CN114990088A

CN114990088A - 烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌与nmn的制备方法

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Publication number: CN114990088A
Application number: CN202210729684.3A
Authority: CN
Inventors: 张钊; 魏玮; 张西平; 张学军; 周西高; 裴中立; 何海伦
Original assignee: ZHONGSHI DUQING (SHANDONG) BIOTECH CO Ltd
Current assignee: ZHONGSHI DUQING (SHANDONG) BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2022-06-24
Filing date: 2022-06-24
Publication date: 2022-09-02
Anticipated expiration: 2042-06-24
Also published as: CN114990088B

Abstract

本发明提供了一种烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌与NMN的制备方法，属于生物工程技术领域，所述烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.11所示，该烟酰胺核糖激酶突变体显著提高了烟酰胺核糖激酶的酶催化活性，更加耐受高底物浓度，稳定性更高。本发明利用该烟酰胺核糖激酶突变体酶法合成β‑烟酰胺单核苷酸，显著提高了合成β‑烟酰胺单核苷酸的产量和转化率，缩短转化时间，且获得的β‑烟酰胺单核苷酸纯度高，同时反应条件温和、合成方法简便、对环境友好，且该制备方法得到的β‑烟酰胺单核苷酸抗衰老活性显著，具有广阔的工业化应用的前景。

Description

烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌与NMN的制备方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，尤其涉及一种烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌与NMN的制备方法。

背景技术

β-烟酰胺单核苷酸(简称NMN)是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶NAD⁺)的关键前体之一，体内体外及临床试验证明NMN具有抗衰老作用，特别是哈佛医学院DavidSinclair教授研究发现22个月大的小鼠(相当于人类60岁)服用β-烟酰胺单核苷酸一周后，生理指标恢复到6个月状态(相当于人类20岁)，并延长了30％的寿命，令世人惊奇。此外，NMN对胰岛素的分泌也能起到调节作用，对mRNA的表达水平也有影响。因而以NMN为活性成分的功能性保健食品或药物有着很大的开发潜力和市场前景。

传统的NMN的生产是采用化学合成，然而化学合成磷酸化特异性不高，导致产品中杂质过多，分离纯化极其困难，总体收率很低，同时有机溶剂使用量大，造成严重的环境污染、成本高。因而，目前NMN主要采用生物酶法来制备。

NMN的生物酶法制备主要有两条途径：第一条是以D-核糖和烟酰胺为起始原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶和烟酰胺磷酸核糖转移酶等的作用下，经过三步催化反应得到NMN；该条路线底物转化率不高(以烟酰胺计算，最高不超过50％)，且中间产物较多，后续分离纯化较困难，因而总体收率偏低，导致生产成本高。第二条路线是以烟酰胺核糖(NR)为起始原料，在烟酰胺核糖激酶(NRkinase，NrK)和ATP的作用下，一步反应得到NMN，收率高，但是目前烟酰胺核糖激酶催化活性低，导致转化时间、转化率降低，且烟酰胺核糖激酶生产NMN的研究较少，限制了其在NMN工业化生产中的应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供了一种烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌与NMN的制备方法，该烟酰胺核糖激酶突变体的酶活性显著提高，更加耐受高底物浓度，稳定性更高，显著提高NMN的转化率，缩短转化时间。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种烟酰胺核糖激酶突变体，所述烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。

本发明提供了一种编码上述烟酰胺核糖激酶突变体的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。

本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括上述的核苷酸序列。

优选的，所述的表达载体为pET 28a(+)。

本发明提供了一种含有上述烟酰胺核糖激酶突变体、核苷酸序列或上述表达载体的重组菌。

优选的，所述重组菌的出发菌株为大肠杆菌。

本发明提供了一种上述烟酰胺核糖激酶突变体、核苷酸序列、表达载体或重组菌在催化合成β-烟酰胺单核苷酸中的应用。

本发明提供了一种催化合成β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，包括如下步骤：

将上述的重组菌进行种子培养和发酵培养，得到含烟酰胺核糖激酶的发酵液，在发酵液中加入含有烟酰胺核糖和三磷酸腺苷二钠的反应液，得到转化液后，催化转化，即得β-烟酰胺单核苷酸。

优选地，所述转化液的pH为6.5～7.0，所述转化温度为28～30℃，所述转化时间为6～8小时。

本发明提供一种上述制备方法得到的β-烟酰胺单核苷酸在制备抗衰老产品中的应用。

相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：

本发明提供了一种烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌与NMN的制备方法，该烟酰胺核糖激酶突变体显著提高了烟酰胺核糖激酶的酶催化活性，更加耐受高底物浓度，稳定性更高。本发明利用该烟酰胺核糖激酶突变体酶法合成β-烟酰胺单核苷酸，显著提高了合成β-烟酰胺单核苷酸的产量和转化率，缩短转化时间，且获得的β-烟酰胺单核苷酸纯度高，同时反应条件温和、合成方法简便、对环境友好，且该制备方法得到的β-烟酰胺单核苷酸抗衰老活性显著，具有广阔的工业化应用的前景。

