EA030573B1 - Композиции и способы для лечения рака с применением бактерий - Google Patents

Композиции и способы для лечения рака с применением бактерий Download PDF

Info

Publication number
EA030573B1
EA030573B1 EA201591017A EA201591017A EA030573B1 EA 030573 B1 EA030573 B1 EA 030573B1 EA 201591017 A EA201591017 A EA 201591017A EA 201591017 A EA201591017 A EA 201591017A EA 030573 B1 EA030573 B1 EA 030573B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
bacteria
gram
cancer
polymyxin
composition according
Prior art date
Application number
EA201591017A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201591017A1 (ru
Inventor
Майкл Дж. Ньюман
Original Assignee
Дикой Байосистемз, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дикой Байосистемз, Инк. filed Critical Дикой Байосистемз, Инк.
Publication of EA201591017A1 publication Critical patent/EA201591017A1/ru
Publication of EA030573B1 publication Critical patent/EA030573B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/11—Aldehydes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/664—Amides of phosphorus acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0275—Salmonella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Согласно изобретению предложены композиции, содержащие по существу нежизнеспособные грамотрицательные бактериальные организмы, демонстрирующие значительное снижение активности эндотоксина и/или пирогенности, и способы лечения рака с применением указанных композиций. Также предложены способы лечения рака, включающие введение млекопитающему, у которого диагностирован рак, по существу нежизнеспособных грамотрицательных бактерий, демонстрирующих значительное снижение активности эндотоксина и/или пирогенности, в количестве, достаточном для ингибирования роста или метастазирования раковой опухоли. Предложен дополнительный способ, включающий введение жизнеспособных или нежизнеспособных грамотрицательных бактериальных организмов, имеющих генетический дефект, который приводит к значительной потере липополисахарида в наружной мембране бактерий. Дополнительно предложены способы снижения активности эндотоксина и/или пирогенности в грамотрицательных бактериях, включающие обработку полимиксином и глутаральдегидом.

