JP7097438B2 - 遺伝子操作された免疫刺激性細菌菌株およびその使用 - Google Patents

Description

関連出願
２０１７年７月１１日に出願され、Christopher D. ThanosおよびLaura Hix Glickmanの「ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF」と題された米国特許仮出願第６２／５３１，３２７号に対する優先権の利益を主張する。２０１８年３月２６日に出願され、Christopher D. Thanos、Laura Hix GlickmanおよびJustin Skobleの「ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF」と題された米国特許仮出願第６２／６４８，３８０号に対する優先権の利益も主張する。

本出願は、本願と同日付で出願された、「ENGINEERED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF」と題され、米国特許仮出願第６２／５３１，３２７号および同第６２／６４８，３８０号に対する優先権を主張する米国出願番号（代理人整理番号第６２１３１．０１７０１号：米国特許出願公開第０３／１７０１号）と関連する。

可能な場合、これらの出願のそれぞれの主題は、その内容全体が参照により組み込まれるものとする。

電子的に提供される配列表の参照による組み込み
配列リストの電子バージョンは、本願と共に出願され、その内容は、その全体が参照により組み込まれるものとする。電子出願は、２０１８年７月１１日に作製されており、サイズは４１０キロバイトであり、表題は１７０１ＳＥＱＰＣ００１．ｔｘｔである。

がん免疫療法の分野は、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ－１および抗ＰＤ－Ｌ１免疫チェックポイント抗体の臨床的な成功によって立証されるように、大きく進歩している（例えば、Buchbinder et al. (2015) J. Clin. Invest. 125: 3377-3383；Hodi et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:3392-4000；およびChen et al. (2015) J. Clin. Invest. 125:3384-3391を参照のこと）。腫瘍は、完全な免疫抑制性環境を進化させてきた。それらは免疫監視を回避するための複数の機序、免疫を抑制するための抗腫瘍免疫細胞の再プログラム、および最新のがん療法に対する継続的な突然変異抵抗性を引き起こす（例えば、Mahoney et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14(8):561-584を参照のこと）。免疫寛容および逃避を克服する免疫療法を設計し、同時に近年の免疫療法の自己免疫関連毒性を制限することは、免疫腫瘍学の分野への挑戦である。したがって、追加の革新的な免疫療法および他の治療法が必要とされる。

免疫刺激性となるように改変された抗がん療法のための細菌が提供される。本明細書において提供する免疫刺激性細菌は、抗腫瘍療法に対して多角的なアプローチを提供する。サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の菌種等の本明細書において提供する細菌は、強力な抗腫瘍活性を有するように微調整することができる。細菌は、抗腫瘍免疫刺激活性を誘発するための多くの手段が存在するプラットフォームを提供する。細菌は、免疫チェックポイント遺伝子および産物、ならびに他の標的を抑制するか、阻害するか、遮断するか、そうでなければサイレンシングするように設計されたマイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｓｉＲＮＡを含むＲＮＡ等の抗がん療法をコードするプラスミドを含む。これらの標的は、免疫抑制性経路および免疫刺激性経路において役割を果たし、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）およびｃＧＡＳ等の抗腫瘍応答を改善する。細菌は、免疫系を本質的に刺激し、細菌感染は、免疫および炎症性の経路および応答を誘導し、抗腫瘍処置に望ましいものもあれば、望ましくないものもある。不所望の炎症応答をもたらす遺伝子および産物、ならびに望ましい免疫刺激性抗腫瘍応答を誘導する遺伝子を欠失または改変することによって細菌を改変すると、細菌の抗腫瘍活性を改善することができる。また、細菌は、腫瘍細胞および組織において蓄積し、その中で複製することによって、細胞を溶解する場合がある。細菌は、投与部位から移動し、他の腫瘍および腫瘍細胞に蓄積し、アブスコパル効果を付与することがある。本明細書では、細菌のこれらの特性の全てを利用し、相乗的に作用することができる複数の抗腫瘍活性および特性を有する免疫刺激性細菌を確実に産生する。

がんを処置するため等、疾患を処置するために免疫応答をモジュレートする組成物、これらの使用、および方法が提供される。組成物は、本明細書において提供される免疫刺激性細菌を含む。処置するための方法、および処置するための細菌の使用も提供される。処置の対象としては、ヒトおよび他の霊長目、イヌおよびネコ等のペット、ならびにウマ等の他の動物がある。

免疫刺激性細菌を含む医薬組成物、ならびに疾患および障害、特に固形腫瘍を含む腫瘍等の増殖性障害を処置するための方法およびこれらの使用が提供される。

免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物を投与することによって、または処置するための組成物を使用して、固形腫瘍の成長を阻害するかまたは容量を減少させる方法も提供される。例えば、単回投薬量の場合、有効量の弱毒化サルモネラ属菌種を含む組成物を、対象である固形腫瘍がんを有するヒト患者へ投与するかまたは使用する方法が提供される。

細菌のＲＮＡｉおよび改変物、ならびに記載されるプラスミドは全て、任意の所望の組合せで組み合わせることができることを理解されたい。したがって、免疫刺激性細菌に対する言及は、少なくとも１つの標的に対するＲＮＡｉを含む細菌を指し、本明細書において述べられる改変のいずれもまたは全てを有することができる。

免疫チェックポイントまたは他の標的の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断し、その阻害、抑制または遮断が、対象における抗腫瘍免疫応答を高めるＲＮＡ（ＲＮＡｉ）をコードするヌクレオチドの配列を含み；ＲＮＡが免疫刺激性細菌中のプラスミド上にコードされ；アスパルテート－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ^－（ａｓｄ^－）である、免疫刺激性細菌が提供される。

本明細書における目的に関しては、ＲＮＡｉは、二本鎖ＲＮＡの全ての形態を含み、それを使用し、標的となる核酸の発現をサイレンシングすることができる。ＲＮＡｉとしては、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡがある。これらの形態のうちのいずれも、本明細書において開示され、記載される実施形態において入れ替えることができる。一般的に、ＲＮＡｉは、細菌中のプラスミド上にコードされる。プラスミドは、活性をモジュレートするかまたは加える目的の産物を、または細菌へ産物を、または細菌を用いて処置されることになる対象の免疫系をモジュレートすることができる他のそのような産物をコードする他の異種核酸を含むことができる。細菌遺伝子も、追加、欠失または破壊することができる。これらの遺伝子は、細菌が成長および複製するための産物、または細菌に対する宿主の免疫応答をモジュレートする産物もコードすることができる。

３’修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するＲＮＡ（ＲＮＡｉ）をコードするヌクレオチドの配列を含み、アデノシン栄養要求性である免疫刺激性細菌も提供される。ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶ－ドメインＩｇサプレッサーをコードする遺伝子）の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するＲＮＡをコードするヌクレオチドの配列を含み、アデノシン栄養要求性である免疫刺激性細菌も提供される。プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の発現を阻害する、抑制する、遮断するＲＮＡをコードするヌクレオチドの配列を含む免疫刺激性細菌も提供される。

これらの免疫刺激性細菌のうちの１つは、サルモネラ属菌種のものである。これらとしては、３’修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）および／またはＶＩＳＴＡの発現を阻害するか、または抑制するか、遮断するか、またはサイレンシングするＲＮＡをコードする核酸を含むサルモネラ属がある。

３’修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するＲＮＡをコードするヌクレオチドの配列、およびＰＤ－Ｌ１の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するＲＮＡをコードするヌクレオチドの配列を含む免疫刺激性細菌も提供される。

ＶＩＳＴＡの発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するＲＮＡをコードするヌクレオチドの配列、およびＰＤ－Ｌ１の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するＲＮＡをコードするヌクレオチドの配列を含む免疫刺激性細菌も提供される。

ＴＲＥＸ１、ＶＩＳＴＳＡおよびＰＤ－Ｌ１、ならびに当業者であれば公知のおよび／または本明細書において列挙されるもしくは例示される他のそのような標的のうちの１つまたは複数の遺伝子遮断を媒介するｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ等のＲＮＡｉをコードするプラスミドを保有するＳ．ティフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）等の免疫刺激性細菌が提供される。そのようなプラスミドを保有する細菌菌種としては、これらに限定されるものではないが、例えば、サルモネラ属の菌株、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、およびビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａｅ）がある。例えば、菌種としては、シゲラ・ソンネイ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｓｏｎｎｅｉ）、シゲラ・フレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ）、シゲラ・ディセンテリアエ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、サルモネラ・ティフィ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、サルモネラ・ガリナルム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、およびサルモネラ・エンテリティディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）がある。

菌種としては、例えば、サルモネラ属、シゲラ属、Ｅ．コリ、ビフィドバクテリウム属、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、リステリア属、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、コレラ属（Ｃｈｏｌｅｒａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、レジオネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、およびエリジペロスリックス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）の菌株、または細菌菌株の先行する列挙のうちのいずれかのこれらの弱毒化菌株もしくはこれらの改変菌株がある。

他の好適な細菌菌種としては、リケッチア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、アエロモナス属、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ）、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、ビブリオ属、バチルス属、およびエリジペロスリックス属がある。例えば、リケッチア・リケッチアエ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ Ｒｉｋｅｔｔｓｉａｅ）、リケッチア・プロワゼキイ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ）、リケッチア・ツツガムシ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｔｓｕｔｓｕｇａｍｕｃｈｉ）、リケッチア・モーセリ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｍｏｏｓｅｒｉ）、リケッチア・シビリカ（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ ｓｉｂｉｒｉｃａ）、ボルデテラ・ブロンキセプティカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ナイセリア・ゴノロエアエ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、アエロモナス・オイクレノフィラ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｅｕｃｒｅｎｏｐｈｉｌａ）、アエロモナス・サルモニシダ（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａ）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）、コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、シトロバクター・フレウンディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クラミジア・ニューモニアエ（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・ソムヌス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｏｒｎｎｕｓ）、ブルセラ・アボルツス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ ａｂｏｒｔｕｓ）、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｑｕｉ）、シュードモナス・アエルギノサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ヘリコバクター・ムステラエ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ）、ビブリオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、バチルス・スブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、エリジペロスリックス・ルシオパチアエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、エルシニア・エンテロコリティカ（Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）、ロシャリメア・クインタナ（Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａ ｑｕｉｎｔａｎａ）、およびアグロバクテリウム・ツメルファシウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｒｆａｃｉｕｍ）がある。

サルモネラ属、特に、ＹＳ１６４６（ＡＴＣＣ＃２０２１６５）またはＶＮＰ２０００９と称される菌株等のサルモネラ・ティフィムリウム菌株が本明細書において例示される。他の菌株としては、ＲＥ８８、ＳＬ７２０７、χ８４２９、χ８４３１、およびχ８４６８がある。本明細書において提供される例示的な改変サルモネラ属菌株は、免疫刺激性細菌菌株ＡＳＴ－１０４、ＡＳＴ－１０５、ＡＳＴ－１０６、ＡＳＴ－１０８、ＡＳＴ－１０９、ＡＳＴ－１１２、ＡＳＴ－１１３、ＡＳＴ－１１５、ＡＳＴ－１１７、ＡＳＴ－１１８、ＡＳＴ－１１９、ＡＳＴ－１２０、ＡＳＴ－１２１、ＡＳＴ－１２２、およびＡＳＴ－１２３である。これらの配列および説明は、詳細な説明、実施例および配列リストにおいて提供される。免疫刺激性細菌は、細菌の弱毒化菌株に由来することができるか、または、ａｓｄの欠失等の本明細書において述べられる改変に基づき弱毒化されるようになり、そのため複製はインビボに限定される。

本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、様々な遺伝子、および／または抗腫瘍免疫応答が減少する一因となる遺伝子および／または遺伝子産物の発現、および／または免疫系を刺激する産物の阻害剤をコードし、したがって免疫刺激性である。本明細書において記載するＴＲＥＸ１の阻害は、ＰＤ－Ｌ１の阻害であるため、免疫刺激性である。アデノシン栄養要求性も免疫刺激性である。とりわけＴＲＥＸ１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＩＳＴＡ（Ｔ細胞活性化のＶ－ドメインＩｇサプレッサーをコードする遺伝子）、ＴＧＦ－ベータ、およびＣＴＮＮＢ１（β－カテニンをコードする遺伝子）、これらの組合せの発現を遮断するかまたは阻害するために標的とされるｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ等の阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、ならびに他の免疫抑制性遺伝子の発現を阻害するかまたは遮断する任意のｓｈＲＮＡであって、その発現が腫瘍または腫瘍微小環境（ＴＭＥ）によって活性化されるかまたは強化される任意のｓｈＲＮＡが提供される。これらのＲＮＡの発現は、２つの独立した免疫刺激性経路を利用し、単一の治療法において腫瘍定着（ｔｕｍｏｒ ｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎ）の強化をもたらす。この組合せの効果は、アデノシン栄養要求性である本明細書において提供される菌株によって強化され、アデノシン富化免疫抑制性腫瘍微小環境において優先的な蓄積またはその中へのリクルートメントを提供する。そのようなＴＭＥにおいてアデノシンが減少すると、免疫刺激性効果が更に強化される。公知のまたは治療的投与のために遺伝子操作することができる細菌菌株のうちのいずれかにおける特徴のこのような組合せは、同様の免疫刺激性効果を提供する。

標的の中の１つはＴＧＦ－ベータであり、これは３つのアイソフォーム：１、２および３を有する。標的の中の１つはＴＧＦ－ベータ、アイソフォーム２および３ではなく、特にアイソフォーム１である。毒性は、アイソフォーム２および３と関連する。例えば、心臓弁毒性は、アイソフォーム２の阻害と関連する。アイソフォーム１は、大部分のがんに存在する（例えば、ＴＣＧＡデータベースを参照のこと）。アイソフォーム１のみを阻害することは有利である。ＲＮＡｉは、標的を極めて特異的に認識するように設計できるため、この目的のために有利に用いることができる。ＴＧＦ－ベータに関しては、アイソフォーム１の特異的阻害は、アイソフォーム２または３に存在しない、アイソフォーム１に特有の（例えば、実施例２におけるＴＧＦ－ベータアイソフォーム１に対するＲＮＡを参照のこと）配列を標的とするか、またはアイソフォーム１および３を標的とし、２を標的としない配列を選択することによって達成することができる。プラスミドが、ＴＧＦ－ベータアイソフォーム１の発現を特異的に阻害するか、抑制するか、または遮断するが、ＴＧＦ－ベータアイソフォーム２またはＴＧＦ－ベータアイソフォーム３の発現ではしないｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡをコードするか；またはプラスミドが、ＴＧＦ－ベータアイソフォーム１および３の発現を特異的に阻害するか、抑制するか、または遮断するが、アイソフォーム２の発現ではしないｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡをコードする免疫刺激性細菌も提供される。

また、本明細書において提供される免疫刺激性細菌によって提供されるＰＤ－Ｌ１のＲＮＡｉ、そのようなｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ介在性遺伝子遮断も、定着を改善する。ＰＤ－Ｌ１をノックアウトすると、Ｓ．ティフィムリウム感染を助長することが示されている。例えば、ＰＤ－Ｌ１ノックアウトマウスにおいて野生型マウスよりも少なくとも１０倍高い細菌を負荷すると、ＰＤ－Ｌ１は、Ｓ．ティフィムリウム感染に対して防御性を示すことが観察されている（例えば、Lee et al. (2010) Immunol. 185:2442-2449を参照のこと）。

Ｓ．ティフィムリウム免疫刺激性細菌等の本明細書において提供される遺伝子操作された免疫刺激性細菌は、複数の相乗的モダリティを含み、冷たい腫瘍（ｃｏｌｄ ｔｕｍｏｒ）の免疫再活性化を誘導し、腫瘍抗原特異的免疫応答を促進し、同時に、腫瘍が、恒久的な抗腫瘍免疫を破壊し、回避するために利用する免疫チェックポイント経路を阻害する。アデノシン栄養要求性および強化された血管破壊が実施形態において含まれる。アデノシン栄養要求性を介した腫瘍標的化におけるこの改善および血管破壊の強化は、潜在力を高め、同時に炎症を局在化し、他の免疫療法モダリティを用いて観察された全身性サイトカイン曝露および自己免疫毒性を制限する。

アデノシン栄養要求性であり、および／またはその発現を阻害するｓｈＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ等の二本鎖ストランドのＲＮＡをコードするような、かつ他のチェックポイント阻害剤の発現を標的とし、阻害するｍｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ等の追加のＲＮＡをコードしていてもよい、ＴＲＥＸ１遺伝子を標的とする免疫刺激性細菌が提供される。これらの細菌の中の１つは、アデノシン栄養要求性である免疫刺激性細菌である。固形腫瘍および血液悪性腫瘍を含む腫瘍を処置する方法および処置するための使用が提供される。方法および使用の中の１つは、免疫刺激性細菌がアデノシン栄養要求性であり、使用および処置は、ｃｄ７３^＋および／またはｃｄ７３^＋／ｃｄ３９^＋の腫瘍を処置する。

ＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ（ＲＮＡＰ ＩＩ）およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＲＮＡＰ ＩＩＩ）プロモーター等の、真核生物宿主細胞転写機構によって認識されるプロモーターの制御下で発現される。ＲＮＡＰ ＩＩＩプロモーターは、一般的に、真核生物宿主において構成的に発現され；ＲＮＡＰ ＩＩプロモーターを調節する場合がある。ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ等のＲＮＡは、細菌によって安定に発現されるプラスミド上に提供される。そのような細菌の例示的なものは、継代もしくは他の方法によって、または本明細書において述べられる改変に基づいて弱毒化された菌株である、アデノシン栄養要求性等の、全体的に弱毒化されたサルモネラ属菌株である。細菌の例示的なものはサルモネラ属菌株である。サルモネラ属菌株の例示的なものは、抗生物質不使用を選択するためにａｓｄ突然変異を含む改変Ｓ．ティフィムリウム菌株である。これらの菌株もａｓｄ突然変異を含む場合がある。

プロモーター、例えば低酸素条件においてまたはｐＨが７未満である条件において発現されるプロモーター等の、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において発現されるプロモーターを、腫瘍細胞の環境のために選択することができる。

ＴＲＥＸ１またはＶＩＳＴＡ遺伝子に対するｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む細菌の菌株が提供される。ＴＲＥＸ１またはＶＩＳＴＡ遺伝子は、Ｈ１プロモーター等のＲＮＡＰ ＩＩＩプロモーターの制御下とすることができる。ＴＲＥＸ１をノックダウンすると、血管破壊が誘導され、それが定着を増加させ、また、免疫抑制を低下させる。本明細書において提供される菌株は、これらに限定されないが、ＰＤ－Ｌ１を含む他のチェックポイント阻害剤の発現を阻害するｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含むことができる。ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ等の複数のＲＮＡを含む菌株は、一般的に、ＲＮＡ毎に異なるプロモーターを含む。例えば、細菌としては、Ｕ６プロモーターの制御下のＰＤ－Ｌ１遺伝子に対するｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む、また、Ｈ１プロモーターの制御下のＴＲＥＸ１に対するｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む遺伝子改変されたＳ．ティフィムリウム菌株があり得る。Ｈ１プロモーターの制御下のＳＩＲＰ－α遺伝子に対するｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む遺伝子改変されたＳ．ティフィムリウム菌株も提供される。Ｓ．ティフィムリウム菌株等の例示的細菌は、Ｈ１プロモーター等のＲＮＡＰ ＩＩＩプロモーターの制御下のβ－カテニン遺伝子に対するｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ、および／またはＨ１プロモーター等のＲＮＡＰ ＩＩＩプロモーターの制御下のＶＩＳＴＡ遺伝子に対するｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含むことがある。アデノシン栄養要求性、ＴＲＥＸ１に対するｍｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡ、および／またはＰＤ－Ｌ１もしくはＴＲＥＸ１およびＰＤ－１のうちの１つまたは両方もしくはＶＩＳＴＡを阻害するか、抑制するか、または遮断するＲＮＡ等の、他の免疫チェックポイント標的に対していてもよいｍｉＲＮＡもしくはｓｈＲＮＡの様々な組合せを、改変免疫刺激性細菌に含むことができる。

ｃＧＡＳアゴニストである免疫刺激性細菌が提供される。そのような細菌の例示的なものは、ｃＧＡＳアゴニストおよびインターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストのうちの１つまたは両方であるＳ．ティフィムリウムである。これらは、例えば、細胞質ＤＮＡが産生されるまたは蓄積する照射療法および化学療法等の使用および方法において投与することができる。ＳＴＩＮＧは、細胞質ゾル中のセンシング核酸（ｓｅｎｓｉｎｇ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ）に対する応答において自然免疫を活性化する。下流シグナル伝達は、細菌によってまたは細胞質ゾルのｄｓＤＮＡへの結合に対する応答における宿主酵素ｃＧＡＳによって合成される、サイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）の結合を介して活性化される。細菌および宿主産生ＣＤＮは、異なるホスフェート架橋構造を有し、これはＳＴＩＮＧを活性化するためのその能力を区別する。ＣＤＮは、細菌によってまたは細胞質ゾルｄｓＤＮＡの結合への応答における宿主酵素ｃＧＡＳによって合成される。ＩＦＮ－βは、活性ＳＴＩＮＧのシグネチャーサイトカインである。

上記で記載され、列挙され、本明細書における細菌のうちのいずれかにおけるプラスミドは、ＲＮＡｉおよび他の異種核酸をコードするプラスミドを含む。プラスミドは、多数のまたは少数のコピーとして存在することができる。これは、複製起点等のエレメントを選択することによって制御することができる。低および高および中コピー数のプラスミドおよび複製起点は当業者には周知であり、選択することができる。本明細書における免疫刺激性細菌の実施形態では、プラスミドは、約１５０または１５０コピー以下等の低から中コピー数から、約２５未満または約２０または２５コピーである低コピー数で存在することができる。例示的な起点は、ｐＢＲ３２２、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ｐＭＢ１、ｃｏｌＥ１、ｃｏｌＥ２、ｐＰＳ１０、Ｒ６Ｋ、Ｒ１、ＲＫ２、およびｐＵＣ由来のものである。

検討されるプラスミドは、ＲＮＡが、免疫チェックポイントまたは他の標的および更にその産物の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するようなＲＮＡｉを含むことができる。これらの中の１つは、シグナル配列が無いリステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質（ｃｙｔｏＬＬＯ）をコードする核酸の配列、ＣｐＧモチーフ、ＤＮＡ核標的化配列（ＤＴＳ）、フラジェリンサブユニット（複数可）をコードする遺伝子の欠失、およびレチノイン酸誘導性遺伝子－Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）結合エレメントである。

本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、処置するために対象に投与したときに、ＤＡＰ補充媒体における成長を可能にするが、インビボでの複製を制限する、アスパルテート－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ^－（ａｓｄ^－）とすることができる。このような細菌は、自己限定性であり、処置するために有利な場合があるであろう。細菌は、アスパルテート－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードする内因性遺伝子のうちの全てまたは一部が崩壊または欠失しており、そのために内因性ａｓｄが発現されないことから、ａｓｄ^－とすることができる。他の実施形態では、ａｓｄをコードする遺伝子はインビボで発現するために、プラスミド上に含まれる場合がある。

本明細書において提供される免疫刺激性細菌のいずれも、一般的にプラスミド上にＣｐＧモチーフまたはＣｐＧアイランドを含む核酸を含むことができ、モチーフが、トル様受容体９（ＴＬＲ９）によって認識される。ＣｐＧモチーフまたはアイランドをコードする核酸は、原核生物において豊富であり、したがってＣｐＧモチーフは、細菌性遺伝子に含むことができるか、またはその一部とすることができ、プラスミドにおいてコードされる。ａｓｄをコードする細菌性遺伝子は、免疫刺激性ＣｐＧを含む。

本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、アデノシン、またはアデノシンおよびアデニン栄養要求性とすることができる。本明細書における細菌のいずれもアデノシン栄養性とすることができ、有利には、アデノシンが多くの腫瘍において蓄積し、免疫抑制性であるために、抗腫瘍活性を増加することができる。

野生型細菌が鞭毛を含む場合、本明細書において提供される免疫刺激性細菌はフラジェリン欠損とすることができる。これらは、鞭毛をコードする遺伝子（複数可）の全てまたは一部を破壊するかまたは欠失させることによって、フラジェリン欠損とすることができる。例えば、フラジェリンサブユニットｆｌｉＣとｆｌｊＢのうちの１つまたは両方をコードする遺伝子の欠失を有し、そのために細菌が鞭毛欠損である、免疫刺激性細菌が提供される。

本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、ペリプラズム分泌シグナル配列が無いリステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質であるｃｙｔｏＬＬＯをコードし、細胞質中に蓄積するようになる、核酸を含むことができる。この突然変異は、ａｓｄ^－細菌と有利に組み合わされる。ＬＬＯは、リステリア・モノサイトゲネス由来のコレステロール依存性孔形成溶血素であり、細菌の食作用逃避を介在する。自己溶解性菌株がヒト等の担腫瘍宿主中に導入される場合、細菌は、食作用性免疫細胞によって取り込まれ、液胞に侵入する。この環境では、ＤＡＰが無いと、細菌の複製が阻止され、液胞中で細菌の自己溶解が生じる。その後、溶解すると、プラスミドが放出され、蓄積されたＬＬＯが、コレステロール含有液胞膜において孔を形成し、宿主細胞の細胞質ゾル中へのプラスミドのデリバリーが可能になる。

免疫刺激性細菌は、プラスミド上にコードされるＳＶ４０ＤＴＳ等のＤＮＡ核標的化配列（ＤＴＳ）を含むことができる。

免疫刺激性細菌は、エンドヌクレアーゼ－１（ｅｎｄＡ）をコードする遺伝子の欠失または改変を有することができ、そのためにｅｎｄＡ活性が阻害されるかまたは削除される。これらの例示的なものは、ＣｐＧモチーフ、プラスミドを維持するためのａｓｄ遺伝子選択マーカー、およびＤＮＡ核標的化配列のうちの１つまたは複数を含む免疫刺激性細菌である。

免疫刺激性細菌は、免疫チェックポイントの発現を阻害するか、抑制するか、もしくは遮断する２つ以上の異なるＲＮＡ分子、または免疫抑制性であるか、もしくは免疫抑制性経路にある代謝産物の阻害剤をコードするＲＮＡ分子をコードする核酸をプラスミド上に含むことができる。

ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ等のＲＮＡｉをコードする核酸は、ＲＮＡをコードする核酸の下流に転写ターミネーターを含むことができる。

全ての実施形態では、免疫刺激性細菌中のプラスミド上にコードされるＲＮＡｉは、ショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）またはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）とすることができる。

免疫刺激性細菌は、免疫チェックポイント、およびその阻害、遮断またはサイレンシングが免疫刺激性である他の標的の発現を、阻害するか、抑制するか、もしくは遮断するか、または発現をサイレンシングするＲＮＡｉを含む。これらの標的としては、３’修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１）、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－ベータアイソフォーム１、ベータ－カテニン、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１、ＰＤ－２、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＳＩＲＰα、ＣＤ４７、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２８、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ガレクチン－９、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＣＤ２７、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２００、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ１６０、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ａ２ａ受容体、Ａ２ｂ受容体、ＨＨＬＡ２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬＴ－２／４、ＯＸ４０／ＯＸ－４０Ｌ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＴＩＭ１、ＴＩＭ４およびＳＴＡＴ３、スタビリン－１（ＣＬＥＶＥＲ－１）、ＤＮＡＳＥ ＩＩおよびＲＮＡＳＥ Ｈ２のうちの１つまたは複数があるが、これらに限定されるものではない。例えば、免疫刺激性細菌のうちのいずれかは、ＴＲＥＸ１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＩＳＴＡ、ＴＧＦ－ベータアイソフォーム１またはアイソフォーム１および３等のＴＧＦ－ベータ、ベータ－カテニン、ＳＩＲＰ－アルファ、ＶＥＧＦ、ＲＮＡＳＥ Ｈ２、ＤＮＡＳＥ ＩＩ、ならびにＣＬＥＶＥＲ－１／スタビリン－１のうちの１つまたは組合せの発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するＲＮＡを含むことができる。

プラスミドが、少なくとも２つの標的の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するＲＮＡをコードするヌクレオチドの配列を含み、各ＲＮＡが、異なるプロモーターから発現される免疫刺激性細菌が提供される。これらの例示的なものは、阻害、抑制または遮断のための標的の組合せが、ＴＲＥＸ１およびＰＤ－Ｌ１、ＴＲＥＸ１およびＰＤ－１、ＴＲＥＸ１およびＶＩＳＴＡ、ＴＲＥＸ１およびＳＩＲＰ－アルファ、ＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦ－ベータアイソフォーム１、ＰＤ－Ｌ１およびベータ－カテニン、ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ、ＴＧＦ－ベータアイソフォーム１およびＶＩＳＴＡ、ＳＩＲＰ－アルファおよびＶＩＳＴＡならびにＴＲＥＸ１およびＲＮＡＳＥ Ｈ２の中から選択される少なくとも２つである場合である。

ＲＮＡｉの他の組合せとしては、ＴＲＥＸ１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＩＳＴＡ、ＴＧＦ－ベータアイソフォーム１、ベータ－カテニン、ＳＩＲＰ－アルファ、ＶＥＧＦ、ＲＮＡＳＥ Ｈ２、ＤＮＡＳＥ ＩＩ、およびＣＬＥＶＥＲ－１／スタビリン－１のうちの１つまたは組合せの発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するＲＮＡｉがある。他の組合せとしては、阻害、抑制または遮断のための標的が、ＴＲＥＸ１およびＰＤ－Ｌ１、ＴＲＥＸ１およびＰＤ－１、ＴＲＥＸ１およびＶＩＳＴＡ、ＴＲＥＸ１およびＳＩＲＰ－アルファ、ＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦ－ベータアイソフォーム１、ＰＤ－Ｌ１およびベータ－カテニン、ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡ、ＴＧＦ－ベータアイソフォーム１およびＶＩＳＴＡ、ＳＩＲＰ－アルファおよびＶＩＳＴＡ、ＴＲＥＸ１およびＲＮＡＳＥ Ｈ２、ＶＩＳＴＡおよびＲＮＡＳＥ Ｈ２、ならびにＶＩＳＴＡおよびＤＮＡＳＥＨ２、またはＴＲＥＸ１およびＳＩＲＰα、またはＴＲＥＸ１およびＶＩＳＴＡ、またはＴＲＥＸ１およびＶＥＧＦ、またはＰＤ－Ｌ１およびβ－カテニン、またはＰＤ－Ｌ１およびＴＧＦ－ベータアイソフォーム１、またはＰＤ－Ｌ１およびＶＥＧＦ、またはＴＲＥＸおよびＰＤ－１の中から選択される少なくとも２つの組合せである場合のものがある。

免疫刺激性細菌は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ１（Ｂ７－Ｈ１）、ＰＤ－Ｌ２、ＰＤ－１、ＰＤ－２、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＳＩＲＰα、ＣＤ４７、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）、ＶＥＧＦ、ＴＧＦ－ベータ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＣＤ２８、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ガレクチン－９、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＣＤ２７、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２００、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ１６０、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ａ２ａ受容体、Ａ２ｂ受容体、ＨＨＬＡ２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬＴ－２／４、ＯＸ４０／ＯＸ－４０Ｌ、ＢＴＬＡ、ＫＩＲ、ＴＩＭ１、ＴＩＭ４、ＳＴＡＴ３、ＣＬＥＶＥＲ－１、ＤＮＡＳＥ ＩＩおよびＲＮＡＳＥ－Ｈ２のうちのいずれかの中から選択される、阻害、抑制、または遮断されることになる別の異なる免疫チェックポイントまたは標的の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するＲＮＡをコードする核酸も含むことができる。これらの例示的なものは、ヒトＰＤ－Ｌ１（配列番号３１）、ヒトベータ－カテニン（配列番号３２）、ヒトＳＩＲＰα（配列番号３３）、ヒトＴＲＥＸ１（配列番号３４）、ヒトＶＩＳＴＡ（配列番号３５）、ヒトＴＧＦ－ベータアイソフォーム１（配列番号１９３）、およびヒトＶＥＧＦ（配列番号１９４）の中の１つである。ＲＮＡは、配列番号１～３０、３６～４０、および１９５～２１７のうちのいずれかに示す免疫チェックポイント核酸における配列を標的とするか、または含むことができる。

免疫刺激性細菌のうちのいずれかにおけるプラスミドは、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）またはＲＩＧ－Ｉ結合エレメントのアゴニストであるヌクレオチドの配列もコードすることができる。

免疫刺激性細菌は、ｐｕｒＩ－（ｐｕｒＭ－）、ｍｓｂＢ－、ｐｕｒＤ－、フラジェリン－（ｆｌｉＣ－／ｆｌｊＢ－）、ｐａｇＰ－、ａｄｒＡ－、ＣｓｇＤ－およびｈｉｌＡのうちの１つまたは複数等、遺伝子における欠失のうちの１つまたは複数を含むことができる。免疫刺激性細菌は、ｍｓｂＢ－とすることができる。例えば、免疫刺激性細菌は、ｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失、ａｓｄ欠失、およびａｄｒＡ欠失を含む場合があり、ＣｓｇＤ欠失を含んでいてもよい場合がある。細菌性遺伝子欠失の例示的なものは、以下のもの：
ｒｆａＬ、ｒｆａＧ、ｒｆａＨ、ｒｆａＤ、ｒｆａＰ、ｒＦｂ、ｒｆａ、ｍｓｂＢ、ｈｔｒＢ、ｆｉｒＡ、ｐａｇＬ、ｐａｇＰ、ｌｐｘＲ、ａｒｎＴ、ｅｐｔＡ、およびｌｐｘＴのうちの１つまたは複数の中から選択される、リポポリサッカライドの生合成を変更する、遺伝子の突然変異のうちの１つまたは複数；および／または
自殺遺伝子を導入し、ｓａｃＢ、ｎｕｋ、ｈｏｋ、ｇｅｆ、ｋｉｌまたはｐｈｌＡのうちの１つまたは複数の中から選択される突然変異のうちの１つまたは複数；および／または
溶菌遺伝子を導入し、ｈｌｙおよびｃｌｙのうちの１つまたは両方から選択される突然変異のうちの１つまたは複数；および／または
ＩｓｙＡ、ｐａｇ、ｐｒｇ、ｉｓｃＡ、ｖｉｒＧ、ｐｌｃおよびａｃｔの中から選択される、１つまたは複数のビルレンス因子（複数可）の突然変異；および／または
ｒｅｃＡ、ｈｔｒＡ、ｈｔｐＲ、ｈｓｐおよびｇｒｏＥＬの中から選択される、ストレス応答を改変する１つまたは複数の突然変異；および／または
細胞周期を破壊するｍｉｎの突然変異；および／または
ｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ、およびｏｍｐＲの中から選択される、調節性機能を破壊または不活性化する１つまたは複数の突然変異、のうちのいずれかである。

記載するＲＮＡｉは、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡを含む。標的またはその相補体をコードするＲＮＡがその中に挿入されているｍｉＲＮＡ骨格の例示的なものは、ｍｉＲ－１６－２（配列番号２４８）に基づくもの、または配列番号２４９のｍｉＲＮＡ骨格である。免疫刺激性細菌は、ｍｉＲ－１０３（配列番号２５２）を含むことができ、成熟ｍｉＲ－１０３は配列：５’－ＡＧＣＡＧＣＡＵＵＧＵＡＣＡＧＧＧＣＵＡＵＧＡ－３’を含む。

ＲＮＡｉは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下で発現することができる。概して、ｓｈＲＮＡは、ＲＮＡＰ ＩＩＩプロモーターの制御下で発現され；ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡＰ ＩＩプロモーターの制御下で発現される。多数のＲＮＡＰ ＩＩＩおよびＩＩプロモーターが、当業者であれば公知であり、利用可能である。ＲＮＡＰ ＩＩＩプロモーターとしては、例えば、Ｕ３、Ｈ１、Ｕ６、７ＳＫおよび７ＳＬがあり；ＲＮＡＰ ＩＩプロモーターとしては、ウイルスプロモーター、サイトメガロウイルスＳＶ４０プロモーター、およびアデノウイルスプロモーターがある。多数のウイルスプロモーター、特に後者のプロモーターは、強力な構成プロモーターである。

免疫刺激性細菌は、サルモネラ属、シゲラ属、Ｅ．コリ、ビフィドバクテリウム属、リケッチア属、ビブリオ属、リステリア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、アエロモナス属、フランシセラ属、コレラ属、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、バチルス属、およびエリジペロスリックス属の菌株、または細菌菌株の先行する列挙のうちのいずれかのこれらの弱毒化菌株もしくはこれらの改変菌株とすることができる。

免疫刺激性細菌の例示的なものは、プラスミドが、シグナル配列が無いリステリオリジンＯ（ＬＬＯ）タンパク質（ｃｙｔｏＬＬＯ）をコードする核酸の配列、ＣｐＧモチーフ、ＤＮＡ核標的化配列（ＤＴＳ）、フラジェリンサブユニット（複数可）をコードする遺伝子の欠失、およびレチノイン酸誘導性遺伝子－Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）結合エレメントのうちの１つまたは複数を含む場合のものである。

プラスミドが、発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するＲＮＡをコードする２つ以上を含む場合、それぞれが、少なくとも約７５個のヌクレオチド、または少なくとも７５個のヌクレオチド、最大約または少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００個のヌクレオチド（または塩基対）、最大約１６００もしくは１６００個のヌクレオチド（または塩基対）、または７５～１５００もしくは１６００個の間のヌクレオチド（または塩基対）分、離れている。

他の例示的な免疫刺激性細菌は、アデノシン栄養要求性であるものを含み、鞭毛をコードする遺伝子（複数可）における欠失；ｅｎｄＡにおける欠失；ＣｙｔｏＬＬＯをコードするプラスミド；核局在配列；およびａｓｄプラスミド相補系を含み、免疫チェックポイントまたは他の標的の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断し、その阻害、抑制または遮断が対象における抗腫瘍免疫応答を高めるＲＮＡをコードする。

このような免疫刺激性細菌としては、サルモネラ・ティフィムリウム菌株等のサルモネラ属の菌株、例えば、ＡＳＴ１００、ＶＮＰ２０００９と称される菌株、または菌株ＹＳ１６４６（ＡＴＣＣ＃２０２１６５）、ＲＥ８８、ＳＬ７２０７、χ８４２９、χ８４３１、およびχ８４６８の中から選択される弱毒化サルモネラ・ティフィムリウム菌株がある。

免疫刺激性細菌は、配列番号３６～４０および７５～７８のうちのいずれかに示すヌクレオチドの配列によってコードされるｓｈＲＮＡ、または配列番号２１４～２１７のうちのいずれかに示すヌクレオチドの配列によってコードされるｍｉＲＮＡをコードするプラスミドを含むことができる。

免疫刺激性細菌のうちのいずれも、成長したときに静止期において採取されるものである。免疫刺激性細菌を産生する方法は、標準的な方法によって培養され、静止期において採取されるものを含む。

免疫刺激性細菌を含む組成物が提供される。このような組成物は、細菌および薬学的に許容される賦形剤または媒体を含む。単回用量は、免疫刺激が処置をもたらす疾患または障害を処置するために治療上有効である。そのような刺激の例示的なものは、免疫応答であり、それとしては、これらに限定されるものではないが、特異的免疫応答および非特異的免疫応答のうちの１つまたは両方、特異的応答と非特異的応答の両方、自然応答、一次免疫応答、適応免疫、二次免疫応答、記憶免疫応答、免疫細胞活性化、免疫細胞増殖、免疫細胞分化、およびサイトカイン発現がある。

免疫刺激性細菌のうちのいずれかを含む医薬組成物が提供される。がんを処置するためのこれらの使用、およびがんを処置する方法も同様である。方法および使用は、がんを有する対象を処置することを含み、免疫刺激性細菌または医薬組成物を、ヒト等の対象に投与することを含む。免疫刺激性細菌を投与することを含む、がんを有する対象を処置する方法が提供される。方法および使用は、第２の抗がん剤または処置が投与される組合せ療法を含む。第２の抗がん剤は、細胞質ＤＮＡをもたらす化学療法剤、または照射療法、または抗ＰＤ－１、もしくは抗ＰＤ－Ｌ１もしくは抗ＣＴＬＡ４抗体、もしくはＣＡＲ－Ｔ細胞等の抗免疫チェックポイント阻害剤、または幹細胞、ＴＩＬ細胞およびがん療法用に改変された細胞等の他の治療用細胞である。

ｍｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ等のＲＮＡｉをコードするサルモネラ属菌株等のＴＲＥＸ１に対する本明細書において記載する免疫刺激性細菌は、遺伝毒性であるか、またはＤＮＡを標的とするかもしくはそれに悪影響を与え、細胞質ＤＮＡをもたらす治療法に対して相補的である。

投与は、非経口等の任意の好適な経路によって行うことができ、デリバリーを促進するかまたは強化することができる追加の薬剤を含むことができる。投与は、経口または直腸であるか、または肺へのエアゾールによるものか、または腫瘍内、静脈内、筋肉内、または皮下とすることができる。

がんとしては、これらに限定されないが、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、子宮、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、肝臓、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、頸部または肝臓のがん等の固形腫瘍および血液悪性腫瘍がある。

免疫刺激性細菌は、懸濁剤等の投与するための組成物へ製剤化することができる。これらは、乾燥し、粉末として貯蔵することができる。免疫刺激性細菌と他の抗がん剤との組合せも提供される。

配列番号３６～４０および７５～７８のうちのいずれかに示す核酸の配列を含む核酸分子等のｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡも提供される。そのようなＤＮＡを含むプラスミドも提供される。プラスミドを含むサルモネラ属等の免疫刺激性細菌が提供される。

がんおよび悪性腫瘍を処置するための組合せ療法が提供される。免疫刺激性細菌は、他のがん療法の前に、またはそれと同時に投与することができ、それとしては、照射療法、化学療法、特に細胞質ＤＮＡをもたらす遺伝毒性の化学療法、および抗ＰＤ－Ｌ１、抗ＣＴＬＡ４を含む抗チェックポイント阻害剤抗体等の免疫療法、ならびに他のそのような免疫療法がある。

ｃｄ７３^＋である腫瘍を有する対象を処置する方法および処置するための使用も提供される。そのような処置のための免疫刺激性細菌はアデノシン栄養要求性であり；対象は、腫瘍生検または他の身体組織もしくは体液試料を試験することによって、ｃｄ７３^＋である腫瘍を有しているか、または有するとして同定される。

対象における免疫刺激性細菌の定着を増加させる方法が提供される。これらの方法は、免疫刺激性細菌を対象に投与することと；対象におけるＴＲＥＸ１の発現および／またはＴＲＥＸ１のコード化産物の活性を阻害するか、または抑制することとを含む。

用いられる用語および表現は、説明用語として使用され、限定ではなく、そのような用語および表現の使用において、示され、記載される特徴またはその一部の任意の等価物を除外することを意図せず、様々な改変が考慮されることが認識される。

