KR102214794B1 - 박테리아를 사용하는 암 치료용 조성물 및 방법 - Google Patents

박테리아를 사용하는 암 치료용 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR102214794B1
KR102214794B1 KR1020157020243A KR20157020243A KR102214794B1 KR 102214794 B1 KR102214794 B1 KR 102214794B1 KR 1020157020243 A KR1020157020243 A KR 1020157020243A KR 20157020243 A KR20157020243 A KR 20157020243A KR 102214794 B1 KR102214794 B1 KR 102214794B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gram
bacterial cells
viable
negative bacterial
polymyxin
Prior art date
Application number
KR1020157020243A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150102093A (ko
Inventor
마이클 제이. 뉴먼
Original Assignee
디코이 바이오시스템즈 인코퍼레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 디코이 바이오시스템즈 인코퍼레이티드 filed Critical 디코이 바이오시스템즈 인코퍼레이티드
Publication of KR20150102093A publication Critical patent/KR20150102093A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102214794B1 publication Critical patent/KR102214794B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/11—Aldehydes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/13—Amines
    • A61K31/155—Amidines (), e.g. guanidine (H2N—C(=NH)—NH2), isourea (N=C(OH)—NH2), isothiourea (—N=C(SH)—NH2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/664—Amides of phosphorus acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/66—Phosphorus compounds
    • A61K31/675—Phosphorus compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pyridoxal phosphate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A61K38/1774—Immunoglobulin superfamily (e.g. CD2, CD4, CD8, ICAM molecules, B7 molecules, Fc-receptors, MHC-molecules)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0275—Salmonella
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A61P29/02—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID] without antiinflammatory effect
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P39/00—General protective or antinoxious agents
    • A61P39/02—Antidotes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/36—Adaptation or attenuation of cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/521—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells inactivated (killed)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/522—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/52—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells
    • A61K2039/523—Bacterial cells; Fungal cells; Protozoal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • A61K2039/585—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation wherein the target is cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Marine Sciences & Fisheries (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

내독소 활성 및/또는 발열성의 실질적인 감소를 갖는 실질적으로 생존 불가능한 그람-음성 박테리아 유기체를 포함하는 조성물 및 같은 것을 사용하여 암을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다. 또한 본원에서 제공된 암을 치료하는 방법이 제공되는데, 암으로 진단된 포유동물에게 내독소 활성 및/또는 발열성의 실질적인 감소를 갖는 실질적으로 생존 불가능한 그람-음성 박테리아를 암의 성장 또는 전이를 억제하는데 충분한 양으로 투여하는 단계를 포함한다. 박테리아의 외막 내에서 지질다당류의 실질적인 손실을 초래하는 유전적 결함을 갖는 생존 가능한 또는 생존 불가능한 그람-음성 박테리아 유기체를 투여하는 단계를 포함하는 추가적인 방법이 제공된다. 폴리믹신 및 글루타르알데히드의 처리를 포함하는, 그람-음성 박테리아에서 내독소 활성 및/또는 발열성을 감소시키는 방법이 더 제공된다.

