CN101010002B - 癌症选择性营养缺陷型 - Google Patents

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Abstract

本发明至少两种氨基酸是营养缺陷型的细菌，所述至少两种氨基酸在至少一种肿瘤中被发现，所述细菌为有效的抗肿瘤治疗、标记试剂以及抗感染疫苗。通过在适宜的肿瘤模型中传代，这些菌株也可以提供改进的抗肿瘤作用。

Description

癌症选择性营养缺陷型
相关申请
本申请要求2004年6月29日提交的序列号为60/584,301的美国临申请的利益，其全文在此引入作为参考。
技术领域
本发明涉及抗肿瘤细菌，该细菌已被修饰以需要至少两种氨基酸作为营养物，并可进一步表现出对肿瘤粘附性和毒力增强。作为示例，包含双营养缺陷型突变以需要精氨酸和亮氨酸的鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)被证实在体内是无毒的并在肿瘤中选择性生长。
背景技术
众所周知厌氧性细菌在肿瘤中选择性生长，并且确实在从患者切除的肿瘤中发现大量细菌。鉴于这一点，细菌被建议作为肿瘤治疗剂。例如，YazawaK.，e tal.，Breast Canc.Res.and Treat.(2001)66∶165-170证实长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)(其为一种非致病性革兰氏阳性细菌)被静脉注射后，在大鼠诱导的乳房肿瘤中选择性生长。Dang，L H.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA (2001)98∶15155-15160证实，其致命毒素已被耗尽的诺氏梭菌(Clostridium novyi)菌株产生孢子，孢子在小鼠肿瘤的无血管区域内萌芽，并破坏周围存活的肿瘤细胞。
如Hoiseth，S.K.J.，etal.，Nature(1981)291∶238-239所描述的，由于aro基因遭到破坏而成为营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌表现为毒力被抑制，因此可用作活疫苗。aro基因的破坏阻断对-氨基苯甲酸(PABA)和2，3-二羟基苯甲酸酯(DHB)二者的生成。早前的获得仅针对PABA的营养缺陷型沙门氏菌、和仅针对DHB的营养缺陷型沙门氏菌的研究工作虽然也导致毒力降低，但是导致双营养缺陷型的aro基因破坏被表征为实际上无毒性的。Pawelek，J.，etal.，Cancer Res.(1997)57∶4537-4544描述了作为致病性降低的抗肿瘤治疗剂的pur-(需要腺嘌呤和维生素B1)沙门氏菌突变体。Low，B.，etal.，Nature Biotech.(1999)17∶37-41报道了msbB基因遭到破坏的脂质-A突变体沙门氏菌，其TNFα诱导降低，并且LD50提高了10,000倍。据报道，与正常组织相比，肿瘤累积率超过1,000∶1。用这些经修饰的沙门氏菌处理的小鼠黑素瘤，其肿瘤大小是未处理的对照的6％。
进一步，如在Toso，J.F.，etal.，J.Clin.Oncol.(200220∶142-152)中所报道的，减毒的鼠伤寒沙门氏菌已经在I期临床试验中被评估。二十四位转移性黑素瘤患者和一位转移性肾细胞癌患者接受了含有106至109cfu/m2的脂质-A突变体鼠伤寒沙门氏菌(VNP20009)的静脉内快速注射输注，所述突变体通过缺失purI和msbB两基因而减毒。purI突变体需要外源腺嘌呤，msbB突变体阻止将末端十四烷基加入至脂质-A功能域。VNP20009株能够被安全地施用给患者，并且在最高耐受剂量时，观察到肿瘤集群。
肿瘤细菌治疗的准确性当然能够通过追踪细菌感染进程的系统而得以增强。一种这样的系统被描述在2003年8月28日公开的美国专利公开物2003-0161788上，在此引入作为参考。如该公开所描述的，用荧光蛋白标记的细菌，如E.coli，被用于监测感染和评估治疗。在模型系统中，以及实际上在接受治疗的受试者中，除了直接观察被标记的细菌本身之外，也可以将不同颜色的荧光标记提供给肿瘤组织以提供所希望的对比。在示例性实施方式中，经修饰表达维多利亚水母绿色荧光蛋白(GFP)变体的鼠伤寒沙门氏菌被注射入用红色荧光蛋白(RFP)标记的裸鼠肿瘤中。在可替换的实施方式中，经修饰以表达RFP的大肠杆菌被注射入含有GFP标记的肿瘤的裸鼠中。值得注意的是，除了它们自身固有的抗肿瘤作用以外，细菌也可被修饰以产生治疗剂，例如IL2或甲硫氨酸酶。
Yu，Y.A.，etal.，Nat.Biotechnol.(2004)22∶313-320显示表达GFP的细菌被静脉注射入活体动物后在实体肿瘤和转移灶中复制，包括乳腺、前列腺、脑肿瘤和纤维肉瘤。用荧光素酶催化的荧光以及GFP对肿瘤中的生长情况进行实时成像。大肠杆菌和三种减毒病原体在肿瘤中复制：霍乱弧菌(Vibriocholerae)，鼠伤寒沙门氏菌，和单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)。