図１は、ａｓｄ遺伝子を株ＹＳ１６４６から欠失させるのに使用されるプロセスの概略図を示す。Ｓ．ティフィムリウム株ＹＳ１６４６由来のａｓｄ遺伝子は、DatsenkoおよびWanner［Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645 (2000)］に記載されているラムダ由来レッド組換え系を使用して欠失させた。 図２は、ｑＰＣＲおよびウエスタンブロットを使用するヒトＰＤ－Ｌ１ ｓｈＲＮＡスクリーニングの結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、およびＰＤＬ１を標的にする異なるｓｈＲＮＡをコードする様々なｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図２Ａは、ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するためのｑＰＣＲ分析の結果を示す。図２Ｂは、ヒトＰＤ－Ｌ１ ｓｈＲＮＡのウエスタンブロット分析を示す。ウエスタンブロッティングおよびデンシトメトリーを使用して、ＰＤ－Ｌ１タンパク質発現のレベルを測定した。 図３は、ｑＰＣＲおよびウエスタンブロットを使用するヒトＴＲＥＸ１ ｓｈＲＮＡスクリーニングの結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＲＥＸ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、およびＴＲＥＸ１を標的にする異なるｓｈＲＮＡをコードする様々なｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図３Ａは、ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲ分析の結果を示す。図３Ｂは、ヒトＴＲＥＸ１ ｓｈＲＮＡのウエスタンブロット分析の結果を示す。ウエスタンブロッティングおよびデンシトメトリーを使用して、ＰＤ－Ｌ１タンパク質発現のレベルを測定した。 図４は、ｑＰＣＲおよびウエスタンブロットを使用するヒトベータカテニンｓｈＲＮＡスクリーニングの結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ベータカテニンｃＤＮＡ発現プラスミド、およびベータカテニンを標的にする異なるｓｈＲＮＡをコードする様々なｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図４Ａは、ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図４Ｂは、ヒトベータカテニンｓｈＲＮＡのウエスタンブロット分析の結果を示す。ウエスタンブロッティングおよびデンシトメトリーを使用して、ベータカテニンタンパク質発現のレベルを測定した。 図５は、ｑＰＣＲおよびウエスタンブロットを使用するヒトＳＩＲＰアルファｓｈＲＮＡスクリーニングの結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＳＩＲＰアルファｃＤＮＡ発現プラスミド、およびＳＩＲＰアルファを標的にする異なるｓｈＲＮＡをコードする様々なｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図５Ａは、ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図５Ｂは、ヒトＳＩＲＰアルファｓｈＲＮＡのウエスタンブロット分析の結果を示す。ウエスタンブロッティングおよびデンシトメトリーを使用して、ＳＩＲＰアルファタンパク質発現のレベルを測定した。 図６は、ｑＰＣＲを使用するヒトＴＧＦ－ベータアイソフォーム１ ｓｈＲＮＡスクリーニングの結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＧＦ－ベータアイソフォーム１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、およびＴＧＦ－ベータを標的にする異なるｓｈＲＮＡをコードする様々なｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。ｑＰＣＲを使用してｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定した。 図７は、ｑＰＣＲを使用するヒトＶＥＧＦ ｓｈＲＮＡスクリーニングの結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＶＥＧＦ ｃＤＮＡ発現プラスミド、およびＶＥＧＦを標的にする異なるｓｈＲＮＡをコードする様々なｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。ｑＰＣＲを使用してｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定した。 図８は、ｑＰＣＲおよびウエスタンブロットを使用するヒトＶＩＳＴＡ ｓｈＲＮＡスクリーニングの結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡ発現プラスミド、およびＶＩＳＴＡを標的にする異なるｓｈＲＮＡをコードする様々なｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図８Ａは、ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図８Ｂは、ヒトＶＩＳＴＡ ｓｈＲＮＡのウエスタンブロット分析の結果を示す。ウエスタンブロッティングおよびデンシトメトリーを使用して、ＶＩＳＴＡタンパク質発現のレベルを測定した。 図９は、ＨｕＰＤ－Ｌ１＋ＨｕＴＲＥＸ１ ＲＮＡｉによる組合せ遺伝子ノックダウンのｑＰＣＲ評価の結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＴＲＥＸ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、ＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、ならびにＰＤ－Ｌ１およびＴＲＥＸ１を標的にするＡＲＩ－１３４ ｓｈＲＮＡをコードするｐＥＱＵ６－Ｈ１プラスミド、またはＰＤ－Ｌ１単独を標的にするＡＲＩ－１２３ ｓｈＲＮＡをコードするｐＥＱＵ６プラスミド、もしくはＴＲＥＸ１を標的にするＡＲＩ－１１４ ｓｈＲＮＡをコードするｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図９Ａは、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図９Ｂは、ＴＲＥＸ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。 図１０は、ＨｕＰＤ－Ｌ１＋ＨｕＳＩＲＰアルファＲＮＡｉによる組合せ遺伝子ノックダウンのｑＰＣＲ評価の結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、ＳＩＲＰアルファｃＤＮＡ発現プラスミド、ならびにＰＤ－Ｌ１およびＳＩＲＰアルファを標的にするｓｈＲＮＡを含有するＡＲＩ－１３５をコードするｐＥＱＵ６－Ｈ１プラスミド、またはＰＤ－Ｌ１単独を標的にするＡＲＩ－１２３ ｓｈＲＮＡをコードするｐＥＱＵ６プラスミド、もしくはＳＩＲＰアルファを標的にするＡＲＩ－１７５ ｓｈＲＮＡをコードするｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図１０Ａは、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図１０Ｂは、ＳＩＲＰアルファｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。 図１１は、ＨｕＰＤ－Ｌ１＋ＨｕベータカテニンＲＮＡｉによる組合せ遺伝子ノックダウンのｑＰＣＲ評価の結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、ベータカテニンｃＤＮＡ発現プラスミド、ならびにＰＤ－Ｌ１およびベータカテニンを標的にするｓｈＲＮＡを含有するＡＲＩ－１３６をコードするｐＥＱＵ６－Ｈ１プラスミド、またはＰＤ－Ｌ１単独を標的にするＡＲＩ－１２３ ｓｈＲＮＡをコードするｐＥＱＵ６プラスミド、もしくはベータカテニンを標的にするＡＲＩ－１６９ ｓｈＲＮＡをコードするｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図１１Ａは、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図１１Ｂは、ベータカテニンｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。 図１２は、ＨｕＰＤ－Ｌ１＋ＨｕＶＩＳＴＡ ＲＮＡｉによる組合せ遺伝子ノックダウンのｑＰＣＲ評価の結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、ＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、ＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡ発現プラスミド、ならびにＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡを標的にするｓｈＲＮＡを含有するＡＲＩ－１３７（配列番号２１３）をコードするｐＥＱＵ６－Ｈ１プラスミド、またはＰＤ－Ｌ１単独を標的にするＡＲＩ－１２３（配列番号２）ｓｈＲＮＡをコードするｐＥＱＵ６プラスミド、もしくはＶＩＳＴＡを標的にするＡＲＩ－１９５（配列番号２５）ｓｈＲＮＡをコードするｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図１２Ａは、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図１２Ｂは、ＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。 図１３は、マウスＴＲＥＸ１＋マウスＰＤ－Ｌ１ ＲＮＡｉによる組合せ遺伝子ノックダウンのｑＰＣＲ評価の結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、マウスＴＲＥＸ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、マウスＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、ならびにマウスＴＲＥＸ１およびマウスＰＤ－Ｌ１を標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１２８と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６－Ｈ１プラスミド、またはマウスＰＤ－Ｌ１単独を標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１１５と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６プラスミド、もしくはマウスＴＲＥＸ１を標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１０８と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図１３Ａは、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図１３Ｂは、ＴＲＥＸ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。 図１４は、マウスＰＤ－Ｌ１＋マウスＳＩＲＰアルファＲＮＡｉによる組合せ遺伝子ノックダウンのｑＰＣＲ評価の結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、マウスＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、マウスＳＩＲＰアルファｃＤＮＡ発現プラスミド、ならびにマウスＰＤ－Ｌ１およびＳＩＲＰアルファを標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１２９と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６－Ｈ１プラスミド、またはＰＤ－Ｌ１単独を標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１１５と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６プラスミド、もしくはＳＩＲＰアルファを標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１３８と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図１４Ａは、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図１４Ｂは、ＳＩＲＰアルファｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。 図１５は、マウスＰＤ－Ｌ１＋マウスＶＩＳＴＡ ＲＮＡｉによる組合せ遺伝子ノックダウンのｑＰＣＲ評価の結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、マウスＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、マウスＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡ発現プラスミド、ならびにＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡを標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１３２と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６－Ｈ１プラスミド、またはＰＤ－Ｌ１単独を標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１１５と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６プラスミド、もしくはＶＩＳＴＡを標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１５７と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図１５Ａは、ＰＤＬ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図１５Ｂは、ベータカテニンｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。 図１６は、マウスＴＲＥＸ１＋マウスＳＩＲＰアルファＲＮＡｉによる組合せ遺伝子ノックダウンのｑＰＣＲ評価の結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、マウスＴＲＥＸ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、マウスＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡ発現プラスミド、ならびにＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡを標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１３１と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６－Ｈ１プラスミド、またはＴＲＥＸ１単独を標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１０８と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６プラスミド、もしくはＳＩＲＰアルファを標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１３８と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図１６Ａは、ＴＲＥＸ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図１６Ｂは、ＳＩＲＰアルファｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。 図１７は、マウスＰＤ－Ｌ１＋マウスベータカテニンＲＮＡｉによる組合せ遺伝子ノックダウンのｑＰＣＲ評価の結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、マウスＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、マウスベータカテニンｃＤＮＡ発現プラスミド、ならびにＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡを標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１３３と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６－Ｈ１プラスミド、またはＰＤ－Ｌ１単独を標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１１５と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６プラスミド、もしくはベータカテニンを標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１６６と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図１７Ａは、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図１７Ｂは、ベータカテニンｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。 図１８は、マウスＴＲＥＸ１＋マウスＶＩＳＴＡ ＲＮＡｉによる組合せ遺伝子ノックダウンのｑＰＣＲ評価の結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、マウスＴＲＥＸ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、マウスＶＩＳＴＡ ｃＤＮＡ発現プラスミド、ならびにＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡを標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１３０と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６－Ｈ１プラスミド、またはＴＲＥＸ１単独を標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１０８と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６プラスミド、もしくはＶＩＳＴＡを標的にするｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１５７と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図１８Ａは、ＴＲＥＸ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図１８Ｂは、ＶＩＳＴＡ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。 図１９は、マウスＰＤ－Ｌ１のマイクロＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ介在性ノックダウンの比較を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、マウスＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、およびＰＤ－Ｌ１を標的にするマイクロＲＮＡ（ＡＲＩ－２０１）またはｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１１５と名付けられた）をコードするどちらかのｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。図１９Ａは、ＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図１９Ｂは、ウエスタンブロット分析の結果を示す。ウエスタンブロッティングおよびデンシトメトリーを使用して、ＰＤ－Ｌ１タンパク質発現のレベルを測定した。 図２０は、マウスＴＲＥＸ１のマイクロＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ介在性ノックダウンの比較を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、マウスＴＲＥＸ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、およびＴＲＥＸ１を標的にするマイクロＲＮＡ（ＡＲＩ－２０３と名付けられた）またはｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１０８と名付けられた）をコードするｐＥＱＵ６プラスミドを同時トランスフェクトした。ウエスタンブロットを使用してｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定した。 図２１は、マイクロＲＮＡのＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ発現によるＴＲＥＸ１ノックダウンの結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、マウスＴＲＥＸ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、ならびにマウスＴＲＥＸ１を標的にするｐＥＱＵ６プラスミドｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１０８と名付けられた）またはＣＭＶプロモーターおよびマウスＴＲＥＸ１を標的にするマイクロＲＮＡ（ＡＲＩ－２０４と名付けられた）をコードするｐＥＱプラスミドを同時トランスフェクトした。図２１Ａは、マウスＴＲＥＸ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図２１Ｂは、ウエスタンブロット分析の結果を示す。ウエスタンブロッティングおよびデンシトメトリー を使用して、マウスＴＲＥＸ１タンパク質発現のレベルを測定した。 図２２は、マイクロＲＮＡのＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩ発現によるＰＤ－Ｌ１ノックダウンの結果を示す。ＨＥＫ２９３細胞に、マウスＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ発現プラスミド、ならびにマウスＰＤ－Ｌ１を標的にするｐＥＱＵ６プラスミドｓｈＲＮＡ（ＡＲＩ－１１５と名付けられた）またはＣＭＶプロモーターおよびマウスＴＲＥＸ１を標的にするマイクロＲＮＡ（ＡＲＩ－２０２と名付けられた）をコードするｐＥＱプラスミドを同時トランスフェクトした。図２２Ａは、マウスＰＤ－Ｌ１ ｍＲＮＡノックダウンのレベルを決定するのに使用したｑＰＣＲの結果を示す。図２２Ｂは、ウエスタンブロット分析の結果を示す。ウエスタンブロッティングおよびデンシトメトリーを使用して、マウスＰＤ－Ｌ１タンパク質発現のレベルを測定した。 図２３は、ＣＴ２６結腸腫瘍モデルにおける全身投与株ＡＳＴ－１０４の有効性を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスに単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝８）。確立された腫瘍を有するマウスに、プラスミド対照（株ＡＳＴ－１０２）もしくはＴＲＥＸ１ ｓｈＲＮＡプラスミド（株ＡＳＴ－１０４の）のどちらかを含有する１×１０^７ＣＦＵのＹＳ１６４６株、またはＰＢＳ対照を、矢印によって示された日にＩＶ注射した。スパゲッティプロットは腫瘍成長を示し、各線は個々のマウスに相当する。腫瘍測定は、電子ノギス（Ｆｏｗｌｅｒ、ニュートン、ＭＡ）を使用して行った。腫瘍容量は、修正された楕円体式１／２（縦×横^２）を使用して計算した。腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したとき、または壊死したとき、ＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）％を１－（平均テスト腫瘍容量／平均対照腫瘍容量）×１００として計算した。^＊ｐ＜０．０５ ｖｓ．プラスミド対照、スチューデントｔ検定。 図２４は、株ＡＳＴ－１０４介在性サイトカイン変化とＳＴＩＮＧシグネチャーとの相関を示す。ＢＡＬＢ／ｃに単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝８）。確立された腫瘍を有するマウスに、プラスミド対照（株ＡＳＴ－１０２）もしくはＴＲＥＸ１ ｓｈＲＮＡプラスミド（ＡＳＴ－１０４）のどちらかを含有する５×１０^６ＣＦＵのＹＳ１６４６株、またはＰＢＳ対照をＩＶ注射した。初回投与の６時間後、マウスを採血し、全身性血清サイトカインをＬｕｍｉｎｅｘ ２００装置（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびマウスサイトメトリービーズアレイ（ＢＤビーズアレイ、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ、ＦＣＡＰソフトウェア、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でテストした。図２４Ａは、炎症促進性サイトカインのレベルを示す。図２４Ｂは、免疫抑制性サイトカインのレベルを示す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。 図２５は、ＭＣ３８結腸腫瘍モデルにおける全身投与株ＡＳＴ－１０４の有効性を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（６～８週齢）に単一ＭＣ３８（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝１０）。確立された腫瘍を有するマウスに、プラスミド対照（株ＡＳＴ－１０２）またはＴＲＥＸ１ ｓｈＲＮＡプラスミド（株ＡＳＴ－１０４）のどちらかを含有する５×１０^６ＣＦＵのＹＳ１６４６株、またはＰＢＳ対照を、矢印によって示された日にＩＶ注射した。スパゲッティプロットは腫瘍成長を示し、各線は個々のマウスに相当する。腫瘍測定は、電子ノギス（Ｆｏｗｌｅｒ、ニュートン、ＭＡ）を使用して行った。腫瘍容量は、修正された楕円体式１／２（縦×横^２）を使用して計算した。腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したとき、または壊死したとき、ＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。ＴＧＩを１－（平均テスト腫瘍容量／平均対照腫瘍容量）×１００として計算した。^＊ｐ＜０．０５ ｖｓ．プラスミド対照、スチューデントｔ検定。 図２６は、チェックポイント抵抗性Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマモデルにおけるＡＳＴ－１０４の有効性を示す。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス（６～８週齢）に単一Ｂ１６．Ｆ１０（５×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝１０）。確立された腫瘍を有するマウスに、プラスミド対照（ＡＳＴ－１０２）もしくはＴＲＥＸ１ ｓｈＲＮＡプラスミド（ＡＳＴ－１０４）のどちらかを含有する５×１０^６ＣＦＵのＹＳ１６４６株、またはＰＢＳ対照を、矢印によって示された日にＩＶ注射した。スパゲッティプロットは腫瘍成長を示し、各線は個々のマウスに相当する。腫瘍測定は、電子ノギス（Ｆｏｗｌｅｒ、ニュートン、ＭＡ）を使用して行った。腫瘍容量は、修正された楕円体式１／２（縦×横^２）を使用して計算した。腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したとき、または壊死したとき、ＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。ＴＧＩを１－（平均テスト腫瘍容量／平均対照腫瘍容量）×１００として計算した。^＊ｐ＜０．０５ ｖｓ．プラスミド対照、スチューデントｔ検定。 図２７は、ＣＴ２６腫瘍モデルにおける全身投与ＡＳＴ－１０５（ｓｈＰＤ－Ｌ１）の有効性を示す。ＢＡＬＢ／ｃ（６～８週齢）に単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝８）。確立された腫瘍を有するマウスに、プラスミド対照（ＡＳＴ－１０２）もしくはＰＤ－Ｌ１ ｓｈＲＮＡプラスミド（ＡＳＴ－１０５）のどちらかを含有する５×１０^６ＣＦＵのＹＳ１６４６株、またはＰＢＳ対照を、矢印によって示された日にＩＶ注射した。別個の群に、１００μｇ抗ＰＤ－Ｌ１抗体（クローン１０Ｆ．９Ｇ２クローン、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を初回のＩＶ注射で始めて、毎週ＩＰ注射によって投与した。スパゲッティプロットは腫瘍成長を示し、各線は個々のマウスに相当する。腫瘍測定は、電子ノギス（Ｆｏｗｌｅｒ、ニュートン、ＭＡ）を使用して行った。腫瘍容量は、修正された楕円体式１／２（縦×横^２）を使用して計算した。腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したとき、または壊死したとき、ＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。ＴＧＩを１－（平均テスト腫瘍容量／平均対照腫瘍容量）×１００として計算した。^＊ｐ＜０．０５ ｖｓ．プラスミド対照、スチューデントｔ検定。 図２８は、ＡＳＴ－１０５が、ＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂで観察される有意なサイトカイン応答を誘導することを示す結果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝８）。確立された腫瘍を有するマウスに、プラスミド対照（ＡＳＴ－１０２）もしくはＰＤ－Ｌ１ ｓｈＲＮＡプラスミド（ＡＳＴ－１０５）のどちらかを含有する５×１０^６ＣＦＵのＹＳ１６４６株、またはＰＢＳ対照を、矢印によって示された日にＩＶ注射した。別個の群に、初回ＩＶ注射で始めて、毎週１００μｇ抗ＰＤ－Ｌ１抗体ＩＰ（クローン１０Ｆ．９Ｇ２クローン、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を投与した。マウスを初回投与後６時間で採血し、全身性血清サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（ＢＤビーズアレイおよびＬｕｍｉｎｅｘ ２００）およびマウスサイトメトリービーズアレイ（ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ、ＦＣＡＰソフトウェア、全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってテストした。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。 図２９は、両側腹部結腸腫瘍への株ＡＳＴ－１０４およびＡＳＴ－１０５の腫瘍内投与の、腫瘍容量に対する効果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に、二重ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を右側腹部および左側腹部に移植した（１群当たりｎ＝１０）。確立された腫瘍を有するマウスに、プラスミド対照（ＡＳＴ－１０２）またはＴＲＥＸ１ ｓｈＲＮＡプラスミド（ＡＳＴ－１０４）、もしくはＰＤ－Ｌ１ ｓｈＲＮＡプラスミド（ＡＳＴ－１０５）のどちらかを含有する５×１０^６ＣＦＵのＹＳ１６４６株、またはＰＢＳ対照を、矢印によって示された日に右側腹部へＩＴ注射した。腫瘍測定は、電子ノギス（Ｆｏｗｌｅｒ、ニュートン、ＭＡ）を使用して行った。腫瘍容量は、修正された楕円体式１／２（縦×横^２）を使用して計算した。腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したとき、または壊死したとき、ＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）％を１－（平均テスト腫瘍容量／平均対照腫瘍容量）×１００として計算した。プロットは、注射群（左のグラフ）および遠位群（右のグラフ）における各群の平均腫瘍成長、±ＳＥＭを示す。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定。 図３０は、マウスにおける両側腹部結腸腫瘍への腫瘍内ＡＳＴ－１０４投与の治療効果を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に、二重ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を右側腹部および左側腹部に移植した（１群当たりｎ＝１０）。確立された腫瘍を有するマウスに、プラスミド対照（ＡＳＴ－１０２）またはＴＲＥＸ１ ｓｈＲＮＡプラスミド（ＡＳＴ－１０４）、もしくはｓｈＰＤ－Ｌ１プラスミド（ＡＳＴ－１０５）のどちらかを含有する５×１０^６ＣＦＵのＹＳ１６４６株、またはＰＢＳ対照を、腫瘍移植後１０日目および１４日目に右側腹部へＩＴ注射した。腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したとき、または壊死したとき、ＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。図は、マウスの全生存率を示す。^＊＊ｐ＜０．０１、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定。 図３１は、ＡＳＴ－１０４のＩＴ投与後の注射した腫瘍および遠位腫瘍における腫瘍定着のレベルを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に、二重ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を右側腹部および左側腹部に移植した（１群当たりｎ＝１０）。確立された腫瘍を有するマウスに、ＴＲＥＸ１ ｓｈＲＮＡプラスミドを含有する５×１０^６ＣＦＵ のＹＳ１６４６株（ＡＳＴ－１０４）を右側腹部へＩＴ注射した。腫瘍移植の３５日後（ＡＳＴ－１０４の最終投与の１２日後）に３匹のマウスを屠殺し、注射した腫瘍および遠位腫瘍をホモジナイズし［ＧｅｎｔｌｅＭＡＣｓ（商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ］、ＬＢプレートにプレーティングして腫瘍組織１グラム当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）数を数えた。図は、組織１グラム当たりの平均ＣＦＵ、±ＳＤを示す。 図３２は、ＣｐＧスクランブルプラスミド（ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｐｌａｓｍｉｄ）が免疫刺激性抗腫瘍特性を有することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝９）。確立された腫瘍を有するマウスに、５×１０^６ＣＦＵのＹＳ１６４６株（ＡＳＴ－１００）、もしくはスクランブルｓｈＲＮＡ対照プラスミドを含有するＹＳ１６４６株（ＡＳＴ－１０３）、またはＰＢＳ対照を、矢印によって示された日にＩＶ注射した。腫瘍測定は、電子ノギス（Ｆｏｗｌｅｒ、ニュートン、ＭＡ）を使用して行った。腫瘍容量は、修正された楕円体式１／２（縦×横^２）を使用して計算した。腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したとき、または壊死したとき、ＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。ＴＧＩを１－（平均テスト腫瘍容量／平均対照腫瘍容量）×１００として計算した。図は、各群の平均腫瘍成長、±ＳＥＭを示す。^＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。 図３３は、ＡＳＴ－１０６（マイクロＲＮＡ ＴＲＥＸ１）ｖｓ． ＡＳＴ－１０４（ｓｈＲＮＡ ＴＲＥＸ１）の有効性を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝９）。確立された腫瘍を有するマウスに、ＴＲＥＸ１ ｓｈＲＮＡプラスミドを含有するＹＳ１６４６（ＡＳＴ－１０４）もしくはＴＲＥＸ１マイクロＲＮＡプラスミドを含有する５×１０^６ＣＦＵのＹＳ１６４６株（ＡＳＴ－１０６）、またはＰＢＳ対照を、矢印によって示された日にＩＶ注射した。腫瘍測定は、電子ノギス（Ｆｏｗｌｅｒ、ニュートン、ＭＡ）を使用して行った。腫瘍容量は、修正された楕円体式１／２（縦×横^２）を使用して計算した。腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したとき、または壊死したとき、ＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。ＴＧＩを１－（平均テスト腫瘍容量／平均対照腫瘍容量）×１００として計算した。図は、各群の平均腫瘍成長、±ＳＥＭを示す。^＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。 図３４は、ｆｌｉＣ遺伝子を欠失させるのに使用したプロセスの概略図を示す。ｆｌｉｃ遺伝子は、DatsenkoおよびWanner［Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645 （2000）］に記載されているラムダ由来レッド組換え系を使用して、Ｓ．ティフィムリウム株ＡＳＴ－１０１（ＹＳ１６４６のａｓｄ欠失株）の染色体から欠失させた。 図３５は、フラジェリン欠失株がＬＢで正常に成長することを示す。図は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ９６ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＯＤ_６００によって測定した、３７℃、ＬＢブロスでの株ＡＳＴ－１０８ ＡＳＤ（ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）およびＡＳＴ－１１２ ＡＳＤ／ＦＬＧ（ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）の成長を示す。 図３６は、フラジェリンノックアウトが抗腫瘍効果を改善することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝９）。確立された腫瘍を有するマウスに、ｐＡＴＩ ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するａｓｄ／ｆｌｇＢ／ｆｌｉＣノックアウト株（ＡＳＴ－１１３）、もしくはｐＡＴＩ ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するａｓｄノックアウト株（ＡＳＴ－１１０）５×１０^６ＣＦＵ、またはＰＢＳ対照を、矢印によって示された日にＩＶ注射した。腫瘍測定は、電子ノギス（Ｆｏｗｌｅｒ、ニュートン、ＭＡ）を使用して行った。腫瘍容量は、修正された楕円体式１／２（縦×横^２）を使用して計算した。腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したとき、または壊死したとき、ＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。ＴＧＩを１－（平均テスト腫瘍容量／平均対照腫瘍容量）×１００として計算した。図は、各群の平均腫瘍成長、±ＳＥＭを示す。^＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。 図３７は、フラジェリンノックアウトがＩＦＮ－ガンマシグネチャーの増加を示すことを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝９）。確立された腫瘍を有するマウスに、ｐＡＴＩ ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するａｓｄ／ｆｌｇＢ／ｆｌｉＣノックアウト株（ＡＳＴ－１１３）、もしくはｐＡＴＩ ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するａｓｄノックアウト株（ＡＳＴ－１１０）５×１０^６ＣＦＵ、またはＰＢＳ対照をＩＶ注射した。マウスを初回投与後６時間で採血し、全身性血清サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ ２００装置（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびマウスサイトメトリービーズアレイ（ＢＤビーズアレイ、ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ、ＦＣＡＰソフトウェア、全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってテストした。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１、スチューデントｔ検定。 図３８は、フラジェリンが腫瘍定着に必要ではないことを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝９）。確立された腫瘍を有するマウスに、ｐＡＴＩ ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するａｓｄ／ｆｌｇＢ／ｆｌｉＣノックアウト株（ＡＳＴ－１１３）、もしくはｐＡＴＩ ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するａｓｄノックアウト株（ＡＳＴ－１１０）５×１０^６ＣＦＵ、またはＰＢＳ対照をＩＶ注射した。腫瘍移植後３５日目（遺伝子改変サルモネラ療法の最終投与後１２日目）に、１群当たり３匹のマウスを屠殺し、腫瘍をホモジナイズし［ＧｅｎｔｌｅＭＡＣｓ（商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ］、ＬＢプレートにプレーティングして腫瘍組織１グラム当たりのコロニー形成単位数を数えた。図は、組織１グラム当たりの平均コロニー形成単位（ＣＦＵ）、±ＳＤを示す。 図３９は、ｃｙｔｏＬＬＯ発現株がインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で正常に成長することを示す。図は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ９６ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＯＤ_６００によって測定した、３７℃、ＬＢブロスでの株ＡＳＴ－１１０［（ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）を含有するａｓｄ欠失を有するＹＳ１６４６］およびＡＳＴ－１１５［（ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）を含有するａｓｄ欠失およびｃｙｔｏＬＬＯ発現カセットのノックインを有するＹＳ１６４６］の成長を示す。 図４０は、ＡＳＴ－１１５（ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを有するＡＳＤノックアウト＋ＣｙｔｏＬＬＯノックイン株）が、マウスＣＴ２６腫瘍モデルにおいて強い単回投与有効性を示すことを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝９）。確立された腫瘍を有するマウスに、５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１１５［（ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）を含有する、ａｓｄ座にａｓｄ欠失およびｃｙｔｏＬＬＯ発現カセットのノックインを有するＹＳ１６４６］、またはＰＢＳ対照を、矢印によって示された日にＩＶ注射した。腫瘍測定は、電子ノギス（Ｆｏｗｌｅｒ、ニュートン、ＭＡ）を使用して行った。腫瘍容量は、修正された楕円体式１／２（縦×横^２）を使用して計算した。腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したとき、または壊死したとき、ＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。ＴＧＩを１－（平均テスト腫瘍容量／平均対照腫瘍容量）×１００として計算した。図は、各群の平均腫瘍成長、±ＳＥＭを示す。^＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。 図４１は、株ＹＳ１６４６が成長に腫瘍微小環境レベルのアデノシンを必要とすることを示す。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ９６ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＯＤ_６００によって測定した、３７℃、ＬＢブロスでの株ＹＳ１６４６（ｐｕｒＩ－／ｍｓｂＢ－）および野生型親株ＡＴＣＣ１４０２８の成長が示される。 図４２は、ＡＳＤ、ＦＬＧ、およびＣｙｔｏＬＬＯ遺伝子改変株が成長に高アデノシンを必要とすることを示す。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ９６ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＯＤ_６００によって測定した、３７℃、ＬＢブロスでの株ＡＳＴ－１１７（低コピーｓｈＴＲＥＸ－１プラスミドを含有するＹＳ１６４６ Δａｓｄ）、ＡＳＴ－１１８（低コピーｓｈＴＲＥＸ－１プラスミドを含有するＹＳ１６４６ Δａｓｄ／ｆｉｌＣ／ｆｌｊＢ）、およびＡＳＴ－１１９（低コピーｓｈＴＲＥＸ－１プラスミドを含有するＹＳ１６４６ Δａｓｄ：ＬＬＯ）の成長が示される。 図４３は、複製ａｓｄコードプラスミドの低コピー起点を有する株が、複製ａｓｄコードプラスミドの高コピー起点を有する株より優れた成長速度論を有することを示す。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ９６ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＯＤ_６００によって測定した、３７℃、ＬＢブロスでの株ＹＳ１６４６、ＡＳＴ－１１７（機能性ａｓｄ遺伝子を有する低コピーｓｈＴＲＥＸ－１プラスミドを含有するＹＳ１６４６ Δａｓｄ）、ＡＳＴ－１０４（ａｓｄ遺伝子がない低コピーｐＥＱ ｓｈＴＲＥＸ－１プラスミドを含有するＹＳ１６４６）、およびＡＳＴ－１１０（機能性ａｓｄ遺伝子を有する高コピーｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ－１プラスミドを含有するＹＳ１６４６ Δａｓｄ）の成長が示される。 図４４は、低コピーａｓｄプラスミドを有する株が、高コピーａｓｄプラスミドを有する株よりマウス腫瘍細胞に適合することを示す。株ＡＳＴ－１１７（機能性ａｓｄ遺伝子を有する低コピーｓｈＴＲＥＸ－１プラスミドを含有するＹＳ１６４６ Δａｓｄ）およびＡＳＴ－１１０（機能性ａｓｄ遺伝子を有する高コピーｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ－１プラスミドを含有するＹＳ１６４６ Δａｓｄ）の細胞内成長が、Ｂ１６Ｆ．１０マウスメラノーマ細胞およびＣＴ２６マウス結腸癌細胞で示される。２４ウェル皿中５×１０^５細胞を、５のＭＯＩでＳ．ティフィムリウム株に感染させた。感染の３０分後、培地をゲンタマイシンを含有する培地に取り換えて細胞外細菌を死滅させた。示された時点で、細胞単層を浸透圧ショックによって溶解し、細胞溶解物を希釈し、ＬＢ寒天にプレーティングしてＣＦＵを数えた。 図４５は、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でａｓｄ遺伝子相補系（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）が、Ｓ．ティフィムリウム感染腫瘍におけるプラスミドの保持をもたらすことを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝９）。確立された腫瘍を有するマウスに、ｐＡＴＩ ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するａｓｄノックアウト株（ＡＳＴ－１１０）、またはａｓｄ遺伝子がないｐＥＱ ｓｈＴＲＥＸ－１プラスミドを含有するＹＳ１６４６（ＡＳＴ－１０４）５×１０^６ＣＦＵをＩＶ注射した。腫瘍移植後３５日目（遺伝子改変サルモネラ療法の最終投与後１２日目）に１群当たり３匹のマウスを屠殺し、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣｓ（商標）ホモジナイザー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して腫瘍をホモジナイズし、ＬＢ寒天プレートまたは５０ｕｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天プレートにプレーティングした。図は、腫瘍組織ホモジネートにおけるカナマイシン耐性ＣＦＵのパーセンテージ、±ＳＤを示す。 図４６は、ａｓｄ遺伝子相補系およびｓｈＴＲＥＸ１を有するプラスミドを含有する株（ＡＳＴ－１１０）の治療有効性が改善されることを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝９）。確立された腫瘍を有するマウスに、ｐＡＴＩ ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するａｓｄノックアウト株（ＡＳＴ－１１０）もしくはｐＡＴＩスクランブルプラスミドを含有するａｓｄノックアウト株（ＡＳＴ－１０９）、もしくはａｓｄ遺伝子がないｐＥＱ－ｓｈＴＲＥＸ－１プラスミドを含有するＹＳ１６４６株（ＡＳＴ－１０４）５×１０^６ＣＦＵ、またはＰＢＳ対照を、矢印によって示された日にＩＶ注射した。腫瘍測定は、電子ノギス（Ｆｏｗｌｅｒ、ニュートン、ＭＡ）を使用して行った。腫瘍容量は、修正された楕円体式１／２（縦×横^２）を使用して計算した。腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したとき、または壊死したとき、ＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。ＴＧＩを１－（平均テスト腫瘍容量／平均対照腫瘍容量）×１００として計算した。図は、各群の平均腫瘍成長、±ＳＥＭを示す。 図４７は、低コピーｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有する株（ＡＳＴ－１１７）が、高コピープラスミドを含有する株（ＡＳＴ－１１０）と比べて優れた抗腫瘍特性を有することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝９）。確立された腫瘍を有するマウスに、高コピー数の複製起点を有するｐＡＴＩ ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するａｓｄノックアウト株（ＡＳＴ－１１０）もしくは低コピー数の複製起点を有するｐＡＴＩ ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するａｓｄノックアウト株（ＡＳＴ－１１７）５×１０^６ＣＦＵ、またはＰＢＳ対照を、矢印によって示された日にＩＶ注射した。腫瘍測定は、電子ノギス（Ｆｏｗｌｅｒ、ニュートン、ＭＡ）を使用して行った。腫瘍容量は、修正された楕円体式１／２（縦×横^２）を使用して計算した。腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したとき、または壊死したとき、ＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。ＴＧＩを１－（平均テスト腫瘍容量／平均対照腫瘍容量）×１００として計算した。図は、各群の平均腫瘍成長、±ＳＥＭを示す。^＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。 図４８は、ＡＳＴ－１１７低コピープラスミド株が、ＡＳＴ－１１０高コピープラスミド株より良好に腫瘍に定着し、より高い腫瘍対脾臓定着比を有することを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝９）。確立された腫瘍を有するマウスに、高コピー数の複製起点を有するｐＡＴＩ ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するａｓｄノックアウト株（ＡＳＴ－１１０）または低コピー数の複製起点を有するｐＡＴＩ ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するａｓｄノックアウト株（ＡＳＴ－１１７）５×１０^６ＣＦＵをＩＶ注射した。腫瘍移植後３５日目（遺伝子改変サルモネラ療法の最終投与後１２日目）に１群当たり３匹のマウスを屠殺し、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣｓ（商標）ホモジナイザー（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して腫瘍をホモジナイズし、ＬＢプレートにプレーティングして腫瘍組織１グラム当たりのＣＦＵ数を数えた。図４８Ａは、腫瘍組織１グラム当たりの平均ＣＦＵ、±ＳＤを示す。図４８Ｂは、腫瘍対脾臓定着比を示す。 図４９は、定常期まで成長した株が同等に強力であり、対数期まで成長した同じ株より炎症性が低いことを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝９）。確立された腫瘍を有するマウスに、対数期もしくは定常期に採取したｐＥＱ－ｓｈＴＲＥＸ－１プラスミドを含有する５×１０^６ＣＦＵのＹＳ１６４６株（ＡＳＴ－１０４）、またはＰＢＳ対照を、矢印によって示された日にＩＶ注射した。腫瘍測定は、電子ノギス（Ｆｏｗｌｅｒ、ニュートン、ＭＡ）を使用して行った。腫瘍容量は、修正された楕円体式１／２（縦×横^２）を使用して計算した。腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したとき、または壊死したとき、ＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。ＴＧＩを１－（平均テスト腫瘍容量／平均対照腫瘍容量）×１００として計算した。図４９Ａは、各群の平均腫瘍成長、±ＳＥＭを示す。^＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。図４９Ｂは、ＴＮＦ－アルファおよびＩＬ－６のレベルを示す。マウスを初回投与後６時間で採血し、全身性血清サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ｌｕｍｉｎｅｘ Ｃｏｒｐ．）およびマウスサイトメトリービーズアレイ（ＦＡＣＳ Ｆｏｒｔｅｓｓａ、ＦＣＡＰソフトウェア、全てＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によってテストした。^＊＊ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。 図５０は、自己溶解株（ＡＳＴ－１２０）がＤＡＰの非存在下で成長できないことを示す。図は、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ９６ウェルプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用してＯＤ_６００によって測定した、ＬＢブロス単独、または５０μｇ／ｍＬ ＤＡＰを補充したＬＢブロスでの、ａｓｄ遺伝子を含有しないｐＥＱＵ６－ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するΔａｓｄ：ｃｙｔｏＬＬＯ株（ＡＳＴ－１２０）の経時的な成長を示す。 図５１は、自己溶解株（ＡＳＴ－１２０）の抗腫瘍活性を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に単一ＣＴ２６（２×１０^５細胞）皮下側腹部腫瘍を移植した（１群当たりｎ＝９）。確立された腫瘍を有するマウスに、ａｓｄ遺伝子を含有しないｐＥＱＵ６－ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有する５×１０^６ＣＦＵのΔａｓｄ：ｃｙｔｏＬＬＯ株（ＡＳＴ－１２０）、またはＰＢＳ対照を、矢印によって示された日にＩＶ注射した。腫瘍測定は、電子ノギス（Ｆｏｗｌｅｒ、ニュートン、ＭＡ）を使用して行った。腫瘍容量は、修正された楕円体式１／２（縦×横２）を使用して計算した。腫瘍サイズが体重の＞２０％に達したとき、または壊死したとき、ＩＡＣＵＣ規則に従ってマウスを安楽死させた。ＴＧＩを１－（平均テスト腫瘍容量／平均対照腫瘍容量）×１００として計算した。図は、各群の平均腫瘍成長、±ＳＥＭを示す。^＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。 図５２は、ＴＲＥＸ１発現が、いくつかのヒト腫瘍タイプで増加することを示す。ＴＣＧＡデータベースを使用するＴＲＥＸ１遺伝子の相対的遺伝子発現の分析を、広範な腫瘍タイプから行った。正常組織と比べてＴＲＥＸ１の上方調節が有意な腫瘍タイプが示されている：前立腺がん、乳がん、子宮頸がん、子宮がんおよび膀胱がん（ｐ値：ＢＲＣＡ － ７．７ｅ－１６；ＰＲＡＤ － ９．４ｅ－１２；ＵＣＥＣ － ２．５ｅ－０５；ＢＬＣＡ － ３．７ｅ－０３；ＣＥＳＣ － ７．７ｅ－０３）および腎臓がんのいくつかの形態（ｐ値：ＫＩＰＡＮ － ８．９ｅ－３９；ＫＩＲＣ － ９．６ｅ－３５；ＫＩＲＰ － ５．８ｅ－１４；ＫＩＣＨ － ４．９ｅ－０８）。 図５３は、Ｓ．ティフィムリウム株ＡＳＴ－１０６の投与後の放射線療法が、腫瘍定着を増加させることを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウス（６～８週齢）に、１×１０^５マウスＴＳＡ乳癌細胞を右側腹部に皮下接種した。確立された腫瘍を担持するマウスに以下を投与した：５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１０６（ｐＥＱＵ６－ｍｉＴＲＥＸ１で形質転換されたＹＳ１６４６）のＩＶ注射と４時間後の０Ｇｙ（３匹のマウス）、または５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１０６と４時間後の２０Ｇｙ（３匹のマウス）；２０Ｇｙ照射と４時間後の５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１０６（３匹のマウス）、またはＰＢＳ ＩＶとその後の０Ｇｙ照射（１匹のマウス）。焦点放射線療法を、小動物放射線研究プラットフォーム（ｓｍａｌｌ ａｎｉｍａｌ ｒａｄｉａｔｉｏｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｐｌａｔｆｏｒｍ）（ＳＡＲＲＰ）装置（ＸＳｔｒａｈｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して投与した。マウスを２４時間後に屠殺し、腫瘍を採取し、秤量した。ＧｅｎｔｌｅＭａｃｓ（商標）装置（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）でＭチューブを使用して１０ｍＬ滅菌ＰＢＳ中で腫瘍をホモジナイズし、次いで１０倍連続希釈を行い、カナマイシンを含有するＬＢ寒天プレートにプレーティングした。翌日、コロニー形成単位（ＣＦＵ）をカウントし、腫瘍組織１グラム当たりのＣＦＵを計算した。^＊ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。

概要
Ａ．定義
Ｂ．免疫刺激性細菌の概説
Ｃ．がん免疫療法
１．免疫療法
２．養子免疫療法
３．がんワクチンおよび腫瘍崩壊性ウイルス
Ｄ．細菌によるがん免疫療法
１．細菌による治療法
２．細菌およびウイルスに対する免疫応答の比較
３．サルモネラ属による治療法
ａ．腫瘍指向性細菌。
ｂ．サルモネラエンテリカセロバーティフィムリウム
ｃ．細菌の弱毒化
ｉ．ｍｓｂＢ－突然変異体
ｉｉ．ｐｕｒＩ－突然変異体
ｉｉｉ．弱毒突然変異の組合せ
ｉｖ．ＶＮＰ２０００９および他の弱毒化Ｓ．ティフィムリウム菌株
ｖ．高分子をデリバリーするように遺伝子操作された弱毒化Ｓ．ティフィムリウム
４．治療指数を増加させるための免疫刺激性細菌の強化
ａ．ａｓｄ遺伝子欠失
ｂ．アデノシン栄養要求性
ｃ．フラジェリン欠損菌株
ｄ．サルモネラ属含有液胞（ＳＣＶ）を逃避するように遺伝子操作されたサルモネラ属
ｅ．バイオフィルム形成に必要なサルモネラ属遺伝子における欠失
ｆ．ＬＰＳ生合成経路中の遺伝子における欠失
ｇ．ＳＰＩ－１遺伝子の欠失
ｈ．プラスミドデリバリーを増加させるためのエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄＡ）突然変異
ｉ．ＲＩＧ－Ｉ阻害
ｊ．ＤＮＡＳＥ ＩＩ阻害
ｋ．ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害
ｌ．スタビリン－１／ＣＬＥＶＥＲ－１阻害
ｍ．細菌培養条件
Ｅ．例示的プラスミドの構築
１．干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）
ａ．ｓｈＲＮＡ
ｂ．マイクロＲＮＡ
２．複製起点およびプラスミドコピー数
３．ＣｐＧモチーフおよびＣｐＧアイランド
４．プラスミドの維持／構成成分の選択
５．ＤＮＡ核標的化配列
Ｆ．腫瘍標的化免疫刺激性細菌は、抗腫瘍免疫を刺激するための例示的免疫標的遺伝子に対するＲＮＡｉを含む
１．ＴＲＥＸ１
２．ＰＤ－Ｌ１
３．ＶＩＳＴＡ
４．ＳＩＲＰα
５．β－カテニン
６．ＴＧＦ－β
７．ＶＥＧＦ
８．追加の例示的なチェックポイント標的
Ｇ．単回療法モダリティおよび組合せ療法内での複数の免疫標的に対するＲＮＡＩ ｓｈＲＮＡの組合せ
１．ＴＲＥＸ１および他の標的
２．ＴＲＥＸ１および照射療法
３．ＴＲＥＸ１および免疫原性化学療法
４．抗チェックポイント抗体を用いた組合せ療法
Ｈ．医薬産生、組成物、および製剤
１．製造
ａ．細胞バンクの製造
ｂ．原薬の製造
ｃ．薬物産物の製造
２．組成物
３．製剤
ａ．液体剤、注射剤、乳剤
ｂ．熱安定性乾燥製剤
４．他の投与経路のための組成物
５．投薬量および投与
６．包装および製造物品
Ｉ．処置および使用の方法
１．がんおよび腫瘍
２．投与
３．モニタリング
Ｊ．実施例

Ａ．定義
別段の定義がない限り、本明細書において使用する全ての技術および科学用語は、本発明（複数可）が属する技術分野における当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書における開示全体にわたって言及される全ての特許、特許出願、出願公開および文献、ＧｅｎＢａｎｋ配列、データベース、ウェブサイトおよび他の刊行物は、特に注釈がない限り、その全体が参照により組み込まれるものとする。本明細書における用語に関して複数の定義が存在する場合には、この項におけるものが優先される。ＵＲＬまたは他のそのような識別子またはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変更されている場合があり、インターネット上の特定の情報が押し寄せてくる場合があるが、インターネット検索によって等価の情報を見出すことができることを理解されたい。その参照は、そのような情報の利用可能性および一般的な普及の証拠となる。

本明細書において使用する治療用細菌は、ヒト等の対象に投与したときに、がんまたは抗腫瘍療法等の治療法に効果を与える細菌である。

本明細書において使用する免疫刺激性細菌は、対象に導入したときに、腫瘍等の免疫特権組織および細胞において蓄積し、免疫刺激性であるかまたは免疫刺激をもたらす産物を複製および／または発現する治療用細菌である。免疫刺激性細菌は、主に免疫特権環境中を除いて産物を複製および／または発現することができないために、減少された毒性または病原性に基づき、および／または毒性または病原性が減少されたコード化産物に基づき宿主内で弱毒化される。本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、産物（複数可）をコードするために改変されるか、またはそれらに免疫刺激性を与える特徴または特性を示す。このような産物、特性および特徴は、チェックポイント遺伝子を標的とするか、遮断するか、もしくは阻害するｓｈＲＮＡ、またはそのような阻害剤、もしくは免疫抑制性であるか、もしくは免疫抑制性経路にある代謝産物をコードする遺伝子のうちの少なくとも１つを含む。これらとしては、ＴＲＥＸ１の発現を標的とするかもしくは阻害するｓｈＲＮＡ等のコード化ｓｉＲＮＡ、細菌にアデノシン栄養要求性をもたらす改変、および／またはＰＤ－Ｌ１を遮断するかもしくは阻害するｓｈＲＮＡ等の、免疫チェックポイント遺伝子またはその産物の阻害剤または遮断物質がある。

本明細書において使用する菌株名称ＶＮＰ２０００９（例えば、国際公開第９９／１３０５３号を参照のこと、米国特許第６，８６３，８９４号も参照のこと）およびＹＳ１６４６および４１．２．９は、区別せずに使用され、それぞれは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、登録番号２０２１６５が割り当てられた菌株を指す。ＶＮＰ２０００９は、サルモネラ・ティフィムリウムの改変弱毒化菌株であり、これは、ｍｓｂＢおよびｐｕｒＩの欠失を含み、野生型菌株ＡＴＣＣ１４０２８から生成された。

本明細書において使用する菌株名称ＹＳ１４５６および８．７は、区別せずに使用され、それぞれは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託され、登録番号２０２１６４に割り当てられた菌株を指す（米国特許第６，８６３，８９４号を参照のこと）。

本明細書において使用する複製起点は、染色体、プラスミドまたはウイルス上で複製が開始されるＤＮＡの配列である。細菌性プラスミドおよび小ウイルスを含む小分子ＤＮＡに関しては、単一の起点で十分である。

複製起点は、ベクターのコピー数を決定し、それは選択される複製起点に依存する。例えば、発現ベクターが、低コピー数のプラスミドｐＢＲ３２２に由来する場合、それは約２５～５０コピー／細胞の間であり、高コピー数のプラスミドｐＵＣに由来する場合、それは１５０～２００コピー／細胞とすることができる。

本明細書において使用する、細胞におけるプラスミドの中コピー数は、約１５０、または１５０または１５０未満であり、低コピー数は、２０または２０未満等の１５～３０である。低から中コピー数は、１５０未満である。高コピー数は１５０コピー／細胞超である。

本明細書において使用するＣｐＧモチーフは、中心のＣｐＧに隣接する（３’および５’位側で）少なくとも１つの塩基によって囲まれる非メチル化中心ＣｐＧ（「ｐ」は、連続するＣとＧヌクレオチドとの間のホスホジエステル結合を指す）を含む塩基のパターンである。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも約１０ヌクレオチド長であり、非メチル化ＣｐＧを含むオリゴヌクレオチドである。５’ＣＧ３’のうちの少なくともＣは、メチル化されない。

本明細書において使用するＲＩＧ－Ｉ結合配列は、ポリ（ｄＡ－ｄＴ）配列に直接由来するか、またはこの配列からＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩによって合成される５’トリホスフェート（５’ｐｐｐ）構造体を指し、ＲＩＧ－Ｉとの相互作用により、ＲＩＧ－Ｉ経路を介してＩ型ＩＦＮを活性化できる。ＲＮＡとしては、少なくとも４個のＡリボヌクレオチド（Ａ－Ａ－Ａ－Ａ）があり；４、５、６、７、８、９、１０またはそれ超を含むことができる。ＲＩＧ－Ｉ結合配列は、細菌中のプラスミド中に導入されて、ポリＡに転写される。

本明細書において使用する「改変」は、ポリペプチドのアミノ酸の配列または核酸分子におけるヌクレオチドの配列の改変に関連し、それとしてはそれぞれ、アミノ酸またはヌクレオチドの欠失、挿入、および置換えがある。ポリペプチドを改変する方法は、組換えＤＮＡ方法論を使用することによる等、当業者であれば日常的なものである。

本明細書において使用する、細菌ゲノムに対するまたはプラスミドもしくは遺伝子に対する改変としては、核酸の欠失、置換えおよび挿入がある。

本明細書において使用するＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＲＮＡ分子が、標的とされるｍＲＮＡ分子を中和し、翻訳を阻害し、その結果、標的とされる遺伝子の発現を阻害することによって、遺伝子発現または翻訳を阻害する生物学的方法である。

本明細書において使用するＲＮＡｉを介して作用するＲＮＡ分子は、標的とされる遺伝子の発現のそれらのサイレンシングに基づき阻害性と称される。サイレンシング発現は、標的とされる遺伝子の発現が減少されるまたは抑制されるまたは阻害されることを意味する。

本明細書において使用する、ＲＮＡｉを介した遺伝子サイレンシングは、標的とされる遺伝子の発現を阻害するか、抑制するか、遮断するかまたはサイレンシングすると言われている。標的とされる遺伝子は、阻害性ＲＮＡにおける配列に対応するヌクレオチドの配列を含み、そのために阻害性ＲＮＡは、ｍＲＮＡの発現をサイレンシングする。

本明細書において使用する、標的とされる遺伝子を阻害するか、抑制するか、遮断するかまたはサイレンシングするとは、標的とされる遺伝子の翻訳等の発現を変更し、そのために標的とされる遺伝子によってコードされる産物の活性または発現が減少される方法を指す。減少は、完全なノックアウトまたは部分的なノックアウトを含み、そのために、本明細書において提供される免疫刺激性細菌および本明細書における投与に関しては、処置が行われる。

本明細書において使用する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、二本鎖ストランド（ｄｓ）ＲＮＡの小片で、通常約２１ヌクレオチド長であり、各終端において３’オーバーハング（２ヌクレオチド）を伴っており、それを使用し、特異的配列においてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へ結合し、分解を促進することによってタンパク質の翻訳に「干渉する」ことができる。そうすることで、それらに対応するｍＲＮＡのヌクレオチド配列に基づいて、ｓｉＲＮＡは特異的タンパク質の産生を阻止する。プロセスはＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と称され、ｓｉＲＮＡサイレンシングまたはｓｉＲＮＡノックダウンとも称される。

本明細書において使用するショートヘアピン型ＲＮＡまたは低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、人工ＲＮＡ分子であり、タイトなヘアピン型の折り返しを伴っており、それを使用し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を介して標的とする遺伝子の発現をサイレンシングすることができる。細胞におけるｓｈＲＮＡの発現は、典型的には、プラスミドのデリバリーによってまたはウイルス性または細菌性ベクターを介して達成される。

本明細書において使用する腫瘍微小環境（ＴＭＥ）は、腫瘍が存在する細胞環境であり、それとしては、周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、骨髄由来炎症性細胞、リンパ球、シグナル伝達分子および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）がある。存在する条件としては、これらに限定されるものではないが、血管新生の増加、低酸素、低ｐＨ、乳酸濃度の増加、ピルビン酸濃度の増加、間質液圧の増加、および腫瘍の指標である高レベルのアデノシン等の代謝産物または代謝の変化がある。

本明細書において使用するヒトＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）は、免疫系の活性を調節するインターフェロンタンパク質のサブグループである。全てのＩ型ＩＦＮが、ＩＦＮ－α受容体等の特定の細胞表面受容体複合体へ結合する。Ｉ型インターフェロンとしては、とりわけＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－βがある。ＩＦＮ－βタンパク質は、線維芽細胞によって産生され、自然免疫応答に主に関与する抗ウイルス活性を有する。ＩＦＮ－βのうちの２つのタイプは、ＩＦＮ－β１（ＩＦＮＢ１）およびＩＦＮ－β３（ＩＦＮＢ３）である。

本明細書において使用する、核酸またはコードされるＲＮＡが遺伝子を標的とするという記載は、それが遺伝子の発現を、任意の機序によって阻害するか、または抑制するか、またはサイレンシングすることを意味する。概して、そのような核酸は、少なくとも、標的とされる遺伝子に対して相補的な部分を含み、その部分は、相補的な部分と共にハイブリッドを形成するのに十分である。

本明細書において使用する「欠失」は、核酸またはポリペプチド配列に言及する場合、標的ポリヌクレオチドもしくはポリペプチドまたは天然型もしくは野生型配列等の配列と比較した、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失を指す。

本明細書において使用する「挿入」は、核酸またはアミノ酸配列に言及する場合、標的、天然型、野生型または他の関連する配列内に、１つまたは複数の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸を含むことを説明する。したがって、１つまたは複数の挿入を含む核酸分子は、野生型配列と比較して、配列の直鎖長内に１つまたは複数の追加のヌクレオチドを含む。

本明細書において使用する、核酸およびアミノ酸配列への「追加」は、別の配列と比較して、いずれかの末端上へのヌクレオチドまたはアミノ酸の追加を説明する。

本明細書において使用する「置換」または「置換え」は、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸を、分子の長さ（残基の数に記載されるような）を変更することなく、天然型、標的、野生型または他の核酸もしくはポリペプチド配列において、代替のヌクレオチドまたはアミノ酸で置き換えることを指す。したがって、分子における１つまたは複数の置換は、分子のアミノ酸残基またはヌクレオチドの数を変更しない。アミノ酸の置換えは、特定のポリペプチドと比較して、ポリペプチド配列長に沿ったアミノ酸残基の数に関して発現することができる。

本明細書において使用する「対応する位置において」、またはヌクレオチドもしくはアミノ酸位置が、配列リストに示すような開示される配列におけるヌクレオチドもしくはアミノ酸位置に「対応する」という説明は、ギャップアルゴリズム等の標準的なアラインメントアルゴリズムを使用して、同一性が最大になるように、開示される配列を含むアラインメント上で同定されるヌクレオチドまたはアミノ酸位置を指す。配列をアラインメントすることによって、当業者であれば、例えば保存された、同一のアミノ酸残基をガイドとして使用して、相当する残基を同定することができる。一般的に、対応する位置を同定するために、アミノ酸の配列は、最大のマッチ（ｈｉｇｈｅｓｔ ｏｒｄｅｒ ｍａｔｃｈ）が得られるようにアラインメントされる（例えば、Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987； Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991；およびCarrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073を参照のこと）。

本明細書において使用する、配列のアラインメントは、ヌクレオチドまたはアミノ酸の２つ以上の配列をアラインメントするように相同性を使用することを指す。典型的には、５０％以上の同一性で関連性がある２つ以上の配列がアラインメントされる。アラインメントされた１組の配列は、対応する位置においてアラインメントされた２つ以上の配列を指し、ゲノムＤＮＡ配列を用いてアラインメントされたＥＳＴ等のＲＮＡ、および他のｃＤＮＡ由来のアラインメント配列を含むことができる。関連または変異体ポリペプチドまたは核酸分子は、当業者であれば公知の任意の方法によってアラインメントされる場合がある。このような方法は、典型的にはマッチを最大化し、それらとしては、手動アラインメントを使用した、利用可能な多数のアラインメントプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰ）を使用することによる方法、および当業者であれば公知の他のものがある。ポリペプチドまたは核酸の配列をアラインメントすることによって、当業者であれば保存された、同一のアミノ酸残基をガイドとして使用して、類似した部分または位置を同定することができる。更に、当業者であれば、保存されたアミノ酸またはヌクレオチド残基をガイドとして用い、ヒトと非ヒト配列との間の対応するアミノ酸またはヌクレオチド残基を見出することもできる。対応する位置は、例えば、コンピューターシミュレーションされたタンパク質構造のアラインメントを使用することによって、構造アラインメントに基づく場合もある。他の例では、対応する領域を同定することができる。当業者であれば、保存されたアミノ酸残基をガイドとして用い、ヒトと非ヒト配列との間の対応するアミノ酸残基を見出すこともできる。

本明細書において使用する、抗体等のポリペプチドの「特性」は、ポリペプチドによって示される任意の特性を指し、それとしては、これらに限定されないが、結合特異性、構造的立体配置またはコンフォーメーション、タンパク質安定性、タンパク質分解に対する抵抗性、コンフォーメーション的安定性、熱耐性、およびｐＨ条件に対する耐性がある。特性における変化は、ポリペプチドの「活性」を変更することができる。例えば、抗体ポリペプチドの結合特異性における変化は、抗原を結合するための能力、および／または親和性もしくはアビディティ等の様々な結合活性、またはポリペプチドのインビボ活性を変更することができる。

本明細書において使用する、抗体等のポリペプチドの「活性」または「機能活性」は、ポリペプチドによって示される任意の活性を指す。このような活性は経験的に判定することができる。例示的な活性としては、これらに限定されるものではないが、例えば、抗原結合、ＤＮＡ結合、リガンド結合、もしくは二量化を介して生体分子と相互作用するための能力、または酵素活性、例えばキナーゼ活性もしくはタンパク質分解活性がある。抗体（抗体フラグメントを含む）に関しては、活性としては、これらに限定されるものではないが、特定の抗原を特異的に結合するための能力、抗原結合の親和性（例えば、高または低親和性）、抗原結合のアビディティ（例えば、高または低アビディティ）、結合速度（ｏｎ－ｒａｔｅ）、解離速度（ｏｆｆ－ｒａｔｅ）、抗原の中和またはクリアランス、ウイルスの中和を促進するための能力等のエフェクター機能、および病原体の感染または侵入を阻止するための、またはクリアランスを促進するための、または身体内の特定の組織もしくは体液または細胞へ浸透する能力等のインビボ活性がある。活性は、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、表面プラズモン共鳴または結合または解離速度の測定と同等のアッセイ、免疫組織化学および免疫蛍光組織学および顕微鏡の細胞ベースアッセイ、フローサイトメトリー、ならびに結合アッセイ（例えば、パンニングアッセイ）等の認識されるアッセイを使用してインビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）またはインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で評価することができる。

本明細書において使用する、「結合する」、「結合」、または文法上のこれらの変形形態は、任意の引力相互作用における分子の別の分子との関与を指し、２つの分子が互いに極めて接近している安定な会合をもたらす。結合としては、これらに限定されるものではないが、非共有結合、共有結合（可逆的および不可逆的共有結合等）があり、これらに限定されないが、タンパク質、核酸、炭水化物、脂質、および小分子、例えば薬物を含む化学化合物等の分子間相互作用がある。

本明細書において使用する「抗体」は、天然であるにせよ、遺伝子組換えで産生されるような部分的にもしくは全体的に合成的であるにせよ、抗原結合部位を形成し、集合したときに抗原と特異的に結合するのに十分である免疫グロブリン分子の可変重鎖および軽鎖領域のうちの少なくとも一部を含む任意のこれらの断片を含む免疫グロブリンおよび免疫グロブリンフラグメントを指す。したがって、抗体は、免疫グロブリン抗原結合ドメイン（抗体結合部位）と相同または実質的に相同である結合ドメインを有する任意のタンパク質を含む。例えば、抗体は、２つの重鎖（これらはＨおよびＨ’と示すことができる）および２つの軽鎖（これらはＬおよびＬ’と示すことができる）を含む抗体を指し、各重鎖は、完全長免疫グロブリン重鎖または抗原結合部位を形成するのに十分なこれらの一部とすることができ（例えば、重鎖としては、これらに限定されるものではないが、ＶＨ鎖、ＶＨ－ＣＨ１鎖およびＶＨ－ＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３鎖がある）、各軽鎖は、完全長軽鎖または抗原結合部位を形成するのに十分なこれらの一部とすることができる（例えば、軽鎖としては、これらに限定されるものではないが、ＶＬ鎖およびＶＬ－ＣＬ鎖がある）。各重鎖（ＨおよびＨ’）は、１つの軽鎖（それぞれＬおよびＬ’）と対を成す。典型的には、抗体は、可変重（ＶＨ）鎖および／または可変軽（ＶＬ）鎖のうちの全てまたは少なくとも一部を最小限に含む。抗体は、定常領域のうちの全てまたは一部も含むことができる。

本明細書における目的に関しては、抗体という用語は、完全長抗体およびその部分を含み、抗ＥＧＦＲ抗体フラグメント等の抗体フラグメントを含む。抗体フラグメントとしては、これらに限定されるものではないが、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド連結Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄフラグメント、Ｆｄ’フラグメント、一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、一本鎖Ｆａｂｓ（ｓｃＦａｂ）、ダイアボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、または上記のうちのいずれかの抗原結合性断片がある。抗体としては、合成抗体、遺伝子組換え産生抗体、多重特性抗体（例えば二重特異性抗体）、ヒト抗体、非ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および細胞内抗体もある。本明細書において提供される抗体としては、任意の免疫グロブリンクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）のメンバーがある。

本明細書において使用する「核酸」は、少なくとも２つの連結ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を指し、それとしては、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）があり、典型的にはホスホジエステル結合によって一緒に接合している。ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロチオエートＤＮＡ、ならびに他のそのような類似体およびその誘導体または組合せ等の核酸の類似体も「核酸」という用語に含まれる。核酸は、例えば、ヌクレオチド類似体またはホスホジエステル結合以外の「骨格」結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホロアミデート結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合、またはペプチド結合（ペプチド核酸）を含むＤＮＡおよびＲＮＡ誘導体も含む。その用語は、等価物として、ヌクレオチド類似体から作製されるＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかのうちの誘導体、変異体および類似体、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ストランドの核酸も含む。デオキシリボヌクレオチドとしては、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンがある。ＲＮＡに関しては、ウラシル塩基はウリジンである。

本明細書において使用する単離された核酸分子は、核酸分子の天然原料に存在する他の核酸分子から分離されるものである。ｃＤＮＡ分子等の「単離された」核酸分子は、他の細胞材料、もしくは組換え技術によって産生される場合は、培養培地を実質的に含まない場合があるか、または化学的前駆体、もしくは化学的に合成される場合は、他の化学物質を実質的に含まない。本明細書において提供される例示的な単離された核酸分子としては、提供される抗体または抗原結合性断片をコードする単離された核酸分子がある。

本明細書において使用する、核酸配列、領域、エレメントまたはドメインに関連する「操作可能に連結」は、核酸領域が互いに機能的に関連することを意味する。例えば、リーダーペプチドをコードする核酸は、ポリペプチドをコードする核酸に操作可能に連結することができ、そのために核酸は、転写され、翻訳され、機能的融合タンパク質を発現することができ、リーダーペプチドは、融合ポリペプチドの分泌をもたらす。一部の例では、第１のポリペプチド（例えば、リーダーペプチド）をコードする核酸は、第２のポリペプチドコードする核酸に操作可能に連結され、核酸は、単一のｍＲＮＡ転写物として転写されるが、ｍＲＮＡ転写物の翻訳は、２つのポリペプチドのうちの１つが発現される場合がある。例えば、アンバー終止コドンは、部分的なアンバーサプレッサー細胞中に導入されたときに、第１のポリペプチドをコードする核酸と第２のポリペプチドをコードする核酸との間に位置することができ、得られた単一のｍＲＮＡ転写物が翻訳され、第１および第２のいずれかのポリペプチドを含む融合タンパク質を産生することができるか、または翻訳され、第１のポリペプチドのみを産生することができるようになる。別の例では、プロモーターは、ポリペプチドをコードする核酸に操作可能に連結することができ、そのためにプロモーターは、核酸の転写を調節するかまたは介在する。

本明細書において使用する、例えば、合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドと関連する「合成」は、組換え法によっておよび／または化学的合成法によって産生される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。

本明細書において使用する天然発生α－アミノ酸の残基は、自然界で見出されるそれらの２０個のα－アミノ酸の残基であり、これらは、荷電ｔＲＮＡ分子の特異的認識によって、その同族ｍＲＮＡコドンと共にヒトにおいてタンパク質中に組み込まれる。

本明細書において使用する「ポリペプチド」は、共有的に接合された２つ以上のアミノ酸を指す。「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書において区別せずに使用される。

本明細書において使用する「ペプチド」は、２から約４０個または４０個のアミノ酸長であるポリペプチドを指す。

本明細書において使用する「アミノ酸」は、アミノ基およびカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは、２つ以上のアミノ酸を含む。本明細書における目的に関しては、提供される抗体中に含まれるアミノ酸としては、２０種類の天然発生アミノ酸（以下の表を参照のこと）、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体（例えば、α－炭素が側鎖を有するアミノ酸）がある。本明細書において使用する、本明細書において出現するポリペプチドの様々なアミノ酸配列において存在するアミノ酸は、それらの周知の３文字または１文字の略語に従って同定される（以下の表を参照されたい）。様々な核酸分子およびフラグメント中に存在するヌクレオチドは、当技術分野において通常使用される標準的な単一文字表記を用いて表記される。

本明細書において使用する「アミノ酸残基」は、ポリペプチドが、そのペプチド結合において化学的消化（加水分解）を受けると同時に形成されるアミノ酸を指す。本明細書において述べられるアミノ酸残基は、一般的に「Ｌ」異性体形態である。「Ｄ」異性体形態における残基は、ポリペプチドによって所望の機能特性が保持される限りは、任意のＬ－アミノ酸残基と置換することができる。ＮＨ_２は、ポリペプチドのアミノ末端において存在する遊離アミノ基を指す。ＣＯＯＨは、ポリペプチドのカルボキシル末端において存在する遊離カルボキシ基を指す。J. Biol. Chem., 243:3557-59 (1968)に記載され、特許、商標および著作権に関する連邦規則第１．８２１～１．８２２条において採用されている標準的なポリペプチド命名法を順守して、アミノ酸残基に関する略語を以下の表に示す。

本明細書において式によって表されるアミノ酸残基の全ての配列は、アミノ末端からカルボキシル末端への従来の方向において、左から右の向きを有する。「アミノ酸残基」という句は、上記の対応表の改変、非天然および異常アミノ酸において挙げられるアミノ酸を含むことが定義される。アミノ酸残基配列の開始または終端におけるダッシュ記号は、１つまたは複数のアミノ酸残基の更なる配列への、またはＮＨ_２等のアミノ末端基への、またはＣＯＯＨ等のカルボキシル末端基へのペプチド結合を示す。

ペプチドまたはタンパク質において、アミノ酸の好適な保守的置換は、当業者であれば公知であり、一般的に得られる分子の生物学的活性を変化させることなく作製することができる。当業者であれば、一般的には、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に変更しないことを認識している（例えば、Watson et al., Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224を参照のこと）。

このような置換は、以下の表に示す例示的置換に従って行うことができる。

他の置換も許容され、経験的にまたは他の公知の保守的もしくは非保守的置換に従って判定することができる。

本明細書において使用する「天然発生的なアミノ酸」は、ポリペプチド中に存在する２０種類のＬ－アミノ酸を指す。

本明細書において使用する「非天然アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸と同様の構造を有するが、構造的に改変され、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣している有機化合物を指す。したがって、非天然発生的なアミノ酸としては、例えば、２０種類の天然発生的なアミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸類似体があり、これらに限定されるものではないが、アミノ酸のＤ－立体異性体がある。例示的な非天然アミノ酸は、当業者であれば公知であり、それらとしては、これらに限定されるものではないが、２－アミノアジピン酸（Ａａｄ）、３－アミノアジピン酸（ｂＡａｄ）、β－アラニン／β－アミノプロピオン酸（Ｂａｌａ）、２－アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４－アミノ酪酸／ピペリジン酸（４Ａｂｕ）、６－アミノカプロン酸（Ａｃｐ）、２－アミノヘプタン酸（Ａｈｅ）、２－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、３－アミノイソ酪酸（Ｂａｉｂ）、２－アミノピメリン酸（Ａｐｍ）、２，４－ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）、デスモシン（Ｄｅｓ）、２，２’－ジアミノピメリン酸（Ｄｐｍ）、２，３－ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、Ｎ－エチルグリシン（ＥｔＧｌｙ）、Ｎ－エチルアスパラギン（ＥｔＡｓｎ）、ヒドロキシリシン（Ｈｙｌ）、アロヒドロキシリシン（Ａｈｙｌ）、３－ヒドロキシプロリン（３Ｈｙｐ）、４－ヒドロキシプロリン（４Ｈｙｐ）、イソデスモシン（Ｉｄｅ）、アロイソロイシン（Ａｉｌｅ）、Ｎ－メチルグリシン、サルコシン（ＭｅＧｌｙ）、Ｎ－メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）、６－Ｎ－メチルリシン（ＭｅＬｙｓ）、Ｎ－メチルバリン（ＭｅＶａｌ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、およびオルニチン（Ｏｒｎ）がある。

本明細書において使用するＤＮＡコンストラクトは、自然界で見出されることがない様式で連結され、並べられたＤＮＡのセグメントを含む、単鎖または二本鎖、直鎖状または環状ＤＮＡ分子である。ＤＮＡコンストラクトは、ヒト操作の結果として存在し、クローンおよび操作された分子の他のコピーを含む。

本明細書において使用するＤＮＡセグメントは、特定の属性を有する大きなＤＮＡ分子の一部である。例えば、特定のポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントは、プラスミドまたはプラスミド断片等の長いＤＮＡ分子の一部であり、５’から３’方向を読み取るときに、特定のポリペプチドのアミノ酸の配列をコードする。

本明細書において使用するポリヌクレオチドという用語は、５’から３’終端で読み取られるデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の単鎖または二本鎖ストランドのポリマーを意味する。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡおよびＤＮＡを含み、天然原料から単離するか、インビトロで合成するか、または天然および合成分子の組合せから調製することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、ヌクレオチド（略称「ｎｔ」）または塩基対（略称「ｂｐ」）を単位として本明細書において与えられる。ヌクレオチドという用語は、文脈上可能な場合、単鎖および二本鎖ストランドの分子に関して使用される。その用語が二本鎖ストランドの分子へ適用される場合、それは、全体的な長さを示すために使用され、塩基対という用語と等価であることが理解されるであろう。二本鎖ストランドのポリヌクレオチドの２本のストランドは、長さがわずかに異なる場合があり、しかもこれらの終端はずれている場合があり、したがって、二本鎖ストランドのポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対を成すことができない点は、当業者によって認識されているであろう。このような不対終端は、一般的には、２０ヌクレオチド長を超えないであろう。

本明細書において使用する、組換えＤＮＡ法を使用することによる組換え手段による産生は、クローン化ＤＮＡによってコードされるタンパク質を発現するための、分子生物学の周知の方法の使用を意味する。

本明細書において使用する「発現」は、ポリペプチドが、ポリヌクレオチドの転写および翻訳によって産生される方法を指す。ポリペプチドの発現レベルは、当技術分野において公知の任意の方法を使用して評価することができ、例えば、宿主細胞から産生されるポリペプチドの量を判定する方法を含む。このような方法としては、これらに限定されるものではないが、ＥＬＩＳＡ、ゲル電気泳動後のクーマシーブルー染色、ローリータンパク質アッセイおよびブラッドフォードタンパク質アッセイによる細胞溶解物中のポリペプチドの定量があり得る。

本明細書において使用する「宿主細胞」は、ベクターを収容し、維持し、再産生し、および／または増幅するために使用される細胞である。宿主細胞を使用し、ベクターによってコードされるポリペプチドを発現することもできる。ベクター中に含まれる核酸は、宿主細胞が分裂するときに複製され、その結果、核酸が増幅する。

本明細書において使用する「ベクター」は、複製可能な核酸であり、ベクターが適切な宿主細胞へ形質転換されたときに、そこから１つまたは複数の異種タンパク質を発現することができる。ベクターに対する言及は、典型的には、制限消化およびライゲーションによってポリペプチドをコードする核酸またはその断片を導入することができるベクターを含む。ベクターに対する言及は、改変された抗ＥＧＦＲ抗体等のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターも含む。ベクターを使用し、ポリペプチドをコードする核酸を宿主細胞へ導入して、核酸を増幅するかまたは核酸によってコードされるポリペプチドを発現／提示する。ベクターは、典型的には、エピソームのままであるが、遺伝子またはその一部とゲノムの染色体とが一体化されるように設計することができる。酵母人工染色体および哺乳動物人工染色体等の人工染色体であるベクターも検討される。そのような媒体の選択および使用は、当業者であれば周知である。ベクターは、「ウイルスベクター」または「ウイルス性ベクター」も含む。ウイルスベクターは、外因性遺伝子へ操作可能に連結され、外因性遺伝子を細胞へ（媒体またはシャトルとして）転移させる遺伝子操作されたウイルスである。

