CN1143372A

CN1143372A - 血细胞生成成熟因子

Info

Publication number: CN1143372A
Application number: CN94195046A
Authority: CN
Inventors: 厄文·科克尼斯; 马克·D·亚当斯; 亨里克·奥尔森; 克雷格·罗森
Original assignee: Human Genome Sciences Inc
Current assignee: Human Genome Sciences Inc
Priority date: 1994-01-25
Filing date: 1994-05-10
Publication date: 1997-02-19
Also published as: US20020146408A1; US6790826B2; NZ269871A; ZA943463B; EP0763045A4; EP0763045A1; CA2181431A1; US6346246B1; JPH09510869A; US5986069A; US5922572A; AU7354194A; AU697535B2; WO1995019985A1

Abstract

本发明提供了一种人成熟因子多肽和编码这种血细胞生成成熟因子多肽的DNA(RNA)，还提供了通过重组技术生产这种多肽的方法，以及抗这种多肽的抗体。这种多肽可以与合适的药物学载体或稀释剂结合，以提供对由人血细胞生成成熟因子多肽的表达不足引起的各种疾病的诊断、治疗和/或预防效果。

Description

血细胞生成成熟因子

本发明涉及新近识别的多核苷酸序列，由这些序列编码的多肽，这类多核苷酸和多肽的用途，以及这类多核苷酸和多肽的生产。更确切地说，本发明的多肽是一种血细胞生成因子。

各种各样的生长因子已经被发现、研究和应用(Cellular and Molecular Biology，editedby the Japanese Tissue Culture Association，Asakula Shoten，1987)。这类细胞生长因子包括表皮生长因子，血小板衍生生长因子，酸性成纤维细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子。基于成纤维细胞的生长促进作用，所有这些生长因子都已分离。然而，也已发现这些因子显示出广泛的活性及较低的特异性。

因此，最近的努力都在寻找能特异性地作用于功能性分化细胞的生长因子。结果，一些生长因子如角质细胞生长因子和肝细胞生长因子已被分离出来，并由此产生了将这些因子用于治疗那些易受其特异性作用攻击的疾病的可能性。另一种被分离的生长因子披露于欧洲专利申请92102385.9，该项专利由Taketa Chemical Industries，Ltd.申请，它公开了一种具有加速神经胶质细胞生长活性的神经胶质激活因子，以及编码该多肽的DNA。

血细胞生成作用即血细胞的产生。主要的血细胞生成组织是骨髓，脾脏，淋巴结和胸腺。在人的胚胎中，血细胞生成作用开始于生命的第二周。在第二个月里胚胎中出现骨髓，并且在妊娠的后半期以及出生后的整个生命周期中成为主要的血细胞生成器官。骨髓中含有干细胞，由它而产生所有的属于血细胞生成系列的细胞。除了T-淋巴细胞外，所有的血细胞都产生于骨髓。造血干细胞由于血细胞生成成熟因子的作用，分化成成熟的血细胞。因而，可以被纯化和分离出来的血细胞生成成熟因子，在治疗和诊断血细胞疾病或其它疾病方面将具有广泛的医用价值。

根据本发明的一个方面，提供了一种新的多肽，即血细胞生成成熟因子，还有它的类似物和衍生物。本发明中的血细胞生成成熟因子是人源的。

根据本发明的另一个方面，提供了编码这种多肽的多核苷酸(DNA或RNA)。

根据本发明的另一个方面，还提供了一种依靠重组技术生产这种多肽的方法。

根据本发明的又一个方面，提供了一种方法将这种多肽，或编码该多肽的DNA用于治疗目的，如刺激造血或神经起源细胞的分化与繁殖。

根据本发明的另外一个方面，还提供了一种血细胞生成成熟因子的抗体。

根据本发明的另外一个方面，还提供了一种用作血细胞生成成熟因子拮抗剂的组合物，如在治疗T-细胞缺乏性相关疾病中可用于抑制这种多肽作用的抗这种多肽的抗体。

本发明的这些方面及其它的方面对于本领域熟练技术人员来说，从此处的讲述中就能明白。

下面的图示仅仅是作为本发明的特殊实施例的阐述而非任何意义上的限制。

图1示出编码血细胞生成成熟因子多肽的多核苷酸序列。同时示出血细胞生成成熟因子多肽的氨基酸序列。使用标准的三字母缩写方式说明氨基酸序列。

图2示出血细胞生成成熟因子与神经胶质成熟因子β间的同源性。

图3说明了经细菌表达以及纯化后的纯的血细胞生成成熟因子蛋白的带型特征。

图4是Northern杂交分析，指出血细胞生成成熟因子主要发现于人体的哪些器官。

图5说明了Hela细胞的生长被血细胞生成成熟因子的存在所抑制。

根据本发明的一个方面，提供了如图1所示的DNA序列(以及相应的RNA序列)和/或编码与图2中所示序列相同的多肽的DNA(RNA)序列，以及它们的片段，衍生物，类似物及所有的等位突变体。

根据本发明的另一方面，提供了编码与于1993年8月4日保藏的、ATCC保藏号为75514的cDNA克隆所编码的多肽相同的多肽的多核苷酸，和/或这种多核苷酸的片段，类似物，衍生物及等位突变体。

对于DNA，该DNA可能是单链或双链形式。若是单链形式，该DNA序列可能是如图1所示的“有意义”的链或者是其互补链。

该多核苷酸(DNA或RNA，最好是DNA)至少包括编码该多肽的部分，其编码部分可能与保藏的克隆相同也可能不同，由此可编码相同的多肽或者是它的等位突变体。该编码部分最好至少要能编码成熟形式的本发明的多肽。