对于改进的细菌菌株仍存在需求，所述改进的细菌菌株具有对肿瘤的增强的选择性，并且毒性降低，以使得这些改进的菌株可以用作治疗剂、疫苗以及作为监控肿瘤进展、和评估及优化肿瘤治疗的指导。本发明提供这种改进的细菌菌株。Zhao，M.，atal.，Proc.Am.Assoc.Cancer Res.(2004)45∶869(No.3765)公开了一篇摘要，该摘要描述了根据本发明制备的鼠伤寒沙门氏菌的作用效果，但是没有描述突变的性质。
下面描述的营养缺陷型菌株A1的详细说明在Zhao，M.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2005)102∶755-760中提供，在此引入作为参考。简要概述发表在Nature Biotechnology(2005)23∶189中。
发明内容
本发明提供用于上面所述目的的细菌菌株，所述菌株对至少两种氨基酸是营养缺陷的，例如精氨酸和亮氨酸。这些双营养缺陷型当施用给受试者时大大增强了肿瘤选择性，降低了毒性，并且TNFα诱导降低。
因此，一方面，本发明针对制备作为药物组合物的厌氧菌或兼性厌氧菌，所述厌氧菌或兼性厌氧菌被修饰以在其营养培养基中需要至少两种氨基酸。在一个实施方式中，本发明的双营养缺陷型被进一步修饰以表达荧光蛋白。
在另一方面，本发明针对如前段所描述的、粘附性、毒力和/或入侵力增强的厌氧菌，其可通过在体内鼠肿瘤模型中传代而获得。
在其他方面，本发明涉及使用本发明的双(或两种以上)营养缺陷型治疗受试者肿瘤的方法，以及使用这些营养缺陷型的疫苗。在其他方面，本发明针对当这些细菌被施用给，例如携带肿瘤的受试者时，通过观察营养缺陷型的行为监控治疗的方法，所述营养缺陷型被修饰以包含荧光蛋白。在一个实施方式中，肿瘤自身用荧光蛋白标记。
附图简要说明
附图1为显示鼠伤寒沙门氏菌A1突变体在PC-3人前列腺肿瘤细胞中毒力的依赖性作为其生长阶段的函数的图。
附图2为将突变体A1的毒性与不携带肿瘤的裸鼠中野生型比较的图。
附图3比较了与野生型相比较，通过由A1突变体对BALB/c小鼠的细菌感染引起的TNFα诱导。
附图4为显示静脉内注射后，A1突变体对裸鼠PC-3前列腺癌生长的影响的图。
附图5为显示通过注射A1突变体，在PC-3肿瘤模型中可获得的增高的存活率。
实施本发明的模型
需要至少两种氨基酸用于其生长的厌氧细菌或兼性厌氧菌的突变体通过使用标准诱变技术而得以制备。当细菌的基因组组成是已知的时，正如在大肠杆菌的情形中时，例如定向突变或同源重组技术可用于特异性实现这些突变。可选择的是，可运用使用辐射或化学刺激的非特异性突变技术，随后进行本领域标准的选择操作。例如，被诱变的细菌生长在含有所有需要的氨基酸的培养基中，并分离单个菌落。在缺乏一种氨基酸的培养基中无法生长的那些菌落随后被挑出来，用于评估在适当的替代培养基中的生长。选择需要向培养基中添加至少两种氨基酸的那些菌落。
还发现，当双突变体在体内肿瘤模型中被传代并再次分离时，产生了对肿瘤细胞的粘附性和/或入侵力和/或毒力增强的菌落。这些被进一步修饰的细菌在下面为营养缺陷型所描述的方法中是特别有用和无毒的。
能够以这种方式修饰的适宜的厌氧性细菌包括沙门氏菌属(Salmonella)，梭菌属(Clostridium)，埃希氏菌属(Escherichia)，弧菌属(Vibrio)，利斯特氏菌属(Listeria)，双歧杆菌属(Bifidobacterium)的各种菌株，以及任何其他适宜的厌氧菌。
在一些例子中，例如在梭菌属的情况下，也可能需要进一步修饰以去除该有机体的毒性。本发明的营养缺陷型在各种场合都是有用的，包括针对肿瘤的直接治疗，针对野生型细菌感染的疫苗，表达系统的载体，所述表达系统用于选择性传递给肿瘤的治疗性蛋白，监控疾病进展和评估候选治疗方案，以及优化方案本身。本发明细菌的特征性特点是它们依赖至少两种由肿瘤充分地供给、而通常不由宿主提供的氨基酸。下面用来示例所使用的是需要亮氨酸和精氨酸的双营养缺陷型；但是，也可以使用其它组合，优选的是不相似的氨基酸的组合。因此，也可以使用需要组氨酸和甲硫氨酸，缬氨酸和天冬氨酸，谷氨酸和丝氨酸等等的突变体。优选的是，所需要的两种氨基酸来自不同途径；因此，可以使用对色氨酸和丙氨酸、或者谷氨酰胺和赖氨酸等等需求的组合。优选的组合是碱性氨基酸和中性氨基酸的组合，例如组氨酸/丙氨酸；组氨酸/缬氨酸；组氨酸/亮氨酸；精氨酸/亮氨酸；精氨酸/缬氨酸；精氨酸/异亮氨酸；赖氨酸/甲硫氨酸；赖氨酸/缬氨酸，等等。下面示例的是精氨酸和亮氨酸组合的营养缺陷型。
该具体的营养缺陷型在下面证实是对在肿瘤中生长具高度选择性的，并且是无毒的。应用对肿瘤细胞系的研究，申请人显示，感染之后，大量细胞内细菌的累积引起小鼠MMT乳腺癌细胞和小鼠B 16F10黑素瘤细胞的非特异性破坏。这些双营养缺陷型在PC-3人前列腺肿瘤细胞中诱导凋亡和坏死。体内研究显示该突变体在治疗PC-3肿瘤以及增加受累小鼠的存活时间方面是成功的。
由于本发明的营养缺陷型必须在肿瘤组织中增殖，氨基酸需求必须通过肿瘤中存在的这些氨基酸的浓度来得到满足。因此，细菌对其营养缺陷的氨基酸必须以足够支持其生长的浓度存在。这些氨基酸必须在至少一种肿瘤类型中存在。可以使用肿瘤细胞培养物很容易地在体外进行测定。所述培养物的系列可以从各种来源得到，例如国立癌症研究院(National CancerInstitute)。只要细胞在至少一种细胞培养物中生长，则它们落入本发明的范围之内。