Description

박테리아를 사용하는 암 치료용 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATMENT OF CANCER USING BACTERIA}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에서 2013년 1월 2일에 출원된 미국 가출원 61/748,369에 대한 이익을 주장하며, 이것은 참고로 본원에 포함된다.
분야
본 개시물은 그람-음성(Gram-negative) 박테리아를 포함하는 조성물 및 같은 것을 투여함으로써 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
박테리아 감염을 겪고 있는 환자에서 암 퇴행의 연관성은 적어도 1868년 초기에 관찰되고 보고되었다. 고체 종양을 가지고 있는 동물에게 생 약독화 살모넬라(Salmonella) 유기체의 전신성 투여는 종양 치료를 일으키는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,685,935 및 Pawelek et al., (Lancet Oncol. 4(9):548-56, 2003)을 참고하면 된다. 또한, 약독화 그람-양성(Gram-positive) 미코박테리아(mycobacteria) (BCG)의 방광 내 (비-전신성) 투여는 방광의 상피 내 암종 (carcinoma in situ; CIS)의 치료 및 예방을 위해 미국에서 승인된다.
생 그람-음성 살모넬라를 사용하는 종양 치료의 개선이 또한 특정 영양 요구성 돌연변이에 대하여 보고되었다. 예를 들어, Hoffman et al., (Amino Acids 37:509-521, 2009), 미국 특허 공개 20090300779 (Zhao et al.), 및 Zhao et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 102(3):775-760, 2005)를 참고하면 된다.
msbB 자리에서 결실을 갖고 있는 살모넬라가 제조되었는데 이것은 외막에서 지질 A의 말단 미리스토일화가 결핍된 LPS를 발현한다. 이 msbB-살모넬라 균주가 처리된 마우스 및 돼지에서 TNF-알파 유발은 각각 야생형 박테리아에 의해 유발된 양의 33% 및 14%였다. 예를 들어, Low et al., Nature 17:37-41, 1999 및 미국 특허 번호 7,354,592 (Bermudes et al.)를 참고하면 된다. 균주 VNP20009를 포함하는, 이러한 생 유기체의 투여는 피하로 이식된 B16F10 쥐 흑색종(melanoma), 및 마우스에서 키워진 인간 종양 이종이식편(xenograft) Lox, DLD-1, A549, WiDr, HTB177, 및 MDA-MB-231의 성장을 억제하는 것으로 보고되었다 (Luo et al., Oncol. Res. 12(11-12):501-508, 2001). 살모넬라 균주 VNP20009는 또한 최대 허용 용량에서 및 규칙적 저용량 식이요법으로 화학치료제 시클로포스파미드의 항-종양 효능을 개선하는 것으로 보고되었다 (Jia et al., Int. J. Cancer 121(3):666-674, 2007).
외막에서 지질 A를 생산할 수 없고 LPS가 결핍된 그람-음성 박테리아의 조건부 돌연변이가 제조되었지만 유기체에 독성인 것으로 보고되었다. 예를 들어, 3-데옥시-D-만노-옥툴로소네이트 (Kdo) 합성의 돌연변이에 의한 억제 또는 Kdo 분자의 지질 IVA로의 통합의 돌연변이에 의한 억제는 지질 A 및 LPS 합성 및 LPS 전구체의 그람-음성 박테리아 외막으로의 국소화를 방지한다. 지질 IVA는 글리코실화가 결핍된 LPS 전구체이다. 이 돌연변이의 활성화는 박테리아 생존력의 손실로 이어진다 (Rick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69(12):3756-3760, 1972, Belunis et al. J. Biol. Chem. 270(46):27646-27652, 1995, 및 Taylor et al. J. Biol. Chem. 275(41):32141-32146, 2000).
또한 외인성으로 추가된 화합물의 사용을 통해 지질 IVA로의 Kdo 통합, 지질 A의 합성 및 외막으로의 국소화를 억제하는 것이 가능하다. Goldman et al. (J Bacteriol. 170(5):2185-91, 1988)은 CTP:CMP-3-데옥시-D-만노-옥툴로소네이트 시티딜일트랜스퍼라제 활성을 특이적으로 억제하고, 이로 인해 2-케토 3-데옥시-D-만노-옥툴로소네이트 (Kdo)의 그람-음성 유기체의 지질 IVA로의 통합을 차단하는 항세균제를 설명한다. LPS 합성이 중단되면, 지질 IVA와 구조가 유사한 분자가 축적되고, 박테리아 성장이 중단되는 것이 발견되었다. 발명자는 Kdo의 LPS 전구체 지질 종 IVA로의 추가가 에스. 티피뮤리움(S. typhimurium) LT2 및 대장균 (Escherichia coli; E. coli) 둘 다에서 지질 A-Kdo2 형성의 주요 경로인 것으로 결론을 내렸다.
더 최근에는, 외막에서 지질 A 또는 6-아실 지질다당류를 포함하는 LPS가 결핍되었지만, 생존력을 유지하는 그람-음성 박테리아의 돌연변이가 제조되었다. 예를 들어, 미국 특허 공개 2010/0272758은 3-데옥시-d-만노-옥트-2-울로손산 (Kdo)의 합성에 결함이 있는 대장균 K-12 균주 KPM22를 보고한다. KPM22는 대부분 지질 IVA로 구성된 외막 (OM)을 갖는다. 이 유기체들의 생존력은 내막에서 외막으로 지질 IVA의 수송을 용이하게 하는 제2 부위 저해자의 존재에 의해 달성되었다. 이 저해자는 내막에서 지질 IVA 축적의 독성 부작용을 줄이고 OM 생물 발생을 지지하는데 충분한 양의 LPS 전구체를 제공하는 것으로 보고된다. 이 균주에 의해 생산된 LPS 전구체는 내독소 활성이 결핍되며, 최대 1 μg/mL의 LPS 전구체 용량으로 인간 단핵 세포에 의해 TNF-알파 분비를 유발할 수 없는 능력에 의해 결정된 바와 같다. 또한, Mamat et al., (Mol Microbiol. 67(3):633-48, 2008)을 참고하면 된다.
감염 및 패혈성 쇼크(septic shock)와 관련된 용량-제한 부작용은 암 환자에게 생 박테리아의 전신 투여를 크게 제한한다. 이 제한은 야생형 박테리아와 관련된 것이며 (예를 들어, 재검토를 위해 Wiemann and Starnes, Pharmac. Ther. 64:529-564, 1994를 참고하면 된다), 또한 유전적 약독화 박테리아와 관련된 것인데, 이것은 종양 조직에서 선택적으로 증식하고 변형된 지질 A를 발현한다 (예를 들어, Toso et al., J. Clin. Oncol. 20(1): 142-152, 2002를 참고하면 된다). 이 제한은 암 치료를 위해 열사(heat killed) 박테리아의 사용으로 이어졌다. 예를 들어, Havas et al. (Med. Oncol. & Tumour Pharmacother. 10(4): 145-158, 1993), Ryoma et al. (Anticancer Res. 24:3295-3302, 2004), Maletzki et al. (Clin. Develop. Immunol. 2012:1-16, 2012), 미국 특허 번호 8,034,359 B2 (Gunn), 유럽 특허 번호 EP 1,765,391 B1 (Gunn), 및 재검토를 위해, Wiemann and Starnes (Pharmac. Ther. 64:529-564, 1994)를 참고하면된다. 하지만, 비-감염성, 죽은 박테리아는 여전히 LPS-유래 내독소 및 다른 세포 구성요소와 관련된 큰 용량-제한 독성을 유발하는데, 이것은 발열성이며 패혈성 쇼크의 증상을 생산할 수 있다. 따라서, 박테리아로의 암 치료에 있어서 추가의 개선이 필요하다.
암에 걸린 것으로 진단된 포유동물 (예를 들어, 인간)에서 상기 포유동물에게 그람-음성 박테리아의 양을 투여함으로써 암을 치료하는 조성물 및 방법이 본원에서 제공되는데 박테리아는 (i) 포유동물에서 생존 불가능하거나 실질적으로 생존 불가능하고, (ii) 내독소 활성 및/또는 발열성이 실질적으로 감소되며, (iii) 암의 성장 또는 전이 가능성을 억제하는데 충분한 양으로 투여된다. 일부 구체예에서, 그람-음성 박테리아는 포유동물에게 투여 전에 (i) 방사선, (ii) 화학 살균제, (iii) 내독소를 비활성화시키는 항생제 (예를 들어, 폴리믹신 B 또는 폴리믹신 E), 또는 (iv) KD02-지질 IVA의 생합성을 방해하는 항생제 처리에 의해 생존 불가능하거나 또는 실질적으로 생존 불가능하게 된다. 상기 언급된 처리 중 하나 이상에 대한 대안으로, 또는 이것들 이외에, 그람-음성 박테리아는 KD02-지질 IVA의 생합성을 방해하거나 또는 부분적으로 방해하거나 또는 KD02-지질 IVA의 O-아실화를 방지하는 유전적 결함을 더 포함한다. KD02-지질 IVA의 O-아실화를 방해하거나 또는 부분적으로 방해하는 유전적 결함은, 예를 들어, msbB 및 lpxM 자리를 기능적으로 방해하는 결함을 포함한다.
본 개시물의 한 양태에서, 조성물은 내독소 활성 및/또는 발열성의 실질적인 감소를 갖는 실질적으로 생존 불가능한 그람-음성 박테리아 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함한다. 한 구체예에서, 그람-음성 박테리아는 글루타르알데히드 처리에 의해 생존 불가능하게 된다. 또 다른 구체예에서, 내독소 활성 및/또는 발열성은 폴리믹신 B 또는 폴리믹신 E의 처리에 의해 감소된다. 추가의 구체예에서, 내독소 활성 및/또는 발열성은 글루타르알데히드의 처리에 의해 감소된다.
또 다른 양태에서, 암에 걸린 것으로 진단된 포유동물을 치료하는 방법이 제공되는데 내독소 활성 및/또는 발열성의 실질적인 감소를 갖는 실질적으로 생존 불가능한 그람-음성 박테리아의 양을 투여하는 단계를 포함하며, 투여된 양은 암의 성장 또는 전이를 억제하는데 충분하다.
또 다른 양태에서, 본 개시물은 암에 걸린 것으로 진단된 포유동물 (예를 들어, 인간)에서 상기 포유동물에게 그람-음성 박테리아의 양을 투여함으로써 암을 치료하는 방법을 제공하는데 박테리아는 생존 가능하고, 약독화될 수도 있거나 그렇지 않을 수도 있으며, 박테리아의 외막 내에서 지질다당류의 실질적인 또는 전체적인 손실을 초래하는 유전적 결함을 가지고 투여된 양은 암의 성장 또는 전이 가능성을 억제하는데 충분하다.
한 구체예에서, 본 개시물은 암을 치료하는 방법을 제공하는데 암에 걸린 것으로 진단된 포유동물에게 박테리아의 외막 내에서 지질다당류의 실질적 손실을 초래하는 유전적 결함을 갖는 생존 가능한 또는 생존 불가능한 그람-음성 박테리아 유기체의 양을 투여하는 단계를 포함하며, 투여된 양은 암의 성장을 억제하는데 충분하다.
일부 구체예에서, 유전적 결함은 KD02-지질 IVA의 생합성을 방해하거나 또는 부분적으로 방해하거나 또는 KD02-지질 IVA의 O-아실화를 방지한다.
일부 구체예에서, 암은 고체 종양이다.
다른 구체예에서, 포유동물은, 예를 들어, 시클로포스파미드를 포함하는 화학치료제가 더 투여된다. 다른 구체예에서, 포유동물은, 예를 들어, T-세포 수용체 또는 T-세포 수용체 리간드 (예를 들어, CTLA-4, PD-1, PD-L1, 및 PD-L2)의 기능의 억제를 포함하는 면역 기능-억제 수용체 또는 수용체 작용제의 길항제가 더 투여된다.
다른 구체예에서, 포유동물은, 예를 들어, T-세포 수용체를 자극하는 작용제를 포함하는 면역 기능-자극 수용체의 작용제가 더 투여된다. 적합한 수용체 표적은, 예를 들어, GITR, 4-1BB, CD40, 및 OX40을 포함한다.
다른 구체예에서, 포유동물은, 예를 들어, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자, 인터류킨-2, 및 인터류킨-12를 포함하는 면역 기능-자극 시토킨이 더 투여된다.
일부 구체예에서, 그람-음성 박테리아는 살모넬라 또는 에스체리키아이다.
또 다른 구체예에서, 본 개시물은 박테리아에 폴리믹신 B 및 글루타르알데히드를 처리함으로써 그람-음성 박테리아를 죽이고 이것의 내독소 활성 및/또는 발열성을 감소시키는 방법을 제공한다. 한 구체예에서, 생존력은 0%로 감소되고 내독소 활성 또는 발열성은 약 90% 또는 96%만큼 감소된다.
도 1 및 2는 폴리믹신 B (PMB)과 함께 대장균의 배양이 박테리아 세포-관련 내독소 활성 및 세포 생존력의 수준을 감소시킨다는 것을 입증한다. 이것은 실시예 2에서 더 설명된다.
도 3 및 4는 글루타르알데히드 (GA)와 함께 대장균의 배양이 박테리아 세포-관련 내독소 활성 및 세포 생존력의 수준을 감소시킨다는 것을 입증하며, 실시예 3에서 더 설명된 바와 같다.
도 5는 미처리 (도 5A), 1,000 μg/mL PMB (도 5B), 1% GA (도 5C), 또는 PMB 및 GA 둘 다 (도 5D)가 처리된 대장균의 투과 전자 현미경 이미지를 도시하는데, 박테리아가 모든 처리 후에 온전하게 유지된다는 것을 입증하며, 실시예 4에서 더 설명된 바와 같다.
도 6은 마우스에서 피하 쥐 B16F10 흑색종의 성장에 대한 PMB + GA-처리된 대장균의 용량-의존적 효과를 나타내는 그래프를 도시하는데, 실시예 7에서 더 설명된 바와 같다.
도 7은 마우스에서 피하 쥐 B16F10 흑색종의 성장에 대한 미처리 및 1% GA-처리된 대장균의 용량-의존적 효과를 나타내는 그래프를 나타내는데, 실시예 8에서 더 설명된 바와 같다.
도 8A 및 8B는 마우스에서 피하 CT26 쥐 결장 직장 암종(colorectal carcinoma)의 성장에 대한, 규칙적 시클로포스파미드 (도 8A) 또는 항-쥐 CTLA-4 항체 (도 8B)와 함께 및 이것들이 없이 PMB + GA-처리된 대장균의 용량-의존적 효과를 나타내는 그래프를 예시하는데, 실시예 9에서 더 설명된 바와 같다.
생존 불가능한 그람-음성 박테리아 유기체를 포함하고 내독소 및/또는 발열성 활성의 실질적인 감소를 갖는 조성물 및 암으로 고통받는 포유동물에게 내독소 또는 발열성 활성의 실질적인 감소를 갖는 생존 불가능한 그람-음성 박테리아 유기체의 양을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 본원에서 제공되는데, 투여된 양은 암의 성장 또는 전이를 억제하는데 충분하다.
박테리아에 의해 매개된 항-종양 활성의 원인이 되는 가능한 메커니즘(들)은 종양 조직에서 생 박테리아 유기체의 선택적 증식 및, 특히, 숙주 단핵 세포로부터의 종양 파괴성 시토킨 방출의 LPS (내독소)-매개 유발을 통한, 숙주 면역 반응의 자극을 포함한다. 하지만, 생 박테리아의 증식 및 시토킨의 LPS (내독소)-매개된 유발 (msbB 돌연변이에 의한 LPS 약독화로)은 포유동물에 생 박테리아의 처리에 관련된 용량-제한 독성의 원인인 것으로 생각된다. Toso et al. (J. Clin. Oncol. 20(1): 142-152, 2002)는 암 환자에게 생 msbB-약독화 살모넬라를 처리하였고 용량-제한 독성은 균혈증(bacteremia) 및 시토킨 방출에 관련된 부작용을 포함하였다. 종양 조직에서 박테리아의 증식은 마우스의 인간 종양 이종 이식 모델에서 나타난 것보다 더 낮아졌고 시토킨-매개된 독성에 대한 민감도는 더 높아졌다. 생존 가능한 박테리아에 의한 전신성 증식 및/또는 부분적으로 하나의 제2 아실 사슬이 결핍된 LPS에 의해 매개된 시토킨-관련 독성은 마우스 이외의 일부 포유동물 (예를 들어, 인간)에게 안전하고 효과적인 용량의 생, 약독화 그람-음성 박테리아의 투여를 방지할 수도 있다고 생각되며, 이것은 박테리아 감염에 비교적 저항성이고 시토킨 유발의 패혈성 결과에 관련된 것으로 알려져 있다.
어떤 이론에도 결부되지 않으면서, 실질적으로 감소된 내독소 활성 및/또는 발열성을 갖는 죽은 또는 생존 불가능한 그람-음성 유기체는 암 환자에게 생 유기체 또는 생존 가능한 유기체를 사용하는 것에 비해 덜 독성이고 암을 치료하는데 더 효과적인 양으로 투여될 수 있다고 생각되는데, 이것은 각 환자의 정상 및 종양 조직에서 전문의에 의해 제어될 수 없는 다양한 방식으로 증식하며, 치료 효과를 생산하기에 불충분하게 증식하거나 또는 너무 많이 증식하고, 이로 인해 허용 불가능한 독성을 생산한다. 또한 실질적으로 감소된 내독소 활성 및/또는 발열성을 갖는 죽은 또는 생존 불가능한 그람-음성 유기체는 암 환자에게 야생형 수준의 내독소 활성 및/또는 발열성을 나타내는 죽은 박테리아를 사용하는 것에 비해 덜 독성이고 암을 치료하는데 더 효과적인 양으로 투여될 수 있다고 생각된다.
또한 박테리아의 외막에서 글리코실화된 지질 A 및 LPS 양의 실질적인 감소를 초래하는 LPS의 형성에 있어서 유전적 결함을 갖는 생존 가능한 그람-음성 유기체는 포유동물 숙주에서 추가의 증식을 방지하기 위해 생 유기체 및 약독화 유기체, 또는 죽은 유기체로서 투여 여부에 따라 암의 치료에 효과적일 수 있고 생각된다. 이러한 유기체는 내독소 쇼크를 유발할 뿐만 아니라 숙주의 면역 시스템에 대한 자극을 제공하는 기능적 LPS 분자가 결핍되지만, 종양 세포 살해 또는 종양 성장 억제를 달성하기 위한 숙주의 선천적 또는 조합된 선천적 및 후천적 면역 반응을 자극하는 그람-음성 박테리아의 다른 특징이 있다고 생각된다.
한 구체예에서, 암 치료에 사용된 그람-음성 유기체는, 본원에서 개시된 바와 같이, 비-박테리아 단백질 (예를 들어, 종양-특이적 항원)을 암호화하거나 이것을 발현하는 DNA를 함유하지 않는다. 그러므로, 그람-음성 유기체는 종양 항원에 특이적인 면역학적 반응을 직접적으로 유발하지 않는다는 점에서 암 백신은 아니다. 대신에, 이 유기체들은 일반적으로 숙주의 선천적 면역 반응 및 아마도 간접적으로 후천적 항-종양 면역 반응을 자극하는 보조제 또는 생체 반응 조절 물질 (biological response modifier; BRM)로 기능한다. 일부 구체예에서, 그람-음성 유기체는 종양 부위에 직접적으로 또는 그 주위에 주사되거나, 또는 전신으로 주사되어 종양에 또는 그 주위에 축적된다. 유기체에 대한 증가된 선천적 면역 반응은 이후에 부차적으로 종양을 향하게 될 수도 있다. 게다가, 또는 대안으로, 유기체에 대한 면역 반응은 후천적 항-종양 반응에 참가할 수 있는 기존의 종양 항원-특이적 면역 세포를 자극하거나 활성화시킬 수도 있다.