本发明还涉及与上述多核苷酸序列杂交的多核苷酸序列，如果在两个序列之间至少有50％、最好是至少70％的同一性。在另一个优选的实施方案中，本发明涉及在严格条件下与上述的多核苷酸杂交的多核苷酸序列。用于此处的术语“严格条件”意味着在两个序列之间至少95％，最好是至少97％的同一性时，杂交才能发生。因此，本发明包括图1所示的DNA所编码的多肽的等位突变体的编码DNA(RNA)序列。由此，本发明提供了分离形式的DNA(RNA)，该DNA(RNA)编码天然产生的一种人类多肽即血细胞生成成熟因子，还有它的等位突变体。

本发明还涉及一种多肽即血细胞生成成熟因子，它具有图2所示的结构，还有其等位突变体，以及其类似物，片段及衍生物，这些都具有与天然产生的多肽相同的功能。

本发明的多肽主要在血细胞生成组织中表达，而且本身作为血细胞生成成熟因子控制着血细胞生成作用的起始以及那些与之相互作用的细胞。

本发明还涉及1993年8月4日保藏的，ATCC保藏号为75514的克隆中的DNA所编码的一种多肽，以及它的类似物，片段，衍生物及等位突变体。保藏是按国际承认的用于专利目的的微生物保藏布达佩斯条约进行的。这种保藏仅仅是提供一种方便而非按35 U.S.C.S 112要求保藏物的一种许可。从保藏材料中获得的多核苷酸序列，以及由该多核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列，在此一并作为参考并且在万一与在此所描述的序列有冲突时作为对照。制造，使用或销售保藏的材料要求得到许可，而这种许可并未被授予。

本发明的多肽优选的是以一种分离形式以及纯品的形式提供。

术语“分离的”指的是材料离开了它的原始环境(例如天然环境，若它是天然产生的)。例如，存在于活的动物中的天然产生的多核苷酸或多肽不是分离的，但同样的多核苷酸或多肽，若将其与在天然系统中与其共存的一些或所有材料分开，则就是分离的。这样的多核苷酸可以是一个载体的一部分，而且/或者这样的多核苷酸或多肽可能是一种组合物的一部分，如果这些载体或组合物不是它的天然环境的一部分，则它仍是分离的。

在一个优选的实施方案中，血细胞生成成熟因子是全长形式的成熟的人类血细胞生成成熟因子或是它的等位突变体或糖基化了的突变体。该多核苷酸还可能是编码一个前体蛋白，然后该前体在哺乳动物细胞中加工，再以成熟的蛋白质的形式分泌出来。

本发明的多核苷酸能编码一种成熟形式的多肽或是还编码一段引导序列以方便该多肽的分泌。例如，所要DNA序列能在同一个读框中与一段能帮助多肽分泌的DNA序列融合，如一段引导序列，它的功能就是作为分泌序列控制多肽从宿主细胞往外的运输。具有引导序列的蛋白质即为前体蛋白质，而且引导序列能被宿主细胞切除，形成成熟形式的蛋白质。本发明的多核苷酸还能在同一个读框中融合一个标记序列，例如一个组氨酸标记，它有助于多肽的纯化。

由此，本发明的多肽可能是成熟形式的本发明的血细胞生成成熟因子；或者是前体蛋白或前体多肽的形式，即成熟形式的多肽加上一段引导序列或分泌序列；或者可能是融合蛋白的形式，即在成熟的或前体蛋白的3′或5′端融合一段附加的氨基酸，它将有助于多肽的纯化处理。

在本发明的一个优选实施方案中，标记序列是通过细菌表达载体加到编码框架中的6-His标记。

本发明的多肽主要发现于脾脏和胸腺，并且富集于白细胞中。

正如上面所指出的，本发明还包括该多肽的突变体。其编码DNA是图1中的DNA和/或从保藏的克隆中获得的DNA的突变体；这些突变体保留有血细胞生成成熟因子的活性。突变体可能是替换突变体，或者是插入突变体或缺失突变体。这些突变体可能是天然产生的等位突变体，例如那些具有不同糖基化方式的或是在氨基酸水平上的替换或缺失。

这些突变体还可以通过点突变产生。替换突变体可以是替换一个保守氨基酸或是替换一个非保守氨基酸，但优选是一个保守的氨基酸。

编码本发明的多肽的多核苷酸能够从来源于人类早期肾脏组织、脾脏、胸腺、或是白细胞中的cDNA文库中获得。它含有一个开放的读框，能编码长度为142个氨基酸的成熟蛋白质。血细胞生成成熟因子的氨基酸序列与已知的分离于神经细胞的生长因子同源。本发明的多核苷酸编码的多肽在结构上涉及人类神经胶质成熟因子，两者有82％的相同氨基酸及整个序列的92％的相似性。它还涉及牛神经胶质成熟因子，两者有82％的相同氨基酸及整个序列的92％的相似性。

神经胶质成熟因子是一个17Kd的蛋白质，发现于哺乳动物脑中，与其它的已知蛋白没有明显的同源顺序。它在胚胎中最为丰富但在发育的后期仍能发现。人类的神经胶质成熟因子控制神经起源中的某些细胞的分化与繁殖。

宿主细胞在用本发明的载体转化之后，培养于传统的营养培养基中。对培养基可作适当的修饰，以适应诱导启动子，选择转化子以及扩增血细胞生成成熟因子基因的需要。培养时的条件，如温度、pH及类似的条件，就是先前培养被选做表达系统的宿主细胞时的条件，这些对于本领域普通技术人员来说将是显然的。

“转化”指的是将DNA导入有机体内，使DNA能够复制，不管是作为染色体外的单元还是依靠染色体整合方式。除非特别指明，否则在此所用的转化宿主细胞方法是依照Graham，F.和Van de Eb，A.在Viology 52：456-457(1973)上发表的方法进行的。当然也可以使用其它的转化方法，例如细胞核注射或原生质融合。如果使用原核细胞或是具有基本细胞壁结构的细胞，优选的转染方法是使用氯化钙处理，该方法如Cohn，F.N.et al.在Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，69：2210(1972)上所述。

“转染”指的是将DNA导入宿主细胞而不管编码序列最终是否得到表达。细胞并不能自发地吸收DNA。因此，使用了各种各样的技术“诀窍”来绕过基因转移的天然屏障。许多转染方法对于本领域普通技术人员来说是熟悉的，例如磷酸钙法或电穿孔法。宿主细胞的转化是转染成功的标志。

本发明的多核苷酸还可以用来依靠重组技术生产多肽。因此，该多核苷酸序列可以包括在各种各样的载体或质粒中的任何一个之中来表达一条多肽链。这些载体包括染色体的，非染色体的以及合成的DNA序列，例如SV40的衍生物；细菌质粒；噬菌体DNA；酵母质粒；源于质粒和噬菌体DNA结合的载体，以及质粒与病毒DNA如痘苗病毒，腺病毒，禽痘病毒，以及假狂犬病毒DNA结合的载体。当然，其它的载体或质粒也能使用，只要它在宿主中能复制与生存。

如上所述，适当的DNA序列可以通过种种途径插入到载体中。通常地，DNA序列是通过使用已知的技术插入到一个合适的限制性内切酶位点。这些方法及其它的技术是本领域熟练技术人员所了解的。

在表达载体中，该DNA序列有效地连接着一段合适的表达调控序列(启动子)来指导mRNA的合成。作为启动子的具有代表性的例子，应该提到的是：LTR或SV40启动子，大肠杆菌lac或trp启动子，λ噬菌体PL启动子和别的已知的在原核细胞或真核细胞或它们的病毒中调控基因表达的启动子。表达载体还含有一个有关翻译起始的核糖体结合位点以及一个转录终止子。载体还可能包括有使之扩增表达的适当的序列。

另外，表达载体最好含有一个能提供一个具有表现型特征的基因，以此来筛选转化的宿主细胞，如真核细胞培养中的二氢叶酸还原酶或抗新霉素基因，或如在大肠杆菌中的抗四环素或抗氨苄青霉素基因。

带有如上所述的合适的DNA序列，以及适当的启动子或调控序列的载体，就能被用来转化适当的宿主细胞，并让宿主细胞表达所需的蛋白质。

作为适当的宿主的代表性例子，可能被提到的有：细菌细胞，如E.coli，鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞，如酵母；动物细胞：如CHO细胞或Bowes黑素瘤细胞；植物细胞；等等。有关合适的宿主细胞的选择也是在本领域熟练技术人员的能力之内的。

较为特殊的是，本发明还包括一些重组构建物，它们包含了以上广泛地描述过的那些序列中的一个或多个序列。这些构建物中包含一个载体，例如质粒或病毒载体，在载体中插入了本发明的一个序列，插入可能是正向也可能是反向。在这个实施方案的一个优选方面，结构中还包含一些调控序列，如与该序列相连接的启动子或增强子。大量的适用的载体或启动子对于本领域熟练技术人员来说是熟悉的，而且是通过商业途径可以得到的。作为例子提供了以下一些载体。在细菌中：pQE-9(Qiagen)，pBS，phagescript，PsiX174，pBluescript SK，pBsKS，pNH8a，pNH16a，pNH18a，pNH46a(Stratagene)；pTrc99A，pKK223-3，pKK233-3，pDR540，pRIT5(Pharmacia)。在真核细胞中：pWL neo，pSV2 cat，pOG44，pXT1，pSG(Stratagene)；pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(Pharmacia)。然而，只要在宿主中能够复制和生存，任何其它的质粒或载体都是可以使用的。

启动子区可以从任何使用CAT(氯霉素转移酶)载体或其它有选择标记的载体的基因中选择。两个合适的载体是pKK232-8和pCM7。特别提到的细菌启动子包括lacZ，T3，T7，gpt，λP_R，和trc。真核启动子包括CMV极早期启动子，HSV胸腺嘧啶激酶启动子，SV40早期与晚期启动子，反转录病毒的LTRs，以及小鼠金属硫蛋白-I启动子。有关合适的载体和启动子的选择也是本领域公知的。

在另一个实施方案中，本发明涉及含有上述构建物的宿主细胞。宿主细胞可以是高等真核生物细胞，例如哺乳动物细胞，或者是低等真核生物细胞，例如酵母细胞，或者还可以是原核细胞，例如细菌细胞。使用磷酸钙转染法，DEAE，葡聚糖介导的转染法，或电穿孔法都可以有效地将所说的构建物导入宿主细胞中。(Davis，L.，Dihner，M.，Battery，I.，Basic Methods in Molecular Biology，1986)。

可用一种传统的方式使用宿主细胞中的结构来生产由重组序列编码的基因产物。或者是，被编码的多肽可用传统的多肽合成仪来合成生产。

在合适的启动子的控制下，能够在哺乳动物细胞，酵母细胞，细菌或其它的细胞中表达出成熟的蛋白质。使用源于本发明的DNA构建物的RNAs，细胞外翻译系统也可以用来生产这些蛋白。用于原核和真核宿主细胞的合适的克隆或表达载体描述于Sambrook，etal.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，(Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。

编码本发明的多肽的一条DNA序列的在高等真核生物中的转录水平可以通过在载体上插入一段增强子序列而得到提高。增强子是一些顺式作用的DNA单元，长度通常为大约1O-300bp，作用于启动子以提高其转录水平。这样的例子包括在复制原点后面(100-270bp)的SV40增强子，细胞瘤病毒早期启动子增强子，在复制原点后面的多形瘤增强子，以及腺病毒增强子。

通常地，重组表达载体将包括：复制原点和选择性标记(后者能容许宿主细胞的转化，如大肠杆菌中的氨苄青霉素抗性基因以及酿酒酵母TRP1基因)，以及一个来源于高效表达基因的能够指导其下游结构基因转录的启动子。这些启动子可能来自于一些编码糖酵解酶类如PGK的操纵子，以及编码α-因子，酸性磷酸酶，或热休克蛋白的操纵子，等等。异源的结构序列以一种适当的相位与翻译的起始和终止序列装配在一起，而且，最好能加上一个引导序列，使之能指导翻译蛋白分泌到周质空间或细胞外的培养基中去。

使用于细菌中的有用的表达载体的构建，是在一个具有功能性启动子的有效读框中，将编码所要蛋白质的结构DNA序列与适当的翻译起始和终止信号一起插入。该载体将带有一个或多个表型选择标记和一个复制原点，以在宿主细胞中能保持这种载体，若有必要，还可提供在宿主内的扩增。合适的供转化的原核宿主包括E.coli，枯草芽孢杆菌鼠伤寒沙门氏菌以及各种属的假单胞菌、链霉菌、金黄色葡萄球菌，虽然其它的也能作为一种选择。

作为一个代表性的但非限制性的例子，使用于细菌的有用的表达载体可以包括一个选择性标记，细菌复制原点，后者源于市场上可购得的包含有众所周知的克隆载体pBR322(ATCC 37017)中的遗传单元的质粒。这样的商用质粒包括，如pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和GEM1(Promega Biotec.，Madison，WI，USA)。这些pBR322“骨架”部分结合有合适的启动子和待表达的结构序列。

在转化了合适的宿主细胞以及宿主菌生长到一个合适的细胞密度之后，就可用一些适当的方法(如，温度升高或化学诱导)给所选择的启动子脱阻抑，并将细胞延长培养一段时间。细胞经过离心收集，用物理或化学方法破碎，得到的粗提取物保留起来以供进一步的纯化。

从重组细胞培养物中回收与纯化血细胞生成成熟因子的方法，包括硫酸铵或乙醇沉淀，酸抽提，阴离子或阳离子交换层析，磷酸纤维素层析，疏水相互作用层析，亲和层析(例如，使用固相支持物上的DNA或核苷酸)，羟磷灰石层析以及凝集素层析。在纯化过程中，优选的是低浓度(将近0.1-5μm)的钙离子(Price，et al.，J.biol.Chem.，244：917(1969))。

还可用各种哺乳动物细胞培养系统来表达重组蛋白，哺乳动物细胞表达系统的例子包括，猴肾成纤维细胞的COS-7细胞系，见Gluzman，Cell 23：175(1981)所述，以及其它能表达相容性载体的细胞系，例如C127，3T3，CHO，Hela和BHK细胞系。哺乳动物表达载体包括一个复制原点，一个合适的启动子和增强子，还需要一些核糖体结合位点，多腺苷酸化位点，拼接供体与受体位点，转录终止序列与5′端非转录区序列。衍生于SV40病毒基因组的DNA序列，例如SV40复制原点，早期启动子，增强子，拼接位点以及多腺苷酸化位点都可用来提供所需要的非转录遗传单元。

在细菌培养中生产的重组蛋白的分离通常是直接从细胞沉淀中提取，接着进行一次或多次盐析，溶液中的离子交换或分子筛层析等步骤。如果需要，可进行蛋白的重新折叠，以恢复成熟蛋白质的构象。最后，使用高效液相色谱(HPLC)作为最终的纯化步骤。用来表达蛋白的微生物细胞可以通过任何方便的方法破碎，包括冻-融循环，超声处理，机械破碎，或使用细胞裂解试剂。

本发明的多肽可能是天然的经纯化的产品，或化学合成工艺的产物，或者是通过重组技术用本发明的多核苷酸序列在原核或真核宿主细胞(例如，细菌，酵母，培养的高等植物，昆虫和哺乳动物细胞)中生产。根据用于重组生产工艺的宿主的不同，本发明的多肽可能糖基化上哺乳动物或其它真核生物的糖类或者也可能是非糖基化的。本发明的多肽还可能包括一个起始的甲硫氨酸残基(在位置-1上)。

除了天然产生的等位形式的多肽，本发明还包括它的类似物与衍生物，它们的功能与血细胞生成成熟因子一样。因而，该多肽的一个或多个氨基酸残基可能被保守的氨基酸残基所取代。

血细胞生成成熟因子可被用于治疗神经或血细胞生成起始的异常，例如癌症，因为血细胞生成成熟因子可以阻止或延迟癌细胞的生长。

本发明的多肽还可以用来治疗白血病。白血病的临床特征是正常血细胞的形成受到抑制，这是因为白血病性细胞产生的因子抑制了正常的血细胞的生成过程。它导致贫血，血小板减少以及粒细胞减少。因此，给予治疗有效剂量的血细胞生成成熟因子可以消除白血病性细胞对血细胞生成作用的抑制。血细胞生成成熟因子还可用来治疗其它的血液性疾病，例如溶血症，红细胞增多症，melogibrosis，血友病，以及脾大症。

当病人由于患癌症而接受了骨髓移植的时候，或者是在其它的情况下，血细胞生成成熟因子可被用来刺激成熟的血细胞的分化。为了研究或诊断的目的，血细胞生成成熟因子还可用来在体外刺激骨髓细胞。

根据本发明，本发明的多肽还可用于在体内表达该多肽，即通常所指的“基因治疗”。

举例来说，可以在体外用编码该多肽的一条多核苷酸链(DNA或RNA)来转导细胞如骨髓细胞，然后将这些转导过的细胞提供给将接受该多肽治疗的患者。这种方法在本领域是已知的。例如，可以按照本领域公知的程序使用含有为本发明的多肽编码的RNA的反转录病毒颗粒来转导细胞。

类似地，通过本领域公知的程序，为在体内表达该多肽的细胞转导也可以在体内完成。正如已知的技术，一个能生产含有编码本发明的多肽的RNA的生产者细胞可以注射到病人体内，在体内完成转导并在体内表达该多肽。

从本发明的讲述中，这些及其它的给予本发明的多肽的给药方法对于本领域熟练技术人员来说是显而易见的。转导细胞的表达载体也可以不用反转录病毒，而用腺病毒，后者在与一种合适的传递载体结合以后就可在体内转导细胞。

本发明的多肽还可与一种合适的药物学载体结合使用。这种组合物包括治疗有效剂量的蛋白质，以及药物学上可接受的载体或赋形剂。这样的载体包括但并非仅限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，乙醇，以及它们的结合物。配方应该与给药的方式相适应。

一种含有血细胞生成成熟因子的组合物的注射液可以通过传统的方法制备，例如使用生理盐水或含有葡萄糖或其它辅助试剂的水溶液，药物组合物例如片剂或胶囊也能使用传统的方法生产。用作制药工业中的组合物的注射液，水溶液，片剂或胶囊均在无菌条件下制备。

本发明还提供一种药物包装盒或药盒，包括一个或多个容器，里面装有一或多种本发明的药物组合物的成分。随这些容器附带的还有一份由管理医药或生物制品的生产、使用及销售的政府部门所颁发的通知，通知表明得到了生产、使用及销售管理部门对在人体中使用该药物的同意。另外，本发明的多肽还可与其它的治疗用化合物联合使用。

当本发明的血细胞生成成熟因子作为药物使用时，它能通过一种合适的媒介给予哺乳动物(例如人类，小鼠，大鼠，仓鼠，狗，兔和猫等)。

如上所述，当本发明的多肽作为药物时，它给药于上面提到的对象的治疗有效剂量是每千克体重至少10微克，在大多数情况下每天每千克体重的给药剂量不超过8mg左右，考虑到给药的疗程，症状等，最适宜的剂量是每日每千克体重从大约10微克至1毫克。

在此鉴定的每条DNA序列或是它的某一部分可通过许多方式用作多核苷酸试剂。该序列可用作在某些细胞类型中诊断某一特殊RNA存在的探针。另外，这些序列还可在基因连锁分析(多态现象)中用作探针。

本发明的序列在染色体分类中也是有价值的。该序列能特异性地瞄上某一人类染色单体上的某一特定位置并与之杂交。而且，确定染色体上的特殊位点也是一种现实的需要。目前所能得到的用于标记染色体定位的基于确切的序列数据(重复多态性)的染色体标记试剂极少。根据本发明的染色体cDNA图谱是在将那些序列和与疾病有关的基因关联起来的方面所迈出的重要的第一步。

简而言之，可通过从cDNA中制备PCR引物(最好是15-25bp)将这些序列定位于染色体上。cDNA的计算机分析被用来快速地选择与基因组DNA中不超过一个外显子配对的引物，因此不致于使扩增过程复杂化。这些引物然后被用来筛选含有人类染色体单体的体细胞杂合子。仅仅那些含有与该引物相符的人类基因的杂合子才能产生扩增的片段。

体细胞杂合子的PCR图谱是一种将某一特定DNA在某一特定染色体上定位的快速方法。使用与本发明相同的寡核苷酸引物，以来自于特殊染色体上的片段或大的基因组克隆文库为模板，以类似的方式可以完成亚定位。其它的染色体定位方法包括：原位杂交，用标记过的流选的染色体预筛选，以及通过与染色体特异性cDNA文库杂交的预挑选。

cDNA克隆对有丝分裂中期的染色体涂片的荧光原位杂交(FISH)可用来提供一种精确的一步染色体定位。这种技术可使用长度短到500或600bp的cDNA；然而，大于2000bp的克隆以其足够的供样品检测的信号强度使之结合于一个唯一的染色体位置的可能性大大增加了。FISH要求使用那些已能得出EST的克隆，而且越长越好。例如，2000bp是好的，4000bp更好，而考虑到合理的时间上的比例，超过4000bp对于获得好的结果就并非必要。作为对该技术的回顾，可见Verma et al.，Human Chromosome：a Manual of BasicTechniques，Pergamon Press，New york(1988)。

一旦某序列已精确定位于某一染色体位置，该序列在染色体上的物理位置就能与其基因图谱数据关联起来。(例如，这样的数据可见V.Mckusick，Mendelian Inheritancein Man，available on line through Johns Hopkins University Welch MedicalLibrary)。定位于相同染色体区域的基因与疾病之间的关系可以通过连锁分析(物理性相邻基因的伴随遗传)确定。

接着，有必要确定已感染与未感染个体间在cDNA或基因组序列间的差异。如果在一些或所有的已感染个体中都可观察到某一突变而在任一正常个体中均无发现，那么这个突变就很可能是引起疾病的因素。

根据目前的物理图谱和基因图谱技术所能得到的结果，一条精确定位于某一与某种疾病有关的染色体区域的cDNA，可能是50-500个潜在的有致病因素的基因中的一个(假设能定位于1Mbp上而每一基因长约20kb)。

已感染与未感染的个体的比较通常包括，首先寻找染色体中的结构变化，如可通过染色体涂片看见或可通过基于cDNA序列的PCR检出的缺失与易位。最后，要求对来自于数个个体的基因进行彻底的序列分析以肯定突变的存在并从多态现象中鉴别出这些突变。

本发明还利用反义技术在体内抑制血细胞生成成熟因子以减轻和/或消除它的刺激作用。通过三重螺旋的形成或反义DNA或RNA(两种方法都是以一条多核苷酸链与DNA或RNA的结合为基础)，反义技术能用来控制基因的表达。例如，为本发明的多肽编码的多核苷酸序列的5′编码部分，可用来设计一条长度为10-40bp的反义RNA寡核苷酸链。一条DNA寡核苷酸链可设计为与参与形成转录三重螺旋的基因的某一区域互补，见Lee et al，Nucl.Acids Res.，6：3037(1979)；Cooney et al.，Science，241：456(1988)；andDervan et al.，Science，251：1360(1991)，因而能阻止转录及血细胞生成成熟因子的产生。

反义RNA寡核苷酸在体内与mRNA杂交，阻止mRNA分子翻译成血细胞生成成熟因子(Okano，J.Neurochem.，56：560(1991)；Oligodeoxynucleotides as AntisenseInhibitors of Gene Expression，CRC Press，Boca Raton，FL(1988))。

另外，上述的寡核苷酸能用本领域公知的程序送入细胞内，使得反义RNA或DNA可能在体内表达，以上述的方式抑制血细胞生成成熟因子的产生。

血细胞生成成熟因子的反义构建物能刺激细胞生长，因而可能用于治疗某些疾病，如AIDS，因为阻止血细胞生成成熟因子可以控制T细胞的成熟。用这种方式，反义构建物还可以用来治疗贫血症。

该蛋白质，它的片段或其它衍生物，或它的类似物，或者是表达它们的细胞，能用作免疫原性物质来生产它们的抗体。这些抗体可以是，例如，多克隆的，单克隆的，嵌合的，单链形式的，以及Fab片段，或Fab表达文库的产物。各种本领域公知的方法都能被用来生产多克隆抗体。

与本发明的一段序列相对应的多肽的抗体的获得，可通过直接给动物注射该多肽或是给予这种多肽于动物(最好是非人类)来进行。这样获得的抗体能够与多肽本身结合。以这种方式，甚至仅编码该多肽的一个片段的序列也能用来生产能与整个天然多肽结合的抗体。然后这种抗体可用来从表达该多肽的组织中分离该多肽。而且，这种抗体对大量的多肽具有特异性，能被用来鉴定和分辨这种组织。

为了制备单克隆抗体，可能会用到一些依靠连续的细胞培养来生产抗体的技术。这样的例子包括：杂交瘤技术(Kohler and Milstein，1975，Nature，256：495-497)，三重杂交瘤技术，人类B细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.，1983，Immunology Today 4：72)，以及生产人单克隆抗体的EBV-杂交瘤技术(Cole，et al.，1985，in MonoclonalAntibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。

已知的用来生产单链抗体的技术(U.S.Patent 4,946,778)也适用于生产抗本发明的免疫原性多肽产物的单链形式的抗体。

这些抗体能用于涉及本发明的蛋白质序列的定位与活性的方法中，如在合适的生理性样品中显现这些蛋白质，测量其水平等。

对血细胞生成成熟因子有专一性的抗体还能用作拮抗剂来抑制该多肽的正常功能。以这种方式，这些抗体可用于治疗目的，例如，用它刺激细胞生长来治疗某些疾病如AIDS和贫血。

而且，这些抗体能用来检测血细胞生成成熟因子的存在与否，因而是血细胞生成和神经系统疾病的一种指示物。这些抗体能用来诊断与此有关的一些疾病。若一个疾病是先天性的，出生前的诊断将是特别有用的。

另外，本发明的多肽的一种拮抗剂可用来结合那些本发明的多肽正常地与之相结合的受体。拮抗剂类似于失活形式的该多肽，并且能以类似于生产专一性抗血细胞生成成熟因子的抗体的方法来生产。以这种方式，血细胞生成成熟因子的作用被阻止，而拮抗剂能用于治疗目的，以刺激细胞生长来治疗某些疾病，如AIDS。拮抗剂还能用于诊断目的，检测血细胞生成成熟因子的存在与否。

本发明将根据以下的实施例做进一步的描述；当然，应该明白本发明不局限于这些实施例。

为了使下面的实施例更加易于理解，在此对将出现的一些方法和专业术词作一些说明。

“质粒”的命名是以一小写的p开头，和/或后跟大写的字母和/或数字。在此的起始质粒既可通过商业途径获得，也可在不受限制的基础上公开得到，或者是根据已出版的方法从可得到的起始质粒开始构建。另外，与所述的等价的质粒是本领域公知的，并且对于本领域普通技术人员来说是明显的。

DNA的“消化”指的是DNA被限制性酶催化裂解，这些酶只在DNA的某一特定位点发生作用。在此所用的各种限制性酶都是可在市场上买到的，而且它们的使用条件，辅助因子以及其它的要求对于本领域普通技术人员都是已知的。若用于分析目的，典型地使用方法是，在20微升缓冲溶液中1微克的质粒或DNA片段要用2单位的酶。若用于从质粒的结构上分离DNA片段，典型的是在大的体系中用20-250单位的酶消化5-50微克的DNA。某一特定限制性酶的适宜的缓冲液和底物的量由生产厂家规定。通常所用的保温时间是在37℃1小时，但也可根据供应商的介绍来改变。消化反应完成之后可通过直接在聚丙烯酰胺凝胶中电泳来分离所要的DNA片段。

裂解片段的大小分离使用8％聚丙烯酰胺凝胶电泳完成，见Goeddle，D.et al.，Nucleic Acids Res.，8：4057(1980)。

“寡核苷酸”指的是能够用化学方法合成的单链多脱氧核苷酸或两条互补的多脱氧核苷酸链。这种合成的寡核苷酸没有5′磷酸基，因此若不在激酶存在时用ATP加上磷酸基，它将不能与另一条寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸能够连接上没有去磷酸化的片段。

“连接”指的是在两条双链核酸片段间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis，T.，etal.，Id.，p.146)。除非另外提供，连接反应的完成都是使用已知的缓冲液，反应条件是每0.5微克的接近等摩尔的待连接的DNA片段用10单位T4DNA连接酶(＂ligase＂)。实施例1血细胞生成成熟因子的表达与纯化

编码血细胞生成成熟因子的DNA序列(ATCC#75514)的初始扩增是使用与该DNA序列的5′和3′末端相配对的PCR寡核苷酸引物来合成插入片段。5′寡核苷酸引物的序列是GACTTCATGAAAAAGACAGATATCGCAATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTTGCGCAAGCTGCTTCTGACTCCCTGGTGGTGTGC其含有一个BspHI限制性酶切位点以及ompA引导序列，接着是血细胞生成成熟因子编码序列中甲硫氨酸起始密码子后的21个核苷酸；3′末端引物的序列是GACTAGATCTACGAAGAAAGACGGCTTTTC，其含有一个Bg1II位点以及血细胞生成成熟因子编码区的最后21个核苷酸。这些限制性酶切位点与细菌表达载体pQE-60(Qiagen Inc.，9259 Eton Ave.，Chatsworth，CA913311)上的限制性酶切位点相符合。质粒载体上含有编码抗生素抗性的基因(Amp^r)，一个细菌复制原点(Ori)，一个IPTG调节启动子/操纵子(P/O)，核糖体结合位点(RBS)，6-组氨酸标记(6-His)，以及限制性酶切克隆位点。pQE-60载体用NcoI和Bg1II消化，然后将插入片段连接到pQE-60载体上。pQE-60保持着从细菌RBS开始的读框。连接混合物转化大肠杆菌菌株m15/rep4(从Qiagen公司获得)，m15/rep4含有多拷贝的质粒pREP4，它能表达lac阻遏蛋白并有卡那霉素抗性(Kan^r)。根据转化子细菌能在含有Amp与Kan的LB培养基上生长的特性，鉴定出转化子。含有所要构建物的克隆在加有Amp(100微克/毫升)和Kan(25微克/毫升)的液体培养基中生长过夜(O/N)。用过夜培养物以1∶100至1∶250的比例接种，大量培养。细胞生长到吸光度为OD₆₀₀在0.4-0.6之间时，加入IPTG。IPTG诱导表达，灭活lac阻遏蛋白，清除P/O导致表达水平上升。细胞再生长3-4小时后，离心收获细胞。细胞沉淀溶解于离液剂6M盐酸胍，澄清之后，从溶液中用Ni离子螯合柱纯化血细胞生成成熟因子，所用的条件能允许含有6-His标记的蛋白质紧密结合在柱上(Hochuli，et al.，GeneticEngineering，Principle & Methods，12：87-98，Plenum Press，New York(1990))。用pH5.0，6M的盐酸胍将血细胞生成成熟因子(纯度95％)从螯合柱上洗脱下来。为了使蛋白复性，体系调节到3M的盐酸胍，100mM的磷酸钠，10mM的谷胱甘肽(还原型)和2mM谷胱甘肽(氧化型)。在此溶液中保温12小时以后，蛋白对50mM的磷酸钠透析。实施例2编码血细胞生成成熟因子的RNA在不同组织中的表达

为了分析血细胞生成成熟因子的表达模式，从人体的不同组织中分离出了RNA，在分离出总的RNA之后，用Poly T-亲和层析柱分离出含有Poly A的RNA。含Poly A的RNA(2微克)用变形凝胶层析分开后，转移到一块膜上，然后用放射性的血细胞生成成熟因子基因探针来杂交结合有Poly A RNA的膜，最后进行放射自显影。结果见图4。实施例3血细胞生成成熟因子与Hela细胞的生长抑制

Hela细胞培养于24孔板，密度分别为每孔10⁵(实验#1)或10⁴(实验#2和#3)个细胞。细胞生长于含有5％的胎牛血清并加有50units/ml的青霉素和50微克/ml的链霉素的DMEM(＂Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium)培养基(1ml)中。每个实验中为每一种浓度的血细胞生成成熟因子培养四孔。在培养1天之后加入血细胞生成成熟因子。3天之后细胞用胰酶处理并计数。见图5。

结果指出血细胞生成成熟因子抑制癌细胞的生长，因为Hela细胞是一种癌细胞。

根据以上的讲述，对本发明还可进行许多修饰与改进，而且，在以下权利要求的范围之内，本发明还可以别的方式实施而不仅限于以上的特殊的描述。

序列表(1)一般信息：(i)申请人：KIRKNESS，ET AL.(ii)发明名称：血细胞生成成熟因子(iii)序列数：2(iv)通讯地址：

(A)收信人：CARELLA，BYRNE，BAIN，GILFILLAN，

CECCHI，STEWART & OLSTEIN

(B)街道：6 BEKER FARM ROAD

(C)城市：ROSELAND

(D)州：新泽西州

(E)国家：美国

(F)邮编：07068(v)计算机可读形式：

(A)媒介类型：3.5寸软盘

(B)计算机：IBM PS/2

(C)操作系统：MS-DOS

(D)软件：WORD PERFECT 5.1(vi)本申请资料：

(A)申请号：

(B)申请日：

(C)分类：(vii)在先申请资料：

(A)申请号：08/187,186

(B)申请日：1994年1月25日(viii)律师/代理人信息

(A)姓名：FERRARO，GREGORY D.

(B)注册号：36，134

(C)案号/文档号：325800-143(ix)通讯信息：

(A)电话：201-994-1700

(B)电传：201-994-1744(2)SEQ ID NO：1的信息：(i)序列特征：

(A)长度：600碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴学性质：线性(ii)分子类型：cDNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：1AGACAGCGGA ACTAAGAAAA GAAGAGGCCT GTGGACAGAA CAATCATGTC TGACTCCCTT60GTGGTGTGCG AGGTAGACCC AGAGCTAACA GAAAAGCTGA GGAAATTCCG CTTCCGAAAA120GAGACAGACA ATGCAGCCAT CATAATGAAG GTGGACAAAG ACCGGCAGAT GGTGGTGCTG180GAGGAAGAAT TTCAGAACAT TTCCCCAGAG GAGCTCAAAA TGGAGTTGCC GGAGAGACAG240CCCAGGTTCG TGGTTTACAG CTACAAGTAC GTGCATGACG ATGGCCGAGT GTCCTACCCT300TTGTGTTTCA TCTTCTCCAG CCCTGTGGGC TGCAAGCCGG AACAACAGAT GATGTATGCA360GGGAGTAAAA ACAGGCTGGT GCAGACAGCA GAGCTCACAA AGGTGTTCGA AATCCGCACC420ACTGATGACC TCACTGAGGC CTGGCTCCAA GAAAAGTTGT CTTTCTTTCG TTGATCTCTG480GGCTGGGGAC TGAATTCCTG ATGTCTGAGT CCTCAAGGTG ACTGGGGACT TGGAACCCCT540AGGACCTGAA CAACCAAGAC TTTAAATAAA TTTTTAAATG CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA600(2)SEQ ID NO：2的信息：(i)序列特征：

(A)长度：142个氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：

(D)拓朴学性质：线性(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：2Met Ser Asp Ser Leu Val Val Cys Glu Val Asp Pro Glu LeuThr

5 1015Glu Lys Leu Arg Lys Phe Arg Phe Arg Lys Glu Thr Asp AsnAla

20 2530Ala Ile Ile Met Lys Val Asp Lys Asp Arg Gln Met Val ValLeu

35 4045Glu Glu Glu Phe Gln Asn Ile Ser Pro Glu Glu Leu Lys MetGlu

50 5560Leu Pro Glu Arg Gln Pro Arg Phe Val Val Tyr Ser Tyr LysTyr

65 7075Val His Asp Asp Gly Arg Val Ser Tyr Pro Leu Cys Phe IlePhe

80 8590Ser Ser Pro Val Gly Cys Lys Pro Glu Gln Gln Met Met TyrAla

95 100105Gly Ser Lys Asn Arg Leu Val Gln Thr Ala Glu Leu Thr LysVal

110 115120Phe Glu Ile Arg Thr Thr Asp Asp Leu Thr Glu Ala Trp LeuGln

125 130135Glu Lys Leu Ser Phe Phe Arg

140

Claims

1.一种分离的DNA序列，包括编码至少如图1中的DNA序列所编码的成熟多肽的DNA或者其任一等位突变体。

2.权利要求1的分离的DNA，其中的DNA包括图1中的至少编码图1中的成熟多肽的DNA及其等位突变体。

3.一种分离的RNA序列，包括与权利要求1中的DNA相对应的RNA和其等位突变体。

4.一种分离的DNA序列，包括至少编码与ATCC Deposit No.75514所含DNA编码的成熟多肽相同的成熟多肽的DNA序列和其等位突变体。

5.权利要求4的分离的DNA，其中所述的DNA包括ATCC Deposit No.75514所含的编码该成熟多肽的DNA。

6.一种分离的RNA序列，包括与权利要求4的DNA相对应的RNA。

7.一种包括权利要求1的DNA序列的表达载体。

8.一种包括权利要求4的DNA序列的表达载体。

9.一种多肽，包括由权利要求1的DNA所编码的氨基酸序列或者其活性片段，衍生物或功能类似物。

10.一种多肽，包括由权利要求4的DNA所编码的氨基酸序列或者其活性片段，衍生物或功能类似物。

11.一种多肽，包括由权利要求2的DNA所编码的氨基酸序列或者其活性片段，衍生物或功能类似物。

12.一种多肽，包括由权利要求5的DNA所编码的氨基酸序列或者其活性片段，衍生物或功能类似物。

13.一种生产多肽的方法，包括用权利要求1的DNA表达一种多肽。

14.一种抗权利要求9的多肽的抗体。

15.一种抗权利要求10的多肽的抗体。

16.用权利要求1的DNA工程化的细胞。

17.一种生产表达多肽的细胞的方法，包括：用权利要求1的DNA遗传工程化细胞。

18.一种抗权利要求9的多肽的拮抗剂。

19.一种治疗需要血细胞生成成熟因子的患者的方法，包括：给予患者治疗有效剂量的权利要求9的多肽。

20.一种治疗需要抑制血细胞生成成熟因子的患者的方法，包括：给予患者治疗有效剂量的权利要求18的拮抗剂。

21.一种能与权利要求1的DNA序列杂交的分离的DNA序列。

22.权利要求19的方法，其中给予患者治疗有效剂量的所说多肽是通过给患者提供编码所说多肽的DNA并在体内表达所说的多肽而进行。