本发明尤其有用的营养缺陷型包括那些显示抑制肿瘤生长能力增强、导致肿瘤退却、以及增加治疗受试者或实验室研究动物的存活时间的营养缺陷型。这些菌株显示出对肿瘤粘附性和/或入侵力和/或毒力增强，并可通过上述营养缺陷型或通常的厌氧或兼性厌氧菌在体内肿瘤模型中的体内传代而获得。用于传代的肿瘤模型典型地涉及对所选择的细菌的增殖特别有利的器官。例如，由于鼠伤寒沙门氏菌典型的栖息于结肠，优选使用结肠肿瘤模型。获得增强的所需特性的机制还不清楚，但是，正如在下面的实施例中所详述的，通过注射受试者细菌入肿瘤模型，从所述肿瘤中回收细菌，例如，通过均质化和回收上清液，并选择具有所需特性的菌落，可以可靠地获得那些改进的性质。
得益于本发明治疗性和预防性方法的动物受试者是受到实体瘤侵害的所有动物，但是，典型的是脊椎动物，例如鱼、鸟类和哺乳动物，最典型的是哺乳动物。尤其感兴趣的是对人的治疗，但是，对家畜的治疗，例如对猪、牛、绵羊和山羊，鸡，火鸡等等的治疗也是明显有益的，正如对陪伴动物例如狗、猫的治疗一样。由于所使用的荧光蛋白发射出的荧光的强度，本发明的方法提供实时观察，而不需对任何这些动物受试者进行介入技术。
使用实验室动物作为疾病进展和药效测试的模型系统也特别重要，所述实验室动物例如大鼠、小鼠和兔。本发明的那些采用荧光细菌的实施方式在该内特别有用。但是，被治疗的脊椎动物中的疾病进展也可以采用标记的细菌。
本发明的营养缺陷型厌氧菌可以被配制成用作治疗剂和预防剂的药学和兽医学组合物。该组合物包括附加的生理上可接受的赋形剂；适于各种施用途径的治疗剂和疫苗的制剂在，例如Remington’s Pharmacrutical Sciences，最近一版，Mack Publishing Co.，Easton，PA中找到，此处引入作为参考。制剂可以以粉末剂、胶囊剂、糖浆剂、片剂、注射液，等等的形式。也可使用可控释放的制剂、脂质体制剂和植入物。制剂和施用途径的选择取决于具体应用，属于普通技能。
当被用于标记肿瘤时，例如用于监测感染的进展，使用荧光蛋白用于标记。利用可视的标记物荧光蛋白以标记细菌，使得它们在实体瘤中的迁移和集群都能够被跟踪，并且这些细菌的治疗剂的局部生产可以被控制和评估。
由于通过使用荧光蛋白能够获得足够强度以观察完整动物中荧光细胞的迁移和蛋白质的生产，除了测定这些方面之外，肿瘤退却、和转移、或其被抑制的进展能够在完整受试者中实时监测。这可以通过使用在不同波长下发出荧光的蛋白来标记肿瘤细胞本身对优化。
用于本发明各个方面的标记是荧光蛋白，即当用适当的波长照射时发出可见光的蛋白。编码这一类中的原初(seminal)蛋白的天然基因，GFP克隆自生物发光的水母维多利亚水母(Aequorea victoria)(Morin，J.，etal.，J.Cell.Physiol(1972)77∶313-318)。该基因的可获得性使得应用GFP作为基因表达的标记物成为可能。最初的GFP本身是分子量27KD的带有283个氨基酸的蛋白。其既不需要来自其天然来源的额外蛋白，也不需要仅从其天然来源才可得到的底物或辅助因子以发出荧光。(Prasher，D.C.，etal.，Gene(1992)111∶229-233；Yang，F.，etal.，Nature Biotechnol(1996)14∶1252-1256；Cody，C.W.，etal.，Biochemistry(1993)32∶1212-1218)。对最初GFP基因的突变被发现对增强表达和改变产物的激发和荧光有用，所以获得了各种颜色的“GFP”，包括红色、黄色和蓝色。GFP-S65T(此处65位的丝氨酸被苏氨酸替代)在本发明的方法中尤其有用，它在490nm具有单一的激发峰。(Heim，R.，etal.，Nature(1995)373∶663-664)；美国专利5,625，048。其他突变也被Delagrade，S.，etal.，Biotechnology(1995)13∶151-154；Cormack，B.，etal.，Gene (1996)173∶33-38和Cramer，A.，etal.，Nature Biotechnol.(1996)14∶315-319所公开。其他突变也公开在美国专利5,625,048中。
通过适当的修饰，GFP发出的光的光谱可以被改变。因此，尽管由于历史习惯，本发明中经常使用术语“GFP”，该定义所包括的蛋白在外表上并不一定是绿色的，而应该简单地称为荧光蛋白。各种形式的“GFP”表现出除了绿色之外的颜色，这些也包含在“GFP”的使用之内，并且在本发明的方法和材料中是有用的。此外，值得注意的是，此处“GFP”定义范围内的绿色荧光蛋白分离自其他组织，例如海肾(sea pansy)，Renilla reniformis。任何颜色的任何适宜和便利形式的“GFP”都能够被用于修饰在本发明中有用的感染性制剂，无论是天然还是突变形式的。