대안의 구체예에서, 그람-음성 유기체는, 예를 들어, 종양-특이적 항원 또는 면역계 자극 단백질을 포함하는 비-박테리아 단백질의 발현을 암호화하는 DNA를 발현한다. 다시 말하면, 유기체는 종양 부위에 또는 그 주위에, 또는 전신으로 주사되어, 유기체, 종양-특이적 항원, 또는 둘 다에 대한 선천적 또는 후천적 면역 반응을 유발할 수도 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 종양 특이적 항원은 종양에 의해 발현되지만 종양이 유래된 유기체의 어떤 정상 세포에 의해서도 발현되지 않는 항원을 나타낸다. 용어 종양-관련 항원은 종양에 의해 발현되지만 또한 종양이 유래된 유기체의 정상 세포에 의해서도 제한된 방식으로 발현될 수 있는 항원을 나타낸다. 제한된 방식의 발현은 종양보다 정상 세포에서 더 낮은 수준의 발현, 정상 세포의 제한된 타입에 의한 발현 또는 태아 발육 중에만 정상 세포에 의한 발현 (즉, 태아 항원)을 반영할 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 항원은 면역 반응, 항체 또는 면역 세포 (예를 들어, T 세포)에 의해 인식될 수 있는 어떤 분자도 된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "보조제" 및 "생체 반응 조절 물질"은 항원, 종양 또는 종양-관련 세포에 대한 면역 반응을 향상시키는 어떤 물질도 나타낸다. 따라서, 보조제 또는 생체 반응 조절 물질은 외래성 항원 또는 새로운 항원, 또는 기존 항원의 구조적으로 변화된 또는 비정상 수준을 발현하는 질환-유발 또는 질환-관련 세포에 더 강하게 반응시키기 위해 면역계를 자극하는데 사용된다. 하지만, 일부 구체예에서, 예를 들어, 종양 특이적 또는 종양-관련 항원 또는 시토킨 또는 케모킨과 같은 인간 면역 활성화 단백질을 발현하는 그람-음성 박테리아의 재조합 형태는 개시된 방법에서의 사용에 대하여 고려된다. 대안의 구체예에서, 시토킨 또는 케모킨과 같이 정제된 면역 활성화 단백질은 투여 전 그람-음성 유기체와 혼합되거나, 또는 그람-음성 유기체 전 또는 후에 투여된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 포유동물은 인간, 개, 고양이, 소, 양, 등과 같은 어떤 포유동물도 포함한다. 바람직한 포유동물은 인간이다.
용어 "그람-음성 박테리아"는 그람 염색으로 알려져 있는 과정 중 일부인 초기 염기성 염료 염색 (예를 들어, 크리스탈 바이올렛)을 유지하지 않는 박테리아를 나타낸다. 예시적 그람 염색에서, 세포는 먼저 열에 의해 슬라이드에 고정되고 염기성 염료 (예를 들어, 크리스탈 바이올렛)로 염색되는데, 이것은 그람-음성 및 그람-양성 박테리아 둘 다에 의해 흡수된다. 슬라이드는 이후에 매염제(mordant) (예를 들어, 그람 아이오다인)가 처리되는데, 이것은 염기성 염료 (예를 들어 크리스탈 바이올렛)에 결합하고 그것을 세포에 가둔다. 세포는 이후에 아세톤 또는 알콜로 세척하되고, 이후에 다른 색깔의 제2 염료 (예를 들어, 사프라닌)로 대비염색된다. 그람-양성 유기체는 처음 바이올렛 염색을 유지하는 한편, 그람-음성 유기체는 세척 유기 용제에 의해 탈색되고 이로 인해 대비염색을 나타낸다. 예시적 그람-음성 박테리아는 에스체리키아 종(Escherichia spp.), 시겔라 종(Shigella spp.), 살모넬라 종(Salmonella spp.), 캄필로박터 종(Campylobacter spp.), 네이세리아 종(Neisseria spp.), 헤모필루스 종(Haemophilus spp.), 애로모나스 종(Aeromonas spp.), 프란시셀라 종(Francisella spp.), 예르시니아 종(Yersinia spp.), 클레브시엘라 종(Klebsiella spp.), 보르데텔라 종(Bordetella spp.), 레지오넬라 종(Legionella spp.), 코리네박테리아 종(Corynebacteria spp.), 시트로박터 종(Citrobacter spp.), 클라미디아 종(Chlamydia spp.), 브루셀라 종(Brucella spp.), 슈도모나스 종(Pseudomonas spp.), 헬리코박터 종(Helicobacter spp.) 및 비브리오 종(Vibrio spp.)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
그람-음성 유기체 내에는 많은 공생체(symbiont)와 함께, 살모넬라, 대장균, 페스트균(Yersinia pestis), 클레브시엘라 및 시겔라, 프로테우스(Proteus), 엔테로박터(Enterobacter), 세라티아(Serratia), 및 시트로박터(Citrobacter)와 같이 많은 잘 알려진 병원체를 포함하는 큰 과인 장내세균과(Enterobacteriaceae)가 있다. 장내세균과의 멤버는 여러 멤버들이 동물의 장에 살고 있기 때문에 장내세균으로 불려왔다.
장내세균과는 막대 모양이고, 길이는 전형적으로 1-5 μm이다. 그것들은 조건적 혐기성 생물이며, 당을 발효시켜서 젖산 및 다양한 다른 최종 생성물을 생산한다. 대부분은 또한 질산염을 아질산염으로 환원시키고 일반적으로 시토크롬 C 옥시다제가 결핍된다. 대부분 운동성을 위해 많은 편모를 가지고 있지만, 일부는 비운동성이다. 장내세균과는 포자를 형성하지 않는다.
용어 "벡터"는 핵산 분자를 나타내는데, 이것은 핵산의 단일 조각으로서 결합되는 또 다른 핵산을 수송할 수 있다. 작동 가능하게 결합된 유전자의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 나타난다. 용어 "발현 시스템"은 본원에서 사용된 바와 같이, 발현 벡터의 서열이 DNA로 전사되거나, 구조 RNA로 폴딩되거나(folded), 또는 단백질로 번역되게 할 수 있는 구성성분의 조합을 나타낸다. 발현 시스템은, 예를 들어, 상업적으로 이용 가능하거나 알려져 있는 방법에 따라 쉽게 만들어지는 시험관 내(in vitro) 발현 시스템일 수도 있거나, 또는 발현 벡터를 함유하는 진핵 또는 원핵 숙주 세포와 같이, 생체 내(in vivo) 발현 시스템일 수도 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에 유용한 발현 벡터는 일반적으로, 벡터 형태로는, 박테리아 염색체에 결합되지 않는 환형 이중 가닥 DNA를 나타내는 "플라스미드"일 수 있다. 업계에 잘 알려져 있는 다른 발현 벡터가 또한 발현 시스템에 사용될 수 있다 (예를 들어, 코스미드(cosmid), 파지미드(phagemid) 및 박테리오파지(bacteriophage) 벡터).
용어 "핵산"은 데옥시리보핵산 (DNA), 및, 적절한 경우에는, 리보핵산 (RNA)과 같은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다. 용어는, 동등물로서, 뉴클레오티드 유사체로부터 만들어진 RNA 또는 DNA의 유사체 및 설명된 구체예에 적용 가능한 바와 같이, 단일 (센스(sense) 또는 안티센스(antisense)) 및 이중 가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로 생각되어야 한다.
용어 "조절"은 본원에서 사용된 바와 같이, 상향조절 (즉, 활성화 또는 자극 (예를 들어, 작용시키거나 또는 강화함으로써)) 및 하향조절 (즉, 억제 또는 저해 (예를 들어, 길항작용을 하거나, 감소시키거나 억제함으로써)) 둘 다를 나타낸다. 용어 "유발성"은 특히 본질적인 것은 아니지만 자극 (예를 들어, 온도, 중금속 또는 다른 배지 첨가물)에 반응하여 일어나는 유전자 발현을 나타낸다.
A. 후보 박테리아 유기체
본원의 방법에 의해 이용될 수도 있는 후보 박테리아 유기체는 그람-음성이고 야생형 유기체로서 내독소 활성을 가지고 있는 것들로부터 유래된다. 예시적 그람-음성 박테리아는 에스체리키아 종, 시겔라 종, 살모넬라 종, 캄필로박터 종, 네이세리아 종, 헤모필루스 종, 애로모나스 종, 프란시셀라 종, 예르시니아 종, 클레브시엘라 종, 보르데텔라 종, 레지오넬라 종, 코리네박테리아 종, 시트로박터 종, 클라미디아 종, 브루셀라 종, 슈도모나스 종, 헬리코박터 종 및 비브리오 종을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 후보 그람 음성 유기체는 또한 장내세균과, 슈도모나스과(Pseudomonadaceae), 네이세리아과(Neisseriaceae), 베일로넬라과(Veillonellaceae), 박테로이데스과(Bacteroidaceae), 비브리오과(Vibrionaceae), 파스퇴렐라과(Pasteurellaceae), 및 푸소박테리움과(Fusobacteriaceae) 과에 속한 것들일 수도 있다. 일부 구체예에서, 후보 유기체는 살모넬라 또는 에스체리키아 종의 종이다.
하나의 후보 살모넬라 유기체, VNP20009는 Luo et al., Oncol Res. 12(11-12):501-8, 2001에 의해 설명되었다. VNP20009는 msbB 및 purI 자리에서 결실을 갖는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)의 유전적으로 변형된 균주이다. 종양을 가지고 있는 마우스에 생 VNP20009의 1 x 104 내지 3 x 106 cfu/마우스 범위의 용량으로 정맥 내 투여는 피하로 이식된 B16F10 쥐 흑색종, 및 인간 종양 이종 이식편 Lox, DLD-1, A549, WiDr, HTB177, 및 MDA-MB-231의 성장을 억제하였다. 정맥 내로 제공된 VNP20009가 또한 이 동물들에서 폐 전이의 성장을 억제하였다. 또한, 미국 특허 번호 7,354,592 (Bermudes et al.)를 참고하면 된다.
또 다른 후보 살모넬라 유기체는 Eisenstein et al. Med. Oncol. 12(2): 103-8, 1995에 의해 설명된 SL3235이다. SL3235는 살아있는 채로 투여될 때 마우스에서 형질세포종(plasmacytoma) 종양 성장을 치유할 수 있는 살모넬라의 약독화 균주이다.
추가의 후보 살모넬라는 Hoffman et al., Amino Acids 37:509-521, 2009에 의해 보고된 영양 요구성 돌연변이를 포함한다. 에스. 티피뮤리움 A1-R 돌연변이는 leu-arg에 대하여 영양 요구성이고 높은 항-종양 병독성을 갖는다. 시험관 내, A1-R은 종양 세포를 감염시켜서 핵 파괴를 유발한다. A1-R 투여는 누드(nude) 마우스에서 정위적으로 이식된 전이성 인간 전립선 및 유방 종양을 치료한다. 1차 골육종(primary osteosarcoma) 및 폐 전이에 걸린 누드 마우스에 정맥 내 (i.v.) 투여된 A1-R은 특히 전이에 대하여 효과적이다. A1-R은 또한 누드 마우스에 비장 내로 투여될 때 췌장암 간 전이에 대하여 효과적인 것으로 보고되었다. 또한 미국 특허 공보 20090300779 (Zhao et al.), 및 Zhao et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 102(3):775-760, 2005)를 참고하면 된다.
고체 종양의 치료에 적합한 다양한 그람-음성 유기체는 미국 특허 번호 6,685,935 (Pawelek et al.)에서 보고된다. 이 유기체들은 그것들이 투여 후 종양에서 우선적으로 복제되기 때문에 중복감염성인 것으로 나타난다. 살모넬라 종, 예를 들어, 살모넬라 티피뮤리움의 중복감염성, 종양-특이적 돌연변이가 포함된다. 또한 단순 헤르페스 바이러스(Herpes simplex virus)의 티미딘 키나제, 대장균의 시토신 탈아미노 효소, 또는 인간 마이크로솜 p450 산화 환원 효소와 같은 자살 유전자를 함유하는 살모넬라 종의 중복감염성, 종양-특이적 돌연변이가 설명된다. 또한 Pawelek et al., (Lancet Oncol. 4(9):548-56, 2003)을 참고하면 된다.
한 구체예에서, 대장균은 유기체로서 선택된다. 고려되는 한 특정 균주는 대장균 균주 2617-143-312, (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 13070™)이다. 사용될 수도 있는 추가적인 대장균 균주는 MG1655 (ATCC® 47076) 및 KY8284 (ATCC® 21272)를 포함한다.
본원의 방법에서 사용된 그람-음성 유기체는 유기체의 야생형 형태에 외래성인 DNA를 함유하거나 발현하는 재조합 유기체일 필요가 없다. 하지만, 일부 구체예에서는, 유기체가 일부 비-고유한 분자를 발현하도록 변형될 수도 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 7,452,531은 하나 이상의 1차 작용기 분자(들)의 고체 종양의 부위로의 전달을 위한 약독화 종양-표적화된 박테리아 벡터의 제조 및 사용법을 보고한다. 방법에 따라, 작용기 분자는 숙주에게 전신으로 투여될 때 독성일 수도 있으며, 숙주에 대한 독성이 감소된 약독화 종양-표적화된 박테리아에 의해 종양에 국소적으로 전달될 수 있다. 특히, 약독화 종양-표적화된 박테리아는 하나 이상의 1차 작용기 분자(들)을 암호화하도록 변형된 조건적 호기성 생물 또는 조건적 혐기성 생물일 수 있다. 1차 작용기 분자(들)는 TNF 시토킨 과의 멤버, 항-혈관 형성 인자, 및 세포 독성 폴리펩티드 또는 펩티드를 포함한다.
개시물의 1차 작용기 분자는, 예를 들어, 암종, 흑색종, 림프종, 육종, 또는 이 종양들로부터 유래된 전이와 같은 고체 종양을 치료하는데 유용하다.
B. 박테리아 내독소 활성의 감소
다양한 방법이 박테리아 유기체의 내독소 활성 및/또는 발열성을 감소시키기 위해 사용될 수도 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "내독소 활성"은 발열성 및 패혈성 쇼크를 포함하는 독성을 유발할 수 있는 그람-음성 박테리아의 일부를 나타낸다. 내독소에서 기인한 독성 효과는 그람-음성 박테리아의 외벽에 존재하거나 이것으로부터 유래된 지질다당류 분자의 글리코실화된 지질 A 부분과 연관된 것으로 발견되었다.
용어 "지질다당류" (LPS)는 공유 결합에 의해 결합된 지질 및 다당류 (글리코인지질)로 구성된 큰 분자를 나타낸다. LPS는 세 부분을 포함한다: 1) O-항원; 2) 코어 올리고당, 및 3) 지질 A. O-항원은 코어 올리고당에 부착된 반복성 글리칸 폴리머이고, LPS 분자의 가장 바깥 쪽 도메인을 포함한다. 코어 올리고당은 지질 A에 직접 부착되고 보통 펩토스 및 3-데옥시-D-만노옥툴로손산 (KDO, 케토-데옥시옥툴로소네이트로도 알려져 있음)과 같은 당을 함유한다. 지질 A는 다수의 지방산에 결합된 인산화된 글루코사민 이당류이다. 지방산은 LPS를 박테리아 막에 고정하고, LPS의 나머지는 세포 표면으로부터 돌출된다. 박테리아 죽음은 LPS가 돌연변이되거나 제거되면 발생할 수도 있다.
내독소 활성은 LPS의 지질 A 도메인 부분에 있다. 박테리아 세포가 면역계에 의해 용해되면, 지질 A를 함유하는 막의 단편은 순환계로 방출되며, 고열 (발열성), 설사, 및 잠재적 치명적 쇼크 (내독소 또는 패혈성 쇼크로 불림)를 유발한다. LPS의 독성은 포유동물 면역계의 B-세포와 대식세포의 상호작용, 전염증성 시토킨, 주로 종양 괴사 인자 (TNF)의 분비로 이어지는 공정을 통해 지질 A에 의해 발현되며, 이것은 숙주에 대하여 치명적인 결과를 초래할 수도 있다. 지질 A는 또한 "시험관 내" 인간 T-림프구 (Th-1), 뿐만 아니라 "생체 내" 쥐 CD4+ 및 CD8+ T-세포를 활성화시키는데, 이것은 숙주의 면역계가 LPS의 가변적-크기 탄수화물 사슬에 대한 특이적, 면역 기억(anamnestic) IgG 항체 반응을 증가하게 하는 속성이다. 이것들에 기초하여, LPS는 현재 "생체 내" T-세포 의존적 항원으로 인식되고 있다.
내독소 활성은 업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해 측정될 수 있는데, 예를 들어, 리뮬루스 아메보사이트 용해물 (Limulus Amebocyte Lysate; LAL) 검정을 포함하며, 이것은 투구게(horseshoe crab)의 혈액을 활용하고, 매우 낮은 수준의 LPS를 검출할 수 있다. 내독소 활성의 존재는 효소 캐스케이드(cascade)를 통한 증폭으로 인해 리뮬루스(limulus) 혈액 용해물의 응고를 일으킬 것이다. LAL 검정의 젤 응고, 혼탁도 측정, 및 발색 형태는 상업적으로 이용 가능하다. 예를 들어, Lonza, Allendale, NJ, and Clongen Labs, Germantown, MD를 참고하면 된다.
독일 뮌헨 영역의 Hyglos의 EndoLISA®와 같은 효소 결합 면역 흡착 검정 (Enzyme linked immunoadsorbent assay; ELISA)-기반 내독소 활성 검정이 또한 알려져 있다. 이 검정은 고체상에 부착된 LPS 특이적 파지 단백질을 이용하여 LPS를 캡쳐하고, 세척 단계 후, LPS의 존재가 재조합 인자 C의 추가에 의해 결정되는데, 이것은 LPS에 의해 활성화될 때, 이후 형광물질을 방출하는 화합물을 분할한다. 인자 C는 리뮬루스 아메보사이트 용해물에 존재하며, 보통 지모겐으로 존재하고, LAL 테스트에서 발생하는 응고 캐스케이드의 프라이머다.
내독소 활성은 또한 시험관 내에서 1차 말초 혈액 단핵구 세포로부터 TNF-알파 분비의 유발을 평가하거나, 또는 동물에 내독소의 의심되는 공급원을 처리하고 대략 1 내지 4시간 후 동물로부터 얻은, 혈장의 TNF-알파 수준을 측정함으로써 측정될 수 있다. 1차 포유동물 말초 혈액 단핵구 세포는 Lonza (Allendale, NJ, USA)와 같은 회사로부터 구입될 수 있다. 세포 상층액 또는 혈장의 TNF-알파 수준은 ELISA 키트, 예를 들어, Thermo Scientific (Rockford, IL, USA), Abeam (Cambridge, MA, USA) 또는 eBioscience (San Diego, CA, USA)로부터 이용 가능한 것들로 결정될 수 있다.
내독소 활성은 또한 정맥 내로 투여된 유기체 또는 이것의 유도체에 반응하여 토끼에서의 발열성 (직장 온도 증가)을 측정함으로써 생체 내에서 평가될 수 있다.
그람-음성 유기체의 내독소 활성 및/또는 발열성은 야생형 유기체와 비교하여 실질적으로 감소될 수도 있다. 내독소 활성의 실질적 감소는 바람직하게는 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 95% 이상 및 약 99% 이상이다.
다양한 방법은 그람-음성 유기체의 내독소 활성을 감소시키는데 이용 가능하다. 방법은 LPS에 결합하거나 그것의 형성을 방해하는 약제의 처리, 또는 LPS를 변형시키거나 LPS 형성을 억제하도록 박테리아 유기체의 유전적 조작에 의한 것들을 포함한다.
한 구체예에서, 내독소 활성 또는 발열성의 감소는 박테리아 유기체에 내독소를 비활성화시키는 항생제를 처리함으로써 달성된다. 적합한 이러한 항생제는 폴리믹신 B 또는 폴리믹신 E이다. 예를 들어, Cooperstock et al., Infect Immun. 1981 Jul;33(l):315-8은 폴리믹신 B 처리가 보르데텔라 페르투시스(Bordetella pertussis), 대장균, 헤모필루스 인플루엔재(Haemophilus influenzae), 및 슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)를 포함하는 그람-음성 박테리아의 백신에서 LPS의 염증 반응성을 감소시킬 수 있다고 보고한다. 항생제의 양 및 처리의 조건을 결정하는 것은 당업자의 기술 내에 있다. 한 구체예에서, 폴리믹신, 폴리믹신 B 또는 E는 밀리리터 당 1x107 내지 5x1010개의 박테리아 당 대략 3 마이크로그램 내지 5,000 마이크로그램의 농도로 이용될 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 폴리믹신의 농도는 밀리리터 당 1x107 내지 5x1010개의 박테리아 당 약 200 마이크로그램 내지 5,000 마이크로그램일 수도 있다. 한 구체예에서, 항생제는 박테리아에 10분 내지 4시간 동안 또는 약 30분에서 약 3시간까지 적용된다. 한 구체예에서, 박테리아는 MgCl2의 형태로 마그네슘 (Mg)의 존재 시 성장하였고 MgCl2의 존재 시, 뿐만 아니라 박테리아의 온전함을 유지하는데 적합한 온도에서 폴리믹신이 처리된다. 한 구체예에서, 성장 배지에서 MgCl2의 농도는 약 0.5 mM 내지 약 5.0 mM, 또는 약 2 mM이고, 처리 배지에서 MgCl2의 농도는 약 5.0 mM 내지 약 30 mM, 또는 약 20 mM이다. 한 구체예에서, 처리 배지의 온도는 약 2℃ 내지 약 10℃, 또는 약 4℃이다. 박테리아 온전성은 3,000 x g에서 10분 동안 원심분리 후 명확한 펠렛에서 회수의 효율, 및 전자 현미경에 의해 결정된다. 바람직한 구체예에서, 처리 및 세척 후 박테리아 회수는 약 80% 이상이고 박테리아는 전자 현미경으로 온전한 것으로 나타난다.