Description

изобретение относится к композициям, содержащим грамотрицательные бактерии, и способам лечения рака путем введения указанных композиций.
Уровень техники
Связь с регрессом рака у пациентов, подвергающихся бактериальной инфекции, наблюдали и сообщали о ней еще, по меньшей мере, в 1868 году. Существуют данные о том, что системное введение живых ослабленных организмов Salmonella животным с солидными опухолями приводило к терапии опухолей. См., например, патент США № 6685935 и Pawelek et al., (Lancet Oncol. 4(9):548-56, 2003). Кроме того, внутрипузырное (несистемное) введение ослабленных грамположительных микобактерий (БЦЖ) разрешено в Соединенных Штатах для лечения и профилактики карциномы in situ (CIS) мочевого пузыря.
Также существуют данные об улучшении терапии опухолей с применением живых грамотрицательных Salmonella для некоторых ауксотрофных мутантов. См., например, Hoffman et al., (Amino Acids 37:509-521, 2009, публикация патента США 20090300779 (Zhao et al.) и Zhao et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 102(3):775-760, 2005).
Были получены Salmonella, содержащие делеции в локусе msbB, которые экспрессируют липополисахарид (ЛПС) с отсутствием концевого миристоилирования липида A в наружной мембране. Индукция TNF-альфа у мышей и свиней, которых лечили данными штаммами msbB-Salmonella, составляла 33 и 14% от количества, индуцируемого бактериями дикого типа, соответственно. См., например, Low et al., Nature, 17:37-41, 1999 и патент США № 7354592 (Bermudes et al.). Существуют данные о том, что введение таких живых организмов, включая штамм VNP20009, ингибирует рост подкожно имплантированной меланомы B16F10 мыши и ксенотрансплантатов опухоли человека Lox, DLD-1, A549, WiDr, НТВ 177 и MDA-MB-231, выращенных у мышей (Luo et al., Oncol. Res. 12(11-12):501-508, 2001). Также существуют данные о том, что штамм Salmonella VNP20009 повышает противоопухолевую эффективность химиотерапевтического агента циклофосфамида как в максимальной переносимой дозе, так и в случае метрономного режима введения низких доз (Jia et al., Int. J. Cancer, 121(3):666-674, 2007).
Были получены условные мутанты грамотрицательных бактерий, которые не могут вырабатывать липид A и у которых отсутствует ЛПС в наружной мембране, но которые, по сообщениям, были токсичны для организма. Например, мутационное ингибирование синтеза 3-дезокси-О-маннооктулозоната (Kdo) или мутационное ингибирование включения молекул Kdo в липид IVA предотвращает синтез липида A и ЛПС и локализацию предшественников ЛПС по направлению к наружной мембране грамотрицательных бактерий. Липид IVA является предшественником ЛПС, в котором отсутствует гликозилирование. Активация данных мутаций приводит к потере жизнеспособности бактерий (Rick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69(12):3756-3760, 1972, Belunis et al. J. Biol. Chem. 270(46):27646-27652, 1995 и Taylor et al. J. Biol. Chem. 275(41):32141-32146, 2000).
Также можно ингибировать включение Kdo в липид IVA, синтез липида A и локализацию по направлению к наружной мембране путем использования экзогенно добавляемых соединений. Goldman et al. (J. Bacteriol. 170(5):2185-91, 1988) описывают антибактериальные агенты, которые специфично ингибируют активность СТР:СМР-3-дезокси-О-маннооктулозонат-цитидилилтрансферазы, тем самым блокируя включение 2-кето-3-дезокси-Э-маннооктулозоната (Kdo) в липид IVA грамотрицательных организмов. Когда синтез ЛПС прекращался, обнаруживали накопление молекул, схожих по структуре с липидом IVA, и рост бактерий прекращался. Авторы пришли к выводу, что присоединение Kdo к предшественникам ЛПС, липидам IVA, представляет собой основной путь образования комплекса липид A-Kdo2 как в S.typhimurium LT2, так и в Escherichia coli (K.coli).
Недавно были получены мутанты грамотрицательных бактерий, у которых отсутствует ЛПС, включающий липид A или 6-ациллипополисахарид, в наружной мембране, но которые сохраняют жизнеспособность. Например, в патентной публикации США 2010/0272758 описан штамм KPM22 B.coli K-12 с дефектом синтеза 3-дезокси-Э-манноокт-2-улозоновой кислоты (Kdo). KPM22 имеет наружную мембрану (ОМ), состоящую преимущественно из липида IVA. Жизнеспособность данных организмов обеспечивалась присутствием супрессорной мутации (second-site suppressor), облегчающей перенос липида IVA из внутренней мембраны в наружную мембрану. Сообщалось, что данная мутация ослабляет токсические побочные эффекты накопления липида IVA во внутренней мембране и обеспечивает достаточные количества предшественников ЛПС для поддержки биогенеза ОМ. У предшественника ЛПС, вырабатываемого данным штаммом, отсутствует активность эндотоксина, как определено по его неспособности индуцировать секрецию TNF-альфа мононуклеарными клетками человека в дозах предшественника ЛПС, составляющих до 1 мкг/мл. См. также Mamat et al., (Mol. Microbiol. 67(3):633-48, 2008).
Дозолимитирующие побочные эффекты, связанные с инфекцией, и септический шок в значительной степени ограничивают системное введение живых бактерий пациентам, страдающим раком. Данное
- 1 030573
ограничение было связано с бактериями дикого типа (более подробно см., например, Wiemann and Starnes, Pharmac. Ther. 64:529-564, 1994), а также было связано с генетически ослабленными бактериями, которые селективно пролиферируют в опухолевой ткани и экспрессируют модифицированный липид A (см., например, Toso et al., J. Clin. Oncol. 20(1):142-152, 2002). Данные ограничения привели к применению нейтрализованных нагреванием бактерий для лечения рака. См., например, Havas et al. (Med. Oncol. & Tumour Pharmacother. 10(4):145-158, 1993), Ryoma et al. (Anticancer Res. 24:3295-3302, 2004), Maletzki et al. (Clin. Develop. Immunol. 2012:1-16, 2012), патент США № 8034359 B2 (Gunn), европейский патент № ЕР 1765391 B1 (Gunn) и более подробно Wiemann и Starnes (Pharmac. Ther. 64:529-564, 1994). Однако неинфекционные нейтрализованные бактерии по-прежнему индуцируют значительную дозолимитирующую токсичность, связанную с эндотоксином, происходящим от ЛПС, и другими компонентами клетки, которые являются пирогенными и могут вызывать симптомы септического шока. Таким образом, необходимы дальнейшие улучшения способов лечения рака с помощью бактерий.
Краткое описание изобретения
Согласно настоящему изобретению предложены композиции и способы для лечения рака у млекопитающего (например, человека), у которого диагностирован рак, путем введения данному млекопитающему некоторого количества грамотрицательных бактерий, при этом указанные бактерии (i) являются нежизнеспособными или по существу нежизнеспособными у млекопитающего, (ii) демонстрируют значительное снижение активности эндотоксина и/или пирогенности и (iii) их вводят в количестве, достаточном для ингибирования роста или метастатического потенциала раковой опухоли. В некоторых вариантах реализации грамотрицательные бактерии превращают в нежизнеспособные или по существу нежизнеспособные до введения млекопитающему путем обработки (i) излучением, (ii) химическим стерилизующим агентом, (iii) антибиотиком, который инактивирует эндотоксин (например, полимиксином В или полимиксином Е), или (iv) антибиотиком, который нарушает биосинтез комплекса KDO2-липид IVA. В качестве альтернативы или в дополнение к любой одной или более из вышеуказанных обработок, грамотрицательные бактерии дополнительно содержат генетический дефект, который нарушает или частично нарушает биосинтез комплекса KDO2-липид IVA или предотвращает О-ацилирование комплекса KDO2-липид IVA. Генетические дефекты, которые нарушают или частично нарушают О-ацилирование комплекса KDO2-липид IVA, включают, например, дефекты, которые функционально нарушают локусы msbB и lpxM.
В соответствии с одним из аспектов настоящего изобретения композиции содержат по существу нежизнеспособные грамотрицательные бактерии, демонстрирующие значительное снижение активности эндотоксина и/или пирогенности, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В одном из вариантов реализации грамотрицательные бактерии делают нежизнеспособными путем обработки глутаральдегидом. В другом варианте реализации активность эндотоксина и/или пирогенность снижают путем обработки полимиксином В или полимиксином Е. В другом варианте реализации активность эндотоксина и/или пирогенность снижают путем обработки глутаральдегидом.
В соответствии с другим аспектом предложены способы лечения млекопитающего, у которого диагностирован рак, включающие введение некоторого количества по существу нежизнеспособных грамотрицательных бактерий, демонстрирующих значительное снижение активности эндотоксина и/или пирогенности, при этом указанное вводимое количество является достаточным для ингибирования роста или метастазирования раковой опухоли.
В соответствии с другим аспектом настоящего изобретения предложены способы лечения рака у млекопитающего (например, человека), у которого диагностирован рак, путем введения данному млекопитающему некоторого количества грамотрицательных бактерий, при этом указанные бактерии являются жизнеспособными, могут быть или могут не быть ослаблены и имеют генетический дефект, который приводит к значительной или полной потере липополисахарида в наружной мембране бактерий, и при этом вводимое количество является достаточным для ингибирования роста или метастатического потенциала раковой опухоли.
В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложен способ лечения рака, включающий введение млекопитающему, у которого диагностирован рак, некоторого количества жизнеспособных или нежизнеспособных грамотрицательных бактериальных организмов, которые имеют генетический дефект, приводящий к значительной потере липополисахарида в наружной мембране бактерий, при этом вводимое количество является достаточным для ингибирования роста раковой опухоли.
В некоторых вариантах реализации указанный генетический дефект нарушает или частично нарушает биосинтез комплекса KDO2-липид IVA или предотвращает О-ацилирование комплекса KDO2липид IVA.
В некоторых вариантах реализации рак представляет собой солидную опухоль.
В других вариантах реализации млекопитающему дополнительно вводят химиотерапевтический агент, включая, например, циклофосфамид. В других вариантах реализации млекопитающему дополнительно вводят антагонист рецептора, ингибирующего иммунную функцию, или агонист рецептора, в том числе, например, ингибирующий функцию T-клеточного рецептора или лиганда T-клеточного рецептора (например, CTLA-4, PD-1, PD-L1 и PD-L2).
- 2 030573
В других вариантах реализации млекопитающему дополнительно вводят агонист рецептора, стимулирующего иммунную функцию, в том числе, например, агонисты, которые стимулируют T-клеточный рецептор. Подходящие рецепторы-мишени включают, например, GITR, 4-1BB, CD40 и ОХ40.
В других вариантах реализации млекопитающему дополнительно вводят цитокин, стимулирующий иммунную функцию, включая, например, интерферон-альфа, интерферон-бета, интерферон-гамма, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, интерлейкин-2 иинтерлейкин-12.
В некоторых вариантах реализации грамотрицательные бактерии представляют собой Salmonella или Escherichia.
В другом варианте реализации настоящего изобретения предложены способы нейтрализации и снижения активности эндотоксина и/или пирогенности в грамотрицательных бактериях путем обработки указанных бактерий полимиксином В и глутаральдегидом. В одном из вариантов реализации жизнеспособность уменьшают до 0% и активность эндотоксина или пирогенность снижают примерно на 90 или 96%.
Краткое описание чертежей
На фиг. 1 и 2 показано, что инкубация E.coli совместно с полимиксином В (РМВ) снижает уровень активности эндотоксина, связанного с бактериальной клеткой, и жизнеспособности клетки. Это дополнительно описано в примере 2.
На фиг. 3 и 4 показано, что инкубация E.coli в присутствии глутаральдегида (GA) снижает уровень активности эндотоксина, связанного с бактериальной клеткой, и жизнеспособности клетки, как дополнительно описано в примере 3.
На фиг. 5 представлены полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа изображения E.coli, необработанной (фиг. 5А), обработанной 1000 мкг/мл РМВ (фиг. 5В), 1% GA (фиг. 5С) или как РМВ, так и GA (фиг. 5D), демонстрирующие, что указанные бактерии остаются интактными после всех обработок, как дополнительно описано в примере 4.
На фиг. 6 изображен график, показывающий дозозависимое влияние РМВ + GA-обработанной E.coli на рост подкожной меланомы B16F10 мыши, как дополнительно описано в примере 7.
На фиг. 7 изображен график, показывающий дозозависимое влияние необработанной и 1% GAобработанной E.coli на рост подкожной меланомы B16F10 мыши, как дополнительно описано в примере 8.
На фиг. 8А и В изображены графики, показывающие дозозависимое влияние РМВ + GAобработанной E.coli без и совместно с метрономным введением циклофосфамида (фиг. 8А) или антитела анти-CTLA-4 мыши (фиг. 8В) на рост подкожной карциномы толстой и прямой кишки СТ26 мыши, как дополнительно описано в примере 9.
Подробное описание изобретения
Согласно настоящему изобретению предложены композиции, содержащие нежизнеспособные грамотрицательные бактериальные организмы, которые демонстрируют значительное снижение активности эндотоксина и/или пирогенной активности, и способы лечения рака, включающие введение млекопитающему, страдающему раком, некоторого количества нежизнеспособных грамотрицательных бактериальных организмов, которые демонстрируют значительное снижение активности эндотоксина или пирогенной активности, при этом вводимое количество является достаточным для ингибирования роста или метастазирования раковой опухоли.
Возможный механизм (механизмы), ответственный за противоопухолевую активность, опосредуемую бактериями, включает селективную пролиферацию живых бактериальных организмов в опухолевой ткани и стимуляцию иммунных ответов хозяина, в частности, через ЛПС (эндотоксин)-опосредуемую индукцию высвобождения цитокинов, уничтожающих клетки опухоли, из мононуклеарных клеток хозяина. Однако считается, что пролиферация живых бактерий и ЛПС (эндотоксин)-опосредуемая индукция цитокинов (даже в случае ЛПС, ослабленного мутацией msbB) ответственны за дозолимитирующую токсичность, связанную с лечением млекопитающих живыми бактериями. Toso et al. (J. Clin. Oncol. 20(l):142-152, 2002) лечили пациентов, страдающих раком, живыми msbB-ослабленными Salmonella, и дозолимитирующая токсичность включала бактериемию и побочные эффекты, связанные с высвобождением цитокинов. Пролиферация бактерий в опухолевой ткани была ниже, а чувствительность к цитокинопосредуемой токсичности была выше наблюдаемой в ксенотрансплантатных моделях опухолей человека у мышей. Считается, что системная пролиферация жизнеспособных бактерий и/или связанная с цитокинами токсичность, частично опосредуемая ЛПС, не содержащим одну вторичную ацильную цепь, могут препятствовать введению безопасных и эффективных доз живых ослабленных грамотрицательных бактерий некоторым млекопитающим (таким как люди), отличным от мышей, которые, как известно, относительно устойчивы к бактериальной инфекции и связанным с ней септическим последствиям индукции цитокинов.
Без конкретного теоретического обоснования считается, что нейтрализованные или нежизнеспособные грамотрицательные организмы, обладающие существенно сниженной активностью эндотоксина и/или пирогенностью, можно вводить пациентам, страдающим раком, в количествах, которые менее токсичны и более эффективны для лечения рака по сравнению с применением живых или жизнеспособных
- 3 030573
организмов, которые пролиферируют в здоровых и опухолевых тканях каждого пациента различным образом, что не может прогнозировать практикующий врач, либо пролиферируя в недостаточной степени для оказания терапевтического эффекта, либо пролиферируя слишком сильно, тем самым вызывая неприемлемую токсичность. Также считается, что нейтрализованные или нежизнеспособные грамотрицательные организмы, обладающие существенно сниженной активностью эндотоксина и/или пирогенностью, можно вводить пациентам, страдающим раком, в количествах, которые менее токсичны и более эффективны для лечения рака, по сравнению с применением нейтрализованных бактерий, которые экспрессируют уровни активности эндотоксина и/или пирогенности дикого типа.
Также считается, что жизнеспособные грамотрицательные организмы, имеющие генетический дефект при образовании ЛПС, который приводит к значительному уменьшению количества гликозилированного липида A и ЛПС в наружной мембране бактерий, могут эффективно лечить рак, независимо от того, вводят их живыми и ослабленными для предотвращения дальнейшей пролиферации у хозяина, представляющего собой млекопитающее, или в виде нейтрализованных организмов. Хотя такие организмы не содержат функциональные молекулы ЛПС, которые вызывают эндотоксический шок, а также создают стимул для иммунной системы хозяина, считается, что существуют другие особенности грамотрицательных бактерий, которые будут стимулировать врожденные или комбинированные врожденные и адаптивные иммунные ответы хозяина для осуществления уничтожения клеток опухоли или ингибирования роста опухоли.
В одном из вариантов реализации грамотрицательные организмы, применяемые для лечения рака, описанные в настоящем документе, не содержат ДНК, которая кодирует или экспрессирует небактериальные белки (например, опухолеспецифические антигены). Следовательно, указанные грамотрицательные организмы не представляют собой противораковую вакцину по той причине, что они непосредственно не индуцируют специфический иммунный ответ на опухолевый антиген. Вместо этого данные организмы функционируют в качестве адъюванта или модификатора биологического ответа (BRM), который, как правило, может стимулировать врожденный иммунный ответ хозяина и, возможно, опосредованно адаптивный противоопухолевый иммунный ответ. В некоторых вариантах реализации грамотрицательные организмы вводят путем инъекции непосредственно в участок опухоли или вблизи него, или вводят системно путем инъекций и они накапливаются в опухоли или вблизи нее. Повышенный врожденный иммунный ответ на организмы может быть вторично направлен против опухоли. В дополнение или в качестве альтернативы иммунные ответы на организмы могут стимулировать или активировать уже существующие опухолевые антигенспецифические иммуноциты, способные участвовать в адаптивном противоопухолевом ответе.
В альтернативном варианте реализации грамотрицательные организмы экспрессируют ДНК, которая кодирует экспрессию небактериальных белков, включая, например, опухолеспецифические антигены или белки, стимулирующие иммунную систему. И в этом случае тоже организмы могут быть введены путем инъекции в участок опухоли или вблизи него, или системно, и они индуцируют врожденный или адаптивный иммунный ответ на организм, опухолеспецифический антиген или на тот и другой.