本明細書において使用する「発現ベクター」は、そのようなＤＮＡフラグメントを発現させることができるプロモーター領域等の、調節配列と操作可能に連結されたＤＮＡを発現することができるベクターを含む。このような追加のセグメントは、プロモーターおよびターミネーター配列を含むことができ、１つまたは複数の複製起点、１つまたは複数の選択マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル等を含んでいてもよい場合がある。発現ベクターは、一般的に、プラスミドまたはウイルス性ＤＮＡ由来であるか、または両方のエレメントを含むことができる。したがって、発現ベクターは、プラスミド、ファージ、組換えウイルス、または適切な宿主細胞へ導入されると、クローン化ＤＮＡの発現をもたらす他のベクター等の、組換えＤＮＡまたはＲＮＡコンストラクトを指す。適切な発現ベクターは、当業者であれば周知であり、真核細胞および／または原核細胞において複製可能なもの、およびエピソームのままであるもの、または宿主細胞ゲノムへ一体化されるものを含む。

本明細書において使用する「一次配列」は、ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の配列または核酸分子におけるヌクレオチドの配列を指す。

本明細書において使用する「配列同一性」は、被験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間で比較した、同一のまたは類似のアミノ酸またはヌクレオチド塩基の数を指す。核酸またはタンパク質配列を配列アラインメントし、類似しているまたは同一の領域を同定することによって、配列同一性を判定することができる。本明細書における目的に関しては、配列同一性は、アラインメントすることによって一般的に判定され、同一の残基が同定される。アラインメントは、ローカルであっても、グローバルであってもよい。マッチ、ミスマッチおよびギャップは、比較される配列間で同定することができる。ギャップは、アラインメントされる配列の残基間に挿入され、同一のまたは類似の特徴がアラインメントされるようになる、ヌルの（ｎｕｌｌ）アミノ酸またはヌクレオチドである。概して、これらは、内部および末端ギャップとすることができる。ギャップペナルティを使用する場合、配列同一性は、終端ギャップに関してはペナルティなしを用いて判定することができる（例えば、末端ギャップは、ペナルティは加えられない）。あるいは、配列同一性は、同一の位置の数／アラインメントされた全配列の長さ×１００として、ギャップを考慮せずに判定することができる。

本明細書において使用する「グローバルアラインメント」は、開始から終端まで２つの配列をアラインメントするアラインメントであり、各配列における各文字を１回のみアラインメントする。アラインメントは、配列間に類似性または同一性があるかどうかにかかわらず産生される。例えば、「グローバルアラインメント」に基づいた５０％配列同一性は、それぞれ１００ヌクレオチド長の２つの比較される配列の全配列のアラインメントにおいて、残基の５０％が同じであることを意味する。グローバルアラインメントは、アラインメントされる配列の長さが同じではない場合でさえ、配列同一性の判定において使用することもできることは理解される。配列の末端終端における差は、「末端ギャップに関してペナルティがない」が選択されない限り、配列同一性の判定において考慮されるであろう。概して、グローバルアラインメントは、それらの長さの大部分にわたって顕著な類似性を共有する配列上で使用される。グローバルアラインメントを行うための例示的なアルゴリズムとしては、ニードルマン－ウンシュアルゴリズムがある（Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48: 443）。グローバルアラインメントを行うための例示的なプログラムは公的に利用可能であり、全米バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）ウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）において利用可能なグローバル配列アラインメントツール、およびｄｅｅｐｃ２．ｐｓｉ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ａａｔ／ａｌｉｇｎ／ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌにおいて利用可能なプログラムを含む。

本明細書において使用する「ローカルアラインメント」は、２つの配列をアラインメントするが、類似性または同一性を共有する配列の一部のみをアラインメントするアラインメントである。したがって、ローカルアラインメントは、１つの配列のサブセグメントが別の配列に存在するかを決定する。類似性が無い場合、アラインメントは戻らないことになる。ローカルアラインメントアルゴリズムとしては、ＢＬＡＳＴまたはスミス－ウォーターマンアルゴリズムがある（Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)）。例えば、「ローカルアラインメント」に基づく５０％配列同一性は、任意の長さの２つの比較される配列の全配列のアラインメントにおいて、１００ヌクレオチド長の類似性または同一性の領域が、類似性または同一性の領域において同じである残基の５０％を有することを意味する。

本明細書における目的に関しては、配列同一性は、各供給元によって確立されたデフォルトギャップペナルティを用いて使用される標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムによって判定することができる。ギャッププログラムに関するデフォルトパラメーターは、（１）Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)に記載されるようなGribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745の単項比較（ｕｎａｒｙ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）マトリックス（同一性に関する１および非同一性に関する０の値を含む）および重みづけ比較マトリックス；（２）各ギャップに関するペナルティ３．０および各ギャップにおける各記号に関する追加の０．１０ペナルティ；および（３）末端ギャップに関するペナルティなしを含むことができる。少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％「同一」、または百分率の同一性を記載する他の類似の変形である、ヌクレオチド配列を、任意の２つの核酸分子が有するか、またはアミノ酸配列を、任意の２つのポリペプチドが有するかどうかを、ローカルまたはグローバルアラインメントに基づく公知のコンピューターアルゴリズムを使用して判定することができる（例えば、多くの公知の公的に利用可能なアラインメントデータベースおよびプログラムへのリンクを提供するｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＿ｓｏｆｔｗａｒｅを参照のこと）。概して、本明細書における目的に関しては、配列同一性は、ＮＣＢＩ／ＢＬＡＳＴ（ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＣＭＤ＝Ｗｅｂ＆Ｐａｇｅ＿ＴＹＰＥ＝ＢｌａｓｔＨｏｍｅ）から入手可能なニードルマン－ウンシュグローバル配列アラインメントツール；ＬＡｌｉｇｎ（ＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅｒアルゴリズムを実施するＷｉｌｌｉａｍ Ｐｅａｒｓｏｎ（Adv. Appl. Math. (1991) 12:337-357)））；およびｄｅｅｐｃ２．ｐｓｉ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ａａｔ／ａｌｉｇｎ／ａｌｉｇｎ．ｈｔｍｌにおいて利用可能なＸｉａｏｑｕｉ Ｈｕａｎｇからのプログラム等のグローバルアラインメントに基づいたコンピューターアルゴリズムを使用して判定される。典型的には、それぞれ比較されるポリペプチドまたはヌクレオチドの完全長配列は、グローバルアラインメントにおける各配列の完全長にわたってアラインメントされる。ローカルアラインメントは、比較される配列が実質的に同じ長さである場合に使用することもできる。

したがって、本明細書において使用する、「同一性」という用語は、被験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較またはアラインメントを表す。非限定的な一例では、「に対して少なくとも９０％同一」は、参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して９０から１００％の百分率同一性を指す。９０％以上のレベルにおける同一性は、例示目的のために１００アミノ酸またはヌクレオチドの被験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの長さが比較されると仮定し、被験ポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおいてアミノ酸またはヌクレオチドの１０％（すなわち、１００のうち１０個）以下が参照ポリペプチドのものとは異なるという事実の指標である。同様の比較を被験および参照ポリヌクレオチド間で行うことができる。このような差異は、アミノ酸配列の全長にわたって無作為に分布する点突然変異として表すことができるか、またはこれらは、最大の許容可能な、例えば、１０／１００アミノ酸相違（約９０％同一性）までの様々な長さの１つまたは複数の位置においてクラスター化することができる。相違は、アミノ酸残基の欠失または切断に起因する場合もある。相違は、核酸またはアミノ酸置換、挿入または欠失として定義される。比較される配列の長さに応じて、約８５～９０％を超える相同性または同一性のレベルにおいて、結果はプログラムおよびギャップパラメーターセットとは無関係な場合があり；そのような高レベルの同一性は、容易に評価することができ、ソフトウェアを頼らないことが多い。

本明細書において使用する、「疾患または障害」は、原因または状態に起因する有機体における病理学的状態を指し、それらとしては、これらに限定されないが、感染、後天的状態、遺伝的状態を含み、同定可能な症状によって特徴付けられる。

本明細書において使用する、疾患または状態を呈する対象を「処置する」は、対象の症状が部分的にまたは全体的に軽減されるか、または依然として処置後の変化がないままを意味する。

本明細書において使用する処置は、疾患または障害の症状を回復させる任意の効果を指す。処置は、予防、治療法および／または治癒を包含する。処置は、任意の免疫刺激性細菌または本明細書において提供される組成物の任意の薬学的使用も包含する。

本明細書において使用する予防は、潜在的な疾患の阻止および／または症状の悪化もしくは疾患の進行の阻止を指す。

本明細書において使用する、「阻止」または予防、およびこれらの文法上等価の形態は、疾患または状態を発症するリスクまたは可能性を減少させる方法を指す。

本明細書において使用する「薬学的に有効な薬剤」は、任意の治療剤または生物活性薬剤を含み、それとしては、これらに限定されないが、例えば、麻酔剤、血管収縮剤、分散化剤、ならびに小分子薬物および治療用タンパク質を含む従来の治療薬剤を含む。

本明細書において使用する「治療効果」は、対象の処置に起因する効果であって、疾患もしくは状態の症状を変更するか、典型的には改善するかもしくは回復させるか、または疾患もしくは状態を治癒する効果を意味する。

本明細書において使用する、「治療有効量」または「治療有効用量」は、対象に投与した後に治療効果を生成するのに少なくとも十分である、薬剤、化合物、材料、または化合物を含む組成物の量を指す。したがって、それは、疾患または障害の症状を阻止、治癒、回復、停止または部分的に停止するために必要な量である。

本明細書において使用する、「治療有効性」は、薬剤、化合物、材料、または化合物を含む組成物が投与されている対象において治療効果を生成する、薬剤、化合物、材料、または化合物を含む組成物の能力を指す。

本明細書において使用する、「予防有効量」または「予防有効用量」は、対象に投与したときに、意図される予防効果、例えば、疾患または症状の発病または再発の阻止または遅延、疾患または症状の発病または再発の可能性の低下、またはウイルス感染の発生の低下を有するであろう、薬剤、化合物、材料、または化合物を含む組成物の量を指す。最大予防効果は、１回の用量を投与することによって必ずしも生じることはなく、一連の用量を投与した後にのみ生じる場合がある。したがって、予防有効量は、１回または複数回投与で投与される場合がある。

本明細書において使用する、医薬組成物または他の治療剤の投与による等、処置による特定の疾患または障害の症状の改善は、永続的または一時的、長期的または一過性であろうとなかろうと、組成物または治療剤の投与に起因するか、または投与と関連する場合がある症状の任意の減少を指す。

本明細書において使用する「抗がん剤」は、悪性細胞および組織に対して破壊的または毒性である任意の薬剤を指す。例えば、抗がん剤は、がん細胞を殺傷するか、または特に腫瘍もしくはがん細胞の成長を阻害するかもしくは損なわせる薬剤を含む。例示的な抗がん剤は化学療法剤である。

本明細書において使用する「治療活性」は、治療用ポリペプチドのインビボ活性を指す。概して、治療活性は、疾患または状態の処置と関連する活性である。

本明細書において使用する「対象」という用語は、ヒト等の哺乳動物を含む動物を指す。

本明細書において使用する患者は、ヒト対象を指す。

本明細書において使用する動物としては、これらに限定されないが、ヒト、ゴリラおよびサルを含む霊長目；マウスおよびラット等の齧歯動物；ニワトリ等の家禽；ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジ等の反芻動物；ブタおよび他の動物等の任意の動物がある。非ヒト動物は、検討される動物としてヒトを除外する。本明細書において提供されるポリペプチドは、任意の原料、動物、植物、原核生物および真菌からのものである。大部分のポリペプチドは、哺乳動物起源を含む動物起源のものである。

本明細書において使用する「組成物」は、任意の混合物を指す。それは、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性またはこれらの任意の組合せとすることができる。

本明細書において使用する「組合せ」は、２つ以上のアイテムの間のまたはそれらのうちの任意の関連性を指す。組合せは、２つの組成物または２つの回収物等の２つ以上の個別のアイテム、２つ以上のアイテムの単一の混合物等のこれらの混合物、またはこれらの任意の変形物とすることができる。組合せのエレメントは、全般的に、機能的に関連または関係する。

本明細書において使用する組合せ療法は、２つ以上の異なる治療物質を投与することを指す。異なる治療薬剤を、個別に、連続的に、間欠的に提供し、投与することができるか、または単一の組成物で提供することができる。

本明細書において使用するキットは、これらに限定されないが、生物学的活性または特性の活性化、投与、診断、および評価を含む目的のために包装された組合せであり、追加の試薬、および組合せまたはこれらのエレメントを使用するための取扱説明書等の他のエレメントを含んでいてもよい。

本明細書において使用する「単位用量形態」は、ヒトおよび動物対象に好適な物理的に個別の単位を指し、当技術分野において公知であるように個々に包装される。

本明細書において使用する「単回投薬量製剤」は、直接投与するための製剤を指す。

本明細書において使用する複数回用量製剤は、複数回用量の治療薬剤を含む製剤を指し、直接投与し、いくつかの単回用量の治療薬剤を提供することができる。用量は、分、時間、週、日または月単位にわたって投与することができる。複数回用量製剤は、用量調整、用量プールおよび／または用量分割を可能にすることができる。複数回用量製剤は、経時的に使用されるため、これらは、微生物の成長を阻止するために１つまたは複数の保存剤を一般的に含む。

本明細書において使用する「製造品」は、製造され、販売される製品である。本出願を通して使用されるこの用語は、包装品中に含まれる本明細書において提供される組成物いずれも包含することを意図する。

本明細書において使用する「流体」は、流動することができる任意の組成物を指す。したがって、流体は、半固形、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよび他のそのような組成物の形態である組成物を包含する。

本明細書において使用する、単離されたもしくは精製されたポリペプチドもしくはタンパク質（例えば、単離された抗体またはその抗原結合性断片）、またはこれらの生物学的活性部分（例えば、単離された抗原結合性断片）は、細胞材料またはタンパク質に由来する細胞もしくは組織からの他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成された場合は、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。調製物は、その純度を評価するために当業者によって使用される薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動および高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）等の標準的な分析方法によって判定されるような容易に検出可能な不純物を含まないと思われる場合は、実質的に含まないこと、または更に精製すると、物質の酵素および生物学的活性等の物理的および化学的特性が変化したことが検出されないよう十分に純粋であることを判定することができる。化合物を精製し、実質的に化学的に純粋な化合物を生成するための方法は、当業者であれば公知である。しかし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物とすることができる。そのような場合では、更に精製すると、化合物の比活性が増加する場合がある。本明細書において使用する、「細胞抽出物」または「溶解物」は、溶解されたかまたは破壊された細胞から作製される調製物またはフラクションを指す。

本明細書において使用する「対照」は、被験試料と実質的に同一である試料を指し、ただし、それは被験パラメーターを用いて処置されないか、またはそれが血漿試料である場合、目的の状態に罹患していない健常ボランティアからとすることができる。対照は内部対照とすることもできる。

本明細書において使用する、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数形の指示対象を含む。したがって、例えば、「ａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ」を含むポリペプチドに対する言及は、免疫グロブリンドメイン（ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｄｏｍａｉｎ）のうちの１つまたは複数のポリペプチドを含む。

本明細書において使用する「または」という用語は、代替物のみを指すことが明確に示されないかまたは代替が相互排他的ではない限り、「および／または」を意味するために使用される。

本明細書において使用する範囲および量は、「約」特定の値または範囲として表すことができる。約は、正確な量も含む。したがって「約５つのアミノ酸」は、「約５つのアミノ酸」、また「５つのアミノ酸」を意味する。

本明細書において使用する、「任意選択の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」または「してもよい（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、その後に記載される事象または状況が起こるかまたは起こらないこと、および説明が前記事象または状況が起こる場合および起こらない場合を含むことを意味する。例えば、変異体であってもよい部分は、一部が変異体または非変異体であることを意味する。

本明細書において使用する、任意の保護基、アミノ酸および他の化合物に関する略語は、特に指示がない限り、それらの一般的な使用、認識される略語、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ ｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅに従う（Biochem. (1972) 11 (9) : 1726 - 1732を参照のこと）。

開示を明確にするためにかつ限定の目的ではなく、詳細な説明を以下に続くサブセクションへ分ける。

Ｂ．免疫刺激性細菌の概説
本明細書において免疫刺激性細菌と称され、腫瘍において蓄積しおよび／または複製し、処置される対象においてＲＮＡが発現すると同時に、その阻害、抑制またはサイレンシングが腫瘍療法をもたらす遺伝子を標的とする設計ｓｈＲＮＡおよび設計マイクロＲＮＡ等の阻害性ＲＮＡをコードする改変細菌が提供される。改変のための細菌の菌株は、治療的使用にいずれも好適である。本明細書において提供される改変された免疫刺激性細菌は、がんを処置するための使用のためのものおよび方法のためのものである。細菌は、そのような使用および方法のために改変される。

本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、それらの炎症応答を弱毒化するように細菌性遺伝子を欠失または改変することによって改変され、かつ細菌を用いて処置された宿主における抗腫瘍免疫応答を強化するように改変される。例えば、宿主内でチェックポイント遺伝子を阻害するＲＮＡｉをコードするプラスミドは、細菌に含まれ、細菌はアデノシン栄養要求性とすることができる。細菌に対する炎症応答の弱毒化は、ＴＮＦ－アルファを宿主内で減少させ、および／またはフラジェリン遺伝子をノックアウトするｍｓｂＢ遺伝子を欠失させることによってもたらすことができる。細菌は、例えば、宿主免疫チェックポイントを標的とするＲＮＡｉをコードするプラスミドを追加することによって、かつＣｐＧを有する核酸を追加することによって宿主抗腫瘍活性を刺激するように改変される。

細菌菌株は、弱毒化菌株、または標準的な方法によって弱毒化された、または本明細書において提供される改変によって、定着するためのそれらの能力が、免疫特権組織および器官、特に免疫および固形腫瘍を含む腫瘍細胞に主に制限されるという点で弱毒化された菌株とすることができる。細菌としては、これらに限定されるものではないが、例えば、サルモネラ属、シゲラ属、リステリア属、Ｅ．コリ、およびビフィドバクテリウム属の菌株がある。例えば、菌種としては、シゲラ・ソンネイ、シゲラ・フレクスネリ、シゲラ・ディセンテリアエ、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・ガリナルム、およびサルモネラ・エンテリティディスがある。他の好適な細菌菌種としては、リケッチア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、アエロモナス属、フランシセラ属、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、ビブリオ属、バチルス属、およびエリジペロスリックス属がある。例えば、リケッチア・リケッチアエ、リケッチア・プロワゼキイ、リケッチア・ツツガムシ、リケッチア・モーセリ、リケッチア・シビリカ、ボルデテラ・ブロンキセプティカ、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノロエアエ、アエロモナス・オイクレノフィラ、アエロモナス・サルモニシダ、フランシセラ・ツラレンシス、コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス、シトロバクター・フレウンディイ、クラミジア・ニューモニアエ、ヘモフィルス・ソムヌス、ブルセラ・アボルツス、マイコバクテリウム・イントラセルラレ、レジオネラ・ニューモフィラ、ロドコッカス・エクイ、シュードモナス・アエルギノサ、ヘリコバクター・ムステラエ、ビブリオ・コレラエ、バチルス・スブティリス、エリジペロスリックス・ルシオパチアエ、エルシニア・エンテロコリティカ、ロシャリメア・クインタナ、およびアグロバクテリウム・ツメルファシウムがある。

細菌は、免疫特権組織もしくは器官もしくは環境、栄養素もしくは栄養要求性である他の分子を提供する環境、および／または細菌の侵入および複製のための環境を提供する複製細胞を含む環境への拡散、遊走および走化性を含む１つまたは複数の特性に基づき蓄積する。本明細書において提供されるそのような治療法をもたらす免疫刺激性細菌および菌種としては、サルモネラ属、リステリア属、およびＥ．コリの菌種がある。細菌は、その発現が、標的とする遺伝子の発現を阻害するかまたは遮断する、１つまたは複数のショートヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡコンストラクト（複数可）、または他のＲＮＡｉモダリティをコードするプラスミドを含む。ｓｈＲＮＡコンストラクトは、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）ＩＩまたはＩＩＩプロモーター等の真核生物プロモーターの制御下で発現される。典型的には、ＲＮＡＰ ＩＩＩ（ＰＯＬＩＩＩとも称される）プロモーターは構成的であり、ＲＮＡＰ ＩＩ（ＰＯＬＩＩとも称される）は調節される場合がある。一部の例では、ｓｈＲＮＡは遺伝子ＴＲＥＸ１を標的とし、その発現を阻害する。一部の実施形態では、プラスミドは、ＰＤ－Ｌ１、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＲＰα、ＣＴＮＮＢ１、ＴＧＦ－ベータ、および／またはＶＥＧＦおよび当業者であれば公知のその他のものを阻害するためのｓｈＲＮＡ等の、２つ以上のチェックポイント遺伝子を阻害するｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ等の複数のＲＮＡｉ分子をコードする。複数のｓｈＲＮＡがコードされる場合、各発現は、異なるプロモーターの制御下にある。

本明細書において提供される細菌の中の１つは、それらがアデノシン栄養要求性であるように改変された細菌である。これは、プリン合成、代謝、または輸送に関与する遺伝子の改変または欠失によって達成することができる。例えば、サルモネラ・ティフィ等のサルモネラ属菌種におけるｔｓｘ遺伝子を破壊すると、アデノシン栄養要求性が得られる。アデノシンは免疫抑制性であり、腫瘍において高濃度に蓄積し；細菌が、アデノシンが豊富である組織において選択的に複製するため、アデノシン栄養要求性は、細菌の抗腫瘍活性を改善する。

それらが欠陥ａｓｄ遺伝子を有するように改変された細菌も提供される。インビボで使用するためのこれらの細菌は、導入されるプラスミド上に機能的なａｓｄ遺伝子の保有を含むように改変され；これは、抗生物質ベースのプラスミドを維持／選択する系は必要とされないようにプラスミドに関する選択を維持する。プラスミド上に機能的なａｓｄ遺伝子を含まず、したがって宿主内で自己溶解するように遺伝子操作されるａｓｄ欠陥菌株の使用も提供される。

それらが鞭毛を産生できないように改変された細菌も提供される。これは、フラジェリンサブユニットをコードする遺伝子の欠失を用いて細菌を改変することによって達成することができる。フラジェリンが無い改変細菌は、炎症性が低く、したがって優れた耐容性を示し、より強力な抗腫瘍応答を誘導する。

食細胞細胞におけるプラスミドデリバリーを改善するリステリオリジンＯを生成するように改変された細菌も提供される。

低コピーのＣｐＧ含有プラスミドを保有するように改変された細菌も提供される。プラスミドは、他の改変およびＲＮＡｉを更に含むことができる。

細菌がサルモネラ属菌種である場合に、毒性ＳＰＩ－１（サルモネラ属病原性アイランド－１）遺伝子の発現が少なくなるような様式で成長するように、細菌を改変することもできる。サルモネラ属では、ビルレンス、侵入、生存、および腸外拡散の原因となる遺伝子は、サルモネラ属病原性アイランド（ＳＰＩ）に位置する。

細菌は、ＰＤ－Ｌ１もしくはＴＲＥＸ１のみ、またはＴＲＥＸ１および第２の免疫チェックポイントのうちの１つまたは複数等のチェックポイントを阻害する、ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ等のＲＮＡｉをコードするプラスミドを含む。細菌は、プラスミドを維持する選択、特に抗生物質なしで菌株を調製するための選択を含む、他の望ましい特徴のために更に改変することができる。免疫刺激性細菌は、抗腫瘍治療用ポリペプチドおよび薬剤を含む治療用ポリペプチドをコードしてもよい場合がある。

本明細書において提供される免疫刺激性細菌の例示的なものは、サルモネラ属の菌種である。本明細書において記載するような改変のための細菌の例示的なものは、菌株ＹＳ１６４６（ＡＴＣＣカタログ＃２０２１６５；国際公開第９９／１３０５３号も参照のこと、ＶＮＰ２０００９とも称される）等の、サルモネラ・ティフィムリウムの遺伝子操作された菌株であり、これはａｓｄ遺伝子ノックアウトおよび抗生物質不使用プラスミド維持を相補するように遺伝子操作されたプラスミドである。

アデノシン栄養要求性が付与された改変免疫刺激性細菌菌株が、ヒト等の対象に投与するために製剤化され、腫瘍およびがんを処置する方法において使用するためのそのような菌株を含む医薬組成物として、本明細書において提供される。

本明細書において提供される遺伝子操作された免疫刺激性細菌は、冷たい腫瘍の免疫再活性化を誘導するように、かつ腫瘍抗原特異的免疫応答を促進するように複数の相乗的モダリティを含み、同時に腫瘍が恒久的な抗腫瘍免疫を破壊し、回避するために利用する免疫チェックポイント経路を阻害する。アデノシン栄養要求性を介して改善された腫瘍標的化、および強化された血管破壊によって、潜在力が改善され、同時に炎症が局在化され、他の免疫療法モダリティを用いて観察された全身性サイトカイン曝露および自己免疫毒性が制限される。そのように改変された細菌の例示的なものは、Ｓ．ティフィムリウム菌株であり、菌株ＹＳ１６４６、特にａｓｄ－菌株のそのような改変を含む。

例えば、ＰＤ－Ｌ１のｓｈＲＮＡ介在性遺伝子遮断を提供する免疫刺激性細菌が本明細書において提供される。ＰＤ－Ｌ１を遺伝子遮断すると、腫瘍定着を改善できることがマウスにおいて示されている。例えば、ＰＤ－Ｌ１ノックアウトマウスにおけるＳ．ティフィムリウム感染は、野生型マウスよりも１０倍高い細菌負荷につながることが示されている（Lee et al. (2010) Immunol. 185:2442-2449を参照のこと）。したがって、ＰＤ－Ｌ１は、Ｓ．ティフィムリウム感染に対して防御性である。ＴＲＥＸ１、ＰＤ－Ｌ１の、またはＰＤ－Ｌ１およびＴＲＥＸ１のＲＮＡｉ介在性遺伝子をノックダウンする能力があるプラスミドを保有するＳ．ティフィムリウム等の免疫刺激性細菌が本明細書において提供される。このような細菌は、単一の治療法において強化されかつ持続的な抗腫瘍免疫応答をもたらす２つの独立した経路の組合せに起因する抗腫瘍効果を提供する。

Ｃ．がん免疫療法
腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内で認められる免疫抑制性環境は、腫瘍を発症し、進行させるドライバーである。がんは、免疫系が腫瘍の制御および封じ込めを失敗した後に出現する。複数の腫瘍特異的な機序が腫瘍環境を作り出し、免疫系は、それらを除去する代わりに腫瘍およびそれらの細胞の許容を示さざるを得ない。がん免疫療法の目標は、腫瘍を削除する免疫系の自然の能力を助けることである。微生物感染と関連する急性の炎症は、何世紀にもわたる観察に基づいた腫瘍の自然消失に関連している。

１．免疫療法
いくつかの臨床的ながん免疫療法は、抗腫瘍免疫に対する免疫抑制のバランスを混乱させることが求められている。ＩＬ－２およびＩＦＮ－α等のサイトカインを直接投与することを介して免疫を刺激するための戦略では、少数の患者において中程度の臨床応答が認められ、同時に重篤な全身性炎症関連毒性が誘導されてきた（Sharma et al. (2011) Nat Rev Cancer 11:805-812）。免疫系は、Ｔ細胞上のプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）の上方調節、および抗原提示細胞（ＡＰＣ）上と腫瘍細胞上の両方で発現されるその同族リガンドであるプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）に対するその結合等の自己免疫を制限するためにいくつかのチェックおよびバランスを進化させてきた。ＰＤ－Ｌ１がＰＤ－１へ結合すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞シグナル伝達経路に干渉し、ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能を損なわせ、Ｔ細胞寛容を誘導する。ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１は、多数の阻害性「免疫チェックポイント」のうちの２つの例であり、これらは免疫応答を下方調節することによって機能する。他の阻害性免疫チェックポイントとしては、細胞毒性Ｔ－リンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ－４）、シグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）、Ｔ細胞活性化のＶ－ドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、プログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）１および２、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、ガレクチン－９、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有３（ＴＩＭ－３、Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２（ＨＡＶＣＲ２）としても公知である）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６としても公知である）、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＣＤ１５５、ＣＤ１６０、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、Ｂ－およびＴ－リンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ、またはＣＤ２７２）およびがん胎児性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１、またはＣＤ６６ａ）がある。

抗ＰＤ－１（例えば、ペンブロリズマブ、ニボルマブ）および抗ＰＤ－Ｌ１（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ）等の免疫チェックポイントをブロックするように設計された抗体は、Ｔ細胞アネルギーを阻止し、免疫寛容を破壊することを恒久的に成功した。処置された患者のうちのほんの一部、および自己免疫関連毒性を示すことが多いもののみで、臨床的利点が実証されている（例えば、Ribas (2015) N Engl J Med 373:1490-1492；Topalian et al. (2012) N Engl J Med 366:3443-3447を参照のこと）。これは、より効果的でありかつ毒性が少ない本明細書において提供される治療法の必要性に関する更なるエビデンスである。

別のチェックポイントブロック戦略は、ＣＤ８０またはＣＤ８６等のＡＰＣ上の共刺激受容体へ結合し、それを阻害し、同じ受容体に結合するが親和性がより低い共刺激クラスター分化２８（ＣＤ２８）に勝つ（ｏｕｔ－ｃｏｍｐｅｔｉｎｇ）、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ－４の誘導を阻害する。これは、ＣＤ２８からの刺激性シグナルをブロックし、同時にＣＴＬＡ－４からの阻害性シグナルを伝達し、Ｔ細胞活性化を阻止する（Phan et al.(2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100:8372-8377を参照のこと）。抗ＣＴＬＡ－４療法（例えば、イピリムマブ）は、一部の患者では臨床的成功および耐久性を示し、一方で更に高い重度の免疫関連有害事象の発生を示している（例えば、Hodi et al. (2010) N Engl J Med 363:711-723；Schadendorf et al. (2015) J. Clin. Oncol. 33:1889-1894を参照のこと）。腫瘍は、抗免疫チェックポイント抗体に対する抵抗性を発展させていることも示されており、より恒久的な抗がん療法の必要性が強調され、本明細書において提供される。

２．養子免疫療法
冷たい腫瘍を再活性化し、より免疫原性になるようにするための試みにおいては、養子細胞療法（ＡＣＴ）として公知であるある種の免疫療法は、免疫細胞を利用し、抗腫瘍活性を有するようにそれらを再プログラムする様々な戦略を包含する（Hinrichs et al. (2011) Immunol. Rev. 240:40-51）。樹状細胞ベースの治療法は、更なる免疫刺激特性を有する遺伝子操作された樹状細胞（ＤＣ）を導入する。これらの治療法は、がんに対する免疫寛容を破壊することができないために成功していない（例えば、Rosenberg et al. (2004) Nat. Med. 12:1279を参照のこと）。ＤＣリクルートメントを刺激するために、内因性腫瘍抗原および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）を含む全体が照射された腫瘍細胞を使用する、ＧＶＡＸとして公知の方法は、腫瘍寛容を破壊するための能力が無いために同様に臨床においてできない（Copier et al. (2010) Curr. Opin. Mol. Ther. 12:647-653）。個別の自家細胞ベース療法であるシプロイセル－Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ）は、去勢抵抗性前立腺がんに対して２０１０年にＦＤＡ承認された。それは、患者から採取されたＡＰＣを利用し、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）抗原を発現するように再武装し、Ｔ細胞応答を刺激し、次いでリンパ切除後に再導入される。残念ながら、その広範な採用は、観察される客観的奏効率が低く、かつコストが高いことによって制限されており、その使用は、前立腺がんの初期段階のみに限定される（Anassi et al. (2011) P T. 36(4):197-202）。同様に、自家Ｔ細胞療法（ＡＴＣ）は、患者自身のＴ細胞を採取し、それらをエクスビボで再活性化し、腫瘍寛容を克服し、次いでそれらをリンパ切除後に患者へ再導入する。ＡＴＣの臨床的成功は限定され、黒色腫においてのみであり、同時に重大な安全性および実行可能性の問題が生じ、これらがその有用性を限定する（Yee et al. (2013) Clin. Cancer Res. 19:1-3）。

キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法は、Ｔ細胞受容体と抗体Ｉｇ可変細胞外ドメインとの間に融合タンパク質を発現するように遺伝子再操作されている、患者から採取されたＴ細胞である。これは、活性Ｔ細胞の細胞溶解性特性と共に抗体の抗原認識特性を与える（Sadelain (2015) Clin. Invest. 125:3392-400）。成功は、致死的な免疫関連有害事象という代償を払って、Ｂ細胞および造血悪性腫瘍に限定されている（Jackson et al. (2016) Nat. Rev. Clin. Oncol. 13:370-383）。腫瘍は、突然変異し、ＣＤ１９（Ruella et al., (2016) Comput Struct Biotechnol J. 14: 357-362）およびＥＧＦＲｖＩＩＩ（O'Rourke et al. (2017) Sci Transl Med. Jul 19; 9:399）を含む標的抗原による認識を避け、その結果、免疫からの逃避を促進する場合もある。更に、ＣＡＲ－Ｔ治療法は承認されており、血液悪性腫瘍の背景において承認されており、固形腫瘍を処置するための実行可能性に関する重大なハードルに面し：固形腫瘍微小環境の高度な免疫抑制性特質を克服している。現存するＣＡＲ－Ｔ治療法に対していくつかの追加の改変が必須となり、固形腫瘍に対する実行可能性を潜在的に提供するであろう（Kakarla、et al. (2014) Cancer J. Mar-Apr; 20(2): 151-155）。ＣＡＲ－Ｔの安全性が顕著に改善され、それらの有効性が固形腫瘍へ拡大された場合、これらの大きな労働力を要する治療法と関連する実行可能性およびコストが、それらの幅広い採用を制限し続けることになる。

３．がんワクチンおよび腫瘍崩壊性ウイルス
冷たい腫瘍は、Ｔ細胞および樹状細胞（ＤＣ）の浸潤が無く、Ｔ細胞非炎症性である（Sharma et al. (2017) Cell 9; 168(4):707-723）。冷たい腫瘍を再活性化し、より免疫原性にするための試みにおいては、別の種類の免疫療法で、腫瘍において自然にまたは工学に基づき蓄積することができる微生物が利用される。これらは、免疫系を刺激し、腫瘍抗原を発現し、その結果、免疫系を活性化および再プログラミングし、腫瘍を拒絶するように設計されたウイルスを含む。ウイルスベースのがんワクチンは、ウイルス性ベクター自体に対する既存のまたは後天的な免疫、ならびに腫瘍抗原を提示するのに十分な免疫原性の欠如を含むいくつかの因子のために臨床的に大きく失敗している（Larocca et al. (2011) Cancer J. 17(5):359-371）。ＡＰＣの適正なアジュバント活性化が無いことも、ＤＮＡワクチン等の他の非ウイルス性ベクターがんワクチンの妨げになる。対照的に、腫瘍崩壊性ウイルスは、健常組織よりも分裂腫瘍細胞において優先的に複製しようとし、するとその後の腫瘍細胞溶解が、免疫原性の腫瘍細胞死および更なるウイルス性播種をもたらす。腫瘍崩壊性ウイルスのタリモジェンラヘルパレプベク（Ｔ－ＶＥＣ）は、改変単純ヘルペスウイルスをＤＣリクルーティングサイトカインＧＭ－ＣＳＦと組み合わせて使用しており、転移性の黒色腫に関してＦＤＡ承認されている（Bastin et al. (2016) Biomedicines 4(3):21）。一部の黒色腫患者における臨床的利点と、他の免疫療法よりも免疫毒性が少ないことが実証されたが、腫瘍内投与経路および製造条件が制限され、ならびに遠位腫瘍有効性および他の腫瘍タイプに対する幅広い適用が欠如している。とりわけ、パラミクソウイルス、レオウイルスおよびピコナウイルスを利用したもの等の他の腫瘍崩壊性ウイルス（ＯＶ）ベースのワクチンでは、全身性抗腫瘍免疫の誘導において類似の制限が認められる（Chiocca et al. (2014) Cancer Immunol. Res. 2(4):295-300）。腫瘍崩壊性ウイルスの全身投与は、ユニークな課題を示す。ＩＶ投与の場合、ウイルスは急速に希釈され、したがって高力価が必要とされ、それが肝毒性をもたらすことがある。更に、既存の免疫が存在する場合、ウイルスは血液中で急速に中和され、そして後天的な免疫が反復投薬を制限する（Maroun et al. (2017) Future Virol. 12(4):193-213）。

ウイルスベースのワクチンベクターおよび腫瘍崩壊性ウイルスが制限される中で、最も大きい制限は、ウイルス自体である場合がある。ウイルス抗原は、腫瘍抗原と比較して著しく高い親和性をヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に対して有する（Aleksic et al. (2012) Eur J Immunol. 42(12):3174-3179）。更に活性が高いＡＰＣの表面上にＭＨＣ－１によってウイルス性ベクター抗原と同時に提示される腫瘍抗原は、ＴＣＲへの結合に関する競合に勝ち、抗原特異的抗腫瘍免疫が非常に低くなるであろう。高親和性Ｔ細胞エピトープをそれ自体は付与しない本明細書において提供する腫瘍標的化免疫刺激性ベクターは、これらの制限を回避することができる。

Ｄ．細菌によるがん免疫療法
１．細菌療法
細菌が抗がん活性を有するという認識は、何名かの医師が、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に感染した患者において腫瘍の退行を観察したときの１８００年代にさかのぼる。Ｗｉｌｌｉａｍ Ｃｏｌｅｙは、末期のがんの処置に対して細菌を利用して研究を最初に開始し、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）およびセラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）から構成されるワクチンを開発し、肉腫、がん腫、リンパ腫および黒色腫を含む様々ながんの処置に使用するのに成功した。その後、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、マイコバクテリウム属、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、Ｌ．モノサイトゲネス等のリステリア属、およびエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の菌種を含むいくつかの細菌が、抗がんワクチンの原料として研究されている（例えば、国際公開第１９９９／０１３０５３号；国際公開第２００１／０２５３９９号；Bermudes et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199；Patyar et al. (2010) Journal of Biomedical Science 17:21；Pawelek et al. (2003) Lancet Oncol.4:548-556を参照のこと）。

細菌は、動物およびヒト細胞に感染することができ、一部は細胞の細胞質ゾルへＤＮＡをデリバリーする自然の能力を有し、これらは、遺伝子療法のための候補ベクターである。細菌は、経口で投与することができるため治療法にも好適であり、これらは、インビトロおよびインビボで容易に繁殖し、凍結乾燥された状態で貯蔵し、輸送することができる。細菌の遺伝学的特質は容易に操作され、多数の菌株に関する完全ゲノムは完全に特徴付けられている（Felgner et al. (2016) mbio 7(5):e01220-16）。結果的に、サイトカイン、血管新生阻害剤、毒素およびプロドラッグ変換酵素をコードするものを含む細菌が使用され、様々な遺伝子をデリバリーし、発現している。例えば、サルモネラ属を使用し、免疫刺激分子様ＩＬ－１８（Loeffler et al. (2008) Cancer Gene Ther. 15(12):787-794)、ＬＩＧＨＴ(Loeffler et al. (2007) PNAS 104(31):12879-12883）、およびＦａｓリガンド（Loeffler et al. (2008) J. Natl. Cancer Inst. 100:1113-1116）を腫瘍において発現している。また、細菌ベクターは、ウイルス性ベクターより安価であり、生成が容易であり、必要に応じて抗生物質によって素早く削除することができるため、細菌性デリバリーはウイルス性デリバリーよりも好ましく、より安全な代替物となる。

しかし、使用するためには、菌株自体が病原性であってはならず、または治療剤として使用するために改変した後は病原性ではない。例えば、がんの処置において、治療用細菌菌株は、弱毒化されるか、または十分に非毒性にされ、その結果、全身性疾患および／または敗血症ショックをもたらさないが、いくらかのレベルの感染力を依然として維持し、腫瘍に効果的に定着しなければならない。遺伝子改変された細菌は、直接的な腫瘍形成効果を誘導するためにおよび／または腫瘍形成分子をデリバリーするように抗腫瘍薬剤として使用されることが記載されている（Clairmont, et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002；Bermudes, D. et al. (2002) Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 5:194-199；Zhao, M. et al. (2005) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:755-760；Zhao, M. et al. (2006) Cancer Res. 66:7647-7652）。これらの中の１つは、バイオ工学によって作られたサルモネラエンテリカセロバーティフィムリウム（Ｓ．ティフィムリウム）の菌株である。これらの細菌は、腫瘍において、健常組織よりも優先的には１，０００倍超えで多く蓄積し、腫瘍組織において均質に分散する（Pawelek, J. et al. (1997) Cancer Res. 57:4537-4544；Low, K. B. et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17:37-41）。優先的な複製は、細菌が腫瘍内に様々な抗がん治療薬剤を高濃度で直接生成し、デリバリーすることを可能にし、同時に健常組織に対する毒性を最小限にする。これらの弱毒化細菌は、ｉ．ｖ．投与したときにマウス、ブタ、およびサルにおいて安全であり（Zhao, M. et al. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102:755-760；Zhao, M. et al. (2006) Cancer Res 66:7647-7652；Tjuvajev J. et al. (2001) J. Control Release 74:313-315；Zheng, L. et al. (2000) Oncol. Res. 12:127-135）、ある特定の弱毒化サルモネラ属生存菌株は、ヒト臨床試験において経口投与後に良好な耐容性を示すことが示されている（Chatfield, S. N. et al. (1992) Biotechnology 10:888-892；DiPetrillo, M. D. et al. (1999) Vaccine 18:449-459；Hohmann, E. L. et al. (1996) J. Infect. Dis. 173:1408-1414；Sirard, J. C. et al. (1999) Immunol. Rev. 171:5-26）。Ｓ．ティフィムリウム ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱオペロンは、膜関連センサーキナーゼ（ＰｈｏＱ）および細胞質転写レギュレーターから構成される典型的な細菌２構成成分調節性系である（PhoP: Miller、S. I. et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:5054-5058；Groisman、E. A. et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 7077-7081）。ＰｈｏＰ／ｐｈｏＱはビルレンスに必須であり、その欠失は、マクロファージにおけるこの細菌の低い生存およびマウスおよびヒトにおける顕著な弱毒化をもたらす（Miller, S. I. et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:5054-5058；Groisman, E. A. et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 7077-7081；Galan, J. E. and Curtiss, R. III. (1989) Microb Pathog 6:433-443；Fields, P. I. et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:189-193）。ＰｈｏＰ／ｐｈｏＱ欠失菌株は、効果的なワクチンデリバリー媒体として用いられている（Galan, J. E. and Curtiss, R. III. (1989) Microb Pathog 6:433-443；Fields, P. I. et al. (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83:189-193；Angelakopoulos, H. and Hohmann, E. L. (2000) Infect Immun 68:213-241）。弱毒化サルモネラ属は、殺腫瘍性タンパク質の標的化デリバリーのために使用されている（Bermudes, D. et al. (2002) Curr Opin Drug Discov Devel 5:194-199；Tjuvajev J. et al. (2001) J Control release 74:313-315）。

細菌ベースのがん療法剤は、臨床的利点が制限されることが実証されている。クロストリジウム・ノビイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｎｏｖｙｉ）（Dang et al. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98(26):15155-15160；米国特許出願公開第２０１７／００２０９３１号、同第２０１５／０１４７３１５号；米国特許第７，３４４，７１０；同第３，９３６，３５４号）、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）（米国特許出願公開第２０１５／０２２４１５１号；同第２０１５／００７１８７３号）、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｉｆｉｄｕｍ）（Kimura et al. (1980) Cancer Res. 40:2061-2068）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｓｅｉ）（Yasutake et al. (1984) Med Microbiol Immunol. 173(3):113-125）、リステリア・モノサイトゲネス（Le et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18(3):858-868；Starks et al. (2004) J. Immunol. 173:420-427；米国特許出願公開第２００６／００５１３８０号）およびエシュリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（米国特許第９，３２０，７８７号）を含む様々な細菌菌種が、抗がん療法剤に可能な薬剤として研究されている。

例えばバチルスカルメットゲラン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ－Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）菌株は、ヒトにおける膀胱がんの処置のために承認されており、膀胱内化学療法剤より効果的であり、一次処置として使用されることが多い（Gardlik et al. (2011) Gene therapy 18:425-431）。別のアプローチは、マウスにおいて腫瘍抗原を発現するために強力なＣＤ８＋Ｔ細胞初回抗原刺激を誘導することができる弱毒化細胞内生存細菌のリステリア・モノサイトゲネスを利用する（Le et al. (2012) Clin. Cancer Res. 18(3):858-868）。腫瘍抗原のメソテリンを組み込んだリステリア属ベースのワクチンと、同種異系膵臓がんベースのＧＶＡＸワクチンとのプライムブーストアプローチでの臨床試験において、ＧＶＡＸワクチン単独で処置された患者に関する３．９ヶ月の生存中央値に対し、進行した膵臓がんを呈する患者において６．１ヶ月の生存中央値が認められた（Le et al. (2015) J. Clin. Oncol. 33(12):1325-1333）。これらの結果は、大規模第２ｂ相研究において再現されず、メソテリン等の低親和性自己抗原に免疫を誘導するための試みが困難であることをおそらく示している。

細菌菌株は、ＴＲＥＸ１および／またはＰＤ－Ｌ１を阻害するかまたは遮断するｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ等の阻害性ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、および任意選択で１つまたは複数の追加の免疫チェックポイント遺伝子を発現するために、本明細書において記載されかつ例示されるように改変することができる。菌株は、標準的な方法によって、および／または遺伝子の欠失または改変によって、および腫瘍細胞および固形腫瘍中のＴＭＥ等の主に免疫特権環境においてインビボで細菌が成長できるようにする遺伝子の変更または導入によって弱毒化することができる。本明細書において記載する改変するための菌株は、例えば、シゲラ属、リステリア属、Ｅ．コリ、ビフィドバクテリウム属およびサルモネラ属の中から選択することができる。例えば、シゲラ・ソンネイ、シゲラ・フレクスネリ、シゲラ・ディセンテリアエ、リステリア・モノサイトゲネス、サルモネラ・ティフィ、サルモネラ・ティフィムリウム、サルモネラ・ガリナルム、およびサルモネラ・エンテリティディスがある。他の好適な細菌菌種としては、リケッチア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、アエロモナス属、フランシセラ属、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、ビブリオ属、バチルス属、およびエリジペロスリックス属がある。例えば、リケッチア・リケッチアエ、リケッチア・プロワゼキイ、リケッチア・ツツガムシ、リケッチア・モーセリ、リケッチア・シビリカ、ボルデテラ・ブロンキセプティカ、ナイセリア・メニンギティディス、ナイセリア・ゴノロエアエ、アエロモナス・オイクレノフィラ、アエロモナス・サルモニシダ、フランシセラ・ツラレンシス、コリネバクテリウム・シュードツベルクロシス、シトロバクター・フレウンディイ、クラミジア・ニューモニアエ、ヘモフィルス・ソムヌス、ブルセラ・アボルツス、マイコバクテリウム・イントラセルラレ、レジオネラ・ニューモフィラ、ロドコッカス・エクイ、シュードモナス・アエルギノサ、ヘリコバクター・ムステラエ、ビブリオ・コレラエ、バチルス・スブティリス、エリジペロスリックス・ルシオパチアエ、エルシニア・エンテロコリティカ、ロシャリメア・クインタナ、およびアグロバクテリウム・ツメルファシウムがある。免疫刺激性細菌を含む任意の公知の治療法は、本明細書において記載するように改変することができる。

２．細菌およびウイルスに対する免疫応答の比較
細菌は、ウイルスと同様、自然免疫刺激性であるという利点を有する。細菌およびウイルスは、宿主細胞パターン認識受容体（ＰＲＲ）によって感知される病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として公知の保存構造を含むことは公知である。ＰＲＲによるＰＡＭＰの認識は、サイトカインおよびケモカインの誘導をもたらす下流シグナル伝達カスケード、および病原体クリアランスをもたらす免疫応答の開始を誘導する（Iwasaki and Medzhitov (2010) Science 327(5963):291-295）。自然免疫系にＰＡＭＰが関与する様式、および何のタイプの感染因子からかが、侵入病原体を阻止するための適切な適応免疫応答を決定する。

Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）として公知のあるクラスのＰＲＲは、細菌およびウイルス起源由来のＰＡＭＰを認識し、細胞内の様々なコンパートメントに位置する。ＴＬＲは、リポポリサッカライド（ＴＬＲ４）、リポタンパク質（ＴＬＲ２）、フラジェリン（ＴＬＲ５）、ＤＮＡにおける非メチル化ＣｐＧモチーフ（ＴＬＲ９）、二本鎖ストランドのＲＮＡ（ＴＬＲ３）、および一本鎖ストランドのＲＮＡ（ＴＬＲ７およびＴＬＲ８）を含む様々なリガンドに結合する（Akira et al. (2001) Nat. Immunol. 2(8):675-680；Kawai and Akira (2005) Curr. Opin. Immunol. 17(4):338-344）。例えば、Ｓ．ティフィムリウムの宿主監視は大部分が、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４およびＴＬＲ５を通して介在される（Arpaia et al.(2011)Cell 144(5):675-688）。ＮＦ－ｋＢの誘導を媒介するためのＭｙＤ８８およびＴＲＩＦアダプター分子を介したこれらのＴＬＲシグナルは、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６およびＩＦＮ－γ等の炎症促進性サイトカインに依存する（Pandey et. al. (2015) Cold Spring Harb Perspect Biol 7(1):a016246）。

ＰＲＲの別のカテゴリーは、ｎｏｄ－ｌｉｋｅ受容体（ＮＬＲ）ファミリーである。これらの受容体は、宿主細胞の細胞質ゾル中に常在し、細胞内ＰＡＭＰを認識する。例えば、Ｓ．ティフィムリウムフラジェリンがＮＬＲＣ４／ＮＡＩＰ５インフラマソーム経路を活性化し、カスパーゼ－１の開裂および炎症促進性サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の誘導をもたらし、感染マクロファージがパイロトーシスを起こした細胞の細胞死を引き起こすことが示された（Fink et al. (2007) Cell Microbiol. 9(11):2562-2570）。

ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５およびインフラマソームの関与が、細菌性クリアランスを媒介する炎症促進性サイトカインを誘導し、ＮＦ－κＢドライブシグナル伝達カスケードを主に活性化し、好中球、マクロファージおよびＣＤ４＋Ｔ細胞のリクルートメントおよび活性化をもたらすが、抗腫瘍免疫に必須のＤＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞にはもたらさない（Lui et al. (2017) Signal Transduct Target Ther. 2:17023）。ＣＤ８＋Ｔ細胞介在性抗腫瘍免疫を活性化するために、ＩＲＦ３／ＩＲＦ７依存性Ｉ型インターフェロンシグナル伝達はＤＣ活性化に重要であり、腫瘍抗原を交差提示し、ＣＤ８＋Ｔ細胞初回抗原刺激を促進する（Diamond et al. (2011) J. Exp. Med. 208(10):1989-2003；Fuertes et al. (2011) J. Exp. Med. 208(10):2005-2016）。Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β）は、２つの個別のＴＬＲ依存性およびＴＬＲ非依存性シグナル伝達経路によって誘導されるシグネチャーサイトカインである。ＩＦＮ－βを誘導するためのＴＬＲ依存性経路が、病原体のエンドサイトーシスの後に起こり、ＴＬＲ３、７、８および９が、エンドソーム内の病原体由来ＤＮＡおよびＲＮＡエレメントを検出する。ＴＬＲ７および８は、ウイルス性ヌクレオシドおよびヌクレオチドを認識し、レシキモドおよびイミキモド等のこれらの合成アゴニストが臨床的に検証されている（Chi et al. (2017) Frontiers in Pharmacology 8:304）。ＲＮａｓｅ消化に抵抗するためにポリＬリシンを用いて製剤化された類似体であるポリイノシンポリシチジン酸（ポリ（Ｉ：Ｃ））およびポリＩＣＬＣ等の合成ｄｓＲＮＡは、ＴＬＲ３およびＭＤＡ５経路に対するアゴニストであり、ＩＦＮ－βの強力なインデューサーである（Caskey et al. (2011) J. Exp. Med. 208(12):2357-66）。ウイルスおよび細菌ＤＮＡに存在するエンドソームＣｐＧモチーフのＴＬＲ９検出も、ＩＲＦ３を介してＩＦＮ－βを誘導することができる。更に、ＴＬＲ４は、ＩＲＦ３のＭｙＤ８８非依存性ＴＲＩＦ活性化を介してＩＦＮ－βを誘導することが示されている（Owen et al. (2016) mBio.7:1 e02051-15）。その後、ＤＣのＴＬＲ４活性化はＩ型ＩＦＮとは無関係であったため、Ｉ型ＩＦＮを介したＤＣを活性化するためのＴＬＲ４の能力は、生物学的に関連性がないようであることが示された（Hu et al. (2015) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112:45）。更に、ＴＬＲ４シグナル伝達は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を直接的にリクルートまたは活性化することは示されていない。

ＴＬＲ非依存性Ｉ型ＩＦＮ経路のうちの１つは、細胞質ゾル中の一本鎖ストランド（ｓｓ）および二本鎖ストランド（ｄｓ）ＲＮＡの宿主認識によって介在される。これらは、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、黒色腫分化関連遺伝子５（ＭＤＡ－５）を含むＲＮＡヘリカーゼによって、およびＩＲＦ－３転写因子のＩＦＮ－βプロモーター刺激因子１（ＩＰＳ－１）アダプタータンパク質介在性リン酸化を介して感知され、ＩＦＮ－βの誘導が引き起こされる（Ireton and Gale (2011) Viruses 3(6):906-919）。合成ＲＩＧ－Ｉ－結合エレメントも、Ｕ６プロモーター転写開始部位におけるＡＡジヌクレオチド配列の形態で、一般的なレンチウイルスｓｈＲＮＡベクターにおいて意図せずに発見されている。その後、プラスミドにおけるその欠失が、オフターゲットのＩ型ＩＦＮ活性化の交絡を阻止した（Pebernard et al. (2004) Differentiation. 72:103-111）。

ＴＬＲ非依存性Ｉ型インターフェロン誘導経路の第２のタイプは、感染性病原体または異常な宿主細胞損傷からの細胞質ゾルｄｓＤＮＡを感知するための中心メディエーターとして現在認識されている細胞質ゾルのＥＲ常在性（ｒｅｓｉｄｅｎｔ）アダプタータンパク質である、インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）を通して介在される（Barber (2011) Immunol. Rev 243(1):99-108）。ＳＴＩＮＧシグナル伝達は、ＴＡＮＫ結合キナーゼ（ＴＢＫ１）／ＩＲＦ３軸およびＮＦ－ｋＢシグナル伝達軸を活性化し、ＩＦＮ－β、ならびに自然および適応免疫を強力に活性化する他の炎症促進性サイトカインおよびケモカインの誘導をもたらす（Burdette et al. (2011) Nature 478(7370):515-518）。ＳＴＩＮＧを介した細胞質ゾルｄｓＤＮＡの感知は、宿主細胞ヌクレオチジル転写酵素であるサイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）を必要とし、ｄｓＤＮＡに直接的に結合し、それに応答して、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）であるサイクリックジヌクレオチド（ＣＤＮ）セカンドメッセンジャーを合成し、これがＳＴＩＮＧに結合し、それを活性化する（Sun et al. (2013) Science 339(6121):786-791；Wu et al. (2013) Science 339(6121):826-830）。細胞内リステリア・モノサイトゲネスから産生されるｃ－ｄｉ－ＡＭＰ等の細菌由来のＣＤＮも、ネズミＳＴＩＮＧに直接的結合することができるが、５つのヒトＳＴＩＮＧ対立遺伝子のうち３つのみである。３’－３’結合を用いたホスフェート架橋によって２つのプリンヌクレオシドが接合された細菌により産生されるＣＤＮとは異なり、哺乳動物のｃＧＡＳによって合成されるｃＧＡＭＰにおけるヌクレオチド間ホスフェート架橋は、非標準的な２’－３’結合によって接合される。これらの２’－３’分子は、細菌性３’－３’ＣＤＮよりも３００倍高い親和性でＳＴＩＮＧに結合し、したがって、ヒトＳＴＩＮＧのより強力な生理学的リガンドである（例えば、Civril et al. (2013) Nature 498(7454):332-337；Diner et al. (2013) Cell Rep. 3(5):1355-1361；Gao et al. (2013) Sci. Signal 6(269):pl1；Ablasser et al. (2013) Nature 503(7477):530-534を参照のこと）。

ヒトにおけるｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路は、細菌性病原体よりもウイルス性病原体に優先的に応答するように経時的に進化している場合があり、これは、なぜ宿主腫瘍抗原を保持する細菌性ワクチンが、ヒトにおける不十分なＣＤ８＋Ｔ細胞初回抗原刺激ベクターのために作製されたかを説明することができる。従来のＤＣからのＳＴＩＮＧ依存性Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達によるＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＬＲ非依存的活性化は、ウイルスが検出される一次機序であり、ＳＴＩＮＧ経路が、ウイルスが不活性化されているときのみ動作する形質細胞様ＤＣによるＴＬＲ依存性Ｉ型ＩＦＮの産生を伴う（Hervas-Stubbs et al. (2014) J Immunol. 193:1151-1161）。更に、Ｓ．ティフィムリウム等の細菌に関しては、ＴＬＲ４を介したＩＦＮ－βの誘導は可能であるが、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、クリアランスまたは防御免疫を誘導もされず、必要ともしない（Lee et al. (2012) Immunol Lett. 148(2): 138-143）。Ｓ．ティフィムリウムを含む多数の細菌の菌株に関して、同一の遺伝子菌株からでさえも生理学的に適切なＣＤ８＋Ｔエピトープが無いことは、細菌性ワクチン開発と感染後の防御免疫の両方を妨げている（Lo et al. (1999) J Immunol. 162:5398-5406）。したがって、細菌ベースのがん免疫療法は、腫瘍抗原交差提示および恒久的な抗腫瘍免疫を促進するために必要な、ＣＤ８＋Ｔ細胞をリクルートし、活性化するためのＩ型ＩＦＮを誘導するそれらの能力が生物学的に制限される。したがって、本明細書において提供される細菌性免疫療法を操作し、ＴＬＲ依存性細菌性免疫シグナル伝達ではなく、ウイルス様ＴＬＲ非依存性Ｉ型ＩＦＮシグナル伝達を誘導することは、ＣＤ８＋Ｔ細胞介在性抗腫瘍免疫を優先的に誘導することになる。

ＳＴＩＮＧは、細胞質ゾル中のセンシング核酸に対する応答において自然免疫を活性化する。下流シグナル伝達は、細胞質ゾルｄｓＤＮＡへの結合に対する応答において、細菌によってまたは宿主酵素ｃＧＡＳによって合成されるＣＤＮの結合を介して活性化される。細菌および宿主生成ＣＤＮは、ＳＴＩＮＧを活性化するためのその能力を区別する個別のホスフェート架橋構造を有する。ＩＦＮ－βは、活性ＳＴＩＮＧのシグネチャーサイトカインであり、細菌誘導ＩＦＮよりはむしろウイルス誘導Ｉ型ＩＦＮが、効果的ＣＤ８＋Ｔ細胞介在性抗腫瘍免疫に必要である。本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、ＳＴＩＮＧアゴニストであるものを含む。

３．サルモネラ属による治療法
サルモネラ属は、がん治療剤として使用することができる細菌属の例示的なものである。本明細書において例示されるサルモネラ属は、弱毒化菌種、またはがん治療剤として使用するための改変が毒性を減少させることに基づいたものである。

ａ．腫瘍指向性細菌
いくつかの細菌菌種が、遠位部位から注射したときに、固形腫瘍内で優先的に複製することは実証されている。これらの細菌としては、これらに限定されるものではないが、サルモネラ属、ビフィドバクテリウム属、クロストリジウム属、およびエシェリキア属の菌種がある。細菌性感染に対する宿主の自然免疫応答と組み合わせた細菌の天然の腫瘍ホーミング特性は、抗腫瘍応答を媒介すると考えられている。この腫瘍組織指向性は、腫瘍のサイズを様々な程度に減少させることが示されている。これらの細菌菌種の腫瘍指向性に対する１つの要因は、無酸素または低酸素環境中で複製するための能力である。いくつかのこれらの天然の腫瘍指向性細菌が、抗腫瘍応答の潜在力を高めるように更に遺伝子操作されている（reviewed in Zu et al. (2014) Crit Rev Microbiol. 40(3):225-235；およびFelgner et al. (2017) Microbial Biotechnology 10(5):1074-1078）。

ｂ．サルモネラエンテリカセロバーティフィムリウム
サルモネラエンテリカセロバーティフィムリウム（Ｓ．ティフィムリウム）は、抗がん治療剤として使用するための細菌菌種の例示的なものである。がんに対する宿主免疫を刺激するために細菌を使用するための１つのアプローチは、グラム陰性通性嫌気性菌Ｓ．ティフィムリウムを介しており、この菌は、腫瘍微小環境を含む低酸素部分および身体の壊死部分において優先的に蓄積する。Ｓ．ティフィムリウムは、組織壊死から栄養素を利用することができ、腫瘍血管系が漏出性であり、かつそれらが免疫系回避腫瘍微小環境において生き残る可能性が高いために、これらの環境において蓄積する（Baban et al. (2010) Bioengineered Bugs 1(6):385-294）。Ｓ．ティフィムリウムは、好気性と嫌気性の両方の条件下で成長することができ；したがって低酸素の程度が低い小さい腫瘍および低酸素の程度が高い大きい腫瘍に定着することができる。

Ｓ．ティフィムリウムは、糞口経路を介して感染するグラム陰性通性病原体である。この病原体は、局在的な胃腸感染をもたらすが、経口摂取後に、血流およびリンパ系に侵入し、肝臓、脾臓および肺等の全身組織にも感染する。野生型Ｓ．ティフィムリウムを全身投与すると、ＴＮＦ－α誘導を過剰に刺激し、サイトカインカスケードおよび敗血症ショックを引き起こし、未処置のままの場合は命にかかわることがある。結果的に、Ｓ．ティフィムリウム等の病原性細菌菌株は、腫瘍組織に効果的に定着するためのそれらの能力を完全に抑制することなく、全身感染を阻止するように弱毒化されなくてはならない。弱毒化は、細菌性外膜等の免疫応答を誘導することができる細胞構造を突然変異させるか、または補助的栄養素の非存在下で複製するその能力を制限することによって達成されることが多い。

Ｓ．ティフィムリウムは、マクロファージ等の骨髄細胞によって急速に取り込まれるかまたは上皮細胞等の非食細胞においてそれ自体の取り込みを誘導することができる細胞内病原体である。一度細胞内部に入ると、サルモネラ属含有液胞（ＳＣＶ）内で複製することができ、かつ一部の上皮細胞の細胞質ゾルへ逃避することもできる。Ｓ．ティフィムリウム病原性の分子決定基のうちの多くは同定されており、遺伝子はサルモネラ属病原性アイランド（ＳＰＩ）へ分類される。２つの最も特徴的な病原性アイランドは、非食細胞の細菌侵入を介在する原因となるＳＰＩ－１、およびＳＣＶ内での複製に必須のＳＰＩ－２である（Agbor and McCormick (2011) Cell Microbiol. 13(12): 1858-1869）。これら両方の病原性アイランドが、宿主膜を超えてエフェクタータンパク質を転位させることができるＩＩＩ型分泌装置（Ｔ３ＳＳ）と称される高分子構造をコードする（Galan and Wolf-Watz (2006) Nature 444:567-573）。

ｃ．細菌の弱毒化
がんの処置として投与するための治療用細菌は、弱毒化されるべきである。細菌性病原体を弱毒化するための様々な方法が、当技術分野において公知である。例えば、栄養要求性突然変異によって、細菌は必須栄養素を合成することができなくなり、ａｒｏ、ｐｕｒ、ｇｕａ、ｔｈｙ、ｎａｄおよびａｓｄ等の遺伝子における欠失／突然変異（米国特許出願公開第２０１２／０００９１５３号）が広範囲に使用される。これらの遺伝子に関与する生合成経路によって産生される栄養素は、宿主細胞において利用できないことが多く、したがって、細菌の生存が課題である。例えば、サルモネラ属および他の菌種の弱毒化は、シキミ酸経路の一部であり、芳香族化合物アミノ酸生合成のための解糖に関連するａｒｏＡ遺伝子の欠失によって達成することができる（Felgner et al. (2016) MBio 7(5):e01220-16）。したがって、ａｒｏＡの欠失は、細菌の芳香族化合物アミノ酸栄養要求性、およびその後の弱毒化をもたらす（米国特許出願公開第２００３／０１７０２７６号、同第２００３／０１７５２９７号、同第２０１２／０００９１５３号、同第２０１６／０３６９２８２号、国際公開第２０１５／０３２１６５号、および国際公開第２０１６／０２５５８２号）。同様に、ａｒｏＣおよびａｒｏＤを含む、芳香族化合物アミノ酸のための生合成経路に関与する他の酵素は、欠失され、弱毒化が達成されている（米国特許出願公開第２０１６／０３６９２８２；国際公開第２０１６／０２５５８２号）。例えば、Ｓ．ティフィムリウム菌株ＳＬ７２０７は、芳香族化合物アミノ酸栄養要求株（ａｒｏＡ－突然変異体）であり；菌株Ａ１およびＡ１－Ｒはロイシン－アルギニン栄養要求株である。ＶＮＰ２０００９はプリン栄養要求株（ｐｕｒＩ－突然変異体）である。本明細書において示すように、免疫抑制性ヌクレオシドアデノシン栄養要求性でもある。

細菌を弱毒化する突然変異としては、これらに限定されるものではないが、ｒｆａＬ、ｒｆａＧ、ｒｆａＨ、ｒｆａＤ、ｒｆａＰ、ｒＦｂ、ｒｆａ、ｍｓｂＢ、ｈｔｒＢ、ｆｉｒＡ、ｐａｇＬ、ｐａｇＰ、ｌｐｘＲ、ａｒｎＴ、ｅｐｔＡ、およびｌｐｘＴ等の、リポポリサッカライドの生合成を変更する、遺伝子の突然変異；ｓａｃＢ、ｎｕｋ、ｈｏｋ、ｇｅｆ、ｋｉｌまたはｐｈｌＡ等の、自殺遺伝子を導入する突然変異；ｈｌｙおよびｃｌｙ等の、溶菌遺伝子を導入する突然変異；ＩｓｙＡ、ｐａｇ、ｐｒｇ、ｉｓｃＡ、ｖｉｒＧ、ｐｌｃおよびａｃｔ等の、ビルレンス因子の突然変異；ｒｅｃＡ、ｈｔｒＡ、ｈｔｐＲ、ｈｓｐおよびｇｒｏＥＬ等の、ストレス応答を改変する突然変異；ｍｉｎ等の、細胞周期を破壊する突然変異；およびｃｙａ、ｃｒｐ、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ、およびｏｍｐＲ等の、調節性機能を破壊または不活性化する突然変異もある（米国特許出願公開第２０１２／０００９１５３号、同第２００３／０１７０２７６号、同第２００７／０２９８０１２号；米国特許第６，１９０，６５７号；国際公開第２０１５／０３２１６５号；Felgner et al. (2016) Gut microbes 7(2):171-177；Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178；Frahm et al. (2015) mBio 6(2):e00254-15；Kong et al. (2011) Infection and Immunity 79(12):5027-5038；Kong et al. (2012) PNAS 109(47):19414-19419）。理想的には、遺伝子的弱毒化は、ビルレント表現型への復帰をもたらす場合がある自然代償性突然変異を阻止するために、点突然変異ではなく遺伝子欠失を含む。

ｉ．ｍｓｂＢ－突然変異体
Ｓ．ティフィムリウムにおけるｍｓｂＢ遺伝子によってコードされる酵素脂質Ａ生合成ミリストイル転写酵素は、末端ミリスチル基がリポポリサッカライド（ＬＰＳ）の脂質Ａドメインへ追加されることを触媒する（Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41）。したがってｍｓｂＢの欠失は、グラム陰性細菌の外膜の主要な構成成分であるＬＰＳの脂質Ａドメインのアシル組成を変更する。この改変は、敗血症ショックを誘導するＬＰＳの能力を顕著に減少させ、細菌菌株を弱毒化し、ＴＮＦαの潜在的に有害な産生を減少させ、したがって、全身毒性を低下させる。Ｓ．ティフィムリウム ｍｓｂＢ突然変異体は、マウスにおける他の組織にわたる腫瘍に優先的に定着するそれらの能力を維持し、抗腫瘍活性を保持し、したがってサルモネラ属ベースの免疫療法の治療インデックスを増加させる（米国特許出願公開第２００３／０１７０２７６号、同第２００３／０１０９０２６号、同第２００４／０２２９３３８号、同第２００５／０２２５０８８号、同第２００７／０２９８０１２号）。

例えば、Ｓ．ティフィムリウム菌株ＶＮＰ２０００９におけるｍｓｂＢの欠失は、天然型ヘキサアシル化ＬＰＳよりも毒性が少なく、毒性ショックを誘導することなく全身性デリバリーが可能になる、主にペンタアシル化されたＬＰＳの産生をもたらす（Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25）。他のＬＰＳ突然変異を、サルモネラ属菌株を含み、ビルレンスを劇的に減少させる本明細書において提供される細菌菌株中に導入することができ、その結果より低い毒性を提供し、高用量の投与を可能にする。

ｉｉ．ｐｕｒＩ－突然変異体
プリン（例えばアデニン）、ヌクレオシド（例えばアデノシン）またはアミノ酸（例えば、アルギニンおよびロイシン）等の１つまたは複数の必須栄養素に対する栄養要求性にすることによって弱毒化することができる免疫刺激性細菌が用いられる。特に、Ｓ．ティフィムリウム等の本明細書において提供される免疫刺激性細菌の実施形態では、細菌は、腫瘍微小環境において優先的に蓄積するアデノシンに対する栄養要求性が付与される。したがって、本明細書において記載する免疫刺激性細菌の菌株は、成長するためにアデノシンを必要とし、以下で検討されるようなアデノシンを豊富に有するＴＭＥで優先的に定着するため、弱毒化される。

ｐｕｒＩ遺伝子（ｐｕｒＭ遺伝子と同義）によってコードされる酵素であるホスホリボシルアミノイミダゾールシンテターゼは、プリン生合成経路に関与する。したがって、ｐｕｒＩ遺伝子の破壊は、細菌をプリン栄養要求性にする。弱毒化されることに加えて、ｐｕｒＩ－突然変異体は、腫瘍環境において豊富であり、顕著な抗腫瘍活性を有する（Pawelek et al. (1997) Cancer Research 57:4537-4544）。この定着は、それらの急速な細胞代謝回転の結果として腫瘍の間質液に存在する高濃度のプリンに起因することは既に述べられている。ｐｕｒＩ－細菌はプリンを合成することができないため、外部原料のアデニンを必要とし、これが、プリンが豊富な腫瘍微小環境においてそれらの成長が制限されることにつながると考えられた（Rosenberg et al. (2002) J. Immunotherapy 25(3):218-225）。ＶＮＰ２０００９菌株は、ｐｕｒＩ遺伝子の欠失を含むことが最初に報告されたが（Low et al. (2003) Methods in Molecular Medicine Vol. 90, Suicide Gene Therapy:47-59）、ＶＮＰ２０００９の全ゲノムのその後の分析によって、ｐｕｒＩ遺伝子は欠失されないが、染色体の反転によって破壊されることが実証された（Broadway et al. (2014) Journal of Biotechnology 192:177-178）。全遺伝子は、挿入配列に隣接するＶＮＰ２０００９染色体の２つの部分内に含まれる（これらのうちの１つは活性トランスポサーゼを有する）。

ｐｕｒＩ突然変異体Ｓ．ティフィムリウム菌株はヌクレオシドアデノシン栄養要求性であり、これは腫瘍微小環境において非常に豊富であることが本明細書において示される。したがって、ＶＮＰ２０００９を使用する場合、アデノシン栄養要求性を達成するために任意の更なる改変を導入することは必須ではない。他の菌株および細菌に関しては、ＶＮＰ２０００９に存在しているようなｐｕｒＩ遺伝子を破壊する場合があるか、または野生型遺伝子への復帰を阻止するためにｐｕｒＩ遺伝子の全てのまたは一部の欠失を含む場合がある。

ｉｉｉ．弱毒突然変異の組合せ
染色体の異なる領域における遺伝子欠失を用いて複数の遺伝子的弱毒化を有する細菌は、弱毒化を増加し、同時に野生型遺伝的材料との相同的組換えによる遺伝子の獲得によってビルレント表現型への復帰の可能性を減少させることができるため、細菌免疫療法に望ましい。相同的組換えによってビルレンスが回復すると、同じ有機体内で起こるように２つの個別の組換え事象を必要とすることになる。理想的には、免疫療法薬剤において使用するために選択される弱毒突然変異の組合せは、有効性を低下させることなく忍容性を増加させ、その結果、治療インデックスが増加する。例えば、Ｓ．ティフィムリウム菌株ＶＮＰ２０００９におけるｍｓｂＢおよびｐｕｒＩ遺伝子の破壊は、腫瘍を標的とし、成長を抑制するために使用されており、動物モデルにおいて低毒性を誘導する（Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002；Bermudes et al. (2000) Cancer Gene Therapy: Past Achievements and Future Challenges, edited by Habib Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, pp. 57-63；Low et al. (2003) Methods in Molecular Medicine, Vol. 90, Suicide Gene Therapy:47-59；Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25；Rosenberg et al. (2002) J. Immunotherapy 25(3):218-225；Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178；Loeffler et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104(31):12879-12883；Luo et al. (2002) Oncology Research 12:501-508）。ＶＮＰ２０００９（ｍｓｂＢ－／ｐｕｒＩ－）を同系またはヒト異種移植腫瘍を有するマウスに投与した場合、細菌は、３００～１０００対１を超える比で腫瘍の細胞外構成成分内に優先的に蓄積し、ＴＮＦα誘導を減少させ、腫瘍が退行し、制御マウスと比較して生存率が延長することが実証された（Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002）。しかし、ヒトにおける第１相臨床試験からの結果、ＶＮＰ２０００９は比較的安全であり、優れた耐容性を示すことが示されたが、不十分な蓄積がヒト黒色腫腫瘍において観察され、抗腫瘍活性は非常にわずかであることが実証された（Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152）。任意の抗腫瘍活性を示すために必須の高用量は、毒性のために不可能であった。

したがって、更なる改善が必要とされる。本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、この課題に取り組む。

ｉｖ．ＶＮＰ２０００９および他の弱毒化Ｓ．ティフィムリウム菌株
本明細書において記載する改変することができる治療用細菌の例示的なものは、ＶＮＰ２０００９（ＡＴＣＣ＃２０２１６５、ＹＳ１６４６）と称される菌株である。臨床的候補のＶＮＰ２０００９（ＡＴＣＣ＃２０２１６５、ＹＳ１６４６）は、安全性のためにｍｓｂＢとｐｕｒｌの両方の遺伝子の欠失によって少なくとも５０，０００倍弱毒化された（Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002；Low et al. (2003) Methods in Molecular Medicine, Vol. 90, Suicide Gene Therapy:47-59；Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25）。弱毒化された同様のサルモネラ属の菌株も検討される。上述のように、ｍｓｂＢの欠失は、グラム陰性細菌性外膜の主要な構成成分であるリポポリサッカライドの脂質Ａドメインの組成を変更する（Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41）。これは、リポポリサッカライド誘導性敗血症ショックを阻止し、細菌菌株を弱毒化し、全身毒性を低下させ、同時にＴＮＦαの潜在的に有害な産生を減少させる（Dinarello、C.A. (1997) Chest 112(6 Suppl):321S-329S；Low et al. (1999) Nat. Biotechnol. 17(1):37-41）。ｐｕｒＩ遺伝子の欠失は、細菌をプリン栄養要求性にし、細菌を更に弱毒化し、腫瘍微小環境においてそれを富化する（Pawelek et al.(1997) Cancer Res. 57:4537-4544；Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178）。

腫瘍におけるＶＮＰ２０００９の蓄積は、親菌株ＡＴＣＣ１４０２８の固有の侵襲性、低酸素環境において複製するためのその能力、および腫瘍の間質液に存在するプリンを高濃度にするためのその必須要件を含む因子の組合せに起因する。これを考慮すると、腫瘍微小環境において病理学的に高レベルへ蓄積することができ、免疫抑制性腫瘍微小環境の一因となるＶＮＰ２０００９も、ヌクレオシドアデノシン栄養要求性であることが実証されることになる（Peter Vaupel and Arnulf Mayer Oxygen Transport to Tissue XXXVII, Advances in Experimental Medicine and Biology 876 chapter 22, pp. 177-183）。ＶＮＰ２０００９が、同系またはヒト異種移植腫瘍を有するマウスへ投与された場合、細菌は、３００～１０００対１を超える比で腫瘍の細胞外構成成分内に優先的に蓄積し、腫瘍成長が阻害され、ならびに制御マウスと比較して生存率が延長することが実証された（Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002）。第１相臨床試験からの結果、ＶＮＰ２０００９は比較的安全であり、優れた耐容性を示すことが示されたが、不十分な蓄積がヒト黒色腫腫瘍において観察され、抗腫瘍活性は非常にわずかであることが実証された（Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152）。任意の抗腫瘍活性に影響を与えるために必須であろう高用量は、高レベルの炎症促進性サイトカインと相関する毒性のために不可能であった。

例えば、ロイシン－アルギニン栄養要求株Ａ－１（Zhao et al. (2005) PNAS 102(3):755-760；Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436；米国特許第８，８２２，１９４号；米国特許出願公開第２０１４／０１７８３４１号）およびその誘導体ＡＲ－１（Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436；Kawagushi et al. (2017) Oncotarget 8(12):19065-19073；Zhao et al. (2006) Cancer Res. 66(15):7647-7652；Zhao et al. (2012) Cell Cycle 11(1):187-193；Tome et al. (2013) Anticancer Research 33:97-102；Murakami et al. (2017) Oncotarget 8(5):8035-8042；Liu et al. (2016) Oncotarget 7(16):22873-22882；Binder et al. (2013) Cancer Immunol Res. 1(2):123-133）；ａｒｏＡ－突然変異体Ｓ．ティフィムリウム菌株ＳＬ７２０７（Guo et al. (2011) Gene therapy 18:95-105；米国特許出願公開第２０１２／０００９１５３号、同第２０１６／０３６９２８２号および同第２０１６／０１８４４５６号）およびその偏性嫌気性誘導体ＹＢ１（Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436；Leschner et al. (2009) PLoS ONE 4(8): e6692；Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436）；ａｒｏＡ－／ａｒｏＤ－突然変異体Ｓ．ティフィムリウム菌株ＢＲＤ５０９、ＳＬ１３４４（ＷＴ）菌株の誘導体（Yoon et al. (2017) European J. of Cancer 70:48-61）；ａｓｄ－／ｃｙａ－／ｃｒｐ－突然変異体Ｓ．ティフィムリウム菌株χ４５５０（Sorenson et al. (2010) Biology: Targets & Therapy 4:61-73）およびｐｈｏＰ－／ｐｈｏＱ－Ｓ．ティフィムリウム菌株ＬＨ４３０（国際公開第２００８／０９１３７５号）等のＳ．ティフィムリウムの他の菌株を使用して、腫瘍標的化デリバリーおよび治療法を行うことができる。

ＶＮＰ２０００９は、進行した黒色腫を呈する患者を含む研究において臨床的利点を示すことができなかったが、最大耐量（ＭＴＤ）が確立され、処置は、進行したがん患者に安全に投与された。したがって、この菌株、ならびに他の類似の遺伝子操作された細菌菌株は、腫瘍標的化治療的デリバリー媒体として使用することができる。本明細書において提供される改変は、治療薬剤の抗腫瘍効率ならびに／または安全性および忍容性を増加させることによって有効性を高めるための戦略を提供する。

ｖ．高分子をデリバリーするように遺伝子操作された弱毒化Ｓ．ティフィムリウム
細菌菌株は、治療用分子をデリバリーするように遺伝子操作される。本明細書における菌株は、免疫チェックポイント、また他のそのような標的を標的とし、それに対して阻害性であるＲＮＡｉをデリバリーする。

転移性の黒色腫の臨床試験においてＶＮＰ２０００９を使用すると、転移性の腫瘍量において顕著な変化は生じなかったが、腫瘍定着のエビデンスがいくつか実証された。ＶＮＰ２０００９および他のＳ．ティフィムリウム菌株は、サイトカイン、抗血管新生因子、阻害性酵素および細胞毒性ポリペプチドをコードするもの等の様々な遺伝子をデリバリーするためのベクターとして使用されてきた（米国特許出願公開第２００７／０２９８０１２号）。例えば、ＶＮＰ２０００９を使用したサイトカインコード化ＬＩＧＨＴのデリバリーは、免疫応答性マウスにおける原発腫瘍の成長ならびにがん腫細胞株の肺転移を阻害し、顕著な毒性は観察されなかった（Loeffler et al. (2007) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104(31):12879-12883）。別の研究では、Ｅ．コリシトシンデアミナーゼ遺伝子を発現するＶＮＰ２０００９が、プロドラッグの５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）も経口で受けた患者に投与された。３名の患者のうち２名が、最初に注射してから少なくとも１５日間、腫瘍内細菌定着を示し、シトシンデアミナーゼが５－ＦＣを抗がん薬物５－ＦＵへ変換したことが示された。サルモネラ属からの副作用は観察されず、５－ＦＵの直接ＩＶ投与では、シトシンデアミナーゼ遺伝子の細菌性デリバリーを用いるよりも、腫瘍薬物濃度の低下が生じた（Nemunaitis et al. (2003) Cancer Gene Therapy 10:737-744）。

他の例では、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶＴＫ）を発現する弱毒化サルモネラ属は、Ｂ１６黒色腫腫瘍サイズにおいて、ガンシクロビル介在性腫瘍成長抑制を介して２．５倍減少させることが実証され（Pawelek, J. et al. (1997) Cancer Res 57:4537-4544）、Ｃ末端ｐ５３ペプチド（Ｃｐ５３）は、Ｓ．ティフィムリウムを使用してデリバリーされ、ＭＣＦ７乳がん細胞において誘発発現され、腫瘍細胞母集団において減少をもたらした（Camacho et al. (2016) Scientific Reports 6:30591）。Ｓ．ティフィムリウムは、例えば、ＩＦＮ－γ（Yoon et al. (2017) European J. of Cancer 70:48-61）；ＳＩＩＮＦ抗原（Binder et al. (2013) Cancer Immunol Res. 1(2):123-133）；ビブリオ・ブルニフィカス（Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ）フラジェリンＢ（Zheng et al. (2017) Sci. Transl. Med. 9、9537）；および切断型－ＩＬ２（Sorenson et al. (2010) Biology: Targets & Therapy 4:61-73）の腫瘍を標的とする発現にも利用されている。

Ｓ．ティフィムリウムは、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）サバイビン（ＳＶＮ）をＡＰＣへデリバリーし、適応免疫をプライムするようにも改変されている（米国特許出願公開第２０１４／０１８６４０１号；Xu et al. (2014) Cancer Res. 74(21):6260-6270）。ＳＶＮは、細胞生存を延長し、細胞周期制御を提供し、全ての固形腫瘍において過剰発現され、健常組織では発現が少ないアポトーシスタンパク質阻害剤（ＩＡＰ）である。この技術は、サルモネラ属病原性アイランド２（ＳＰＩ－２）およびそのＩＩＩ型分泌装置（Ｔ３ＳＳ）を利用しており、ＴＡＡをＡＰＣの細胞質ゾルへデリバリーし、次いでＡＰＣが活性され、ＴＡＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞および抗腫瘍免疫を誘導する（Xu et al. (2014) Cancer Res. 74(21):6260-6270）。リステリア属ベースのＴＡＡワクチンと同様に、このアプローチは、マウスモデルにおいて有望であることを示しているが、ヒトにおける効果的な腫瘍抗原特異的Ｔ細胞初回抗原刺激はまだ実証されていない。

遺伝子デリバリーに加えて、Ｓ．ティフィムリウムは、がん療法用の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をデリバリーするためにも使用されている。例えば、弱毒化Ｓ．ティフィムリウムは、Ｓｔａｔ３およびＩＤＯ１を標的とするもの等のある特定のｓｈＲＮＡを発現するために改変されている（米国特許出願公開第２００７／０７４２７２号、および米国特許第９，４５３，２２７号）。ＶＮＰ２０００９は、免疫抑制性遺伝子インドラミンデオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）に対するｓｈＲＮＡプラスミドを用いて形質転換され、ネズミ黒色腫モデルにおけるＩＤＯ発現をサイレンシングすることに成功し、好中球による腫瘍細胞死および顕著な腫瘍浸潤をもたらす（Blache et al. (2012) Cancer Res. 72(24):6447-6456）。このベクターとＰＥＧＰＨ２０（細胞外ヒアルロナンを激減させる酵素）の同時投与との組合せでは、膵臓管腺がん腫瘍の処置において有益な結果が示された（Manuel et al. (2015) Cancer Immunol. Res. 3(9):1096-1107；米国特許出願公開第２０１６／０１８４４５６号）。別の研究では、ｐｈｏＰ／ｐｈｏＱ欠失によって弱毒化され、シグナル伝達性転写因子３（ＳＴＡＴ３）特異的ｓｈＲＮＡを発現するＳ．ティフィムリウム菌株は、腫瘍成長を阻害し、転移器官の数を減少させ、Ｃ５７ＢＬ６マウスの寿命を延ばすことが見出された（Zhang et al. (2007) Cancer Res. 67(12):5859-5864）。別の例では、Ｓ．ティフィムリウム菌株ＳＬ７２０７は、β－カテニンをコードする遺伝子であるＣＴＮＮＢ１を標的とするｓｈＲＮＡをデリバリーするために使用されており（Guo et al.(2011)Gene therapy 18:95-105；米国特許出願公開第２００９／０１２３４２６号、同第２０１６／０３６９２８２号）、同時にＳ．ティフィムリウム菌株ＶＮＰ２０００９は、ＳＴＡＴ３を標的とするｓｈＲＮＡのデリバリーにおいて利用されている（Manuel et al. (2011) Cancer Res. 71(12):4183-4191；米国特許出願公開第２００９／０２０８５３４号、同第２０１４／０１８６４０１号、同第２０１６／０１８４４５６号；国際公開第２００８／０９１３７５号；国際公開第２０１２／１４９３６４号）。オートファジー遺伝子Ａｔｇ５およびＢｅｃｌｉｎ１を標的とするｓｉＲＮＡは、Ｓ．ティフィムリウム菌株Ａ１－ＲおよびＶＮＰ２０００９を使用して腫瘍細胞へデリバリーされている（Liu et al. (2016) Oncotarget 7(16):22873-22882）。免疫応答をより効果的に刺激し、他の有利な特性を有するように、本明細書において提供される免疫刺激性細菌等、このような菌株を改善することが必要とされる。

上述の細菌のいずれも、ＴＲＥＸ１等の他のチェックポイントを標的とする核酸をコードする追加のｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡを追加することによって等、本明細書において記載するように改変することができる。細菌は、本明細書において記載する炎症効果が低下するように、したがって毒性が低くなるように改変することができる。結果的に、例えば、より高い投薬量を投与することができる。これらのサルモネラ属の菌株、ならびに当業者であれば公知のおよび／または上記でかつ本明細書において列挙される他の細菌菌種のいずれも、ＴＲＥＸ１発現を阻害するためにアデノシン栄養要求性および／またはｓｈＲＮＡを導入することによって等、本明細書において記載する改変し、かつ本明細書において記載するような他の改変を行うことができる。例示的なものは、本明細書において記載するＳ．ティフィムリウム菌種である。これを考慮すると、Ｓ．ティフィムリウム菌株ＶＮＰ２０００９はアデノシン栄養要求性であることが示される。

４．治療指数を増加させるための免疫刺激性細菌の強化
毒性を低下させ、抗腫瘍活性を改善する免疫刺激性細菌に対する強化が本明細書において提供される。そのような強化の例示的なものは、以下のものである。これらはサルモネラ属、特にＳ．ティフィムリウムに関して記載しており；当業者であれば、他の細菌菌種および他のサルモネラ属菌株において同様の強化を与えることができる点を理解されたい。

ａ．ａｓｄ遺伝子欠失
細菌におけるａｓｄ遺伝子は、アスパルテート－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする。Ｓ．ティフィムリウムのａｓｄ－突然変異体は、細胞壁合成に必須のジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）に対して偏性の必須要件を有し、ＤＡＰに恵まれない環境において溶解されることになる。ａｓｄ遺伝子がプラスミド上で、トランス型で相補される場合に、このＤＡＰ栄養要求性は、プラスミドを選択し、抗生物質を使用せずにプラスミドの安定性を維持するために、インビボで使用することができる。抗生物質不含ベースのプラスミド選択系は有利であり、１）有害事象の症状における急速なクリアランス機序として投与された抗生物質の使用、および２）そのような使用は通常回避される場合、抗生物質を使用しない生産のスケールアップを可能にする。ａｓｄ遺伝子相補系はそのような選択を提供する（Galan et al. (1990) Gene 28:29-35）。腫瘍微小環境においてプラスミドを維持するためにａｓｄ遺伝子相補系を使用すると、遺伝子または干渉ＲＮＡをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子操作されたＳ．ティフィムリウムの潜在力を高めることが期待される。

Ｓ．ティフィムリウムのａｓｄ突然変異体に関する代替の使用は、高分子を、自己溶解性（または自殺性）菌株を産生して、宿主腫瘍で持続的に定着するための能力を用いずに感染した細胞にデリバリーするために、ＤＡＰ栄養要求性を利用することである。ａｓｄ遺伝子の欠失は、細菌を、インビトロまたはインビボで成長した場合に、ＤＡＰ栄養要求性にする。本明細書において記載する例は、ＤＡＰ栄養要求性であり、ｓｈＲＮＡまたはｍｉ－ＲＮＡ等のＲＮＡｉのデリバリーに好適なプラスミドを含む、ａｓｄ欠失菌株を提供し、これは、ａｓｄ相補遺伝子を含まず、インビボでの複製に関して欠陥がある菌株をもたらす。この菌株は、ＤＡＰの存在下、インビトロで繁殖され、正常に成長し、次いで免疫療法薬剤としてＤＡＰが存在しない哺乳動物宿主に投与される。自殺性菌株は、宿主細胞に侵入することができるが、哺乳動物組織においてＤＡＰは存在しないために、複製することができず、自動的に溶解し、その細胞質ゾルの内容物（例えば、プラスミドまたはタンパク質）をデリバリーする。本明細書において提供される例では、ＶＮＰ２０００９のａｓｄ遺伝子欠失菌株が、その内因性ペリプラズム分泌シグナル配列が無いＬＬＯタンパク質を発現し、それをサルモネラ属の細胞質中に蓄積させるように更に改変した。ＬＬＯは、細菌の食作用からの逃避を介在するリステリア・モノサイトゲネスからのコレステロール依存性孔形成溶血素である。自己溶解性菌株が、担腫瘍マウス中に導入された場合、細菌は食作用性免疫細胞によって取り込まれ、サルモネラ属含有液胞（ＳＣＶ）に侵入する。この環境では、ＤＡＰが無いと、細菌の複製を阻止し、ＳＣＶにおいて細菌の自己溶解性をもたらすことになる。その後、自殺性菌株が溶解すると、プラスミドが放出されることになり、蓄積されたＬＬＯがコレステロール含有ＳＶＣ膜において孔を形成し、プラスミドを宿主細胞の細胞質ゾル中へデリバリーすることが可能になるであろう。

ｂ．アデノシン栄養要求性
トリプトファンおよびＡＴＰ／アデノシン経路由来の代謝産物は、腫瘍内の免疫抑制性環境形成において主要なドライバーである。細胞の内部および外部に遊離形態で存在するアデノシンは、免疫機能のエフェクターである。アデノシンは、ＮＦ－κＢのＴ細胞受容体誘導性活性化を低下させ、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＦＮ－γを阻害する。アデノシンは、Ｔ細胞細胞毒性を減少させ、Ｔ細胞アネルギーを増加させ、Ｆｏｘｐ３＋またはＬａｇ－３＋調節性（Ｔ－ｒｅｇ）Ｔ細胞へのＴ細胞分化を増加させる。ＮＫ細胞に関しては、アデノシンはＩＦＮ－γ産生を減少させ、ＮＫ細胞の細胞毒性を抑制する。アデノシンは、好中球接着血管外漏出をブロックし、食作用を減少させ、スーパーオキシドおよび一酸化窒素のレベルを弱毒化する。アデノシンは、マクロファージ上でＴＮＦ－α、ＩＬ－１２、およびＭＩＰ－１αの発現も減少させ、ＭＨＣクラスＩＩ発現を弱毒化し、ＩＬ－１０およびＩＬ－６のレベルを増加させる。アデノシン免疫調節活性は、腫瘍の細胞外空間へのその放出および標的免疫細胞、がん細胞または内皮細胞表面上のアデノシン受容体（ＡＤＲ）の活性化後に起こる。腫瘍微小環境においてアデノシンレベルが高いと、局在的な免疫抑制をもたらし、それが、がん細胞を削除するための免疫系の能力を制限する。

細胞外アデノシンは、腫瘍間質細胞上に発現される膜結合性エクト酵素ＣＤ３９およびＣＤ７３の連続的な活性によって産生され、死細胞または瀕死の細胞からのＡＴＰまたはＡＤＰをホスホ加水分解することによってアデノシン産生と一緒に産生される。ＣＤ３９は、細胞外ＡＴＰ（またはＡＤＰ）を５’ＡＭＰへ変換し、それが、５’ＡＭＰによってアデノシンへ変換される。内皮細胞上でのＣＤ３９およびＣＤ７３の発現は、腫瘍微小環境の低酸素条件下で増加され、その結果アデノシンレベルが増加する。腫瘍低酸素は、不十分な血液供給および乱れた腫瘍血管系に起因する場合があり、酸素のデリバリーが損なわれる（Carroll and Ashcroft (2005) Expert. Rev. Mol. Med. 7(6):1-16）。腫瘍微小環境において起こる低酸素状態も、アデノシンをＡＭＰへ変換し、非常に高い細胞外アデノシン濃度をもたらすアデニル酸キナーゼ（ＡＫ）を阻害する。低酸素の腫瘍微小環境におけるアデノシンの細胞外濃度は、１０～１００μＭで測定されており、これは、およそ０．１μＭの典型的な細胞外アデノシン濃度よりも最大約１００～１０００倍高い（Vaupel et al. (2016) Adv Exp Med Biol. 876:177-183；Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857）。腫瘍における低酸素領域は、微小血管から遠位にあるため、腫瘍の一部の領域におけるアデノシンの局在濃度は、他のものよりも高い場合がある。

直接作用し、免疫系を阻害するために、アデノシンはがん細胞増殖、アポトーシスおよび血管新生に対して作用することによって、がん細胞成長および播種を制御することもできる。例えば、アデノシンは、Ａ２ＡおよびＡ２Ｂ受容体の刺激を介して、血管新生を最初に促進することができる。内皮細胞上で受容体を刺激すると、内皮細胞上での細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ－１）およびＥ－セレクチン発現を調節し、血管完全性を維持し、血管成長を促進することができる（Antonioli et al. (2013 Nat. Rev. Can. 13:842-857）。アデノシンによって様々な細胞上のＡ２Ａ、Ａ２ＢまたはＡ３のうちの１つまたは複数を活性化すると、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）またはアンジオポエチン２等の血管新生誘導因子の産生を刺激することができる（Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857）。

アデノシンは、がん細胞上の受容体との相互作用を介して、腫瘍細胞増殖、アポトーシスおよび転移を直接調節することもできる。例えば、研究によって、一部の乳がん細胞株において腫瘍細胞増殖を促進し、Ａ１およびＡ２Ａ受容体を活性化すると、Ａ２Ｂ受容体の活性化が、結腸がん腫細胞においてがん成長促進特性を有することが示されるている（Antonioli et al. (2013) Nat. Rev. Can. 13:842-857）。アデノシンは、がん細胞のアポトーシスを誘導することもでき、様々な研究が、この活性化を、Ａ３を介した外因性アポトーシス経路またはＡ２ＡおよびＡ２Ｂを介した内因性アポトーシス経路の活性化に相関付けている（Antonioli et al. (2013)）。アデノシンは、細胞運動性、細胞外マトリックスへの接着、ならびに細胞結合タンパク質および受容体の発現を増加させ、細胞移動および運動性を促進することによって、腫瘍細胞の遊走および転移を促進することができる。

アデノシントリホスフェート（ＡＴＰ）の細胞外放出は、刺激された免疫細胞、および損傷され、死滅したかまたはストレスを受けた細胞から生じる。ＮＬＲファミリーピリンドメイン含有３（ＮＬＲＰ３）インフラマソームは、ＡＴＰのこの細胞外放出によって刺激されたときに、カスパーゼ－１を活性化し、サイトカインＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の分泌をもたらし、自然および適応免疫応答を活性化する（Stagg and Smyth (2010) Oncogene 29:5346-5358）。ＡＴＰは、酵素ＣＤ３９およびＣＤ７３によってアデノシンへ異化される。活性化されたアデノシンは、ネガティブフィードバック機序を介した高免疫抑制性代謝産物として作用し、低酸素の腫瘍微小環境において複数の免疫細胞タイプに対して多面的な効果を有する（Stagg and Smyth (2010) Oncogene 29:5346-5358）。アデノシン受容体Ａ２ＡおよびＡ２Ｂは、様々な免疫細胞上に発現され、アデノシンによって刺激され、ｃＡＭＰ介在性シグナル伝達変化を促進し、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、肥満細胞、マクロファージ、好中球、およびＮＫＴ細胞の免疫抑制性表現型をもたらす。この結果として、アデノシンレベルは、それらの通常濃度の１００倍を超えて固形腫瘍等の病理学的組織中に蓄積することができ、ＣＤ７３等のエクトヌクレオチダーゼを過剰発現させることが示されている。アデノシンは、腫瘍の血管新生および進行を促進することも示されている。したがって、アデノシン栄養要求性である遺伝子操作された細菌は、強化された腫瘍標的化および定着を示すことになる。

サルモネラ・ティフィ等の免疫刺激性細菌は、ｔｓｘ遺伝子の欠失によって（Bucarey et al. (2005) Infection and Immunity 73(10):6210-6219）またはｐｕｒＤの欠失によって（Husseiny (2005) Infection and Immunity 73(3):1598-1605）アデノシン栄養要求性にすることができる。グラム陰性細菌キサントモナス・オリザエ（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ ｏｒｙｚａｅ）では、ｐｕｒＤ遺伝子ノックアウトはアデノシン栄養要求性となることが示された（Park et al. (2007) FEMS Microbiol Lett 276:55-59）。本明細書において例示されるように、Ｓ．ティフィムリウム菌株ＶＮＰ２０００９は、そのｐｕｒＩ欠失のためにアデノシン栄養要求性であり、そのため、アデノシン栄養要求性にするための更なる改変は必須ではない。したがって、本明細書において提供する免疫刺激性細菌菌株の実施形態は、アデノシン栄養要求性である。このような栄養要求性細菌は、腫瘍微小環境において選択的に複製し、腫瘍において投与された細菌の蓄積および複製を更に増加させ、腫瘍の中および周囲のアデノシンレベルを低下させ、その結果、アデノシンの蓄積によって引き起こされる免疫抑制を減少または除去する。本明細書において提供されるそのような細菌の例示的なものは、アデノシン栄養要求性を提供するためのｐｕｒＩ－／ｍｓｂＢ－突然変異を含むＳ．ティフィムリウムの改変菌株である。

ｃ．フラジェリン欠損菌株
鞭毛は、細菌の表面上にある小器官であり、フックを介して回転モーターへ結合された長いフィラメントから構成され、そのモーターは、時計回りまたは反時計回りの様式で回転し、移動するための手段を提供することができる。Ｓ．ティフィムリウムにおける鞭毛は、胃腸管内の粘膜層全体での運動性を媒介するための能力に起因して、走化性のため、かつ経口経路を介した感染を確立するために重要である。鞭毛は、インビトロでの円柱腫瘍への走化性およびそこへの定着に必須であることが実証され（Kasinskas and Forbes (2007) Cancer Res. 67(7):3201-3209）、運動性は、腫瘍貫通のために重要であることが示されているが（Toley and Forbes (2012) Integr Biol (Camb). 4(2):165-176）、鞭毛は、細菌が静脈内で投与された場合に、動物における腫瘍定着に必須ではない（Stritzker et al. (2010) International Journal of Medical Microbiology 300:449-456）。各鞭毛フィラメントは、何万ものフラジェリンサブユニットからなる。Ｓ．ティフィムリウム染色体は、２つの遺伝子、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢを含み、これらは抗原的に異なるフラジェリンモノマーをコードする。ｆｌｉＣとｆｌｊＢの両方が欠陥している突然変異体は、感染の経口経路を介して投与したときに非運動性およびビルレントであるが、非経口で投与したときにビルレンスを維持する。

フラジェリンは、サルモネラ属の主要な炎症促進性決定基であり（Zeng et al. (2003) J Immunol 171:3668-3674）、細胞の表面上にあるＴＬＲ５によって、および細胞質ゾル中のＮＬＣＲ４によって直接認識される（Lightfield et al. (2008) Nat Immunol. 9(10):1171-1178）。両方の経路が炎症促進性の応答をもたらし、結果として、ＩＬ－１β、ＩＬ－１８、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－６を含むサイトカインが分泌される。フラジェリンによってコードされるｆｌｉＣおよびｆｌｊＢよりも大きな炎症を誘導するビブリオ・ブルニフィカス フラジェリンＢを分泌するように細菌を遺伝子操作することでフラジェリンに対する炎症促進性応答を増加させることによって、より強力なサルモネラ属ベースのがん免疫療法を作製するための試みが行われている（Zheng et al. (2017) Sci. Transl. Med. 9(376):eaak9537）。

これを考慮すると、サルモネラ属細菌Ｓ．ティフィムリウムは、フラジェリンサブユニットｆｌｉＣとｆｌｊＢの両方が無いように遺伝子操作され、炎症促進性シグナル伝達を減少させる。例えば、本明細書において示すように、ＴＮＦ－アルファ誘導の減少をもたらすｍｓｂＢが無いサルモネラ属菌株は、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢノックアウトと組み合わせる。これは、ＴＮＦ－アルファ誘導における減少およびＴＬＲ５認識における減少の組合せを有するサルモネラ属菌株をもたらす。これらの改変は、ｍｓｂＢ－、ｆｌｉＣ－およびｆｌｊＢ－と組み合わされ、ＣｐＧ、また、ｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ等の阻害性ＲＮＡｉ分子（複数可）を含んでいてもよい免疫刺激性プラスミドを用いて形質転換され、ＴＲＥＸ１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＲＰ－アルファ、ＴＧＦ－ベータ、ベータ－カテニン、ＶＥＧＦ、およびこれらの組合せ等の免疫チェックポイントを標的とすることができる。得られた細菌は、炎症促進性シグナル伝達が減少されているが、頑強な抗腫瘍活性を有する。

例えば、本明細書において提供する、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ二重突然変異体は、Ｓ．ティフィムリウム ＶＮＰ２０００９のａｓｄ欠失菌株で構築した。ｐｕｒＩ／ｐｕｒＭを破壊することによってビルレンスが弱毒化されたＶＮＰ２０００９も、野生型脂質Ａよりも毒素産生性が低い脂質Ａサブユニットの産生をもたらすｍｓｂＢ欠失を含むように遺伝子操作された。これは、野生型脂質Ａを有する菌株と比較して、静脈内投与後にマウスモデルにおいてＴＮＦ－α産生の減少をもたらす。得られた菌株は、ＴＬＲ２／４シグナル伝達を減少させるように脂質Ａを改変し、ＴＬＲ５認識およびインフラマソーム誘導を減少させるためにフラジェリンサブユニットを欠失することによって、細菌性炎症が弱毒化された菌株の例示的なものである。ＬＰＳの改変と組み合わせたフラジェリンサブユニットの欠失は、宿主内での優れた忍容性を可能にし、かつ抗腫瘍応答を誘導し、腫瘍に対する適応免疫応答を促進するＴＭＥにおける所望の標的に対するＲＮＡ干渉のデリバリーに対して免疫刺激応答を指示する。

ｄ．サルモネラ属含有液胞（ＳＣＶ）を逃避するように遺伝子操作されたサルモネラ属
Ｓ．ティフィムリウム等のサルモネラ属は、サルモネラ属含有液胞（ＳＣＶ）と称される膜結合性コンパートメントにおいて主に複製する細胞内病原体である。一部の上皮細胞株においてかつ低頻度で、Ｓ．ティフィムリウムは細胞質ゾルへ逃避し、複製できることが示されてきた。ＳＣＶの脂質二重層が潜在的な障壁であるため、高い効率でＳＣＶを逃避するように遺伝子操作されたサルモネラ属は、プラスミド等の高分子のデリバリーにおいてより効率的であろう。ＳＣＶからの逃避の頻度が強化されたサルモネラ属および方法が本明細書において提供される。これは、フィラメント（ＳＩＦ）形成を誘導されるサルモネラ属に必須の遺伝子を欠失することによって達成される。これらの突然変異体は、ＳＣＶからの逃避の頻度が増加され、細胞質ゾルにおいて複製することができる。

例えば、Ｓ．ティフィムリウムのｓｉｆＡ突然変異体を使用した、強化されたプラスミドデリバリーが実証されている。ｓｉｆＡ遺伝子は、宿主ＧＴＰａｓｅｓのＲｈｏＡファミリーを模倣するかまたは活性化するＳＰＩ－２、Ｔ３ＳＳ－２分泌エフェクタータンパク質をコードする（Ohlson et al. (2008) Cell Host & Microbe 4:434-446）。ＳＩＦ形成に関与する分泌エフェクターをコードする他の遺伝子を標的とすることができる。これらとしては、例えば、ｓｓｅＪ、ｓｓｅＬ、ｓｏｐＤ２、ｐｉｐＢ２、ｓｓｅＦ、ｓｓｅＧ、ｓｐｖＢ、およびｓｔｅＡがある。ＳＩＦ形成を阻止することによってＳ．ティフィムリウムの逃避を強化すると、生存細菌が細胞質ゾル中に放出され、そこで複製することができる。

ＳＣＶからＳ．ティフィムリウムの逃避を強化し、プラスミド等の高分子のデリバリーを増加させるための別の方法は、ＳＣＶ膜における孔形成またはＳＣＶ膜の破壊をもたらす異種溶血素を発現することである。１つのそのような溶血素は、ｈｌｙＡ遺伝子によってコードされる、リステリア・モノサイトゲネスからのリステリオリジンＯタンパク質（ＬＬＯ）である。ＬＬＯは、Ｌ．モノサイトゲネス遺伝子から分泌され、食作用からの逃避および宿主細胞の細胞質ゾルへの侵入の主に原因となるコレステロール依存性孔形成細胞溶解素である。Ｓ．ティフィムリウムからのＬＬＯの分泌は、細菌の逃避をもたらし、かつ細胞質ゾルにおける複製をもたらすことができる。無傷Ｓ．ティフィムリウムが、ＳＣＶから逃避し、細胞質ゾルにおいて複製するのを阻止するために、シグナル配列をコードするヌクレオチドを遺伝子から除去することができる。このように、活性ＬＬＯは、Ｓ．ティフィムリウムの細胞質内に含まれ、細菌が溶解したときのみＬＬＯが放出される。本明細書において提供する、ｃｙｔｏＬＬＯを発現し、ＴＲＥＸ１等の標的に対する干渉ＲＮＡを発現するためのプラスミドのデリバリーを強化するように操作されたＶＮＰ２０００９は、免疫刺激性細菌の治療的潜在力を高めることができる。

ｅ．サルモネラ属遺伝子におけるバイオフィルム形成に必要な欠失
細菌および真菌は、バイオフィルムと称される多細胞構造体を形成することができる。細菌性バイオフィルムは、分泌された細胞壁関連のポリサッカライド、糖タンパク質、および糖脂質、ならびに、細胞外高分子物質と総称される細胞外ＤＮＡの混合物に内包される。これらの細胞外高分子物質は、細菌を、洗浄剤、抗生物質、および抗菌ペプチド等の複数の傷害から保護する。細菌性バイオフィルムは、表面に定着し、インジェクションポートおよびカテーテル等の人工器官の顕著な感染の原因である。バイオフィルムは、感染の進行中の組織において形成し、細菌存続およびシェディングの持続を増加させ、抗生物質療法の有効性を制限する場合もある。バイオフィルムにおける細菌の慢性的な存続は、例えば胆嚢のＳ．ティフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）感染における腫瘍形成の増加と関連する（Di Domenico et al. (2017) Int. J. Mol. Sci. 18:1887）。

Ｓ．ティフィムリウムバイオフィルム形成は、ＣｓｇＤによって調節される。ＣｓｇＤはｃｓｇＢＡＣオペロンを活性化し、ｃｕｒｌｉ線毛サブユニットＣｓｇＡおよびＣｓｇＢの産生を増加させる（Zakikhani et al. (2010) Molecular Microbiology 77(3):771-786）。ＣｓｇＡは、ＴＬＲ２によってＰＡＭＰとして認識され、ヒトマクロファージからＩＬ－８の産生を誘導する（Tukel et al. (2005) Molecular Microbiology 58(1):289-304）。更に、ＣｓｇＤは、ジグアニル酸シクラーゼをコードするａｄｒＡ遺伝子を活性化することによってセルロース産生を間接的に増加させる。ＡｄｒＡによって産生される小分子サイクリックジ－グアノシンモノホスフェート（ｃ－ｄｉ－ＧＭＰ）は、ほぼ全ての細菌菌種において認められる遍在性の二次メッセンジャーである。ｃ－ｄｉ－ＧＭＰにおけるＡｄｒＡ介在性の増加は、セルロースシンテターゼ遺伝子ｂｃｓＡの発現を強化し、次にｂｃｓＡＢＺＣおよびｂｃｓＥＦＧオペロンの刺激を介したセルロース産生を増加させる。バイオフィルムを形成するためのＳ．ティフィムリウム等の免疫刺激性細菌の能力における減少は、例えば、ｃｓｇＤ、ｃｓｇＡ、ｃｓｇＢ、ａｄｒＡ、ｂｃｓＡ、ｂｃｓＢ、ｂｃｓＺ、ｂｃｓＥ、ｂｃｓＦ、ｂｃｓＧ、ｄｓｂＡまたはｄｓｂＢ等のバイオフィルム形成に関与する遺伝子の欠失を介して達成することができる（Anwar et al. (2014) Plos One 9(8):e106095）。

Ｓ．ティフィムリウムは、宿主免疫細胞による食作用に対する防護として、固形腫瘍においてバイオフィルムを形成することができる。バイオフィルムを形成することができないサルモネラ属突然変異体は、宿主食細胞によってより急速に取り込まれ、感染腫瘍から除去される（Crull et al.(2011)Cellular Microbiology 13(8):1223-1233）。食細胞内の細胞内局在化におけるこの増加は、細胞外細菌の存続を減少することができ、プラスミドデリバリーの有効性を強化し、本明細書において記載するＲＮＡ干渉によって遺伝子をノックダウンする。バイオフィルム形成を減少させるために遺伝子操作された免疫刺激性細菌は、腫瘍／組織からのクリアランス率を増加させることになり、したがって治療法の忍容性を増加させ、患者における人工器官の定着を阻止することになり、その結果、これらの菌株の治療的利点を高める。アデノシンミメティックは、Ｓ．ティフィムリウムバイオフィルム形成を阻害することができ、腫瘍微小環境における高アデノシン濃度は、腫瘍関連バイオフィルム形成の一因となり得ることを示す（Koopman et al. (2015) Antimicrob Agents Chemother 59:76 -84）。ｐｕｒＩ破壊を含み（したがって、アデノシン富化腫瘍に定着する）、また、バイオフィルム形成に必須の１つまたは複数の遺伝子の欠失によってバイオフィルム形成が阻止された、Ｓ．ティフィムリウム等の本明細書において提供する生存弱毒化細菌の菌株は、頑強な抗腫瘍免疫応答を刺激する干渉ＲＮＡをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子操作される。

ａｄｒＡ遺伝子は、Ｓ．ティフィムリウムバイオフィルム形成に必須のｃ－ｄｉ－ＧＭＰを生成するジグアニル酸シクラーゼをコードする。ｃ－ｄｉ－ＧＭＰは、宿主細胞質ゾルタンパク質ＳＴＩＮＧに対するアゴニストに結合し、かつアゴニストである。上述のようなＳＴＩＮＧアゴニストは、抗がん処置のワクチンアジュバントとして追究され、細菌が、免疫療法において使用するためのサイクリックジ－ヌクレオチドを分泌するように遺伝子操作された（Libanova 2012, Synlogic 2018 AACR poster）。ａｄｒＡの欠失を介したｃ－ｄｉ－ＧＭＰ産生において減少される免疫刺激性細菌は、反直感的であると思われるが、バイオフィルムを形成することができないＳ．ティフィムリウム突然変異体（ａｄｒＡ突然変異体を含む）等の細菌突然変異体は、マウス腫瘍モデルにおいて治療可能性が低いことが実証されている（Crull et al. (2011) Cellular Microbiology 13(8):1223-1233）。更に、ＳＴＩＮＧのうちのいくつかのヒト対立遺伝子は、細菌産生３’３’ＣＤＮ結合に対して無反応性である（Corrales et al. (2015) Cell Reports 11:1022-1023）。

アデノシン栄養要求性となるように遺伝子操作され、ＬＰＳの改変および／またはフラジェリンの欠失および／またはバイオフィルム形成に必須の遺伝子の欠失によって炎症促進性サイトカインを誘導するそれらの能力が減少され、干渉ＲＮＡをデリバリーするように更に改変された、Ｓ．ティフィムリウム菌株等の本明細書において記載する細菌菌株は、頑強な抗腫瘍免疫応答を促進する。

ｆ．ＬＰＳ生合成経路中の遺伝子における欠失
グラム陰性細菌のＬＰＳは、細菌膜の外葉の主要な構成成分である。それは、３つの主要な部分である脂質Ａ、非反復コアオリゴサッカライド、およびＯ抗原（またはＯポリサッカライド）からなる。Ｏ抗原は、ＬＰＳ上の最も外側の部分であり、細菌透過性に対する防御層としての役割を果たすが、Ｏ抗原の糖組成は、菌株間で広範囲に異なる。脂質Ａおよびコアオリゴサッカライドは非常に少なく、より典型的には、同じ菌種の菌株内に保存される。脂質Ａは、エンドトキシン活性を含むＬＰＳの一部である。それは、典型的には、複数の脂肪酸で修飾されるジサッカライドである。これらの疎水性脂肪酸鎖は、ＬＰＳを細菌膜へ固定し、残りのＬＰＳは細胞表面から突出する。脂質Ａドメインは、グラム陰性細菌の毒性の多くの原因となる。典型的には、血液中のＬＰＳは、深刻な病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として認識され、重度の炎症促進性応答を誘導する。ＬＰＳは、ＣＤ１４、ＭＤ２およびＴＬＲ４を含む膜結合受容体複合体のためのリガンドである。ＴＬＲ４は、輸送膜タンパク質ＮＦκＢ経路を刺激するためのＭｙＤ８８およびＴＲＩＦ経路を介してシグナルを送ることができ、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１β等の炎症促進性サイトカインの産生をもたらし、内毒素性ショックとなることがある結果、命にかかわる場合がある。哺乳動物細胞の細胞質ゾル中のＬＰＳは、カスパーゼ４、５、および１１のＣＡＲＤドメインに直接結合し、自己活性化およびパイロトーシス細胞死を引き起こすことがある（Hagar et al. (2015) Cell Research 25:149-150）。脂質Ａの組成および脂質Ａ変異体の毒素産生性は十分に立証されている。例えば、モノリン酸化された脂質Ａは、複数のホスフェート基を有する脂質Ａよりも炎症性が低い。脂質Ａ上のアシル鎖の数および長さも、毒性の程度に深刻な影響を与える場合がある。Ｅ．コリからの標準的な脂質Ａは、６個のアシル鎖を有し、このヘキサアシル化は、強力な毒性である。Ｓ．ティフィムリウム脂質Ａは、Ｅ．コリのものと同様であり；それは４つの第一級および２つの第二級ヒドロキシアシル鎖を保有するグルコサミンジサッカライドである（Raetz and Whitfield (2002) Annu Rev Biochem. 71:635-700）。上述のようなＳ．ティフィムリウムのｍｓｂＢ突然変異体は、そのＬＰＳに末端ミリストイル化を受けることができず、ヘキサアシル化脂質Ａよりも顕著に毒性が低いペンタアシル化ＬＰＳを主に生成する。パルミテートを用いた脂質Ａの改変は、パルミトイル転写酵素（ＰａｇＰ）によって触媒される。ｐａｇＰ遺伝子の転写は、例えば、ＳＣＶ内部で低濃度のマグネシウムによって活性されるＰｈｏＰ／ＰｈｏＱ系の制御下である。したがって、Ｓ．ティフィムリウムのアシル含有量は可変であり、野生型細菌の場合、ヘキサまたはペンタアシル化とすることができる。その脂質ＡをパルミテートするためのＳ．ティフィムリウムの能力は、ファゴリソソームへ分泌される抗菌ペプチドに対する抵抗性を増加させる。

野生型Ｓ．ティフィムリウムでは、ｐａｇＰの発現は、ヘプタアシル化された脂質Ａをもたらす。ｍｓｂＢ突然変異体（脂質Ａの末端アシル鎖を加えることができない）では、ｐａｇＰの誘導によって、ヘキサアシル化ＬＰＳがもたらされる（Kong et al. (2011) Infection and Immunity 79(12):5027-5038）。ヘキサアシル化ＬＰＳは、最も炎症促進性であることが示されている。他の基は、例えば、ｐａｇＰを欠失させ、ヘキサアシル化ＬＰＳのみが産生されるようにすることによって、この炎症促進性シグナルを利用することを求められているが（Felgner et al. (2016) Gut Microbes 7(2):171-177；Felgner et al. (2018) Oncommunelogy 7(2): e1382791）、これは、ＬＰＳのＴＮＦ－α介在性炎症促進性性質、および逆説的ではあるが適応免疫が少ないことに起因して不十分な忍容性につながることがある（Kocijancic et al. (2017) Oncotarget 8(30):49988-50001）。本明細書において提供されるものは、ペンタアシル化ＬＰＳのみを産生するＳ．ティフィムリウムの生存弱毒化菌株であり、ｍｓｂＢ遺伝子の欠失（上述のような脂質Ａの末端ミリストイル化を阻止する）を含み、ｐａｇＰの欠失（パルミトイル化を阻止する）によって更に改変される。ＴＲＥＸ１等の免疫チェックポイントに対する干渉ＲＮＡを発現するように更に改変された場合に、ペンタアシル化ＬＰＳを産生するように改変された菌株は、炎症促進性サイトカインのレベルを低下させ、抗菌ペプチドに対する感受性を高め、忍容性を強化し、抗腫瘍免疫を増加させることになる。

ｇ．ＳＰＩ－１遺伝子の欠失
上述のように、Ｓ．ティフィムリウム等のサルモネラ属菌種では、病態形成は、サルモネラ属病原性アイランド（ＳＰＩ）と称される遺伝子のクラスターに関与する。ＳＰＩ－１は、上皮細胞の侵入を介在する。ＳＰＩ－１は、宿主細胞の細胞質ゾル中へエフェクタータンパク質がトランスロケーションすることに寄与する３型分泌装置（Ｔ３ＳＳ）をコードし、サルモネラ属の取り込みをもたらすアクチンをもたらす場合がある。ＳＰＩ－１Ｔ３ＳＳは、消化管上皮層を横断するのに必須であるが、細菌が非経口で注射された場合は、感染に重要ではない。一部のタンパク質の注入およびニードル複合体自体も、インフラマソーム活性化および食細胞のパイロトーシスを誘導することができる。この炎症促進性細胞死は、抗原－提示細胞（ＡＰＣ）死を直接誘導することによって頑強な適応免疫応答の開始を制限し、ならびにサイトカイン環境を改変し、メモリーＴ細胞の生成を阻止することができる。ＳＰＩ－１遺伝子は、いくつかのオペロンを含み、それらとしてはｓｉｔＡＢＣＤ、ｓｐｒＢ、ａｖｒＡ、ｈｉｌＣ、ｏｒｇＡＢＣ、ｐｒｇＫＪＩＨ、ｈｉｌＤ、ｈｉｌＡ、ｉａｇＢ、ｓｐｔＰ、ｓｉｃＣ、ｉａｃＰ、ｓｉｐＡＤＣＢ、ｓｉｃＡ、ｓｐａＯＰＱＲＳ、ｉｎｖＦＧＥＡＢＣＩＪ、およびｉｎｖＨがある。

本明細書において例示される、ｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失、ａｓｄ遺伝子欠失を含み、干渉ＲＮＡをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子操作されたＳ．ティフィムリウムの生存弱毒化菌株は、ＳＰＩ－１遺伝子を欠失するように更に改変される。例えば、ＳＰＩ－１関連３型分泌装置（Ｔ３ＳＳ－１）の発現に必須の調節遺伝子（例えば、ｈｉｌＡまたはｉｎｖＦ）の欠失、Ｔ３ＳＳ－１構造的遺伝子（例えば、ｉｎｖＧまたはｐｒｇＨ）、またはＴ３ＳＳ－１エフェクター遺伝子（例えば、ｓｉｐＡまたはａｖｒＡ）である。この分泌装置は、エフェクタータンパク質を、細菌の取り込みをもたらす上皮細胞等の宿主非食細胞の細胞質ゾル中に注入することに関与する。この例では、静脈内または腫瘍内のいずれかで投与される治療用サルモネラ・ティフィムリウム菌株からのｈｉｌＡ遺伝子の追加の欠失によって、Ｓ．ティフィムリウム感染を、取り込みのためにＳＰＩ－１Ｔ３ＳＳを必要としない食細胞に集中させ、これらの食細胞の寿命を延長する。ｈｉｌＡ突然変異はまた、炎症促進性サイトカインの量を減少させ、治療法の忍容性、ならびに適応免疫応答の質を増加させる。

ｈ．プラスミドデリバリーを増加させるためのエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄＡ）突然変異
ｅｎｄＡ遺伝子（例えば、配列番号２５０）は、グラム陰性細菌のペリプラズムにおける二本鎖ＤＮＡの分解を介在するエンドヌクレアーゼ（例えば、配列番号２５１）をコードする。ｅｎｄＡ遺伝子の突然変異は、高収率のプラスミドＤＮＡを可能にするため、実験用Ｅ．コリの最も一般的な菌株はｅｎｄＡ－である。この遺伝子は菌種と一緒に保存される。無傷プラスミドＤＮＡデリバリーを促進するために、遺伝子操作された免疫刺激性細菌のｅｎｄＡ遺伝子を欠失または突然変異させ、そのエンドヌクレアーゼ活性を阻止する。そのような突然変異の例示的なものは、Ｅ２０８Ｋアミノ酸置換（Durfee、et al. (2008) J. Bacteriol. 190(7):2597-2606）または目的の菌種に対応する突然変異である。Ｅ２０８を含むｅｎｄＡは、サルモネラ属を含む細菌菌種と一緒に保存される。したがって、Ｅ２０８Ｋ突然変異を使用し、サルモネラ属菌種を含む他の菌種においてエンドヌクレアーゼ活性を削除することができる。当業者であれば、ｅｎｄＡ活性を削除するために、他の突然変異または欠失を導入することができる。サルモネラ属等、本明細書における免疫刺激性細菌においてｅｎｄＡの活性を削除するために、遺伝子にこの突然変異または欠失または破壊を行うと、無傷プラスミドＤＮＡデリバリーの効率を増加させ、その結果、ｓｈＲＮＡおよび／またはｍｉＲＮＡ等のＲＮＡの発現を増加させ、プラスミドにおいてコードされる免疫チェックポイントのうちのいずれかまたは２つ以上を標的とし、その結果、チェックポイント遺伝子のＲＮＡｉ－介在性ノックダウンを増加させ、抗腫瘍有効性を強化する。

ｉ．ＲＩＧ－Ｉ阻害
ＴＬＲ非依存性Ｉ型ＩＦＮ経路のうちの１つは、細胞質ゾルにおける一本鎖ストランド（ｓｓ）および二本鎖ストランド（ｄｓ）ＲＮＡの宿主認識によって介在される。これらは、ＲＮＡヘリカーゼによって感知され、これらとしては、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、黒色腫分化関連遺伝子５（ＭＤＡ－５）があり、ＩＲＦ－３転写因子のＩＦＮ－βプロモーター刺激因子１（ＩＰＳ－１）アダプタータンパク質介在性リン酸化を介して、Ｉ型ＩＦＮの誘導を引き起こす（Ireton and Gale (2011) Viruses 3(6):906-919）。ＲＩＧ－Ｉは、５’－トリホスフェートを有するｄｓＲＮＡおよびｓｓＲＮＡを認識する。この部分は、ＲＩＧ－Ｉに直接結合するか、またはポリＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によってポリ（ｄＡ－ｄＴ）鋳型から合成することができる（Chiu, Y. H. et al. (2009) Cell 138(3):576-91）。２つのＡＡジヌクレオチド配列を含むポリ（ｄＡ－ｄＴ）鋳型は、一般的なレンチウイルスｓｈＲＮＡクローニングベクター中のＵ６プロモーター転写開始部位において生じる。その後のプラスミドにおけるその欠失は、Ｉ型ＩＦＮ活性化を阻止する（Pebernard et al. (2004) Differentiation. 72:103-111）。ＲＩＧ－Ｉ結合配列は、本明細書において提供されるプラスミドに含むことができ；含有していると、本明細書における免疫刺激性細菌の抗腫瘍活性を増加させる免疫刺激を増加することができる。

ｊ．ＤＮａｓｅ ＩＩ阻害
外来および自己ＤＮＡ分解の原因となる別のヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼであるＤＮａｓｅ ＩＩであり、これはエンドソームのコンパートメント中に常在し、アポトーシス後のＤＮＡを分解する。ＤＮａｓｅ ＩＩ（マウスにおけるＤｎａｓｅ２ａ）が無いと、細胞質ゾルへ逃避し、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧシグナル伝達を活性化するエンドソームＤＮＡの蓄積をもたらす（Lan YY et al. (2014) Cell Rep. 9(1):180-192）。ＴＲＥＸ１と同様に、ヒトにおけるＤＮａｓｅ ＩＩ－欠乏は、自己免疫Ｉ型インターフェロン症を示す。がんでは、腫瘍常在性マクロファージによって取り込まれた死滅腫瘍細胞は、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ活性化およびエンドソームコンパートメント内のＤＮＡのＤＮａｓｅ ＩＩ消化を介した潜在的な自己免疫を阻止する（Ahn et al. (2018) Cancer Cell 33:862-873）。したがって、本明細書において提供する免疫刺激性細菌菌株の実施形態は、ＤＮａｓｅ ＩＩの発現を阻害するか、抑制するか、または遮断し、腫瘍微小環境においてＤＮａｓｅ ＩＩを阻害することができるｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ等のＲＮＡｉをコードし、その結果、細胞質ゾルにおいてエンドサイトーシスされたアポトーシス腫瘍ＤＮＡの蓄積をもたらし、強力なｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧアゴニストとして作用することができる。

ｋ．ＲＮａｓｅ Ｈ２阻害
ＴＲＥＸ１およびＤＮａｓｅ ＩＩは、異常なＤＮＡ蓄積を除去するために機能するが、ＲＮａｓｅ Ｈ２は、細胞質ゾルにおいてＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドの病原性の蓄積を削除するために同様に機能する。ＴＲＥＸ１と同様に、ＲＮａｓｅ Ｈ２の不足は、エカルディグティエール症候群の自己免疫表現型の一因にもなる（Rabe、B. (2013) J Mol Med. 91:1235-1240）。特に、ＲＮａｓｅ Ｈ２の損失およびＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドまたはゲノム埋込リボヌクレオチド基質のその後の蓄積は、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧシグナル伝達を活性化することを示している（MacKenzie et al. (2016) EMBO J. Apr15；35(8):831-44）。したがって、本明細書において提供する免疫刺激性細菌菌株の実施形態は、ＲＮＡｓｅ Ｈ２の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ等のＲＮＡｉをコードし、その結果ＲＮａｓｅ Ｈ２を阻害し、腫瘍由来ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドおよびこれらの誘導体をもたらし、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧシグナル伝達および抗腫瘍免疫を活性化する。

ｌ．スタビリン－１／ＣＬＥＶＥＲ－１阻害
最初に単球上で発現され、免疫調節することに関与する別の分子は、スタビリン－１（遺伝子名ＳＴＡＢ１、ＣＬＥＶＥＲ－１、ＦＥＥＬ－１としても公知である）である。スタビリン－１は、炎症後に内皮細胞およびマクロファージ上で、特に腫瘍関連マクロファージ上で上方調節されるＩ型輸送膜タンパク質である（Kzhyshkowska et al. (2006) J. cell. Mol. Med. 10(3):635-649）。炎症が活性化した場合に、スタビリン－１はスカベンジャーとして作用し、創傷治癒およびアポトーシス小体クリアランスを助け、肝線維症等の組織損傷を阻止することができる（Rantakari et al. (2016) PNAS 113(33):9298-9303）。スタビリン－１の上方調節は、抗原特異的Ｔ細胞応答を直接阻害し、単球におけるｓｉＲＮＡによるノックダウンは、それらの炎症促進性機能を強化することが示された（Palani、S. et al. (2016) J Immunol.196:115-123）。したがって、本明細書において提供する免疫刺激性細菌菌株の実施形態は、腫瘍微小環境においてスタビリン－１／ＣＬＥＶＥＲ－１の発現を阻害するか、抑制するか、または遮断するｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ等のＲＮＡｉをコードし、その結果腫瘍常在性マクロファージの炎症促進性機能を強化する。

ｍ．細菌培養条件
細菌のための培養条件は、それらの遺伝子発現に影響を与える場合がある。Ｓ．ティフィムリウムは、ＳＰＩ－１およびその関連するＴ３ＳＳ－１を含む機序により、感染して３０～６０分以内にマクロファージの急速な炎症促進性カスパーゼ依存性細胞死を誘導することができるが、上皮細胞は誘導しないことが報告されている（Lundberg et. al (1999) Journal of Bacteriology 181(11):3433-3437）。この細胞死は、その後、ＩＬ－１βおよびＩＬ－１８の成熟および放出を促進し、パイロトーシスと称される細胞死の新規な形態を開始する、カスパーゼ－１を活性化するインフラマソームの活性化によって介在されることは、現在公知である（Broz and Monack (2011) Immunol Rev. 243(1):174-190）。このパイロトーシス活性は、対数期細菌を使用することによって誘導することができ、一方、静止期細菌は、マクロファージにおいてこの急速な細胞死を誘導しない。ＳＰＩ－１遺伝子は、対数期成長中に誘導される。したがって、静止期において治療上使用することになるＳ．ティフィムリウムを採取することによって、マクロファージの急速なパイロトーシスを阻止することができる。マクロファージは、自然免疫系の重要なメディエーターであり、これらは適切な抗腫瘍応答を確立するのに重要であるサイトカインを分泌するように作用することができる。更に、ＩＬ－１βおよびＩＬ－１８等の炎症促進性サイトカイン分泌を制限すると、投与されたＳ．ティフィムリウム療法の忍容性が改善するであろう。本明細書において提供する、静止期において採取される免疫刺激性Ｓ．ティフィムリウムは、抗腫瘍応答を誘導するために使用されるであろう。

Ｅ．例示的プラスミドの構築
本明細書において提供される免疫刺激性細菌は改変されている。それらは、細菌性ゲノムおよび細菌性遺伝子を発現するような改変を含み、また、細菌性プロモーターを含むことによって細菌中に、または適切な真核生物プロモーターおよび必要に応じて他の調節性領域を含むことによって宿主内に発現される産物をコードするプラスミドを含む。

プラスミドを導入するために、細菌は、所定の分子生物学的ツールを用いて構築された精製ＤＮＡプラスミドを用いたエレクトロポレーション等の標準的な方法（ＤＮＡ合成、ＰＣＲ増幅、ＤＮＡ制限酵素による消化、および適合する付着末端フラグメントとリガーゼとのライゲーション）を使用して形質転換される。

以下で検討されるように、プラスミドは、１つまたは複数のショートヘアピン型（ｓｈ）ＲＮＡコンストラクト（複数可）、または他の阻害性ＲＮＡモダリティをコードし、その発現は、標的とする遺伝子の発現を阻害するかまたは遮断する。ｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ等のＲＮＡｉコンストラクトは、ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）ＩＩまたはＩＩＩプロモーター等の真核生物プロモーターの制御下で発現される。典型的には、ＲＮＡＰ ＩＩＩ（ＰＯＬＩＩＩとも称される）プロモーターは構成的であり、ＲＮＡＰ ＩＩ（ＰＯＬＩＩとも称される）は調節される場合がある。一部の例では、ｓｈＲＮＡは遺伝子ＴＲＥＸ１を標的とし、その発現を阻害する。一部の実施形態では、プラスミドは、ＰＤ－Ｌ１、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＲＰα、ＣＴＮＮＢ１、ＴＧＦ－ベータ、および／またはＶＥＧＦ、および当業者であれば公知のその他のものを阻害するためのｓｈＲＮＡ等の２つ以上のチェックポイント遺伝子を阻害することを標的とする複数のｓｈＲＮＡをコードする。ｓｈＲＮＡ等の複数のＲＮＡｉがコードされる場合、各発現は、異なるプロモーターの制御下にある。

本明細書において提供する、Ｓ．ティフィムリウムを含むサルモネラ属の菌株等の細菌菌株は、腫瘍微小環境においてアデノシン栄養要求性であるように、かつＴＲＥＸ１、ＰＤ－Ｌ１、ＶＩＳＴＡ、ＳＩＲＰ－アルファ、ベータ－カテニン、ＴＧＦ－ベータおよびＶＥＧＦの遺伝子発現をノックダウンすることができるｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡをコードする遺伝子を含むプラスミドを保有するように改変されるかまたは同定される。Ｓ．ティフィムリウムは、腫瘍細胞とマクロファージの両方を含む複数の細胞タイプに感染することができる。Ｓ．ティフィムリウムに感染した細胞に関しては、プラスミドが放出され、ＲＮＡポリメラーゼによって転写することができる。その後産生されたｓｈＲＮＡは、プロセシングされ、標的ｍＲＮＡ遺伝子の発現に干渉することができる。

１．干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）
本明細書におけるプラスミドは、チェックポイントおよび上述のような他の目的の標的を標的とするＲＮＡｉ核酸をコードする。ＲＮＡｉとしては、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびマイクロＲＮＡがある。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的遺伝子と相同の配列を有する短い合成ｄｓＲＮＡ分子である低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を使用して真核細胞における遺伝子発現の配列選択的抑制を可能にする。ＲＮＡｉ技術は、疾患関連転写を枯渇するための強力なツールを提供する。

ａ．ｓｈＲＮＡ
典型的には、約１９～２９塩基対長であるｓｉＲＮＡは、特異的な宿主ｍＲＮＡ配列を分解し、それらの各タンパク質産物への翻訳を不可能にし、標的とする遺伝子の発現を効果的にサイレンシングすることによって機能する。タイトなヘアピンループを含むショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡｉにおいて広範囲に使用される。ｓｈＲＮＡは、４～１５ヌクレオチドのループスペーサーによって連結された各１９～２９ｂｐｓ長の２つの相補的ＲＮＡ配列を含む。標的遺伝子配列相補的である（したがってｍＲＮＡ配列と同一である）ＲＮＡ配列は、「センス」ストランドとして公知であり、同時にｍＲＮＡに相補的である（および標的遺伝子配列と同一である）ストランドは、「アンチセンス」または「ガイド」ストランドとして公知である。ｓｈＲＮＡ転写は、ｓｉＲＮＡ二本鎖へのダイサーとして公知のＲＮａｓｅ ＩＩＩ酵素によってプロセシングされる。次いで産物は、アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質および他のＲＮＡ－結合タンパク質を有するＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）へ積み込まれる。次いでＲＩＳＣは、アンチセンスまたは「ガイド」ストランドをその相補的ｍＲＮＡ配列へ局在化させ、その後、それがＡｇｏによって開裂される（米国特許第９，６２４，４９４号）。ｓｈＲＮＡの使用は、より費用効果が高く、細胞内高濃度のｓｉＲＮＡはオフターゲット効果と関連するため、かつｓｉＲＮＡの濃度は細胞分裂時に希釈されるようになるためにｓｉＲＮＡよりも好ましい。一方、ｓｈＲＮＡの使用は、安定で長期の遺伝子ノックダウンをもたらし、複数の一連のトランスフェクションの必要がない（Moore et al. (2010) Methods Mol. Bio. 629:141-158）。

マイクロＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡ介在性サイレンシング等のＲＮＡｉのための目的の標的としては、これらに限定されるものではないが、サイトカインおよびそれらの受容体、サイクリンキナーゼ阻害剤、神経伝達物質およびそれらの受容体、成長／分化因子およびそれらの受容体等の発生遺伝子；ＢＣＬ２、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＭＹＢ、ＭＹＣ等のがん遺伝子；ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＭＣＣ、ｐ５３等の腫瘍抑制遺伝子；およびＡＣＣシンターゼおよびオキシダーゼ、ＡＴＰａｓｅ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、カタラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼおよびリパーゼ等の酵素がある（米国特許第７，７３２，４１７号、同第８，８２９，２５４号、同第８，３８３，５９９号、同第８，４２６，６７５号、同第９，６２４，４９４号；米国特許出願公開第２０１２／０００９１５３号）。特に興味深いものは、ＰＤ－１、ＰＤ－２、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＩＤＯ１および２、ＣＴＮＮＢ１（β－カテニン）、ＳＩＲＰα、ＶＩＳＴＡ、ＲＮＡＳＥＨ２、ＤＮＡＳＥ ＩＩ、ＣＬＥＶＥＲ－１／スタビリン－１、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ、ガレクチン－９、ＫＩＲ、ＧＩＴＲ、ＴＩＭ１、ＴＩＭ４、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ２７、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１１２、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ１５５、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ２２６、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ６、ＩＣＯＳ、Ａ２ａＲ、Ａ２ｂＲ、ＨＨＬＡ２、ＩＬＴ－２、ＩＬＴ－４、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｇ、ＩＬＴ－２／４およびＯＸ４０／ＯＸ－４０Ｌ等の免疫チェックポイント標的である。他の標的としては、ＭＤＲ１、アルギナーゼ１、ｉＮＯｓ、ＩＬ－１０、ＴＧＦ－β、ｐＧＥ２、ＳＴＡＴ３、ＶＥＧＦ、ＫＳＰ、ＨＥＲ２、Ｒａｓ、ＥＺＨ２、ＮＩＰＰ１、ＰＰ１、ＴＡＫ１およびＰＬＫ１がある（米国特許出願公開第２００８／０９１３７５号、同第２００９／０２０８５３４号、同第２０１４／０１８６４０１号、同第２０１６／０１８４４５６号、同第２０１６／０３６９２８２号；国際公開第２０１２／１４９３６４号、国際公開第２０１５／００２９６９号、国際公開第２０１５／０３２１６５号、国際公開第２０１６／０２５５８２号）。

細菌は、ｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを腫瘍標的化デリバリーするための魅力的なベクターである。サルモネラ属は、例えば、ＩＤＯ（Blache et al. (2012) Cancer Res. 72(24):6447-6456；Manuel et al. (2015) Cancer Immunol. Res. 3(9):1096-1107；米国特許出願公開第２０１４／０１８６４０１号、同第２０１６／０１８４４５６号；国際公開第２０１２／１４９３６４号、国際公開第２０１５／００２９６９号）；STAT3(Manuel et al. (2011) Cancer Res. 71(12):4183-4191；Zhang et al. (2007) Cancer Res. 67(12):5859-5864；米国特許出願公開第２０１４／０１８６４０１号、同第２０１６／０１８４４５６号；国際公開第２００８／０９１３７５号、国際公開第２０１２／１４９３６４号、国際公開第２０１５／００２９６９号、国際公開第２０１５／０３２１６５号）；β－カテニン（Guo et al. (2011) Gene therapy 18:95-105；国際公開第２０１５／０３２１６５号）およびＣＴＬＡ－４（米国特許出願公開第２０１４／０１８６４０１号、同第２０１６／０１８４４５６号；国際公開第２０１２／１４９３６４号、国際公開第２０１５／００２９６９号）等の遺伝的標的に対するｓｈＲＮプラスミドをデリバリーするために使用することができる。

ｓｈＲＮＡ等の発現ＲＮＡｉは、ｓｈＲＮＡが転写される限りは、それらの標的転写の長期にわたる安定なノックダウンを媒介する。ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩおよびＩＩＩプロモーターは、必要とされる発現のタイプに応じてｓｈＲＮＡコンストラクトの発現をドライブするために使用される。豊富な内因性小分子ＲＮＡの産生においてそれらの健常細胞の役割と一致して、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（Ｕ６またはＨ１等）は、構成ｓｈＲＮＡ発現を高レベルでドライブし、それらの転写開始点および末端シグナル（４－６チミジン）が明確に定義される。Ｐｏｌ ＩＩプロモータードライブｓｈＲＮＡは、組織特異的に発現することができ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡを模倣し、プロセシングされることになるキャップおよびポリＡシグナルを有するより長い前駆体として転写される。このような人工ｍｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡは、ＲＩＳＣ中に効率的に組み込まれ、標的遺伝子発現のより強力な阻害に寄与し；これは低レベルのｓｈＲＮＡ発現を可能にし、ＲＮＡｉ経路における構成成分の飽和を阻止することになる。Ｐｏｌ ＩＩプロモーターの更なる利点は、単一の転写が、いくつかのｍｉＲＮＡおよび模倣ｓｈＲＮＡを同時に発現できることである。この多重化戦略を使用し、２つ以上の治療的標的の発現を同時にノックダウンするか、または単一の遺伝子産物においていくつかの位置を標的とすることができる（例えば、米国特許出願公開第２００９／０２０８５３４号を参照のこと）。

ｂ．マイクロＲＮＡ
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、約２０～２４または２０～２４ヌクレオチド長の短い非コード一本鎖ストランドのＲＮＡ分子である。天然発生ｍｉＲＮＡは、遺伝子発現の転写後調節に関与し；ｍｉＲＮＡは、遺伝子をコードしない。ｍｉＲＮＡは、細胞増殖および生存、ならびに細胞分化を調節することが示されている。ｍｉＲＮＡは、配列相補性を共有する標的となるｍＲＮＡへ結合することによって翻訳を阻害するかまたはＲＮＡ分解を促進する。これらはｍＲＮＡの安定性および翻訳に作用し；ｍｉＲＮＡは、配列相補性を共有する標的となるｍＲＮＡへ結合することによって、翻訳を阻害しおよび／またはＲＮＡ分解を促進する。真核生物中に存在するｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩによって一次ｍｉＲＮＡ、またはｐｒｉ－ｍｉＲＮＡとして公知の、キャップされ、ポリアデニル化されたヘアピン含有一次転写産物へ転写される。これらのｐｒｉ－ｍｉＲＮＡは、酵素ドローシャリボヌクレアーゼＩＩＩおよびその補助因子Ｐａｓｈａ／ＤＧＣＲ８によって、前駆体ｍｉＲＮＡまたはプレ－ｍｉＲＮＡとして公知の約７０ヌクレオチド長の前駆体ｍｉＲＮＡヘアピンへ開裂され、次いでこれらは核から細胞質へ輸送され、ダイサーリボヌクレアーゼＩＩＩによって、およそ２２ヌクレオチド長のセンスおよびアンチセンスストランド産物を有するｍｉＲＮＡ：ｍｉＲＮＡ^＊二本鎖へ開裂される。成熟ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）中に組み込まれ、それが標的ｍＲＮＡを認識し、通常、ｍｉＲＮＡと対を成す不完全な塩基を介して３’非翻訳領域（ＵＴＲ）においてそこに結合し、翻訳の阻害または標的ｍＲＮＡの不安定化／分解をもたらす（例えば、Auyeung et al. (2013) Cell 152(4):844-85を参照のこと）。

本明細書において記載する、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）によって遺伝子発現を調節することは、標的とされる遺伝子の発現を阻害するか、遮断するか、または別に干渉するためにショートヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用することが多い。有利に使用し、かつ本明細書において使用する一方、一部の例では、ｓｈＲＮＡは、小分子ＲＮＡ生物発生因子のための基質となるには不十分であり、小分子ＲＮＡの異種混合物へプロセシングすることができ、それらの前駆体転写物は、細胞中に蓄積することができ、配列非依存的非特異的効果を誘導し、インビボ毒性を引き起こす。ｍｉＲＮＡは、本明細書において使用するために考慮される。ｍｉＲＮＡ様スキャフォールド、または人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）を使用し、配列非依存的非特異的効果を減少させることができる（Watanabe et al. (2016) RNA Biology 13(1):25-33; Fellmann et al. (2013) Cell Reports 5:1704-1713）。改善された安全性プロファイルに加えて、ａｍｉＲＮＡは、Ｐｏｌ ＩＩによって、ｓｈＲＮＡよりも容易に転写される、調節された細胞特異的発現を可能にする。人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）は、ｓｈＲＮＡと比較して、効果的に、場合によっては、より強力に遺伝子発現をサイレンシングすることができ、大量の阻害性ＲＮＡを生成することはない（McBride et al. (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105(15):5868-5873)。この効果は、ｓｈＲＮＡ転写からではなく、プレ－ｍｉＲＮＡ前駆体からのより効果的なｓｉＲＮＡのプロセシングによるものであると判定された（Boden et al. (2004) Nucl Acid Res 32(3):1154-1158）。

ｍｉＲＮＡは、細胞増殖および生存、細胞内シグナル伝達、細胞代謝、ならびに細胞分化を含むいくつかの細胞プロセスを調節することが示されている。１９９３年に、最初のｍｉＲＮＡが、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）において同定され（Lee et al. (1993) Cell 75:843-854）、その後、哺乳動物ｍｉＲＮＡが同定された（Pasquinelli et al. (2000) Nature. 408(6808):86-89）。１７，０００種類を超えるｍｉＲＮＡが１４２種類の菌種において同定されており、１９００種類を超えるｍｉＲＮＡがヒトにおいて同定され、これらのうちのいずれかは、がん（例えば、Ｂ－ＣＬＬにおけるｍｉＲ－１５およびｍｉＲ－１６、乳がんにおけるｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１５５およびｍｉＲ－２１０、肺がんにおけるｍｉＲ－１５５およびｌｅｔ－７ａ、胃がんにおけるｍｉＲ－１４５、肝臓がんにおけるｍｉＲ－２９ｂ）；ウイルス感染（例えば、ＨＣＶ感染におけるｍｉＲ－１２２およびｍｉＲ－１５５、ＨＩＶ－１感染におけるｍｉｒ－２８、ｍｉＲ－１２５ｂ、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－２２３およびｍｉＲ－３８２、インフルエンザウイルス感染におけるｍｉＲ－２１およびｍｉＲ－２２３）；免疫関連疾患（例えば、多発性硬化症におけるｍｉＲ－１４５、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１５５およびｍｉＲ－３２６、全身性エリテマトーデスにおけるｍｉＲ－１４６ａ、Ｉ型Ｉ糖尿病におけるｍｉＲ－１４４、ｍｉＲ－１４６ａ、ｍｉＲ－１５０、ｍｉＲ－１８２、ｍｉＲ－１０３およびｍｉＲ－１０７、非アルコール性脂肪肝疾患におけるｍｉＲ－２００ａ、ｍｉＲ－２００ｂ、ｍｉＲ－４２９、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－４５１およびｍｉＲ－２７、非アルコール性脂肪性肝炎におけるｍｉＲ－２９ｃ、ｍｉＲ－３４ａ、ｍｉＲ－１５５およびｍｉＲ－２００ｂ）；および神経変性疾患（例えば、パーキンソン病におけるｍｉＲ－３０ｂ、ｍｉＲ－３０ｃ、ｍｉＲ－２６ａ、ｍｉＲ－１３３ｂ、ｍｉＲ－１８４＊およびｌｅｔ－７、アルツハイマー病におけるｍｉＲ－２９ｂ－１、ｍｉＲ－２９ａおよびｍｉＲ－９）を含む様々な疾患と関連していた（Li and Kowdley (2012) Genomics Proteomics Bioinformatics 10:246-253）。

研究によって、特異的内因性ｍｉＲＮＡは、ある特定のがんにおいて上方調節されるかまたは下方調節されることが示されている。例えば、ｍｉＲ－１４０は、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）において下方調節され、その過剰発現がＰＤ－Ｌ１を抑制することが見出され（Xie et al. (2018) Cell Physiol. Biochem. 46:654-663）；ｍｉＲ－１９７は白金系化学療法耐性ＮＳＣＬＣにおいて下方調節され、化学療法抵抗性、腫瘍原生および転移をもたらし（Fujita et al. (2015) Mol Ther 23(4):717-727）；いくつかのｍｉＲＮＡは、がん細胞において下方調節され、ｍｉＲ－２００、ｍｉＲ－３４ａおよびｍｉＲ－１３８を含むＰＤ－Ｌ１の発現を可能にすることを見出されている（Yee et al. (2017) J. Biol. Chem. 292(50):20683-20693）。いくつかのｍｉＲＮＡ、例えば、ｍｉＲ－２１、ｍｉＲ－１７およびｍｉＲ－２２１はまた、肺がんにおいて上方調節される（Xie et al. (2018 Cell Physiol. Biochem. 46:654-663）。

マイクロＲＮＡ－１０３（ｍｉＲ－１０３）は、照射後の遺伝毒性ストレスおよびＤＮＡ損傷の結果として、内皮細胞において最も上方調節されるマイクロＲＮＡとして同定された。ｍｉＲ－１０３は、ＴＲＥＸ１、ＴＲＥＸ２およびＦＡＮＣＦ遺伝子の下方調節をもたらすことが見出され、ＴＲＥＸ１発現における減少は、ｍｉＲ－１０３が細胞死および血管新生抑制を介在する主要な機序として同定された（Wilson et al. (2016) Nature Communications 7:13597）。ＴＲＥＸ１の損失によって、ｄｓおよびｓｓＤＮＡの蓄積、ＤＮＡ修復の欠陥、およびサイトカインの放出がもたらされるため、Ｗｉｌｓｏｎらは、ｍｉＲ－１０３がサイトカインの発現を調節するかどうかを検討した。結果によって、ｍｉＲ－１０３発現は、炎症促進性ケモカインＩＰ－１０、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＧ、およびサイトカインＩＬ－１５、ＩＬ－１２およびＩＦＮ－γを顕著に上方調節し、この上方調節は、ＴＲＥＸ１レベルにおけるｍｉＲ－１０３介在性の減少によるものだったことが示された。研究は、共刺激受容体ＣＤ４０およびＣＤ１６０における有意な増加、および４Ｔ１腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１＋マクロファージおよび好中球数の減少も明らかにした。したがって、ＴＲＥＸ１のｍｉＲ－１０３調節は、免疫ＴＭＥの強力なモジュレーターである。ＴＲＥＸ１を標的とする他のｍｉＲＮＡとしては、ｍｉＲ－１０７（米国特許第９，２４２，０００号）、ｍｉＲ－２７ａおよびｍｉＲ－１４８ｂ（米国特許第８，５８０，７５７号）がある。ｍｉＲＮＡ－１０３は、ＴＲＥＸ１を阻害するために本明細書におけるプラスミドで使用することができる。

人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）は、細胞へデリバリーされ、マイクロＲＮＡベースのｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡベクター（ｓｈＲＮＡｍｉｒ）を生成することによって、標的とする遺伝子をサイレンシングするために使用することができる。ｍｉＲ－３０ａ骨格は、哺乳動物において使用されることが多く、およそ２００～３００塩基の一次ｍｉＲＮＡ転写物がベクター中に含まれ、ｍｉＲＮＡヘアピンが断片の中心に位置し、天然ｍｉＲＮＡステム配列が目的のｓｉＲＮＡ／ｓｈＲＮＡエンコード配列に置き換えられる。ＣＭＶ、ＭＳＣＶおよびＴＬＲプロモーター等のウイルスプロモーター；ＥＩＦ－１ａ等の細胞プロモーター；ｔｅｔ－ＣＭＶ等の誘導性キメラプロモーター；および組織特異的プロモーターを使用することができる（Chang et al. (2013) Cold Spring Harb Protoc; doi:10.1101/pdb.prot075853）。使用することができる他のｍｉＲＮＡとしては、ｍｉｒ－１６－２（Watanabe et al. (2016) RNA Biology 13(1):25-33）、ｍｉＲ－１５５（Chung et al. (2006) Nuc Acids Res 34:e53）、ｍｉＲ１７－９２（Liu et al. (2008) Nuc Acids Res 36(9):2811-2824）、ｍｉＲ－１５ａ、ｍｉＲ－１６、ｍｉＲ－１９ｂ、ｍｉＲ－２０、ｍｉＲ－２３ａ、ｍｉＲ－２７ｂ、ｍｉＲ－２９ａ、ｍｉＲ－３０ｂ、ｍｉＲ－３０ｃ、ｍｉＲ－１０４、ｍｉＲ－１３２ｓ、ｍｉＲ－１８１、ｍｉＲ－１９１、ｍｉＲ－２２３（米国特許第８，４２６，６７５号）、およびＬｅｔ－７ ｍｉＲＮＡ（国際公開第２００９／００６４５０号；国際公開第２０１５／０３２１６５号）がある。

ｓｈＲＮＡｍｉｒは、特に低または単一コピー条件下で発現される場合、計算で予測されるｓｈＲＮＡ配列の有効性が低いことによって制限される。ｍｉＲ－Ｅ（ｍｉＲ－３０ａベース）およびｍｉＲ－３Ｇ（ｍｉＲ－１６－２ベース）等の第三世代の人工ｍｉＲＮＡが開発されており、正確に定義されたガイドＲＮＡのプロセシングおよび蓄積が強化されたため、Ｐｏｌ ＩＩとＰｏｌ ＩＩＩベースの両方の発現ベクターにおいて、ｓｈＲＮＡｍｉｒと比較してより強力な遺伝子サイレンシングを示すことが見出された。ステム３ｐフランキング配列内のｍｉＲＮＡのプロセシングを強化するために保存されたＣＮＮＣモチーフの発見によって開発されたｍｉＲ－Ｅは、３つの態様：ｍｉＲ－Ｅのステムは膨張しておらず、反対側のストランドに意図するガイドを有すること；ループに隣接する２つの保存された塩基対は、ＣＵ／ＧＧからＵＡ／ＵＡへ突然変異したこと；およびＸｈｏＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位は、ｓｈＲＮＡをクローニングするために、隣接する領域中に導入されたことにおいて、内因性ｍｉＲ－３０ａとは異なる（Fellmann et al.(2013) Cell Reports 5:1704-1713）。ｍｉＲ－Ｅは、ｍｉＲ－３０ａよりも強力であることが見出されたが、ｍｉＲ－３０ａの３ｐと５ｐの両方のストランドの対称なプロセシングは、パッセンジャーストランドデリバリーよりもガイドストランドデリバリーを優先せず、これは最適ではない。更に、１００ｎｔよりも長いオリゴを使用したｍｉＲ－Ｅへのクローニングは、費用および時間がかかる（Watanabe et al. (2016) RNA Biology 13(1):25-33）。

ｍｉＲ－１６－２と表されるａｍｉＲＮＡ（例えば、Watanabe et al. (2016) RNA Biology 13(1):25-33、図１を参照のこと）は、第三世代の（３Ｇ）ａｍｉＲＮＡスキャフォールド代替物であり；いくつかの組織において発現され、天然で非対称であり（成熟ストランドは、ステムの５ｐまたは３ｐアームのみに由来する）、そのステムおよびループセグメントは小さくかつ固く、ベクタークローニングは単純化される。ｍｉＲ－３Ｇは、天然型ｍｉＲ－１６－２ステム、およびループ、およびステムの両側にある３５ｂｐｓフランキングを含む、約１７５ｂｐフラグメントをベクター中にクローニングすることによって生成される。ｍｉＲ－３Ｇは、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ等のクローニング部位を、５ｐおよび３ｐアームフランキング配列へそれぞれ導入し、ガイド（アンチセンス）およびパッセンジャー（センス）ストランドステムを、ガイドストランドに対する位置１におけるミスマッチを除いて完全に塩基対合することにより、ｍｉＲ－１６－２の更なる改変を含む。制限部位は、ｍｉＲ－１６－２ヘアピンおよびフランキングエレメントの予測される二次構造を損なうことなく、８８－ｍｅｒ二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを介して新規の標的となるコンストラクトの生成を可能にする。更に、２つのＣＮＮＣモチーフおよびＧＨＧモチーフ（小分子ＲＮＡプロセシングエンハンサー）のうちの１つは、ｍｉＲ－１６－２の３ｐフランキング配列において改変される。次いで、目的の遺伝子（複数可）を標的とするｓｉＲＮＡは、成熟５ｐガイドおよび３ｐパッセンジャー配列の最初の２１ヌクレオチドと交換される。研究では、ｍｉＲ－ＥおよびｍｉＲ－３Ｇは同様に強力であったことが判定された。ｍｉＲ－３Ｇは、その発現カセットのサイズが小さいため（ｍｉＲ－Ｅの約３７５に対して約１７５ｎｔｓ）、魅力的なＲＮＡｉ系、およびその産生のための簡易化され、費用効果が高い単一工程のクローニング法を提供する。ｓｈＲＮＡと同様に、細菌をベクターとして使用し、マイクロ－ＲＮＡをインビボでデリバリーすることができる。例えば、弱毒化Ｓ．ティフィムリウムをベクターとして使用し、炎症を呈するマウスにおけるＣＣＬ２２に対するｍｉＲＮＡを発現するプラスミドを経口デリバリーできることが示された。この方法によるＣＣＬ２２遺伝子発現の下方調節は、アトピー性皮膚炎のマウスモデルにおいてインビトロとインビボの両方で成功した（Yoon et al. (2012) DNA and Cell Biology 31(3):289-296）。本明細書における目的に関しては、ｍｉＲＮＡ１６－２を使用し、ｓｈＲＮＡの代わりに使用されるｍｉＲＮＡを生成することができる。ｓｈＲＮＡに関する配列は、ｍｉＲＮＡを設計するために使用することができる。

本明細書において記載するまたは当業者であれば公知の任意の免疫チェックポイント等の、選択される標的となる遺伝子のうちのいずれかを、遮断および／または阻害および／または標的化するＲＮＡｉをコードするＤＮＡは、配列番号２４９および以下に示すマイクロＲＮＡ骨格等のマイクロＲＮＡ骨格へ挿入される。当業者であれば公知の任意の好適なマイクロＲＮＡ骨格を使用することができ；一般的にそのような骨格は、天然発生マイクロＲＮＡをベースとし、ＲＮＡｉを発現するように改変される。そのような骨格の例示的なものは、ｍｉＲ－１６－２（配列番号２４８）をベースとするものである。改変されるマイクロＲＮＡ骨格の配列は、
５’－ＣＣＧＧＡＴＣ ＡＡＣＧＣＣＣＴＡＧ ＧＴＴＴＡＴＧＴＴＴ ＧＧＡＴＧＡＡＣＴＧ ＡＣＡＴＡＣＧＣＧＴ ＡＴＣＣＧＴＣ ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ ＧＴＡＧ ＴＧＡＡＡＴＡＴＡＴ ＡＴＴＡＡＡＣ ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ ＴＡＣＧＧＴＡＡＣＧＣＧ ＧＡＡＴＴＣＧＣＡＡ ＣＴＡＴＴＴＴＡＴＣ ＡＡＴＴＴＴＴＴＧＣ ＧＴＣＧＡＣ－３’（配列番号２４９）
であり、Ｎは、相補的な、一般的に１８～２６、例えば１９～２４、１９～２２、１９～２０塩基対長のアンチセンスおよびセンスヌクレオチド配列であって、サイレンシングされることになる遺伝子を標的とし、マイクロＲＮＡループの前後に挿入される配列を表す。ＡＲＩ－２０５（配列番号２１４）およびＡＲＩ－２０６（配列番号２１５）等のＲＮＡは、配列番号２４９のマイクロＲＮＡ骨格をベースとする例示的なコンストラクトであり、２１および２２個の塩基対相同配列をそれぞれコードする。ＡＲＩ－２０７（配列番号２１６）およびＡＲＩ－２０８（配列番号２１７）は、配列番号２４９のマイクロＲＮＡ骨格ベースの例示的コンストラクトであり、１９個の塩基対相同配列をコードする。別の例は、ＡＲＩ－２０１と称されるコンストラクトであり、これはマイクロＲＮＡコンストラクトＡＲＩ－２０５であり、Ｎは、マウスＰＤ－Ｌ１を標的とするヌクレオチドの配列で置き換えられる。ＡＲＩ－２０２と称されるコンストラクトは、マイクロＲＮＡコンストラクトＡＲＩ－２０６を表し、Ｎは、マウスＰＤ－Ｌ１を標的とする配列で置き換えられる。当業者であれば、ｍｉＲ－１６－２骨格、または当業者であれば公知の他の好適な骨格を使用して、本明細書において記載され、例示されるようなプラスミド中に含ませるためのマイクロＲＮＡを容易に構成することができる。

２．複製起点およびプラスミドコピー数
プラスミドは、複製起点を用いて細菌内に維持される自律複製染色体外環状二本鎖ＤＮＡ分子である。コピー数は、プラスミドの安定性に影響を与える。コピー数が高いと、細胞分裂時にランダムな分割が生じた場合に、プラスミドに優れた安定性を一般的にもたらす。プラスミド数が高いと、成長速度が一般的に低下し、したがって場合により、プラスミドが少ない細胞が、成長が早いために培養を支配することを可能にする。複製起点も、プラスミドの相互性、すなわち同じ細菌性細胞内の別のプラスミドと共に複製するためのその能力を決定する。同じ複製系を利用するプラスミドは、同じ細菌性細胞中で共存できない。これらは同じ相互性グループに属すると言われている。同じ相互性グループから第２のプラスミドの形態で新規の起点を導入すると、常在性プラスミドを複製するという結果を模倣する。したがって、任意の更なる複製は、２つのプラスミドが異なる細胞に分離され、正しい複製前コピー数の生成を済ませるまで阻止される。

細菌の複製起点の多くは、当業者であれば公知である。起点は、所望のコピー数を達成するために選択することができる。複製起点は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを介したプラスミド複製の開始部位として認識される配列を含む（Solar et al. (1998) Microbiology And Molecular Biology Reviews 62(2):434-464）。異なる複製起点が、各細胞内に様々なプラスミドコピーレベルを提供し、１細胞当たり１から数百コピーの範囲とすることができる。一般的に使用される細菌性プラスミド複製起点としては、これらに限定されるものではないが、非常に高いコピー誘導体を有するｐＭＢ１由来起点、低コピー数を有するＣｏｌＥ１起点、ｐ１５Ａ、ｐＳＣ１０１、ｐＢＲ３２２等がある。このような起点は当業者であれば周知である。ｐＵＣ１９起点は、１細胞当たり５００～７００コピーのコピー数をもたらす。ｐＢＲ３２２起点は、１５～２０の公知のコピー数を有する。これらの起点は、単一の塩基対によってのみ異なる。ＣｏｌＥ１起点コピー数は１５～２０であり、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等の誘導体は、３００～５００の範囲のコピー数を有する。例えば、ｐＡＣＹＣ１８４におけるｐ１５Ａ起点は、およそ１０のコピー数をもたらす。ｐＳＣ１０１起点は、およそ５のコピー数を与える。起点を得ることができる他の低コピー数のベクターとしては、例えば、ｐＷＳＫ２９、ｐＷＫＳ３０、ｐＷＫＳ１２９およびｐＷＫＳ１３０がある（Wang et al. (1991) Gene 100:195-199を参照のこと）。中から低コピー数は１５０未満または１００未満である。低コピー数は、２０、２５、または３０未満である。当業者であれば、低または高コピー数を有するプラスミドを同定することができる。例えば、コピー数が高いか低いかを実験的に判定するために、ミニプレップを行う。高コピープラスミドは、ＬＢ培養物１ｍｌ当たり３μｇ～５μｇの間のＤＮＡが得られるはずであり；低コピープラスミドは、ＬＢ培養物１ｍｌ当たり０．２μｇ～１μｇの間のＤＮＡが得られることになる。

複製起点の同定および配列を含む細菌性プラスミドの配列は周知である（例えば、ｓｎａｐｇｅｎｅ．ｃｏｍ／ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ／ｐｌａｓｍｉｄ＿ｆｉｌｅｓ／ｂａｓｉｃ＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ｖｅｃｔｏｒｓ／ｐＢＲ３２２／を参照のこと）。

遺伝子の投薬量は、染色体遺伝子およびタンパク質の高い特定の収率に対して増加するために、高コピープラスミドは、インビトロでタンパク質を異種発現するために選択され、治療用細菌に関しては、コードされる治療薬の治療的投薬量は更に高い。しかし、本明細書において記載するＳ．ティフィムリウムによる等のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）をコードするプラスミドのデリバリーに関しては、高コピープラスミドが理想的に適していると思われるが、治療上は、低コピー数がより効果的であることが本明細書において示される。

発現された分子が有機体に対して毒性である場合、細菌にとって高コピープラスミドを維持するための必須要件が課題となる場合がある。これらのプラスミドを維持するための代謝必須要件は、インビボでの複製適応度を犠牲にするようになる場合がある。干渉ＲＮＡをデリバリーするための最適なプラスミドコピー数は、プラスミドをデリバリーするように遺伝子操作された菌株を弱毒化する機序によって決めることができる。必要に応じて、当業者であれば、本明細書における開示を考慮して、細菌の特定の免疫刺激性菌種および菌株に関する適切なコピー数を選択することができる。低コピー数は有利である場合がある点が本明細書において示される。

３．ＣｐＧモチーフおよびＣｐＧアイランド
非メチル化シチジン－ホスフェート－グアノシン（ＣｐＧ）モチーフは、細菌においてよく認められるが、脊椎動物のゲノムＤＮＡでは認められない。ＣｐＧモチーフを含む病原性ＤＮＡおよび合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）は、宿主防御機序を活性化し、先天的および後天的な免疫応答を引き起こす。非メチル化ＣｐＧモチーフは、中心非メチル化ＣＧジヌクレオチドとフランキング領域を含む。ヒトにおける、ＣｐＧ ＯＤＮの４つの個別のクラスは、誘導する免疫応答の構造および性質における相違に基づいて同定されている。Ｋ－タイプＯＤＮ（Ｂ－タイプとも称される）は、典型的には、１から５個のＣｐＧモチーフをホスホロチオエート骨格上に含む。Ｄ－タイプＯＤＮ（Ａ－タイプとも称される）は、混合ホスホジエステル／ホスホロチオエート骨格を有し、ステム－ループ構造の形成を可能にするパリンドローム配列に隣接する単一のＣｐＧモチーフ、ならびにポリＧモチーフを３’および５’終端において有する。Ｃ－タイプＯＤＮは、ホスホロチオエート骨格を有し、ステムループ構造またはダイマーを形成することができる複数のパリンドロームＣｐＧモチーフを含む。Ｐ－クラスＣｐＧ ＯＤＮは、ホスホロチオエート骨格を有し、複数のＣｐＧモチーフを含み、二重パリンドロームを伴い、それらのＧＣが豊富な３’終端においてヘアピンを形成することができる（Scheiermann and Klinman (2014) Vaccine 32(48):6377-6389）。本明細書における目的に関しては、ＣｐＧは、プラスミドＤＮＡにおいてコードされ；モチーフとしてまたは遺伝子中に導入することができる。

トル様受容体（ＴＬＲ）は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）をセンシングし、病原体に対する自然免疫を活性化するための鍵となる受容体である（Akira et al. (2001) Nat Immunol. 2(8):675-680)。ＴＬＲ９は、原核生物のＤＮＡにおける低メチル化ＣｐＧモチーフを認識する哺乳動物ＤＮＡにおいて自然に生じることがない（McKelvey et al. (2011) J Autoimmunity 36:76-86）。免疫細胞サブセットにおけるエンドソームへの病原体の食作用に対してＣｐＧモチーフが認識すると、ＩＲＦ７依存性Ｉ型インターフェロンシグナル伝達を誘導し、自然および適応免疫を活性化する。

ＣｐＧアイランドを含むプラスミドを保有する菌株であるＳ．ティフィムリウム等のサルモネラ属菌種等の免疫刺激性細菌が本明細書において提供される。これらの細菌は、ＴＬＲ９を活性化し、Ｉ型ＩＦＮ介在性自然および適応免疫を誘導することができる。本明細書において例示する、低メチル化ＣｐＧアイランドを含む細菌性プラスミドは、自然および適応抗腫瘍免疫応答を、ＴＲＥＸ１を標的とするｓｈＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ等の免疫チェックポイントを標的とするＲＮＡｉ等の、プラスミドにおいてコードされるＲＮＡｉと組合せて誘導することができ、そのため、ＴＲＥＸ１介在性ＳＴＩＮＧ経路を活性化すると、相乗的なまたは強化された抗腫瘍活性を有することができる。例えば、ａｓｄ遺伝子（配列番号４８）は、高頻度の低メチル化ＣｐＧアイランドをコードする。ＣｐＧモチーフは、本明細書における説明に記載されるか、またはそこから明白なＲＮＡｉのうちのいずれかと組合せて免疫刺激性細菌中に含むことができ、その結果、処置される対象における抗腫瘍免疫応答を強化するかまたは改善する。

免疫刺激性ＣｐＧは、典型的には、遺伝子産物をコードする細菌性遺伝子からの核酸を含ませることによって、また、ＣｐＧモチーフをコードする核酸を追加することによってプラスミド中に含むことができる。本明細書におけるプラスミドは、ＣｐＧモチーフを含むことができる。例示的なＣｐＧモチーフは公知である（例えば、米国特許第８，２３２，２５９号、同第８，４２６，３７５号および同第８，２４１，８４４号を参照のこと）。これらは、一般式：（ＣｐＧ）_ｎ（式中、ｎは反復の数である）を有する、例えば、１０から１００、１０から２０、１０から３０、１０から４０、１０から５０、１０から７５の間の塩基対長の合成免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。

概して、少なくとも１つまたは２つの反復が使用され；非ＣＧ塩基が散在する場合がある。当業者であれば、ＴＬＲ、特にＴＬＲ９を調節することによって免疫応答を誘導するためのＣｐＧモチーフの一般的な使用を熟知している。

４．プラスミドの維持／構成成分の選択
実験室背景におけるプラスミドの維持は、抗生物質抵抗性遺伝子をプラスミド上に含ませ、成長培地中に抗生物質を使用することによって常に確実にする。上述のような、プラスミド上の機能ａｓｄ遺伝子を補完されるａｓｄ欠失突然変異体を使用すると、抗生物質を使用することなくインビトロでプラスミドを選択することが可能になり、かつインビボでプラスミドを選択することが可能になる。ａｓｄ遺伝子相補系は、そのような選択を提供する（Galaen et al. (1990) Gene 28:29-35）。腫瘍微小環境においてプラスミドを維持するためにａｓｄ遺伝子相補系を使用すると、遺伝子または干渉ＲＮＡをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子操作されたＳ．ティフィムリウムの潜在力が高められる。

ＲＮＡポリメラーゼプロモーター
本明細書において提供されるプラスミドは、上述のような免疫学的チェックポイントを標的とする干渉ＲＮＡをコードするように設計される。ＲＮＡ発現カセットは、Ｈ１プロモーター、またはＵ６プロモーター、またはＣＭＶプロモーター等のヒト細胞において転写するためのプロモーターを含む。Ｕ６およびＨ１はＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（ＲＮＡＰ ＩＩＩ）プロモーターであり、これらは、小分子ＲＮＡを産生およびプロセシングするためのものである。ＣＭＶプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識され、ＲＮＡＰ ＩＩＩよりも長いＲＮＡ伸展を発現することを可能にする。プロモーターは、上述のようなｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡ等の干渉ＲＮＡに先行する。

真核細胞では、ＤＮＡは、３種類のＲＮＡポリメラーゼ；ＲＮＡ Ｐｏｌ Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩによって転写される。ＲＮＡ Ｐｏｌ Ｉは、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子のみを転写し、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩは、ＤＮＡをｍＲＮＡおよび小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）へ転写し、ＲＮＡＰｏｌ ＩＩＩは、ＤＮＡをリボソーム５Ｓ ｒＲＮＡ（Ｉ型）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）（ＩＩ型）およびＵ６ ｓｎＲＮＡ（ＩＩＩ型）等の他の小分子ＲＮＡへ転写する。ｓｈＲＮＡは、典型的には、スプライソソームのＵ６ ｓｎＲＮＡ構成成分を転写するヒトＵ６プロモーター、およびＲＮａｓｅ ＰのＲＮＡ構成成分を転写するＨ１ヒトプロモーター等の真核生物ＩＩＩ型 ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの制御下、インビボで転写される。Ｕ６およびＨ１プロモーターは、構造的に単純であり、明確に定義された転写開始部位を有し、小分子ＲＮＡの転写を自然にドライブするために、他のＰｏｌ ＩＩＩまたはＰｏｌ ＩＩプロモーターよりも好適である。Ｕ６およびＨ１プロモーターは、転写開始部位から下流の任意のものを転写するために必要な配列は保有しない（Makinen et al. (2006) J. Gene Med. 8:433-441）。したがって、これらは、ｓｈＲＮＡの発現において使用するための最も単純なプロモーターである。

ＩＩ型Ｐｏｌ ＩＩＩ ｔＲＮＡプロモーター等の他のプロモーターを使用すると、同時にｓｈＲＮＡを発現することに成功し、長いｄｓＲＮＡ転写物が得られ、これがインターフェロン応答を誘導することができる。ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター等のＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーターも使用してもよいが（米国特許第８，２０２，８４６号；同第８，３８３，５９９号）、長いＲＮＡ伸展を発現するために利用されることが多い。研究によって、Ｕ６プロモーター付近のＣＭＶプロモーターからエンハンサーを加えると、その活性を増加させ、ｓｈＲＮ合成を増加させ、遺伝子サイレンシングを改善できることが示されている（Xia et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31(17):e100；Nie et al. (2010) Genomics Proteomics Bioinformatics 8(3):170-179）。ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、炎症促進性インターフェロン応答をもたらす細胞質ＤＮＡの生成に起因して、典型的には、ｓｈＲＮＡ転写において回避される。この場合、特に本明細書において提供するＴＲＥＸ１阻害の文脈におけるＳ．ティフィムリウム感染腫瘍からの細胞における細胞質ＤＮＡ介在性インターフェロン応答は、抗腫瘍利点を有する。Ｔ７、ｐＢＡＤおよびｐｅｐＴプロモーターを含む原核生物プロモーターは、細菌性細胞において転写が生じた場合に利用することができる（Guo et al. (2011) Gene therapy 18:95-105；米国特許出願公開第２０１２／０００９１５３号、同第２０１６／０３６９２８２号；国際公開第２０１５／０３２１６５号、同第２０１６／０２５５８２号）。

ＲＮＡＰｏｌ ＩＩＩプロモーターは、一般的に、構成ｓｈＲＮＡを発現するために使用される。誘導性発現に関しては、ＲＮＡ Ｐｏｌ ＩＩプロモーターが使用される。例としては、Ｌ－アラビノースによって誘導することができるｐＢＡＤプロモーター；ＴＲＥ－ｔｉｇｈｔ、ＩＰＴ、ＴＲＥ－ＣＭＶ、Ｔｅｔ－ＯＮおよびＴｅｔ－ＯＦＦ等のテトラサイクリン誘導性プロモーター；レトロウイルス性ＬＴＲ；ＬａｃＩ、Ｌａｃ－Ｏ応答性プロモーター等のＩＰＴＧ－誘導性プロモーター；ＬｏｘＰ－ｓｔｏｐ－ＬｏｘＰ系プロモーター（米国特許第８，４２６，６７５号；国際公開第２０１６／０２５５８２号）；および低酸素誘導性プロモーターであるｐｅｐＴ（Yu et al. (2012) Scientific Reports 2:436）がある。これらのプロモーターは周知である。これらのプロモーターの例示的なものは、ヒトＵ６（配列番号７３）およびヒトＨ１（配列番号７４）である。

組織特異的プロモーターとしては、黒色腫細胞およびメラニン細胞に対するＴＲＰ２プロモーター；乳がんおよび乳がん細胞に対するＭＭＴＶプロモーターまたはＷＡＰプロモーター、腸細胞に対するビリンプロモーター（Ｖｉｌｌｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）またはＦＡＢＰプロモーター、膵臓ベータ細胞に対するＲＩＰプロモーター、ケラチノサイトに対するケラチンプロモーター、前立腺上皮に対するプロバシンプロモーター（Ｐｒｏｂａｓｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ＣＮＳ細胞／がんに対するネスチンプロモーター（Ｎｅｓｔｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）またはＧＦＡＰプロモーター、ニューロンに対するチロシンヒドロキシラーゼＳ１００プロモーターまたは神経フィラメントプロモーター、肺がんに対するクララ細胞分泌タンパク質プロモーター（Ｃｌａｒａ ｃｅｌｌ ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、および心臓細胞におけるアルファミオシンプロモーターがある（米国特許第８，４２６，６７５号）。

５．ＤＮＡ核標的化配列
ＳＶ４０ＤＴＳ等のＤＮＡ核標的化配列（ＤＴＳ）は、核膜孔複合体を介してＤＮＡ配列のトランスロケーションを媒介する。この輸送の機序は、核局在配列を含むＤＮＡ結合タンパク質の結合に依存することが報告されている。プラスミド上にＤＴＳが含まれると、核輸送および発現が増加することが実証されており（Dean、D.A. et al. (1999) Exp. Cell Res.253(2):713-722）、その含まれる点を使用し、Ｓ．ティフィムリウムによってデリバリーされるプラスミドから遺伝子発現を増加させる（Kong et al. (2012) PNAS 109(47):19414-19419）。

Ｅ．コリのｒｒｎＢ遺伝子のＴ１ターミネーター等のＲｈｏ非依存性またはクラスＩ転写ターミネーターは、転写伸長複合体の解離をもたらす二次構造を形成するＤＮＡ配列を含む。転写ターミネーターは、Ｓ．ティフィムリウム転写機構による干渉ＲＮＡの発現を阻止するためにプラスミド中に含まれていなければならない。これは、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ等のコードされる干渉ＲＮＡの発現が宿主細胞転写機構に限定されることを確実にする。

本明細書において記載するがん療法として、Ｓ．ティフィムリウム等のサルモネラ属の形質転換のために使用されるプラスミドは、以下の特性：１）ＣｐＧアイランド、２）細菌の複製起点、３）プラスミドを維持するためのａｓｄ遺伝子選択マーカー、４）１つまたは複数のヒト干渉ＲＮＡ発現カセット、５）ＤＮＡ核標的化配列、および６）転写ターミネーターのうちの全てまたは一部を含む。

Ｆ．腫瘍標的化免疫刺激性細菌は、抗腫瘍免疫を刺激するための例示的免疫標的遺伝子に対するＲＮＡＩを含む
任意の免疫標的に対するＲＮＡｉは、プラスミドにおいてコードすることができる。これらとしては、これらに限定されるものではないが、本明細書における開示において検討される任意のもの、および当業者であれば公知の任意のものがある。以下の議論では、例示的な標的を記載する。プラスミドは、そのような標的に対する任意のＲＮＡｉを含むことができ、それらとしては、これらに限定されないが、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡおよびマイクロＲＮＡがある。

１．ＴＲＥＸ１
本明細書において提供されるある特定の実施形態では、免疫刺激性細菌は、ＴＲＥＸ１発現を阻害するかまたは遮断するかまたは抑制するｓｈＲＮＡ等の阻害性ＲＮＡをコードする。ＴＲＥＸ１によってコードされ、ｃＧＡＳから上流に位置する酵素産物は、Ｉ型インターフェロン経路のメディエーターである。ＴＲＥＸ１は、哺乳動物細胞において主要な３’ＤＮＡエキソヌクレアーゼ（ＤＲＮａｓｅ ＩＩＩとも称される）をコードする。ヒトＴＲＥＸ１タンパク質は、細菌性エキソヌクレアーゼと同じように触媒的に効率的である（Mazur and Perrino (2001) J. Biol. Chem. 276:17022-17029）。ＲＮＡサイレンシング以外のプロセスによってＴＲＥＸ１発現を阻害する免疫刺激性細菌も本明細書において検討される。

ＴＲＥＸ１に対するｓｈＲＮＡを発現するもの等の、本明細書において提供される免疫刺激性細菌に関しては、ＴＲＥＸ１活性が損失され、その後のｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ誘導性血管破壊が活性化されると、Ｓ．ティフィムリウムの腫瘍定着が強化される。ＴＲＥＸ１遺伝子は、３１４アミノ酸長であるタンパク質をコードし（Mazur et al. (2001) J.Biol.Chem 276:17022-17029）、ホモダイマーとして存在し、エンドヌクレアーゼ活性は無い。ＴＲＥＸ１は、ＵＶ照射およびＤＮＡに傷害を与える化合物を含む外因性遺伝毒性ストレスによって損傷されるＤＮＡの修復に関与するいくつかのタンパク質のうちの１つである。ＴＲＥＸ１は、３’末端から誤対合ヌクレオチドを切り出すことによって、ＤＮＡ ｐｏｌ βに対する編集エキソヌクレアーゼ（ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ）として機能することができる（Mazur et al. (2001) J.Biol.Chem 276:17022-17029）。ｓｓＤＮＡは、ｄｓＤＮＡよりも３～４倍効率的に分解される（Lindahl et al.(2009) Biochem Soc Trans 37 (Pt 3)、535-538)。残基Ｄ１８およびＤ２００の突然変異は、自己免疫疾患と関連することが多く、ＴＲＥＸ１酵素によるｄｓＤＮＡ分解を無効にし、ｓｓＤＮＡを分解するためのその能力を低下させる。ＴＲＥＸ１酵素は、ＤＮＡ損傷後に小胞体から核へ移動し、損傷されたＤＮＡの複製におけるその関与を示す。ＴＲＥＸ１のプロモーターの活性化および上方調節は、マウス線維芽細胞におけるＵＶＣ曝露の結果として観察されてきており、ＴＲＥＸ１ ｎｕｌｌマウス細胞は、ＵＶＣ光に対して高感受性であることが実証されている（Tomicic et al. (2013) Bioch. Biophys. Acta 1833:1832-1843）。

ＴＲＥＸ１の損失をもたらす突然変異は、遺伝性のまれな疾患であるエカルディグティエール症候群（ＡＧＳ）を呈する患者において同定されており、この疾患は自己免疫疾患の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および凍瘡状狼瘡と表現型が重複する（Aicardi and Goutieres、(2000) Neuropediatrics 31(3):113）。ＴＲＥＸ１の突然変異は、脳白質ジストロフィーを伴う網膜血管症とも関連する。ＴＲＥＸ１介在性自己免疫疾患は、細胞質中に蓄積するｓｓＤＮＡおよびｄｓＤＮＡの分解を介した自己免疫を阻止するための細胞の無能力と関連する。炎症性心筋炎に罹患したＴＲＥＸ１ ｎｕｌｌマウスは、循環不全となり、これは慢性的なサイトカイン産生によって引き起こされる（Morita et al. (2004) Mol Cell Biol 24 (15):6719-6727；Yang et al. (2007) Cell 131(5):873-886；Tomicic et al. (2013) Bioch. Biophys. Acta 1833(8):1832-1843）。したがって、ＴＲＥＸ１欠乏症は、ＤＮＡの細胞質蓄積後に自然免疫を誘導し、炎症応答をもたらす（Wang et al. (2009) DNA Repair (Amst) 8:1179-1189）。ＴＲＥＸ１が、逆転写（ＲＴ）ＤＮＡを代謝することは公知であるために、ＴＲＥＸ１－欠損細胞の細胞質ゾルにおいて蓄積するＤＮＡ原料は、損傷された核から逃避する内因性レトロエレメントに一部由来することが見出された（Stetson et al. (2008) Cell 134(4):587-598）。ＨＩＶ感染では、ＨＩＶ ＲＴ ＤＮＡは、感染したＴ細胞およびマクロファージの細胞質ゾル中に蓄積し、抗ウイルス性免疫のｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ活性化を通常は誘導するであろう。ＴＲＥＸ１はこのウイルス性ＤＮＡを消化し、ＨＩＶ免疫回避を可能にする（Yan et al. (2010) Nat. Immunol. 11(11):1005-1013）。したがって、ＴＲＥＸ１は、ＳＴＩＮＧの負のレギュレーターとして作用し、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）、サル免疫欠乏症ウイルス（ＳＩＶ）、および多数の他のもの等のいくつかのレトロウイルスによる検出を回避するように利用する場合がある（Hasan et al. (2014) Front. Microbiol. 4:393）。

ＳＴＩＮＧと同様に、ＴＲＥＸ１は、マクロファージおよび樹状細胞に由来するＴＲＥＸ１ ｎｕｌｌマウスにおけるサイトカインの鍵となるプロデューサーと共に、大部分の哺乳動物細胞タイプにおいて発現される（Ahn et al. (2014) J. Immunol. 193(9):4634-4642）。データは、ＴＲＥＸ１が、損傷された核から細胞質ゾルへ漏出することがある自己ＤＮＡを分解する原因となり、そうでなければｃＧＡＳに結合し、それを活性化し、自己免疫をもたらすことになる点を示す（Barber (2015) Nat. Rev. Immunol. 15(12):760-770）。これを支持して、ｃＧＡＳが無いＴＲＥＸ１ ｎｕｌｌマウスおよびＴＲＥＸ１－欠損細胞は、Ｉ型インターフェロン活性化および致死的な自己免疫から完全に保護される（Ablasser et al. (2014) J. Immunol. 192(12):5993-5997；Gray et al. (2015) J. Immunol. 195(5):1939-1943）。負のフィードバックループでは、Ｉ型インターフェロンおよびＩＩ型ＩＦＮγも、ＴＲＥＸ１を誘導することができ、したがってＴＲＥＸ１は、異常な自己免疫活性化を制限する役割を果たす（Tomicic et al. (2013) Bioch. Biophys. Acta 1833:1832-1843）。

突然変異したＴＲＥＸ１を含むエカルディグティエール症候群患者由来のリンパ球は、血管新生および神経芽細胞腫細胞の成長を阻害し、その効果は、ＩＦＮ－αの存在によって強化されることが見出された（Pulliero et al. (2012) Oncology Reports 27:1689-1694）。マイクロＲＮＡ－１０３の使用も、ＴＲＥＸ１の発現、ＤＮＡ修復の破壊、および血管新生を阻害し、インビボでの腫瘍成長を減少させることが示されている（米国特許出願公開第２０１４／０１２７２８４号、Cheresh et al.を参照のこと）。

ＴＲＥＸ１は、マクロファージ活性化および炎症促進性機能の負のレギュレーターである。ＴＲＥＸ１ ｎｕｌｌマクロファージは、ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－α産生の増加、高レベルのＣＤ８６、およびＴ細胞に対する抗原提示の増加、ならびにアポトーシス性Ｔ細胞クリアランスの損失を示すことが見出された（Pereira-Lopes et al. (2013) J. Immunol. 191:6128-6135）。ＴＲＥＸ１ ｎｕｌｌマクロファージにおけるアポトーシスＤＮＡを適切に消化することができないと、大量の異常な細胞質ＤＮＡが生成され、それがｃＧＡＳへ結合し、ＳＴＩＮＧ経路を活性化し、高レベルのＩ型インターフェロンを生成する（Ahn et al. (2014) J. Immunol. 193:4634-4642）。しかし、全ての細胞タイプに、Ｔｒｅｘ１ノックダウンの免疫刺激性効果に対して感受性があるわけではない。個体細胞タイプの研究では、樹状細胞、マクロファージ、線維芽細胞およびケラチノサイトは、Ｔｒｅｘ１をノックダウンしたときにＩ型ＩＦＮを生成し、同時にＢ細胞、心筋細胞、ニューロンおよびミクログリアはそれを生成しないことが見出された（Peschke et al. (2016) J. Immunol. 197:2157-2166）。したがって、Ｓ．ティフィムリウムに取り込まれた食細胞におけるＴＲＥＸ１の機能を阻害すると、それらの炎症促進性活性を強化し、同時に貪食された腫瘍細胞からの細胞質ＤＮＡの蓄積をドライブし、次いでｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ経路を活性化する場合があるであろう。マイクロＲＮＡ－１０３を使用すると、ＴＲＥＸ１の発現、ＤＮＡ修復の破壊および血管新生を阻害し、インビボでの腫瘍成長の減少がもたらされる（米国特許出願公開第２０１４／０１２７２８４、Cheresh et al.を参照のこと）。

研究によって、ｃＧＡＳおよび／またはＳＴＩＮＧの発現は、直腸結腸がんの３分の１超において阻害され、同時にＳＴＩＮＧ発現は、多数の原発性および転移性の黒色腫およびＨＰＶ^＋がんにおいて失われることが見出されている。ＳＴＩＮＧシグナル伝達は、ＴＭＥの抗原環境を継続的に採取する全ての腫瘍常在性ＡＰＣにおいて依然として無傷のままであり、腫瘍抗原をＣＤ８^＋Ｔ細胞に交差提示するＢａｔｆ３－系譜ＣＤ１０３／ＣＤ８α^＋ＤＣを含み、これらのＡＰＣも、Ｓ．ティフィムリウムを容易に貪食することになるか、またはＴＲＥＸ１遺伝子ノックダウンを含むＳ．ティフィムリウムを貪食した隣接マクロファージのＩ型ＩＦＮによって活性化される。

ＴＲＥＸ１を不活性化すると、ｄｓＤＮＡが細胞質ゾルで蓄積するのを可能にし、それが、Ｉ型インターフェロンおよび他のサイトカインの産生を、ＳＴＩＮＧシグナル伝達経路の活性化を介して誘導する細胞質ＤＮＡセンサーである、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）シンターゼ（ｃＧＡＳ）酵素へ結合することによって免疫応答が強化される（Sun et al. (2013) Science 339(6121):786-791；Wu et al. (2013) Science 339(6121):826-830）。ＳＴＩＮＧ経路を活性化すると、強力な自然および適応抗腫瘍免疫を誘導することが示されている（Corrales et al. (2015) Cell Reports 11:1018-1030）。

したがって、本明細書において提供する免疫刺激性細菌菌株の実施形態は、腫瘍常在性ＡＰＣにおいてＴＲＥＸ１を阻害し、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ活性化を誘導するために投与され、その結果、これらのＤＣを活性化し、宿主腫瘍抗原をＣＤ８^＋Ｔ細胞へ交差提示し、局在性および全身性腫瘍の退行および恒久的な抗腫瘍免疫を誘導する（Corrales et al. (2015) Cell Reports 11:1018-1030; Zitvogel et al.(2015) Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 16:393-405）。

ＶＮＰ２０００９の臨床的活性は、大部分は不本意であり、一部はそのヒト腫瘍に定着するための能力が不十分なことによるものであり、マウスモデルにおいて観察されなかった現象である（Nemunaitis et al.(2003) Cancer Gene Ther. 10(10):737-744；Toso et al. (2002) J. Clin. Oncol. 20(1):142-152；Heimann et al. (2003) J. Immunother. 26(2):179-180）。ヒトとマウスとの間の腫瘍定着が一致しない理由は、正位移植された同系マウス腫瘍は、ヒト腫瘍よりも更にいっそう血管新生されたことである点が後になって明らかになった。ヒト腫瘍血管新生の欠如を、マウスにおいてより密接にモデル化するために、原発性腫瘍モデルをＶＮＰ２０００９で処置し、血管破壊薬剤を前処置して、腫瘍定着のみを可能にすることを見出した（Drees et al. (2015) J of Cancer 6(9):843-848；Drees et al. (2015) Anticancer Res. 35(2):843-849）。５，６－ジメチルキサンテノン－４－酢酸（ＤＭＸＡＡ）等の血管破壊薬剤は、ＳＴＩＮＧに直接結合し、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達を誘導することによって、マウス（ヒトではなく）における腫瘍崩壊を媒介することが示されている（Baguley (2003) Lancet Oncol. 4(3):141-148; Corrales and Glickman et al. (2015) Cell Reports 11(7):1018-1030）。ＳＴＩＮＧシグナル伝達は、内皮細胞上でαＶβ３インテグリン接着受容体を下方調節することによって血管破壊を直接的に促進することが示されているサイトカインであるＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γ産生を誘導する（Rueegg et al. (1998) Nat Medicine 4(4):408-414）。ＳＴＩＮＧが活性化されたときに誘導されるＴＮＦ－α、ＩＬ－１２ｐ４０およびＩＦＮ－γ等の自然炎症促進性サイトカインの産生は、抗腫瘍免疫活性化にとって重要である（Burdette et al. (2011) Nature 478(7370):515-518）。

したがって、ＴＲＥＸ１に対するｓｈＲＮＡを発現し、ＴＲＥＸ１を損失させ、その後のｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧ誘導性血管破壊を活性化する、本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、Ｓ．ティフィムリウムの腫瘍定着を強化する。

２．ＰＤ－Ｌ１
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）は、免疫応答の負の調節に関与する免疫阻害受容体である。その同族リガンドであるプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、ＡＰＣ上に発現され、Ｔ細胞上のＰＤ－１に結合したときにＣＤ８^＋Ｔ細胞エフェクター機能の損失をもたらし、Ｔ細胞耐性を誘導する。ＰＤ－Ｌ１の発現は、ある特定のヒトがんにおける腫瘍攻撃性および生存率の低下と関連することが多い（Gao et al. (2009) Clin. Cancer Res. 15(3):971-979）。

抗ＰＤ－１等の免疫チェックポイントをブロックするように設計された抗体（例えば、ペンブロリズマブ、ニボルマブ）および抗ＰＤ－Ｌ１（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ）抗体は、Ｔ細胞アネルギーを阻止し、免疫寛容を破壊する点において恒久的に成功してきた。処置された患者のほんの一部、および自己免疫関連毒性を示すことが多いもののみが、臨床的利点を示す（Ribas (2015) N. Engl. J. Med. 373(16):1490-1492；Topalian et al. (2012) N. Engl. J. Med. 366(26):2443-54）。毒性の獲得に加えて、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法は抵抗性をもたらすことが多く、抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えばイピリムマブ）の併用は、臨床試験における成功が限られ、顕著な相加的毒性が伴っていた。ＰＤ－Ｌ１ブロックの毒性を制限し、潜在力を強化するために、本明細書において提供するＰＤ－Ｌ１に対するｓｈＲＮＡを有する免疫刺激性細菌は、免疫細胞のＴＬＲ活性化と共に相乗効果を与え、抗腫瘍免疫を活性化し、強化もすることになる。

３．ＶＩＳＴＡ
免疫活性化における他の非冗長なチェックポイントは、Ｔ細胞活性化のＶ－ドメイン免疫グロブリン（Ｉｇ）サプレッサー（ＶＩＳＴＡ）等のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１およびＣＴＬＡ－４と共に相乗効果を与えることができる。ＶＩＳＴＡは、ＡＰＣ上に、特に腫瘍浸潤骨髄細胞および骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）上に、かつ少ない程度ではあるが調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇｓ）上に最初に発現される（Wang et al. (2011) J. Exp. Med. 208(3):577-592）。ＰＤ－Ｌ１と同様に、ＶＩＳＴＡの上方調節は、Ｔ細胞増殖および細胞毒性機能を直接抑制する（Liu et al. (2015) PNAS 112(21):6682-6687）。ＶＩＳＴＡを標的とするモノクローナル抗体は、マウスにおける腫瘍微小環境を再モデル化し、ＡＰＣ活性化を高め、抗腫瘍免疫を強化することが示された（LeMercier et al. (2014) Cancer Res. 74(7):1933-1944）。臨床的には、ＶＩＳＴＡの発現は、前立腺がんにおける抗ＣＴＬＡ－４療法処置後に、腫瘍常在性マクロファージ上で上方調節されることが示されており、免疫チェックポイントの代償性調節が実証された（Gao et al. (2017) Nat. Med. 23(5):551-555）。ＶＩＳＴＡの発現の大部分は、骨髄細胞の表面上ではなく細胞内コンパートメントに位置するとされており、これはモノクローナル抗体アプローチの有効性を制限する場合がある（Deng et al. (2016) J.Immunother. Cancer 4:86）。本明細書において提供するＶＩＳＴＡに対するｓｈＲＮＡを含む腫瘍標化細菌を使用して、ＡＰＣ内からＶＩＳＴＡを阻害するための能力は、より効率的であり、ＶＩＳＴＡのＴ細胞抑制機能を完全に阻害し、Ｔ細胞介在性抗腫瘍免疫の活性化および腫瘍退行をもたらすであろう。

４．ＳＩＲＰα
腫瘍細胞が除去を回避することによる１つの機序は、自然免疫細胞によってそれらの食作用を阻止することである。食作用は、造血および非造血細胞上に広範囲に発現するＣＤ４７の表面発現によって阻害される（Liu et al. (2015) PLoS ONE 10(9):e0137345）。ＣＤ４７が、その受容体のシグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）に結合すると、食作用に関する阻害性シグナルが開始される。ＳＩＲＰαは、マクロファージ、顆粒球およびＤＣを含む食細胞上に豊富に発現する。したがって、ＣＤ４７とＳＩＲＰαとの間のタンパク質－タンパク質相互作用は、ＡＰＣに特有の別のクラスの免疫チェックポイント、特に腫瘍常在性マクロファージを提示する。食作用の阻止におけるＣＤ４７の有効性は、様々な腫瘍において上方調節されることが多く、これは腫瘍微小環境においてＡＰＣによる貪食を回避することを可能にするという事実によって証明されている（Liu et al. (2015) Nat. Med. 21(10):1209-1215）。抗ＣＤ４７もしくは抗ＳＩＲＰα抗体または抗体フラグメントの開発、いずれかのタンパク質に結合する小ペプチドの使用、またはＣＤ４７発現のノックダウンを含む、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα相互作用をブロックするためのいくつかの方法が検討されている（米国特許出願公開第２０１３／０１４２７８６号、同第２０１４／０２４２０９５号；国際公開第２０１５／１９１８６１号；McCracken et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21(16):3597-3601）。このため、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）として公知のプロセスにおいて、ＳＩＲＰαを直接標的とするいくつかのモノクローナル抗体が、単独で、または抗体オプソニン化腫瘍細胞の食作用を強化することができる腫瘍標的化抗体（例えばリツキシマブ、ダラツムマブ、アレムツズマブ、セツキシマブ）と組み合わせて臨床的に開発されている（McCracken et al. (2015) Clin. Cancer Res. 21(16):3597-3601；Yanagita et al. (2017) JCI Insight 2(1):e89140）。

ＣＤ４７／ＳＩＲＰαの相互作用は、食細胞消失を阻止することによって赤血球の寿命を維持することにも役立つ（Murata et al. (2014) J. Biochem. 155(6):335-344）。そのため、この相互作用を広範に破壊する抗ＣＤ４７抗体等の全身投与療法は、貧血毒性をもたらしている（Huang et al. (2106) J Thorac Dis. 126:2610-20）。全身性のＳＩＲＰαベースの治療法も、全身性の過剰食作用を有する自食マクロファージ（ｈｙｐｅｒｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ ｓｅｌｆ－ｅａｔｉｎｇ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）の生成による器官損傷等の有害事象のリスクがある。本明細書において提供されるようなＳＩＲＰαに対するｓｈＲＮＡを含む腫瘍標的化免疫刺激性細菌を使用すると、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα破壊を腫瘍微小環境に局在化させ、これらの有害事象を消失させることになる。更に、ＴＬＲ介在性炎症促進性シグナル伝達経路の細菌性活性化の背景におけるＳＩＲＰαの阻害は、これらのマクロファージを強力に活性化し、隣接する腫瘍細胞に向かって過剰食作用を有するようになるであろう（Bian et al. (2016) PNAS. 113(37): E5434-E5443）。

５．β－カテニン
免疫チェックポイント経路は、免疫の過剰活性化および自己免疫を阻止するために存在する複数の層の調節、抗腫瘍免疫を促進するためのこれらの経路の破壊における困難を例示する。腫瘍がチェックポイント治療法に対して難治性に進化した１つの機序は、Ｔ細胞非炎症性または「冷たい腫瘍」として記載されるＴ細胞および樹状細胞（ＤＣ）浸潤の欠如を介している（Sharma et al. (2017) Cell 9;168(4):707-723）。いくつかの腫瘍の内因性機序は同定されており、抗腫瘍Ｔ細胞の排除および免疫療法に対する抵抗性につながっている。黒色腫では、特に、チェックポイント治療法－難治性腫瘍の分子プロファイリングによって、腫瘍浸潤性リンパ球の欠如と相関するβ－カテニンおよびその下流標的遺伝子のシグネチャーの上昇が明らかにされた（Gajewski et al. (2011) Curr. Opin. Immunol. 23(2):286-292）。

ＣＴＮＮＢ１は、β－カテニンをコードする癌遺伝子であり、遺伝子ｃ－ＭｙｃおよびサイクリンＤ１の発現を誘導し、腫瘍増殖をもたらすことができる。ＣＴＮＮＢ１の突然変異は、ある特定のがんと関連する。Ｓ．ティフィムリウム ｓｈＲＮＡベクターを使用したＣＴＮＮＢ１／β－カテニンの遺伝子サイレンシングは、がんの処置において使用することができる（Guo et al. (2011) Gene therapy 18:95-105；米国特許出願公開第２０１２／０００９１５３号、同第２０１６／０３６９２８２号；国際公開第２０１５／０３２１６５号）。例えば、デリバリーベクターとしてＳ．ティフィムリウム菌株ＳＬ７２０７を使用したＣＴＮＮＢ１のｓｈＲＮＡサイレンシングは、対照細胞と比較すると、ＳＷ４８０異種移植マウスにおいて腫瘍増殖および成長を減少させ、ｃ－ＭｙｃおよびサイクリンＤ１の発現を減少させる（Guo et al. (2011) Gene therapy 18:95-105）。肝芽細胞腫の処置のためのＣＴＮＮＢ１のサイレンシングも、免疫チェックポイントＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１に対する抗体療法を用いても、用いなくても、ｍｉＲＮＡを使用して達成することができる（国際公開第２０１７／００５７７３号）。腺がんおよび扁平上皮細胞がん腫を含むＣＴＮＮＢ１関連がんの処置のためのリポソーム等の代替のベクターを介してデリバリーされるＣＴＮＮＢ１を標的とするｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡの使用も、影響を与えることができる（米国特許出願公開第２００９／０１１１７６２号、同第２０１２／０２９４９２９号）。

β－カテニンシグナル伝達が上昇すると、Ｂａｔｆ３－系譜ＣＤ１０３／ＣＤ８α^＋ＤＣのリクルーティングからケモカインＣＣＬ４が直接阻害され、その結果、抗原刺激腫瘍抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞のプライミングからそれらが阻止される（Spranger et al. (2015) Nature 523(7559):231-235）。β－カテニンは、ＷＮＴシグナル伝達経路の主要な下流メディエーターであり、成体組織再生、ホメオスタシスおよび造血にも重要な鍵となる胚発生経路である（Clevers et al. (2012) Cell 149(6):1192-1205）。過剰なＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達は、様々ながんに関与している（Tai et al. (2015) Oncologist 20(10):1189-1198）。したがって、ＷＮＴ／β－カテニンシグナル伝達を標的とするいくつかの戦略が進められているが、腫瘍微小環境に対する特異性が無いことによって成功が妨げられ、腸幹細胞、骨代謝回転および造血にオフターゲット毒性が生じている（Kahn (2014) Nat. Rev. Drug Dis. 13(7):513-532）。本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、これらの課題を克服する。

例えば、本明細書において提供するβ－カテニンに対するｓｈＲＮＡを有する免疫刺激性細菌を使用する利点は、現存する治療モダリティの全身性毒性を伴わずにＴ細胞プライミングＤＣのケモカイン介在性浸潤、および冷たい腫瘍の細胞炎症性腫瘍微小環境への変換を強化することである。更に、ＴＬＲ自然免疫シグナル伝達経路の細菌性活性化は、β－カテニン阻害と共に相乗効果を与え、免疫活性化および抗腫瘍免疫を更に促進する。

６．ＴＧＦ－β
形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ－β）は、胚形成、創傷治癒、血管新生および免疫調節において多くの役割を有する多面的なサイトカインである。哺乳動物細胞では、３つのアイソフォーム、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２およびＴＧＦ－β３が存在し；ＴＧＦ－β１は、免疫細胞中で最も優勢である（Esebanmen et al. (2017) Immunol Res. 65:987-994）。免疫抑制剤としてのＴＧＦ－βの役割は、おそらく、その最も優勢な機能である。腫瘍微小環境における潜在的形態からのその活性化は、特に、ＤＣに対して広範囲の免疫抑制性効果、および抗原特異的Ｔ細胞に対して耐性化するためのそれらの能力を有する。ＴＧＦ－βは、Ｔｈ１ ＣＤ４^＋Ｔ細胞を免疫抑制性Ｔｒｅｇに直接変換し、腫瘍寛容の促進を更に拡大することもできる（Travis et al. (2014) Annu Rev Immunol. 32: 51-82）。その腫瘍特異的な免疫抑制性機能に基づいて、かつその公知のがん細胞成長および転移促進特性に関係なく、ＴＧＦ－βの阻害が、がん療法の標的である。高ＴＧＦ－βシグナル伝達は、ＣＲＣ、ＨＣＣ、ＰＤＡＣおよびＮＳＣＬＣを含むいくつかのヒト腫瘍タイプにおいて実証されている（Colak et al. (2017) Trends in Cancer 3:1）。ＴＧＦ－βの全身性の阻害は、許容できない自己免疫毒性をもたらすことがあり、その阻害は、腫瘍微小環境に対して局在的とするべきである。したがって、本明細書において提供されるＴＧＦ－βに対するｓｈＲＮＡまたはＴＧＦ－βＲＩＩに対するｓｈＲＮＡ等のＲＮＡｉを有する腫瘍標的化免疫刺激性細菌は、腫瘍免疫寛容を破壊し、抗腫瘍免疫を刺激する。

７．ＶＥＧＦ
血管新生または新規の血管の発達は、任意の腫瘍微小環境が確立されるようになるために必須の工程である。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、内皮増殖および血管新生に重要なマイトジェンであり、腫瘍微小環境におけるＶＥＧＦが阻害されると、腫瘍血管分布が顕著に減少し、その結果、腫瘍への血液供給が枯渇する（Kim et al. (1993) Nature 362(6423):841-4）。この初期研究は、ＶＥＧＦのモノクローナル抗体阻害剤、ベバシズマブ（アバスチン；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）の開発へつながっており、化学療法と組み合わせて、転移性のＣＲＣに関する標準治療となっている。ベバシズマブの全身投与も、ＮＳＣＬＣの第ＩＩ相トライアルにおいて複数の死亡を含む顕著な毒性が実証され、大部分は出血によるものであった。したがって、抗ＶＥＧＦ受容体２抗体ラムシルマブ（Ｃｙｒａｍｚａ、Ｉｍｃｌｏｎｅ）等のいくつかの次世代の抗血管新生剤および抗血管新生チロシンキナーゼ阻害剤のアキシチニブ（Ｉｎｌｙｔａ、Ｐｆｉｚｅｒ）が評価されてきたが、全身毒性を克服することも、無増悪生存を顕著に改善することもできなかった（Alshangiti et al. (2018) Curr Oncol. 25(Suppl 1):S45-S58）。抗ＶＥＧＦ治療法の抗腫瘍活性は、一部の有望性を示すが、全身毒性は、明らかに制限されている。したがって、本明細書において提供されるＶＥＧＦに対するｓｈＲＮＡを有する免疫刺激性腫瘍標的化細菌等の腫瘍微小環境のみを標的とする治療法は、局在性の抗血管新生療法をデリバリーし、同時に全身毒性を阻止する。この治療モダリティは、腫瘍微小環境においてＶＥＧＦを主に産生する骨髄細胞へ取り込まれるという追加の利点を有し、これは、腫瘍の進行に最大限の影響を与えるであろう（Osterberg et al. (2016) Neuro-Oncology. 18(7):939-949）。

８．追加の例示的なチェックポイント標的
マイクロＲＮＡおよびｓｈＲＮＡ等のＲＮＡｉを調製することができるか、または本明細書において例示する例示的なチェックポイント標的は、これらに限定されるものではないが以下のものがある。

他の例示的標的としては、これらに限定されるものではないが以下のものがある。

Ｇ．単回療法モダリティおよび組合せ療法内での複数の免疫標的に対するＲＮＡＩ ｓｈＲＮＡの組合せ
１つの細菌において異なる標的を阻害するｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡ等のＲＮＡｉの組合せが検討される。そのような標的の組合せ、相乗的に作用するように選択することができる。任意の２つの免疫チェックポイントを標的とするＲＮＡｉを組合せは、本明細書において記載するように改変された免疫刺激性細菌性宿主中にまたは他の治療用細菌性宿主中に導入することができる。

１．ＴＲＥＸ１および他の標的
ＳＴＩＮＧ活性化時に上方調節され、抗腫瘍免疫を強化することができる代償性免疫チェックポイント経路の誘導を軽減するため、本明細書において提供される改変された免疫刺激性細菌は、他の免疫標的に対するｓｈＲＮＡと組合せてＴＲＥＸ１に対するショートヘアピン型（ｓｈ）－ＲＮＡ配列を含み、それらとしては、これらに限定されないが、ＰＤ－Ｌ１、ＶＩＳＴＡおよびＳＩＲＰαがある。腫瘍常在性食細胞においてＴＲＥＸ１およびＳＩＲＰαをノックダウンすると、腫瘍細胞上のＣＤ４７との「私を食べないで（ｄｏｎ’ｔ ｅａｔ ｍｅ）」相互作用をブロックすること、ならびにＳ．ティフィムリウム感染に対する腫瘍微小環境の感受性を更に強化することが可能になり（Li et al.(2012) J Immunol 189(5):2537-2544）、本明細書において提供される。ＳＩＲＰαの阻害によって可能になる強化された食作用とＴＲＥＸ１の同時ノックダウンとの組合せは、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧシグナル伝達をより強力に活性化することができる、細胞質ゾルのより優れたデリバリーおよび腫瘍ＤＮＡの安定化を促進する。特に、ＣＤ４７／ＳＩＲＰαブロックの抗腫瘍効果は、無傷ＳＴＩＮＧシグナル伝達を必要とすることが示され、ＴＲＥＸ１介在性ＳＴＩＮＧ活性化とＳＩＲＰα阻害との組合せの潜在的な相乗効果が実証された（Liu et al. (2015) Nat. Med. 21(10):1209-1215）。本明細書において提供されるＰＤ－Ｌ１に対するｓｈＲＮＡと組み合わせてＴＲＥＸ１をノックダウンすると、改変されたＳ．ティフィムリウムの病態形成および免疫刺激特性が強化され（Lee et al. (2010) J.Immunol. 185(4):2442-2449）、その結果、より炎症性のかつ免疫原性の腫瘍微小環境がもたらさせる。β－カテニンおよびＴＧＦ－βに対するｓｈＲＮＡの標的化も、よりＴ細胞炎症性の腫瘍微小環境をもたらし、ＰＤ－Ｌ１に対するｓｈＲＮＡと共により相乗効果を与え、本明細書において提供される。マクロファージ／骨髄性コンパートメント内での局在性のチェックポイントブロックと免疫活性化とを組み合わせると、特に、例えば本明細書において提供されるＴＲＥＸ１およびＶＩＳＴＡに対するｓｈＲＮＡの組合せを介して、Ｓ．ティフィムリウム感染ＡＰＣによる腫瘍新抗原の提示の促進と、腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化の促進の両方によって免疫応答が強化される。

２．ＴＲＥＸ１および照射療法
抗がん照射療法の成功は、Ｉ型インターフェロン依存性自然および適応免疫の誘導によって決まる。ＴＲＥＸ１は、損傷されたがん細胞において産生される細胞質ＤＮＡを分解することによって、高レベルのＧｙ照射後の抗腫瘍免疫を弱毒化し、その結果、ｃＧＡＳおよびＳＴＩＮＧが介在するＩ型インターフェロン経路を阻止することが示されている（Vanpouille-Box et al. (2017) Nature Communications 8:15618）。したがって、ＩＦＮ－Ｉ経路の活性化を阻止するＴＲＥＸ１の過剰発現またはｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧのノックアウトは、照射時にアブスコパル腫瘍応答を弱毒化する。ＣＤ８^＋Ｔ細胞のＳＴＩＮＧ介在性Ｂａｔｆ３－ＤＣプライミングを活性化し、最大限のアブスコパル抗腫瘍免疫を達成するために、ＴＲＥＸ１を誘導することがないであろう低用量の放射線が必要とされた（Vanpouille-Box et al. (2017) Nature Communications 8:15618）。ＴＲＥＸ１を下方調節すると、電離放射線に対する腫瘍細胞の感受性が回復することが示されている。例えば、高用量を照射すると、ＴＲＥＸ１発現が誘導され、ｄｓＤＮＡの細胞質蓄積が阻止され、その結果、アブスコパル腫瘍退行が阻害された（Vanpouille-Box et al. (2017) Nature Communications 8:15618）。ＴＲＥＸ１発現をブロックするまたは阻害する本明細書において提供される免疫刺激性菌株は、高用量照射処置時にＴＲＥＸ１の発現を減少させるかまたは削除するかまたは鈍化し、治療域を顕著に拡大することができる。

照射療法（ＲＴ）は、低用量においてアブスコパル効果を有するが、低用量は必ずしも効果的ではない。しかし、高用量では、アブスコパル効果はもはや観察されない。これは、ＲＴに伴う公知の課題である。照射療法は、細胞質ゾルｄｓＤＮＡを分解するＴＲＥＸ１の上方調節を促進し、ｃＧＡＳ／ＳＴＩＮＧシグナル伝達に続くＩＦＮ－β分泌を不可能にすることが示されている（Vanpouille-Box et al. (2017) Nat. Commun. 8:15618を参照のこと）。したがって、本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、ＴＲＥＸ１の上方調節を阻止するためにＲＴと共に投与することができる。ｓｈＲＮＡまたはＴＲＥＸ１を阻害する他の産物をコードする、本明細書において提供される免疫刺激性細菌を投与すると、この応答は無効になり、その結果、ＲＴが改善され、相補される。したがって、ｓｈＲＮＡまたはＴＲＥＸ１の発現を阻害するかまたは減少させる他の産物をコードする免疫刺激性細菌が、ＲＴと共に、ＲＴの前に、それと共に、またはその後に、またはそれと間欠的に投与される組合せ療法が本明細書において提供される。免疫刺激性細菌およびＲＴ療法の組合せ療法は、チェックポイント阻害剤の投与等の他の抗がん療法、および／または本明細書において記載するＰＤ－Ｌ１等の他のチェックポイントに対するｓｈＲＮＡの包含も含むことができる。

３．ＴＲＥＸ１および免疫原性化学療法
ＴＲＥＸ１の誘導は、マウスおよびヒト線維芽細胞のＤＮＡに傷害を与えるＵＶ照射、ならびにＤＮＡアルキル化剤のニムスチン、カルムスチンおよびホテムスチン、ならびにトポイソメラーゼＩ阻害剤のトポテカンを用いた神経膠腫および悪性黒色腫細胞の処置後に観察された。これらの腫瘍細胞は、ＴＲＥＸ１をｓｉＲＮＡでノックダウンした後に、これらの抗がん療法に対して再感作された（Tomicic et al. (2013) Biochimica et Biophysica Acta 1833:1832-1843）。ＴＲＥＸ１は、ＡＰ－１を効率的に誘導する薬剤を損傷することによってのみ誘導されるが、メチル化薬剤のテモゾロマイドおよびトポイソメラーゼＩＩ阻害剤のエトポシド等のＦｏｓ／Ｊｕｎ／ＡＰ－１の弱いインデューサーである薬剤は、ＴＲＥＸ１を誘導しない。

個別の研究によって、ｄｓＤＮＡは、シスプラチン、イリノテカン、ドキソルビシンおよびエトポシド等のＳ相においてＤＮＡ複製を失速させる化学療法を用いて処置すると、蓄積し、Ｉ型ＩＦＮを活性化するが、ビノレルビンおよびパクリタキセル等のＭ相において作用する薬剤を用いてもそうならないことが見出された（Wilkinson R. presented at ESMO TAT Conference 2018）。Ｓ相薬剤は、細胞質ゾル中に蓄積し、ＴＲＥＸ１を上方調節する損傷されたＤＮＡフラグメントの放出をおそらくもたらす。これらの化学療法薬剤は、ヌクレオチド類似体、アルキル化剤、白金薬物、およびインターカレート剤等のＤＮＡストランドの切断をもたらすものを含み（例えば、Swift et al.(2014) Int. J. Mol. Sci 15:3403-3431を参照のこと）、ＤＮＡを分解するのに十分なレベルでＴＲＥＸ１を誘導することができ、その結果、サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）シンターゼ（ｃＧＡＳ）およびインターフェロン遺伝子のその下流アダプター刺激因子（ＳＴＩＮＧ）を介したＩ型インターフェロン（ＩＦＮ－Ｉ）経路の活性化を不可能にする。本明細書において提供される免疫刺激性細菌を用いる処置は、化学療法薬剤、および更なる他のチェックポイント阻害剤と組み合わせることができる。したがって、本明細書において提供される免疫刺激性細菌は、有利には、様々な抗がん剤および処置との組合せ療法において使用することができる。

４．抗チェックポイント抗体を用いた組合せ療法
本明細書において提供される免疫刺激性細菌を用いた治療法は、チェックポイント阻害剤療法および上記で検討された他のがん処置および化学療法を含む任意の他の抗がん療法と組み合わせることができる。

Ｈ．医薬品生成、組成物、および製剤
本明細書において提供される免疫刺激性細菌のうちのいずれか、および薬学的に許容される賦形剤または添加物を含む、医薬組成物および製剤を製造する方法が本明細書において提供される。医薬組成物は、腫瘍またはがん等の過剰増殖性疾患または状態等の疾患の処置において使用することができる。免疫刺激性細菌は、単一の薬剤療法として投与することができるか、または更なる薬剤または処置を用いた組合せ療法として投与することができる。組成物は、単回投薬量投与用にまたは多回投薬量投与用に製剤化することができる。薬剤は、直接投与するために製剤化することができる。組成物は、液体または乾燥製剤として提供されることもある。

１．製造
ａ．細胞バンクの製造
本明細書において記載する免疫療法の活性成分は、遺伝子操作された自己複製細菌からなるため、選択される組成物は、長期貯蔵のためにかつ原薬を製造するための出発材料として維持されるであろう一連の細胞バンクへ拡大することになる。細胞バンクは、連邦規則集（Ｃｏｄｅ ｏｆ Ｆｅｄｅｒａｌ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ）（ＣＦＲ）２１ ｐａｒｔ２１１または他の関連規制当局に従って、適切な製造施設において、現行の製造管理および品質管理に関する基準（ｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ｃＧＭＰ）の下で作製される。免疫療法剤の活性薬剤は生存細菌であるため、本明細書において記載する製品は、定義によれば非滅菌であり、最終的に滅菌することはできない。無菌手順が、汚染を阻止するために、製造プロセスにわたって使用されることが確実になるように注意するべきである。したがって、全ての原材料および溶液は、製造プロセスにおいて使用する前に滅菌されていなくてはならない。

マスター細胞バンク（ＭＣＢ）は、混入物が出発材料中に存在しないことを確実にするために、選択される細菌菌株の連続的に順次単コロニー単離することによって作製される。滅菌培地を含む滅菌培養容器（複合培地、例えばＬＢまたはＭＳＢＢまたは定義される培地、例えば、適切な栄養素が追加されたＭ９とすることができる）は、単一の完全に単離された細菌性コロニーを接種し、細菌は、例えば、３７℃で振とうしながらインキュベートすることによって複製させる。次いで、細菌は、凍結保護剤（複数可）を含む溶液中に懸濁することによって低温保存するために調製される。

凍結保護剤の例としては、ヒトまたはウシ血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリン等のタンパク質；単糖類（ガラクトース、Ｄ－マンノース、ソルボース等）およびそれらの非還元誘導体（例えば、メチルグルコシド）、二糖類（トレハロース、スクロース等）、シクロデキストリン、およびポリサッカライド（ラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン等）を含む炭水化物；アミノ酸（グルタミン酸、グリシン、アラニン、アルギニンまたはヒスチジン、トリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニン等）；ベタイン等のメチルアミン；３価以上の糖アルコール等のポリオール、例えば、グリセリン、エリスリトール、グリセロール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトール；プロピレングリコール；ポリエチレングリコール；界面活性剤、例えば、プルロニック；またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの有機硫黄化合物、およびこれらの組合せがある。凍結保護溶液は、溶液中に、塩（例えば、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、およびまたはリン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）等の緩衝剤、および当業者であれば公知の他のそのような緩衝剤も含んでいてもよい、１つまたは複数の凍結保護剤を含んでいてもよい。

凍結保存溶液中の細菌の懸濁液は、濃縮凍結保護剤（複数可）を培養材料に添加し、凍結解凍プロセス中の細菌の生存率を保持する最終濃度を達成することによって（例えば０．５％から２０％の最終濃度のグリセロール）、または細菌を採取し（例えば、遠心分離によって）、適切な最終濃度の凍結保護剤（複数可）を含む凍結保護剤溶液中に懸濁することによって達成することができる。次いで、凍結保護溶液中の細菌の懸濁液は、凍結状態下で完全な閉鎖を維持することができる容器閉鎖系を備えた適切な滅菌バイアル（プラスチックまたはガラス）中に充填される（例えば、ブチルストッパーおよび圧着シール）。次いで、マスター細胞バンクのバイアルを凍結する（速度制御された冷凍庫を用いてゆっくりと、または冷凍庫へ直接入れることで素早く）。次いで、ＭＣＢは、長期の生存能力を保持する温度で凍結保存される（例えば、－６０℃以下で）。解凍されたマスター細胞バンク材料は、適切な当局による規制によって同一性、純度、および活性を保証することを十分に特徴付けられる。

ワーキング細胞バンク（ＷＣＢ）はマスター細胞バンクとほぼ同じ方法で作製されるが、出発材料は、ＭＣＢに由来する。ＭＣＢ材料は、滅菌培地を含む発酵容器に直接移し、上記のように膨張させることができる。次いで、細菌を、凍結保護溶液中に懸濁し、容器中に充填し、密閉し、－２０℃以下で凍結する。複数のＷＣＢを、ＭＣＢ材料から作製することができ、ＷＣＢ材料は、追加の細胞バンク（例えば、製造業者のワーキング細胞バンクＭＷＣＢ）を作製するために使用することができる。ＷＣＢは凍結保存され、同一性、純度、および活性を確実にするために特徴付けられる。ＷＣＢ材料は、典型的には、遺伝子操作された細菌等の生物製剤の原薬の製造において使用される出発材料である。

ｂ．原薬の製造
原薬は、上述のようなｃＧＭＰの下で滅菌プロセスを使用して製造される。ワーキング細胞バンク材料は、典型的には、ｃＧＭＰの下で原薬を製造するための出発材料として使用されるが、他の細胞バンク（例えば、ＭＣＢまたはＭＷＣＢ）を使用することができる。滅菌プロセシングは、細菌性細胞ベース療法剤を含む全ての細胞療法剤を製造するために使用される。細胞バンクからの細菌は発酵によって膨張され、これは、プレ培養物を製造することによって（例えば、振とうフラスコ中で）または発酵槽へ直接接種することによって達成することができる。発酵は、滅菌バイオリアクター、または使い捨てであっても、再使用可能であってもよいフラスコ中で達成される。細菌は、濃縮することによって（例えば、遠心分離、連続遠心分離、または接線流ろ過によって）採取される。濃縮された細菌は、培地を緩衝液と交換することによって（例えば、ダイアフィルトレーション）培地構成成分および細菌性代謝産物から精製される。バルク薬物製品は、中間体として製剤化され、保存されるか（例えば、凍結または乾燥によって）、または薬物製品へと直接プロセシングされる。原薬は、同一性、強度、純度、潜在力、および品質に関して試験される。

ｃ．薬物製品の製造
薬物製品は、その最終容器中に含まれる活性物質の最終製剤として定義される。薬物製品は、ｃＧＭＰの下で滅菌プロセスを使用して製造される。薬物製品は、原薬から製造される。原薬は、必要に応じて解凍されるかまたは復元され、次いで適切な標的の強度に製剤化される。薬物製品の活性構成成分は生存している遺伝子操作された細菌であるため、強度は、懸濁液内に含まれるＣＦＵの数によって判定される。バルク製品は、以下に記載するような貯蔵および使用に適した最終製剤で希釈される。容器へ充填し、容器閉鎖系を用いて密閉し、薬物製品にラベル付けする。薬物製品は、適切な温度で貯蔵され、安定性を維持し、同一性、強度、純度、潜在力、および品質に関して試験を行い、特定の承認基準を満たす場合はヒトに使用するために発売される。

２．組成物
薬学的に許容される組成物は、規制当局または他の当局の承認を考慮して調製され、動物およびヒトにおいて使用するための一般的に認識されている薬局方に従って調製される。組成物は、溶液剤、懸濁剤、粉末剤、または持続放出製剤として調製することができる。典型的には、化合物は、当技術分野において周知の技術および手順を使用して医薬組成物へ製剤化される（例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126を参照のこと）。製剤は、投与様式に適合する必要がある。

組成物は、当業者であれば公知の任意の経路によって投与するために製剤化される場合があり、それらとしては、筋肉内、静脈内、皮内、病巣内、腹腔内注射、皮下、腫瘍内、硬膜外、経鼻、経口、膣内、直腸、局所、局在、耳内、吸入、バッカル（例えば舌下）、および経皮投与または任意の経路がある。投与の他の様式も検討される。投与は、処置の位置に応じて、局在的、局所的または全身的とすることができる。処置を必要とする領域への局在投与は、例えば、これらに限定されないが、手術中の局在注入、局所適用、例えば、手術後の創傷包帯との併用によって、注射によって、カテーテルを用いて、坐剤を用いて、または埋込剤を用いて達成することができる。組成物は、他の生物学的活性薬剤と共に、連続的に、間欠的にまたは同じ組成物内でのいずれかで投与することもできる。投与は、調節放出製剤を含む調節放出系およびポンプ等を用いるデバイス調節放出も含むことができる。

任意の所与の症例において最も好適な経路は、疾患の特質、疾患の進行、疾患の重症度および使用される特定の組成等の様々な因子によって決まる。医薬組成物は、各投与経路に適切な投薬形態として製剤化することができる。特に、組成物は、全身性、局在腹腔内、経口または直接投与のための任意の好適な医薬調製物へ製剤化することができる。例えば、組成物は、皮下、筋肉内、腫瘍内、静脈内または皮内で投与するために製剤化することができる。投与方法は、活性薬剤が、抗原性および免疫原性応答を介した免疫学的介入等の分解プロセスへ曝露されるのを減少させるために用いることができる。そのような方法の例としては、処置の部位における局在投与または連続注入がある。

免疫刺激性細菌は、経口投与のための溶液剤、懸濁剤、錠剤、分散錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤またはエリキシル剤、ならびに経皮パッチ調製物および乾燥粉末吸入器等の好適な医薬調製物へ製剤化することができる。典型的には、化合物は、当技術分野において周知の技術および手順を使用して医薬組成物へ製剤化される（例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126を参照のこと）。概して、製剤の様式は、投与経路の機能である。組成物は、乾燥（凍結乾燥または他のガラス化形態）または液体形態として製剤化することができる。組成物が乾燥形態として提供される場合、これらは、適切な緩衝液、例えば滅菌生理食塩水溶液を使用直前に添加することによって復元することができる。

３．製剤
ａ．液体剤、注射剤、乳剤
製剤は、投与経路に適合するように概して作製される。概して、皮下、筋肉内、腫瘍内、静脈内または皮内のいずれかでの注射または点滴によって特徴付けられる非経口投与が本明細書において検討される。非経口投与のための細菌の調製物としては、調製済み懸濁注射剤（直接投与）または凍結乾燥粉末剤等の使用前に解凍される凍結懸濁液、可溶性乾燥産物、使用直前に再懸濁溶液を組み合わせる調製済み製剤（ｒｅａｄｙ ｔｏ ｂｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｗｉｔｈ ａ ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｊｕｓｔ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｕｓｅ）、およびエマルションがある。凍結乾燥された製剤等の乾燥された熱安定製剤は、後で使用するための単位用量を貯蔵するために使用することができる。

医薬調製物は、凍結液体形態、例えば懸濁液とすることができる。凍結液体形態として提供される場合、薬物製品は、使用前に解凍され、治療有効濃度に希釈されることになる濃縮調製物として提供されることがある。

医薬調製物は、使用するための解凍または希釈を必要としない投薬量形態として提供されることもある。このような液体調製物は、必要に応じて、懸濁化剤（例えば、ソルビトール、セルロース誘導体または硬化食用脂肪）；乳化剤（例えば、レシチンまたはアカシア）；非水性媒体（例えば、アーモンド油、油性エステル、または分画された植物油）；および微生物療法と共に使用するために好適な保存剤等の薬学的に許容される添加物を用いて従来の手段によって調製することができる。医薬調製物は、使用前に水または他の滅菌された好適な媒体を用いて復元するための凍結乾燥またはスプレードライ等の乾燥形態で提供することができる。

好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、またはグリセロールである。溶液は水性であっても、非水性であってもよい。静脈内で投与される場合、好適な担体としては、生理学的生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、および静脈内水分補給のために使用される他の緩衝溶液がある。腫瘍内投与に関しては、グルコース、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコール、油エマルションおよびこれらの混合物等の増粘剤を含む溶液は、注射剤の局在化を維持するために適切な場合がある。

医薬組成物は、担体または他の賦形剤を含むことができる。例えば、本明細書において提供される医薬組成物は、希釈剤（複数可）、アジュバント（複数可）、抗付着剤（ａｎｔｉａｄｈｅｒｅｎｔ）（複数可）、結合剤（複数可）、被覆剤（複数可）、充填剤（複数可）、香味剤（複数可）、着色剤（複数可）、滑沢剤（複数可）、流動促進剤（複数可）、保存剤（複数可）、界面活性剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）（複数可）、または吸着剤（複数可）およびこれらの組合せのうちのいずれか１つまたは複数、または改変された治療用細菌と一緒に投与される媒体を含むことができる。例えば、非経口調製物において使用される薬学的に許容される担体または賦形剤としては、水性媒体、非水性媒体、等張化剤、緩衝液、抗酸化剤、局所麻酔剤（ｌｏｃａｌ ａｎｅｓｔｈｅｔｉｃｓ）、懸濁化剤および分散化剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤またはキレート化剤および他の薬学的に許容される物質がある。液体調製物を含む製剤は、薬学的に許容される添加物または賦形剤を用いた従来の手段によって調製することができる。

医薬組成物は、組成物と一緒に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体等の担体を含むことができる。好適な医薬担体の例は、"Remington's Pharmaceutical Sciences" by E. W. Martinに記載されている。このような組成物は、好適な量の担体と共に、一般的に精製された形態または部分的に精製された形態の治療有効量の化合物または薬剤を含み、その結果患者への投与に適切な形態を提供することになる。このような医薬担体は、水、および落花生油、ダイズ油、無機油、およびゴマ油等の石油、動物性、植物性または合成起源のものを含む油等の滅菌液体とすることができる。水は典型的な担体である。生理食塩水溶液および水性デキストロースおよびグリセロール溶液も、液体担体、特に注射用溶液として用いることができる。組成物は、ラクトース、スクロース、リン酸二カルシウム、またはカルボキシメチルセルロース等の希釈剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク等の滑沢剤；およびデンプン等の結合剤、アカシアガム等の天然ガム、ゼラチン、グルコース、糖蜜、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびこれらの誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当業者であれば公知の他のそのような結合剤を、活性成分と一緒に含むことができる。好適な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールがある。例えば、好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールである。必要に応じて、組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解促進剤、および例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートおよびシクロデキストリン等の他のそのような薬剤等の他の微量の非毒性補助物質も含むことができる。

非経口製剤において使用される薬学的に許容される担体としては、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張化剤、緩衝液、抗酸化剤、局所麻酔剤、懸濁化剤および分散化剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤またはキレート化剤および他の薬学的に許容される物質がある。水性媒体の例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロースおよび乳酸加リンゲル注射剤がある。非水性非経口媒体としては、植物由来の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油および落花生油がある。等張化剤としては、塩化ナトリウムおよびデキストロースがある。緩衝剤としては、リン酸塩およびクエン酸塩がある。抗酸化剤としては、重炭酸ナトリウムがある。局所麻酔剤としては、塩酸プロカインがある。懸濁化剤および分散化剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンがある。乳化剤としては、例えば、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ８０）等のポリソルベートがある。ＥＤＴＡ等の金属イオン封鎖剤または金属イオンキレート化薬剤も含まれることがある。医薬担体としては、水混和性媒体に関しては、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール、ならびにｐＨ調整剤に関しては、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸もある。非抗菌性保存剤を含んでいてもよい。

医薬組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解促進剤、ならびに、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートおよびシクロデキストリン等の他のそのような薬剤等の他の微量の非毒性補助物質も含み得る。一定レベルの投薬量が維持されるように、遅延放出または持続放出系を埋め込むことも本明細書において検討される（例えば、米国特許第３，７１０，７９５号を参照のこと）。そのような非経口組成物中に含まれる活性化合物の百分率は、これらの特定の性質、ならびに化合物の活性および対象の必要性に大きく依存する。

ｂ．熱安定性乾燥製剤
細菌は乾燥することができる。凍結乾燥または噴霧乾燥粉末およびガラス化ガラス（ｖｉｔｒｉｆｉｅｄ ｇｌａｓｓ）等の乾燥された熱安定製剤は、溶液、エマルションおよび他の混合物として投与するために復元することができる。乾燥された熱安定製剤を、上述の懸濁剤等の液体製剤のうちのいずれかから調製することができる。医薬製剤は、使用前に水または他の好適な媒体を用いて復元するための凍結乾燥またはガラス化形態として提供することができる。

