KR20210068462A

KR20210068462A - 박테리아를 사용하는 감염 치료 방법

Info

Publication number: KR20210068462A
Application number: KR1020217011018A
Authority: KR
Inventors: 마이클 제이. 뉴만
Original assignee: 디코이 바이오시스템즈 인코퍼레이티드
Priority date: 2018-09-27
Filing date: 2019-09-26
Publication date: 2021-06-09
Also published as: AU2019347502A1; EP3856213A1; FI3856213T3; WO2020069211A1; JP2022502439A; US20200101119A1; MX2021003551A; IL281775A; CN112770764A; DK3856213T3; EP3856213A4; US20220031768A1; EP3856213B1; BR112021005762A2; CA3114110A1; US11147844B2; EA202190546A1

Abstract

본 개시는 일반적으로 감염을 예방 및 치료하기 위한 조성물, 투여 형태, 및 방법에 관한 것이다. 조성물은 리포다당 (LPS)-관련 내독소 활성을 감소시키기 위해 처리된, 놀랍게도 사이토카인의 면역 세포 생성을 촉발시키는 활성이 증가된 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포를 포함한다.

Description

박테리아를 사용하는 감염 치료 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2018년 9월 27일에 출원된 미국 가출원 번호 62/737,762의 35 U.S.C. §119에 따른 이익을 주장하며, 이 출원의 내용은 그 전문이 본 개시에 참조로 포함된다.

바이러스 감염, 예컨대 B형 간염 (HBV) 및 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)의 경우, 기존의 치료법은 바이러스 복제를 제어하고, 치료된 환자의 대부분에서 임상 상태를 개선하며, 감소된 사망률 및 이병률을 초래할 수 있다. 그러나, 항바이러스 요법은 치료 중단 후 바이러스혈증의 반동 및 약물 내성 돌연변이의 출현에 의해 방해를 받는다. 대부분의 환자는 평생 치료를 필요로 하며 만성 HBV 또는 HIV 감염의 치료는 거의 이루어지지 않는다.

사이토카인 및 케모카인은 간염 및 HIV를 포함한 광범위한 바이러스 감염에 대한 숙주 방어에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 인터페론-알파 (IFN-α)는 B형 간염 감염의 치료를 위해 승인되었고, 인터페론-감마 (IFN-γ), 인터류킨-12 (IL-12), 인터류킨-23 (IL-23), GM-CSF 및 종양 괴사 인자-알파 (TNF-α)를 포함한 여러 추가 사이토카인은 간염 및 HIV와 같은 바이러스 감염에 대한 숙주 방어 또는 그것의 치료에 연루되었다.

병원체에 대한 예방적 백신접종은 병원체 항원에 대한 면역 반응의 활성화에 필요한 면역 체계 위험 신호 또는 그것의 하류 이펙터를 제공하는, 병원체 및 보조제로부터의 항원 결정기의 제공을 필요로 한다. 기존 감염을 치료하기 위해 의도된 치료용 백신은 존재하는 감염의 병원체 항원 결정기의 숙주 인식에 좌우되고, 또한 위험 신호-매개 면역 활성화를 제공하기 위하여 보조제 또는 그것의 하류 이펙터를 필요로 한다. 일부 경우에, 외인성 병원체-유래 항원의 제공에 의해 치료용 백신을 향상시키는 것이 가능할 수 있다. 선천성 및 적응성 면역 체계 둘 다의 면역 세포는 병원체-관련 분자 패턴 (PAMP)의 형태로 위험을 감지하기 위해 패턴 인식 수용체 (PRR)를 사용한다. PRR의 가장 두드러진 패밀리는 본질적으로 모든 면역 세포 상에서 발견되는 Toll-유사 수용체 (TLR)로 구성된다. 이들 수용체 (TLR 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 및 9)는 박테리아 및 바이러스를 포함한 많은 상이한 유형의 병원체에서 발견되는 생성물에 반응한다. TLR 수용체의 활성화는 면역 세포 기능 및 면역 반응의 간접 및 직접 활성화 둘 다로 이어진다. 직접 활성화는 세포 성숙, 증식 및 분화의 촉진을 통해 발생하는 한편, 간접 활성화는 사이토카인 및 케모카인 분비의 유도를 통해 발생한다. 10번째 TLR (TLR10)은 면역 기능의 음성 조절 이펙터로서 기능할 수 있다.

숙주-매개 항-병원체 면역 반응에서 TLR의 역할로 인해, 감염에 대한 TLR 작용물질 보조제 및 치료제를 생산하기 위해 상당한 노력이 기울여졌다. 광범위한 단일 특이적, 정제된 또는 합성 TLR 작용물질이 제조되었고 전임상 및 임상 환경에서 테스트되었다. TLR 작용물질은 예방적 백신에서 보조제로서 사용된다. 그러나, 비록 항-병원체 활성이 치료용 백신 환경에서 관찰되었지만, 이들 노력은 중요한 문제에 당면했다. 당면한 문제는 효능의 결핍 및 과도한 독성 둘 다를 포함하였고, 이것은 존재하는 감염을 TLR 작용물질로 예방하고, 특히 치료하는 데 추가의 개선이 필요한 것을 시사한다.

최적 면역 방어를 위한 선천성 및 적응성 면역 반응 둘 다의 활성화에 대한 필요성 및 병원체가 다중 TLR 작용물질 및 다른 위험 신호-관련 구성요소를 함유한다는 사실로 인해, 다중-TLR 작용물질 치료 접근법이 항-바이러스 요법을 포함한 최적의 항-감염 요법에 필요한 것으로 고려된다. 그람 음성균은 다중 TLR 작용물질을 함유하고 사이토카인 분비를 포함한 중요한 TLR 작용물질-관련 면역 반응을 유도하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 고수준의 TLR-4 작용물질 리포다당 (LPS) 또는 내독소를 함유하는 야생형 그람 음성균은 정맥내로 투여될 때, 대부분 면역 세포에 의한 과도한 사이토카인 분비의 유도로 인해 매우 독성이다. 그람 음성균은 또한 면역 체계 자극 및 전신적 독성 둘 다에 기여할 수 있는, TLR 1/2, 5 및 9에 대한 작용물질을 함유할 수 있다.

그람 음성균의 LPS-관련 내독소 활성을 감소시키기 위하여, 예컨대 박테리아를 사멸시킬 수 있고, 박테리아를 온전하게 유지할 수 있으며, LPS 수준을 상당히 감소시킬 수 있는 폴리믹신 및 글루타르알데하이드로의 그람 음성균의 치료가 동시에 인간 면역 세포로부터 사이토카인 분비를 유도하는 박테리아의 능력을 증가시킬 수 있다는 것은 본 개시의 놀랍고 예상치 못한 발견이다. 이것은 LPS의 유의한 감소가 또한 비처리 야생형 박테리아에 비해 처리된 박테리아에 노출된 면역 세포에 의해 각각의 다중 사이토카인의 양의 상당한 감소로 이어진 것으로 추정되었기 때문에 적어도 예상하지 못한 것이다.

놀랍게도, 표 1에서 나타낸 것과 같이, 처리된 박테리아는 동일한 농도의 (비처리 및 처리된) 박테리아로 테스트되었을 때, 처리된 박테리아가 비처리 박테리아에서 발견된 LPS 수준의 4.94%만을 가졌다는 사실에도 불구하고, 비처리 야생형 박테리아에 비해 인간 면역 세포에 의해 분비된 9개의 사이토카인 중 8개의 더 높은 수준을 유도하였다. 더불어, LPS의 유의한 감소에도 불구하고, 처리된 박테리아는 단일 특이적 TLR 작용물질보다 더 높은 수준의 사이토카인을 유도하였다 (표 2). 치료로부터의 LPS-관련 내독소 활성의 감소는 비처리 야생형 박테리아와 비교하여 시험관내 리물루스 아메보사이트 용해물 (Limulus Amebocyte Lysate, LAL) 검정에 의해 측정되는 바 약 75%-99%일 수 있고, 독성의 감소를 초래할 수 있다. 임의의 특정 이론에 의해 얽매이기를 바라지는 않지만, 처리된 박테리아 세포의 온전한 구조가 숙주 대상체의 일부 구획으로의 자유로운 LPS의 방출을 방지하거나 또는 최소화하는 것을 도울 수 있는 것으로 고려된다. 결과는 처리된 박테리아가 비처리 박테리아에 비해 감소된 전신적 독성을 나타내면서, 비처리 박테리아 또는 단일 특이적 작용물질보다 더 월등한 면역 반응을 유도할 수 있음을 시사한다.

동물 연구는 이러한 처리된 박테리아가 HBV 및 HIV 기존 바이러스 감염을 모두 억제할 수 있는 것을 추가로 확인하였다. 추가로, 돌봄 표준 (예컨대, HBV의 경우 엔테카비어(entecavir))과 비교할 때, 처리된 박테리아는, 초기 억제 효과가 나타나는 데 더 오래 걸릴 수 있음에도 불구하고, 치료의 중단 후에도 오랫동안 지속 가능하고 상당한 억제 효과를 나타낸다. 또한 흥미롭게도, NSAID (예컨대, 인도메타신(indomethacin)) 단독으로의 치료는 관찰 가능한 항바이러스 효과를 나타내지 못했음에도 불구하고, NSAID와의 조합은 처리된 박테리아의 효능을 상조적으로 증가시킬 수 있다.

따라서, 한 구체예에서, 본 개시는 리포다당 (LPS)-관련 내독소 활성의 적어도 75%의 감소를 초래하기 위한 방식으로 처리된 복수의 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 환자에서 감염을 치료하는 방법을 제공한다.

다른 구체예에서, 본 개시는 리포다당 (LPS)-관련 내독소 활성의 적어도 90%의 감소를 초래하기 위한 방식으로 처리된 복수의 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포 및 병원체-유래 또는 병원체-관련 항원을 포함하는 조성물의 유효량을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 대상체에서 감염을 치료하는 방법을 제공한다.

한 구체예에서, 본 개시는 그것을 필요로 하는 환자에서 감염을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 방법은 리물루스 아메보사이트 용해물 (LAL) 검정에 의해 측정될 때 비처리 야생형 그람 음성균 세포와 비교하여 리포다당 (LPS)-관련 내독소 활성 (활성 LPS)의 약 75% 내지 99%의 감소를 초래하기 위한 방식으로 처리된 복수의 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 수반한다.

일부 구체예에서, 조성물은 환자의 kg 체중당 약 0.01 내지 100 ng의 활성 LPS를 함유한다. 일부 구체예에서, 조성물은 환자의 kg 체중당 약 0.02 내지 20 ng의 활성 LPS를 함유한다. 일부 구체예에서, 조성물은 환자의 kg 체중당 약 0.1 내지 10 ng의 활성 LPS를 함유한다.

일부 구체예에서, 조성물은 1 x 10⁸개 세포당 약 2 내지 200 ng의 활성 LPS를 함유한다. 일부 구체예에서, 조성물은 1 x 10⁸개 세포당 약 10 내지 120 ng의 활성 LPS를 함유한다. 일부 구체예에서, 조성물은 1 x 10⁸개 세포당 약 20 내지 100 ng의 활성 LPS를 함유한다.

일부 구체예에서, 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포는 LPS-관련 내독소의 약 85% 내지 98%의 감소를 초래하기 위한 방식으로 처리되었다. 일부 구체예에서, 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포는 LPS-관련 내독소의 약 90% 내지 98%의 감소를 초래하기 위한 방식으로 처리되었다.

일부 구체예에서, 감염은, 예컨대 표 A로부터 선택된 바이러스에 의한 바이러스 감염이다. 일부 구체예에서, 바이러스 감염은 B형 간염 바이러스 (HBV) 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)에 의한 것이다.

또한, 한 구체예에서, 리물루스 아메보사이트 용해물 (LAL) 검정에 의해 측정될 때 비처리 야생형 그람 음성균 세포와 비교하여 리포다당 (LPS)-관련 내독소 활성의 약 75% 내지 99%의 감소를 초래하기 위한 방식으로 처리된 복수의 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포를 포함하는 제약학적 투여 형태가 제공되며, 여기서 총 LPS-관련 내독소 활성은 약 0.7 ng 내지 7000 ng의 활성 LPS에 동등하며, 바람직하게 약 7 ng 내지 1400 ng의 활성 LPS에 동등하다.

다른 구체예에서, 치료 조성물, 백신, 및 그것들의 투여 형태가 또한 기술된다.