В настоящем описании термин "опухолеспецифический антиген" относится к антигену, который экспрессируется опухолью, но не экспрессируется любыми здоровыми клетками организма, из которого происходит указанная опухоль. Термин "опухолеассоциированный антиген" относится к антигену, который экспрессируется опухолью, но может также экспрессироваться в ограниченной степени здоровыми клетками организма, из которого происходит указанная опухоль. Термин "ограниченная степень экспрессии" может отражать более низкий уровень экспрессии в здоровых клетках, чем в опухоли, экспрессию ограниченным типом здоровой клетки или экспрессию здоровыми клетками только во время развития плода (т.е. антиген плода). В настоящем описании антиген представляет собой любую молекулу, которая может распознаваться иммунным ответом, либо антителом, либо иммуноцитом (например, T-клеткой).
В настоящем описании термины "адъювант" и "модификатор биологического ответа" относятся к любому веществу, которое усиливает иммунный ответ на антиген, опухоль или опухолеассоциированную клетку. Таким образом, адъювант или модификатор биологического ответа применяют для стимуляции более "энергичного" ответа иммунной системы на чужеродный антиген или болезнетворную или связанную с заболеванием клетку, экспрессирующую новый антиген, или структурно измененный или аномальный уровень существующего антигена. Однако в некоторых вариантах реализации рекомбинантные формы грамотрицательных бактерий, которые экспрессируют, например, опухолеспецифические или опухолеассоциированные антигены, или белки активации иммунной системы человека, такие как цитокины или хемокины, предусмотрены для применения в описанных способах. В альтернативном варианте реализации очищенные белки активации иммунной системы, такие как цитокины или хемокины, смешивают с грамотрицательными организмами до введения или вводят до или после грамотрицательных организмов.
В настоящем описании термин "млекопитающее" включает любое млекопитающее, такое как человек, собака, кошка, корова, овца и т.п. Предпочтительно млекопитающее представляет собой человека.
- 4 030573
Термин "грамотрицательные бактерии" относится к бактериям, которые не сохраняют исходное окрашивание основным красителем (например, кристаллическим фиолетовым), которое является частью процедуры, известной как окрашивание по Граму. При типичном окрашивании по Граму клетки сначала фиксируют на предметном стекле под воздействием тепла и окрашивают основным красителем (например, кристаллическим фиолетовым), который поглощается как грамотрицательными, так и грамположительными бактериями. Затем предметные стекла обрабатывают протравой (например, йодом для окрашивания по Граму), которая связывается с основным красителем (например, кристаллическим фиолетовым) и улавливает его в клетке. Затем клетки промывают ацетоном или спиртом, а затем дополнительно окрашивают вторым красителем другого цвета (например, сафранином). Грамположительные организмы сохраняют исходное фиолетовое окрашивание, в то время как грамотрицательные организмы обесцвечиваются при промывке органическим растворителем и, следовательно, демонстрируют дополнительное окрашивание. Типичные грамотрицательные бактерии включают, но не ограничиваются ими, Escherichia spp., Shigella spp., Salmonella spp., Campylobacter spp., Neisseria spp., Haemophilus spp., Aeromonas spp., Francisella spp., Yersinia spp., Klebsiella spp., Bordetella spp., Legionella spp., Corynebacteria spp., dtrobacter spp., Chlamydia spp., Brucella spp., Pseudomonas spp., Helicobacter spp. и Vibrio spp.
К числу грамотрицательных организмов относятся Enterobacteriaceae, большое семейство, которое включает, наряду со многими безвредными симбионтами, множество хорошо известных патогенов, таких как Salmonella, E.coli, Yersinia pestis, Klebsielh и Shigella, Proteus, Enterobacter, Serrati и Citrobacter. Члены семейства Enterobacteriaceae были названы энтеробактериями, поскольку некоторые его члены живут в кишечнике животных.
Enterobacteriaceae являются палочковидными, как правило, имеют длину 1-5 мкм. Они представляют собой факультативные анаэробы, ферментирующие сахара с получением молочной кислоты и различных других конечных продуктов. Большинство также восстанавливают нитрат до нитрита и, как правило, не содержат цитохром-с-оксидазу. Большинство имеют много жгутиков для подвижности, но некоторые являются неподвижными. Enterobacteriaceae не образуют спор.
Термин "вектор" относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая способна переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана, в виде цельной нуклеиновой кислоты. Векторы, способные направлять экспрессию генов, с которыми они функционально связаны, называются в настоящем описании "векторами экспрессии". В настоящем описании термин "система экспрессии" относится к комбинации компонентов, которые позволяют последовательностям в векторе экспрессии транскрибироваться в РНК, складываться в структурную РНК или транслироваться в белок. Указанная система экспрессии может представлять собой систему экспрессии in vitro, такую как коммерчески доступная или легко получаемая в соответствии с известными способами, или может представлять собой систему экспрессии in vivo, такую как эукариотическая или прокариотическая клетка-хозяин, содержащая вектор экспрессии. В целом, векторы экспрессии, подходящие для технологий рекомбинантных ДНК, могут представлять собой "плазмиды", которые, как правило, относятся к кольцевой двухцепочечной ДНК, которые в форме вектора не связаны с бактериальной хромосомой. Другие векторы экспрессии, хорошо известные в данной области техники, также можно использовать в системах экспрессии (например, векторы, представляющие собой космиды, фагмиды и бактериофаги).
Термин "нуклеиновая кислота" относится к полинуклеотидам или олигонуклеотидам, таким как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и, при необходимости, рибонуклеиновая кислота (РНК). Следует понимать, что данный термин также включает в качестве эквивалентов аналоги либо РНК, либо ДНК, полученные из аналогов нуклеотидов, и, когда применимо к описываемому варианту реализации, односмысловые или антисмысловые и двухцепочечные полинуклеотиды.
В настоящем описании термин "модуляция" относится как к повышающей регуляции (т.е. активации или стимуляции (например, путем оказания агонистического действия или потенцирования)), так и к понижающей регуляции (т.е. ингибированию или подавлению (например, путем оказания антагонистического действия, понижения или ингибирования)). Термин "индуцируемый" относится, в частности, к экспрессии генов, которая не является конститутивной, но которая происходит в ответ на стимул (например, температуру, тяжелые металлы или другую добавку к среде).
А. Подходящие бактериальные организмы.
Подходящие бактериальные организмы, которые можно применять в способах согласно настоящему изобретению, являются грамотрицательными и получены из тех, которые обладают активностью эндотоксина, таких как организмы дикого типа. Типичные грамотрицательные бактерии включают, но не ограничиваются ими, Escherichia spp., Shigella spp., Salmonella spp., Campyiobacter spp., Neisseria spp., Haemophilus spp., Aeromonas spp., Francisella spp., Yersinia spp., Klebsiella spp., Bordetella spp., Legionella spp., Corynebacteria spp., dtrobacter spp., Chlamydia spp., Brucella spp., Pseudomonas spp., Helicobacter spp. и Vibrio spp. Подходящие грамотрицательные организмы также могут представлять собой организмы, которые принадлежат семействам Enter obacteriaceae, Pseudomonadaceae, Neisseriaceae, Veillonellaceae, Bacteroidaceae, Vibrionaceae, Pasteurellaceae и Fusobacteriaceae. В некоторых вариантах реализации подходящий организм является одним из видов Salmonella или Escherichia spp.
- 5 030573
Один из подходящих организмов Salmonella, VNP20009, был описан Luo et al., Oncol Res. 12(1112):501-8, 2001. VNP20009 представляет собой генетически модифицированный штамм Salmonella typhimurium, содержащий делеции в локусах msbB и purl. Внутривенное введение живых VNP20009 в дозах в диапазоне от 1 х 104 до 3х106 КОЕ/мышь мышам с опухолями ингибировало рост подкожно имплантированной меланомы B16F10 мыши и ксенотрансплантатов опухоли человека Lox, DLD-1, A549, WiDr, HTB177 и MDA-MB-231. VNP20009, вводимые внутривенно, также ингибировали рост метастазов в легких у данных животных. См. также патент США № 7354592 (Bermudes et al.).
Другой подходящий организм Salmonella представляет собой SL3235, описанный Eisenstein et al. Med. Oncol. 12(2)103-8, 1995. SL3235 представляет собой ослабленный штамм Salmonella, который при введении в живом виде может лечить опухоль, представляющую собой плазмацитому, растущую у мышей.
Другие подходящие Salmonella включают ауксотрофные мутанты, описанные Hoffman et al., Amino Acids, 37:509-521, 2009. Мутант S.typhimurium A1-R является ауксотрофным по leu-arg и обладает высокой противоопухолевой вирулентностью. In vitro A1-R инфицирует клетки опухоли и вызывает разрушение ядра. Введение A1-R позволяет лечить метастатические опухоли предстательной железы и молочной железы человека, ортотопически имплантированные мышам линии nude. A1-R, вводимый внутривенно (в/в) мышам линии nude с первичной остеосаркомой и метастазированием в легких, является эффективным, особенно в отношении метастазирования. Существуют данные о том, что A1-R также эффективен в отношении метастазирования рака поджелудочной железы в печени при введении внутриселезеночно мышам линии nude. См. также публикацию патента США 20090300779 (Zhao et al.) и Zhao et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 102(3)775-760, 2005).
Различные грамотрицательные организмы, подходящие для лечения солидных опухолей, описаны в патенте США № 6685935 (Pawelek et al.). Данные организмы называются суперинфекционными, поскольку они реплицируются предпочтительно в опухоли после введения. Они включают суперинфекционные опухолеспецифические мутанты Salmonella spp., например Salmonella typhimurium. Также описаны суперинфекционные опухолеспецифические мутанты Salmonella spp., содержащие ген "самоубийства", например тимидинкиназы вируса простого герпеса, цитозиндезаминазы E.coli или микросомальной оксидоредуктазы р450 человека. См. также Pawelek et al., (Lancet Oncol. 4(9):548-56, 2003).
В одном из вариантов реализации E.coli выбрана в качестве указанного организма. Одним из конкретных предусмотренных штаммов является штамм E.coli 2617-143-312, (Migula) Кастеллани (Castellani) и Чалмерс (Chalmers) (ATCC® 13070™). Дополнительные штаммы E.coli, которые можно применять, включают MG1655 (АТСС® 47076) и KY8284 (АТСС® 21272).
Грамотрицательные организмы, применяемые в способах согласно настоящему изобретению, не обязательно должны представлять собой рекомбинантные организмы, которые содержат или экспрессируют ДНК, чужеродную для формы организма дикого типа. Однако в некоторых вариантах реализации организмы могут быть модифицированы для экспрессии некоторых ненативных молекул. Например, в патенте США № 7452531 описано получение и применение векторов на основе ослабленных прицельно воздействующих на опухоль бактерий для доставки одной или более первичных эффекторных молекул в участок солидной опухоли. В соответствии с указанным способом эффекторные молекулы, которые могут быть токсичными при системном введении хозяину, могут быть доставлены локально в опухоли ослабленными прицельно воздействующими на опухоль бактериями с пониженной токсичностью для хозяина. В частности, указанные ослабленные прицельно воздействующие на опухоль бактерии могут представлять собой факультативные аэробы или факультативные анаэробы, модифицированные для кодирования одной или более первичных эффекторных молекул. Указанная первичная эффекторная молекула (молекулы) включает членов семейства цитокинов TNF, антиангиогенные факторы и цитотоксические полипептиды или пептиды. Первичные эффекторные молекулы согласно настоящему изобретению подходят, например, для лечения рака, представляющего собой солидную опухоль, такого как карцинома, меланома, лимфома, саркома, или метастазов, образуемых данными опухолями.
В. Снижение активности бактериального эндотоксина.
Можно применять различные способы для снижения активности эндотоксина и/или пирогенности бактериальных организмов. В настоящем описании термин "активность эндотоксина" относится к частям грамотрицательных бактерий, которые могут вызывать токсичность, включая пирогенность и септический шок. Было обнаружено, что токсические эффекты, приписываемые эндотоксину, связаны с частью, представляющей собой гликозилированный липид A, молекулы липополисахарида, присутствующей в или полученной из наружной мембраны грамотрицательных бактерий.
Термин "липополисахарид" (ЛПС) относится к крупным молекулам, состоящим из липида и полисахарида (гликофосфолипид), соединенных ковалентной связью. ЛПС содержит три части: 1) О-антиген; 2) центральный олигосахарид и 3) липид А. О-антиген представляет собой повторяющийся гликановый полимер, присоединенный к центральному олигосахариду, и содержит крайний домен молекулы ЛПС. Центральный олигосахарид присоединяется непосредственно к липиду A и обычно содержит сахара, такие как гептоза и 3-дезокси-О-маннооктулозоновая кислота (также известная как KDO, кетодезоксиок- 6 030573
тулозонат). Липид A представляет собой фосфорилированный глюкозаминовый дисахарид, связанный с несколькими жирными кислотами. Указанные жирные кислоты "заякоривают" ЛПС в бактериальной мембране, а оставшаяся часть ЛПС выступает из клеточной поверхности. Гибель бактерии может происходить, если ЛПС подвергается мутации или удаляется.
Активность эндотоксина свойственна части ЛПС, представляющей собой домен липид А. Когда бактериальные клетки подвергаются лизису иммунной системой, фрагменты мембраны, содержащие липид A, высвобождаются в кровообращение, вызывая лихорадку (пирогенность), диарею и потенциально смертельный шок (называемый эндотоксическим или септическим шоком). Токсичность ЛПС "выражается" липидом A через взаимодействие с В-клетками и макрофагами иммунной системы млекопитающего, процесс, приводящий к секреции провоспалительных цитокинов, главным образом фактора некроза опухоли (TNF), которые могут иметь смертельные последствия для хозяина. Липид A также активирует T-лимфоциты человека (Th-1) in vitro, а также CD4+ и CD8+ T-клетки мышей in vivo, свойство, которое позволяет иммунной системе хозяина формировать специфический анамнестический ответ антител IgG на углеводную цепь ЛПС различного размера. На основании этого ЛПС был недавно признан T-клеточно-зависимым антигеном in vivo.
Активность эндотоксина может быть измерена способами, хорошо известными в данной области техники, включая, например, анализ на основе лизата амёбоцитов Limulus (LAL), в котором используют кровь мечехвоста и который позволяет детектировать очень низкие уровни ЛПС. Наличие активности эндотоксина будет приводить к коагуляции лизата крови Limulus вследствие амплификации через ферментативный каскад. Формы гель-тромб, турбидиметрические и хромогенные формы анализа LAL коммерчески доступны. См., например, Lonza, Аллендейл, Нью-Джерси и Clongen Labs, Джермантаун, Мэриленд.
Также известны анализы активности эндотоксина на основе твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), такие как EndoLISA® от Hyglos, Мюнхен, Германия. В данном анализе используют ЛПС-специфичный фаговый белок, присоединенный к твердой фазе для захвата ЛПС, и после этапа промывки определяют присутствие ЛПС путем добавления рекомбинантного фактора С, который при активации липополисахаридом (ЛПС) расщепляет соединение, которое затем излучает флуоресценцию. Фактор С, присутствующий в лизате амёбоцитов Limulus, обычно существует в виде зимогена и представляет собой праймер каскада свертывания, происходящего в тесте LAL.
Активность эндотоксина может быть также измерена путем оценки индукции секреции TNF-альфа либо из первичных мононуклеарных клеток периферической крови in vitro, либо путем воздействия на животное предполагаемым источником эндотоксина и измерения уровней TNF-альфа в плазме, полученной от указанного животного приблизительно через 1-4 ч. Первичные мононуклеарные клетки периферической крови млекопитающего можно приобрести у таких компаний, как Lonza (Аллендейл, НьюДжерси, США). Уровни TNF-альфа в надосадочной жидкости клеток или плазме могут быть определены с помощью наборов ELISA, таких как наборы от Thermo Scientific (Рокфорд, Иллинойс, США), Abeam (Кембридж, Массачусетс, США) или eBioscience (Сан-Диего, Калифорния, США).
Активность эндотоксина можно также оценить in vivo путем измерения пирогенности (повышение ректальной температуры) у кроликов в ответ на внутривенно вводимые организмы или их производные.
Активность эндотоксина и/или пирогенность грамотрицательных организмов может быть, по существу, снижена по сравнению с активностью эндотоксина и/или пирогенностью организма дикого типа. Значительное снижение активности эндотоксина предпочтительно составляет больше примерно 70%, больше примерно 75%, больше примерно 80%, больше примерно 85%, больше примерно 90%, больше 95% и больше примерно 99%.
Доступны различные способы снижения активности эндотоксина грамотрицательных организмов. Указанные способы включают обработку организмов агентом, который связывается с ЛПС или нарушает его формирование, или манипуляции с генами бактериального организма для модификации ЛПС или ингибирования формирования ЛПС.
В одном из вариантов реализации снижения активности эндотоксина или пирогенности достигают путем обработки бактериальных организмов антибиотиком, который инактивирует эндотоксин. Такой подходящий антибиотик представляет собой полимиксин В или полимиксин Е. Например, Cooperstock et al., Infect Immun. 1981 Jul; 33(1):315-8 сообщают, что обработка полимиксином В может снижать воспалительную реактивность ЛПС в вакцинах на основе грамотрицательных бактерий, включая Bordetelfa pertussis, E.coli, Haemophilus influenzae и Pseudomonas aeruginosa. Специалист в данной области техники может определить количество антибиотика и условия обработки. В одном из вариантов реализации полимиксин, либо полимиксин В, либо полимиксин Е можно применять в концентрации, составляющей от приблизительно 3 до 5000 мкг на 1х107 - 5х1010 бактерий/мл. В другом варианте реализации концентрация полимиксина может составлять от примерно 200 до 5000 мкг на 1 х 107 - 5х1010 бактерий/мл. В одном из вариантов реализации указанный антибиотик применяют к бактериям на 10 мин-4 ч или от примерно 30 мин до примерно 3 ч. В одном из вариантов реализации бактерии выращивают в присутствии магния (Mg) в форме MgCl2 и обрабатывают полимиксином в присутствии MgCl2, а также при температуре, под- 7 030573