또 다른 구체예에서, 내독소 활성의 감소는 박테리아 유기체에 KD02-지질 IVA의 생합성을 방해하는 것으로 알려져 있는 항생제를 처리함으로써 달성된다. 예를 들어, Goldman et al., J Bacteriol. 170(5):2185-91, 1988은 항세균제를 설명하는데, 항세균제 III를 포함하며, 이것은 CTP:CMP-3-데옥시-D-만노-옥툴로소네이트 시티딜일트랜스퍼라제 활성을 특이적으로 억제하고 3-데옥시-D-만노-옥툴로소네이트 (KDO)의 그람-음성 유기체의 LPS로의 통합을 차단하는데 유용하다. LPS 합성이 중단되면, 박테리아 성장이 중단된다. KDO의 LPS 전구체 종 지질 IVA로의 추가는 에스. 티피뮤리움 및 대장균 둘 다에서 지질 A-KDO 형성의 주요 경로이다.
한 구체예에서, 항생제는 항세균제 III이고 그람-음성 박테리아는 적합한 시간, 예를 들어, 2 내지 8시간 동안 적합한 양, 예를 들어, 밀리리터 당 5 마이크로그램 내지 밀리리터 당 500 마이크로그램이 처리된다.
내독소 활성의 감소는 유전적 결함을 유기체로 도입함으로써 달성될 수도 있다. 용어 "결함"은 본원에서 사용된 바와 같이, 유전자 또는 유전자의 발현에 관하여, 유전자가 정상 (야생형) 유전자와 다르거나 유전자의 발현이 야생형 유전자와 비교하여 감소된 발현의 수준에 있다는 것을 의미한다. 결함 유전자는 상기 유전자의 돌연변이, 또는 상기 유전자의 발현 (예를 들어, 전사 또는 전사 후)을 조절하는 돌연변이로부터 발생할 수도 있다
한 구체예에서, 내독소 활성의 감소는 KD02-지질 IVA의 생합성을 방해하는 유전적 결함을 도입함으로써 달성될 수도 있다. 예를 들어, Woodard et al., 미국 특허 공보 제20100272758은 외막 내에서 실질적으로 LPS가 결핍된 생존 가능한 비-독성 그람-음성 박테리아 (예를 들어, 대장균)을 보고한다. 발명자들은 대장균 K-12 균주 KPM22를 3-데옥시-d-만노-옥툴로손산 (Kdo)의 합성에 있어서 결함이 있는 것으로 설명한다. KPM22는 대부분 지질 IVA, 글리코실화가 결핍된 LPS 전구체로 구성된 외막 (OM)을 갖는다. 유기체의 생존력은 지질 IVA를 내막 (IM)에서 외막으로 수송하는 제2 부위 저해자의 존재에 의해 달성된다. 이 저해자는 내막에서 지질 IVA 축적의 독성 부작용을 줄이고 OM 생물 발생을 지지하는데 충분한 양의 LPS 전구체를 제공하는 것으로 보고된다. 또한, Mamat et al., (Mol Microbiol. 67(3):633-48, 2008)을 참고하면 된다.
또 다른 구체예에서, Bramhill et al., 미국 특허 공보 제2011-0224097은 지질 A 또는 TLR4/MD2의 작용제의 역할을 하는 6-아실 지질다당류와 같은 리간드가 실질적으로 결핍된 외막을 포함하는 생존 가능한 그람-음성 박테리아를 설명한다. Bramhill에 따르면, 박테리아는, 예를 들어, 지질 IVA를 수송하기 위한 수송력을 증가시키는 운반체에서, 또는 막 단백질 YhjD에서 아라비노스-5-포스페이트 이소머라제의 감소된 활성 및 하나 이상의 저해자 돌연변이를 포함할 수도 있다. 하나 이상의 유전자 (예를 들어, lpxL, lpxM, pagP, lpxP, 및/또는 eptA)는 실질적으로 결실될 수도 있고 및/또는 하나 이상의 효소 (예를 들어, LpxL, LpxM, PagP, LpxP, 및/또는 EptA)는 실질적으로 비활성일 수도 있다.
또 다른 구체예에서, 내독소 활성의 감소는 Kdo의 합성을 방지하는 유전적 결함을 도입함으로써 달성될 수도 있다. 예를 들어, Rick et al., (Proc Natl Acad Sci U S A. 69(12):3756-60, 1972)는 LPS의 3-데옥시-D-만노옥툴로소네이트 (케토데옥시옥토네이트) 영역의 합성에 결함이 있고 성장에 D-아라비노스-5-포스페이트를 필요로 하는 살모넬라 티피뮤리움의 영양 요구성 돌연변이를 보고한다. 돌연변이 결함은 모체 효소보다 35배 더 높은 D-아라비노스-5-포스페이트에 대하여 명백한 K(m)을 갖는 변화된 케토데옥시옥토네이트-8-포스페이트 합성 효소 (kdsA) 때문이었다.
이것은 돌연변이 균주가 성장 및 완전한 LPS의 합성 둘 다에 대하여 외인성 D-아라비노스-5-포스페이트에 의존적인 원인이었다. 또 다른 예에서, Belunis et al., (J. Biol. Chem. 270(46):27646-27652, 1995)은 대장균에서 Kdo 전이 효소 (kdtA) 유전자를 방해하였는데, 이것은 Kdo의 지질 IVA로의 통합을 방지하였다. 이 돌연변이는 치명적이지만, kdtA를 암호화하는 온도-민감성 플라스미드의 조건부 존재에 의해 구제될 수 있다. Kdo 합성 경로에서 조건부 돌연변이의 발달은 박테리아의 성장을 허용한 후 이어서, 비-허용성 조건으로 수송하여, 크게 감소된 내독소 활성을 갖는 생존 불가능한 박테리아를 생산하는데 충분한 성장 또는 생존을 일으킨다.
LPS-유래 내독소에 더하여, 그람-음성 유기체의 다양한 다른 구성요소는 발열성 및 패혈성 쇼크를 유발하거나 이것들에 기여할 수 있으며, 외막 단백질, 핌브리애(fimbriae), 필리(pili), 지질펩티드, 및 지질단백질을 포함한다 (Jones, M., Int. J. Pharm. Compd., 5(4):259-263, 2001에 의해 재검토됨). 발열성은 업계에 잘 알려져 있으며, 추정상 발열원의 정맥 내 투여 후 직장 온도의 평가를 수반하는 토끼 방법에 의해 측정될 수 있다.
그람-음성 유기체에 폴리믹신 B 및 글루타르알데히드의 조합의 처리는 발열성의 30배 감소를 일으킨다는 것이 발견되었으며, 토끼에서 측정된 바와 같다. 한 구체예에서, 폴리믹신 B 및 1% 글루타르알데히드의 1,000 밀리리터 당 마이크로그램 (μg/mL)을 이용하여 발열성의 30배 감소를 일으켰으며, 토끼에서 측정된 바와 같다. 발열성은 LPS와의 폴리믹신 B 반응 및 LPS 및/또는 다른 박테리아 구성요소와의 글루타르알데히드 반응성의 조합에 의해 감소된다. 글루타르알데히드는 이 설정에서 박테리아를 또한 죽임으로써 이중의 역할을 한다. 따라서, 한 구체예에서, 상기 박테리아에 1,000 μg/mL 폴리믹신 B 및 1% 글루타르알데히드의 조합을 처리함으로써 그람-음성 박테리아 미생물의 내독소 활성 및 발열성을 감소시키고 이것들을 죽이는 방법이 제공된다. 또 다른 구체예에서, 그람-음성 박테리아는 약 3 μg/mL 내지 약 1,000 μg/mL 용량 범위의 폴리믹신 B 및 약 0.1% 내지 약 1.0% 용량 범위의 글루타르알데히드의 조합이 처리된다. 추가의 구체예에서, 폴리믹신 B의 용량 범위는 약 100 μg/mL 내지 약 1,000 μg/mL이고, 글루타르알데히드는 약 0.5% 내지 약 1.0% 용량 범위에 있다. 추가적으로, 그람-음성 박테리아는, 예를 들어, 약 1,000 μg/mL 내지 약 3,000 μg/mL의 폴리믹신 B의 용량 범위가 처리될 수도 있고 글루타르알데히드는 약 0.5% 내지 약 1.0%의 용량 범위에 있다. 또 다른 양태에서, 그람-음성 박테리아는 약 3,000 μg/mL 내지 약 5,000 μg/mL의 폴리믹신 B의 용량 범위가 처리될 수도 있고 글루타르알데히드는 약 0.5% 내지 약 2.0%의 용량 범위에 있다. 한 구체예에서, 내독소 활성은 약 70%, 또는 약 75%, 또는 약 80%, 또는 약 85%, 또는 약 90%, 또는 약 92% 만큼 감소되고 발열성은 약 75%, 또는 약 80%, 또는 약 85%, 또는 약 90%, 또는 약 95%, 또는 약 97% 만큼 감소된다.
C. 박테리아를 생존 불가능하게 만들기
본 개시물의 방법에 따라 투여용 박테리아는 투여 전에 생존 불가능하거나 실질적으로 생존 불가능하게 되거나 또는 투여 시에 그렇게 된다. "생존 불가능한"은 유기체가 외인성 약제의 투여에 의해 죽고, 및/또는 유기체가 포유동물 숙주에서 생존할 수 없는 능력을 발생시키는 돌연변이를 함유한다는 것을 의미한다. 실질적으로 생존 불가능한 박테리아는 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 또는 그 이상 만큼 감소된 생존력을 갖는 균주이다. 죽여지지 않거나 완전히 죽여지지 않는 박테리아에 대한 바람직한 구체예에서, 박테리아는 포유동물 숙주 내에서 증식할 수 없도록 더 처리되거나 변형된다. LPS가 실질적으로 생산되지 않는 일부 구체예에서, 생존 불가능한, 약독화, 또는 생존 가능한 박테리아가 투여되는 것이 고려된다.
박테리아를 생존 불가능하게 만드는 바람직한 방법은 LPS에 결합하고, 이로 인해 그것의 내독소 활성을 차단하는 화합물의 처리, 또는 LPS 생합성에 간섭하는 화합물의 처리이다. 두 경우, LPS 결합 및 LPS 합성에 간섭 모두에서, 생존력은 세포 외피 투과화의 결과로서 감소된다. 또 다른 접근법은 성장 중에 저하되는 LPS 생합성 경로에서 조건부 돌연변이를 가진 박테리아 균주를 키우고 이후에 돌연변이를 활성화하고 LPS 생합성을 방해하는 비-허용성 조건으로 수송하는 것이다. 각각의 경우에, 적용된 과정은 각 설정에서, 처리의 최적 시간 또는 화합물의 용량을 결정함으로써 박테리아를 생존 불가능하게 하는 것이며, 이로 인해 생존력은 중요한 박테리아 세포 온전성의 유지로 실질적으로는 손실되었다. 비-생존력이 100% 미만인 경우에, 포유동물 (예를 들어, 디아미노피멜산 영양 요구체, Bukhari and Taylor, J. Bacteriol. 105(3):844-854, 1971 및 Curtiss et al., Immunol. Invest. 18(1-4):583-596, 1989에 의해 설명된 바와 같음) 숙주에서 생존 가능한 박테리아의 추가의 증식을 방지하는 돌연변이를 함유하는 박테리아가 사용될 수 있다.
박테리아를 생존 불가능하게 하는 대체 또는 추가의 방법이 요구되는 경우, 박테리아를 죽이는 바람직한 방법은 전리 방사선(ionizing radiation) (감마선 또는 전자 빔)이지만, 습기 또는 건열, 멸균 가스 또는 증기와 같은 다른 표준 멸균 방법에 의해서도 실행될 수 있다 (예를 들어, Shintani et al., Biocontrol Science, 16(3):85-94, 2011을 참고하면 된다). 사용될 수 있는 종말 살균법(terminal sterilization)의 추가적인 비표준 방법은 화학 살균제와 같은 화학적 치료를 포함하고, Rutala and Weber (Emerg. Infect. Dis. 7(2):348-353, 2001) 및 Yaman (Curr. Opin. Drug Discov. Develop. 4(6):760-763, 2001)에 의해 요약된다. 화학 가스, 증기 및 액체 살균제의 예는 에틸렌 옥시드 가스 (EOG), 이산화염소, 액체 과산화수소 (VHP)의 증기상, 포름알데히드, 글루타르알데히드 (예를 들어, ≥10분 동안 ≥0.05%), 오르토-프탈알데히드 (OPA) (예를 들어 ≥5분 동안 ≥0.1%), 및 페놀을 포함한다. 박테리아를 죽이는 방법은 유기체의 온전성에 영향을 미칠 수도 있다. 예를 들어, 열의 추가는 방사선의 사용과 달리, 박테리아 온전성을 손상시킬 수도 있다. 박테리아 유기체에 대한 지시대상은 본원에서 사용된 바와 같이, 완벽하게 온전한 유기체 및 유기체가 죽여질 때 발생할 수도 있는 유기체의 부분적으로 분해된 형태를 포함하지만, 세포벽 분획 (조성물) 또는 세포벽 골격 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,436,727을 참고하면 된다), 세포질 분획, 등과 같은 다른 세포 구성성분으로부터 분리되는 유기체의 세포 이하 분획까지 연장되지 않는다.
D. 조성물
한 구체예에서, 내독소 및/또는 발열성 활성의 실질적 감소를 갖는 생존 불가능한 그람-음성 박테리아 유기체 및 약학적으로 허용 가능한 부형제를 포함하는 조성물이 제공된다. 또 다른 구체예에서, 유기체의 적어도 약 80%가 생존 불가능하거나 유기체의 적어도 약 90%가 생존 불가능하거나, 또는 유기체의 약 100%가 생존 불가능하다. 한 구체예에서, 유기체는 약 80%, 또는 약 85%, 또는 약 90%, 또는 약 95%, 또는 약 100% 만큼 감소된 생존력을 갖는다.
한 구체예에서, 내독소 및/또는 발열성 활성은 약 70%, 또는 약 75%, 또는 약 80%, 또는 약 85%, 또는 약 90%, 또는 약 95% 만큼 감소된다. 조성물은 내독소 또는 발열성 독성의 어떤 고려된 감소와 결합하여 생존 불가능하거나 생존력-감소된 유기체의 어떤 고려된 양을 함유할 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 조성물은 적어도 약 95% 감소된 내독소 활성 및 발열성을 갖는 적어도 약 100% 생존 불가능한 유기체를 포함한다.
본원에서 설명된 조성물은 본원에서 설명된 방법에서 사용된 다양한 방식으로 제형화될 수도 있다. 한 구체예에서, 조성물은 전반에 걸쳐 설명된 바와 같은 유기체 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함한다.
"약학적으로 허용 가능한 담체"는 조성물에서 사용될 수도 있는 어떤 희석제, 부형제, 또는 담체도 나타낸다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 이온 교환체, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민, 완충 물질, 예를 들어, 포스페이트, 글리신, 소르브산, 칼륨 소르베이트, 식물성 포화 지방산의 불완전 글리세리드 혼합물, 물, 염 또는 전해질, 예를 들어, 프로타민 술페이트, 인산수소이나트륨, 인산수소칼륨, 염화나트륨, 아연 염, 콜로이드 실리카, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기반 물질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 폴리아크릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌-폴리옥시프로필렌-차단 폴리머, 폴리에틸렌 글리콜 및 양모지(wool fat)를 포함한다. 적합한 약학적 담체는 본 분야의 표준 참조 텍스트인 Remington 's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company에서 설명된다. 그것들은 의도된 형태의 투여, 즉, 경구용 타블렛, 캡슐, 엘릭서(elixir), 시럽 등에 관하여 선택되고, 통상적인 약학적 관행과 일치한다.
약학적 조성물은 발효기에서 미생물 성장과 같이 업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해 제조된 후 이어서, 그 중에서도, 원심분리, 여과 또는 투석, 통상적인 과립화, 혼합, 용해, 캡슐화, 동결건조, 또는 에멀젼화 공정에 의해 농축 및 세척될 수도 있다. 조성물은 다양한 형태로 생산될 수도 있으며, 과립, 침전, 또는 미립자, 동결 건조되거나, 회전 건조되거나 분무 건조된 분말, 무정형 분말을 포함하는 분말, 주사액, 에멀젼, 엘릭서, 현탁액 또는 용액을 포함한다. 제형화는 선택적으로 안정화제, pH 개질제, 계면활성제, 생체 이용성 개질제 및 이것들의 조합을 함유할 수도 있다.
약학적 조성물은 멸균 액체, 예를 들어, 오일, 물, 알콜, 및 이것들의 조합을 사용하여 액체 현탁액 또는 용액으로 제조될 수도 있다. 약학적으로 적합한 계면활성제, 현탁화제 또는 에멀젼화제는 경구 또는 비경구 투여를 위해 추가될 수도 있다. 현탁액은 오일, 예를 들어, 땅콩 오일, 참기름, 면실유, 옥수수 오일 및 올리브 오일을 포함할 수도 있다. 현탁 조제물은 또한 지방산의 에스테르, 예를 들어, 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 지방산 글리세리드 및 아세틸화된 지방산 글리세리드를 함유할 수도 있다. 현탁 제형은 알콜, 예를 들어, 에탄올, 이소프로필 알콜, 헥사데실 알콜, 글리세롤 및 프로필렌 글리콜을 포함할 수도 있다. 에테르, 예를 들어, 폴리(에틸렌글리콜), 석유 탄화수소, 예를 들어, 미네랄 오일 및 바셀린(petrolatum), 및 물은 또한 현탁 제형에서 사용될 수도 있다.
조성물은 포유동물, 바람직하게는 인간에게 약학적 투여를 위해 제형화된다. 본 발명의 이러한 약학적 조성물은 다양한 방식으로 투여될 수도 있는데, 비경구를 포함한다. 용어 "비경구"는 본원에서 사용된 바와 같이, 피하, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 활액 내, 흉골 내, 척추강 내, 간장 내, 병소 내 및 두개 내 주사 또는 투입 기술을 포함한다.
조성물의 멸균 주사 가능 형태는 수성 또는 유성 현탁액일 수도 있다. 이 현탁액은 업계에 알려져 있는 기술에 따라 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 제형화될 수도 있다. 멸균 주사 가능 조제물은 또한 비-독성 비경구로 허용 가능한 희석제 또는 용제 중의 멸균 주사 가능 용액 또는 현탁액, 예를 들어, 1,3-부탄디올 중의 용액일 수도 있다. 이용될 수도 있는 허용 가능한 비히클(vehicle) 및 용제 중에는 가 물, 링거 용액(Ringer's solution) 및 염화나트륨 등장액이 있다. 게다가, 멸균 지방유(fixed oil)는 통상적으로 용제 또는 현탁화 배지로서 이용된다. 이 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디-글리세리드를 포함하는 어떤 완하성 지방유도 이용될 수 있다. 지방산, 예를 들어, 올레산 및 그것의 글리세리드 유도체는 특히, 폴리옥시에틸화된 버젼의 천연 약학적 허용 가능 오일, 예를 들어, 올리브 오일 또는 피마자유(castor oil)와 같이, 주사액의 제조에 있어서 유용하다. 이 유제(oil solution) 또는 현탁액은 또한 장쇄 알콜 희석제 또는 분산제(dispersant), 예를 들어, 카르복시메틸 셀룰로스 또는 에멀젼 및 현탁액을 포함하는 약학적으로 허용 가능한 투약 형태의 제형으로 흔히 사용되는 유사한 분산제(dispersing agent)를 함유할 수도 있다. 다른 흔히 사용되는 계면활성제, 예를 들어, Tween, Span 및 약학적으로 허용 가능한 고체, 액체, 또는 다른 투약 형태의 제조에 있어서 흔히 사용되는 다른 에멀젼화제 또는 생체 이용 가능성 인핸서(enhancer)가 또한 제형화의 목적을 위해 사용될 수도 있다. 조성물은 주사, 예를 들어, 볼루스(bolus) 주사 또는 지속적 투입에 의한 비경구 투여를 위해 제형화될 수도 있다.