도 1A-1D는 생체내에서 HBV DNA 생성의 억제에 미치는 엔테카비어, 처리된 박테리아 (Decoy bacteria), 또는 그것들의 조합으로의 치료의 효과를 도시한다.
도 2는 엔테카비어가 아니라 디코이 박테리아가 생체내에서 HBeAg 수준을 감소시킨 것을 도시한다.
도 3A-D는 생체내에서 HBV DNA 생성의 억제의 장기간 연구의 결과를 도시한다.
도 4A-D는 생체내에서 HBsAg 발현의 억제 결과를 도시한다.
도 5A-D는 생체내에서 HBeAg 발현의 억제 결과를 도시한다.
도 6은 치료 중단 후 27주 후에 마우스 간에서 인도메타신 및 디코이 박테리아의 조합 (엔테카비어가 있거나 없음)이 HBeAg 발현을 억제하였음을 도시한다.
도 7A-F는 치료 중단 후 27주 후 마우스 간에서의 HBcAg 발현의 면역조직화학 분석을 도시한다.
도 8A-C는 HIV로 감염된 인간화된 마우스에서 표준 돌봄 치료 또는 처리된 박테리아에 의한 HIV 혈중 수준의 억제를 도시한다.

상세한 설명

다음의 설명은 본 기술의 예시적인 구체예를 제시한다. 그러나, 그러한 설명은 본 개시의 범주에 대한 제한으로서 의도되지 않았을뿐만 아니라 대신 예시적인 구체예의 설명으로서 제공된 것이 인지되어야 한다.

본 명세서에서 사용되는 바, 다음의 단어, 문구 및 부호는, 그것들이 사용되는 맥락이 다른 것을 나타내는 정도를 제외하고, 일반적으로 하기 제시된 의미를 가지는 것으로 의도된다.

면역 반응을 자극하기 위한 조성물 및 방법

본 개시의 실험예는 LPS-관련 내독소 활성을 유의하게 감소시키기 위해 처리된 온전한 및 비-생존성 그람 음성균 세포가 놀랍게도 면역 세포로부터 사이토카인 분비를 유도하는 능력을 증가시켰음을 입증한다. 그러므로, 그러한 처리된 박테리아 세포는 대상체의 면역 반응을 자극하기 위한 안전하고 효과적인 수단을 제공하기에 적합하다. 면역 반응은 박테리아, 진균, 기생충 또는 바이러스 감염에 대한 것일 것이다.

그러므로, 본 개시의 한 구체예에 따르면, 그것을 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 그것을 필요로 하는 대상체에서 면역결핍을 치료하는 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 감염의 위험이 있는 대상체를 백신접종하는 방법이 제공된다.

방법은, 일부 구체예에서, 대상체/환자에게 본원에 개시된 복수의 처리된 박테리아 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 투여하는 것을 수반한다. 처리된 박테리아 세포는, 일부 구체예에서, 리포다당 (LPS)-관련 내독소 활성 및/또는 발열원성을 감소시키기 위해 처리된 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포이다.

본원의 방법에 의해 사용될 수 있는 후보 박테리아 유기체는 그람 음성이며 야생형 유기체로서 LPS-관련 내독소 활성을 가지는 것들로부터 유래된다. 용어 "그람 음성균"은 그람 염색으로서 알려져 있는 과정의 일부인 초기 염기성 염료 염색 (예컨대, 크리스탈 바이올렛)을 보유하지 않는 박테리아를 나타낸다. 예시의 그람 염색에서, 세포는 먼저 열에 의해 슬랑이드에 고정되고 그람 음성균 및 그람 양성균 둘 다에 의해 흡수되는 염기성 염료 (예컨대, 크리스탈 바이올렛)로 염색된다. 그런 후 슬라이드는 염기성 염료 (예컨대, 크리스탈 바이올렛)에 결합하여 그것을 세포에 가두는 매염제 (예컨대, 그람 요오드)로 처리된다. 그런 후 세포는 아세톤 또는 알코올로 세척된 후 상이한 색의 제2 염료 (예컨대, 사프라닌(safranin))로 대비염색된다. 그람 양성 유기체는 초기의 바이올렛 염색을 유지하는 한편, 그람 음성 유기체는 세척 용매 유기물에 의해 탈색되고 따라서 대비염색을 나타낸다. 예시의 그람 음성균으로는, 한정하는 것은 아니지만, 대장균(Escherichia) 종, 시겔라(Shigella) 종, 살모넬라(Salmonella) 종, 캄필로박터(Campylobacter) 종, 네이세리아(Neisseria) 종, 해모필루스(Haemophilus) 종, 에로모나스(Aeromonas) 종, 프란시셀라(Francisella) 종, 예르시니아(Yersinia) 종, 클레브시엘라(Klebsiella) 종, 보르데텔라(Bordetella) 종, 레지오넬라(Legionella) 종, 코리네박테리아(Corynebacteria) 종, 시트로박터(Citrobacter) 종, 클라미디아(Chlamydia) 종, 브루셀라(Brucella) 종, 슈도모나스(Pseudomonas) 종, 헬리코박터(Helicobacter) 종 및 비브리오(Vibrio) 종을 들 수 있다.

그람 음성 유기체 내에는 많은 무해한 공생자와 함께, 많은 잘 알려져 있는 병원체, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 대장균(E. coli), 예르시니아 페스티스(Yersinia pestis), 클레브시엘라(Klebsiella) 및 시겔라(Shigella), 프로테우스(Proteus), 엔테로박터(Enterobacter), 세라티아(Serratia), 및 시트로박터(Citrobacter)를 포함하는 큰 과인 장내세균과(Enterobacteriaceae)가 있다. 장내세균과의 구성원은 여러 구성원이 동물의 장에서 살기 때문에 장내세균으로서 언급되었다.

한 구체예에서, 대장균이 유기체로서 선택된다. 고려되는 한 특정 스트레인은 대장균 스트레인 2617-143-312, (Migula) 카스텔라니(Castellani) 및 칼머스(Chalmers) (ATCC^®13070^TM)이다. 사용될 수 있는 가적인 대장균 스트레인으로 MG1655 (ATCC® 47076) 및 KY8284 (ATCC® 21272)를 들 수 있다.

본원의 방법에 사용된 그람 음성 유기체는 유기체의 야생형 형태에 대해 외래인 DNA를 함유하거나 발현하는 재조합 유기체일 필요는 없다. 그러나, 일부 구체예에서, 유기체는 예를 들어, 병원체 항원 또는 면역 자극 단백질을 포함한, 일부 비천연 분자를 발현하도록 변형될 수 있다.

용어 "리포다당" (LPS)은 공유 결합에 의해 연결된 지질 및 다당 (당인지질)으로 이루어지는 큰 분자를 나타낸다. LPS는 3개 부분을 포함한다: 1) O 항원; 2) 코어 올리고당, 및 3) 지질 A. O-항원은 코어 올리고당에 부착된 반복되는 글리칸 중합체이며 LPS 분자의 최외각 도메인을 포함한다. 코어 올리고당은 직접 지질 A에 부착되며 보통 헵토스와 같은 당 및 3-데옥시-D-만노옥툴로손산 (또한 KDO, 케토-데옥시옥툴로소네이트로도 알려짐)을 함유한다. 지질 A는 다중 지방산에 결합된 인산화된 글루코사민 이당이다. 지방산은 LPS를 박테리아 외막에 고정시키고, LPS의 나머지는 세포 표면으로부터 돌출되어 있다.

내독소 활성은 LPS의 지질 A 도메인 부분에 있으며, 따라서 또한 "LPS-관련 내독소 활성"으로도 언급된다. 박테리아 세포가 면역 체계에 의해 용해될 때, LPS 및 지질 A를 함유하는 막의 단편이 순환으로 방출되어 열을 유발하고 (발열원성), 잠재적으로 치명적인 쇼크 (내독성 또는 패혈성 쇼크로 불림)를 유발한다. LPS의 독성은 숙주에 대해 치명적인 결과를 나타낼 수 있는, 종양 괴사 인자-알파 (TNFα) 및 인터류킨-1베타 (IL-1β)를 포함한 전염증성 사이토카인의 분비로 이어지는 과정인 포유류 면역 체계의 세포와의 상호작용을 통해 지질 A에 의해 발현된다.

LPS-관련 내독소 활성은 예를 들어, 투구게로부터의 혈액을 활용하며, LPS의 매우 낮은 수준을 검출할 수 있는 리물루스 아메보사이트 용해물 (LAL) 검정을 포함한, 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있다. 내독소 활성의 존재는 효소 캐스케이드를 통한 증폭으로 인해 리물루스 혈액 용해물의 응고를 초래할 것이다. LAL 검정의 겔 응고, 혼탁도, 및 발색 형태는 상업적으로 이용할 수 있다.

효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)-기반 내독소 활성 검정, 예컨대 독일 뮌헨 지역의 Hyglos로부터의 EndoLISA®이 또한 알려져 있다. 이 검정은 LPS를 포획하기 위하여 고체상에 부착된 LPS 특이적 상 단백질을 사용하며, 세척 단계 후에, LPS의 존재는 LPS에 의해 활성화될 때, 화합물을 절단한 후 형광을 방출하는 재조합 인자 C의 첨가에 의해 측정된다. 리물루스 아메보사이트 용해물에 존재하는 인자 C는 정상적으로 자이모겐으로서 존재하며, LAL 테스트에서 발생하는 응고 캐스케이트의 프라이머이다.

발열원성은 대상체에서 열을 유발하는 작용제의 능력을 나타낸다. 발열원성은 정맥내로 투여된 TLR 작용물질, 유기체 또는 그것의 유도체에 대한 반응으로 토끼에서 직장 온도 증가로서 측정될 수 있다.

그람 음성 유기체의 내독소 활성 및/또는 발열원성을 감소시키기 위해 다양한 방법이 이용 가능하다. 방법은 LPS에 결합하거나 그것의 형성을 방해하는 작용제로의 유기체의 치료를 포함한다.

한 구체예에서, 내독소 활성 또는 발열원성의 감소는 내독소를 비활성화하는 항생물질로 박테리아 유기체를 처리함으로써 이루어진다. 적합한 그러한 항생물질은 폴리믹신 B 또는 폴리믹신 E를 포함한 폴리믹신이다. 치료를 위한 항생물질의 양 및 조건을 결정하는 것은 기술분야의 당업자의 숙련도 내에 있다. 한 구체예에서, 폴리믹신은, 폴리믹신 B이거나 또는 E거나간에, 밀리리터당 대략 3 마이크로그램 내지 5,000 마이크로그램의 농도로 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 폴리믹신의 농도는 밀리리터당 약 200 마이크로그램 내지 5,000 마이크로그램이다. 한 구체예에서, 항생물질은 박테리아에 10분 내지 4시간 또는 약 30분 내지 약 3시간 동안 적용된다.

한 구체예에서, 박테리아는 MgCl₂의 형태의 마그네슘 (Mg)의 존재 하에 성장한다. 한 구체예에서, 박테리아는 MgCl₂의 존재 하에서뿐만 아니라, 박테리아의 무결성을 유지하기에 적합한 온도에서 폴리믹신으로 처리된다. 한 구체예에서, 성장 배지 중의 MgCl₂의 농도는 약 0.5 mM 내지 약 5.0 mM, 또는 약 2 mM이고, 치료 배지 중의 MgCl₂의 농도는 약 5.0 mM 내지 약 30 mM, 또는 약 20 mM이다. 한 구체예에서, 치료 배지의 온도는 약 2℃ 내지 약 10℃, 또는 약 4℃이다. 박테리아 무결성은 3,000 x g에서 10분 동안 원심분리된 후 잘 규정된 펠릿에서의 회복 효율에 의해, 및 전자 형미경 또는 그람 염색을 포함한 광학 현미경에 의해 측정된다. 바람직한 구체예에서, 치료 및 세척 후의 박테리아 회복은 약 80%보다 크고 박테리아는 광학 또는 전자 현미경에 의해 온전한 것으로 나타난다.

다른 구체예에서, 내독소 활성의 감소는 KDO2-지질 IV_A의 생합성을 방해하는 것으로 알려져 있는 항생물질로 박테리아 유기체를 처리함으로써 이루어진다. 예를 들어, Goldman et al., J Bacteriol. 170(5):2185-91, 1988에는 항박테리아제 III을 포함한 항박테리아제가 기술되는데, 그것은 CTP:CMP-3-데옥시-D-만노옥툴로소네이트 시티딜릴트랜스퍼라제 활성을 특이적으로 억제하며 3-데옥시-D-만노옥툴로소네이트 (KDO)의 그람 음성 유기체의 LPS로의 통합을 차단하는 데 유용하다. LPS 합성이 중단되면, 박테리아 성장도 중단된다. KDO의 LPS 전구체 종 지질 IV_A에의 첨가는 살모넬라 타이피뮤리움(S. typhimurium) 및 대장균 둘 다에서 지질 A-KDO 형성의 주요 경로이다. 한 구체예에서, 항생물질은 항박테리아제 III이고 그람 음성균은 적합한 양, 예컨대, 예를 들어 밀리리터당 5 마이크로그램 내지 밀리리터당 500 마이크로그램으로 적합한 시간, 예를 들어 2 내지 8시간 동안 처리된다.

