CN115717120A - 可控生长工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可控生长工程菌及其构建方法和应用，可控生长工程菌为在aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌基础上，进行dapA基因的敲除，构建了DAP营养缺陷型沙门氏菌突变体。其构建方法为：构建携带dapA基因上游和下游序列的重组自杀质粒pDM4‑dapA U+D；将其导入至aroA突变或relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌株中，通过两次同源重组，获得不能增殖的突变菌株。本发明的可控生长工程菌感染机体后，可控生长工程菌可以在肿瘤部位可控增殖，实现在细菌治疗肿瘤的过程中减毒工程菌的可控生长，提高肿瘤治疗的安全性。

Description

可控生长工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及肿瘤生物治疗技术领域，尤其涉及可控生长工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

癌症是威胁人类健康的重大疾病之一，死于癌症的人数日益增加。随着生物医学的发展，癌症治疗方面已取得了突破性进展。目前肿瘤的主要治疗方式是手术、放疗及化疗的综合治疗，虽然在一定程度上可以缓解患者疼痛并使肿瘤体积缩小，但这些方法有着明显的局限性，包括肿瘤复发、药物耐受、以及机体毒副作用。近年来癌症研究人员研发出了一种新型癌症疗法即细菌介导的肿瘤疗法，用来解决目前临床上存在的问题。肿瘤微环境是肿瘤存在的细胞环境，很大程度上决定了肿瘤的生存和发展。肿瘤组织中不规则脉管系统导致的低氧、免疫抑制和营养丰富等独特的微环境使得兼性厌氧菌特异性地在此定居、繁殖，从而显示出细菌对肿瘤的高度靶向特异性。在细菌靶向定居肿瘤的过程中，细菌的病原相关分子模式，包括脂多糖、鞭毛蛋白、核酸等，会被机体的模式识别受体识别，通过激活相应的炎症信号通路，募集免疫细胞，引发强烈的炎症反应，并进一步激活机体的固有免疫反应与适应性免疫反应，从而杀死肿瘤细胞。

细菌介导的癌症治疗的一个关键优势是细菌在肿瘤中选择性积聚，细菌在肿瘤中浓度达到正常器官的一千倍，甚至一万倍以上。目前被广泛研究的细菌包括沙门氏菌、李斯特菌、大肠杆菌等均有显著的抗肿瘤活性。其中，由于工程改造的减毒鼠伤寒沙门氏菌具有高度靶向多种实体瘤、肿瘤组织穿透能力强、广谱的抑癌效果和安全性等优势，而被广泛应用于抗癌研究。

但是，如果细菌在靶向肿瘤细胞的过程中过度增殖，可能会对正常组织产生杀伤能力，产生细菌治疗方面的安全性问题。另一方面，对于工程化的细菌在输送某些抗癌药物到达肿瘤部位的时候，如果细菌增殖过快，引起机体免疫反应的速度就会越快，此时对于评估该肿瘤治疗药物的效果会有很大影响。因此构建抗癌效果好和细菌增殖能力可控性的减毒菌株对提高细菌治疗肿瘤的安全性非常关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种可控生长工程菌及其制备方法，可控生长工程菌在aroA突变或relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌基础上，将携带dapA基因上下游各1kb DNA片段的自杀质粒pDM4-dapA-U+D通过接合转移的方法转入至SL7207或ΔppGpp菌株中，进行dapA基因的敲除，构建了DAP营养缺陷型沙门氏菌突变体，该突变体感染机体后，无法在无DAP小分子的组织中增殖或持续存在，很快被机体清除。在该突变体靶向肿瘤后，通过瘤内注射DAP小分子，提高沙门氏菌L-赖氨酸的生产能力，从而可以使得肿瘤部位的可控生长工程菌继续增殖，实现在细菌治疗肿瘤的过程中减毒工程菌的可控生长，提高肿瘤治疗的安全性。

为了实现上述目的，本发明提供了一种可控生长工程菌，所述可控生长工程菌为在鼠伤寒沙门氏菌基础上，进行dapA基因的敲除，构建了二氨基庚二酸(diaminopimelate，DAP)营养缺陷型沙门氏菌突变体。

上述的可控生长工程菌，进一步的，所述鼠伤寒沙门氏菌为aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌SL7207或relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌14028s/ΔppGpp。

具体为：在aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌SL7207或relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌14028s/ΔppGpp基础上，将携带dapA基因上下游各1kb DNA片段的自杀质粒pDM4-dapA-U+D通过接合转移的方法转入至SL7207或ΔppGpp菌株中，进行dapA基因的敲除，构建了DAP营养缺陷型沙门氏菌突变体SL7207/ΔdapA或DAP营养缺陷型沙门氏菌突变体ΔppGpp/ΔdapA，该突变体感染机体后，无法在无DAP小分子的组织中增殖或持续存在，很快被机体清除。在该突变体靶向肿瘤后，通过瘤内注射DAP小分子，可以使得SL7207/dapA或ΔppGpp/ΔdapA重新获得增殖能力，从而获得可控生长工程菌。

基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的可控生长工程菌的构建方法，包括以下步骤：

S1、构建携带dapA基因上游和下游序列的重组自杀质粒pDM4-dapA U+D；

S2、将所述重组自杀质粒pDM4-dapA U+D导入至鼠伤寒沙门氏菌株中，通过两次同源重组，获得不能增殖的可控生长工程菌。

上述的构建方法，进一步的，还包括以下步骤：

S3、DAP小分子鉴定所述可控生长工程菌。

上述的构建方法，进一步的，所述S3具体包括以下步骤：

S3-1、将所述可控生长工程菌在LB培养基中培养，细菌不生长；

S3-2、通过外源加入DAP分子，恢复增殖能力的细菌则为dapA突变的鼠伤寒沙门氏菌。

上述的构建方法，进一步的，所述S1具体包括以下步骤：

S1-1、根据aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌株SL7207基因组DNA设计两组引物：用于扩增包含dapA基因上游DNA片段的引物1和引物2；以及用于扩增包含dapA基因下游的DNA片段的引物3和引物4；

S1-2、通过Crossover PCR的方法，利用引物1和引物4扩增dapA基因上游1kb和下游1kb相连片段，获得dapA基因上游和下游相连的扩增产物；

S1-3、酶切所述dapA基因上游和下游相连的扩增产物和pDM4自杀质粒载体；

S1-4、将酶切后的扩增产物连接到酶切后的pDM4自杀质粒上得到重组自杀质粒pDM4-dapA U+D。

上述的构建方法，进一步的，所述S1具体包括以下步骤：

S1-1、根据relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌14028s/ΔppGpp基因组DNA设计两组引物：用于扩增包含dapA基因上游DNA片段的引物1和引物2；以及用于扩增包含dapA基因下游的DNA片段的引物3和引物4；

S1-2、通过Crossover PCR的方法，利用引物1和引物4扩增dapA基因上游1kb和下游1kb相连片段，获得dapA基因上游和下游相连的扩增产物；

S1-3、酶切所述dapA基因上游和下游相连的扩增产物和pDM4自杀质粒载体；

S1-4、将酶切后的扩增产物连接到酶切后的pDM4自杀质粒上得到重组自杀质粒pDM4-dapA U+D。

上述的构建方法，进一步的，所述引物1的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；所述引物2的DNA序列如SEQ ID NO.6所示；所述引物3的DNA序列如SEQ ID NO.7所示；所述引物4的DNA序列如SEQ ID NO.8所示。

上述的构建方法，进一步的，所述S2具体包括以下步骤：

S2-1、将所述重组自杀质粒pDM4-dapA U+D通过接合转移的方法导入鼠伤寒沙门氏菌株中，重组自杀质粒pDM4-dapA U+D与鼠伤寒沙门氏菌株基因组发生第一次同源重组；

S2-2、将转入重组自杀质粒pDM4-dapA U+D的鼠伤寒沙门氏菌株在10％蔗糖培养基上进行培养，通过自杀质粒pDM4上含有的sacB基因进行二次同源重组，通过筛选得到沙门氏菌营养缺陷菌株。

基于一个总的技术构思，本发明还提供了所述的可控生长工程菌在制备治疗癌症药物中的应用。

以减毒鼠伤寒沙门氏菌株SL7207或ΔppGpp为原菌株，通过自杀质粒同源重组的方式敲除SL7207或ΔppGpp菌株基因组中细胞壁合成的重要基因dapA基因，dapA基因突变体菌株不能继续增殖，只有在外源添加DAP小分子的条件下细菌可以重新恢复增殖能力，因此可以进一步将该突变体菌株工程为携带肿瘤治疗药物的载体，SL7207/ΔdapA突变菌株或ΔppGpp/ΔdapA突变菌株在靶向肿瘤的过程中不能过度增殖，减小了对正常组织的杀伤能力，通过瘤内注射DAP小分子，使得靶向定位到肿瘤中的细菌重新恢复增殖能力，同时突变体菌株中含有可诱导表达的裂解酶系统，突变体菌株在肿瘤部位达到工作剂量，通过诱导细菌裂解，可以释放大量的肿瘤治疗药物，大大提高药物对肿瘤的杀伤能力，同时在细菌载体靶向肿瘤的过程中，减少对正常组织的损害，提高细菌治疗肿瘤的安全性。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明提供了一种可控生长工程菌，以减毒鼠伤寒沙门氏菌株SL7207或ΔppGpp为原菌株，SL7207和ΔppGpp具有高度肿瘤靶向特异性及良好的抑癌效果，在SL7207和ΔppGpp的基础上进行基因工程，敲除沙门氏菌细胞壁合成的重要基因dapA基因，细菌不能过度增殖，在外源添加DAP小分子的条件下细菌可以重新增殖，构建了DAP营养缺陷型可控生长的沙门氏菌突变体SL7207/ΔdapA以及ΔppGpp/ΔdapA。

(2)本发明提供了一种可控生长重组工程菌的构建方法，在aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌SL7207或relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌14028s/ΔppGpp基础上，通过接合转移的方法将携带dapA基因上下游各1kb DNA片段的自杀质粒pDM4-dapA-U+D转入至所述aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌中，通过两次同源重组发生，进行dapA基因的敲除，构建了DAP营养缺陷型沙门氏菌突变体SL7207/ΔdapA和ΔppGpp/ΔdapA，该突变体感染机体后，无法在无DAP小分子的组织中增殖或持续存在，可以进一步防止在细菌靶向肿瘤的过程中过度增殖。另外，在该突变体靶向肿瘤后，通瘤内注射DAP小分子，可以使得SL7207/ΔdapA和ΔppGpp/ΔdapA重新获得增殖能力，从而获得可控生长工程菌。

(3)本发明提供了一种可控生长重组工程菌在制备治疗癌症药物中的应用，解决了细菌在靶向肿瘤细胞的过程中过度增殖对正常组织产生杀伤能力的缺陷，本发明的可控生长重组工程菌是一种抗癌效果好和细菌增殖能力可控性的减毒菌株，提高了细菌治疗肿瘤的安全性。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1是本发明实施例1中用固体培养基筛选可控生长减毒重组工程菌dapA突变菌株图。

图2是本发明实施例1中用引物1和引物4以及用于扩增dapA基因的引物分别进行的PCR鉴定图。

图3是本发明实施例1中可控生长减毒重组工程菌在不同DAP浓度下的生长曲线图。

图4是本发明实施例2中用固体培养基筛选可控生长减毒重组工程菌dapA突变菌株图。

图5是本发明实施例2中用引物1和引物4以及用于扩增dapA基因的引物分别进行的PCR鉴定图。

图6是本发明实施例2中可控生长减毒重组工程菌在不同DAP浓度下的生长曲线图。

图7是本发明实施例3中可控生长减毒重组工程菌SL7207/ΔdapA在体内的生长控制菌落计数结果图。

图8是本发明实施例3中可控生长减毒重组工程菌ΔppGpp/ΔdapA在体内的生长控制菌落计数结果图。

具体实施方式

以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

实施例

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1：

一种可控生长工程菌，在aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌SL7207基础上，将携带dapA基因上下游各1kb DNA片段的自杀质粒pDM4-dapA-U+D通过接合转移的方法转入至SL7207菌株中，通过自杀质粒与细菌基因组发生两次同源重组，进行dapA基因的敲除，构建了DAP营养缺陷型沙门氏菌突变体SL7207/ΔdapA。

aroA基因片段的序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：

atggaatccctgacgttacaacccatcgcgcgggtcgatggcgccattaatttacctggctccaaaagtgtttcaaaccgtgctttgctcctggcggctttagcttgtggtaaaaccgctctgacgaatctgctggatagcgatgacgtccgccatatgctcaatgccctgagcgcgttggggatcaattacaccctttctgccgatcgcacccgctgtgatatcacgggtaatggcggcgcattacgtgcgccaggcgctctggaactgtttctcggtaatgccggaaccgcgatgcgtccgttagcggcagcgctatgtctggggcaaaatgagatagtgttaaccggcgaaccgcgtatgaaagagcgtccgataggccatctggtcgattcgctgcgtcagggcggggcgaatattgattacctggagcaggaaaactatccgcccctgcgtctgcgcggcggttttaccggcggcgacattgaggttgatggtagcgtttccagccagttcctgaccgctctgctgatgacggcgccgctggcccctaaagacacaattattcgcgttaaaggcgaactggtatcaaaaccttacatcgatatcacgctaaatttaatgaaaacctttggcgtggagatagcgaaccaccactaccaacaatttgtcgtgaagggaggtcaacagtatcactctccaggtcgctatctggtcgagggcgatgcctcgtcagcgtcctattttctcgccgctggggcgataaaaggcggcacggtaaaagtgaccggaattggccgcaaaagtatgcagggcgatattcgttttgccgatgtgctggagaaaatgggcgcgaccattacctggggcgatgattttattgcctgcacgcgcggtgaattgcacgccatagatatggatatgaaccatattccggatgcggcgatgacgattgccaccacggcgctgtttgcgaaaggaaccacgacgttgcgcaatatttataactggcgagtgaaagaaaccgatcgcctgttcgcgatggcgaccgagctacgtaaagtgggcgctgaagtcgaagaagggcacgactatattcgtatcacgccgccggcgaagctccaacacgcggatattggcacgtacaacgaccaccgtatggcgatgtgcttctcactggtcgcactgtccgatacgccagttacgatcctggaccctaaatgtaccgcaaaaacgttccctgattatttcgaacaactggcgcgaatgagtacgcctgcctaa。

dapA基因片段的序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：

atgttcacgggaagtattgtcgcgcttgttacgccgatggatgagaaaggtaacgtcagtaggtcttgcctgaaaaaactcattgattatcatgtcgccaacggtacctcggcgattgtttcggttggcactaccggcgagtctgccacgctaagccatgatgaacatggcgatgtcgtgatgatgacgctggaactggctgacggacgtattccggttatcgccggcacgggcgcaaacgcgaccgcggaagcgattagcctgacgcagcgttttaacgatagcggtattgtaggctgcctgacggtaacgccgtactacaatcgccccacgcaggaaggtttgttccagcatttcaaagccatcgcggaacacactgacttgccgcaaattctgtataatgtgccgtcccgtaccggttgcgatatgttgccggaaaccgtgggtcgtctggcggaaataaaaaatattatcgctatcaaagaggcgacagggaacttaacccgcgttcaccagatcaaagagctggtttcagacgattttattctgcttagcggcgatgacgcgtctgcgctggactttatgcaactgggtggtcatggcgtgatttccgttacggctaacgtagcggcgcgcgagatggctgacatgtgcaaactggcggcggaagggcaatttgccgaggcgcgcgctatcaaccagcgtctgatgccgttacacaacaaactatttgtcgaacccaatcctatcccggtgaaatgggcatgtaaggcattgggtcttgtggcgaccgacacgctgcgcctgccaatgacgcctatcacggaccatggtcgtgacatcgtcaaagcagcgcttcagcatgctggcctgctgtaa。

L-赖氨酸是细菌细胞壁的重要成分，dapA基因是L-赖氨酸生物合成途径中的关键酶—4-羟基四氢二吡啶甲酸合成酶的编码基因，其功能是催化(S)-天冬氨酸-β-半醛[(S)-ASA]和丙酮酸缩合为4-羟基-四氢二吡啶甲酸，可控生长工程菌通过对控制细菌细胞壁生长的dapA基因进行敲除，使得缺失dapA基因的沙门氏菌不能合成细胞壁，在细菌靶向肿瘤的过程中不能增殖，从而减少了对正常组织的破坏。

具体的构建方法为：

(1)制备携带目的基因dapA上下游各1kb片段的pDM4-dapA-U+D自杀质粒，其方法包括以下步骤：

1.1、以aroA基因突变的鼠伤寒沙门氏菌株SL7207基因组DNA为模版，通过PCR扩增dapA基因上下游各1kb片段。

dapA基因上游1kb片段的序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：

cggacaaaagggtaaagttcagcagctctttttcagcgaaacgggagagtttttcaggtttatcggtgctgatgcccagcacgtccacgcctgcttttttgagctcgtccatgttatcgcgtaagccgcaggcctgcacggtacagccgggtgtcatggcttttgggtagaaataaaccagaacgcgctgtccctggaagtcggtcaaatttacttgttccccgtcttgatccggcaagctaaatttcggtgcgatatcaccggctttcagtggattcattacttaactccatcctgttcatcatgttgtgagtaattgacgacgtttatactgccttgcgcattgagttctgtacatagtgctttaaaggcttgctcaatatttgcggaattttgcgacgccgggctatgtgcggtgatttgaataaataattgcgcagctttatcaccttcagccggctgcgtgcgggagaccagctccgcaatattcatttcatgactattaaacagcgcggtgaatcgctcaattaaatgcggggagtcggcgacctcaacctgaacccataccgtcgcgggcattgccgggcgggggcggtcggacgtccgtttcatcacaatcagcagatccagctccgcgccttttaacggcaatgtcgattcaatcaaggtaatcgcgttccacgtgccggacaacagcataataaacgtgaattcatcgcccagcatcgccagtcggctgtcttcgatattacagccgcaactgctgacatggcgagtaatggtattcacaataccgggcctgtcggcgcccagcgcagtgataaccaaatagtgttgtgatgacggtgtcaaaccagttattcctttgagcggtgaggtaatcttaaggaaaccataaaaaaaacctgcatacaacaatcagaacggctttggtcgcttgcttttattgccataccaaacgtaccattgagggacttgtttgcacagaggatggcccatg。

扩增dapA基因上游1kb片段的正向引物1序列为：5′-ggacgagctcgtccatgttatcgcgtaag-3′(SEQ ID NO.5)；

扩增dapA基因上游1kb片段的反向引物2序列为：5′-tctccctaaactttacatgggccatcctctgtgc-3′(SEQ ID NO.6)；

dapA基因下游1kb的序列如SEQ ID NO.4所示，具体为：

taaagtttagggagatttgatggcttactcagtacaaaagtcgcgcctggcgaaggttgcgggtgtttcgcttgttttgctgctcgctgcctgtagttccgattcgcgctacaagcgccaggtaagcggcgatgaatcctatctggatgccgcgccgcttgctgaacttcacgccccggcaggaatgatcctgccgataacgaccggcgactacgttattccggtcacgaaggggagcggcgcggttggtaaggcgttggatatccgtccgccggcgcagccgttagcgttagtgagcggcgcgcgtacccagttctctggcgataccgctacgctattggtggaaaatggccggagcagcacgctgtggccgcaagtcgtcagcgtgattcaggcgaaaaattatccgattgaaaaacgtgacgatgccagccagaccctgacgaccgattgggtgaactggaatcgcctggatgaagacgaacagtatcgtggacgttatcaaatctcggtgaagccgcagggctatcagcaggcggtaacggtaaaactggttaatctggaacaggctggcaagccggtcgctgacgcggcgtcgctgcagcgctatagcacggaaatgatgaacgtcatttccgccggtctggataagaccgctacggatgcggcaaatgccgcgcagaaccgttccgccgcaacgatggatgtgcagagcgccgctgatgataccggtttacctatgctggtcgttcgcggtccgttcaacctcgtgtggcagcgcctcccggccgcgctggaaaaagtgggcatgaaagtcaccgacagcactcgctctcagggcagcatggcggtaacgtacaaaccgttgtctgacagcgactggcgggatctgggcgctagcgacccgggcctggcatccggagactataaattgcaggttggcgatttagataaccgcagcagcttgcagtttatcgatcctaaggggcatactctgacg。

扩增dapA基因下游1kb片段的正向引物3序列为：5′-agaggatggcccatgtaaagtttagggagatttgatgg-3′(SEQ ID NO.7)；

扩增dapA基因下游1kb片段的反向引物4序列为：5′-cagggccccgtcagagtatgccccttag-3′(SEQ ID NO.8)；

PCR扩增体系为(50μL)：

扩增程序为：95℃预加热5分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。每一个循环中，先于95℃保持15秒使模板变性，然后将温度降到复性温度52℃，保持30秒使引物与模板充分退火；在72℃保持1分10秒，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环，重复该循环30次。最后在72℃保持5分钟，使产物延伸完整，4℃保存得到扩增产物。

1.2、用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，分别把目的长度1kb片段从凝胶中切下，并分离纯化目的DNA。

1.3、以上述纯化后的目的基因上游和下游DNA片段为引物1和4的模板进行PCR。

PCR扩增体系为(50μL)：

扩增程序为：95℃预加热5分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。每一个循环中，先于95℃保持15秒使模板变性，然后将温度降到复性温度52℃，保持30秒使引物与模板充分退火；在72℃保持2分钟，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环，重复该循环30次。最后在72℃保持5分钟，使产物延伸完整，4℃保存得到扩增产物。

1.4、用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，把目的长度2kb片段从凝胶中切下，并分离纯化目的DNA。

1.5、酶切所述纯化扩增产物和pDM4自杀质粒原始载体得到酶切后的扩增产物和酶切后的原始载体

1.6、将酶切后的扩增产物连接到酶切后的原始载体上得到携带dapA上下游各1kb片段的自杀质粒pDM4-dapA U+D。

(2)将自杀质粒pDM4-dapA U+D转化进入SM10大肠杆菌供体菌中，通过接合转移的方法导入鼠伤寒沙门氏菌SL7207中，在含有氯霉素的固体培养基中筛选含有自杀质粒的阳性克隆。进入到SL7207菌株里面的自杀质粒，由于和细菌基因组具有同源片段，因此可以和SL7207基因组发生第一次同源重组，自杀质粒整合到SL7207细菌基因组上。

(3)从上述阳性克隆的平板上挑选10-15个细菌菌落，并在LB液体培养基中扩大培养5小时后获得菌液。

(4)将上述菌液用LB稀释至不同浓度梯度(取100μL的菌液加入到900μl的LB培养基中浓度为10^-1，按此浓度比例分别稀释至10^-3、10^-4、10^-5、10^-6)，涂至含有10％蔗糖和100μg/mL DAP小分子的LB固体培养基上，37℃过夜培养。

由于自杀质粒含有编码蔗糖果聚糖酶sacB基因，可以催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖并产生高分子量的果聚糖，可造成细胞死亡。蔗糖致死自杀质粒，在含有蔗糖的固体培养基上可以进行反向选择，使得自杀质粒与SL7207细菌基因组发生第二次同源重组，获得两种类型的菌株，一种是野生型菌株，另外一种是dapA基因缺失突变型菌株。

(5)24小时之后从上述固体培养基上挑选100个单菌落，用牙签分别在LB平板、LB+氯霉素+DAP平板和LB+DAP平板上划线，过夜培养。

(6)比较LB平板、LB+氯霉素+DAP平板和LB+DAP平板的菌落生长，可以在LB+DAP平板上生长，但不能在LB和LB+氯霉素+DAP平板上生长的菌落可能是dapA基因缺失突变体。选择这些菌落，用引物1和引物4进行PCR鉴定，突变菌株可以扩增得到2kb DNA片段。

(7)第一次PCR鉴定筛选出突变菌株之后，将该菌株分别在LB+氯霉素+DAP平板和LB+DAP平板上划线纯化，该突变菌株可以在LB+DAP平板上生长，但不能在LB+氯霉素+DAP平板上生长。从LB+DAP平板上选择10个单克隆菌落，用引物1/引物4和扩增dapA基因的引物dapA-F/dapA-R进行PCR鉴定，突变菌株用引物1/引物4扩增得到2kb DNA片段，用扩增dapA基因的引物dapA-F/dapA-R不能扩增出DNA片段。

(8)用引物1/引物4进行PCR扩增，具体如下：

PCR扩增体系为(10μL)：

扩增程序为：95℃预加热5分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。每一个循环中，先于95℃保持15秒使模板变性，然后将温度降到复性温度52℃，保持30秒使引物与模板充分退火；在72℃保持3分钟，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环，重复该循环30次。最后在72℃保持5分钟，使产物延伸完整，4℃保存得到扩增产物。

用扩增dapA基因的引物dapA-F/dapA-R进行PCR扩增，具体如下：

dapA-F引物序列为：5′-cgcgcttgttacgccgatggat-3′(SEQ ID NO.9)；

dapA-R引物序列为：5′-gcgctgctttgacgatgtcacg-3′(SEQ ID NO.10)；

PCR扩增体系为(10μl)：

扩增程序为：95℃预加热5分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。每一个循环中，先于95℃保持15秒使模板变性，然后将温度降到复性温度62℃，保持30秒使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环，重复该循环30次。最后在72℃保持5分钟，使产物延伸完整，4℃保存得到扩增产物。

(8)将上述纯化验证之后的突变菌株分别在LB平板、LB+氯霉素+DAP平板和LB+DAP平板上再次划线验证，挑选出只在LB+DAP平板上生长的纯化突变菌株，从该突变菌株的LB+DAP平板上随机选择一个单克隆，分别用引物1/引物4和扩增dapA基因的引物dapA-F/dapA-R进行PCR鉴定，野生型SL7207菌株做对照。纯化突变菌株用引物1/引物4扩增得到2kb DNA片段，野生型SL7207菌株扩增得到2879bp的DNA片段，纯化突变菌株用扩增dapA基因的引物dapA-F/dapA-R没有扩增出DNA片段，野生型SL7207菌株扩增出目的基因的条带大小是879bp。

图1为用固体培养基筛选可控生长减毒重组工程菌dapA突变菌株图；(a)pDM4-dapA U+D与SL7207基因组发生第一次同源重组后，取不同浓度梯度菌液(10^-3、10^-4、10^-5、10^-6)，涂至含有10％蔗糖和100μg/mL DAP小分子的LB固体培养基上的平板图；(b)从蔗糖培养基上挑选单菌落，用牙签分别在LB平板、LB+氯霉素+DAP平板和LB+DAP平板上划线的平板图；(c)筛选出突变菌株之后在LB+氯霉素+DAP平板和LB+DAP平板上划线纯化验证图；(d,e)纯化验证之后的突变菌株分别在LB平板、LB+氯霉素+DAP平板和LB+DAP平板上划线验证图。

图2是用引物1和引物4以及用于扩增dapA基因的引物分别进行的PCR鉴定图。(a)划线纯化后的突变菌株以及野生型SL7207用引物1和引物4做PCR鉴定图，突变菌株扩增的条带大小是2kb，野生型SL7207菌株扩增条带大小是2879bp；(b)划线纯化后的突变菌株以及野生型SL7207用扩增dapA基因的引物做PCR鉴定图，突变菌株没有扩增出dapA基因的条带，野生型SL7207菌株扩增出目的基因的条带大小是879bp。

(9)挑选上述鉴定成功的单个细菌菌落，并在LB+DAP液体培养基中扩大培养获得可控生长减毒重组工程菌菌液。

(10)在可控生长减毒重组工程菌菌液中添加50％甘油，-80℃以备长期实验使用。

实验：考察可控生长减毒重组工程菌SL7207/ΔdapA在不同DAP浓度中的生长曲线：

1、重组工程菌培养：

实验组：实施例1的可控生长减毒重组工程菌(SL7207/ΔdapA)；

对照组：野生型减毒鼠伤寒沙门氏菌(SL7207)。

2、生长曲线测定：

2.1、接种SL7207/ΔdapA至LB+DAP培养基中，SL7207至LB培养基中过夜摇菌。

2.2、将过夜培养的SL7207/ΔdapA菌液至30mL不同DAP浓度(0、20μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)的LB液体培养基中、使得菌浓度达1×10⁷CFU/mL测定突变菌株生长曲线，过夜培养的SL7207菌液接种至30mL LB液体培养基中、使得菌浓度达1×10⁷CFU/mL作为生长曲线测定的对照组。

2.3、分别在2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h取出上述菌液测定OD₆₀₀值，得到细菌生长曲线图。

图3是可控生长减毒重组工程菌在不同DAP浓度下的生长曲线图，从图中可以看出：SL7207/ΔdapA突变菌株在没有小分子DAP的情况下，完全失去了增殖能力，OD₆₀₀值一直保持在初始值；在很少量DAP小分子(20μg/mL)存在的情况下，SL7207/ΔdapA突变菌株就能够恢复其原有的增殖能力，其生长曲线和高浓度小分子存在状态下SL7207/ΔdapA突变菌株的生长曲线以及野生型的SL7207生长曲线几乎完全吻合。突变菌株生长曲线图表明低剂量的DAP小分子就可以使得SL7207/ΔdapA突变菌株恢复其增殖能力，因此可以通过低剂量小分子控制突变菌株的生长，证明该突变菌株有潜力应用于体内实验。

实施例2

本发明的可控生长的鼠伤寒沙门氏菌菌株ΔppGpp/ΔdapA，在relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌14028s/ΔppGpp基础上，通过接合转移将携带dapA基因的自杀质粒pDM4-dapA-U+D转入至ΔppGpp菌株中，通过自杀质粒与细菌基因组发生两次同源重组，进行dapA基因的敲除，构建了DAP营养缺陷型沙门氏菌突变体ΔppGpp/ΔdapA，该突变体感染机体后，无法在无DAP小分子的组织中增殖或持续存在。

具体构建方法：以relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌14028s(ΔppGpp)基因组DNA为模版，通过PCR扩增dapA基因上下游各1kb片段。其构建方法和所采用的引物与实施例1一致。

图4为用固体培养基筛选可控生长减毒重组工程菌dapA突变菌株图；(a)pDM4-dapA U+D与ΔppGpp基因组发生第一次同源重组后，取不同浓度梯度菌液(10^-3、10^-4、10^-5、10^-6)，涂至含有10％蔗糖和100μg/mL DAP小分子的LB固体培养基上的平板图；(b)从蔗糖培养基上挑选单菌落，用牙签分别在LB平板、LB+氯霉素+DAP平板和LB+DAP平板上划线的平板图；(c)筛选出突变菌株之后在LB+氯霉素+DAP平板和LB+DAP平板上划线纯化验证图；(d,e)纯化验证之后的突变菌株分别在LB平板、LB+氯霉素+DAP平板和LB+DAP平板上划线验证图。

图5是用引物1和引物4以及用于扩增dapA基因的引物分别进行的PCR鉴定图；(a)划线纯化后的突变菌株以及野生型ΔppGpp用引物1和引物4做PCR鉴定图，突变菌株扩增的条带大小是2kb，野生型ΔppGpp菌株扩增条带大小是2879bp；(b)划线纯化后的突变菌株以及野生型ΔppGpp用扩增dapA基因的引物做PCR鉴定图，突变菌株没有扩增出dapA基因的条带，野生型ΔppGpp菌株扩增出目的基因的条带大小是879bp。

实验：考察可控生长减毒重组工程菌ΔppGpp/ΔdapA在不同DAP浓度中的生长曲线：

1、重组工程菌培养：

实验组：实施例2的可控生长减毒重组工程菌(ΔppGpp/ΔdapA)；

对照组：野生型减毒鼠伤寒沙门氏菌(ΔppGpp)。

2、生长曲线测定：

2.1、接种ΔppGpp/ΔdapA至LB+DAP培养基中，ΔppGpp至LB培养基中过夜摇菌。

2.2、将过夜培养的ΔppGpp/ΔdapA菌液至30mL不同DAP浓度(0、20μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)的LB液体培养基中、使得菌浓度达1×10⁷CFU/mL测定突变菌株生长曲线，过夜培养的ΔppGpp菌液接种至30mL LB液体培养基中、使得菌浓度达1×10⁷CFU/mL作为生长曲线测定的对照组。

2.3、分别在2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h取出上述菌液测定OD₆₀₀值，得到细菌生长曲线图。

图6是可控生长减毒重组工程菌在不同DAP浓度下的生长曲线图，从图中可以看出：ΔppGpp/ΔdapA突变菌株在没有小分子DAP的情况下，完全失去了增殖能力，OD₆₀₀值一直保持在初始值；在很少量DAP小分子(20μg/mL)存在的情况下，ΔppGpp/ΔdapA突变菌株就能够恢复其原有的增殖能力，其生长曲线和高浓度小分子存在状态下ΔppGpp/ΔdapA突变菌株的生长曲线以及野生型的ΔppGpp生长曲线几乎完全吻合。突变菌株生长曲线图表明低剂量的DAP小分子就可以使得ΔppGpp/ΔdapA突变菌株恢复其增殖能力，因此可以通过低剂量小分子控制突变菌株的生长，证明该突变菌株有潜力应用于体内实验。

实施例3：

一种可控生长工程菌在介导的癌症治疗中的应用，具体的应用方法为：

组别1：在CT26皮下肿瘤模型中，分别尾静脉注射1.0×10⁷CFU可控生长减毒重组工程菌SL7207/ΔdapA、SL7207/ΔdapA+DAP(瘤内注射)、SL7207和PBS溶液，分别在1、2、3天后，取小鼠的肿瘤组织。将测量重量后的组织器官在PBS缓冲液中匀浆，然后采用10倍梯度稀释法将适当浓度的样品涂抹在含有DAP的细菌培养平板上，经37℃过夜培养后进行活菌落计数，并根据组织器官的重量计算组织中细菌的浓度(菌落/克)。

组别2：在CT26皮下肿瘤模型中，分别尾静脉注射1.0×10⁷CFU可控生长减毒重组工程菌ΔppGpp/ΔdapA、ΔppGpp/ΔdapA+DAP(瘤内注射)、SL7207(ΔppGpp)和PBS溶液，分别在1、2、3天后，取小鼠的肿瘤组织。将测量重量后的组织器官在PBS缓冲液中匀浆，然后采用10倍梯度稀释法将适当浓度的样品涂抹在含有DAP的细菌培养平板上，经37℃过夜培养后进行活菌落计数，并根据组织器官的重量计算组织中细菌的浓度(菌落/克)。

图7和图8分别是本发明可控生长减毒重组工程菌SL7207/ΔdapA和ΔppGpp/ΔdapA在体内的生长控制菌落计数结果图。可以观察到SL7207/ΔdapA和ΔppGpp/ΔdapA在到达体内之后，由于小鼠体内的免疫清除，到达肿瘤内的SL7207/ΔdapA和ΔppGpp/ΔdapA突变菌株不断减少，但是同时在瘤内注射DAP小分子的实验组，SL7207/ΔdapA和ΔppGpp/ΔdapA突变菌株在到达肿瘤部位之后恢复其正常的增殖能力，与野生型的SL7207在到达肿瘤后增殖的情况相似。因此，该突变菌株的体内生长可控性，有利于其在细菌靶向治疗肿瘤领域的应用

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

序列表

<110> 湖南大学

<120> 可控生长工程菌及其构建方法和应用

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1284

<212> DNA

<213> 沙门氏菌(Salmonella)

<400> 1

atggaatccc tgacgttaca acccatcgcg cgggtcgatg gcgccattaa tttacctggc 60

tccaaaagtg tttcaaaccg tgctttgctc ctggcggctt tagcttgtgg taaaaccgct 120

ctgacgaatc tgctggatag cgatgacgtc cgccatatgc tcaatgccct gagcgcgttg 180

gggatcaatt acaccctttc tgccgatcgc acccgctgtg atatcacggg taatggcggc 240

gcattacgtg cgccaggcgc tctggaactg tttctcggta atgccggaac cgcgatgcgt 300

ccgttagcgg cagcgctatg tctggggcaa aatgagatag tgttaaccgg cgaaccgcgt 360

atgaaagagc gtccgatagg ccatctggtc gattcgctgc gtcagggcgg ggcgaatatt 420

gattacctgg agcaggaaaa ctatccgccc ctgcgtctgc gcggcggttt taccggcggc 480

gacattgagg ttgatggtag cgtttccagc cagttcctga ccgctctgct gatgacggcg 540

ccgctggccc ctaaagacac aattattcgc gttaaaggcg aactggtatc aaaaccttac 600

atcgatatca cgctaaattt aatgaaaacc tttggcgtgg agatagcgaa ccaccactac 660

caacaatttg tcgtgaaggg aggtcaacag tatcactctc caggtcgcta tctggtcgag 720

ggcgatgcct cgtcagcgtc ctattttctc gccgctgggg cgataaaagg cggcacggta 780

aaagtgaccg gaattggccg caaaagtatg cagggcgata ttcgttttgc cgatgtgctg 840

gagaaaatgg gcgcgaccat tacctggggc gatgatttta ttgcctgcac gcgcggtgaa 900

ttgcacgcca tagatatgga tatgaaccat attccggatg cggcgatgac gattgccacc 960

acggcgctgt ttgcgaaagg aaccacgacg ttgcgcaata tttataactg gcgagtgaaa 1020

gaaaccgatc gcctgttcgc gatggcgacc gagctacgta aagtgggcgc tgaagtcgaa 1080

gaagggcacg actatattcg tatcacgccg ccggcgaagc tccaacacgc ggatattggc 1140

acgtacaacg accaccgtat ggcgatgtgc ttctcactgg tcgcactgtc cgatacgcca 1200

gttacgatcc tggaccctaa atgtaccgca aaaacgttcc ctgattattt cgaacaactg 1260

gcgcgaatga gtacgcctgc ctaa 1284

<210> 2

<211> 879

<212> DNA

<213> 沙门氏菌(Salmonella)

<400> 2

atgttcacgg gaagtattgt cgcgcttgtt acgccgatgg atgagaaagg taacgtcagt 60

aggtcttgcc tgaaaaaact cattgattat catgtcgcca acggtacctc ggcgattgtt 120

tcggttggca ctaccggcga gtctgccacg ctaagccatg atgaacatgg cgatgtcgtg 180

atgatgacgc tggaactggc tgacggacgt attccggtta tcgccggcac gggcgcaaac 240

gcgaccgcgg aagcgattag cctgacgcag cgttttaacg atagcggtat tgtaggctgc 300

ctgacggtaa cgccgtacta caatcgcccc acgcaggaag gtttgttcca gcatttcaaa 360

gccatcgcgg aacacactga cttgccgcaa attctgtata atgtgccgtc ccgtaccggt 420

tgcgatatgt tgccggaaac cgtgggtcgt ctggcggaaa taaaaaatat tatcgctatc 480

aaagaggcga cagggaactt aacccgcgtt caccagatca aagagctggt ttcagacgat 540

tttattctgc ttagcggcga tgacgcgtct gcgctggact ttatgcaact gggtggtcat 600

ggcgtgattt ccgttacggc taacgtagcg gcgcgcgaga tggctgacat gtgcaaactg 660

gcggcggaag ggcaatttgc cgaggcgcgc gctatcaacc agcgtctgat gccgttacac 720

aacaaactat ttgtcgaacc caatcctatc ccggtgaaat gggcatgtaa ggcattgggt 780

cttgtggcga ccgacacgct gcgcctgcca atgacgccta tcacggacca tggtcgtgac 840

atcgtcaaag cagcgcttca gcatgctggc ctgctgtaa 879

<210> 3

<211> 1000

<212> DNA

<213> 沙门氏菌(Salmonella)

<400> 3

cggacaaaag ggtaaagttc agcagctctt tttcagcgaa acgggagagt ttttcaggtt 60

tatcggtgct gatgcccagc acgtccacgc ctgctttttt gagctcgtcc atgttatcgc 120

gtaagccgca ggcctgcacg gtacagccgg gtgtcatggc ttttgggtag aaataaacca 180

gaacgcgctg tccctggaag tcggtcaaat ttacttgttc cccgtcttga tccggcaagc 240

taaatttcgg tgcgatatca ccggctttca gtggattcat tacttaactc catcctgttc 300

atcatgttgt gagtaattga cgacgtttat actgccttgc gcattgagtt ctgtacatag 360

tgctttaaag gcttgctcaa tatttgcgga attttgcgac gccgggctat gtgcggtgat 420

ttgaataaat aattgcgcag ctttatcacc ttcagccggc tgcgtgcggg agaccagctc 480

cgcaatattc atttcatgac tattaaacag cgcggtgaat cgctcaatta aatgcgggga 540

gtcggcgacc tcaacctgaa cccataccgt cgcgggcatt gccgggcggg ggcggtcgga 600

cgtccgtttc atcacaatca gcagatccag ctccgcgcct tttaacggca atgtcgattc 660

aatcaaggta atcgcgttcc acgtgccgga caacagcata ataaacgtga attcatcgcc 720

cagcatcgcc agtcggctgt cttcgatatt acagccgcaa ctgctgacat ggcgagtaat 780

ggtattcaca ataccgggcc tgtcggcgcc cagcgcagtg ataaccaaat agtgttgtga 840

tgacggtgtc aaaccagtta ttcctttgag cggtgaggta atcttaagga aaccataaaa 900

aaaacctgca tacaacaatc agaacggctt tggtcgcttg cttttattgc cataccaaac 960

gtaccattga gggacttgtt tgcacagagg atggcccatg 1000

<210> 4

<211> 1000

<212> DNA

<213> 沙门氏菌(Salmonella)

<400> 4

taaagtttag ggagatttga tggcttactc agtacaaaag tcgcgcctgg cgaaggttgc 60

gggtgtttcg cttgttttgc tgctcgctgc ctgtagttcc gattcgcgct acaagcgcca 120

ggtaagcggc gatgaatcct atctggatgc cgcgccgctt gctgaacttc acgccccggc 180

aggaatgatc ctgccgataa cgaccggcga ctacgttatt ccggtcacga aggggagcgg 240

cgcggttggt aaggcgttgg atatccgtcc gccggcgcag ccgttagcgt tagtgagcgg 300

cgcgcgtacc cagttctctg gcgataccgc tacgctattg gtggaaaatg gccggagcag 360

cacgctgtgg ccgcaagtcg tcagcgtgat tcaggcgaaa aattatccga ttgaaaaacg 420

tgacgatgcc agccagaccc tgacgaccga ttgggtgaac tggaatcgcc tggatgaaga 480

cgaacagtat cgtggacgtt atcaaatctc ggtgaagccg cagggctatc agcaggcggt 540

aacggtaaaa ctggttaatc tggaacaggc tggcaagccg gtcgctgacg cggcgtcgct 600

gcagcgctat agcacggaaa tgatgaacgt catttccgcc ggtctggata agaccgctac 660

ggatgcggca aatgccgcgc agaaccgttc cgccgcaacg atggatgtgc agagcgccgc 720

tgatgatacc ggtttaccta tgctggtcgt tcgcggtccg ttcaacctcg tgtggcagcg 780

cctcccggcc gcgctggaaa aagtgggcat gaaagtcacc gacagcactc gctctcaggg 840

cagcatggcg gtaacgtaca aaccgttgtc tgacagcgac tggcgggatc tgggcgctag 900

cgacccgggc ctggcatccg gagactataa attgcaggtt ggcgatttag ataaccgcag 960

cagcttgcag tttatcgatc ctaaggggca tactctgacg 1000

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical sequence)

<400> 5

ggacgagctc gtccatgtta tcgcgtaag 29

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical sequence)

<400> 6

tctccctaaa ctttacatgg gccatcctct gtgc 34

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical sequence)

<400> 7

agaggatggc ccatgtaaag tttagggaga tttgatgg 38

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical sequence)

<400> 8

cagggccccg tcagagtatg ccccttag 28

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical sequence)

<400> 9

cgcgcttgtt acgccgatgg at 22

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artifical sequence)

<400> 10

gcgctgcttt gacgatgtca cg 22

Claims (9)

1.一种可控生长工程菌，其特征在于，所述可控生长工程菌为在鼠伤寒沙门氏菌基础上，进行dapA基因的敲除，构建了DAP营养缺陷型沙门氏菌突变体。

2.根据权利要求1所述的可控生长工程菌，其特征在于，所述鼠伤寒沙门氏菌为aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌SL7207或relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌14028s/ΔppGpp。

3.一种权利要求1或2所述的可控生长工程菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、构建携带dapA基因上游和下游序列的重组自杀质粒pDM4-dapA U+D；

S2、将所述重组自杀质粒pDM4-dapA U+D导入至鼠伤寒沙门氏菌株中，通过两次同源重组，获得不能增殖的可控生长工程菌。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：

S3、DAP小分子鉴定所述可控生长工程菌。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述S3具体包括以下步骤：

S3-1、将所述可控生长工程菌在LB培养基中培养，细菌不生长；

S3-2、通过外源加入DAP分子，恢复增殖能力的细菌则为dapA突变的鼠伤寒沙门氏菌。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述S1具体包括以下步骤：

S1-1、根据aroA突变的鼠伤寒沙门氏菌株SL7207基因组DNA或根据relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌14028s/ΔppGpp基因组DNA设计两组引物：用于扩增包含dapA基因上游DNA片段的引物1和引物2；以及用于扩增包含dapA基因下游的DNA片段的引物3和引物4；

S1-2、通过Crossover PCR的方法，利用引物1和引物4扩增dapA基因上游1kb和下游1kb相连片段，获得dapA基因上游和下游相连的扩增产物；

S1-3、酶切所述dapA基因上游和下游相连的扩增产物和pDM4自杀质粒载体；

S1-4、将酶切后的扩增产物连接到酶切后的pDM4自杀质粒上得到重组自杀质粒pDM4-dapA U+D。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述引物1的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；所述引物2的DNA序列如SEQ ID NO.6所示；所述引物3的DNA序列如SEQ ID NO.7所示；所述引物4的DNA序列如SEQ ID NO.8所示。

8.根据权利要求3至5中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述S2具体包括以下步骤：

S2-1、将所述重组自杀质粒pDM4-dapA U+D通过接合转移的方法导入鼠伤寒沙门氏菌株中，重组自杀质粒pDM4-dapA U+D与鼠伤寒沙门氏菌株基因组发生第一次同源重组；

S2-2、将转入重组自杀质粒pDM4-dapA U+D的鼠伤寒沙门氏菌株在10％蔗糖培养基上进行培养，通过自杀质粒pDM4上含有的sacB基因进行二次同源重组，通过筛选得到沙门氏菌营养缺陷菌株。

9.一种权利要求1或2所述的可控生长工程菌在制备治疗癌症药物中的应用。

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