JPH08198899A

JPH08198899A - 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物

Info

Publication number: JPH08198899A
Application number: JP7024633A
Authority: JP
Inventors: Yuu Honshiyo; 佑本庶; Toru Nakano; 徹仲野; Shiro Shibayama; 史朗柴山; Hideaki Tada; 秀明多田; Daikichi Fukushima; 大吉福島
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1995-01-19
Filing date: 1995-01-19
Publication date: 1996-08-06

Abstract

(57)【要約】【構成】マウス骨髄ストローマ細胞が産生する２８１
アミノ酸からなるポリペプチド及びそのヒトホモロー
グ、その製造法、そのポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、そのＤＮＡ配列に選択的にハイブリダイズするフラ
グメント、そのＤＮＡからなる複製又は発現ベクター、
そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプ
チドの抗体、及びそのペプチドまたは抗体を含有する薬
学的組成物。【効果】本発明のポリペプチドは、造血系細胞の発育
不全や異常増殖、神経系機能の亢進や低下、免疫系機能
の亢進や低下に関する疾患、例えば炎症性疾患、骨髄移
植後の造血幹細胞の減少、放射線治療後等の白血球、血
小板、Ｂ細胞又はＴ細胞の減少、貧血又は感染症の予防
又は治療、ガン、白血病又はＡＩＤＳの予防又は治療、
各種変性疾患、神経損傷の予防又は治療、骨代謝異常の
予防又は治療、及び組織修復等のために用いることがで
きる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規なポリペプチド、
その製造方法、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、
そのＤＮＡからなるベクター、そのベクターで形質転換
された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびその
ペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物に関する。
更に詳細に述べると、ある種のマウスストローマ細胞株
が産生する新規なポリペプチド、そのポリペプチドのヒ
トのホモローグ、それらポリペプチドの製造方法、それ
らポリペプチドをコードするＤＮＡ、それらＤＮＡから
なるベクター、それらベクターで形質転換された宿主細
胞、それらポリペプチドの抗体、およびそれらポリペプ
チドまたは抗体を含有する薬学的組成物に関する。

【０００２】

【発明の背景】骨髄ストローマ細胞は、免疫系、造血系
等の骨髄微小環境を形作り、それらの幹細胞の増殖分化
誘導に欠かせない因子、例えば、ＩＬ−７、ＳＣＦ、Ｉ
Ｌ−１１、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｉ
Ｌ−６、ＴＧＦ−β、ＬＩＦ等の因子を産生、分泌して
いることが知られている。また、骨髄ストローマ細胞の
あるものは、骨代謝に関わることが明かとなっている。
しかしながら、これまでに単離された因子群のみでは、
ストローマ細胞の役割を完全に担うことができない。こ
のことは、まだ単離されていない因子が存在することを
示唆している。

【０００３】

【発明の目的】本発明者らは、この点に注目し、ある種
のストローマ細胞が産生している新規な因子（ポリペプ
チド）、特に分泌タンパクおよび膜蛋白に着目してそれ
を見出すべく、鋭意検討を行なった。

【０００４】従来、ある特定のポリペプチドまたはそれ
をコードするＤＮＡを得ようとする場合、組織や細胞培
養液中に目的とする生物活性を確認し、次いでポリペプ
チドの単離精製を経て、遺伝子をクローニングする方
法、あるいは、その生物活性を指標として遺伝子を発現
クローニングする方法が一般的に用いられていた。しか
し、生体内生理活性ポリペプチドは、多様な生物活性を
有している場合が多いので、あるひとつの活性を指標に
して遺伝子をクローニングした結果、それが既知のポリ
ペプチドと同一であることが後になって判明するという
事例が増えている。また、骨髄ストローマ細胞が産生す
る因子はほとんどのものが微量しか産生されず、そのこ
とが単離、精製および生物活性の確認を困難なものとし
ている。

【０００５】近年、ｃＤＮＡの作製技術やシークエンス
技術は急速に発展し、大量のｃＤＮＡのシークエンスを
迅速に行なうことができるようになった。そこでこれら
の技術を利用して、様々な細胞や組織からｃＤＮＡライ
ブラリーを作製し、ランダムにｃＤＮＡをクローニング
して塩基配列を決定し、相当するポリペプチドを発現さ
せた後、その生理機能を解析していくという方法が発展
しつつある。この方法は、生化学的、遺伝子学的な解析
を一切必要とせずに遺伝子をクローニングし、その塩基
配列の情報を得ることができるという特徴を有している
が、目的とする遺伝子の発見は偶発的要素が大きい。

【０００６】本発明者らは、これまで造血系や免疫系で
働く増殖分化因子の遺伝子のクローニングを研究してき
た。そして、増殖分化因子（例えば、各種サイトカイン
等）のような分泌タンパクやそのレセプターのような膜
タンパク（以下、これらをまとめて分泌タンパク等と呼
ぶ。）の大部分がそのＮ末端にシグナルペプチドと呼ば
れる配列を有していることに着目して、シグナルペプチ
ドをコードする遺伝子を効率的かつ選択的にクローニン
グする方法を鋭意検討した。その結果、Ｎ末端断片を効
率的に増幅させ、シグナルペプチドの有無を簡単に検索
できる方法を見出し（特願平6-13951 号参照）、その方
法を用いて、骨髄ストローマ細胞が産生している新規な
因子（ペプチド）およびそれをコードするＤＮＡを見出
すことに成功し、本発明を完成した。

【０００７】スイスプロット（Swiss Prot Release 29
）に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配
列を調査した結果、本発明のポリペプチドはマウスバイ
ジジン（Basigin）とそのカウンターパートをはじめと
するイムノグロブリンスーパーファミリーに属する蛋白
と有意な相同性を示した。このことから、本発明のポリ
ペプチドは、イムノグロブリンスーパーファミリーに属
する新規の膜蛋白であることが確認された。

【０００８】

【発明の構成】本発明は、（１）配列番号１で示される
アミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）前記（１）
に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡ、（３）配
列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、（４）配
列番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、（５）配
列番号５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチ
ド、（６）前記（５）に記載したポリペプチドをコード
するＤＮＡ、（７）配列番号６で示される塩基配列を有
するＤＮＡ、および（８）配列番号７で示される塩基配
列を有するＤＮＡに関する。

【０００９】本発明は、実質的に純粋な形である配列番
号１または５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チド、そのホモローグ、その配列のフラグメントおよび
そのホモローグに関する。本発明はさらにそれらのポリ
ペプチドをコードするＤＮＡに関する。より具体的に
は、配列番号２、３、６または７で示される塩基配列を
有するＤＮＡ、および配列番号２、３、６または７で示
される塩基配列に選択的にハイブリダイズするフラグメ
ントを有するＤＮＡに関する。

【００１０】実質的に純粋な形である配列番号１または
５で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、
一般に、生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば、
９５、９８または９９％が配列番号１で示されるアミノ
酸配列を有するポリペプチドであることを意味する。

【００１１】配列番号１または５で示されるアミノ酸配
列からなるポリペプチドのホモローグとは、一般に少な
くとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４
０、６０または１００個の連続したアミノ酸領域で、少
なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０または９０
％、より好ましくは９５％以上相同性であるものであ
り、そのようなホモローグは、以後本発明のポリペプチ
ドとして記載される。

【００１２】さらに、配列番号１または５で示されるア
ミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメント、また
はそれらのホモローグのフラグメントとは、少なくとも
１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例
えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸
部分を意味する。

【００１３】配列番号２、３、６または７で示される塩
基配列を有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤ
ＮＡとは、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少な
くとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連続
した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少
なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以上
相同性であるものであり、そのようなＤＮＡは、以後本
発明のＤＮＡとして記載される。

【００１４】配列番号２、３、６または７で示される塩
基配列を有するＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも
１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２
０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのよう
なフラグメントも本発明のＤＮＡに含まれる。

【００１５】さらに、本発明には、本発明のＤＮＡから
なる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとし
ては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの
発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子な
どからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクタ
ーが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選
択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を
含んでいてもよい。ベクターは、イン・ビトロ（in vit
ro）において、例えばＤＮＡに対応するＲＮＡの製造、
宿主細胞の形質転換に用いることができる。

【００１６】さらに、本発明には、配列番号２、３、６
または７で示される塩基配列、またはそれらのオープン
リーディングフレームを有するＤＮＡを含む本発明のＤ
ＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転換
された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細
菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。

【００１７】さらに、本発明には、本発明のポリペプチ
ドを発現させるための条件下で、本発明の宿主細胞を培
養することからなる本発明のポリペプチドの製造方法も
含まれる。培養は、本発明のポリペプチドが発現し、宿
主細胞より製造される条件下で行われることが好まし
い。

【００１８】本発明のＤＮＡは、上記のようなベクター
のアンチセンス領域に挿入することでアンチセンスＲＮ
Ａを製造することもできる。このようなアンチセンスＲ
ＮＡは、細胞中の本発明のポリペプチドのレベルを制御
することに用いることもできる。

【００１９】本発明は、本発明におけるポリペプチドの
モノクローナルまたはポリクローナル抗体も含む。さら
に本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたは
ポリクローナル抗体の製造方法も含む。モノクローナル
抗体は、本発明のペプチドまたは、その断片を抗原とし
て用い、通常のハイブリドーマの技術により製造するこ
とができる。ポリクローナル抗体は、宿主動物（例え
ば、ラットやウサギ等）に本発明のポリペプチドを接種
し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造するこ
とができる。

【００２０】本発明には、本発明のポリペプチド、その
抗体と薬学的に許容される賦形剤および／または担体を
含有する薬学的組成物も含まれる。

【００２１】（１）または（５）の本発明のポリペプチ
ドとしては、配列番号１または５で示されたアミノ酸配
列を有するもの以外に、その一部が欠損したもの（例え
ば、配列番号１または５中、生物活性の発現に必須な部
分だけからなるポリペプチドならびに細胞質ドメイン、
トランスメンブレンドメイン領域を欠失した可溶性ポリ
ペプチド等）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの
（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、
およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入された
ものも含まれる。よく知られているように、ひとつのア
ミノ酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅ
ｔは１種類、Ｌｅｕは６種類）知られている。従って、
ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの
塩基配列を変えることができる。

【００２２】（２）または（６）で特定される本発明の
ＤＮＡには、おのおの（１）の配列番号１または（５）
の配列番号５で示されるポリペプチドをコードするすべ
ての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることによ
って、ポリペプチドの生産性が向上することがある。
（３）または（７）で特定されるＤＮＡは、おのおの
（２）または（６）で示されるＤＮＡの一態様であり、
天然型配列を表わす。（４）または（８）に示されるＤ
ＮＡは、おのおの（３）または（７）で特定されるＤＮ
Ａに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。

【００２３】配列番号３で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれる。

【００２４】シグナルペプチドのｃＤＮＡライブラリー
の作製（１）対象となる細胞より単離したｍＲＮＡに対する
一本鎖ＤＮＡを、ランダムプライマーを用いて合成した
後、得られた一本鎖ＤＮＡの３′末端にオリゴｄＧを付
加し、（２）（１）で得られた一本鎖ＤＮＡに対する
二本鎖ＤＮＡを、特定の制限酵素（酵素Ｉ）サイトを連
結したポリＣオリゴマーをプライマーとして用いて合成
し、（３）（２）で得られた二本鎖ＤＮＡを分断し、
断片のサイズで分画後、酵素Ｉとは異なる特定の制限酵
素（酵素II）サイトを含むリンカーを連結し、再度分画
し、（４）酵素Ｉサイトを含むプライマーと酵素IIサ
イトを含むプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応
（以下、ＰＣＲと略記する。）に付し、増幅されたｃＤ
ＮＡを酵素Ｉ−酵素IIで消化した後分画し、（５）得
られたｃＤＮＡ断片を、シグナルペプチドを削除した公
知の分泌タンパク等の遺伝子の上流に連結し、真核細胞
発現プラスミドベクターに組み込んだ後形質転換する工
程よりなる。

【００２５】各工程を詳しく説明すると、工程（１）で
は、対象となる細胞より、必要により適当な刺激剤で刺
激した後、オカヤマ（Okayama H.）等の方法（Method i
n Enzymology, 154, 3 (1987) に記載）に従ってｍＲＮ
Ａの単離が行なわれる。対象となる細胞としては、分泌
タンパク等を産生している可能性のある細胞なら何でも
よい。例えば、神経系細胞や造血系細胞が挙げられる。
ランダムプライマーを用いる一本鎖ｃＤＮＡの合成は公
知の方法により行なわれる。ランダムプライマーは市販
のものが用いられる。続いて、ターミナルデオキシトラ
ンスフェレースにより一本鎖ｃＤＮＡの３′末端にオリ
ゴｄＣが付加される。

【００２６】工程（２）の二本鎖ＤＮＡの合成も、公知
の方法により行なわれる。プライマーとなるポリＧオリ
ゴマーに連結される制限酵素（酵素Ｉ）サイトと次の工
程（３）で用いられる制限酵素（酵素II）サイトは、互
いに異なるものであれば何を用いてもよい。好ましく
は、酵素ＩとしてＳａｌ I、酵素IIとしてはＳａｃ Iが
用いられる。

【００２７】工程（３）は、超音波処理によりｃＤＮＡ
長が平均５００ｂｐになるように断片化し、アガロース
電気泳動（ＡＧＥ）により４００〜８００ｂｐのｃＤＮ
Ａに分画した後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑
化し、酵素IIアダプターを連結し、再度アガロース電気
泳動により４００〜８００ｂｐのＤＮＡに分画すること
により行なわれる。酵素IIは、前記したように酵素Ｉと
異なるものなら何でもよい。本工程によって、シグナル
ペプチドを含むｃＤＮＡ断片は、酵素Ｉと酵素IIによっ
て挟まれた部分に存在する可能性が高まる。

【００２８】工程（４）では、シグナルペプチドを含む
可能性のある酵素Ｉと酵素IIで挟まれた部分の存在確立
をさらに高めるためにＰＣＲに付す。ＰＣＲはよく知ら
れた方法であり、そのための自動化装置も市販されてい
る。２５〜３０回の増幅で十分である。増幅されたｃＤ
ＮＡは酵素Ｉ−酵素IIで消化し、アガロース電気泳動に
より４００〜８００ｂｐのｃＤＮＡに分画される。

【００２９】工程（５）は、真核細胞発現用プラスミド
ベクターにシグナルペプチドを削除した公知の分泌タン
パク等の遺伝子（レポーター遺伝子という。）と、その
上流に（４）で得られたｃＤＮＡ断片とを組み込んで形
質転換する工程である。ここで真核細胞発現用プラスミ
ドベクターとしては種々のものが知られているが、例え
ば、大腸菌内で機能するｐｃＤＬ−ＳＲαやｐｃＥＶ−
４が用いられる。

【００３０】また、レポーター遺伝子としては、あらゆ
る種類の可溶性分泌タンパクおよび膜タンパクの成熟タ
ンパク部分の遺伝子が用いられる。さらに、これらのレ
ポーター遺伝子は、抗体法などの何らかの方法でその発
現が確認できるものでなければならない。好適にはヒト
ＩＬ−２レセプターα遺伝子が用いられる。形質転換の
ための宿主大腸菌株はすでに多くのものが知られてお
り、いずれを用いてもよいが、好ましくはＤＨ５のコン
ピテントセル（Gene, 96, 23 (1990) に記載）である。
形質転換体は常法により培養され、本発明のｃＤＮＡラ
イブラリーが得られる（図１にその概念図を示す。）。

【００３１】本発明のｃＤＮＡライブラリー作製方法で
は、ライブラリー中にシグナルペプチドをコードする遺
伝子断片を含む可能性は高いが、すべてのクローンが該
断片を含んでいる訳ではないし、またすべてが未知の
（新規の）シグナルペプチドをコードする遺伝子断片と
は限らない。そこで、次に該ライブラリーから未知のシ
グナルペプチドをコードする遺伝子断片をスクリーニン
グする必要がある。

【００３２】すなわち、ｃＤＮＡライブラリーを適当な
サイズのプールに細分化し、発現系に組み込む。ポリペ
プチドを生産するための発現系としては、哺乳動物細胞
（例えば、サルＣＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスタ
ーＣＨＯ細胞、マウスＬ細胞等）が挙げられる。トラン
スフェクションは公知の方法、例えばＤＥＡＥ−デキス
トラン法によって行なわれる。培養後、レポーター遺伝
子の発現の有無を判定する。

【００３３】レポーター遺伝子は、シグナルペプチドが
他の分泌タンパクに固有のものであっても発現すること
が知られている。すなわち、レポーター遺伝子が発現さ
れたということは、ライブラリー中に何らかの分泌タン
パクのシグナルペプチドが組み込まれていたことを示し
ている。陽性を示すプールについてはさらに細分化を行
ない、シングルクローンを得るまで発現と判定を繰り返
す。レポーター遺伝子の発現の判定は、レポーター遺伝
子の種類によって異なるが、蛍光標識抗体法、酵素標識
抗体法（ＥＬＩＳＡ法）、放射性標識抗体法（ＲＩＡ
法）などにより行なわれる。

【００３４】次に、単離した陽性クローンについて、塩
基配列を決定し、未知のタンパク質をコードすることが
明らかになったｃＤＮＡについては、それをプローブと
して全長クローンを単離し、全長の塩基配列を決定する
ことができる。これらの操作は、当業者にとってすべて
公知の方法で行なわれる。例えば、塩基配列の決定はマ
キサム・ギルバート（Maxam-Gilbert）法やジデオキシ
・ターミネーター法により行なわれる。また、全長のシ
ークエンスは Molecular Cloning（Sambrook,J., Frits
ch, E. F.および Maniatis, T. 著、 Cold Spring Harb
or LaboratoryPressより1989年に発刊）に記載の方法に
従って行なわれる。

【００３５】配列番号２および３で示される塩基配列
が、一部、好ましくは全てが確定されると哺乳類に存在
する本発明のタンパクをコードするＤＮＡもしくは本発
明タンパクのホモローグおよびサブセットをコードする
ＤＮＡを得ることができる。適当な該マウス塩基配列を
有するオリゴヌクレオチドを合成し、それを用いて、哺
乳類由来のｃＤＮＡライブラリーあるいはｍＲＮＡから
ＰＣＲ法により、あるいは適当な該マウス塩基配列の断
片をプローブとしてハイブリダイズさせることにより、
哺乳類ｃＤＮＡライブラリーあるいは該ゲノムライブラ
リーから、哺乳類型の当該タンパクをコードするＤＮＡ
を得ることができる。

【００３６】より詳細に述べると、例えば、(i) 本発
明のヒト型ペプチドをコードするｃＤＮＡを単離するた
め、該ペプチドを産生する細胞をノザンブロット分析あ
るいはＰＣＲ法により選ぶことができる。(ii) ノザン
ブロット等によりマウス該ペプチドのヒトホモログの遺
伝子を発現していることを確認済みの、例えば、細胞株
や組織からｍＲＮＡを分離し、(iii) 該ｍＲＮＡからフ
ァーストストランド（１本鎖ｃＤＮＡ）、次いでセカン
ドストランド（２本鎖ｃＤＮＡ）を合成し（ｃＤＮＡの
合成）、(iv) 該ｃＤＮＡを適当なファージベクターに
組み込み、(v) 得られた組み換えファージを宿主細胞
に感染させ（ｃＤＮＡライブラリーの作製）、(vi) 得
られたｃＤＮＡライブラリーをラベルした該ペプチドを
コードするｃＤＮＡ断片をプローブに用いて、プラーク
ハイブリダイゼーションによりスクリーニングし、(vi
i) 得られたポジティブクローンよりファージＤＮＡを
調製し、切り出したｃＤＮＡをプラスミドベクターにサ
ブクローニングし、(viii) 全長をシークエンスするこ
とによって作成することができる。

【００３７】より詳細に説明すると、工程(i) は、ヒト
グリア芽細胞腫細胞株を適当な刺激剤（例えば、ＩＬ−
１等）で刺激するかまたは無刺激のままで、オカヤマ等
の方法（Method in Enzymology, 154, 3(1987)に記載）
に従って行なわれる。本ポリペプチドを産生する細胞と
しては、好ましくは、ヒトグリア芽細胞腫細胞株Ｔ９８
Ｇ（ＡＴＣＣ株番号、ＣＲＬ−1690）が挙げられるが、
該ペプチドを産生している細胞であればどの細胞でもよ
い。

【００３８】工程(ii)の工程はオカヤマ（Okayama, H）
らの方法等(Method in Enzymology,154, 3 (1987)参照)
に従って行なわれる。工程(iii) 、(iv)および(v) の
工程はｃＤＮＡライブラリー作製の工程であり、改変し
た Gubler ＆ Hoffman法（Gene, 25, 263 (1983)に記
載）に準じて行なわれる。

【００３９】工程(iv)で用いられるプラスミドベクター
としては、プラスミドベクター（例えば、ｐＢＲ３２
２、pBluescript II等）やファージベクター（例えば、
λｇｔ１０、λＤＡＳＨ II 等）が多数知られている
が、好ましくはファージベクターλｇｔ２２Ａ（42.73k
bp BRL社より販売）が用いられる。

【００４０】工程(v) で用いられる宿主細胞としては、
好ましくは、大腸菌Ｙ1090（ｒ−）（BRL 社より販売）
が用いられる。工程(vi)および(vii) は、Molecular Cl
oning （Sambrook, J, Fritsh, E, F.および Maniatis,
T, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)）に
記載の方法に準じて行なわれる。工程(viii)のシークエ
ンシングは、マキサム・ギルバート（Maxam-Gilbert ）
法やジデオキシ・ターミネーター法により行なわれる。

【００４１】このようにして得られたｃＤＮＡは、該ｃ
ＤＮＡが全長、またはほぼ全長であることを確認する必
要がある。この確認は、該ｃＤＮＡをプローブとして、
ノーザン(Northern)解析により行なわれる（前記のMole
cular Cloning 参照）。ハイブリダイズしたバンドから
得られるｍＲＮＡのサイズと該ｃＤＮＡのサイズを比較
し、ほぼ同じであれば該ｃＤＮＡはほぼ全長であると考
えられる。

【００４２】配列番号２、３、６および７で示される塩
基配列が一旦確定されると、その後は、化学合成によっ
て、あるいは該塩基配列の断片を化学合成し、これをプ
ローブとしてハイブリダイズさせることにより、本発明
のＤＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有
するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖
させることによって、目的とするＤＮＡを必要量得るこ
とができる。

【００４３】本発明のポリペプチドを取得する方法とし
ては、（１）生体または培養細胞から精製単離する方
法、（２）ペプチド合成する方法、または（３）遺
伝子組み換え技術を用いて生産する方法、などが挙げら
れるが、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。

【００４４】遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチド
を生産するための発現系（宿主−ベクター系）として
は、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞
の発現系が挙げられる。

【００４５】例えば、大腸菌で発現させる場合には、成
熟タンパク部分をコードするＤＮＡの５′末端に開始コ
ドン（ＡＴＧ）を付加し、得られたＤＮＡを、適当なプ
ロモーター（例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロ
モーター、λＰＬプロモーター、Ｔ７プロモーター等）
の下流に接続し、大腸菌内で機能するベクター（例え
ば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９等）に挿入
して発現ベクターを作製する。

【００４６】次に、この発現ベクターで形質転換した大
腸菌（例えば、E. Coli ＤＨ１、E.Coli ＪＭ１０９、
E. Coli ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、そ
の菌体より目的とするポリペプチドを得ることができ
る。また、バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐ
ｅｌＢのシグナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズ
ム中に目的とするポリペプチドを分泌することもでき
る。さらに、他のポリペプチドとのフュージョン・プロ
テイン（fusion protein）を生産することもできる。

【００４７】また、哺乳動物細胞で発現させる場合に
は、例えば、配列表３または７で示される塩基配列をコ
ードするＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイ
ルスベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニ
アウイルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当
なプロモーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴ
Ｒプロモーター、メタロチオネインプロモーター等）の
下流に挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られ
た発現ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば，サルＣ
ＯＳ−７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マ
ウスＬ細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地
で培養することによって、その培養液中に目的とするポ
リペプチドが分泌される。以上のようにして得られたポ
リペプチドは、一般的な生化学的方法によって単離精製
することができる。

【００４８】

【発明の効果】本発明のポリペプチドは、ベイシジン
（basigin ）蛋白質（Teruo Miyauchi et al. J.B. 10
7, 316-323 (1990), Teruo Miyauchi et al. J. B. 11
0, 770-774(1991) ）をはじめとするイムノグロブリン
スーパーファミリーに属する蛋白と有意な相同性を示し
た。細胞外ドメインには、４個のシステイン残基が存在
し、２ヶ所のイムノグロブリン様のループ構造をとると
考えられ、本ペプチドはベイシジン同様イムノグロブリ
ンスーパーファミリーに属していると予想される。イム
ノグロブリンスーパーファミリーに属する多くの分子が
種々の組織において細胞接着に関与していることから本
ペプチドも細胞接着等の細胞間相互作用になんらかの形
で関与していると考えられる。さらに、本発明のポリペ
プチドは、ストローマ細胞株が生産・分泌するものであ
るので、造血系細胞の分化、増殖、成長または生存維持
に関連した生物活性、免疫系の機能に関連した生物活
性、腫瘍の増殖、成長あるいは炎症に関連した生物活
性、また骨代謝に関連した生物活性を有していると考え
られる。

【００４９】例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞の増
殖、免疫グロブリンのクラススイッチ促進によるクラス
特異的誘導、Ｂ細胞の抗体産生細胞への分化、顆粒球前
駆細胞の増殖または分化、単球・マクロファージ前駆細
胞の増殖または分化、好中球、単球・マクロファージ、
好酸球、好塩基球の増殖または機能亢進、巨核球前駆細
胞の増殖、好中球前駆細胞の増殖または分化、Ｂまたは
Ｔ前駆細胞の増殖または分化、赤血球の産生促進、赤血
球、好中球、好酸球、好塩基球、単球・マクロファー
ジ、肥満細胞、巨核球前駆細胞の増殖支持、好中球、単
球・マクロファージ、Ｂ細胞またはＴ細胞の遊走促進、
胸腺細胞の増殖、脂肪細胞の分化抑制、ナチュラルキラ
ー細胞の増殖、造血幹細胞の増殖、幹細胞および各種造
血前駆細胞の増殖抑制、あるいは単球から破骨細胞への
分化促進による骨吸収の促進、間葉系幹細胞からの骨芽
細胞への分化促進または増殖、あるいは破骨細胞の活性
化の作用を本ポリペプチドのみで、あるいは他のサイト
カインと相乗的に働くことにより有する可能性がある。

【００５０】またこれら以外にも、免疫系に作用する因
子であれば、神経系にも作用することが予測されるの
で、各種神経伝達物質作動性神経細胞への分化ならびに
それらの生存維持、グリア細胞の増殖促進、神経突起の
伸展、神経節細胞の生存維持、アストロサイトの増殖ま
たは分化促進、末梢神経の増殖または生存維持、シュワ
ン細胞の増殖、運動神経の増殖または生存維持の作用も
ある可能性がある。

【００５１】さらに、本ポリペプチドは初期胚の発生過
程において、外胚葉誘導作用による表皮、脳、背骨、神
経の器官形成、中胚葉誘導作用による背索結合組織
（骨、筋肉、腱）、血球細胞、心臓、腎臓、生殖巣の器
官形成、あるいは内胚葉誘導作用による消化器系臓器
（胃、腸、肝臓、膵臓）、呼吸器系（肺、気管）の形成
に促進的または抑制的に作用する可能性があるととも
に、生体においても上記器官の増殖あるいは増殖抑制作
用を有する可能性がある。

【００５２】従って、本発明のポリペプチドはそれ自身
で、造血系細胞の発育不全または異常増殖、免疫系もし
くは神経系または骨代謝の機能の低下または亢進に関す
る疾患、例えば、炎症性疾患（リウマチ、潰瘍性大腸炎
等）、骨髄移植後の造血幹細胞の減少症、ガン、白血病
に対する放射線照射または化学療法剤投与後の白血球、
血小板、Ｂ細胞またはＴ細胞の減少症、貧血、感染症、
ガン、白血病、ＡＩＤＳ、各種変性疾患（アルツハイマ
ー病、多発性硬化症等）、あるいは神経損傷の治療薬、
骨代謝異常（骨粗鬆症等）の予防または治療薬として用
いることが期待される。

【００５３】また本ポリペプチドは、外胚葉、中胚葉ま
たは内胚葉由来器官の分化または増殖作用を有する可能
性があるので、各器官（表皮、骨、筋肉、腱、心臓、腎
臓、胃、腸、肝臓、膵臓、肺、気管等）の組織修復剤と
して用いることも期待される。

【００５４】また、該ポリペプチドのポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該
ポリペプチドの定量が行なえ、これによって該ポリペプ
チドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用
することができる。ポリクローナル抗体およびモノクロ
ーナル抗体は該ポリペプチドあるいはその断片を抗原と
して用いて常法により作製することができる。

【００５５】本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待さ
れる本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須
の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療（遺伝子
欠損症の治療またはアンチセンスＤＮＡ（ＲＮＡ）によ
って、ポリペプチドの発現を停止させることによる治療
等）に利用できる。また、本発明のＤＮＡをプローブと
してジェノミック（genomic）ＤＮＡを分離できる。同
様にして、本発明ＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリ
ペプチドの遺伝子、またヒト以外の生物における本発明
ポリペプチドと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分
離することも可能である。

【００５６】

【医薬品への適用】造血系細胞の発育不全や異常増殖、
神経系機能の亢進や低下、免疫系機能の亢進や低下に関
する疾患、例えば炎症性疾患（リウマチ、潰瘍性大腸炎
等）、骨髄移植後の造血幹細胞の減少症、放射線治療後
または化学療法剤投与後の白血球、血小板、Ｂ細胞また
はＴ細胞の減少症、貧血、感染症、ガン、白血病、ＡＩ
ＤＳ、各種変性疾患（アルツハイマー病、多発性硬化症
等）、または神経損傷の予防または治療、骨代謝異常
（骨粗鬆症等）の予防または治療薬、あるいは組織修復
等のために、本発明のポリペプチドは通常、全身的又は
局所的に、一般的には経口または非経口の形で投与され
る。好ましくは、経口投与、静脈内投与および脳室内投
与である。

【００５７】投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、
投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人
あたり、一回につき、１００μｇから１００ｍｇの範囲
で、一日一回から数回経口投与されるかまたは、成人一
人当り、一回につき、１０μｇから１００ｍｇの範囲
で、一日一回から数回非経口投与される。もちろん前記
したように、投与量は、種々の条件により変動するの
で、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、ま
た範囲を越えて必要な場合もある。

【００５８】本発明化合物を投与する際には、経口投与
のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成
物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として
用いられる。経口投与のための固体組成物には、錠剤、
丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセ
ルには、ソフトカプセルおよびハードカプセルが含まれ
る。

【００５９】このような固体組成物においては、一つま
たはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な
希釈剤（例えば、ラクトース、マンニトール、グルコー
ス、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロー
ス、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アル
ミン酸マグネシウム等）と混合される。組成物は、常法
に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、潤滑
剤（ステアリン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グ
リコール酸カルシウム等）、安定化剤（ヒト血清アルブ
ミン、ラクトース等）、溶解補助剤（アルギニン、アス
パラギン酸等）を含有していてもよい。

【００６０】錠剤または丸剤は、必要により白糖、ゼラ
チン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸
溶性のフィルムで皮膜してもよいし、また２以上の層で
皮膜してもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる
物質のカプセルも包含される。

【００６１】経口投与のための液体組成物は、薬学的に
許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、シロップ剤、エリ
キシル剤等を含み、一般に用いられる不活性な希釈剤
（例えば、精製水、エタノール等）を含んでいてもよ
い。この様な組成物は、不活性な希釈剤以外に湿潤剤、
懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、防腐
剤を含有していてもよい。

【００６２】経口投与のためのその他の組成物として
は、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、それ自体
公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。こ
の組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウム
のような安定剤と等張性を与えるような安定化剤、塩化
ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のよ
うな等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方
法は、例えば米国特許第2,868,691号および同第3,095,3
55号明細書に詳しく記載されている。

【００６３】本発明による非経口投与のための注射剤と
しては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳
濁剤を包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤と
しては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも
一つの不活性な希釈剤と混合される。水性の希釈剤とし
ては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が挙げられ
る。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコ
ール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植
物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベー
ト８０（登録商標）等が挙げられる。

【００６４】このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤
剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ヒト血清アル
ブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（例えば、アルギ
ニン、アスパラギン酸等）のような補助剤を含んでいて
もよい。

【００６５】これらはバクテリア保留フィルターを通す
ろ過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。
これらはまた無菌の固体組成物を製造し（例えば、凍結
乾燥法等により）、使用前に無菌の注射用蒸留水または
他の溶媒に溶解して使用することもできる。

【００６６】非経口投与のためのその他の組成物として
は、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、常法によ
り処方される外用液剤、軟膏、塗布剤、直腸内投与のた
めの坐剤およびペッサリー等が含まれる。

【００６７】

【実施例】以下に実施例および参考例を挙げて本発明を
より具体的に説明するが、これらは本発明の範囲を制限
するものではない。

【００６８】実施例１：発現ベクター作製用プラスミド
の構築武部らの作製したｐｃＤ−ＳＲα２９６ベクター（Mol.
Cell. Biol., 8, 966(1988) に記載）は、ＳＶ４０初
期プロモーターとＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲのＲ領域とＵ５
配列の一部から構成されるプロモーターシステム（ＳＲ
α）を有する、優れた哺乳動物細胞用の発現ベクターで
ある。しかし、（１）インサートのクローニングサイト
がＥｃｏＲＩひとつである、（２）ｐＢＲ３２２ベクタ
ーをベクター領域の骨格としているので、大腸菌からの
ベクター回収量が低い、等の欠点がある。そこで、大腸
菌からの収量が多いｐＵＣ１９ベクターを骨格とし、イ
ンサートのマルチクローニングサイトを有するｐｃＤ−
ＳＲα２９６改変ベクターを、以下の方法により作成し
た。

【００６９】ｐｃＤ−ＳＲα２９６ベクター（国立予防
衛生研究所、武部氏より譲与された。）をＳａｌＩで切
断し、ＳＲαプロモーターを含む 1.7ｋｂｐの切断をア
ガロース電気泳動法を用いて分離回収し、続いて、この
断片をKlenow処理し平滑末端とした。ｐＵＣ１９ベクタ
ーを、Ｎｄｅ IおよびＨｉｎｄ IIIで切断後、ＡｍｐＲ
およびｐＵＣori の領域を含む 2.4ｋｂｐの断片をアガ
ロース電気泳動法を用いて分離回収し、Klenow処理して
平滑末端とした後、さらにＢＡＰ（バクテリアルアルカ
リフォスファターゼ）処理して、５′末端のリン酸基を
除いた。

【００７０】こうして得られたＳＲαプロモーターを含
む 1.7ｋｂｐ断片とｐＵＣori を含む 2.4ｋｂｐ断片を
ライゲーションにより環状化し、新しいベクターを構築
した。得られたベクターよりＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ断片を
除去し、下記のＴ７およびｓｐ６プロモーターを有する
合成ポリリンカー、

【００７１】

【化１】

【００７２】と入れ換えた。このようにして構築したプ
ラスミドベクター（約 3.9ｋｂｐ、図２に示す。）をｐ
ＵＣＳＲαＭＬ２と命名した。

【００７３】ｐＵＣＳＲαＭＬ２は、多目的プラスミド
ベクターとして以下のような特徴を有する。１．岡山−Berg法および Gubler ＆ Hoffman法が適用で
きる。２．培養菌当りのプラスミド収量が多い。３．一本鎖ＤＮＡも調製することができる。４．ｃＤＮＡインサートの切り出しが容易である。５．シークエンスのためのデレーション・ミュータント
(Deletion mutant)の作製が容易である。６．イン・ビトロ(in vitro)での転写が可能である。７．哺乳動物細胞にて発現するプロモーターを有する。

【００７４】実施例２：シグナルペプチドに対して選択
性のあるｃＤＮＡライブラリー作製用ベクターの構築次に、ｈＴａｃ（ヒトＩＬ−２レセプターα、レポータ
ー遺伝子として使用）のシグナルシーケンスを除去した
タンパクをコードするｃＤＮＡを前記のｐＵＣＳＲαＭ
Ｌ２に組み込んだプラスミドを構築し、ｐＵＣＳＲα−
ｈＴａｃと命名した。該ベクターのＳＲαプロモーター
の下流、ｈＴａｃ遺伝子の上流にｃＤＮＡを組み込み、
シグナルシークエンスを持つｃＤＮＡからタンパクが翻
訳されることでｈＴａｃと融合タンパクを形成すれば、
膜上に該融合タンパクが発現することとなる。

【００７５】（１）すなわち、pBluescript ＳＫ（＋）
（Stratagene社より販売、ｐＢＳ）のＨｉｎｄ IIIサイ
トにｈＴａｃのｃＤＮＡを組み込んだｐＢＳ−ｈＴａｃ
をＫｐｎＩで消化後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑
化し、次にＳａｃＩで消化し、リーダーシーケンスを除
去した後、ＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩアダプターをライゲー
トし、ＥｃｏＲＩ−平滑末端断片を得た。この断片をＳ
ａｃＩサイトを壊したｐＵＣＳＲαＭＬ２のＥｃｏＲＩ
−ＳｍａＩサイトに組み込んでｐＵＣＳＲαＭＬ２−ｈ
Ｔａｃを得た（図３に示す。）。

【００７６】実施例３：シグナルペプチドに対して選択
性のあるｃＤＮＡライブラリーの作製マウスストローマ細胞株ＳＴ２（造血幹細胞の生存増殖
およびＢ細胞やミエロイド細胞系の増殖分化を支持する
細胞であって、EMBO J., 7,1337 (1988)に記載されてい
る。）より、ＡＧＰＣ（アシッドグアニジン−フェノー
ル−クロロホルム）法（細胞工学実験プロトコール（秀
潤社より発刊）、２８〜３１ページに詳しく記載されて
いる。）によって全ＲＮＡを抽出し、さらにオリゴ（ｄ
Ｔ）−ラテックス（Oligotex-dT30 （商品名、宝酒造
（株）より販売））を用いてポリＡ−ＲＮＡを精製し
た。ランダムヘキサマーをプライマーとして、逆転写酵
素により一本鎖のｃＤＮＡを合成し、ターミナルデオキ
シトランスフェラーゼによりその３′末端にｄＣを付加
した。ＳａｌＩを含む制限酵素部位を連結した１７ｍｅ
ｒのｄＣ、

【００７７】

【化２】

【００７８】をアニールさせ、それをプライマーとして
二本鎖のｃＤＮＡを合成した。平均長が５００ｂｐにな
るように超音波処理してｃＤＮＡを断片化した後、アガ
ロース電気泳動で４００〜８００ｂｐのｃＤＮＡを分画
した。Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼで末端を平滑化した後、
ＳａｃＩ部位を含むローンリンカー、

【００７９】

【化３】

【００８０】（Nucreic Acids Res., 18, 4293(1990)参
照のこと）を連結し、再度アガロース電気泳動により４
００〜８００ｂｐのｃＤＮＡを分画した。ＳａｌＩサイ
トを含むプライマー（ＮＬＣ）、

【００８１】

【化４】

【００８２】とＳａｃＩサイトを含むプライマー（ＬＬ
ＨＥＳ）、

【００８３】

【化５】

【００８４】を用いて、９４℃で１分間、５０℃で２分
間、７２℃で２分間の条件で２５サイクルのＰＣＲを行
なった。増幅されたｃＤＮＡをＳａｃＩとＥｃｏＲＩで
消化して、アガロース電気泳動により４００〜８００ｂ
ｐのｃＤＮＡを分画した。このｃＤＮＡと、ｐＵＣＳＲ
αＭＬ２−ｈＴａｃ（実施例２で作製した。）をＳａｃ
ＩとＳａｌＩで消化したプラスミドとをＴ４ＤＮＡリガ
ーゼで連結し、大腸菌ＤＨ５α株を形質転換して、シグ
ナルペプチドに対して選択性のあるｃＤＮＡライブラリ
ーを得た。

【００８５】実施例４：シグナルペプチドをコードする
ｃＤＮＡのスクリーニングおよび解析実施例３で作製したライブラリーで得られたコロニーを
プール（約５０コロニー／プール）に細分化した。各プ
ールごとに、プラスミドをミニプレット法で単離し、Ｄ
ＥＡＥ−デキストラン法（Current Protocol in Molecu
lar Biology,§9.2.1 ）によりＣＯＳ−７細胞にトラン
スフェクションした。４８時間後、細胞をディッシュか
らはがし、マウス抗ＴａｃＩｇＧ抗体と氷上で２０分
間インキュベーションした。フリーの抗体を除去した
後、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で
ラベルしたヤギ抗マウスＩｇＧ抗体と氷上で２０分間
インキュベーションし、再度フリーの抗体を除去して、
細胞表面のＴａｃに対する蛍光染色を行なった。次い
で、蛍光顕微鏡を用いて、陽性を示すプールを選択し
た。そのうち１プールについて、さらにコロニーを細分
化し、単一クローンを得るまで同様の方法を繰り返し、
１個の陽性クローン（ｐＢＳ−ＳＴ−Ｓ１）を得た。次
にｐＵＣＳＲαＭＬ２−ｈＴａｃベクターに特異的な２
種類の合成プライマー

【００８６】

【化６】

【００８７】を用いて、ＳＴ−Ｓ１インサートの塩基配
列を決定した。ＤＮＡのシークエンシングは、サンガー
（Sanger, F）らのジデオキシ・ターミネーター法に基
づいた、ＡＢＩ社（Applied Biosystems Inc.）の蛍光
ダイ−ターミネーターを用いるサイクルシークエンス法
により行なった。またシークエンスの読みとりには、Ａ
ＢＩ社のＤＮＡシークエンサー（Model 373A）を用い
た。ＤＮＡおよびアミノ酸レベルでデータベースとのホ
モロジー検索を行なった結果、ＳＴ−Ｓ１は、未知のタ
ン白質をコードすることが明らかとなった。

【００８８】実施例５：全長ｃＤＮＡのスクリーニング
および塩基配列の決定ｃＤＮＡライブラリーの作製は、マウスストローマ細胞
株ＳＴ２由来のｍＲＮＡよりスーパースクリプト（Supe
r Script、登録商標）ラムダシステム（BRL 社より販
売）を用いて行なった。このｃＤＮＡをホスファターゼ
処理済みのＳａｌＩ、ＮｏｔＩアーム（ａｒｍ）を持つ
λｇｔ２２Ａ（BRL 社より販売）と連結した。インビト
ロパッケージングは、イン・ビトロ・パッケジング・キ
ット（in vitro Packaging Kit） LAMDA INN（日本ジー
ン）のプロトコールに従って行ない、その組換えファー
ジを宿主大腸菌Ｙ１０９０（ｒ−）（BRL 社より販売）
に感染させた。その結果１００万のプラークからなるｃ
ＤＮＡライブラリーが得られた。次に、ｐＢＳ−ＳＴ−
Ｓ１を SalＩとNotIで消化し、アガロース電気泳動でＳ
Ｔ−Ｓ１断片を調製した。オリゴラベルしたＳＴ−Ｓ１
ｃＤＮＡ断片をプローブとしてライブラリーのスクリ
ーニングを行ない、多数の陽性クローンを得た。その中
でインサートが約 1.0ｋｂｐのクローンについて、λｇ
ｔ２２Ａベクターから切り出したＳａｌＩ−ＮｏｔＩ断
片をｐＵＣＳＲαＭＬ２にサブクローニングし、プラス
ミドｐＵＣＳＲαＭＬ２−ＳＴ−Ｓ１を得た。Ｔ７プラ
イマーを使ってＳＴ−Ｓ１ｃＤＮＡの５′側３００ｂ
ｐの塩基配列を決定して、プローブのＳＴ−Ｓ１と一致
する配列がファージライブラリー由来のＳＴ−Ｓ１の最
も５′側に存在することをまず確認した。

【００８９】実施例６：ｃＤＮＡ全長のシークエンスと
オープンリーディングフレームの決定ｃＤＮＡの全長のシークエンスは、Molecular Cloning
（Sambrook, J., Fritsch, E. F.および Maniatis, T.
著、Cold Spring Harbor Laboratory Press より1989年
に発刊）に記載の方法に従って、ランダムシークエンシ
ングを行なって決定した。

【００９０】すなわち、ＳＴ−Ｓ１クローンよりプラス
ミドを回収し、ｃＤＮＡインサートを分離精製した。こ
れをライゲーションおよびフラグメンテーションし、Ｔ
４ポリメラーゼによりＤＮＡ断片の末端を平滑化し、４
００ｂｐ付近の長さのＤＮＡ断片を回収した。得られた
ＤＮＡ断片をプラスミドベクター、BLUESCRIPT II （St
ratagene社より販売）のＳｍａＩサイトにクローニング
した後、大腸菌(E. Coli) に形質転換した。２０個のコ
ロニーをランダムにピックアップし、プラスミドＤＮＡ
を調製後、これら２０個のプラスミド（これらはすべて
ＳＴ−Ｓ１のｃＤＮＡの断片をインサートとして持って
いる。）のＤＮＡシークエンシングを行なった。ＤＮＡ
のシークエンシングとシークエンスの読み取りは実施例
４に記載した方法により行なった。

【００９１】ＳＴ−Ｓ１のｃＤＮＡ断片のシークエンス
データは、ＤＮＡＳＩＳのＤＮＡシークエンス連結プロ
グラムを用いて、連続したシークエンスに編集し、配列
番号３に示す塩基配列を得た。このｃＤＮＡ全長シーク
エンスデータからオープンリーディングフレームを決定
し、さらにアミノ酸配列に翻訳して、配列番号１に示す
配列を得た。

【００９２】実施例７：ヒト型ＳＴ−Ｓ１ペプチドをコ
ードするｃＤＮＡのソースの確認ヒトグリア芽細胞腫細胞株Ｔ９８Ｇ（ＡＴＣＣ株番号、
ＣＲＬ−１６９０）をホモジナイズし、オリゴｄＴ−セ
ルロースとインキュベートした。不要物を洗浄した後に
Poly Ａ−ＲＮＡを溶出させ、回収した（Vennstorm, B.
et. al., Cell, 28, 135 (1982) 参照）。このＲＮＡ
２μｇを 1.0％アガロース電気泳動後、ニトロセルロー
スメンブレンにブロッティングし、プローブとして³²Ｐ
標識したマウスＳＴ−Ｓ１ｃＤＮＡをハイブリダイズさ
せ、約 2.4ｋｂのｍＲＮＡの発現が認められた。

【００９３】実施例８：ヒトｍＲＮＡの分離精製ヒトグリア芽細胞腫細胞株Ｔ９８Ｇ３×１０⁷個を１
００ユニット／ｍｌのヒトＩＬ−１βで４時間刺激した
後、オカヤマ等の方法（Method in Enzymology, 154, 3
(1987) 参照）に従って、ｍＲＮＡを分離した。すなわ
ち、 5.5ＭＧＴＣ溶液（5.5 メタグアニジンチオシア
ネート、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、 0.5％ラウリル
サルコシンナトリウム(sodium lauryl sarcosine)）で
細胞を可溶化した後、セルライゼート(cell lysate)を
密度1.51のセシウムトリフルオロアセテート(CsTFA) 溶
液のクッション上に載せて超遠心分離（120,000 ×ｇ、
２０時間）を行ない、沈澱中に1.26ｍｇの全ＲＮＡを回
収した。これをオリゴｄＴセルロースカラムに２回通し
て４６μｇのPoly（Ａ）⁺ＲＮＡを回収した。

【００９４】実施例９：ヒトのｃＤＮＡライブラリーの
作製ｃＤＮＡライブラリーは、Gubler & Hoffmann 法（Gen
e, 25, 263 (1983)参照）の変法にて作製した。実施例
８で調製したPoly（Ａ）⁺ＲＮＡ（５μｇ）から、Ｎｏ
ｔＩサイトを持つオリゴｄＴプライマーを用いて、逆転
写酵素により、ファーストストランドを合成した。続い
て、セカンドストランドを合成し、ＳａｌＩアダプター
のライゲーションおよびＮｏｔＩ消化を行なった後、ゲ
ルろ過カラムクロマトグラフィー（Sephacryl S-500HR
(Pharmacia社より販売) ）によりアダプターとプライマ
ーを除いて、８２０ｎｇのｃＤＮＡフラクションを回収
した。以上のｃＤＮＡ合成ステップは、スーパースクリ
プトラムダシステム（SuperScript System, BRL社より
販売）のキットを用いて行なった。

【００９５】実施例１０：ヒトのｃＤＮＡライブラリー
からのクロスハイブリダイゼーションによるヒト型ＳＴ
−Ｓ１ｃＤＮＡのスクリーニング実施例５に記載したように、組み換えファージを作成
し、１００万個のプラークからなるｃＤＮＡライブラリ
ーを得た。ＬＢプレート上に得られた１００万のプラー
クをニトロセルロースメンブレンにブロッティングし、
³²Ｐ標識したマウスＳＴ−Ｓ１ｃＤＮＡ（実施例５で調
整したのと同じ断片の配列番号３で示されるもの）をプ
ローブとして、８０個のポジティブクローンが得られ
た。

【００９６】実施例１１：ヒト型ＳＴ−Ｓ１ｃＤＮＡの
ポジティブクローンの単離その中の４クローンについて、常法（細胞工学実験プロ
トコール、秀潤社、８ページ参照）により、ファージＤ
ＮＡを調製し、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩで消化して、アガロ
ース電気泳動でインサートｃＤＮＡの長さを調べたとこ
ろ、すべてが 2.0ｋｂであった。ノーザン(Northern)解
析の結果からこの 2.0ｋｂのクローンはヒトＳＴ−Ｓ１
のほぼ全長であると考えられた。そこで、このうちの１
クローンについて、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩで消化したｃＤ
ＮＡをアガロース電気泳動後、切り出して、プラスミド
ｐＵＣＳＲαＭＬ２のＳａｌＩ、ＮｏｔＩサイトにサブ
クローニングした。

【００９７】実施例１２：ヒト型ＳＴ−Ｓ１ｃＤＮＡの
シークエンシングこの全長ｃＤＮＡシークエンスデータから、オープンリ
ーディングフレーム（配列番号６で示す）を決定し、さ
らにアミノ酸配列に翻訳して、配列番号５に示す配列を
得た。得られたアミノ酸配列のＮ末端側３０〜４０アミ
ノ酸について、既知のシグナルペプチドと比較すること
により、本ペプチドにおけるシグナルペプチド部分を推
定し（Von Heuane, G. Nucleic Acids Res. 14, 4683
(1986)参照）、配列番号８に示す配列を得た。

【００９８】ＤＮＡの塩基配列決定は、蛍光ダイターミ
ネーターを用いたサイクルシーケンス法により行なった
（Applied Biosystems Inc. 社より販売）。また配列読
み取りには、ＤＮＡシーケンサー（Model 373A, Applie
d Biosystems Inc. 社より販売）を用いた。

【００９９】

【配列表】

配列番号: １配列の長さ: ２８１配列の型: アミノ酸トポロジー: 直鎖状配列の種類: タンパク質配列 Met Ser Gly Ser Ser Leu Pro Gly Ala Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu -23 -20 -15 -10 Val Ser Gly Ser Leu Leu Pro Gly Pro Gly Ala Ala Gln Asn Glu Pro -5 1 5 Arg Ile Val Thr Ser Glu Glu Val Ile Ile Arg Glu Ser Leu Leu Pro 10 15 20 25 Val Thr Leu Gln Cys Asn Leu Thr Ser Ser Ser His Thr Leu Met Tyr 30 35 40 Ser Tyr Trp Thr Arg Asn Gly Val Glu Leu Thr Ala Thr Arg Lys Asn 45 50 55 Ala Ser Asn Met Glu Tyr Arg Ile Asn Lys Pro Arg Ala Glu Asp Ser 60 65 70 Gly Glu Tyr His Cys Val Tyr His Phe Val Ser Ala Pro Lys Ala Asn 75 80 85 Ala Thr Ile Glu Val Lys Ala Ala Pro Asp Ile Thr Gly His Lys Arg 90 95 100 105 Ser Glu Asn Lys Asn Glu Gly Gln Asp Ala Met Met Tyr Cys Lys Ser 110 115 120 Val Gly Tyr Pro His Pro Glu Trp Ile Trp Arg Lys Lys Glu Asn Gly 125 130 135 Val Phe Glu Glu Ile Ser Asn Ser Ser Gly Arg Phe Phe Ile Thr Asn 140 145 150 Lys Glu Asn Tyr Thr Glu Leu Ser Ile Val Asn Leu Gln Ile Thr Glu 155 160 165 Asp Pro Gly Glu Tyr Glu Cys Asn Ala Thr Asn Ser Ile Gly Ser Ala 170 175 180 185 Ser Val Ser Thr Val Leu Arg Val Arg Ser His Leu Ala Pro Leu Trp 190 195 200 Pro Phe Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ile Ile Ile Leu Val Val Ile Ile 205 210 215 Val Val Tyr Glu Lys Arg Lys Arg Pro Asp Glu Val Pro Asp Asp Asp 220 225 230 Glu Pro Ala Gly Pro Met Lys Thr Asn Ser Thr Asn Asn His Lys Asp 235 240 245 Lys Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Asn 250 255

【０１００】配列番号：２配列の長さ：８４３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGTCGGGCT CGTCGCTCCC CGGCGCCCTG GCCCTCTCGC TCTTGCTGGT CTCTGGCTCG 60 CTCCTTCCAG GGCCAGGCGC TGCTCAGAAC GAACCAAGAA TTGTCACCAG TGAAGAGGTC 120 ATTATTCGAG AAAGCCTCCT TCCTGTCACC CTGCAGTGTA ACCTCACTTC CAGCTCTCAC 180 ACCCTTATGT ACAGCTACTG GACAAGGAAT GGGGTAGAAC TCACTGCCAC CCGTAAGAAT 240 GCCAGCAACA TGGAGTACAG GATCAATAAG CCAAGAGCTG AGGATTCAGG CGAATACCAC 300 TGTGTATATC ATTTTGTCAG CGCTCCTAAA GCAAATGCCA CCATTGAAGT GAAAGCTGCT 360 CCTGACATCA CTGGCCATAA ACGAAGTGAA AACAAAAATG AAGGGCAGGA TGCTATGATG 420 TACTGCAAGT CAGTTGGCTA CCCCCACCCA GAGTGGATAT GGCGCAAGAA GGAGAATGGT 480 GTGTTTGAGG AGATTTCTAA TAGCTCTGGT CGCTTCTTCA TCACCAACAA GGAGAATTAC 540 ACTGAATTGA GTATTGTGAA TCTCCAAATC ACAGAAGATC CTGGAGAGTA TGAATGTAAT 600 GCCACCAACT CCATTGGCTC TGCCTCCGTT TCCACCGTCC TCAGGGTACG GAGCCACCTT 660 GCCCCACTTT GGCCTTTCTT GGGAATTCTG GCTGAAATCA TCATCCTTGT GGTGATCATT 720 GTTGTGTATG AGAAGAGGAA GAGGCCAGAT GAGGTTCCTG ATGATGATGA ACCAGCTGGG 780 CCAATGAAAA CCAACTCTAC CAACAATCAC AAAGATAAAA ACTTGCGCCA GAGAAACACA 840 AAT 843

【０１０１】配列番号：３配列の長さ：１９１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 TCGCTGCGCG CTCTCCGGCT AGGGAGGATG TCGGGCTCGT CGCTCCCCGG CGCCCTGGCC 60 CTCTCGCTCT TGCTGGTCTC TGGCTCGCTC CTTCCAGGGC CAGGCGCTGC TCAGAACGAA 120 CCAAGAATTG TCACCAGTGA AGAGGTCATT ATTCGAGAAA GCCTCCTTCC TGTCACCCTG 180 CAGTGTAACC TCACTTCCAG CTCTCACACC CTTATGTACA GCTACTGGAC AAGGAATGGG 240 GTAGAACTCA CTGCCACCCG TAAGAATGCC AGCAACATGG AGTACAGGAT CAATAAGCCA 300 AGAGCTGAGG ATTCAGGCGA ATACCACTGT GTATATCATT TTGTCAGCGC TCCTAAAGCA 360 AATGCCACCA TTGAAGTGAA AGCTGCTCCT GACATCACTG GCCATAAACG AAGTGAAAAC 420 AAAAATGAAG GGCAGGATGC TATGATGTAC TGCAAGTCAG TTGGCTACCC CCACCCAGAG 480 TGGATATGGC GCAAGAAGGA GAATGGTGTG TTTGAGGAGA TTTCTAATAG CTCTGGTCGC 540 TTCTTCATCA CCAACAAGGA GAATTACACT GAATTGAGTA TTGTGAATCT CCAAATCACA 600 GAAGATCCTG GAGAGTATGA ATGTAATGCC ACCAACTCCA TTGGCTCTGC CTCCGTTTCC 660 ACCGTCCTCA GGGTACGGAG CCACCTTGCC CCACTTTGGC CTTTCTTGGG AATTCTGGCT 720 GAAATCATCA TCCTTGTGGT GATCATTGTT GTGTATGAGA AGAGGAAGAG GCCAGATGAG 780 GTTCCTGATG ATGATGAACC AGCTGGGCCA ATGAAAACCA ACTCTACCAA CAATCACAAA 840 GATAAAAACT TGCGCCAGAG AAACACAAAT TAAGTACTGC TTTTAATCTC TTTAGGTTCC 900 TGAAAAACGA TGGCAACATG ACCTGCTAAG TTTTCTGCTT GGACCTCTTT GGTCTCTCTC 960 CCTTTCAAGT GAGCNACANC ACAATGACCG TCTNAAGCAT GCCTTATTTA GCCTCTCCTA 1020 TANGGGTGAC CTAGCCAGGT AACAATTTTA AACAATGCTT CAGTGTAGNA NGGGTGTAAN 1080 CNTAATTTNG GGCTTGATGT GCTGTGAATG TTGCTTTCCC TCCCTTTTGT TAAAAANATT 1140 TAAANAGAAA TGAAAAGGTC CTCTGAGGAT CAGATCATGC ATGCGCCATT TTTTACTTAT 1200 GCAGCTGTTA AATTGGCAAA GCTCTAAACG CACTGCTGCC ATCTAGTGAT CATTTTGTAA 1260 AGTACACCCC CACCTACAGA TATATACAGT ATATAAATAT ATATATATAT TTATATTTTT 1320 GGGGGTGGGA GAAATCCCAA ATAAAGTCNA CGCTTGTTTC ATTTTAAGCT GCTGATACTC 1380 ATTCCTTATT ATTTGTCGTC AGATGAGGAA GCTGCAGTTC TGGTACAAAC TGATGAGAGT 1440 GTATAGACTT AAGTCTGGCA TTCTAAGGGC TTACCGTATA ACTTTAGGAA CCTGGAACAG 1500 TCCACTGAAC GGCTAGAATG AATTGCAGTA TATATGTATG ATTGATTGCT TTTTAAGTGA 1560 CTATTTTTCC TCTTGTCAAA TCATGTAAAT TCTGAAATCT TTTGCACTGA TGTGTCAAAC 1620 CTCATTCTTG TATATTCAAT CAAGGCAACT TTTATAATTT CCCATTTGTT TTCAATGACC 1680 CTGAAATGTT AATAGCATGG TGATATTCTA TGCAACTCTA GTTACACCTT TTGGTTTGAC 1740 ACTGTATTTT CACATTGATT TCATGACTGA TGATAGATTT TATAACCTGA CTGGGTTCTC 1800 ATGCGGTACT AACTGTAGAT GCATGTACTT GTGTTCTGTG TAATTATTGA AGTGCAATGG 1860 TGTACCAAAA AAGTGGATTC ACCTGTTTTT AACAATAAAA CATTGATAAA AAAAAAAA 1918

【０１０２】配列番号：４配列の長さ：１９１８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：Mouse セルライン：ＳＴ２配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：28..870 特徴を決定した方法：Ｐ特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：28..96 特徴を決定した方法：Ｓ特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：97..870 特徴を決定した方法：Ｓ配列 TCGCTGCGCG CTCTCCGGCT AGGGAGG ATG TCG GGC TCG TCG CTC CCC GGC 51 Met Ser Gly Ser Ser Leu Pro Gly -23 -20 GCC CTG GCC CTC TCG CTC TTG CTG GTC TCT GGC TCG CTC CTT CCA GGG 99 Ala Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu Val Ser Gly Ser Leu Leu Pro Gly -15 -10 -5 1 CCA GGC GCT GCT CAG AAC GAA CCA AGA ATT GTC ACC AGT GAA GAG GTC 147 Pro Gly Ala Ala Gln Asn Glu Pro Arg Ile Val Thr Ser Glu Glu Val 5 10 15 ATT ATT CGA GAA AGC CTC CTT CCT GTC ACC CTG CAG TGT AAC CTC ACT 195 Ile Ile Arg Glu Ser Leu Leu Pro Val Thr Leu Gln Cys Asn Leu Thr 20 25 30 TCC AGC TCT CAC ACC CTT ATG TAC AGC TAC TGG ACA AGG AAT GGG GTA 243 Ser Ser Ser His Thr Leu Met Tyr Ser Tyr Trp Thr Arg Asn Gly Val 35 40 45 GAA CTC ACT GCC ACC CGT AAG AAT GCC AGC AAC ATG GAG TAC AGG ATC 291 Glu Leu Thr Ala Thr Arg Lys Asn Ala Ser Asn Met Glu Tyr Arg Ile 50 55 60 65 AAT AAG CCA AGA GCT GAG GAT TCA GGC GAA TAC CAC TGT GTA TAT CAT 339 Asn Lys Pro Arg Ala Glu Asp Ser Gly Glu Tyr His Cys Val Tyr His 70 75 80 TTT GTC AGC GCT CCT AAA GCA AAT GCC ACC ATT GAA GTG AAA GCT GCT 387 Phe Val Ser Ala Pro Lys Ala Asn Ala Thr Ile Glu Val Lys Ala Ala 85 90 95 CCT GAC ATC ACT GGC CAT AAA CGA AGT GAA AAC AAA AAT GAA GGG CAG 435 Pro Asp Ile Thr Gly His Lys Arg Ser Glu Asn Lys Asn Glu Gly Gln 100 105 110 GAT GCT ATG ATG TAC TGC AAG TCA GTT GGC TAC CCC CAC CCA GAG TGG 483 Asp Ala Met Met Tyr Cys Lys Ser Val Gly Tyr Pro His Pro Glu Trp 115 120 125 ATA TGG CGC AAG AAG GAG AAT GGT GTG TTT GAG GAG ATT TCT AAT AGC 531 Ile Trp Arg Lys Lys Glu Asn Gly Val Phe Glu Glu Ile Ser Asn Ser 130 135 140 145 TCT GGT CGC TTC TTC ATC ACC AAC AAG GAG AAT TAC ACT GAA TTG AGT 579 Ser Gly Arg Phe Phe Ile Thr Asn Lys Glu Asn Tyr Thr Glu Leu Ser 150 155 160 ATT GTG AAT CTC CAA ATC ACA GAA GAT CCT GGA GAG TAT GAA TGT AAT 627 Ile Val Asn Leu Gln Ile Thr Glu Asp Pro Gly Glu Tyr Glu Cys Asn 165 170 175 GCC ACC AAC TCC ATT GGC TCT GCC TCC GTT TCC ACC GTC CTC AGG GTA 675 Ala Thr Asn Ser Ile Gly Ser Ala Ser Val Ser Thr Val Leu Arg Val 180 185 190 CGG AGC CAC CTT GCC CCA CTT TGG CCT TTC TTG GGA ATT CTG GCT GAA 723 Arg Ser His Leu Ala Pro Leu Trp Pro Phe Leu Gly Ile Leu Ala Glu 195 200 205 ATC ATC ATC CTT GTG GTG ATC ATT GTT GTG TAT GAG AAG AGG AAG AGG 771 Ile Ile Ile Leu Val Val Ile Ile Val Val Tyr Glu Lys Arg Lys Arg 210 215 220 225 CCA GAT GAG GTT CCT GAT GAT GAT GAA CCA GCT GGG CCA ATG AAA ACC 819 Pro Asp Glu Val Pro Asp Asp Asp Glu Pro Ala Gly Pro Met Lys Thr 230 235 240 AAC TCT ACC AAC AAT CAC AAA GAT AAA AAC TTG CGC CAG AGA AAC ACA 867 Asn Ser Thr Asn Asn His Lys Asp Lys Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr 245 250 255 AAT TAAGTACTGC TTTTAATCTC TTTAGGTTCC TGAAAAACGA TGGCAACATG 920 Asn ACCTGCTAAG TTTTCTGCTT GGACCTCTTT GGTCTCTCTC CCTTTCAAGT GAGCNACANC 980 ACAATGACCG TCTNAAGCAT GCCTTATTTA GCCTCTCCTA TANGGGTGAC CTAGCCAGGT 1040 AACAATTTTA AACAATGCTT CAGTGTAGNA NGGGTGTAAN CNTAATTTNG GGCTTGATGT 1100 GCTGTGAATG TTGCTTTCCC TCCCTTTTGT TAAAAANATT TAAANAGAAA TGAAAAGGTC 1160 CTCTGAGGAT CAGATCATGC ATGCGCCATT TTTTACTTAT GCAGCTGTTA AATTGGCAAA 1220 GCTCTAAACG CACTGCTGCC ATCTAGTGAT CATTTTGTAA AGTACACCCC CACCTACAGA 1280 TATATACAGT ATATAAATAT ATATATATAT TTATATTTTT GGGGGTGGGA GAAATCCCAA 1340 ATAAAGTCNA CGCTTGTTTC ATTTTAAGCT GCTGATACTC ATTCCTTATT ATTTGTCGTC 1400 AGATGAGGAA GCTGCAGTTC TGGTACAAAC TGATGAGAGT GTATAGACTT AAGTCTGGCA 1460 TTCTAAGGGC TTACCGTATA ACTTTAGGAA CCTGGAACAG TCCACTGAAC GGCTAGAATG 1520 AATTGCAGTA TATATGTATG ATTGATTGCT TTTTAAGTGA CTATTTTTCC TCTTGTCAAA 1580 TCATGTAAAT TCTGAAATCT TTTGCACTGA TGTGTCAAAC CTCATTCTTG TATATTCAAT 1640 CAAGGCAACT TTTATAATTT CCCATTTGTT TTCAATGACC CTGAAATGTT AATAGCATGG 1700 TGATATTCTA TGCAACTCTA GTTACACCTT TTGGTTTGAC ACTGTATTTT CACATTGATT 1760 TCATGACTGA TGATAGATTT TATAACCTGA CTGGGTTCTC ATGCGGTACT AACTGTAGAT 1820 GCATGTACTT GTGTTCTGTG TAATTATTGA AGTGCAATGG TGTACCAAAA AAGTGGATTC 1880 ACCTGTTTTT AACAATAAAA CATTGATAAA AAAAAAAA 1918

【０１０３】配列番号: ５配列の長さ: ２８２配列の型: アミノ酸トポロジー: 直鎖状配列の種類: タンパク質配列 Met Ser Gly Ser Ser Leu Pro Ser Ala Leu Ala Leu Ser Leu Leu Leu -23 -20 -15 -10 Val Ser Gly Ser Leu Leu Pro Gly Pro Gly Ala Ala Gln Asn Glu Pro -5 1 5 Arg Ile Val Thr Ser Glu Glu Val Ile Ile Arg Asp Ser Pro Val Leu 10 15 20 25 Pro Val Thr Leu Gln Cys Asn Leu Thr Ser Ser Ser His Thr Leu Thr 30 35 40 Tyr Ser Tyr Trp Thr Lys Asn Gly Val Glu Leu Ser Ala Thr Arg Lys 45 50 55 Asn Ala Ser Asn Met Glu Tyr Arg Ile Asn Lys Pro Arg Ala Glu Asp 60 65 70 Ser Gly Glu Tyr His Cys Val Tyr His Phe Val Ser Ala Pro Lys Ala 75 80 85 Asn Ala Thr Ile Glu Val Lys Ala Ala Pro Asp Ile Thr Gly His Lys 90 95 100 105 Arg Ser Glu Asn Lys Asn Glu Gly Gln Asp Ala Thr Met Tyr Cys Lys 110 115 120 Ser Val Gly Tyr Pro His Pro Asp Trp Ile Trp Arg Lys Lys Glu Asn 125 130 135 Gly Met Pro Met Asp Ile Val Asn Thr Ser Gly Arg Phe Phe Ile Ile 140 145 150 Asn Lys Glu Asn Tyr Thr Glu Leu Asn Ile Val Asn Leu Gln Ile Thr 155 160 165 Glu Asp Pro Gly Glu Tyr Glu Cys Asn Ala Thr Asn Ala Ile Gly Ser 170 175 180 185 Ala Ser Val Val Thr Val Leu Arg Val Arg Ser His Leu Ala Pro Leu 190 195 200 Trp Pro Phe Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ile Ile Ile Leu Val Val Ile 205 210 215 Ile Val Val Tyr Glu Lys Arg Lys Arg Pro Asp Glu Val Pro Asp Asp 220 225 230 Asp Glu Pro Ala Gly Pro Met Lys Thr Asn Ser Thr Asn Asn His Lys 235 240 245 Asp Lys Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Asn 250 255

【０１０４】配列番号：６配列の長さ：８４３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGTCGGGTT CGTCGCTGCC CAGCGCCCTG GCCCTCTCGC TGTTGCTGGT CTCTGGCTCC 60 CTCCTCCCAG GGCCAGGCGC CGCTCAGAAC GAGCCAAGGA TTGTCACCAG TGAAGAGGTC 120 ATTATTCGAG ACAGCCCTGT TCTCCCTGTC ACCCTGCAGT GTAACCTCAC CTCCAGCTCT 180 CACACCCTTA CATACAGCTA CTGGACAAAG AATGGGGTGG AACTGAGTGC CACTCGTAAG 240 AATGCCAGCA ACATGGAGTA CAGGATCAAT AAGCCGAGAG CTGAGGATTC AGGCGAATAC 300 CACTGCGTAT ATCACTTTGT CAGCGCTCCT AAAGCAAACG CCACCATTGA AGTGAAAGCC 360 GCTCCTGACA TCACTGGCCA TAAACGGAGT GAGAACAAGA ATGAAGGGCA GGATGCCACT 420 ATGTATTGCA AGTCAGTTGG CTACCCCCAC CCAGACTGGA TATGGCGCAA GAAGGAGAAC 480 GGGATGCCCA TGGACATTGT CAATACCTCT GGCCGCTTCT TCATCATCAA CAAGGAAAAT 540 TACACTGAGT TGAACATTGT GAACCTGCAG ATCACGGAAG ACCCTGGCGA GTATGAATGT 600 AATGCCACCA ACGCCATTGG CTCCGCCTCT GTTGTCACTG TCCTCAGGGT GCGGAGCCAC 660 CTGGCCCCAC TCTGGCCTTT CTTGGGAATT CTGGCTGAAA TTATCATCCT TGTGGTGATC 720 ATTGTTGTGT ATGAGAAGAG GAAGAGGCCA GATGAGGTTC CTGACGATGA TGAACCAGCT 780 GGACCAATGA AAACCAACTC TACCAACAAT CACAAAGATA AAAACTTGCG CCAGAGAAAC 840 ACA 843

【０１０５】配列番号：７配列の長さ：２０４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 GAAGGACGGA GCCGAGCCGC GGCTGCCTCC CTCGCTCACT CCCTCGCGCA CTCGCCCGCC 60 CCCTCCCTCC CTCCCCTCCC TTCCCCGGGC CCGGGTCTGG CCCCGGCCCA TTCGCTGTTG 120 GGTCTTCTGC TAGGGAGGAT GTCGGGTTCG TCGCTGCCCA GCGCCCTGGC CCTCTCGCTG 180 TTGCTGGTCT CTGGCTCCCT CCTCCCAGGG CCAGGCGCCG CTCAGAACGA GCCAAGGATT 240 GTCACCAGTG AAGAGGTCAT TATTCGAGAC AGCCCTGTTC TCCCTGTCAC CCTGCAGTGT 300 AACCTCACCT CCAGCTCTCA CACCCTTACA TACAGCTACT GGACAAAGAA TGGGGTGGAA 360 CTGAGTGCCA CTCGTAAGAA TGCCAGCAAC ATGGAGTACA GGATCAATAA GCCGAGAGCT 420 GAGGATTCAG GCGAATACCA CTGCGTATAT CACTTTGTCA GCGCTCCTAA AGCAAACGCC 480 ACCATTGAAG TGAAAGCCGC TCCTGACATC ACTGGCCATA AACGGAGTGA GAACAAGAAT 540 GAAGGGCAGG ATGCCACTAT GTATTGCAAG TCAGTTGGCT ACCCCCACCC AGACTGGATA 600 TGGCGCAAGA AGGAGAACGG GATGCCCATG GACATTGTCA ATACCTCTGG CCGCTTCTTC 660 ATCATCAACA AGGAAAATTA CACTGAGTTG AACATTGTGA ACCTGCAGAT CACGGAAGAC 720 CCTGGCGAGT ATGAATGTAA TGCCACCAAC GCCATTGGCT CCGCCTCTGT TGTCACTGTC 780 CTCAGGGTGC GGAGCCACCT GGCCCCACTC TGGCCTTTCT TGGGAATTCT GGCTGAAATT 840 ATCATCCTTG TGGTGATCAT TGTTGTGTAT GAGAAGAGGA AGAGGCCAGA TGAGGTTCCT 900 GACGATGATG AACCAGCTGG ACCAATGAAA ACCAACTCTA CCAACAATCA CAAAGATAAA 960 AACTTGCGCC AGAGAAACAC AAATTAAGTA CTGCTTACAA TATCTTTAGG TTCCTGAAAC 1020 TGGTGGCAAC ATGACCTGCT AAAATTTTCT GCTTGGACCT CTTTGGTTCT CTCCCCTTTC 1080 AAGTGAGCAA CACCACAATG ACTGTCTAAA GCATGCCTTA TTTAGCCTCT CCTGTAAGGG 1140 TGATCTAGCC AGGTACATTT TAAACAATGC TTCAGTGTAG AAGGTGTAAA CTATTTTGGG 1200 CTTGATGTGC TGTGAATGTT GCTTTTTTTT TTCCTTTGTT AAAATATTTA AATAGAAGTG 1260 AAAAGGTCCT CTGAGGATCA GATCATGCAT GCGCCATTTT TTACTTAATG CAGCTGTTAA 1320 ATTGGCAAAG CTCTAAAATG CACTGCTGCC ATCTAGTGAT ACACTTTTGT AAAGTACAGC 1380 AAAACCTACA GGTATATACA GCATATAAAT ATATATATAT ATATATTTAT ATTTTTGGGG 1440 GTGGGAGAAA TCCAAAATAA AGTAAATGCT TGTTTCATTT TTAAGCTGCT GATATTCATT 1500 CCTTATTGTA TGTTGTCAGA TGAGGAAATT GTGCAGTTCT GGTACATAAA GATGAGTAAT 1560 ATAAACTGAA ATCTATAATT TTAAGGGCTT AACCTGTGAC TTTAATAAGC TGGAACAGTC 1620 CACTGAATGG GTATAATGAA TTGCAGTATA TACGTATGAT TGCTTTTTAA GTGATTATCT 1680 TTTCTTCTGT TAAGTCATGT AAATTCATAA ATCCTTTTGC ACTGATGTGT TGAACCTTAT 1740 TCTTGTACAT TCATTCAATC AAGGCAAACT TTTATAATTT TTCTTTTGTT TCCAATGACC 1800 TTGAAATGTT ATAGCATGGT AATATTCTAT GCAACTATAG TTATACTTTT TGGTTTGACA 1860 CTGTATTTTT TCACATTGAT TTACTGGTTG ATGATAGATT TTATAACCTA ACGGTTCTCA 1920 TGCGGTGCGT AATTGTAGAT GCATGTACTT GTGTGTTTTG TGTAACTATT GAAGTGCAAT 1980 GATGTATAAA AAAGTGGATT CACCTGTTTT TAAAAATAAA ACATTGATAA AAAAAAAAAA 2040

【０１０６】配列番号：８配列の長さ：２０４０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：Homo Sapiens セルライン：Ｔ９８Ｇ配列の特徴特徴を表す記号：ＣＤＳ存在位置：１３９．．９８４特徴を決定した方法：Ｐ特徴を表す記号：sig peptide 存在位置：１３９．．２０７特徴を決定した方法：Ｓ特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：２０８．．９８４特徴を決定した方法：Ｓ配列 GAAGGACGGA GCCGAGCCGC GGCTGCCTCC CTCGCTCACT CCCTCGCGCA CTCGCCCGCC 60 CCCTCCCTCC CTCCCCTCCC TTCCCCGGGC CCGGGTCTGG CCCCGGCCCA TTCGCTGTTG 120 GGTCTTCTGC TAGGGAGG ATG TCG GGT TCG TCG CTG CCC AGC GCC CTG GCC 171 Met Ser Gly Ser Ser Leu Pro Ser Ala Leu Ala -23 -20 -15 CTC TCG CTG TTG CTG GTC TCT GGC TCC CTC CTC CCA GGG CCA GGC GCC 219 Leu Ser Leu Leu Leu Val Ser Gly Ser Leu Leu Pro Gly Pro Gly Ala -10 -5 1 GCT CAG AAC GAG CCA AGG ATT GTC ACC AGT GAA GAG GTC ATT ATT CGA 267 Ala Gln Asn Glu Pro Arg Ile Val Thr Ser Glu Glu Val Ile Ile Arg 5 10 15 20 GAC AGC CCT GTT CTC CCT GTC ACC CTG CAG TGT AAC CTC ACC TCC AGC 315 Asp Ser Pro Val Leu Pro Val Thr Leu Gln Cys Asn Leu Thr Ser Ser 25 30 35 TCT CAC ACC CTT ACA TAC AGC TAC TGG ACA AAG AAT GGG GTG GAA CTG 363 Ser His Thr Leu Thr Tyr Ser Tyr Trp Thr Lys Asn Gly Val Glu Leu 40 45 50 AGT GCC ACT CGT AAG AAT GCC AGC AAC ATG GAG TAC AGG ATC AAT AAG 411 Ser Ala Thr Arg Lys Asn Ala Ser Asn Met Glu Tyr Arg Ile Asn Lys 55 60 65 CCG AGA GCT GAG GAT TCA GGC GAA TAC CAC TGC GTA TAT CAC TTT GTC 459 Pro Arg Ala Glu Asp Ser Gly Glu Tyr His Cys Val Tyr His Phe Val 70 75 80 AGC GCT CCT AAA GCA AAC GCC ACC ATT GAA GTG AAA GCC GCT CCT GAC 507 Ser Ala Pro Lys Ala Asn Ala Thr Ile Glu Val Lys Ala Ala Pro Asp 85 90 95 100 ATC ACT GGC CAT AAA CGG AGT GAG AAC AAG AAT GAA GGG CAG GAT GCC 555 Ile Thr Gly His Lys Arg Ser Glu Asn Lys Asn Glu Gly Gln Asp Ala 105 110 115 ACT ATG TAT TGC AAG TCA GTT GGC TAC CCC CAC CCA GAC TGG ATA TGG 603 Thr Met Tyr Cys Lys Ser Val Gly Tyr Pro His Pro Asp Trp Ile Trp 120 125 130 CGC AAG AAG GAG AAC GGG ATG CCC ATG GAC ATT GTC AAT ACC TCT GGC 651 Arg Lys Lys Glu Asn Gly Met Pro Met Asp Ile Val Asn Thr Ser Gly 135 140 145 CGC TTC TTC ATC ATC AAC AAG GAA AAT TAC ACT GAG TTG AAC ATT GTG 699 Arg Phe Phe Ile Ile Asn Lys Glu Asn Tyr Thr Glu Leu Asn Ile Val 150 155 160 AAC CTG CAG ATC ACG GAA GAC CCT GGC GAG TAT GAA TGT AAT GCC ACC 747 Asn Leu Gln Ile Thr Glu Asp Pro Gly Glu Tyr Glu Cys Asn Ala Thr 165 170 175 180 AAC GCC ATT GGC TCC GCC TCT GTT GTC ACT GTC CTC AGG GTG CGG AGC 795 Asn Ala Ile Gly Ser Ala Ser Val Val Thr Val Leu Arg Val Arg Ser 185 190 195 CAC CTG GCC CCA CTC TGG CCT TTC TTG GGA ATT CTG GCT GAA ATT ATC 843 His Leu Ala Pro Leu Trp Pro Phe Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ile Ile 200 205 210 ATC CTT GTG GTG ATC ATT GTT GTG TAT GAG AAG AGG AAG AGG CCA GAT 891 Ile Leu Val Val Ile Ile Val Val Tyr Glu Lys Arg Lys Arg Pro Asp 215 220 225 GAG GTT CCT GAC GAT GAT GAA CCA GCT GGA CCA ATG AAA ACC AAC TCT 939 Glu Val Pro Asp Asp Asp Glu Pro Ala Gly Pro Met Lys Thr Asn Ser 230 235 240 ACC AAC AAT CAC AAA GAT AAA AAC TTG CGC CAG AGA AAC ACA AAT 984 Thr Asn Asn His Lys Asp Lys Asn Leu Arg Gln Arg Asn Thr Asn 245 250 255 TAAGTACTGC TTACAATATC TTTAGGTTCC TGAAACTGGT GGCAACATGA CCTGCTAAAA 1044 TTTTCTGCTT GGACCTCTTT GGTTCTCTCC CCTTTCAAGT GAGCAACACC ACAATGACTG 1104 TCTAAAGCAT GCCTTATTTA GCCTCTCCTG TAAGGGTGAT CTAGCCAGGT ACATTTTAAA 1164 CAATGCTTCA GTGTAGAAGG TGTAAACTAT TTTGGGCTTG ATGTGCTGTG AATGTTGCTT 1224 TTTTTTTTCC TTTGTTAAAA TATTTAAATA GAAGTGAAAA GGTCCTCTGA GGATCAGATC 1284 ATGCATGCGC CATTTTTTAC TTAATGCAGC TGTTAAATTG GCAAAGCTCT AAAATGCACT 1344 GCTGCCATCT AGTGATACAC TTTTGTAAAG TACAGCAAAA CCTACAGGTA TATACAGCAT 1404 ATAAATATAT ATATATATAT ATTTATATTT TTGGGGGTGG GAGAAATCCA AAATAAAGTA 1464 AATGCTTGTT TCATTTTTAA GCTGCTGATA TTCATTCCTT ATTGTATGTT GTCAGATGAG 1524 GAAATTGTGC AGTTCTGGTA CATAAAGATG AGTAATATAA ACTGAAATCT ATAATTTTAA 1584 GGGCTTAACC TGTGACTTTA ATAAGCTGGA ACAGTCCACT GAATGGGTAT AATGAATTGC 1644 AGTATATACG TATGATTGCT TTTTAAGTGA TTATCTTTTC TTCTGTTAAG TCATGTAAAT 1704 TCATAAATCC TTTTGCACTG ATGTGTTGAA CCTTATTCTT GTACATTCAT TCAATCAAGG 1764 CAAACTTTTA TAATTTTTCT TTTGTTTCCA ATGACCTTGA AATGTTATAG CATGGTAATA 1824 TTCTATGCAA CTATAGTTAT ACTTTTTGGT TTGACACTGT ATTTTTTCAC ATTGATTTAC 1884 TGGTTGATGA TAGATTTTAT AACCTAACGG TTCTCATGCG GTGCGTAATT GTAGATGCAT 1944 GTACTTGTGT GTTTTGTGTA ACTATTGAAG TGCAATGATG TATAAAAAAG TGGATTCACC 2004 TGTTTTTAAA AATAAAACAT TGATAAAAAA AAAAAA 2040

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のｃＤＮＡライブラリーの作製方法の
概念図である。

【図２】プラスミドベクターｐＵＣＳＲαＭＬ２の
構築図である。

【図３】ｐＵＣＳＲαＭＬ２−ｈＴａｃの構築図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 39/395 ＡＢＥＡＢＹＮＡＤＵＴＡＤＶＥＣ０７Ｋ 16/18 8517−4ＨＣ１２Ｎ 5/10 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ 21/08 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｒ 1:91） (72)発明者多田秀明大阪府三島郡島本町桜井３丁目１番１号小野薬品工業株式会社水無瀬研究所内 (72)発明者福島大吉大阪府三島郡島本町桜井３丁目１番１号小野薬品工業株式会社水無瀬研究所内 (54)【発明の名称】新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】実質的に純粋な形である配列番号１また
は５で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そ
のホモローグ、そのフラグメントまたはそのフラグメン
トのホモローグ。
【請求項２】実質的に純粋な形である配列番号１で示
されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのホモロ
ーグ、そのフラグメントまたはそのフラグメントのホモ
ローグ。
【請求項３】配列番号１で示されるアミノ酸配列から
なる請求項２記載のポリペプチド。
【請求項４】請求項３に記載されたポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ。
【請求項５】配列番号２で示される塩基配列を有する
請求項４記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
ブリダイズするフラグメント。
【請求項６】配列番号３で示される塩基配列を有する
請求項４記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
ブリダイズするフラグメント。
【請求項７】請求項４から６のいずれかの項に記載の
ＤＮＡからなる複製または発現ベクター。
【請求項８】請求項７記載の複製または発現ベクター
で形質転換された宿主細胞。
【請求項９】請求項２または３に記載されたポリペプ
チドを発現させるための条件下で請求項８記載の宿主細
胞を培養することからなる該ポリペプチドの製造方法。
【請求項１０】請求項２または３に記載されたポリペ
プチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体。
【請求項１１】請求項２または３に記載されたポリペ
プチドまたは請求項１０記載の抗体および薬学的に許容
される賦形剤および／または担体を含有することを特徴
とする薬学的組成物。
【請求項１２】実質的に純粋な形である配列番号５で
示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのホモ
ローグ、そのフラグメントまたはそのフラグメントのホ
モローグ。
【請求項１３】配列番号５で示されるアミノ酸配列か
らなる請求項１２記載のポリペプチド。
【請求項１４】請求項１２に記載されたポリペプチド
をコードするＤＮＡ。
【請求項１５】配列番号６で示される塩基配列を有す
る請求項１４記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的に
ハイブリダイズするフラグメント。
【請求項１６】配列番号７で示される塩基配列を有す
る請求項１４記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的に
ハイブリダイズするフラグメント。
【請求項１７】請求項１４から１６のいずれかの項に
記載のＤＮＡからなる複製または発現ベクター。
【請求項１８】請求項１７記載の複製または発現ベク
ターで形質転換された宿主細胞。
【請求項１９】請求項１２または１３に記載されたポ
リペプチドを発現させるための条件下で請求項１８記載
の宿主細胞を培養することからなる該ポリペプチドの製
造方法。
【請求項２０】請求項１２または１３に記載されたポ
リペプチドのモノクローナルまたはポリクローナル抗
体。
【請求項２１】請求項１２または１３に記載されたポ
リペプチドまたは請求項２０記載の抗体および薬学的に
許容される賦形剤および／または担体を含有することを
特徴とする薬学的組成物。