为了避免混淆，也经常使用简单术语“荧光蛋白”；通常，这理解为指由各种生物体产生的荧光蛋白，例如海肾和水母，以及可以以各种可见颜色发出荧光的这些天然荧光蛋白的修饰形式。通常，术语“荧光蛋白”和“GFP”有时候被交替使用；但是，有时候，特定的其他颜色也能够被注意到。该系统是严格记忆的(mnemonic)，例如，RFP指红色荧光蛋白，YFP指黄色荧光蛋白，BFP指蓝色荧光蛋白，等等。取决于所进行的特异性修饰，这些蛋白质发出宽范围的可见光波长。
由于可得到各种颜色的荧光蛋白，可以同时用超过一种单个色彩的颜色成像。例如，两种不同的细菌制剂、或每种表达特征性荧光的三种不同细菌能够被施用给受试者，或者单个细菌能够用单一颜色组成型标记，并使用不同颜色以产生与基因产物的融合。编码荧光蛋白的核苷酸序列能够被插入到所要产生的蛋白的遗传位点，或作为带有所要产生的治疗性蛋白的载体中的融合蛋白，所述荧光蛋白具有与用来标记细菌本身的颜色不同的颜色。
颜色的多重性在本发明上下文中是尤其有利的。例如，肿瘤本身可以用一种颜色的荧光蛋白标记，带有结构或细胞内蛋白的所施用细菌用不同颜色标记，因此，细菌的定位可以被更好地确定，而细菌的蛋白产物进一步用第三种颜色标记，使得该蛋白的产生水平可以得到监测。因此，利用对活体动物的全身观察，可同时对所施用细菌的定位进行确定、对所述细菌中治疗性蛋白的产生水平进行监测、以及对给肿瘤造成的影响进行监测。
本发明所使用的荧光蛋白有足够强度，使得能够对活体动物的上述现象进行实时观察。这为现有技术中所描述的细菌递送的“盲目”方法提供了极大改进。由于动物是活的，当由这些观察所指示的时候，可以有利地对治疗方案作出修改而增加其功效。
如果需要标记肿瘤，在肿瘤细胞中产生荧光蛋白已被本申请人在美国专利6251384和6235968所描述，这两篇文献在此引入作为参考。简要的说，用于表达荧光蛋白的病毒载体、优选的是逆转录病毒载体，能够被施用给已经携带实体瘤的受试者。可以选择的是，在实体瘤情况下，可以肿瘤内注射表达载体。模型系统可以通过移植肿瘤至无免疫应答或同系动物而获得，所述肿瘤由被修饰以含有荧光蛋白表达系统的细胞产生。导致肿瘤本身被标记的多种方法已被描述。
至于标记细菌，编码荧光蛋白的核苷酸序列可以通过直接修饰被引入到细菌中，例如修饰染色体组，以在细菌内源控制序列控制下将荧光蛋白编码序列定位至适宜位点，或者也可使用合适的表达载体引入。所选择的细菌是那些在实体瘤中存活并增殖的细菌，优选选择性、即使不是完全特异性地存活并增殖，使得宿主动物的其余部分优选基本上无细菌存在，即使细菌被系统施用。优选的是，细菌培养物在肿瘤体积中分散，而不是浓缩成小的菌落。
通过在原位直接观察，本发明提供一种直截了当的方法以确定最有利的细菌宿主。因此，所选择的菌株通过插入基因组或通过提供表达载体而得以标记，并被施用给动物。能够直接观察到肿瘤中与其他组织不同的增殖方式，并且选择具有所需模式的菌株。现有技术已知多种能够在肿瘤中增殖的候选细菌，包括大肠杆菌，沙门氏菌属，梭菌属，乳杆菌属(Lactobacilli)，双歧杆菌属(Bifidobacteria)，等等。到目前为止，用于在这些系统中表达的适宜控制序列也是本领域已知的，或者可以使用内源性控制序列。
在很多情况下，可能希望进一步修饰细菌，以使其失去任何产生毒性效应的能力。这种情况最多的是针对专性厌氧菌。如果细菌分泌毒素，可能需要缺失或失活产生毒素的基因；如果细菌产生造成不希望的副作用的物质，编码这些物质的基因可以被失活或移除。如果使用标记，则细菌被修饰，以或者在组成型启动子调控下作为细胞生长和复制的持续性特征表达荧光蛋白，或者编码序列可以在特定的所希望位点被插入基因组，以替代内源性序列。
除了发挥其自身固有的抗肿瘤作用之外，细菌也可以被修饰以产生治疗剂，例如IL2或甲硫氨酸酶。在一个实施方式中，治疗性蛋白任选作为与荧光蛋白的融合蛋白而产生。如果肿瘤和/或细菌被标记，融合蛋白中荧光蛋白的颜色应该是与肿瘤和细菌中任一所选择的颜色不同。用荧光蛋白构建融合蛋白作为标记物是本领域已知的，如上面所描述。治疗性蛋白(所述治疗性蛋白或者是单独的，或者与荧光蛋白融合)的表达系统能够被置于载体中或细菌基因组中，控制序列可以是组成型的，或者在许多情况下，是可诱导的，并依赖于原位因子或外部提供的转录因子。
治疗性蛋白的一个具体优选实例是甲硫氨酸酶，其当细胞内供给时发挥抗肿瘤效应，如PCT公开WO00/29589所公开的，在此引入作为参考；或者当提供作为药物时发挥抗肿瘤效应，如美国专利5,690，929和WO94/11535所公开的，在此引入作为参考。甲硫氨酸酶的重组生产也在这些文献中公开。
除了其固有的对肿瘤的效应，本身是酶的治疗性蛋白也能够用于从前药中释放毒性物质。例如，Miki，K.，etal.，Cancer Research(2001)61∶6805-6810描述了利用甲基硒醇毒性的研究工作。该化合物能够通过甲硫氨酸酶的作用从硒代甲硫氨酸生成。该文献描述了实验，在该实验中通过重组产生的甲硫氨酸酶从硒代甲硫氨酸产生甲基硒醇，所述甲基硒醇杀死用该酶的表达系统转化的癌细胞。在硒代甲硫氨酸存在下甲硫氨酸酶的重组生产可因此用作治疗癌症。
在本发明的一个实施方式中，所述实施方式仅提供作为示例，细菌例如长双歧杆菌或诺氏梭菌被修饰，以不能生产任何毒素。所述解毒的细菌被修饰，以包含与荧光蛋白融合的甲硫氨酸酶的表达系统。此外，如果需要，这些细菌被修饰以包含荧光蛋白的表达系统以标记细菌本身。如果甲硫氨酸酶是组成型表达的，这可为非必需的，因为甲硫氨酸酶自身的生产会指示细菌的存在。经过如此修饰的细菌然后被施用给携带肿瘤的实验模型受试者，所述肿瘤例如从人MDA-MB-435乳腺癌细胞形成的肿瘤，所述细胞本身用与融合蛋白中所使用的不同颜色的荧光标记标记。可选择的是，肿瘤是天然的，并且如上面所引用的美国专利6,251,384和6,235,968中所描述的用病毒表达载体标记。
如果使用细菌细胞，则细胞被直接注射给肿瘤；如果使用孢子，则也可以采用静脉内注射。孢子的直接肿瘤内注射也是可能的。细菌的静脉内注射也是可能的。适当修饰的细菌以任何实用的方式施用给受试者。虽然在实验性肿瘤模型的情形中，可能需要受试者是无免疫应答的或与肿瘤同系以提供所述模型，细菌的施用本身不需要受试者是无免疫应答的。因此，在受试者携带肿瘤的情况下，免疫抑制是不必要的。在具有完整免疫系统的动物中，肿瘤中的感染很容易发生。但是，无免疫应答的受试者也可用于研究其中肿瘤经人工引入的病症的进展。
在一个实施方式中，甲硫氨酸酶生产的标记发出红色荧光(RFP)，细菌的特征性标记发出蓝色荧光(BFP)，肿瘤的特征性标记发出绿色荧光(GFP)。
此外，如果需要，硒代甲硫氨酸被注射入肿瘤，或者被系统供给。甲硫氨酸酶的生产本身和/或细菌的存在本身对肿瘤是有毒的。释放的甲基硒醇不仅对细菌存在的直接区域是有毒的，而且更广泛地扩散到活的肿瘤组织。该治疗的进展能够通过RFP、GFP和BFP的同时成像而得以直接监测。
外部对受试者全身的荧光可视肿瘤成像(FOTI)允许在连续的基础上在模型系统中或在具有天然肿瘤的受试者中对感染的进展进行实时观察和监测，以及对方案进行评估。在被治疗的受试者中，FOTI的可获得性允许那些设计治疗方案的人连续了解应该或不应该修改治疗方案。除了外部(FOTI)成像，非入侵性的内窥镜方法也可被采用。
用作模型的适宜受试者优选哺乳动物受试者，最优选便利的实验室动物，例如兔子、大鼠、小鼠等。为了与人受试者更接近，也可以使用灵长类动物。任何适宜的受试者都可以使用，选择主要根据便利性、以及与最终所感兴趣的系统的相似性来决定。
下面的实施例被用来示例，但并不用来限制本发明。
一般方法
为了对细菌-宿主相互作用进行荧光双色成像，使用了配备有50W水银灯供电系统的LZ型Leica荧光立体显微镜。为在同一时间显现GFP和RFP荧光，通过D425/60带通滤波器(band pass filter)，470DCXR二色镜(dichroicmirror)产生激发，发出的荧光通过长通滤波器(long pass filter)GG475(Chroma Technology，Btattleboro，VT)收集。宏观成像(macroimaging)在看片灯(light box)(Lightools Research，Encinitas，CA)中进行。GFP和RFP肿瘤的荧光激发通过干涉滤光片440+/-20nm使用用于动物照明的狭缝纤维光学器件(fiber optics)产生。通过520nm长通滤波器观察荧光。来自显微镜和看片灯的成像被捕捉在Hamamatsu C5810三芯片冷色(3-chip coolcolor)CCR照相机上(Hamamatsu Photonics Systems，Bridgewater，NJ)。使用配备有100W水银灯供电系统的Olympus BH2-RFCA荧光显微镜。为在同一时间显现GFP和RFP荧光，通过D425/60带通滤波器、470DCXR二色镜产生激发光。发出的荧光通过长通滤波器GG475(Chroma Technology)收集。1024/724像素的高分辨率成像用Hamamatsu C5810三芯片冷色CCR照相机(Hamamatsu Photonics)捕捉，并直接存贮在IBM PC上。对图像进行对比度、亮度处理，并借助IMAGE PRO PLUS 4.0软件(Media Cybernetics)进行分析。
使用Statistica(Statsoft，Inc，Tulsa，OK)用ANOVA评估处理组之间的差异。带有对数等级测试(log rank test)的Kaplan-Meier分析被用于确定成活率。p≤0.05被认为具有统计学上的显著性。
实施例1
制备鼠伤寒沙门氏菌A1
从LB琼脂平板挑取鼠伤寒沙门氏菌单个克隆(ATCC 14028)(Stratagene，San Diego CA)，培养在5ml的液体LB培养基中，以37℃，300rpm摇瓶过夜。将过夜培养物用LB培养基进行1∶10比例的稀释，然后在37℃下孵育。针对每一时间点对培养的细菌在OD600下进行测量。
在对数中期，4℃下收获细胞，用冰冷的甘油(10％V/V)洗涤三次，然后重悬在大约原始培养体积的1/100的冰冷甘油(10％V/V)中。40μl的2.0×108细胞与2ul的pGFP(Clontech)载体混合，冰浴5分钟，然后根据厂商说明用Gene Pulser装置(BioRad Labs)电穿孔：在1.8kv的设置下、用脉冲控制器、1000Ω并联电阻进行电穿孔。电脉冲之后迅速加入1毫升SOC培养基，然后转移细胞悬浮液至17×100mm聚丙烯管中，37℃下孵育1小时。将细胞涂布在LB琼脂平板上，37℃孵育过夜。成功表达GFP的克隆指示为鼠伤寒沙门氏菌-GF。
鼠伤寒沙门氏菌-GFP在10ml中在LB培养基中生长至对数中期。新鲜制备的亚硝基胍(无菌水中1mg/ml)被加入到洗涤过的培养物中，直至在pH6.0的TRIS-马来酸缓冲液中的终浓度为100μg/ml。在不摇瓶条件下37℃孵育培养物30分钟，然后在等体积的营养培养液中离心和重悬。再离心细胞，并重悬在营养培养液中。
由于期望独立的突变，培养物被分成若干个传代培养物。在菌落达到大约3mm直径之后，将它们复制铺板到基本琼脂和营养琼脂平板上。菌落生长之后，那些生长在营养琼脂上、但不在基本琼脂平板上生长的菌落被分离出来作为营养缺陷型的候选者。
用无菌牙签分离被鉴别的营养缺陷型菌落，然后用0.6cm宽的斑点划痕至新鲜的营养琼脂平板上，在37℃生长。获得的菌落被复制铺板到含有特异氨基酸的补充的M56的基本培养基琼脂平板上，用以鉴定营养缺陷型的需求。
通过这一分析，一个指定为A1的克隆被鉴定为亮氨酸和精氨酸双营养缺陷型。该结果显示在表1中。
表1
鼠伤寒沙门氏菌A1在补充有各种氨基酸组合的基本培养基中的生长
  补充的氨基酸   A1营养缺陷突变体生长情况
  亮氨酸   不生长
  精氨酸   不生长
  所有氨基酸   生长
  除了亮氨酸以外的所有氨基酸   不生长
  除了精氨酸以外的所有氨基酸   不生长
  亮氨酸和精氨酸   生长
所有补充物的终浓度为20μg/ml。
为其生长，将鼠伤寒沙门氏菌A1的单个克隆从LB琼脂平板上挑取出来，培养在5ml的液体LB培养基中，摇瓶300rpm，37℃的条件下过夜。用LB培养基以1∶10稀释过夜培养物，然后在37℃条件下孵育。针对每一时间点对培养物进行OD600测量。
实施例2
体外细菌入侵和肿瘤细胞系的细胞内复制
使肿瘤细胞生长在24孔组织培养板中，至密度大约为104细胞/孔。使细菌如上面所述在LB培养液中生长到对数中期，对数晚期和静止期(OD600＝0.3，0.6，1.2，2.0)。在细胞培养培养基中稀释细菌，将其加入到肿瘤细胞中(1×105/ml)，然后放在37℃培养箱中。1小时后，洗涤细胞，然后培养在含有硫酸庆大霉素(gentamicin sulfate)(20μg/ml)的培养基中以杀死外部、但非内部的细菌。在荧光显微镜下监测不同时间点下的细胞内细菌。
肿瘤细胞中的鼠伤寒沙门氏菌-GFP毒力受到细菌生长状态的影响：对数中期的细菌具有最小的毒力，在对数晚期和静止期重新恢复它们的侵入力。在对数晚期的细菌具有杀死PC-3肿瘤细胞的最大毒力。这些感染后24小时的结果显示在附图1中。
A1营养缺陷型也在人PC-3前列腺癌和小鼠乳腺肿瘤(MMT)细胞中体外入侵和细胞内复制，并最终诱导凋亡。肿瘤细胞和细菌间的相互作用可以通过双色荧光看到，其中表达GFP的鼠伤寒沙门氏菌A1生长在如实施例3所描述制备的表达RFP的肿瘤细胞中。
更具体的说，PC-3人前列腺肿瘤细胞和MMT小鼠肿瘤细胞，两者用RFP标记，生长在24孔组织培养平板上至密度大约为104细胞/孔。细菌生长在LB中并在对数晚期收获，在细胞培养培养基中稀释，然后加入到肿瘤细胞中(1x105CFU/孔)。在37℃下孵育1小时后，洗涤细胞，并培养在含有硫酸庆大霉素(20μg/ml)的培养基中以杀死外部但非内部的细菌。在荧光显微镜放大倍率(400x)下观察不同时间点下细菌和肿瘤细胞间的相互作用。
实施例3
制备体内肿瘤模型
通过逆转录病毒转导用RFP标记肿瘤，PT67，NIH3T3来源的包装细胞系，表达10A1病毒被膜，从CLONTECH Laboratories Inc购得。PT67细胞培养在补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)(Gemini Bio-productsCalabasas，CA)的DME(Irvne Scientific，Santa Ana，CA)中。对于载体生产，70％融合的包装细胞(PT67)用DOTApTM试剂(Boehringer Mannheim)的沉淀的混合物和饱和量pLNCX2-DsRed-2-RFP质粒孵育18小时。购自CLONTECH  Laboratories Inc(Palo Alto，CA)的宿主pLNCX2载体包含用于真核细胞中抗生素选择的新霉素抗性基因。RFP基因(DsRed2，CLONTECH Laboratories Inc.，Palo Alto，CA)被插入至pLNCX2载体的Eg1II和NotI位点。补充新鲜培养基，转染后48小时用荧光显微镜查看细胞。为了选择，将细胞在以逐步方式递增的500μg/ml-2000μg/mlG418存在下培养七天(LifeTechnologies，Grand Island，NY)。
人前列腺癌系PC-3和鼠乳腺肿瘤MMT060562被培养在含有10％胎牛血清(FBS)(Gemini Bio-products，Calabasas，CA)的RPMI(GIBCO)中。对于表达载体的转染，在补充新鲜培养基之前，用LipofectAMINETM plus(GIBCO)的沉淀的混合物和饱和量的表达RFP的pLNCX2-DsRed-2-RFP孵育接近满板的细胞6小时。转染后48小时用胰蛋白酶/EDTA收获细胞，以1∶15的比率在含有200μg/ml G418的选择性培养基中传代培养。通过在200μg/ml含有G418的培养基中生长瞬时转染的细胞，选择出稳定整合了质粒的细胞。用克隆圆柱(cloning cylinders)(Bel-Art Products Pequannock，NJ)通过胰蛋白酶/EDTA分离克隆，然后在无选择性试剂条件下用常规培养方法扩增和转染。
6周龄、雄性Nu/nu小鼠被用于肿瘤模型和转染研究。通常，如上面所述用RFP标记的肿瘤细胞(2×106)以皮下方式注射，该方式得到的RFP标记肿瘤被常位(orrhotopically)施用。根据国立健康研究院(NIH)实验室动物照料与使用指南，保险号A3873-1中概述的原理和程序，进行所有动物研究。
实施例4
A1的体内行为
A1营养缺陷型在LB培养基生长过夜，然后在LB培养基中以1∶10稀释，在对数晚期收获，用PBS洗涤，然后在PBS中稀释。在荧光指导下，该A1营养缺陷型被直接注射至实施例3的RFP标记肿瘤的中央区域，使用两个注射位点，每个位点50μl，总共100μl，每个肿瘤109cfu，或者注射入带RFP常位肿瘤的裸鼠尾静脉(107cfu/100μlPBS)，或者注射入带RFP常位肿瘤的裸鼠腹膜(107cfu/100μlPBS)。
在麻醉下杀死动物。从肺、肝脏、脾、肾、心脏和肿瘤中获得组织样品。切下正常组织和肿瘤，对样品称重并制备以测量通过铺板感染的细菌。为了进行生物分布研究，通过收获这些组织、均质化、在营养培养基上铺板以及计数细菌菌落，在接种后的不同时间点确定肿瘤和正常小鼠组织的cfu。也可以制备组织以进行标准冰冻切片和根据Low，B.，et al.，NatureBiotech.(1999)17∶37-41进行苏木精和曙红组织病理学分析。
在另一实验中，用22口径针头向6-8周龄NCR裸鼠的中右侧皮下植入2×106RFP标记的PC-3人前列腺肿瘤细胞。在对数晚期收获A1培养物，用PBS洗涤，然后在PBS中稀释并直接注射至肿瘤中央区域，使用两个单独的位点，每一位点注射50μl，总共100μl，每一肿瘤109cfu。肿瘤在26天的时间内退却。
在另一个实验中，进行IV施用，用22口径针头向6-8周龄NCR裸鼠的中右侧皮下注入2×106RFP标记的PC-3人前列腺肿瘤细胞。A1营养缺陷型在LB培养基生长过夜，然后在LB培养基上1∶10稀释，在对数晚期收获，用PBS洗涤。然后在PBS中稀释，并注射入尾静脉(107cfu/100μlPBS)。为了进行生物分布研究，尾静脉注射之后5和10天，肿瘤和正常小鼠组织中A1的cfu通过收获这些组织、均质化、和在营养培养基上铺板得以确定。
如表2所示，注射后4日内，肿瘤：肝脏细菌比率在500∶1至2000：1的范围之间。
表2
鼠伤寒沙门氏菌A 1的肿瘤和肝脏分布
Figure S05829144920070302D000151
A1在PC-3肿瘤中选择性生长，并且在尾静脉注射和肿瘤内注射之后抑制肿瘤生长。肿瘤内注射之后，肿瘤在20日内完全退却，而没有对宿主产生明显的副作用。
A1也生长在RFP标记的MARY-X乳腺肿瘤中，所述RFP标记的MARY-X乳腺肿瘤为如上面对PC-3所述那样皮下植入的。如通过GFP表达可见的那样，随着时间推移，生长是渐进性的。
实施例5
A1和亲代菌株的毒性比较
A1和野生型亲代鼠伤寒沙门氏菌被施与不携带肿瘤的动物。A1注射后动物幸存，亲代菌株注射后动物死亡。
野生型和A1在LB培养基上生长过夜，然后在LB培养基上1∶10稀释，在对数晚期收获，用PBS洗涤，然后在PBS中稀释，并直接注射入尾静脉(107cfu/100μl PBS)。注射之后，随时间推移测定小鼠的成活率。n＝20只动物。结果显示于附图2。如图所示，A1基本上是无毒性的，而用野生型注射的所有小鼠在三天后死去。
更进一步地，当注射入小鼠后，A1显示出比亲代野生型鼠伤寒沙门氏菌少得多的TNF-α诱导。鼠伤寒沙门氏菌A1和野生型在LB培养基生长过夜，然后在LB培养基上1∶10稀释，在对数晚期收获，用PBS洗涤，然后在PBS中稀释，将1×106cfu注射入雌性BALB/c小鼠(8周n＝10只动物)尾静脉，用PBS作为阴性对照。1.5小时后，收集血清，并离心以移除细胞内容物。用Biosource International Cytoscreen ELISA试剂盒分析TNF-α，用Tecan Sunrise微量培养板读数器读取结果。结果显示于附图3。如图所示，与野生型相比，接种A1突变体后，TNF-α的生产显著降低。
到第10天为止，鼠伤寒沙门氏菌A1从肝脏消失；到第15天为止，从脾脏中消失；到第14天为止，从肺消失；到第4天为止，从肾消失。
实施例6
A1的治疗效果
用22口径的针头向6-8周龄NCR裸鼠的中右侧皮下植入2×106RFP标记的PC-3人前列腺肿瘤细胞。A1突变体在LB培养基生长过夜，在LB培养基中1∶10稀释，在对数晚期收获，用PBS洗涤，然后在PBS中稀释，并直接注射入尾静脉(107cfu/100μlPBS)。感染之后的每个时间点用荧光成像确定肿瘤大小。平均n＝10只动物。结果显示于图4。如所示，A1治疗导致肿瘤生长受到抑制，而未处理的肿瘤在25天的时间里急速生长。
此外，如图5所示，该模型中存活时间延长。如该图所示，在第0天和第12天注射A1细菌；30天后，用A1注射的小鼠成活率为80％，而此时对照的存活率仅为40％。
实施例7
抗肿瘤特性的增强一菌株A2
如实施例1所述将用GFP标记的A1细菌注射入携带HT-29人结肠肿瘤的裸鼠的尾静脉。感染三天后，移除肿瘤组织，均质化，并用PBS稀释。分离后，来自肿瘤组织的上清液在LB琼脂平板上37℃培养过夜。培养单个克隆，挑取具有最亮绿色荧光的菌落，然后培养在5ml的LB培养基中。所溶解的菌株称为A2，保持对精氨酸和亮氨酸的营养缺陷。
为检测A2对肿瘤细胞的粘附性，使RFP标记的HT-29人乳腺癌细胞生长在24孔组织培养平板至密度大约为104细胞/孔。使A2分离群在LB培养液中生长到对数晚期，在细胞培养培养基中稀释(1×106)，加到肿瘤细胞中，放入37℃培养箱。60分钟后，用1-2ml PBS洗涤细胞五次。通过用0.2ml的0.1％Triton X-100孵育10分钟释放出粘附的细菌。加入LB培养液(0.8ml)，用吸管剧烈混合每一样品。通过铺板以计算LB琼脂培养基上的cfu，来定量粘附的细菌。
该定量分析显示附着于HT-29肿瘤细胞的A2营养缺陷型的数量大约比A1营养缺陷型数量高出6倍。
为测量侵入力，洗涤过的细胞培养在含有硫酸庆大霉素(20μg/ml)的培养基中以杀死外部、但不是内部的细菌。庆大霉素孵育12小时之后，用PBS洗涤细胞一次，通过荧光显微镜评估存活的细胞内细菌。
A2分离群具有更大的进入和生长入HT-29肿瘤细胞的能力。大约20％的肿瘤细胞被A1细菌侵袭，但80％的肿瘤细胞被A2细菌侵袭。
为测试毒力，双色标记的PC-3人前列腺肿瘤细胞生长在24孔组织培养平板至密度大约为104个细胞/孔。如上所述细菌在LB培养液中生长至对数晚期。在细胞培养物培养基中稀释细菌(1×106)，将其加入至肿瘤细胞，放入37℃培养箱。30分钟后，在含有硫酸庆大霉素(20μg/ml)的培养基中洗涤和培养细胞以杀死外部、但不是内部细菌。在不同时间点用荧光显微镜观察毒力。
A2细菌在PC-3肿瘤细胞中显示强烈毒性，所述肿瘤细胞在感染一小时后开始死亡。注射三小时后，95％的细胞完全死于凋亡和坏死。在先前使用A1细菌的研究中，仅在大约12小时后细胞死亡才开始发生。
因此，传代入HT-29结肠肿瘤小鼠模型的A1鼠伤寒沙门氏菌营养缺陷型经历了生理或遗传改变，导致抗肿瘤特性增强，包括粘附性、入侵力和毒力增强。但是，在PC-3和Mary-X肿瘤模型中传代以修饰A1菌株的尝试并没有导致显示这些修饰的性质的菌株。
实施例8
A2的体内行为
以107cfu/100ul PBS将GFP标记的A2细菌注射入裸鼠PC-3肿瘤模型的尾静脉。肿瘤模型如实施例4中那样制备。
在PC-3模型中，所有被处理的小鼠在注射A2细菌后表现出肿瘤被损害，其中五只动物中的两只20天后成为无肿瘤的。它们的存活时间与健康小鼠的存活时间具有可比性。
来自接受注射的小鼠的受感染的PC-3肿瘤的石蜡切片显示A2侵袭并损害肿瘤。如上所述，只有A1的肿瘤内注射导致完全的肿瘤移除。
在使用RFP标记的Mary-X人乳腺肿瘤细胞的模型中获得了类似的结果。所有五个被处理的动物表现出肿瘤破坏和肿瘤退却。在五个被处理动物中的三个动物中，肿瘤被完全去除，并且对宿主没有明显的副作用。
用如上所述的显微技术评估A2细菌的分布，显示在肿瘤中具有广泛的分布。A2并没有显现出对宿主的毒性。注射之后，正常组织，例如肝脏和脾脏，由被标记的A2所感染，但是，随着时间推移，A2完全从正常组织消失。

Claims (9)

1.一种培养物，其包含突变的厌氧或兼性厌氧细菌，其中所述细菌对至少两种氨基酸是营养缺陷的，所述氨基酸在至少一种肿瘤中以足够支持所述细菌生长的浓度存在，
其中所述细菌是沙门氏菌属(Salmonella)，且
其中一种氨基酸是精氨酸，另一种氨基酸是亮氨酸。
2.权利要求1所述的培养物，其中所述突变的细菌已通过体内肿瘤模型传代并从肿瘤组织中回收以提高对肿瘤细胞的粘附性和入侵力，其中所述体内肿瘤模型包含被所述细菌天然感染的肿瘤。
3.权利要求1或2的培养物，其中所述细菌被进一步修饰以产生治疗性蛋白。
4.权利要求1-3任一项的培养物，其中所述细菌被进一步修饰以产生荧光蛋白。
5.权利要求3的培养物，其中所述治疗性蛋白为IL2或甲硫氨酸酶。
6.权利要求4的培养物，其中所述荧光蛋白是绿色荧光蛋白(GFP)。
7.一种药学或兽医学组合物，其包含权利要求1-6任一项的细菌。
8.一种药学或兽医学组合物在制备用于使脊椎动物产生对感染的免疫力的方法中的药物的用途，其中所述组合物包含权利要求1或2的细菌，其中所述方法包含向所述脊椎动物施用有效量的所述药学或兽医学组合物。
9.一种药学或兽医学组合物在制备用于治疗脊椎动物肿瘤的方法中的药物的用途，其中所述组合物包含权利要求1-3任一项的细菌，其中所述方法包含向需要所述治疗的脊椎动物施用有效量的所述药学或兽医学组合物。
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