CN111315868B

CN111315868B - 靶向肿瘤和治疗癌症的细菌

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Publication number: CN111315868B
Application number: CN201880057532.5A
Authority: CN
Inventors: 金叶
Original assignee: Xinshi Co ltd
Current assignee: Xinshi Co ltd
Priority date: 2017-09-08
Filing date: 2018-08-14
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2038-08-14
Also published as: WO2019047679A1; US20210079405A1; WO2019047166A1; EP3679123A1; JP2020532994A; MY195280A; JP2020533978A; US11696931B2; US20220273730A1; EP3679142A4; US20200323926A1; CN111278978B; AU2017430856A1; SG11202001797TA; SG11202001796SA; CN111278978A; US11458172B2; JP7102512B2; AU2018328465A1; EP3679123A4

Abstract

本发明提供用于靶向肿瘤和治疗癌症的细菌、药物递送组合物及其使用方法用于治疗癌症。

Description

靶向肿瘤和治疗癌症的细菌

技术领域

本发明涉及细菌，药物递送组合物以及将其用于诸如治疗癌症的用途的方法。

背景技术

大多数抗肿瘤药物针对所有活跃分裂的细胞起作用，导致严重的甚至致命的副作用。当全身施用时，靶向疗法必须能够区分肿瘤与非肿瘤组织，以便治疗原发性和播散性肿瘤。

以前的靶向治疗依赖于非生物药物。当全身递送时，非生物药物在血流中显著稀释，仅有一小部分可用于肿瘤。此外，非生物药物依赖于肿瘤血管来递送，因此不能有效地扩散至血管化不良和低氧的肿瘤组织。因此，在过去的几十年中，已经评估了各种专性或兼性厌氧菌在靶向肿瘤方面的安全性和有效性，所述专性或兼性厌氧菌能够进行递送后繁殖并偏爱血管化不良的肿瘤组织。然而，尽管越来越多地关注癌症的细菌治疗，但迄今为止其抗癌功效仍不能令人满意。

考虑到增加抗癌功效的需求，需要更多的更特异靶向肿瘤并有效杀死肿瘤的治疗方法和治疗剂。

发明内容

本发明的一个示例实施方案提供了一系列用于靶向肿瘤和治疗癌症的细菌。每种细菌包括核酸系统和编码细胞毒素(cytotoxin)的基因，所述细胞毒素杀死肿瘤细胞但不影响细菌的生存力。该核酸系统包括编码杀死细菌的毒素的第一DNA片段，编码消除毒素的解毒剂的第二DNA片段，解毒剂基因的启动子和毒素基因的组成型启动子。

在一些实施方案中，编码细胞毒素的基因是同源基因。在一些实施方案中，编码细胞毒素的基因是异源基因。在一些实施方案中，用于靶向肿瘤和治疗癌症的细菌是基因修饰的细菌。

在一些实施方案中，细菌包括细胞毒素的组成型启动子。在一些实施方案中，细菌包括细胞毒素的诱导型启动子，使得细胞毒素在肿瘤组织中表达但在非肿瘤组织中沉默。在一些实施方案中，细菌包括细胞毒素的抑制型启动子，使得该细胞毒素在非肿瘤组织中被抑制但在肿瘤组织中表达。

在一些实施方案中，第二DNA片段在肿瘤组织处转录但在非肿瘤组织处不转录。解毒剂基因的启动子与第二DNA片段可操作地连接，在葡萄糖水平的控制下抑制第二DNA片段的转录，使得解毒剂在肿瘤组织处表达，但在非肿瘤组织处不表达。与第一DNA片段可操作地连接的毒素基因的组成型启动子引起第一DNA片段的组成型转录，使得毒素在肿瘤组织和非肿瘤组织处表达。

在一些实施方案中，解毒剂基因的启动子控制解毒剂基因的转录，使得葡萄糖抑制解毒剂基因的转录。在一些实施方案中，毒素基因的组成型启动子引起毒素基因的组成型表达。

在一些实施方案中，第一DNA片段在非肿瘤组织处转录但在肿瘤组织处不转录。与第二DNA片段可操作连接的解毒剂基因的组成型启动子引起第二DNA片段的组成型转录。与第一DNA片段可操作连接的毒素基因的启动子在葡萄糖水平的控制下引起第一DNA片段的转录。在葡萄糖水平的控制下，毒素的表达高于解毒剂的组成型表达，以使毒素杀死在非肿瘤组织处的细菌。

在一些实施方案中，毒素基因的启动子控制毒素基因的转录，使得葡萄糖诱导毒素基因的转录。在一些实施方案中，解毒剂基因的组成型启动子引起解毒剂基因的组成型表达。

在一些实施方案中，用于靶向肿瘤和治疗癌症的细菌在肿瘤组织处生长，但在非肿瘤组织处不生长。

另一个示例实施方案提供了一种药物递送组合物，其包括用于靶向肿瘤和治疗癌症的细菌。另一个示例实施方案提供了通过施用细菌或药物递送组合物来治疗癌症的方法。

在一些实施方案中，所述细胞毒素选自由铜绿假单胞菌外溶素(Pseudomonasaeruginosa exolysin)、蜡状芽孢杆菌非溶血性肠毒素(Bacillus cereus non-hemolyticenterotoxin)、霍乱弧菌溶血素A(Vibrio cholera hemolysin A)和大肠杆菌α-溶血素(Escherichia coli alpha-hemolysi)组成的组。

另一个示例实施方案涉及将异源基因引入靶向肿瘤的细菌或引起靶向肿瘤的细菌过表达(overexpress)同源基因。异源或同源基因编码杀死肿瘤细胞的细胞毒素。在一些实施方案中，由异源基因编码的细胞毒素选自由铜绿假单胞菌外溶素，蜡状芽孢杆菌非溶血性肠毒素，霍乱弧菌溶血素A；同源基因编码的细胞毒素为大肠杆菌α-溶血素组成的组。肿瘤靶向的细菌的实施例包括但不限于通过传感肿瘤微环境的信号(例如低氧、葡萄糖剥夺和酸化)来选择性地定殖在实体肿瘤中并使非肿瘤组织完整，并从而控制其自身生存力的细菌。这些肿瘤靶向的细菌可以是天然或基因修饰的细菌。

本文讨论了其他示例性实施例。

附图说明

图1A显示了根据一个示例性实施方案将细菌靶向低葡萄糖环境的毒素-解毒剂遗传系统。

图1B显示了根据一个示例性实施方案，使用CcdB作为毒素、CcdA作为解毒剂，构建将大肠杆菌靶向低葡萄糖环境的核酸系统的示意图。

图1C显示了根据一个示例性实施方案的药物递送组合物，其包括将抗癌药物递送至实体肿瘤的基因工程化细菌。所述抗癌药物包括但不限于由工程化细菌产生的抗癌分子或化合物。

图1D显示了根据一个示例性实施方案在具有0mM至4mM不同葡萄糖浓度的M63琼脂上划线以寻找在葡萄糖存在下不能生长但在葡萄糖不存在下生长的克隆。

图2A显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(10⁷/小鼠)后15天，基因工程化菌株JY1和JY6和未修饰的命名为MG1655的野生型大肠杆菌菌株在Bagg白化体/c(BALB/c)小鼠的CT26(鼠结肠直肠癌细胞系)肿瘤中的定殖。

图2B显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(10⁷/小鼠)后15天，细菌JY1、JY6和MG1655菌株在CT26肿瘤BALB/c小鼠肝脏中的定殖。

图2C显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(10⁷/小鼠)后15天，细菌菌株JY1、JY6和MG1655在具有CT26肿瘤的BALB/C小鼠肝脏中定殖的百分比。

图2D显示了根据一个示例性实施例，在静脉注射细菌(10⁷/小鼠)后7天，细菌菌株JY1、JY6和MG1655在具有HCT116(人结肠直肠癌细胞系)肿瘤的裸鼠的肿瘤中的定殖。

图2E显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(10⁷/小鼠)后7天，细菌菌株JY1、JY6和MG1655在具有HCT116肿瘤的裸鼠肝脏中的定殖。

图2F显示了根据一个示例性实施方案，在静脉注射细菌(10⁷/小鼠)后7天，细菌菌株JY1、JY6和MG1655在具有HCT116肿瘤的裸鼠肝脏中定殖的百分比。

图3A显示了根据一个示例性实施方案，细菌菌株JYH1和SH1hly在携带皮下SW480(人结肠直肠癌细胞系)肿瘤的裸鼠的肝脏和脾脏中的定殖。

图3B显示了根据一个示例性实施方案，在携带皮下SW480肿瘤的裸鼠中被细菌菌株JYH1和SH1hly感染的肝脏和脾脏的百分比。

图3C显示了根据一个示例性实施方案用细菌菌株SH1hly处理的小鼠中形成的肝脓肿。

图3D显示了根据一个示例性实施方案，来自携带皮下SW480肿瘤的裸鼠的苏木精和伊红(H&E)染色的肝脏切片的显微图像，所述裸鼠用磷酸盐缓冲盐水(PBS)、菌株SH1hly和JYH1处理。

图4显示了根据一个示例性实施方案静脉注射JYH1菌株对免疫活性BALB/c小鼠CT26肿瘤的靶向效果。

图5显示了根据一个示例性实施方案，通过在葡萄糖缺乏区选择性存活和生长来构建靶向实体肿瘤的基因工程化细菌菌株的方法。

图6A显示了根据一个示例性实施例的静脉注射的大肠杆菌JYH1对HCT116肿瘤在裸鼠中生长的抑制作用。

图6B显示了根据一个示例性实施方案的静脉注射大肠杆菌JYH1对SW480肿瘤在裸鼠中生长的抑制作用。

图6C显示了根据一个示例性实施方案，在0-55天内将PBS静脉注射到小鼠中治疗SW480肿瘤的代表性照片。

图6D显示了根据一个示例性实施方案，在0-90天内将JYH1静脉注射到小鼠中治疗SW480肿瘤的代表性照片。

图7显示了根据一个示例性实施方案的体外细胞毒性测定，其说明了质粒衍生的细胞毒素ExlA、Nhe、大肠杆菌α-溶血素和霍乱弧菌溶血素A的产生对癌细胞系B16F10具有细胞毒性。pBAD，一种空质粒，用作阴性对照；hlyCABD，编码大肠杆菌α-溶血素的操纵子及其分泌系统；Vhly，编码霍乱弧菌溶血素A的基因。误差棒，SD。

图8显示了根据一个示例性实施方案的质粒衍生的大肠杆菌α-溶血素和霍乱弧菌溶血素A的溶血活性。HlyCABD，编码大肠杆菌α-溶血素的操纵子及其分泌系统；Vhly，编码霍乱弧菌溶血素A的基因。将所有质粒引入非病原性和非溶血性大肠杆菌参考菌株TOP10。

图9显示，在免疫活性小鼠中，细胞毒素增强了大肠杆菌对小鼠同基因(syngeneic)肿瘤的抑制能力。将单剂量的具有或不具有表达多种细胞毒素的大肠杆菌注射到C57BL/6N小鼠的小鼠黑色素瘤B16F10肿瘤中。(A)随时间推移的小鼠体重。误差棒，SEM。(B)瘤内(intratumorally)注射细菌(5×10⁷/小鼠)对肿瘤生长的影响。由于肿瘤的过度生长，在肿瘤测量后第9天对用携带空质粒pBAD的细菌处理的小鼠和用PBS处理的小鼠(阴性对照)实施安乐死。误差棒，SEM。*，P＜0.05。(C)在第9天(即肿瘤挑战后9天)注射表达测试细胞毒素的大肠杆菌或携带空载体pBAD的大肠杆菌的B16F10肿瘤的代表性照片。

图10显示，从染色体中的hlyCABD操纵子的单个拷贝产生大肠杆菌α-溶血素对于溶血大肠杆菌的抗癌功效不是必需的。将单剂量的细菌(每个肿瘤1x10⁷cfu)注射到C57BL/6N小鼠的鼠黑色素瘤B16F10肿瘤中。hly+，一种在染色体上带有hlyCABD操纵子的溶血大肠杆菌菌株；hly-，其同基因突变体缺失了整个hlyCABD操纵子。误差棒，SEM。

具体实施方式

示例性实施方案涉及一种核酸系统。将所述核酸系统导入细菌菌株，以使基因工程化细菌菌株靶向实体肿瘤，但使正常组织保持完整。基因工程化细菌菌株在肿瘤组织生长，但在非肿瘤组织死亡。

其他示例实施方式涉及用于靶向肿瘤和治疗癌症的细菌。该细菌包括编码杀死肿瘤细胞的细胞毒素的异源或同源基因，以及核酸系统。应当理解，可以以任何顺序进行为产生靶向肿瘤和治疗癌症的细菌而进行的遗传修饰。例如，可以首先将核酸系统插入细菌中，然后插入细胞毒素编码基因以杀死肿瘤细胞。备选地，可以首先进行插入编码杀死肿瘤细胞的细胞毒素的异源或同源基因，然后插入核酸系统。