E. 암을 치료하는 방법
본원의 방법에 의한 치료에 적합한 암은 일반적으로, 암종, 백혈병 또는 림프종, 및 육종을 포함한다. 암종은 항문, 담도, 방광, 유방, 결장, 직장, 폐, 인두, 하인두, 식도, 위, 췌장, 간, 신장, 담낭 및 담관, 소장, 요로, 여성 생식기, 남성 생식기, 내분비선, 갑상선, 및 피부의 것일 수도 있다. 다른 적합한 암은 카르시노이드 종양(carcinoid tumor), 위장관 간질성 종양(gastrointestinal stromal tumor), 두경부 종양(head and neck tumor), 원발부위 불명 종양(unknown primary tumor), 혈관종(hemangioma), 흑색종, 악성 중피종(malignant mesotheliom), 다발성 골수종(multiple myeloma), 및 뇌, 신경, 눈, 및 뇌막의 종양을 포함한다. 일부 구체예에서, 치료되는 암은 고체 종양, 예를 들어, 암종, 육종, 흑색종 및 림프종을 형성한다.
암 치료는, 본원에서 설명된 바와 같이, 암의 성장 또는 전이를 억제하는데 충분한 그람-음성 (적절하게 살아있거나 죽은) 유기체의 양을 투여함으로써 달성된다. 본원에서 이용된 바와 같이, 구절 "충분한 양"은 이것의 수령체에 대한 유익한 효과를 전달하는데 충분한 용량 (또는 일련의 용량)을 나타낸다. 어떤 특정 대상체에 특이적인 치료적 유효량 수준은 치료되는 암의 타입, 암의 심각도, 특이적 유기체 또는 조합된 조성물의 활성, 투여의 경로, 유기체 또는 조합된 조성물의 제거 속도, 치료 기간, 유기체와 조합하여 사용된 약물 (있으면), 대상체의 나이, 체중, 성별, 식단, 및 일반적인 건강 등 의학 및 과학 업계에 잘 알려져 있는 인자를 포함하는 다양한 인자에 의존할 것이다. "치료적 유효량"을 결정하는데 있어서 고려되는 다양한 일반적인 고려사항은 당업자들에게 알려져 있고, 예를 들어, Gilman et al., eds., Goodman And Gilman's: The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8th ed., Pergamon Press, 1990; 및 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990에서 설명된다. 투약 수준은 전형적으로 약 0.001 내지 100 mg/kg/일의 범위에 속하며; 약 0.05 내지 10 mg/kg/일의 범위의 수준이 일반적으로 화합물에 적용 가능하다. 투여된 유기체를 위한 투약 수준은 전형적으로 m2 당 약 106 내지 1012의 범위에 속한다. 조성물은 비경구로, 예를 들어, 혈관 내, 정맥 내, 동맥 내, 근육 내, 피하, 경구 등으로 투여될 수 있다. 박테리아 유기체는 비경구로, 예를 들어, 혈관 내, 정맥 내, 동맥 내, 근육 내, 피하, 복강 내, 또는 방광 내로 투여될 수 있다.
치료적 유효량은 업계에 잘 알려져 있는 방법에 의해 추정될 수 있다. 암 동물 모델, 예를 들어, 쥐 종양을 가진 면역 적격(immune-competent) 마우스 또는 인간 종양 이종이식편을 가진 면역력이 약화된(immune-compromised) 마우스 (예를 들어, 누드 마우스)는 업계에 잘 알려져 있고 본원에서 참조를 위해 포함된 많은 참고문헌에서 광범위하게 설명되어 있다. 이러한 정보는 인간에서 안전하고 잠재적으로 유용한 초기 용량을 결정하기 위해 래트, 개 및/또는 비-인간 영장류의 안전성 연구와 조합하여 사용된다. 유기체의 용량을 추정하는 추가적인 정보는 실제 인간 암의 연구로부터 비롯될 수 있다. 예를 들어, Toso et al. (J Clin Oncol. 20(1): 142-52, 2002)은 생 VNP20009가 전이성 흑색종에 걸린 환자에게 투여되는 단계 I 임상 실험을 보고한다. 환자는 10(6) 내지 10(9) cfu/m(2)의 VNP20009를 함유하는 30분 정맥 내 볼루스 투입물을 받았다. 최대-허용 용량은 3 x 10(8) cfu/m(2)였다. 용량-제한 독성은 1 x 10(9) cfu/m(2)를 받은 환자에서 관찰되었는데, 이는 혈소판 감소증(thrombocytopenia), 빈혈증(anemia), 지속적 균혈증(persistent bacteremia), 빌리루빈과잉혈증(hyperbilirubinemia), 설사, 구토, 구역질, 높아진 알칼리 포스파타제, 및 저인산염혈증(hypophosphatemia)를 포함하였다.
유기체는 약학적으로 허용 가능한 제형으로서 투여될 수도 있다. 용어 "약학적으로 허용 가능한"은 재료가 생물학적으로 또는 달리 바람직하지 않은 것은 아니라는 것을 의미한다, 즉, 재료는 어떤 바람직하지 않은 생물학적 효과도 유발하거나 또는 다른 투여된 약제 중 어떤 것과도 해로운 방식으로 상호작용하지 않으면서 선택된 유기체 또는 결합된 화합물과 함께 개체에 투여될 수도 있다. 이것은 상기 더 충분히 설명된다.
용어 질병 또는 질환에 걸린 대상체를 "치료하는"은, 본원에서 사용된 바와 같이, 질병 또는 질환의 적어도 하나의 증상을 치유할 뿐만 아니라 개선하는 것을 포함하는 것으로 의도된다. 환자의 암이 치유되거나, 암이 차도를 보이거나, 생존이 통계적으로 유의한 방식으로 길어지거나, 종양 진행에 대한 시간이 통계적으로 유의한 방식으로 증가되거나, 림프구성 또는 조혈성 악성 종양의 각 타입에 대하여 확립된 규격 기준을 기반으로 하여 림프구성 또는 조혈성 종양 크기가 감소되거나, 또는 고체 종양 크기가 고체 종양의 반응 평가 기준에 의해 한정된 바와 같이 감소되었으면 암 환자가 치료된다 (RECIST 1.0 또는 RECIST 1.1, Therasse et al. J Natl. Cancer Inst. 92(3):205-216, 2000 및 Eisenhauer et al. Eur. J. Cancer 45:228-247, 2009). 본원에서 사용된 바와 같이, "차도"는 이전에 암의 증거를 가진 환자에서 암 세포의 성장의 부재를 나타낸다. 따라서, 차도가 있는 암 환자는 암이 치유되거나 암이 존재하지만 쉽게 검출되지 않는다. 따라서, 암은 종양이 확대되거나 전이하는데 실패할 때 차도가 있을 수도 있다. 완전한 차도는 본원에서 사용된 바와 같이, 진단 방법, 예를 들어, x-선, MRI, CT 및 PET와 같은 이미징(imaging), 또는 혈액 또는 골수 생검에 의해 지시된 바와 같이 병이 없는 것이다. 암 환자가 차도가 있을 때, 암이 다시 나타나면, 이것은 재발로 이어질 수도 있다.
용어 "실질적으로"는 달리 지시되지 않으면 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 및 약 99% 이상을 의미한다.
F. 암 치료용 조합
본원에서 설명된 암 치료 방법은 숙주 면역 반응을 음성으로 조절하는 수용체 또는 리간드의 하나 이상의 길항제와 함께 그람-음성 유기체의 투여를 이용할 수도 있다. 길항제는 PD-1, PD-L1 또는 CTLA-4에 관한 것일 수도 있고 전형적으로는, 예를 들어, 1 내지 4주마다 킬로그램 당 약 0.03 밀리그램 내지 킬로그램 당 약 30 밀리그램의 용량 범위로 정맥 내로 투여된다.
예정 세포사 단백질 1 (PD-1)은 인간에서 PDCD1 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. PD-1은 또한 CD279 (분화 클러스터 279)로 지정되었다. PD-1은 268 아미노산의 타입 I 막 단백질이다. PD-1은 T 세포 조절기의 연장된 CD28/CTLA-4 과의 멤버이다. 예를 들어, Ishida et al., EMBO J. 11 (11): 3887-95, 1992를 참고하면 된다. 단백질은 세포 외 IgV 도메인에 이어서 막관통 영역 및 세포 내 꼬리를 함유한다. 세포 내 꼬리는 면역수용체 티로신-기반 억제 모티프(motif) 및 면역수용체 티로신-기반 전환 모티프 내에 두 개의 인산화 부위를 함유한다. 이것은 PD-1이 TCR 신호전달을 부정적으로 조절한다고 제안한다. PD-1은 활성화된 T 세포, B 세포, 및 대식세포의 표면 상에서 발현된다. PD-1은 면역 반응의 광범위한 부정적 조절자이다.
PD-1은 두 개의 리간드, PD-L1 및 PD-L2를 가지며, 이것들은 B7 과의 멤버이다. 예를 들어, Freeman et al., J. Exp. Med. 192 (7): 1027-34, 2000 및 Latchman et al., Nat. Immunol. 2(3): 261-8, 2001을 참고하면 된다. PD-L1은 임신, 조직 동종이식, 자가면역 질환 및 간염(hepatitis) 동안에 면역계를 저해하는데 있어서 주요한 역할을 하는 것으로 보고된 40kDa 타입 1 막관통 단백질이다. PD-L1 단백질은 LPS 및 GM-CSF 처리에 반응하여 대식세포 및 수지상세포 (DC) 상에서, 및 TCR 및 B 세포 수용체 신호전달 시 T 세포 및 B 세포 상에서 상향조절된다. PD-1 수용체 / PD-L1 리간드 복합체의 형성은 림프절(lymph node)에서 CD8+ T 세포의 증식을 감소시키는 (면역 반응 중에) 억제 신호를 전송하고 PD-1은 또한 아폽토시스(apoptosis)를 통해 림프절에서 외래성 항원 특이적 T 세포의 축적을 제어할 수 있다. PD-L2 발현이 더 제한되고 주로 수지상세포 및 소수의 종양 라인에 의해 발현된다.
CTLA-4 (세포독성 T-림프구 항원 4)는, CD 152 (분화 클러스터 152)로도 알려져 있으며, 면역계를 하향조절하는 단백질 수용체이다. CTLA-4는 보조기(helper), 작용기 및 면역조절 T-세포의 표면 상에서 발현되는데, 이것은 항원에 대한 세포 면역 공격을 주도한다. T 세포는 CD28 수용체를 자극함으로써 작동되거나 CTLA-4 수용체를 자극함으로써 중지될 수 있다.
T-세포 동시-자극 단백질, CD28과 유사한 CTLA-4는 항원-제공 세포에서, 각각 B7-1 및 B7-2로도 불리는, CD80 및 CD86에 결합한다. T-세포 수용체 및 CD28을 통한 T-세포 활성화는 CTLA-4, B7 분자에 대한 억제 수용체의 증가된 발현으로 이어진다.
T-세포 활성화의 향상 또는 연장은 CTLA-4 및 PD-1에 대한 단클론성 항체 (mAbs)에 의해 달성되었다. 이필리무맙 및 트레멜리무맙은 CTLA-4를 억제하는 단클론성 항체이며, 영속성(durable) 항-종양 효과로 이어지는 항-종양 면역 반응을 유발하거나 향상시키는 것으로 나타났다. Yervoy라는 이름으로 미국에서 판매중인 이필리무맙 (MDX-010 또는 MDX-101로도 알려져 있음)은 절제 불가능 또는 전이성 악성 흑색종의 치료를 위해 브리스톨 마이어스 스퀴브(Bristol Myers Squibb)에 의해 판매된다. BMS-936558 (MDX-1106)은 PD-1에 대한 단클론성 항체이며 인간 임상 실험에서 상당한 항-종양 활성을 나타냈다. 예를 들어, Brahmer et al., J. Clin. Oncol., 28(19):3167-3175, 2010, Brahmer et al., N. Engl. J. Med., 366(26):2455-2465, 2012; 및 Lipson et al., Clin. Can. Res. 19(2):462-468, 2013을 참고하면 된다.
CTLA-4의 억제는 또한 CTLA-4 및 면역글로불린 (Ig) 중쇄의 Fc로 구성된 융합 단백질 (CTLA4Ig)에 의해 달성될 수도 있다. 예를 들어, Park et al., Pharm Res. 20(8): 1239-48, 2003을 참고하면 된다.
종양 미세환경에서 면역 반응의 추가적인 중요한 부정적 조절자는 신호전달 및 전사 활성화 인자 (signal transducer and activator of transcription; STAT) 신호 반응성 전사 인자 STAT3이다. 이 인자의 활성은 종양 및 관련된 면역 세포에서 높아진다. 종양 세포에서 STAT3 활성은 향상된 생존, 증식, 침입 및 전이, 뿐만 아니라 혈관형성의 자극에도 기여한다. 면역 세포에서 높아진 STAT3 활성은 면역억제 세포, 예를 들어, Treg, Th17 및 종양 미세환경 내 골수 유래 저해자 세포의 축적 및 활성화로 이어진다. 예를 들어, 재검토를 위해 Rebe et al. (JAK-STAT 2(1):e23010-1-10, 2013)을 참고하면 된다. 널리 사용된 2형 당뇨병 약물 메트포민 및 펜포민은 항종양 활성을 갖는 것으로 나타났고 메커니즘은 STAT3 활성의 억제를 포함하며, 감소된 항-종양 면역저하를 일으키는 것으로 생각된다. 예를 들어, 재검토를 위해 Deng et al., (Cell Cycle 11(2):367-376, 2012), Hirsch et al., (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 110(3):972-977, 2013), Appleyard et al., (British J Cancer 106: 1117-1122, 2012), Jiralerspong et al., (J Clin Oncol. 27(20):3297-3302, 2009), 및 Del Barco et al., (Oncotarget 2(12):896-917, 2011)을 참고하면 된다. 본원에서 설명된 암 치료 방법은 STAT3 발현 또는 활성의 억제자와 함께 그람-음성 유기체의 투여를 이용할 수도 있다. 이러한 억제자는 메트포민 및 펜포민을 포함할 수도 있다. 메트포민은, 예를 들어, 보통 하루에 1 내지 3번 약 50 밀리그램 내지 약 1,000 밀리그램의 용량 범위로 투여될 수도 있다. 펜포민은 전형적으로 하루에 1 내지 2번 약 20 밀리그램 내지 약 800 밀리그램의 용량 범위로 투여된다.
본원에서 설명된 암 치료 방법은 또한 숙주 면역 반응을 양성으로 조절하는 수용체 또는 리간드 중 하나 이상의 작용제와 함께 그람-음성 유기체의 투여를 이용할 수도 있다. 작용제는 4-1BB (CD137), GITR, CD40 또는 OX40 (CD 134)를 나타내며, 예를 들어, 정맥 내로 1 내지 4주마다 킬로그램 당 약 0.03 밀리그램 내지 킬로그램 당 약 30 밀리그램의 용량 범위로 투여될 수도 있다.
글루코코르티코이드 유발성 종양 괴사 인자 수용체 (TNFR)-관련 단백질 (GITR), 4-1BB (CD137), CD40 및 OX40 (CD134)는 조절 및 작용기 T 세포, 뿐만 아니라 면역계의 다른 세포 상에서 발현되는 동시자극 TNFR 과 멤버이다. 이 단백질들의 활성화는 면역 기능의 자극 또는 향상으로 이어진다. 이 단백질들 각각에 대한 단클론성 항체의 활성화는 전임상 모델에서 항-종양 활성을 나타냈고 임상 개발에 진입하였다. 예를 들어, Melero et al., Clin. Cancer Res. 15(5):1507-1509, 2009, Garber, JNCI 103(14): 1079-1082, 2011, Khong et al., Int. Rev. Immunol. 31(4):246-266, 2012, Vinay and Kwon, Mol. Cancer Ther. 11(5): 1062-1070, 2012, Snell et al., Immunol. Rev. 244(1): 197-217, 2011, 및 So et al., Cytokine Growth Factor Rev. 19(3-4):253-262, 2008을 참고하면 된다.
본원에서 설명된 암 치료 방법은 또한 하나 이상의 화학치료제와 함께 그람-음성 유기체의 투여를 이용할 수도 있다. 이러한 약제는 시클로포스파미드를 포함할 수도 있다.
시클로포스파미드가 본원에서 설명된 방법에서 사용될 때, 그것은 5 mg/m2 내지 750 mg/m2의 용량으로 매일 또는 21일 마다 정맥 내 또는 경구로 투여될 수도 있다는 것이 고려된다. 대안으로, 시클로포스파미드는, 예를 들어, 규칙적인 요법으로 5 mg 내지 100 mg의 용량으로 매일 경구로 투여될 수도 있다. 예를 들어, Jia et al., Int. J. Cancer 121(3):666-674, 2007을 참고하면 된다.
항-종양 면역 반응의 자극은 다양한 시토킨으로 입증되었다. 예를 들어, 재검토를 위해 Smyth et al., Immunological Rev. 202:275-293, 2004 및 Kim-Schulze, Surg. Oncol. Clin N. Am. 16:793-818, 2007을 참고하면 된다. 본원에서 설명된 암 치료 방법은 또한 재조합으로 발현되거나 또는 분리되고 정제된 시토킨, 예를 들어, 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자, 인터류킨-2, 및 인터류킨-12와 함께 그람-음성 유기체의 투여를 이용할 수도 있다. 본원에서 설명된 암 치료 방법은 또한 재조합으로 발현되거나 또는 분리되고 정제된 인터페론-알파와 함께 그람-음성 유기체의 투여를 이용할 수도 있다. 인터페론-알파는 약 3 x 105 내지 약 3 x 108 IU의 용량 범위로 주 당 1, 3, 5 또는 7번 피하로, 근육 내, 또는 정맥 내로 투여될 수도 있다. 또 다른 구체예에서, 그람-음성 박테리아는 인터페론-베타와 함께 투여될 수도 있다. 특정 구체예에서, 인터페론-베타는 일주일에 1번 또는 격일로 약 0.01 밀리그램 내지 약 5 밀리그램의 용량 범위로 피하 또는 정맥 내로 투여될 것이다. 인터페론-감마가 또한 투여될 수도 있다. 한 구체예에서, 인터페론-감마는 한 번 또는 매일 약 1 x 105 IU 내지 약 1 x 109 IU의 용량 범위로 피하 또는 정맥 내로 투여될 수도 있다.
추가의 방법에서, 인터류킨 (예를 들어 인터류킨-2, 및 인터류킨-12)은 동시투여될 수도 있다. 한 구체예에서, 인터류킨은 그람-음성 박테리아와 조합으로 일주일에 1번 또는 최대 하루에 3번 약 1 x 104 내지 약 1 x 107 IU의 용량으로 정맥 내로 투여될 수도 있다. 추가의 방법은 그람-음성 박테리아가, 예를 들어, 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자와 함께 매일 또는 매달 약 5 마이크로그램 내지 약 5 밀리그램의 용량 범위로 피하, 피내, 또는 정맥 내로 투여되는 것을 포함한다. 전반에 걸쳐 언급된 조합 치료 중 어떤 것에서도, 유기체가 추가의 암 치료 전 또는 후에 투여될 수도 있다는 것이 고려된다. 그것들은 또한 동시에 투여될 수도 있다.
하기 실시예들은 본 개시물을 설명하는 역할을 한다. 이 실시예들은 결코 본 개시물의 범위를 제한할 의도가 없다.
실시예
실시예 1:
지질다당류-관련 내독소 활성의 비활성화 및 세포 온전성의 손실 없이 폴리믹신 B에 의한 박테리아 세포 살해를 위한 최적의 조건을 농축된 후기 로그(log) 박테리아 (mL 당 109 내지 1011)를 37℃에서 2분 내지 6시간의 다양한 시간 동안 1-100 μg/mL의 폴리믹신 B가 들어있는 포스페이트 완충된 식염수 (PBS)에서 배양함으로써 각 박테리아 균주에 대하여 결정한다. 생존력을 성장-호환성 아가(agar) 플레이트 상에 대조군 및 처리된 박테리아 현탁액의 단계 희석 플레이팅 후 이어서, 하룻밤 동안 배양 및 콜로니 계수에 의해 결정한다. 세포 온전성을 육안 (현미경) 검사 및 600 nm에서 흡광도 분석에 의해 결정한다. 내독소 활성을 리뮬루스 아메보사이트 용해물 (LAL) 검정에 의해 결정한다. 가용성 또는 과도한 폴리믹신 및 세포 데브리(debris)는 가용성 내독소를 포함하며, 0.9% NaCl (정상 식염수)로의 원심분리-매개된 세척에 의해 제거한다.