ходящей для сохранения целостности бактерий. В одном из вариантов реализации концентрация MgCl2 в питательной среде составляет от примерно 0,5 до примерно 5,0 мМ или примерно 2 мМ, и концентрация MgCl2 в среде для обработки составляет от примерно 5,0 до примерно 30 мМ или примерно 20 мМ. В одном из вариантов реализации температура среды для обработки составляет от примерно 2 до примерно 10°C или примерно 4°C. Целостность бактерий определяют по эффективности восстановления в хорошо выраженном осадке после центрифугирования при 3000xg в течение 10 мин и путем электронной микроскопии. В предпочтительном варианте реализации восстановление бактерий после обработки и промывки больше примерно 80%, и бактерии выглядят интактными по данным электронной микроскопии.
В другом варианте реализации снижения активности эндотоксина достигают путем обработки бактериальных организмов антибиотиком, который, как известно, нарушает биосинтез комплекса KDO2липид IVA. Например, Goldman et al., J. Bacteriol. 170(5):2185-91, 1988 описывают антибактериальные агенты, включая антибактериальный агент III, которые специфично ингибируют активность СТР:СМР-3дезокси-О-маннооктулозонат-цитидилилтрансферазы и которые подходят для блокирования включения 3-дезокси-О-маннооктулозоната (KDO) в ЛПС грамотрицательных организмов. Когда синтез ЛПС прекращался, прекращался рост бактерий. Присоединение KDO к предшественникам ЛПС, липидам IVA, представляет собой основной путь образования комплекса липид А-KDO как в S.typhimurium, так и в E.coli. В одном из вариантов реализации антибиотик представляет собой антибактериальный агент III, и грамотрицательные бактерии обрабатывают подходящим количеством, таким как, например, от 5 до 500 мкг/мл, в течение подходящего времени, например от 2 до 8 ч.
Снижение активности эндотоксина может быть достигнуто путем введения генетического дефекта в организм. В настоящем описании термин "дефект" применительно к гену или экспрессии гена означает, что указанный ген отличается от обычного (дикого типа) гена или что экспрессия указанного гена происходит на сниженном уровне по сравнению с экспрессией гена дикого типа. Дефектный ген может являться следствием мутации в данном гене или мутации, регулирующей экспрессию данного гена (например, транскрипционная или посттранскрипционная).
В одном из вариантов реализации снижение активности эндотоксина может быть достигнуто путем введения генетического дефекта, который нарушает биосинтез комплекса KDO2-липид IVA. Например, Woodard et al., публикация патента США 20100272758, описывают жизнеспособные нетоксичные грамотрицательные бактерии (например, K.coli), по существу не содержащие ЛПС в наружной мембране. Указанные авторы описывают штамм KPM22 H.coli K-12, как дефектный в отношении синтеза 3-дезоксиD-маннооктулозоновой кислоты (Kdo). KPM22 имеет наружную мембрану (ОМ), состоящую преимущественно из липида IVA, предшественника ЛПС, у которого отсутствует гликозилирование. Жизнеспособность данных организмов обеспечивается присутствием супрессорной мутации, обеспечивающей перенос липида IVa из внутренней мембраны (IM) в наружную мембрану. Сообщалось, что данная мутация ослабляет токсические побочные эффекты накопления липида IVA во внутренней мембране и обеспечивает достаточные количества предшественников ЛПС для поддержки биогенеза ОМ. См. также Mamat et al., (Mol Microbiol. 67(3):633-48, 2008).
В другом варианте реализации Bramhill et al., публикация патента США 20110224097, описывают жизнеспособные грамотрицательные бактерии, содержащие наружные мембраны, которые, по существу, не содержат лиганд, такой как липид A или 6-ациллипополисахарид, который выступает в качестве агониста TLR4/MD2. Согласно Bramhill указанные бактерии могут демонстрировать пониженную активность арабинозо-5-фосфатизомераз и содержать одну или более супрессорных мутаций, например, в транспортере, что, таким образом, увеличивает способность транспортеров переносить липид IVA, или в мембранном белке YhjD. Один или более генов (например, IpxL, IpxM, pagP, IpxP и/или eptA) могут быть, по существу, подвергнуты делеции и/или один или более ферментов (например, LpxL, LpxM, PagP, LpxP и/или EptA) могут быть, по существу, неактивными.
В другом варианте реализации снижение активности эндотоксина может быть достигнуто путем введения генетического дефекта, который предотвращает синтез Kdo. Например, Rick et al., (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 69(12):3756-60, 1972) описывают ауксотрофный мутант Salmonella typhimurium с дефектом синтеза области ЛПС, представляющей собой 3-дезокси-Э-маннооктулозонат (кетодезоксиоктонат), которому необходим D-арабинозо-5-фосфат для роста. Указанный мутантный дефект был обусловлен измененной кетодезоксиоктонат-8-фосфатсинтетазой (kdsA) с кажущейся K(m) в отношении D-арабинозо-5-фосфата, которая в 35 раз больше, чем у исходного фермента. Это приводило к зависимости мутантного штамма от экзогенного D-арабинозо-5-фосфата как для роста, так и для синтеза полного ЛПС. В другом примере Belunis et al., (J. Biol. Chem. 270(46):27646-27652, 1995) нарушали ген Kdoтрансферазы (kdtA) в E.coli, который предотвращал включение Kdo в липид IVA. Данная мутация была летальной, но могла быть восстановлена при условном присутствии термочувствительной плазмиды, кодирующей kdtA. Получение условных мутантов в пути синтеза Kdo обеспечивает рост бактерий с последующим переходом в непермиссивные условия, что приводит к достаточному росту или выживаемости для получения нежизнеспособных бактерий со значительно сниженной активностью эндотоксина.
- 8 030573
В дополнение к эндотоксину, происходящему от ЛПС, различные другие компоненты грамотрицательных организмов могут индуцировать или вносить вклад в пирогенность и септический шок, в том числе белки наружной мембраны, фимбрии, пили, липопептиды и липопротеины (рассмотрены Jones, M., Int. J. Pharm. Compd., 5(4):259-263, 2001). Пирогенность может быть измерена способом с кроликами, хорошо известным в данной области техники, включающим оценку ректальной температуры после внутривенного введения предполагаемых пирогенов.
Было обнаружено, что обработка грамотрицательного организма комбинацией полимиксина В и глутаральдегида приводила к 30-кратному снижению пирогенности, измеряемой у кроликов. В одном из вариантов реализации применяли 1000 мкг/мл полимиксина В и 1% глутаральдегида для достижения 30кратного снижения пирогенности, измеряемой у кроликов. Пирогенность снижается под действием комбинации реакции полимиксина В с ЛПС и реактивности глутаральдегида с ЛПС и/или другими компонентами бактерий. Глутаральдегид играет двойную роль в данной ситуации, также нейтрализуя бактерии. Таким образом, в одном из вариантов реализации предложен способ снижения активности эндотоксина, и пирогенности, и нейтрализации грамотрицательного бактериального микроорганизма путем обработки указанных бактерий комбинацией 1000 мкг/мл полимиксина В и 1% глутаральдегида. В другом варианте реализации грамотрицательные бактерии обрабатывают комбинацией полимиксина В в диапазоне доз от примерно 3 до примерно 1000 мкг/мл и глутаральдегида в диапазоне доз от примерно 0,1 до примерно 1,0%. В другом варианте реализации диапазон доз полимиксина В представляет собой от примерно до примерно 1000 мкг/мл, и глутаральдегид находится в диапазоне доз от примерно 0,5 до примерно 1,0%. Кроме того, грамотрицательные бактерии могут быть обработаны, например, диапазоном доз полимиксина В от примерно 1000 до примерно 3000 мкг/мл, и глутаральдегид находится в диапазоне доз от примерно 0,5 до примерно 1,0%. В соответствии с другим аспектом грамотрицательные бактерии могут быть обработаны, например, диапазоном доз полимиксина В от примерно 3000 до примерно 5000 мкг/мл, и глутаральдегид находится в диапазоне доз от примерно 0,5 до примерно 2,0%. В одном из вариантов реализации активность эндотоксина снижена примерно на 70, или примерно на 75, или примерно на 80, или примерно на 85, или примерно на 90, или примерно на 92%, и пирогенность снижена примерно на 75, или примерно на 80, или примерно на 85, или примерно на 90, или примерно на 95, или примерно на 97%.
С. Превращение бактерий в нежизнеспособные.
Бактерии для введения в соответствии со способами согласно настоящему изобретению превращают в нежизнеспособные или по существу нежизнеспособные либо перед введением, либо они становятся таковыми после введения. Термин "нежизнеспособный" означает, что организмы нейтрализуют путем обработки экзогенным агентом и/или они содержат мутацию, которая приводит к неспособности организмов выживать в организме хозяина, представляющего собой млекопитающее. По существу нежизнеспособные бактерии представляют собой штаммы, жизнеспособность которых была снижена по меньшей мере на 80, 85, 90, 95, 99% или более. В предпочтительных вариантах реализации для бактерий, которые не нейтрализованы или не полностью нейтрализованы, указанные бактерии дополнительно обрабатывают или модифицируют таким образом, что они не могут пролиферировать в организме хозяина, представляющего собой млекопитающее. В некоторых вариантах реализации, в которых ЛПС, по существу, не вырабатывается, предполагается, что вводят нежизнеспособные, ослабленные или жизнеспособные бактерии.
Предпочтительные способы превращения бактерий в нежизнеспособные представляют собой обработку соединением, которое связывается с ЛПС, тем самым блокируя активность эндотоксина, или обработку соединением, которое препятствует биосинтезу ЛПС. В обоих случаях, связывания ЛПС и препятствования синтезу ЛПС, жизнеспособность снижается в результате пермеабилизации клеточной оболочки. Другой подход заключается в выращивании бактериальных штаммов с условными мутациями в пути биосинтеза ЛПС, которые подавляются во время роста, а затем переходят в непермиссивные условия, которые активируют мутацию и нарушают биосинтез ЛПС. В каждом случае используемая процедура представляет собой процедуру, позволяющую превратить бактерии в нежизнеспособные путем определения в каждой ситуации оптимального времени обработки или дозы соединения, в результате чего жизнеспособность, по существу, утрачивается с сохранением значительной целостности бактериальной клетки. В случае, когда нежизнеспособность составляет менее 100%, можно использовать бактерии, которые содержат мутацию, предотвращающую дальнейшую пролиферацию жизнеспособных бактерий у хозяина, представляющего собой млекопитающее (например, ауксотроф с диаминопимелиновой кислотой, описанный Bukhari and Taylor, J. Bacteriol. 105(3):844-854, 1971 и Curtiss et al., Immunol. Invest. 18(14):583-596, 1989).
Если необходимы альтернативные или дополнительные способы превращения бактерий в нежизнеспособные, предпочтительный способ нейтрализации бактерий представляет собой ионизирующее излучение (гамма-лучи или электронный пучок), но также могут быть использованы другие стандартные способы стерилизации, такие как влажный или сухой жар, стерилизующий газ или пар (см., например, Shintani et al., Biocontrol Science, 16(3):85-94, 2011). Дополнительные нестандартные способы конечной стерилизации, которые могут применяться, включают химическую обработку, например, химическим
- 9 030573
стерилизующим агентом и описаны Rutala и Weber (Emerg. Infect. Dis. 7(2)348-353, 2001) и Yaman (Curr. Opin Drug Discov. Develop. 4(6):760-763, 2001). Примеры химического газа, пара и жидких стерилизующих агентов включают газообразный этиленоксид (EOG), диоксид хлора, парообразную фазу жидкого пероксида водорода (VHP), формальдегид, глутаральдегид (например, >0,05% в течение >10 мин), ортофгалальдегид (ОРА) (например, >0,1% в течение >5 мин) и фенол. Способы, позволяющие нейтрализовать бактерии, могут влиять на целостность организма. Например, нагревание может нарушать целостность бактерий в отличие от использования излучения. В настоящем описании ссылка на бактериальный организм включает полностью интактный организм и частично распавшиеся формы указанного организма, которые могут возникать при нейтрализации организмов, но не распространяется на субклеточные фракции организмов, которые отделились от других клеточных компонентов, такие как фракция, представляющая собой клеточную стенку (препарат), или скелет клеточной стенки (см., например, патент США № 4436727), цитоплазматическая фракция и т.п.
D. Композиции.
В одном из вариантов реализации предложена композиция, содержащая нежизнеспособные грамотрицательные бактериальные организмы, демонстрирующие значительное снижение активности эндотоксина и/или пирогенной активности, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В другом варианте реализации по меньшей мере примерно 80% организмов являются нежизнеспособными, или по крайней мере примерно 90% организмов являются нежизнеспособными, или примерно 100% организмов являются нежизнеспособными. В одном из вариантов реализации организмы демонстрируют жизнеспособность, сниженную примерно на 80, или примерно на 85, или примерно на 90, или примерно на 95, или примерно на 100%.
В одном из вариантов реализации активность эндотоксина и/или пирогенная активность снижена примерно на 70, или примерно на 75, или примерно на 80, или примерно на 85, или примерно на 90, или примерно на 95%. Композиция может содержать любое предусмотренное количество нежизнеспособных организмов или организмов со сниженной жизнеспособностью в комбинации с любым предусмотренным снижением токсичности эндотоксина или пирогенной токсичности. В другом варианте реализации композиция содержит по меньшей мере примерно 100% нежизнеспособных организмов, демонстрирующих активность эндотоксина и пирогенность, сниженную по меньшей мере примерно на 95%.
Композиции, описанные в настоящем документе, могут быть получены различными способами для применения в способах, описанных в настоящем документе. В одном из вариантов реализации композиция содержит организмы, описанные на протяжении всего текста настоящего документа, и фармацевтически приемлемый носитель.
Термин "фармацевтически приемлемые носители" относится к любым разбавителям, вспомогательным веществам или носителям, которые могут быть использованы в композициях. Фармацевтически приемлемые носители включают ионообменные вещества, оксид алюминия, стеарат алюминия, лецитин, сывороточные белки, такие как сывороточный альбумин человека, буферные вещества, такие как фосфаты, глицин, сорбиновую кислоту, сорбат калия, смеси неполных глицеридов насыщенных растительных жирных кислот, воду, соли или электролиты, такие как протаминсульфат, динатрийгидрофосфат, гидрофосфат калия, хлорид натрия, соли цинка, коллоидный диоксид кремния, трисиликат магния, поливинилпирролидон, вещества на основе целлюлозы, полиэтиленгликоль, натрийкарбоксиметилцеллюлозу, полиакрилаты, воски, полиэтилен-полиоксипропиленовые блок-сополимеры, полиэтиленгликоль и ланолин. Подходящие фармацевтические носители описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, стандартном эталонном руководстве в данной области. Их выбирают с учетом предполагаемой формы введения, т.е. таблеток, капсул, эликсиров, сиропов для перорального введения и т.п., и в соответствии с традиционной фармацевтической практикой.
Фармацевтические композиции могут быть изготовлены способами, хорошо известными в данной области техники, в том числе такими, как выращивание микроорганизмов в ферментерах с последующим концентрированием и промывкой путем центрифугирования, фильтрации или диализа, традиционные способы гранулирования, смешивания, растворения, инкапсулирования, лиофилизации или эмульгирования. Композиции могут быть получены в различных формах, включая гранулы, осадки или частицы, порошки, включая высушенные методом сублимации, высушенные во вращающейся сушилке и высушенные распылением порошки, аморфные порошки, препараты для инъекций, эмульсии, эликсиры, суспензии или растворы. Составы могут содержать стабилизаторы, модификаторы рН, поверхностноактивные вещества, модификаторы биологической доступности и комбинации указанных веществ.
Фармацевтические композиции могут быть получены в виде жидких суспензий или растворов с использованием стерильной жидкости, такой как масло, вода, спирт и их комбинации. Фармацевтически подходящие поверхностно-активные вещества, суспендирующие агенты или эмульгаторы могут быть добавлены для перорального или парентерального введения. Суспензии могут содержать масла, такие как арахисовое масло, кунжутное масло, хлопковое масло, кукурузное масло и оливковое масло. Препарат в виде суспензии могут также содержать сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеат, изопропилмиристат, глицериды жирных кислот и ацетилированные глицериды жирных кислот. Составы в
- 10 030573
виде суспензий могут содержать спирты, такие как этиловый спирт, изопропиловый спирт, гексадециловый спирт, глицерин и пропиленгликоль. В составах в виде суспензий также могут применяться простые эфиры, такие как поли(этиленгликоль), углеводороды нефти, такие как минеральное масло и вазелин, и вода.
Композиции изготавливают в форме для фармацевтического введения млекопитающему, предпочтительно человеку. Такие фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению могут быть введены различными способами, в том числе парентерально. В настоящем описании термин "парентерально" включает техники подкожных, внутривенных, внутримышечных, внутрисуставных, внутрисиновиальных, интрастернальных, интратекальных, внутрипеченочных, внутриочаговых и интракраниальных инъекций или инфузий.
Стерильные формы композиций для инъекций могут представлять собой водную или масляную суспензию. Данные суспензии могут быть получены в соответствии со способами, известными в данной области техники, с использованием подходящих диспергирующих или смачивающих агентов и суспендирующих агентов. Стерильный препарат для инъекций может также представлять собой стерильный раствор или суспензию для инъекций в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе, например раствор в 1,3-бутандиоле. К числу подходящих носителей и растворителей, которые могут быть использованы, относится вода, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, стерильные жирные масла традиционно используют в качестве растворителя или суспендирующей среды. Для этой цели можно применять любое легкое жирное масло, включая синтетические моно- или диглицериды. Жирные кислоты, такие как олеиновая кислота и ее глицеридные производные, подходят для получения лекарственных средств для инъекций, так же как и природные фармацевтически приемлемые масла, такие как оливковое масло или касторовое масло, особенно в их полиоксиэтилированных вариантах. Данные масляные растворы или суспензии могут также содержать представляющий собой длинноцепочечный спирт разбавитель или диспергирующий агент, такой как карбоксиметилцеллюлоза, или схожие диспергирующие агенты, широко используемые для получения фармацевтически приемлемых лекарственных форм, включая эмульсии и суспензии. Другие широко используемые поверхностно-активные вещества, такие как Твины, Спаны и другие эмульгаторы, или усилители биологической доступности, широко используемые для получения фармацевтически приемлемых твердых, жидких или других лекарственных форм, можно также использовать для целей получения составов. Композиции могут быть представлены в форме для парентерального введения путем инъекции, например путем болюсной инъекции, или непрерывной инфузии.
Е. Способы лечения рака.
Раковые опухоли, подходящие для лечения способами согласно настоящему изобретению, включают, как правило, карциномы, лейкозы или лимфомы и саркомы. Карциномы могут представлять собой карциному анального отверстия, желчных протоков, мочевого пузыря, молочной железы, толстой кишки, прямой кишки, легкого, ротоглотки, гортанной части глотки, пищевода, желудка, поджелудочной железы, печени, почки, желчного пузыря и желчных протоков, тонкой кишки, мочевых путей, женских половых путей, мужских половых путей, эндокринных желез, щитовидной железы и кожи. Другие подходящие раковые опухоли включают карциноидные опухоли, стромальные опухоли желудочно-кишечного тракта, опухоли головы и шеи, опухоли неизвестной первичной локализации, гемангиомы, меланомы, злокачественную мезотелиому, множественную миелому и опухоли головного мозга, нервов, глаз и оболочек головного мозга.
В некоторых вариантах реализации рак, который лечат, формирует солидные опухоли, такие как карциномы, саркомы, меланомы и лимфомы.
Лечение рака, описанное в настоящем документе, осуществляют путем введения количества грамотрицательных (живых или неживых при необходимости) организмов, достаточного для ингибирования роста или метастазирования рака. В настоящем описании термин "достаточное количество" относится к дозе (или серии доз), достаточной для оказания полезного эффекта реципиенту. Конкретный терапевтически эффективный уровень доз для любого конкретного субъекта будет зависеть от различных факторов, включая тип вылечиваемого рака, тяжесть рака, активность конкретного организма или комбинированной композиции, путь введения, скорость клиренса организма или комбинированной композиции, продолжительность лечения, лекарственные средства (при наличии), применяемые в комбинации с организмом, возраст, массу тела, пол, рацион и общее состояние здоровья субъекта, и подобные факторы, хорошо известные в области медицины и медицинских наук. Различные общие факторы, учитываемые при определении "терапевтически эффективного количества", известны специалисту в данной области техники и описаны, например, в Gilman et al., eds., Goodman And Gilmaris: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990 и Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990. Уровни доз, как правило, лежат в диапазоне от примерно 0,001 до 100 мг/кг/сутки; при этом уровни в диапазоне от примерно 0,05 до 10 мг/кг/сутки, как правило, применимы для соединений. Уровни доз для вводимых организмов, как правило, лежат в диапазоне от примерно 106 до 1012 на 1 м2 Композицию можно вводить парентерально, например внутрисосудисто, внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, подкожно, перорально и т.п. Бактериальные организмы можно вводить парен- 11 030573
терально, например внутрисосудисто, внутривенно, внутриартериально, внутримышечно, подкожно, интраперитонеально или внутрипузырно.
Терапевтически эффективную дозу можно определить способами, хорошо известными в данной области техники. Модели рака у животных, такие как иммунокомпетентные мыши с опухолями или мыши с нарушенным иммунитетом (например, мыши линии nude) с ксенотрансплантатами опухоли человека, хорошо известны в данной области техники и подробно описаны во многих источниках, включенных в настоящий документ для сведения. Такую информацию используют в комбинации с исследованиями безопасности у крыс, собак и/или нечеловекообразных приматов для определения безопасных и потенциально подходящих начальных доз у людей. Дополнительную информацию для определения дозы организмов можно получить из исследований в случае конкретной раковой опухоли человека. Например, Toso et al. (J. Clin. Oncol. 20(1):142-52, 2002) описывают клиническое исследование I фазы, в котором живые VNP20009 вводили пациентам с метастатической меланомой. Пациенты получали 30-минутные внутривенные болюсные инфузии, содержащие от 106 до 109 КОЕ/м2 VNP20009. Максимальная переносимая доза составляла 3х108 КОЕ/м2. Дозолимитирующую токсичность наблюдали у пациентов, получающих 1х109 КОЕ/м2, которая включала тромбоцитопению, анемию, персистирующую бактериемию, гипербилирубинемию, диарею, рвоту, тошноту, повышенный уровень щелочной фосфатазы и гипофосфатемию.
Организмы могут быть введены в виде фармацевтически приемлемого состава. Термин "фармацевтически приемлемый" означает вещество, которое не является биологически или иным образом нежелательным, т.е. указанное вещество может быть введено индивидууму наряду с выбранным организмом или комбинированным соединением, не вызывая при этом каких-либо нежелательных биологических эффектов или не взаимодействуя неблагоприятным образом с любым из остальных вводимых агентов. Это более подробно описано выше.
В настоящем описании термин "лечение" состояния или заболевания у субъекта включает вылечивание, а также ослабление по меньшей мере одного из симптомов указанного состояния или заболевания. Пациенты, страдающие раком, претерпевают лечение, если у пациента вылечивают рак, рак входит в стадию ремиссии, выживаемость увеличивается статистически значимым образом, время до прогрессирования опухоли увеличивается статистически значимым образом, происходит уменьшение массы лимфоцитарной или гемопоэтической опухоли на основе стандартных критериев, установленных для каждого типа лимфоцитарной или гемопоэтической злокачественной опухоли, или произошло уменьшение массы солидной опухоли, определяемое с помощью критериев оценки ответа при солидных опухолях (RECIST 1.0 или RECIST 1.1, Therasse et al. J. Natl. Cancer Inst. 92(3):205-216, 2000 и Eisenhauer et al. Eur. J. Cancer 45:228-247, 2009).
В настоящем описании термин "ремиссия" относится к отсутствию роста раковых клеток у пациента, ранее демонстрировавшего признаки рака. Таким образом, у пациента, страдающего раком, в стадии ремиссии либо рак вылечен, либо рак присутствует, но его нельзя с легкостью обнаружить. Таким образом, рак может находиться в стадии ремиссии, когда опухоль не увеличивается или не метастазирует. В настоящем описании термин "полная ремиссия" представляет собой отсутствие заболевания по данным способов диагностики, таких как визуализация, например рентген, магнитно-резонансная томография (МРТ), компьютерная томография (КТ) и позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ) или забор крови или биопсия костного мозга. Когда пациент, страдающий раком, входит в стадию ремиссии, за этим может следовать рецидив, при котором рак снова возникает.
Термин "по существу", если не указано иное, означает больше примерно 80%, больше примерно 90%, больше примерно 95% и больше примерно 99%.
F. Комбинации для лечения рака.
В способах лечения рака, описанных в настоящем документе, можно применять введение грамотрицательных организмов совместно с одним или более антагонистами рецепторов или лигандов, которые отрицательно модулируют иммунный ответ хозяина.
Антагонисты могут быть направлены на PD-1, PD-L1 или CTLA-4, и их, как правило, вводят внутривенно, например, в диапазоне доз от примерно 0,03 до примерно 30 мг/кг каждую 1-4 недели.
Белок запрограммированной гибели клеток 1 (PD-1) представляет собой белок, который у людей кодируется геном PDCD1. PD-1 также был обозначен CD279 (кластер дифференцировки 279). PD-1 представляет собой мембранный белок I типа, состоящий из 268 аминокислот. PD-1 является членом большого CD28/CTLA-4-семейства T-клеточных регуляторов. См., например, Ishida et al., EMBO J. 11(11):388795, 1992. Указанные белки содержат внеклеточный домен IgV, за которым следует трансмембранная область и внутриклеточный "хвост". Указанный внутриклеточный "хвост" содержит два сайта фосфорилирования в пределах ингибиторного мотива иммунорецепторов на основе тирозина и переключающего мотива иммунорецепторов на основе тирозина. Это позволяет предположить, что PD-1 отрицательно регулирует передачу сигнала TCR. PD-1 экспрессируется на поверхности активированных T-клеток, В-клеток и макрофагов. PD-1 является общим отрицательным регулятором иммунных ответов.
- 12 030573
PD-1 имеет два лиганда, PD-L1 и PD-L2, которые являются членами семейства В7. См., например, Freeman et al., J. Exp. Med. 192(7):1027-34, 2000 и Latchman et al., Nat. Immunol. 2(3):261-8, 2001. PD-L1 представляет собой трансмембранный белок 1 типа массой 40 кДа, который, по сообщениям, играет главную роль в подавлении иммунной системы во время беременности, в случае аллотрансплантатов ткани, аутоиммунного заболевания и гепатита. Белок PD-L1 подвергается повышающей регуляции на макрофагах и дендритных клетках (ДК) в ответ на воздействие ЛПС и GM-CSF и на T-клетках и В-клетках после передачи сигнала TCR и В-клеточного рецептора. Образование комплекса рецептор PD-1/лиганд PD-L1 приводит к передаче ингибирующего сигнала, который уменьшает пролиферацию CD8+ T-клеток (во время иммунного ответа) в лимфатических узлах, и PD-1 также может контролировать накопление T-клеток, специфичных в отношении чужеродного антигена, в лимфатических узлах через апоптоз. Экспрессия PD-L2 является более ограниченной, и он экспрессируется главным образом дендритными клетками и несколькими линиями опухоли.
CTLA-4 (антиген 4 цитотоксических T-лимфоцитов), также известный как CD152 (кластер дифференцировки 152), представляет собой белковый рецептор, который понижающе регулирует иммунную систему. CTLA-4 экспрессируется на поверхности хелперных, эффекторных и иммунорегуляторных T-клеток, которые приводят к клеточно-опосредованной иммунной атаке на антигены. T-клетка может быть "включена" путем стимуляции рецептора CD28 или "выключена" путем стимуляции рецептора CTLA-4.
CTLA-4, так же как и для костимулирующего белка T-клеток, CD28, связываются с CD80 и CD86, также называемыми В7-1 и В7-2 соответственно, на антигенпредставляющих клетках. Активация T-клеток через рецептор T-клеток и CD28 приводит к повышенной экспрессии CTLA-4, ингибирующего рецептора для молекул В7.
Усиление или продление активации T-клеток было достигнуто с помощью моноклональных антител (mAbs) к CTLA-4 и PD-1. Ипилимумаб и тремелимумаб представляют собой моноклональные антитела, которые ингибируют CTLA-4, и было показано, что они индуцируют или усиливают противоопухолевые иммунные ответы, вызывая длительные противоопухолевые эффекты. Ипилимумаб (также известный как MDX-010 или MDX-101), продаваемый в США под названием Ервой (Yervoy), продается Bristol Myers Squibb для лечения неоперабельной или метастатической злокачественной меланомы. BMS-936558 (MDX-1106) представляет собой моноклональное антитело к PD-1 и продемонстрировал значительную противоопухолевую активность в клинических исследованиях у людей. См., например, Brahmer et al., J. Clin. Oncol., 28(19):3167-3175, 2010, Brahmer et al., N. Engl. J. Med., 366(26):2455-2465, 2012 и Lipson et al., Clin. Can. Res. 19(2):462-468, 2013.
Ингибирование CTLA-4 также можно осуществлять гибридным белком (CTLA4Ig), состоящим из CTLA-4 и Fc тяжелой цепи иммуноглобулина (Ig). См., например, Park et al., Pharm Res. 20(8):1239-48, 2003.
Дополнительным, имеющим важное значение отрицательным регулятором иммунного ответа в микросреде опухоли является передатчик сигнала и активатор транскрипции (STAT), отвечающий на сигнал фактор транскрипции STAT3. Активность данного фактора повышается в опухоли и связанных с ней иммуноцитах. Активность STAT3 в клетках опухоли вносит вклад в увеличение выживаемости, пролиферации, инвазии и метастазирования, а также в стимуляцию ангиогенеза. Повышенная активность STAT3 в иммуноцитах приводит к накоплению и активации иммуносупрессорных клеток, таких как Treg, Th17 и супрессорные клетки миелоидного происхождения, в микросреде опухоли. Более подробно см., например, Rebe et al. (JAK-STAT 2(1):е23010-1-10, 2013). Было показано, что широко применяемые лекарственные средства от диабета 2 типа, метформин и фенформин, обладают противоопухолевой активностью, и механизм, как полагают, включает ингибирование активности STAT3, что приводит к снижению противоопухолевой иммуносупрессии. Более подробно см., например, Deng et al., (Cell Cycle 11(2):367-376, 2012), Hirsch et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 110(3):972-977, 2013), Appleyard et al., (British J. Cancer, 106:1117-1122, 2012), Jiralerspong et al., (J. Clin. Oncol. 27(20):3297-3302, 2009) и Del Barco et al., (Oncotarget, 2(12):896-917, 2011). В способах лечения рака, описанных в настоящем документе, можно применять введение грамотрицательных организмов совместно с ингибитором экспрессии или активности STAT3. Такие ингибиторы могут включать метформин и фенформин. Метформин может быть введен, например, в диапазоне доз от примерно 50 до примерно 1000 мг обычно от 1 до 3 раз в сутки. Фенформин, как правило, вводят в диапазоне доз от примерно 20 до примерно 800 мг от 1 до 2 раз в сутки.
В способах лечения рака, описанных в настоящем документе, можно также применять введение грамотрицательных организмов совместно с одним или более агонистами рецепторов или лигандов, которые положительно модулируют иммунный ответ хозяина. Агонисты направлены на 4-1ВВ (CD137), GITR, CD40 или ОХ40 (CD134), и их можно вводить, например, внутривенно в диапазоне доз от примерно 0,03 до примерно 30 мг/кг каждую 1-4 недели.
Глюкокортикоид-индуцируемый рецептор фактора некроза опухоли (TNFR)-родственный белок (GITR), 4-1BB (CD137), CD40 и ОХ40 (CD134) являются членами семейства костимулирующих TNFR, которые экспрессируются на регуляторных и эффекторных T-клетках, а также на других клетках иммун- 13 030573
ной системы. Активация данных белков приводит к стимуляции или усилению иммунной функции. Активирующие моноклональные антитела для каждого из данных белков проявили противоопухолевую активность в доклинических моделях и вступили в клинические исследования. См., например, Melero et al., Clin. Cancer Res. 15(5):1507-1509, 2009, Garber, JNCI, 103(14):1079-1082, 2011, Khong et al., Int. Rev. Immunol. 31(4):246-266, 2012, Vinay and Kwon, Mol. Cancer Ther. 11(5):1062-1070, 2012, Snell et al., Immunol. Rev. 244(1):197-217, 2011 и So et al., Cytokine Growth Factor Rev. 19(3-4):253-262, 2008.
В способах лечения рака, описанных в настоящем документе, можно также применять введение грамотрицательных организмов совместно с одним или более химиотерапевтическими агентами. Такие агенты могут включать циклофосфамид. Предполагается, что, когда циклофосфамид применяют в способах, описанных в настоящем документе, он может быть введен в дозе от 5 до 750 мг/м2 внутривенно или перорально каждый день или каждый 21 день. В качестве альтернативы циклофосфамид можно вводить, например, в метрономном режиме в дозе от 5 до 100 мг перорально каждый день. См., например, Jia et al., Int. J. Cancer, 121(3):666-674, 2007.
Была продемонстрирована стимуляция противоопухолевых иммунных ответов различными цитокинами. Для обзора см., например, Smyth et al., Immunological Rev. 202:275-293, 2004 и Kim-Schulze, Surg. Oncol. Clin N. Am. 16:793-818, 2007. В способах лечения рака, описанных в настоящем документе, можно также применять введение грамотрицательных организмов совместно с рекомбинантно экспрессируемыми или выделенными и очищенными цитокинами, такими как интерферон-альфа, интерферонбета, интерферон-гамма, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор, интерлейкин-2 и интерлейкин-12.
В способах лечения рака, описанных в настоящем документе, можно также применять грамотрицательные бактерии, вводимые совместно с рекомбинантно экспрессируемым или выделенным и очищенным интерфероном-альфа. Интерферон-альфа можно вводить либо подкожно, либо внутримышечно, либо внутривенно в диапазоне доз от примерно 3х105 до примерно 3х108 ME 1, 3, 5 или 7 раз в неделю. В другом варианте реализации грамотрицательные бактерии можно вводить совместно с интерферономбета. В некоторых вариантах реализации интерферон-бета будут вводить подкожно или внутривенно в диапазоне доз от примерно 0,01 до примерно 5 мг либо один раз в неделю, либо через день. Можно также совместно вводить интерферон-гамма. В одном из вариантов реализации интерферон-гамма можно вводить либо подкожно, либо внутривенно в диапазоне доз от примерно 1х105 до примерно 1х109 ME либо однократно, либо каждый день.
В дополнительных способах можно совместно вводить интерлейкины (например, интерлейкин-2 и интерлейкин-12). В одном из вариантов реализации интерлейкины можно вводить внутривенно в дозе от примерно 1х104 до примерно 1х107 ME один раз в неделю или до трех раз в сутки в комбинации с грамотрицательными бактериями. Дополнительные способы включают грамотрицательные бактерии, вводимые, например, совместно с гранулоцитарно-макрофатальным колониестимулирующим фактором либо подкожно, либо внутрикожно, либо внутривенно, как правило, в диапазоне доз от примерно 5 до примерно 5 мг либо каждый день, либо каждый месяц. В случае любого из комбинированных видов лечения, указанных на всем протяжении настоящего документа, предполагается, что организмы могут быть введены до или после дополнительного лечения рака. Они также могут быть введены одновременно.
Следующие примеры служат для иллюстрации настоящего изобретения. Данные примеры никоим образом не ограничивают объем настоящего изобретения.
Примеры
Пример 1.
Оптимальные условия для инактивации активности эндотоксина, связанной с липополисахаридами, и нейтрализации бактериальных клеток полимиксином В без потери целостности клеток определяли для каждого бактериального штамма путем инкубации концентрированных бактерий в поздней логарифмической фазе роста (от 109 до 1011 на 1 мл) при 37°C в натрий-фосфатном буфере (НФБ) совместно с 1-100 мкг/мл полимиксина В в течение различных периодов времени от 2 мин до 6 ч. Жизнеспособность определяли путем серийного разведения с высеванием контрольных и обработанных бактериальных суспензий в совместимые с ростом планшеты с агаром с последующей инкубацией в течение ночи и подсчетом колоний. Целостность клеток определяли путем визуального (с помощью микроскопа) осмотра и анализа поглощения при 600 нм. Активность эндотоксина определяли путем анализа на основе лизата амёбоцитов Limulus (LAL). Растворимый или избыточный полимиксин и клеточный осадок, содержащий растворимый эндотоксин, удаляли путем опосредуемой центрифугированием промывки 0,9% NaCl (изотонический раствор).