细胞毒素不能在非肿瘤组织处表达，因为该细菌不能在非肿瘤组织处生存或存活。在一些实施方案中，细菌在肿瘤组织处生长，但在非肿瘤组织处不生长。

低氧(hypoxia)是肿瘤微环境中的特征之一，最常用于将细菌靶向实体肿瘤。然而，严格靶向低氧的专性厌氧菌局限于实体肿瘤的坏死区，而兼性厌氧菌定殖于整个实体肿瘤，但由于其对低氧靶向的不严格而感染正常组织。根据本发明的实施例通过向细菌中引入核酸系统解决了这些技术问题，所述核酸系统通过调节细菌的葡萄糖依赖性存活力来改善细菌的肿瘤特异性。

细菌可以产生各种细胞毒素，其以多种机制破坏哺乳动物细胞。一些细胞毒素有效地杀死大多数上皮和内皮细胞。然而，如果将细菌施用于患者，则该细菌表达的细胞毒素不仅会损害肿瘤细胞，而且还会损害正常细胞。示例性实施方式通过将细胞毒素编码基因引入具有肿瘤特异性的基因工程化细菌或天然细菌中来解决这些技术问题，使得细胞毒素仅损害肿瘤细胞，而保持正常细胞完整。备选地，也可以通过在一些诱导型(inducible)或抑制型(repressible)的启动子(如葡萄糖抑制型启动子)下诱导性表达细胞毒素来避免细胞毒素对正常组织的损害，从而使细胞毒素仅在肿瘤组织中表达而在非肿瘤组织中沉默。此外，编码细胞毒素的基因赋予细菌抵抗癌症的附加能力。

示例性实施方案的细胞毒素包括但不限于铜绿假单胞菌外溶素，蜡状芽孢杆菌非溶血性肠毒素，霍乱弧菌溶血素A和大肠杆菌α-溶血素。

肠毒素(ExlA)是由铜绿假单胞菌排泄的成孔毒素。ExlA对大多数细胞类型(如上皮细胞，内皮细胞和成纤维细胞和巨噬细胞)具有溶解能力，但溶血性差。非溶血性肠毒素(Nhe)是蜡状芽孢杆菌中发现的主要毒素。Nhe通过触发哺乳动物细胞膜上的孔形成来诱导细胞裂解，诱导细胞周期停在G0/G1期并激发细胞凋亡，但不会引起溶血。霍乱弧菌溶血素A通过在真核细胞膜上形成孔而引起细胞裂解。与ExlA和Nhe相反，霍乱弧菌溶血素A不仅具有溶细胞作用，而且具有溶血作用。大肠杆菌α-溶血素是由尿路致病性(uropathgenic)大肠杆菌产生的。与霍乱弧菌溶血素A相似，大肠杆菌α-溶血素具有溶细胞作用和溶血作用。它不仅对上皮细胞具有细胞毒性，而且还对巨噬细胞和自然杀伤细胞具有细胞毒性，抵消了对大肠杆菌的宿主防御作用。

另一个实施方案提供了在有需要的患者中治疗癌症的方法，该方法包括以下步骤：向该患者施用一种用于靶向肿瘤和治疗癌症的细菌。在一些实施方案中，表达的细胞毒素引起肿瘤细胞裂解，从而治疗癌症。在一些实施方案中，将细菌与一种或多种另外的癌症疗法，例如手术、化学疗法、放射疗法、靶向疗法、免疫疗法、激素疗法或干细胞移植联合施用。当一种疗法与另一种疗法联合施用时，施用可以是顺序的或可以共同施用。在一实施方案中，癌症是黑色素瘤。

另一个实施方案提供了一种裂解肿瘤细胞的方法，该方法包括使肿瘤细胞与靶向肿瘤并治疗癌症的细菌接触的步骤。在一些实施方案中，该方法是体外方法。在其他实施方案中，该方法是体内方法。

图1A显示了包括组成型表达的毒素编码基因和在葡萄糖抑制型启动子控制下的解毒剂编码基因的核酸系统100。根据一个示例性实施方案，核酸系统赋予细菌靶向低葡萄糖环境的能力。

毒素-解毒剂遗传系统使细菌能够在葡萄糖缺乏的环境中选择性生长，但在葡萄糖存在下死亡。由于葡萄糖缺乏是实体肿瘤微环境的特征，因此，当全身应用时，配备有所述核酸系统的细菌可以特异性靶向实体肿瘤。肿瘤细胞通常由于快速细胞生长和过量葡萄糖消耗以及血液供应不足而缺乏葡萄糖。假定1g组织为1ml，肿瘤组织中葡萄糖浓度为0.123-0.424mM，正常组织中葡萄糖浓度为1.22-1.29mM。毒素-解毒剂核酸系统使细菌能够在低葡萄糖环境下选择性生长。

核酸系统赋予细菌在低葡萄糖条件下选择性生长的能力，这是肿瘤微环境的特征。由于肿瘤微环境处于强烈免疫抑制的状态，细菌(例如大肠杆菌)具有优先在实体肿瘤中生长并在较小程度上定植于正常组织的内在能力。在此基础上，靶向低葡萄糖环境的核酸系统赋予细菌如大肠杆菌更高的肿瘤选择性，其细菌本身不具有足够的肿瘤特异性，从而提高了细菌介导的肿瘤治疗的安全性。

在一个示例性实施方案中，作为肿瘤靶向系统的核酸系统被整合到细菌的染色体中，使得细菌不仅仅依赖于它们靶向肿瘤的天然能力，并且进而细菌的安全性得到改善。在一个示例性实施方案中，将核酸系统插入质粒中。在一个示例性实施方案中，核酸系统是葡萄糖传感(glucose-sensing)系统或模块。

在一个示例性实施方案中，携带核酸系统的细菌通过靶向低葡萄糖环境而严格定殖(colonize)实体肿瘤。

在一个示例性实施方案中，核酸系统包括毒素编码基因、解毒剂编码基因、控制解毒剂编码基因转录的葡萄糖抑制型启动子和引起毒素编码基因组成型表达的组成型启动子。

在一个示例性实施方案中，在具有生理水平葡萄糖的环境中，毒素组成型表达，而处于葡萄糖抑制的启动子的控制下，解毒剂表达被葡萄糖抑制。携带核酸系统的细菌在具有生理水平葡萄糖的环境中不生长，因为解毒剂不表达以中和毒素。在低葡萄糖环境中，毒素和解毒剂都被表达。携带核酸系统的细菌在低葡萄糖环境中生长，因为解毒剂中和了毒素。

在一个示例性实施方案中，核酸系统包括毒素编码基因、解毒剂编码基因、控制毒素编码基因转录的葡萄糖诱导型启动子和引起解毒剂编码基因组成型表达的组成型启动子。

在一个示例性实施方案中，在具有生理水平的葡萄糖的环境中，解毒剂组成型表达，而处于葡萄糖诱导的启动子控制下，毒素表达由葡萄糖诱导。携带核酸系统的细菌在具有生理水平葡萄糖的环境中不生长，因为毒素表达的水平高于解毒剂的表达，从而杀死细菌。在低葡萄糖环境中，毒素不表达，使得细菌存活和生长。

在一个示例性实施方案中，低葡萄糖环境包括浓度低于0.424mM的葡萄糖。在一个示例性实施方案中，高葡萄糖环境包括浓度高于1.22mM的葡萄糖。在一个示例性实施方案中，低葡萄糖环境具有浓度为0.123-0.424mM的葡萄糖。在一个示例性实施方案中，高葡萄糖环境具有浓度为1.22-1.29mM的葡萄糖。

在一个示例性实施方案中，在实体肿瘤中，表达的解毒剂的水平高于或等于表达的毒素的水平，使得毒素的毒性被解毒剂拮抗。

在一个示例性实施方案中，肿瘤靶向核酸系统是包括编码表达毒素的毒素基因的第一DNA片段、编码表达使毒素无效的解毒剂基因的第二DNA片段、第一启动子(即解毒剂基因的启动子)和第一组成型启动子(即毒素基因的组成型启动子)的核酸系统。第一组成型启动子引起毒素基因的组成型表达。第一启动子在葡萄糖浓度的控制下调节第二DNA片段的转录，使得第二DNA片段在低葡萄糖环境下或在不存在葡萄糖的情况下转录，但在存在葡萄糖或在高葡萄糖环境下不转录。在一个示例性实施方案中，第二DNA片段在不存在葡萄糖的情况下转录，但在M63培养基中浓度等于或高于1mM的高葡萄糖环境下不转录。

在一个示例性实施方案中，第一启动子(即解毒剂基因的启动子)控制解毒剂基因的转录，使得葡萄糖抑制解毒剂基因的转录。第二DNA片段在实体肿瘤中转录，但在非肿瘤组织中不转录。

在一个示例性实施方案中，肿瘤靶向核酸系统是包括编码表达毒素的毒素基因的第一DNA片段、编码表达使毒素无效的解毒剂基因的第二DNA片段、第二启动子(即毒素基因的启动子)和第二组成型启动子(即解毒剂基因的组成型启动子)的核酸系统。第二组成型启动子引起解毒剂基因的组成型表达。第二启动子在葡萄糖浓度的控制下调节第一DNA片段的转录，使得第一DNA片段在高葡萄糖环境下或在生理水平的葡萄糖存在下转录，但在葡萄糖不存在或在低葡萄糖环境下不转录。在一个示例性实施方案中，第一DNA片段在不存在葡萄糖时不转录，但在M63培养基中在浓度等于或高于1mM的高葡萄糖环境下转录。

在一个示例性实施方案中，第二启动子控制毒素基因的转录，使得葡萄糖诱导毒素基因的转录。第一DNA片段在非肿瘤组织中转录，但在实体肿瘤中不转录。在一个示例实施方案中，在非肿瘤组织中毒素的表达高于解毒剂的组成型表达。

在一个示例性实施方案中，第一DNA片段如SEQ ID No.1所示。在一个示例性实施方案中，第二DNA片段如SEQ ID No.2所示。

在一个示例性实施方案中，第一DNA片段位于第二DNA片段的上游。在一个示例性实施方案中，第一DNA片段位于第一启动子的上游。在一个示例性实施方案中，第一DNA片段位于第二DNA片段的下游。在一个示例性实施方案中，第二启动子位于第一DNA片段的上游。在一个示例性实施方案中，所述第一组成型启动子位于所述第一DNA片段的上游。在一个示例性实施方案中，所述第二组成型启动子位于第二DNA片段的上游。在一个示例性实施方案中，第一启动子如SEQ ID No.3所示。

在一个示例性实施方案中，核酸系统包括由5-6个核苷酸组成的随机序列，并且位于第二DNA片段的紧接上游和第一启动子的下游。在一个示例性实施方案中，随机序列是GCCTT或TGTCT。

在一个示例性实施方案中，核酸系统包括由5-6个核苷酸组成的随机序列，并且位于第一DNA片段的紧接上游和第二启动子的下游。

在一个示例性实施方案中，核酸系统包括由5-6个核苷酸组成的随机序列，并且替换位于第二DNA片段紧接上游的细菌的原始或天然5-6个核苷酸。

在一个示例性实施方案中，核酸系统包括由5-6个核苷酸组成的随机序列，并且替换位于第一DNA片段紧接上游的细菌的原始或天然5-6个核苷酸。

在一个示例性实施方案中，核酸系统包括由5-6个核苷酸组成的随机序列，并且替换第一启动子的原始或天然5-6个核苷酸。在一个示例性实施方案中，核酸系统包括由5-6个核苷酸组成的随机序列，并且替换第二启动子的原始或天然5-6个核苷酸。

在一个示例性实施方案中，随机序列位于第一启动子的下游。在一个示例性实施方案中，随机序列位于第二DNA片段的上游。

在一个示例性实施方案中，随机序列位于第二启动子的下游。在一个示例性实施方案中，随机序列位于第一DNA片段的紧接上游。

在一个示例性实施方案中，所述核酸系统包括编码可选择标记(selectablemarker)的第三DNA片段。在一个示例性实施方案中，所述标记是氯霉素可选择标记(Cm^R)。在一个示例性实施方案中，所述可选择标记是氯霉素抗性盒。在一个示例性实施方案中，第三DNA片段如SEQ ID No.4所示。

在一个示例性实施方案中，第三DNA片段位于第一DNA片段的下游和第一启动子的上游。在一个示例性实施方案中，第三片段位于第二DNA片段的下游和第二启动子的上游。

在一个示例性实施方案中，所述核酸系统包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4。在一个示例性实施方案中，所述核酸系统包括驱动ccdB表达的组成型启动子，如SEQ ID No.5所示。在一个示例性实施方案中，所述核酸系统包含如SEQ ID No.6所示的rrnB转录终止区，在一个示例性实施方案中，所述核酸系统如SEQ ID No.7所示，在一个示例性实施方案中，所述核酸系统如SEQ ID No.8所示。

在一个示例性实施方案中，核酸系统包括毒素基因、解毒剂基因、控制解毒剂基因转录的第一启动子和毒素基因的组成型启动子。在一个示例性实施方案中，核酸系统包括毒素基因、解毒剂基因、控制毒素基因转录的第二启动子和解毒剂基因的组成型启动子。

在一个示例性实施方案中，所述细菌菌株是革兰氏阳性细菌菌株。在一个示例性实施方案中，所述细菌菌株是革兰氏阴性细菌菌株。

在一个示例性实施方案中，细菌菌株是大肠杆菌。在一个示例性实施方案中，所述细菌菌株选自由大肠杆菌MG1655和大肠杆菌SH1组成的组。

图1B示出了根据一个示例性实施方案的用于构建将大肠杆菌靶向低葡萄糖环境的核酸系统的示意图110。图1B显示了采用随机化的、葡萄糖抑制的乳糖启动子(Plac)和CcdA/CcdB毒素-解毒剂对构建了将大肠杆菌靶向低葡萄糖环境的核酸系统。

CcdB是一种杀死宿主细菌的毒素，而CcdA是一种中和CcdB的解毒剂。在肿瘤靶向的核酸系统中，CcdB组成型表达，而CcdA表达在葡萄糖抑制的乳糖(lac)启动子控制下被葡萄糖抑制。在低葡萄糖环境中，携带该核酸系统的细菌生长良好，因为解毒剂CcdA被去抑制从而中和了CcdB。在生理水平的葡萄糖存在下，CcdA表达被关闭，CcdB被释放以杀死细菌。

在一个示例性实施方案中，在肿瘤靶向的核酸系统中，CcdA组成型表达，而CcdB的表达在葡萄糖诱导的启动子的控制下由葡萄糖诱导。在低葡萄糖环境中，携带这种核酸系统的细菌生长良好，因为毒素CcdB被抑制。在生理水平的葡萄糖存在下，CcdB表达被启动以杀死细菌。

如图1B所示，由5-6个核苷酸(nnnnn)组成的随机化片段替换了ccdA基因起始密码子紧接上游的原始或天然5-6个核苷酸(第二DNA片段的一个实施例)。该随机化片段中的不同序列导致ccdA表达的不同水平。在某些序列中，肿瘤中的葡萄糖水平低到足以激活CcdA的表达以拮抗CcdB的毒性，而正常组织中的葡萄糖水平高到足以在lac启动子的控制下关闭CcdA的表达。在图1B的核酸系统中也使用了可选择标记，例如氯霉素可选择标记(Cm^R)。

将随机化片段(核酸系统的随机库或DNA库)中具有不同序列的核酸系统插入大肠杆菌染色体中，然后将细菌在含有葡萄糖(Glc(+))或不含葡萄糖(Glu(-))的溶菌肉汤(lysogeny broth(LB))琼脂平板上划线，以筛选在葡萄糖存在下不能生长但在葡萄糖不存在下生长的细菌。箭头112指示在葡萄糖阴性培养基中生长但在含葡萄糖的培养基中不生长的克隆。在一个示例性实施方案中，LB琼脂平板上葡萄糖的浓度是0mM或5mM。

图1C显示了药物递送组合物120，其包括基因工程化细菌122，该细菌不仅特异性靶向实体肿瘤，而且通过产生抗癌分子或化合物而将抗癌药物124递送至实体肿瘤。

基因工程化细菌122将药物124递送至实体肿瘤并杀死肿瘤细胞。基因工程化细菌122包括本文讨论的核酸系统，使得细菌在实体肿瘤中生长，但不在非肿瘤组织中生长。

提供以下实施例来说明各种实施方案。

实施例1

材料和方法

靶向低葡萄糖环境的工程化大肠杆菌的随机库的构建：

本实施例设计的肿瘤靶向核酸系统由组成型表达的ccdB基因和lac启动子控制下的葡萄糖抑制ccdA基因组成。解毒剂CcdA在生理水平的葡萄糖存在下被抑制，因此毒素CcdB杀死细菌。相反，由于CcdA的表达被去抑制并抵消CcdB的作用，所以细菌在低葡萄糖生长条件下是存活的。为了提高CcdA在低葡萄糖条件下在lac启动子控制下拮抗CcdB的能力，或者为了增强CcdB在葡萄糖存在下杀死细菌的能力，通过随机化ccdA基因起始密码子紧接上游的5个核苷酸来构建肿瘤靶向核酸系统的随机库。为了促进通过λ-Red重组技术对染色体进行遗传工程改造，将可选择标记(氯霉素可选择标记(Cm^R))包括在图1B所示的肿瘤靶向核酸系统中。

具体而言，如图1B所示，通过重叠聚合酶链反应(PCR)生成含有在组成型启动子控制下的ccdB基因、可选择标记(例如loxP-cat-loxP盒)、5个核苷酸(5nt)随机化区和在葡萄糖抑制启动子(例如lac启动子)控制下的ccdA基因的一组DNA片段(即肿瘤靶向核酸系统)。5nt随机化区允许生成核酸系统的随机库。可选择标记使得可以通过重组工程将核酸系统插入细菌的染色体。然后，使用λ-Red重组工程技术，将核酸系统的库插入大肠杆菌的染色体中。在缺乏葡萄糖的LB培养基中恢复1小时后，将细菌培养物涂布在补充了抗生素(12.5g/ml氯霉素，如果是使用loxP-cat-loxP盒用作可选择标记的话)的缺乏葡萄糖的LB琼脂上。在32℃过夜培养后，在琼脂上形成单独的菌落。每个菌落来源于具有在低葡萄糖条件下选择性生长的潜力的单个大肠杆菌的复制，这些菌落形成推定的肿瘤靶向细菌的随机库。在此，CcdB-CcdA对可以被其他毒素-解毒剂对替代。

针对靶向葡萄糖缺乏环境的细菌的库筛选：

使用葡萄糖缺乏的LB培养基进行库筛选，筛选在低葡萄糖条件下选择性生长的细菌。为了筛选随机库，将每个克隆在葡萄糖缺乏的LB琼脂和添加5mM葡萄糖的LB琼脂上划线。在37℃过夜培养后，使用基本培养基M63琼脂进一步评估发现在缺乏葡萄糖的LB琼脂上容易生长但在葡萄糖阳性的LB琼脂上不生长的克隆。除了30mM甘油之外，M63琼脂中还补充了浓度不断增加的葡萄糖。这里，可以用非大肠杆菌MG1655的细菌菌株，使用相同的策略筛选靶向肿瘤的细菌。

工程化细菌的肿瘤靶向功效的体内评估：

六至八周龄裸鼠用于人类癌细胞系的肿瘤移植，六至八周龄免疫活性BALB/c小鼠用于鼠源细胞系的肿瘤移植。将1×10⁷的细菌注射到每只小鼠的尾静脉中。在细菌注射后每三天使用数字卡尺(digital caliper)测量肿瘤大小。在实验结束时，将小鼠安乐死，并取出其肿瘤和器官以确定菌落形成单位。具体地，将1克组织在1ml磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液中匀浆。将所得组织悬浮液连续稀释并铺板，并对稀释悬浮液的菌落形成单位进行计数。根据稀释率计算每种组织中的细菌数。如果细菌存在于肿瘤中但不存在于器官中，则认为它们能够特异性靶向肿瘤。

在一个示例性实施方案中，肿瘤靶向的核酸系统由组成型表达的ccdB基因、Cm^R盒和lac启动子控制的ccdA组成，5nt随机序列位于其起始密码子的紧接上游。这些元件不必按照图1B所示的顺序放置。在一个示例性实施方案中，所述肿瘤靶向的核酸系统由组成型表达的ccdA基因、Cm^R盒和葡萄糖诱导的启动子控制的ccdB组成，5nt随机序列位于其起始密码子的紧接上游。ccdB-ccdA对可以被其它毒素-抗毒素对所取代。Cm^R可以被其它可选择标记替代。随机序列中的核苷酸数目不限于五个。

基因克隆：

合成编码细胞毒素铜绿假单胞菌ExlA，蜡状芽孢杆菌Nhe，霍乱弧菌溶血素A和大肠杆菌α-溶血素的基因，并使用金斯瑞(GenScript)的CloneEZ无缝克隆技术将其克隆到pBAD质粒中。通过测序分析验证所有重组质粒。

体外细胞毒性测定：

将每种测试的细胞系以每孔1×10⁴个细胞的密度接种在96孔板中的合适生长培养基中。当细胞生长到80％融合(confluency)状态时，将它们与测试Moi为100(即每个细胞100个细菌)的大肠杆菌菌株共培养。作为对照，细胞也与单独的PBS共培养。在不含抗生素的培养基中孵育4-12小时后，将细胞用PBS洗涤三次，并用1％结晶紫染色5分钟。因为将死细胞通过洗涤除去，所以仅染色活细胞。用PBS轻轻洗涤染色的细胞，然后用95％乙醇脱色。用微量滴定板读数器在595nm下测量脱色溶液中结晶紫染色的量，其反映了活癌细胞的数量。使用以下公式计算被共培养细菌杀死的细胞百分比：(对照-处理)/对照×100。所有实验在两次独立的实验中一式四份进行。

溶血分析：

将细菌过夜培养物滴在补充有羊血的LB琼脂上，然后在37℃下培养8-10小时。琼脂的清除(clearing)揭示了红细胞分解的溶血作用。

工程化大肠杆菌对肿瘤的功效的体内评估：

将六至八周大的雌性C57BL/6N小鼠用于人或鼠癌细胞系的皮下肿瘤植入。将所测试的细胞系的10⁵-10⁶个细胞皮下注射到每只小鼠的腹侧(plank)。细胞系注射后10-15天，当肿瘤的平均体积达到约150-300mm³时，将10⁷个细菌注射到每只小鼠的尾静脉中或将5×10⁷个细菌直接注射到每个肿瘤中。细菌注射后每三天测量一次肿瘤体积和体重。用公式(最大直径)×(最小直径)²×0.52计算肿瘤体积。通过从体重中减去估计的肿瘤体重来计算无肿瘤体重的体重(假定1000mm³的肿瘤组织为1g)。

实施例2

在本实施例中使用大肠杆菌MG1655。组成型表达的CcdB、lac启动子控制的CcdA、lac启动子和Cm^R用于构建肿瘤靶向核酸系统。ccdB基因位于Cm^R盒的上游，Cm^R盒位于lac启动子的上游。通过在ccdA基因紧接上游的lac启动子中插入随机片段(在本实施例中为5个核苷酸)产生推定的肿瘤靶向的细菌的随机库。随机库在大肠杆菌菌株MG1655中通过染色体建立。在该随机库中，每个大肠杆菌MG1655变体在染色体中均带有一个lac启动子变体，该lac启动子变体在随机域(randomized domain)中具有独特的5个核苷酸序列。筛选随机库以搜索在低葡萄糖条件下选择性生长的细菌克隆。具体地，该库建立在葡萄糖贫乏的LB琼脂上。然后将所得大肠杆菌克隆分别在含5mM葡萄糖的LB琼脂和不含葡萄糖的LB琼脂上划线，以筛选在葡萄糖存在下不能生长但在葡萄糖不存在下生长的那些。筛选大约1500个克隆，发现6个克隆在葡萄糖阴性培养基中优先生长。

图1D显示了六个大肠杆菌克隆在基本培养基M63琼脂上对葡萄糖的敏感性的图130。纯化6个克隆，过夜培养，并连续稀释。在补充有从0mM Glu至4mM Glu的递增浓度的葡萄糖(Glu)的基本培养基M63中分别滴加10μL稀释的悬浮液，以验证其表型。在6个克隆中，第1和第6个克隆在葡萄糖-阴性培养基琼脂上生长良好，但在葡萄糖存在下生长不良。相反，第2、第3、第4和第5个克隆在葡萄糖-阴性和葡萄糖-阳性培养基琼脂中都显示相当大的生长。鉴于此，第1和第6个克隆(图1D中方框内)是肿瘤靶向细菌的候选者，并分别命名为JY1和JY6(也命名为JY8)。如果进行更多的文库筛选，则可以鉴定出更多的葡萄糖-传感克隆。

在JY1克隆的染色体ccdA基因上游的随机序列是GCCTT。JY1的核苷酸序列包括SEQID NO.5所示的序列。在克隆JY6染色体ccdA基因上游的随机序列是TGTCT。

菌株JY1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为14577，保藏日为2017年8月30日。菌株JY6保藏在CGMCC，保藏号为14578，保藏日为2017年8月30日。

实施例3

工程化的大肠杆菌变体JY1和JY6对葡萄糖敏感，在葡萄糖存在下无法体外生长。本实施例提供了体内实验和数据，表明肿瘤中的葡萄糖水平低到JY1和JY6足以存活和生长。JY1和JY6分别注射到具有CT26(鼠结肠直肠癌细胞系)肿瘤(10⁷cfu/小鼠)的具有免疫活性的BALB/c小鼠的尾静脉中。亲本菌株MG1655用作对照。尾静脉注射后15天，分析细菌在肿瘤和肝中的分布。选择肝脏用于分析是因为它比其它器官更容易受到细菌感染。

图2A-2F显示了大肠杆菌JY1和JY6特异性靶向小鼠的肿瘤。误差棒，SEM.*P＜0.05，**P＜0.01。

图2A显示BALB/c小鼠中每克CT26肿瘤的菌落形成单位(CFU)200。如图2A所示，JY1、JY6和MG1655在BALB/c可比性地定殖在小鼠中的CT26肿瘤，它们在肿瘤中的水平超过10⁸cfu/g。这些数据表明JY1和JY6都是免疫活性BALB/c小鼠携带的CT26肿瘤中的良好定殖菌。

图2B显示了在具有CT26肿瘤的BALB/c小鼠中每克肝脏CFU210。如图2B所示，JY1没有在具有CT26肿瘤的BALB/c小鼠的肝脏中定殖。JY6在具有CT26的BALB/c小鼠的肝脏中定殖的程度低于MG1655。图2C表示在具有CT26肿瘤的BALB/C小鼠中JY1、JY6和MG1655定殖肝的百分比220。如图2C所示，JY6在20％的具有CT26肿瘤的BALB/C小鼠肝脏中检出(5只中的1只)，JY1在任何小鼠肝脏中都没有检出，而MG1655定殖发生在60％小鼠肝脏中(5只中的3只)。这些结果表明JY1和JY6比MG1655更特异于肿瘤，JY1比JY6更特异于肿瘤。

进一步的涂板分析表明，JY1也在免疫活性小鼠的血液和包括脾、心、肺和肾在内的器官中缺失。尽管JY1和JY6显示出在CT26肿瘤中定殖的能力，但JY1在特异性靶向免疫活性小鼠的肿瘤方面优于JY6。

在携带皮下HCT116(人结肠直肠癌细胞系)肿瘤的免疫受损裸鼠中进行类似的实验。在尾静脉注射细菌(10⁷cfu/小鼠)后7天，分析细菌在肿瘤和肝中的分布。图2D显示了每克裸鼠HCT116肿瘤的CFU230。如图2D所示，JY1、JY6和MG1655在裸鼠中定殖了HCT116肿瘤。图2E显示了具有HCT116肿瘤的裸鼠中每克肝脏CFU 240。如图2E所示，JY1没有在HCT116肿瘤裸鼠的肝脏中定殖。JY6在HCT116肿瘤裸鼠肝脏中的定殖程度低于MG1655。图2F显示在具有HCT116的裸鼠中JY1、JY6和MG1655定殖肝脏的百分比250。如图2F所示，JY6和MG1655分别在28.57％(7只中的2只)和85.71％(7只中的6只)的裸鼠肝脏中得到检测。同样，JY1在任何小鼠的肝脏中都不存在(n＝6)。这些结果表明JY1和JY6在免疫受损免疫低下小鼠中比MG1655对肿瘤更特异，JY1在免疫受损小鼠中比JY6对肿瘤更特异。

为了保证JY1不感染正常组织，进一步检查细菌处理组中每只小鼠的脾、心、肺和肾的匀浆悬浮液和血液。所有这些都不具JY1。尽管JY1避免了感染器官，但它很容易在HCT116肿瘤中定殖，并且在肿瘤中的水平达到3.79×10⁷cfu/g(图2D)。综合考虑，体内数据表明JY1和JY6细菌携带的肿瘤靶向核酸系统使它们能特异性地靶向免疫活性和免疫受损的小鼠的实体肿瘤，而JY1在靶向实体肿瘤的能力上优于JY6。

实施例4

接下来，将由JY1携带的靶向葡萄糖的核酸系统移植到大肠杆菌SH1的染色体中，以表明该核酸系统并不局限于特定的细菌菌株。

从健康女性志愿者提供的粪便样本中分离出大肠杆菌SH1。将粪便样品重悬于PBS缓冲液中，并涂布在补充有1mM异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)和X-gal(0.06mg/ml)的LB琼脂上。大肠杆菌形成蓝色菌落与其它细菌种类区分。SH1是粪便大肠杆菌分离株之一。SH1菌株保藏于CGMCC，保藏号为14580，保藏日为2017年8月30日。

得到的重组大肠杆菌菌株称为JYH1。所述菌株JYH1保藏于CGMCC，保藏号14579，保藏日为2017年8月30日。

然后将JYH1静脉注射到具有皮下SW480(一种人结肠直肠癌细胞系)肿瘤的裸鼠中。在静脉注射细菌后90天，分析小鼠在肿瘤和器官中的细菌定殖。因为四只JYH1处理的小鼠的肿瘤完全治愈，所以在这个组中只有两个肿瘤可用于分析。从两个肿瘤之一中检测到JYH1，达到1.8×10⁸cfu/g。

它显示了当模块或核苷酸系统被导入大肠杆菌SH1中时，得到的菌株不仅可以靶向肿瘤，而且可以治疗肿瘤。

图3A和3B示出了大肠杆菌JYH1特异性靶向SW480肿瘤，但未在裸鼠正常组织中定殖，而未被肿瘤靶向核苷酸体系统工程改造的同基因菌株(isogenic strain)SH1hly则在肿瘤和正常组织中定殖。*P＜0.05。误差棒，SEM。

图3A显示了在患有SW480的裸鼠中每克肝和脾组织CFU 300。图3B显示310％的肝脏和脾脏器官被JYH1和SH1hly感染。如图3A和3B所示，JYH1没有在肝或脾中定殖。所有JYH1处理的裸鼠的肝、脾、心脏、肺、肾都不具JYH1，这表明葡萄糖-传感模块能够将JYH1限制在肿瘤中，并且能够防止其长时间扩散到远处的器官。与JYH1相反，没有葡萄糖传感模块的同基因菌株SH1hly不仅定殖了肿瘤(9.35×10⁸±5.97×10⁸cfu/g，均值±SEM)，而且定殖了器官。当在第82天分析时，四只SH1hly处理的小鼠(80％，5只中的4只)的肝脏(6.0×10¹⁰±6.0×10¹⁰cfu/g，均值±SEM)和脾(1.85×10⁵±9.74×10⁴cfu/g，均值±SEM)被SH1hly感染。

在感染的小鼠中，一只小鼠出现肝脓肿，如图3C所示。照片320是在第82天对小鼠实施安乐死以供分析时拍摄的。

JYH1的肿瘤特异性和对葡萄糖传感的肿瘤靶向核酸系统的需求也可以通过肝切片330的苏木精和伊红(H&E)染色来证实，这表明JYH1处理的小鼠的肝脏正常，而SH1hly处理的小鼠肝脏发生大量的炎症浸润和脓肿，如图3D所示(比例尺，200μm)。综合考虑，这些数据证明葡萄糖传感的肿瘤靶向核酸系统优化了JYH1在裸鼠中的肿瘤特异性。

实施例5

测试JYH1在免疫活性小鼠中特异性地定殖肿瘤的能力。将JYH1静脉给药于携带CT26肿瘤的免疫活性BALB/c小鼠。细菌注射后14天，由于过度的肿瘤生长，所有小鼠被安乐死。图4显示BALB/c小鼠中每克正常组织和CT26肿瘤的CFU 400。对匀浆组织的铺板分析表明，在第14天，静脉注射的JYH1没有在免疫活性小鼠的任何受试器官中定殖，包括肝脏、脾脏、心脏、肺和肾脏。相反，如图4所示，JYH1在肿瘤中的水平达到4.67×10⁷cfu/g(±1.62×10⁷cfu/g)。这些数据与裸鼠的数据一起表明JYH1特异性靶向实体肿瘤，而与免疫系统的完整性无关。

图5显示了构建通过在葡萄糖缺乏环境中选择性生长而靶向实体肿瘤的基因工程化细菌菌株的方法500。

方框510说明了将核酸系统的随机库插入细菌菌株中。

在一个示例性实施方案中，核酸系统包括编码毒素的第一DNA片段、编码使毒素无效的解毒剂的第二DNA片段。核酸系统还包括控制第二DNA片段转录的第一启动子。所述核酸系统还包括引起第一DNA片段组成型表达的第一组成型启动子。

在一个示例性实施方案中，核酸系统包括编码毒素的第一DNA片段、编码使毒素无效的解毒剂的第二DNA片段。核酸系统还包括控制第一DNA片段转录的第二启动子。所述核酸系统还包括引起第二DNA片段组成型表达的第二组成型启动子。

在一个示例性实施方案中，毒素-解毒剂对包括但不限于CcdB-CcdA对。其它毒素-解毒剂对如AvrRxo1-Arc1、Hha-TomB和PaaA2-ParE2可用于替代CcdB-CcdA对。在一个示例性实施方案中，第一启动子包括但不限于lac启动子。lac启动子可以被其它葡萄糖抑制型启动子如gltA、sdhADC或tnaB的启动子所取代。在一个示例性实施方案中，第二启动子包括但不限于ptsG的启动子、fruB的启动子和ackA的启动子。

在一个示例性实施方案中，插入由5-6个核苷酸组成的随机序列以替换ccdA基因起始密码子紧接上游和第一启动子下游的天然5-6个核苷酸。

在一个示例性实施方案中，插入由5-6个核苷酸组成的随机序列以取代ccdB基因起始密码子紧接上游和第二启动子下游的天然5-6个核苷酸。

方框512说明了培养基因工程化细菌菌株的克隆的随机库。

在一个示例性实施方案中，将核酸系统移植到细菌菌株的染色体中。在一个示例性实施方案中，将核酸系统移植到质粒中，并将质粒插入细菌菌株中。在一个示例性实施方案中，细菌菌株包括但不限于大肠杆菌MG1655。其它大肠杆菌菌株如DH5α和CFT073和其它革兰氏阴性细菌如沙门氏菌和志贺氏菌属可以用于替代MG1655。在一个示例性实施方案中，包括核酸系统的细菌菌株的克隆在含有或不含葡萄糖的LB琼脂上培养。

方框514说明了选择在葡萄糖不存在下生长但在葡萄糖存在下不生长的克隆，从而获得肿瘤靶向的基因工程化细菌菌株。

在一个示例性实施方案中，选择在不含葡萄糖的LB琼脂中生长但在含5mM葡萄糖的LB琼脂中不生长的克隆，并将其鉴定为肿瘤靶向的细菌的潜在候选物。

在一个示例性实施方案中，在不含葡萄糖的M63琼脂中生长但在1-4mM的葡萄糖浓度下不生长的克隆被证实为肿瘤靶向的细菌的潜在候选物。

在一个示例性实施方案中，所述方法还包括当所述核酸系统包含第一启动子时，通过插入由5-6个核苷酸组成的随机序列以替换位于第二DNA片段紧接上游的天然核苷酸，从而产生所述核酸系统的随机库。

在一个示例性实施方案中，所述方法还包括当所述核酸系统包含第二启动子时，通过插入由5-6个核苷酸组成的随机序列以替换位于第一DNA片段紧接上游的天然核苷酸，从而产生所述核酸系统的随机库。

实施例6

在本实施例中，评价了静脉注射的大肠杆菌JYH1对体内肿瘤生长的抑制作用。

图6A显示了静脉注射大肠杆菌JYH1对HCT116肿瘤在裸鼠中生长的抑制作用700。静脉注射JYH1抑制HCT116肿瘤在裸鼠中的生长。相反，JY1与PBS对照相比对肿瘤生长的影响很小。JY1-处理的小鼠的HCT116肿瘤与PBS-处理的对照组的生长同样好，而JYH1-处理的小鼠的HCT116肿瘤生长相对较慢，并且在静脉注射细菌后18-26天(10⁷/小鼠)，其中50％(10只中的5只)开始消退。JYH1对HCT116肿瘤生长的抑制效果在100％的试验小鼠中都有表现(n＝10)，这表明其抗肿瘤效果明显好于JY1(Fisher精确试验，p＜0.0001)。

图6B显示了静脉注射大肠杆菌JYH1对裸鼠SW480肿瘤生长的抑制作用的分析702。图6C显示了0和55天的PBS处理小鼠中SW480肿瘤的代表性照片704。图6D显示了0天和90天的JYH1处理的小鼠中SW480肿瘤的代表性照片706。监测SW480肿瘤的生长长达90天。JYH1处理的小鼠(n＝6)在静脉注射JYH1后26-52天肿瘤消退，有效百分比为100％。其中，66.7％的小鼠(6只中的4只)的肿瘤消失，并且在实验结束时没有复发。剩余两只小鼠之一的肿瘤没有治愈，而是保持静止(quiescent)。仅一只小鼠的肿瘤复发(16.67％，6只中的1只)。相反，PBS处理的肿瘤都不退化或消失。这些数据进一步表明JYH1对体内肿瘤生长具有显著的抑制作用。

因此，在一个示例性实施方案中，当细菌具有肿瘤靶向核酸系统时，对肿瘤细胞和正常组织细胞都有毒性的细菌可以变得对肿瘤特异并抑制肿瘤生长而不影响正常组织。

实施例7

在这个实施例中，将细胞毒素编码基因(即编码细胞毒素的基因)克隆到pBAD质粒中。将编码每种细胞毒素的基因分别克隆到pBAD质粒中。对于铜绿假单胞菌的exlA，蜡状芽孢杆菌的nhe和霍乱弧菌的hlyA(以下称为VhlyA)，将pelB前导序列框架内融合(fused inframe)至标靶基因的上游以允许编码的细胞毒素分泌。使用组成型启动子来驱动融合DNA的转录。在编码大肠杆菌α-溶血素的hlyCABD操纵子(以下称为hlyCABD)的情况下，将整个操纵子克隆到pBAD载体中。pelB前导序列未用于hlyCABD操纵子，因为操纵子的产物不仅包括hlyA溶血素，还包括溶血素分泌所需的分泌系统。所得重组质粒的测序分析证实所有四个基因均已正确克隆。

在一个示例实施方案中，pelB前导序列如SEQ ID No.9所示。具有pelB前导的exlA的序列如SEQ ID No.10所示。具有pelB前导的Nhe的序列如SEQ ID No.11所示。具有pelB前导序列的霍乱弧菌的hlyA的序列如SEQ ID No.12所示。大肠杆菌的hlyBACD操纵子的序列如SEQ ID No.13所示。

实施例8

在该实施例中，显示实施例7的克隆基因在体外测定中产生功能性细胞毒素并杀死癌细胞。

将每个重组质粒引入大肠杆菌参考菌株TOP10。该菌株本身不引起细胞裂解，因此，任何杀伤作用都必须归因于该菌株携带的质粒产生的毒素。鼠黑素瘤细胞系B16F10用于体外细胞毒性测定。将B16F10细胞与携带四个重组质粒中的每一个的大肠杆菌TOP10共培养，moi为100(即每个细胞100个细菌)。作为对照，也将细胞与携带空pBAD质粒或PBS的TOP10共培养。共培养12小时后，携带带有毒素编码基因的重组质粒的TOP10对B16F10细胞显示出明显的细胞毒性作用，而带有空质粒的TOP10对细胞存活率的影响很小，如图7所示。

这些体外数据证明，克隆到pBAD质粒中的基因成功产生了细胞毒素以杀死癌细胞。在四种细胞毒素中，两种溶血素具有溶血作用，而其他两种毒素则不具有溶血作用。与此相符的是，TOP10与pBAD-hlyCABD和TOP10与pBAD-VhlyA引起血液琼脂溶血，而TOP10携带pBAD-exlA或pBAD-nhe不会引起溶血(如图8所示)。溶血试验证实了克隆在质粒中的基因的功能。

实施例9

在该实施例中，显示细胞毒素增强细菌在体内的抗癌效力。

评估了被转化为过表达每种上述细胞毒素的细菌的抗癌能力。JYH1是一种大肠杆菌菌株，具有适度抑制肿瘤生长的内在能力。将四种重组质粒分别引入JYH1中，以分析它们是否增强JYH1的抗癌效力。

在C57BL/6N小鼠中，瘤内注射过表达四种细胞毒素中任一种的JYH1的皮下B16F10肿瘤的生长速度比携带空质粒的JYH1慢得多(所有P<0.05)。细胞毒素治疗的肿瘤在治疗后的前6或9天内消退，而用磷酸盐缓冲液(PBS)或携带空质粒的JYH1治疗的肿瘤则容易生长而无消退(如图9所示)。

在四种细胞毒素中，α-溶血素是由某些大肠杆菌菌株自然产生的。删除编码α-溶血素的染色体基因不会损害大肠杆菌抑制肿瘤生长的能力(如图10所示)。这表明溶血性大肠杆菌菌株(如JYH1)的固有抗癌作用不依赖于它们从染色体上自然产生的α-溶血素。但是，质粒衍生的α-溶血素的过量产生增强了这些细菌的抗癌效力，如图9所示。由染色体中操纵子的单个拷贝产生的α-溶血素不足以抑制肿瘤，但从多个拷贝的质粒过量产生的α-溶血素足以使细胞毒素显着抑制肿瘤生长。

细胞毒素铜绿假单胞菌外溶素，蜡状芽孢杆菌非溶血性肠毒素和霍乱弧菌溶血素A不是由大肠杆菌自然产生的，但改造大肠杆菌以产生这些细胞毒素可增强大肠杆菌的抗癌功效。

在一个示例实施方案中，通过将携带编码细胞毒素基因的质粒引入大肠杆菌来制备大肠杆菌以产生非大肠杆菌衍生的细胞毒素。在一个示例性实施方案中，将细胞毒素编码基因插入大肠杆菌的染色体中以增加抗癌功效。在一个示例性的实施方案中，细胞毒素改善了除大肠杆菌以外的细菌的抗癌功效。

本文所用的术语“治疗”是指减轻、缓解或改善疾病或病症症状、预防其它症状、缓解或预防症状的潜在代谢原因、抑制疾病或病症、阻止疾病或病症的发展、缓解疾病或病症、使疾病或病症消退、缓解由疾病或病症引起的病症、或预防性和/或治疗性地停止疾病或病症的症状的方法。

如本文所用，“紧接(immediately)”、“紧接上游”或“紧接下游”是指在一个DNA片段和另一个DNA片段之间没有其它核苷酸。

如本文所用，“系统”是指包括毒素基因、解毒剂基因及其相应启动子的组合或遗传回路。该系统的毒素基因和解毒剂基因可以以任何顺序放置。该系统的毒素基因和解毒剂基因可以位于相同的分子中或不同的分子中。在一个示例性实施方案中，毒素基因和解毒剂基因之一可以在细菌的染色体中，而另一个基因可以在同一细菌的质粒中。

如本文所用，“在肿瘤组织处”可与诸如“在肿瘤中”，“在肿瘤部位”，“在肿瘤内”，“在肿瘤组织的区域”之类的术语互换。这些术语是指位于存在肿瘤细胞并且局部环境的葡萄糖低。

序列表

<110> 新实有限公司（New Portal Limited）

<120> 靶向肿瘤和治疗癌症的细菌

<130> N026.002.NPOCN

<150> PCT/CN2017/101069

<151> 2017-09-08

<160> 13

<170> PatentIn版本3.5

<210> 1

<211> 306

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 1

atgcagttta aggtttacac ctataaaaga gagagccgtt atcgtctgtt tgtggatgta 60

cagagtgata ttattgacac gcccgggcga cggatggtga tccccctggc cagtgcacgt 120

ctgctgtcag ataaagtctc ccgtgaactt tacccggtgg tgcatatcgg ggatgaaagc 180

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atataa 306

<210> 2

<211> 219

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 2

atgaagcagc gtattacagt gacagttgac agcgacagct atcagttgct caaggcatat 60

gatgtcaata tctccggtct ggtaagcaca accatgcaga atgaagcccg tcgtctgcgt 120

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<210> 3

<211> 164

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 3

taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg caacgcaatt 60

aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct tccggctcgt 120

atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaa 164

<210> 4

<211> 1101

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 4

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttattaggtc tgaagaggag tttacgtcca 60

gccaagctta ggatcccggg taccgatatc ggcagcatca cccgacggac tttgcgccga 120

ataaatacct gtgacggaag atcacttcgc agaataaata aatcctggtg tccctgttga 180

taccgggaag ccctgggcca acttttggcg aaaatgagac gttgatcggc acgtaagagg 240

ttccaacttt caccataatg aagtaagatc actaccgggc gtattttttg agttatcgag 300

attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga gaaaaaaatc actggatata ccaccgttga 360

tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt tgaggcattt cagtcagttg ctcaatgtac 420

ctataaccag accgttcagc tggatattac ggccttttta aagaccgtaa agaaaaataa 480

gcacaagttt tatccggcct ttattcacat tcttgcccgc cagatgaatg ctcatccgga 540

attccgtatg gcaatgaaag acggtgagct ggtgatatgg gatagtgttc acccttgtta 600

caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt ttcatcgctc tggagtgaat accacgacga 660

tttccggcag tttctacaca tatattcgca agatgtggcg tgttacggtg aaaacctggc 720

ctatttccct aaagggttta ttgagaatat gtttttcgtc tcagccaatc cctgggtgag 780

tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa tatggacaac ttcttcgccc ccgttttcac 840

catgggcaaa tattatacgc aaggcgacaa ggtgctgatg ccgctgacga ttcaggttca 900

tcatgccgtt tgtgatggct tccatgtcgg cagaatgctt aatgaattac aacagtactg 960

cgatgagtgg cagggcgggg cgtaattttt ttaaggcagt tattggtgcc cttagatatc 1020

aagcttagga tccggaaccc ttaatataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatt 1080

aggtccctcg aagaggttca c 1101

<210> 5

<211> 342

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 5

aacgcgtgga tccggcttac taaaagccag ataacagtat gcgtatttgc gcgctgattt 60

ttgcggtata agaatatata ctgatatgta tacccgaagt atgtcaaaaa gaggtgtgct 120

atgaagcagc gtattacagt gacagttgac agcgacagct atcagttgct caaggcatat 180

atgatgtcaa tatctccggt ctggtaagca caaccatgca gaatgaagcc cgtcgtctgc 240

gtgccgaacg ctggaaagcg gaaaatcagg aagggatggc tgaggtcgcc cggtttattg 300

aaatgaacgg ctcttttgct gacgagaaca gggactggtg aa 342

<210> 6

<211> 158

<212> DNA

<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）

<400> 6

tgcctggcgg cagtagcgcg gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac 60

gccgtagcgc cgatggtagt gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat 120

caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctt 158

<210> 7

<211> 2710

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 一个示例实施方案的核酸系统

<400> 7

aacgcgtgga tccggcttac taaaagccag ataacagtat gcgtatttgc gcgctgattt 60

ttgcggtata agaatatata ctgatatgta tacccgaagt atgtcaaaaa gaggtgtgct 120

atgaagcagc gtattacagt gacagttgac agcgacagct atcagttgct caaggcatat 180

atgatgtcaa tatctccggt ctggtaagca caaccatgca gaatgaagcc cgtcgtctgc 240

gtgccgaacg ctggaaagcg gaaaatcagg aagggatggc tgaggtcgcc cggtttattg 300

aaatgaacgg ctcttttgct gacgagaaca gggactggtg aaatgcagtt taaggtttac 360

acctataaaa gagagagccg ttatcgtctg tttgtggatg tacagagtga tattattgac 420

acgcccgggc gacggatggt gatccccctg gccagtgcac gtctgctgtc agataaagtc 480

tcccgtgaac tttacccggt ggtgcatatc ggggatgaaa gctggcgcat gatgaccacc 540

gatatggcca gtgtgccggt ctccgttatc ggggaagaag tggctgatct cagccaccgc 600

gaaaatgaca tcaaaaacgc cattaacctg atgttctggg gaatataaat gtcaggctcc 660

gttatacaca gccagtctgc aggtcgacca tagtgactgg atatgttgtg ttttacagta 720

ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta tatcatttta 780

cgtttctcgt tcagctttct tgtacaaagt ggtgatcaag cttgaaggta agcctatccc 840

taaccctctc ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat catcaccatc accattgagt 900

ttaaacggtc tccagcttgg ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag 960

attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg 1020

gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt 1080

gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca 1140

gtcgaaagac tgggccttaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattccga 1200

tcatattcaa taacccttaa tataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttattaggt 1260

ctgaagagga gtttacgtcc agccaagctt aggatcccgg gtaccgatat cggcagcatc 1320

acccgacgga ctttgcgccg aataaatacc tgtgacggaa gatcacttcg cagaataaat 1380

aaatcctggt gtccctgttg ataccgggaa gccctgggcc aacttttggc gaaaatgaga 1440

cgttgatcgg cacgtaagag gttccaactt tcaccataat gaagtaagat cactaccggg 1500

cgtatttttt gagttatcga gattttcagg agctaaggaa gctaaaatgg agaaaaaaat 1560

cactggatat accaccgttg atatatccca atggcatcgt aaagaacatt ttgaggcatt 1620

tcagtcagtt gctcaatgta cctataacca gaccgttcag ctggatatta cggccttttt 1680

aaagaccgta aagaaaaata agcacaagtt ttatccggcc tttattcaca ttcttgcccg 1740

ccagatgaat gctcatccgg aattccgtat ggcaatgaaa gacggtgagc tggtgatatg 1800

ggatagtgtt cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa actgaaacgt tttcatcgct 1860

ctggagtgaa taccacgacg atttccggca gtttctacac atatattcgc aagatgtggc 1920

gtgttacggt gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt attgagaata tgtttttcgt 1980

ctcagccaat ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta aacgtggcca atatggacaa 2040

cttcttcgcc cccgttttca ccatgggcaa atattatacg caaggcgaca aggtgctgat 2100

gccgctgacg attcaggttc atcatgccgt ttgtgatggc ttccatgtcg gcagaatgct 2160

taatgaatta caacagtact gcgatgagtg gcagggcggg gcgtaatttt tttaaggcag 2220

ttattggtgc ccttagatat caagcttagg atccggaacc cttaatataa cttcgtataa 2280

tgtatgctat acgaagttat taggtccctc gaagaggttc actaatgcag ctggcacgac 2340

aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact 2400

cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg 2460

agcggataac aatttcacac aggaaatgtc tatgaagcag cgtattacag tgacagttga 2520

cagcgacagc tatcagttgc tcaaggcata tgatgtcaat atctccggtc tggtaagcac 2580

aaccatgcag aatgaagccc gtcgtctgcg tgccgaacgc tggaaagcgg aaaatcagga 2640

ggggatggct gaggtcgccc ggtttattga aatgaacggc tcttttgctg atgagaacag 2700

ggactggtga 2710

<210> 8

<211> 2710

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 另一个示例实施方案的核酸系统

<400> 8

aacgcgtgga tccggcttac taaaagccag ataacagtat gcgtatttgc gcgctgattt 60

ttgcggtata agaatatata ctgatatgta tacccgaagt atgtcaaaaa gaggtgtgct 120

atgaagcagc gtattacagt gacagttgac agcgacagct atcagttgct caaggcatat 180

atgatgtcaa tatctccggt ctggtaagca caaccatgca gaatgaagcc cgtcgtctgc 240

gtgccgaacg ctggaaagcg gaaaatcagg aagggatggc tgaggtcgcc cggtttattg 300

aaatgaacgg ctcttttgct gacgagaaca gggactggtg aaatgcagtt taaggtttac 360

acctataaaa gagagagccg ttatcgtctg tttgtggatg tacagagtga tattattgac 420

acgcccgggc gacggatggt gatccccctg gccagtgcac gtctgctgtc agataaagtc 480

tcccgtgaac tttacccggt ggtgcatatc ggggatgaaa gctggcgcat gatgaccacc 540

gatatggcca gtgtgccggt ctccgttatc ggggaagaag tggctgatct cagccaccgc 600

gaaaatgaca tcaaaaacgc cattaacctg atgttctggg gaatataaat gtcaggctcc 660

gttatacaca gccagtctgc aggtcgacca tagtgactgg atatgttgtg ttttacagta 720

ttatgtagtc tgttttttat gcaaaatcta atttaatata ttgatattta tatcatttta 780

cgtttctcgt tcagctttct tgtacaaagt ggtgatcaag cttgaaggta agcctatccc 840

taaccctctc ctcggtctcg attctacgcg taccggtcat catcaccatc accattgagt 900

ttaaacggtc tccagcttgg ctgttttggc ggatgagaga agattttcag cctgatacag 960

attaaatcag aacgcagaag cggtctgata aaacagaatt tgcctggcgg cagtagcgcg 1020

gtggtcccac ctgaccccat gccgaactca gaagtgaaac gccgtagcgc cgatggtagt 1080

gtggggtctc cccatgcgag agtagggaac tgccaggcat caaataaaac gaaaggctca 1140

gtcgaaagac tgggccttaa taggcgtatc acgaggccct ttcgtcttca agaattccga 1200

tcatattcaa taacccttaa tataacttcg tataatgtat gctatacgaa gttattaggt 1260

ctgaagagga gtttacgtcc agccaagctt aggatcccgg gtaccgatat cggcagcatc 1320

acccgacgga ctttgcgccg aataaatacc tgtgacggaa gatcacttcg cagaataaat 1380

aaatcctggt gtccctgttg ataccgggaa gccctgggcc aacttttggc gaaaatgaga 1440

cgttgatcgg cacgtaagag gttccaactt tcaccataat gaagtaagat cactaccggg 1500

cgtatttttt gagttatcga gattttcagg agctaaggaa gctaaaatgg agaaaaaaat 1560

cactggatat accaccgttg atatatccca atggcatcgt aaagaacatt ttgaggcatt 1620

tcagtcagtt gctcaatgta cctataacca gaccgttcag ctggatatta cggccttttt 1680

aaagaccgta aagaaaaata agcacaagtt ttatccggcc tttattcaca ttcttgcccg 1740

ccagatgaat gctcatccgg aattccgtat ggcaatgaaa gacggtgagc tggtgatatg 1800

ggatagtgtt cacccttgtt acaccgtttt ccatgagcaa actgaaacgt tttcatcgct 1860

ctggagtgaa taccacgacg atttccggca gtttctacac atatattcgc aagatgtggc 1920

gtgttacggt gaaaacctgg cctatttccc taaagggttt attgagaata tgtttttcgt 1980

ctcagccaat ccctgggtga gtttcaccag ttttgattta aacgtggcca atatggacaa 2040

cttcttcgcc cccgttttca ccatgggcaa atattatacg caaggcgaca aggtgctgat 2100

gccgctgacg attcaggttc atcatgccgt ttgtgatggc ttccatgtcg gcagaatgct 2160

taatgaatta caacagtact gcgatgagtg gcagggcggg gcgtaatttt tttaaggcag 2220

ttattggtgc ccttagatat caagcttagg atccggaacc cttaatataa cttcgtataa 2280

tgtatgctat acgaagttat taggtccctc gaagaggttc actaatgcag ctggcacgac 2340

aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact 2400

cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg 2460

agcggataac aatttcacac aggaaagcct tatgaagcag cgtattacag tgacagttga 2520

cagcgacagc tatcagttgc tcaaggcata tgatgtcaat atctccggtc tggtaagcac 2580

aaccatgcag aatgaagccc gtcgtctgcg tgccgaacgc tggaaagcgg aaaatcagga 2640

ggggatggct gaggtcgccc ggtttattga aatgaacggc tcttttgctg atgagaacag 2700

ggactggtga 2710

<210> 9

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> pelB前导序列

<400> 9

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggcc 66

<210> 10

<211> 5019

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 具有pelB前导序列的exlA

<400> 10

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggcccata gagacaatcc tgtcttccac ctctcccccc ggggaaaact ccgttgcctg 120

atcgccggcc tgctgctggc gccccacctg ccccaggctt tcgccggcgg gctggaggcg 180

gccggcgggc cgggcggcac gccgcaactg ctcaaccagg gcggcgtgcc catcgtcaat 240

atcgtcgcgc cgaacgccgc cggcctgtcg cacaaccagt tcctcgacta caacgtcgac 300

cgccagggcc tggtcctcaa caatgcgctg caagccggcg cctcgcagct cgccggacaa 360

ctggcggcca acccgcagct gcgcggcgac gccgccagtg ccatcctcaa cgaagtgatc 420

agccgcaacg cctcggcgat caacggcccg caggaaatct tcggccaggc cgccgactac 480

atcctggcca accccaacgg catctcggtg aacggcggca gcttcatcaa cacgccccat 540

gccagcctgc tggtcggccg tccggaactg gccgacggca agctgcaggc gctgaacacc 600

aacgacgccg tcggcgccct gcagatccag ggccagggcc tgagcaaccg ggatggcagc 660

atcgccctgc tggcgccgcg agtcgacagc caaggcaaga tcgaggcgtc ggccgagctc 720

gacctgaccg tcggtcgcaa ccgcatcgac tacccgagcg gcaaggtcga gcgcgacccg 780

tccggcgacg tccgtccggg cgagcggcgc atcgacgcca gcctgttcgg cgccatgcag 840

gccggacgca tcaacatcct cagcaccgcc gagggcgccg gcgtgcgcgt cggcccggtc 900

gggatcgacg gcagggacgg cgtcgacctg cgctccgccg gcgacctgtc gatcagcggc 960

caggcgcttc ccgacaacag cctgaacgcc ttgcgcgcgg cgatccgcag cgacagcggc 1020

aacgtcggcc tgcatgcccg cggcgacctg agcctggccg ccgccgacgt cagcggcggc 1080

agggtcgacc tcaagtccgg gcgcaacctg accctgggca gcgtggaaag ccgcaacctg 1140

cgggaaagcc gcgagcgctg gagcaacagc accatcggca tcacctggga aacctacgac 1200

cgcacgcgta ccgtcaccga ttcgaagcag cacggcagcc ggatcgatgc ccgcgccgac 1260

gcgagcctgg ccgcgcgggg cgacagcgaa ctgagggcgg cgacggtcaa ggccggcgct 1320

accctgaaag tctccagcgg cggcgatacc cgtcttctcg ccgccaccga gacccgcacc 1380

gaacgcgacc agggcgcgca ccgcaagcac ctgtggaaag ccaactggga caagggcagc 1440

agcgagcaac gcagcgtggc cagcagcctc gaaggcgcgc gggtcgaact cggcggcggc 1500

cggcgcctga atctggaagg cgccgacgtg gccagccgcg gcgacctcga cctgcaagcc 1560

aagagcgtcg acatcggcag cgccagccgc agccacagca gccgcgacaa cagctactcc 1620

ggcgacctgg tcggcggcag cttcttcggc agccacggcg atggcgacag cggcaagacc 1680

ctgcaacagg gcagccgggt caaggccgac ggcgcactga cggtgaccgc cgatgcggtc 1740

gaggtgcgcg gcagccaggt acgcggcgcg cgcaaggccg aggtagtcag cgggaaaggc 1800

tcgctgcgca tcgacggcgt ggaggaaacc gcccacagca acagctacag caaggacagc 1860

aagttcttcg gcatcgccaa ggacgagagt cgccagcgca gcaaggacag cagcaaccgc 1920

gccagcgaag tacgctcgga cagcaacctg accctgcgca gcgccgccga catcgccatt 1980

cgcggctccc gggtcgaggc tggcggcgcc ctcgccgccg aggccaaggg caacctggag 2040

atagcctcgg cgcaggagcg ccacgacggc aacgacagcc gccacacccg cggcttcgac 2100

gcctatgccg gcgagcagac cccaggcagc cgccaatacc gcgccggggt gcgctaccag 2160

gaccagcgga ccagcgtccg ccgcgaggaa acccgcaaca gcggctccag cctgggcggc 2220

gcctccctgg ccgtgaaggc cggcggcgat ctcaccgtga agggggccga gctgaaggcc 2280

agcgcgggcg acgccagcct ctccgggaag aacgtcgccc tgctcgccga gcaggacagc 2340

aagacccgca gcagcgaaca gaccaccacc ggcggcggct tctactatac cggcggcctg 2400

gaccgtgccg gcagcggtat cgaagtcggc caccagcgga tcgacgagaa cgacgccgaa 2460

agccatgcgc gcaccagcca ggtgaacgcg acgggcaatc tcaggatcga cgccgcccag 2520

ggcagcctga cgacgcaggg cgcgcgcctg gaggccggcg acagcctggc ggtcgccgcc 2580

ggcacggtcg acaaccaggc cgcccgcgac agccagagca gccagcgcca cgacagcggc 2640

tggagcggcg acatcggcgc caacctcgag taccgcggca tcgcccggcc gatcgagaag 2700

gcggtcgaag gcgtcgccca gcgcaaggtc caccagcccg gcctgctcga caacctggag 2760

cagccgaacg tcggcgtcga cctcgagatc agccaccgcg acagccgcgg cgagcaacag 2820

gcgagccagg cgcaggtcag cagcttcgcg ggcggccagg tcgaactgaa ggtcggcgac 2880

gccctgcggg acgagggcac ccgttaccag gctcgcagcg gaggcctcct catcgacgcc 2940

gccaggcatg acgccagggc ggcggagaac acctccggca gccatgagca gagcctcgac 3000

gccaaggtcg gcgggcgcct ctacaccacc accggccagg acctgaacct gcgcctgagc 3060

ggcattggcg gcagcagcga gaacagcgcc agccagacca ccgcggtggt cggcgaatac 3120

gccgcgaagc agggcgtcga gatccgcctc ggcggagacg gcctctacca gggcagccgc 3180

ttcgacggcg gcgaagccgg ggtcaggctc agcgccggcg gcaacctggc cctggaacag 3240

gccaacgacc ggcagagcgc cagcagcgcc agcctgcgtg gcgacgccgc gttgagcggc 3300

ggcatggccc ccagcgccaa cggcaaaggg ctgaacgcca gcgccggcct gcaactcgac 3360

cacaaggccg gcgacagccg ggacagccag gcgcgggtcg ccgacatcca ggccaagggc 3420

gcggtggagc tgcgcagcgg cggcgatctg gtcctgcaag gcagcaatat cggcagcgcg 3480

gcagcgaaga ccggcgacat agtcctggcc gccggcggca agctcgacct gcaggccgcc 3540

cgcgatagcc accgggccgg gggaaacaac ctcggcggcg gcttcagcct aggcggcggc 3600

agcgttcgcg acgccgaaac gagcagcaag aacggcagcg tcagcggcaa cttcaacatc 3660

ggccgggtcg acgaggaacg tcacgcgctg aacggcggca acctgcacag cgcgaccaag 3720

gccagccttt ccagcgccgc agacgacgcc accgcggtac gcctgcaagg cactcgcatc 3780

gaagccgccc aggtcagcct cgaagccggc aacggcggca ttctccagga gtccgccgaa 3840

tccagcgagc ggcgcgacaa ctggggcgtg ctgctcggtg ccggggccaa cggcggcaag 3900

accaccggcg cgccgagcga ctaccggagc gactatgccg tccaggcccg cgccaaggtc 3960

gatgtcgatg tcctgcgcag ccagacccag ggcgacagcg tcatccaggc cgaccgggta 4020

atcctggcga gccagggcga cacccgcctg gagggcgcgc gcatcgacgc ggcacaggtg 4080

gacgggcgca tcggcggcga cctgcgggtg gagagccgcc aggaccgcgc ggagggcgtg 4140

aaggtcaacg tcgacgcgcg cctgggcgtg gagaagaacc agcccggcct ggtgaacaag 4200

ctggcgagca agaccggacc gttgaaggac aagctggaaa ccaaggccga gaatgctttc 4260

gacaagcacc gcggcaagtt ggagaacggc atcgaccgta atgtcgagcg gctcggcaag 4320

gccggggaca acctcctcgc caaagccgaa aaggccaagg agcgcctggg cgagaagctg 4380

gtccgcagcg gcagctacga ggtcaacccg gagccgcgcg gcgccttcgc cagcaagctg 4440

gacagggcca ggggctatct ggcggagaaa ggcgaagcgc tcggcgaccg gctgtccggc 4500

ctcaagcagc gcctgtcgcc gaacaagacc ggtagctatg tggtgaacga caagcagacg 4560

gccggcgcca aggtcggcaa tgccgccgag aacgtgctgt tcggcgacaa gagcggcgaa 4620

gcctcggtaa ccccgacgct gtacctggac gtcagccacg tcagccgcaa ctacgtcacc 4680

gaggcctccg gcatcaccgg caggcagggc gtgaacctgc aggtgggcgc agcgacccag 4740

ctgaccggcg cacggatcag cgccagcgac ggcaaggtcg acctcggcgg ctcgcgcgtg 4800

gaaacccgcg ccctggccgg caaggactac cgcgccgatc tcggcctgaa cgtctccagg 4860

tcgccggtgg acctggcctt cggtatcaag gacgagttca gccaggagca cgaccaggcg 4920

acccgcgacg accaggcctt caacctcggc gccctgcgcg tcggcggacg caaccgcgac 4980

cagcagttgc aggccggcat cgagcagaag gccgactaa 5019

<210> 11

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 具有pelB前导序列的Nhe

<400> 11

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggccaata cttatgtaag ggaaccagtt aatgcattta ctcacttagg tggagcgata 120

ttatcattta ttgcgttatt agctatgctt gtgaaagttt ctatcaagat gccatcattt 180

gctgcaatta cagctgttat tttgtttggt attggaatga tggtccttta tacggcgtca 240

gctgtatatc atagtgttgt ggccaatgaa cgtgttatat acttctttag gaagctagat 300

cattctatga tttttatatt aattgcaggt acatatgcac ccttttgctt aattacatta 360

aattcagcaa gtggtttgct attattttgt ttagtctatg caactgcgat ttgtggcatt 420

gtatttaaaa tgttttggtt taattgtcca aggtggttat cgacagcaat ttatattacg 480

atgggttggt taattgtttt attctttgca ccgttagctg agaatttaag tacaggaggc 540

attattttct tagtacttgg tggcattttt tatacaattg gtggatttat ttatggaaca 600

aagccaaaat ggttagagtt taaatatatg gggcatcatg aaatttttca tgtttttgta 660

ttattaggta gtcttgcgca ttttctaagt gtatattgtt acgtaattta a 711

<210> 12

<211> 2220

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 具有pelB前导序列的霍乱弧菌的hlyA

<400> 12

atgaaatacc tgctgccgac cgctgctgct ggtctgctgc tcctcgctgc ccagccggcg 60

atggccgcaa atatcaatga accaagtggt gaagcggcgg atattattag tcaagtcgct 120

gatagtcatg caataaaata ttacaatgct gctgattggc aagccgaaga caacgcatta 180

ccgagcttag ctgagctgcg cgatttggtg attaaccagc aaaaacgcgt tttggttgat 240

ttcagtcaga tcagtgatgc tgaaggtcaa gcagagatgc aagcccaatt cagaaaggct 300

tatggggtgg gttttgctaa tcaatttatt gtcatcactg aacataaagg ggaactgctg 360

tttacacctt ttgatcaggc agaagaggtt gaccctcaat tactcgaagc gccgcgtacc 420

gctcgcttat tagcgcgctc tggttttgca agtccggcac cggcaaacag cgaaacaaat 480

accttgccgc atgtggcttt ttacatcagt gtcaaccgtg cgatcagcga tgaagagtgt 540

acctttaaca actcttggtt gtggaaaaac gaaaagggca gtcgtccgtt ctgtaaagat 600

gccaatatct cattgattta tcgagttaac ctagagcgtt cattgcaata cggcattgtg 660

ggttccgcga caccggatgc caaaattgtg cgtatcagcc tagatgatga cagcacggga 720

gccggcattc atctgaatga tcaactcggt tatcgtcagt ttggagccag ttatacgacg 780

ttagatgcct atttccgtga gtggtcaacc gatgcgattg cccaagatta tcgcttcgtg 840

tttaacgcat cgaacaataa agcgcagatc ctgaaaacct ttcctgtcga taacattaac 900

gagaaatttg agcgcaaaga ggtttcaggt tttgagcttg gggtgactgg tggggtggaa 960

gtcagtggag atggcccgaa agccaaacta gaggcgagag caagttatac ccagagtcgc 1020

tggttaacct acaacacaca agactatcgt attgagcgta atgcgaagaa tgcgcaagcg 1080

gttagcttta catggaatcg tcaacaatac gcgacagcag aatcgctact caatcgttcg 1140

accgatgctt tgtgggtgaa tacctacccg gtagatgtaa accgtattag cccgctgagc 1200

tacgcgagtt ttgtgccgaa aatggatgtg atttataaag cctcagccac agagacaggc 1260

agtacggatt ttatcatcga ctcttcggtc aatatccgcc caatctataa cggtgcttat 1320

aagcactact atgtggtcgg tgctcatcag ttctaccatg gctttgaaga taccccacgt 1380

cgtcgaatca cgaaatcggc aagctttacg gtcgattggg atcacccagt attcacgggt 1440

ggccgcccgg tcaacctaca acttgccagc tttaacaacc gctgtattca agtcgatgct 1500

caaggtcgct tggcggccaa tacgtgcgat agccagcaat cagcgcaatc gttcatctat 1560

gatcagcttg gtcgttatgt gagtgcgagt aacaccaagc tctgtcttga tggtgaggca 1620

ttagacgcat tgcaaccctg taaccaaaac ctgactcagc gttgggagtg gcgtaaaggc 1680

acagatgaat tgaccaatgt ctacagcggc gagtcccttg gacatgacaa acaaaccggt 1740

gagcttggtt tgtatgcgag cagcaacgat gcggtaagtt tacgtaccat caccgcttat 1800

accgatgtgt ttaatgcgca agaaagttcg ccgattctgg gttacacaca agggaaaatg 1860

aatcagcagc gtgtgggaca agatcatcgt ttgtatgtgc gagcgggtgc tgccattgat 1920

gcattagggt ccgcctccga tttattggtt ggtggcaatg gtggtagctt gagttcggtg 1980

gatctgtccg gcgtgaaatc catcacggca acctctggtg atttccaata tggcggtcag 2040

cagttggtgg cgctgacatt cacctaccaa gatggacgtc agcaaacggt aggctcgaaa 2100

gcgtatgtca ccaatgctca tgaagaccgt ttcgatttac cggctgccgc taagatcact 2160

caactgaaaa tttggtctga cgattggttg gtgaaagggg ttcaatttga tttgaactaa 2220

<210> 13

<211> 7410

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> hlyBACD operon of E. coli

<400> 13

ttggtttgct tttttttacc tgccaccgca atgaatgctt tttttatgtt aatgtgcgtt 60

atgaaactaa atgcaagaaa catatttaaa ggattaatat cgttctctca cagactccgt 120

ttacttattc aagaatataa tttaatttat agtgagctta ttatgaatat gaacaatcca 180

ttagaggttc ttgggcatgt atcctggctc tgggccagtt ccccattaca cagaaactgg 240

ccagtctctt tgtttgcaat aaatgtatta cctgcaatac gggctaacca atatgcttta 300

ttaacccggg ataattaccc tgttgcatat tgtagttggg ctaatttaag tttagaaaat 360

gaaattaaat atcttaatga tgttacctca ttagtcgcag aagactggac ttcaggtgat 420

cgtaaatggt tcattgactg gattgctcct ttcggggata acggtgccct gtacaaatat 480

atgcgaaaaa aattccctga tgaactattc cgagccatca gggtggatcc caaaactcat 540

gttggtaaag tatcagaatt tcacggaggt aaaattgata aacagttagc gaataaaatt 600

tttaaacaat attaccacga gttaataact gaagtaaaaa acaagacaga tttcaatttt 660

tcattaacag gttaagagat aattaaatgc caacaataac cactgcacaa attaaaagca 720

cactacagtc tgcaaagcaa tcctctgcaa ataaattgca ctcagcagga caaagcacga 780

aagatgcatt aaaaaaagca gcagagcaaa cccgcaatgc gggaaacaga ctcattttac 840

ttatccctaa agattataaa ggacagggtt caagccttaa tgaccttgtc aggacggcag 900

atgaactggg aattgaagtc cagtatgatg aaaagaatgg cacggcgatt actaaacagg 960

tattcggcac agcagagaaa ctcattggcc tcaccgaacg gggagtgact atctttgcac 1020

cacaattaga caaattactg caaaagtatc aaaaagcggg taataaatta ggcggcagtg 1080

ctgaaaatat aggtgataac ttaggaaagg caggcagtgt actgtcaacg tttcaaaatt 1140

ttctgggtac tgcactttcc tcaatgaaaa tagacgaact gataaagaga caaaaatctg 1200

gtagcaatgt cagttcttct gaactggcaa aagcgagtat tgagctaatc aaccaactcg 1260

tggacacagc tgccagcatt aataataatg ttaactcatt ttctcaacaa ctcaataagc 1320

tgggaagtgt attatccaat acaaagcacc tgaccggtgt tggtaataag ttacagaatt 1380

tacctaacct tgataatatc ggtgcagggt tagatactgt atcgggtatt ttatctgcga 1440

tttcagcaag cttcattctg agcaatgcag atgcagatac cggaactaaa gctgcagcag 1500

gtgttgaatt aacaacgaaa gtactgggta atgttggaaa aggtatttct caatatatta 1560

tcgcacagcg cgctgcacag ggattatcta catctgctgc tgctgccggt ttaattgctt 1620

ctgtagtgac attagcaatt agtcccctct cattcctgtc cattgccgat aagtttaaac 1680

gtgccaataa aatagaggag tattcacaac gattcaaaaa acttggatac gatggtgaca 1740

gtttacttgc tgcttttcac aaagaaacag gagctattga tgcatcgtta acaacgataa 1800

gcactgttct ggcttcagta tcttcaggta ttagtgctgc tgcaacgaca tctctggttg 1860

gtgcaccggt aagcgcgctg gtaggggctg ttacggggat aatttcaggc atccttgagg 1920

cttcaaaaca ggcaatgttt gaacatgtcg ccagtaaaat ggccgatgtt attgctgaat 1980

gggagaaaaa acacggcaaa aattactttg aaaatggata tgatgcccgc catgctgcat 2040

ttttagaaga taactttaaa atattatctc agtataataa agagtattct gttgaaagat 2100

cagtcctcat tacccagcaa cattgggata cgctgatagg tgagttagcg ggtgtcacca 2160

gaaatggaga caaaacactc agtggtaaaa gttatattga ctattatgaa gaaggaaaac 2220

gtctggagaa aaaaccggat gaattccaga agcaagtctt tgacccattg aaaggaaata 2280

ttgacctttc tgacagcaaa tcttctacgt tattgaaatt tgttacgcca ttgttaactc 2340

ccggtgagga aattcgtgaa aggaggcagt ccggaaaata tgaatatatt accgagttat 2400

tagtcaaggg tgttgataaa tggacggtga agggggttca ggacaagggg tctgtatatg 2460

attactctaa cctgattcag catgcatcag tcggtaataa ccagtatcgg gaaattcgta 2520

ttgagtcaca cctgggagac ggggatgata aggtcttttt atctgccggc tcagccaata 2580

tctacgcagg taaaggacat gatgttgttt attatgataa aacagacacc ggttatctga 2640

ccattgatgg cacaaaagca accgaagcgg gtaattacac ggtaacacgt gtacttggtg 2700

gtgatgttaa gattttacag gaagttgtga aggagcagga ggtttcagtt ggaaaaagaa 2760

ctgaaaaaac gcaatatcgg agttatgaat tcactcatat caatggtaaa aatttaacag 2820

agactgataa cttatattcc gtggaagaac ttattgggac cacgcgtgcc gacaagtttt 2880

ttggcagtaa atttactgat atcttccatg gcgcggatgg tgatgaccat atagaaggaa 2940

atgatgggaa tgaccgctta tatggtgata aaggtaatga tacgctgagg ggcggaaacg 3000

gggatgacca gctctatggc ggtgatggca atgataagtt aattgggggg acaggtaata 3060

attaccttaa cggcggtgac ggagatgatg agcttcaggt tcaggggaat tctcttgcta 3120

aaaatgtatt atccggtgga aaaggtaatg acaagttgta cggcagtgag ggagcagatc 3180

tgcttgatgg cggagaaggg aatgatcttc tgaaaggtgg atatggtaat gatatttatc 3240

gttatctttc aggatatggc catcatatta ttgacgatga tggggggaaa gacgataaac 3300

tcagtttggc tgatattgat ttccgggatg tggccttcag gcgagaaggt aatgacctca 3360

tcatgtataa agctgaaggt aatgttcttt ccattggtca taaaaatggt attacattca 3420

ggaactggtt tgaaaaagag tcaggtgata tctctaatca ccagatagag cagatttttg 3480

ataaagacgg cagggtaatc acaccagatt cccttaaaaa ggcacttgag tatcaacaga 3540

gtaataataa ggcaagttat gtgtatggga atgatgcatt agcctatgga agtcaggata 3600

atcttaatcc attaattaat gaaatcagca aaatcatttc agctgcaggt aattttgatg 3660

ttaaagagga aagagctgca gcttctttat tgcagttgtc cggtaatgcc agtgattttt 3720

catatggacg gaactcaata actttgacag catcagcata atttattaat ttaaataata 3780

gcaatcttac tgggctgtgc cacataagat tgctattttt ttggagtcat aatggattct 3840

tgtcataaaa ttgattatgg gttatacgcc ctggagattt tagcccaata ccataacgtc 3900

tctgttaacc cggaagaaat taaacataga tttgacacag acgggactgg tctgggatta 3960

acgtcatggt tgcttgctgc gaaatcttta gaactaaagg taaaacaggt aaaaaaaaca 4020

attgaccgat taaactttat ttctttgccc gcattagtct ggagagagga tggacgtcat 4080

tttattctga ctaaagtcag taaagaagca aacagatatc ttatttttga tctggagcaa 4140

cgaaatcccc gtgttctcga acagtctgag tttgaggcgt tatatcaggg gcatattatt 4200

cttattgctt cccgttcttc tgttaccggg aaactggcaa aatttgactt tacctggttt 4260

atccctgcca ttataaaata cagaaaaata tttattgaaa cccttgttgt atctgttttt 4320

ttacaattat ttgcattaat aacccccctt ttttttcagg tggttatgga caaagtatta 4380

gtacacaggg ggttttcaac ccttaatgtt attactgtcg cattatctgt tgtggtggtg 4440

tttgagatta tactcagcgg tttaagaact tacatttttg cacatagtac aagtcggatt 4500

gatgttgagt tgggtgccaa actcttccgg catttactgg cgctaccgat ctcttatttt 4560

gagagtcgtc gtgttggtga tactgttgcc agggtaagag aattagacca gatccgtaat 4620

tttctgacag gacaggcatt aacatctgtt ctggacttat tattttcatt catatttttt 4680

gcggtaatgt ggtattacag cccaaagctt actctggtga tcttattttc gctgccctgt 4740

tatgctgcat ggtctgtttt tattagcccc attttgcgac gtcgccttga tgataagttt 4800

tcacggaatg cggataatca atctttcctg gtggaatcag tcacggcgat taacactata 4860

aaagctatgg cagtctcacc tcagatgacg aacatatggg acaaacaatt ggcaggatat 4920

gttgctgcag gctttaaagt gacagtatta gccaccattg gtcaacaagg aatacagtta 4980

atacaaaaga ctgttatgat catcaacctg tggttgggag cacacctggt tatttccggg 5040

gatttaagta ttggtcagtt aattgctttt aatatgcttg ctggtcagat tgttgcaccg 5100

gttattcgcc ttgcacaaat ctggcaggat ttccagcagg ttggtatatc agttacccgc 5160

cttggtgatg tgcttaactc tccaactgaa agttatcatg ggaaactggc attaccggaa 5220

attaatggta atatcacttt tcgtaatatc cggtttcgct ataagcctga ctctccggtt 5280

attttagata atatcaatct cagtattaag cagggggagg ttattggtat tgtcggacgt 5340

tctggttcag gaaaaagcac attaactaaa ttaattcaac gtttttatat tcctgaaaat 5400

ggccaggtct taattgatgg acatgatctt gcgttggccg atcctaactg gttacgtcgt 5460

caggtggggg ttgtgttgca ggacaatgtg ctgcttaatc gcagtattat tgataatatc 5520

tcactggcta atcctggtat gtccgtcgaa aaagttattt atgcagcgaa attagcaggc 5580

gctcatgatt ttatttctga attgcgtgag gggtataaca ccattgtcgg ggaacagggg 5640

gcaggattat ccggaggtca acgtcaacgc atcgcaattg caagggcgct ggtgaacaac 5700

cctaaaatac ttatttttga tgaagcaacc agtgctctgg attatgagtc ggagcatatc 5760

atcatgcgca atatgcacaa aatatgtaag ggcagaacgg ttataatcat tgctcatcgt 5820

ctgtctacag taaaaaatgc agaccgcatt attgtcatgg aaaaagggaa aattgttgaa 5880

cagggtaaac ataaggaact gctttctgaa ccggaaagtt tatacagtta cttatatcag 5940

ttacagtcag actaacagaa agaacagaag aatatgaaaa catggttaat ggggttcagc 6000

gagttcctgt tgcgctataa acttgtctgg agtgaaacat ggaaaatccg gaagcaatta 6060

gatactccgg tacgtgaaaa ggacgaaaat gaattcttac ccgctcatct ggaattaatt 6120

gaaacgccgg tatccagacg gccgcgtctg gttgcttatt ttattatggg gtttctggtt 6180

attgctgtca ttttatctgt tttaggtcag gtggaaattg ttgccactgc aaatgggaaa 6240

ttaacactaa gtgggcgcag caaagaaatt aaacctattg aaaactcaat agttaaagaa 6300

attatcgtaa aagaaggaga gtcagtccgg aaaggggatg tgttattaaa gcttacagca 6360

ctgggagctg aagctgatac gttaaaaaca cagtcatcac tgttacagac caggctggaa 6420

caaactcggt atcaaattct gagcaggtca attgaattaa ataaactacc tgaactgaag 6480

cttcctgatg agccttattt tcagaatgta tctgaagagg aagtactgcg tttaacttct 6540

ttgataaaag aacagttttc cacatggcaa aatcagaagt atcaaaaaga actgaatctg 6600

gataagaaaa gagcagagcg attaacaata cttgcccgta taaaccgtta tgaaaattta 6660

tcgagagttg aaaaaagccg tctggatgat ttcaggagtt tattgcataa acaggcaatt 6720

gcaaaacatg ctgtacttga gcaggagaat aaatatgtcg aggcagcaaa tgaattacgg 6780

gtttataaat cgcaactgga gcaaattgag agtgagatat tgtctgcaaa agaagaatat 6840

cagcttgtca cgcagctttt taaaaatgaa attttagaca agctaagaca aacaacagac 6900

aacattgagt tattaactct ggagttagag aaaaatgaag agcgtcaaca ggcttcagta 6960

atcagggccc ctgtttcggg aaaagttcag caactgaagg ttcatactga aggtggggtt 7020

gttacaacag cggaaacact gatggtcatc gttccggaag atgacacgct ggaggttact 7080

gctctggtac aaaataaaga tattggtttt attaacgtcg ggcagaatgc catcattaaa 7140

gtggaggcct ttccttacac ccgatatggt tatctggtgg gtaaggtgaa aaatataaat 7200

ttagatgcaa tagaagacca gaaactggga ctcgttttta atgtcattgt ttctgttgaa 7260

gagaatgatt tgtcaaccgg gaataagcac attccattaa gctcgggtat ggctgtcact 7320

gcagaaataa agactggaat gcgaagcgta atcagctatc ttcttagtcc tctggaagag 7380

tctgtaacag aaagtttaca tgagcgttaa 7410

Claims

1.一种靶向肿瘤和治疗癌症的细菌，包括：

核酸系统；和

编码杀死肿瘤细胞的细胞毒素的基因，

其中核酸系统包括：

第一DNA片段，其编码杀死细菌的毒素；

第二DNA片段，其编码消除毒素的解毒剂，第二DNA片段在肿瘤组织处转录，但在非肿瘤组织处不转录；

解毒剂基因的启动子，其与第二DNA片段可操作地连接并在葡萄糖水平的控制下抑制第二DNA片段的转录，从而解毒剂在肿瘤组织处表达，但在非肿瘤组织处不表达；和

毒素基因的组成型启动子，其可操作地连接至第一DNA片段并引起第一DNA片段的组成型转录，从而毒素在肿瘤组织和非肿瘤组织处表达；

其中所述解毒剂基因的启动子是lac启动子；

其中所述毒素和所述解毒剂的对是CcdB-CcdA对；

所述核酸系统还包括：

由5-6个核苷酸组成的随机序列，并替换位于所述第二DNA片段的紧接上游的所述细菌的原始5-6个核苷酸；

其中所述随机序列是GCCTT或TGTCT；

其中所述细胞毒素选自由铜绿假单胞菌外溶素，蜡状芽孢杆菌非溶血性肠毒素，霍乱弧菌溶血素A和大肠杆菌α-溶血素组成的组。

2.根据权利要求1所述的细菌，其中所述解毒剂基因的启动子位于第二DNA片段的紧接上游。

3.根据权利要求1所述的细菌，其中所述毒素基因的组成型启动子位于所述第一DNA片段的紧接上游。

4.根据权利要求1所述的细菌，其中所述第一DNA片段如SEQ ID No.1所示，并且所述第二DNA片段如SEQ ID No.2所示。

5.根据权利要求1所述的细菌，其中所述解毒剂基因的启动子如SEQ ID No.3所示。

6.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌还包括编码氯霉素抗性盒的第三DNA片段，其中所述第三DNA片段如SEQ ID No.4所示。

7.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述细菌衍生自选自由大肠杆菌、沙门氏菌和志贺氏菌的细菌菌株组成的组。

8.根据权利要求1所述的细菌，其中所述细菌衍生自大肠杆菌MG1655或SH1。

9.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述核酸系统如SEQ ID No.7所示或SEQ ID No.8所示。

10.根据权利要求1所述的细菌，其中，所述细菌衍生自存放于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）保藏号为no. 14577的菌株JY1，存放于CGMCC保藏号为no. 14578的菌株JY8，存放于CGMCC保藏号为no. 14580的菌株SH1，或存放于CGMCC保藏号为no. 14579的菌株JYH1。

11.一种药物递送组合物，其包含根据权利要求1-10中任一项所述的细菌。

12.一种根据权利要求1-11 中任一项所述的细菌用于制备治疗癌症的药物的用途。

13.根据权利要求12所述的用途，其中所述癌症是黑素瘤。

14.一种根据权利要求11所述的药物递送组合物用于制备治疗癌症的药物的用途。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述癌症是黑素瘤。