마찬가지로, 화합물 알파-C-(1,5-안하이드로-7-아미노-2,7-다이데옥시-D-만노헵토피라노실)-카르복실레이트가 LPS에의 통합을 위해 3-데옥시-D-만노옥툴로소네이트 (KDO)를 활성화하는 세포질 효소인 3-데옥시-D-만노옥툴로소네이트 시티딜릴트랜스퍼라제 (CMP-KDO 합성효소)를 억제하는 것으로 알려져 있다 (Nature. 1987 10-16;329(6135):162-4). 그러므로, 유기체의 화합물로의 치료 또한 LPS-관련 내독소 활성을 감소시킬 수 있다.

다른 구체예에서, 내독소 활성의 감소는 LPS 억제제로 유기체를 처리함으로써 이루어진다. 예를 들어, 박테리아 고리형 리포펩타이드인 서팩틴(surfactin)은 지질 A에 결합하여 그것의 활성을 억제하는 것으로 나타났다 (J Antibiot 2006 59(1):35-43).

LPS-관련 내독소 외에, 외막 단백질, 핌브리아(fimbriae), 섬모, 리포펩타이드, 및 리포단백질을 포함한 그람 음성 유기체의 다양한 다른 구성요소는 발열원성 및 패혈성 쇼크를 유도하거나 그것에 기여할 수 있다 (Jones, M., Int. J. Pharm. Compd., 5(4):259-263, 2001에서 검토됨). 발열원성은 잠정적인 발열원의 정맥내 투여 후에 직장 온도의 평가를 포함하는, 기술분야에 잘 알려져 있는 토끼 방법에 의해 측정될 수 있다.

폴리믹신　B와 글루타르알데하이드의 조합으로의 그람 음성 유기체의 치료는 토끼에서 측정되는 바, 발열원성의 30배 감소를 유발한 것으로 나타났다. 한 구체예에서, 밀리리터당 1,000 마이크로그램 (μg/mL)의 폴리믹신 B 및 1% 글루타르알데하이드가 토기에서 측정되는 바, 발열원성의 30배 감소를 생성하기 위해 사용되었다. 발열원성은 LPS와의 폴리믹신 B 반응 및 LPS 및 기타 박테리아 구성요소와의 글루타르알데하이드 반응성의 조합에 의해 감소된다. 글루타르알데하이드는 또한 박테리아를 사멸함으로써 이 환경에서 이중 역할을 수행한다.

그러므로, 한 구체예에서 상기 박테리아를 1,000 μg/mL의 폴리믹신 B와 1% 글루타르알데하이드의 조합으로 처리함으로써 내독소 활성 및 발열원성을 감소시키고 그람 음성균 미생물을 사멸시키는 방법이 제공된다. 다른 구체예에서, 그람 음성균은 약 3 μg/mL 내지 약 1,000 μg/mL의 용량 범위의 폴리믹신 B 및 및 약 0.1% 내지 약 1.0%의 용량 범위의 글루타르알데하이드의 조합으로 처리된다. 추가의 구체예에서, 폴리믹신 B의 용량 범위는 약 100 μg/mL 내지 약 1,000 μg/mL이고 글루타르알데하이드는 약 0.5% 내지 약 1.0%의 용량 범위에 있다. 추가적으로, 그람 음성균은, 예를 들어 약 1,000 μg/mL 내지 약 3,000 μg/mL의 용량 범위의 폴리믹신 B 및 약 0.5% 내지 약 1.0%의 용량 범위의 글루타르알데하이드로 처리될 수 있다. 다른 측면으로, 그람 음성균은, 예를 들어 약 3,000 μg/mL 내지 약 5,000 μg/mL의 용량 범위의 폴리믹신 B 및 약 0.5% 내지 약 2.0%의 용량 범위의 글루타르알데하이드로 처리될 수 있다.

일부 구체예에서, 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포는 비처리 야생형 박테리아와 비교하여 LPS-관련 내독소 활성의 적어도 약 70% 감소를 나타낸다 (예컨대, LAL 검정에 의해 측정됨). 일부 구체예에서, 감소는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.95% 또는 99.98%이다. 일부 구체예에서, 감소는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.95%, 99.98% 또는 99.99%보다 크지 않다. 일부 구체예에서, 감소는 제한 없이, 약 70% 내지 약 99.99%, 약 80% 내지 약 99.99%, 약 90% 내지 약 99.5% 또는 99%, 약 91% 내지 약 99%, 약 92% 내지 약 98%, 약 93% 내지 약 97%, 약 94% 내지 약 96%, 약 94.5% 내지 약 95.5%, 약 94% 내지 약 97%, 약 95% 내지 약 98%, 약 96% 내지 약 99%, 약 97% 내지 약 99.5%, 또는 약 98% 내지 약 99.9%이다.

일부 구체예에서, 특정 잔류 활성 LPS 수준이 바람직하다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 본 개시의 조성물에, 1 x 10⁸개 세포당 약 1 내지 200 ng의 활성 LPS가 있다. 일부 구체예에서, 1 x 10⁸개 세포당 약 10 내지 120 ng, 약 20 내지 100 ng, 약 20 내지 50 ng, 약 10 내지 50 ng의 활성 LPS가 있다.

일부 구체예에서, 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포는 비처리 야생형 박테리아와 비교하여 발열원성의 적어도 약 70% 감소를 나타낸다 (예컨대, 생체내 토끼 검정에 의해 측정됨). 일부 구체예에서, 감소는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.95% 또는 99.98%이다. 일부 구체예에서, 감소는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.95%, 99.98% 또는 99.99%보다 크지 않다. 일부 구체예에서, 감소는 제한 없이, 약 70% 내지 약 99.99%, 약 80% 내지 약 99.99%, 약 90% 내지 약 99.5% 또는 99%, 약 91% 내지 약 99%, 약 92% 내지 약 98%, 약 93% 내지 약 97%, 약 94% 내지 약 96%, 약 94.5% 내지 약 95.5%, 약 94% 내지 약 97%, 약 95% 내지 약 98%, 약 96% 내지 약 99%, 약 97% 내지 약 99.5%, 또는 약 98% 내지 약 99.9%이다.

상기에서 제공되는 바, LPS-관련 내독소 외에, 그람 음성 유기체의 다양한 다른 구성요소, 예컨대 외막 단백질, 핌브리아, 섬모, 리포펩타이드, 및 리포단백질은 또한 발열원성을 유도하거나 또는 그것에 기여할 수 있다. 일부 구체예에서, 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포는 발열원성의 감소가 LPS-관련 내독소 활성의 감소 및 비-LPS-관련 발열원성의 감소 둘 다에 의해, 예컨대 외막 단백질, 핌브리아, 섬모, 리포펩타이드, 또는 리포단백질의 비활성화, 제거 또는 차단에 의해 이루어지도록 하는 방식으로 처리된다. 일부 구체예에서, 비-LPS-관련 발열원성의 감소는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.95% 또는 99.98%이다. 일부 구체예에서, 감소는 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.95%, 99.98% 또는 99.99%보다 크지 않다.

개시의 방법에 따르는 투여를 위한 박테리아는 투여 전에 또는 투여시에 비-생존성 또는 실질적으로 비-생존성이 된다. "비-생존성"이란 유기체가 외인성 작용제로의 치료에 의해 사멸되거나, 및/또는 포유류 숙주에서 유기체가 생존하지 못하는 무능력을 초래하는 돌연변이를 함유한 것을 의미한다. 실질적으로 비-생존성 박테리아는 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상만큼 감소된 그것의 생존성을 가지는 스트레인이다.

박테리아는 폴리믹신과 같은 화합물로 처리함으로써 비-생존성이 될 수 있다. 폴리믹신은 LPS에 결합하여 박테리아가 분할함에 따라 막 통합성을 간섭하며, 이때 생존성은 세포 엔벨로프의 투과화의 결과로서 감소된다. 만약 생존성이 이 방법에 의해 감소되면, 세포 용해를 방지하고 세포를 온전하게 유지하기 위한 단계들이 수행될 필요가 있다. 다른 접근법은 성장 중에 억제되는 LPS 생합성 경로에 조건부 돌연변이를 가진 박테리아 스트레인을 성장시키고 그런 후 돌연변이를 활성화하고 LPS 생합성을 방해하는 비허용 조건으로 전달하는 것이다. 각각의 경우에, 적용된 과정은 각 환경에서 최적의 치료 시간 또는 화합물 용량을 결정함으로써, 생존성이 상당한 박테리아 세포 통합성이 보유되면서 실질적으로 상실되도록 박테리아를 비생존성이 되게 하는 것이다. 비생존성이 100% 미만인 경우에, 포유류 숙주에서 생존할 수 있는 박테리아의 추가의 증식을 방지하는 돌연변이를 함유하는 박테리아가 사용될 수 있다 (예컨대 Bukhari and Taylor, J. Bacteriol. 105(3):844-854, 1971 및 Curtiss et al., Immunol. Invest. 18(1-4):583-596, 1989에서 기술된 것과 같은 다이아미노피멜산 자가영양성).

질환 및 상태

본원에 개시된 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포는 대상체의 면역 체계의 강화에 유용하며, 그로써 개선된 면역 반응을 통해 질환 및 상태를 예방 또는 치료하는 데 유용하다. 본원에 개시된 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포는 또한 그러한 질환 또는 상태가 발병할 위험이 있는 대상체를 위한 백신 또는 면역학적 보조제로서 사용될 수 있다.

"치료" 또는 "치료하는"은 임상 결과를 포함한 유익한 또는 원하는 결과를 얻기 위한 접근법이다. 유익한 또는 원하는 임상 결과는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: a) 질환 또는 상태의 억제 (예컨대, 질환 또는 상태로부터 초래되는 하나 이상의 증상의 감소, 및/또는 질환 또는 상태의 정도의 감소); b) 질환 또는 상태와 관련된 하나 이상의 임상 증상의 발달의 둔화 또는 정지 (예컨대, 질환 또는 상태의 안정화, 질환 또는 상태의 악화 또는 진행의 방지 또는 지연, 및/또는 질환 또는 상태의 확산 (예컨대, 전이)의 방지 또는 지연; 및/또는 c) 질환의 완화, 즉, 임상 증상의 퇴행의 유발 (예컨대, 질환 상태의 개선, 질환 또는 상태의 부분적 또는 전체적인 차도의 제공, 또 다른 의약품의 향상 효과, 질환의 진행의 지연, 삶의 질의 증가, 및/또는 생존 연장).

"예방" 또는 "예방하는"은 질환 또는 상태의 임상 증상이 발생하지 않는 것을 유발하는 질환 또는 상태의 임의의 치료를 의미한다. 박테리아 세포는, 일부 구체예에서, 질환 또는 상태가 발병할 위험이 있거나 가족력이 있는 대상체 (인간을 포함함)에게 투여될 수 있다.

"대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 또는 대상이 될 동물, 예컨대 포유류 (인간을 포함함)를 나타낸다. 본원에 기술된 방법은 인간 치료법 및/또는 수의학적 적용에 유용할 수 있다. 일부 구체예에서, 대상체는 포유류, 예컨대 인간, 개, 고양이, 소, 양, 등이다. 한 구체예에서, 대상체는 인간이다.

일부 구체예에서, 치료될 질환 또는 상태는 감염성 질환이다. 일부 구체예에서, 감염은 박테리아, 진균, 기생충 또는 바이러스에 의해 유발된다. 특히, 본원에 개시된 박테리아 세포는 바이러스 감염, 예컨대 표 A에 열거된 바이러스들에 의해 유발된 감염을, 선택적으로 이차 항-감염제로 치료하기에 특유하게 적합할 수 있다.

일부 구체예에서, 치료되는 질환은 HBV 감염이다. 일부 구체예에서, 치료되는 감염은 HIV 감염이다.

투약 및 타이밍

일부 구체예에서, 대상체에 투여된 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포의 LPS-관련 내독소 활성의 수준이 측정될 수 있다. 한 구체예에서, 투여된 조성물은 대상체의 kg 체중당 약 0.01 내지 200 ng의 활성 LPS를 함유한다.