熱安定性製剤は、滅菌溶液を用いて乾燥化合物を復元することによって投与するために調製される。溶液は、粉末から調製された活性物質または復元される溶液の安定性または他の薬理学的特性を改善する賦形剤を含むことができる。熱安定性製剤は、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたは他の好適な薬剤等の賦形剤を、クエン酸塩、リン酸ナトリウムまたはカリウム等の好適な緩衝液、または当業者であれば公知の他のそのような緩衝液中に溶解することによって調製される。その後、原薬を、得られた混合物へ加え、それが混合されるまで撹拌する。得られた混合物は、バイアル中に分配してから乾燥する。各バイアルは、１バイアル当たり１×１０^５～１×１０^１１ＣＦＵを含む単回投薬量を含むことになる。乾燥後、製品バイアルは、密閉されたバイアルに水分または混入物が侵入するのを阻止する容器閉鎖系を用いて密閉される。乾燥製品は、－２０℃、４℃、または室温等の適切な状態の下で貯蔵することができる。水または緩衝溶液を用いたこの乾燥製剤の復元は、非経口投与において使用するための製剤を提供する。正確な量は、処置される適応症および選択される化合物に依存する。このような量は、経験的に判定することができる。

４．他の投与経路のための組成物
処置される状態によって、局所適用、経皮パッチ等の非経口、経口および直腸投与に加えて他の投与経路も本明細書において検討される。上述の懸濁剤および散剤は、経口で投与することができるか、または経口投与のために復元することができる。直腸投与のための医薬投薬形態は、全身的な効果のための直腸坐剤、カプセル剤および錠剤およびゲルカプセル剤である。直腸坐剤は、体温で融解または軟化する直腸へ挿入するための固形物を含み、１つまたは複数の薬理学的または治療上活性成分を放出する。直腸坐剤中の薬学的に許容される物質は、融点を上げるための基剤または媒体および薬剤である。基剤の例としては、ココアバター（テオブロマ油）、グリセリンゼラチン、カーボワックス（ポリオキシエチレングリコール）および脂肪酸モノ－、ジ－およびトリグリセリドの適切な混合物がある。様々な基剤の組合せを使用することができる。坐剤の融点を上げるための薬剤としては、鯨ろうおよびワックスがある。直腸坐剤は、圧縮法によってまたは成形によって調製することができる。直腸坐剤の典型的な重量は、約２～３ｇｍである。直腸投与のための錠剤およびカプセル剤は、同じ薬学的に許容される物質を使用して、かつ経口投与のための製剤と同じ方法によって製造される。直腸投与に好適な製剤は、単位用量坐剤として提供されることもある。これらは、原薬を、１つまたは複数の従来の固形担体、例えば、ココアバターと混合し、次いで得られた混合物を成形することによって調製することができる。

経口投与に関しては、医薬組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトース、微晶質セルロースまたはリン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）；崩壊剤（例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；または湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）等の薬学的に許容される賦形剤を用いた従来の手段によって調製される、錠剤またはカプセル剤形態をとることができる。錠剤は、当技術分野において周知の方法によって被覆することができる。

バッカル（舌下）投与に好適な製剤としては、例えば、香味付けされた基剤、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性化合物を含むトローチ剤；およびゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア等の不活性ベース中に化合物を含むトローチ剤がある。

局所混合物は、局在および全身投与用に記載されているように調製される。得られた混合物は、溶液剤、懸濁剤、乳剤等とすることができ、クリーム剤、ゲル剤、軟膏剤、乳剤、溶液剤、エリキシル剤、ローション剤、懸濁剤、チンキ剤、ペースト剤、フォーム剤、エアゾール剤、洗浄剤、スプレー剤、坐剤、包帯、皮膚パッチ剤または局所投与に好適な任意の他の製剤として製剤化される。

組成物は、吸入によって等の局所適用のためのエアゾールとして製剤化することができる（例えば、米国特許第４，０４４，１２６号；同第４，４１４，２０９号および同第４，３６４，９２３号を参照されたく、これらは肺疾患の処置に有用であるステロイドのデリバリーのためのエアゾールを記載している）。これらの製剤は、気道へ投与するために、または吹入剤用のマイクロ微粉末として、単独でまたはラクトース等の不活性担体と組み合わせてネブライザー用のエアゾールまたは溶液の形態とすることができる。そのような場合では、製剤の粒子は、典型的には、５０ミクロン未満または１０ミクロン未満の直径を有するであろう。

化合物は、ゲル剤、クリーム剤、およびローション剤の形態で皮膚および眼内等の粘膜への局所適用のため、眼に適用するため、または槽内または髄腔内適用のための等の、局在または局所適用のために製剤化することができる。局所投与は、経皮デリバリー、また眼または粘膜投与、または吸入療法も考慮される。活性化合物のみまたは他の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた点鼻用溶液も、投与することができる。

経皮投与に好適な製剤が提供される。これらは、長時間にわたり受容者の表皮と密着し続けるように適合する個別のパッチ等の任意の好適な方式で提供されることもある。このようなパッチは、例えば活性化合物に対して０．１～０．２Ｍの濃度の緩衝されていてもよい水溶液中に、活性化合物を含む。経皮投与に好適な製剤も、イオン導入によってデリバリーすることができ（例えば、Tyle, P, (1986) Pharmaceutical Research 3(6):318-326を参照のこと）、典型的には、活性化合物の、緩衝されていてもよい水溶液の形態をとる。

医薬組成物は、調節放出製剤および／またはデリバリーデバイスによって投与することもできる（例えば、米国特許第３，５３６，８０９号；同第３，５９８，１２３号；同第３，６３０，２００号；同第３，８４５，７７０号；同第３，９１６，８９９号；同第４，００８，７１９号；同第４，７６９，０２７号；同第５，０５９，５９５号；同第５，０７３，５４３号；同第５，１２０，５４８号；同第５，５９１，７６７号；同第５，６３９，４７６号；同第５，６７４，５３３号および５，７３３，５６６を参照のこと）。

５．投薬量および投与
組成物は、単回投薬量または多回投薬量投与のために医薬組成物として製剤化することができる。免疫刺激性細菌は、処置された患者に対する不所望の副作用が無い場合は、治療有用効果に影響を与えるのに十分な量で含むことができる。例えば、薬学的活性化合物の濃度は、注射が、所望の薬理学的効果を生成するために有効量を提供できるように調整される。治療上有効な濃度は、本明細書において記載するまたは当技術分野において公知のアッセイを使用することによって等の、公知のインビトロおよびインビボ系において免疫刺激性細菌を試験することによって経験的に判定することができる。例えば、標準的な臨床的技術を用いることができる。インビトロアッセイおよび動物モデルは、最適な投薬量範囲の同定の助けとなるように用いることができる。経験的に判定することができる正確な用量は、患者または動物の年齢、重量、体表面積、および状態、投与される特定の免疫刺激性細菌、投与経路、処置されることになる疾患のタイプおよび疾患の重症度によって決まり得る。

したがって、処置の正確な投薬量および持続は、処置される疾患の関数であり、公知の試験プロトコールを使用するか、またはインビボまたはインビトロ試験データから外挿することによって経験的に判定できることは理解される。濃度および投薬量の値も、軽減されることになる状態の重症度に伴って変化する場合がある。任意の特定の対象に関しては、特定の投薬レジメンが組成物の投与を管理または監視する人の個々の必要性および専門家としての判断に従って経時的に調整されるはずであり、本明細書において示す濃度範囲は例示的なものにすぎず、組成物およびそれらを含む組合せの範囲または使用を限定することを意図するものではないことが更に理解される。組成物は、１時間ごとに、１日ごとに、１週ごとに、１ヶ月ごとに、１年ごとに、または１回投与することができる。概して、投薬レジメンは、毒性を制限するように選択する。担当医師であれば、毒性または骨髄、肝臓もしくは腎臓または他の組織機能障害のために治療法をいつどのように終了するか、中断するか、または調整し、投薬量を減少させるかを知っているであろう点に留意されたい。反対に、担当医師であれば、臨床応答が適切ではない場合に、いつどのように処置を高レベルに調整するかも知っているであろう（毒性の副作用を防ぐ）。

免疫刺激性細菌は、治療上有用な効果に影響を与えるのに十分な量で組成物中に含まれる。例えば、量は、がん等の過剰増殖性疾患または状態の処置において治療効果に達するものである。

薬学的にかつ治療上の活性化合物およびこれらの誘導体は、典型的には、単位投薬形態または多回投薬形態として製剤化され、投与される。各単位用量は、必須の医薬品担体、媒体または希釈剤と関連して、所望の治療効果を生成するのに十分な治療上の活性化合物のあらかじめ決められた量を含む。単位投薬形態としては、これらに限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、非経口懸濁剤、および経口用溶液剤または懸濁剤、および好適な量の化合物または薬学的に許容されるこれらの誘導体を含む油水エマルションがある。単位用量形態は、バイアル、アンプルおよび注射器中に含まれるか、または個々に包装された錠剤またはカプセル剤である場合もある。単位用量形態は、これらを分割するか、または複数回で投与することができる。複数回用量形態は、分離された単位用量形態として投与することになる単一の容器中に包装された複数の同一の単位投薬形態である。複数回用量形態の例としては、バイアル、錠剤もしくはカプセル剤のボトルまたはパイントまたはガロンのボトルがある。したがって、複数回用量形態は、包装中で分離されていない複数回単位用量である。概して、０．００５％から１００％の範囲の活性成分を、非毒性担体からなる残余と共に含む投薬形態または組成物を調製することができる。医薬組成物は、各投与経路に適切な投薬形態として製剤化することができる。

単位用量の非経口調製物は、アンプル、バイアルまたは針と共に注射器内に包装される。薬学的活性化合物を含む液体溶液または復元される粉末調製物の容量は、処置されることになる疾患および包装のために選択される特定の製造品の関数である。非経口投与のための全ての調製物は、公知であり、当技術分野において実施されるように滅菌されていなくてはならない。

示されるように、本明細書において提供される組成物は、当業者であれば公知の任意の経路のために製剤化することができ、それらとしては、これらに限定されないが、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、病巣内、腹腔内注射、硬膜外、膣内、直腸、局在、耳内、経皮投与または任意の投与経路がある。そのような経路に適した製剤は、当業者であれば公知である。組成物は、他の生物学的活性薬剤と共に、連続的に、間欠的にまたは同じ組成物内でのいずれかで投与することもできる。

医薬組成物は、調節放出製剤および／またはデリバリーデバイスによって投与することができる（例えば、米国特許第３，５３６，８０９号；同第３，５９８，１２３号；同第３，６３０，２００号；同第３，８４５，７７０号；同第３，８４７，７７０号；同第３，９１６，８９９号；同第４，００８，７１９号；同第４，６８７，６６０号；同第４，７６９，０２７号；同第５，０５９，５９５号；同第５，０７３，５４３号；同第５，１２０，５４８号；同第５，３５４，５５６号；同第５，５９１，７６７号；同第５，６３９，４７６号；同第５，６７４，５３３号および同第５，７３３，５６６号を参照のこと）。様々なデリバリー系が公知であり、選択される組成物を投与するために使用することができ、本明細書において使用を考慮され、そのような粒子は容易に作製することができる。

６．包装および製造物品
包装材料、本明細書において提供される任意の医薬組成物、および組成物が、本明細書において記載する疾患または状態を処置するために使用されることを示すラベルを含む製造物品も提供される。例えばラベルは、処置が、腫瘍またはがんのためのものであることを示す場合もある。

本明細書において記載する免疫刺激性細菌と別の治療薬剤の組合せも、製造中に包装することができる。１つの例において、製造品は、免疫刺激性細菌組成物を含む医薬組成物を含み、更なる薬剤または処置は含まない。他の例では、異なる抗がん剤等の別の更なる治療剤製造品である。この例では、薬剤は、製造物品として包装するために一緒にまたは個別に提供されることもある。

本明細書において提供される製造物品は、包装材料を含む。包装医薬製品において使用するための包装材料は、当業者には周知である。例えば、米国特許第５，３２３，９０７号、同第５，０５２，５５８号および同第５，０３３，２５２号を参照されたく、これらそれぞれは、その内容全体が本明細書において組み込まれるものとする。医薬品包装材料の例としては、これらに限定されるものではないが、ブリスター包装、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、注射器、瓶、および選択される製剤および意図される投与および処置の様式に好適な任意の包装材料がある。製造物品の例示的なものは、単一チャンバーおよび二重チャンバー容器を含む容器である。容器としては、これらに限定されるものではないが、チューブ、ボトルおよび注射器がある。容器は、静脈内投与用の針を更に含んでいてもよい。

パッケージの選択は、薬剤と、そのような組成物が一緒に包装されているか個別に包装されているかによって決まる。一般的に、包装は、そこに含まれる組成物と非反応性である。他の例では、構成成分の一部を、混合物のまま包装することができる。他の例では、全ての構成成分は個別に包装される。したがって、例えば構成成分は、投与直前に混合すると直接一緒に投与することができる個別の組成物として包装することができる。あるいは、構成成分は、個別に投与するための個別の組成物として包装することができる。

これらの製造物品を含む選択される組成物をキットとして提供することもできる。キットは、本明細書において記載する医薬組成物および製造品として提供される投与するためのアイテムを含むことができる。組成物は、投与するためのアイテム中に含まれることも、または後で添加するために個別に提供されることもある。キットは、投薬量、投薬レジメンを含む適用に関する取扱説明書、および投与様式に関する取扱説明書を含んでいてもよい場合がある。キットは、本明細書において記載する医薬組成物および診断のためのアイテムも含むことができる。

Ｉ．処置および使用の方法
本明細書で提供される方法は、がん等の疾患または状態を有する対象を処置するための免疫刺激性細菌を投与または使用する方法を含み、対象の症状はそのような細菌の投与によって改善または緩和され得る。特定の例では、疾患または状態は腫瘍またはがんである。更に、抗がん剤または抗ヒアルロナン剤等の処置用の１つまたは複数の追加の薬剤との併用療法の方法もまた提供される。細菌は、非経口、全身、腫瘍内等の局所および局部、静脈内、直腸、経口、筋肉内、粘膜ならびに他の経路を含むがこれらに限定されない任意の適切な経路によって投与することができる。各々に適した製剤が提供される。当業者は、適切なレジメンおよび用量を確立し、経路を選択することができる。

１．がんおよび腫瘍
本明細書で提供される免疫刺激性細菌、組合せ、使用および方法は、がん、特に、肺がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、胃がん、頭頸部がん、卵巣がん、肝臓がん、膵臓がん、腎臓がん、乳がん、結腸直腸がん、および前立腺がんを含む固形腫瘍を含む、全てのタイプの腫瘍の処置に適用可能である。方法はまた、血液がんに使用することもできる。

本明細書で提供される方法の使用による処置の対象となる腫瘍およびがんには、免疫系、骨格系、筋肉および心臓、乳房、膵臓、消化管、中枢および末梢神経系、腎臓系、生殖器系、呼吸器系、皮膚、結合組織系（関節、脂肪組織を含む）、ならびに循環器系（血管壁を含む）に起因するものが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で提供される免疫刺激性細菌で処置することができる腫瘍の例には、癌腫、神経膠腫、肉腫（脂肪肉腫を含む）、腺癌、腺肉腫、および腺腫が挙げられる。そのような腫瘍は、例えば、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸部または肝臓を含む身体の事実上全ての部分で生じ得る。

骨格系の腫瘍には、例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、および軟骨芽細胞腫等の肉腫および芽細胞腫が挙げられる。筋肉および心臓腫瘍には、骨格および平滑筋の両方の腫瘍、例えば、平滑筋腫（平滑筋の良性腫瘍）、平滑筋肉腫、横紋筋腫（骨格筋の良性腫瘍）、横紋筋肉腫、心臓肉腫が挙げられる。消化管の腫瘍には、例えば、口、食道、胃、小腸、結腸の腫瘍および結腸直腸腫瘍、ならびに唾液腺、肝臓、膵臓、および胆道等の消化分泌器官の腫瘍が挙げられる。中枢神経系の腫瘍には、脳、網膜、および脊髄の腫瘍が挙げられ、関連する結合組織、骨、血管または神経組織にも起因し得る。末梢神経系の腫瘍の処置もまた企図される。末梢神経系の腫瘍には、悪性末梢神経鞘腫瘍が挙げられる。腎臓系の腫瘍には、腎臓の腫瘍、例えば、腎細胞癌、ならびに尿管および膀胱の腫瘍が挙げられる。生殖器系の腫瘍には、子宮頸部、子宮、卵巣、前立腺、精巣および関連分泌腺の腫瘍が挙げられる。免疫系の腫瘍には、リンパ腫、例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の両方を含む血液ベースの腫瘍および固形腫瘍の両方が挙げられる。呼吸器系の腫瘍には、鼻腔、気管支および肺の腫瘍が挙げられる。乳房の腫瘍には、例えば、小葉癌および腺管癌の両方が挙げられる。

本明細書で提供される免疫刺激性細菌および方法によって処置され得る腫瘍の他の例には、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物、神経芽細胞腫、毛細血管芽細胞腫、髄膜腫および脳転移、メラノーマ、胃腸および腎臓の癌および肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽細胞腫（多形性神経膠芽細胞腫等）ならびに平滑筋肉腫が挙げられる。本明細書で提供される処置され得る他のがんの例には、リンパ腫、芽細胞腫、神経内分泌腫瘍、中皮腫、シュワン腫、髄膜腫、メラノーマ、および白血病またはリンパ性悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。そのようながんの例には、血液悪性腫瘍、例えば、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、有毛細胞白血病およびリンパ形質細胞性白血病）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、およびＴ細胞急性リンパ芽球性白血病／リンパ腫、胸腺腫を含むリンパ球前駆細胞の腫瘍、末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫および大顆粒リンパ球性白血病を含む成熟ＴおよびＮＫ細胞の腫瘍、ランゲルハンス細胞組織球症（Ｌａｎｇｅｒｈａｎｓ ｃｅｌｌ ｈｉｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ）、骨髄異常増殖（成熟を伴うＡＭＬ、分化を伴わないＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、および急性単球性白血病を含む急性骨髄性白血病等）、骨髄異形成症候群、ならびに慢性骨髄性白血病を含む慢性骨髄増殖性障害；神経膠腫、神経芽細胞腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、上衣腫、および網膜芽細胞腫等の中枢神経系の腫瘍；頭頸部の固形腫瘍（例えば、鼻咽腔がん、唾液腺癌、および食道がん）、肺（例えば、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌）、消化器系（例えば、胃腸がん、胆管または胆道のがん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、および肛門癌を含む胃部または胃がん）、生殖器系（例えば、精巣、陰茎、または前立腺がん、子宮、膣、外陰部、子宮頸、卵巣、および子宮内膜がん）、皮膚（例えば、メラノーマ、基底細胞癌、扁平上皮がん、光線角化症、皮膚メラノーマ）、肝臓（例えば、肝臓がん、肝臓癌、肝細胞がん、およびヘパトーマ）、骨（例えば、骨巨細胞腫、および溶骨性骨がん）更なる組織および臓器（例えば、膵臓がん、膀胱がんがん、腎臓または腎臓がん、甲状腺がん、乳がん、腹膜のがん、およびカポジ肉腫）、血管系腫瘍（例えば、血管肉腫および血管周囲細胞腫）、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、骨肉腫およびユーイング肉腫が挙げられる。

２．投与
本明細書の使用および方法の実施において、本明細書で提供される免疫刺激性細菌は、腫瘍を有するか、もしくは新生物細胞を有する対象、または免疫化される対象を含む対象に投与され得る。対象への免疫刺激性細菌の投与の前、同時または後に、免疫刺激性細菌の投与に適した状態を有する対象の診断、対象の免疫力の決定、対象の免疫化、化学療法剤による対象の処置、放射線による対象の処置、または対象の外科的処置を含むがこれらに限定されない１つまたは複数のステップが行われ得る。

治療目的で免疫刺激性細菌を腫瘍担持対象に投与することを含む実施形態に関して、対象は典型的には、新生物状態を有すると以前に診断されている。診断方法はまた、新生物状態のタイプの決定、新生物状態のステージの決定、対象における１つもしくは複数の腫瘍のサイズの決定、対象のリンパ節における転移性細胞もしくは新生物細胞の有無の決定、または対象の転移の存在の決定も含み得る。

免疫刺激性細菌を対象に投与する治療方法のいくつかの実施形態は、原発腫瘍のサイズまたは新生物疾患のステージの決定のステップを含んでもよく、原発腫瘍のサイズが閾値容量以上であるか、または新生物疾患のステージが閾値ステージ以上であれば、免疫刺激性細菌が対象に投与される。類似の実施形態において、原発腫瘍のサイズが閾値容量より下であるか、または新生物疾患のステージが閾値ステージ以下であれば、免疫刺激性細菌はまだ対象に投与されない。そのような方法は、腫瘍サイズまたは新生物疾患ステージが閾値量に達するまで対象をモニタリングすること、および次いで免疫刺激性細菌を対象に投与することを含み得る。閾値サイズは、腫瘍の成長速度、腫瘍に感染する免疫刺激性細菌の能力、および対象の免疫力を含むいくつかの要因によって異なり得る。一般的に閾値サイズは、宿主の免疫系によって完全に除去されることなく、免疫刺激性細菌が腫瘍中または腫瘍の近くに蓄積および複製するのに十分なサイズであり、典型的には、宿主が腫瘍細胞に対する免疫応答を高めるのに十分な長さの時間、典型的には約１週間以上、約１０日以上、または約２週間以上にわたって細菌感染を持続するのに十分なサイズでもあるであろう。例示的な閾値ステージは、最も低いステージ（例えば、ステージＩまたは同等）を超える任意のステージ、または原発腫瘍が閾値サイズより大きい任意のステージ、または転移性細胞が検出される任意のステージである。

投与様式により、免疫刺激性細菌の腫瘍または転移への進入が可能になることを条件に、対象への微生物の任意の投与様式が使用され得る。投与様式には、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、腫瘍内、多重穿刺、吸入、鼻腔内、経口、体腔内（例えば、カテーテルを介した膀胱への投与、坐剤または浣腸による腸への投与）、耳、直腸、および眼投与が挙げられ得るが、これに限定されない。

当業者は、対象および細菌に適合し、また、細菌が腫瘍および／または転移腫瘍に達する結果をもたらす可能性がある任意の投与様式を選択することができる。投与経路は、疾患の性質、腫瘍の種類、および医薬組成物に含有された特定の細菌を含む任意の様々な要因に従って、当業者によって選択され得る。標的部位への投与は、例えば、コロイド分散系として弾道的デリバリー（ｂａｌｌｉｓｔｉｃ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）によって行うことができ、または全身投与は、動脈への注射によって行うことができる。

投与レジメンは、任意の様々な方法および量であり得、公知の臨床的要因に従って当業者によって決定され得る。単回投与は、免疫刺激により処置が達成される疾患または障害の処置に治療効果がある場合がある。そのような刺激の例は、特異的免疫応答および非特異的免疫応答の一方または両方、特異的および非特異的応答の両方、自然応答、一次免疫応答、適応免疫、二次免疫応答、記憶免疫応答、免疫細胞活性化、免疫細胞増殖、免疫細胞分化、ならびにサイトカイン発現を含むが、これらに限定されない免疫応答である。

医学分野で公知のとおり、対象のための投与量は、対象の種、サイズ、体表面積、年齢、性別、免疫力、および全般的健康状態、投与される特定の細菌、投与の期間および経路、疾患の種類およびステージ、例えば、腫瘍サイズ、ならびに同時に投与される薬物等の他の化合物を含む多くの要因に依存し得る。上記の要因に加えて、当業者によって決定され得るようなレベルが、細菌の感染力および細菌の性質によって影響される場合がある。本方法では、細菌の適当な最小投与量レベルは、腫瘍または転移において細菌が生存、成長および複製するのに十分なレベルとなり得る。細菌を６５ｋｇのヒトに投与するための例示的な最小レベルは、少なくとも約５×１０^６コロニー形成単位（ＣＦＵ）、少なくとも約１×１０^７ＣＦＵ、少なくとも約５×１０^７ＣＦＵ、少なくとも約１×１０^８ＣＦＵ、または少なくとも約１×１０^９ＣＦＵを含み得る。本方法では、細菌の適当な最大投与量レベルは、宿主に有害でないレベル、３×以上の脾腫を引き起こさないレベル、約１日後または約３日後または約７日後に正常組織または臓器にコロニーまたはプラークをもたらさないレベルとなり得る。細菌を６５ｋｇのヒトに投与するための例示的な最大レベルは、約５×１０^１１ＣＦＵ以下、約１×１０^１１ＣＦＵ以下、約５×１０^１０ＣＦＵ以下、約１×１０^１０ＣＦＵ以下、または約１×１０^９ＣＦＵ以下を含み得る。

本明細書で提供される方法および使用には、対象への免疫刺激性細菌の単回投与もしくは対象への免疫刺激性細菌の複数回投与、または他の抗腫瘍療法および／もしくは処置との併用療法を含む様々なレジメンの他の投与が挙げられ得る。これらには、改変免疫細胞の投与等の細胞療法、ＣＡＲ－Ｔ療法、ＣＲＩＳＰＲ療法、抗体等のチェックポイント阻害剤、およびヌクレオシド類似体等の化学療法化合物、手術および放射線療法が挙げられる。

いくつかの実施形態において、単回投与は、細菌が定着することができ、対象における抗腫瘍応答を引き起こすかまたは強化することができる腫瘍において免疫刺激性細菌を確立するのに十分である。他の実施形態において、本明細書の方法における使用に提供される免疫刺激性細菌は、典型的には少なくとも１日、時間的に隔てられた異なる機会に投与されてもよい。別々の投与は、細菌を腫瘍または転移にデリバリーする上で前回の投与が無効になっている可能性がある腫瘍または転移に、細菌をデリバリーする可能性を高めることができる。実施形態において、別々の投与は、細菌の定着／増殖が生じ得るか、またはさもなければ腫瘍に蓄積された細菌の力価を高め得る腫瘍または転移上の場所を増加させることができ、宿主の抗腫瘍免疫応答の誘発または強化を増加させることができる。

別々の投与が行われる場合、各投与は、他の投与量と比べて同じであるかまたは異なる投与量であってもよい。１つの実施形態において、全て投与量は同じである。他の実施形態において、初回の投与量は、１つまたは複数のその後の投与量より大きい、例えば、その後の投与量より少なくとも１０×大きい、少なくとも１００×大きい、または少なくとも１０００×大きい投与量であってもよい。初回の投与量が１つまたは複数のその後の投与量を超える別々の投与の方法の１つの例では、全てその後の投与量は、初回の投与と比べて同量、少量であってもよい。

別々の投与は、２、３、４、５または６回投与を含む２回以上の投与の任意の回数を含んでもよい。当業者は、治療方法をモニタリングするための当技術分野で公知の方法および本明細書で提供される他のモニタリング方法に従って、行う投与の回数、または１つもしくは複数の追加の投与を行うことの望ましさを容易に決定することができる。したがって、本明細書で提供される方法は、対象をモニタリングすること、およびモニタリングの結果に基づき１つまたは複数の追加の投与を提供するか否かを決定することによって投与の回数が決定され得る、免疫刺激性細菌の１つまたは複数の投与を対象に提供する方法を含む。１つまたは複数の追加の投与を提供するか否かの決定は、腫瘍成長の徴候または腫瘍成長の阻害、新たな転移の出現または転移の阻害、対象の抗細菌抗体力価、対象の抗腫瘍抗体力価、対象の健康全般および対象の体重を含むがこれらに限定されない様々なモニタリング結果に基づき得る。

投与間の期間は、任意の様々な期間であり得る。投与間の期間は、投与の回数との関連で記載されたようなモニタリングステップ、対象が免疫応答を高める期間、対象が正常組織から細菌を排除する期間、または腫瘍もしくは転移腫瘍における細菌定着／増殖の期間を含む任意の様々な要因の関数であり得る。１つの例では、期間は、対象が免疫応答を高める期間の関数であってもよい。例えば、期間は、対象が免疫応答を高める期間を超えてもよく、例えば、約１週間超、約１０日超、約２週間超、または約１ヶ月超であってもよい。別の例では、期間は、対象が免疫応答を高める期間に満たなくてもよく、例えば、約１週間未満、約１０日未満、 約２週間未満、または約１ヶ月未満であってもよい。別の例では、期間は、腫瘍または転移における細菌定着／増殖の期間の関数であってもよい。例えば、期間は、検出可能なマーカーを発現する微生物の投与後、検出可能なシグナルが腫瘍または転移で発生する時間を超えてもよく、例えば、約３日、約５日、約１週間、約１０日、約２週間、または約１ヶ月であってもよい。

本明細書で使用される方法はまた、本明細書で提供される免疫刺激性細菌を含有する懸濁液および他の製剤等の組成物を投与することによって行われてもよい。そのような組成物は、本明細書で提供されるまたは当業者に公知の細菌および薬学的に許容される賦形剤または媒体を含有する。

上記に論じたように、本明細書で提供される使用および方法はまた、免疫刺激性細菌の対象への投与に加えて、投与抗腫瘍化合物または他のがん治療薬等の１つまたは複数の治療化合物の対象への投与も含み得る。治療化合物は、腫瘍治療効果に関して独立に、または免疫刺激性細菌と併用して作用し得る。独立に作用し得る治療化合物には、腫瘍成長を阻害し、転移成長および／または形成を阻害し、腫瘍または転移のサイズを減少させ、腫瘍に蓄積し腫瘍中で複製する免疫刺激性細菌の能力を低減することなく腫瘍または転移を排除し、ならびに対象における抗腫瘍免疫応答を引き起こすかまたは強化することができる、任意の様々な既知の化学療法化合物が挙げられる。そのような化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏｓｐｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）等のアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン等のスルホン酸アルキル；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン等のアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン等の抗副腎剤；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン等の抗アンドロゲン剤；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カルビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポルフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン等の抗生物質；例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む抗エストロゲン剤；メトトレキセートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）等の代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート等の葉酸類似体；ベンゾデパ、カルボコン、メツレデパ、およびウレデパ等のアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロールメラミンを含めむエチレンイミンおよびメチルメラミン；ホリン酸等の葉酸補充剤；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチン等のニトロソウレア；シスプラチンおよびカルボプラチン等の白金類似体；ビンブラスチン；白金；アルギニンデイミナーゼおよびアスパラギナーゼ等のタンパク質；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン等のプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵ等のピリミジン類似体；パクリタキセルおよびドセタキセルおよびならびにそのアルブミネート形態（すなわち、ナブパクリタキセルおよびナブドセタキセル）等のタキサン、トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ ２０００；チミジル酸合成酵素阻害剤（トムデックス等）；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキセート；デホスファミド；デメコルシン；ジアジコン；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；エフロルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；レチノイン酸；エスペラマイシン；カペシタビン；およびイリノテカン等のトポイソメラーゼ阻害剤を含む追加の化学療法薬が挙げられるが、これらに限定されない。上記の任意の薬学的に許容される塩、酸または誘導体もまた使用することができる。

免疫刺激性細菌と併用して作用する治療化合物には、例えば、ＰＤ－Ｌ１、もしくはＴＲＥＸ１等のチェックポイント遺伝子、または他のチェックポイント遺伝子の発現を阻害、抑制または遮断する、ｓｈＲＮＡおよびｍｉＲＮＡ等のＲＮＡｉの発現を増加させることによって、例えば、細菌の特性を誘発する免疫応答を増加させる化合物、または細菌の定着／増殖を更に増大することができる化合物が挙げられる。例えば、遺伝子発現変更化合物は、例えば、１つまたは複数のチェックポイント遺伝子の発現を阻害、抑制または遮断し、それによって免疫応答を惹起するｓｈＲＮＡをコードする、細菌中の外来遺伝子等の遺伝子の転写を誘導または増加することができる。ＩＰＴＧおよびＲＵ４８６を含む、遺伝子発現を変更することができる任意の多種多様な化合物は、当技術分野で公知である。発現が上方調節され得る例示的な遺伝子には、毒素、プロドラッグを抗腫瘍薬に変換することができる酵素、サイトカイン、転写調節タンパク質、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、およびリボザイムを含むタンパク質およびＲＮＡ分子が挙げられる。他の実施形態において、定着／増殖または細菌の特性を誘発する免疫応答を増加させるために免疫刺激性細菌と併用して作用し得る治療化合物は、細菌に発現される遺伝子産物と相互作用し得る化合物であり、そのような相互作用は、腫瘍細胞の死滅の増加、または対象における抗腫瘍免疫応答の増加をもたらすことができる。細菌に発現される遺伝子産物と相互作用し得る治療化合物には、例えばプロドラッグまたは他の化合物が挙げられ得る。該化合物は、対象に投与される形態においては毒性または他の生物活性がほとんどないかまたはないが、細菌に発現される遺伝子産物と相互作用した後、化合物は、細胞毒性、アポトーシスを誘導する能力、または免疫応答を誘発する能力を含むがこれらに限定されない、腫瘍細胞死をもたらす特性を発現し得る。ガンシクロビル、５－フルオロウラシル、６－メチルプリンデオキシリボシド、セファロスポリン－ドキソルビシン、４－［（２－クロロエチル）（２－メスロキシエチル（ｍｅｓｕｌｏｘｙｅｔｈｙｌ））アミノ］ベンゾイル－Ｌ－グルタミン酸、アセトアミノフェン、インドール－３－酢酸、ＣＢ１９５４、７－エチル－１０－［４－（１－ピペリジノ）－１－ピペリジノ］カルボニルオキシカンプトテシン（ｃａｒｂｏｎｙｌｏｘｙｃａｍｐｏｔｏｔｈｅｃｉｎ）、ビス－（２－クロロエチル）アミノ－４－ヒドロキシフェニルアミノメタノン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｏｎｅ）２８、１－クロロメチル－５－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロ（ｄｉｈｙｒｏ）－３Ｈ－ベンズ［ｅ］インドール、エピルビシン－グルクロニド（ｇｌｕｃｏｒｏｎｉｄｅ）、５’－デオキシ５－フルオロウリジン、シトシンアラビノシド、およびリナマリンを含む様々なプロドラッグ様物質が当技術分野で公知である。

３．モニタリング
本明細書で提供される方法は、対象をモニタリングする、腫瘍をモニタリングする、および／または対象に投与される免疫刺激性細菌をモニタリングする１つまたは複数のステップを更に含んでもよい。腫瘍サイズのモニタリング、転移の存在および／またはサイズのモニタリング、対象のリンパ節のモニタリング、対象の体重または血液もしくは尿マーカーを含む他の健康指標のモニタリング、抗細菌抗体力価のモニタリング、検出可能な遺伝子産物の細菌発現のモニタリング、ならびに対象の腫瘍、組織または臓器における細菌力価の直接モニタリングを含むがこれらに限定されない任意の様々なモニタリングステップが、本明細書で提供される方法に含まれ得る。

モニタリングの目的は、対象の健康状態もしくは対象の治療的処置の進展を単に評価するためであってもよく、あるいは同じもしくは異なる免疫刺激性細菌の更なる投与が正当とされるか否かを決定するため、または化合物が治療方法の有効性を高めるように作用し得る、もしくは化合物が対象に投与される細菌の病原性を減少させるように作用し得る対象に、化合物をいつ投与するか、もしくは投与するか否かを決定するためであってもよい。

いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法は、細菌によって発現される１つまたは複数の遺伝子のモニタリングを含んでもよい。本明細書で提供されるかまたはさもなければ当技術分野で公知の細菌等の細菌は、検出可能なタンパク質を含むがこれに限定されない、１つまたは複数の検出可能な遺伝子産物を発現することができる。

本明細書で提供されるとおり、細菌で発現される検出可能な遺伝子産物の測定により、対象に存在する細菌のレベルの正確な決定を提供することができる。本明細書で更に提供されるとおり、例えば断層撮影方法を含むイメージング方法による検出可能な遺伝子産物の位置の測定により、対象における細菌の局在を決定することができる。したがって、検出可能な細菌遺伝子産物のモニタリングを含む本明細書で提供される方法は、対象の１つもしくは複数の臓器または組織中の細菌の有無、および／または対象の腫瘍もしくは転移腫瘍中の細菌の有無を決定するのに使用することができる。更に、検出可能な細菌遺伝子産物のモニタリングを含む本明細書で提供される方法は、１つまたは複数の臓器、組織、腫瘍または転移に存在する細菌の力価を決定するのに使用することができる。正常組織および臓器の細菌感染、および特に感染レベルが細菌の病原性を示唆し得ることから、対象における細菌の局在および／または力価のモニタリングを含む方法は、細菌の病原性の決定に使用することができる。対象における免疫刺激性細菌の局在および／または力価のモニタリングを含む方法は、複数の時点で行うことができ、したがって、対象の１つまたは複数の臓器または組織における細菌複製速度を含む、対象における細菌複製速度を決定することができる。したがって、細菌遺伝子産物のモニタリングを含む方法は、細菌の複製能の決定に使用することができる。本明細書で提供される方法はまた、様々な臓器または組織、および腫瘍または転移に存在する免疫刺激性細菌の量を定量化するのに使用することもでき、それによって、対象における細菌の優先的な蓄積の程度を示唆することができる。したがって、細菌遺伝子産物モニタリングは、正常組織または臓器より優先して腫瘍または転移に蓄積する細菌の能力を決定する方法において使用することができる。本明細書で提供される方法で使用される免疫刺激性細菌は、腫瘍全体に蓄積し得るか、または腫瘍中の複数の部位に蓄積し得、および転移腫瘍にも蓄積し得ることから、細菌遺伝子産物をモニタリングするための本明細書で提供される方法は、対象に存在する腫瘍のサイズまたは転移の数を決定するのに使用することができる。腫瘍または転移中の細菌遺伝子産物のそのような存在の、時間の範囲にわたるモニタリングは、腫瘍の成長もしくは縮小、または新たな転移の発生もしくは転移の消失を含む腫瘍または転移中の変化を評価するのに使用することができ、また、腫瘍の成長もしくは縮小の速度、または新たな転移の発生もしくは転移の消失、または腫瘍の成長もしくは縮小の速度の変化、または新たな転移の発生もしくは転移の消失を決定するのに使用することもできる。したがって、細菌遺伝子産物のモニタリングは、腫瘍の成長もしくは縮小の速度、または新たな転移の発生もしくは転移の消失、または腫瘍の成長もしくは縮小の速度の変化、または新たな転移の発生もしくは転移の消失を決定することによって、対象における新生物疾患のモニタリング、または新生物疾患の処置の有効性の決定に使用することができる。

任意の様々な検出可能なタンパク質は、モニタリングによって検出することができる。該タンパク質の例は、任意の様々な蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質）、任意の様々なルシフェラーゼ、輸送タンパク質もしくは他の鉄結合タンパク質；または受容体、結合タンパク質もしくは抗体を特異的に結合する化合物が、検出可能な薬剤であり得るか、もしくは検出可能な物質（例えば、放射性核種またはイメージング剤）で標識され得る、受容体、結合タンパク質、および抗体である。

腫瘍および／または転移腫瘍サイズは、外部評価方法または断層撮影もしくは磁気イメージング方法を含む、当技術分野で公知の任意の様々な方法によってモニタリングすることができる。当技術分野で公知の方法に加えて、本明細書で提供される、例えば、細菌遺伝子発現をモニタリングする方法は、腫瘍および／または転移腫瘍サイズのモニタリングに使用することができる。

いくつかの時点にわたるサイズのモニタリングは、腫瘍または転移のサイズの増加または減少に関する情報を提供することができ、また、対象における追加の腫瘍および／または転移腫瘍の存在に関する情報を提供することもできる。いくつかの時点にわたる腫瘍サイズのモニタリングは、対象における新生物疾患の処置の有効性を含む、対象における新生物疾患の発生に関する情報を提供することができる。

本明細書で提供される方法はまた、対象への免疫刺激性細菌の投与に応答して産生される抗体を含む、対象における抗体力価のモニタリングも含み得る。本明細書で提供される方法において投与される細菌は、内因性細菌抗原に対する免疫応答を誘発することができる。本明細書で提供される方法において投与される細菌はまた、細菌によって発現される外来遺伝子に対する免疫応答を誘発することもできる。本明細書で提供される方法において投与される細菌はまた、腫瘍抗原に対する免疫応答を誘発することもできる。細菌抗原、細菌によって発現される外来遺伝子産物、または腫瘍抗原に対する抗体力価のモニタリングは、細菌の毒性のモニタリング、処置方法の有効性のモニタリング、または産生および／もしくは採取に関する遺伝子産物もしくは抗体のレベルのモニタリングに使用することができる。

抗体力価のモニタリングは、細菌の毒性をモニタリングするのに使用することができる。細菌に対する抗体力価は、対象への細菌の投与後の期間にわたって変わり得、いくつかの特定の時点では、低い抗（細菌抗原）抗体力価はより高い毒性を示唆し得るが、他の時点では、高い抗（細菌抗原）抗体力価がより高い毒性を示唆し得る。本明細書で提供される方法において使用される細菌は免疫原性であり得、したがって、対象への細菌の投与直後に免疫応答を誘発し得る。対象の免疫系が、全ての正常な臓器または組織から細菌を除去することができる場合、一般的に、対象の免疫系が強い免疫応答を高めることができる免疫刺激性細菌は、低い毒性を有する細菌である可能性がある。故に、いくつかの実施形態において、対象に細菌を投与した直後の細菌抗原に対する高い抗体力価は、細菌の低い毒性を示唆している可能性がある。

他の実施形態において、抗体力価のモニタリングは、処置方法の有効性をモニタリングするのに使用することができる。本明細書で提供される方法において、抗（腫瘍抗原）抗体力価等の抗体力価は、新生物疾患を処置するための治療方法等の治療方法の有効性を示唆し得る。本明細書で提供される治療方法は、腫瘍および／または転移腫瘍に対する免疫応答を引き起こすかまたは強化することを含み得る。故に、抗（腫瘍抗原）抗体力価をモニタリングすることによって、腫瘍および／または転移腫瘍に対する免疫応答を引き起こすかまたは強化する上での治療方法の有効性をモニタリングすることが可能である。

他の実施形態において、抗体力価のモニタリングは、産生および／または採取に関する遺伝子産物または抗体のレベルのモニタリングに使用することができる。本明細書で提供されるとおり、方法は、腫瘍に蓄積した微生物で外来遺伝子を発現させることによって、タンパク質、ＲＮＡ分子または他の化合物、特にｓｈＲＮＡ等のＲＮＡ分子を産生するために使用され得る。タンパク質、ＲＮＡ分子または他の化合物に対する抗体力価のモニタリングは、腫瘍蓄積微生物によるタンパク質、ＲＮＡ分子または他の化合物の産生レベルを示唆することができ、また、そのようなタンパク質、ＲＮＡ分子または他の化合物に特異的な抗体のレベルを直接示唆することもできる。

本明細書で提供される方法はまた、対象の健康をモニタリングする方法も含み得る。本明細書で提供される方法のいくつかは、新生物疾患治療方法を含む治療方法である。対象の健康のモニタリングは、当技術分野で公知のように、治療方法の有効性を決定するのに使用することができる。本明細書で提供される方法はまた、本明細書で提供される免疫刺激性細菌を対象に投与するステップを含むこともできる。対象の健康のモニタリングは、対象に投与される免疫刺激性細菌の病原性を決定するのに使用することができる。新生物疾患、感染症、または免疫関連疾患等の疾患をモニタリングするための任意の様々な健康診断方法が、当技術分野で公知のようにモニタリングされてもよい。例えば、対象の体重、血圧、脈拍、呼吸、血色、体温または他の観察可能な状態は、対象の健康を示唆し得る。更に、対象由来の試料中の１つまたは複数の成分の有無またはレベルは、対象の健康を示唆し得る。典型的な試料には、血液および尿試料が挙げられ得、１つまたは複数の成分の有無またはレベルが、例えば、血液パネルまたは尿パネル診断検査を行うことによって決定され得る。対象の健康を示唆する例示的な成分には、白血球数、ヘマトクリット、およびｃ反応性タンパク質濃度が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で提供される方法は、治療的判断がモニタリングの結果に基づき得る治療のモニタリングを含み得る。本明細書で提供される治療方法は、細菌が腫瘍および／または転移腫瘍に優先的に蓄積し得、ならびに細菌が抗腫瘍免疫応答を引き起こすかまたは強化し得る、対象への免疫刺激性細菌の投与を含み得る。そのような治療方法は、特定の免疫刺激性細菌の複数回投与、第２の免疫刺激性細菌の投与、または治療化合物の投与を含む様々なステップを含み得る。対象に投与する免疫刺激性細菌または化合物の量、タイミングまたはタイプの決定は、対象のモニタリングからの１つまたは複数の結果に基づき得る。例えば、低い抗体力価が、追加の免疫刺激性細菌、異なる免疫刺激性細菌、および／または細菌遺伝子発現を誘導する化合物、もしくは免疫刺激性細菌とは独立して有効である治療化合物等の治療化合物を投与することの望ましさを示唆し得る場合、例えば、対象における抗体力価は、免疫刺激性細菌および適宜化合物を投与することが望ましいか否か、投与する細菌および／または化合物の量、ならびに投与する細菌および／または化合物のタイプを決定するのに使用することができる。

別の例では、例えば、対象が健康であることの決定が、追加の細菌、異なる細菌、または細菌遺伝子（例えば、１つまたは複数のチェックポイント遺伝子を阻害するｓｈＲＮＡ）発現を誘導する化合物等の治療化合物を投与することの望ましさを示唆し得る場合、対象の全般的健康状態は、免疫刺激性細菌および適宜化合物を投与することが望ましいか否か、投与する細菌または化合物の量、ならびに投与する細菌および／または化合物のタイプを決定するのに使用することができる。別の例では、例えば、対象が健康であることの決定が、追加の細菌、異なる細菌、または細菌遺伝子（例えば、１つまたは複数のチェックポイント遺伝子を阻害するｓｈＲＮＡ）発現を誘導する化合物等の治療化合物を投与することの望ましさを示唆し得る場合、検出可能な細菌によって発現される遺伝子産物のモニタリングは、免疫刺激性細菌および適宜化合物を投与することが望ましいかどうか、投与する細菌および／または化合物の量、ならびに投与する細菌および／または化合物のタイプを決定するのに使用することができる。そのようなモニタリング方法は、治療方法が有効であるか否か、治療方法が対象にとって病原性であるか否か、細菌が腫瘍または転移に蓄積しているか否か、および細菌が正常組織または臓器に蓄積しているか否かを決定するのに使用することができる。そのような決定に基づき、更なる治療方法の望ましさおよび形態が得られ得る。

別の例では、モニタリングは、免疫刺激性細菌が対象の腫瘍または転移に蓄積しているか否かを決定することができる。そのような決定をすると、対象に追加の細菌、異なる免疫刺激性細菌および適宜化合物を更に投与する判断を下すことができる。

Ｊ．実施例
以下の例は例示目的のみで含まれ、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。

例示的な遺伝子改変免疫刺激性細菌株および命名の概要：

サルモネラａｓｄ遺伝子ノックアウト株遺伝子改変
株ＡＳＴ－１０１を調製した。株ＡＳＴ－１０１は、ａｓｄ^－（ａｓｄ遺伝子ノックアウト）になるように遺伝子改変されているＹＳ１６４６（ＡＴＣＣから購入することができる、カタログ＃ ２０２１６５）に由来する弱毒化サルモネラ・ティフィムリウムである。この例では、サルモネラ・ティフィムリウム株ＹＳ１６４６ ａｓｄ^－遺伝子欠失は、図１に概説され、以下に記載されるように、DatsenkoおよびWanner［Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645（2000）］の方法の変更形態を使用して遺伝子改変した。

ラムダレッドヘルパープラスミドのＹＳ１６４６への導入
ＹＳ１６４６株は、以前に記載されているように［Sambrook J., (1998), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory］、培養物をＬＢで成長させ、１００倍濃縮し、氷冷１０％グリセロールで３回洗浄してエレクトロコンピテントになるように調製した。エレクトロコンピテントな株に、０．２ｃｍギャップキュベットを使用して以下の設定：２．５ｋＶ、１８６ｏｈｍ、５０μＦでラムダレッドヘルパープラスミドｐＫＤ４６（配列番号２１８）を電気穿孔した。ｐＫＤ４６を担持する形質転換体を、アンピシリンおよび１ｍＭ Ｌ－アラビノースを含む５ｍＬ ＳＯＣ培地、３０℃で成長させ、アンピシリンを含有するＬＢ寒天プレートで選択した。ラムダレッドヘルパープラスミドｐＫＤ４６を含有するＹＳ１６４６クローンを、次いで、上記に記載したようにＹＳ１６４６用にエレクトロコンピテントにした。

ａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットの構築
ＹＳ１６４６のゲノム由来のａｓｄ遺伝子［Broadway et al. (2014) J. Biotechnology 192:177-178］を、ａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットの設計に使用した。ａｓｄ遺伝子の左側および右側領域に相同な２０４および２０３ｂｐをそれぞれ含有するプラスミドを、ＤＨ５－アルファコンピテント細胞に形質転換した。ｌｏｘ Ｐ部位と隣接するカナマイシン遺伝子カセットを、このプラスミドにクローニングした。ａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットを、次いで、プライマーａｓｄ－１およびａｓｄ－２（表１）を使用してＰＣＲ増幅し、ゲル精製した。

ａｓｄ遺伝子欠失の実行
プラスミドｐＫＤ４６を担持するＹＳ１６４６株に、ゲル精製した直鎖状ａｓｄ遺伝子ノックアウトカセットを電気穿孔した。電気穿孔細胞をＳＯＣ培地に回収し、カナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびジアミノピメリン酸（ＤＡＰ、５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ寒天プレートにプレーティングした。このステップ中、ラムダレッドリコンビナーゼは、染色体ａｓｄ遺伝子とｋａｎカセットとの相同組換えを誘導し（染色体ａｓｄ遺伝子の上流および下流の相同な隣接配列の存在のため）、ａｓｄ遺伝子の染色体コピーのノックアウトが起こる。選択したカナマイシン耐性クローンにおける破壊されたａｓｄ遺伝子の存在を、破壊部位に隣接するＹＳ１６４６ゲノム由来のプライマー（プライマーａｓｄ－３）およびマルチクローニング部位由来のプライマー（プライマーｓｃＦｖ－３）を用いたＰＣＲ増幅によって確認した（表１）。また、ＤＡＰ栄養要求性を証明するために、補充ＤＡＰを含むおよび含まないＬＢプレートにコロニーをレプリカプレーティングした。ａｓｄ遺伝子欠失を有する全てのクローンは補充ＤＡＰの非存在下では成長できず、ＤＡＰ栄養要求性を証明した。

カナマイシン遺伝子カセット除去
ｋａｎ選択マーカーは、Ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位特異的組換え系を使用して除去した。ＹＳ１６４６ ａｓｄ^－遺伝子Ｋａｎ^Ｒ突然変異体を、ｐＪＷ１６８（ｃｒｅリコンビナーゼを発現する温度感受性プラスミド、配列番号２２４）で形質転換した。Ａｍｐ^Ｒコロニーを３０℃で選択し、ｐＪＷ１６８はその後、４２℃での成長によって排除した。選択されたクローン（ＡＳＴ－１０１）を、次いで、カナマイシンを含むおよび含まないＬＢ寒天プレートにレプリカプレーティングしてｋａｎの喪失についてテストし、破壊部位に隣接するＹＳ１６４６ゲノム由来のプライマー（プライマーａｓｄ－３およびａｓｄ－４、プライマー配列については、表１を参照のこと）を使用したＰＣＲ検証によって確認した。

ａｓｄ欠失突然変異体株ＡＳＴ－１０１の特徴付け
ａｓｄ突然変異体ＡＳＴ－１０１はＬＢ寒天プレート、３７℃で成長することができなかったが、５０μｇ／ｍＬジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を含有するＬＢプレートでは成長することができた。ａｓｄ突然変異体成長率をＬＢ液体培地で評価した。ａｓｄ突然変異体は液体ＬＢで成長することができなかったが、６００ｎＭで吸光度を測定して決定した場合、５０μｇ／ｍＬ ＤＡＰを補充したＬＢでは成長することができた。

ａｓｄ遺伝子欠失後のＡＳＴ－１０１ ａｓｄ座配列の配列確認
ＡＳＴ－１０１ ａｓｄ遺伝子欠失株を、プライマーａｓｄ－３およびａｓｄ－４を使用したＤＮＡ配列決定によって検証した。ａｓｄ座に隣接する領域の配列決定を行い、該配列により、ａｓｄ遺伝子がＹＳ１６４６染色体から欠失されたことを確認した。

例示的なｓｈＲＮＡの設計および特徴付け
所望の標的遺伝子に対するｓｈＲＮＡをコードするプラスミドで形質転換された組換えサルモネラ・ティフィムリウムを生成するために、ヒトＰＤ－Ｌ１、ＳＩＲＰアルファ、ベータカテニン、ＶＩＳＴＡ、ＴＲＥＸ１、およびＶＥＧＦの各々に対する６つのｓｈＲＮＡのセットを設計した。ヒトＴＧＦ－ベータアイソフォーム１に対しては合計９つのｓｈＲＮＡを設計した。合計４５個のｓｈＲＮＡについて、ｓｈＲＮＡをｐＥＱＵ６ベクター（配列番号４１）にサブクローニングした。

各遺伝子中の標的配列は、次のとおりである：

各ｓｈＲＮＡを生成するために、設計したオリゴヌクレオチド対を合成してｓｈＲＮＡをコードするカセットを形成した。オリゴヌクレオチドを互いにアニールさせてカセットを形成し、制限酵素Ｓｐｅ１およびＸｈｏ１であらかじめ消化した線状化ｐＥＱＵ６ベクターにライゲートした。連結ＤＮＡ断片をＥ．コリ細胞に形質転換し、陽性クローンを制限酵素消化により選択した。ｓｈＲＮＡ配列を精製し、配列決定した。ＲＮＡ干渉のための６つの配列を異なるｃＤＮＡコード領域から選択し、ＢＬＡＳＴ検索によって分析して他の遺伝子と有意な配列相同性をもたないことを確保した。６つの例示的なｓｈＲＮＡコード配列は、次のとおりである：

ｐＥＱＵ６－ｓｈＰＤＬ１－ｓｈＲＮＡ、ｐＥＱＵ６－ｓｈＰＤＬ１－Ｈ１－ｓｈＣＴＮＮＢ１、ｐＥＱＵ６－ｓｈＰＤＬ１－Ｈ１－ｓｈＳＩＲＰアルファ、ｐＥＱＵ６－ｓｈＰＤＬ１－Ｈ１－ｓｈＴＲＥＸ１、およびｐＥＱＵ６－ｓｈＰＤＬ１－Ｈ１－ｓｈＶＩＳＴＡと名付けられた、得られたベクターの配列は、配列番号４３～４７に記載されている。各ｓｈＲＮＡを、次いで、個別にスクリーニングして各標的タンパク質に対する最良のｓｈＲＮＡを同定する。スクリーニングに使用したプラスミドは、細菌複製起点、カナマイシン耐性マーカー、およびヒトＵ６プロモーター配列と、これに続く個々のｓｈＲＮＡを含有し、次いでターミネーターポリＴ配列がこれに続く。ベクターは、Ｕ６プロモーターの代わりにＨ１プロモーターを使用してもよい。Ｕ６およびＨ１は、小ＲＮＡの産生およびプロセシングに一般的に使用されるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである（配列表を参照のこと）。各ｓｈＲＮＡは、標的配列に対する１９個のヌクレオチドのオーバーラップとハイブリダイズするように設計した。これは、７個のヌクレオチドのループスペーサーと、これに続く最初の標的配列の逆相補体を含有する。ｓｈＲＮＡ設計は、これらのヌクレオチド長に限定されない。相補的ｓｈＲＮＡ配列は、１９～２９個のヌクレオチド（標的遺伝子に由来する「センス」配列）と、これに続く４～１５個のヌクレオチドのループスペーサーに及び、次いで、一次標的配列の「アンチセンス」配列である１９～２９個のヌクレオチド配列で終結する。

第２のベクターを使用して、別の標的の遺伝子発現のノックダウンを達成した。このベクターは、第２のプロモーター、Ｈ１を使用する。Ｈ１は、両方の標的ｓｈＲＮＡによる有効な遺伝子ノックダウンを達成するために、約６０～１００個であり得る少なくとも７５個のヌクレオチドの長さでＵ６プロモーターから分離される。例として、１つの特定のベクターは、ＰＤ－Ｌ１およびＳＩＲＰアルファに対するｓｈＲＮＡ配列を担持し、Ｕ６プロモーター下の抗ＰＤ－Ｌ１ ｓｈＲＮＡと、これに続くＨ１プロモーター下の抗ＳＩＲＰアルファｓｈＲＮＡを含む。オーソロガスな種由来のＵ６またはＨ１プロモーター等の追加のプロモーターを利用して、複数の標的化ｓｈＲＮＡをプラスミドに付加することができる。

各標的に対する最も性能の良いｓｈＲＮＡを同定するために、ｐＥＱＵ６にサブクローニングした個々のｓｈＲＮＡを、ノックダウン遺伝子発現の能力についてテストした。先ず、ＨＥＫ２９３細胞に、ｐＥＱＵ６プラスミド（異なるｓｈＲＮＡ配列をコードする）およびｃＤＮＡ発現プラスミド（ＣＭＶプロモーター下で標的タンパク質ｃＤＮＡを発現する）の両方を同時トランスフェクトする。例えば、ＰＤ－Ｌ１に対するｓｈＲＮＡをコードするｐＥＱＵ６プラスミド、クローン１が、ＰＤ－Ｌ１ ｃＤＮＡ発現プラスミドと同時トランスフェクトされる。遺伝子発現のｓｈＲＮＡ介在性ノックダウンを、ウエスタンブロットおよびｑＰＣＲによって測定する。市販のｃＤＮＡｓがＧＥ／ＤｈａｒｍａｃｏｎまたはＯｒｉｇｅｎｅから入手可能であり、標的タンパク質のＣ末端への融合ＨＡタグをもたらすＣＭＶ発現ベクターにサブクローニングされる。これにより、抗ＨＡ抗体－ＨＲＰ融合を使用した遺伝子ノックダウンの均一な測定な可能になる。ｃＤＮＡ分子は、ｃＤＮＡコード遺伝子の部分に対応する。

ヒト遺伝子を標的にするｓｈＲＮＡに加えて、インビボモデルでのテストに使用するためのｓｈＲＮＡを提供する。同系マウス移植モデルおよび自然発生マウス腫瘍モデルにおいてテストするために、オーソロガスなマウス遺伝子を標的にするｓｈＲＮＡを生成する。マウス標的化ｓｈＲＮＡ配列（ＳＩＧＭＡ）を、上記に記載したｐＥＱＵ６ベクターにサブクローニングし、ウエスタンブロットおよびｑＰＣＲによって遺伝子ノックダウン傾向を特徴付ける。更に、ＰＤ－Ｌ１およびＴＲＥＸ１に対するｓｈＲＮＡの組合せを、Ｕ６プロモーター下でＰＤ－Ｌ１に対するｓｈＲＮＡ、およびＨ１プロモーター下でＴＲＥＸ１に対するｓｈＲＮＡを含むｐＥＱＵ６－Ｈ１（配列番号４２）にサブクローニングした。マウスモデルで使用するために、以下のｓｈＲＮＡコード配列を設計した：