附图说明

图1为β-烟酰胺单核苷酸标准品的HPLC色谱图；

图2为β-烟酰胺单核苷酸样品的HPLC色谱图；

图3为不同样品处理组斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度典型图。

具体实施方式

本发明提供了烟酰胺核糖激酶突变体，所述烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNo.10所示。

在本发明中，所述烟酰胺核糖激酶(NRK1)来源于酿酒酵母Saccharomycescerevisiae S288C，所述烟酰胺核糖激酶氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，本发明通过对烟酰胺核糖激酶氨基酸序列进行突变，所述烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列与氨基酸序列SEQ ID No.1相比，在SEQ ID No.1的氨基酸序列中第121位赖氨酸突变成天冬酰胺和第201位谷氨酸突变成天门冬氨酸，获得更高酶活性的烟酰胺核糖激酶突变体如SEQ IDNo.10所示。

本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括上述的核苷酸序列。在本发明中所述的表达载体优选为pET 28a(+)。

在本发明中，所述重组菌的出发菌株优选为大肠杆菌，所述大肠杆菌优选地包括大肠杆菌BL21(DE3)。

将上述的重组菌进行种子培养和发酵培养，得到含烟酰胺核糖激酶的发酵液，在发酵液中加入含有烟酰胺核糖和三磷酸腺苷二钠的转化液，催化转化，即得β-烟酰胺单核苷酸。

在本发明中，将上述的重组菌进行种子培养和发酵培养，得到含烟酰胺核糖激酶的发酵液。

在本发明中，所述种子培养包括斜面培养和种子扩大培养，所述斜面培养方法包括：向种子培养基接入烟酰胺核糖激酶及其其突变体重组菌，接种量体积为1～3％，35～38℃培养13～16h，使其生长至对数生长期，获得含有烟酰胺核糖激酶及其其突变体的种子培养基；所述种子培养基优选为酵母提取物6g/L、大豆肽12g/L、NaCl 9g/L、琼脂20g/L；所述种子扩大培养方法包括：分别向含有烟酰胺核糖激酶及其其突变体的种子培养基加入5～7mL无菌水，用接种环将斜面上菌种刮洗到无菌水中，得到含有烟酰胺核糖激酶及其其突变体的洗脱种子液，分别接入到含有种子扩大培养基的三角瓶中进行扩大培养，接种量为0.9～1.1mL/100mL，搅拌速度为200～240rpm，培养时间为10～11h，检测OD₆₀₀在4.5～5.5时停止扩大培养，即得烟酰胺核糖激酶或其突变体种子扩大培养液。所述种子扩大培养基优选含量成分为：大豆肽16g/L、酵母浸粉8g/L、无水甘油5g/L、胰蛋白胨11g/L、KH₂PO₄1.31g/L、K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L。

在本发明中，所述发酵培养分为发酵培养前期和发酵培养后期，所述发酵培养的培养基包括大豆肽2g/L、胰蛋白胨10g/L、甘油8g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、(NH₄)₂SO₄2.5 g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 9.82g/L、KH₂PO₄3.0g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 15.13g/L。所述发酵培养后期即为补料培养期，所述补料培养基包括酵母浸粉75g/L，胰蛋白胨31.25g/L，甘油500g/L。在本发明中，所述发酵培养的温度优选为30～40℃，进一步地，所述发酵培养前期优选为35～40℃，所述发酵培养后期优选为30～34℃；所述发酵培养的通气量优选为0.9～1.5vvm；所述发酵培养的搅拌转速优选为400～800rpm；所述发酵的溶氧量优选为≥20％，所述发酵培养的pH值优选为6.5～7.0。在本发明中，在发酵培养后期时，当OD₆₀₀达到20～25时，降温至诱导温度25～28℃，加入0.1～0.5mM的IPTG，继续发酵14～16h，破壁、收集，即得含烟酰胺核糖激酶的发酵液。所述破壁的方式优选为采用碱性蛋白酶破壁。所述收集方式优选为采用离心机进行固液分离(转速为3000转/分钟)，收集上清液。

在本发明中，得到含烟酰胺核糖激酶的发酵液后，在发酵液中加入含有烟酰胺核糖和三磷酸腺苷二钠的反应液，得到转化液后，催化转化，即得β-烟酰胺单核苷酸。在本发明中，所述反应液优选地由如下含量的成分组成：磷酸氢二钾90～110mM、六水合氯化镁45～55mM、二水合氯化钙15～25mM、氯化钾90～110mM、四水合氯化锰0.003～0.007mM，三磷酸腺苷二钠90～110mM、烟酰胺核糖90～110mM。在本发明中，所述转化液的pH优选为6.5～7.0，所述转化温度优选为28～30℃，所述转化时间优选为6～8小时。本发明采用上述催化合成方法得到的β-烟酰胺单核苷酸产量、转化率和纯度显著提高，本发明采用HPLC检测转化液中NMN浓度，NMN浓度达32.06g/L，转化率为96.2％。

本发明还提供了一种上述制备方法得到的β-烟酰胺单核苷酸在制备抗衰老产品中的应用。

在本发明中，所述产品包括药物或食品。在本发明中，所述药物包括活性成分β-烟酰胺单核苷酸以及药学上可接受的载体。在本发明中，所述载体包括赋形剂、甜味剂、稳定剂、稀释剂、崩解剂等，如淀粉、糊精、硫酸钙、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化钠、葡萄糖、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯胶浆、羧甲基纤维素钠、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠、甲基纤维素、乙基纤维素、玉米淀粉、硬脂酸盐、硼酸、液体石蜡、聚乙二醇、抗坏血酸等中的一种或多种。在本发明中，所述药物的剂型可以为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、滴丸剂、丸剂、粉剂、冻干粉针剂、溶液剂、混悬剂、乳剂或膜剂等。本发明中的药物给药途径可为口服、鼻腔、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、腹腔注射和皮内注射等。在本发明中，所述活性成分β-烟酰胺单核苷酸的含量为0.1～99％。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

一种烟酰胺核糖激酶突变体重组菌的构建方法，具体步骤如下：

(1)烟酰胺核糖激酶重组菌的构建

以酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae S288C来源的烟酰胺核糖激酶(NRK1)(GenBank：NM_001182967)为初始模板进行构建，其中，所述烟酰胺核糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

对烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列进行密码子优化，两端添加相应的酶切位点，所述优化后的烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。所述的酶切位点为NcoI和XhoI，优化后序列委托苏州金唯智生物科技有限公司进行人工全合成。

以上述优化后的烟酰胺核糖激酶的核苷酸序列设计上、下游引物：

上游引物(nkase-NcoI-F):5’-CCATGGGCATGACCAGCAAGA-3’(SEQ ID No.4)；

下游引物(nkase-Xhol-R):5’-CTCGAGTTAATCTTTGCACAC-3’(SEQ ID No.5)；

利用上述引物进行PCR反应，反应条件：95℃预变性1min，然后30个循环(95℃10s，50℃～65℃12s，72℃22s)，72℃再延伸5min。PCR反应完毕后，经进行凝胶回收、验证和纯化PCR反应后的产物以及pET 28a(+)质粒的DNA溶液组成Ncol和Xhol(购于Takara生物技术有限公司)酶切反应体系进行酶切修饰，酶切条件为37℃温度下酶切反应5min，然后进行回收酶切产物，然后与含DNA连接酶的溶液混合均匀，在15℃循环水浴中反应过夜。DNA过夜连接完毕后，将10μL连接产物全部加入50μL刚融化的大肠杆菌Trans5α感受态细胞(购自Takara生物技术有限公司)中，混匀后置于冰上冰浴30min；然后将其快速转移至恒温水浴锅中，42℃热激95s；随后取出转化混合物置于冰上2min后，于超净台中加入400μL无菌的无抗LB培养基，放至37℃、200rpm恒温摇床中复苏1h；分别取100μL复苏后的菌液均匀地涂布在两个卡那霉素抗性的LB固体培养基的培养平板上，37℃恒温培养16h；在转化后的两个平板上各挑单克隆菌落，接入含卡那抗性的1mL LB液体培养基中，然后37℃、200rpm恒温摇8.5h，以该菌液作为PCR模板进行PCR验证，进行验证阳性克隆获得蔗糖磷酸化酶克隆菌株pET 28a(+)-nkase。

选取阳性克隆菌液，接种于含卡那抗性的5mL LB液体培养基中，37℃、200rpm恒温摇菌10h后提取重组质粒。然后分别取1μL重组质粒和1μLpET28a(+)质粒加入两管50μL刚融化的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自Takara生物技术有限公司)中，混匀后置于冰上冰浴18min；随后将其快速转移至恒温水浴锅中，42℃热激15s，再从恒温水浴锅中取出转化混合物置于冰上3min后，于超净台中分别加入500μL无菌的无抗LB培养基，放至37℃、200rpm恒温摇床中复苏50min；取100μL复苏后的菌液均匀地涂布在含100μg/mL的卡那霉素的LB固体培养基培养平板上，37℃恒温培养箱中培养10h。挑取实验组平板上的单克隆菌落至含卡那抗性的1mL LB液体培养基中，于37℃、200rpm恒温摇菌12h后进行菌液PCR验证获得阳性表达菌株pET 28a(+)-nkase-BL21(DE3)。

(2)烟酰胺核糖激酶突变体重组菌的构建

对烟酰胺核糖激酶的氨基酸序列SEQ ID No.1的第121位赖氨酸(Lys121)突变成天冬酰胺(Asn)和第201位谷氨酸(Glu201)突变成天门冬氨酸(Asp)，设计两对突变引物，其引物设计如下：

K121N(Lys→Asn)

K121N上游：5’-ATTAATGACGACAACTACGAAGTGGTGATTG-3’(SEQ ID No.6)

K121N下游：5’-CAATCACCACTTCGTAGTTGTCGTCATTAAT-3’(SEQ ID No.7)

E201D(Glu→Asp)

E201D上游：5’-AACGGCGATGTGGACGGCCTGCTGGATCCG-3’(SEQ ID No.8)

E201D下游：5’-CGGATCCAGCAGGCCGTCCACATCGCCGTT-3’(SEQ ID No.9)