용어 "활성 LPS"는 예컨대, LAL 검정에 의해 측정되는 바, LPS-관련 내독소 활성을 나타낼 수 있는 조성물 중의 LPS를 나타내며, 5-9 내독소 단위 (EU)가 표준 LPS 조제물을 토대로 1 ng의 활성 LPS와 동등한 것으로 여겨진다. 조성물 중의 활성 LPS의 양은 조성물과 동일한 수준의 LPS-관련 내독소 활성을 나타낼 수 있는 억제되지 않은 LPS의 중량으로서 기술될 수 있다.

일부 구체예에서, 투여된 조성물 (예컨대, 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포의 LPS-관련 내독소 활성을 함유하는 조성물)은 대상체의 kg 체중당 약 0.01 내지 150 ng의 활성 LPS를 함유한다. 일부 구체예에서, 투여된 조성물은 대상체의 kg 체중당 약 0.02 내지 150 ng, 약 0.02 내지 100 ng, 약 0.05 내지 100 ng, 약 0.05 내지 100 ng, 약 0.05 내지 50 ng, 약 0.05 내지 20 ng, 약 0.1 내지 20 ng, 약 0.1 내지 10 ng, 약 0.1 내지 5 ng, 약 0.2 내지 100 ng, 약 0.2 내지 50 ng, 약 0.2 내지 20 ng, 약 0.2 내지 10 ng, 약 0.2 내지 5 ng, 약 0.3 내지 90 ng, 약 0.4 내지 80 ng, 약 0.5 내지 70 ng, 약 0.6 내지 60 ng, 약 0.7 내지 50 ng, 약 0.8 내지 40 ng, 약 0.9 내지 30 ng, 약 1 내지 20 ng, 약 2 내지 15 ng, 또는 약 3 내지 12 ng의 활성 LPS를 함유한다.

대상체에게 투여된 활성 LPS의 양은 대상체 및 질환의 유형에 따라 달라질 수 있다. 특정 동물, 예컨대 마우스, 래트 및 개는 더 많은 양 (예컨대, 인간 및 토끼와 비교하여 250-500배)의 활성 LPS의 장점을 가질 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 투여된 조성물은 대상체의 kg 체중당 약 10 내지 100,000 ng의 활성 LPS를 함유한다. 일부 구체예에서, 투여된 조성물은 대상체의 kg 체중당 약 20 내지 50,000 ng, 약 30 내지 40,000 ng, 약 40 내지 30,000 ng, 약 50 내지 20,000 ng, 약 0.7 내지 10,000 ng, 약 80 내지 8,000 ng, 약 90 내지 7,000 ng, 약 100 내지 6,000 ng, 약 200 내지 5,000 ng, 또는 약 500 내지 5000 ng의 활성 LPS를 함유한다.

대상체에게 투여된 박테리아 세포의 수는 필요한 활성 LPS의 양 및 박테리아 세포의 내독소 활성 수준을 토대로 측정될 수 있다. 수는 또한 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식단, 투여 시기, 투여 경로, 및 배설 속도, 약물 조합 및 치료가 진행 중인 대상체의 특정 질환의 중증도를 포함한 다양한 인자에 따라 좌우될 수 있다. 예를 들어, 투여량은 대상체 체중의 킬로그램당 본원에 기술된 박테리아 세포의 수로서 표시될 수 있다 (mg/kg). 약 10,000 내지 100,000,000개 세포/kg의 투여량이 적절할 수 있다. 일부 구체예에서, 약 100,000 내지 10,000,000개 세포/kg이 적절할 수 있다. 다른 구체예에서 1,000,000 내지 5,000,000개 세포/kg의 투여량이 적절할 수 있다. 표준화는 또한 제곱 미터 (m²)로 표시된 체표면적을 토대로 이루어질 수 있다. 일부 구체예에서, 약 10,000 내지 100,000,000개 세포/m²의 투여량이 적절할 수 있다. 일부 구체예에서, 약 100,000 내지 10,000,000개 세포/m²가 적절할 수 있다. 다른 구체예에서 1,000,000 내지 5,000,000개 세포/ m²의 투여량이 적절할 수 있다. 대상체의 체중에 대한 표준화는 예컨대 아동 및 성인 인간 둘 다에서 약물을 사용할 때 또는 개와 같은 비인간 대상체에서의 유효 투여량을 인간 대상체에 적합한 투여량으로 전환할 때 발생하는, 광범위하게 다른 크기의 대상체간 투여량을 조정할 때 특히 유용하다.

박테리아 세포는 일반적으로 질환 또는 상태가 진단된 후에 투여된다. 일부 구체예에서, 투여는 감염 후 24시간 내에, 또는 감염 후 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 내에 시작된다. 일부 구체예에서, 투여는 감염 후 적어도 24시간 후에, 또는 감염 후 적어도 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 후에 시작된다. 일부 구체예에서, 투여는 감염 전 또는 후의 임의의 시점에서 시작되고 필요에 따라 수행될 수 있다.

투여는 또한 실제 감염 전에, 또는 감염이 진단되기 전에, 예방적인 백신 또는 예방으로서 시작될 수 있다.

병용 요법

한 구체예에서, 본원에 개시된 박테리아 세포는 감염을 치료하기 위해 사용되는 및/또는 개발된 하나 이상의 추가 치료제와 함께 사용될 수 있다.

일부 구체예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 사이클로옥시게나제 (COX) 효소의 억제제, 예컨대 NSAIDS, 이를테면 6MNA, 아스피린, 카르프로펜(carprofen), 다이클로페낙(diclofenac), 페노프로펜(fenoprofen), 플루페나메이트(flufenamate), 플루비크로펜(flubiprofen), 이부프로펜(ibuprofen), 인도메타신, 케토프로펜(ketoprofen), 케토롤락(ketorolac), 메클로페나메이트(meclofenamate), 메페남산(mefenamic acid), 나프록센(naproxen), 니플룸산(niflumic acid), 피록시캄(piroxicam), 술린닥 설파이드(sulindac sulphide), 수프로펜(suprofen), 테니답(tenidap), 톨메틴(tolmetin), 토목시프롤(tomoxiprol), 조메피락(zomepirac), 셀렉소십(celexocib), 에토돌락(etodolac), 멜록시캄(meloxicam), 니메술라이드(nimesulide), 다이아이소프로필 플루오로포스페이트, L745,337, NS398, 로페콕십(rofecoxib), SC58125, S-아미노살리실산, 암피론(ampyrone), 다이플루니살(diflunisal), 나부메톤(nabumetone), 파라세타몰(paracetamol), 레스베라트롤(resveratrol), 살리신(salicin), 살리실알데하이드, 살리실산 나트륨, 술파살라진(sulfasalazine), 술린닥(sulindac), 타목시펜(tamoxifen), 티클로피딘(ticlopidine), 및 발레릴 살리실레이트일수 있다.

일부 구체예에서, 하나 이상의 추가 치료제는 CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR 및 ICOS와 같은 자극 면역 체크포인트의 작용물질, 또는 A2AR, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, TIM-3, 및 VISTA와 같은 억제 면역 체크포인트의 길항물질일 수 있다.

하나 이상의 추가 치료제의 비제한적인 예로는 또한 아바카비어(abacavir), 아시클로비어(acyclovir), 아데포비어(adefovir), 아만타딘(amantadine), 암프레나비어(amprenavir), 암플리겐(ampligen), 아르비돌(arbidol), 아타자나비어(atazanavir), 아트리플라(atripla), 발라비어(balavir), 시도포비어(cidofovir), 콤비비어(combivir), 돌루테그라비어(dolutegravir), 다루나비어(darunavir), 델라비르딘(delavirdine), 다이다노신(didanosine), 도코사놀(docosanol), 에독수딘(edoxudine), 에파비렌즈(efavirenz), 엠트리시타빈(emtricitabine), 엔푸비르티드(enfuvirtide), 엔테카비어, 에콜리에버(ecoliever), 팜시클로비어(famciclovir), 포미비르센(fomivirsen), 포삼프레나비어(fosamprenavir), 포스카르넷(foscarnet), 포스포넷(fosfonet), 간시클로비어(ganciclovir), 이바시타빈(ibacitabine), 이무노비어(imunovir), 이독수리딘(idoxuridine), 이미퀴모드(imiquimod), 인디나비어(indinavir), 이노신, 인테그라제 억제제, 인터페론 유형 III, 인터페론 유형 II, 인터페론 유형 I, 인터페론, 라미부딘(lamivudine), 로피나비어(lopinavir), 로비리드(loviride), 마라비록(maraviroc), 모록시딘(moroxydine), 메티사존(methisazone), 넬피나비어(nelfinavir), 네비라핀(nevirapine), 넥사비어(nexavir), 니타족사니드(nitazoxanide), 뉴클레오사이드 유사체, 노르비어(norvir), 오셀타미비어(oseltamivir (Tamiflu^®)), 페그인터페론 알파-2a, 펜시클로비어(penciclovir), 페라미비어(peramivir), 플레코나릴(pleconaril), 포도필로톡신(podophyllotoxin), 프로테아제 억제제, 랄테그라비어(raltegravir), 리바비린(ribavirin), 리만타딘(rimantadine), 리토나비어(ritonavir), 피라미딘(pyramidine), 사퀴나비어(saquinavir), 소포스부비어(sofosbuvir), 스타부딘(stavudine), 텔라프레비어(telaprevir), 테노포비어(tenofovir), 테노포비어 다이소프록실(tenofovir disoproxil), 티프라나비어(tipranavir), 트라이플루리딘(trifluridine), 트라이지비어(trizivir), 트로만타딘(tromantadine), 트루바다(truvada), 발라시클로비어(valaciclovir), 발간시클로비어(valganciclovir), 비크리비록(vicriviroc), 비다라빈(vidarabine), 비라미딘(viramidine), 잘시타빈(zalcitabine), 자나미비어(zanamivir), 및 지도부딘(zidovudine)을 들 수 있다.

한 구체예에서, 추가 치료제는 인터페론 알파이다.

일부 구체예에서, 그람 음성 유기체는 예를 들어, 바이러스-특이적 항원 또는 면역 체계 자극 단백질과 같은 비박테리아 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하다. 일부 구체예에서, 그람 음성 유기체는 그람 양성 유기체 또는 다른 병원체를 포함한 동일하거나 상이한 박테리아 유기체로부터 유래될 수 있는 박테리아 항원을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본원에서 사용되는 바, 항원은 항체 또는 면역 세포에 의한 면역 반응에 의해 인식될 수 있는 임의의 분자이다.

제약학적 조성물, 투여 형태 및 투여 방식

본 개시에서 질환 또는 상태의 치료에 적합한 다양한 조성물이 기술되었다. 한 구체예에서, 리물루스 아메보사이트 용해물 (LAL) 검정에 의해 측정될 때 비처리 야생형 그람 음성균 세포와 비교하여 리포다당 (LPS)-관련 내독소 활성의 약 90% 내지 99%의 감소를 초래하기 위한 방식으로 처리된 복수의 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포를 포함하는 조성물 또는 투여 형태가 제공되며, 총 LPS-관련 내독소 활성은 약 0.7 ng 내지 7,000 ng 활성 LPS, 약 7 ng 내지 7,000 ng 활성 LPS, 약 7 ng 내지 1400 ng 활성 LPS, 또는 약 70 ng 내지 1400 ng 활성 LPS와 동등하다.

조성물은 보조제 또는 생물학적 반응 조절제로서 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 바 용어 "보조제" 및 "생물학적 반응 조절제"는 항원에 대한 면역 반응을 향상시키는 임의의 물질을 나타낸다. 그러므로, 보조제 또는 생물학적 반응 조절제는 면역 체계를 외래 항원 또는 질환-유발 또는 질환-관련 유기체에 대해 보다 더 활발하게 반응하도록 자극하기 위해 사용된다. 그러나, 일부 구체예에서, 예컨대 바이러스 단백질 또는 사이토카인 또는 케모카인과 같은 인간 면역 활성화 단백질을 발현하는 그람 음성균의 재조합 형태가 개시된 방법에 사용하기 위해 고려된다. 대체 구체예에서, 사이토카인 또는 케모카인과 같은 정제된 면역 활성화 단백질은 투여 전에 그람 음성 유기체와 혼합되거나, 또는 그람 음성 유기체 전 또는 후에 투여된다.

