JPH0656895A

JPH0656895A - 新規なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコードするｄｎａ、そのｄｎａからなるベクター、およびそのベクターで形質転換された宿主細胞

Info

Publication number: JPH0656895A
Application number: JP5067656A
Authority: JP
Inventors: Takayuki Naito; 隆之内藤; Mikio Konishi; 幹夫小西; Tsumoru Miyamoto; 積宮本
Original assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Ono Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1992-03-03
Filing date: 1993-03-03
Publication date: 1994-03-01
Also published as: DE69303840D1; GR3021294T3; DK0559428T3; EP0559428A2; DE69303840T2; EP0559428B1; TW288019B; CA2090639A1; EP0559428A3; ES2092758T3; ATE140967T1

Abstract

(57)【要約】【構成】ヒトグリア芽細胞腫細胞株が産生する、１５
６アミノ酸（シグナルペプチドも含めて）からなる新規
なポリペプチド、その製造方法、そのポリペプチドをコ
ードするＤＮＡ、そのＤＮＡ配列に選択的にハイブリダ
イズするフラグメント、そのＤＮＡからなる複製または
発現ベクター、およびそのベクターで形質転換された宿
主細胞。【効果】本発明のポリペプチドは、グリアやニューロ
ンの発育不全または異常増殖、免疫機能の低下または亢
進、あるいは腫瘍等の予防あるいは治療剤として用いる
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ある種のグリア芽細胞
腫細胞株が産生する新規なポリペプチド、その製造方
法、そのポリペプチドをコードするＤＮＡ、そのＤＮＡ
配列に選択的にハイブリダイズするフラグメント、その
ＤＮＡからなる複製または発現ベクター、およびそのベ
クターで形質転換された宿主細胞に関する。

【０００２】

【発明の背景】脳を構成する細胞には、大別して神経細
胞とグリア細胞が存在する。神経細胞は、脳内情報の伝
達、処理の主役である。一方、グリア細胞は神経細胞の
働きを支持する。具体的には神経細胞の保護および支持
作用、ミエリン鞘の形成、血液脳関門の形成、神経細胞
への栄養補給、神経伝達物質の代謝、さらには脳発育過
程における神経細胞の増殖および分化作用の制御等が考
えられている。グリア細胞には多種多様な細胞が含まれ
る。中枢神経系ではアストロサイト、オリゴデンドロサ
イト、ミクログリアなどがあり、末梢神経系にはシュワ
ン(Schwann) 細胞、マントル(mantle)細胞などがあり、
また脳室内皮に存在するエペンダイマル(ependymal) 細
胞もグリア細胞のひとつである。

【０００３】

【従来の技術】近年、神経細胞やグリア細胞の分化、増
殖および成長に係わる多くの液性因子が見出されている
が、そのうち、大部分はグリア細胞または癌化したグリ
ア細胞（以下、まとめてグリア細胞等という。）から産
生されるものである。例えば、神経細胞に作用する因子
として知られている神経成長因子（ＮＧＦ、分子量約1
3.5ｋｄ（ヒト））、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、
分子量約13.5ｋｄ（ヒト））、神経芽細胞腫増殖抑制因
子（ＮＧＩＦ、分子量約５ｋｄ（ヒト））およびグリア
由来神経発育因子（分子量約５００ｋｄのものと約１１
０ｋｄのものがある（いずれもラット））、およびグリ
ア細胞に作用するグリア細胞由来グリア細胞増殖抑制因
子（ＧｄＧＧＩＦ、分子量約１００ｋｄ以上（ラッ
ト））および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ、分子量約
３２ｋｄ（ヒト））、さらに、神経突起伸展促進作用と
グリア細胞の増殖促進作用を併せ持つグリア由来神経突
起伸展因子（ＧｄＮＴＦ、分子量約４３ｋｄ（ラッ
ト））、神経突起伸展促進作用とグリア芽細胞の増殖と
分化を促進するグリア細胞成長因子（ＧＭＦ、分子量約
16.5ｋｄ（ウシ））、神経節細胞の生存維持作用、交感
神経節細胞の増殖抑制および分化促進作用、およびアス
トロサイトの分化促進作用を有する毛様体神経発育因子
（ＣＮＴＦ、分子量約２３ｋｄ（ウサギおよびラッ
ト））および神経細胞とアストロサイトに対して増殖促
進活性を有する線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ、分子量約
１６〜１７ｋｄ（ヒト））は、いずれもアストロサイト
から産生される。さらに神経細胞に作用するシュワン細
胞由来神経発育因子（ＳｃｈＮＴＦ、分子量８ｋｄ以上
（ラット））はシュワン細胞から産生される［詳細につ
いては、蛋白質核酸酵素，36（No.7），260 （1991）参
照のこと］。また、これまでは、免疫系の細胞が主に分
泌すると考えられていたインターロイキン類（ＩＬ−
１、ＩＬ−６等）がグリア細胞からも分泌されているこ
とが知られるようになった。これらの因子は、既に大部
分アミノ酸配列の解明がなされており、現在では単に研
究対象としてだけでなく、医薬への応用に向けた開発研
究がなされている。

【０００４】

【発明の目的】前記したように、グリア細胞等からは、
神経細胞やグリア細胞の分化、増殖および成長に関連し
た多くの液性因子および免疫に関連した液性因子が産生
されていることがわかる。これらの事実は、上記以外に
も同様の作用を有するいくつかの因子がグリア細胞等か
ら分泌されている可能性を示唆している。本発明者ら
は、この点に注目しグリア細胞等が産生している新規な
因子（ポリペプチド）を見出すべく鋭意検討を行なっ
た。

【０００５】従来、ある特定のポリペプチドまたはそれ
をコードするＤＮＡを得ようとする場合、組織や細胞培
養液中に目的とする生物活性を確認し、次いでポリペプ
チドの単離精製を経て、遺伝子をクローニングするとい
う方法、あるいはその生物活性を指標として遺伝子を発
現クローニングする方法が一般的に用いられていた。し
かし、生体内生理活性ポリペプチドは多様な生物活性を
有している場合が多いので、あるひとつの活性を指標に
して遺伝子をクローニングした結果、それが既知のポリ
ペプチドと同一であることが後になって判明するという
事例が増えている。また、グリア細胞が産生する因子は
いずれもごく微量であり、そのことが単離、精製および
生物活性の確認を困難なものとしている。

【０００６】一方、ｃＤＮＡの作製技術やシークエンス
技術は急速に発展し、大量のｃＤＮＡのシークエンスを
迅速に行なうことができるようになった。また、遺伝子
からその遺伝子の機能を同定するリバースジェネティク
ス (Reverse Genetics) の諸方法の発展も著しい。そこ
で、本発明者らは、これらの方法を用いて新規なポリペ
プチドを見出すことにした。すなわち、グリア細胞等か
らｍＲＮＡを単離し、これを出発材料としてｃＤＮＡを
得、その塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定した。
続いて、得られたＤＮＡを動物細胞に形質導入し、新規
なポリペプチドを組み換え蛋白質として発現、単離する
ことに成功した。また、この蛋白質のアミノ酸シークエ
ンスを行ない、推定されたアミノ酸配列と一致すること
を確認するとともに、成熟蛋白のＮ末端を同定した。こ
うして、本発明者らは、まったく新規な分泌性ポリペプ
チドおよびそれをコードするＤＮＡを見出すことに成功
し、本発明を完成した。

【０００７】スイスプロット（Swiss Prot Release 20
）に登録されている既知のポリペプチドのアミノ酸配
列を調査したが、本発明のポリペプチドのそれと同一あ
るいは相同性の高い配列を有しているものはまったく無
かった。さらに、ジーンバンク（GenBank Release 70.
0）に登録されているヌクレオチド配列も調査したが、
本発明のポリペプチドをコードするｃＤＮＡと同一ある
いは相同性の高い配列は見つからなかった。従って、本
発明のポリペプチドはまったく新規なものであることが
確認された。

【０００８】

【発明の構成】本発明は、実質的に純粋な形である配列
番号１または３で示されるアミノ酸配列からなるポリペ
プチド、そのホモローグ、その配列のフラグメント、お
よびそのホモローグに関する。本発明はさらにそれらの
ポリペプチドをコードするＤＮＡに関する。より具体的
には、配列番号２、４または５で示される塩基配列を有
するＤＮＡ、および配列番号２、４または５で示される
塩基配列に選択的にハイブリダイズするフラグメントを
有するＤＮＡに関する。

【０００９】特に本発明は、（１）配列番号１で示され
るアミノ酸配列からなるポリペプチド、（２）前記
（１）に記載したポリペプチドをコードするＤＮＡ、
（３）配列番号２で示される塩基配列を有するＤＮＡ、
（４）配列番号３で示されるアミノ酸配列からなるポリ
ペプチド、（５）前記（４）に記載したポリペプチドを
コードするＤＮＡ、（６）配列番号４で示される塩基配
列を有するＤＮＡ、および（７）配列番号５で示される
塩基配列を有するＤＮＡに関する。

【００１０】実質的に純粋な形である配列番号１または
３で示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、
一般に、生産時のポリペプチドの９０％以上、例えば９
５、９８または９９％が配列番号１または３で示される
アミノ酸配列を有するポリペプチドであることを意味す
る。配列番号１または３で示されるアミノ酸配列からな
るポリペプチドのホモローグとは、一般に少なくとも２
０個、好ましくは少なくとも３０個、例えば４０、６０
または１００個の連続したアミノ酸領域で、少なくとも
７０％、好ましくは少なくとも８０または９０％、より
好ましくは９５％以上相同性のあるものであり、そのよ
うなホモローグは、以後本発明のポリペプチドとして記
載される。

【００１１】さらに、配列番号１または３で示されるア
ミノ酸配列からなるポリペプチドのフラグメント、また
はそれらのホモローグのフラグメントとは、少なくとも
１０アミノ酸、好ましくは少なくとも１５アミノ酸、例
えば２０、２５、３０、４０、５０または６０アミノ酸
部分を意味する。特に好ましいフラグメントとしては、
配列番号１またはそのホモローグを含む配列番号３のフ
ラグメントである。配列番号２、４または５で示される
塩基配列を有するＤＮＡに選択的にハイブリダイズする
ＤＮＡとは、一般に、少なくとも２０個、好ましくは少
なくとも３０個、例えば４０、６０または１００個の連
続した塩基配列領域で、少なくとも７０％、好ましくは
少なくとも８０または９０％、より好ましくは９５％以
上の相同性のあるものであり、そのようなＤＮＡは、以
後本発明のＤＮＡとして記載される。

【００１２】配列番号２、４または５で示される塩基配
列を有するＤＮＡのフラグメントとは、少なくとも１０
塩基、好ましくは少なくとも１５塩基、例えば２０、２
５、３０または４０塩基部分を意味し、そのようなフラ
グメントも本発明のＤＮＡに含まれる。本発明のＤＮＡ
は、遺伝子組み換え法、合成法あるいは当業者に公知の
方法によって取得することができる。

【００１３】さらに、本発明には、本発明のＤＮＡから
なる複製または発現ベクターが含まれる。ベクターとし
ては、例えば、ｏｒｉ領域と、必要により上記ＤＮＡの
発現のためのプロモーター、プロモーターの制御因子な
どからなるプラスミド、ウィルスまたはファージベクタ
ーが挙げられる。ベクターはひとつまたはそれ以上の選
択的マーカー遺伝子、例えばアンピシリン耐性遺伝子を
含んでいてもよい。さらに、本発明には、配列番号２、
４または５で示される塩基配列、またはそれらのオープ
ンリーディングフレームを有するＤＮＡを含む本発明の
ＤＮＡを複製または発現させるためのベクターで形質転
換された宿主細胞も含まれる。細胞としては、例えば細
菌、酵母、昆虫細胞または哺乳動物細胞が挙げられる。
さらに、本発明には、本発明のポリペプチドを発現させ
るための条件下で、本発明の宿主細胞を培養することか
らなる本発明のポリペプチドの製造方法も含まれる。

【００１４】ほとんどのサイトカインや成長因子類、ま
た多くの膜蛋白質は、Ｎ末端にシグナルペプチドを有す
ることが知られている。シグナルペプチドは、翻訳開始
Ｍｅｔのすぐ後ろの疎水性に富んだ領域である。本ポリ
ペプチドの場合、配列番号３で示されるアミノ酸配列
中、１番目のメチオニン（Ｍｅｔ）から２３番目のセリ
ン（Ｓｅｒ）までであることが確認された（実施例１
１）。生物活性を発現する本質は配列番号３で示される
アミノ酸配列中、シグナルペプチドを除いた部分（成熟
蛋白部分、すなわち配列番号１に相当する。）にあり、
シグナルペプチドは活性に関与しない。

【００１５】本発明のポリペプチドとしては、配列番号
１および３で示されたアミノ酸配列を有するもの以外
に、その一部が欠損したもの（例えば、成熟蛋白中、生
物活性の発現に必須な部分だけから成るポリペプチ
ド）、その一部が他のアミノ酸と置換したもの（例え
ば、物性の類似したアミノ酸に置換したもの）、および
その一部に他のアミノ酸が付加または挿入されたものも
含まれる。よく知られているように、ひとつのアミノ酸
をコードするコドンは１〜６種類（例えば、Ｍｅｔは１
種類、ロイシン（Ｌｅｕ）は６種類）知られている。従
って、ポリペプチドのアミノ酸配列を変えることなくＤ
ＮＡの塩基配列を変えることができる。（２）および
（５）で特定される本発明のＤＮＡには、それぞれ配列
番号１および３で示されるポリペプチドをコードするす
べての塩基配列群が含まれる。塩基配列を変えることに
よって、ポリペプチドの生産性が向上することがある。
（３）および（６）で特定されるＤＮＡは、それぞれ
（２）および（５）で示されるＤＮＡの一態様であり、
天然型配列を表わす。（７）に示されるＤＮＡは、
（６）で特定されるＤＮＡに天然の非翻訳部分を加えた
配列を示す。

【００１６】配列番号５で示される塩基配列を有するＤ
ＮＡの作製は、以下の方法に従って行なわれる。すなわ
ち、(i) 本発明のポリペプチドを産生する細胞、例え
ば、ヒトグリア芽細胞腫細胞株からｍＲＮＡを分離し、
(ii) 該ｍＲＮＡからファーストストランド（１本鎖Ｄ
ＮＡ）、次いでセカンドストランド（２本鎖ＤＮＡ）を
合成し（ｃＤＮＡの作製）、(iii) 該ｃＤＮＡを適当な
プラスミドベクターに組み込み、(iv) 得られた組み換
えベクターで宿主細胞を形質転換し（ｃＤＮＡライブラ
リーの作製）、(v) 得られたｃＤＮＡライブラリーよ
り、大量のランダムクローニングおよび５′側から平均
３００ベースのシークエンシングを行ない、(vi) 塩基
配列の新規なクローンについて、その全長をシークエン
スすることによって作製することができる。

【００１７】より詳細に説明すると、工程(i) は、ヒト
グリア芽細胞腫細胞株を適当な刺激剤（例えば、ＩＬ−
１等）で刺激した後、Okayama, H. 等の方法［Method i
n Enzymology, 154, 3(1987)に記載。］に従って行なわ
れる。本ポリペプチドを産生する細胞としては、好まし
くはヒトグリア芽細胞腫細胞株Ｔ９８Ｇ（ＡＴＣＣ株番
号、ＣＲＬ−１６９０）が挙げられる。(ii)、(iii) お
よび(iv)の工程はｃＤＮＡライブラリー作製の工程であ
り、改変したGubler＆Hoffman 法［Gene, 25,263(1983)
に記載。］に準じて行なわれる。(iii) の工程で用い
られるプラスミドベクターとしては大腸菌内で機能する
もの（例えば、ｐＢＲ３２２）や枯草菌内で機能するも
の（例えば、ｐＵＢ１１０）が多数知られているが、好
適には、大腸菌内で機能するｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）
［３１９９ｂｐ、プロメガ社より販売。］より作製した
ｐＶｆＣＳ−１（後記実施例に詳しく記載されてい
る。）が用いられる。(iv)の工程で用いられる宿主細胞
は既に多くのものが知られており、いずれを用いてもよ
いが、好ましくはＤＨ５のコンピテントセル［Gene, 9
6,23(1990)記載の方法により調整される。］である。工
程(v) のクローニングは公知の方法により行なわれる。
またシークエンシングはマキサム・ギルバート（Maxam-
Gilbert ）法やジデオキシ・ターミネーター法により行
なわれる。(vi)の工程は、Molecular Cloning ［Sambro
ok, J., Fritsch, E. F.およびManiatis, T.著、Cold S
pring Harbor Laboratory Press より1989年に発刊］に
記載の方法に従って行なわれる。

【００１８】このようにして得られたＤＮＡは真に分泌
蛋白質をコードしているか否かの検討を行なう必要があ
る。それには、（Ｉ）ＤＮＡシークエンスを可能なフレ
ームにおいてアミノ酸配列に変換し、（II）変換された
アミノ酸配列よりハイドロフォビシティープロファイル
（Hydrophobicity profile）を作製し、翻訳開始コドン
（ＡＴＧ）の直後に疎水性に富んだ部分が存在すること
を確認し（分泌蛋白質はそのＮ末端に疎水性に富んだシ
グナルペプチドを有している。）、さらに(III) 該ＤＮ
Ａが全長あるいはほぼ全長であることを確認する必要が
ある。これらの確認は、工程(vi)の後に行なってもよい
が、(v) の工程と(vi)の工程の間に行なうとより効率的
である。

【００１９】上記の検討中、(II)は、Kyte, J.および D
oolittle, R.F.のハイドロテーブルを用いて、既存のソ
フトウェア、例えばＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトウエアエ
ンジニアリング製）でコンピューター解析することによ
って行なわれる。 (III)はNorthern解析により行なわれ
る。

【００２０】配列番号２、４および５で示される塩基配
列が、一旦確定されると、その後は、化学合成によっ
て、またはＰＣＲ法によって、あるいは該塩基配列の断
片をプローブとしたハイブリダイズ法によって、本発明
のＤＮＡを得ることができる。さらに、本ＤＮＡを含有
するベクターＤＮＡを適当な宿主に導入し、これを増殖
させることによって、目的とする本発明ＤＮＡを必要量
得ることができる。

【００２１】本発明のポリペプチド（配列番号１および
３）を取得する方法としては、（１）生体または培養細
胞から精製単離する方法、（２）ペプチド合成する方
法、または（３）遺伝子組み換え技術を用いて生産する
方法、などが挙げられるが、工業的には（３）に記載し
た方法が好ましい。

【００２２】遺伝子組み換え技術を用いてポリペプチド
を生産するための発現系（宿主−ベクター系）として
は、例えば、細菌、酵母、昆虫細胞および哺乳動物細胞
の発現系が挙げられる。例えば、大腸菌で発現させる場
合には、成熟蛋白部分をコードするＤＮＡ（例えば、配
列番号２で示される塩基配列をコードするＤＮＡ）の
５′末端に開始コドン（ＡＴＧ）を付加し、得られたＤ
ＮＡを、適当なプロモーター（例えば、ｔｒｐプロモー
ター、ｌａｃプロモーター、λＰ_Lプロモーター、Ｔ７
プロモーター等）の下流に接続し、大腸菌内で機能する
ベクター（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ
１９等）に挿入して発現ベクターを作製する。次に、こ
の発現ベクターで形質転換した大腸菌（例えば、E.coli
ＤＨ１、E.coliＪＭ１０９、E.coliＨＢ１０１株等）を
適当な培地で培養して、その菌体より目的とするポリペ
プチドを得ることができる。また、バクテリアのシグナ
ルペプチド（例えば、ｐｅｌＢのシグナルペプチド）を
利用すれば、ペリプラズム中に目的とするポリペプチド
を分泌することもできる。さらに、他のポリペプチドと
のヒュージョンプロテイン (fusion protein) を生産す
ることもできる。

【００２３】また、哺乳動物細胞で発現させる場合に
は、例えば、配列番号５で示される塩基配列をコードす
るＤＮＡを適当なベクター（例えば、レトロウイルスベ
クター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイ
ルスベクター、ＳＶ４０系ベクター等）中の適当なプロ
モーター（例えば、ＳＶ４０プロモーター、ＬＴＲプロ
モーター、メタロチオネインプロモーター等）の下流に
挿入して発現ベクターを作製する。次に、得られた発現
ベクターで適当な哺乳動物細胞（例えば、サルＣＯＳ−
７細胞、チャイニーズハムスターＣＨＯ細胞、マウスＬ
細胞等）を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養
することによって、その培養液中に目的とするポリペプ
チドが分泌される。以上のようにして得られたポリペプ
チドは、一般的な生化学的方法によって単離精製するこ
とができる。

【００２４】

【発明の効果】本発明のポリペプチドはヒトグリア芽細
胞腫細胞株から生産、分泌されるものであるので、グリ
アやニューロンの分化、増殖、成長に関連した生物活
性、免疫機能に関連した生物活性あるいは腫瘍の増殖、
成長に関連した生物活性を有していると予測される。従
って、本発明のポリペプチドはそれ自身で、グリアやニ
ューロンの発育不全または異常増殖、免疫機能の低下ま
たは亢進、あるいは腫瘍等の予防あるいは治療剤として
用いることができる。

【００２５】また、該ポリペプチドのポリクローナル抗
体またはモノクローナル抗体を用いて、生体における該
ポリペプチドの定量が行なえ、これによって該ポリペプ
チドと疾患との関係の研究あるいは疾患の診断等に利用
することができる。ポリクローナル抗体およびモノクロ
ーナル抗体は該ポリペプチドあるいはその断片を抗原と
して用いて常法により作製することができる。

【００２６】本発明のＤＮＡは、多大な有用性が期待さ
れる本発明のポリペプチドを生産する際の重要かつ必須
の鋳型となるだけでなく、遺伝病の診断や治療（遺伝子
欠損症の治療またはアンチセンスＤＮＡ（ＲＮＡ）によ
って、ポリペプチドの発現を停止させることによる治療
等）に利用できる。また、本発明のＤＮＡをプローブと
してジェノミック(genomic) ＤＮＡを分離できる。同様
にして、本発明ＤＮＡと相同性の高いヒトの関連ポリペ
プチドの遺伝子、またヒト以外の生物における本発明ポ
リペプチドと相同性の高いポリペプチドの遺伝子を分離
することも可能である。

【００２７】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、これらは本発明の範囲を制限するものでは
ない。実施例１：ｃＤＮＡライブラリー作製用ベクターの構築プラスミドベクターｐＧＥＭ−３Ｚｆ（＋）［３１９９
ｂｐ、プロメガ社(Promega Corp.) より販売］をＨｉｎ
ｄ III で切断後、Klenow処理して再円環化した。この
プラスミドで大腸菌を形質転換してプラスミドを回収し
た。次に、回収されたプラスミドのＡａｔ II −Ｎｄｅ
Ｉ断片を切り取り、直鎖プラスミドの末端をＴ４ポリメ
ラーゼを用いて平滑末端とした。この末端にＨｉｎｄ I
IIリンカーをライゲーションし、Ｈｉｎｄ III切断後、
再び円環化し、大腸菌に形質転換してプラスミドを回収
した。得られたプラスミドのポリリンカー中のＳａｃＩ
からＰｓｔＩの部分を下記の合成ポリリンカー、

【００２８】

【化１】

【００２９】と入れ換えた。このようにして構築したプ
ラスミドベクター（図１に示す。）をｐＶｆＣＳ−１と
命名した。ｐＶｆＣＳ−１は多目的プラスミドベクター
として以下のような特徴を有する。１．岡山−Berg法および Gubler-Hoffman 法が適用でき
る。２．培養菌当りのプラスミド収量が多い。３．一本鎖ＤＮＡも調製することができる。４．ｃＤＮＡインサートの切り出しが容易である。５．シークエンスのためのデレーションミュータント(D
eletion mutant) の作製が容易である。６．インビトロでの転写が可能である。

【００３０】実施例２：ｍＲＮＡの分離精製ヒトグリア芽細胞腫細胞株Ｔ９８Ｇ（ＡＴＣＣ株番号、
ＣＲＬ−１６９０）３×１０⁷個を１００ユニット／ｍ
ｌのヒトＩＬ−１βで４時間刺激した後、Okayama,H.等
の方法［Methods in Enzymology, 154, 3(1987) に記
載。］に従って、ｍＲＮＡを分離した。すなわち、5.5
ＭＧＴＣ溶液（5.5 Ｍグアニジンチオシアネート、２
５ｍＭクエン酸ナトリウム、0.5 ％ソジウムラウリルサ
ルコシン(sodium lauryl sarcosine) で細胞を可溶化し
た後、セルライゼート(cell lysate) を密度1.51のセシ
ウムトリフルオロアセテート（ＣｓＴＦＡ）溶液のクッ
ション上に載せて超遠心（120,000 ×ｇ、２０時間）し
て、沈殿中に1.26ｍｇの全ＲＮＡを回収した。これを、
オリゴｄＴセルロースカラムに２回通して４６μｇのｐ
ｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡを精製回収した。

【００３１】実施例３：ｃＤＮＡライブラリーの作製ｃＤＮＡライブラリーは、Gubler＆Hoffman 法［Gene,
25, 263(1983) に記載。］の変法にて作製した。実施例
２で作製したｐｏｌｙ（Ａ）⁺ＲＮＡ（５μｇ）から、
ＮｏｔＩサイトを持つオリゴｄＴプライマーを用いて、
逆転写酵素により、ファーストストランドを合成した。
続いて、セカンドストランドを合成し、ＳａｌＩアダプ
ターのライゲーションおよびＮｏｔＩ消化を行なった
後、ゲルろ過カラムクロマトグラフィー［Sephacryl S-
500HR (Pharmacia社より販売) カラムを用いた。］によ
り、アダプターとプライマーを除いて、８２０ｎｇのｃ
ＤＮＡフラクションを回収した。以上のｃＤＮＡ合成ス
テップは、スーパースクリプトシステム（Super Script
System 、ＢＲＬ社より販売）のキットを用いて行なっ
た。

【００３２】一方、ベクターの調整は、実施例１で作製
したｐＶｆＣＳ−１をＮｏｔＩにより完全消化後さらに
ＳａｌＩで消化し、0.8 ％アガロース電気泳動にてバン
ドを切り出し、ガラス・パウダー法のためのキット［Ｇ
ＥＮＥＣＬＥＡＮII（ＢＩＯ１０１社より販売）］を用
いて精製することにより行なった。それぞれ作製したｃ
ＤＮＡとベクターをライゲーションした後、Inoue, H.
等の方法［Gene, 96, 23(1990)に記載。］で調製したＤ
Ｈ５のコンピテントセルに形質転換した。その結果、平
均長 1.5ｋｂ、インディペンデントクローン数６×１０
⁵個のｃＤＮＡライブラリーが得られた。

【００３３】実施例４：クローニングとシークエンシング実施例３で作製したｃＤＮＡライブラリーより、直径１
０ｃｍのＬＢプレートに約３００個のコロニー／プレー
トの密度でクローンを播き、コロニー群からランダムに
ピックアップしてクローニングを行なった。１コロニー
から３ｍｌのＬＢ培養液で一晩培養後、培養液２００μ
ｌに７％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加えて、
−８０℃で保存した。残りの培養液から菌を分離し、常
法によりプラスミドを分離精製した。プラスミドは図２
で示される構造となっているので、Ｔ７をプライマーと
してシークエンスすると、クローニングされたｃＤＮＡ
の５′側からヌクレオチド配列を読むことができる。Ｄ
ＮＡのシークエンシングは、Sanger, F.等のジデオキシ
・ターミネーター法に基づいた、ＡＢＩ社(Applied Bio
systems Inc.) の蛍光ダイターミネーターを用いるサイ
クルシークエンス法により行なった。また、シークエン
スの読み取りには、ＡＢＩ社のＤＮＡシークエンサー(M
odel３７３Ａ) を用いた。こうして、各クローンの５′
側から平均３００ベースの長さのヌクレオチド配列が得
られた。

【００３４】実施例５：パーシャルシークエンスデータの解析実施例４で得られたヌクレオチドシークエンスは、Lipm
an, D.J.およびPearson,W.R.のＦＡＳＴＡプログラムを
用いて、既知データベース（GenBank およびＥＭＢＬ）
に含まれるすべてのヌクレオチド配列に対するホモロジ
ーサーチを行なった。これにより、シークエンスしたク
ローン群の中から未知シークエンスを持つクローンを同
定した。同定されたクローンのヌクレオチド配列を可能
な３つのフレームでアミノ酸配列に変換した。次に、Ky
te, J.およびDoolittle,R.F.のハイドロテーブルを用い
て、コンピューターにより、３つのフレームに相当する
アミノ酸配列の疎水性および親水性のプロファイルを計
算し図式化させた（コンピューターソフトウエアはＤＮ
ＡＳＩＳ（日立ソフトウエアエンジニアリング製）を用
いた。）。

【００３５】ほとんどのサイトカインや成長因子類、ま
た多くの膜蛋白質は、Ｎ末端にシグナルペプチドを有す
ることが知られている。シグナルペプチドは、翻訳開始
Ｍｅｔのすぐ後ろの疎水性の強い領域である。ヌクレオ
チド配列では、コーディング領域で開始コドン（ＡＴ
Ｇ）のすぐ後にある。そこで、未知シークエンスを有す
るクローンのオープンリーディングフレームのデータお
よびアミノ酸配列の疎水性、親水性のデータより、シグ
ナルペプチドを持つ蛋白質をコードする可能性のあるｃ
ＤＮＡを探索した結果、目的のクローン（クローン番号
ＴＧ００７７）を見出した。このクローンは、アミノ酸
配列の３つの可能なフレームのひとつにシグナルペプチ
ドの特徴を有していた（図３参照。ただし、図３は全ア
ミノ酸配列に対するハイドロフォビシティープロファイ
ルである。図中、＋側はハイドロフォビシティーの強い
領域であり、−側はハイドロフォビシティーの弱い領域
であることを示している。）。しかし、クローニングさ
れたｃＤＮＡクローンのすべてが、ｍＲＮＡの全長をカ
バーしているとは限らない。全長でなければ、Ｎ末端の
アミノ酸配列部分を含んでいる可能性は少ない。

【００３６】そこで、ＴＧ００７７のクローンが全長か
否かを決めるために、Northern解析を行なった。すなわ
ち、グリア芽細胞腫細胞株より抽出精製したｐｏｌｙ
（Ａ）⁺ＲＮＡを電気泳動後、ナイロンメンブレン上に
ブロッティングした。ＴＧ００７７のｃＤＮＡインサー
トをプローブとしてハイブリダイズさせると、約７００
ｂｐの位置に１本のバンドが観察された。ＴＧ００７７
クローンのインサートの大きさは約７００ｂｐであった
ので、ＴＧ００７７はほぼ全長のｃＤＮＡであることが
確かめられた。

【００３７】実施例６：ｃＤＮＡ全長のシークエンスと
オープンリーディングフレームの決定ｃＤＮＡの全長のシークエンスは、Molecular Cloning
［Sambrook,J.,Fritsch,E.F.および Maniatis,T.著、Co
ld Spring Harbor Laboratory Press より1989年に発
刊］に記載の方法に従って、ランダムシークエンシング
を行なって決定した。

【００３８】すなわち、ＴＧ００７７クローンよりプラ
スミドを回収し、ｃＤＮＡインサートを分離精製した。
これをライゲーションおよびフラグメンテーションし、
Ｔ４ポリメラーゼによりＤＮＡ断片の末端を平滑化し、
４００ｂｐ付近の長さのＤＮＡ断片をアガロース電気泳
動にて回収した。得られたＤＮＡ断片をプラスミドベク
ター、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴII（Stratagene社より販
売）のＳｍａＩサイトにクローニングした後、大腸菌
(E.Coli)に形質転換した。２０個のコロニーをランダム
にピックアップし、プラスミドＤＮＡを調製後、これら
２０個のプラスミド（これらはすべてＴＧ００７７のｃ
ＤＮＡの断片をインサートとして持っている。）のＤＮ
Ａシークエンシングを行なった。ＤＮＡのシークエンシ
ングとシークエンスの読み取りは実施例４に記載した方
法により行なった。ＴＧ００７７ｃＤＮＡ断片のシーク
エンスデータは、ＤＮＡＳＩＳのＤＮＡシークエンス連
結プログラムを用いて、連続したシークエンスに編集
し、配列番号５に示す塩基配列を得た。このｃＤＮＡ全
長シークエンスデータからオープンリーディングフレー
ムを決定し、さらにアミノ酸配列に翻訳して、配列番号
３に示す配列を得た。

【００３９】実施例７：発現ベクター作製用プラスミド
ベクターの構築武部らの作製したｐｃＤ−ＳＲα２９６ベクター［Mol.
Cell. Biol., 8, 966(1988)に記載。］は、ＳＶ４０初
期プロモーターとＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲのＲ領域とＵ５
配列の一部から構成されるプロモーターシステム（ＳＲ
α）を有する、優れた哺乳動物細胞用の発現ベクターで
ある。しかし、（１）インサートのクローニングサイト
がＥｃｏＲＩひとつである、（２）ｐＢＲ３２２ベクタ
ーをベクター領域の骨格としているので、大腸菌からの
ベクター回収量が低い、等の欠点がある。そこで、大腸
菌からの収量が多いｐＵＣ１９ベクターを骨格とし、イ
ンサートのマルチクローニングサイトを有するｐｃＤ−
ＳＲα２９６改変ベクターを、以下の方法により作成し
た。

【００４０】ｐｃＤ−ＳＲα２９６ベクター（国立予防
衛生研究所、武部氏より譲与された。）をＳａｌＩで切
断し、ＳＲαプロモーターを含む1.7 ｋｂｐの切断をア
ガロース電気泳動法を用いて分離回収し、続いて、この
断片をKlenow処理し平滑末端とした。ｐＵＣ１９ベクタ
ーを、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄ IIIで切断後、Ａｍｐ^r
およびｐＵＣori の領域を含む2.4 ｋｂｐの断片をアガ
ロース電気泳動法を用いて分離回収し、Klenow処理して
平滑末端とした後、さらにＢＡＰ（バクテリアルアルカ
リフォスファターゼ）処理して、５′末端のリン酸基を
除いた。こうして得られたＳＲαプロモーターを含む1.
7 ｋｂｐ断片とｐＵＣori を含む2.4 ｋｂｐ断片をライ
ゲーションにより環状化し、新しいベクターを構築し
た。得られたベクターよりＰｓｔＩ−ＫｐｎＩ断片を除
去し、下記の合成ポリリンカー、

【００４１】

【化２】

【００４２】と入れ換えた。このようにして構築したプ
ラスミドベクター（約3.9 ｋｂｐ、図４に示す。）をｐ
ＵＣ−ＳＲαＭＬ１と命名した。

【００４３】実施例８：発現ベクターの構築ＴＧ００７７クローン（実施例５で作製した。）より分
離したプラスミドからｃＤＮＡインサートを、ＳａｌＩ
およびＳｐｅＩを用いて切り出し、これをｐＵＣ−ＳＲ
αＭＬ１（実施例７で作製した。）のＳａｌＩ−Ｓｐｅ
Ｉサイトに挿入して、発現ベクターｐＵＣ−ＳＲαＭＬ
１−ＴＧ００７７Ａを得た。一方、下記式

【００４４】

【化３】

【００４５】および

【化４】

【００４６】で示されるオリゴデオキシヌクレオチドを
合成し、これらをプライマーとしてＴＧ００７７プラス
ミドに対してＰＣＲ（ポリメラーゼチェーンリアクショ
ン）を行なった。得られたＰＣＲ断片は、ＴＧ００７７
蛋白質のＣ末端にヒスチジン（Ｈｉｓ）が６個余分につ
いた蛋白質をコードするｃＤＮＡを含むようになってい
る。得られたＰＣＲ断片をＳａｌＩおよびＳｐｅＩで切
断後、分離精製してｐＵＣ−ＳＲαＭＬ１（実施例７で
作製した。）のＳａｌＩ−ＳｐｅＩサイトに挿入して、
発現ベクターｐＵＣ−ＳＲαＭＬ１−ＴＧ００７７Ｂを
得た。ｐＵＣ−ＳＲαＭＬ１−ＴＧ００７７Ａおよびｐ
ＵＣ−ＳＲαＭＬ１−ＴＧ００７７Ｂプラスミドでそれ
ぞれ大腸菌ＤＨ５を形質転換し、形質転換菌の培養液
（１００ｍｌ）よりプラスミドを分離し、ＣｓＣｌ密度
勾配法を２回繰り返して精製し、それぞれ５９２μｇお
よび５４６μｇを得た。

【００４７】実施例９：ＣＯＳ細胞での発現ＣＯＳ−７細胞［Cell, 23, 175 (1981)に記載。］にプ
ラスミドＤＮＡ、ｐＵＣ−ＳＲαＭＬ１、ｐＵＣ−ＳＲ
αＭＬ１−ＴＧ００７７ＡおよびｐＵＣ−ＳＲαＭＬ１
−ＴＧ００７７Ｂをそれぞれジエチルアミノエチル（Ｄ
ＥＡＥ）デキストラン法［J. Immunology, 136, 4291(1
986)に記載。］により導入した。すなわち、約1.8 ×１
０⁶個のＣＯＳ−７細胞を５０ｍｌの増殖培養液（１０
％非働化牛胎児血清を含むダルベッコ変法ＭＥＭ培養
液）とともに、２２５ｃｍ²フラスコ（コーニング社
製）に植え込み、炭酸ガスインキュベーター（３７℃、
５％ＣＯ₂）中で一晩培養した。翌日、培養液を除去し
た後、フラスコ当り１２ｍｌのＤＮＡカクテル（それぞ
れのプラスミドＤＮＡ１５μｇ、５０ｍＭトリス塩酸緩
衝液（ｐＨ7.4 ）、４００μｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキ
ストランを含むダルベッコ変法ＭＥＭ培養液）を加え
て、３７℃、５％ＣＯ₂中で３時間反応させた。次にＤ
ＮＡカクテルを除去し、クロロキン液（１５０μＭクロ
ロキン、７％非働化牛胎児血清を含むダルベッコ変法Ｍ
ＥＭ培養液）１５ｍｌを加えてさらに３時間反応させ
た。

【００４８】クロロキン液を除去した後、増殖培養液
（５０ｍｌ）を加えて、３７℃、５％ＣＯ₂のインキュ
ベーター中で７２時間培養し、細胞がほぼ単層になるま
で増殖させた。次に、培養液を除去し、無血清培養液
（商品名：ＳＦＭ−１０１、日水製薬社製）で一度洗浄
した後、新たに無血清培養液（７５ｍｌ）を加えて、さ
らに７２時間培養した。培養液を回収し、除菌フィルタ
ー（商品名：ＳＴＥＲＩＶＥＸ−ＧＳ、ミリポア社製）
を通じてろ過した。これらの培養液は４℃に保存し、以
後の実験に供した。得られた培養液のうち、ＴＧ００７
７のｃＤＮＡインサートを含むプラスミドで形質導入さ
れたＣＯＳ細胞の培養液には、ＴＧ００７７に相当する
ポリペプチドの成熟蛋白部分が分泌されているはずであ
る。

【００４９】実施例１０：発現の確認形質導入を行なったＣＯＳ細胞培養上清（実施例９で得
られた。）をそれぞれ２ｍｌずつ取り、これを遠心濃縮
フィルター（商品名：セントリコン−１０、ミリポア社
製）を用いて１００μｌに濃縮した。それぞれ１μｌを
等量のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ナトリウムドデシルサルフェ
ートポリアクリルアミドゲル電気泳動）用ローディング
バッファー［0.125 Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ6.8 ）、
４％ナトリウムドデシルサルフェート、３０％グリセロ
ール］と混合し、９０℃で３分間処理した後、ＳＤＳ−
ＰＡＧＥに供した。さらに、Ｃ末端にＨｉｓヘキサマー
を導入したＴＧ００７７Ｂ蛋白質については、ＣＯＳ細
胞培養上清だけでなく、精製品についてもＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥによる解析を行なった。

【００５０】精製は、Ｈｉｓが様々な遷移金属イオンと
複合体を形成することを応用して、金属キレートアフィ
ニティークロマトグラフィーの手法［Biotechnology,
9, 273 (1991)に記載。］で精製した。すなわち、ＣＯ
Ｓ細胞より得られた培養上清（３５０ｍｌ）に、最終濃
度１Ｍになるように塩化ナトリウム水溶液を加え、亜鉛
を結合させたキレーティングセファロースカラム［商品
名：キレーティングセファローズファスト−フロー（Ch
elating Sepharose Fast-Flow ）、ファルマシア社製、
４ｍｌ］に吸着させた。１Ｍ塩化ナトリウム水溶液（４
０ｍｌ）を含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0 ）でカ
ラムを洗浄後、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液および0.4 Ｍ
イミダゾールを含む５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ7.0 ）
を用いて溶出した。溶出液１２ｍｌを１００μｌに濃縮
し、そのうち１μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥはファストシステム（Phast System、フ
ァルマシア社製）により、ゲルはファストゲル（Phast
Gel （登録商標）SDS 10/20 gradient、ファルマシア社
製）を用いて行なった。銀染色した結果を図５に示す。

【００５１】レーン１はｐＵＣ−ＳＲαＭＬ１で形質導
入されたＣＯＳ細胞培養上清濃縮液、レーン２はｐＵＣ
−ＳＲαＭＬ１−ＴＧ００７７Ｂで形質導入されたＣＯ
Ｓ細胞培養上清濃縮液、レーン３はｐＵＣ−ＳＲαＭＬ
１−ＴＧ００７７Ｂで形質導入されたＣＯＳ細胞培養上
清をカラム精製した時のカラム非吸着画分、レーン４は
同じくカラム精製した時のイミダゾール溶出画分、レー
ン５はｐＵＣ−ＳＲαＭＬ１−ＴＧ００７７Ａで形質導
入されたＣＯＳ細胞培養上清濃縮液を示し、レーンＭは
分子量マーカーを表わしている。レーン２、４および５
には、１５〜１６ｋＤ附近にレーン１および３には見ら
れないバンドが認められる。このバンドが発現されたＴ
Ｇ００７７蛋白質のバンドである。この値はアミノ酸配
列から計算されるＴＧ００７７蛋白質の分子量とよく一
致している。また、金属キレートアフィニティーカラム
で精製回収した蛋白質量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色し
たバンドをヒトＩＬ−４標準品のバンドと比較すること
により、約２０μｇと推定した。

【００５２】実施例１１：発現蛋白質のアミノ酸シークエンシング金属キレートアフィニティーカラムにより得られた精製
品は、マツダイラ等の方法［J. Biol. Chem., 262, 100
35(1987)に記載。］に従い、気相シークエンサーを用い
てＮ末端からのアミノ酸配列を決定した。すなわち、約
１００ｐｍｏｌｅ相当のＴＧ００７７Ｂ蛋白質（実施例
１０で得られた精製品）を、１０〜２０％ポリアクリル
アミドグラジエントゲル（第一化学社製）で、６０ｍＡ
で１時間ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行なった。泳動終了後、ブ
ロッティング用緩衝液［１０ｍＭＣＡＰＳ（３−シク
ロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸）および１
０％メタノールよりなる。］でゲルを平衡化し、同組成
の緩衝液で平衡化したＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフル
オリド）膜［商品名：プロブロット (Pro Blott)、ＡＢ
Ｉ社製］上に、ブロッティング装置（マリソル社製）を
用いて、0.4 Ａで２時間エレクトロブロッティングを行
なった。ブロッティング終了後、ＰＶＤＦ膜は蒸留水で
３回洗浄し、0.1 ％（ｗ／ｖ）クマシーブルーで１分間
染色し、５０％メタノールで脱色後、目的バンドを切り
取り、シークエンサーに供した。シークエンサーはＡＢ
Ｉ社のプロテインシークエンサー（モデル４７０Ａオン
ラインＰＴＨアナライザーモデル１２０Ａ装備）を用い
た。

【００５３】Ｎ末端からのシークエンスは、

【００５４】

【化５】

【００５５】（式中、Ｘ₁からＸ₄はシークエンサーチ
ャート上で明瞭に判定できなかったことを示す。）と認
められた。このシークエンスは、ｃＤＮＡの塩基配列よ
り推定されたアミノ酸配列の２４番目以降と一致してい
る。このことより、ＴＧ００７７蛋白質はＮ末端側に２
３個のシグナルペプチドを有し、成熟蛋白質のＮ末端は
グリシン（Ｇｌｙ）であることが決定された。配列表６
にＴＧ００７７ｃＤＮＡの全塩基配列とこれにコードさ
れるＴＧ００７７蛋白質のアミノ酸一次配列を示した。

【００５６】

【配列表】

【００５７】配列番号：１配列の長さ：１３３配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Gly Ser Pro Pro Thr Gln Pro Ser Pro Ala Ser Asp Ser Gly Ser Gly 1 5 10 15 Tyr Val Pro Gly Ser Val Ser Ala Ala Phe Val Thr Cys Pro Asn Glu 20 25 30 Lys Val Ala Lys Glu Ile Ala Arg Ala Val Val Glu Lys Arg Leu Ala 35 40 45 Ala Cys Val Asn Leu Ile Pro Gln Ile Thr Ser Ile Tyr Glu Trp Lys 50 55 60 Gly Lys Ile Glu Glu Asp Ser Glu Val Leu Met Met Ile Lys Thr Gln 65 70 75 80 Ser Ser Leu Val Pro Ala Leu Thr Asp Phe Val Arg Ser Val His Pro 85 90 95 Tyr Glu Val Ala Glu Val Ile Ala Leu Pro Val Glu Gln Gly Asn Phe 100 105 110 Pro Tyr Leu Gln Trp Val Arg Gln Val Thr Glu Ser Val Ser Asp Ser 115 120 125 Ile Thr Val Leu Pro 130

【００５８】配列番号：２配列の長さ：３９９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 GGAAGCCCTC CGACCCAGCC CTCGCCGGCC TCGGATTCCG GCTCTGGCTA CGTTCCGGGC 60 TCGGTCTCTG CAGCCTTTGT TACTTGCCCC AACGAGAAGG TCGCCAAGGA GATCGCCAGG 120 GCCGTGGTGG AGAAGCGCCT AGCAGCCTGC GTCAACCTCA TCCCTCAGAT TACATCCATC 180 TATGAGTGGA AAGGGAAGAT CGAGGAAGAC AGTGAGGTGC TGATGATGAT TAAAACCCAA 240 AGTTCCTTGG TCCCAGCTTT GACAGATTTT GTTCGTTCTG TGCACCCTTA CGAAGTGGCC 300 GAGGTAATTG CATTGCCTGT GGAACAGGGG AACTTTCCGT ACCTGCAGTG GGTGCGCCAG 360 GTCACAGAGT CAGTTTCTGA CTCTATCACA GTCCTGCCA 399

【００５９】配列番号：３配列の長さ：１５６配列の型：アミノ酸トポロジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Met Pro Ala Leu Leu Pro Val Ala Ser Arg Leu Leu Leu Leu Pro Arg 1 5 10 15 Val Leu Leu Thr Met Ala Ser Gly Ser Pro Pro Thr Gln Pro Ser Pro 20 25 30 Ala Ser Asp Ser Gly Ser Gly Tyr Val Pro Gly Ser Val Ser Ala Ala 35 40 45 Phe Val Thr Cys Pro Asn Glu Lys Val Ala Lys Glu Ile Ala Arg Ala 50 55 60 Val Val Glu Lys Arg Leu Ala Ala Cys Val Asn Leu Ile Pro Gln Ile 65 70 75 80 Thr Ser Ile Tyr Glu Trp Lys Gly Lys Ile Glu Glu Asp Ser Glu Val 85 90 95 Leu Met Met Ile Lys Thr Gln Ser Ser Leu Val Pro Ala Leu Thr Asp 100 105 110 Phe Val Arg Ser Val His Pro Tyr Glu Val Ala Glu Val Ile Ala Leu 115 120 125 Pro Val Glu Gln Gly Asn Phe Pro Tyr Leu Gln Trp Val Arg Gln Val 130 135 140 Thr Glu Ser Val Ser Asp Ser Ile Thr Val Leu Pro 145 150 155

【００６０】配列番号：４配列の長さ：４６８配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 ATGCCGGCGC TGCTGCCTGT GGCCTCCCGC CTTTTGTTGC TACCCCGAGT CTTGCTGACC 60 ATGGCCTCTG GAAGCCCTCC GACCCAGCCC TCGCCGGCCT CGGATTCCGG CTCTGGCTAC 120 GTTCCGGGCT CGGTCTCTGC AGCCTTTGTT ACTTGCCCCA ACGAGAAGGT CGCCAAGGAG 180 ATCGCCAGGG CCGTGGTGGA GAAGCGCCTA GCAGCCTGCG TCAACCTCAT CCCTCAGATT 240 ACATCCATCT ATGAGTGGAA AGGGAAGATC GAGGAAGACA GTGAGGTGCT GATGATGATT 300 AAAACCCAAA GTTCCTTGGT CCCAGCTTTG ACAGATTTTG TTCGTTCTGT GCACCCTTAC 360 GAAGTGGCCG AGGTAATTGC ATTGCCTGTG GAACAGGGGA ACTTTCCGTA CCTGCAGTGG 420 GTGCGCCAGG TCACAGAGTC AGTTTCTGAC TCTATCACAG TCCTGCCA 468

【００６１】配列番号：５配列の長さ：６６０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 配列 TGGTGCGCGC TGTTTTCTAA TCACGTGGCT GCCACCCAGG CCTCTCTGCT CCTGTCTTTT 60 GTTTGGATGC CGGCGCTGCT GCCTGTGGCC TCCCGCCTTT TGTTGCTACC CCGAGTCTTG 120 CTGACCATGG CCTCTGGAAG CCCTCCGACC CAGCCCTCGC CGGCCTCGGA TTCCGGCTCT 180 GGCTACGTTC CGGGCTCGGT CTCTGCAGCC TTTGTTACTT GCCCCAACGA GAAGGTCGCC 240 AAGGAGATCG CCAGGGCCGT GGTGGAGAAG CGCCTAGCAG CCTGCGTCAA CCTCATCCCT 300 CAGATTACAT CCATCTATGA GTGGAAAGGG AAGATCGAGG AAGACAGTGA GGTGCTGATG 360 ATGATTAAAA CCCAAAGTTC CTTGGTCCCA GCTTTGACAG ATTTTGTTCG TTCTGTGCAC 420 CCTTACGAAG TGGCCGAGGT AATTGCATTG CCTGTGGAAC AGGGGAACTT TCCGTACCTG 480 CAGTGGGTGC GCCAGGTCAC AGAGTCAGTT TCTGACTCTA TCACAGTCCT GCCATGATGA 540 GCCCTGTTCC TGCTCATCAT GAAGATCCCC GCGATACTTC AACGCCTTCT GACTTCCAGG 600 TGATGACTGG GCCCCCAATA AATCCCGTCT TTGGGTCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 660

【００６２】配列番号：６配列の長さ：６６０配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：cDNA to mRNA 起源生物名：Homo sapiens セルライン：Ｔ９８Ｇ配列の特徴特徴を表わす記号：ＣＤＳ存在位置：67..537 特徴を決定した方法：Ｐ特徴を表わす記号：sig peptide 存在位置：67..135 特徴を決定した方法：Ｅ特徴を表わす記号：mat peptide 存在位置：136..534 特徴を決定した方法：Ｅ配列 TGGTGCGCGC TGTTTTCTAA TCACGTGGCT GCCACCCAGG CCTCTCTGCT CCTGTCTTTT 60 GTTTGG ATG CCG GCG CTG CTG CCT GTG GCC TCC CGC CTT TTG TTG CTA 108 Met Pro Ala Leu Leu Pro Val Ala Ser Arg Leu Leu Leu Leu -20 -15 -10 CCC CGA GTC TTG CTG ACC ATG GCC TCT GGA AGC CCT CCG ACC CAG CCC 156 Pro Arg Val Leu Leu Thr Met Ala Ser Gly Ser Pro Pro Thr Gln Pro -5 1 5 TCG CCG GCC TCG GAT TCC GGC TCT GGC TAC GTT CCG GGC TCG GTC TCT 204 Ser Pro Ala Ser Asp Ser Gly Ser Gly Tyr Val Pro Gly Ser Val Ser 10 15 20 GCA GCC TTT GTT ACT TGC CCC AAC GAG AAG GTC GCC AAG GAG ATC GCC 252 Ala Ala Phe Val Thr Cys Pro Asn Glu Lys Val Ala Lys Glu Ile Ala 25 30 35 AGG GCC GTG GTG GAG AAG CGC CTA GCA GCC TGC GTC AAC CTC ATC CCT 300 Arg Ala Val Val Glu Lys Arg Leu Ala Ala Cys Val Asn Leu Ile Pro 40 45 50 55 CAG ATT ACA TCC ATC TAT GAG TGG AAA GGG AAG ATC GAG GAA GAC AGT 348 Gln Ile Thr Ser Ile Tyr Glu Trp Lys Gly Lys Ile Glu Glu Asp Ser 60 65 70 GAG GTG CTG ATG ATG ATT AAA ACC CAA AGT TCC TTG GTC CCA GCT TTG 396 Glu Val Leu Met Met Ile Lys Thr Gln Ser Ser Leu Val Pro Ala Leu 75 80 85 ACA GAT TTT GTT CGT TCT GTG CAC CCT TAC GAA GTG GCC GAG GTA ATT 444 Thr Asp Phe Val Arg Ser Val His Pro Tyr Glu Val Ala Glu Val Ile 90 95 100 GCA TTG CCT GTG GAA CAG GGG AAC TTT CCG TAC CTG CAG TGG GTG CGC 492 Ala Leu Pro Val Glu Gln Gly Asn Phe Pro Tyr Leu Gln Trp Val Arg 105 110 115 CAG GTC ACA GAG TCA GTT TCT GAC TCT ATC ACA GTC CTG CCA TGATGAGCC 543 Gln Val Thr Glu Ser Val Ser Asp Ser Ile Thr Val Leu Pro 120 125 130 CTGTTCCTGC TCATCATGAA GATCCCCGCG ATACTTCAAC GCCTTCTGAC TTCCAGGTGA 603 TGACTGGGCC CCCAATAAAT CCCGTCTTTG GGTCAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAA 660

【図面の簡単な説明】

【図１】プラスミドベクターｐＶｆＣＳ−１の構築図で
ある。

【図２】ヒトグリア芽細胞腫細胞株Ｔ９８Ｇ由来のｃＤ
ＮＡが挿入された組み換えＤＮＡの構築図である。

【図３】本発明のポリペプチドのハイドロフォビシティ
ープロファイルである。

【図４】発現ベクターｐＵＣ−ＳＲαＭＬ１の構築図で
ある。

【図５】実施例１０で行なったＳＤＳ−ＰＡＧＥのパタ
ーンである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＤ 8314−4ＣＡＤＵ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】実質的に純粋な形である配列番号１で示
されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのホモロ
ーグ、そのフラグメントまたはそのフラグメントのホモ
ローグ。
【請求項２】配列番号１で示されるアミノ酸配列から
なる請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】実質的に純粋な形である配列番号３で示
されるアミノ酸配列からなるポリペプチド、そのホモロ
ーグ、そのフラグメントまたはそのフラグメントのホモ
ローグ。
【請求項４】配列番号３で示されるアミノ酸配列から
なる請求項３記載のポリペプチド。
【請求項５】請求項１、２、３または４に記載された
ポリペプチドをコードするＤＮＡ。
【請求項６】配列番号２で示される塩基配列を有する
請求項５記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
ブリダイズするフラグメント。
【請求項７】配列番号４で示される塩基配列を有する
請求項５記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
ブリダイズするフラグメント。
【請求項８】配列番号５で示される塩基配列を有する
請求項５記載のＤＮＡ、またはその配列に選択的にハイ
ブリダイズするフラグメント。
【請求項９】請求項４から８のいずれかの項に記載の
ＤＮＡからなる複製または発現ベクター。
【請求項１０】請求項９記載の複製または発現ベクタ
ーで形質転換された宿主細胞。
【請求項１１】請求項１から４のいずれかの項に記載
されたポリペプチドを発現させるための条件下で請求項
１０記載の宿主細胞を培養することからなる該ポリペプ
チドの製造方法。