利用上述K121N和E201D引物，以烟酰胺核糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示为模板，对进行PCR反应，反应条件：95℃预变性1min，然后30个循环(95℃10s，50℃～65℃12s，72℃22s)，72℃再延伸5min。PCR反应完毕后，经进行凝胶回收、验证和纯化PCR反应后的产物以及pET 28a(+)质粒的DNA溶液组成Ncol和Xhol(购于Takara生物技术有限公司)酶切反应体系进行酶切修饰，酶切条件为37℃温度下酶切反应5min，然后进行回收酶切产物，然后与含DNA连接酶的溶液混合均匀，在15℃循环水浴中反应过夜。DNA过夜连接完毕后，将10μL连接产物全部加入50μL刚融化的大肠杆菌Trans5α感受态细胞(购自Takara生物技术有限公司)中，混匀后置于冰上冰浴30min；然后将其快速转移至恒温水浴锅中，42℃热激95s；随后取出转化混合物置于冰上2min后，于超净台中加入400μL无菌的无抗LB培养基，放至37℃、200rpm恒温摇床中复苏1h；分别取100μL复苏后的菌液均匀地涂布在两个卡那霉素抗性的LB固体培养基的培养平板上，37℃恒温培养16h；在转化后的两个平板上各挑单克隆菌落，接入含卡那抗性的1mL LB液体培养基中，然后37℃、200rpm恒温摇8.5h，以该菌液作为PCR模板进行PCR验证，进行验证阳性克隆获得蔗糖磷酸化酶克隆菌株pET 28a(+)-nkase-1。

选取阳性克隆菌液，接种于含卡那抗性的5mL LB液体培养基中，37℃、200rpm恒温摇菌10h后提取重组质粒。然后分别取1μL重组质粒和1μLpET28a(+)质粒加入两管50μL刚融化的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(购自Takara生物技术有限公司)中，混匀后置于冰上冰浴18min；随后将其快速转移至恒温水浴锅中，42℃热激15s，再从恒温水浴锅中取出转化混合物置于冰上3min后，于超净台中分别加入500μL无菌的无抗LB培养基，放至37℃、200rpm恒温摇床中复苏50min；取100μL复苏后的菌液均匀地涂布在含100μg/mL的卡那霉素的LB固体培养基培养平板上，37℃恒温培养箱中培养10h。挑取实验组平板上的单克隆菌落至含卡那抗性的1mL LB液体培养基中，于37℃、200rpm恒温摇菌12h后进行菌液PCR验证获得阳性表达菌株pET 28a(+)-nkase-1-BL21(DE3)，并对阳性表达酶蛋白的氨基酸序列进行测定，烟酰胺核糖激酶突变体氨基酸序列和核苷酸序列如下：

烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示：

MTSKKVILVALSGCSSSGKTTIAKLTASLFTKATLIHEDDFYKHDNEVPVDAKYNIQNWDSPEALDFKLFGKELDVIKQTGKIATKLIHNNNVDDPFTKFHIDRQVWDELKAKYDSINDDNYEVVIVDGFMIFNNTGISKKFDLKILVRAPYEVLKKRRASRKGYQTLDSFWVDPPYYFDEFVYESYRANHAQLFVNGDVDGLLDPRKSKNIKEFINDDDTPIAKPLSWVCQEILKLCKD。

烟酰胺核糖激酶突变体的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示：

CCATGGGCATGACCAGCAAGAAGGTAATCCTGGTGGCGCTGAGCGGCTGCAGCAGCAGCGGCAAGACTACTATTGCGAAACTGACCGCGAGCCTGTTTACCAAAGCGACCCTGATTCATGAAGATGATTTCTACAAGCATGATAACGAAGTGCCGGTGGATGCGAAATATAACATTCAGAACTGGGATAGCCCGGAAGCGCTGGATTTCAAGCTGTTCGGGAAGGAACTGGATGTGATTAAACAGACCGGCAAGATAGCAACCAAACTGATTCATAACAACAACGTGGATGATCCGTTTACCAAATTTCATATTGATCGCCAGGTGTGGGATGAACTGAAAGCGAAATATGATAGCATTAATGACGACAACTACGAAGTGGTGATTGTGGATGGCTTTATGATATTCAATAATACCGGCATTAGCAAGAAGTTCGACCTGAAGATCTTAGTGCGCGCGCCGTATGAAGTGCTGAAGAAGCGTAGGGCGAGCCGCAAAGGCTATCAGACCCTGGATAGCTTCTGGGTCGATCCGCCGTATTATTTCGACGAGTTTGTGTATGAAAGCTATCGCGCGAACCATGCGCAGCTGTTTGTGAACGGCGATGTGGACGGCCTGCTGGATCCGCGCAAGTCCAAGAACATTAAGGAGTTCATCAATGACGACGACACTCCCATAGCCAAACCGCTGAGCTGGGTGTGCCAGGAAATTCTGAAACTGTGCAAAGATTAACTCGAG。

其中，烟酰胺核糖激酶突变体的核苷酸序列中划线的部分分别为NcoI酶切位点和XhoI酶切位点。

本实施例通过上述方法成功构建了烟酰胺核糖激酶突变体重组菌，为后续的发酵生产奠定了基础。

实施例2

烟酰胺核糖激酶(野生型)和烟酰胺核糖激酶突变体发酵液的制备

1)斜面培养

采用斜面培养的方式进行种子培养，向种子培养基分别接入实施例1制备得到的烟酰胺核糖激酶或其突变体重组菌，接种量体积为2％，37℃培养15h，使其生长至对数生长期，分别获得含有烟酰胺核糖激酶或其突变体种子培养基；所述种子培养基为酵母提取物6g/L、大豆肽12g/L、NaCl 9g/L、琼脂20g/L。

2)种子扩大培养

分别向含有烟酰胺核糖激酶或其突变体种子培养基中加入6mL无菌水，用接种环将斜面上菌种刮洗到无菌水中，得到含有烟酰胺核糖激酶或其突变体种子培养基洗脱种子液，分别接入到含有种子扩大培养基三角瓶中进行扩大培养，接种量为1mL/100mL，搅拌速度为220rpm，培养时间为10.5h，检测OD₆₀₀在5左右时停止扩大培养，即得烟酰胺核糖激酶或其突变体种子扩大培养液；

所述种子扩大培养基为：大豆肽16g/L、酵母浸粉8g/L、无水甘油5g/L、胰蛋白胨11g/L、KH₂PO₄1.31g/L、K₂HPO₄·3H₂O 16.43g/L。

3)发酵培养

以7L发酵罐5L装液量为例，培养基灭菌后当温度降至60℃时，将卡那霉素按50mg/L加入培养基中，混合即得发酵培养基；所述培养基为：大豆肽2g/L、胰蛋白胨10g/L、甘油8g/L、一水合柠檬酸2.1g/L、(NH₄)₂SO₄2.5g/L、柠檬酸铁铵0.3g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 9.82g/L、KH₂PO₄3.0 g/L、Na₂HPO₄·12H₂O 15.13g/L、消泡剂(PPE)1.5mL；

所述补料培养基为酵母浸粉75g/L，胰蛋白胨31.25g/L，甘油500g/L；

发酵培养方法如下：

将步骤2)获得的烟酰胺核糖激酶或其突变体种子扩大培养液分别按接种量：100mL/5L(2.0％)接入发酵培养基中，37℃培养，发酵培养的pH值一直控制在6.8左右，通气量开始时为1vvm，3h后增至1.2vvm，罐压为0.055Mpa，搅拌转速开始时为500rpm，3h后增至700rpm，在发酵2h后溶氧快速下降，5h左右溶氧快速上升，此时开始补料，使溶氧控制在30％左右，补料开始1.5h后缓慢降温至32℃左右，当OD600达到20～25时，再降温至诱导温度27℃，加0.3mM IPTG，诱导后继续发酵15h后，加入200U/mL碱性蛋白酶进行破壁处理，3000转/分钟离心收集上清液，即可分别得到含烟酰胺核糖激酶或其突变体的发酵液。

烟酰胺核糖激酶(野生型)和烟酰胺核糖激酶突变体酶活测试：

取1mL烟酰胺核糖激酶或其突变体的发酵液于1.5mL小离心管中，然后经12000rpm离心3min，弃上清液，然后加入1mL酶活测试液(测试液组成：Tris-HCl 100mM、六水合氯化镁5mM、烟酰胺核糖10mM、ATP15mM，pH7.0。)，并使菌体分散均匀，然后置于盖紧盖子，置于三角瓶于振荡摇床中进行反应，做3个平行样。反应条件为温度35℃、转速200转/分、时间60min。反应完毕后，再经12000rpm离心3min，吸取50μL上清液于1.5mL小离心管中，再加入950μL 10％甲醇水溶液进行稀释并离心、0.45μm膜过滤得到酶活测试HPLC分析样品液，然后根据NMN含量的检测方法进行检测NMN浓度，结果见表1。

表1烟酰胺核糖激酶或其突变体的发酵液的酶活性、NMN转化率结果

重组菌发酵液类型	酶活(NMN浓度/g/L)	转化率(％)
			野生型	2.085	62.4％
烟酰胺核糖激酶突变体	3.081	92.2％

由表1的结果表明，本发明的烟酰胺核糖激酶突变体的发酵液中的酶活性显著提高，在温度35℃、转速200转/分、转化60min后，将烟酰胺核糖转化为NMN的转化率为92.2％。

实施例3

一种催化合成β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，具体步骤如下：

本实施例的反应液由如下含量成分组成：100mM磷酸氢二钾、50mM六水合氯化镁、20mM二水合氯化钙、100mM氯化钾、0.005mM四水合氯化锰，100mM三磷酸腺苷二钠、100mM烟酰胺核糖。

将100mM磷酸氢二钾、50mM六水合氯化镁、20mM二水合氯化钙、100mM氯化钾、0.005mM四水合氯化锰，100mM三磷酸腺苷二钠、100mM烟酰胺核糖依次加入到含烟酰胺核糖激酶突变体的发酵液中，并充分溶解，然后用4M氢氧化钠溶液将转化液pH值调整至6.7，温度调整至29℃，转速为100转/分，进行生物催化制备NMN，转化7小时后，得到NMN。

采用HPLC检测转化液中NMN浓度，其中，色谱柱：Agilent SB-C185μm4.6×150mm，洗脱程序：梯度洗脱，初始流速：0.8mL/min，分析时间：12min，检测波长：260nm，进样体积：5μL，柱温：25℃，流动相A为0.1％三氟乙酸(TFA)：准确l量取1mLTFA于1000mL去离子水中超声脱气15min后作为流动相A，流动相B为HPLC级甲醇，对照溶液：精密称取50mg NMN标准品于100mL容量瓶中，用去离子水溶解并定容至刻度。所述梯度洗脱程序如表2所示。

表2梯度洗脱程序

时间(min)	流动相A(％)	流动相B(％)
			0	100	0
3	100	0
			5.3	80	20
6.6	80	20
			8.6	80	20
9	100	0
			12	100	0

由图1和2可知，HPLC检测的NMN的保留时间为3.625min，采用烟酰胺核糖激酶突变体酶催化合成的NMN纯度高达99.95％以上，NMN浓度达32.06g/L，转化率96.2％。

实施例4

本实施例的反应液由如下含量成分组成：90mM磷酸氢二钾、55mM六水合氯化镁、15mM二水合氯化钙、110mM氯化钾、0.003mM四水合氯化锰，90mM三磷酸腺苷二钠、90mM烟酰胺核糖。

将90mM磷酸氢二钾、55mM六水合氯化镁、15mM二水合氯化钙、110mM氯化钾、0.003mM四水合氯化锰，90mM三磷酸腺苷二钠、90mM烟酰胺核糖依次加入到含烟酰胺核糖激酶突变体的发酵液中，并充分溶解，然后用4M氢氧化钠溶液将转化液pH值调整至6.5，温度调整至30℃，转速为100转/分，进行生物催化制备NMN，转化6小时后，得到NMN。

实施例5

本实施例的反应液由如下含量成分组成：110mM磷酸氢二钾、45mM六水合氯化镁、25mM二水合氯化钙、90mM氯化钾、0.007mM四水合氯化锰，110mM三磷酸腺苷二钠、110mM烟酰胺核糖。

将110mM磷酸氢二钾、45mM六水合氯化镁、25mM二水合氯化钙、90mM氯化钾、0.007mM四水合氯化锰，110mM三磷酸腺苷二钠、110mM烟酰胺核糖依次加入到含烟酰胺核糖激酶突变体的发酵液中，并充分溶解，然后用4M氢氧化钠溶液将转化液pH值调整至7.0，温度调整至28℃，转速为100转/分，进行生物催化制备NMN，转化8小时后，得到NMN。

实施例6

NMN抗衰老活性评价：

6.1仪器、耗材与试剂

解剖显微镜(SZX7，OLYMPUS，Japan)；CCD相机(VertA1，上海土森视觉科技有限公司，China)；精密电子天平(CP214，OHAUS，USA)；6孔板(NestBiotech，China)。

过氧化氢(批号G2023089，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)；细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(货号C0602，碧云天生物，China)；甲基纤维素(批号B2006074，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，China)；组织细胞固定液；4％组织细胞固定液(批号20201216，北京索莱宝科技有限公司，China)。

由实施例3制备得到的NMN，均用标准稀释水配制成20.0mg/mL母液，现用现配。

阳性对照：过氧化氢酶，棕色液体，批号K2010330，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，-20℃避光储存。用超纯水配制成200mg/mL母液，-20℃避光储存。

6.2实验动物

斑马鱼均饲养于28℃的养鱼用水中(水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为450～550μS/cm；pH为6.5～8.5；硬度为50～100mg/LCaCO₃)，实验动物使用许可证号为：SYXK(浙)2012-0171。饲养管理符合国际AAALAC认证(认证编号：001458)的要求。

野生型AB品系斑马鱼，以自然成对交配繁殖方式进行。年龄为6hpf的斑马鱼用于样品β-半乳糖苷酶活性抑制功效评价。

6.3.检测方法

随机选取6hpf野生型AB品系斑马鱼于6孔板中，每孔(实验组)均处理30尾斑马鱼。分别水溶给予NMN(浓度见表3)，阳性对照过氧化氢酶2000μg/mL浓度，同时设置正常对照组和模型对照组，每孔容量为3mL。除正常对照组外，其余各实验组均水溶给予过氧化氢建立斑马鱼衰老模型。样品与过氧化氢共同处理至5dpf后，将斑马鱼用4％组织细胞固定液固定过夜，用β-半乳糖苷酶染色试剂盒进行染色。染色结束后，每个实验组随机选取10尾斑马鱼置于解剖显微镜下拍照并保存图片，利用NIS-Elements D 3.20高级图像处理软件进行图像分析并采集数据，分析统计斑马鱼整体β-半乳糖苷酶染色强度，以该指标的统计学分析结果评价样品对衰老模型斑马鱼β-半乳糖苷酶活性抑制功效。统计学处理结果采用mean±SE表示。用SPSS26.0软件进行统计学分析，p<0.05表明差异具有统计学意义。

结果见表3所示。

表3不同样品处理组斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度实验结果

注：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。

由表3表明，模型对照组斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度(53102像素)与正常对照组(46561像素)比较p<0.01，表明模型建立成功。阳性对照过氧化氢酶2000μg/mL浓度组斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度为49312像素，与模型对照组比较p<0.05，对斑马鱼β-半乳糖苷酶活性抑制功效为58％，说明过氧化氢酶具有β-半乳糖苷酶活性抑制功效。

NMN 500、1000和2000μg/mL浓度组斑马鱼β-半乳糖苷酶染色强度分别为46309、44632和44521像素，β-半乳糖苷酶活性抑制功效分别为103.8％、129.5％和131.2％，与模型对照组比较，分别为p＜0.05、p＜0.01、p＜0.01，提示NMN在上述浓度条件下对过氧化氢诱发的斑马鱼衰老模型具有β-半乳糖苷酶活性抑制功效。

由图3的结果表明，NMN的浓度为500、1000和2000μg/mL时，β-半乳糖苷酶染色强度显著降低，且具有浓度依赖性。

综上所述，本发明制备得到的NMN具有抗衰老的活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中食都庆（山东）生物技术有限公司

<120> 烟酰胺核糖激酶突变体及其重组菌与NMN的制备方法

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Thr Ser Lys Lys Val Ile Leu Val Ala Leu Ser Gly Cys Ser Ser

1 5 10 15

Ser Gly Lys Thr Thr Ile Ala Lys Leu Thr Ala Ser Leu Phe Thr Lys

20 25 30

Ala Thr Leu Ile His Glu Asp Asp Phe Tyr Lys His Asp Asn Glu Val

35 40 45

Pro Val Asp Ala Lys Tyr Asn Ile Gln Asn Trp Asp Ser Pro Glu Ala

50 55 60

Leu Asp Phe Lys Leu Phe Gly Lys Glu Leu Asp Val Ile Lys Gln Thr

65 70 75 80

Gly Lys Ile Ala Thr Lys Leu Ile His Asn Asn Asn Val Asp Asp Pro

85 90 95

Phe Thr Lys Phe His Ile Asp Arg Gln Val Trp Asp Glu Leu Lys Ala

100 105 110

Lys Tyr Asp Ser Ile Asn Asp Asp Lys Tyr Glu Val Val Ile Val Asp

115 120 125

Gly Phe Met Ile Phe Asn Asn Thr Gly Ile Ser Lys Lys Phe Asp Leu

130 135 140

Lys Ile Leu Val Arg Ala Pro Tyr Glu Val Leu Lys Lys Arg Arg Ala

145 150 155 160

Ser Arg Lys Gly Tyr Gln Thr Leu Asp Ser Phe Trp Val Asp Pro Pro

165 170 175

Tyr Tyr Phe Asp Glu Phe Val Tyr Glu Ser Tyr Arg Ala Asn His Ala

180 185 190

Gln Leu Phe Val Asn Gly Asp Val Glu Gly Leu Leu Asp Pro Arg Lys

195 200 205

Ser Lys Asn Ile Lys Glu Phe Ile Asn Asp Asp Asp Thr Pro Ile Ala

210 215 220

Lys Pro Leu Ser Trp Val Cys Gln Glu Ile Leu Lys Leu Cys Lys Asp

225 230 235 240

<210> 2

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgacttcga aaaaagtgat attagttgca ttgagtggat gctcctccag tggtaagacg 60

acaattgcga aacttacagc aagtttattc acgaaggcta cattaattca tgaagatgac 120

ttttacaaac atgataatga agtgccagta gatgctaaat ataacattca aaattgggat 180

tcgccagaag ctcttgattt taaacttttc ggtaaagaat tagatgtgat caaacaaact 240

ggtaaaatag ccaccaaact tatacacaat aacaacgtag atgatccctt tacaaagttc 300

cacattgata gacaagtttg ggacgagtta aaggctaagt atgactctat taatgacgac 360

aaatatgaag ttgtaattgt agatgggttt atgattttca ataatactgg aatatcaaaa 420

aaatttgatt tgaagatatt agtgcgtgct ccctatgaag tactaaaaaa aaggagggct 480

tccagaaaag gataccagac tttggattct ttctgggtgg atccgccgta ttatttcgac 540

gaatttgtgt atgaatctta tcgtgcaaat catgcgcagt tatttgttaa tggagacgta 600

gaaggtttac tagacccaag gaagtcaaag aatataaaag agttcataaa tgatgatgac 660

actccaattg cgaaaccttt aagctgggtg tgccaagaga ttctaaagct ttgtaaggat 720

tag 723

<210> 3

<211> 737

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatgggcat gaccagcaag aaggtaatcc tggtggcgct gagcggctgc agcagcagcg 60

gcaagactac tattgcgaaa ctgaccgcga gcctgtttac caaagcgacc ctgattcatg 120

aagatgattt ctacaagcat gataacgaag tgccggtgga tgcgaaatat aacattcaga 180

actgggatag cccggaagcg ctggatttca agctgttcgg gaaggaactg gatgtgatta 240

aacagaccgg caagatagca accaaactga ttcataacaa caacgtggat gatccgttta 300

ccaaatttca tattgatcgc caggtgtggg atgaactgaa agcgaaatat gatagcatta 360

atgacgacaa gtacgaagtg gtgattgtgg atggctttat gatattcaat aataccggca 420

ttagcaagaa gttcgacctg aagatcttag tgcgcgcgcc gtatgaagtg ctgaagaagc 480

gtagggcgag ccgcaaaggc tatcagaccc tggatagctt ctgggtcgat ccgccgtatt 540

atttcgacga gtttgtgtat gaaagctatc gcgcgaacca tgcgcagctg tttgtgaacg 600

gcgatgtgga aggcctgctg gatccgcgca agtccaagaa cattaaggag ttcatcaatg 660

acgacgacac tcccatagcc aaaccgctga gctgggtgtg ccaggaaatt ctgaaactgt 720

gcaaagatta actcgag 737

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccatgggcat gaccagcaag a 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcgagttaa tctttgcaca c 21

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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caatcaccac ttcgtagttg tcgtcattaa t 31

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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<210> 10

<211> 240

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Thr Ser Lys Lys Val Ile Leu Val Ala Leu Ser Gly Cys Ser Ser

1 5 10 15

Ser Gly Lys Thr Thr Ile Ala Lys Leu Thr Ala Ser Leu Phe Thr Lys

20 25 30

Ala Thr Leu Ile His Glu Asp Asp Phe Tyr Lys His Asp Asn Glu Val

35 40 45

Pro Val Asp Ala Lys Tyr Asn Ile Gln Asn Trp Asp Ser Pro Glu Ala

50 55 60

Leu Asp Phe Lys Leu Phe Gly Lys Glu Leu Asp Val Ile Lys Gln Thr

65 70 75 80

Gly Lys Ile Ala Thr Lys Leu Ile His Asn Asn Asn Val Asp Asp Pro

85 90 95

Phe Thr Lys Phe His Ile Asp Arg Gln Val Trp Asp Glu Leu Lys Ala

100 105 110

Lys Tyr Asp Ser Ile Asn Asp Asp Asn Tyr Glu Val Val Ile Val Asp

115 120 125

Gly Phe Met Ile Phe Asn Asn Thr Gly Ile Ser Lys Lys Phe Asp Leu

130 135 140

Lys Ile Leu Val Arg Ala Pro Tyr Glu Val Leu Lys Lys Arg Arg Ala

145 150 155 160

Ser Arg Lys Gly Tyr Gln Thr Leu Asp Ser Phe Trp Val Asp Pro Pro

165 170 175

Tyr Tyr Phe Asp Glu Phe Val Tyr Glu Ser Tyr Arg Ala Asn His Ala

180 185 190

Gln Leu Phe Val Asn Gly Asp Val Asp Gly Leu Leu Asp Pro Arg Lys

195 200 205

Ser Lys Asn Ile Lys Glu Phe Ile Asn Asp Asp Asp Thr Pro Ile Ala

210 215 220

Lys Pro Leu Ser Trp Val Cys Gln Glu Ile Leu Lys Leu Cys Lys Asp

225 230 235 240

<210> 11

<211> 737

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ccatgggcat gaccagcaag aaggtaatcc tggtggcgct gagcggctgc agcagcagcg 60

gcaagactac tattgcgaaa ctgaccgcga gcctgtttac caaagcgacc ctgattcatg 120

aagatgattt ctacaagcat gataacgaag tgccggtgga tgcgaaatat aacattcaga 180

actgggatag cccggaagcg ctggatttca agctgttcgg gaaggaactg gatgtgatta 240

aacagaccgg caagatagca accaaactga ttcataacaa caacgtggat gatccgttta 300

ccaaatttca tattgatcgc caggtgtggg atgaactgaa agcgaaatat gatagcatta 360

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ttagcaagaa gttcgacctg aagatcttag tgcgcgcgcc gtatgaagtg ctgaagaagc 480

gtagggcgag ccgcaaaggc tatcagaccc tggatagctt ctgggtcgat ccgccgtatt 540

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acgacgacac tcccatagcc aaaccgctga gctgggtgtg ccaggaaatt ctgaaactgt 720

gcaaagatta actcgag 737

Claims

1.一种烟酰胺核糖激酶突变体，其特征在于，所述烟酰胺核糖激酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID No.10所示。

2.编码权利要求1所述烟酰胺核糖激酶突变体的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求2所述的核苷酸序列。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pET 28a(+)。

5.含有权利要求1所述烟酰胺核糖激酶突变体、权利要求2所述的核苷酸序列或权利要求3或4所述表达载体的重组菌。

6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌的出发菌株为大肠杆菌。

7.权利要求1所述烟酰胺核糖激酶突变体、权利要求2所述的核苷酸序列、权利要求3或4所述表达载体或权利要求5或6所述重组菌在催化合成β-烟酰胺单核苷酸中的应用。

8.一种催化合成β-烟酰胺单核苷酸的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

将权利要求5或6所述的重组菌进行种子培养和发酵培养，得到含烟酰胺核糖激酶的发酵液，在发酵液中加入含有烟酰胺核糖和三磷酸腺苷二钠的反应液，得到转化液后，催化转化，即得β-烟酰胺单核苷酸。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述转化液的pH为6.5～7.0，所述转化温度为28～30℃，所述转化时间为6～8小时。

10.权利要求8或9所述制备方法得到的β-烟酰胺单核苷酸在制备抗衰老产品中的应用。