일부 구체예에서, 투여 형태 중의 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포는 비처리 야생형 박테리아와 비교하여 LPS-관련 내독소 활성 (예컨대, LAL 검정에 의해 측정됨)의 적어도 약 70% 감소를 나타낸다. 일부 구체예에서, 감소는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.95% 또는 99.98%이다. 일부 구체예에서, 감소는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.95%, 99.98% 또는 99.99%보다 크지 않다. 일부 구체예에서, 감소는, 제한 없이, 약 70% 내지 약 99.99%, 약 80% 내지 약 99.99%, 약 90% 내지 약 99.5% 또는 99%, 약 91% 내지 약 99%, 약 92% 내지 약 98%, 약 93% 내지 약 97%, 약 94% 내지 약 96%, 약 94.5% 내지 약 95.5%, 약 94% 내지 약 97%, 약 95% 내지 약 98%, 약 96% 내지 약 99%, 약 97% 내지 약 99.5%, 또는 약 98% 내지 약 99.9%이다.

일부 구체예에서, 투여 형태 중의 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포는 비처리 야생형 박테리아와 비교하여 발열원성 (예컨대, 생체내 토끼 검정에 의해 측정됨)의 적어도 약 70% 감소를 나타낸다. 일부 구체예에서, 감소는 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.95% 또는 99.98%이다. 일부 구체예에서, 감소는 약 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.95%, 99.98% 또는 99.99%보다 크지 않다. 일부 구체예에서, 감소는, 제한 없이, 약 70% 내지 약 99.99%, 약 80% 내지 약 99.99%, 약 90% 내지 약 99.5% 또는 99%, 약 91% 내지 약 99%, 약 92% 내지 약 98%, 약 93% 내지 약 97%, 약 94% 내지 약 96%, 약 94.5% 내지 약 95.5%, 약 94% 내지 약 97%, 약 95% 내지 약 98%, 약 96% 내지 약 99%, 약 97% 내지 약 99.5%, 또는 약 98% 내지 약 99.9%이다.

일부 구체예에서, 비-LPS-관련 발열원성의 감소는 적어도 약 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.95% 또는 99.98%이다. 일부 구체예에서, 감소는 약 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 99.9%, 99.95%, 99.98% 또는 99.99%보다 크지 않다.

일부 구체예에서, 실질적으로 비-생존성 박테리아는 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상만큼 감소된 생존력을 가진다.

일부 구체예에서, 투여 형태는 약 10,000 내지 약 1x10¹⁰개의 그러한 박테리아 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 투여 형태는 약 100,000 내지 약 1x10⁸개의 그러한 박테리아 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 투여 형태는 약 1000,000 내지 약 1x10⁷개의 그러한 박테리아 세포를 포함한다. 일부 구체예에서, 투여 형태는 약 1x10⁶ 내지 약 1x10⁸개의 그러한 박테리아 세포를 포함한다.

일부 구체예에서, 조성물은 추가로 제2 치료제/항바이러스제를 포함한다. 일부 구체예에서, 제2 치료제는 NSAID (비-스테로이드성 항-염증 약물)이다. 일부 구체예에서, 제2 치료제는 바람직하게 6MNA, 아스피린, 카르프로펜, 다이클로페낙, 페노프로펜, 플루페나메이트, 플루비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 나프록센, 니플룸산, 피록시캄, 술린닥 설파이드, 수프로펜, 테니답, 톨메틴, 토목시프롤, 조메피락, 셀렉소십, 에토돌락, 멜록시캄, 니메술라이드, 다이아이소프로필 플루오로포스페이트, L745,337, NS398, 로페콕십, SC58125, S-아미노살리실산, 암피론, 다이플루니살, 나부메톤, 파라세타몰, 레스베라트롤, 살리신, 살리실알데하이드, 살리실산 나트륨, 술파살라진, 술린닥, 타목시펜, 티클로피딘, 발레릴 살리실레이트 및 그것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 사이클로옥시게나제 억제제이다.

일부 구체예에서, 제2 치료제는 바람직하게 CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR 및 ICOS로 이루어지는 군으로부터 선택된 자극 면역 체크포인트의 작용물질이다. 일부 구체예에서, 제2 치료제는 바람직하게 A2AR, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, TIM-3, 및 VISTA로 이루어지는 군으로부터 선택된 억제 면역 체크포인트의 길항물질이다.

일부 구체예에서, 제2 치료제는 아바카비어, 아시클로비어, 아데포비어, 아만타딘, 암프레나비어, 암플리겐, 아르비돌, 아타자나비어, 아트리플라, 발라비어, 시도포비어, 콤비비어, 돌루테그라비어, 다루나비어, 델라비르딘, 다이다노신, 도코사놀, 에독수딘, 에파비렌즈, 엠트리시타빈, 엔푸비르티드, 엔테카비어, 에콜리에버, 팜시클로비어, 포미비르센, 포삼프레나비어, 포스카르넷, 포스포넷, 간시클로비어, 이바시타빈, 이무노비어, 이독수리딘, 이미퀴모드, 인디나비어, 이노신, 인테그라제 억제제, 인터페론 유형 III, 인터페론 유형 II, 인터페론 유형 I, 인터페론, 라미부딘, 로피나비어, 로비리드, 마라비록, 모록시딘, 메티사존, 넬피나비어, 네비라핀, 넥사비어, 니타족사니드, 뉴클레오사이드 유사체, 노르비어, 오셀타미비어 (Tamiflu^®), 페그인터페론 알파-2a, 펜시클로비어, 페라미비어, 플레코나릴, 포도필로톡신, 프로테아제 억제제, 랄테그라비어, 리바비린, 리만타딘, 리토나비어, 피라미딘, 사퀴나비어, 소포스부비어, 스타부딘, 텔라프레비어, 테노포비어, 테노포비어 다이소프록실, 티프라나비어, 트라이플루리딘, 트라이지비어, 트로만타딘, 트루바다, 발라시클로비어, 발간시클로비어, 비크리비록, 비다라빈, 비라미딘, 잘시타빈, 자나미비어, 지도부딘 및 그것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

일부 구체예에서, 제2 치료제는 인터페론 알파이다.

본원에 기술된 조성물은 본원에 기술된 방법에 사용하기 위해 다양한 방식으로 제제화될 수 있다. 한 구체예에서, 조성물은 전체에 걸쳐 기술된 유기체 및 제약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.

"제약학적으로 허용되는 담체"는 조성물에 사용될 수 있는 임의의 희석제, 부형제, 또는 담체를 나타낸다. 제약학적으로 허용되는 담체로는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예컨대 인간 혈청 알부민, 완충 물질, 예컨대 포스페이트, 글리신, 소르브산, 소르브산 칼륨, 포화된 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예컨대 황산 마그네슘, 황산 프로타민, 인산 수소 이나트륨, 인산 수소 칼륨, 염화 나트륨, 아연 염, 콜로이드성 실리카, 마그네슘 트라이실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-블럭 중합체, 폴리에틸렌 글리콜, 한랭보존제, 예컨대 트레할로스 및 만니톨 및 양모 지방을 들 수 있다. 적합한 제약학적 담체는 이 분야의 표준 참고 교재인 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company에 기술되어 있다.

조성물은 포유류, 바람직하게는 인간에게 제약학적 투여를 위해 제제화된다. 발명의 그러한 제약학적 조성물은 비경구를 포함한 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "비경구"는 피하, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 척추강내, 간내, 병변내 및 두개내 주사 또는 주입 기법을 포함한다.

조성물의 멸균된 적합한 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수 있다. 이들 현탁액은 기술분야에 알려져 있는 기법에 따라 적합한 분산 또는 습윤제 및 현탁제를 사용하여 제제화될 수 있다. 멸균된 주사 가능한 조제물은 또한 무독성 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 용매 중의 멸균된 주사 가능한 용액 또는 현탁액, 예를 들어 1,3-부탄다이올 중의 용액일 수 있다. 사용될 수 있는 허용되는 비히클 및 용매 중에 물, 링거액 및 등장성 염화 나트륨 용액이 있다. 더불어, 멸균된, 고정 오일이 용매 또는 현탁 배지로서 관례적으로 사용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 다이글리세라이드를 포함한 임의의 완화성 고정 오일이 사용될 수 있다. 지방산, 예컨대 올레산 및 그것의 글리세라이드 유도체가, 특히 그것들의 폴리옥시에틸화된 버전의 올리브유 또는 캐스터유와 같은 천연 제약학적으로 허용되는 오일과 같이 주사제의 제조에 유용하다. 이들 오일 용액 또는 현탁액은 또한 장쇄 알코올 희석제 또는 분산제, 예컨대 카르복시메틸 셀룰로스 또는 에멀션 및 현탁액을 포함한 제약학적으로 허용되는 투여 형태의 제제화에 일반적으로 사용되는 유사한 분산제를 함유할 수 있다. 다른 일반적으로 사용되는 계면활성제, 예컨대, Tween, Span 및 기타 유화제 또는 제약학적으로 허용되는 고체, 액체, 또는 다른 투여 형태의 제조에 일반적으로 사용되는 생체이용률 향상제가 또한 제제의 목적에 대해 사용될 수 있다. 조성물은 대용량 주사에 의한 것과 같은 주사 또는 연속 주입에 의한 비경구 투여를 위해 제제화될 수 있다.

제약학적 조성물은 단일 또는 다중 용량으로 투여될 수 있다. 제약학적 조성물은 예를 들어, 직장, 볼, 비강내 및 경피 경로를 포함한 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 제약학적 조성물은 관절내 주사에 의해, 정맥내로, 복강내로, 비경구적으로, 근육내로, 또는 피하로 투여될 수 있다.

한 가지 투여 방식은 예를 들어 주사에 의한 비경구이다. 본원에 기술된 제약학적 조성물이 주사에 의한 투여를 위해 혼입될 수 있는 형태로, 예를 들어, 참깨 기름, 옥수수유, 면실유, 또는 땅콩 기름, 뿐만 아니라 엘릭시르, 만니톨, 덱스트로스, 또는 멸균된 수용액, 및 유사한 제약학적 비히클과의 수성 또는 유성 현탁액, 또는 에멀션을 들 수 있다.

적합한 부형제의 일부 예로는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 소르비톨, 만니톨, 트레할로스, 전분, 검 아카시아, 칼슘 포스페이트, 알긴산염, 트라가칸트, 젤라틴, 칼슘 실리케이트, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 멸균수, 시럽, 및 메틸 셀룰로스를 들 수 있다. 제제는 추가적으로 탈크, 스테아르산 마그네슘, 및 미네랄 오일과 같은 윤활제; 습윤제; 유화제 및 현탁제; 메틸 및 프로필하이드록시벤조에이트와 같은 보존제; 감미제; 및 풍미제를 포함할 수 있다.

실시예

다음의 실시예는 개시의 특정 구체예를 입증하기 위해 포함된다. 기술분야의 숙련자들에 의해 하기의 실시예에서 개시된 기법이 개시의 실행에서 잘 기능하기 위한 기법을 나타내며, 따라서 그것의 실행을 위한 특정 방식을 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것이 인정되어야 한다. 그러나, 기술분야의 숙련자들은, 본 개시의 관점에서, 많은 변화가 개시되는 특정 구체예에서 이루어질 수 있고 여전히 개시의 사상 및 범주로부터 벗어나지 않으면서 같은 또는 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인정해야 한다.

실시예 1. 전신적으로 투여된 다중 Toll-유사 수용체 (TLR) 작용물질의 전임상 효능 특성화

이 실시예는 비병원성, 그람 음성균의 사멸 및 안정화와 함께, LPS 활성의 완전한 제거 없이 유의한 감소가 정맥내 투여를 통해 항종양 면역 반응을 안전하고 효과적으로 유도할 수 있는 다중 TLR 생성물을 생성할 수 있다는 가설을 테스트하였다.

비병원성, 그람 음성 대장균을 폴리믹신 B 및 글루타르알데하이드로 세포를 사멸하고 안정화시키는 조건 하에서 처리하여, LPS 내독소 활성 및 발열원성의 90%를 초과하는 감소를 유발하였다 ("처리된 박테리아", 또한 "디코이 박테리아" 또는 간단히 "디코이"로도 언급됨). 내독소 활성 및 발열원성을 리물루스 아메보사이트 용해물 및 생체내 토끼 검정을 사용하여 정량화하였다. 박테리아 무결성을 전자 및 광 현미경에 의해 평가하였다. 항종양 활성을 표준 동계 및 이종이식 종양 모델을 사용하여 측정하였다.

처리된 박테리아는 비처리된 박테리아에 비해 급성 생체내 독성에서 3배의 감소를 나타냈다. 놀랍게도, 쥐과 및 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMC)에 의한 항종양 사이토카인 분비의 유도는 비처리된 박테리아에 비해 손상되지 않았다. 처리된 박테리아로의 처리 (정맥내)는 정위(orthotopic) 쥐과 대장 암종 및 전이성 쥐과 췌장 암종에 대해 상당한 단일 작용제 항종양 활성을 유발하였다.

치료 지수가 최대 10배인 확립된 종양의 근절을 포함한 시너지 조합 활성을, 쥐과 대장 암종 모델에서 IL-2 또는 저용량 사이클로포스파미드 (LDC)와의 조합으로, 피하 (s.c.), 쥐과 비-호지킨 림프종 (NHL) 모델에서 LDC로, 및 s.c., 인간 NHL 모델에서 LDC 플러스 리툭시맙으로 관찰하였다. 시너지 항종양 활성을 또한 전이성, 쥐과 췌장 암종 모델에서 저용량의, 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID)과의 조합으로 관찰하였다. 더불어, 종양 근절을 NSAID와의 조합으로 관찰하였고 s.c., 쥐과 간세포 암종 모델에서 항-PD1 치료법의 첨가에 의해 향상되었다. 최적 (80-100%) 종양 근절은 천연 킬러 (NK), CD4⁺ 및 CD8⁺ T 세포에 의해 매개될 수 있는 것으로 나타났다. 후속되는 종양 도전의 거부에 의해 측정된 면역학적 기억 (80-100% 및 부분적인)은 각각 면역 적격 및 선천성 전용 환경 둘 다에서 입증되었다.

실시예 2. 처리된 박테리아에 의한 사이토카인 분비의 유도

이 실시예는 사이토카인 분비 from 인간 말초혈 단핵 세포로부터 사이토카인 분비를 유도하는 데에서 처리된 박테리아의 능력을 조사하였다.

비병원성, 그람 음성 대장균을 폴리믹신 B 및 글루타르알데하이드로 세포를 사멸하고 안정화시키기 위한 조건 하에서 처리하여, LPS 내독소 활성 및 발열원성의 90%를 초과하는 감소를 유발하였다 ("처리된 박테리아", "디코이 박테리아", 또는 간단히 "디코이"). 실시예 1 및 미국 특허 제 9,265,804 B2호 참조. 내독소 활성 및 발열원성을 리물루스 아메보사이트 용해물 및 생체내 토끼 검정을 사용하여 정량화하였다. 박테리아 무결성을 그람-염색 후에 광 현미경에 의해 평가하였다.

1x10 내지 1x10⁸개의 비처리된 또는 처리된 박테리아의 10배 증분을 2.5x10⁵개의 인간 말초혈 단핵 세포 (PBMCs)와 함께 2.5 mM 글루타민, 10% 인간 혈청 및 1% 페니실린 및 스트렙토마이신을 함유하고 있는 RPMI 배양 배지에서 37℃에서 5% CO₂로 48시간 동안 인큐베이션하였다. 상층액을 1,000 rpm에서 10분 동안 플레이트를 원심분리함으로써 수득하고 -80℃에서 보관하였다. 사이토카인의 루미넥스 분석을 Millipore 인간 사이토카인/케모카인 마그네틱 비드 패널 HCYTOMAG-60K 및 HSTCMAG-28SK를 사용하여 수행하였다. 사이토카인의 수준을 5-점 비선형 회귀 분석을 사용하여 표준 곡선에서 보간하였고, 여기서 피트 = (A+((B-A)/(1+(((B-E)/(E-A))*((x/C)^D)))))였다. 보간된 데이터를 비히클 대조군 또는 무자극 대조군에 대해 표준화하고 분석하였다. 신선한 정상 말초혈 백혈구성분채집술 팩 (ALLCells, Alameda, CA)으로부터의 PBMC를 피콜 구배를 사용하여 분리하였다 (Ficoll-Paque PLUS, Cat #17-144-02, 밀도 1.077+/-0.001 g/mL, GE Healthcare Bio-Sciences, Pittsburgh, PA). 박테리아 비히클은 칼슘 및 2 mM MgCl₂가 없는 포스페이트-완충 식염수 (PBS)였다.

제공된 결과는 동일한 비처리된 또는 처리된 박테리아 용량을 사용하여 각각의 사이토카인에 대해 측정된 피크 수준이다. 처리된 박테리아는 시험관내 리물루스 아메보사이트 용해물 (LAL) 검정에 의해 측정되는 바, 박테리아 기준으로 비처리된 박테리아보다 4.94% 많은 LPS를 함유하였다.

처리된 박테리아에 의해 유도된 PBMC로부터의 사이토카인의 수준

시험관내에서 인간 PBMC에 의한 분비	미처리된 박테리아	처리된 박테리아
사이토카인	각각의 사이토카인에 대해 동일한 박테리아 용량에서의 48-시간 pg/mL 피크 (3개 한 벌의 평균)
GM-CSF	1,094	1,197
IFNγ	175,866	47,488*
IL-1β	11,976	17,651
IL-6	78,422	98,534
IL-8	126,942	166,769
IL-10	6,970	7,670
IL-12p70	176	528
IL-23	0	119
TNFα	49,782	77,919

*제공된 결과는 비처리된 박테리아에 대해 더 낮은 용량에서 피크를 보인 IFNγ를 제외하고, 동일한 비처리된 및 처리된 박테리아 용량에서 발생되고 동일한 용량의 처리된 박테리아와 비교된, 각각의 사이토카인에 대해 측정된 피크 수준이다.

처리된 박테리아의 활성을 소수의 toll-유사 수용체 작용물질 (TLRa) 및 분리된 LPS와 비교하였다. 실험을 표 1에 대해 기술한 것과 같이 수행하였다. Toll-유사 수용체 작용물질 (TLRa)을 InvivoGen (San Diego, CA)으로부터 얻었고 다음과 같이 실험에서 적정하였다: CpG ODN 2006 (#tlrl-2006, 0.005 내지 5 마이크로몰), 폴리(I:C) (#tlrl-pic, 0.001 내지 100 마이크로그램/mL), R848 (#tlrl-r848, 0.1 내지 100 마이크로그램/mL) 및 대장균 LPS (#tlrl-pb5lps, 10 내지 1x10⁶ 피코그램/mL). TLR 작용물질 스톡을 제조사에 의해 권고된 대로 그들의 최대 권장 용해도 한계까지 제조하였고 결과는 각각의 TLRa 및 처리된 박테리아에 대해 측정된 피크 사이토카인 수준이다. 결과를 하기 표 2에 제공한다.

개별 TLR 작용물질과 비교한 사이토카인의 유도

	CpG ODN (TLR9a)	폴리(I:C) (TLR3a)	R848 (TLR 7/8a)	LPS (TLR4a)	처리된 박테리아
사이토카인	pg/mL (전체 적정 피크 평균)
GM-CSF	0	0	87	175	1,197
IFNγ	7	103	31,324	29,416	91,475
IL-1β	1	22	9,990	4,631	17,651
IL-6	241	129	40,555	54,174	98,534
IL-8	2,436	1,452	116,135	143,459	166,769
IL-10	374	8	940	3,542	7,670
IL-12p70	4	18	253	109	528
TNFα	51	208	33,393	24,944	77,919

실시예 3. 처리된 박테리아로 바이러스 감염을 치료하는 동물 테스트

이 실시예는 실시예 1 및 2에서 나타낸 것과 같이 제조될 수 있는 처리된 박테리아를, 동물에서 바이러스 감염을 치료하는 그것들의 활성에 대해 테스트한다.

이 실시예에서 사용한 B형 간염 (HBV) 감염의 동물 모델은 다음 중 임의의 것일 수 있다: 유체역학적 주사 모델, FVB/N 모델, 아데노 바이러스 전달 모델, 아데노-관련 바이러스 모델, 우드척 간염 바이러스 감염 모델, 침팬지 모델, 투파이아(Tupaia) 모델, HBV 유전자도입 마우스 모델, HBV-트라이메라 모델 및 인간 간-키메라 모델. 적합한 HIV 동물 모델을 또한 HIV 감염을 예방 또는 치료하는 처리된 박테리아의 활성을 테스트하기 위하여 사용할 수 있다.

시험관내 리물루스 아메보사이트 용해물 (LAL) 검정에 의해 측정된 바 총 량의 LPS 활성을 가진 처리된 박테리아의 제제를 상이한 범위로 바이러스에 의해 감염되었거나 바이러스 유전자를 발현하는 동물에게 투여한다. 일부 동물에서, 추가적인 면역 자극 또는 항바이러스 작용제를 병용 요법으로서 사용할 것이다. 치료를 받지 않은 동물 및 다른 면역 자극 또는 항바이러스 작용제로 치료한 동물을 대조군으로서 사용한다. 처리된 박테리아는 이들 동물 모델에서 효과적인 항바이러스 활성을 나타내는 것으로 고려된다.

실시예 4. 마우스에서의 HBV 감염

아데노-관련 바이러스/B형 간염 바이러스 (AAV/HBV)는 복제 가능한 인간 HBV 게놈을 운반하는 재조합 AAV이다. 유전자형 8 AAV의 고도로 간지향성 특징의 장점을 고려하여, 인간 HBV 게놈을 마우스 간 세포로 효율적으로 전달할 수 있다. 면역 적격 마우스의 AAV/HBV로의 감염은 환자에서의 만성 HBV 감염을 모방하는, 인간 HBV 비리온, HBsAg 및 HBeAg의 혈액으로의 방출을 포함한 장기간 HBV 바이러스혈증을 초래할 수 있다. AAV/HBV 모델을 다양한 유형의 항-HBV 작용제의 생체내 활성을 평가하기 위해 사용할 수 있다. 나아가, 이것은 면역 조절자의 평가를 위한 적절한 모델이다 (예를 들어 Huang et al., Int. J. Onc. v39 pp1511-1519, 2011 참조).

rAAV8-1.3HBV, 유전자형 D를 Beijing FivePlus Molecular Medicine Institute로부터 구입하였다 (배치 번호 A2018092406). 1x10¹²개의 바이러스 게놈 (v.g.)/mL의 스톡 바이러스를 멸균된 포스페이트-완충 식염수 (PBS)로 5x10¹¹ v.g./mL로 희석하고 200 μL 중의 1x10¹¹ v.g. AAV/HBV를 생후 5주령의 수컷 C57BL/6 마우스에게 투약 시작 31일 전에 주사하였다 (제-31일).

혈액 샘플 (~100 μL)을 제-17일, -7일 및 -4일에 턱밑출혈을 통해 K2-EDTA 코팅된 튜브에 수집하였다. 샘플을 7,000 g (4℃)에서 10분 동안 혈장 수집을 위해 원심분리하였다. 적어도 40 μL의 혈장 샘플을 qPCR에 의해 HBV-DNA를 측정하고, 효소 결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 HBs 항원 (HBsAg) 및 HBe 항원 (HBeAg)의 수준을 측정하기 위해 준비하였다. 나머지 혈장 샘플을 사후 분석을 위해 -80℃에서 보관하였다. 제-17일, -7일 및 -4일의 HBV DNA, HBsAg, HBeAg의 혈장 수준 및 체중을 기준으로, 정량화된 바이러스 감염 수준이 있는 마우스를 선택하고 제-1일에 무작위로 각 그룹에 5마리씩의 7개 그룹으로 나누었다. 제-4일에 HBV DNA, HBsAg, HBeAg 수준 및 체중의 관점에서 각 그룹간 유의한 차이가 존재하지 않는 것을 보장하기 위해 모든 마우스를 각 그룹에 고르게 분배하였다.

디코이 박테리아를 실시예 1 및 미국 특허 제 9,265,804 B2호에서 기술한 것과 같이 제조하였고, 이때 LPS-내독소 활성 범위는 10⁹의 사멸된 박테리아 세포당 대략 2,000 내지 6,000 내독소 단위 (EU) 또는 대략 250 내지 750 ng LPS이다. 동물 그룹을 치료하지 않거나, 0.005 mg/kg의 엔테카비어 (ETV)로 경구로 (p.o.) 제0일 내지 34일에, 꼬리 정맥으로 i.v. 투여되는 마우스당 2x10⁸개의 사멸된 박테리아의 디코이로 제1, 2, 8, 9, 15, 16, 22, 23, 29 및 30일에, 또는 ETV 및 디코이로 치료하였다. 혈장 샘플을 주마다 얻어서 상기 기술된 것과 같이 HBV-DNA, HBsAg 및 HBeAg에 대해 분석하였다. 치료된 그룹으로부터의 마우스에서의 HBV DNA (복사물), HBsAg 및 HBeAg의 수준을 독립적인 비모수 Mann-Whitney 통계 분석에 의해 각각의 비슷한 시점에서 비치료 그룹에서의 수준과 비교하였다.

도 1은 돌봄 표준 치료법 (ETV)이 투약을 시작하고 3일 이내에 HBV DNA 생성을 상당히 억제하여, 5마리 마우스 중 5마리에서 혈장 수준을 매일 투약한 지 28일 (감염 후 제59일) 째에 정량화 하한 (120개 복사물/μL 혈장)까지 감소시켰음을 입증한다 (도 1B). 디코이 또한 HBV DNA 생성을 상당히 억제하여, 5마리 마우스 중 3마리에서 주 2회 투약한 지 28일 (감염 후 제59일) 째에 정량화 하한까지 감소시켰다 (도 1C). ETV + 디코이에 의한 HBV DNA의 억제는 ETV 단독과 유사하였고, 이것은 화합물 투여에서 최대 이 지점까지 길항적 상호작용이 없었음을 입증한다 (도 1D).

ETV로 HBsAg 또는 HBeAg 생성의 억제는 관찰되지 않았다. 그러나, 디코이는 투약 후 제28일 (감염 후 제59일)에 HBeAg의 생성을 억제한 것으로 나타났다 (도 2).

그러므로 이 실시예는 돌봄 표준 (ETV)과 같이, 디코이 박테리아가 억제 활성을 나타내기까지 더 오래 걸리긴 하였지만, 디코이 박테리아가 또한 HBV 복제를 상당히 억제할 수 있음을 입증하며, 이것은 디코이 작용 메커니즘에 대한 면역학적 기준과 일치한다. 그러나, HBV DNA 생성만을 억제한 ETV와 달리, 디코이 박테리아는 HBe 항원의 생성 역시 억제하는 장점을 가진다.

실시예 5. 장기간 HBV 감염

이 실험을 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID)이 디코이 박테리아에 의한 항바이러스 활성을 향상시킬 수 있는지, 디코이의 항바이러스 활성이 치료 중단 후에 상실되는지, 그리고 ETV, 디코이 및 ETV + 디코이의 잠재적 독성 효과를 측정하기 위하여 수행하였다. 실험을 AAV/HBV 바이러스를 투약 시작과 관련하여 제-29일에 주사한 것을 제외하고, 실시예 4에서 기술한 것과 같이 수행하였다. 혈장 중의 HBV-DNA, HBsAg 및 HBeAg 수준을 제0일에 투약을 시작하는 것과 관련하여 제-15, -8 및 -1일에 측정하였고, ETV 용량을 0.1 mg/kg으로 증가시켰다. 더불어, 도 3, 4, 5 및 6에 도시한 모든 그룹에게 인도메타신 (NSAID)을 매일 투여하였다 (마시는 물에 10 μg/mL). 투약을 실시예 4에서와 같이 5주 동안 수행하였고, HBV-DNA, HBsAg 및 HBeAg의 혈장 수준을 주마다 측정하였을뿐만 아니라, 치료 중단 후 27주 동안 격주로 측정하였다. 억제 활성을 독립적인 비모수 Mann-Whitney 통계 분석에 의해 각 시점에서 치료된 그룹을 동일한 시점에서의 대조군 (인도메타신 단독) 그룹과 비교함으로써 측정하였다.

종결시, 각 마우스로부터의 간을 다중 섹션으로 나누고, 수집시 즉시 액체 질소 중에 순간 냉동시켜서 -80℃에서 보관하였다. 간 섹션을 HBV DNA 검출을 위해 사용하였고 각 마우스 간으로부터의 추가적인 섹션을 10% 중성 완충 포르말린 (NBF)에 약 24시간 동안 고정시킨 후, 일상적인 탈수 및 파라핀 삽입을 위해 옮겼다. 파라핀 블럭을 헤마톡실린-에오신 (H&E) 염색 및 병리 분석을 위해, 또한 HBsAg 및 HBcAg에 대한 면역조직화학 (IHC) 분석을 위해 섹션화하였다.

도 3A는 인도메타신 단독으로 HBV DNA 생성을 억제하지 못하였음을 입증한다. 반면, 도 3 (B, C 및 D)은 ETV, 디코이 또는 ETV + 디코이가 인도메타신의 존재 하에 인도메타신의 부재 하에 관찰된 것 (도 1)과 유사한 방식으로 HBV DNA 생성을 억제한 것을 입증한다. ETV 치료로 체중 손실은 관찰되지 않았다. 일시적인 체중 손실은 디코이 치료의 첫 번째 주 중에 1일 동안 6% (± ETV), 디코이 치료의 두 번째 주 중에 1일 동안 1.3% (ETV 없음) 및 3.4% (+ ETV), 치료의 세 번째 주 중에 1일 동안 0.8% (no ETV) 및 2.0% (+ETV)가 관찰되었고 디코이 치료 (± ETV)의 네 번째 및 다섯 번째 주 중에 체중 손실은 관찰되지 않았다.

HBV DNA의 통계적으로 유의한 억제는 ETV 치료의 중단 후 27주 후인 종결시 (제253일)에 상실되었지만 (도 3B), 억제는 디코이 (도 3C) 및 디코이 + ETV (도 3D) 그룹에서 제253일에 통계적으로 유의하게 유지되었다. 이것은 디코이가 ETV보다 더 길게 지속되는 억제 효과를 가지는 것을 입증한다.

인도메타신 + ETV는 인도메타신 단독에 비해 HBsAg 또는 HBeAg를 억제하지 못하였다 (도 4A, B 및 A, B). 그러나, 디코이의 첨가 (즉, 인도메타신 + 디코이 또는 인도메타신 + 디코이 + ETV)는 인도메타신 단독에 비해 HBsAg 및 HBeAg 생성을 억제하였다 (도 4A, C, D 및 5A C, D). 디코이 단독이나, 인도메타신 단독 중 어느 것도 HBsAg 생성을 억제하지 못하였기 때문에, 이들 결과는 HBsAg의 억제와 관련하여 디코이와 인도메타신 사이에 시너지 상호작용이 있음을 입증한다.

도 6은 ETV가 아닌 인도메타신, 디코이 또는 디코이 + ETV의 존재 하에서, 치료 중단 후 27주 후에 마우스의 간에서 HBeAg 발현이 억제된 것을 입증한다. 도 7은 디코이 비히클 (즉, 디코이 조성물에서 단독으로 사용된 완충제) 및 화합물 치료된 마우스의 간에서의 HBcAg 발현의 IHC 분석을 나타낸다. 다시, 인도메타신과 디코이의 조합은 인도메타신 단독에 비해, 5마리의 마우스 중 2마리에서 HBcAg 발현을 감소시켰고, 인도메타신, 디코이 및 ETV의 조합은 인도메타신 + ETV 또는 인도메타신 + 디코이로의 치료에 비해 5마리의 마우스 중 5마리에서 HBcAg 발현을 감소시켰다.

이 실시예는 인도메타신과 같은 NSAID가 HBV를 억제할 수 없지만, 시너지 방식으로 디코이 박테리아의 항바이러스 활성을 상당히 향상시킬 수 있음을 입증한다. 돌봄 표준, ETV와 비교하여, 디코이 박테리아는 더 길고 더 지속적인 치료 효과를 나타냈다. 디코이와 ETV의 조합은, 특히, 치료 중단 후 장기간 관찰과 관련하여, 또한 각각의 치료 단독보다 상당한 개선을 초래하였다.

실시예 6. HIV 감염의 억제

디코이 박테리아의 생체내에서 인간 면역결핍 바이러스 (HIV) 감염을 억제하는 잠재력을 조사하기 위하여, 인간 면역 체계를 인간 제대혈로부터 분리된 조혈 줄기 세포를 가진 NOD/Shi-scid/IL-2Rγ 널-특이적 (NCG) 면역결핍 암컷 마우스 (Charles River)에서 재구성하였다. 마우스를 화학적 골수절제 치료 후에 제대혈-유래 CD34+ 조혈 줄기 및 전구체 세포 (French Blood Institute)로 생착시켰다 (Manfroi et al., Can. Res. v77, pp1097-1107 2017). 생착은 105CD34+ 세포의 정맥내 주사로 이루어졌다. 생착 수준을 유동 세포분석에 의해 전체 혈액 백혈구 중 인간 CD45+ 세포의 분석에 의해 모니터링하였다.

생착후 14주 후에, 자격을 갖춘 인간화된 마우스를 80 ng의 HIV-1 (NL4-3 HIV1/Clade B; X4 향성 바이러스)로 정맥내 주사에 의해 접종하였다. 혈장 바이러스혈증을 qRT-PCR에 의해 5주째에 측정하였다. 다른 방법은 Wenzel et al., J. Virol. Doi:10.1128/JVI.00907-19 (승인된 원고는 2019년 8월 2일에 온라인으로 게시됨)에서 기술된 것과 같았다. 10⁴ 복사물/mL을 초과하는 바이러스 로드를 가진 HIV-마우스만을 실험에 사용하였다. 5주 째에, 마우스를 그것의 인간화 속도, HIV 로드 및 혈액 중의 CD4+ T 세포의 백분율을 토대로 무작위로 그룹을 나누었다.

그룹들을 5주 동안 주 2회 정맥내 디코이 비히클로, 6주 동안 사료 펠릿으로 1일당 2.4 mg의 라미부딘, 2.35 mg의 테노포비어 다이소프록실 및 19.2 mg의 랄테그라비어로 이루어진 고도로 활성인 항-레트로바이러스 요법 (HAART 또는 삼중요법)으로, 또는 5주 동안 주 2회 6x10⁷개의 정맥내 디코이 사멸된 박테리아 (실시예 4에서 기술된 것과 같이 제조됨)로 치료하였다.

혈액 (100 μL)을 EDTA-코팅된 튜브에서 안와 후 부동으로부터 2주마다 수집하였다. 혈장을 세포로부터 원심분리에 의해 분리하고 30분 동안 56℃에서 인큐베이션하여 HIV를 비활성화한 후 -80℃에서 냉동시켰다. 바이러스 RNA를 40 μL의 냉동된 비활성화된 혈장으로부터 자동 핵산 정제 장치 (Arrow, NorDiag) 및 바이러스 RNA 추출 키트 (DiaSorin, #12-08-02)를 사용하여 추출하였다. HIV 혈장 바이러스 로드를 "일반적인 HIV 충전 바이러스" 키트 (Biocentric, #TR001-440IC, 배치 0089/08A)를 사용하여 qRT-PCR에 의해 측정하였다. 민감성 한계를 1000 복사물/mL로서 설정하였다. 이 한계갑 아래의 값을 측정할 수 없는 것으로 간주하였다. 억제 활성을 각 시점에서의 치료된 그룹을 동일한 시점에서의 비히클 그룹에 비교함으로써 독립적인 비모수 Mann-Whitney 통계 분석에 의해 측정하였다. 별표 기호는 통계적으로 유의한 억제를 나타낸다.

도 8은 HAART 치료법이 치료를 시작한 후 2주 후에 HIV 혈액 수준을 억제하였고 치료를 중단한 후 3주 동안 지속된 것을 입증한다 (도 8B). 디코이 박테리아는 치료 중에 HIV 수준을 억제하지 못하였지만, 억제는 치료 중단 후 4주 후에 시작하여 19주를 제외하고, 11주 동안 지속된 것으로 관찰되었다 (도 8C). 지연된 억제 반응은 디코이 박테리아가 HIV 감염에 대한 면역 반응을 유도할 수 있었음을 시사한다. 디코이 비히클 그룹과 HAART로 치료된 그룹에서 각각 한 마리의 마우스 사망이 기록되었다. 디코이-치료된 그룹에서는 사망이 관찰되지 않았다.

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다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적이고 과학적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상적인 지식을 가진 자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다.

본원에서 예시적으로 기술된 발명은 본원에서 특별하게 개시되지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서 적합하게 실시될 수 있다. 그러므로, 예를 들어, 용어 "포함하는", "함유하는" 등은 제안 없이 광범위하게 판독되어야 한다. 추가적으로, 본원에서 사용된 용어 및 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로 사용되었고, 그러한 용어 및 표현을 사용에서 제시되고 기술된 특징의 임의의 동등물 또는 그것의 일부분을 배제하려는 의도는 없지만, 다양한 변형이 청구되는 발명의 범주 내에서 가능한 것이 인식된다.

그러므로, 비록 본 발명이 본원에 바람직한 구체예 및 선택적 특징에 의해 구체적으로 개시되었지만, 본원에 개시된 그 안에 삽입된 발명의 변형, 개선 및 변화가 기술분야에 숙련된 사람들에 의해 복원될 수 있고, 그러한 변형, 개선 및 변화는 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 간주되는 것이 이해되어야 한다. 본원에 제공된 물질, 방법, 및 실시예는 바람직한 구체예를 나타내는 것이고, 예시적이며, 발명의 범주에 대한 제한으로서 의도되지 않는다.

발명은 본원에서 광범위하고 일반적으로 기술되었다. 일반적인 개시 내에 속하는 각각의 더 좁은 종 및 하위 그룹도 또한 발명의 일부를 형성한다. 이것은 절제된 물질이 본원에서 구체적으로 인용되는지의 여부와 관계없이, 속으로부터 어떠한 주제를 제거하는 단서 또는 부정적 제한과 함께 발명의 일반적인 설명을 포함한다.

더불어, 발명의 특징 또는 측면이 Markush 그룹의 관점에서 기술되는 경우에, 기술분야에 숙련된 사람들은 발명이 또한 그로써 Markush 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위그룹의 관점에서 기술되는 것을 인지할 것이다.

본원에서 언급된 모든 출판물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은, 각각이 개별적으로 참조로 포함된 것과 동일한 정도로, 분명하게 그 전문이 참조로 본원에 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 본 명세서는 제어할 것이다.

개시가 상기 구체예와 함께 기술되었지만, 전술한 설명 및 실시예는 예시하기 위해 의도된 것이고 개시의 범주를 제한하지 않는다는 것이 이해되어야 한다. 개시의 범주 내에 있는 다른 측면, 장점 및 변형은 개시가 속하는 기술분야에 숙련된 사람들에게 분명할 것이다.

Claims

리물루스 아메보사이트 용해물 (LAL) 검정에 의해 측정될 때 비처리된 야생형 그람 음성균 세포와 비교하여 리포다당 (LPS)-관련 내독소 활성의 약 75% 내지 99%의 감소를 초래하기 위한 방식으로 처리된 복수의 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포를 포함하는 조성물의 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 그것을 필요로 하는 환자에서 감염을 예방 또는 치료하는 방법.
제1항에 있어서, 조성물은 환자의 kg 체중당 약 0.01 내지 100 ng의 활성 LPS를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 조성물은 환자의 kg 체중당 약 0.02 내지 20 ng의 활성 LPS를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 조성물은 환자의 kg 체중당 약 0.1 내지 10 ng의 활성 LPS를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 1 x 10⁸ 세포당 약 2 내지 200 ng의 활성 LPS를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 조성물은 1 x 10⁸ 세포당 약 10 내지 120 ng의 활성 LPS를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 조성물은 1 x 10⁸ 세포당 약 20 내지 100 ng의 활성 LPS를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포는 LPS-관련 내독소의 약 85% 내지 98%의 감소를 초래하기 위한 방식으로 처리된 것을 특징으로 하는 방법.
제8항에 있어서, 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포는 LPS-관련 내독소의 약 90% 내지 98%의 감소를 초래하기 위한 방식으로 처리된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 감염은 바이러스 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 바이러스 감염은 표 A로부터 선택된 바이러스에 의한 감염인 것을 특징으로 하는 방법.
제10항에 있어서, 바이러스 감염은 B형 간염 바이러스 (HBV) 또는 인간 면역결핍 바이러스 (HIV)에 의한 것임을 특징으로 하는 방법.
제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 제2 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 제2 치료제는 6MNA, 아스피린, 카르프로펜, 다이클로페낙, 페노프로펜, 플루페나메이트, 플루비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 나프록센, 니플룸산, 피록시캄, 술린닥 설파이드, 수프로펜, 테니답, 톨메틴, 토목시프롤, 조메피락, 셀렉소십, 에토돌락, 멜록시캄, 니메술라이드, 다이아이소프로필 플루오로포스페이트, L745,337, NS398, 로페콕십, SC58125, S-아미노살리실산, 암피론, 다이플루니살, 나부메톤, 파라세타몰, 레스베라트롤, 살리신, 살리실알데하이드, 살리실산 나트륨, 술파살라진, 술린닥, 타목시펜, 티클로피딘, 발레릴 살리실레이트 및 그것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 바람직하게 선택된 사이클로옥시게나제 억제제인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 제2 치료제는 CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR 및 ICOS로 이루어지는 군으로부터 바람직하게 선택된 자극 면역 체크포인트의 작용물질인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 제2 치료제는 A2AR, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, TIM-3, 및 VISTA로 이루어지는 군으로부터 바람직하게 선택된 억제 면역 체크포인트의 길항물질인 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 제2 치료제는 아바카비어, 아시클로비어, 아데포비어, 아만타딘, 암프레나비어, 암플리겐, 아르비돌, 아타자나비어, 아트리플라, 발라비어, 시도포비어, 콤비비어, 돌루테그라비어, 다루나비어, 델라비르딘, 다이다노신, 도코사놀, 에독수딘, 에파비렌즈, 엠트리시타빈, 엔푸비르티드, 엔테카비어, 에콜리에버, 팜시클로비어, 포미비르센, 포삼프레나비어, 포스카르넷, 포스포넷, 간시클로비어, 이바시타빈, 이무노비어, 이독수리딘, 이미퀴모드, 인디나비어, 이노신, 인테그라제 억제제, 인터페론 유형 III, 인터페론 유형 II, 인터페론 유형 I, 인터페론, 라미부딘, 로피나비어, 로비리드, 마라비록, 모록시딘, 메티사존, 넬피나비어, 네비라핀, 넥사비어, 니타족사니드, 뉴클레오사이드 유사체, 노르비어, 오셀타미비어 (Tamiflu^®), 페그인터페론 알파-2a, 펜시클로비어, 페라미비어, 플레코나릴, 포도필로톡신, 프로테아제 억제제, 랄테그라비어, 리바비린, 리만타딘, 리토나비어, 피라미딘, 사퀴나비어, 소포스부비어, 스타부딘, 텔라프레비어, 테노포비어, 테노포비어 다이소프록실, 티프라나비어, 트라이플루리딘, 트라이지비어, 트로만타딘, 트루바다, 발라시클로비어, 발간시클로비어, 비크리비록, 비다라빈, 비라미딘, 잘시타빈, 자나미비어, 지도부딘 및 그것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항에 있어서, 제2 치료제는 인터페론 알파 또는 페길화된 인터페론인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 그람 음성균 세포는 병원체-특이적 항원 또는 면역 체계 자극 단백질을 암호화하는 통합된 또는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 감염 후 24시간 내에, 또는 감염 후 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 내에 시작되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 투여는 감염 후 적어도 24시간 후에, 또는 감염 후 적어도 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 또는 7일 후에 시작되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 세포의 적어도 90%, 95% 또는 100%는 비-생존성인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 폴리믹신, 바람직하게는 폴리믹신 B 또는 폴리믹신 E로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서, 치료는 약 2℃ 내지 약 10℃, 바람직하게는 약 4℃의 온도에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 치료는 폴리믹신 및 글루타르알데하이드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제25항에 있어서, 치료는 약 3 mg/mL 내지 약 1,000 mg/mL의 용량 범위의 폴리믹신 B 및 약 0.1% 내지 약 1.0%의 용량 범위의 글루타르알데하이드로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 박테리아 세포는 살모넬라 또는 대장균 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
리물루스 아메보사이트 용해물 (LAL) 검정에 의해 측정될 때 비처리된, 야생형 그람 음성균 세포와 비교하여 리포다당 (LPS)-관련 내독소 활성의 약 75% 내지 99%의 감소를 초래하기 위한 방식으로 처리된 복수의 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포를 포함하는 제약학적 투여 형태로서, 총 LPS-관련 내독소 활성은 약 0.7 ng 내지 7000 ng의 활성 LPS와 동등한, 바람직하게는 약 7 ng 내지 1400 ng의 활성 LPS와 동등한, 제약학적 투여 형태.
제28항에 있어서, 제2 치료제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 투여 형태.
제29항에 있어서, 제2 치료제는 바람직하게 6MNA, 아스피린, 카르프로펜, 다이클로페낙, 페노프로펜, 플루페나메이트, 플루비프로펜, 이부프로펜, 인도메타신, 케토프로펜, 케토롤락, 메클로페나메이트, 메페남산, 나프록센, 니플룸산, 피록시캄, 술린닥 설파이드, 수프로펜, 테니답, 톨메틴, 토목시프롤, 조메피락, 셀렉소십, 에토돌락, 멜록시캄, 니메술라이드, 다이아이소프로필 플루오로포스페이트, L745,337, NS398, 로페콕십, SC58125, S-아미노살리실산, 암피론, 다이플루니살, 나부메톤, 파라세타몰, 레스베라트롤, 살리신, 살리실알데하이드, 살리실산 나트륨, 술파살라진, 술린닥, 타목시펜, 티클로피딘, 발레릴 살리실레이트 및 그것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 사이클로옥시게나제 억제제인 것을 특징으로 하는 제약학적 투여 형태.
제29항에 있어서, 제2 치료제는 CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR 및 ICOS로 이루어지는 군으로부터 바람직하게 선택된 자극 면역 체크포인트의 작용물질인 것을 특징으로 하는 제약학적 투여 형태.
제29항에 있어서, 제2 치료제는 A2AR, B7-H3, B7-H4, CTLA-4, IDO, KIR, LAG3, PD-1, PD-L1, TIM-3, 및 VISTA로 이루어지는 군으로부터 바람직하게 선택된 억제 면역 체크포인트의 길항물질인 것을 특징으로 하는 제약학적 투여 형태.
제29항에 있어서, 제2 치료제는 아바카비어, 아시클로비어, 아데포비어, 아만타딘, 암프레나비어, 암플리겐, 아르비돌, 아타자나비어, 아트리플라, 발라비어, 시도포비어, 콤비비어, 돌루테그라비어, 다루나비어, 델라비르딘, 다이다노신, 도코사놀, 에독수딘, 에파비렌즈, 엠트리시타빈, 엔푸비르티드, 엔테카비어, 에콜리에버, 팜시클로비어, 포미비르센, 포삼프레나비어, 포스카르넷, 포스포넷, 간시클로비어, 이바시타빈, 이무노비어, 이독수리딘, 이미퀴모드, 인디나비어, 이노신, 인테그라제 억제제, 인터페론 유형 III, 인터페론 유형 II, 인터페론 유형 I, 인터페론, 라미부딘, 로피나비어, 로비리드, 마라비록, 모록시딘, 메티사존, 넬피나비어, 네비라핀, 넥사비어, 니타족사니드, 뉴클레오사이드 유사체, 노르비어, 오셀타미비어 (Tamiflu^®), 페그인터페론 알파-2a, 펜시클로비어, 페라미비어, 플레코나릴, 포도필로톡신, 프로테아제 억제제, 랄테그라비어, 리바비린, 리만타딘, 리토나비어, 피라미딘, 사퀴나비어, 소포스부비어, 스타부딘, 텔라프레비어, 테노포비어, 테노포비어 다이소프록실, 티프라나비어, 트라이플루리딘, 트라이지비어, 트로만타딘, 트루바다, 발라시클로비어, 발간시클로비어, 비크리비록, 비다라빈, 비라미딘, 잘시타빈, 자나미비어, 지도부딘 및 그것들의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제약학적 투여 형태.
제29항에 있어서, 제2 치료제는 인터페론 알파 또는 페길화된 인터페론인 것을 특징으로 하는 제약학적 투여 형태.
제28항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 그람 음성균 세포는 병원체-특이적 항원 또는 면역 체계 자극 단백질을 암호화하는 통합된 또는 외인성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 제약학적 투여 형태.
제28항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 1 x 10⁸ 세포당 약 2 내지 200 ng의 활성 LPS를 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 투여 형태.
제36항에 있어서, 1 x 10⁸ 세포당 약 10 내지 120 ng의 활성 LPS를 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 투여 형태.
제36항에 있어서, 1 x10⁸ 세포당 약 20 내지 100 ng의 활성 LPS를 함유하는 것을 특징으로 하는 제약학적 투여 형태.
제28항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포는 LPS-관련 내독소의 약 85% 내지 98%의 감소를 초래하기 위한 방식으로 처리된 것을 특징으로 하는 제약학적 투여 형태.
제39항에 있어서, 온전하고 실질적으로 비-생존성 그람 음성균 세포는 LPS-관련 내독소의 약 90% 내지 98%의 감소를 초래하기 위한 방식으로 처리된 것을 특징으로 하는 제약학적 투여 형태.