CN112770764A

CN112770764A - 使用细菌治疗感染的方法

Info

Publication number: CN112770764A
Application number: CN201980062939.1A
Authority: CN
Inventors: 迈克尔·J·纽曼
Original assignee: Dico Biosystems
Current assignee: Indapus Treatment Co ltd
Priority date: 2018-09-27
Filing date: 2019-09-26
Publication date: 2021-05-07
Also published as: US11147844B2; JP2022502439A; IL281775A; BR112021005762A2; AU2019347502A1; WO2020069211A1; US20200101119A1; EP3856213A4; US20220031768A1; KR20210068462A; EP3856213A1; CA3114110A1; MX2021003551A; EA202190546A1; EP3856213B1

Abstract

本发明总体上涉及用于预防和治疗感染的组合物、剂型和方法。所述组合物包括完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞，其已被处理以降低与脂多糖（LPS）相关的内毒素活性，其令人惊讶地具有增加的活性以触发细胞因子的免疫细胞产生。

Description

使用细菌治疗感染的方法

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119要求2018年9月27日提交的美国临时申请62/737,762的利益，其内容通过引用整体并入本文。

背景技术

对于病毒感染，例如乙型肝炎(HBV)和人免疫缺陷病毒(HIV)，现有疗法可以控制病毒复制，改善大多数接受治疗的患者的临床状况，并导致降低的死亡率和发病率。然而，在停止治疗和出现耐药性突变后反弹的病毒血症会阻碍抗病毒治疗。大多数患者需要终生治疗，很少能治愈慢性HBV或HIV感染。

已知细胞因子和趋化因子在针对多种病毒感染(包括肝炎和HIV)的宿主防御中起重要作用。干扰素-α(IFN-α)被批准用于治疗乙型肝炎感染，并且其他几种细胞因子，包括干扰素-γ(IFN-γ)、白介素12(IL-12)、白介素23(IL-23)、GM-CSF和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)，与针对或治疗病毒感染(例如肝炎和HIV)的宿主防御有关。

针对病原体的预防性疫苗接种需要提供来自病原体的抗原决定簇和佐剂，其提供免疫系统危险信号或其激活针对病原体抗原的免疫反应所需的下游效应子。旨在治疗先前存在的感染的治疗性疫苗取决于宿主对现有感染中病原体抗原决定簇的识别，并且还需要佐剂或其下游效应子来提供危险信号介导的免疫激活。在某些情况下，有可能通过提供外源性病原体衍生的抗原来增强治疗性疫苗。先天性和适应性免疫系统的免疫细胞都使用模式识别受体(PRR)来以病原体相关分子模式(PAMP)的形式感知危险。PRR最突出的家族由Toll样受体(TLR)组成，其基本上存在于所有免疫细胞上。这些受体(TLR 1、2、3、4、5、6、7、8和9)对在许多不同类型的病原体(包括细菌和病毒)中发现的产物有反应。TLR受体的激活导致免疫细胞功能和免疫反应的直接和间接激活。直接激活通过促进细胞成熟、增殖和分化而发生，而间接激活通过诱导细胞因子和趋化因子分泌而发生。第十TLR(TLR10)可能起到免疫功能的负调节作用。

由于TLR在宿主介导的抗病原体免疫应答中的作用，已经做出了巨大的努力以产生TLR激动剂佐剂和用于感染的治疗剂。已经在临床前和临床环境中生产并测试了多种单特异性、纯化或合成的TLR激动剂。TLR激动剂在预防性疫苗中用作佐剂。然而，尽管在治疗性疫苗设置中已观察到抗病原体活性，但是这些努力遇到了重大挑战。遇到的问题包括缺乏效力和过度毒性，这表明需要进一步改善以TLR激动剂预防和特别是治疗现有感染。

概述

由于需要激活固有的和适应性的免疫应答以获得最佳的免疫防御，并且病原体包含多种TLR激动剂和其他危险信号相关成分，因此考虑到需要一种多TLR激动剂治疗方法，以获得最佳的抗感染(包括抗病毒)疗法。已知革兰氏阴性细菌包含多种TLR激动剂，并诱导与TLR激动剂相关的重要免疫反应，包括细胞因子分泌。然而，含有高水平的TLR-4激动剂脂多糖(LPS)或内毒素的野生型革兰氏阴性细菌，在静脉内给药时是剧毒的，这主要是由于免疫细胞诱导了过量的细胞因子分泌。革兰氏阴性细菌还含有TLR 1/2、5和9的激动剂，可同时刺激免疫系统和全身毒性。

本发明令人惊讶且出乎意料地发现，用多粘菌素和戊二醛处理革兰氏阴性细菌以降低其与LPS相关的内毒素活性，可以杀死细菌，保持细菌完整，并且显著降低LPS水平，同时可以增加细菌诱导人类免疫细胞分泌细胞因子的能力。这是出乎意料的，至少因为认为相对于未经处理的野生型细菌，LPS的显著降低还应导致暴露于经处理的细菌的免疫细胞释放的多种细胞因子中每种细胞因子的数量显著降低。

令人惊讶地，如表1所示，当在相同浓度(未经处理和经处理)的细菌中进行测试时，相对于未经处理的野生型细菌，经处理的细菌在人类免疫细胞分泌的9种细胞因子中的8种诱导出更高的水平，尽管经过处理的细菌仅具有未经处理的细菌中LPS含量的4.94％。此外，尽管LPS显著降低，但与单特异性TLR激动剂相比，经处理的细菌诱导的细胞因子水平更高(表2)。与未经处理的野生型细菌相比，通过体外鲎变形细胞溶解物(LimulusAmebocyte Lysate，LAL)测定测得，处理中与LPS相关的内毒素活性的降低约为75％-99％，可导致毒性降低。不受任何特定理论的束缚，可以预期的是，经处理的细菌细胞的完整结构可以帮助防止或最小化游离LPS向宿主对象的一些隔室中的释放。结果表明，与未经处理的细菌或单特异性激动剂相比，经处理的细菌可以诱导出更高的免疫反应，相对于未经处理的细菌，全身毒性降低。

动物研究进一步证实，这种经处理的细菌可以抑制HBV和HIV现有的病毒感染。此外，当与标准护理(例如恩替卡韦(Entecavir)用于HBV)相比时，尽管最初的抑制作用可能需要更长的时间才能出现，但经处理的细菌在停止治疗后很长时间仍显示出可持续的和显著的抑制作用。同样有趣的是，即使单独使用NSAID(例如吲哚美辛(indomethacin))的处理未显示出可观察到的抗病毒作用，但与NSAID组合可以协同地提高所处理的细菌的功效。

因此，在一个实施方案中，本发明提供了一种用于在有需要的患者中治疗感染的方法，该方法包括向该患者施用有效量的组合物，该组合物包含多个完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞，所述细菌细胞已经被处理从而导致脂多糖(LPS)相关的内毒素活性至少降低75％。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种在有需要的对象中预防感染的方法，该方法包括向该对象施用有效量的组合物，该组合物包含多个完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞和病原体衍生的或病原体相关的抗原，所述细菌细胞已经被处理从而导致脂多糖(LPS)相关的内毒素活性至少降低90％。

在一个实施例中，本发明提供了一种在有需要的患者中预防或治疗感染的方法。该方法需要向患者施用有效量的组合物，该组合物包含多个完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞，所述细菌细胞已经被处理从而导致与未经处理的野生型革兰氏阴性细菌细胞相比，当通过鲎变形细胞溶解物(LAL)测定进行测量时，脂多糖(LPS)相关的内毒素活性(活性LPS)降低约75％至99％。

在一些实施方案中，所述组合物包含每千克患者体重约0.01至100ng的活性LPS。在一些实施方案中，所述组合物包含每千克患者体重约0.02至20ng的活性LPS。在一些实施方案中，所述组合物包含每千克患者体重约0.1至10ng的活性LPS。

在一些实施方案中，所述组合物包含每1x10⁸个细胞约2至200ng的活性LPS。在一些实施方案中，所述组合物包含每1x10⁸个细胞约10至120ng的活性LPS。在一些实施方案中，所述组合物包含每1x10⁸个细胞约20至100ng的活性LPS。

在一些实施方案中，所述完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞已经被处理从而导致LPS相关的内毒素减少约85％至98％。在一些实施方案中，所述完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞已经被处理从而导致LPS相关的内毒素减少约90％至98％。

在一些实施方案中，所述感染是病毒感染，例如由选自表A的病毒引起的。在一些实施方案中，病毒感染是由乙型肝炎病毒(HBV)或人免疫缺陷病毒(HIV)引起的。

在一个实施方案中，还提供了一种药物剂型，其包含多个完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞，所述细菌细胞已经被处理从而导致与未经处理的野生型革兰氏阴性细菌细胞相比，当通过鲎变形细胞溶解物(LAL)测定进行测量时，脂多糖(LPS)相关的内毒素活性降低约75％至99％，其中总共的LPS相关的内毒素活性相当于约0.7ng至7000ng活性LPS，优选相当于约7ng至1400ng活性LPS。