대안으로, 조건부 돌연변이로부터 발생한, 결함이 있는 LPS를 가진 온전한, 생존 불가능한 박테리아를 위한 최적의 조건을 박테리아를 비-허용성 조건 하에서 LB (용원성 브로스(Lysogeny broth)) 배지에서 키우고 다양한 시점에 제거한 후 이어서, 폴리믹신 처리에 대하여 설명된 바와 같이 분석 및 가공한다는 점을 제외하고는, 폴리믹신 처리에 대하여 설명된 바와 같이 결정한다.
폴리믹신-처리된 박테리아 또는 식염수-세척된 후기 로그 단계 LPS 돌연변이/결함이 있는 박테리아를 동결방지제로서 트레할로스를 사용하여 동결건조한다 (예를 들어, Leslie et al., App. Environment. Microbiol. 61(10):3592-3597, 1995; Gu et al., J. Biotech. 88:95-105, 2001 및 American Type Culture Collection Bacterial Culture Guide를 참고하면 된다). 원하면, 박테리아 생존력은 박테리아의 온전성의 손실 없이 생존력을 0%로 감소시키는데 충분한 용량으로 전리 방사선의 처리에 의해 더 감소된다.
동결 건조된 박테리아는 항-종양 연구에 사용 전 멸균수에 재현탁하였다. PBS 세척된 쥐 종양 세포 (B16 및 B16F10 흑색종, CT-26 결장 직장 암종, Panc02 췌장 암종 또는 루이스 폐 암종(Lewis lung carcinoma) (세포주에 따라 105-107 세포)를 면도된 C57BL/6 마우스의 등에 피하로 이식하였다. 마우스를 무작위로 추출하고 종양이 처음 만져질 때, 종양이 75 mm3의 평균 부피에 도달했을 때, 또는 종양이 300 mm3의 평균 부피에 도달했을 때 (캘리퍼스 측정에 의해 추정됨) 처리를 개시한다. 재현탁된 박테리아에 0.1-0.2 mL 주사 용량 당 103 내지 1010의 개개의 용량 범위로 꼬리 정맥을 통해 또는 복강 내 (i.p.) 일주일 당 1회 내지 2회 주사한다. T-세포 수용체와 관련된 항체 길항제 또는 작용제를 일주일 당 1회 내지 2회 3-100 마이크로그램의 개개의 용량으로 복강 내로 투여한다. 시클로포스파미드를 5일 동안 격일마다 식수 중 최대 150 mg/kg로 (MTD 주입) 또는 하루에 25 mg/kg로 (규칙적 주입) 복강 내 투여한다. 마우스를 일주일에 2번 칭량하고 임상적 관찰을 기록하였다. 종양 측정 (캘리퍼스에 의한)을 일주일에 2번 수행하고 종양이 1,000 mm3에 도달하면/도달할 때, 괴사되면/괴사될 때 또는 ≥15% 중량 손실이 관찰되면 마우스를 인도적으로 희생시켰다. 종양을 제거하고 칭량하고, 최소한의 부검을 희생된 마우스로 수행한다. 마우스는 장기간 종양 퇴행 또는 치유가 관찰되면 종양 세포 이식으로 재도전될 수도 있다.
실시예 2:
실시예 2에서, 대장균 균주 2617-143-312 (Migula) Castellani and Chalmers (ATCC® 13070™)를 사용하였다. 이 무해한 그람-음성 박테리아는 성장을 위해 외인성 디아미노피멜산 (DAP)이 필요하다. 포유동물이 DAP를 만들지 않기 때문에, 이 박테리아 균주는 포유동물에서 생존 가능하지 않고 감염을 일으킬 수 없다. 게다가, DAP 영양 요구성(auxotrophy)은 시험관 내 연구 중에 오염을 관찰하는데 사용될 수 있다. 박테리아를 2 mM MgCl2, 0.5% 글루코스 및 1 mM DAP가 들어있는 LB Miller 브로스에서 37℃에서 300 rpm으로 일정하게 흔들면서 후기 로그 단계 (O.D.600에 기초함)까지 키웠다. 배양물을 15분 동안 2,000 x g로 원심분리 및 20 mM MgCl2, 0.5% 글루코스 및 0.1 mM DAP를 함유하는 4℃ LB Miller 브로스 (PMB 처리 배지)에서 재현탁에 의해 세 번 세척하였다. 최종 재현탁액을 mL 당 2x1010 박테리아로 만들었으며, mL 당 1.12x109 박테리아와 동일한 O.D.600에 기초한다. 배양물의 개개의 앨리쿼트를 4℃에서 1시간 동안 일정하게 교반하면서 다양한 농도의 폴리믹신 B (PMB) (Calbiochem #5291) 없이 및 함께 배양하였다. 이후에 박테리아를 3,000 x g로 10분 동안 원심분리에 의해 4℃ 신선한 PMB 처리 배지로 3번 세척하였고 mL 당 2x109 박테리아로 재현탁하였다. 박테리아 회수 효율을 O.D.600에 의해 관찰하였다. PMB 처리 및 세척 후 박테리아 회수는 최대 300 μg/mL PMB가 처리된 모든 샘플에 대하여 90% 이상이었고 1,000 μg/mL PMB 처리에 대하여 80%를 초과하였다.
도 1에서, 내독소 활성을 미처리된 및 처리된 박테리아 배양물의 단계 희석액을 리뮬루스 아메보사이트 용해물 (LAL) Endosafe Endochrome-K kinetic 검정 키트 (Charles River Endosafe, Charleston, SC)로 분석함으로써 결정하였다. 미처리된 배양물은 전형적으로 1x106 박테리아 당 대략 50-100 내독소 유닛을 함유하였다. 유사한 내독소 감소를 네 번의 독립적인 실험에서 1,000 μg/mL PMB 처리에 대하여 관찰하였다 (평균 = 미처리 중 17%).
도 2에서, 박테리아 생존력을 각 샘플을 단계 희석하고 1 mM DAP가 있고 없는 (각각 생존력 및 오염을 관찰하기 위해), 2 mM MgCl2, 0.5% 글루코스를 함유한 LB Miller 아가 플레이트 상에 플레이팅함으로써 결정하였다. 플레이트를 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였고, 각 플레이트 상에서 콜로니의 수를 결정하였으며, 이후에 생존력을 희석 인자에 의해 각 플레이트 상의 콜로니 수를 곱함으로써 계산하였다. 각 현탁액의 총 박테리아 수를 O.D.600을 1의 O.D.600 당 1.12x109 박테리아/mL의 환산 계수(conversion factor)를 곱함으로써 계산하였다. 생존력 (% 생 박테리아)를 총 박테리아 수에 대한 생존 가능한 박테리아/mL의 퍼센트로서 계산하였다. 1,000 μg/mL PMB의 처리는 박테리아 생존력을 0%로 감소시켰다. 그 다음 스케일 업(scale-up) 실험에서, 1,000 μg PMB는 네 번의 독립적인 실험에서 생존력을 평균 11%로 감소시켰다.
실시예 3:
실험을, 전처리 세척, 글루타르알데히드 (GA) 처리 및 후처리 세척을 20 mM MgCl2를 함유하는 포스페이트-완충된 식염수 (PBS; Mg 및 Ca-없음) pH 7.5로 수행한다는 점을 제외하고, 실시예 2에서 설명된 바와 같이 수행하였다. GA 처리 후 박테리아 회수율은, 테스트된 모든 농도에서, 전형적으로 80-100%였다. 도 3은 1% GA 처리가 내독소 활성을 96% 만큼 감소시켰다는 것을 입증한다. 1% GA 처리된 2-리터 스케일 업 실험은 미처리된 배양물에 비해 82%의 내독소 활성 감소를 초래하였다.
GA 처리는 0.05% 이상의 용량에서 일관되게 100% 박테리아 살해를 초래하였으며, 도 4에서 입증된 바와 같다.
1,000 μg/mL PMB 처리에 이은 1% GA 처리의 조합은 2 리터의 후기 로그 단계 배양물을 사용하여 미처리된 배양물에 비해 0% 생존력 및 내독소 활성의 92% (12배) 감소를 가진 박테리아를 생산하였다 (표 1).
실시예 4:
실시예 4에서, 박테리아를 키워서 실시예 2 및 3의 프로토콜에서 설명된 바와 같이 1,000 μg/mL PMB, 1% GA 또는 둘 다를 처리하였다. 샘플을 1% GA를 함유하는 (이전에 GA에 노출되지 않았으면) PBS, pH 7.5로 희석하였고 10분 동안 고정하였다. 박테리아를 함유하는 25개의 미세역가 방울을 파라필름(parafilm) 상에 배치하였고 이후에 100 메쉬 포름바(mesh formvar) + 탄소 EM 그리드(grid) (EMS, Hatfield, PA)로 커버하였으며, 이것을 0.1% 폴리-L-리신으로 사전 코팅하였다. 샘플을 10분 동안 부착되게 하고 이후에 그리드를 200 미세역가 물방울 상에 배치에 의해 간략히 3번 세척하였다. 그리드를 1분 동안 수중 2% 우라닐 아세테이트의 100 미세역가 방울 상에 배치에 의해 음성 염색하였다. 과도한 염색약을 3M 여과지로 닦아낸 후 이어서, 공기 건조 하였다. 샘플을 바닥 탑재 Eagle 4k (1600만 화소) 디지털 카메라 (배율 1,200x 및 11,000x)가 장착된 FEI Tecnai Spirit G2 BioTWIN 투과 전자 현미경을 사용하여 시각화하였다. 도 5B, 5C, 및 5D의 이미지는 본 방법에 따라 수행된 PMB 및/또는 GA 처리는 박테리아를 온전하게 둔다는 것을 확인하며, 이것은 바람직한 결과이다. 다당류 캡슐은 미처리된 박테리아 (도 5A)에서 가시적이지만 (보풀이 있는(fuzzy) 표면), 모든 처리된 박테리아에서는 제거되었거나 표면이 입상인 것으로 나타난다 (도 5B, 5C, 및 5D).
실시예 5:
실시예 5를 위해, 대장균을 키웠고 1,000 μg/mL PMB 플러스 1% GA를 처리하였으며, 생존력 및 내독소 수준을 실시예 2 및 3에서 설명된 바와 같이 결정하였다. 최종 세척 후, 미처리된 및 PMB + GA-처리된 박테리아를 mL 당 1.1x1011 박테리아의 농도로 50% PBS, pH 7.5, 0.5 mM MgCl2, 12% 트레할로스에서 재현탁하였고, 앨리쿼트하였고, 순간 냉동하여 -80℃에 저장하였다. 발열 한계점을 본질적으로 미국 약전, 151장에서 설명된 바와 같이 결정하였다. 적어도 2.0 kg으로 칭량된 성체 암컷 뉴질랜드 백색 토끼를 사용하였다. 모든 동물을 발열원 테스트 전 7일 이하에 가짜 테스트(sham test)로 조절하였다. 용량 범위-조사를 용량 당 한 마리의 토끼로 수행하였고 이 결과들을 그 다음에 용량 당 두 마리의 토끼로 확인하였다. 박테리아를 주사용 멸균 식염수로 희석하였다. 모든 용량을 10 mL의 부피로 정맥 내 루트를 통해 전달하였다.
테스트 약제 투여의 3시간 내 어떤 시점에서도 0.5-1.0℃의 온도 증가를 초래하는 테스트 약제의 최저 농도는 발열 한계점을 나타내는 것으로 고려되었다. 직장 온도를 베이스라인 및 테스트 약제의 주사 후 1 내지 3시간에 30분 간격으로 기록하였다. 미처리된 및 처리된 대장균의 저장에 사용된 식염수-희석된 비히클은 발열성이 아닌 것으로 나타났다. 두 마리의 토끼에 3x104 미처리된 박테리아의 투여는 0.8 및 1.0℃의 온도 증가를 초래하였다. 3x105 PMB + GA-처리된 박테리아의 투여는 0.1℃ 이상의 온도 증가를 초개하지 않았지만, 두 마리의 토끼에 9x105 PMB + GA-처리된 박테리아의 투여는 0.7 및 1.0℃의 온도 증가를 초래하였으며, 30배의 발열 한계점 차이를 입증하였다. PMB는 지질다당류-매개된 발열성 활성만을 중화시킬 가능성이 높다. 반면에, GA는 지질다당류, 뿐만 아니라 박테리아의 다른 구성요소에 의해 매개된 발열성을 중화시킬 수도 있다.
표 1은 미처리된 박테리아 및 1,000 μg/mL PMB 및 1% GA 둘 다가 처리된 박테리아에 대한 발열 (발열 반응) 한계점을 입증하며, 표준 생체 내 토끼 테스트에 의해 측정된 바와 같다. 결과를 시험관 내 LAL 검정으로 결정된 내독소 수준과 비교하였으며, PMB + GA 처리가 내독소 수준을 미처리된 박테리아와 비교하여 12배 만큼 감소시키지만, 같은 샘플에 의해 매개된 발열성은 30배 만큼 감소된다는 것을 입증한다.
처리 생 박테리아 내독소 활성
LAL 검정 		발열 한계점
토끼 검정
처리 안함 83% 44.7 유닛 / 106 박테리아 3x104 박테리아
PMB + GA 0% 3.6 유닛 / 106 박테리아 9x105 박테리아
최대 감소 12X 30X
실시예 6:
실시예 6에서, 대장균을 키웠고 실시예 2 및 3에 대한 프로토콜에서 설명된 바와 같이 1,000 μg/mL 폴리믹신 B 플러스 1% GA를 처리하였다. 미처리된 및 처리된 박테리아의 냉동 스톡(stock)을 37℃에서 신속하게 녹였고,
주사용 멸균 식염수에 적어도 10배 희석하거나 (정맥 내 ≤3x109 박테리아의 용량) 또는 3,000 x g로 10분 동안 원심분리하였고 주사용 멸균 식염수에서 재현탁하였다 (정맥 내 ≥5x109의 용량). 박테리아 또는 비히클을 100 미세역가의 부피로 꼬리 정맥을 통해 정맥 내 주사하였다.
8주령 C57BL/6 또는 BALB/c 암컷 마우스를 사용하였고 연구 전 적어도 7일 동안 적응시켰다. 치사율 및 임상적 관찰을 하루에 1번 또는 2번 수행하였다. 주사의 시점 및 주사 후 1-4시간에 추가로 관찰하였다. 비히클에 의한 독성의 결핍을 확인하였다. 케이지 측면 관찰은 다음을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다:
피부, 털, 눈, 점막, 걸음걸이, 자세, 및 분비/배설의 발생을 취급하는 반응 또는 자율적 활성의 다른 증거, 예를 들어, 눈물 흘림(lacrimation), 털 세움(piloerection), 특이한 호흡 패턴의 변화; 발작의 존재; 일반적인 민첩성의 변화; 과도한 그루밍(grooming) 및 반복적 선회와 같은 상동 행동; 특이한 행동 (자해); 혹/돌출의 발달 (종양, 종기(abscess), 등); 스트레스 및/또는 호흡기 증후군의 징후의 발달; 자극 및 염증의 징후에 대한 주사 부위의 관찰; 식품 및 물 소비 및 소변 및 배설물 배출의 변화.
다회수 투여 연구을 위한 박테리아 투여를 2주일 동안 일주일에 2번 (4회 처리) 수행하였다. 독성의 평가는 동물 체중의 관찰을 포함하였다. 1x109로 PMB + GA-처리된 박테리아에 대하여 보고된 다회수 투여 연구에 사용된 마우스는 종양을 가지고 있었다. 표 2에서 보고된 모든 다른 마우스들은 종양을 가지고 있지 않았다.
박테리아
처리 		용량 일회 용량
관찰 		다회수(4) 용량
관찰
미처리 3x108 1-4시간에 약간 빈사상태 1-4시간에 약간 빈사상태
1x109 1-4시간에 빈사상태 1-4시간에 빈사상태,
4차 주입 후 3마리 중 2마리 마우스 죽음
5x109 1-48시간에 빈사상태
72시간까지 죽음		 ND*
1x1010 18시간까지 죽음 ND
PMB + GA 1x109 1-4시간에 약간 빈사상태 1-4시간에 약간 빈사상태, 뻗친 털
3x109 1-4시간에 빈사상태 처리 후 최대 4시간에 약간 빈사상태, 빈사상태 또는 뻗친 털
5x109 1-4시간에 빈사상태 처리 후 최대 4시간에 약간 빈사상태, 빈사상태 또는 뻗친 털
1x1010 극심한 빈사상태,
24시간까지 3마리 중 1마리 마우스 죽음		 빈사상태, 약간 빈사상태, 뻗친 털 및/또는 얕은 호흡
*ND = 미결정
실시예 7:
실시예 7에서, 1,000 μg/mL PMB + 1% GA-처리된 박테리아 (DB103)를 실시예 2 및 3에 대한 프로토콜에서 설명된 바와 같이 제조하였다. 8주령 암컷 C57BL/6J 마우스를 주사 부위에 면도하였고 우측 옆구리에 2x105 B16F10 쥐 흑색종 세포 (ATCC CRL-6475)로 피하 주사하였다. 처리를 3일 후에 꼬리 정맥 정맥 내 투여을 통해 시작하였고 총 5회 처리를 위해 일주일에 2번씩 계속하였다. mL 당 1.1x1011의 농도의 50% PBS, pH 7.5, 0.5 mM MgCl2, 12% 트레할로스 중 DB103은 멸균 식염수로 11배 (1x109 용량) 또는 220배 (5x107 용량) 희석하였고 100 미세역가의 최종 부피로 주사하였다. 스톡 비히클을 비히클 대조군 처리군에 대하여 11배 희석하였다. 종양을 일주일에 2번 캘리퍼스로 측정하였고 종양 부피를 식 (길이 x 너비2)/2를 사용하여 결정하였다. 화합물-관련 죽음은 관찰되지 않았다. 1x109 DB103 처리된 두 마리의 동물을 제외하고, 모든 동물이 종양에 걸렸다. 최대 3% (저용량 군) 및 7% (고용량 군)의 일시적 체중 손실을 관찰하였지만, 최종 처리 후 회복되었다 (도 6).
실시예 8:
실시예 8을 위해, 대장균 (미처리된 및 1% GA-처리된)을 실시예 2 및 3에 대한 프로토콜에서 설명된 바와 같이 제조하였다. 실험을 처리가 종양이 바로 감지 가능한 제11 일에 시작하였다는 점을 제외하고, 실시예 7에 대한 프로토콜에서 설명된 바와 같이 수행하였다. 군 측정값을 제24 일 후에는 대부분 군에 대하여 기록하지 않았는데 이 각각의 군에서 동물의 일부를 종양 크기로 인해 안락사시켜야 했기 때문이다. 종양은 모든 동물에서 형성되었다. 1x109 GA 군에서 최대 중량 손실은 11% 였다. 독성은 1x109 미처리된 대장균의 투여를 불가능하게 했다 (표 2 참조).
실시예 9:
실시예 9에서, 1,000 μg PMB + 1% GA-처리된 박테리아 (DB103)를 실시예 2 및 3에 대한 프로토콜에서 설명된 바와 같이 제조하였다. 실험을 1x105 쥐 CT26 결장 직장 암종 세포를 BALB/c 마우스의 우측 옆구리에서 피하로 주사하였다는 점을 제외하고, 실시예 7에 대한 프로토콜에서 설명된 바와 같이 수행하였다. DB103 처리를 3일 후에 꼬리 정맥 정맥 내 투여를 통해 시작하였고 총 6회 처리를 위해 일주일에 2번씩 계속하였다. 시클로포스파미드 (LKT Laboratories, #C9606)를 식수를 통해 ~20 mg/kg/일 (수중 0.133 mg/mL)로 지속적으로 투여하였으며, 제3 일에 시작하였다. 항-쥐 CTLA-4 항체 (BioXcell #BE0164), 200 미세역가 PBS 중의 100 μg을 제3 일, 제6 일 및 제9 일에 복강 내 투여하였다. 임상적 관찰 및 치사율을 매일 기록하였다. 종양을 매주 2회 캘리퍼스로 측정하였고 종양 부피를 식 (길이 x 너비2)/2로 결정하였다. 종양은 비히클 군의 모든 마우스에서 형성되었다. 어떤 군에서도 중량 손실 및 화합물-관련 죽음이 관찰되지 않았다. 비히클, 저용량 및 고용량 DB103 군에 대한 데이터는 도 8A 및 8B와 같다.
명세서에서 언급된 모든 특허 및 공보는 개시물이 적용되는 업계의 당업자들의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공보는 각 개별 공보가 특이적으로 및 개별적으로 참고로 포함되는 것으로 나타나는 바와 같은 정도로 본원에서 참고로 포함된다.
본원에서 예시적으로 설명된 개시물은 본원에서 특이적으로 개시되지 않은 어떤 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재시에도 실행될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본원의 각각의 경우에서 용어 "포함하는", "본질적으로 구성되는" 및 "구성되는" 중 어떤 것도 다른 두 용어 중 어떤 것으로 대체될 수 있다. 용어 및 이용된 표현은 제한이 아닌 설명의 용어로서 사용되고, 나타나고 설명된 특징의 어떤 동등물 또는 이것들의 일부를 제외한 이러한 용어 및 표현의 사용에 있어서, 제한할 의도는 없지만, 다양한 변형은 청구항의 범위 내에서 가능한 것으로 인식된다. 따라서, 본 개시물이 바람직한 구체예 및 선택적 특징에 의해 설명되었지만, 본원에서 개시된 개념의 변형 및 변화는 당업자에 의해 재분류될 수도 있고, 이러한 변형 및 변화는 첨부된 청구범위에 의해 한정된 본 개시물의 범위 내에 있는 것으로 간주된다고 생각되어야 한다. 다른 구체예는 하기 청구범위 내에서 제시된다.

Claims (38)

  1. 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포로서, 상기 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포는 상응하는 야생형 그람-음성 박테리아 세포와 비교할 때 적어도 80% 감소된 지질다당류(LPS)-매개 내독소 활성을 가지며, 생 그람-음성 박테리아 세포에 폴리믹신 및 글루타르알데히드를 처리함으로써 만들어지고, 상기 폴리믹신은 폴리믹신 B 또는 폴리믹신 E인, 복수의 생존 불가능한 그람-음성 박테리아 세포.
  2. 제1 항에 있어서, 상기 박테리아 세포의 적어도 90%는 생존 불가능한 것을 특징으로 하는 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포.
  3. 제1 항에 있어서, 상기 박테리아 세포의 100%는 생존 불가능한 것을 특징으로 하는 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포.
  4. 제1 항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 적어도 85% 감소된 LPS-매개 내독소 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포.
  5. 제1 항에 있어서, 상기 박테리아 세포는 적어도 95% 감소된 LPS-매개 내독소 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포.
  6. 제1 항에 있어서, LPS-매개 내독소 활성의 감소는 시험관 내(in vitro) 리뮬루스 아메보사이트 용해물(Limulus Amebocyte Lysate; LAL) 검정으로 측정되는 것을 특징으로 하는 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포.
  7. 제1 항에 있어서, 상기 그람-음성 박테리아 세포는 살모넬라(Salmonella) 세포 또는 에스체리키아(Escherichia) 세포인 것을 특징으로 하는 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포.
  8. 제1 항에 있어서, 상기 폴리믹신은 2℃ 내지 10℃의 온도에서 치리되는 것을 특징으로 하는 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포.
  9. 제8 항에 있어서, 상기 폴리믹신은 4℃의 온도에서 치리되는 것을 특징으로 하는 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포.
  10. 제8 항에 있어서, 상기 폴리믹신은 3 마이크로그램/ml 내지 3000 마이크로그램/ml의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포.
  11. 제10 항에 있어서, 상기 폴리믹신은 폴리믹신 B인 것을 특징으로 하는 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포.
  12. 제11 항에 있어서, 상기 폴리믹신 B는 염화마그네슘 형태의 마그네슘과 함께 존재하는 것을 특징으로 하는 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포.
  13. 제1 항에 있어서, 상기 글루타르알데히드는 0.05% 내지 2.0%의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포.
  14. 제13 항에 있어서, 상기 글루타르알데히드는 0.5% 내지 2.0%의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포.
  15. 약학적으로 허용되는 담체 및 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항의 복수의 생존 불가능하고 온전한 그람-음성 박테리아 세포를 포함하는, 암 치료용 약학적 조성물.
  16. 제15 항에 있어서, 상기 조성물은 CTLA-A(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4), PD-1(programmed cell death protein-1), PD-L1(programmed death-ligand 1) 및 PD-L2(programmed death-ligand 2)로 구성된 군으로부터 선택되는 면역 기능 억제 T-세포 수용체 또는 T-세포 수용체 리간드의 길항제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 제15 항에 있어서, 상기 조성물은 메트포민 또는 펜포민으로 구성된 군으로부터 선택되는 STAT3(Signal Transducer And Activator Of Transcription 3)의 억제자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  18. 제17 항에 있어서, 상기 STAT3의 억제자는 메트포민인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  19. 제17 항에 있어서, 상기 STAT3의 억제자는 펜포민인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  20. 제15 항에 있어서, 상기 조성물은 GITR(glucocorticoid-induced TNFR-related protein), 4-1BB, CD40 및 OX40으로 구성된 군으로부터 선택되는 면역 기능 자극 T-세포 수용체의 작용제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  21. 제15 항에 있어서, 상기 조성물은 화학치료제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  22. 제21 항에 있어서, 상기 화학치료제는 시클로포스파미드인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  23. 제15 항에 있어서, 상기 조성물은 시토킨을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  24. 제23 항에 있어서, 상기 시토킨은 인터페론-알파, 인터페론-베타, 인터페론-감마, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 인터류킨-2 및 인터류킨-12로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  25. 제15 항에 있어서, 상기 그람-음성 박테리아 세포는 살모넬라(Salmonella)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  26. 제15 항에 있어서, 상기 그람-음성 박테리아 세포는 에스체리키아(Escherichia)인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  27. 그람-음성 박테리아 세포 세포에 폴리믹신 B 또는 폴리믹신 E, 및 글루타르알테히드를 처리하는 단계를 포함하는, 그람-음성 박테리아 세포를 온전하게 유지하면서 상기 그람-음성 박테리아 세포를 죽이고 상기 그람-음성 박테리아 세포 내 지질다당류(LPS)-매개 내독소 활성을 감소시키는 방법.
  28. 제27 항에 있어서, 상기 LPS-매개 내독소 활성은 90% 까지 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제27 항에 있어서, 상기 LPS-매개 내독소 활성은 96% 까지 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제27 항에 있어서, 생존력은 0%로 감소되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제27 항 내지 제30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 그람-음성 박테리아 세포는 3 마이크로그램/ml 내지 3000 마이크로그램/ml의 농도와 2℃ 내지 10℃의 온도에서 폴리믹신 B 또는 폴리믹신 E로 처리되고, 0.05% 내지 2.0%의 농도의 글루타르알데히드로 처리되는 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
KR1020157020243A 2013-01-02 2013-12-23 박테리아를 사용하는 암 치료용 조성물 및 방법 KR102214794B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201361748369P 2013-01-02 2013-01-02
US61/748,369 2013-01-02
PCT/US2013/077441 WO2014107365A1 (en) 2013-01-02 2013-12-23 Compositions and methods for treatment of cancer using bacteria

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150102093A KR20150102093A (ko) 2015-09-04
KR102214794B1 true KR102214794B1 (ko) 2021-02-10

Family

ID=49943600

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157020243A KR102214794B1 (ko) 2013-01-02 2013-12-23 박테리아를 사용하는 암 치료용 조성물 및 방법

Country Status (17)

Country Link
US (5) US9265804B2 (ko)
EP (1) EP2941258B1 (ko)
JP (1) JP6125041B2 (ko)
KR (1) KR102214794B1 (ko)
CN (1) CN104884073B (ko)
AU (1) AU2013371454B2 (ko)
CA (1) CA2896858C (ko)
DK (1) DK2941258T3 (ko)
EA (1) EA030573B1 (ko)
ES (1) ES2759854T3 (ko)
HK (1) HK1217289A1 (ko)
IL (1) IL239453B (ko)
MX (1) MX368210B (ko)
PL (1) PL2941258T3 (ko)
PT (1) PT2941258T (ko)
TW (1) TWI664976B (ko)
WO (1) WO2014107365A1 (ko)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DK2941258T3 (da) * 2013-01-02 2019-12-16 Decoy Biosystems Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af bakterier
WO2015153820A1 (en) * 2014-04-02 2015-10-08 Felder Mitchell S Ctla-4 blockade with metronomic chemotherapy for the treatment of cancer
KR20170042778A (ko) * 2014-08-19 2017-04-19 고꾸리츠 다이가꾸 호우징 오까야마 다이가꾸 면역 세포의 기능 증강 방법 및 면역 세포의 다기능성 평가 방법
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
US10676723B2 (en) 2015-05-11 2020-06-09 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US20200282037A1 (en) * 2017-06-16 2020-09-10 Nantbio, Inc. Bacterial vaccine
JP7097438B2 (ja) 2017-07-11 2022-07-07 アクティム・セラピューティクス・インコーポレイテッド 遺伝子操作された免疫刺激性細菌菌株およびその使用
EP3713586B1 (en) * 2017-11-20 2023-01-04 Codex Dna, Inc. Vibrio sp. organisms with modified lipopolysaccharide
KR20200110343A (ko) * 2018-01-19 2020-09-23 4디 파마 리서치 리미티드 암을 치료하거나 예방하기 위한 조합 치료법
EP3820992A2 (en) 2018-07-11 2021-05-19 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
WO2020047161A2 (en) 2018-08-28 2020-03-05 Actym Therapeutics, Inc. Engineered immunostimulatory bacterial strains and uses thereof
WO2020069211A1 (en) * 2018-09-27 2020-04-02 Decoy Biosystems, Inc. Methods of treatment of infections using bacteria
US11471497B1 (en) 2019-03-13 2022-10-18 David Gordon Bermudes Copper chelation therapeutics
US20220193149A1 (en) * 2019-05-16 2022-06-23 City Of Hope Compositions and methods for targeting tumor-associated extracellular matrix components to improve drug delivery
CN114302729A (zh) * 2019-08-29 2022-04-08 生物医学研究集团有限公司 癌化学疗法支持剂、食品及药品
US10973908B1 (en) 2020-05-14 2021-04-13 David Gordon Bermudes Expression of SARS-CoV-2 spike protein receptor binding domain in attenuated salmonella as a vaccine
KR20220063113A (ko) * 2020-11-09 2022-05-17 전남대학교산학협력단 암의 예방 및 치료용 살모넬라 균주 및 이의 용도
FI129784B (en) * 2021-04-27 2022-08-31 Solar Foods Oy METHODS OF PRODUCING MICROPRODUCTS

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005120560A1 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Harold David Gunn Bacterial compositions for the treatment of cancer
JP2009523810A (ja) 2006-01-19 2009-06-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 生存可能な無毒性グラム陰性細菌

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4842855A (en) * 1980-12-19 1989-06-27 University Of Pittsburgh Antitumor process using a Brucella abortus preparation
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US5171738A (en) * 1982-10-04 1992-12-15 Toray Industries, Inc. Method of treating malignant tumors
JPH04270965A (ja) * 1990-05-18 1992-09-28 Burton W Blais オリゴペプタイド吸着担体の調製方法、及びこれを使用したリポ多糖類の検定と除去方法
US6264952B1 (en) * 1993-11-05 2001-07-24 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College Method for protecting a mammalian host against infection by Brucella
CA2218601A1 (en) * 1995-03-24 1996-10-03 Ophidian Pharmaceuticals, Inc. Treatment for verotoxin-producing escherichia coli
US6190657B1 (en) 1995-06-07 2001-02-20 Yale University Vectors for the diagnosis and treatment of solid tumors including melanoma
US5811097A (en) * 1995-07-25 1998-09-22 The Regents Of The University Of California Blockade of T lymphocyte down-regulation associated with CTLA-4 signaling
US5997881A (en) * 1995-11-22 1999-12-07 University Of Maryland, Baltimore Method of making non-pyrogenic lipopolysaccharide or A
WO1998053851A1 (en) * 1997-05-28 1998-12-03 University Of Iowa Research Foundation Laft mutants of pathogenic gram-negative bacteria
CA2302866C (en) 1997-09-10 2012-02-21 Vion Pharmaceuticals, Inc. Genetically modified tumor-targeted bacteria with reduced virulence
US6962696B1 (en) 1999-10-04 2005-11-08 Vion Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
NZ518354A (en) * 1999-10-04 2005-02-25 Vion Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for tumor-targeted delivery of effector molecules
WO2001024637A1 (en) * 1999-10-04 2001-04-12 Vion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating solid tumors with irradiation and bacteria
WO2001095876A1 (en) * 2000-06-09 2001-12-20 Baylor College Of Medicine The combination of antimicrobial agents and bacterial interference to coat medical devices
AU2002350235A1 (en) 2001-11-21 2003-06-10 The Johns Hopkins University Combination bacteriolytic therapy for the treatment of tumors
WO2003063593A1 (en) * 2002-01-28 2003-08-07 Vion Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer by administering tumor-targetted bacteria and an immunomodulatory agent
EP1675465B1 (en) 2003-10-22 2010-03-03 The Johns Hopkins University Improved combination bacteriolytic therapy for the treatment of tumors
US8034359B2 (en) * 2004-06-07 2011-10-11 Qu Biologics Inc. Tissue targeted antigenic activation of the immune response to cancers
US8501198B2 (en) 2004-06-07 2013-08-06 Qu Biologics Inc. Tissue targeted antigenic activation of the immune response to treat cancers
US8822194B2 (en) 2004-06-29 2014-09-02 Anticancer, Inc. Cancer selective auxotrophs
EP2545162B1 (en) 2010-03-12 2016-10-19 Research Corporation Technologies Viable gram negative bacteria lacking outer membrane agonists of tlr4/md-2
DK2941258T3 (da) 2013-01-02 2019-12-16 Decoy Biosystems Inc Sammensætninger og fremgangsmåder til behandling af cancer ved anvendelse af bakterier

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005120560A1 (en) 2004-06-07 2005-12-22 Harold David Gunn Bacterial compositions for the treatment of cancer
JP2009523810A (ja) 2006-01-19 2009-06-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 生存可能な無毒性グラム陰性細菌

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Luo et al, Oncol Res. 2001;12(11-12):501-508*

Also Published As

Publication number Publication date
CN104884073A (zh) 2015-09-02
IL239453A0 (en) 2015-07-30
US11045504B2 (en) 2021-06-29
AU2013371454A1 (en) 2015-07-02
MX2015008606A (es) 2016-01-14
TW201440779A (zh) 2014-11-01
JP6125041B2 (ja) 2017-05-10
EP2941258B1 (en) 2019-09-11
JP2016505604A (ja) 2016-02-25
US20160228523A1 (en) 2016-08-11
US10195259B2 (en) 2019-02-05
BR112015015832A2 (pt) 2017-07-11
ES2759854T3 (es) 2020-05-12
WO2014107365A1 (en) 2014-07-10
MX368210B (es) 2019-09-24
KR20150102093A (ko) 2015-09-04
IL239453B (en) 2020-03-31
CA2896858A1 (en) 2014-07-10
EA030573B1 (ru) 2018-08-31
DK2941258T3 (da) 2019-12-16
HK1217289A1 (zh) 2017-01-06
CN104884073B (zh) 2019-07-12
TWI664976B (zh) 2019-07-11
EP2941258A1 (en) 2015-11-11
PL2941258T3 (pl) 2020-02-28
US20160199422A1 (en) 2016-07-14
PT2941258T (pt) 2019-12-12
US20190307869A1 (en) 2019-10-10
AU2013371454B2 (en) 2019-01-03
US20220047649A1 (en) 2022-02-17
US10052371B2 (en) 2018-08-21
CA2896858C (en) 2022-08-23
US9265804B2 (en) 2016-02-23
EA201591017A1 (ru) 2015-12-30
US20140212396A1 (en) 2014-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11045504B2 (en) Compositions and methods for treatment of cancer using bacteria
Hill et al. The primacy of the gastrointestinal tract as a target organ of acute graft-versus-host disease: rationale for the use of cytokine shields in allogeneic bone marrow transplantation
Hill et al. Differential roles of IL-1 and TNF-α on graft-versus-host disease and graft versus leukemia
Wang et al. Antibacterial effect of human Vγ2Vδ2 T cells in vivo
Malaviya et al. Clinical implications of mast cell–bacteria interaction
Dréau et al. Combining the specific anti-MUC1 antibody TAB004 and lip-MSA-IL-2 limits pancreatic cancer progression in immune competent murine models of pancreatic ductal adenocarcinoma
US10918677B2 (en) Attenuated or inactivated pathogenic Escherichia coli for treating urogenital cancer
Varkila Depletion of asialo-GM1+ cells from the F1 recipient mice prior to irradiation and transfusion of parental spleen cells prevents mortality to acute graft-versus-host disease and induction of anti-host specific cytotoxic T cells.
BR112015015832B1 (pt) Composição compreendendo células bacterianas gram-negativas intactas e não viáveis e uso das mesmas
Ferdinandi et al. Virulizin®-a review of its antineoplastic activity
US20190231822A1 (en) Methods of reducing chronic graft-versus-host disease
Au et al. An injectable subcutaneous colon-specific immune niche for the treatment of ulcerative colitis
US20230057396A1 (en) Methods and agents for treating solid tumor cancers
Castillo et al. Cellular mechanisms underlying beneficial versus detrimental effects of bacterial antitumor immunotherapy
CN115943211A (zh) 肿瘤靶向鸡沙门氏菌菌株及其用途
US20090253620A1 (en) Methods and compositions for treating gastrointestinal radiosensititivity in a subject
Al-Attiyah The regulation of necrosis in mycobacterial lesions

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant