックスとして示す。遺伝子翻訳方向は、ライン下の矢印
によって示す。

工程1:マウスプローブによるヒトLIFの検出 マウスLIFcDNAクローンpLIF7.2bの放射性ラベルした
フラグメントをハイブリッド形成プローブとして用い
て、ヒトLIF遺伝子を検出する方法は既に開示されてい
る。第22図は、種々の制限エンドヌクレアーゼで切断し
たヒトゲノムDNAにおいてヒトLIF遺伝子を検出する方法
を示す。このような分析および図示されていない他のゲ
ルにより、ヒトLIF遺伝子が存在する、種々の制限エン
ドヌクレアーゼによって生成したDNAフラグメントのサ
イズがわかった。このデータは、ヒト遺伝子の検出のた
めのハイブリッド形成プローブとしてマウスプローブを
使用し得る条件を確立するためだけでなく、ヒトゲノム
LIFクローンの同定に有用な診断用制限マッピングデー
タを提供するためにも、本実施例の後の工程において重
要である。

マウスおよびヒトのLIF配列の間の相同性が高いこと
は、BamH Iで切断したマウスおよびヒトゲノムDNAを、
マウスLIFcDNAプローブと共に、種々のハイブリッド形
成および洗浄条件下にハイブリッド形成することによっ
てわかった（第23図）。ハイブリッド形成および洗浄の
ストリンジェンシーを高めると、バックグラウンドが低
下し、マウスプローブと共にハイブリッド形成している
〜3kbpの特有のフラグメントがあらわれた。ヒト遺伝子
が、0.2×SSC中で65℃においても実質的なハイブリッド
形成を保持したことは重要である。

工程2:ヒトゲノムライブラリーのスクリーニングおよび
LIF遺伝子含有クローンの単離 Sau3Aで部分的に切断し、λファージクローニングベ
クターEMBL3Aに結合したヒトゲノムDNAのライブラリー
について、マウスcDNAをプローブとしてハイブリッド形
成することにより、LIF遺伝子含有クローンをスクリー
ニングした。LIFcDNAのフラグメントは、放射性ラベル
し、ハイブリッド形成条件は、前記の通りであった（実
施例４）。ゲノムライブラリーを示すファージプラーク
を、10cmのペトリ皿当たり〜50,000プラークの密度で培
養し、文献に記載のようにニトロセルロースに移した
（マニアティスら、モレキュラー・クローニング、コー
ルド・スプリング・ハーバー、1982）。ハイブリッド形
成前に、６×SSC（SSC＝0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナ
トリウム）、0.2％フィコル、0.2％ポリビニルピロリド
ン、0.2％ウシ血清アルブミン、2mMピロリン酸ナトリウ
ム、1mM ATP、50μg/ml変性サケ精子DNAおよび50μg/ml
大腸菌tRNA中で65℃で数時間フィルターをインキュベー
トした。ハイブリッド形成は、0.1％SDSを含有する同じ
溶液中で、65℃で16〜18時間行った。［α³²P］dATPを
用いてニックトランスレーションにより比活性〜２×10
⁸cpm/μｇに放射性ラベルしたLIFcDNAフラグメントを、
〜２×10⁶cpm/mlの濃度でハイブリッド形成に使用し
た。ハイブリッド形成後、６×SSC、0.1％ドデシル硫酸
ナトリウム中で65℃で広範に洗浄し、次いでオートラジ
オグラフィーに付した。複製フィルター上の陽性のプラ
ークを取り、前記のように低密度で再スクリーニングし
た。

３種のクローンλHGLIF1、２および３をこのようにし
て同定および精製した。。これらのクローンの関係を調
べ、ヒトLIF遺伝子を含むかどうかを調べるために、各
クローンからDNAを調製し、以下の制限エンドヌクレア
ーゼで切断した：クローン化ゲノムDNAの全セグメント
を切断するSal I、並びにLIF遺伝子内およびその周辺に
おいて切断するBamH IおよびPst I;（前記のように）そ
れぞれ、〜3kbpおよび1.8kbpおよび0.6kbpの固有のフラ
グメントを生成する。組換ファージDNAを切断し、アガ
ロースゲル上の電気泳動により分画（第24図、左図）し
た後、DNAをニトロセルロースに移し、（前記条件下
に）マウスLIFcDNAプローブとハイブリッド形成させ
て、LIF遺伝子を有するフラグメントを明らかにした
（第24図、右図）。この分析により、次のことがわかっ
た （ａ）３種のクローンはいずれも同じであると考えられ
る、 （ｂ）いずれも、マウスLIFプローブと相同の領域を有
するゲノムDNAの〜9kbpセグメントを有する； （ｃ）マウスcDNAと相同の領域は、ヒトLIF遺伝子に特
有の3kbpBamH Iフラグメント上並びに1.8および0.6kbpP
st Iフラグメント上に存在する（前記）。このように、
３種のクローンはいずれもヒトLIF遺伝子を含む染色体D
NAのセグメントを有することがわかった。

工程3:ヒトLIF遺伝子のヌクレオチド配列の決定 マウスLIFcDNAプローブとハイブリッド形成する前記
λHGLIF1の〜3kbpのBamH Iフラグメントをプラスミドベ
クターpEMBL8⁺に再クローン化してクローンpHGLIFBam1
を生成し、ヌクレオチド配列分析に付した。ヌクレオチ
ドシークエンシングは、アルカリ変性２本鎖プラスミド
DNAを鋳型として使用し、遺伝子中の配列に相補的な種
々のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用し、大
腸菌DNAポリメラーゼＩのクレノウフラグメントおよび
トリ骨髄芽球症ウイルス逆転写酵素をポリメラーゼとし
て使用して、ジデオキシ法によって行った（サンガー
ら、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミ
ー・オブ・サイエンシーズ、米国、74:5463〜5467、197
7）。

LIF遺伝子にかかるBamH Iフラグメントの全ヌクレオ
チド配列（2840bp）を決定し、そのうちの1297bpを第25
図に示す。この配列をマウスLIFmRNA配列と並べると、
成熟ヒトLIFタンパク質をコード化する配列が、693bpの
イントロンによって分離された２つのエクソン上に存在
することがわかった（第25図）。成熟タンパク質をコー
ド化する領域では、ヌクレオチドおよびアミノ酸配列レ
ベルのいずれにおいても、２種間の相同性が高い。エク
ソン１においては88％の核酸配列（114/129残基）およ
び91％のアミノ酸配列（39/43）が、成熟タンパク質コ
ード化領域（位置58〜186）と同じである。エクソン２
はやや相同性が低く、コード化領域において、ヌクレオ
チドレベルで77％（318/411）およびアミノ酸レベルで7
4％（101/136）である。成熟タンパク質全体としては、
ここで決定したマウスおよびヒトLIF配列は、挿入また
は欠失無く140〜179位置（78％）において同じである
（第26図）。そのうえ、相違の多くは、少々の置換にす
ぎない（Lys:Arg、Glu:AspおよびLeu:Val:Ala）。

成熟LIFのＮ−末端プロリン残基のコドンの５′で、
（第25図の位置58）ヒト遺伝子は、ほとんどの疎水性リ
ーダーをコード化する領域を通してマウスLIFmRNA配列
と同じである。しかし、このmRNAおよび遺伝子配列は、
特有のRNA切断部位（TCCCAG）で異なるので、リーダー
全体がこのエクソンにおいてコード化されているのでは
ない［マウント（Mount,S.M.）ら、ヌクレイック・アシ
ッズ・リサーチ、10:459〜472、1982］。５′未翻訳領
域およびリーダーの最初の残基を特定するエクソンは、
この切断部位の1097bp5′中に存在しない。マウスLIF遺
伝子において、疎水性リーダーの最初の６個のアミノ酸
配列を特定するエクソンは、同様の切断部位の〜1.5kbp
5′に位置する。

工程4:ヒトLIF遺伝子の制限エンドヌクレアーゼ切断地
図の決定 ヒトLIF遺伝子中およびその周辺の制限エンドヌクレ
アーゼ切断部位の位置を決定し、この遺伝子の分子フィ
ンガープリント提供するために、ヒトゲノムDNA（RAMOS
細胞系由来）を種々の制限エンドヌクレアーゼで１本お
よび２本鎖の状態で切断し、使用したプローブが前記工
程３に記載のpHGLIFBam1から誘導し、ニックトランスレ
ーションによって放射能ラベルした3kbpのBamHIフラグ
メントであったことを除いては実施例８に記載のように
サザンブロット分析に付した。λHGLIF1およびpHGLIFBa
m1の分析から誘導した第22図に示すデータと同様に、そ
のように誘導したデータ（図示せず）を分析することに
より、得られた制限エンドヌクレアーゼ切断地図を第27
図に示す。

実施例11 本実施例は、酵母細胞中で発現させるためのクローン
化ヒトLIF遺伝子の修飾、並びにそのように誘導された
組換ヒトLIFの生物学的および生理学的性質の決定に関
する。

第28図：工程１に関する:YEpseclに組み込むヒトLIF遺
伝子の修飾に使用するオリゴヌクレオチド。オリゴヌク
レオチド（ａ）は、コード化領域の５′末端（第25図の
残基31〜69）に相当する。オリゴヌクレオチド（ｂ）
は、コード化領域の中央（第25図の残基163〜186および
880〜903）に相当する。エクソン１に相補的なこのオリ
ゴヌクレオチドの部分には、ダッシュで下線を付し、エ
クソン２に相補的な部分には、点線を付す。オリゴヌク
レオチド（ｃ）は、コード化領域の３′末端（第25図の
位置1279から）に相当する。オリゴヌクレオチド（ａ）
および（ｂ）は、示された制限エンドヌクレアーゼ切断
部位を導入する。

第29図：工程１に関する：クローン化ヒトLIF遺伝子の
突然変移誘発により誘導された合成ヒトLIFcDNAのヌク
レオチド配列およびそれによってコード化されたアミノ
酸。オリゴヌクレオチド（ａ）および（ｃ）（第28図）
によって導入されるBamH IおよびHind III切断部位を示
す。（マウスと同様に）成熟LIFの推定Ｎ−末端アミノ
酸を＋１とする。

第30図：工程３に関する：精製天然マウスLIF希釈物
（○−−−○）およびガラクトースで誘導したYEpsecl/
HLIF組換体含有酵母細胞ならし培地（●＿●）による、
M1白血病細胞コロニーにおける分化の誘導。YEpsecl/HL
IF組換体含有非誘導酵母培養の培地（○＿○）は不活性
であった。複製７日培養の平均データを示す。

第31図：工程４に関する：酵母誘導HLIFと天然マウス
¹²⁵I−LIFとの、マウスM1細胞特異的レセプターへの結
合の競合。真正天然マウスLIF−Ａ（実施例１）の希釈
物（○＿○）、組換マウスLIF（●＿●）並びに非誘導Y
Epsecl/HLIF構造含有酵母細胞ならし培地（非誘導：■
＿■、誘導：□＿□）の、37℃におけるマウスM1細胞の
細胞レセプターへの天然¹²⁵I−LIF−Ａの結合を競合す
る能力を前記のように試験した。

工程1:酵母における発現のためのヒトLIF遺伝子の修飾 ヒトLIF遺伝子および前記ヌクレオチド配列を有する
組換DNAクローンの単離を前記のように行った（実施例1
0）。成熟ヒトLIFタンパク質をコード化する２エクソン
にかかる1297bpのDNAのヌクレオチド配列を第25図に示
す。

酵母細胞において、酵母発現ベクターYEpseclを用い
てマウス組換LIFを予め調製した（実施例５）。このベ
クターは、ガラクトース誘導性ハイブリッドGAL−CYCプ
ロモーターから転写された、クルイヴェロミセス・ラク
ティスのキラー毒素遺伝子から誘導されたＮ−末端リー
ダー配列を提供する。

このベクター中でヒトLIF遺伝子によってコード化さ
れたタンパク質を発現するためには、いくつかの手段で
遺伝子を修飾する必要があった。成熟タンパク質をコー
ド化する領域の５′末端において、制限エンドヌクレア
ーゼBamH I切断部位を導入して、クルイヴェロミセス・
ラクティスリーダーをフレームに挿入させ、適当なシグ
ナルペプチダーゼ切断部位（Gly−Ser）を保持した。こ
こでも、マウスcDNA（pLIF7.2b）に適用したのと同様の
修飾を行った。中央において、693bpの間に入った配列
を除去し、２つのエクソンを同じ翻訳リーディングフレ
ームに融合した。３′末端において、天然終止コドンの
３′に第２の翻訳終止コドンを直接導入し、YEpseclに
挿入するHind III部位を導入した。修飾はすべてオリゴ
ヌクレオチド介在突然変異誘発によって行った:LIF遺伝
子にかかる〜3kbp BamH Iのフラグメントをプラスミドp
EMBL8⁺中にサブクローン化し（デンテら、ヌクレイック
・アシッズ・リサーチ、11:1645〜1655、1983）、１本
鎖DNAはF1重感染によって調製した。イン・ビトロ突然
変異誘発は、それぞれ39、48および39塩基のオリゴヌク
レオチドを用いて、文献［ニスベット（Nisbet,I.T.）
およびバイルハルツ（Beilharz,M.W.）、ジーン・アナ
リシス・タクニクス（Gene Anal.Techn.）、２:23 2
9、1985］に記載のように行い、前記のように遺伝子の
５′末端、中央および３′末端を修飾した（第28図参
照）。修飾ヒトLIFコード化領域のヌクレオチド配列を
第29図に示す。

工程2:YEpsecl/HLIF組換体の酵母細胞への導入 エス・セレビシエ（S.cerevisiae）株GY1⁺（leu2 ur
a3 ade2 trp1 cir＋;G.cesareni、EMBLハイデルベル
ク）を、ポリエチレングリコール法によって形質転換し
た（クレベら、ジーン、25:333〜341、1983）。形質転
換体を選択し、ウラシル不存在下に、合成最少培地（必
要なアミノ酸50μg/mlを補給した、２％炭素源、0.67％
酵母窒素ベース（ディフコ））上に保持した。２方法の
いずれかにより、組換体HLIFを調製した。（１）Ura⁺形
質転換体を２％ガラクトース含有非選択的培地中で定常
期で増殖させ、培地のLIF活性をアッセイした。（２）U
ra⁺形質転換体を２％グルコース含有選択的最少培地中
で定常期で増殖させた。次いで、細胞を洗浄し、同じ体
積の２％エタノール含有選択的最少培地に再懸濁させ、
グルコースリプレッションを補うために８時間増殖させ
た。次いで、細胞を２％ガラクトース含有合成最少培地
で希釈（1:10）することによってHLIFインサートの転写
を誘導した。誘導から種々の時間後に培養上澄試料を採
り、ミリポアフィルター（0.2μｍ）で濾過し、LIF活性
を直接アッセイした。

工程3:酵母誘導HLIFの生物学的性質の決定 マウスおよびヒトのLIFの配列が高度に類似している
という観点から、酵母誘導ヒトLIFのマウスM1細胞に対
する活性を評価した。酵母ならし培地の分化誘導活性お
よび白血病抑制活性のアッセイは、20％ウシ胎児血清お
よび0.3％寒天の最終濃度のダルベッコ改良イーグル培
地中にマウスM1細胞（ホズミ博士、サイタマ・カンサー
・リサーチ・センター、日本による提供）300個を含有
する1mlの培養中で行った。アッセイする試料は、寒天
培地中の細胞懸濁液の添加前に、連続希釈した0.1mlの
体積で培養器に加えた。培養は、空気中10％CO₂の水蒸
気飽和雰囲気中で７日間インキュベートした。培養は、
解剖顕微鏡を用いて35倍の倍率で、分散した細胞のコロ
ナを有するか、または分散した細胞のみから成る分化し
たコロニーを記録した。コロニーの形態学的検査は、全
培養を2.5％グルタルアルデヒド1mlで固定し、次いで顕
微鏡スライド上で乾燥した培養をアセチルコリンエステ
ラーゼ／ルクソール・ファスト・ブルー／ヘマトキシリ
ンで染色することによって行った。

同じ酵母細胞の非誘導培養の培地、非形質転換酵母ま
たはベクターYEpseclのみを含有する酵母の培養の培地
ではなく、YEpsecl中にヒトコード化領域を含有する酵
母のガラクトース誘導培養の培地は、M1コロニーの培養
において特有のマクロファージ分化を誘導することがで
きた（第30図）。マウスLIFの場合のように、濃度を高
めると、酵母誘導ヒト試料も、M1コロニー分化の数およ
びサイズを徐々に低下した。精製天然マウスLIFと比較
すると、酵母ならし培地はヒトLIFを50,000ユニット/ml
まで含有することがわかった。

工程4:酵母誘導ヒトLIFのレセプター結合特異性 精製マウスLIF−Ａ（実施例１）を前記のようにヨウ
素化した。M1細胞を洗浄し、10％ウシ胎児血清含有Hepe
s−緩衝RPMI培地中に2.5×10⁶/50μで再懸濁させた。
50μ中の細胞を200,000cpmの¹²⁵I−LIF−Ａ（同じ培
地中10μ）および10μの対照培地または非ラベル純
マウスLIF−Ａの連続２倍希釈物またはYEpsecl/HLIF構
造を有する酵母形質転換体のガラクトース誘導もしくは
非誘導培養のならし培地と共にインキュベートした。

YEpsecl/HLIF組換体含有ガラクトース誘導酵母細胞の
ならし培地は、マウスM1細胞上の特異的細胞レセプター
への天然マウス¹²⁵I−LIA−Ａの結合を、天然および組
換マウスLIF−Ａと同程度に、37℃（第31図）および０
℃（図示せず）において競合することができた。非誘導
酵母細胞の培地およびベクターYEpseclのみを含有する
酵母細胞の培地は競合しなかった。従って、１次アミノ
酸配列の高度の相同性に匹敵して、マウスおよびヒトLI
Fにおいてレセプター結合領域は高度に保持されること
がわかる。

工程5:酵母誘導ヒトLIFの精製、シークエンシングおよ
びヨウ素化 DEAE−セファロースCL−6Bカラムに結合し、塩傾斜に
よって溶出したLIF活性を工程２においてプールしたこ
とを除いては、YEpsecl/HLIF組換体含有ガラクトース誘
導酵母細胞のならし培地中のヒトLIFを、実施例１の工
程２および４によって精製した。精製した酵母誘導ヒト
LIFを、0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.2）50μ中
のヒトLIF1μｇを、2M NaCl中のNa¹²⁵I（2.7μ）1mCi
および0.2mM ICl5μと共に60秒間インキュベートする
ことによって放射性ラベルした。0.02％トゥイーン20お
よび0.02％アジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝（20
mM、pH7.4）生理食塩液（0.15M）中で平衡化したセファ
デックスＧ−25M（ファルマシア）のカラム反応混合物
を通すことによって、¹²⁵I−LIFを、取り込まれなかっ
た¹²⁵Iから分離した。ヒト¹²⁵I−LIFを８〜25％ドデシ
ル硫酸ナトリウムポリアミドゲル上で電気泳動すると、
見掛けの分子量170,000の単一の広いバンドがあらわれ
た。ヒト¹²⁵I−LIFがマウスM1細胞および骨髄細胞に特
異的に結合したことから、ヒトLIFが、マウスLIFレセプ
ターへの結合能力を有することを確認した。精製酵母誘
導ヒトLIF（約10μｇ）を、実施例２に記載のようにア
ミノ末端アミノ酸シークエンシングに付し、単一の配
列： Ile−Thr−Pro−Val−Ｘ−Ala.... がわかった。これは、マウス配列（実施例２参照）： Pro−Leu−Pro−Ile−Thr−Pro−Val−Asn−Ala.... の４番目のアミノ酸から始まることを除いては、ヒトLI
Fの推定アミノ酸配列（第26図）と同じである。このこ
とは、精製した酵母誘導ヒトLIFが、マウス配列の対応
する最初の３個のアミノ酸を欠いているが、生物学的に
活性であり、マウスLIFレセプターに結合し得ることを
示している。最初の３個のアミノ酸は、LIFの生物学的
活性に重要でないことがわかる。

実施例12 本実施例は、推定天然ヒトLIF分枝を同定し、部分的
に精製するための工程を説明する。

図面は、以下に記載する方法の種々の工程に関する： 第32図：推定ヒトLIFの同定の工程２に関する：ヒト膀
胱癌細胞系5637（ATCC No.HTB9）（−□−）粗もしくは
（−＋−）DEAE非結合フラクションのならし培地または
天然マウスLIF−Ａ（−○−）の種々の希釈物の、マウ
ス¹²⁵I−LIF−Ａのマウス腹膜細胞上の細胞レセプター
への結合を競合する能力。ヒトＧ−CSF（−■−）は結
合を競合する能力がないことも示されている（未希釈＝
５μg/ml）。

第33図：推定ヒトLIFの同定の工程３に関する：ヒト膀
胱癌細胞系5637のならし培地の、DEAE−セファロースCL
−6Bカラムによる分画、前記マウスLIF−Ａの分画（実
施例１）と同様の溶出、この分画による個々のフラクシ
ョンの、マウスM1細胞の分化コロニー生成を誘導する能
力。Ａ図は塩傾斜、Ｂ図は5637ならし培地の分画、Ｃ図
は比較のためのクレブスII細胞ならし培地の分画を示
す。

第34図：推定ヒトLIFの同定の工程３に関する：レンチ
ル−レクチン・セファロース4Bカラムによる、ヒト膀胱
癌細胞系5637のならし培地の分画（前記マウスLIF−Ａ
の分画と同様に溶出（実施例１））およびこの分画によ
る個々のフラクションの、マウスM1細胞の分化コロニー
生成を誘導する能力。Ａ図はα−メチル−Ｄ−マンノピ
ラノシド傾斜、Ｂ図は5637ならし培地の分画、Ｃ図は比
較のためのクレブスII細胞ならし培地の分画を示す。

工程1:数種のヒト細胞系のならし培地の、半固型寒天培
養中のM1マウス骨髄性白血病細胞の分化誘導および増殖
抑制の能力をアッセイした（本発明の実施例５の工程４
と同様）。数種の細胞系はそのような活性を示し、その
うち膀胱癌細胞系5637の活性は最も高レベルであった。
しかし、5637細胞系は、M1細胞の分化を誘導し得るヒト
Ｇ−CSF［ニコラら、ネイチャー、314:625〜628、1985;
ウェルテ（Welte,K.）ら、プロシーディングス・ナショ
ナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズ、米国、82:1
526〜1530、1985］を生成することがわかっている［ト
ミダ（Tomida,M.）ら、FEBS・レターズ（FEBS Let
t.）、207:271〜275、1986;ネカーズ（Neckers,L.M.）
およびプルズニーク（Pluznik,D.H.）、エクスペリメン
タル・ヘマトロジー（Exp.Hematol.）、15:700〜703、1
987］。5637細胞が真正ヒトLIFを（Ｇ−CSFに加えて）
生成することを確認するために、5637ならし培地を更に
以下の工程２および３に付した。

工程2:5637細胞のならし培地を20倍濃縮し、マウス腹膜
細胞の特異的細胞レセプターへの天然マウス¹²⁵I−LIF
−Ａの結合を競合するその能力を試験した。この競合結
合アッセイは、本発明の実施例５の工程５に記載した通
りである。5637細胞ならし培地は、細胞レセプターへの
マウス¹²⁵I−LIF−Ａの結合を競合する活性を有してお
り、この活性を5637CM（LIF−Ａ）DEAE非結合フラクソ
ン中で濃縮した（第32図）。ヒトおよびマウスＧ−CSF
は、非常に高い濃度でも¹²⁵I−LIF−Ａ結合部位を競合
しないので、5637ならし培地中に、マウスLIFレセプタ
ーを特異性に認識し得る同様のヒトLIF活性が存在する
ことがわかる。このことは、１次アミノ酸配列の高い相
同性に匹敵して、レセプター結合領域におけるマウスお
よびヒトLIFの保存が強いことを示す。

工程3:ヒト膀胱癌5637細胞のならし培地（10％v/vウシ
胎児血清中２）を40mlに濃縮し、クレブスII腹水細胞
ならし培地からのマウスLIFに対する前記の場合と同よ
うに、DEAE−セファロースCL−6Bおよびレンチル−レク
チン−セファロース4Bで連続的にクロマトグラフィーに
付した。5637細胞のM1分化誘導活性（推定ヒトLIF）
を、マウスLIFの場合と同様にDEAE−セファロースによ
るクロマトグラフィーに付すと、いくつかの活性はカラ
ムに結合しなかったが（LIF−Ａ）、残りは結合し、塩
傾斜により溶出された（LIF−Ｂ）（第33図）。同様
に、レンチル−レクチン−セファロースクロマトグラフ
ィーにおいて、推定ヒトLIFに挙動はマウスLIFと同様で
あり、活性の１部はカラムに結合し、このことは糖タン
パク質上にマンノース含有炭水化物が存在することを示
す（第34図）。このように、マウスM1細胞分化誘導にお
けるその交差反応性、マウスLIF細胞レセプターを特異
的に認識するその能力、およびその生化学的分画性によ
って、5637細胞ならし培地中のヒト活性は、マウスLIF
の天然ヒト類縁体の基準を満たす。

5637細胞ならし培地からの天然ヒトLIFを、実施例１
の工程２および４によって精製した；工程２から非結合
LIF活性のプールおよび工程４からLIF活性の結合。この
プールされたLIF活性を、ブラウンリーRP300C8カラム
を、最初は0.1％TAF中の０〜60％CH₃CN傾斜を用い、次
いで0.1％TFA中の45〜55％CH₃CN傾斜を用いて２回使用
したことを除いては実施例１の工程５と同様に逆相HPLC
によって分画した。第２の傾斜において、ヒトLIFは50
％CH₃CNで溶出され、８〜25％傾斜ドデシル硫酸ナトリ
ウムポリアクリルアミドゲル電気泳動を行うと、見掛け
の分子量73,000の主要な銀染色バンドが現れた。天然精
製ヒトLIFを実施例10の工程５に記載のように放射性ヨ
ウ素化し、酵母誘導ヒト¹²⁵I−LIFに関して記載たよう
に（実施例11の工程５）、マウスM1細胞およびマウス骨
髄細胞に特異的に結合させた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 ＰＩ６００５ (32)優先日 1987年12月21日 (33)優先権主張国 オ−ストラリア（ＡＵ） (72)発明者 ヒルトン、ダグラス・ジェイムズ オーストラリア連邦ビクトリア、3113、 ワランダイト、ウエスト・エンド・ロー ド ８番 (72)発明者 キング、ジュリー・アン オーストラリア連邦ビクトリア、3131、 ヌナウエイディング、スプリングベー ル・ロード 121番 (72)発明者 メットカーフ・ドナルド オーストラリア連邦ビクトリア、3103、 バルウィン、ユニオン・ロード 268番 (72)発明者 ナイス、エドアルド・コリンズ オーストラリア連邦ビクトリア、3182、 セント・キルダ、オデッサ・ストリート ９番 (72)発明者 ニコラ、ニコス・アンソニー オーストラリア連邦ビクトリア、3073、 レジェント、クイーン・ストリート 59 番 (72)発明者 シンプソン、リチャード・ジョン オーストラリア連邦ビクトリア、3121、 リッチモンド、スタンレイ・ストリート 42番 (72)発明者 ウイルソン、トレーシー・アン オーストラリア連邦ビクトリア、3104、 ノース・バルウィン、フォーチュナ・ア ベニュー 26番 (56)参考文献 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉ ｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒ ｙ，Ｖｏｌ．259，Ｎｏ．17 （1984) Ｐ．10978−10982 ＦＥＢＳ ＬＥＴＴＥＲＳ，Ｖｏｌ. 178，Ｎｏ．２ （1984） Ｐ．291− 296 Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．138，Ｎｏ. 11 （1987．６） Ｐ．3844−3849

Claims (39)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アミノ酸配列： を含む、ヒト白血病抑制因子（LIF）、または上記アミ
   ノ酸配列中の１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失も
   しくは置換された配列を有するヒトLIF活性を有するポ
   リペプチド。
2. 【請求項２】遺伝子組換え手法によって得られる、請求
   項１記載のヒトLIF、または上記アミノ酸配列中の１も
   しくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換された
   配列を有するヒトLIF活性を有するポリペプチド。
3. 【請求項３】グルコシル化または非グルコシル化された
   請求項１または２記載のヒト白血病抑制因子（LIF）の
   精製方法であって、（ａ）粗LIFを陰イオン交換カラム
   クロマトグラフィーに付し、塩増加勾配によりLIFを溶
   出し、（ｂ）工程（ａ）の生成物を、マンノースに対す
   る親和性を有するレクチンアフィニティカラムクロマト
   グラフィーに付し、マンノース誘導体でLIFを溶出し、
   （ｃ）工程（ｂ）の生成物を陽イオン交換カラムクロマ
   トグラフィーに付し、塩増加勾配でLIFを溶出し、
   （ｄ）工程（ｃ）の生成物を、HPLC条件下に逆相カラム
   クロマトグラフィーに付し、アセトニトリルの増加勾配
   でLIFを溶出することを含む方法。
4. 【請求項４】粗LIFが、ヒト膀胱癌細胞系5637ならし培
   地を含むものである、請求項３記載の方法。
5. 【請求項５】ヒト白血病抑制因子（LIF）をコードし、 ヌクレオチド配列： を含む組換えDNA分子、またはヒトLIF活性を有するポリ
   ペプチドをコードし、上記ヌクレオチドにおいて、１個
   またはそれ以上のヌクレオチドが欠失、置換または付加
   したヌクレオチド配列を含む組換えDNA分子。
6. 【請求項６】６×SSC、65℃の条件下、またはそれ以上
   の厳しい条件下で、 ヌクレオチド配列： を有するpLIF7.2bのインサート、 ヌクレオチド配列： を有するpLIFNK3のインサート、および ヌクレオチド配列： を有するpHGLIFBamlのインサート からなるクローン群から選ばれる核酸プローブとハイブ
   リダイズするヌクレオチド配列を含む、請求項５記載の
   組換えDNA分子。
7. 【請求項７】上記ポリペプチドが、 （ａ）Ml骨髄性白血病細胞の増殖を抑制し得ること、 （ｂ）Ml細胞またはヒトマクロファージの特定の細胞レ
   セプターの結合についてヒトLIFと競合し得ること を特徴とする、ヒトLIF活性を有するポリペプチドをコ
   ードするヌクレオチド配列を含む、請求項５記載の組換
   えDNA分子。
8. 【請求項８】複製開始点を更に含み、それにより上記分
   子をクローニングベクターとしての使用に適したものと
   する、請求項５〜７のいずれか１項記載の組換えDNA分
   子。
9. 【請求項９】上記ヌクレオチド配列に機能可能に結合す
   るプロモーター配列を更に含み、それにより上記分子を
   発現ベクターとしての使用に適したものとする、請求項
   ８記載の組換えDNA分子。
10. 【請求項１０】アミノ酸配列： を含むヒト白血病抑制因子（LIF）、または、上記アミ
    ノ酸配列中の１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失ま
    たは置換したヒトLIF活性を有するポリペプチドをコー
    ドするヌクレオチド配列を含む組換えDNA分子。
11. 【請求項１１】請求項４〜10のいずれか１項に記載の組
    換えDNA分子で形質転換された宿主細胞。
12. 【請求項１２】酵母細胞、哺乳動物細胞または他の真核
    細胞である、請求項11記載の宿主細胞。
13. 【請求項１３】原核細胞である、請求項11記載の宿主細
    胞。
14. 【請求項１４】ヒトLIF活性を有するポリペプチドの製
    造方法であって、（ａ）請求項11〜13のいずれか１項に
    記載の宿主細胞を用い、（ｂ）上記細胞を、ヒトLIF活
    性を有するポリペプチドの発現を誘導する条件下に培養
    し、（ｃ）上記ポリペプチドを回収することを含む方
    法。
15. 【請求項１５】ポリペプチドが、 から選ばれるアミノ酸配列を有する、請求項14記載の方
    法。
16. 【請求項１６】ポリペプチドが、 アミノ酸配列： を有する、請求項14記載の方法。
17. 【請求項１７】ポリペプチドが宿主細胞によってグリコ
    シル化されているものである、請求項14〜16のいずれか
    １項記載の方法。
18. 【請求項１８】宿主細胞が酵母細胞である、請求項17記
    載の方法。
19. 【請求項１９】プロモーターが、ガラクトース誘導ハイ
    ブリッドGAL−CYCプロモーターである、請求項14〜16の
    いずれか１項記載の方法。
20. 【請求項２０】上記ポリペプチドが、ポリペプチドの分
    泌を目的とするリーダー配列を更に含むものである、請
    求項14〜16のいずれか１項記載の方法。
21. 【請求項２１】リーダー配列が、クルイヴェロミセス・
    ラクティスのキラー毒素から誘導されるものである、請
    求項20記載の方法。
22. 【請求項２２】宿主細胞が、サッカロミセス・セレビシ
    アエである、請求項18記載の方法。
23. 【請求項２３】宿主細胞が、哺乳動物細胞である、請求
    項14〜16のいずれか１項記載の方法。
24. 【請求項２４】宿主細胞が、レトロウイルス発現ベクタ
    ーで形質転換されたものである、請求項23記載の方法。
25. 【請求項２５】ベクターが、モロニーマウス白血病ウイ
    ルスから誘導されたものである、請求項24記載の方法。
26. 【請求項２６】ベクターが、骨髄増殖性肉腫ウイルスの
    LTRエンハンサーを更に含むものである、請求項25記載
    の方法。
27. 【請求項２７】上記ベクターが、天然LIFmRNAの３′非
    翻訳領域を欠くものである、請求項26記載の方法。
28. 【請求項２８】宿主細胞が、造血細胞である、請求項23
    記載の方法。
29. 【請求項２９】宿主細胞が、E.coli細胞である、請求項
    14〜16のいずれか１項記載の方法。
30. 【請求項３０】ベクターが、グルタオチンＳ−トランス
    フェラーゼ/LIF融合タンパク質の発現を目的とするベク
    ターである、請求項29記載の方法。
31. 【請求項３１】ベクターが、グルタオチンＳ−トランス
    フェラーゼ／トロンビン分解部位/LIF融合タンパク質の
    発現を目的とするベクターである、請求項30記載の方
    法。
32. 【請求項３２】請求項14〜16のいずれか１項に記載の方
    法により製造され、ヒトLIF活性を有するポリペプチ
    ド。
33. 【請求項３３】請求項５に記載のDNA分子によってコー
    ドされているアミノ酸配列を含み、ヒトLIF活性を有す
    るポリペプチド。
34. 【請求項３４】請求項１または２に記載のポリペプチド
    を含む、医薬的に許容され得る形態の骨髄性白血病細胞
    増殖阻害剤。
35. 【請求項３５】薬学的担体および／または希釈剤と組み
    合わせた、請求項１、２、32および33のいずれか１項に
    記載のポリペプチドを含む骨髄性白血病細胞増殖阻害の
    ための医薬組成物。
36. 【請求項３６】請求項５に記載のDNA分子によってコー
    ドされた成熟ポリペプチドを含む、請求項35記載の組成
    物。
37. 【請求項３７】アミノ酸配列： である成熟ポリペプチドを含むものである、請求項35記
    載の組成物。
38. 【請求項３８】少なくとも１種の他の生物学的血球調節
    物質を更に含むものである、請求項35記載の組成物。
39. 【請求項３９】上記他の調節物質が、Ｇ−CSFまたはGM
    −CSF活性を有するポリペプチドである、請求項38記載
    の組成物。