В качестве альтернативы оптимальные условия для выделения интактных нежизнеспособных бактерий с дефектным ЛПС, являющимся следствием условной мутации, определяли, как описано для обработки полимиксином, за исключением того, что бактерии выращивали в среде лизогенного бульона (LB) в непермиссивных условиях и извлекали в различные моменты времени с последующим анализом и обработкой, как описано для обработки полимиксином.
- 14 030573
Обработанные полимиксином бактерии или промытые физиологическим раствором мутантные/дефектные по ЛПС бактерии в поздней логарифмической фазе роста подвергали сушке методом сублимации с использованием трегалозы в качестве криопротектора (см., например, Leslie et al., Арр. Environment. Microbiol. 61(10):3592-3597, 1995; Gu et al., J. Biotech. 88:95-105, 2001 и Руководство по бактериальным культурам от Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection Bacterial Culture Guide)). При необходимости, жизнеспособность бактерий дополнительно снижали путем обработки ионизирующим излучением в дозе, достаточной для снижения жизнеспособности до 0% без потери целостности бактерий.
Высушенные методом сублимации бактерии ресуспендировали в стерильной воде перед применением в исследованиях противоопухолевого действия. Промытые НФБ клетки опухоли мыши (меланома В16 и B16F10, карцинома толстой и прямой кишки CT-26, карцинома поджелудочной железы Panc02 или карцинома легкого Льюис (105-107 клеток в зависимости от линии клеток)) подкожно имплантировали на спину побритых мышей C57BL/6. Мышей рандомизировали и лечение начинали, когда опухоли впервые поддавались пальпации, когда опухоли достигали среднего объема, равного 75 мм3, или когда опухоли достигали среднего объема, равного 300 мм (по оценкам путем измерения штангенциркулем). Ресуспендированные бактерии вводили путем инъекции от одного раза до двух раз в неделю через хвостовую вену или интраперитонеально (и/п) в индивидуальных дозах в диапазоне от 103 до 1010 на 0,1-0,2 мл объема ведения. Представляющие собой антитела антагонисты или агонисты, направленные на рецепторы T-клеток, вводили интраперитонеально в индивидуальных дозах, составляющих 3-100 мкг, от одного раза до двух раз в неделю. Циклофосфамид вводили интраперитонеально в дозе до 150 мг/кг через день в течение 5 дней (введение максимальных переносимых доз (MTD)) или в дозе 25 мг/кг в сутки в питьевой воде (метрономный режим введения доз). Определяли массу тела мышей два раза в неделю и фиксировали клинические наблюдения. Измерения опухоли (штангенциркулем) проводили два раза в неделю и мышей гуманно умерщвляли, если, когда опухоли достигали 1000 мм3, некротизировались или если наблюдали потерю массы >15%. Опухоли извлекали и определяли их массу и осуществляли минимальную аутопсию умерщвленных мышей. Мышей могли повторно "заражать" путем имплантации клеток опухоли, если наблюдали длительный регресс или вылечивание опухоли.
Пример 2.
В примере 2 использовали штамм E.coli 2617-143-312 (Migula) Кастеллани (Castellani) и Чалмерс (Chalmers) (ATCC® 13070™). Для роста данной безвредной грамотрицательной бактерии необходима экзогенная диаминопимелиновая кислота (DAP). Поскольку млекопитающие не вырабатывают DAP, данный бактериальный штамм не является жизнеспособным и не может вызывать инфекции у млекопитающих. Кроме того, DAP-ауксотрофия может быть использована для контроля загрязнения во время исследований in vitro. Бактерии выращивали до поздней логарифмической фазы (исходя из оптической плотности при 600 нм (O.D.600)) в бульоне LB Миллера, содержащем 2 мМ MgCl2, 0,5% глюкозу и 1 мМ DAP, при 37°C с постоянным встряхиванием при 300 об/мин. Культуру три раза промывали путем центрифугирования при 2000xg в течение 15 мин и ресуспендирования в бульоне LB Миллера 4°C, содержащем 20 мМ MgCl2, 0,5% глюкозу и 0,1 мМ DAP (среда для обработки РМВ). Конечное ресуспендирование осуществляли в количестве 2х1010 бактерий/мл, исходя из того, что O.D.600 равна 1,12х109 бактерий/мл. Отдельные аликвоты культуры инкубировали без и совместно с различными концентрациями Полимиксина В (РМВ) (Calbiochem #5291) в течение 1 ч при 4°C при постоянном перемешивании. Затем бактерии три раза промывали свежей средой для обработки РМВ 4°C путем центрифугирования при 3000xg в течение 10 мин и ресуспендировали в количестве 2х10 бактерий/мл. Эффективность восстановления бактерий контролировали, следя за O.D.600. Восстановление бактерий после обработки РМВ и промывки составляло более 90% для всех образцов, обработанных до 300 мкг/мл РМВ, и превышало 80% для обработки 1000 мкг/мл РМВ.
На фиг. 1 активность эндотоксина определяли путем анализа серийных разведений необработанных и обработанных бактериальных культур с помощью набора Endosafe Endochrome-K для кинетического анализа на основе лизата амёбоцитов Limulus (LAL) (Charles River Endosafe, Чарльстон, Южная Каролина). Необработанные культуры, как правило, содержали приблизительно 50-100 единиц эндотоксина на 1х106 бактерий. Аналогичное уменьшение эндотоксина наблюдали для обработки 1000 мкг/мл РМВ в четырех независимых экспериментах (среднее значение = 17% от необработанных).
На фиг. 2 жизнеспособность бактерий определяли путем серийного разведения и высевания каждого образца в планшеты с агаром LB Миллера, содержащие 2 мМ MgCl2, 0,5% глюкозу, совместно с и без 1 мМ DAP (для контроля жизнеспособности и загрязнения соответственно). Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°C, определяли количество колоний в каждом планшете, а затем рассчитывали жизнеспособность путем умножения количества колоний в каждом планшете на коэффициент разведения. Общее количество бактерий в каждой суспензии рассчитывали путем умножения ОЮ.600 на коэффициент преобразования 1,12х109 бактерий/мл при O.D.600, равной 1. Жизнеспособность (% живых бактерий) рассчитывали как процент жизнеспособных бактерий/мл относительно общего количества бактерий. Обработка 1000 мкг/мл РМВ снижала жизнеспособность бактерий до 0%. В последующих экспериментах в
- 15 030573
увеличенном масштабе 1000 мкг РМВ снижали жизнеспособность в среднем до 11% в четырех независимых экспериментах.
Пример 3.
Эксперименты проводили, как описано в примере 2, за исключением того, что промывку до обработки, обработку глутаральдегидом (GA) и промывку после обработки осуществляли с использованием фосфатного буферного раствора (НФБ; не содержащий Mg и Са), рН 7,5, содержащего 20 мМ MgCl2. Восстановление бактерий после обработки GA во всех тестируемых концентрациях, как правило, составляло 80-100%. На фиг. 3 показано, что обработка 1% GA снижала активность эндотоксина на 96%. В результате эксперимента в увеличенном до 2 л масштабе с обработкой 1% GA происходило снижение активности эндотоксина, составляющее 82%, по сравнению с необработанной культурой.
Обработка GA согласованно нейтрализовала 100% бактерий в дозах выше 0,05%, как показано на фиг. 4.
Комбинация обработки 1000 мкг/мл РМВ с последующей обработкой 1% GA с использованием 2 л культуры в поздней логарифмической фазе роста позволяла получить бактерии с 0% жизнеспособности и со снижением активности эндотоксина на 92% (12-кратно) по сравнению с необработанной культурой (табл. 1).
Пример 4.
В примере 4 бактерии выращивали и обрабатывали 1000 мкг/мл РМВ, 1% GA или обоими соединениями, как описано в протоколах для примеров 2 и 3. Образцы разводили НФБ, рН 7,5, содержащим 1% GA (если до этого не подвергали воздействию GA), и фиксировали в течение 10 мин. 25-микролитровые капли, содержащие бактерии, помещали на парафильм, а затем покрывали сеткой для электронной микроскопии (ЕМ) с формвар-углеродным покрытием, 100 меш (EMS, Хатфилд, Пенсильвания), на которую предварительно наносили 0,1% поли-Ь-лизин. Образцы оставляли на 10 мин для протекания адгезии, а затем сетки быстро промывали три раза путем помещения на 200-микролитровые капли воды. Сетки отрицательно окрашивали путем помещения на 1 мин на 100-микролитровые капли 2% уранила ацетата в воде. Избыток красителя промокали 3 М фильтровальной бумагой с последующей сушкой на воздухе. Образцы визуализировали с использованием просвечивающего электронного микроскопа FEI Tecnai Spirit G2 Bio TWIN, оснащенного цифровой камерой с нижним креплением Eagle 4k (16 мегапикселей) (увеличения 1200x и 11000x). Изображения на фиг. 5В-5О подтверждают, что обработка РМВ и/или GA, проводимая в соответствии со способами согласно настоящему изобретению, оставляет бактерии в интактном состоянии, что является желаемым результатом. Полисахаридная оболочка видна (расплывчатая поверхность) у необработанных бактерий (фиг. 5А), но, по-видимому, была удалена или сглажена во всех обработанных бактериях (фиг. 5В-5О).
Пример 5.
Для примера 5 E.coli выращивали и обрабатывали 1000 мкг/мл РМВ + 1% GA и определяли жизнеспособность и уровни эндотоксина, как описано для примеров 2 и 3. После окончательной промывки необработанные и РМВ + GA-обработанные бактерии ресуспендировали в 50% НФБ, рН 7,5, 0,5 мМ MgCl2, 12% трегалоза, в концентрации 1.1x10" бактерий/мл, делили на аликвоты, подвергали мгновенному замораживанию и хранили при -80°C. Порог пирогенности определяли, по существу, как описано в Фармакопее США, глава 151. Использовали взрослых самок новозеландских белых кроликов с массой тела по меньшей мере 2,0 кг. Всех животных подвергали ложному тестированию не больше чем за 7 дней до тестирования пирогенности. Определение диапазона доз осуществляли у одного кролика на дозу, а затем данные результаты подтверждали с использованием двух кроликов на дозу. Бактерии разводили в стерильном физиологическом растворе для инъекций. Все дозы доставляли внутривенным путем в объеме 10 мл. Самую низкую концентрацию тестируемого агента, которая вызывала повышение температуры на 0,5-1,0°C в любой момент времени в течение 3 ч после введения тестируемого агента, считали порогом пирогенности. Ректальную температуру фиксировали в начале и с 30-минутными интервалами между 1 и 3 ч после инъекции тестируемого агента. Было показано, что разведенный физиологическим раствором носитель, используемый для хранения необработанных и обработанных E.coli, не является пирогенным. Введение 3x104 необработанных бактерий двум кроликам вызывало повышение температуры на 0,8 и 1,0°C. Введение 3x105 РМВ + GA-обработанных бактерий не вызывало повышения температуры более чем на 0,1°C, но введение 9x105 РМВ + GA-обработанных бактерий двум кроликам вызывало повышение температуры на 0,7 и 1,0°C, что демонстрирует 30-кратное отличие порога пирогенности. Можно предположить, что РМВ нейтрализует пирогенную активность, опосредуемую только липополисахаридом. Тогда как GA может нейтрализовать пирогенность, опосредуемую липополисахаридом, а также другими компонентами бактерий.
В табл. 1 показан порог пирогенности (лихорадочная реакция) для необработанных бактерий и бактерий, обработанных как 1000 мкг/мл РМВ, так и 1% GA, измеренный с помощью стандартного теста с кроликами in vivo. Результаты сравнивали с уровнями эндотоксина, определенными с помощью анализа LAL in vitro, что показывает, что, хотя обработка РМВ + GA снижала уровни эндотоксина в 12 раз, пирогенность, опосредуемая тем же образцом, снижалась в 30 раз по сравнению с необработанными бакте- 16 030573
риями.
Таблица 1
Обработка Живые бактерии Активность эндотоксина, анализ LAL Порог пирогенности, анализ с кроликами
Отсутствие обработки 83% 44,7 единицы/10о бактерий 3x104 бактерий
PMB + GA 0% 3,6 единицы/Ю" бактерий 9x105 бактерий
Максимальное снижение 12Х ЗОХ
Пример 6:
В примере 6 E.coli выращивали и обрабатывали 1000 мкг/мл полимиксина В + 1% GA, как описано в протоколах для примеров 2 и 3. Исходные культуры необработанных и обработанных бактерий подвергали быстрому оттаиванию при 37°C и либо разводили по меньшей мере 10-кратно в стерильном физиологическом растворе для инъекций (дозы для внутривенного введения <3x109 бактерий), либо центрифугировали при 3000xg в течение 10 мин и ресуспендировали в стерильном физиологическом растворе для инъекций (дозы для внутривенного введения >5x109). Бактерии или носители вводили внутривенно через хвостовую вену в объеме 100 мкл.
Использовали восьминедельных самок мышей C57BL/6 или BALB/c и давали им по меньшей мере 7 дней для адаптации перед началом исследований. Контроль смертности и клинические наблюдения осуществляли один или два раза в сутки. Дополнительные наблюдения осуществляли во время и через 1-4 ч после инъекций. Подтверждали отсутствие токсичности носителей. Наблюдения у клетки включали, но не ограничивались следующими:
изменения кожи, шерсти, глаз, слизистых оболочек, походки, осанки и реакции на уход, появление отделяемого/выделений или другого признака автономной активности, такого как слезотечение, пилоэрекция, необычные способы дыхания; наличие судорог;
изменения общей настороженности;
стереотипное поведение, такое как чрезмерный уход за поверхностью тела и цикличное вращение;
необычное поведение (самокалечение);
развитие припухлостей/наростов (опухоль, абсцесс и т.д.);
развитие признаков стресса и/или респираторных симптомов;
наблюдение за местами инъекций на предмет признаков раздражения и воспаления; изменения потребления корма и воды и выделения мочи и кала.
Введение бактерий для исследований с несколькими дозами осуществляли два раза в неделю в течение двух недель (4 введения). Оценка токсичности включала контроль массы тела животного. Мыши, используемые в исследовании с несколькими дозами, указанные для РМВ + GA-обработанных бактерий в количестве 1x 109, были носителями опухолей. Все остальные мыши, указанные в табл. 2, не были носителями опухолей.
Таблица 2
Обработка бактерий Доза Однократная доза, наблюдения Несколько (4) доз, наблюдения
Необработанн ые 3x108 Слегка вялые через 1-4 ч Слегка вялые через 1-4 ч
1x109 Вялые через 1-4 ч Вялые через 1-4 ч, 2 из 3 мышей погибли после 4°" дозы
5x10’ Вялые через 1-48 ч, погибли к 72 ч ND*
1хЮ10 Погибли к 18 ч ND
PMB + GA 1x10’ Слегка вялые через 1-4 ч Слегка вялые через 1-4 ч, взъерошенная шерсть
3x10’ Вялые через 1-4 ч Слегка вялые, вялые или взъерошенная шерсть до 4 ч после лечения
5x10’ Вялые через 1-4 ч Слегка вялые, вялые или взъерошенная шерсть до 4 ч после лечения
1хЮ10 Сильно вялые, 1 из 3 мышей погибла к 24 ч Вялые, слегка вялые, взъерошенная шерсть и/или поверхностное дыхание
*ND = не определено.
- 17 030573
Пример 7.
В примере 7 1000 мкг/мл РМВ + 1% GA-обработанных бактерий (DB103) получали, как описано в протоколах для примеров 2 и 3. У восьминедельных самок мышей C57BL/6J сбривали шерсть в месте инъекции и подкожно вводили путем инъекции в правый бок 2х105 клеток меланомы B16F10 мыши (АТСС CRL-6475). Лечение путем внутривенного введения в хвостовую вену начинали через три дня и продолжали два раза в неделю, всего осуществляли 5 введений. DB103 в 50% НФБ, рН 7,5, 0,5 мМ MgCl2, 12% трегалоза, в концентрации 1,1 х 1011 на 1 мл подвергали 11-кратному (доза 1х109) или 220кратному (доза 5х107) разведению стерильным физиологическим раствором и вводили путем инъекции в конечном объеме 100 мкл. Для контрольной группы лечения носителем осуществляли 11-кратное разведение исходного носителя. Измеряли опухоли штангенциркулями два раза в неделю и определяли объем опухолей с использованием формулы (длинах ширина2)/2. Не наблюдали гибели, связанной с соединениями. У всех животных развивались опухоли, за исключением двух животных, которых лечили 1 х 109 DB103. Наблюдали временную потерю массы тела до 3% (группа, получавшая низкую дозу) и 7% (группа, получавшая высокую дозу), но она восстанавливалась после последнего лечения (фиг. 6).
Пример 8.
Для примера 8 E.coli (необработанные и 1% GA-обработанные) получали, как описано в протоколах для примеров 2 и 3. Эксперимент проводили, как описано в протоколе для примера 7, за исключением того, что лечение начинали в 11 день, когда опухоли были едва пальпируемыми. Измерения в группах не фиксировали после 24 дня для большинства групп, поскольку приходилось проводить эвтаназию подгруппы животных в каждой из данных групп из-за опухолевой массы. Опухоли образовывались у всех животных. Максимальная потеря массы в группе, получавшей 1 х 109 GA, составляла 11%. Токсичность делала невозможным введение 1х 109 необработанных E.coli (см. табл. 2).
Пример 9.
В примере 9 1000 мкг РМВ + 1% GA-обработанных бактерий (DB103) получали, как описано в протоколах для примеров 2 и 3. Эксперимент проводили, как описано в протоколе для примера 7, за исключением того, что 1х105 клеток карциномы толстой и прямой кишки СТ26 мыши вводили подкожно путем инъекции в правый бок мышей BALB/c. Лечение DB103 путем внутривенного введения в хвостовую вену начинали через три дня и продолжали два раза в неделю, всего осуществляли 6 введений. Циклофосфамид (LKT Laboratories, #C9606) вводили с питьевой водой непрерывно, начиная с 3 дня, в дозе ~20 мг/кг/сутки (0,133 мг/мл в воде). Антитело к CTLA-4 мыши (BioXcell #BE0164), 100 мкг в 200 мкл НФБ, вводили интраперитонеально в 3, 6 и 9 день. Клинические наблюдения и смертность фиксировали каждый день. Измеряли опухоли штангенциркулями два раза в неделю и определяли объем опухолей с использованием формулы (длинахширина2)/2. Опухоли образовывались у всех животных в группе, получавшей носитель. Ни в одной группе не наблюдали потери массы и гибели, связанной с соединениями. Данные для групп, получавших носитель, низкую дозу и высокую дозу DB103, совпадают на фиг. 8А и 8В.
Все патенты и публикации, упомянутые в настоящем описании, указывают на уровень специалиста в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Содержание всех патентов и публикаций включено в настоящее описание посредством ссылки так же, как если бы содержание каждой индивидуальной публикации было специально включено отдельно.
Настоящее изобретение, наглядно описанное в настоящем документе, подходящим образом может быть реализовано в отсутствие какого-либо элемента или элементов, ограничения или ограничений, которые, в частности, не указаны в настоящем документе. Таким образом, например, в каждом случае в настоящем описании любой из терминов "содержащий", "по существу состоящий из" и "состоящий из" может быть заменен на любой из указанных двух других терминов. Употребляемые термины и выражения используются в качестве описывающих и не ограничивающих терминов, и использование таких терминов и выражений не исключает любые эквиваленты показанных и описанных признаков или их частей, и понятно, что различные модификации возможны в пределах объема формулы изобретения. Таким образом, следует понимать, что, несмотря на то, что настоящее изобретение специально описано с помощью предпочтительных вариантов реализации и возможных признаков, специалист в данной области техники может прибегнуть к модификации и вариации концепций, указанных в настоящем описании, и что такие модификации и вариации считаются входящими в объем данного изобретения, определяемый прилагаемой формулой изобретения. Другие варианты реализации изложены в приведенной ниже формуле изобретения.
- 18 030573

Claims (20)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Композиция для лечения рака, содержащая (а) интактные нежизнеспособные грамотрицательные бактериальные клетки, демонстрирующие снижение активности эндотоксина, происходящего от липополисахарида (ЛПС), составляющее по меньшей мере 80%, и снижение пирогенности, составляющее по меньшей мере 90%, по сравнению с соответствующими грамотрицательными бактериальными клетками дикого типа; и (б) фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что указанные интактные нежизнеспособные грамотрицательные бактериальные клетки получены путем обработки грамотрицательных бактериальных клеток полимиксином и глутаральдегидом.
3. Композиция по п.2, отличающаяся тем, что указанная доза полимиксина составляет от 3 до 5000 мкг/мл и указанная доза глутаральдегида составляет от 0,05 до 2%.
4. Композиция по п.2 или 3, отличающаяся тем, что полимиксин представляет собой полимиксин В или полимиксин Е.
5. Композиция по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что снижение активности эндотоксина, происходящего от ЛПС, составляет по меньшей мере 90%, и снижение пирогенности составляет по меньшей мере 95% по сравнению с соответствующими грамотрицательными бактериальными клетками дикого типа.
6. Композиция по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что снижение активности эндотоксина, происходящего от ЛПС, определено путем in vitro анализа на основе лизата амёбоцитов Limulus (LAL).
7. Композиция по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что снижение пирогенности определено с помощью стандартного теста с кроликами in vivo.
8. Композиция по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что указанные бактериальные клетки представляют собой клетки Salmonella или Escherichia.
9. Композиция по любому из пп.1-7, отличающаяся тем, что указанные бактериальные клетки содержат ДНК, кодирующую или экспрессирующую небактериальный белок, который предпочтительно представляет собой опухолевый антиген или белок, стимулирующий иммунную систему.
10. Композиция по любому из пп.1-9, отличающаяся тем, что рак выбран из лимфомы или карциномы толстой кишки, прямой кишки, поджелудочной железы или печени.
11. Применение композиции по любому из пп.1-10 для приготовления лекарственного средства для лечения рака у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении.
12. Применение по п.11, отличающееся тем, что рак выбран из лимфомы или карциномы толстой кишки, прямой кишки, поджелудочной железы или печени.
13. Способ лечения рака у млекопитающего, нуждающегося в таком лечении, включающий введение указанному млекопитающему композиции по любому из пп.1-10 в терапевтически эффективном количестве.
14. Способ по п.13, дополнительно включающий введение млекопитающему (а) антагониста ингибирующего иммунную функцию T-клеточного рецептора или лиганда T-клеточного рецептора, выбранного из группы, состоящей из CTLA-4, PD-1, PD-L1 и PD-L2; (б) ингибитора STAT3, выбранного из группы, состоящей из метформина и фенформина; (в) агониста стимулирующего иммунную функцию Tклеточного рецептора, выбранного из группы, состоящей из GITR, 4-1ВВ, CD40 и ОХ40; (г) химиотерапевтического агента, который предпочтительно представляет собой циклофосфамид; или (д) цитокина, предпочтительно выбранного из группы, состоящей из интерферона-альфа, интерферона-бета, интерферона-гамма, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора, интерлейкина-2 и интерлейкина-12.
15. Способ по п.13, отличающийся тем, что указанное количество достаточно для ингибирования роста или метастазирования раковой опухоли.
16. Способ получения композиции по п.1, включающий приведение грамотрицательных бактериальных клеток в контакт с полимиксином и глутаральдегидом в условиях, подходящих для снижения активности эндотоксина, происходящего от липополисахарида (ЛПС), и пирогенности клеток без потери целостности клеток, с получением, таким образом, интактных нежизнеспособных бактериальных клеток, демонстрирующих снижение активности эндотоксина, происходящего от липополисахарида, составляющее по меньшей мере 80%, и снижение пирогенности, составляющее по меньшей мере 90%, по сравнению с соответствующими грамотрицательными бактериальными клетками дикого типа.
17. Способ по п.16, отличающийся тем, что доза полимиксина составляет от 3 до 5000 мкг/мл и доза глутаральдегида составляет от 0,05 до 2%.
18. Способ по п.16 или 17, отличающийся тем, что полимиксин представляет собой полимиксин В или полимиксин Е.
- 19 030573
- 20 030573
Объем опухоли (мм 3 ± sem)
Дни после имплантации клеток опухоли
EA201591017A 2013-01-02 2013-12-23 Композиции и способы для лечения рака с применением бактерий EA030573B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361748369P 2013-01-02 2013-01-02
PCT/US2013/077441 WO2014107365A1 (en) 2013-01-02 2013-12-23 Compositions and methods for treatment of cancer using bacteria

