CN112501098B - 具有降解苯丙氨酸能力的工程益生菌 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有降解苯丙氨酸能力的工程益生菌的构建方法，包括以下步骤：以具有L‑苯丙氨酸解氨酶基因表达能力的大肠杆菌Nissle 1917为底盘菌，增强精氨酸合成途径。本发明构建的工程益生菌能够用于治疗苯丙酮尿症。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种具有降解苯丙氨酸能力的工程益生菌及其构建方法。
背景技术
苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种先天性的苯丙氨酸代谢障碍疾病。在中国，PKU在新生儿中的发病率大概在1/11000，PKU患儿出生若不及时诊治，将会出现高苯丙酸血症。
苯丙酮尿症是因肝脏苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase，PAH)缺乏或四氢生物喋呤合成酶、二氢生物喋呤还原酶突变导致。PAH主要是在肝脏中表达，可将苯丙氨酸转化为酪氨酸，从而合成甲状腺、肾上腺和黑色素等。PAH突变，导致苯丙氨酸在肝脏中出现代谢紊乱，无法转化为酪氨酸，而是苯丙氨酸与α-酮戊二酸在血液与组织中堆积并被排泄到尿液中，另外，其代谢产物在中枢神经中蓄积会产生毒性，从而诱发患儿出现兴奋不安、多动和精神异常等。
苯丙氨酸作为人体必需氨基酸之一，主要从食物中获取，对于PKU患儿不能无苯丙氨酸饮食，所以目前对PKU患儿的唯一治疗方法就是采取低苯丙氨酸饮食。另外，目前也有一些针对PKU治疗的策略尚在实验阶段，例如，通过体外重组表达具有苯丙氨酸降解能力的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lase，stlA)，通过口服蛋白降低血液中苯丙氨酸，但缺点是直接口服蛋白易被肠道内的消化酶分解。科学家也在尝试基因疗法，将携带表达PAH基因的cDNA重组腺病毒置于小鼠体内，以恢复肝脏PAH活性，但目前主要存在转运效率低的问题。
发明内容
益生菌是一大类药物，主要通过口服活菌制剂达到治疗疾病和康复保健效果。益生菌药物制剂的优点在于给药方便，口感一般较好，病人乐于接受，顺从性高，更重要的是能够持续地在肠道内增殖从而稳定地发挥治疗作用。
大肠杆菌属E.coli Nissle 1917(简写为EcN)是一种非致病性大肠杆菌，是1917年从一次志贺菌痢大爆发时未出现腹泻的士兵的粪便中分离得到的。EcN是非乳酸益生菌中研究最多的益生菌，血清型为O6：K5：H1，具有独特的基因组、半粗糙O6-脂多糖(LPS)表型、K5型荚膜、3种不同的菌毛(F1A、F1C和卷曲菌毛)。EcN具有小菌素和铁摄取系统等特殊适应性因子，在与其他微生物竞争中起关键作用。EcN能长期稳定定植于肠道，与肠上皮细胞相互作用，被广泛用于预防传染性腹泻、炎性肠疾病如溃疡性结肠炎和克罗恩病，防止新生儿消化道内病原菌定殖等，和发挥免疫调节生物学功能。
为了寻求新的苯丙酮尿症治疗药物，发明人利用基因工程技术来改造大肠杆菌Nissle1917(EcN)，使其对苯丙氨酸具有降解能力，构建出了一株经动物实验证明具有治疗苯丙酮尿症效果的工程益生菌。具体而言，本发明包括如下技术方案：
一种提高大肠杆菌Nissle 1917降解苯丙氨酸能力的方法，包括以下步骤：
A.以具有L-苯丙氨酸解氨酶基因表达能力的大肠杆菌Nissle 1917为底盘菌，增强精氨酸合成途径。
上述增强精氨酸合成途径(或称“精氨酸强化途径”)的步骤可以为：失活基因argR并且/或者进行argA抗反馈抑制突变。
在一种实施方式中，上述argA抗反馈抑制突变优选为Y19C突变。
上述方法还可以包括以下步骤：
B.使底盘菌表达L-苯丙氨酸内运蛋白基因。
进一步地，上述方法还可以包括以下步骤：
C.使底盘菌表达L-氨基酸脱氨酶基因。
在一种优选的实施方式中，上述步骤A、B和C可以通过基因编辑技术实施，所述基因编辑采用CRISPR-Cas9系统、CRISPR-Cpf1系统、CRISPR-Cas相关的转座系统INTEGRATE系统或者CAST系统。
上述INTEGRATE系统是指Sam Sternberg研究组开发的基因编辑工具(Insertionof transposable elements by guide RNA-assisted targeting，引导RNA辅助靶向的转座元件插入)；CAST系统是指张锋研究组开发的基因编辑工具(CRISPR-associatedtransposase，CRISPR相关转座酶)。
优选地，上述方法中，所述L-苯丙氨酸解氨酶(Genbank号KGM29850.1)基因是stlA，核苷酸序列为SEQ ID NO:1；
所述L-苯丙氨酸内运蛋白(Genbank号QPA14453.1)基因是pheP，核苷酸序列为SEQID NO:2；
所述L-氨基酸脱氨酶(Genbank号AAA86752.1)基因是pma，核苷酸序列为SEQ IDNO:3。
上述方法中，所述具有L-苯丙氨酸解氨酶基因比如stlA表达能力的大肠杆菌Nissle1917的基因型是：EcN(malP::Pj23119-stlA)。由于EcN是E.coli Nissle1917的缩写，故其中的EcN也可表示为Nissle 1917，即该菌株基因型也可以表示为Nissle 1917(malP::Pj23119-stlA)。
根据本发明的第二个方面，提供了一种基因工程菌，其为具有降解苯丙氨酸能力的工程益生菌，其按照上述的方法构建。
优选地，该工程益生菌的基因型是：EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP,agaI::Pj23119-pheP,araBD::Para-pma,△dapA)，本文中命名为TYS009；或者
EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP,agaI::Pj23119-pheP,araBD::Para-pma,△dapA,argA*,△argR)，本文中命名为TYS010。其中argA*尤其是指Y19C突变，可表示为argAmut(Y19C)。
相比工程益生菌TYS009，工程益生菌TYS010进一步强化了精氨酸合成途径。
根据本发明的第三个方面，提供了上述工程益生菌在制备苯丙酮尿症治疗药物中的应用。
上述药物优选是口服剂型，可通过口服给药。相应地，药物剂型为适用于口服、同时保持益生菌活性的口服剂型，包括固体颗粒、片剂和液体活菌制剂。
可选地，所述药物中，除了药物活性成分工程益生菌外，还包含至少一种辅助治疗剂，从而形成复方药物。优选地，所述辅助治疗剂是其他用于治疗苯丙酮尿症、但不损害益生菌活性的药物成分。
通过体外实验表明，本发明的工程益生菌TYS009和TYS010能够降解苯丙氨酸，生成反式肉桂酸；经小鼠口服实验证明，本发明的工程益生菌TYS009和TYS010能够对苯丙酮尿症小鼠血液中苯丙氨酸进行降解，表明菌株TYS009和TYS010具有治疗苯丙酮尿症的效果，具有开发应用前景。
附图说明
图1为原始菌株E.coli Nissle 1917、工程菌TYS014和TYS015对苯丙氨酸进行降解生成反式肉桂酸的柱形图。
图2为原始菌株E.coli Nissle 1917、工程菌TYS009和TYS010对苯丙氨酸进行降解生成反式肉桂酸的柱形图。
图3为原始菌株E.coli Nissle 1917、工程菌TYS009和TYS010降解苯丙酮尿症小鼠血液中苯丙氨酸的统计图。
具体实施方式
本发明在不具有降解苯丙氨酸能力的原始大肠杆菌Nissle 1917的基础上，通过基因组改造，使其能够表达苯丙氨酸解氨酶基因，从而具备了降解苯丙氨酸能力；然后通过失活基因argR并且对argA做抗反馈抑制突变(Y19C)，增强了精氨酸合成途径；接着，进一步通过基因工程使菌株能够表达L-苯丙氨酸内运蛋白基因和/或L-氨基酸脱氨酶基因，得到了对苯丙氨酸降解能力显著提高的工程益生菌TYS009和TYS010。
为简要起见，本文中有时将“工程益生菌”简称为“(基因)工程菌”或者“益生菌”，它们表示相同的意义，可以互换使用。
基因argR是一个在细菌中普遍存在的精氨酸操纵子调节基因，在不同的细菌中有不同的功能，发明人研究发现，通过敲除大肠杆菌Nissle 1917基因组中的这一负调控基因，可一定程度上解除其对精氨酸合成的抑制。
N-乙酰谷氨酸合成酶(NAGS)编码基因argA，Y19C突变具有解除精氨酸反馈抑制的效果。
在一种具体实施方式中，本发明是在益生菌E.coli Nissle 1917基因组上引入了利用组成型启动子Pj23119调控来源于发光分枝杆菌(Photorhabdus luminescens)的苯丙氨酸解氨酶(stlA)和增强了大肠杆菌MG1655来源苯丙氨酸特异转运体(pheP)，可有效提高胞内苯丙氨酸的运输，并将转化为反式肉桂酸；同时引入了来源于奇异变形杆菌(Proteusmirabilis HI4320)的L-氨基酸脱氨酶(pma)，可将苯丙氨酸降解为苯丙酮酸；敲除argR和突变argA(Y19C)强化精氨酸合成途径，可有效利用苯丙氨酸被转化为反式肉桂酸和苯丙酮酸时释放的氨，从而促进苯丙氨酸向反式肉桂酸和苯丙氨酸转化反应进行，达到有效降解苯丙氨酸目的。
为了考察工程菌治疗苯丙酮尿症的效果，在小鼠喂饲工程菌，验证了工程菌的苯丙酮尿症治疗效果。
下面以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金瑞斯生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
主要培养基：
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠。(固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
原始大肠杆菌Nissle 1917、pTargetF质粒(Addgene:62226)和pCas质粒(Addgene:62225)由中国科学院分子植物科学卓越创新中心杨晟课题组惠赠。
pTargetF质粒(Addgene:62226)和pCas质粒(Addgene:62225)由上海陶宇晟生物技术有限责任公司保存，任何单位和个人都可以获得该质粒及相关质粒和细菌用于验证本发明，但未经上海陶宇晟生物技术有限责任公司允许不得用作其他用途，包括开发利用、科学研究和教学。
精氨酸强化工程益生菌的构建可参考Isabella,V.等的文献(Development of asynthetic live bacterial therapeutic for the human metabolic diseasephenylketonuria.Nat Biotechnol 36,857–864,2018.)和Kurtz,C.等的文献(Anengineered E.coli Nissle improves hyperammonemia and survival in miceandshows dose-dependent exposure in healthy humans.Sci.Transl.Med.11,eaau7975,2019.)。利用Jiang Y等的文献的Crispr-Cas9方法(Multigene Editing in theEscherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9 System,Appl Environ Microbiol,2015)进行益生菌基因组改造。
以下实施例中使用的引物序列信息如表1所示。
表1、实施例中使用的引物列表
表1中，名称中的“-F”代表正向；“-R”代表反向。
实施例1：降解苯丙氨酸的工程益生菌TYS014构建
1.1 pTargetF-malP质粒构建
以pTargetF质粒(Addgene:62226)为模板，malP-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增malP-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，转化至大肠杆菌DH5α化学感受态细胞中，37℃条件下在含壮观霉素(50μg/mL)的LB固体平板上进行筛选，获得pTargetF-malP质粒；化学转化感受态细胞制备方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)。
1.2 malP位点敲入Pj23119-stlA
(1)电转片段制备：以E.coli Nissle 1917基因组为模板，分别以malP-F1/malP-R1、malP-F2/malP-R2为引物，PCR扩增分别获得malP-UP和malP-DN片段，分别约600bp；以pUC-sltA质粒(金斯瑞合成)为模板，以stlA(malP)-F/stlA(malP)-R为引物，PCR扩增获得stlA(malP)片段，约1.6kb；以pTargetF质粒为模板，Pj23119(malP)-F/Pj23119(malP)-R为引物，PCR扩增Pj23119(malP)片段，约100bp；以Pj23119(malP)/stlA(malP)片段为模板，Pj23119(malP)-F/stlA(malP)-R为引物，Overlap PCR扩增获得stlA(malP)-2片段，约1.7kb；以malP-UP/stlA(malP)-2/malP-DN片段为模板，以malP-F1/malP-R2为引物，Overlap PCR扩增获得malP::Pj23119-stlA片段，约3kb。
(2)感受态细胞制备：将pCas质粒转化至大肠杆菌E.coli Nissle 1917化学感受态细胞中，在含卡那霉素(50μg/mL)的LB固体平板上进行筛选，获得EcN/pCas转化子(化学转化感受态细胞制备方法参考《分子克隆实验指南》(第三版))。挑取EcN/pCas单菌落于4mL含卡那霉素(50μg/mL)的LB试管中，30℃220rpm培养，在菌浓OD600为0.4时，添加终浓度为10mM阿拉伯糖进行诱导，继续培养1小时，制备电转感受态细胞(电转感受态细胞制备方法参考文献(Multigene Editing in the Escherichia coli Genome via the CRISPR-Cas9System,Jiang Y,Chen B,et al.,Appl Environ Microbiol,2015)；
(3)电转：将malP::Pj23119-stlA片段及pTargetF-malP质粒电转入EcN/pCas感受态细胞中(电转化条件：2.5kV(电转化条件：2.5kV，200Ω，25μF)，涂布于含壮观霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用malP-V-F/stlA-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约600bp；
(4)pTargetF-malP质粒丢失：挑取菌落PCR验证为阳性单菌落，接种于含卡那霉素(终浓度为50μg/ml)的LB试管中，同时加入终浓度为1mM IPTG，30℃过夜培养；次日试管中菌液直接划线于含卡那霉素(终浓度50ug/ml)的LB平板上，30℃过夜培养；次日挑取单菌落转接于含壮观霉素(终浓度为50μg/ml)LB平板上，若不能生长，表明pTargetF-malP质粒已丢失，得到EcN(malP::Pj23119-stlA)/pCas菌株。
(5)pCas质粒丢失：挑取pTargetF-malP质粒丢失阳性菌落，接种于LB试管中，37℃过夜培养；次日菌液划线接种于LB平板上，37℃过夜培养；次日挑取单菌落转接于含卡那霉素(终浓度为50μg/ml)LB平板上，若不能生长，表明pCas质粒丢失，得到EcN(malP::Pj23119-stlA)菌株，命名为TYS014。
实施例2：精氨酸途径增强工程益生菌TYS015构建
2.1 argA位点敲入安普霉素抗性基因
(1)含同源臂片段扩增：以pIJ773质粒(Gust B,et al.,PCR-targetedStreptomyces gene replacement identifies a protein domain needed forbiosynthesis of the sesquiterpene soil odor geosmin.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2003,100:1541-1546.)为模板，Apr(argA)-F/Apr(argA)-R为引物，PCR扩增Apr(argA)片段，约1.4kb，DpnI消化PCR片段；
(2)电转：方法同1.2，Apr(argA)片段电转化入实施例1所得EcN(malP::Pj23119-stlA)/pCas感受态细胞中，涂布于含安普霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用argA-V-F/argA-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约2.6kb，获得EcN(malP::Pj23119-stlA,argA::Apr)/pCas菌株。
2.2 argA定点突变(Y19C)构建
(1)pTargetF-Apr质粒构建：以pTargetF质粒为模板，Apr-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增Apr-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，转化至大肠杆菌DH5α化学感受态细胞中，37℃条件下在含壮观霉素(50μg/mL)的LB固体平板上进行筛选，获得pTargetF-Apr质粒；化学转化感受态细胞制备方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)。
(2)电转片段制备：以E.coli Nissle 1917基因组为模板，分别以argAmu-F1/argAmu-R1、argAmu-F2/argAmu-R2为引物，PCR扩增分别获得argAmu-1和argAmu-2片段，分别约500bp；以argAmu-1和argAmu-2片段为模板，以argAmu-F1/argAmu-R2为引物，OverlapPCR扩增获得argA*(即argAmut(Y19C))片段，约1kb。
(3)电转：方法同1.2，将argA*片段及pTargetF-Apr质粒电转化入EcN(malP::Pj23119-stlA,argA::Apr)/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用argA-V-F/argA-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.1kb；
(4)pTargetF-Apr质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::Pj23119-stlA,argA*)/pCas菌株。
2.3 pTargetF-argR质粒构建
以pTargetF质粒为模板，argR-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增argR-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，转化至大肠杆菌DH5α化学感受态细胞中，37℃条件下在含壮观霉素(50μg/mL)的LB固体平板上进行筛选，获得pTargetF-argR质粒；化学转化感受态细胞制备方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)。
2.4 argR基因敲除
(1)电转片段制备：以E.coli Nissle 1917基因组为模板，分别以argR-aL-F/argR-aL-R、argR-aR-F/argR-aR-R为引物，PCR扩增分别获得argR-KO1和argR-KO2片段，分别约500bp；以argR-KO1和argR-KO2片段为模板，以argR-aL-F/argR-aR-R为引物，OverlapPCR扩增获得argR-KO片段，约1kb。
(2)电转：方法同1.2，将argR-KO片段及pTargetF-argR质粒电转化入EcN(malP::Pj23119-stlA,argA*)/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用argR-aL-F/argR-aR-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1kb；
(3)pTargetF-argR质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::Pj23119-stlA,argA*,△argR)/pCas菌株。
(4)pCas质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::Pj23119-stlA,argA*,△argR)菌株，命名为TYS015。
实施例3：降解苯丙氨酸的工程益生菌TYS009构建
3.1 pTargetF-yicS质粒构建
以pTargetF质粒为模板，yicS-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增yicS-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，转化至大肠杆菌DH5α化学感受态细胞中，37℃条件下在含壮观霉素(50μg/mL)的LB固体平板上进行筛选，获得pTargetF-yicS质粒；化学转化感受态细胞制备方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)。
3.2 yicS位点敲入Pj23119-stlA
(1)电转片段制备：以E.coli Nissle 1917基因组为模板，分别以yicS-F1/yicS-R1、yicS-F2/yicS-R2为引物，PCR扩增分别获得yicS-UP和yicS-DN片段，分别约600bp；以stlA(malP)-2片段为模板，以Pj23119(yicS)-F/stlA(malP)-R为引物，PCR扩增获得stlA(yicS)片段，约1.7kb；以yicS-UP/stlA(yicS)/yicS-DN片段为模板，以yicS-F1/yicS-R2为引物，Overlap PCR扩增获得yicS::Pj23119-stlA片段，约3kb。
(2)电转：方法同1.2，将yicS::Pj23119-stlA片段及pTargetF-yicS质粒电转化入EcN(malP::Pj23119-stlA)/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用yicS-V-F/stlA-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约500bp；
(3)pTargetF-yicS质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119stlA)/pCas菌株。
3.3malE位点敲入安普霉素抗性基因
(1)含同源臂片段扩增：以pIJ773质粒为模板，Apr(malE)-F/Apr(malE)-R为引物，PCR扩增Apr(malE)片段，约1.4kb，DpnI消化PCR片段；
(2)电转：方法同1.2，Apr(malE)片段电转化入EcN(malP::stlA,yicS::stlA)/pCas感受态细胞中，涂布于含安普霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用malE-V-F/Apr-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约800bp，获得EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Apr)/pCas菌株。
3.4 malE位点敲入Pj23119-stlA
(1)电转片段制备：以E.coli Nissle 1917基因组为模板，分别以malE-F1/malE-R1、malE-F2/malE-R2为引物，PCR扩增分别获得malE-UP和malE-DN片段，分别约600bp；以stlA(malP)-2片段为模板，以Pj23119(malE)-F/stlA(malP)-R为引物，PCR扩增获得stlA(malE)片段，约1.7kb；以malE-UP/stlA(malE)/malE-DN片段为模板，以malE-F1/malE-R2为引物，Overlap PCR扩增获得malE::Pj23119-stlA片段，约3kb。
(2)电转：方法同1.2，将malE::Pj23119-stlA片段及pTargetF-Apr质粒电转化入EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Apr)/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用malE-V-F/stlA-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约500bp；
(3)pTargetF-Apr质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA)/pCas菌株。
3.5 pTargetF-rhtC质粒构建
以pTargetF质粒为模板，rhtC-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增rhtC-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，转化至大肠杆菌DH5α化学感受态细胞中，37℃条件下在含壮观霉素(50μg/mL)的LB固体平板上进行筛选，获得pTargetF-rhtC质粒；化学转化感受态细胞制备方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)。
3.6 pTargetT-Ptac-stlA(rhtC)质粒构建
以E.coli Nissle 1917基因组为模板，分别以rhtC-F1/rhtC-R1、rhtC-F2/rhtC-R2为引物，PCR扩增分别获得rhtC-UP和rhtC-DN片段，分别约600bp；以p57-tac质粒为模板，tac-F/tac-R为引物，PCR扩增tac片段，约1.5kb；以stlA(malP)-2片段为模板，以stlA(rhtC)-F/stlA(rhtC)-R为引物，PCR扩增获得stlA(rhtC)片段，约1.6kb；将rhtC-UP、tac、stlA(rhtC)和rhtC-DN片段利用DNA assembly方法(DNA assembly Kit购自全式金)克隆入pTargetF-rhtC的EcoRI/HindIII位点，获得pTargetT-Ptac-stlA(rhtC)质粒。
3.7 rhtC位点敲入Ptac-stlA
(1)电转：方法同1.2，将pTargetT-Ptac-stlA(rhtC)质粒电转化入EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA)/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用rhtC-V-F/stlA-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约2.5kb；
(2)pTargetT-Ptac-stlA(rhtC)质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA)/pCas菌株。
3.8 pTargetF-exo质粒构建
以pTargetF质粒为模板，exo-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增exo-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，转化至大肠杆菌DH5α化学感受态细胞中，37℃条件下在含壮观霉素(50μg/mL)的LB固体平板上进行筛选，获得pTargetF-exo质粒；化学转化感受态细胞制备方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)。
3.9 pTargetT-Ptac-stlA(exo)质粒构建
以E.coli Nissle 1917基因组为模板，分别以exo-F1/exo-R1、exo-F2/exo-R2为引物，PCR扩增分别获得exo-UP和exo-DN片段，分别约600bp；以p57-tac质粒为模板，tac(exo)-F/tac-R为引物，PCR扩增tac(exo)片段，约2.1kb；以pTargetT-Ptac-stlA(rhtC)质粒为模板，以stlA(rhtC)-F/stlA(exo)-R为引物，PCR扩增获得stlA(exo)片段，约1.6kb；将exo-UP、tac(exo)、stlA(exo)和exo-DN片段利用DNA assembly方法(DNA assembly Kit购自全式金)克隆入pTargetF-exo的EcoRI/HindIII位点，获得pTargetT-Ptac-stlA(exo)质粒。
3.10 exo位点敲入Ptac-stlA
(1)电转：方法同1.2，将pTargetT-Ptac-stlA(exo)质粒电转化入EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA)/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用exo-V-F/stlA-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约3kb；
(2)pTargetT-Ptac-stlA(exo)质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA)/pCas菌株。
3.11 pTargetF-lacZ质粒构建
以pTargetF质粒为模板，lacZ-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增lacZ-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，转化至大肠杆菌DH5α化学感受态细胞中，37℃条件下在含壮观霉素(50μg/mL)的LB固体平板上进行筛选，获得pTargetF-lacZ质粒；化学转化感受态细胞制备方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)。
3.12 lacZ位点敲入Pj23119-pheP
(1)电转片段制备：以E.coli Nissle 1917基因组为模板，分别以lacZ-F1/lacZ-R1、lacZ-F2/lacZ-R2为引物，PCR扩增分别获得lacZ-UP和lacZ-DN片段，分别约600bp和700bp；以pTargetF质粒为模板，以Pj23119(lacZ)-F/Pj23119(lacZ)-R为引物，PCR扩增Pj23119(lacZ)片段，约100bp；以E.coli MG 1655基因组为模板，以pheP(lacZ)-F/pheP(lacZ)-R为引物，PCR扩增获得pheP(lacZ)-1片段，约1.4kb；以Pj23119(lacZ)/pheP(lacZ)-1片段为模板，以Pj23119(lacZ)-F/pheP(lacZ)-R为引物，PCR扩增获得pheP(lacZ)-2片段，约1.5kb；以lacZ-UP/pheP(lacZ)-2/lacZ-DN片段为模板，以lacZ-F1/lacZ-R2为引物，Overlap PCR扩增获得lacZ::Pj23119-pheP片段，约2.8kb。
(2)电转：方法同1.2，将lacZ::Pj23119-pheP片段及pTargetF-lacZ质粒电转化入EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA)/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用lacZ-V-F/pheP-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约500bp；
(3)pTargetF-lacZ质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP)/pCas菌株。
3.13 pTargetF-agaI质粒构建
以pTargetF质粒为模板，agaI-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增agaI-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，转化至大肠杆菌DH5α化学感受态细胞中，37℃条件下在含壮观霉素(50μg/mL)的LB固体平板上进行筛选，获得pTargetF-agaI质粒；化学转化感受态细胞制备方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)。
3.14 agaI位点敲入Pj23119-pheP
(1)电转片段制备：以E.coli Nissle 1917基因组为模板，分别以agaI-F1/agaI-R1、agaI-F2/agaI-R2为引物，PCR扩增分别获得agaI-UP和agaI-DN片段，分别约600bp；以pheP(lacZ)-2片段为模板，以pheP(agaI)-F/pheP(agaI)-R为引物，PCR扩增获得pheP(agaI)片段，约1.4kb；以agaI-UP/pheP(agaI)-2/agaI-DN片段为模板，以agaI-F1/agaI-R2为引物，Overlap PCR扩增获得agaI::Pj23119-pheP片段，约2.7kb。
(2)电转：方法同1.2，将agaI::Pj23119-pheP片段及pTargetF-agaI质粒电转化入EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP)/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用agaI-V-F/pheP-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约500bp；
(3)pTargetF-agaI质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP,agaI::Pj23119-pheP)/pCas菌株。
3.15 pTargetF-araBD质粒构建
以pTargetF质粒为模板，araBD-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增araBD-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，转化至大肠杆菌DH5α化学感受态细胞中，37℃条件下在含壮观霉素(50μg/mL)的LB固体平板上进行筛选，获得pTargetF-araBD质粒；化学转化感受态细胞制备方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)。
3.16 pTargetT-Para-pma(araBD)质粒构建
以E.coli Nissle 1917基因组为模板，分别以araBD-F1/araBD-R1、araBD-F2/araBD-R2为引物，PCR扩增分别获得araBD-UP和araBD-DN片段，分别约600bp；以pUC-pma质粒(金斯瑞合成)为模板，以pma(araBD)-F/pma(araBD)-R为引物，PCR扩增获得pma(araBD)片段，约1.6kb；将araBD-UP、araBD-DN和stlA(araBD)片段利用DNA assembly方法(DNAassembly Kit购自全式金)克隆入pTargetF-araBD的EcoRI/HindIII位点，获得pTargetT-Para-pma(araBD)质粒。
3.17 araBD位点敲入Para-pma
(1)电转：方法同1.2，将pTargetT-Para-pma(araBD)质粒电转化入EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP,agaI::Pj23119-pheP)/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素(50μg/ml)和卡那霉素(50μg/ml)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用araBD-V-F/pma-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.6kb；
(2)pTargetT-Para-pma(araBD)质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::stlA,yicS::stlA,malE::stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::pheP,agaI::pheP,araBD::Para-pma)/pCas菌株。
3.18 pTargetF-dapA质粒构建
以pTargetF质粒为模板，dapA-N20-F/pTargetF-R为引物，PCR扩增dapA-N20片段，约2.2kb，DpnI消化PCR片段后自连，转化至大肠杆菌DH5α化学感受态细胞中，37℃条件下在含壮观霉素(50μg/mL)的LB固体平板上进行筛选，获得pTargetF-dapA质粒；化学转化感受态细胞制备方法参考《分子克隆实验指南》(第三版)。
3.19 pTargetT-dapA质粒构建
以E.coli Nissle 1917基因组为模板，分别以dapA-F1/dapA-R1、dapA-F2/dapA-R2为引物，PCR扩增分别获得dapA-UP和dapA-DN片段，分别约600bp；将dapA-UP和dapA-DN片段利用DNA assembly方法(DNA assembly Kit购自全式金)克隆入pTargetF-dapA的EcoRI/HindIII位点，获得pTargetT-dapA质粒。
3.20 dapA基因敲除
(1)电转：方法同1.2，将pTargetT-dapA质粒电转化入EcN(malP::stlA,yicS::stlA,malE::stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::pheP,agaI::pheP,araBD::Para-pma)/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素(50μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)和二氨基庚二酸(100μg/mL)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用dapA-V-F/dapA-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1kb；
(2)pTargetT-dapA质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP,agaI::Pj23119-pheP,araBD::Para-pma,△dapA)/pCas菌株。
(3)pCas质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP,agaI::Pj23119-pheP,araBD::Para-pma,△dapA)菌株，命名为TYS009。
实施例4：精氨酸途径增强工程益生菌TYS010构建
4.1 argA位点敲入安普霉素抗性基因
(1)含同源臂片段扩增：方法同2.1(1)，获得Apr(argA)片段；
(2)电转：方法同1.2，Apr(argA)片段电转化入实施例3所得EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP,agaI::Pj23119-pheP,araBD::Para-pma,△dapA)/pCas感受态细胞中，涂布于含安普霉素(50μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)和二氨基庚二酸(100μg/mL)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用argA-V-F/argA-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约2.6kb，获得EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP,agaI::Pj23119-pheP,araBD::Para-pma,△dapA,argA::Apr)/pCas菌株。
4.2 argA定点突变(Y19C)构建
(1)电转片段制备：方法同2.2(1)，获得argA*(即argAmut(Y19C))片段，约1kb。
(2)电转：方法同1.2，将argA*片段及pTargetF-Apr质粒电转化入EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP,agaI::Pj23119-pheP,araBD::Para-pma,△dapA,argA::Apr)/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素(50μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)和二氨基庚二酸(100μg/mL)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用argA-V-F/argA-V-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1.1kb；
(3)pTargetF-Apr质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP,agaI::Pj23119-pheP,araBD::Para-pma,△dapA,argA*)/pCas菌株。
4.3 argR基因敲除
(1)电转片段制备：方法同2.4(1)，获得argR-KO片段，约1kb。
(2)电转：方法同1.2，将argR-KO片段及pTargetF-argR质粒电转化入EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP,agaI::Pj23119-pheP,araBD::Para-pma,△dapA,argA*)/pCas感受态细胞中，涂布于含壮观霉素(50μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)和二氨基庚二酸(100μg/mL)的LB平板上，30℃培养过夜；长出单菌落利用argR-aL-F/argR-aR-R引物进行菌落PCR验证，阳性片段约1kb；
(3)pTargetF-argR质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP,agaI::Pj23119-pheP,araBD::Para-pma,△dapA,argA*,△argR)/pCas菌株。
(4)pCas质粒丢失：方法同1.2，得到EcN(malP::Pj23119-stlA,yicS::Pj23119-stlA,malE::Pj23119-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119-pheP,agaI::Pj23119-pheP,araBD::Para-pma,△dapA,argA*,△argR)菌株，命名为TYS010。
实施例5：益生菌对苯丙氨酸降解效果体外比较
5.1益生菌体外测活
(1)原始菌株E.coli Nissle1917(EcN)、工程菌TYS014、TYS015、TYS009和TYS010菌株分别接种于LB培养基中(TYS009和TYS010菌株培养需添加终浓度为100μg/mL二氨基庚二酸)，37℃、250rpm过夜培养。以1％v/v接种量转接于30mL LB培养基中(TYS009和TYS010菌株培养需添加终浓度为100μg/mL二氨基庚二酸)，37℃、250rpm条件下培养1.5小时，1.5小时后时添加10mM阿拉伯糖和1mM IPTG继续培养3小时。
(2)4000rpm条件下离心收集菌体，M9培养基(含0.5％葡萄糖)重悬菌体，将菌浓OD600调至1.0。分别取0.4mL菌液于2mL离心管中，4500rpm离心10min，去上清，用5mL分析缓冲液(M9培养基、5g/L葡萄糖，50mM MOPS，4mM L-苯丙氨酸)悬浮菌体于普通试管中，定位T＝0h，放于37℃，250rpm培养3小时，取样1mL。13000rpm，离心10min，收集上清样品进行HPLC检测。
5.2苯丙氨酸、苯丙酮酸及反式肉桂酸HPLC检测方法
色谱柱ZORBAX SB-C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；柱温40℃；以1.5％乙酸和乙腈为流动相，进行梯度洗脱；采用紫外检测器，检测波长260nm，进样量5μL。
HPLC检测结果如图1、2所示，原始菌株EcN不能降解苯丙氨酸生成反式肉桂酸；工程菌TYS014生成反式肉桂酸的浓度为0.045mM；工程菌TYS015生成反式肉桂酸的浓度为0.048mM，提示增强精氨酸合成途径能够提高菌株的苯丙氨酸降解能力。在工程菌TYS014和TYS015基础上分别进一步叠加了基因stlA、pheP和pma表达的工程菌TYS009和TYS010的降解苯丙氨酸能力又有了新的提高，其中工程菌TYS009生成反式肉桂酸的浓度为0.581mM；工程菌TYS010生成反式肉桂酸的浓度为0.661mM。
从图2可知，TYS010较TYS009菌株，反式肉桂酸生成量提高了约13.7％，也表明增强精氨酸合成途径能够进一步提高菌株的苯丙氨酸降解能力。
实施例6：精氨酸强化工程益生菌在苯丙酮尿症小鼠中效果比较
苯丙酮尿症小鼠Pahenu2/enu2(6-9周龄，购自JAX)利用无苯丙氨酸(Phe-deficient)饲料喂养(购自Deyts)，含苯丙氨酸(0.5g/L)的饮用水作为苯丙氨酸补给。动物实验开始时(T＝0h)，停止含苯丙氨酸饮用水补给，更换为普通饮用水，采血检测T＝0h血液中苯丙氨酸浓度。接着，小鼠皮下注射0.1mg/g(BW)苯丙氨酸溶液，在皮下注射后第1、2、3小时分别灌胃300μL(即5×1010cfu/只小鼠)益生菌原始菌株EcN、工程菌TYS009或TYS010，在注射后第4小时采血检测血液中苯丙氨酸的浓度，比较益生菌对苯丙酮尿症小鼠血液中苯丙氨酸的降解能力。检测结果见图3。
从图3可知，与不具有降解苯丙氨酸能力的原始菌株EcN相比，口服TYS009益生菌，苯丙酮尿症小鼠血液中苯丙氨酸浓度下降了25.7％；口服精氨酸强化工程益生菌TYS010，血液中苯丙氨酸浓度则下降了48.0％，表明强化精氨酸途径可进一步提高工程益生菌对苯丙酮尿症小鼠血液中苯丙氨酸的降解。
综上所述，本发明所构建的工程益生菌TYS009和进一步强化精氨酸合成途径的工程益生菌TYS010在体外、体内对苯丙氨酸均能有效降解，有望应用于治疗苯丙酮尿症。
序列表
<110> 上海陶宇晟生物技术有限责任公司
<120> 具有降解苯丙氨酸能力的工程益生菌
<130> SHPI2010613
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1599
<212> DNA
<213> Photorhabdus luminescens
<400> 1
atgaaagcta aagatgttca gccaaccatt attattaata aaaatggcct tatctctttg 60
gaagatatct atgacattgc gataaaacaa aaaaaagtag aaatatcaac ggagatcact 120
gaacttttga cgcatggtcg tgaaaaatta gaggaaaaat taaattcagg agaggttata 180
tatggaatca atacaggatt tggagggaat gccaatttag ttgtgccatt tgagaaaatc 240
gcagagcatc agcaaaatct gttaactttt ctttctgctg gtactgggga ctatatgtcc 300
aaaccttgta ttaaagcgtc acaatttact atgttacttt ctgtttgcaa aggttggtct 360
gcaaccagac caattgtcgc tcaagcaatt gttgatcata ttaatcatga cattgttcct 420
ctggttcctc gctatggctc agtgggtgca agcggtgatt taattccttt atcttatatt 480
gcacgagcat tatgtggtat cggcaaagtt tattatatgg gcgcagaaat tgacgctgct 540
gaagcaatta aacgtgcagg gttgacacca ttatcgttaa aagccaaaga aggtcttgct 600
ctgattaacg gcacccgggt aatgtcagga atcagtgcaa tcaccgtcat taaactggaa 660
aaactattta aagcctcaat ttctgcgatt gcccttgctg ttgaagcatt acttgcatct 720
catgaacatt atgatgcccg gattcaacaa gtaaaaaatc atcctggtca aaacgcggtg 780
gcaagtgcat tgcgtaattt attggcaggt tcaacgcagg ttaatctatt atctggggtt 840
aaagaacaag ccaataaagc ttgtcgtcat caagaaatta cccaactaaa tgatacctta 900
caggaagttt attcaattcg ctgtgcacca caagtattag gtatagtgcc agaatcttta 960
gctaccgctc ggaaaatatt ggaacgggaa gttatctcag ctaatgataa tccattgata 1020
gatccagaaa atggcgatgt tctacacggt ggaaatttta tggggcaata tgtcgcccga 1080
acaatggatg cattaaaact ggatattgct ttaattgcca atcatcttca cgccattgtg 1140
gctcttatga tggataaccg tttctctcgt ggattaccta attcactgag tccgacaccc 1200
ggcatgtatc aaggttttaa aggcgtccaa ctttctcaaa ccgctttagt tgctgcaatt 1260
cgccatgatt gtgctgcatc aggtattcat accctcgcca cagaacaata caatcaagat 1320
attgtcagtt taggtctgca tgccgctcaa gatgttttag agatggagca gaaattacgc 1380
aatattgttt caatgacaat tctggtagtt tgtcaggcca ttcatcttcg cggcaatatt 1440
agtgaaattg cgcctgaaac tgctaaattt taccatgcag tacgcgaaat cagttctcct 1500
ttgatcactg atcgtgcgtt ggatgaagat ataatccgca ttgcggatgc aattattaat 1560
gatcaacttc ctctgccaga aatcatgctg gaagaataa 1599
<210> 2
<211> 1377
<212> DNA
<213> Escherichia coli MG1655
<400> 2
atgaaaaacg cgtcaaccgt atcggaagat actgcgtcga atcaagagcc gacgcttcat 60
cgcggattac ataaccgtca tattcaactg attgcgttgg gtggcgcaat tggtactggt 120
ctgtttcttg gcattggccc ggcgattcag atggcgggtc cggctgtatt gctgggctac 180
ggcgtcgccg ggatcatcgc tttcctgatt atgcgccagc ttggcgaaat ggtggttgag 240
gagccggtat ccggttcatt tgcccacttt gcctataaat actggggacc gtttgcgggc 300
ttcctctctg gctggaacta ctgggtaatg ttcgtgctgg tgggaatggc agagctgacc 360
gctgcgggca tctatatgca gtactggttc ccggatgttc caacgtggat ttgggctgcc 420
gccttcttta ttatcatcaa cgccgttaac ctggtgaacg tgcgcttata tggcgaaacc 480
gagttctggt ttgcgttgat taaagtgctg gcaatcatcg gtatgatcgg ctttggcctg 540
tggctgctgt tttctggtca cggcggcgag aaagccagta tcgacaacct ctggcgctac 600
ggtggtttct tcgccaccgg ctggaatggg ctgattttgt cgctggcggt aattatgttc 660
tccttcggcg gtctggagct gattgggatt actgccgctg aagcgcgcga tccggaaaaa 720
agcattccaa aagcggtaaa tcaggtggtg tatcgcatcc tgctgtttta catcggttca 780
ctggtggttt tactggcgct ctatccgtgg gtggaagtga aatccaacag tagcccgttt 840
gtgatgattt tccataatct cgacagcaac gtggtagctt ctgcgctgaa cttcgtcatt 900
ctggtagcat cgctgtcagt gtataacagc ggggtttact ctaacagccg catgctgttt 960
ggcctttctg tgcagggtaa tgcgccgaag tttttgactc gcgtcagccg tcgcggtgtg 1020
ccgattaact cgctgatgct ttccggagcg atcacttcgc tggtggtgtt aatcaactat 1080
ctgctgccgc aaaaagcgtt tggtctgctg atggcgctgg tggtagcaac gctgctgttg 1140
aactggatta tgatctgtct ggcgcatctg cgttttcgtg cagcgatgcg acgtcagggg 1200
cgtgaaacac agtttaaggc gctgctctat ccgttcggca actatctctg cattgccttc 1260
ctcggcatga ttttgctgct gatgtgcacg atggatgata tgcgcttgtc agcgatcctg 1320
ctgccggtgt ggattgtatt cctgtttatg gcatttaaaa cgctgcgtcg gaaataa 1377
<210> 3
<211> 1422
<212> DNA
<213> Proteus mirabilis HI4320
<400> 3
atgaacattt caaggagaaa gctactttta ggtgttggtg ctgcgggcgt tttagcaggt 60
ggtgcggctt tagttccaat ggttcgccgt gacggcaaat ttgtggaagc taaatcaaga 120
gcatcatttg ttgaaggtac gcaaggggct cttcctaaag aagcagatgt agtgattatt 180
ggtgccggta ttcaagggat catgaccgct attaaccttg ctgaacgtgg tatgagtgtc 240
actatcttag aaaagggtca gattgccggt gagcaatcag gccgtgcata cagccaaatt 300
attagttacc aaacatcgcc agaaatcttc ccattacacc attatgggaa aatattatgg 360
cgtggcatga atgagaaaat tggtgcggat accagttatc gtactcaagg tcgtgtagaa 420
gcgctggcag atgaaaaagc attagataaa gctcaagcgt ggatcaaaac agctaaagaa 480
gcggcaggtt ttgatacacc attaaatact cgcatcatta aaggtgaaga gctatcaaat 540
cgcttagtcg gtgctcaaac gccatggact gttgctgcat ttgaagaaga ttcaggctct 600
gttgatcctg aaacaggcac acctgcactc gctcgttatg ccaaacaaat cggtgtgaaa 660
atttatacca actgtgcagt aagaggtatt gaaactgcgg gtggtaaaat ctctgatgtg 720
gtgagtgaga aaggggcgat taaaacgtct caagttgtac tcgctggggg tatctggtcg 780
cgtttattta tgggcaatat gggtattgat atcccaacgc tcaatgtata tctatcacaa 840
caacgtgtct caggggttcc tggtgcacca cgtggtaatg tgcatttacc taatggtatt 900
catttccgcg aacaagcgga tggtacttat gccgttgcac cacgtatctt tacgagttca 960
atagtcaaag atagcttcct gctagggcct aaatttatgc acttattagg tggcggagag 1020
ttaccgttgg aattctctat tggtgaagat ctatttaatt catttaaaat gccgacctct 1080
tggaatttag atgaaaaaac accattcgaa caattccgag ttgccacggc aacacaaaat 1140
acgcaacact tagatgctgt tttccaaaga atgaaaacag aattcccagt atttgaaaaa 1200
tcagaagttg ttgaacgttg gggtgccgtt gtgagtccaa catttgatga attacctatc 1260
atttctgagg tcaaagaata cccaggctta gtgattaaca cggcaacagt gtggggtatg 1320
acagaaggcc cggcagcggg tgaagtgacc gctgatattg tcatgggcaa gaaacctgtt 1380
attgatccaa cgccgtttag tttggatcgt tttaagaagt aa 1422
Claims (7)
1.一种提高大肠杆菌Nissle 1917降解苯丙氨酸能力的方法，包括以下步骤：
A. 以具有L-苯丙氨酸解氨酶基因表达能力的大肠杆菌Nissle 1917为底盘菌，增强精氨酸合成途径，步骤为：失活基因argR并且进行argA抗反馈抑制突变；
B. 使底盘菌表达L-苯丙氨酸内运蛋白基因；和
C. 使底盘菌表达L-氨基酸脱氨酶基因，其中
所述argA抗反馈抑制突变为Y19C突变，
所述L-苯丙氨酸解氨酶基因是stlA（SEQ ID NO: 1）；所述L-苯丙氨酸内运蛋白基因是pheP（SEQ ID NO: 2）；所述L-氨基酸脱氨酶基因是pma（SEQ ID NO: 3）。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具有L-苯丙氨酸解氨酶基因stlA表达能力的大肠杆菌Nissle 1917的基因型是：EcN (malP::Pj23119-stlA)。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A、B和C通过基因编辑技术实施。
4.一种具有降解苯丙氨酸能力的工程益生菌，其特征在于，按照如权利要求1-3中任一项中所述的方法构建。
5.如权利要求4所述的工程益生菌，其特征在于，菌株的基因型是：
EcN (malP::Pj23119-stlA, yicS::Pj23119-stlA, malE::Pj23119-stlA, rthC::Ptac-stlA, exo::Ptac-stlA, lacZ::Pj23119-pheP, agaI::Pj23119-pheP, araBD::Para-pma, △dapA, argA*, △argR)。
6.如权利要求4或5所述的工程益生菌在制备苯丙酮尿症治疗药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物是口服剂型。
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