CN103917655A - 核心蛋白聚糖组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及改进的核心蛋白聚糖组合物及其产生方法。在一个实施方案中，公开了通过下述来产生非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的方法：提供表达非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的宿主细胞；培养所述宿主细胞使得产生所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白；以及纯化所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白。

Description

核心蛋白聚糖组合物及其用途
发明领域
本发明涉及改进的核心蛋白聚糖组合物及其产生方法。
发明背景
携带一条或多条糖胺聚糖(GAG)链的蛋白聚糖形成一个大的基因家族，该家族根据核心蛋白的结构性质可被分成五组。其中一组是小的富亮氨酸的蛋白聚糖家族，该家族由核心蛋白聚糖(DCN)、双糖链蛋白聚糖、纤调蛋白聚糖和光蛋白聚糖组成。它们的特征在于40kDa的核心蛋白，该核心蛋白含有约12个氨基酸的富亮氨酸重复。DCN是该组的原型，并且也称为PG-S2、PG40、硫酸蛋白皮肤素(proteodermatan sulphate)和DS-PGII。它含有一条共价连接到成熟核心蛋白的丝氨酸的皮肤素硫酸软骨素GAG链，并被视为多功能的蛋白聚糖。
所提出的DCN功能包括但不限于调控胶原原纤维形成、通过与纤连蛋白和血小板反应蛋白结合而维持组织完整性以及作为转化生长因子β(TGF-β)的贮存器(reservoir)。DCN的后一功能通过其核心蛋白将细胞外环境中的生长因子与细胞表面上表达的受体相隔离而实现。
将核心蛋白聚糖输注到实验性啮齿动物脊髓损伤处已表明可抑制疤痕形成并促进轴突生长。核心蛋白聚糖也已在实验性鼠肿瘤模型中证实了具有抗肿瘤发生的特性并且能够抑制多种肿瘤细胞系的生长。对于核心蛋白聚糖基因，存在多种已知的选择性剪切转录变体。核心蛋白聚糖基因中的突变与先天性基质层角膜营养不良相关。
本领域需要的是改进的产生核心蛋白聚糖的方法，尤其是针对治疗性用途。
发明概要
本发明涉及改进的核心蛋白聚糖组合物及其产生方法。
因此，在一些实施方案中，本发明提供包含可操作地连接到编码核心蛋白聚糖的序列的异源信号肽的融合蛋白。在一些实施方案中，信号序列为α-乳白蛋白信号序列。在一些实施方案中，α乳白蛋白序列为牛α-乳白蛋白信号序列。在一些实施方案中，编码核心蛋白聚糖的序列编码核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位包含突变。在一些实施方案中，突变为丝氨酸到丙氨酸突变。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位不含糖胺聚糖分子的实质性修饰。
在一些实施方案中，本发明提供编码上述融合蛋白的载体。在一些实施方案中，载体包含编码α-乳白蛋白信号序列的核酸序列，所述α-乳白蛋白信号序列可操作地连接到编码核心蛋白聚糖核心蛋白的序列。
在一些实施方案中，本发明提供包含上述载体的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供产生非糖胺聚糖化(non-gagylated)核心蛋白聚糖核心蛋白的方法，包括：提供表达非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的宿主细胞；培养所述宿主细胞使得产生所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白；以及纯化所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些实施方案中，非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白分泌到用于培养所述宿主细胞的培养基中。在一些实施方案中，纯化包括将所述培养基与离子交换介质接触。在一些实施方案中，纯化包括将所述培养基与羟基磷灰石介质接触。在一些实施方案中，纯化包括将所述培养基与至少一种离子交换介质和至少一种羟基磷灰石介质按任何顺序接触。在一些实施方案中，纯化包括：将所述培养基与阳离子交换介质接触；洗涤所述阳离子交换介质；从所述阳离子交换介质中洗脱第一含核心蛋白聚糖的洗出液；将所述第一含核心蛋白聚糖的洗出液与羟基磷灰石介质接触；洗涤所述羟基磷灰石介质；从所述羟基磷灰石介质中洗脱第二含核心蛋白聚糖的洗出液。在一些实施方案中，阳离子交换介质为SP-琼脂糖FF。在一些实施方案中，羟基磷灰石介质为陶瓷羟基磷灰石I型。在一些实施方案中，方法还包括用离子交换膜或柱进一步纯化所述第二含核心蛋白聚糖的洗出液。在一些实施方案中，离子交换膜为Q离子交换膜。在一些实施方案中，方法还包括病毒灭活步骤。在一些实施方案中，病毒灭活步骤包括用表面活性剂处理。在一些实施方案中，表面活性剂为TritonX-100。在一些实施方案中，方法还包括病毒过滤步骤。在一些实施方案中，方法还包括浓缩所述核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白通过所述宿主细胞以约大于1、5或10pg/细胞/天的速率产生。
在一些实施方案中，本发明提供从含核心蛋白聚糖的培养基中纯化核心蛋白聚糖的方法，包括：将所述含核心蛋白聚糖的培养基与阳离子交换介质接触；洗涤所述阳离子交换介质；从所述阳离子交换介质中洗脱第一含核心蛋白聚糖的洗出液；将所述第一含核心蛋白聚糖的洗出液与羟基磷灰石介质接触；洗涤所述羟基磷灰石介质；从所述羟基磷灰石介质中洗脱第二含核心蛋白聚糖的洗出液；用离子交换膜过滤所述第二含核心蛋白聚糖的洗出液以提供含核心蛋白聚糖的滤液；处理所述滤液以除去病毒；以及从所述滤液中浓缩核心蛋白聚糖。
在一些实施方案中，本发明提供包含纯化的核心蛋白聚糖核心蛋白的组合物，所述核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位包含突变，使得所述核心蛋白聚糖蛋白基本上非糖胺聚糖化，所述组合物在所述组合物中包含少于约100ng残余宿主细胞蛋白/mg核心蛋白聚糖核心蛋白和少于约20pg残余宿主细胞DNA/mg核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些实施方案中，组合物在所述组合物中包含少于约5ng残余宿主细胞蛋白/mg核心蛋白聚糖核心蛋白和少于约5pg残余宿主细胞DNA/mg核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些实施方案中，将核心蛋白聚糖配制成水溶液。在一些实施方案中，水溶液包含pH为约6.5至约7.5的磷酸盐缓冲溶液。
附图简述
图1：核心蛋白聚糖表达基因序列(SEQ ID NO：8)。
图2：核心蛋白聚糖表达蛋白质序列(SEQ ID NO：4)。
图3：将活细胞浓度的积分相对于在整个15天的生物反应器运行中的核心蛋白聚糖产生作图。各运行的回归曲线的斜率对应于以皮克/细胞/天(p/c/d)表示的细胞产量。这两次运行的平均值为24.4p/c/d。一次运行的最大产量达到了约1.8g/L，而另一次运行达到了1.7g/L。
定义
为了有利于理解本发明，下文将定义多个术语。
如本文所用，术语“核心蛋白聚糖”是指具有与SEQ ID NO：4具有至少80％同一性的成熟蛋白质序列的蛋白质分子。
如本文所用，术语“核心蛋白聚糖核心蛋白”是指在成熟核心蛋白聚糖的第4位具有突变并且在第4位氨基酸基本上不含糖胺聚糖(GAG；即非糖胺聚糖化)修饰的核心蛋白聚糖蛋白分子。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指任何真核细胞(例如，哺乳动物细胞、禽类细胞、两栖动物细胞、植物细胞、鱼类细胞和昆虫细胞)，而不论是位于体外还是体内。
如本文所用，术语“细胞培养”是指细胞的任何体外培养。此术语包括传代细胞系(例如，具有永生化表型)、原代细胞培养、有限细胞系(例如，非转化细胞)以及任何其他体外维持的细胞群，包括卵母细胞和胚胎。
如本文所用，术语“载体”是指当与合适的控制元件相关时能够复制并且可在细胞之间转移基因序列的任何遗传元件，诸如质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体、病毒、病毒粒子等。因此，该术语包括克隆和表达运载体以及病毒载体。
如本文所用，术语“互补的”或“互补性”用于指代通过碱基配对原则相关的多核苷酸(即，核苷酸的序列)。例如，序列″5′-A-G-T-3″′与序列″3′-T-C-A-5″′互补。互补性可以是“部分的”，其中只有一些核酸的碱基根据碱基配对原则匹配。或者，也可在核酸之间存在“完全”或“总”互补性。核酸链之间的互补性程度对于核酸链之间的杂交效率和强度具有显著的影响。这在扩增反应以及依赖核酸之间的结合的检测方法中具有尤其重要的意义。
术语“同源性”和“百分比同一性”当相对于核酸使用时是指互补性程度。可以存在部分同源性(即，部分同一性)或完全同源性(即，完全同一性)。部分互补的序列是至少部分地抑制完全互补的序列与靶核酸序列杂交的序列，并指使用功能术语“基本上同源的”。完全互补序列与靶序列的杂交抑制可通过在低严格性条件下使用杂交测定(Southern或Northern印迹、液相杂交等)进行研究。基本上同源的序列或探针(即，能够与另一所关注的寡核苷酸杂交的寡核苷酸)将在低严格性条件下竞争并抑制完全同源的序列与靶序列的结合(即，杂交)。这并非是说，低严格性条件使得允许非特异性结合；低严格性条件要求两种序列彼此之间的结合为特异性(即，选择性)的相互作用。非特异性结合的不存在可通过使用甚至没有部分互补程度(例如，低于约30％的同一性)的第二靶标进行测试；在不存在非特异性结合的情况下，探针将不与第二非互补靶标杂交。
如本文所用的术语“可操作的组合”、“可操作的顺序”和“可操作地连接”是指核酸序列的连接方式使得产生能够指导给定基因的转录和/或所需蛋白质分子的合成的核酸分子。该术语还指氨基酸序列的连接方式使得产生功能性蛋白。
如本文所用，术语“信号序列”是指当可操作地连接到重组DNA序列时编码能够导致重组多肽分泌的信号序列的任何DNA序列。一般来讲，信号肽包含一系列约15至30个疏水性氨基酸残基(参见例如，Zwizinski等，J.Biol.Chem.255(16)：7973-77[1980]，Gray等，Gene39(2)：247-54[1985]和Martial等，Science205：602-607[1979])。此类分泌信号序列优选地衍生自编码以下多肽的基因：该多肽从靶向组织特异性表达的细胞类型分泌(例如，在乳腺分泌性细胞中表达和分泌的分泌乳蛋白)。然而，分泌性DNA序列不限于此类序列。也可以使用来自从许多细胞类型和生物分泌的蛋白质的分泌性DNA序列(例如，t-PA、血清白蛋白、乳铁蛋白和生长激素的分泌信号，以及编码诸如得自酵母、丝状真菌和细菌的分泌多肽的微生物基因中的分泌信号)。
如本文所用，术语“纯化的”是指从其正常环境中移除、分离或分开的核酸或氨基酸序列分子。“分离的核酸序列”因而是纯化的核酸序列。“基本上纯化的”分子至少60％不含、优选地至少75％不含并且更优选地至少90％不含与其通常相关的其他组分。
发明详述
本发明涉及改进的核心蛋白聚糖组合物及其产生方法，以及涉及核心蛋白聚糖用于治疗患者的用途。
核心蛋白聚糖
天然核心蛋白聚糖是具有附接的糖胺聚糖和90-140kD的平均分子量的糖蛋白。本发明设想产生重组的核心蛋白聚糖。在一些优选的实施方案中，核心蛋白聚糖是核心蛋白聚糖核心蛋白，即，基本上非糖胺聚糖化的核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，从N端起的第4位氨基酸)包含突变。在一些实施方案中，突变为丝氨酸到丙氨酸突变。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖核心蛋白与SEQ IDNO：1(成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少90％、95％、99％或100％同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，从N端起的第4位氨基酸)包含突变。
核心蛋白聚糖通常表达为前蛋白。本发明提供核心蛋白聚糖融合分子，其包含与核心蛋白聚糖前肽和成熟的肽序列可操作相关的异源信号序列。在一些实施方案中，异源信号多肽为α-乳白蛋白信号多肽。在一些实施方案中，α-乳白蛋白信号多肽为牛α-乳白蛋白信号多肽。在一些实施方案中，异源信号多肽与SEQ ID NO：2具有至少80％、90％或100％同一性。在一些实施方案中，前肽序列与SEQ ID NO：3具有至少80％、90％或100％同一性。在一些实施方案中，融合多肽的核心蛋白聚糖核心蛋白部分与SEQ ID NO：1(成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少90％、95％、99％或100％同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，从N端起的第4位氨基酸)包含突变。在一些实施方案中，融合蛋白与SEQ ID NO：4(信号前肽核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少80％、90％、95％、99％或100％同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，从N端起的第4位氨基酸)包含突变。
本发明还提供编码融合蛋白的核酸序列，以及包含核酸序列的载体。在一些实施方案中，异源信号多肽与SEQ ID NO：5具有至少80％、90％或100％同一性。在一些实施方案中，前肽序列与SEQ ID NO：6具有至少80％、90％或100％同一性。在一些实施方案中，融合多肽的核心蛋白聚糖核心蛋白部分与SEQ ID NO：7(成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少90％、95％、99％或100％同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，从N端起的第4位氨基酸)包含突变。在一些实施方案中，融合蛋白与SEQ ID NO：8(信号前肽核心蛋白聚糖核心蛋白)具有至少80％、90％、95％、99％或100％同一性，前提是核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白分子的第4位氨基酸(即，从N端起的第4位氨基酸)包含突变。
本发明的核心蛋白聚糖多核苷酸可用于通过重组技术产生核心蛋白聚糖多肽。因此，例如，可将多核苷酸包含在多种用于表达多肽的表达载体的任何一种中。在本发明的一些实施方案中，载体包括但不限于逆转录病毒载体、染色体、非染色体和合成DNA序列(例如，SV40的衍生物、细菌质粒、噬菌体DNA；杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒与噬菌体DNA的组合的载体，以及病毒DNA，诸如牛痘、腺病毒、禽痘病毒和伪狂犬病病毒)。设想了任何载体均可使用，只要在宿主中能够复制和存活即可。在一些优选的实施方案中，载体是美国专利号6,852,510和7,332,333以及美国专利公开号200402335173和20030224415中所述的逆转录病毒载体，所有这些专利均整体以引用方式并入本文。在一些尤其优选的实施方案中，载体为假型逆转录病毒载体。
具体地讲，本发明的一些实施方案提供包含如上文广泛描述的序列中的一种或多种(例如，SEQ ID NO：8)的重组构建体。在本发明的一些实施方案中，构建体包含已按正向或反向取向向其中插入了本发明序列的载体，诸如质粒或病毒载体。在另外其他实施方案中，通过翻译起始和终止序列，在合适的阶段组装异源结构序列(例如，SEQID NO：8)。在本发明的优选实施方案中，使用多种程序的任一种将合适的DNA序列插入载体。一般来讲，通过本领域已知的程序将DNA序列插入一个或多个合适的限制性内切酶位点。
大量合适的载体是本领域技术人员已知的并可商购获得。此类载体包括但不限于以下载体：1)细菌--pQE70、pQE60、pQE-9(Qiagen)、pBS、pD10、phagescript、psiX174、pbluescript SK、pBSKS、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A(Stratagene)；ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(Pharmacia)；2)真核细胞--pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、PXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPV、pMSG、pSVL(Pharmacia)；以及3)杆状病毒--pPbac和pMbac(Stratagene)。可以使用任何其他质粒或载体，只要它们能够在宿主中复制和存活即可。在本发明的一些优选实施方案中，哺乳动物表达载体包含复制起点、合适的启动子和增强子，以及还包含必要的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体及受体位点、转录终止序列和5′侧翼非转录序列。在其他实施方案中，衍生自SV40剪接体的DNA序列和多聚腺苷酸化位点可用于提供所需的非转录遗传元件。
在本发明的某些实施方案中，表达载体中的DNA序列可操作地连接到一个或多个合适的表达控制序列(启动子)以指导mRNA合成。可用于本发明的启动子包括但不限于LTR或SV40启动子、大肠杆菌(E.coli)lac或trp、噬菌体λPL和PR、T3和T7启动子以及巨细胞病毒(CMV)即刻早期、单纯性疱疹病毒(HSV)胸苷激酶和小鼠金属硫蛋白-I启动子，以及其他已知在原核或真核细胞或其病毒中控制基因表达的启动子。在本发明的其他实施方案中，重组表达载体包含复制起点和允许转化宿主细胞的选择性标记(例如，真核细胞培养的二氢叶酸还原酶或新霉素耐性，或大肠杆菌中的四环素或氨苄青霉素耐性)。
在本发明的一些实施方案中，高等真核细胞对编码本发明多肽的DNA的转录通过将增强子序列插入载体而增强。增强子是DNA的顺式作用元件，通常约10至300bp，作用于启动子以增强其转录。可用于本发明的增强子包括但不限于复制起点后侧bp100至270的SV40增强子、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点后侧多瘤病毒增强子以及腺病毒增强子。
在其他实施方案中，表达载体还包含用于转录起始的核糖体结合位点和转录终止子。在本发明的另外其他实施方案中，载体还可以包含用于扩增表达的合适序列。
在又一个实施方案中，本发明提供包含上述构建体的宿主细胞。在本发明的一些实施方案中，宿主细胞是高等真核细胞(例如，哺乳动物或昆虫细胞)。在本发明的其他实施方案中，宿主细胞是低等真核细胞(例如，酵母细胞)。在本发明的另外其他实施方案中，宿主细胞可以是原核细胞(例如，细菌细胞)。宿主细胞的具体实例包括但不限于：大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)以及假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)和葡萄球菌属(Staphylococcus)中的各个种，以及酿酒酵母(Saccharomycees cerivisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycees pombe)、果蝇(Drosophila)S2细胞、夜蛾(Spodoptera)Sf9细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴肾成纤维细胞COS-7系(Gluzman，Cell23：175[1981])、C127、3T3、293、293T、HeLa和BHK细胞系。
宿主细胞中的构建体可按常规方式使用以产生由重组序列编码的基因产物。在一些实施方案中，将构建体引入宿主细胞可通过以下方式完成：逆转录病毒转导、磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿孔(参见例如，Davis等[1986]Basic Methods in MolecularBiology)。作为另外一种选择，在本发明的一些实施方案中，本发明的多肽可通过常规的肽合成仪通过合成方法产生。
肽可在合适的启动子控制下在哺乳动物细胞、酵母、细菌或其他细胞中表达。无细胞的翻译系统也可用于使用衍生自本发明DNA构建体的RNA来产生此类蛋白质。与原核和真核宿主一起使用的合适的克隆和表达载体由Sambrook，等(1989)Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.进行了描述。
在本发明的一些实施方案中，在对合适的宿主株系进行转化并使宿主株系在培养基中生长到合适的细胞密度后，蛋白质得以分泌并将细胞再培养一段时间。在本发明的其他实施方案中，将细胞通常通过离心而收获，通过物理或化学手段破坏，并将所得的粗提取物保留用于进一步纯化。在本发明的另外其他实施方案中，用于蛋白质表达的微生物细胞可通过任何便利的方法破坏，包括冻融循环、超声处理、机械破坏或使用细胞裂解剂。
本发明还提供用于从重组细胞培养物中回收和纯化核心蛋白聚糖的方法，包括但不限于硫酸铵和乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水相互作用层析、亲和层析、羟基磷灰石层析和凝集素层析。在一些实施方案中，本发明提供用于纯化核心蛋白聚糖尤其是核心蛋白聚糖核心蛋白的改进方法。在一些实施方案中，该工艺包括两个柱层析步骤和精制步骤。
在一些优选的实施方案中，将阳离子交换层析用于从含有核心蛋白聚糖的培养基优选澄清培养基中捕获核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，阳离子交换层析介质为SP-琼脂糖FF。在一些实施方案中，将阳离子交换介质在约5至15mM磷酸钠，优选10mM磷酸钠和20至70mM NaCL，优选约50mM NaCL中在中性pH下平衡。在一些实施方案中，将含核心蛋白聚糖的培养基施加到阳离子交换介质后，对阳离子交换介质进行洗涤。在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含约5至15mM磷酸钠，优选10mM磷酸钠和20至70mM NaCL，优选约50mM NaCL。在一些实施方案中，然后从阳离子交换介质中洗脱核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，洗脱洗涤缓冲液包含约5至15mM磷酸钠，优选10mM磷酸钠和150至250mM NaCL，优选约200mM NaCL。
在一些实施方案中，将得自阳离子交换层析步骤的含核心蛋白聚糖的洗出液施加到羟基磷灰石介质。在一些实施方案中，羟基磷灰石介质为CHT1型。在一些实施方案中，将羟基磷灰石介质在约5至15mM磷酸钠，优选10mM磷酸钠和150至250mM NaCL，优选约200mM NaCL中平衡。在一些实施方案中，将含核心蛋白聚糖的培养基施加到羟基磷灰石介质后，对羟基磷灰石介质进行洗涤。在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含约5至15mM磷酸钠，优选10mM磷酸钠和150至250mM NaCL，优选约200mM NaCL。在一些实施方案中，然后从羟基磷灰石介质中洗脱核心蛋白聚糖。在一些实施方案中，洗脱洗涤缓冲液包含约0.2至0.4M磷酸钠，优选0.3M磷酸钠和150至250mM NaCL，优选约200mM NaCL。
在一些实施方案中，将得自羟基磷灰石层析步骤的含核心蛋白聚糖的洗出液进行缓冲液交换然后施加到离子交换膜。在一些实施方案中，离子交换膜为Q离子交换膜，例如Mustang Q离子交换介质。在一些实施方案中，将膜用约30mM至70mM Tris-HCl，优选约50mM Tris-HCl平衡。在一些实施方案中，在将含有核心蛋白聚糖的溶液施加到膜后，对膜进行洗涤，并且核心蛋白聚糖通过膜。在一些实施方案中，洗涤缓冲液包含约30mM至70mM Tris-HCl，优选约50mM Tris-HCl。在纯化后，优选地将核心蛋白聚糖浓缩到所需的浓度，例如通过流动过滤。
在本发明的其他实施方案中，对含有核心蛋白聚糖的溶液进行处理以将灭活或除去病毒。在一些实施方案中，对含有核心蛋白聚糖的溶液用表面活性剂处理以灭活病毒。在一些实施方案中，表面活性剂为Triton X-100。在一些实施方案中，表面活性剂处理步骤在阳离子交换层析步骤后进行。在一些实施方案中，对含有核心蛋白聚糖的溶液过滤以除去病毒。在一些实施方案中，将溶液通过病毒过滤器(例如，Virosart病毒过滤器)过滤。在一些实施方案中，过滤步骤在羟基磷灰石层析步骤后进行。
本发明的工艺优选地提供适于人患者临床应用的核心蛋白聚糖组合物。在一些实施方案中，组合物包含纯化的核心蛋白聚糖核心蛋白，该核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位包含突变，使得核心蛋白聚糖蛋白基本上非糖胺聚糖化。在一些实施方案中，组合物提供纯化的核心蛋白聚糖蛋白，并且组合物的特征在于在组合物中包含少于约100、50、20、10、5或2ng残余宿主细胞蛋白/mg核心蛋白聚糖核心蛋白和/或少于约20、10、5或2pg残余宿主细胞DNA/mg核心蛋白聚糖核心蛋白。在一些实施方案中，核心蛋白聚糖以水溶液提供。在一些实施方案中，水溶液为磷酸盐缓冲盐水(例如，10mM磷酸钠、150mM氯化钠)，而pH为约6.5至7.5，优选约7.0。
实验
实施例1
人核心蛋白聚糖突变形式的表达和产生优化
产生了核心蛋白聚糖突变形式的表达构建体。在成熟的核心蛋白聚糖的第4位氨基酸进行了丝氨酸到丙氨酸修饰。突变防止GAG附接到核心蛋白聚糖分子。表达构建体使用牛α-乳白蛋白信号肽代替内源信号肽进行蛋白产生和分泌。构建体在图7和图8中示出。
为了确认表达构建体导致了形成正确的蛋白质，使用工艺和上述基因构建体制备了CHO细胞系。产生了核心蛋白聚糖并进行了纯化。对纯化的蛋白质进行了N端氨基酸测序。所得的序列如下所示。
Asp-Glu-Ala-Ala-Gly-Ile-Gly-Pro-Glu-Val-Pro-Asp-Asp-Arg-Asp-Phe-Glu-Pro-Ser-Leu(SEQ ID NO：9)
该序列对应于成熟蛋白质的预期序列。如所预期并入丙氨酸突变，并将信号肽和前蛋白裂解产生正确的成熟核心蛋白聚糖N端序列。
使用生成了产生突变核心蛋白聚糖的克隆细胞系。通过筛选不同的培养条件选择了最高表达细胞系，并且建立了主细胞库。使用分批补料条件在两个10L生物反应器运行中研究了细胞系的产生。运行的结果在图9中示出。
实施例2
核心蛋白聚糖核心蛋白的纯化
1.0概述
以小规模开发了纯化方法，并将该方法应用于使用分批补料策略的在GMP环境中运行的一个200L批量。在第14天，在大约50％的存活水平下，收获了该批物料。在生物反应器的第14天(收获日期)，蛋白质浓度水平为1.240g/l。
1.1DCP合成中使用的组分
用于所有培养步骤的细胞培养基均为含有L-谷氨酰胺和0.1％Pluronic F68的HyClone(Logan，UT，USA)HyQ PF-CHO Liquid Soy(LS)。培养基收货状态为完整、无菌液体。HyQ PF-CHO LS是得自HyClone的专有无蛋白细胞培养基制剂。确切的成分未知，但是，HyClone的确持有按FDA要求编制的HyQ PF-CHO LS的无血清培养基II型设备文件(Type II Device File for Serum-Free Medium)(参考编号BBMF8302)。HyQ CellBoost R15.4是用于生产培养的得自HyClone的专有培养基补充剂制剂。
1.2DCP的产生
1.2.1200L生产培养接种的放大
每个传代培养步骤的详细信息在下文的“接种培养放大的处理步骤”表格中给出。生产批次09018通过在37℃的水浴中解冻批号为06005(182号小瓶)的MCB小瓶而开始。在对冷冻的MCB小瓶解冻后，将细胞加到单个含有35mL HyQ PF-CHO LS细胞培养基的摇瓶(250mL)(Thermo Fisher Scientific)中。使用血球计测定的初始细胞计数为2.25×105个细胞/mL和90.4％的存活率。然后将培养物置于维持在37℃、含5％CO2的潮湿环境中的培养箱内的轨道摇床(90rpm)上。传代培养步骤的目标是大约2.0×105个细胞/ml的接种密度。第3天摇瓶中的细胞计数和存活百分比为14.24×105个细胞/mL和95.8％，并将摇瓶传代培养到1L的摇瓶中。第3天1L摇瓶中的平均活细胞计数为23.43×105个细胞/mL，存活率为98.1％。将1L摇瓶以分别为1000mL和2.0×105个细胞/mL的初始培养体积和初始目标细胞密度传代培养到具有10L一次性摇袋(Wave Bag)的摇袋式生物反应器系统20EH(Wave Bioreactor System20EH)(GE Healthcare BioscienceBioprocess Corp，Somerset，NJ)。摇袋式生物反应器的操作设置为37.0℃的孵育温度、15.0cpm的摇臂速度、11.0°的摇摆角以及曝气中5.0％的CO2浓度，其中曝气流速为0.25L/分钟。在2天后，摇袋中的活细胞密度为10.28×105个细胞/ml，将新鲜的HyQ PF-CHO LS加入，使培养体积达到4992mL。三天后，活细胞密度为18.37×105个细胞/mL，并将摇袋中的体积转移到30L生物反应器中。30L生物反应器中温度、pH、溶解氧、压力和搅拌速率的操作设定点分别为37℃、40％的空气饱和度、1psig的压力和50rpm的搅拌速率。未启动pH控制器，从而让细胞自然偏向pH7。
缩写：VCC，活细胞计数
1.2.2200L生产生物反应器中的培养
最初，将137Kg HyQ PF-CHO LS细胞培养基和4.3Kg HyQ CellBoost R15.412％(重量/体积)溶液加到200L生物反应器中。生产培养的“第0天”被视为接种200L生物反应器的时间。
在培养的第二天，30L生物反应器中的活细胞密度为14.87×105个细胞/mL，其足以按2.00×105个细胞/mL的初始目标密度接种200L生物反应器。转移整个30L内容物，并且接种后重量、细胞密度和存活率分别为171.9Kg、2.90×105个细胞/mL和93.9％。200L生物反应器中温度、pH、溶解氧、压力和搅拌速率的操作设定点分别为37℃、pH7.0、40％的空气饱和度、1psig的压力和35rpm的搅拌速率。
在接种前，将pH死区最初设定在实际的pH值减去7.0。这是为了防备添加CO2，并让细胞自然偏向pH7.0。初始死区设置为0.32。接种后，每天检查pH，并将死区调节到实际的pH值减去7.0。在第1天，pH死区降至0.22，并且在第三天，将死区设为0.05并在接下来的运行中维持在该设置。
第一次进料在第2或3天当葡萄糖水平降到≤5g/l以下时进行，或默认在第3天进行。在第2天，葡萄糖水平降到5g/L以下，因而将另外4.4kg(L)12％重量/体积的HyQ Cell Boost R15.4+120mM的L-谷氨酰胺溶液加到生物反应器中。下一次进料在第4或5天当葡萄糖水平降到≤5g/L以下时进行。在第4天，葡萄糖水平降到5g/L以下，这引起另外进料9g/L(14.2L)12％重量/体积的HyQ Cell Boost R15.4溶液。在第5天，将温度从37℃降至31℃。从第6天到收获，每天检查葡萄糖水平，并且无论葡萄糖水平在哪一天降到≤5g/L以下，都添加20％的葡萄糖溶液以使得葡萄糖升高3g/L。在第8天和12天，葡萄糖水平分别降到4.84和4.98g/l。在第8天和12天，将2.9和3.0kg(L)20％的葡萄糖溶液加到了生物反应器中。
活细胞密度在第5天达到峰值，为61.00×105个细胞/mL，存活率为95.7％。在2009年11月3日(第14天)对生物反应器进行了收获，此时细胞存活率为50.2％，其中生物反应器的最终重量为191.8Kg。
生成了积分细胞数(ICN)，并针对蛋白质结果作图得到曲线，曲线的斜率给出14天运行的pcd(27.316)。
1.4上游生产概述
该批次在第14天在50.2％的存活率和1.240g/L的滴度下收获。将批料转移到下游，并且根据下游批加工记录进行纯化。
DCP200L下游纯化
1.3概述
将从200L批料中收获的物料如下文所述进行了纯化，得到42L最终体积中的211g(5mg/mL)。最终的原料药符合该批之前审核的规范。除非另外指明，否则所有浓度均通过吸光度测定。
1.4.澄清(2009年11月3日)
将收获的物料(189L)通过Cuno60M02Maximizer过滤器(2×16平方英尺)以5.9L/平方英尺的体积/面积比和3L/分钟的初始流速以及通过0.22μm10”Millipore Opticap过滤器过滤。将过滤器外壳用压缩空气吹扫以最大程度提高产物回收率。
表1澄清步骤的分析
*基于RP-HPLC的浓度。
1.5捕获-阳离子交换层析
将SP-琼脂糖FF(GE Healthcare)用于从澄清的培养基中捕获蛋白质。在捕获到柱上之前，将澄清的培养基稀释以降低电导率。该运行的条件与各种馏分的分析一起显示如下。将澄清的培养基作为两个子批次处理。
表2SP-琼脂糖柱参数
捕获-SP-琼脂糖子批次A
表3SP-琼脂糖工艺条件
表4SP-琼脂糖子批次A馏分
*该浓度使用RP-HPLC在预稀释下测定。
**通过反相HPLC测量
1.5.1捕获-SP-琼脂糖子批次B
表5SP-琼脂糖子批次B工艺条件
表6SP-琼脂糖子批次B馏分的分析
*该浓度使用RP-HPLC在预稀释下测定。
**通过反相HPLC测量
1.6病毒灭活
使用稀释到1％浓度的11％(重量/体积)Triton X-100，对两个SP-琼脂糖子批次单独进行病毒灭活。在CHT层析前，将体积在温和的混合下在室温下孵育60-90分钟。病毒灭活物料的后续加工在ISO7环境中进行。
表7病毒灭活详细信息
子批次A 子批次B
初始体积(L) 34.66 35.42
11％Triton添加体积(L) 3.47 3.54
最终体积(L) 38.14 38.98
孵育(分钟) 69 61
1.7中间体-陶瓷羟基磷灰石(CHT)层析
将CHT I型(BioRad)用于进一步从SP-琼脂糖混合物中的残余CHO蛋白中纯化DCP以及从灭活步骤除去Triton。该运行的条件与各种馏分的分析一起显示如下。将SP-琼脂糖混合物如上所述作为两个子批次进行处理。
表8CHT I型柱参数
1.7.1CHT子批次A
表9CHT工艺条件
表10CHT子批次A馏分
*该浓度在Triton灭活前从SP-琼脂糖混合物中测得。
**通过反相HPLC测量
1.7.2中间体-CHT子批次B
表11CHT子批次B工艺条件
表12CHT子批次B馏分的分析
*该浓度在Triton灭活前从SP-琼脂糖混合物中测得。
**通过反相HPLC测量
1.8CHT混合物的中间体缓冲液交换
将两种CHT混合物(47.8L)合并，并用等体积的水稀释，得到95.6L的总体积。使用0.6m2Prep/Scale TFF柱(Millipore)，10KMWCO将其浓缩约2倍得到约45L和约6.57mg/mL。再循环流速为5L/分钟，并且维持约20psi的背压(back pressure)。
然后将浓缩物针对7.9倍体积的25mM Tris-HCl pH7.5(55.5L)连续渗滤，并且缓冲液交换结束时的渗出液电导率经确认为＜5mS/cm(4.40mS/cm)。对过滤器洗涤，并将该洗涤液和浓缩物合并，经0.2μm过滤器过滤，然后在2-8℃下保存。
表13中间体缓冲液交换的馏分
*该浓度由合并得自两个CHT混合物的数据而确定。
1.9精制-Mustang Q过滤
以流穿模式进行了Mustang Q(Pall)步骤，其中任何结合的材料均被氯化钠剥离液洗脱。将缓冲液交换的混合物直接上样到经调节的Mustang Q膜。
表14Mustang Q膜参数
基质 Mustang Q(Pall)
过滤器 NP8
床体积(mL) 780
最大上样容量(g/mL过滤器体积) 0.5
上样 缓冲液交换的CHT混合物6.2mg/mL
流速 2.6L/分钟，3.33cv/分钟
实际上样量(mg/mL树脂) 0.32
表15Mustang Q工艺条件
表16Mustang Q馏分的分析
1.10病毒过滤
使用Virosart过滤器对Mustang Q混合物进行了病毒过滤。
表17病毒过滤器参数
过滤器 Virosart CPV(Sartorius)
过滤器大小(英寸) 10
过滤器面积(cm2) 7000
上样 Mustang Q混合物(4.75mg/mL-46L)
体积/面积比(mL/cm2) 6.6(31.2mg/cm2)
压力 30psi压缩氮气
在30psi氮气下将过滤器用3L注射用水(WFI)润湿。
使Mustang Q混合物在30psi氮气下通过过滤器。然后将过滤器用5L WFI冲洗。
表18病毒过滤馏分的分析
1.11浓缩和配制
将病毒滤液(48.0L)用2×0.6m2Prep/Scale TFF柱(Millipore)，10KMWCO进行了缓冲液交换浓缩。再循环流速为5L/分钟，并维持20psi的进料压力。
将病毒滤液针对6.9倍体积的10mM磷酸钠、150mM氯化钠(pH7.0)连续渗滤，得到48.5L的最终体积。然后将该大批物料浓缩到约40L，再将柱用2.4L10mM磷酸钠、150mM氯化钠(pH7.0)冲洗，以除去任何剩余的蛋白质。将此冲洗液与浓缩物混合，并且浓度经测定为5.0g/L(42.2L总体积)。然后将最终的大批物料用0.2μm过滤器过滤到袋子中。
表19配制样品的分析
*通过QC测量
2步骤回收率表
下表显示了用于该批纯化的每个步骤的步骤回收率。注意：这些值未考虑病毒验证取样。
表20配制样品的分析
在上述说明书中提到的所有出版物和专利以引用方式并入本文。本发明的所述方法和系统的各种修改形式和变型形式将在不脱离本发明范围和精神的情况下对本领域的技术人员显而意见。虽然已结合具体优选实施方案对本发明进行了描述，但是应当理解，受权利要求保护的本发明不应不当地限于此类具体实施方案。实际上，对本发明领域内的技术人员显而易见的对实践本发明的所述模式的各种修改旨在包括在以下权利要求的范围内。

Claims (31)

1.一种产生非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的方法，包括：
提供表达非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白的宿主细胞；
培养所述宿主细胞使得产生所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白；以及
纯化所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白分泌到用于培养所述宿主细胞的培养基中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述纯化包括将所述培养基与离子交换介质接触。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述纯化包括将所述培养基与羟基磷灰石介质接触。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述纯化包括将所述培养基与至少一种离子交换介质和至少一种羟基磷灰石介质按任何顺序接触。
6.根据权利要求2所述的方法，其中所述纯化包括：
将所述培养基与阳离子交换介质接触；
洗涤所述阳离子交换介质；
从所述阳离子交换介质中洗脱第一含核心蛋白聚糖的洗出液；
将所述第一含核心蛋白聚糖的洗出液与羟基磷灰石介质接触；
洗涤所述羟基磷灰石介质；
从所述羟基磷灰石介质中洗脱第二含核心蛋白聚糖的洗出液。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述阳离子交换介质为SP-琼脂糖FF。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述羟基磷灰石介质为陶瓷羟基磷灰石I型。
9.根据权利要求6所述的方法，还包括用离子交换膜或柱进一步纯化所述第二含核心蛋白聚糖的洗出液。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述离子交换膜为Q离子交换膜。
11.根据权利要求6所述的方法，还包括病毒灭活步骤。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述病毒灭活步骤包括用表面活性剂处理。
13.根据权利要求2所述的方法，其中所述表面活性剂为TritonX-100。
14.根据权利要求6所述的方法，还包括病毒过滤步骤。
15.根据权利要求6所述的方法，还包括浓缩所述核心蛋白聚糖。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述非糖胺聚糖化核心蛋白聚糖核心蛋白通过所述宿主细胞以约大于1、5或10pg/细胞/天的速率产生。
17.一种从含核心蛋白聚糖的培养基中纯化核心蛋白聚糖的方法，包括：
将所述含核心蛋白聚糖的培养基与阳离子交换介质接触；
洗涤所述阳离子交换介质；
从所述阳离子交换介质中洗脱第一含核心蛋白聚糖的洗出液；
将所述第一含核心蛋白聚糖的洗出液与羟基磷灰石介质接触；
洗涤所述羟基磷灰石介质；
从所述羟基磷灰石介质中洗脱第二含核心蛋白聚糖的洗出液；
用离子交换膜过滤所述第二含核心蛋白聚糖的洗出液以提供含核心蛋白聚糖的滤液；
处理所述滤液以除去病毒；
从所述滤液中浓缩核心蛋白聚糖。
18.一种包含纯化的核心蛋白聚糖核心蛋白的组合物，所述核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位包含突变，使得所述核心蛋白聚糖蛋白基本上非糖胺聚糖化，所述组合物在所述组合物中包含少于约100ng残余宿主细胞蛋白/mg核心蛋白聚糖核心蛋白和少于约20pg残余宿主细胞DNA/mg核心蛋白聚糖核心蛋白。
19.根据权利要求18所述的组合物，所述组合物在所述组合物中包含少于约5ng残余宿主细胞蛋白/mg核心蛋白聚糖核心蛋白和少于约5pg残余宿主细胞DNA/mg核心蛋白聚糖核心蛋白。
20.根据权利要求18所述的组合物，其中将所述核心蛋白聚糖配制成水溶液。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述水溶液包含pH为约6.5至约7.5的磷酸盐缓冲溶液。
22.一种融合蛋白，其包含可操作地连接到编码核心蛋白聚糖的序列的异源信号肽。
23.根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述信号序列为α-乳白蛋白信号序列。
24.根据权利要求23所述的融合蛋白，其中所述α乳白蛋白序列为牛α-乳白蛋白信号序列。
25.根据权利要求22所述的融合蛋白，其中所述编码核心蛋白聚糖的序列编码核心蛋白聚糖核心蛋白。
26.根据权利要求25所述的融合蛋白，其中所述核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位包含突变。
27.根据权利要求26所述的融合蛋白，其中所述突变为丝氨酸到丙氨酸突变。
28.根据权利要求25所述的融合蛋白，其中所述核心蛋白聚糖核心蛋白在成熟的核心蛋白聚糖核心蛋白的第4位不含糖胺聚糖分子的实质性修饰。
29.一种编码根据权利要求22所述的融合蛋白的载体。
30.根据权利要求29所述的载体，其中所述载体包含编码α-乳白蛋白信号序列的核酸序列，所述α-乳白蛋白信号序列可操作地连接到编码核心蛋白聚糖核心蛋白的序列。
31.一种包含根据权利要求29所述的载体的宿主细胞。
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