在其他实施方案中，还描述了治疗组合物、疫苗及其剂型。

附图说明

图1A-1D显示了用恩替卡韦、经处理的细菌(诱饵(Decoy)细菌)、或其组合治疗对体内HBV DNA产生的抑制的影响。

图2显示了诱饵细菌而非恩替卡韦在体内降低了HBeAg水平。

图3A-D显示了体内抑制HBV DNA生产的长期研究的结果。

图4A-D显示了体内抑制HBsAg表达的结果。

图5A-D显示了体内抑制HBeAg表达的结果。

图6显示吲哚美辛和诱饵细菌(与或不与恩替卡韦一起)的组合在停止治疗后27周抑制了小鼠肝脏中的HBeAg表达。

图7A-F显示了在停止治疗后27周小鼠肝脏中HBcAg表达的免疫组织化学分析。

图8A-C显示了通过标准护理治疗或经处理的细菌在感染了HIV的人源化小鼠中对HIV血液水平的抑制。

详细说明

以下描述阐述了本技术的示例性实施例。然而，应当认识到，这样的描述并非旨在限制本公开的范围，而是作为示例性实施例的描述而提供。

在本说明书中使用的以下词语、短语和符号通常旨在具有以下阐述的含义，除非在使用它们的上下文中另有指示的范围内。

刺激免疫反应的组合物和方法

本发明的实验实施例证明，经处理以显著降低LPS相关内毒素活性的完整且不存活的革兰氏阴性细菌细胞出人意料地具有增强的从免疫细胞诱导细胞因子分泌的能力。因此，这样的经处理的细菌细胞适合提供安全有效的方法来刺激对象的免疫反应。所述免疫反应可以针对细菌、真菌、寄生虫或病毒感染。

因此，根据本发明的一个实施方案，提供了一种在有需要的对象中刺激免疫应答的方法。在另一个实施方案中，提供了一种用于预防或治疗有需要的患者中的感染的方法。在另一个实施方案中，提供了一种在有需要的患者中治疗免疫缺陷的方法。在另一个实施方案中，提供了对有风险感染的对象进行疫苗接种的方法。

在一些实施方案中，该方法需要向对象/患者施用有效量的组合物，该组合物包含多个本文所公开的经处理的细菌细胞。在一些实施方案中，经处理的细菌细胞是完整的且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞，其已经被处理以减少脂多糖(LPS)相关的内毒素活性和/或热原性。

可以通过本文的方法使用的候选细菌生物是革兰氏阴性的，并且衍生自具有与LPS相关的内毒素活性的野生型生物。术语“革兰氏阴性细菌”是指不保留最初的碱性染料染色剂(例如结晶紫，其是被称为革兰氏染色剂的过程的一部分)的细菌。在示例性的革兰氏染色中，首先通过加热将细胞固定在载玻片上，并用碱性染料(例如结晶紫)染色，该染料被革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌吸收。然后将载玻片用媒染剂(例如，革兰氏碘)处理，该媒染剂与碱性染料(例如结晶紫)结合并将其捕获在细胞中。然后将细胞用丙酮或乙醇洗涤，然后用另一种不同颜色的染料(例如番红蛋白)复染。革兰氏阳性生物保留了最初的紫罗兰色，而革兰氏阴性生物被洗涤有机溶剂脱色，因此显示复染。示例性的革兰氏阴性细菌包括但不限于埃希氏菌属(Escherichia spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)、沙门氏菌属(Salmonella spp.)、弯曲杆菌属(Campylobacter spp.)、奈瑟菌属(Neisseria spp.)、嗜血杆菌属(Haemophilus spp.)、气单胞菌属(Aeromonas spp.)、弗氏杆菌属(Francisellaspp.)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)、波氏杆菌属(Bordetella spp.)、军团菌属(Legionella spp.)、棒状杆菌属(Corynebacteria spp.)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter spp.)、衣原体(Chlamydia spp.)、布鲁氏菌属(Brucellaspp.)、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、幽门螺杆菌属(Helicobacter spp.)和弧菌属(Vibrio spp.)。

革兰氏阴性菌中有肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，这是一个大家族，与许多无害的共生体一起包括许多著名的病原体，例如沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(E.coli)、鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、克雷伯氏菌(Klebsiella)和志贺氏菌(Shigella)、变形杆菌(Proteus)、肠杆菌(Enterobacter)、沙雷氏菌(Serratia)和柠檬酸杆菌(Citrobacter)。肠杆菌科的成员被称为肠杆菌，因为一些成员生活在动物的肠道中。

在一个实施方案中，选择大肠杆菌作为生物。预期的一种具体菌株是大肠杆菌菌株2617-143-312,(Migula)Castellani and Chalmers(

13070^TM)。可以使用的其他大肠杆菌菌株包括MG1655(

47076)和KY8284(

21272)。

在本文的方法中使用的革兰氏阴性生物不必是含有或表达对于该生物的野生型形式而言外来的DNA的重组生物。然而，在一些实施方案中，可以修饰生物以表达一些非天然分子，包括例如病原体抗原或免疫刺激蛋白。

术语“脂多糖”(Lipopolysaccharide，LPS)是指由通过共价键连接的脂质和多糖(糖磷脂)组成的大分子。LPS包括三个部分：1)O抗原；2)核心寡糖，和3)脂质A。O抗原是附着在核心寡糖上的重复聚糖聚合物，包含LPS分子的最外层结构域。核心寡糖直接附着在脂质A上，通常含有糖，例如庚糖和3-脱氧-D-甘露辛酸(也称为KDO，酮基-脱氧辛磺酸)。脂质A是与多种脂肪酸连接的磷酸化葡糖胺二糖。脂肪酸将LPS锚固在细菌的外膜中，其余的LPS从细胞表面突出。

内毒素活性位于LPS的脂质A结构域部分，因此也称为“与LPS相关的内毒素活性”。当细菌细胞被免疫系统溶解时，含有LPS和脂质A的膜碎片会释放到循环系统中，从而引起发烧(热原性)和潜在的致命性休克(称为内毒素性或败血性休克)。LPS的毒性由脂质A通过与哺乳动物免疫系统细胞的相互作用来表达，这一过程导致促炎性细胞因子的分泌，包括肿瘤坏死因子-α(TNFα)和白介素-1β(IL-1β)，这可能对宿主有致命的后果。

LPS相关的内毒素活性可以通过本领域公知的方法来测量，包括例如鲎变形细胞溶解物(LAL)测定法，该测定法利用了来自马蹄蟹的血液，可以检测到非常低水平的LPS。内毒素活性的存在将会由于通过酶促级联反应的扩增而导致血液裂解物的凝结。LAL分析的凝胶凝结、浊度和发色形式可商购获得。

基于酶联免疫吸附测定(ELISA)的内毒素活性测定也是已知的，例如来自德国慕尼黑地区的Hyglos的

该测定法使用附着在固相上的LPS特异性噬菌体蛋白捕获LPS，在洗涤步骤之后，通过添加重组因子C来确定LPS的存在，重组因子C在被LPS激活时会裂解化合物，然后发出荧光。存在于鲎变形细胞溶解物中的因子C通常以酶原的形式存在，并且是LAL试验中发生的凝血级联反应的引物。

热原性是指试剂引起对象发烧的能力。热原性可以测量为兔子对静脉内施用的TLR激动剂、生物或其衍生物的直肠温度升高。

可以使用多种方法来降低革兰氏阴性生物的内毒素活性和/或热原性。所述方法包括用与LPS结合或破坏其形成的试剂处理生物。

在一个实施方案中，通过用灭活内毒素的抗生素处理细菌生物体来实现内毒素活性或热原性的降低。合适的此类抗生素是多粘菌素，包括多粘菌素B或多粘菌素E。确定用于处理的抗生素的量和条件在本领域技术人员的能力范围内。在一个实施方案中，可以以每毫升约3微克至5,000微克的浓度使用多粘菌素B或E。在另一个实施方案中，多粘菌素的浓度可以是每毫升约200微克至5,000微克。在一个实施方案中，将抗生素施用于细菌10分钟至4小时或约30分钟至约3小时。

在一个实施方案中，细菌在以MgCl₂形式存在的镁(Mg)的存在下生长。在一个实施方案中，在MgCl₂存在下以及在适于维持细菌完整性的温度下用多粘菌素处理细菌。在一个实施方案中，生长培养基中MgCl₂的浓度为约0.5mM至约5.0mM，或约2mM，并且处理培养基中MgCl₂的浓度为约5.0mM至约30mM，或约20mM。在一个实施方案中，处理培养基的温度为约2℃至约10℃，或约4℃。细菌完整性由以3,000xg离心10分钟后在定义明确的沉淀中的回收效率，以及通过电子显微镜或具有革兰氏染色的光学显微镜确定。在一个优选的实施方案中，处理和洗涤后细菌的回收率大于约80％，并且通过光学或电子显微镜观察细菌完整无缺。

在另一个实施方案中，通过用已知破坏KDO2-脂质IV_A的生物合成的抗生素处理细菌生物体来实现内毒素活性的降低。例如，Goldman et al.,J Bacteriol.170(5):2185-91,1988描述了包括抗菌剂III在内的抗菌剂，它们特异性抑制CTP:CMP-3-脱氧-D-甘露糖醛酸胞嘧啶转移酶的活性，并且可用于阻止3-脱氧-D-甘露糖醛酸(KDO)转化为革兰氏阴性生物的LPS。随着LPS合成的停止，细菌的生长也停止。在LPS前体物种脂质IV_A中添加KDO是鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)和大肠杆菌中脂质A-KDO形成的主要途径。在一个实施方案中，所述抗生素是抗菌剂III，并且革兰氏阴性细菌以合适的量(例如每毫升5微克至每毫升500微克)处理合适的时间(例如2至8小时)。

同样地，已知化合物α-C-(1,5-脱水-7-氨基-2,7-二脱氧-D-甘露聚糖-七吡喃糖基)-羧酸盐抑制3-脱氧-D-甘露聚糖-辛二酸胞嘧啶转移酶(CMP-KDO合成酶，一种可激活3-脱氧-D-甘露糖辛酸(KDO)并掺入LPS的细胞质酶)(Nature.1987 10-16；329(6135):162-4)。因此，用该化合物处理生物体也可以降低LPS相关的内毒素活性。

在另一个实施方案中，通过用LPS抑制剂处理生物来实现内毒素活性的降低。例如，已显示细菌环状脂肽表面活性素与脂质A结合，从而抑制了其活性(J Antibiot2006 59(1):35-43)。

除了与LPS相关的内毒素外，革兰氏阴性生物的各种其他成分还可以诱导或促成热原性和败血性休克，包括外膜蛋白、伞毛、菌毛、脂肽和脂蛋白(Jones,M.,Int.J.Pharm.Compd.,5(4):259-263,2001)。热原性可以通过本领域公知的兔子方法来测量，包括推定的热原静脉注射后的直肠温度评估。

已经发现，如在兔子中所测量的，用多粘菌素B和戊二醛的组合处理革兰氏阴性生物产生了30倍的热原性降低。在一个实施方案中，如在兔子中所测量的，采用每毫升1,000微克(μg/mL)的多粘菌素B和1％的戊二醛使热原性降低30倍。通过与LPS的多粘菌素B反应和与LPS和其他细菌成分的戊二醛反应性的组合，降低了热原性。戊二醛在这种情况下还通过杀死细菌发挥双重作用。

因此，在一个实施方案中，提供了一种通过用1,000μg/mL的多粘菌素B和1％的戊二醛的组合处理细菌来降低内毒素活性和热原性并杀死革兰氏阴性细菌微生物的方法。在另一个实施方案中，用多粘菌素B以约3μg/mL至约1,000μg/mL的剂量范围和戊二醛以约0.1％至约1.0％的剂量范围的组合处理革兰氏阴性细菌。在另一个实施方案中，多粘菌素B的剂量范围为约100μg/mL至约1,000μg/mL，戊二醛的剂量范围为约0.5％至约1.0％。另外，可以用例如约1,000μg/mL至约3,000μg/mL的多粘菌素B的剂量范围来处理革兰氏阴性细菌，而戊二醛的剂量范围为约0.5％至约1.0％。在另一方面，可以用例如约3,000μg/mL至约5,000μg/mL的多粘菌素B的剂量范围来处理革兰氏阴性细菌，而戊二醛的剂量范围为约0.5％至约2.0％。

在一些实施方案中，与未经处理的野生型相比，完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞的与LPS相关的内毒素活性(例如，通过LAL测定法测量)降低了至少约70％。在一些实施方案中，所述降低为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％或99.98％。在一些实施方案中，所述降低为不大于约95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％。在一些实施方案中，所述降低为约70％至约99.99％、约80％至约99.99％、约90％至约99.5％或99％、约91％至约99％、约92％至约98％、约93％至约97％、约94％至约96％、约94.5％至约95.5％、约94％至约97％、约95％至约98％、为约96％至约99％、约97％至约99.5％、或约98％至约99.9％，不受限制。

在一些实施方案中，某些残余活性LPS水平是优选的。例如，在一些实施方案中，在本发明的组合物中，每1x10⁸个细胞存在约1至200ng的活性LPS。在一些实施方案中，每1x10⁸个细胞存在约2至200ng、约5至150ng、约5至120ng、约10至120ng、约20至100ng、约20至50ng、约10至50ng的活性LPS。

在一些实施方案中，与未经处理的野生型细菌相比，完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞的热原性(例如如通过体内兔测定法所测量的)降低至少约70％。在一些实施方案中，所述降低为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％或99.98％。在一些实施方案中，所述降低为不大于约95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％。在一些实施方案中，所述降低为约70％至约99.99％、约80％至约99.99％、约90％至约99.5％或99％、约91％至约99％、约92％至约98％、约93％至约97％、约94％至约96％、约94.5％至约95.5％、约94％至约97％、约95％至约98％、为约96％至约99％、约97％至约99.5％、或约98％至约99.9％，不受限制。

如上所述，除了与LPS相关的内毒素外，革兰氏阴性生物的各种其他成分也可以诱导或促进热原性，例如外膜蛋白、伞毛、菌毛、脂肽和脂蛋白。在一些实施方案中，以如下方式处理完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞，使得通过降低LPS相关的内毒素活性和降低非LPS相关的热原性来实现降低热原性，例如灭活、去除或阻断外膜蛋白、伞毛、菌毛、脂肽或脂蛋白。在一些实施方案中，非LPS相关的热原性的降低为至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％或99.98％。在一些实施例中，降低不大于约60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％。

根据本发明的方法，用于施用的细菌在施用之前或在施用时变得不存活或基本上不存活。“不存活的”是指通过用外源剂处理杀死生物，和/或生物包含导致生物无法在哺乳动物宿主中存活的突变。基本上不存活的细菌是其生存力降低了至少80％、85％、90％、95％、99％或更高的菌株。

通过用例如多粘菌素的化合物处理，可以使细菌不能存活。当细菌分裂时，多粘菌素与LPS结合并干扰膜的完整性，并且由于细胞被膜的透化作用而降低了生存能力。如果通过这种方法降低了生存力，则需要采取措施防止细胞裂解并保持细胞完整。另一种方法是使LPS生物合成途径中具有条件突变的细菌菌株生长，该菌株在生长过程中被抑制，然后转移至激活该突变并破坏LPS生物合成的非容许条件。在每种情况下，所采用的程序都是通过在每种情况下确定最佳的处理时间或化合物剂量来使细菌无法生存的程序，从而在保持明显的细菌细胞完整性的情况下已经丧失了生存能力。在非生存力小于100％的情况下，可以使用含有突变的细菌，该突变阻止了存活细菌在哺乳动物宿主中的进一步增殖(例如，二氨基庚二酸营养缺陷型，如Bukhari and Taylor,J.Bacteriol.105(3):844-854,1971andCurtiss et al.,Immunol.Invest.18(1-4):583-596,1989所述)。

疾病与病症

如本文所公开的完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞可用于增强对象的免疫系统，因此可用于通过改善的免疫反应来预防或治疗疾病和病症。如本文所公开的完整的且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞也可以用作有风险患有这种疾病或病症的对象的疫苗或免疫佐剂。

“治疗”是用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。有益的或期望的临床结果可以包括以下一项或多项：a)抑制疾病或病症(例如，减少由疾病或病症引起的一种或多种症状，和/或减少疾病或病症的程度)；b)减慢或阻止与疾病或状况相关的一种或多种临床症状的发展(例如稳定疾病或病症，预防或延迟疾病或病症的恶化或进展，和/或预防或延迟疾病或病症的扩散(例如转移)；和/或c)缓解疾病，即导致临床症状消退(例如，改善疾病状态，部分或全部缓解疾病或病症，增强另一种药物的疗效，延缓疾病的进展，提高生活质量和/或延长生存期)。

“预防”是指导致疾病或病症的临床症状不发展的任何疾病或病症的治疗。在一些实施方案中，可以将细菌细胞施用给处于有风险患有该疾病或病症或具有家族病史的对象(包括人)。

“对象”是指已经或将会成为治疗、观察或实验对象的动物，例如哺乳动物(包括人)。本文描述的方法可用于人类治疗和/或兽医应用。在一些实施方案中，对象是哺乳动物，例如人、狗、猫、牛、绵羊等。在一个实施方案中，所述对象是人。

在一些实施方案中，待治疗的疾病或病症是感染性疾病。在一些实施方案中，感染是由细菌、真菌、寄生虫或病毒引起的。特别地，当前公开的细菌细胞可以独特地适合于治疗病毒感染，例如由表A中列出的病毒引起的感染，任选地与第二抗感染剂一起。

表A.病毒列表

在一些实施方案中，所治疗的疾病是HBV感染。在一些实施方案中，所治疗的疾病HIV感染。

剂量和时间

在一些实施方案中，可以确定施用于对象的完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞的LPS相关内毒素活性的水平。在一个实施方案中，所施用的组合物包含每千克对象体重约0.01至200ng的活性LPS。

术语“活性LPS”是指组合物中能够表现出与LPS相关的内毒素活性的LPS，例如，如通过LAL测定法所测量的，其中5-9个内毒素单位(EU)被认为是等效于1ng的活性LPS(基于标准LPS制剂)。组合物中活性LPS的量可以描述为能够表现出与组合物相同水平的与LPS相关的内毒素活性的未被抑制的LPS的重量。

在一些实施方案中，所施用的组合物(例如，包含完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞的LPS相关的内毒素活性的组合物)包含每千克对象体重约0.01至150ng的活性LPS。在一些实施方案中，所施用的组合物包含每千克对象体重约0.02至150ng、约0.02至100ng、约0.05至100ng、约0.05至100ng、约0.05至50ng、约0.05至20ng、约0.1至20ng、约0.1至10ng、约0.1至5ng、约0.2至100ng、约0.2至50ng、约0.2至20ng、约0.2至10ng、约0.2至5ng、约0.3至90ng、约0.4至80ng、约0.5至70ng、约0.6至60ng、约0.7至50ng、约0.8至40ng、约0.9至30ng、约1至20ng、约2至15ng、或约3至ng 12ng的活性LPS。

施用于对象的活性LPS的量可以根据对象的类型和疾病而变化。某些动物，例如小鼠、大鼠和狗，可能能够利用较高量的活性LPS(例如，与人和兔子相比250-500倍)。因此，在一些实施方案中，所施用的组合物包含每千克对象体重约10至100,000ng的活性LPS。在一些实施方案中，所施用的组合物包含每千克对象体重约20至50,000ng、约30至40,000ng、约40至30,000ng、约50至20,000ng、约0.7至10,000ng、约80至8,000ng、约90至7,000ng、约100至6,000ng、约200至5,000ng、或约500至5000ng的活性LPS。

可以基于所需的活性LPS的量和细菌细胞的内毒素活性水平来确定施用于对象的细菌细胞的数目。该数目还可以取决于多种因素，包括正在接受治疗的对象中的年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄率、药物组合以及特定疾病的严重程度。例如，剂量可以表示为每千克对象体重(mg/kg)的本文所述的细菌细胞数。约10,000至100,000,000个细胞/kg的剂量可能是合适的。在一些实施方案中，约100,000和10,000,000个细胞/kg可能是合适的。在其他实施方案中，1,000,000至5,000,000个细胞/kg的剂量可能是合适的。还可以基于身体表面积(以平方米(m²)表示)进行归一化。在一些实施方案中，约10,000至100,000,000个细胞/m²的剂量可能是合适的。在一些实施例中，约100,000和10,000,000个细胞/m²可能是合适的。在其他实施方案中，1,000,000至5,000,000个细胞/m²之间的剂量可能是合适的。当调整大小相异的对象之间的剂量时(例如，在儿童和成人中同时使用该药物或将非人类对象(例如狗)中的有效剂量转化为有效剂量适用于人类对象的剂量时发生的情况)，根据对象的体重进行标准化特别有用。

通常在诊断出疾病或病症之后施用细菌细胞。在一些实施方案中，施用在感染后24小时内或感染后2天、3天、4天、5天、6天或7天之内开始。在一些实施方案中，施用在感染后至少24小时之后或在感染后至少2天、3天、4天、5天、6天或7天之后开始。在一些实施方案中，施用在感染之前或之后的任何时间开始，并且可以根据需要进行。

作为预防性疫苗或预防措施，施用也可以在实际感染之前或在诊断出感染之前开始。

组合疗法

在一个实施方案中，本文公开的细菌细胞可以与一种或多种用于和/或开发来治疗感染的其他治疗剂组合使用。

在一些实施方案中，一种或多种另外的治疗剂可以是环氧合酶(COX)酶的抑制剂，例如NSAIDS，包括6MNA、阿司匹林、卡洛芬(carprofen)、双氯芬酸(diclofenac)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟芬那酸酯(flufenamate)、氟比洛芬(flubiprofen)、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸(ketorolac)、甲氯芬那酸酯(meclofenamate)、甲芬那酸(mefenamic acid)、萘普生(naproxen)、尼氟酸(niflumic acid)、吡罗昔康(piroxicam)、硫化舒林酸、舒洛芬(suprofen)、替尼达普(tenidap)、托美汀(tolmetin)、tomoxiprol、佐美酸(zomepirac)、塞来昔布(celexocib)、依托度酸(etodolac)、美洛昔康(meloxicam)、尼美舒利(nimesulide)、氟磷酸二异丙酯、L745,337、NS398、罗非考昔(rofecoxib)、SC58125、S-氨基水杨酸、氨基安替比林(ampyrone)、二氟尼柳(diflunisal)、萘丁美酮(nabumetone)、扑热息痛、白藜芦醇(resveratrol)、水杨苷(salicin)、水杨醛、水杨酸钠、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、舒林酸(sulindac)、他莫昔芬(tamoxifen)、噻氯匹定(ticlopidine)、以及戊酰基水杨酸。

在一些实施方案中，一种或多种其他治疗剂可以是例如CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和ICOS的刺激性免疫检查点的激动剂，或者例如A2AR、B7-H3、B7-H4、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、TIM-3和VISTA的抑制性免疫检查点的拮抗剂。

一种或多种其他治疗剂的非限制性实例还包括阿巴卡韦(abacavir)、阿昔洛韦(acyclovir)、阿德福韦(adefovir)、金刚烷胺(amantadine)、安普那韦(amprenavir)、安普利近(ampligen)、阿比多尔(arbidol)、阿扎那韦(atazanavir)、立普妥(atripla)、balavir、西多福韦(cidofovir)、可比韦(combivir)、杜鲁特韦(dolutegravir)、地瑞那韦(darunavir)、地拉夫定(delavirdine)、地达诺新(didanosine)、二十二烷醇、依度尿苷(edoxudine)、依非韦伦(efavirenz)、恩曲他滨(emtricitabine)、恩夫韦地(enfuvirtide)、恩替卡韦(entecavir)、ecoliever、泛昔洛韦(famciclovir)、福米韦生(fomivirsen)、福沙那韦(fosamprenavir)、膦甲酸酯(foscarnet)、膦乙酸酯(fosfonet)、更昔洛韦(ganciclovir)、依巴他滨(ibacitabine)、imunovir(imunovir)、碘苷(idoxuridine)、咪喹莫特(imiquimod)、茚地那韦(indinavir)、肌苷(inosine)、整合酶抑制剂、III型干扰素、II型干扰素、I型干扰素、干扰素、拉米夫定(lamivudine)、洛匹那韦(lopinavir)、洛韦胺(loviride)、马拉韦罗(maraviroc)、吗啉胍(moroxydine)、甲吲噻腙(methisazone)、奈非那韦(nelfinavir)、奈韦拉平(nevirapine)、nexavir、硝唑尼特(nitazoxanide)、核苷类似物、利托那韦(norvir)、奥司他韦(oseltamivir)(

)、聚乙二醇干扰素(peginterferon)α-2a、喷昔洛韦(penciclovir)、帕拉米韦(peramivir)、普可那利(pleconaril)、鬼臼毒素、蛋白酶抑制剂、雷特格韦(raltegravir)、利巴韦林(ribavirin)、金刚乙胺(rimantadine)、利托那韦(ritonavir)、pyramidine、沙奎那韦(saquinavir)、索非布韦(sofosbuvir)、司他夫定(stavudine)、特拉匹韦(telaprevir)、替诺福韦(tenofovir)、替诺福韦酯(tenofovir disoproxil)、替拉那韦(tipranavir)、三氟尿苷(trifluridine)、三协维(trizivir)、曲金刚胺(tromantadine)、特鲁瓦达(truvada)、伐昔洛韦(valaciclovir)、缬更昔洛韦(valganciclovir)、vicriviroc、阿糖腺苷(vidarabine)、viramidine(viramidine)、扎西他滨(zalcitabine)、扎那米韦(zanamivir)、以及齐多夫定(zidovudine)。

在一个实施方案中，另外的治疗剂是干扰素α。

在一些实施方案中，革兰氏阴性生物包括编码非细菌蛋白(例如病毒特异性抗原或免疫系统刺激蛋白)的多核苷酸。在一些实施方案中，革兰氏阴性生物包括编码细菌抗原的多核苷酸，其可以源自相同或不同的细菌生物，包括革兰氏阳性生物或其他病原体。如本文所用，抗原是可以被免疫应答(抗体或免疫细胞)识别的任何分子。

药物组合物、剂型和给药方式

在本发明中已经描述了适合于治疗疾病或病症的各种组合物。在一个实施方案中，提供了一种组合物或剂型，其包含多个完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞，所述细菌细胞已经被处理从而导致与未经处理的野生型革兰氏阴性细菌细胞相比，当通过鲎变形细胞溶解物(LAL)测定进行测量时，脂多糖(LPS)相关的内毒素活性降低约90％至99％，其中总共的LPS相关的内毒素活性相当于约0.7ng至7,000ng是活性LPS、约7ng至7,000ng的活性LPS、约7ng至1400ng的活性LPS、或约70ng至1400ng的活性LPS。

所述组合物可以用作佐剂或生物反应调节剂。如本文所用，术语“佐剂”和“生物应答调节剂”是指增强对抗原的免疫应答的任何物质。因此，佐剂或生物反应调节剂用于刺激免疫系统对外来抗原或引起疾病或与疾病相关的生物体更强烈地反应。然而，在一些实施方案中，表达例如病毒蛋白或人免疫激活蛋白(例如细胞因子或趋化因子)的革兰氏阴性细菌的重组形式被考虑用于所公开的方法中。在另一个实施方案中，在施用前将纯化的免疫激活蛋白(例如细胞因子或趋化因子)与革兰氏阴性生物体混合，或者在革兰氏阴性生物体之前或之后施用。

在一些实施方案中，与未经处理的野生型细菌相比，剂型中的完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞的与LPS相关的内毒素活性(例如，通过LAL测定法测量)降低至少约70％。在一些实施方案中，所述降低为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％或99.98％。在一些实施方案中，所述降低为不大于约95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％。在一些实施方案中，所述降低为约70％至约99.99％、约80％至约99.99％、约90％至约99.5％或99％、约91％至约99％、约92％至约98％、约93％至约97％、约94％至约96％、约94.5％至约95.5％、约94％至约97％、约95％至约98％、为约96％至约99％、约97％至约99.5％、或约98％至约99.9％，不受限制。

在一些实施方案中，与未经处理的野生型细菌相比，剂型中的完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞的热原性(例如如通过体内兔测定法所测量的)降低至少约70％。在一些实施方案中，所述降低为至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％或99.98％。在一些实施方案中，所述降低为不大于约95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％。在一些实施方案中，所述降低为约70％至约99.99％、约80％至约99.99％、约90％至约99.5％或99％、约91％至约99％、约92％至约98％、约93％至约97％、约94％至约96％、约94.5％至约95.5％、约94％至约97％、约95％至约98％、为约96％至约99％、约97％至约99.5％、或约98％至约99.9％，不受限制。

在一些实施方案中，非LPS相关的热原性的降低为至少约50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％或99.98％。在一些实施例中，所述降低为不大于约60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％。

在一些实施方案中，基本上不存活的细菌的存活力降低了至少80％、85％、90％、95％、99％或更多。

在一些实施方案中，剂型包括约10,000至约1x10¹⁰个这样的细菌细胞。在一些实施方案中，剂型包括约100,000至约1x10⁸个这样的细菌细胞。在一些实施方案中，剂型包括约1000,000至约1x10⁷个这样的细菌细胞。在一些实施方案中，剂型包括约1x10⁶至约1x10⁸这样的细菌细胞。

在一些实施方案中，所述组合物还包含第二治疗/抗病毒剂。在一些实施方案中，第二治疗剂是NSAID(非甾体抗炎药)。在一些实施方案中，第二治疗剂是环氧合酶抑制剂，优选选自6MNA、阿司匹林、卡洛芬、双氯芬酸、非诺洛芬、氟芬那酸酯、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸酯、甲芬那酸、萘普生、尼氟酸、吡罗昔康、硫化舒林酸、舒洛芬、替尼达普、托美汀、tomoxiprol、佐美酸、塞来昔布、依托度酸、美洛昔康、尼美舒利、氟磷酸二异丙酯、L745,337、NS398、罗非考昔、SC58125、S-氨基水杨酸、氨基安替比林、二氟尼柳、萘丁美酮、扑热息痛、白藜芦醇、水杨苷、水杨醛、水杨酸钠、柳氮磺胺吡啶、舒林酸、他莫昔芬、噻氯匹定、戊酰基水杨酸及其组合。

在一些实施方案中，第二治疗剂是优选选自CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和ICOS的刺激性免疫检查点的激动剂。在一些实施方案中，第二治疗剂是优选选自A2AR、B7-H3、B7-H4、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、TIM-3和VISTA的抑制性免疫检查点的拮抗剂。

在一些实施方案中，第二治疗剂选自阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦、安普利近、阿比多尔、阿扎那韦、立普妥、balavir、西多福韦、可比韦、杜鲁特韦、地瑞那韦、地拉夫定、地达诺新、二十二烷醇、依度尿苷、依非韦伦、恩曲他滨、恩夫韦地、恩替卡韦、ecoliever、泛昔洛韦、福米韦生、福沙那韦、膦甲酸酯、磷乙酸酯、更昔洛韦、依巴他滨、imunovir、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、整合酶抑制剂、III型干扰素、II型干扰素、I型干扰素、干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、马拉韦罗、吗啉胍、甲吲噻腙、奈非那韦、奈韦拉平、nexavir、硝唑尼特、核苷类似物、利托那韦、奥司他韦

聚乙二醇干扰素α-2a、喷昔洛韦、帕拉米韦、普可那利、鬼臼毒素、蛋白酶抑制剂、雷特格韦、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、pyramidine、沙奎那韦、索非布韦、司他夫定、特拉匹韦、替诺福韦、替诺福韦酯、替拉那韦、三氟尿苷、三协维、曲金刚胺、特鲁瓦达、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、vicriviroc、阿糖腺苷、viramidine、扎西他滨、扎那米韦、齐多夫定及其组合。

在一些实施方案中，第二治疗剂是干扰素α。

本文所述的组合物可以以多种方式配制以用于本文所述的方法。在一个实施方案中，该组合物包含全文中所述的生物和药学上可接受的载体。

“药学上可接受的载体”是指可以在组合物中使用的任何稀释剂、赋形剂或载体。药学上可接受的载体包括离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(例如人血清白蛋白)、缓冲物质(例如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(例如硫酸镁、鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐)、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇、冷冻保存剂(例如海藻糖和甘露醇以及羊毛脂)。合适的药物载体在该领域的标准参考书Remington's PharmaceuticalSciences,Mack Publishing Company中有描述。

将所述组合物配制成用于对哺乳动物(优选人类)进行药物给药。本发明的此类药物组合物可以多种方式施用，包括肠胃外施用。如本文所用，术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病变内和颅内注射或输注技术。

组合物的无菌注射形式可以是水性或油性悬浮液。可以根据本领域已知的技术，使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂来配制这些悬浮液。无菌注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的溶媒(vehicle)和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的不挥发油通常用作溶剂或悬浮介质。为此，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，可用于制备注射剂，如天然药学上可接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，特别是其聚氧乙烯化形式。这些油溶液或悬浮液还可以包含长链醇稀释剂或分散剂，例如羧甲基纤维素或类似的分散剂，其通常用于配制药学上可接受的剂型，包括乳剂和悬浮液。为了配制的目的，也可以使用其他通常使用的表面活性剂，例如吐温(Tween)、司盘(Span)和其他乳化剂或生物利用度增强剂，其通常用于制造药学上可接受的固体、液体或其他剂型。可将组合物配制成用于通过注射(例如推注或连续输注)进行肠胃外给药的形式。

药物组合物可以单剂量或多剂量施用。药物组合物可以通过各种方法施用，包括例如直肠、颊、鼻内和透皮途径。在某些实施方案中，药物组合物可以通过动脉内注射、静脉内、腹膜内、肠胃外、肌肉内或皮下施用。

一种给药方式是肠胃外给药，例如通过注射。可以掺入本文所述药物组合物以通过注射给药的形式包括，例如，水或油悬浮液、或乳剂、芝麻油、玉米油、棉籽油、或花生油、以及酏剂、甘露醇、葡萄糖或无菌水溶液、以及类似的药物溶媒。

合适的赋形剂的一些例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、黄芪胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、无菌水、糖浆、以及甲基纤维素。所述制剂可以另外包含润滑剂，例如滑石粉、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化剂和助悬剂；防腐剂，例如甲基和丙基羟基苯甲酸酯；甜味剂；以及调味剂。

实施例

包括以下实施例以说明本发明的具体实施方案。本领域技术人员应当理解，以下实施例中公开的技术代表了在本发明的实践中很好地起作用的技术，因此可以认为构成其实施的特定模式。然而，根据本发明，本领域技术人员应当理解，可以在所公开的特定实施例中进行许多改变，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下仍可获得相似或相似的结果。

实施例1.全身施用的多Toll样受体(TLR)激动剂的临床前功效表征

本实施例检验了以下假设，即显著降低但不完全消除LPS活性并杀死和稳定非致病性革兰氏阴性细菌，可以产生多TLR产物，其可以通过施用安全有效地诱导抗肿瘤免疫反应。

在杀死和稳定细胞的条件下，用多粘菌素B和戊二醛处理非致病性革兰氏阴性大肠杆菌，使LPS内毒素活性和热原性降低>90％(“经处理的细菌”，也称为“诱饵细菌”或简称为“诱饵”)。内毒素活性和热原性使用鲎变形细胞溶解物和体内兔测定进行定量。细菌完整性通过电子和光学显微镜评估。使用标准的同基因和异种移植肿瘤模型确定抗肿瘤活性。

相对于未经处理的细菌，经处理的细菌在急性体内毒性方面降低了3倍。令人惊讶的是，相对于未经处理的细菌，鼠和人外周血单核细胞(PBMC)诱导的抗肿瘤细胞因子分泌并未受到损害。用经处理的细菌(i.v.)处理产生针对原位鼠结肠直肠癌和转移性鼠胰腺癌的显著的单药抗肿瘤活性。

在小鼠结直肠癌模型中，与IL-2或低剂量环磷酰胺(low-dosecyclophosphamide，LDC)联合观察到协同组合活性，包括根除已确立的肿瘤，具有高达10倍的治疗指数，其中在皮下(s.c.)鼠非霍奇金淋巴瘤(NHL)模型中使用LDC，在s.c.人NHL模型中使用LDC加利妥昔单抗。在转移性鼠胰腺癌模型中，还观察到与低剂量非甾体类抗炎药(NSAID)联合使用的协同抗肿瘤活性。此外，在s.c.鼠肝细胞癌模型中，观察到与NSAID联合使用可根除肿瘤，并通过添加抗PD1疗法增强根除效果。最佳(80-100％)的肿瘤根除被证明是由自然杀伤(NK)、CD4⁺和CD8⁺T细胞介导的。通过拒绝随后的肿瘤攻击而确定的免疫记忆(80-100％和部分)分别在免疫能力和仅先天条件下得到证实。

实施例2.经处理的细菌诱导细胞因子分泌

该实施例检查了经处理的细菌诱导人外周血单核细胞分泌细胞因子的能力。

在杀死和稳定细胞的条件下，用多粘菌素B和戊二醛处理非致病性革兰氏阴性大肠杆菌，使LPS内毒素活性和热原性降低90％以上(“经处理的细菌”，“诱饵细菌”或简称为“诱饵”)，请参见实施例1和美国专利号9,265,804B2。内毒素活性和热原性使用鲎变形细胞溶解物和体内兔测定进行定量。革兰氏染色后通过光学显微镜评估细菌完整性。

将10x10至1x10⁸十倍增量的未经处理或经处理的细菌与2.5x10⁵的人类外周血单核细胞(PBMC)在含有2.5mM谷氨酰胺、10％人类血清和1％青霉素和链霉素的RPMI培养基中在37℃5％CO₂下孵育48小时。通过将板以1,000rpm离心10分钟来收获上清液，并在-80℃下保存。用Millipore人类细胞因子/趋化因子磁珠板HCYTOMAG-60K和HSTCMAG-28SK对细胞因子水平进行Luminex分析。使用5点非线性回归分析从标准曲线上插入细胞因子水平，其中拟合度＝(A+((B-A)/(1+(((B-E)/(E-A))*((x/C)^D)))))。内插的数据被归一化为溶媒对照或未受刺激的对照并进行分析。使用Ficoll梯度(Ficoll-Paque PLUS,Cat#17-144-02,密度1.077+/-0.001g/mL，来自GE Healthcare Bio-Sciences,Pittsburgh,PA)从新鲜的正常外周血白细胞分离术(ALLCells,Alameda,CA)中分离出PBMC。细菌溶媒是不含钙和2mMMgCl₂的磷酸盐缓冲盐水(PBS)。

给出的结果是使用相同的未处理或处理的细菌剂量确定的每种细胞因子的峰值水平。如通过体外鲎变形细胞溶解物(LAL)测定测量的，按细菌计算，经处理的细菌的LPS含量为未经处理细菌的4.94％。

表1.经处理的细菌诱导的PBMC中细胞因子的水平

*给出的结果是针对每种细胞因子确定的峰值水平，其在相同的未经处理和经处理细菌剂量下出现，但IFNγ除外，其在未经处理细菌的剂量较低时达到峰值，并与相同剂量的经处理的细菌进行了比较。

将经处理的细菌的活性与几种Toll样受体激动剂(TLRa)和分离的LPS进行比较。实验如表1所述进行。Toll样受体激动剂(TLRa)购自InvivoGen(San Diego,CA)，并在实验中进行了如下滴定：CpG ODN 2006(#tlrl-2006,0.005至5微摩尔),Poly(I:C)(#tlrl-pic,0.001至100微克/mL),R848(#tlrl-r848,0.1至100微克/mL)以及E.coli LPS(#tlrl-pb5lps,10至1x10⁶皮克/mL)。按照制造商的建议制备TLR激动剂储备液，直至达到其建议的溶解度极限，结果是针对每种TLRa和经处理的细菌确定的峰值细胞因子水平。结果显示在下表2中。

表2.与单个TLR激动剂相比细胞因子的诱导

实施例3.用经处理的细菌治疗病毒感染的动物试验

该实施例测试了可以如实施例1和2所示制备的经处理的细菌在治疗动物病毒感染中的活性。

在该实施例中采用的乙型肝炎(HBV)感染的动物模型可以是以下任一种：流体动力注射模型，FVB/N模型，腺病毒递送模型，腺相关病毒模型，土拨鼠肝炎病毒感染模型，黑猩猩模型，Tupaia模型，HBV转基因小鼠模型，HBV-Trimera模型和人肝嵌合体模型。合适的HIV动物模型也可用于测试经处理的细菌在预防或治疗HIV感染中的活性。

将具有通过在不同范围内的鲎变形细胞溶解物(LAL)测定所测量的LPS活性总量的经处理的细菌制剂施用于被病毒感染或表达病毒基因的动物。在某些动物中，其他免疫刺激剂或抗病毒剂将会被用作联合疗法。不接受治疗的动物和接受其他免疫刺激或抗病毒剂治疗的动物用作对照。预期在这些动物模型中，经处理的细菌表现出有效的抗病毒活性。

实施例4.小鼠中的HBV抑制

腺相关病毒/乙型肝炎病毒(AAV/HBV)是携带可复制的人HBV基因组的重组AAV。利用基因型8AAV的高度肝功能，可以将人类HBV基因组有效地传递到小鼠肝细胞。用AAV/HBV感染免疫能力强的小鼠可导致长期HBV病毒血症，包括将人HBV病毒体HBsAg和HBeAg释放到血液中，从而模仿患者的慢性HBV感染。AAV/HBV模型可用于评估各种类型的抗HBV药物的体内活性。此外，这是用于评估免疫调节剂的合适模型(参见，例如Huang et al.,Int.J.Onc.v39 pp1511-1519,2011)。

基因型D的rAAV8-1.3HBV购自北京五加分子医学研究所(批号A2018092406)。用无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)将1×10^12个病毒基因组(v.g.)/mL的原病毒稀释至5×10^11v.g./mL。在开始给药前31天(第-31天)，对每只5周龄的雄性C57BL/6小鼠注射200μL中的1×10^11v.g.AAV/HBV。

在第-17、-7和-4天通过下颌下出血将血液样品(～100μL)收集到K2-EDTA包被的管中。将样品在7,000g(4℃)下离心10分钟以收集血浆。制备至少40μL血浆样品以通过qPCR测定HBV-DNA的水平，并通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测定HBs抗原(HBsAg)和HBe抗原(HBeAg)的水平。将剩余的血浆样品存储在-80℃下进行后期分析。根据第-17、-7和-4天的血浆HBV DNA、HBsAg、HBeAg和体重，在第-1天选择病毒感染水平合格的小鼠，随机分为7组，每组5只。在第-4天，所有小鼠均均匀地分布在各组中，以确保各组之间在HBV DNA、HBsAg、HBeAg水平和体重方面没有显著差异。

如实施例1和美国专利号9,265,804B2中所述制备诱饵细菌，其LPS-内毒素活性范围为每10^9个被杀死的细菌细胞约2,000至6,000个内毒素单位(EU)或约250至750ng LPS。动物组未经治疗(无治疗)，在第0-34天每天口服(p.o.)0.005mg/kg的恩替卡韦(ETV)进行治疗，在第1、2、8、9、15、16、22、23、29和30天每只小鼠经尾静脉静脉注射2x10^8个被杀死的细菌诱饵进行治疗，或ETV和诱饵进行治疗。每周获取血浆样品，并如上所述分析其HBV-DNA、HBsAg和HBeAg。通过未配对的非参数Mann-Whitney统计分析，比较了每个可比较时间点的治疗组小鼠的HBV DNA(拷贝数)、HBsAg和HBeAg水平与无治疗组的水平。

图1表明，标准护理治疗(ETV)在开始给药后的3天内显著抑制了HBV DNA的产生，在每日给药的第28天(感染后第59天)使5/5小鼠的血浆水平降至定量下限(120个拷贝/μL血浆)(图1B)。诱饵也显著抑制HBV DNA的产生，在每周两次给药的第28天(感染后第59天)，使3/5小鼠的血浆水平降至定量下限(图1C)。ETV+诱饵对HBV DNA的抑制作用与单独的ETV相似，表明在化合物给药的这一点上没有拮抗作用(图1D)。

ETV未观察到对HBsAg或HBeAg产生的抑制作用。但是，发现在给药的第28天(感染后第59天)，诱饵会抑制HBeAg的产生(图2)。

因此，该实施例证实，与标准护理(ETV)一样，诱饵细菌也可以显著抑制HBV复制，尽管诱饵细菌花费更长的时间表现出抑制活性，这与诱饵作用机制的免疫学基础是一致的。但是，与仅抑制HBV DNA产生的ETV不同，诱饵细菌还具有抑制HBe抗原产生的优势。

实施例5.长期HBV抑制

进行该实验是为了确定如果诱饵的抗病毒活性在治疗停止后丧失，非甾体抗炎药(NSAID)是否可以增强诱饵细菌的抗病毒活性，以及ETV、诱饵和ETV+诱饵治疗的潜在毒性作用。如实施例4所述进行实验，不同之处在于相对于给药开始在第-29天注射AAV/HBV病毒。相对于第0天开始给药，在第-15、-8和-1天确定血浆中HBV-DNA、HBsAg和HBeAg水平，并且ETV剂量增加至0.1mg/kg。另外，图3、4、5和6所示的所有组均每天服用吲哚美辛(NSAID)(在饮用水中10μg/mL)。与实施例4一样，进行给药5周，每周一次并在停止治疗后27周每隔一周一次测定HBV-DNA、HBsAg和HBeAg的血浆水平。通过不配对的非参数Mann-Whitney统计分析将每个时间点的治疗组与相同时间点的对照组(仅吲哚美辛)进行比较，从而确定抑制活性。

终止后，将每只小鼠的肝脏分成多个部分，收集后立即在液氮中速冻并储存在-80℃。将肝切片用于HBV DNA检测，并将每只小鼠肝脏的其他切片固定在10％中性福尔马林(NBF)中约24小时，然后转移至常规脱水和石蜡包埋中。对石蜡块进行切片，以进行苏木精-伊红(H&E)染色和病理分析，以及HBsAg和HBcAg的免疫组织化学(IHC)分析。

图3A表明单独的吲哚美辛不能抑制HBV DNA的产生。而图3(B、C和D)表明，在吲哚美辛存在的情况下ETV、诱饵或ETV+诱饵抑制HBV DNA产生的方式，与在没有吲哚美辛的情况下所观察到的方式类似(图1)。用ETV治疗未观察到体重减轻。在诱饵治疗(±ETV)的第1周观察到一天的短暂体重减轻6％，在诱饵治疗的第2周观察到一天的1.3％(无ETV)和3.4％(+ETV)，在治疗的第三周中观察到一天的0.8％(无ETV)和2.0％(+ETV)，并且在诱饵治疗(±ETV)的第四和第五周中未观察到体重减轻。

停止ETV治疗后27周，在终止时(第253天)失去了HBV DNA的统计学上的显著抑制作用(图3B)，但在诱饵(图3C)和诱饵+ETV(图3D)组中，第253天抑制作用在统计学上仍显著。这表明诱饵比ETV具有更长的持久抑制作用。

相对于单独的吲哚美辛，吲哚美辛+ETV不抑制HBsAg或HBeAg(图4A、B和5A、B)。然而，相对于单独的吲哚美辛，添加诱饵(即吲哚美辛+诱饵或吲哚美辛+诱饵+ETV)抑制了HBsAg和HBeAg的产生(图4A、C、D和5A、C、D)。由于单独的诱饵和单独的吲哚美辛均不能抑制HBsAg的产生，因此这些结果表明，就抑制HBsAg而言，诱饵和吲哚美辛之间存在协同作用。

图6表明，在吲哚美辛的存在下，停止治疗后27周，诱饵或诱饵+ETV而非ETV抑制小鼠肝脏中的HBeAg表达。图7表示在诱饵溶媒(即仅在诱饵组合物中使用的缓冲液)和化合物处理的小鼠的肝脏中HBcAg表达的IHC分析。与单独的吲哚美辛相比，吲哚美辛和诱饵的组合再次降低了5只小鼠中2只的HBcAg的表达，相对于吲哚美辛+ETV或吲哚美辛+诱饵的治疗，吲哚美辛、诱饵和ETV的组合降低了5只小鼠中5只的HBcAg的表达。

该实施例证实NSAID(例如吲哚美辛)不能抑制HBV，但是可以以协同方式显著增强诱饵细菌的抗病毒活性。与标准护理ETV相比，诱饵细菌显示出更长和更持久的治疗效果。诱饵和ETV的结合也相对于单独的每种治疗方法都得到了显著改善，尤其是在停止治疗后的长期观察方面。

实施例6.HIV感染的抑制

为了检查诱饵细菌在体内抑制人免疫缺陷病毒(HIV)感染的潜力，在NOD/Shi-scid/IL-2Rγnull-特异性(NCG)免疫缺陷雌性小鼠(Charles River)中重建了人免疫系统，其中从人类脐带血中分离出造血干细胞。在进行化学清髓治疗后，对小鼠移植脐血来源的CD34+造血干细胞和祖细胞(French Blood Institute)(Manfroi et al.,Can.Res.v77,pp1097-1107 2017)。植入由105CD34+细胞的静脉内注射组成。通过流式细胞术分析全血白细胞中的人CD45+细胞来监测植入水平。

植入14周后，通过腹膜内注射将80ng的HIV-1(NL4-3 HIV1/Clade B；X4向性病毒)接种到合格的小鼠体内。通过qRT-PCR在第5周确定血浆病毒血症。其他方法如Wenzel etal.,J.Virol.Doi:10.1128/JVI.00907-19(接受的稿件于2019年8月2日在线发布)中所述。实验中仅使用病毒载量高于10⁴个拷贝/mL的HIV小鼠。在第5周，根据小鼠的人源化率、HIV载量和血液中CD4+T细胞的百分比，将小鼠随机分组。

各组处理如下：静脉内注射诱饵溶媒，每周两次，持续5周；高活性抗逆转录病毒疗法(HAART或三联疗法)，由2.4mg拉米夫定、2.35mg Tenofovir Disproxil和19.2mgRaltegravir组成，每天在食物颗粒中施加，持续6周；或诱饵杀死细菌(如实施例4中所述制备)，静脉内(尾静脉)注射6x10⁷，每周两次，持续5周。

每两周从涂有EDTA的管中的眼眶后窦收集血液(100μL)。通过离心将血浆与细胞分离，并在56℃孵育30分钟以灭活HIV，然后在-80℃冷冻。使用自动核酸纯化设备(Arrow,NorDiag)和病毒RNA提取试剂盒(DiaSorin,#12-08-02)从40μL冷冻的灭活血浆中提取病毒RNA。使用“Generic HIV Charge Virale”试剂盒(Biocentric,#TR001-440IC,Batch 0089/08A)通过qRT-PCR确定HIV血浆病毒载量。灵敏度的极限设定为1000个拷贝/mL。低于此阈值的值被视为未检测到。通过不配对的非参数Mann-Whitney统计分析将每个时间点的治疗组与同一时间点的溶媒组进行比较，从而确定抑制活性。星号符号表示统计学上显著的抑制作用。

图8证明HAART疗法在开始治疗后两周抑制HIV血液水平，并在停止治疗后持续三周(图8B)。诱饵细菌在治疗过程中没有抑制HIV水平，但是在停止治疗后4周开始观察到抑制作用，持续11周(第19周除外)(图8C)。延迟的抑制反应表明诱饵细菌能够诱导针对HIV感染的免疫反应。在诱饵溶媒组和接受HAART治疗的组中分别记录了一只小鼠死亡。在诱饵治疗组中未观察到死亡。

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除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。

本文说明性地描述的发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下适当地实践。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含有”等应被广泛地且不受限制地阅读。另外，本文所采用的术语和表达已被用作描述的术语而非限制，并且不旨在使用这样的术语和表达来排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同形式，但是应当认识到，在所要求保护的本发明的范围内可以进行各种修改。

因此，应当理解，尽管已经通过优选实施方式和可选特征具体公开了本发明，但是本领域技术人员可以对本文所公开的本发明实施方式进行修改、改进和变化，并且这样的修改、改进和变化被认为在本发明的范围内。这里提供的材料、方法和示例代表优选实施例，是示例性的，并且不意在限制本发明的范围。

在此已经广泛地和概括地描述了本发明。落入一般公开范围内的每个较窄的种类和亚类分组也构成本发明的一部分。这包括对本发明的一般性描述，其附带条件或否定限制从该属中去除了任何主题，无论所切除的材料是否在本文中进行了具体叙述。

此外，在根据马库什组描述本发明的特征或方面的情况下，本领域技术人员将认识到，由此也根据马库什组的任何单个成员或成员的子组来描述本发明。

在此提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都明确地全文引入作为参考，其程度就好像每个文献都单独作为参考引入。在有冲突的情况下，以本说明书(包括定义)为准。

应该理解，尽管已经结合以上实施例描述了本公开，但是前述描述和示例旨在示出而不是限制本发明的范围。对于本发明所属领域的技术人员而言，本发明范围内的其他方面，优点和修改将是显而易见的。

Claims

1.一种在有需要的患者中预防或治疗感染的方法，所述方法包括向所述患者施用有效量的组合物，所述组合物包含多个完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞，所述细菌细胞已经被处理从而导致与未经处理的野生型革兰氏阴性细菌细胞相比，当通过鲎变形细胞溶解物（LAL）测定进行测量时，脂多糖（LPS）相关的内毒素活性降低约75％至99％。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述组合物包含每千克患者体重约0.01至100 ng的活性LPS。

3.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物包含每千克患者体重约0.02至20 ng的活性LPS。

4.根据权利要求2所述的方法，其中所述组合物包含每千克患者体重约0.1至10 ng的活性LPS。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述组合物包含每1 x 10⁸个细胞约2至200 ng的活性LPS。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述组合物包含每1 x 10⁸个细胞约10至120 ng的活性LPS。

7.根据权利要求5所述的方法，其中所述组合物包含每1 x 10⁸个细胞约20至100 ng的活性LPS。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞已经被处理从而导致LPS相关的内毒素减少约85％至98％。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞已经被处理从而导致LPS相关的内毒素减少约90％至98％。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述感染是病毒感染。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述病毒感染是由选自表A的病毒引起的感染。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述病毒感染是由乙型肝炎病毒（HBV）或人免疫缺陷病毒（HIV）引起的。

13.根据权利要求10-12中任一项所述的方法，其进一步包括向所述患者施用第二治疗剂。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二治疗剂是环氧合酶抑制剂，优选选自6MNA、阿司匹林、卡洛芬、双氯芬酸、非诺洛芬、氟芬那酸酯、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸酯、甲芬那酸、萘普生、尼氟酸、吡罗昔康、硫化舒林酸、舒洛芬、替尼达普、托美汀、tomoxiprol、佐美酸、塞来昔布、依托度酸、美洛昔康、尼美舒利、氟磷酸二异丙酯、L745,337、NS398、罗非考昔、SC58125、S-氨基水杨酸、氨基安替比林、二氟尼柳、萘丁美酮、扑热息痛、白藜芦醇、水杨苷、水杨醛、水杨酸钠、柳氮磺胺吡啶、舒林酸、他莫昔芬、噻氯匹定、戊酰基水杨酸及其组合。

15.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二治疗剂是优选选自CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和ICOS的刺激性免疫检查点的激动剂。

16.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二治疗剂是优选选自A2AR、B7-H3、B7-H4、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、TIM-3和VISTA的抑制性免疫检查点的拮抗剂。

17.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二治疗剂选自阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦、安普利近、阿比多尔、阿扎那韦、立普妥、balavir、西多福韦、可比韦、杜鲁特韦、地瑞那韦、地拉夫定、地达诺新、二十二烷醇、依度尿苷、依非韦伦、恩曲他滨、恩夫韦地、恩替卡韦、ecoliever、泛昔洛韦、福米韦生、福沙那韦、膦甲酸酯、膦乙酸酯、更昔洛韦、依巴他滨、imunovir、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、整合酶抑制剂、III型干扰素、II型干扰素、I型干扰素、干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、马拉韦罗、吗啉胍、甲吲噻腙、奈非那韦、奈韦拉平、nexavir、硝唑尼特、核苷类似物、利托那韦、奥司他韦（Tamiflu^®）、聚乙二醇干扰素α-2a、喷昔洛韦、帕拉米韦、普可那利、鬼臼毒素、蛋白酶抑制剂、雷特格韦、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、pyramidine、沙奎那韦、索非布韦、司他夫定、特拉匹韦、替诺福韦、替诺福韦酯、替拉那韦、三氟尿苷、三协维、曲金刚胺、特鲁瓦达、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、vicriviroc、阿糖腺苷、viramidine、扎西他滨、扎那米韦、齐多夫定及其组合。

18.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二治疗剂是干扰素α或聚乙二醇化干扰素。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述革兰氏阴性细菌细胞包含编码病原体特异性抗原或免疫系统刺激蛋白的整合的或外源的多核苷酸。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用在感染后24小时内或感染后2天、3天、4天、5天、6天或7天之内开始。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述施用在感染后至少24小时之后或在感染后至少2天、3天、4天、5天、6天或7天之后开始。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中至少90％、95％或100％的所述细菌细胞是不存活的。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述处理是用多粘菌素进行的，所述多粘菌素优选是多粘菌素B或多粘菌素E。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述处理是在约2℃至约10℃的温度下、优选在约4℃下进行的。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述处理是用多粘菌素和戊二醛进行的。

26.根据权利要求25所述的方法，其中所述处理是用多粘菌素B以约3 mg/mL至约1,000mg/mL的剂量范围和用戊二醛以约0.1％至约1.0％的剂量范围进行的。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细菌细胞是沙门氏菌（Salmonella）或大肠杆菌（Escherichia）细胞。

28.一种药物剂型，其包含多个完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞，所述细菌细胞已经被处理从而导致与未经处理的野生型革兰氏阴性细菌细胞相比，当通过鲎变形细胞溶解物（LAL）测定进行测量时，脂多糖（LPS）相关的内毒素活性降低约75％至99％，其中总共的LPS相关的内毒素活性相当于约0.7 ng至7000 ng活性LPS，优选相当于约7 ng至1400 ng活性LPS。

29.根据权利要求28所述的药物剂型，其进一步包含第二治疗剂。

30.根据权利要求29所述的药物剂型，其中所述第二治疗剂是环氧合酶抑制剂，优选选自6MNA、阿司匹林、卡洛芬、双氯芬酸、非诺洛芬、氟芬那酸酯、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、甲氯芬那酸酯、甲芬那酸、萘普生、尼氟酸、吡罗昔康、硫化舒林酸、舒洛芬、替尼达普、托美汀、tomoxiprol、佐美酸、塞来昔布、依托度酸、美洛昔康、尼美舒利、氟磷酸二异丙酯、L745,337、NS398、罗非考昔、SC58125、S-氨基水杨酸、氨基安替比林、二氟尼柳、萘丁美酮、扑热息痛、白藜芦醇、水杨苷、水杨醛、水杨酸钠、柳氮磺胺吡啶、舒林酸、他莫昔芬、噻氯匹定、戊酰基水杨酸及其组合。

31.根据权利要求29所述的药物剂型，其中所述第二治疗剂是优选选自CD27、CD28、CD40、CD122、CD137、OX40、GITR和ICOS的刺激性免疫检查点的激动剂。

32.根据权利要求29所述的药物剂型，其中所述第二治疗剂是优选选自A2AR、B7-H3、B7-H4、CTLA-4、IDO、KIR、LAG3、PD-1、PD-L1、TIM-3和VISTA的抑制性免疫检查点的拮抗剂。

33.根据权利要求29所述的药物剂型，其中所述第二治疗剂选自阿巴卡韦、阿昔洛韦、阿德福韦、金刚烷胺、安普那韦、安普利近、阿比多尔、阿扎那韦、立普妥、balavir、西多福韦、可比韦、杜鲁特韦、地瑞那韦、地拉夫定、地达诺新、二十二烷醇、依度尿苷、依非韦伦、恩曲他滨、恩夫韦地、恩替卡韦、ecoliever、泛昔洛韦、福米韦生、福沙那韦、膦甲酸酯、磷乙酸酯、更昔洛韦、依巴他滨、imunovir、碘苷、咪喹莫特、茚地那韦、肌苷、整合酶抑制剂、III型干扰素、II型干扰素、I型干扰素、干扰素、拉米夫定、洛匹那韦、洛韦胺、马拉韦罗、吗啉胍、甲吲噻腙、奈非那韦、奈韦拉平、nexavir、硝唑尼特、核苷类似物、利托那韦、奥司他韦（Tamiflu^®）、聚乙二醇干扰素α-2a、喷昔洛韦、帕拉米韦、普可那利、鬼臼毒素、蛋白酶抑制剂、雷特格韦、利巴韦林、金刚乙胺、利托那韦、pyramidine、沙奎那韦、索非布韦、司他夫定、特拉匹韦、替诺福韦、替诺福韦酯、替拉那韦、三氟尿苷、三协维、曲金刚胺、特鲁瓦达、伐昔洛韦、缬更昔洛韦、vicriviroc、阿糖腺苷、viramidine、扎西他滨、扎那米韦、齐多夫定及其组合。

34.根据权利要求29所述的药物剂型，其中所述第二治疗剂是干扰素α或聚乙二醇化干扰素。

35.根据权利要求28-34中任一项所述的药物剂型，其中所述革兰氏阴性细菌细胞包含编码病原体特异性抗原或免疫系统刺激蛋白的整合的或外源的多核苷酸。

36.根据权利要求28-35中任一项所述的药物剂型，其包含每1 x 10⁸个细胞约2至200ng的活性LPS。

37.根据权利要求36所述的药物剂型，其包含每1 x 10⁸个细胞约10至120 ng的活性LPS。

38.根据权利要求36所述的药物剂型，其包含每1 x 10⁸个细胞约20至100 ng的活性LPS。

39.根据权利要求28-38中任一项所述的药物剂型，其中所述完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞已经被处理从而导致LPS相关的内毒素减少约85％至98％。

40.根据权利要求39所述的药物剂型，其中所述完整且基本上不存活的革兰氏阴性细菌细胞已经被处理从而导致LPS相关的内毒素减少约90％至98％。