JPH0795893A - 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのポリペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒトグリア芽細胞腫細胞株が産生する、１８
７アミノ酸からなる新規なポリペプチド、その製造方
法、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡ
からなるベクター、そのベクターで形質転換された宿主
細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのポリペプチ
ドまたは抗体を含有する薬学的組成物。 【効果】 本発明の該ポリペプチドは、細胞の発育不全
または異常増殖、機能の低下または亢進、腫瘍、あるい
は脂質代謝異常による疾患等の予防あるいは治療剤とし
て用いることができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ある種の細胞株が産生
する新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプ
チドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡからなるベクタ
ー、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリ
ペプチドの抗体、およびそのポリペプチドまたは抗体を
含有する薬学的組成物に関する。

【０００２】

【発明の目的】細胞からはその維持、増殖および成長に
関連した多くの因子が産生されている。例えば、脳を構
成しているグリア細胞からは、神経細胞やグリア細胞の
分化、増殖および成長に関連した多くの因子が産生され
ている。本発明者らはこの点に注目し、ある種の細胞
（例えば、グリア細胞）が産生している新規な因子（ポ
リペプチド）を見出すべく鋭意検討を行なった。従来、
ある特定のポリペプチドまたはそれをコードするＤＮＡ
を得ようとする場合、組織や細胞培養液中に目的とする
生物活性を確認し、次いでポリペプチドの単離精製を経
て、遺伝子をクローニングするという方法、あるいはそ
の生物活性を指標として遺伝子を発現クローニングする
方法が一般的に用いられていた。しかし、生体内生理活
性ポリペプチドは多様な生物活性を有している場合が多
いので、あるひとつの活性を指標にして遺伝子をクロー
ニングした結果、それが既知のポリペプチドと同一であ
ることが後になって判明するという事例が増えている。
また、細胞が産生する因子は微量のものが多く、そのこ
とが単離、精製および生物活性の確認を困難なものとし
ている。

【０００３】一方、ｃＤＮＡの作製技術やシークエンス
技術は急速に発展し、大量のｃＤＮＡのシークエンスを
迅速に行なうことができるようになった。また、遺伝子
からその遺伝子の機能を同定するリバース・ジェネティ
クス (Reverse Genetics) の諸方法の発展も著しい。そ
こで、本発明者らは、これらの方法を用いて新規なポリ
ペプチドを見出すことにした。すなわち、グリア細胞等
からｍＲＮＡを単離し、これを出発材料としてｃＤＮＡ
を得、その塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定し
た。その結果、新規なヒトのホスファチジルエタノール
アミン結合蛋白質をコードする遺伝子を見出すことに成
功し、本発明を成した。

【０００４】スイスプロット(Swiss Prot Release 2.0)
に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配列を
調査した結果、本発明のポリペプチドのそれと相同性の
高い配列を有しているものとして、ウシのホスファチジ
ルエタノールアミン結合蛋白質（塩基性２１−ＫＤ蛋白
質）遺伝子が見出された。しかし、ヒト由来の遺伝子に
ついては、ジーンバンク(GenBank Release 70.0)に登録
されているヌクレオチド配列を調査したが、本発明のポ
リペプチドのそれと同一の遺伝子はまったく無かった。
従って、本発明のポリペプチドはまったく新規なもので
あることが確認された。

【０００５】ここで、ホスファチジルエタノールアミン
結合蛋白質について説明する。生物体内において、リン
脂質は非常に重要な分子であり、細胞膜あるいは細胞質
内膜の構成成分として、生物体の生命活動そのものを維
持している。 ホスファチジルエタノールアミンは、Ｃ
ＤＰ−エタノールアミンと１，２−ジアシルグリセロー
ルから、エタノールアミンリン酸の転移反応により合成
される。またこれは、ホスファチジルコリンあるいはホ
スファチジルセリンに変換されたり、ホスホリパーゼ
Ａ，Ｃ，またはＤにより加水分解を受け、代謝回転が起
こる。

【０００６】

【化１】

【０００７】本発明のヒトホスファチジルエタノールア
ミン結合蛋白質は、現在のところホスファチジルエタノ
ールアミンに結合し、リン脂質を可溶化するという性質
しか判っていない [Bernier, I. et al. Biochim. Biop
hys. Acta, 871, 19 (1986)] 。しかし、この蛋白質
は、ホスファチジルエタノールアミンを基質とする酵素
活性を保持しないことから，ホスファチジルエタノール
アミンの細胞内輸送あるいはホスファチジルエタノール
アミンと結合することによって、細胞内酵素の活性化ま
たは不活性化に寄与する因子であると推定される。

【０００８】

【発明の構成】本発明は、実質的に純粋な形である配列
番号１で示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、
そのホモローグ、その配列のフラグメントおよびそのホ
モローグに関する。本発明はさらにそれらのポリペプチ
ドをコードするＤＮＡに関する。より具体的には、配列
番号２または３で示される塩基配列を有するＤＮＡ、お
よび配列番号２または３で示される塩基配列に選択的に
ハイブリダイズするフラグメントを有するＤＮＡに関す
る。

【０００９】特に本発明は、（１）配列番号１で示され
るアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）前記
（１）に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
および（４）配列番号３で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡに関する。

【００１０】実質的に純粋な形である配列番号１で示さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、一般に、
生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば、９５、９
８または９９％が配列番号１で示されるアミノ酸配列を
有するポリペプチドであることを意味する。

【００１１】配列番号１で示されるアミノ酸配列からな
るポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも２
０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０
または１００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも
７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より
好ましくは９５％以上相同性であるものであり、そのよ
うなホモローグは、以後本発明のポリペプチドとして記
載される。さらに、配列番号１で示されるアミノ酸配列
からなるポリペプチドのフラグメント、またはそれらの
ホモローグのフラグメントとは、少なくとも１０アミノ
酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例えば２０、
２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸部分を意味
する。

【００１２】配列番号２または３で示される塩基配列を
有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズするＤＮＡと
は、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少なくとも
３０個、例えば４０、６０または１００個の連続した塩
基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは少なくと
も８０または９０％、より好ましくは９５％以上相同性
であるものであり、そのようなＤＮＡは、以後本発明の
ＤＮＡとして記載される。配列番号２または３で示され
る塩基配列を有するＤＮＡのフラグメントとは、少なく
とも１０塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば
２０、２５、３０または４０塩基部分を意味し、そのよ
うなフラグメントも本発明のＤＮＡに含まれる。

【００１３】さらに、本発明には、本発明のＤＮＡから
なる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとし
ては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの
発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子な
どからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクタ
ーが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選
択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を
含んでいてもよい。ベクターは、イン・ビトロ（in vit
ro）に於いて例えば、DNA に対応するRNA の製造、宿主
細胞の形質転換に用いることができる。

【００１４】さらに、本発明には、配列番号２または３
で示される塩基配列、またはそれらのオープンリーディ
ングフレームを有するＤＮＡを含む本発明のＤＮＡを複
製または発現させるためのベクターで形質転換された宿
主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細菌、酵母、
昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。さらに、本
発明には、本発明のポリペプチドを発現させるための条
件下で、本発明の宿主細胞を培養することからなる本発
明のポリペプチドの製造方法も含まれる。培養は、本発
明のポリペプチドが発現し、宿主細胞より製造される条
件下で行われることが好ましい。本発明のＤＮＡは、上
記のようなベクターのアンチセンス領域に挿入すること
でアンチセンスＲＮＡを製造することもできる。このよ
うなアンチセンスＲＮＡは、細胞中の本発明のポリペプ
チドのレベルを制御することに用いることもできる。

【００１５】本発明は、本発明におけるポリペプチドの
モノクローナルまたはポリクローナル抗体も含む。さら
に本発明におけるポリペプチドのモノクローナルまたは
ポリクローナル抗体の製造方法も含む。モノクローナル
抗体は、本発明のペプチドまたは、その断片を抗原とし
て用い、通常のハイブリドーマの技術により製造するこ
とができる。ポリクローナル抗体は、宿主動物（例え
ば、ラットやウサギ等）に本発明のポリペプチドを接種
し、免疫血清を回収する、通常の方法により製造するこ
とができる。

【００１６】本発明には、本発明のポリペプチド、その
抗体と薬学的に許容される賦形剤および／または担体を
含有する薬学的組成物も含まれる。本発明のポリペプチ
ドとしては、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有す
るもの以外に、その一部が欠損したもの（例えば、配列
番号１中、生物活性の発現に必須な部分だけから成るポ
リペプチド）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの
（例えば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、
およびその一部に他のアミノ酸が付加または挿入された
ものも含まれる。

【００１７】よく知られているように、ひとつのアミノ
酸をコードするコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅｔは
１種類、Ｌｅｕは６種類）知られている。従って、ポリ
ペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤＮＡの塩基
配列を変えることができる。（２）で特定される本発明
のＤＮＡには、（１）の配列番号１で示されるポリペプ
チドをコードするすべての塩基配列群が含まれる。塩基
配列を変えることによって、ポリペプチドの生産性が向
上することがある。（３）で特定されるＤＮＡは、
（２）で示されるＤＮＡの一態様であり、天然型配列を
表わす。（４）に示されるＤＮＡは、（３）で特定され
るＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた配列を示す。配列
番号３で示される塩基配列を有するＤＮＡの作製は、以
下の方法に従って行なわれる。

【００１８】すなわち、(i) 本発明のポリペプチドを産
生する細胞、例えば、ヒトグリア芽細胞腫細胞株からｍ
ＲＮＡを分離し、(ii)該ｍＲＮＡからファーストストラ
ンド（１本鎖ＤＮＡ）、次いでセカンドストランド（２
本鎖ＤＮＡ）を合成し（ｃＤＮＡの合成）、(iii) 該ｃ
ＤＮＡを適当なプラスミドベクターに組み込み、(iv)得
られた組み換えベクターで宿主細胞を形質転換し（ｃＤ
ＮＡライブラリーの作製）、(v) 得られたｃＤＮＡライ
ブラリーより、大量のクローニングおよび５′側から平
均３００ベースのシークエンシングを行ない、(vi)塩基
配列の新規なクローンについて、その全長をシークエン
スすることによって作製することができる。

【００１９】より詳細に説明すると、工程(i) は、ヒト
グリア芽細胞腫細胞株を適当な刺激剤（例えば、ＩＬ−
１等）で刺激した後、Okayama, H. 等の方法［Method i
n Enzymology, 154 ,3 (1987) に記載］に従って行なわ
れる。本ポリペプチドを産生する細胞としては、好まし
くはヒトグリア芽細胞腫細胞株Ｔ９８Ｇ（ＡＴＣＣ株番
号、ＣＲＬ−１６９０）が挙げられる。 (ii)、(iii) および(iv)の工程はｃＤＮＡライブラリー
作製の工程であり、改変した Gubler ＆ Hoffman法［Ge
ne, 25, 263 (1983)に記載］に準じて行なわれる。

【００２０】(iii) の工程で用いられるプラスミドベク
ターとしては大腸菌内で機能するもの（例えば、ｐＢＲ
３２２）や枯草菌内で機能するもの（例えば、ｐＵＢ１
１０）が多数知られているが、好適には、大腸菌内で機
能するｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）［３１９９ｂｐ、プロメ
ガ社より販売］より作製したｐＶｆＣＳ−１（後記実施
例に詳しく記載されている。）が用いられる。(iv)の工
程で用いられる宿主細胞は既に多くのものが知られてお
り、いずれを用いてもよいが、好ましくはＤＨ５のコン
ピテントセル［Gene, 96, 23 (1990)記載の方法により
調製される。］である。

【００２１】工程(v) のクローニングは公知の方法によ
り行なわれる。またシークエンシングはマキサム・ギル
バート（Maxam-Gilbert ）法やジデオキシ・ターミネー
ター法により行なわれる。 (vi)の工程は、Molecular Cloning ［Sambrook, J., Fr
itsch, E. F. およびManiatis, T.著、Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press より1989年に発刊］に記載の方
法に従って行なわれる。

【００２２】このようにして得られたＤＮＡは、（I ）
ＤＮＡシークエンスを可能なフレームにおいてアミノ酸
配列に変換し、（II） 該ＤＮＡが全長あるいはほぼ全
長であることを確認する必要がある。これらの確認は、
工程(vi)の後に行なってもよいが、(v) の工程と(vi)の
工程の間に行なうとより効率的である。上記の検討中、
（II）はノーザン（Northern）解析により行なわれる。

【００２３】配列番号２および３で示される塩基配列
が、一旦確定されると、その後は化学合成によって、ま
たはＰＣＲ（ Polymerase Chain Reaction）法によっ
て、あるいは該塩基配列の断片をプローブとしてハイブ
リダイズさせることにより、本発明のＤＮＡを得ること
ができる。さらに、本ＤＮＡを含有するベクターＤＮＡ
を適当な宿主に導入し、これを増殖させることによっ
て、目的とする本発明ＤＮＡを必要量得ることができ
る。

【００２４】本発明のポリペプチドを取得する方法とし
ては、（１）生体または培養細胞から精製単離する方
法、（２）ペプチド合成する方法、または（３）遺伝子
組み換え技術を用いて生産する方法、などが挙げられる
が、工業的には（３）に記載した方法が好ましい。

【００２５】遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチド
を生産するための発現系（宿主−ベクター系）として
は、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞
の発現系が挙げられる。例えば、大腸菌で発現させる場
合には、配列番号３で示される塩基配列をコードするＤ
ＮＡの５′末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加し、得ら
れたＤＮＡを、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプ
ロモーター、ｌａｃプロモーター、λｐＬプロモータ
ー、Ｔ７プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で
機能するベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１
８、ｐＵＣ１９等）に挿入して、発現ベクターを作製す
る。次に、この発現ベクターで形質転換した大腸菌（例
えば、E. Coli ＤＨ１、E. Coli ＪＭ１０９、E. Coli
ＨＢ１０１株等）を適当な培地で培養して、その菌体よ
り目的とするポリペプチドを得ることができる。また、
バクテリアのシグナルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシ
グナルペプチド）を利用すれば、ペリプラズム中に目的
とするポリペプチドを分泌することもできる。さらに、
他のポリペプチドとのフュージョンプロテイン (fusion
protein) を生産することもできる。

【００２６】また、哺乳動物細胞で発現させる場合に
は、例えば、配列表３で示される塩基配列をコードする
ＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベク
ター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイル
スベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロモ
ーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロモ
ーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に挿
入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現ベ
クターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−７
細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ細
胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養す
ることによって、その細胞中に目的とするポリペプチド
が生産される。以上のようにして得られたポリペプチド
は、一般的な生化学的方法によって単離精製することが
できる。

【００２７】

【発明の効果】本発明のホスファチジルエタノールアミ
ン結合蛋白質はヒトグリア芽細胞腫細胞株から生産され
るものであるが、ウシ脳に存在する蛋白質とアミノ酸レ
ベルで９０％以上の相同性を示し、種を越えて高度に保
存された蛋白質であるといえる。ホスファチジルエタノ
ールアミンは、細胞の膜を構成する分子としてだけでな
く、血液凝固系あるいはグルコース−６−ホスファター
ゼおよびＵＤＰ−ガラクトース−リポ多糖ガラクトシル
トランスフェラーゼの活性化に関与していることが知ら
れており、本発明の蛋白質はグリア細胞や神経細胞およ
びこれら以外の細胞においてその維持、増殖、成長に関
連した働きを有していると予測される。従って、本発明
のポリペプチドは細胞の発育不全または異常増殖、機能
の低下または亢進、腫瘍、あるいは脂質代謝異常による
疾患等の予防あるいは治療剤として用いることができ
る。

【００２８】また、該ポリペプチドのポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該
ポリペプチドの定量が行なえ、これによって該ポリペプ
チドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用
することができる。ポリクローナル抗体およびモノクロ
ーナル抗体は該ポリペプチドあるいはその断片を抗原と
して用いて常法により作製することができる。

【００２９】本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待さ
れる本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須
の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療（遺伝子
欠損症の治療またはアンチセンスＤＮＡ（ＲＮＡ）によ
って、ポリペプチドの発現を停止させることによる治療
等）に利用できる。また、本発明のＤＮＡをプローブと
してジェノミック(genomic) ＤＮＡを分離できる。同様
にして、本発明ＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリペ
プチドの遺伝子、またヒト以外の生物における本発明ポ
リペプチドと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分離
することも可能である。

【００３０】

【医薬品への適用】本発明の目的または、グリア、ニュ
ーロンまたは造血系細胞の発育不全や異常増殖、免疫系
または神経系機能の亢進や低下、あるいは腫瘍または炎
症性疾患の治療等のために本発明のポリペプチドは通
常、全身的又は局所的に、一般的には経口または非経口
の形で投与される。好ましくは、経口投与、静脈内投与
および脳室内投与である。

【００３１】投与量は、年齢、体重、症状、治療効果、
投与方法、処理時間等により異なるが、通常、成人一人
あたり、一回につき、１００m ｇから１００ｍｇの範囲
で、一日一回から数回経口投与されるかまたは、成人一
人当り、一回につき、１０mｇから１００ｍｇの範囲
で、一日一回から数回非経口投与される。もちろん前記
したように、投与量は、種々の条件により変動するの
で、上記投与量より少ない量で十分な場合もあるし、ま
た範囲を越えて必要な場合もある。

【００３２】本発明化合物を投与する際には、経口投与
のための固体組成物、液体組成物およびその他の組成
物、非経口投与のための注射剤、外用剤、坐剤等として
用いられる。経口投与のための固体組成物には、錠剤、
丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤等が含まれる。カプセ
ルには、ソフトカプセルおよびハードカプセルが含まれ
る。

【００３３】このような固体組成物においては、一つま
たはそれ以上の活性物質が、少なくとも一つの不活性な
希釈剤（例えば、ラクトース、マンニトール、グルコー
ス、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶セルロー
ス、デンプン、ポリビニルピロリドン、メタケイ酸アル
ミン酸マグネシウム等）と混合される。組成物は、常法
に従って、不活性な希釈剤以外の添加物、例えば、潤滑
剤（ステアリン酸マグネシウム等）、崩壊剤（繊維素グ
リコール酸カルシウム等）、安定化剤（ヒト血清アルブ
ミン、ラクトース等）、溶解補助剤（アルギニン、アス
パラギン酸等）を含有していてもよい。

【００３４】錠剤または丸剤は、必要により白糖、ゼラ
チン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロ
ピルメチルセルロースフタレート等の胃溶性あるいは腸
溶性のフィルムで皮膜してもよいし、また２以上の層で
皮膜してもよい。さらにゼラチンのような吸収されうる
物質のカプセルも包含される。経口投与のための液体組
成物は、薬学的に許容される乳濁剤、溶液剤、懸濁剤、
シロップ剤、エリキシル剤等を含み、一般に用いられる
不活性な希釈剤（例えば、精製水、エタノール等）を含
んでいてもよい。この様な組成物は、不活性な希釈剤以
外に湿潤剤、懸濁剤のような補助剤、甘味剤、風味剤、
芳香剤、防腐剤を含有していてもよい。

【００３５】経口投与のためのその他の組成物として
は、ひとつまたはそれ以上の活性物質を含み、それ自体
公知の方法により処方されるスプレー剤が含まれる。こ
の組成物は不活性な希釈剤以外に亜硫酸水素ナトリウム
のような安定剤と等張性を与えるような安定化剤、塩化
ナトリウム、クエン酸ナトリウムあるいはクエン酸のよ
うな等張剤を含有していてもよい。スプレー剤の製造方
法は、例えば米国特許第2,868,691 号および同第3,095,
355 号明細書に詳しく記載されている。

【００３６】本発明による非経口投与のための注射剤と
しては、無菌の水性または非水性の溶液剤、懸濁剤、乳
濁剤を包含する。水性または非水性の溶液剤、懸濁剤と
しては、一つまたはそれ以上の活性物質が、少なくとも
一つの不活性な希釈剤と混合される。水性の希釈剤とし
ては、例えば注射用蒸留水および生理食塩水が挙げられ
る。非水性の希釈剤としては、例えばプロピレングリコ
ール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植
物油、エタノールのようなアルコール類、ポリソルベー
ト８０（登録商標）等が挙げられる。

【００３７】このような組成物は、さらに防腐剤、湿潤
剤、乳化剤、分散剤、安定化剤（例えば、ヒト血清アル
ブミン、ラクトース等）、溶解補助剤（例えば、アルギ
ニン、アスパラギン酸等）のような補助剤を含んでいて
もよい。これらはバクテリア保留フィルターを通すろ
過、殺菌剤の配合または照射によって無菌化される。こ
れらはまた無菌の固体組成物を製造し（例えば、凍結乾
燥法等により）、使用前に無菌の注射用蒸留水または他
の溶媒に溶解して使用することもできる。非経口投与の
ためのその他の組成物としては、ひとつまたはそれ以上
の活性物質を含み、常法により処方される外用液剤、軟
コウ、塗布剤、直腸内投与のための坐剤およびペッサリ
ー等が含まれる。

【００３８】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。

【００３９】実施例１：ｃＤＮＡライブラリー作製用ベ
クターの構築 プラスミドベクター ｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）［３１９
９ｂｐ、プロメガ社(Promega Corp.) より販売］をＨｉ
ｎｄ IIIで切断後、Klenow処理して再円環化した。この
プラスミドで大腸菌を形質転換してプラスミドを回収し
た。次に、回収されたプラスミドのＡａｔ II −Ｎｄｅ
Ｉ断片を切り取り、直鎖プラスミドの末端をＴ４ポリメ
ラーゼを用いて平滑末端とした。この末端にＨｉｎｄ I
IIリンカーをライゲーションし、Ｈｉｎｄ III切断後、
再び円環化し、大腸菌に形質転換してプラスミドを回収
した。得られたプラスミドのポリリンカー中のＳａｃＩ
からＰｓｔＩの部分を下記の合成ポリリンカー、

【００４０】

【化２】

【００４１】と入れ換えた。このようにして構築したプ
ラスミドベクター（図１に示す。）をｐＶｆＣＳ−１と
命名した。ｐＶｆＣＳ−１は、多目的プラスミドベクタ
ーとして以下のような特徴を有する。 １．岡山−Berg 法および Gubler-Hoffman 法が適用で
きる。 ２．培養菌当りのプラスミド収量が多い。 ３．一本鎖ＤＮＡも調製することができる。 ４．ｃＤＮＡインサートの切り出しが容易である。 ５．シークエンスのためのデレーション・ミュータント
(Deletion mutant) の作製が容易である。 ６．インビトロでの転写が可能である。

【００４２】実施例２：ｍＲＮＡの分離精製 ヒトグリア芽細胞腫細胞株Ｔ９８Ｇ（ＡＴＣＣ株番号、
ＣＲＬ−１６９０）３×１０⁷ 個を１００ユニット／ｍ
ｌのヒトＩＬ−１βで４時間刺激した後、Okayama, H.
等の方法［Methods in Enzymology, 154, 3 (1987) に
記載］に従って、ｍＲＮＡを分離した。すなわち、5.5
Ｍ ＧＴＣ溶液（5.5 Ｍグアニジンチオシアネート、２
５ｍＭクエン酸ナトリウム、0.5 ％ソジウムラウリルサ
ルコシン(sodium lauryl sarcosine) で細胞を可溶化し
た後、セルライゼート(cell lysate) を密度1.51のセシ
ウムトリフルオロアセテート（ＣｓＴＦＡ）溶液のクッ
ション上に載せて超遠心（120,000 ×ｇ、２０時間）し
て、沈殿中に1.26ｍｇの全ＲＮＡを回収した。これを、
オリゴｄＴセルロースカラムに２回通して４６μｇのｐ
ｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを精製回収した。

【００４３】実施例３：ｃＤＮＡライブラリーの作製 ｃＤＮＡライブラリーは Gubler ＆ Hoffman法［Gene,
25, 263 (1983)に記載］の変法にて作製した。実施例２
で作製したｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡ（５μｇ）から、Ｎ
ｏｔＩサイトを持つオリゴｄＴプライマーを用いて、逆
転写酵素により、ファーストストランドを合成した。続
いて、セカンドストランドを合成し、ＳａｌＩアダプタ
ーのライゲーションおよびＮｏｔＩ消化を行なった後、
ゲルろ過カラムクロマトグラフィー［Sephacryl S-500H
R (Pharmacia社より販売) カラムを用いた。］ によ
り、アダプターとプライマーを除いて、８２０ｎｇのｃ
ＤＮＡフラクションを回収した。以上のｃＤＮＡ合成ス
テップは、スーパースクリプトシステム（Super Script
System 、ＢＲＬ社より販売）のキットを用いて行なっ
た。

【００４４】一方、ベクターの調製は、実施例１で作製
したｐＶｆＣＳ−１をＮｏｔＩにより完全消化後さらに
ＳａｌＩで消化し、0.8 ％アガロース電気泳動にてバン
ドを切り出し、ガラス・パウダー法のためのキット［GE
NECLEAN II（ＢＩＯ１０１社より販売）］を用いて精製
することにより行なった。それぞれ作製したｃＤＮＡと
ベクターをライゲーションした後、Inoue, H. 等の方法
［Gene, 96, 23 (1990) に記載］で調製したＤＨ５のコ
ンピテントセルに形質転換した。その結果、平均長 1.5
ｋｂ、インディペンデントクローン数６×１０⁵ 個のｃ
ＤＮＡライブラリーが得られた。

【００４５】実施例４：クローニングとシークエンシン
グ 実施例３で作製したｃＤＮＡライブラリーより、直径１
０ｃｍのＬＢプレートに約３００個のコロニー／プレー
トの密度でクローンを播き、コロニー群からランダムに
ピックアップしてクローニングを行なった。１コロニー
から３ｍｌのＬＢ培養液で一晩培養後、培養液２００μ
ｌに７％ジメチルスルホキオシド（ＤＭＳＯ）を加え
て、−８０℃で保存した。残りの培養液から菌を分離
し、常法によりプラスミドを分離精製した。プラスミド
は図２で示される構造となっているので、Ｔ７をプライ
マーとしてシークエンスすると、クローニングされたｃ
ＤＮＡの５′側からヌクレオチド配列を読むことができ
る。ＤＮＡのシークエンシングは、Sanger, F. 等のジ
デオキシ・ターミネーター法に基づいた、ＡＢＩ社(App
lied Biosystems Inc.) の蛍光ダイ−ターミネーターを
用いるサイクルシークエンス法により行なった。また、
シークエンスの読み取りには、ＡＢＩ社のＤＮＡシーク
エンサー(Model３７３Ａ) を用いた。こうして、各クロ
ーンの５′側から平均３００ベースの長さのヌクレオチ
ド配列が得られた。

【００４６】実施例５：パーシャルシークエンスデータ
の解析 実施例４で得られたヌクレオチドシークエンスは、Lipm
an, D. J. およびPearson, W. R. のＦＡＳＴＡプログ
ラムを用いて、既知データベース（GenBank およびＥＭ
ＢＬ）に含まれるすべてのヌクレオチド配列に対するホ
モロジーサーチを行なった。これにより、シークエンス
したクローン群の中から未知シークエンスを持つクロー
ンを同定した。同定されたクローンのヌクレオチド配列
を可能な３つのフレームでアミノ酸配列に変換した。し
かし、クローニングされたｃＤＮＡクローンのすべて
が、ｍＲＮＡの全長をカバーしているとは限らない。全
長でなければ、Ｎ末端のアミノ酸配列部分を含んでいる
可能性は少ない。そこで、得られたＴＧ１３４７のクロ
ーンが全長か否かを決めるために、ノーザン（Norther
n）解析を行なった。すなわち、グリア芽細胞腫細胞株
より抽出精製したｐｏｌｙ（Ａ）⁺ ＲＮＡを電気泳動
後、ナイロンメンブレン上にブロッティングした。ＴＧ
１３４７のｃＤＮＡインサートをプローブとしてハイブ
リダイズさせると、約１０００ｂｐの位置に１本のバン
ドが観察された。ＴＧ１３４７クローンのインサートの
大きさは約１０００ｂｐであったので、ＴＧ１３４７は
ほぼ全長のｃＤＮＡであることが確かめられた。

【００４７】実施例６：ｃＤＮＡ全長のシークエンスと
オープンリーディングフレームの決定 ｃＤＮＡの全長のシークエンスは、Molecular Cloning
［Sambrook, J., Fritsch, E. F. および Maniatis,
T. 著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989
年に発刊］に記載の方法に従って、ランダムシークエン
シングを行なって決定した。

【００４８】すなわち、ＴＧ１３４７クローンよりプラ
スミドを回収し、ｃＤＮＡインサートを分離精製した。
これをライゲーションおよびフラグメンテーションし、
Ｔ４ポリメラーゼによりＤＮＡ断片の末端を平滑化し、
４００ｂｐ付近の長さのＤＮＡ断片をアガロース電気泳
動法を用いて回収した。得られたＤＮＡ断片をプラスミ
ドベクター、 BLUESCRIPT II（Stratagene社より販売）
のＳｍａＩサイトにクローニングした後、大腸菌(E.Col
i)に形質転換した。２０個のコロニーをランダムにピッ
クアップし、プラスミドＤＮＡを調製後、これら２０個
のプラスミド（これらはすべてＴＧ１３４７のｃＤＮＡ
の断片をインサートとして持っている。）のＤＮＡシー
クエンシングを行なった。ＤＮＡのシークエンシングと
シークエンスの読み取りは実施例４に記載した方法によ
り行なった。ＴＧ１３４７ｃＤＮＡ断片のシークエンス
データは、ＤＮＡＳＩＳのＤＮＡシークエンス連結プロ
グラムを用いて、連続したシークエンスに編集し、配列
番号３に示す塩基配列を得た。このｃＤＮＡ全長シーク
エンスデータからオープンリーディングフレームを決定
し、さらにアミノ酸配列に翻訳して配列番号１に示す配
列を得た。配列表４にＴＧ１３４７ｃＤＮＡの全塩基配
列とこれにコードされるＴＧ１３４７蛋白質のアミノ酸
一次配列を示した。

【００４９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：１８７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：蛋白質 配列 Met Pro Val Asp Leu Arg Lys Trp Ser Gly Pro Leu Ser Leu Gln Glu 1 5 10 15 Val Asp Glu Gln Pro Gln His Pro Leu His Val Thr Tyr Ala Gly Ala 20 25 30 Ala Val Asp Glu Leu Gly Lys Val Leu Thr Pro Thr Gln Val Lys Asn 35 40 45 Arg Pro Thr Ser Ile Ser Trp Asp Gly Leu Asp Ser Gly Lys Leu Tyr 50 55 60 Thr Leu Val Leu Thr Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Lys Asp Pro Lys 65 70 75 80 Tyr Arg Glu Trp His His Phe Leu Val Val Asn Met Lys Gly Asn Asp 85 90 95 Ile Ser Ser Gly Thr Val Leu Ser Asp Tyr Val Gly Ser Gly Pro Pro 100 105 110 Lys Gly Thr Gly Leu His Arg Tyr Val Trp Leu Val Tyr Glu Gln Asp 115 120 125 Arg Pro Leu Lys Cys Asp Glu Pro Ile Leu Ser Asn Arg Ser Gly Asp 130 135 140 His Arg Gly Lys Phe Lys Val Ala Ser Phe Arg Lys Lys Tyr Glu Leu 145 150 155 160 Arg Ala Pro Val Ala Gly Thr Cys Tyr Gln Ala Glu Trp Asp Asp Tyr 165 170 175 Val Pro Lys Leu Tyr Glu Gln Leu Ser Gly Lys 180 185

【００５０】配列番号：２ 配列の長さ：５６４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGCCGGTGG ACCTCAGAAA GTGGTCCGGG CCCTTGAGCC TGCAAGAAGT GGACGAGCAG 60 CCGCAGCACC CGCTGCATGT CACCTACGCC GGGGCGGCGG TGGACGAGCT GGGCAAAGTG 120 CTGACGCCCA CCCAGGTTAA GAATAGACCC ACCAGCATTT CGTGGGATGG TCTTGATTCA 180 GGGAAGCTCT ACACCTTGGT CCTGACAGAC CCGGATGCTC CCAGCAGGAA GGATCCCAAA 240 TACAGAGAAT GGCATCATTT CCTGGTGGTC AACATGAAGG GCAATGACAT CAGCAGTGGC 300 ACAGTCCTCT CCGATTATGT GGGCTCGGGG CCTCCCAAGG GCACAGGCCT CCACCGCTAT 360 GTCTGGCTGG TTTACGAGCA GGACAGGCCG CTAAAGTGTG ACGAGCCCAT CCTCAGCAAC 420 CGATCTGGAG ACCACCGTGG CAAATTCAAG GTGGCGTCCT TCCGTAAAAA GTATGAGCTC 480 AGGGCCCCGG TGGCTGGCAC GTGTTACCAG GCCGAGTGGG ATGACTATGT GCCCAAACTG 540 TACGAGCAGC TGTCTGGGAA GTAG 564

【００５１】配列番号：３ 配列の長さ：1001 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 配列 CGCGCCTGGC CTACCGCGGG ACTCCCGGCT GCACGCTCTG CTTGGGCTCG CCATGCCGGT 60 GGACCTCAGA AAGTGGTCCG GGCCCTTGAG CCTGCAAGAA GTGGACGAGC AGCCGCAGCA 120 CCCGCTGCAT GTCACCTACG CCGGGGCGGC GGTGGACGAG CTGGGCAAAG TGCTGACGCC 180 CACCCAGGTT AAGAATAGAC CCACCAGCAT TTCGTGGGAT GGTCTTGATT CAGGGAAGCT 240 CTACACCTTG GTCCTGACAG ACCCGGATGC TCCCAGCAGG AAGGATCCCA AATACAGAGA 300 ATGGCATCAT TTCCTGGTGG TCAACATGAA GGGCAATGAC ATCAGCAGTG GCACAGTCCT 360 CTCCGATTAT GTGGGCTCGG GGCCTCCCAA GGGCACAGGC CTCCACCGCT ATGTCTGGCT 420 GGTTTACGAG CAGGACAGGC CGCTAAAGTG TGACGAGCCC ATCCTCAGCA ACCGATCTGG 480 AGACCACCGT GGCAAATTCA AGGTGGCGTC CTTCCGTAAA AAGTATGAGC TCAGGGCCCC 540 GGTGGCTGGC ACGTGTTACC AGGCCGAGTG GGATGACTAT GTGCCCAAAC TGTACGAGCA 600 GCTGTCTGGG AAGTAGGGGG TTAGCTTGGG GACCTGAACT GTCCTGGAGG CCCCAAGCCA 660 TGTTCCCCAG TTCAGTGTTG CATGTATAAT AGATTTCTCC TCTTCCTGCC CCCCTTGGCA 720 TGGGTGAGAC CTGACCAGTC AGATGGTAGT TGAGGGTGAC TTTTCCTGCT GCCTGGCCTT 780 TATAATTTTA CTCACTCACT CTGATTTATG TTTTGATCAA ATTTGAACTT CATTTTGGGG 840 GGTATTTTGG TACTGTGATG GGGTCATCAA ATTATTAATC TGAAAATAGC AACCCAGAAT 900 GTAAAAAAGA AAAAACTGGG GGGAAAAAGA CCAGGTCTAC AGTGATAGAG CAAAGCATCA 960 AAGAATCTTT AAGGGAGGTT TAAAAAAAAA AAAAAAAAAA A 1001

【００５２】配列番号：４ 配列の長さ： 1001 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： cDNA to mRNA 起源 生物名：Homo sapiens セルライン：T98G 配列の特徴 特徴を表わす記号：CDS 存在位置：53..616 特徴を決定した方法：Ｐ 配列 CGCGCCTGGCCTACCGCGGGACTCCCGGCTGCACGCTCTGCTTGGGCTCGCC 52 ATG CCG GTG GAC CTC AGA AAG TGG TCC GGG CCC TTG AGC CTG CAA GAA 100 Met Pro Val Asp Leu Arg Lys Trp Ser Gly Pro Leu Ser Leu Gln Glu 1 5 10 15 GTG GAC GAG CAG CCG CAG CAC CCG CTG CAT GTC ACC TAC GCC GGG GCG 148 Val Asp Glu Gln Pro Gln His Pro Leu His Val Thr Tyr Ala Gly Ala 20 25 30 GCG GTG GAC GAG CTG GGC AAA GTG CTG ACG CCC ACC CAG GTT AAG AAT 196 Ala Val Asp Glu Leu Gly Lys Val Leu Thr Pro Thr Gln Val Lys Asn 35 40 45 AGA CCC ACC AGC ATT TCG TGG GAT GGT CTT GAT TCA GGG AAG CTC TAC 244 Arg Pro Thr Ser Ile Ser Trp Asp Gly Leu Asp Ser Gly Lys Leu Tyr 50 55 60 ACC TTG GTC CTG ACA GAC CCG GAT GCT CCC AGC AGG AAG GAT CCC AAA 292 Thr Leu Val Leu Thr Asp Pro Asp Ala Pro Ser Arg Lys Asp Pro Lys 65 70 75 80 TAC AGA GAA TGG CAT CAT TTC CTG GTG GTC AAC ATG AAG GGC AAT GAC 340 Tyr Arg Glu Trp His His Phe Leu Val Val Asn Met Lys Gly Asn Asp 85 90 95 ATC AGC AGT GGC ACA GTC CTC TCC GAT TAT GTG GGC TCG GGG CCT CCC 388 Ile Ser Ser Gly Thr Val Leu Ser Asp Tyr Val Gly Ser Gly Pro Pro 100 105 110 AAG GGC ACA GGC CTC CAC CGC TAT GTC TGG CTG GTT TAC GAG CAG GAC 436 Lys Gly Thr Gly Leu His Arg Tyr Val Trp Leu Val Tyr Glu Gln Asp 115 120 125 AGG CCG CTA AAG TGT GAC GAG CCC ATC CTC AGC AAC CGA TCT GGA GAC 484 Arg Pro Leu Lys Cys Asp Glu Pro Ile Leu Ser Asn Arg Ser Gly Asp 130 135 140 CAC CGT GGC AAA TTC AAG GTG GCG TCC TTC CGT AAA AAG TAT GAG CTC 532 His Arg Gly Lys Phe Lys Val Ala Ser Phe Arg Lys Lys Tyr Glu Leu 145 150 155 160 AGG GCC CCG GTG GCT GGC ACG TGT TAC CAG GCC GAG TGG GAT GAC TAT 580 Arg Ala Pro Val Ala Gly Thr Cys Tyr Gln Ala Glu Trp Asp Asp Tyr 165 170 175 GTG CCC AAA CTG TAC GAG CAG CTG TCT GGG AAG TAG GGGGTTAGCTTGGGG 631 Val Pro Lys Leu Tyr Glu Gln Leu Ser Gly Lys 180 185 ACCTGAACTGTCCTGGAGGCCCCAAGCCATGTTCCCCAGTTCAGTGTTGCATGTATAATAGAT 694 TTCTCCTCTTCCTGCCCCCCTTGGCATGGGTGAGACCTGACCAGTCAGATGGTAGTTGAGGGT 757 GACTTTTCCTGCTGCCTGGCCTTTATAATTTTACTCACTCACTCTGATTTATGTTTTGATCAA 820 ATTTGAACTTCATTTTGGGGGGTATTTTGGTACTGTGATGGGGTCATCAAATTATTAATCTGA 883 AAATAGCAACCCAGAATGTAAAAAAGAAAAAACTGGGGGGAAAAAGACCAGGTCTACAGTGAT 946 AGAGCAAAGCATCAAAGAATCTTTAAGGGAGGTTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 1001

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドベクターｐＶｆＣＳ−１の構築図
である。

【図２】 ヒトグリア芽細胞腫細胞株Ｔ９８Ｇ由来のｃ
ＤＮＡが挿入された組み換えＤＮＡの構築図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｔ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 9282−4Ｂ 21/08 9161−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/12 Ｃ１２Ｒ 1:91） (54)【発明の名称】 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡからな るベクター、そのベクターで形質転換された宿主細胞、そのポリペプチドの抗体、およびそのポ リペプチドまたは抗体を含有する薬学的組成物

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 実質的に純粋な形である配列番号１で示
   されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのホモロ
   ーグ、そのフラグメントまたはそのフラグメントのホモ
   ローグ。
2. 【請求項２】 配列番号１で示されるアミノ酸配列から
   なる請求項１記載のポリペプチド。
3. 【請求項３】 請求項１に記載されたポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡ。
4. 【請求項４】 配列番号２で示される塩基配列を有する
   請求項３記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
   ブリダイズするフラグメント。
5. 【請求項５】 配列番号３で示される塩基配列を有する
   請求項３記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
   ブリダイズするフラグメント。
6. 【請求項６】 請求項３から５のいずれかの項に記載の
   ＤＮＡからなる複製または発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載の複製または発現ベクター
   で形質転換された宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項１または２に記載されたポリペプ
   チドを発現させるための条件下で請求項７記載の宿主細
   胞を培養することからなる該ポリペプチドの製造方法。
9. 【請求項９】 請求項１または２に記載されたポリペプ
   チドのモノクローナルまたはポリクローナル抗体。
10. 【請求項１０】 請求項１または２に記載されたポリペ
    プチドまたは請求項９記載の抗体および薬学的に許容さ
    れる賦形剤および／または担体を含有することを特徴と
    する薬学的組成物。