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201591017A1 EA201591017A1 (ru) 2015-12-30
EA030573B1 true EA030573B1 (ru) 2018-08-31

Family

ID=49943600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201591017A EA030573B1 (ru) 2013-01-02 2013-12-23 Композиции и способы для лечения рака с применением бактерий

Country Status (17)

Country Link
US (5) US10195259B2 (ru)
EP (1) EP2941258B1 (ru)
JP (1) JP6125041B2 (ru)
KR (1) KR102214794B1 (ru)
CN (1) CN104884073B (ru)
AU (1) AU2013371454B2 (ru)
CA (1) CA2896858C (ru)
DK (1) DK2941258T3 (ru)
EA (1) EA030573B1 (ru)
ES (1) ES2759854T3 (ru)
HK (1) HK1217289A1 (ru)
IL (1) IL239453B (ru)
MX (1) MX368210B (ru)
PL (1) PL2941258T3 (ru)
PT (1) PT2941258T (ru)
TW (1) TWI664976B (ru)
WO (1) WO2014107365A1 (ru)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2759854T3 (es) 2013-01-02 2020-05-12 Decoy Biosystems Inc Composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer utilizando bacterias
WO2015153820A1 (en) * 2014-04-02 2015-10-08 Felder Mitchell S Ctla-4 blockade with metronomic chemotherapy for the treatment of cancer
AU2015304448B2 (en) * 2014-08-19 2020-04-30 National University Corporation Okayama University Method for enhancing immune cell function and method for assessing immune cell multifunctionality
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
JP2020524145A (ja) * 2017-06-16 2020-08-13 ナントバイオ，インコーポレイテッド 細菌性ワクチン
US11168326B2 (en) 2017-07-11 2021-11-09 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
CA3082589A1 (en) 2017-11-20 2019-05-23 Codex Dna, Inc. Vibrio sp. organisms with modified lipopolysaccharide
CA3088343A1 (en) * 2018-01-19 2019-07-25 4D Pharma Research Limited Combination therapy for treating or preventing cancer
CA3176812A1 (en) 2018-07-11 2020-01-16 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
US11242528B2 (en) 2018-08-28 2022-02-08 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
KR20210068462A (ko) 2018-09-27 2021-06-09 디코이 바이오시스템즈 인코퍼레이티드 박테리아를 사용하는 감염 치료 방법
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
WO2020232389A1 (en) * 2019-05-16 2020-11-19 City Of Hope Compositions and methods for targeting tumor-associated extracellular matrix components to improve drug delivery
CN114302729A (zh) * 2019-08-29 2022-04-08 生物医学研究集团有限公司 癌化学疗法支持剂、食品及药品
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
WO2022098213A1 (ko) * 2020-11-09 2022-05-12 전남대학교 산학협력단 암의 예방 및 치료용 살모넬라 균주 및 이의 용도
FI129784B (en) * 2021-04-27 2022-08-31 Solar Foods Oy METHODS OF PRODUCING MICROPRODUCTS

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998053851A1 (en) * 1997-05-28 1998-12-03 University Of Iowa Research Foundation Laft mutants of pathogenic gram-negative bacteria
WO2001024637A1 (en) * 1999-10-04 2001-04-12 Vion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating solid tumors with irradiation and bacteria
WO2003063593A1 (en) * 2002-01-28 2003-08-07 Vion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer by administering tumor-targetted bacteria and an immunomodulatory agent
WO2005120560A1 (en) * 2004-06-07 2005-12-22 Harold David Gunn Bacterial compositions for the treatment of cancer
US20090074816A1 (en) * 2004-06-07 2009-03-19 Harold David Gunn Tissue targeted antigenic activation of the immune response to cancers

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4842855A (en) * 1980-12-19 1989-06-27 University Of Pittsburgh Antitumor process using a Brucella abortus preparation
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US5171738A (en) * 1982-10-04 1992-12-15 Toray Industries, Inc. Method of treating malignant tumors
JPH04270965A (ja) 1990-05-18 1992-09-28 Burton W Blais オリゴペプタイド吸着担体の調製方法、及びこれを使用したリポ多糖類の検定と除去方法
US6264952B1 (en) * 1993-11-05 2001-07-24 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Method for protecting a mammalian host against infection by Brucella
JPH11506424A (ja) * 1995-03-24 1999-06-08 オフィディアン ファーマシューティカルズ インコーポレーテッド ベロ毒素産生大腸菌に対する治療
US6190657B1 (en) 1995-06-07 2001-02-20 Yale University Vectors for the diagnosis and treatment of solid tumors including melanoma
US5811097A (en) * 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US5997881A (en) * 1995-11-22 1999-12-07 University Of Maryland, Baltimore Method of making non-pyrogenic lipopolysaccharide or A
CN1253551C (zh) 1997-09-10 2006-04-26 维昂药品公司 减毒的遗传修饰肿瘤靶向细菌
US6962696B1 (en) 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
WO2001025397A2 (en) * 1999-10-04 2001-04-12 Vion Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
WO2001095876A1 (en) 2000-06-09 2001-12-20 Baylor College Of Medicine The combination of antimicrobial agents and bacterial interference to coat medical devices
US7344710B2 (en) 2001-11-21 2008-03-18 The Johns Hopkins University Combination bacteriolytic therapy for the treatment of tumors
WO2005039492A2 (en) 2003-10-22 2005-05-06 The John Hopkins University Improved combination bacteriolytic therapy for the treatment of tumors
US8501198B2 (en) 2004-06-07 2013-08-06 Qu Biologics Inc. Tissue targeted antigenic activation of the immune response to treat cancers
CA2572756C (en) 2004-06-29 2016-01-26 Anticancer, Inc. Cancer selective auxotrophs
CN101472604B (zh) 2006-01-19 2013-11-06 研究技术股份有限公司 活的无毒的革兰氏阴性细菌
US9068186B2 (en) 2010-03-12 2015-06-30 Research Corporation Technologies, Inc. Viable gram negative bacteria lacking outer membrane agonists of TLR4/MD-2
ES2759854T3 (es) 2013-01-02 2020-05-12 Decoy Biosystems Inc Composiciones y métodos para el tratamiento del cáncer utilizando bacterias

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1998053851A1 (en) * 1997-05-28 1998-12-03 University Of Iowa Research Foundation Laft mutants of pathogenic gram-negative bacteria
WO2001024637A1 (en) * 1999-10-04 2001-04-12 Vion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating solid tumors with irradiation and bacteria
WO2003063593A1 (en) * 2002-01-28 2003-08-07 Vion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer by administering tumor-targetted bacteria and an immunomodulatory agent
WO2005120560A1 (en) * 2004-06-07 2005-12-22 Harold David Gunn Bacterial compositions for the treatment of cancer
US20090074816A1 (en) * 2004-06-07 2009-03-19 Harold David Gunn Tissue targeted antigenic activation of the immune response to cancers

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BROOKS LOW K, ET AL.: "LIPID A MUTANT SALMONELLA WITH SUPPRESSED VIRULENCE AND TNFALPHA INDUCTION RETAIN TUMOR-TARGETING IN VIVO", NATURE BIOTECHNOLOGY, GALE GROUP INC., vol. 17, 1 January 1999 (1999-01-01), pages 37 - 41, XP002939412, ISSN: 1087-0156 *
LUO X; LI Z; LIN S; LE T; ITTENSOHN M; BERMUDES D; RUNYAB J D; SHEN S Y; CHEN J; KING I C; ZHENG L M: "Antitumor effect of VNP20009, an attenuated Salmonella, in murine tumor models", ONCOLOGY RESEARCH., PERGAMON PRESS, NEW YORK, NY., US, vol. 12, no. 11-12, 1 January 2001 (2001-01-01), US, pages 501 - 508, XP008123352, ISSN: 0965-0407 *
ROBERT M. HOFFMAN: "Tumor-targeting amino acid auxotrophic Salmonella typhimurium", AMINO ACIDS ; THE FORUM FOR AMINO ACID AND PROTEIN RESEARCH, SPRINGER-VERLAG, VI, vol. 37, no. 3, 17 March 2009 (2009-03-17), Vi, pages 509 - 521, XP019742423, ISSN: 1438-2199, DOI: 10.1007/s00726-009-0261-8 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW201440779A (zh) 2014-11-01
US10052371B2 (en) 2018-08-21
TWI664976B (zh) 2019-07-11
PT2941258T (pt) 2019-12-12
EP2941258A1 (en) 2015-11-11
US20190307869A1 (en) 2019-10-10
KR102214794B1 (ko) 2021-02-10
CA2896858A1 (en) 2014-07-10
US20160199422A1 (en) 2016-07-14
ES2759854T3 (es) 2020-05-12
CA2896858C (en) 2022-08-23
JP6125041B2 (ja) 2017-05-10
MX368210B (es) 2019-09-24
PL2941258T3 (pl) 2020-02-28
EP2941258B1 (en) 2019-09-11
CN104884073A (zh) 2015-09-02
CN104884073B (zh) 2019-07-12
MX2015008606A (es) 2016-01-14
US20140212396A1 (en) 2014-07-31
IL239453A0 (en) 2015-07-30
US20220047649A1 (en) 2022-02-17
EA201591017A1 (ru) 2015-12-30
KR20150102093A (ko) 2015-09-04
US9265804B2 (en) 2016-02-23
AU2013371454A1 (en) 2015-07-02
JP2016505604A (ja) 2016-02-25
BR112015015832A2 (pt) 2017-07-11
US11045504B2 (en) 2021-06-29
IL239453B (en) 2020-03-31
US10195259B2 (en) 2019-02-05
US20160228523A1 (en) 2016-08-11
DK2941258T3 (da) 2019-12-16
HK1217289A1 (zh) 2017-01-06
AU2013371454B2 (en) 2019-01-03
WO2014107365A1 (en) 2014-07-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11045504B2 (en) Compositions and methods for treatment of cancer using bacteria
JP2022522350A (ja) 弱毒化サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）を使用する良性神経系腫瘍の処置
Le Bourhis et al. Role of Nod1 in mucosal dendritic cells during Salmonella pathogenicity island 1-independent Salmonella enterica serovar Typhimurium infection
Dréau et al. Combining the specific anti-MUC1 antibody TAB004 and lip-MSA-IL-2 limits pancreatic cancer progression in immune competent murine models of pancreatic ductal adenocarcinoma
EP3436065B1 (en) Anti-cancer oncolytic virus combination therapies and elite responder selection platforms
CN114736861B (zh) 一种装载分泌表达免疫检查点纳米抗体减毒沙门氏菌的单核或巨噬细胞及其制备方法和应用
Johnson et al. Monocytes mediate Salmonella Typhimurium‐induced tumor growth inhibition in a mouse melanoma model
Drees et al. Attenuated Salmonella enterica Typhimurium reduces tumor burden in an autochthonous breast cancer model
BR112015015832B1 (pt) Composição compreendendo células bacterianas gram-negativas intactas e não viáveis e uso das mesmas
Au et al. An injectable subcutaneous colon-specific immune niche for the treatment of ulcerative colitis
CN113905749A (zh) 用于治疗免疫检查点抑制剂相关结肠炎的方法和组合物
Castillo et al. Cellular mechanisms underlying beneficial versus detrimental effects of bacterial antitumor immunotherapy
Cebula Yersinia-Mediated Colorectal Cancer Cell Death
Jayawardhana Identification of a syngeneic murine tumour model for Clostridium sporogenes-NT colonisation in combination with cancer immunotherapy
Nimisha et al. PROBIOTICS–INTERPLAY BETWEEN GUT FLORA, IMMUNITY, AND MENTAL HEALTH
CN115943211A (zh) 肿瘤靶向鸡沙门氏菌菌株及其用途
Zorzi Digestive Disease Week 2012: An Update on Basic Science and Translational Research in IBD
KR20170011221A (ko) 클렙시엘라균 감염질환의 예방용 백신
EP1919495A2 (en) Methods and compositions for treating gastrointestinal radiosensitivity in a subject
Dhakal et al. 1Medical College of Wisconsin, Milwaukee, WI; 2Sarah Cannon Research Institute-Tennessee Oncology, Nashville, TN; 3Sarah Cannon Research Institute-Colorado Blood Cancer Institute, Denver, CO; 4Fate Therapeutics, Inc., San Diego, CA; 5Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM