CN110747155A - 减毒重组工程菌及其制备方法、应用和肿瘤靶向药物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种减毒重组工程菌及其制备方法、应用和肿瘤靶向药物，以relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌为载体，将编码ClyA基因的重组质粒转入至所述relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌中获得减毒重组工程菌。其制备方法包括：构建重组质粒、制备relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌、导入。减毒重组工程菌通过携带编码细胞溶素的质粒，在细菌靶向肿瘤后过量表达ClyA蛋白，通过破坏细胞膜的完整性，有效地杀死肿瘤基质细胞和肿瘤细胞，可应用于制备肿瘤靶向药物。

Description

减毒重组工程菌及其制备方法、应用和肿瘤靶向药物
技术领域
本发明涉及医疗技术领域，尤其涉及减毒重组工程菌及其制备方法、应用和肿瘤靶向药物。
背景技术
胰腺癌(pancreatic cancer)是一种恶化恶性程度极高的消化系统肿瘤，其发病率和死亡率近年来在全球范围内呈明显上升趋势。目前对胰腺癌缺乏有效的早期诊断与治疗措施，导致胰腺癌患者整体5年生存率不足8％，给人类生命健康造成了严重威胁。根据我国国家肿瘤防控中心2018年发表数据表明：在2014年，我国有超过8万人死于胰腺癌，位居所有癌症第六位，仅次于肺癌、肝癌、胃癌、食道癌和结直肠癌。因此，对于胰腺癌的早期诊断及治疗药物的研发显得极具必要性和迫切性。
由于生理结构的复杂性，以及缺乏相应的早期诊断措施，使得手术治疗仅适合不到20％的新发患者群体。化学疗法对于胰腺癌患者有一定的治疗效果，但同时也伴随着严重的副作用以及耐药性。近年来，免疫检查点疗法(immunocheckpoint therapy)已通过FDA的批准而被广泛应用于临床肿瘤患者的治疗。该类药物主要通过阻断抑制T细胞活化的信号通路，从而使T细胞被充分活化达到杀死肿瘤细胞的目的。尤其在黑色素瘤、非小细胞肺癌等肿瘤患者的治疗中，已取得了显著的临床效果。通过对肿瘤微环境的分析发现，对于T细胞浸润贫乏的肿瘤，包括胰腺癌、卵巢癌等这一类的“冷肿瘤”，免疫检查点疗法并无显著效果。胰腺癌组织中含有异常丰富的基质细胞(stromal cells)，这些基质细胞通过释放多种免疫抑制因子，包括转化生长因子β(TGF-β)、白介素6(IL-6)、白介素10(IL-10)等，抑制免疫细胞的活化，降低免疫治疗的效果。胰腺癌含有丰富的肿瘤基质细胞而加大了治疗难度，使肿瘤组织中免疫受到抑制，增强了肿瘤组织对抗癌药物的耐药性。由于当前治疗方案对胰腺癌并无显著的治疗效果，对于胰腺癌靶向治疗药物的研发迫切需要寻找新的方向。
重组菌对实体瘤具有广谱的靶向性，如果细菌疗法能够靶向杀伤基质细胞或许能为临床胰腺癌患者治疗提供新的思路。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种减毒重组工程菌及其制备方法、应用和肿瘤靶向药物，减毒重组工程菌通过携带编码细胞溶素(Cytolysin A,ClyA)的质粒，在细菌靶向肿瘤后过量表达ClyA蛋白，通过破坏细胞膜的完整性，有效地杀死肿瘤基质细胞和肿瘤细胞，坏死的肿瘤组织细胞为细菌的生长、繁殖提供了丰富的营养物质，进一步强化炎症反应，提升对肿瘤的杀伤能力。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种减毒重组工程菌，其特征在于，以relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)为载体，将编码ClyA基因的重组质粒转入至所述relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌中获得减毒重组工程菌。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了上述的减毒重组工程菌的制备方法，包括以下步骤：
S1、构建编码ClyA基因的重组质粒；
S2、制备减毒的鼠伤寒沙门氏菌；
S3、将所述重组质粒导入至减毒的鼠伤寒沙门氏菌中获得减毒重组工程菌。
上述的制备方法，进一步的，所述S1具体包括以下步骤：
S1-1、根据人的伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)基因组DNA设计引物对，进行PCR扩增获得扩增产物；
S1-2、酶切所述扩增产物和原始载体得到酶切后的扩增产物和酶切后的原始载体；
S1-3、将所述酶切后的扩增产物连接到所述酶切后的原始载体上得到重组质粒。
上述的制备方法，进一步的，所述S1-1中所述引物对为SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所述的DNA序列。
上述的制备方法，进一步的，所述S2具体包括以下步骤：
S2-1、针对relA和spotT基因序列设计relA引物对和spoT引物对，以pKD4质粒作为relA引物对模板，以pKD3质粒作为spoT引物对模板进行PCR扩增得到扩增产物；
S2-2、将所述S2-1中所述扩增产物通过电转化导入感受态细胞中，得到P22噬菌体；
S2-3、通过P22噬菌体转导，在14028s野生菌株同源重组靶向删除relA、spoT基因，获得relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌。
上述的制备方法，进一步的，所述relA引物对为SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所述的DNA序列；所述spoT引物对为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所述的DNA序列。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了上述的减毒重组工程菌在制备肿瘤靶向药物中的应用。
上述的应用，进一步的，所述肿瘤靶向药物为胰腺癌靶向药物。
基于一个总的技术构思，本发明还提供了一种肿瘤靶向药物，包括权利要求1所述的减毒重组工程菌和阿拉伯糖。
上述的肿瘤靶向药物，进一步的，所述减毒重组工程菌的浓度为0.5～2.5×109cfu/kg；所述阿拉伯糖的浓度为2～6g/kg。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
(1)本发明提供了一种减毒重组工程菌，以减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)为载体，减毒鼠伤寒沙门氏菌(ppGpp)具有高度的肿瘤靶向特异性及良好的抑癌效果。同时，在减毒鼠伤寒沙门氏菌中导入表达ClyA基因的质粒，构建了高度弱化的非侵染性的合成缺陷的沙门氏菌突变体(ΔppGpp)，毒力仅是野生型细菌的百万分之一。这种细菌能够特异性地靶向多种肿瘤模型，且在肿瘤组织中的细菌浓度能达到脾脏、肝脏等正常组织浓度的一万倍以上(1×1010细菌/克肿瘤组织)，通过介导的胰腺癌靶向治疗，能够有效地抑制人的胰腺癌生长。
(2)本发明提供了一种减毒重组工程菌的制备方法，为了增强对胰腺癌的治疗效果，重组工程菌通过在肿瘤组织中持续过量表达溶癌蛋白(ClyA)，有效地杀死肿瘤基质细胞以及肿瘤细胞。我们将细胞溶素基因(ClyA)克隆到阿拉伯糖诱导的pBAD启动子系统中，并将其成功导入减毒沙门氏菌中，体外实验表明减毒重组工程菌表达的ClyA具有很好的溶血活性。
(3)本发明提供了一种肿瘤靶向药物，包括表达ClyA的减毒重组工程菌和阿拉伯糖，减毒重组工程菌能够非常特异性地定居肿瘤组织中，在阿拉伯糖的诱导下调控pBAD启动子以实现抗癌基因ClyA的可控化表达，在靶向杀死肿瘤的同时极大地降低了对正常组织的毒性，保持着对机体的高度安全性。同时，减毒重组工程菌治疗能够有效地促进免疫细胞在肿瘤组织中的浸润，同时破坏肿瘤基质细胞，降低免疫抑制信号，激活肿瘤免疫微环境，为临床胰腺癌治疗及联合疗法提供新的方法。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1是本发明实施例3中用血平板和蛋白免疫印迹鉴定ClyA在体外的活性及表达情况图。
图2是本发明实施例4中减毒重组工程菌在体内的分布及抗癌蛋白的表达情况图。
图3是本发明实施例5中减毒重组工程菌对胰腺癌皮下肿瘤的抑制效果图。
图4是本发明实施例6中减毒重组工程菌对原位胰腺癌的抑制效果图。
图5是本发明实施例7中减毒重组工程菌对肿瘤基质细胞破坏效果评估图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
实施例1：
一种本发明的减毒鼠伤寒沙门氏菌菌株(ΔppGpp)，由PSI和PSII两种合成酶合成，分别由relA和spotT基因编码，通过构建relA和spotT基因的双删除突变体，抑制ppGpp合成。
其具体的制备方法为：
(1)针对relA和spotT基因序列设计两对引物，每条引物至少包含40bp与目的基因互补配对，20bp与模板质粒互补。
relA正向引物序列为：
5′-gtggatcgcaagcctgggaatttccagccagcagtcgtgtgagcgcttaggtgtaggctggagctgcttc-3′(SEQ ID NO.4)；
relA反向引物序列为：
5′-gtgcagtcgccgtgcatcaatcacatccggcacctggttcagcttaccgaattccggggatccgtcgacc-3′(SEQ ID NO.5)；
spotT正向引物序列为：
5′-ttaagcgtcttcggcaggcgtatctcgttgcacgtgacgctcacgagggctgtaggctggagctgcttc-3′(SEQ ID NO.6)；
spotT反向引物序列为：
5′-gccagatgtacgcgatcgcgtgcggtaaggcgaataaaggtactatagaccatatgaatatcctccttag-3′(SEQ ID NO.7)；
(2)以pKD4质粒作为relA引物模板，以pKD3质粒作为spoT引物模板进行PCR。
扩增程序为：95℃预加热5分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。每一个循环中，先于95℃保持30秒使模板变性，然后将温度降到复性温度52℃保持30秒使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环，重复该循环30次。最后在72℃保持5分钟，使产物延伸完整，4℃保存得到扩增产物。
(3)用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，把目的长度片段从凝胶中切下，并分离纯化目的DNA。
(4)将纯化后的纯化目的DNA以电转化的方式转入λred感受态细胞(菌株TT22236携带pTP223质粒)，并用PCR检测转化子，分别获得relA或spotT基因突变的TT22236菌株。
(5)进行P22噬菌体转导，将relA基因突变序列以同源重组的方式转入14028s野生型沙门氏菌，获得relA删除突变体。具体过程为：
5.1、将1ml过夜培养的relA基因突变的TT22236菌液与2ml P22HT int噬菌体混合均匀后，37℃下培养9小时。
5.2、离心收集上清液，转入新的1.7ml离心管中，加入500ul氯仿混合均匀得到混合物。
5.3、离心沉淀，收集上清噬菌体转入新的1.7ml离心管中，立即置于4℃存储，获得l噬菌体稀释液。
5.4、将100μl过夜培养的14028s野生型沙门氏菌与100ul噬菌体稀释液混合均匀，37℃下孵育1h后涂在含卡那霉素的固体培养基上，37℃倒置培养过夜。
5.5、清除P22噬菌体：挑选多个单菌落划线至绿色平板，绿色菌落表示还含有噬菌体，白色菌落表示已不含裂解性噬菌体，即为relA删除突变体。
5.6、进行P22噬菌体转导，将spotT基因突变序列以同源重组的方式转入relA删除突变体，获得relA和spoT双基因删除突变体。
(6)消除突变体的抗性基因。
6.1、将表达FLP重组酶的pCP20质粒转入relA和spoT双基因删除突变体中，涂在含氨苄青霉素的LB固体培养基上，30℃下培养。
6.2、挑选单菌落划线至不含抗生素LB固体培养基上，37℃下过夜培养。
6.3、挑选单个菌落划线至含抗生素LB固体培养基上培养，验证抗性基因以及pCP20质粒是否已消除。
(7)为了监测细菌在体内的分布，我们采用P22HT噬菌体将lux操纵子导入构建好的减毒鼠伤寒沙门氏菌菌株中，通过体内成像系统可以实时非创伤性地检测细菌的信号。
实施例2：
一种携带编码ClyA的质粒的减毒重组工程菌(SL.lux/ClyA)，其制备方法包括以下步骤：
(1)制备重组的编码ClyA的质粒：
1.1、以人的伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)基因组DNA为模版，通过PCR扩增ClyA基因片段。具体引物序列如下：
ClyA基因(SEQ ID NO.1)：
atgaccggaatatttgcagaacaaactgtagaggtagttaaaagcgcgatcgaaaccgcagatggggcattagatctttataacaaatacctcgaccaggtcatcccctggaagacctttgatgaaaccataaaagagttaagccgttttaaacaggagtactcgcaggaagcttctgttttagttggtgatattaaagttttgcttatggacagccaggacaagtattttgaagcgacacaaactgtttatgaatggtgtggtgtcgtgacgcaattactctcagcgtatattttactatttgatgaatataatgagaaaaaagcatcagcccagaaagacattctcattaggatattagatgatggtgtcaagaaactgaatgaagcgcaaaaatctctcctgacaagttcacaaagtttcaacaacgcttccggaaaactgctggcattagatagccagttaactaatgatttttcggaaaaaagtagttatttccagtcacaggtggatagaattcgtaaggaagcttatgccggtgctgcagccggcatagtcgccggtccgtttggattaattatttcctattctattgctgcgggcgtgattgaagggaaattgattccagaattgaataacaggctaaaaacagtgcaaaatttctttactagcttatcagctacagtgaaacaagcgaataaagatatcgatgcggcaaaattgaaattagccactgaaatagcagcaattggggagataaaaacggaaaccgaaacaaccagattctacgttgattatgatgatttaatgctttctttattaaaaggagctgcaaagaaaatgattaacacctgtaatgaataccaacaaagacacggtaagaagacgcttttcgaggttcctgacgtctga。
正向引物序列为5′-agtccatggttatgaccggaatatttgc-3′(SEQ ID NO.2)；
反向引物序列为5′-gatgtttaaactcagacgtcaggaacctc-3′(SEQ ID NO.3)。
扩增程序为：95℃预加热5分钟，使模板DNA充分变性，然后进入扩增循环。每一个循环中，先于95℃保持30秒使模板变性，然后将温度降到复性温度55℃保持30秒使引物与模板充分退火；在72℃保持1分钟，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一个循环，重复该循环30次。最后在72℃保持5分钟，使产物延伸完整，4℃保存得到扩增产物。
1.2、酶切所述扩增产物和原始载体得到酶切后的扩增产物和酶切后的原始载体；
1.3、将酶切后的扩增产物连接到酶切后的原始载体上得到重组的编码ClyA的质粒(pBAD-ClyA)。
(2)利用10％甘油将实施例1中的减毒鼠伤寒沙门氏菌(ΔppGpp)制备成感受态细胞。
(3)将pBAD-ClyA通过电转法导入感受态的减毒鼠伤寒沙门氏菌中，在含有氨苄西林的固体培养基中筛选含有重组质粒的阳性克隆。
(4)挑选单个细菌菌落，并在LB液体培养基中扩大培养获得减毒重组工程菌菌液。
(5)在减毒重组工程菌菌液中添加25％甘油，-80℃以备长期实验使用。
实施例3：
减毒重组工程菌表达ClyA的体外活力鉴定：
1、重组工程菌培养：
实验组：实施例2的携带编码ClyA的质粒的减毒重组工程菌(SL.lux/ClyA)；
对照组：实施例1中不携带编码ClyA的质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌(SL.lux)。
2、溶血实验：
2.1、在直径10cm的新鲜血平板中均匀涂抹40％L-阿拉伯糖100μl，在平板两侧分别接种携带编码ClyA的质粒的减毒重组工程菌(SL.lux/ClyA)与不携带编码ClyA的质粒的减毒鼠伤寒沙门氏菌(SL.lux)。
2.2、在37℃过夜培养观察平板的溶血状况以坚定ClyA的表达与活性。
3、蛋白免疫印迹(Western blot)检测ClyA表达：
3.1、在步骤2.2的平板中分别取SL.lux/ClyA和SL.lux的单个菌落，在含有氨苄西林的LB液体培养基中过夜培养。
3.2、以1％比例加入新鲜的LB培养基中培养1.5小时，OD达到0.8左右。
3.3、分别加入0％或0.2％的L-阿拉伯糖继续培养2.5小时。
3.4、测量细菌浓度之后，在12％聚丙烯酰胺胶上每孔加样5×107细菌进行凝胶电泳，并转移到硝酸纤维素膜上。
3.5、用脱脂牛奶封闭后，孵育针对ClyA的兔源一抗以及辣根过氧化物酶标记的二抗。
3.6、在化学发光系统检测ClyA的表达。
4、结果
图1是用血平板和蛋白免疫印迹鉴定ClyA在体外的活性及表达情况图。图1A为用蛋白免疫印迹鉴定ClyA在体外的活性结果；图1B为用血平板鉴定ClyA在体外的活性结果。
从图中结果显示，SL.lux/ClyA组细胞溶素ClyA在体外培养条件下能够通过阿拉伯糖诱导高水平表达，并且能够有效裂解血红细胞，然而未携带含有编码ClyA基因的重组质粒的细菌SL.lux并不能诱导血红细胞的裂解。
实施例4：
考察实施例2中减毒重组工程菌的肿瘤靶向特异性及体内表达。为了进一步验证减毒重组工程菌的抗癌效果，我们运用转染了萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)的AsPC-1/Fluc细胞建立了与临床病理关系更加密切的原位胰腺癌模型。通过光学影像系统，能够实时、非创伤性地监测肿瘤的发展进程以及抗癌效果。具体步骤如下：
1、皮下肿瘤模型的建立
1.1、人胰腺癌细胞系AsPC-1与Capan-2分别在RPMI1640、DMEM高糖培养基中培养，同时补充10％胎牛血清、1％青链霉素，在37℃5％CO2培养箱中培养。
1.2、待细胞生长到80～90％时，收集细胞并用DPBS洗两次从而去除细胞中残余的血清获得细胞悬浮液。
1.3、将准备好的细胞悬浮液注射到6～8周龄Balb/c裸鼠右侧翼，每只小鼠注射5×106细胞，定期监测肿瘤的生长情况，待肿瘤体积达到120mm3左右进行实验处理。
2、细菌感染实验
2.1、分别取SL.lux/ClyA和SL.lux的单个菌落在含有氨苄西林的LB液体培养基中过夜培养，然后以1％比例加入新鲜的LB培养基中培养4小时，经PBS清洗一遍后测OD进行定量(1OD＝8×108细菌/毫升)，并在PBS溶液中配置成3×108细菌/毫升备用。并以PBS溶液为空白对照。
2.2、将步骤2.1的细菌溶液注射到步骤1中建立好的人胰腺癌裸鼠肿瘤模型中，每只小鼠经尾静脉注射100微升。
3、细菌体内分布分析
在AsPC-1皮下肿瘤模型中，分别尾静脉注射3.0×107减毒重组工程菌SL.lux/ClyA、SL.lux和PBS溶液，3天后，取小鼠的肝脏、脾脏、肿瘤等组织器官。将测量重量后的组织器官在PBS缓冲液中匀浆，然后采用10倍梯度稀释法将适当浓度的样品涂抹在含有卡那霉素和氨苄西林的细菌培养平板上，经37℃过夜培养后进行活菌落计数，并根据组织器官的重量计算组织中细菌的浓度(菌落/克)。同时，利用体内活体成像系统(IVIS 100,Caliper)可以非创伤性地实时监测细菌在荷瘤小鼠体内的分布情况。
4、ClyA体内表达及分析
尾静脉注射3.0×107SL.lux/ClyA、SL.lux和PBS溶液第3天，在阿拉伯糖腹腔注射诱导6小时后，取小鼠肿瘤组织加入裂解液匀浆液，提取蛋白质样品用于Western blot检测ClyA在体内的表达情况。另一批经相同处理的荷瘤小鼠取肿瘤组织，制备冰冻切片，用特异性针对ClyA蛋白与沙门氏菌的抗体进行免疫荧光染色以进一步确认细胞溶素的表达与减毒重组菌在肿瘤组织中的分布。
5、结果
图2是SL.lux/ClyA在体内的分布及抗癌蛋白的表达情况图。图2A为SL.lux/ClyA在体内的分布情况；图2B为SL.lux/ClyA、SL.lux和PBS抗癌蛋白的表达情况图
从图中的结果显示，减毒重组工程菌SL.lux/ClyA能够特异性地靶向胰腺癌皮下肿瘤模型，肿瘤组织中细菌浓度能够达到肝脏、脾脏等正常组织的1000倍以上。在阿拉伯糖的诱导下，能够在肿瘤组织中高水平表达ClyA蛋白。
实施例5：
考察减毒重组工程菌对胰腺癌皮下肿瘤抑制效果：
1、皮下肿瘤模型的建立
在6～8周龄Balb/c裸鼠皮下分别种植AsPC-1(1.0×107)和Capan-2(1.0×107)肿瘤，待肿瘤体积达到100～120mm3后，随机分成三组：
实验组：通过尾静脉注射3.0×107减毒重组工程菌SL.lux/ClyA；
对照组：通过尾静脉注射3.0×107SL.lux；
空白对照组：通过尾静脉注射3.0×107PBS缓冲液。
2、治疗效果观察
在细菌感染第3天起，每天腹腔注射给与40％阿拉伯糖300μl。并且每三天一次，通过游标卡尺测量肿瘤的体积，计算公式：体积＝(长×宽×厚)/2。
3、数据分析
利用GraphPad Prism 5.0软件对肿瘤大小进行分析，绘制肿瘤生长曲线图，并比较分析不同治疗组肿瘤生长差异，P<0.05为差异显著。
4、结果
图3是减毒重组工程菌对胰腺癌皮下肿瘤的抑制效果图；图3A为AsPC-1肿瘤生长变化曲线、图3B为Capan-2肿瘤生长变化曲线。从图中的结果显示：相比PBS治疗组，减毒鼠伤寒沙门氏菌(SL.lux)治疗能够显著抑制AsPC-1、Capan-2皮下肿瘤的生长，并且在表达ClyA的减毒重组工程菌(SL.lux/ClyA)治疗后能够进一步增强对肿瘤的抑制效果。
实施例6：
考察减毒重组工程菌对胰腺癌原位肿瘤模型的抑制效果。
1、原位胰腺癌细胞系构建：
通过慢病毒转染筛选了稳定表达萤火虫荧光素酶的AsPC-1/Fluc细胞系，以便在体内实时非创伤性地检测肿瘤生长及转移情况。
2、原位肿瘤模型构建：
首先将AsPC-1/Fluc细胞注射到裸鼠皮下，待肿瘤长到直径1cm左右，取出肿瘤切成约1mm3的小肿瘤块，然后通过手术缝合到受体小鼠的胰尾上。
3、染色确认：
手术种植原位胰腺癌11天后，将小鼠安乐处死，取出肿瘤组织并用4％多聚甲醛固定，然后采用苏木精-伊红(H&E)染色验证建模是否成功。
4、活菌计数：
经尾静脉注射3.0×107减毒重组工程菌SL.lux/ClyA，感染7、11、20天后取出肝脏、脾脏、肿瘤等组织进行活菌计数判定细菌对原位肿瘤模型的靶向特异性。
5、肿瘤生长监测：
肿瘤种植15天后，分别经尾静脉注射1.0×107减毒重组工程菌SL.lux/ClyA、SL.lux或PBS缓冲液。在治疗第3天起，每天腹腔注射给与40％阿拉伯糖300μl。应用体内光学成像系统，每3～5天对小鼠进行一次成像，每次成像前通过腹腔注射0.75mg荧光素，从而监视肿瘤的发展进程。
6、数据分析：
运用体成像系统软件(IVIS 100,Caliper)，通过测量肿瘤的总信号(Total Flux)变化来检测重组菌对原位胰腺癌的抑制效果。利用GraphPad Prism 5.0软件对原位肿瘤信号强度进行分析，绘制肿瘤生长变化曲线图，并比较分析不同治疗组肿瘤生长差异。
7、结果：
图4是减毒重组工程菌对原位胰腺癌的抑制效果图，图4A表示原位胰腺癌种植后，肿瘤组织对正常胰腺组织的侵袭；图4B表示减毒工程菌在原位胰腺癌模型中肝脏、脾脏、肿瘤中的浓度分布情况；图4C表示原位胰腺癌在不同治疗后肿瘤信号的变化曲线。从图中的结果可知：经手术种植的原位胰腺癌能够在体内成功生长并侵入正常胰腺组织。减毒菌SL.lux/ClyA、SL.lux均能够显著抑制肿瘤信号的增长，并且SL.lux/ClyA抑制效果有着进一步的增强。
实施例7：
考察减毒重组工程菌对肿瘤基质细胞杀伤效果，具体考察方法为：
1、样品收集：
AsPC-1皮下肿瘤模型中，尾静脉注射3.0×107减毒菌：SL.lux或SL.lux/ClyA。5天后，取肿瘤组织置于冷却的4％多聚甲醛溶液中固定2小时，然后转移到30％蔗糖溶液在4℃过夜。然后将样品转移到含有OCT的模子中，置于-80℃备用。每组动物样品不少于3个，独立实验重复2-3次。并以PBS溶液为空白对照。
2、组织切片染色：
在冷冻切片机将OCT包埋的组织进行切片，连续切片厚度为6μm。连续切片在分别孵育不同的基质细胞标志物一抗后，洗去未结合的一抗，然后孵育带有荧光染料标记的二抗，并用核荧光染料(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)对细胞核进行染色。
3、检查分析：
在共聚焦显微镜下(ZEISS,Germany)检查组织切片，并运用软件对信号进行数字化处理。
4、数据分析：
利用GraphPad Prism 5.0软件，对NG2、PDGFRβ、CD31等基质细胞标志物在不同治疗组中的信号强度进行统计分析，P<0.05为差异显著。
5、结果：
图5是减毒重组工程菌对肿瘤基质细胞破坏效果评估图。从图中可以看出减毒菌SL.lux/ClyA、SL.lux能够有效地破坏肿瘤基质细胞，并且SL.lux/ClyA抑制效果有着进一步的增强。
上述实验结果表明：
减毒重组工程菌能够非常特异性地定居肿瘤组织中，在阿拉伯糖的诱导下实现溶癌蛋白的可控化表达，从而极大地降低了对正常组织的毒性。前期预实验表明，工程化的表达ClyA的减毒重组工程菌具有很好的抑制肿瘤生长的效果，能够显著抑制人胰腺癌AsPC-1和Capan-2在裸鼠皮下肿瘤模型的生长。
运用转染了萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)的AsPC-1/Fluc细胞建立了与临床病理关系更加密切的原位胰腺癌模型。通过光学影像系统，能够实时、非创伤性地监测肿瘤的发展进程以及抗癌效果。实验结果表明，未携带ClyA抗癌基因的鼠伤寒能够显著地抑制原位胰腺癌的生长，肿瘤信号和肿瘤重量均有着明显的下降(P<0.01,n＝11)。然而，这种抗癌效果在分泌ClyA蛋白减毒菌治疗组中进一步显著增强，能够完全抑制肿瘤的生长进程。初期的肿瘤微环境分析数据表明，减毒重组工程菌能够有效地破坏肿瘤基质细胞，显著降低了组织中神经/胶质抗原(Neural/glial antigen 2,NG2)、血小板来源的生长因子受体β(Platelet-derived growth factor receptorβ,PDGFRβ)、CD31的含量。
通过组织切片免疫荧光染色我们发现减毒重组工程菌治疗增加了巨噬细胞、嗜中性粒细胞在肿瘤组织中的浸润，这些免疫细胞的募集将增强减毒菌对肿瘤的治疗效果。
同时，表达ClyA蛋白的减毒重组工程菌能够特异性地靶向胰腺癌皮下和原位肿瘤模型，通过在肿瘤组织中释放细胞溶素促进肿瘤基质细胞及肿瘤细胞的凋亡，同时伴随着免疫细胞在肿瘤组织中的募集，抑制肿瘤的生长。我们所做的预实验为本项目研究工作的开展奠定了坚实基础，后期的研究将进一步完善和解决本项目相关的科学问题。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 减毒重组工程菌及其制备方法、应用和肿瘤靶向药物
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 912
<212> DNA
<213> 伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(912)
<223> 根据实验要求而设计，做为ClyA基因片段。
<400> 1
atgaccggaa tatttgcaga acaaactgta gaggtagtta aaagcgcgat cgaaaccgca 60
gatggggcat tagatcttta taacaaatac ctcgaccagg tcatcccctg gaagaccttt 120
gatgaaacca taaaagagtt aagccgtttt aaacaggagt actcgcagga agcttctgtt 180
ttagttggtg atattaaagt tttgcttatg gacagccagg acaagtattt tgaagcgaca 240
caaactgttt atgaatggtg tggtgtcgtg acgcaattac tctcagcgta tattttacta 300
tttgatgaat ataatgagaa aaaagcatca gcccagaaag acattctcat taggatatta 360
gatgatggtg tcaagaaact gaatgaagcg caaaaatctc tcctgacaag ttcacaaagt 420
ttcaacaacg cttccggaaa actgctggca ttagatagcc agttaactaa tgatttttcg 480
gaaaaaagta gttatttcca gtcacaggtg gatagaattc gtaaggaagc ttatgccggt 540
gctgcagccg gcatagtcgc cggtccgttt ggattaatta tttcctattc tattgctgcg 600
ggcgtgattg aagggaaatt gattccagaa ttgaataaca ggctaaaaac agtgcaaaat 660
ttctttacta gcttatcagc tacagtgaaa caagcgaata aagatatcga tgcggcaaaa 720
ttgaaattag ccactgaaat agcagcaatt ggggagataa aaacggaaac cgaaacaacc 780
agattctacg ttgattatga tgatttaatg ctttctttat taaaaggagc tgcaaagaaa 840
atgattaaca cctgtaatga ataccaacaa agacacggta agaagacgct tttcgaggtt 900
cctgacgtct ga 912
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> 根据实验要求而设计，做为正向引物。
<400> 2
agtccatggt tatgaccgga atatttgc 28
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(29)
<223> 根据实验要求而设计，做为反向引物。
<400> 3
gatgtttaaa ctcagacgtc aggaacctc 29
<210> 4
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(70)
<223> 根据实验要求而设计，做为relA正向引物
<400> 4
gtggatcgca agcctgggaa tttccagcca gcagtcgtgt gagcgcttag gtgtaggctg 60
gagctgcttc 70
<210> 5
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(70)
<223> 根据实验要求而设计，做为relA反向引物
<400> 5
gtgcagtcgc cgtgcatcaa tcacatccgg cacctggttc agcttaccga attccgggga 60
tccgtcgacc 70
<210> 6
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(69)
<223> 根据实验要求而设计，做为spotT正向引物
<400> 6
ttaagcgtct tcggcaggcg tatctcgttg cacgtgacgc tcacgagggc tgtaggctgg 60
agctgcttc 69
<210> 7
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列(artifical sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(70)
<223> 根据实验要求而设计，做为spotT反向引物
<400> 7
gccagatgta cgcgatcgcg tgcggtaagg cgaataaagg tactatagac catatgaata 60
tcctccttag 70

Claims (10)

1.一种减毒重组工程菌，其特征在于，以relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)为载体，将编码ClyA基因的重组质粒转入至所述relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌中获得减毒重组工程菌。
2.一种权利要求1所述的减毒重组工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、构建编码ClyA基因的重组质粒；
S2、制备relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌；
S3、将所述重组质粒导入至relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌中获得减毒重组工程菌。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S1具体包括以下步骤：
S1-1、根据人的伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)基因组DNA设计引物对，进行PCR扩增获得扩增产物；
S1-2、酶切所述扩增产物和原始载体得到酶切后的扩增产物和酶切后的原始载体；
S1-3、将所述酶切后的扩增产物连接到所述酶切后的原始载体上得到重组质粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述S1-1中所述引物对为SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所述的DNA序列。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述S2具体包括以下步骤：
S2-1、针对relA和spotT基因序列设计relA引物对和spoT引物对，以pKD4质粒作为relA引物对模板，以pKD3质粒作为spoT引物对模板进行PCR扩增得到扩增产物；
S2-2、将所述S2-1中所述扩增产物通过电转化导入感受态细胞中，得到P22噬菌体；
S2-3、通过P22噬菌体转导，在14028s野生菌株同源重组靶向删除relA、spoT基因，获得relA、spoT突变的鼠伤寒沙门氏菌。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述relA引物对为SEQ ID NO.4和SEQID NO.5所述的DNA序列；所述spoT引物对为SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所述的DNA序列。
7.一种权利要求1所述的减毒重组工程菌在制备肿瘤靶向药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤靶向药物为胰腺癌靶向药物。
9.一种肿瘤靶向药物，其特征在于，包括权利要求1所述的减毒重组工程菌和阿拉伯糖。
10.根据权利要求9所述的肿瘤靶向药物，其特征在于，所述减毒重组工程菌的浓度为0.5～2.5×109cfu/kg；所述阿拉伯糖的浓度为2～6g/kg。
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