各標的に対する個々のｓｈＲＮＡ性能をスクリーニングするために、ウエスタンブロットの陽性対照はベータチューブリン発現に対応し、ウエスタンブロットおよびｑＰＣＲスクリーニングの両方の陰性対照は、任意の哺乳動物配列に対する相同性を欠くスクランブルｓｈＲＮＡに対応する。各ｓｈＲＮＡをウエスタンブロットによって個別にテストする。ｑＰＣＲ遺伝子発現用に、ノックダウンを遺伝子ノックダウン％として定量化し、３通りテストし、エラーバーを生成する。

ウエスタンブロットスクリーニングを次のとおりに行った。先ず、同時トランスフェクション実験を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する標的遺伝子発現プラスミド（ｐＣＭＶ－ｃＤＮＡ－ＨＡ）および個々の反応物として、それぞれ６つの設計したｓｈＲＮＡベクターでセットアップした。以下のチャートは、各反応の成分を記載する。トランスフェクション４８時間後、細胞をＳＤＳ－ＰＡＧＥ緩衝液に溶解し、４～２０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル電気泳動およびウエスタンブロット分析に供した。Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した抗ＨＡ抗体を使用して、１：１０００希釈でウエスタンブロットを実施した。膜をＥＣＬ試薬によって検出した。６ウェルごとに：

ｑＰＣＲによる遺伝子サイレンシング評価を次のとおりに行った。先ず、同時トランスフェクション実験を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用する標的遺伝子発現プラスミドｐＣＭＶ－ｃＤＮＡ－ＨＡおよび６つのｓｈＲＮＡベクターでセットアップした。以下のチャートは各反応の成分を記載する。ｃＤＮＡ対ｓｈＲＮＡ比は、１：６である。トランスフェクション４８時間後、ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。オリゴ（ｄＴ）_２０プライマー、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ逆転写酵素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）および１００ｎｇの全ＲＮＡを使用して、ｃＤＮＡをｍＲＮＡから合成した。リアルタイムＰＣＲアッセイを、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅ（商標）Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ ＳｙｓｔｅｍでＰｏｗｅｒＵＰ（商標）ＳＹＢＲ（商標）マスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてｃＤＮＡ－ＨＡおよびＧＡＰＤＨ（内因性対照）標的に対して行った。６ウェルごとに：

これらのｓｈＲＮＡによるｓｈＲＮＡ介在性遺伝子ノックダウンを機能的に特徴付けた。使用した方法の説明については、Methods Mol Biol. (2010) 629:141-158を参照のこと。ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子を参照として使用して、ＰＤ－Ｌ１遺伝子（配列番号３１）に対する１９塩基対の相補的領域を有する６つのｓｈＲＮＡのセットを設計し、上記に記載したクローニング戦略を利用して、Ｕ６プロモーターの後ろのｐＥＱＵ６スクリーニングベクター（配列番号４１）にクローニングした。上記に記載したｑＰＣＲおよびウエスタンブロットプロトコールを使用して、各ｓｈＲＮＡコンストラクトをヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子発現の遮断についてスクリーニングした。図２Ａに示すように、いくつかのｓｈＲＮＡはＰＤ－Ｌ１遺伝子発現のノックダウンに有効であった。ＡＲＩ－１２３（配列番号２）は、ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子発現が約７５％ノックダウンする最も高い効力をもたらした。これをウエスタンブロットによって確認し（図２Ｂ）、ＡＲＩ－１２３は、ＰＤ－Ｌ１遺伝子発現の＞９９％ノックダウンを示した。更に、ＡＲＩ－１２２（配列番号１）は、ウエスタンブロットによるＰＤ－Ｌ１遺伝子発現の＞９９％ノックダウンを示した。

ヒトＴＲＥＸ１遺伝子（配列番号３４）の発現を遮断するために、１９ｂｐ相補的領域を有する６つのｓｈＲＮＡのセットを設計し、上記に記載した様式でＵ６プロモーターの後ろのｐＥＱＵ６スクリーニングベクター（配列番号４１）にクローニングした。図３Ａに示すように、ＡＲＩ－１０９（配列番号１９）、ＡＲＩ－１１０（配列番号２０）、ＡＲＩ－１１１（配列番号２１）およびＡＲＩ－１１４（配列番号２４）は全て、ｑＰＣＲによるＴＲＥＸ１遺伝子発現の約７０％ノックダウンを示した。ウエスタンブロット分析を使用して、ｑＰＣＲによって同定された遺伝子遮断所見を確認した（図３Ｂ）。ＡＲＩ－１１０（配列番号２０）およびＡＲＩ－１１４（配列番号２４）いずれも、それぞれ、高程度の遺伝子ノックダウン、８５．５％および７６．１％を示した。

ヒトベータカテニン遺伝子（配列番号３２）を参照として使用して、ベータカテニン遺伝子に対する１９塩基の相補的領域を有する６つのｓｈＲＮＡのセットを設計し、上記に記載したようにＵ６プロモーターの後ろのｐＥＱＵ６スクリーニングベクター（配列番号４１）にクローニングした。各ｓｈＲＮＡコンストラクトを、ヒトベータカテニン遺伝子発現の遮断についてｑＰＣＲおよびウエスタンブロットの両方によってスクリーニングした。図４Ａに示すように、いくつかのｓｈＲＮＡは、ベータカテニン遺伝子発現のノックダウンに有効であった。ＡＲＩ－１６９（配列番号８）は、ヒトベータカテニン遺伝子発現の＞７５％ノックダウンを示した。ウエスタンブロット分析では（図４Ｂ）、ＡＲＩ－１６９（配列番号８）、ＡＲＩ－１７０（配列番号９）、ＡＲＩ－１７１（配列番号１０）、およびＡＲＩ－１７２（配列番号１１）はそれぞれ、ベータカテニン遺伝子発現の＞９９％ノックダウンを示した。

ヒトＳＩＲＰアルファ遺伝子（配列番号３３）も、遺伝子発現を遮断するｓｈＲＮＡについてスクリーニングした。１９ｂｐの相補的領域を有する６つのｓｈＲＮＡのセットを設計し、上記に記載したようにＵ６プロモーターの後ろのｐＥＱＵ６スクリーニングベクター（配列番号４１）にクローニングした。図５Ａに示すように、いくつかのｓｈＲＮＡコンストラクトもＳＩＲＰアルファ遺伝子発現を有意にノックダウンすることができた。ＡＲＩ－１７５（配列番号１４）、ＡＲＩ－１７６（配列番号１５）、およびＡＲＩ－１７７（配列番号１６）は全て、ｑＰＣＲによるＳＩＲＰアルファ遺伝子発現の約７０％を超えるノックダウンを示した。ウエスタンブロット分析では（図５Ｂ）、いくつかのコンストラクト：ＡＲＩ－１７５（＞９５％ノックダウン）、ＡＲＩ－１７６（＞８０％ノックダウン）、およびＡＲＩ－１７７（約９０％ノックダウン）について高程度のノックダウンが観察され、ｑＰＣＲによってスクリーニングした場合のこれらの３つのコンストラクトによる所見と一致した。

ヒトＴＧＦ－ベータアイソフォーム１遺伝子（配列番号１９３）を参照として使用して、９つのｓｈＲＮＡのセットを設計し、上記に記載したようにＵ６プロモーターの後ろのｐＥＱＵ６スクリーニングベクター（配列番号４１）にクローニングした。各ｓｈＲＮＡコンストラクトを、ヒトＴＧＦ－ベータアイソフォーム１遺伝子発現の遮断についてｑＰＣＲによってスクリーニングした。図６に示すように、いくつかのｓｈＲＮＡｓは、ＴＧＦ－ベータ遺伝子発現のノックダウンに有効であった。ＡＲＩ－１８１（配列番号１９６）は最も強力なｓｈＲＮＡであり、ヒトＴＧＦ－ベータ遺伝子発現のノックダウンは約＞８５％であった。ＡＲＩ－１８３（配列番号１９８）がこれに続き、ＴＧＦ－ベータ遺伝子発現の約７５％ノックダウンを示した。

１９ｂｐの相補的領域を有する６つのｓｈＲＮＡのセットを設計して、ヒトＶＥＧＦ（配列番号１９４）の発現を遮断し、上記に記載したようにＵ６プロモーターの後ろのｐＥＱＵ６スクリーニングベクター（配列番号４１）にクローニングした。図７に示すように、ｑＰＣＲによって評価した場合、いくつかのｓｈＲＮＡコンストラクトはＶＥＧＦ遺伝子発現に対する高程度のノックダウン効率を有した。ＡＲＩ－１８９（配列番号２０４）、ＡＲＩ－１９０（配列番号２０５）、およびＡＲＩ－１９１（配列番号２０６）は全て、ｑＰＣＲによる７０％にほぼ等しいか、またはこれを超えるＶＥＧＦ遺伝子発現のノックダウンを示した。更に、ＡＲＩ－１９３（配列番号２０８）は、ＶＥＧＦ遺伝子発現の８０％を超えるノックダウンを示した。ウエスタンブロット分析を使用して、ｑＰＣＲによって同定された遺伝子遮断所見を確認し、ＡＲＩ－１８９（配列番号２０４）、ＡＲＩ－１９０（配列番号２０５）、ＡＲＩ－１９１（配列番号２０６）、ＡＲＩ－１９３（配列番号２０８）は全て、トランスフェクション反応においてＶＥＧＦに対する同族ｓｈＲＮＡを欠いたＶＥＧＦレーンである陽性対照と比べて、ゲル上の個々のレーンとしての極めてかすかなＶＥＧＦウエスタンブロットバンドを示した。したがって、ウエスタンブロット分析からの所見はｑＰＣＲ反応からの所見を確認した。

ヒトＶＩＳＴＡ遺伝子（配列番号３５）を参照として使用して、６つのｓｈＲＮＡのセットを設計し、上記に記載したようにＵ６プロモーターの後ろのｐＥＱＵ６スクリーニングベクター（配列番号４１）にクローニングした。各ｓｈＲＮＡコンストラクトを、ｑＰＣＲノックダウン実験でＶＩＳＴＡ遺伝子発現の遮断についてスクリーニングした。図８Ａに示すように、いくつかのｓｈＲＮＡは、ヒトＶＩＳＴＡ遺伝子発現のノックダウンに有効であった。ＡＲＩ－１９５（配列番号２５）およびＡＲＩ－１９６（配列番号２６）は最も強力なｓｈＲＮＡであり、ヒトＶＩＳＴＡ遺伝子発現のノックダウンは、それぞれ約８０％および６５％であった。これらの結果をウエスタンブロット分析によって確認し、分析は、ＡＲＩ－１９５およびＡＲＩ－１９６に関して完全に近いノックダウン（約９９％）を示した（図８Ｂ）。

組合せＲＮＡｉ
同じプラスミドから発現された別個のｓｈＲＮＡによる２つの別個の遺伝子標的の組合せＲＮＡｉノックダウンを、Ｕ６およびＨ１プロモーターの両方を担持する遺伝子改変プラスミド（配列番号４２）を使用してテストした。それぞれＰＤ－Ｌ１（ＡＲＩ－１２３、配列番号２）およびＴＲＥＸ１（ＡＲＩ－１１４、配列番号２４）を標的にする個々のｓｈＲＮＡをサブクローニングして、組合せＲＮＡｉ ＡＲＩ－１３４（配列番号２１０）を生成した。次いで、それぞれの標的（ＰＤ－Ｌ１およびＴＲＥＸ１）の発現をそれぞれ個別にノックダウンすることができる２つの別個のｓｈＲＮＡをインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）で同時に発現する能力について、ＡＲＩ－１３４をテストした。対照として、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３４によるヒトＰＤ－Ｌ１発現のノックダウンを、ＡＲＩ－１２３［ＰＤ－Ｌ１のみを標的にする単一ＲＮＡｉ（配列番号２）］と比較し、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３４によるヒトＴＲＥＸ１のノックダウンを、ＡＲＩ－１１４［ＴＲＥＸ１のみを標的にする単一ＲＮＡｉ（配列番号２４）］と比較した。ＡＲＩ－１２３ノックダウンが野生型ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子発現の２７．６％であったのに対し、ＡＲＩ－１３４（組合せベクター）によるヒトＰＤ－Ｌ１のノックダウンは、野生型ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子発現の１１．８％と改善した（図９Ａ）。同じく、ＡＲＩ－１１４を用いたヒトＴＲＥＸ１ノックダウンが野生型ＴＲＥＸ１発現の１６％であったのに対し、ＡＲＩ－１３４を用いたヒトＴＲＥＸ１のノックダウンは１００％であった（図９Ｂ）。ＰＤ－Ｌ１およびＴＲＥＸ１に対するＡＲＩ－１３４によるノックダウンをウエスタンブロットによって分析した場合、それぞれの陽性対照（ＲＮＡｉを全く欠いた個々のヒトＰＤ－Ｌ１およびヒトＴＲＥＸ１発現反応物）と対比して、ヒトＰＤ－Ｌ１もヒトＴＲＥＸ１も検出可能な発現はなかった。したがって、組合せＲＮＡｉ ＡＲＩ－１３４は、ＰＤ－Ｌ１およびＴＲＥＸ１の発現をノックダウンすることができる。

同様に、上記に記載した、それぞれＰＤ－Ｌ１（ＡＲＩ－１２３、配列番号２）およびＳＩＲＰアルファ（ＡＲＩ－１７５、配列番号１４）を標的にする個々のＲＮＡｉｓを、Ｕ６およびＨ１プロモーターの両方を担持する遺伝子改変プラスミド（配列番号４２）にサブクローニングして、組合せＲＮＡｉ、ＡＲＩ－１３５（配列番号２１１）を生成した。ＰＤ－Ｌ１およびＳＩＲＰアルファの発現をそれぞれ個別にノックダウンすることができる２つの別個のｓｈＲＮＡをインサイチュで同時に発現する能力について、ＡＲＩ－１３５をテストした。対照として、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３５によるヒトＰＤ－Ｌ１発現のノックダウンを、ＡＲＩ－１２３［上記に記載した、ＰＤ－Ｌ１単独のみを標的にする単一ＲＮＡｉ（配列番号２）］と比較した。同じく、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３５によるヒトＳＩＲＰアルファのノックダウンを、ＡＲＩ－１７５［上記に記載した、ＳＩＲＰアルファ単独を標的にする単一ＲＮＡｉ（配列番号１４）］と比較した。ＡＲＩ－１２３およびＡＲＩ－１３５の両方によるＰＤ－Ｌ１のノックダウンは、野生型ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子発現の約２０％という結果となった（図１０Ａ）。同じく、ＡＲＩ－１７５およびＡＲＩ－１３５の両方を用いたＳＩＲＰアルファのノックダウンは、野生型ＳＩＲＰアルファ発現の＜２０％という結果となった（図１０Ｂ）。ＰＤ－Ｌ１およびＳＩＲＰアルファの両方に対するＡＲＩ－１３５によるノックダウンをウエスタンブロットによって分析した場合、それぞれの陽性対照（ＲＮＡｉを全く欠いたヒトＰＤ－Ｌ１およびヒトＳＩＲＰアルファ発現反応物）と対比して、ヒトＰＤ－Ｌ１もヒトＳＩＲＰアルファも検出可能な発現はなかった。したがって、組合せＲＮＡｉ ＡＲＩ－１３５は、ＰＤ－Ｌ１およびＳＩＲＰアルファの発現をノックダウンすることができる。

次に、上記に記載した、それぞれＰＤ－Ｌ１（ＡＲＩ－１２３、配列番号２）およびベータカテニン（ＡＲＩ－１６９、配列番号８）を標的にする個々のＲＮＡｉを、Ｕ６およびＨ１プロモーターを担持する遺伝子改変組合せＲＮＡｉプラスミド（配列番号４２）にサブクローニングして、組合せＲＮＡｉ ＡＲＩ－１３６（配列番号２１２）を生成した。次いで、ＰＤ－Ｌ１およびベータカテニンの発現をそれぞれ個別にノックダウンすることができる２つの別個のＲＮＡｉをインサイチュで同時に発現する能力について、ＡＲＩ－１３６をテストした。対照として、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３６によるヒトＰＤ－Ｌ１発現のノックダウンを、ＡＲＩ－１２３［上記に記載した、ＰＤ－Ｌ１単独を標的にする単一ＲＮＡｉ（配列番号２）］と比較した。同じく、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３６によるヒトベータカテニンのノックダウンを、ＡＲＩ－１６９［上記に記載した、ベータカテニン単独を標的にする単一ＲＮＡｉ（配列番号８）］と比較した。ＡＲＩ－１２３によるＰＤ－Ｌ１のノックダウンは、野生型ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子発現の約２０％という結果となった（図１１Ａ）。ＡＲＩ－１３６によるＰＤ－Ｌ１のノックダウンは、野生型ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子発現の約１０％という結果となった。これは、ＡＲＩ－１２３より約２倍良好である（図１１Ａ）。ＡＲＩ－１３６およびＡＲＩ－１６９を用いたベータカテニンのノックダウンは、野生型ベータカテニン発現の約３０％という結果となった（図１１Ｂ）。ＰＤ－Ｌ１およびベータカテニンに対するＡＲＩ－１３６によるノックダウンをウエスタンブロットによって分析した場合、それぞれの陽性対照（ＲＮＡｉを全く欠いたヒトＰＤ－Ｌ１およびヒトベータカテニン発現反応物）と対比して、ヒトＰＤ－Ｌ１もヒトベータカテニンも検出可能な発現はなかった。したがって、組合せＲＮＡｉ ＡＲＩ－１３６は、ＰＤ－Ｌ１およびベータカテニンの発現をノックダウンすることができる。

上記に記載した、それぞれＰＤ－Ｌ１（ＡＲＩ－１２３、配列番号２）およびＶＩＳＴＡ（ＡＲＩ－１９５、配列番号２５）を標的にする個々のＲＮＡｉを、Ｕ６およびＨ１プロモーターを担持する遺伝子改変プラスミド（配列番号４２）にサブクローニングして、組合せＲＮＡｉ、ＡＲＩ－１３７（配列番号２１３）を生成した。ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡの発現をそれぞれ個別にノックダウンすることができる２つの別個のｓｈＲＮＡをインサイチュで同時に発現する能力について、ＡＲＩ－１３７をテストした。対照として、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３７によるヒトＰＤ－Ｌ１発現のノックダウンを、ＡＲＩ－１２３［上記に記載した、ＰＤ－Ｌ１単独のみを標的にする単一ＲＮＡｉ（配列番号２）］と比較した。同じく、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３７によるヒトＶＩＳＴＡのノックダウンを、ＡＲＩ－１９５（上記に記載した、ＶＩＳＴＡ単独を標的にする単一ＲＮＡｉ、配列番号２５）と比較した。ＡＲＩ－１２３およびＡＲＩ－１３７の両方によるＰＤ－Ｌ１のノックダウンは、野生型ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子発現の約２０％という結果となった（図１２Ａ）。同じく、ＡＲＩ－１９５およびＡＲＩ－１３７の両方によるＶＩＳＴＡのノックダウンは、野生型ＶＩＳＴＡ発現の２０％未満か、または２０％にほぼ等しいという結果となった（図１２Ｂ）。ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡに対するＡＲＩ－１３７によるノックダウンをウエスタンブロットによって分析した場合、それぞれの陽性対照（ＲＮＡｉを全く欠いたヒトＰＤ－Ｌ１およびヒトＶＩＳＴＡ発現反応物）と対比して、ヒトＰＤ－Ｌ１もヒトＶＩＳＴＡも検出可能な発現はなかった。したがって、組合せＲＮＡｉ ＡＲＩ－１３７は、ＰＤ－Ｌ１およびＶＩＳＴＡの発現をノックダウンすることができる。

ヒト標的に加えて、同じプラスミドから発現された別個のｓｈＲＮＡによる２つのマウス遺伝子標的の組合せＲＮＡｉノックダウンを、Ｕ６およびＨ１プロモーターを担持する遺伝子改変プラスミド（配列番号４２）を使用してテストした。それぞれマウスＰＤ－Ｌ１（ＡＲＩ－１１５、配列番号７５）およびマウスＴＲＥＸ１（ＡＲＩ－１０８）を標的にする個々のｓｈＲＮＡをサブクローニングして、組合せＲＮＡｉ ＡＲＩ－１２８を生成した。次いで、それぞれの標的（マウスＰＤ－Ｌ１およびマウスＴＲＥＸ１）の発現をそれぞれ個別にノックダウンすることができる２つの別個のｓｈＲＮＡをインサイチュで同時に発現する能力について、ＡＲＩ－１２８をテストした。対照として、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１２８によるマウスＰＤ－Ｌ１発現のノックダウンを、ＡＲＩ－１１５［ＰＤ－Ｌ１のみを標的にする単一ＲＮＡｉ（配列番号７５）］と比較し、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１２８によるマウスＴＲＥＸ１のノックダウンを、ＡＲＩ－１０８（ＴＲＥＸ１のみを標的にする単一ＲＮＡｉ）と比較した。ＡＲＩ－１１５ノックダウンが野生型マウスＰＤ－Ｌ１遺伝子発現の２２．８％であったのに対し、ＡＲＩ－１２８（組合せベクター）によるマウスＰＤ－Ｌ１のノックダウンは改善し、野生型マウスＴＲＥＸ１遺伝子発現のわずか１４．０％となった（図１３Ａ）。ＡＲＩ－１０８またはＡＲＩ－１２８のどちらかを用いたマウスＴＲＥＸ１のノックダウンは、極めて効率がよかった（それぞれ、野生型マウスＴＲＥＸ１発現の６．６％および１１．３％）（図１３Ｂ）。マウスＰＤ－Ｌ１およびマウスＴＲＥＸ１の両方に対するＡＲＩ－１２８によるノックダウンをウエスタンブロットによって分析した場合、それぞれの陽性対照（ＲＮＡｉを全く欠いた個々のマウスＰＤ－Ｌ１およびマウスＴＲＥＸ１発現反応物）と対比して、マウスＰＤ－Ｌ１もマウスＴＲＥＸ１も検出可能な発現はなかった。

Ｕ６およびＨ１プロモーターを担持する遺伝子改変プラスミド（配列番号４２）を使用して、マウスＰＤ－Ｌ１およびマウスＳＩＲＰアルファを標的にするための組合せＲＮＡｉを生成した。それぞれマウスＰＤ－Ｌ１（ＡＲＩ－１１５、配列番号７５）およびマウスＳＩＲＰアルファ（ＡＲＩ－１３８、配列番号７６）を標的にする個々のｓｈＲＮＡｓをサブクローニングして、組合せＲＮＡｉ ＡＲＩ－１２９を生成した。次いで、それぞれの標的（マウスＰＤ－Ｌ１およびマウスＳＩＲＰアルファ）の発現をそれぞれ個別にノックダウンすることができる２つの別個のｓｈＲＮＡをインサイチュで同時に発現する能力について、ＡＲＩ－１２９をテストした。対照として、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１２９によるマウスＰＤ－Ｌ１発現のノックダウンを、ＡＲＩ－１１５（ＰＤ－Ｌ１のみを標的にする単一ＲＮＡｉ）と比較し、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１２９によるマウスＳＩＲＰアルファのノックダウンを、ＡＲＩ－１３８（ＳＩＲＰアルファのみを標的にする単一ＲＮＡｉ）と比較した。ＡＲＩ－１１５およびＡＲＩ－１２９は、野生型マウスＰＤ－Ｌ１遺伝子発現の約２０％以下のノックダウンであった（図１４Ａ）。ＡＲＩ－１３８またはＡＲＩ－１２９のどちらかを用いたマウスＳＩＲＰアルファのノックダウンは、野生型マウスＳＩＲＰアルファ発現の約２５％以下であった（図１４Ｂ）。マウスＰＤ－Ｌ１およびマウスＳＩＲＰアルファの両方に対するＡＲＩ－１２９によるノックダウンをウエスタンブロットによって分析した場合、それぞれの陽性対照（ＲＮＡｉを全く欠いた個々のマウスＰＤ－Ｌ１およびマウスＳＩＲＰアルファ発現反応物）と対比して、マウスＰＤ－Ｌ１もマウスＳＩＲＰアルファも検出可能な発現はなかった。

次に、Ｕ６およびＨ１プロモーターを担持する遺伝子改変プラスミド（配列番号４２）を使用して、マウスＰＤ－Ｌ１およびマウスＶＩＳＴＡを標的にするための組合せＲＮＡｉを生成した。それぞれマウスＰＤ－Ｌ１（ＡＲＩ－１１５、配列番号７５）およびマウスＶＩＳＴＡ（ＡＲＩ－１５７）を標的にする個々のｓｈＲＮＡをサブクローニングして、組合せＲＮＡｉ ＡＲＩ－１３２を生成した。次いで、それぞれの標的（マウスＰＤ－Ｌ１およびマウスＶＩＳＴＡ）の発現をそれぞれ個別にノックダウンすることができる２つの別個のｓｈＲＮＡをインサイチュで同時に発現する能力について、ＡＲＩ－１３２をテストした。対照として、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３２によるマウスＰＤ－Ｌ１発現のノックダウンを、ＡＲＩ－１１５（ＰＤ－Ｌ１のみを標的にする単一ＲＮＡｉ）と比較し、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３２によるマウスＶＩＳＴＡのノックダウンを、ＡＲＩ－１５７（ＶＩＳＴＡのみを標的にする単一ＲＮＡｉ）と比較した。ＡＲＩ－１１５およびＡＲＩ－１３２いずれも、野生型マウスＰＤ－Ｌ１遺伝子発現の約２０％以下のノックダウンであった（図１５Ａ）。ＡＲＩ－１５７またはＡＲＩ－１３２のどちらかを用いたマウスＶＩＳＴＡのノックダウンは、野生型マウスＶＩＳＴＡ発現の約３０％以下であった（図１５Ｂ）。マウスＰＤ－Ｌ１およびマウスＶＩＳＴＡの両方に対するＡＲＩ－１３２によるノックダウンをウエスタンブロットによって分析した場合、それぞれの陽性対照（ＲＮＡｉを全く欠いた個々のマウスＰＤ－Ｌ１およびマウスＶＩＳＴＡ発現反応物）と対比して、マウスＰＤ－Ｌ１もマウスＶＩＳＴＡも検出可能な発現はなかった。

Ｕ６およびＨ１プロモーターを担持する遺伝子改変プラスミド（配列番号４２）を使用して、マウスＴＲＥＸ１およびマウスＳＩＲＰアルファを標的にするためのＲＮＡｉの組合せを生成した。一方はマウスＴＲＥＸ１（ＡＲＩ－１０８）を標的にし、他方はマウスＳＩＲＰアルファ（ＡＲＩ－１３８、配列番号７６）を標的にする個々のｓｈＲＮＡをサブクローニングして、ＡＲＩ－１３１と名付けられた組合せＲＮＡｉを生成した。それぞれの標的（マウスＴＲＥＸ１およびマウスＳＩＲＰアルファ）の発現をそれぞれ個別にノックダウンすることができる２つの別個のｓｈＲＮＡをインサイチュで同時に発現する能力について、ＡＲＩ－１３１をテストした。対照として、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３１によるマウスＴＲＥＸ１発現のノックダウンを、ＡＲＩ－１０８（ＴＲＥＸ１のみを標的にする単一ＲＮＡｉ）と比較し、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３１によるマウスＳＩＲＰアルファのノックダウンを、ＡＲＩ－１３８（ＳＩＲＰアルファのみを標的にする単一ＲＮＡｉ）と比較した。ＡＲＩ－１０８およびＡＲＩ－１３１は、野生型マウスＴＲＥＸ１遺伝子発現の約２０％以下のノックダウンであった（図１６Ａ）。ＡＲＩ－１３８またはＡＲＩ－１３１のどちらかを用いたマウスＳＩＲＰアルファのノックダウンは、野生型マウスＳＩＲＰアルファ発現より約２５％以下であった（図１６Ｂ）。

Ｕ６およびＨ１プロモーターを担持する遺伝子改変プラスミド（配列番号４２）を使用して、マウスＰＤ－Ｌ１およびマウスベータカテニンを標的にする組合せＲＮＡｉを生成した。それぞれマウスＰＤ－Ｌ１（ＡＲＩ－１１５、配列番号７５）およびマウスベータカテニン（ＡＲＩ－１６６）を標的にする個々のｓｈＲＮＡをサブクローニングして、組合せＲＮＡｉ ＡＲＩ－１３３を生成した。次いで、それぞれの標的（マウスＰＤ－Ｌ１およびマウスベータカテニン）の発現をそれぞれ個別にノックダウンすることができる２つの別個のｓｈＲＮＡをインサイチュで同時に発現する能力について、ＡＲＩ－１３３をテストした。対照として、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３３によるマウスＰＤ－Ｌ１発現のノックダウンを、ＡＲＩ－１１５（ＰＤ－Ｌ１のみを標的にする単一ＲＮＡｉ）と比較し、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３３によるマウスベータカテニンのノックダウンを、ＡＲＩ－１６６（ベータカテニンのみを標的にする単一ＲＮＡｉ）と比較した。ＡＲＩ－１１５およびＡＲＩ－１３３は、野生型マウスＰＤ－Ｌ１遺伝子発現の約２５％以下のノックダウンであった（図１７Ａ）。ＡＲＩ－１６６またはＡＲＩ－１３３のどちらかを用いたマウスベータカテニンのノックダウンは、野生型マウスベータカテニン発現の約２５％以下であった（図１７Ｂ）。マウスＰＤ－Ｌ１およびマウスベータカテニンに対するＡＲＩ－１３３によるノックダウンをウエスタンブロットによって分析した場合、それぞれの陽性対照（ＲＮＡｉを全く欠いた個々のマウスＰＤ－Ｌ１およびマウスベータカテニン発現反応物）と対比して、マウスＰＤ－Ｌ１もマウスベータカテニンも検出可能な発現はなかった。

次に、Ｕ６およびＨ１プロモーターを担持する遺伝子改変プラスミド（配列番号４２）を使用して、マウスＴＲＥＸ１およびマウスＶＩＳＴＡを標的にするための組合せＲＮＡｉを生成した。それぞれマウスＴＲＥＸ１（ＡＲＩ－１０８）およびマウスＶＩＳＴＡ（ＡＲＩ－１５７）を標的にする個々のｓｈＲＮＡをサブクローニングして、組合せＲＮＡｉ ＡＲＩ－１３０を生成した。次いで、それぞれの標的（マウスＴＲＥＸ１およびマウスＶＩＳＴＡ）の発現をそれぞれ個別にノックダウンすることができる２つの別個のｓｈＲＮＡをインサイチュで同時に発現する能力について、ＡＲＩ－１３０をテストした。対照として、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３０によるマウスＴＲＥＸ１発現のノックダウンを、ＡＲＩ－１０８（ＴＲＥＸ１のみを標的にするＲＮＡｉ）と比較し、ＨＥＫ２９３細胞でのＡＲＩ－１３０によるマウスＶＩＳＴＡのノックダウンを、ＡＲＩ－１５７（ＶＩＳＴＡのみを標的にする単一ＲＮＡｉ）と比較した。ＡＲＩ－１０８およびＡＲＩ－１３０いずれも、野生型マウスＴＲＥＸ１遺伝子発現の約３０％以下のノックダウンであった（図１８Ａ）。ＡＲＩ－１５７またはＡＲＩ－１３０のどちらかを用いたマウスＶＩＳＴＡのノックダウンは、野生型マウスＶＩＳＴＡ発現の約３０％以下であった（図１８Ｂ）。ＡＲＩ－１３０によるマウスＴＲＥＸ１およびマウスＶＩＳＴＡの両方に対するノックダウンをウエスタンブロットによって分析した場合、それぞれの陽性対照（ＲＮＡｉを全く欠いた個々のマウスＴＲＥＸ１およびマウスＶＩＳＴＡ発現反応物）と対比して、マウスＴＲＥＸ１もマウスＶＩＳＴＡも検出可能な発現はなかった。

マイクロＲＮＡ（ｍｉ－ＲＮＡ）
マイクロＲＮＡコンストラクト、ＡＲＩ－２０５（配列番号２１４）を使用して、マウスＰＤ－Ｌ１を標的にするＲＮＡｉを配列番号２４９のマイクロＲＮＡ骨格に挿入することによりマウスＰＤ－Ｌ１標的化マイクロＲＮＡ、ＡＲＩ－２０１を生成し、上記に記載したように、ｑＰＣＲおよびウエスタンブロット分析によってＰＤ－Ｌ１標的化ｓｈＲＮＡコンストラクトＡＲＩ－１１５（配列番号７５）と比較した。ＡＲＩ－１１５ノックダウンが野生型ＰＤ－Ｌ１発現の２６．６％であったのに対し、ＡＲＩ－２０１によるノックダウンは、ＰＤ－Ｌ１発現の１４．６％と改善した（図１９Ａ）。ウエスタンブロットで、ＡＲＩ－１１５は野生型ＰＤ－Ｌ１発現の１５．８％までＰＤ－Ｌ１をノックダウンすることができ、ＡＲＩ－２０１によるノックダウンは、ＰＤ－Ｌ１発現の１０．５％と改善した（図１９Ｂ）。

オリゴヌクレオチド合成、オーバーラップＰＣＲおよび制限消化クローニング（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｄｉｇｅｓｔ ｃｌｏｎｉｎｇ）を使用して、上記に記載したマイクロＲＮＡコンストラクト、ＡＲＩ－２０５（配列番号２１４）に基づき、マウスＴＲＥＸ１、ＡＲＩ－２０３に対するマイクロＲＮＡを生成し、ｑＰＣＲによってテストした。マウスＴＲＥＸ１を標的にするｓｈＲＮＡであるＡＲＩ－１０８が、野生型ＴＲＥＸ１と対比して２２．３％の遺伝子ノックダウン効率を有したのに対し、ＡＲＩ－２０３は５．９％のノックダウン効率を有した（図２０）。したがって、マイクロＲＮＡは、ｓｈＲＮＡと比べた場合、マウスＴＲＥＸ１のそのノックダウン効率において約３～４倍改善した。

ＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター下での発現を必要とする大きなマイクロＲＮＡコンストラクト、ＡＲＩ－２０６（配列番号２１５）を、標的遺伝子のノックダウンのテスト、ならびにｑＰＣＲおよびウエスタンブロット分析によるテストのために構築した。このマイクロＲＮＡ、ＡＲＩ－２０４のマウスＴＲＥＸ１標的化バージョンを、上記に記載したマウスＴＲＥＸ１標的化ｓｈＲＮＡ、ＡＲＩ－１０８と比較してテストした。ＡＲＩ－２０４およびＡＲＩ－１０８は、マウスＴＲＥＸ１の発現を効率的にノックダウンすることができた（それぞれ、野生型マウスＴＲＥＸ１発現の２２．５％および２４．１％、図２１Ａ）。マウスＴＲＥＸ１遺伝子発現のノックダウンについてウエスタンブロットによって評価した場合、ＡＲＩ－２０４マウスＴＲＥＸ１標的化マイクロＲＮＡの活性は、ＡＲＩ－１０８マウスＴＲＥＸ１標的化ｓｈＲＮＡと比べてわずかに改善した（ＡＲＩ－１０８の２１．４％と対比してＡＲＩ－２０４の１１．１％、図２１Ｂ）。

マイクロＲＮＡコンストラクトＡＲＩ－２０６のマウスＰＤ－Ｌ１標的化バージョン、ＡＲＩ－２０２を、上記に記載したマウスＰＤ－Ｌ１標的化ｓｈＲＮＡ、ＡＲＩ－１１５と比較してテストした。ＡＲＩ－２０２およびＡＲＩ－１１５は、マウスＰＤ－Ｌ１の発現を効率的にノックダウンすることができた（それぞれ、野生型マウスＰＤ－Ｌ１発現の１０．０および１１．２％、図２２Ａ）。マウスＰＤ－Ｌ１遺伝子発現のノックダウンをウエスタンブロットによって評価した場合、ＡＲＩ－２０２マウスＰＤ－Ｌ１標的化マイクロＲＮＡは、ＡＲＩ－１１５マウスＰＤ－Ｌ１標的化ｓｈＲＮＡと比べてわずかに改善した（ＡＲＩ－１１５の１３．８％と対比してＡＲＩ－２０２の８．７％、図２２Ｂ）。

ｓｈＲＮＡ遺伝子ノックダウンは、標的遺伝子を過剰発現することが知られている腫瘍細胞株において直接測定することができる。例えば、以下は、高いＰＤ－Ｌ１発現を有する既知の腫瘍細胞株である：ＰＣ－３（前立腺）、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（乳房）、およびＡＳＰＣ－１（膵臓）［Grenga et al. (2014) J. ImmunoTherapy of Cancer 2(Suppl 3):P102］。細胞をＩＦＮ－ガンマで刺激して、ＰＤ－Ｌ１発現の誘導を見ることができる。Ｕ９３７腫瘍細胞株は、ＳＩＲＰアルファを過剰発現する［Irandoust et al. (2013) PLoS ONE 8(1):e52143］。ＰＤ－Ｌ１およびＳＩＲＰアルファに対する遺伝子発現の同時ノックダウンは、ＩＦＮ－ガンマで誘導されたＵ９３７細胞で行うことができる。

上記のマイクロＲＮＡコンストラクト、ＡＲＩ－２０５（配列番号２１４）およびＡＲＩ－２０６（配列番号２１５）は、それぞれ２１および２２塩基対の相同性配列をコードする。あるいは、１９塩基対の相同性配列をコードするマイクロＲＮＡコンストラクト、例えば、ＡＲＩ－２０７（配列番号２１６）およびＡＲＩ－２０８（配列番号２１７）を使用することができる。標的遺伝子に対する個々のマイクロＲＮＡは、遺伝子合成、制限部位を含有するプライマーを用いたＰＣＲ増幅、および適合した制限酵素生成オーバーハングを有する発現ベクターへのサブクローニングによって生成することができる。

改変サルモネラ・ティフィムリウム標的は、複数の同系マウス腫瘍モデルにおいて頑強な腫瘍成長阻害を示す
ＴＲＥＸ１
全身投与された弱毒化サルモネラ菌の腫瘍微小環境取り込み後、ｓｈＲＮＡのＴＲＥＸ１へのデリバリーにより、ＳＴＩＮＧ介在性抗腫瘍免疫および腫瘍成長阻害が活性化する。マウス結腸癌モデルにおいて腫瘍成長阻害を誘導するＡＳＴ－１０４（ｐＥＱＵ６－ｓｈＴＲＥＸ１で形質転換された株ＹＳ１６４６）の能力を評価するために、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり８匹）に、ＣＴ２６マウス結腸癌（１００μＬ ＰＢＳ中２×１０^５細胞）を右側腹部へ皮下（ＳＣ）接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、１×１０^７ＣＦＵのＡＳＴ－１０４、またはＡＳＴ－１０２（ｐＥＱＵ６プラスミド対照で形質転換された株ＹＳ１６４６）を４日空けて２回静脈内（ＩＶ）注射し、ＰＢＳ対照と比較した。初回ＩＶ投与の６時間後、マウスを採血し、血漿を回収し、Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙキットを使用して炎症促進性サイトカインについて評価し、ＦＡＣＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。

図２３に示すように、対照株、ＡＳＴ－１０２は、ＰＢＳと比べて中程度の腫瘍制御を示した（２５日目の腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）１８％、ｐ＝ｎｓ）。しかし、ｓｈＴＲＥＸ１含有株、ＡＳＴ－１０４は、ＰＢＳと比べて有意な腫瘍成長阻害（２５日目のＴＧＩ ６６％、ｐ＝０．０１、１群当たり８匹の動物の平均で計算）、およびＡＳＴ－１０２と比べて有意な腫瘍制御（２８日目、ｐ＝０．０２）を示した。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ）パーセントは、１－（平均テスト腫瘍容量／平均対照腫瘍容量）×１００として計算する。

炎症促進性サイトカインの活性化
ＴＲＥＸ１
ＩＶ注射後６時間での全身性血清サイトカインのレベルを評価した。ＡＳＴ－１０４（プラスミド中にａｓｄ相補を含むｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有する；ａｓｄはＣｐＧエレメントを含有する）によって誘発された免疫活性化サイトカインＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１２、およびインターフェロン－ガンマは、ＡＳＴ－１０２プラスミド対照（同様にａｓｄ由来のＣｐＧを含有する）およびＰＢＳ群と比べて有意に高かった（図２４Ａ）。免疫を抑制することが知られているサイトカインであるＩＬ－１０［例えば、Wang et al. (2012) Scand J Immunol. 3:273-281を参照のこと］は、プラスミド対照と比べてｓｈＴＲＥＸ１群でより低い傾向を示した（図２４Ｂ）。これらのデータは、ＴＲＥＸ１の阻害が、結腸癌のマウスモデルにおいて抗腫瘍免疫および強力な腫瘍成長阻害を促進する既知のＳＴＩＮＧ経路誘導サイトカインを活性化することを示している。

別個の侵襲性マウス結腸癌モデル、およびチェックポイント療法抵抗性メラノーマモデルにおいて腫瘍成長阻害を誘導するＡＳＴ－１０４（ＣｐＧエレメントを含むｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有する）の能力を評価するために、６～８週齢のメスのＣ５７ＢＬ／６マウス（１群当たり１０匹）に、ＭＣ３８結腸癌細胞またはＢ１６．Ｆ１０メラノーマ細胞（１００μＬ ＰＢＳ中、それぞれ、５および２×１０^５細胞）を右側腹部へＳＣ接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１０４、またはＡＳＴ－１０２を４日空けて２回ＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。

図２５に示すように、ＴＲＥＸ１に対するｓｈＲＮＡを含有する株ＡＳＴ－１０４は、プラスミド対照と比べてＭＣ３８腫瘍の強力な腫瘍成長阻害（ＴＧＩ ８５％、ｐ＜０．０００１、２８日目）、および有意な腫瘍成長阻害（ｐ＝０．０４９、２８日目）を誘導した。同様に、図２６に示すように、ＡＳＴ－１０４は、Ｂ１６．Ｆ１０メラノーマにおいてＰＢＳと比べて非常に有意な腫瘍成長阻害（ＴＧＩ ８３％、ｐ＝０．００１２、２４日目）、およびプラスミド対照株ＡＳＴ－１０２と比べてより大きな腫瘍成長阻害を誘導し、ＰＢＳと比べてこのモデルで有意な効果があった（ｐ＝０．０１９、２４日目）。これらの結果はまた、ｓｈＴＲＥＸ１介在性ＳＴＩＮＧ活性化と組合せた、ＣｐＧエレメントを含有するプラスミドが相乗効果および有効性を示し、ならびに腫瘍内投与の代わりに全身投与の利点を有することも示している。

まとめると、複数の侵襲性マウス腫瘍モデルにおいて、ＴＲＥＸ１に対するｓｈＲＮＡをコードするプラスミドをＹＳ１６４６株に追加することにより、対照プラスミドを含有するＹＳ１６４６株と比べて抗腫瘍応答が有意に強化された。これらのデータは、免疫刺激性腫瘍標的化細菌の全身投与を通じてＳＴＩＮＧ経路を活性化する効力を示している。

ＰＤ－Ｌ１
免疫系は、自己免疫を制限するためにいくつかのチェック・アンド・バランスを発達させた。プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）およびプログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）は、免疫応答を下方調節することにより機能する数多くの阻害性「免疫チェックポイント」の２つの例である。ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞シグナル伝達経路を妨げ、ＣＤ８^＋Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能を損ない、Ｔ細胞寛容を誘導する［Topalian et al. (2012) N Engl J Med 366:3443-3447］。

ＰＤ－Ｌ１遺伝子をノックダウンするｓｈＲＮＡをデリバリーする改変サルモネラ・ティフィムリウム株の腫瘍定着は、ＰＤ－１へのその結合、およびＣＤ８^＋Ｔ細胞機能のその阻害を破壊する。ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１チェックポイント阻害は、ＣｐＧプラスミドＤＮＡを含有する免疫刺激性Ｓ．ティフィムリウムと、オールインワンの治療様式で十分に相乗効果を生む。ＰＤ－Ｌ１に対するｓｈＲＮＡをコードするプラスミドを含有するＹＳ１６４６株（ＡＳＴ－１０５）のインビボ有効性を証明するために、マウス結腸癌モデルにおいてＡＳＴ－１０２株（同様にＣｐＧモチーフを含有する対照プラスミドを含有する）と比較してこの株を評価した。この実験のために、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり１０匹のマウス）に、ＣＴ２６マウス結腸癌（１００μＬ ＰＢＳ中２×１０^５細胞）を右側腹部へＳＣ接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１０５、ＡＳＴ－１０２を４日空けて２回ＩＶ注射、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体（４ｍｇ／ｋｇ、ＢｉｏＸＣｅｌｌクローン１０Ｆ．９Ｇ２）をＩＶ投与した。初回ＩＶ投与の６時間後、マウスを採血し、血漿を回収し、Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙキットを使用して炎症促進性サイトカインについて評価し、ＦＡＣＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。

図２７に示すように、株ＡＳＴ－１０５による処置は、プラスミド含有対照株ＡＳＴ－１０２による処置と比べて統計的に有意な腫瘍制御を示した（ＴＧＩ ６９％、ｐ＝０．０５、２５日目）。腫瘍成長阻害も、ＡＳＴ－１０５（ｓｈＰＤ－Ｌ１を発現する）による処置の方が抗ＰＤ－Ｌ１抗体の全身投与からの治療より大きかった（抗ＰＤ－Ｌ１と対比したＴＧＩ ６８％）。

ＩＶ注射後６時間での自然炎症促進性サイトカインの産生を比較すると、株ＡＳＴ－１０５によって誘発されたサイトカインは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体と比べて有意により高く（ｐ＜０．０５、図２８）、ＡＳＴ－１０２からのものよりはるかに高かった。これらのデータは、抗ＰＤ－Ｌ１抗体の全身投与と比べて、腫瘍微小環境内でのＰＤ－Ｌ１の阻害は、結腸癌のマウスモデルにおいて抗腫瘍免疫を誘導し、腫瘍成長阻害を促進する強力な炎症促進性サイトカインを独自に活性化することを示している。

改変Ｓ．ティフィムリウムｓｈＴＲＥＸ１の腫瘍内投与は、両側腹部マウス結腸癌モデルにおいて遠位腫瘍定着および完全な抗腫瘍応答を提供する
腫瘍に対する適応免疫を誘導する特徴は、遠位の未処置腫瘍の退縮を誘導する能力である。ｐＥＱＵ６ ｓｈＲＮＡプラスミドを含有するＹＳ１６４６株の、両側腹部マウス結腸癌モデルにおいて原発および遠位腫瘍成長阻害を誘導する能力を評価するために、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり１０匹のマウス）に、ＣＴ２６マウス結腸癌（１００μＬ ＰＢＳ中２×１０^５細胞）を右側腹部および左側腹部へＳＣ接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１０４（ＹＳ１６４６でのｐＥＱＵ６ ｓｈＴＲＥＸ１）、ＡＳＴ－１０５（ＹＳ１６４６でのｐＥＱＵ６ ｓｈＰＤ－Ｌ１）またはＡＳＴ－１０２（ＹＳ１６４６でのプラスミド対照）を４日空けて２回、右側腹部腫瘍へ腫瘍内（ＩＴ）注射し、ＰＢＳ対照と比較した。

図２９に示すように、ＡＳＴ－１０４およびＡＳＴ－１０５のＩＴ注射は、ＰＢＳ対照と比べて注射した腫瘍で有意な腫瘍成長阻害を誘導した（ＡＳＴ－１０５ － ＴＧＩ ６０．５％、ｐ＝０．０３；ＡＳＴ－１０４ － ＴＧＩ ６１．４％、ｐ＝０．０３、２５日目）。ＡＳＴ－１０５とは異なり、ＡＳＴ－１０４のみが、ＰＢＳと比べて遠位の未処置腫瘍の有意な成長阻害（ＴＧＩ ６０％、ｐ＜０．０００１、２５日目）、およびプラスミド対照を含有するＡＳＴ－１０２と比べて有意な遠位腫瘍成長阻害を誘導した（ｐ＝０．００４、２５日目）。ＡＳＴ－１０４株はまた、ＰＢＳ対照と比較して有意な腫瘍退縮、および生存率の増加も示し［ｐ＝０．００７６、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定］、２／１０は完全寛解であった（図３０）。

細菌が、注射した腫瘍、および遠位腫瘍に定着するかどうかを決定するために、ＡＳＴ－１０４で処置した腫瘍担持マウスを屠殺し、腫瘍を回収した。注射した腫瘍および遠位腫瘍をＭチューブに移し、ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＰＢＳ中でホモジナイズした。腫瘍ホモジネートを連続希釈し、ＬＢ寒天プレートにプレーティングし、コロニー形成単位（ＣＦＵ）決定のために３７℃でインキュベートした。図３１に示すように、遠位腫瘍は、注射した腫瘍と同程度に定着した。これは、腫瘍内投与経路で投与された遺伝子改変サルモネラ属菌株が移行し、遠位病変に定着することができることを示唆するものである。これらのデータは、他の臓器より優先的に遠位腫瘍病変に全身性に定着する能力を有する免疫刺激性細菌をＩＴ投与する効力、および全身の腫瘍退縮および完全寛解をもたらすＳＴＩＮＧ Ｉ型インターフェロン経路を活性化する効力を示している。

ＣｐＧエレメントを含有するプラスミドによる改変Ｓ．ティフィムリウム株は、ＹＳ１６４６親株と比べて抗腫瘍活性の強化を示す
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を感知し、病原体に対する自然免疫を活性化するための重要な受容体である［Akira et al. (2001) Nat Immunol. 2(8):675-680］。これらのうち、ＴＬＲ９は、哺乳動物ＤＮＡには天然に存在しない病原体ＤＮＡの低メチル化ＣｐＧモチーフを認識することに関与している［McKelvey et al. (2011) J Autoimmunity 36:76］。免疫細胞サブセットにおけるエンドソームへの病原体の食作用時のＣｐＧモチーフの認識により、ＩＦＲ７依存性Ｉ型インターフェロンシグナル伝達が誘導され、自然および適応免疫が活性化される。ＣｐＧモチーフを含有する改変サルモネラ・ティフィムリウムプラスミドを担持するＳ．ティフィムリウム株ＹＳ１６４６（ＹＳ１６４６ ｐＥＱＵ６スクランブル）は、プラスミドを含まないＹＳ１６４６株と比べて、ＴＬＲ９を同様に活性化し、Ｉ型ＩＦＮ介在性自然および適応免疫を誘導することが本明細書に示されている。

本明細書で使用される遺伝子改変プラスミド中のＣｐＧモチーフを表２に示す。株ＡＳＴ－１０３のｐＥＱＵ６ ｓｈＳＣＲ（非同族ｓｈＲＮＡ）プラスミドは３６２個のＣｐＧモチーフを持っており、サルモネラベースのプラスミドデリバリーが、このプラスミドによる同じサルモネラを欠く形質転換と比べて免疫刺激性であり、抗腫瘍効果を有し得ることを示唆している。マウス結腸癌モデルにおいて腫瘍成長阻害を誘導するＹＳ１６４６内のＣｐＧ含有プラスミドの能力を評価するために、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり９匹のマウス）に、ＣＴ２６（１００μＬ ＰＢＳ中、２×１０^５細胞）を右側腹部へＳＣ接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、５×１０^６ＣＦＵのＹＳ１６４６（ＡＳＴ－１００）またはＣｐＧモチーフを有するｓｈＲＮＡスクランブルプラスミドを含有するＹＳ１６４６（ＡＳＴ－１０３）の３回投与を毎週ＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。

図３２に示すように、ＹＳ１６４６（ＡＳＴ－１００）株は、ＰＢＳと比べて中程度の腫瘍制御を示した（ＴＧＩ ３２％、ｐ＝ｎｓ、２８日目）。非同族スクランブルｓｈＲＮＡをコードするＣｐＧ含有プラスミドの添加によってのみＹＳ１６４６と異なるＡＳＴ－１０３株は、形質転換されなかった、したがってプラスミドを欠くＹＳ１６４６単独と比べて、非常に有意な腫瘍成長阻害を示した（ｐ＝０．００４、３２日目）。

ａｓｄ遺伝子は２３４個のＣｐＧモチーフを持っており（表２）、これを含有するプラスミドが免疫刺激性特性を有し得ることを示唆している。図４６に示すように、ＡＳＴ－１０９（スクランブルｓｈＲＮＡを有するＹＳ１６４６－ＡＳＤ）は、ＰＢＳ単独と対比した腫瘍成長阻害が、強い免疫刺激性作用を示唆する５１％であった。

これらのデータは、Ｓ．ティフィムリウムの腫瘍標的化弱毒化株内のＴＬＲ９活性化ＣｐＧモチーフを含有するプラスミドＤＮＡの強力な免疫刺激性特性を示している。

マイクロＲＮＡ阻害を含有する改変サルモネラ・ティフィムリウム株は、ｓｈＲＮＡと比べて抗腫瘍活性の強化を示す
優れたＴＲＥＸ１遺伝子ノックダウンは、マイクロＲＮＡ ＡＲＩ－２０３によりインビトロで達成された（実施例２、図２０を参照のこと）。マイクロＲＮＡ株ＡＳＴ－１０６を、ＴＲＥＸ１に対するマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードするＡＲＩ－２０３、ｐＥＱＵ６プラスミドでＹＳ１６４６を形質転換して生成した。ＡＳＴ－１０６を、ｓｈＲＮＡ株、ＡＳＴ－１０４（ｐＥＱＵ６ ｓｈＴＲＥＸ１で形質転換されたＹＳ１６４６）と比較した。マウス結腸癌モデルにおけるインビボ効力をテストした。この実験のために、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり１０匹のマウス）に、ＣＴ２６（１００μＬ ＰＢＳ中、２×１０^５細胞）を右側腹部へＳＣ接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１０４またはＡＳＴ－１０６を、８日目、１５日目および２３日目に毎週ＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。

図３３に示すように、ＴＲＥＸ１ノックダウン株の両方のバージョンは、ＰＢＳ対照と比べて有意な腫瘍成長阻害を示した（ＡＳＴ－１０４ ＴＧＩ ５８％、ｐ＝０．０１４；ＡＳＴ－１０６ ＴＧＩ ７７％、ｐ＝０．００３、１７日目）。ＡＳＴ－１０６ ｍｉＴＲＥＸ１は、２回目の投与後に最も強力な腫瘍制御を示し、ｓｈＴＲＥＸ１株ＡＳＴ－１０４より有意に良好であった（ｐ＝０．０３６、１７日目）。これらのデータは、マイクロＲＮＡベースの阻害性ＲＮＡが、腫瘍成長阻害モデルにおいてより強力な遺伝子ノックダウンをインビボで遂行し、ｓｈＲＮＡベースの阻害性ＲＮＡを上回り得ることを示している。

ベクター合成
プラスミドからのａｓｄ発現によるａｓｄ欠失の相補
プラスミド（ｐＡＴＩＵ６）を化学的に合成し、アセンブルした（配列番号２２５）。プラスミドは、以下の特徴を含有した：高コピー（ｐＵＣ１９）複製起点、ショートヘアピンの発現を駆動するためのＵ６プロモーター、その後の除去のためのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位と隣接するアンピシリン耐性遺伝子、および開始コドンの上流に８５塩基対の配列を含有するａｓｄ遺伝子（配列番号２４６）。このベクターに、マウスＴＲＥＸ１を標的にするｓｈＲＮＡまたはスクランブル非同族ｓｈＲＮＡ配列をＳｐｅＩおよびＸｈｏＩによる制限消化およびライゲーションによって導入し、Ｅ．コリＤＨ５－アルファにクローニングした。それぞれ、ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１およびｐＡＴＩ－ｓｈＳＣＲと名付けられた得られたプラスミドをＥ．コリで増幅し、電気穿孔によるａｓｄノックアウト株ＡＳＴ－１０１への形質転換、ならびにそれぞれ株ＡＳＴ－１０８およびＡＳＴ－１０７を産生する、ＬＢ ａｍｐプレートでのクローン選択のために精製した。ｐＡＴＩＵ６由来プラスミドで相補したａｓｄ突然変異体は、ＤＡＰの非存在下のＬＢ寒天および液体培地で成長することができた。

その後の反復において、ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１由来のアンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）をカナマイシン耐性遺伝子に置き換えた。これは、ＨｉｎｄＩＩＩによるｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドの消化と、これに続くＡｍｐＲ遺伝子を除去するためのゲル精製によって達成した。プライマーＡＰＲ－００１およびＡＰＲ－００２（配列番号２２６および配列番号２２７）を使用したカナマイシン耐性（ＫａｎＲ）遺伝子のＰＣＲ増幅、ＨｉｎｄＩＩＩによる消化、およびゲル精製され、消化されたｐＡＴＩＵ６プラスミドへのライゲーション。

その後の反復において、１４８位のヌクレオチドＴをＣに変えるためのＱ５（登録商標）Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）ならびにプライマーＡＰＲ－００３（配列番号２２８）およびＡＰＲ－００４（配列番号２２９）を使用して、単一の点突然変異をｐＵＣ１９複製起点でｐＡＴＩＫａｎプラスミドに導入した。この突然変異は、プラスミドコピー数を低減するために複製起点をｐＢＲ３２２複製起点と相同にする。

ｐＡＴＩ２．０
以下の特徴を含有するプラスミドを設計し、合成した：ｐＢＲ３２２複製起点、ＳＶ４０ ＤＮＡ核標的化配列（ＤＴＳ）、ｒｒｎＢターミネーター、ｓｈＲＮＡの発現を駆動するためのＵ６プロモーターと、これに続く、プロモーターおよびｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡをクローニングするための隣接制限部位、ａｓｄ遺伝子、ｒｒｎＧターミネーター、ならびに除去のためのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびマルチクローニング部位と隣接するカナマイシン耐性遺伝子（配列番号２４７）。更に、２つの別個のｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡの発現用のプラスミドを設計し、合成した。このプラスミドは、以下の特徴を含有した：ｐＢＲ３２２複製起点、ＳＶ４０ ＤＮＡ核標的化配列（ＤＴＳ）、ｒｒｎＢターミネーター、ｓｈＲＮＡの発現を駆動するためのＵ６プロモーターと、これに続く、プロモーターおよびｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡをクローニングするための隣接制限部位、第２のｓｈＲＮＡまたはマイクロＲＮＡの発現を駆動するためのＨ１プロモーター、Ｈ１とＵ６プロモーターの間に置かれる４５０ｂｐのランダムに生成されたスタッファー配列、ａｓｄ遺伝子、ｒｒｎＧターミネーター、ならびに除去のためのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびマルチクローニング部位と隣接するカナマイシン耐性遺伝子（配列番号２４５）。

ＦｌｉｃおよびＦｌｊｂ遺伝子の欠失によるＳ．ティフィムリウムフラジェリンノックアウト株遺伝子改変
本明細書の例では、Ｓ．ティフィムリウム株を、炎症促進性シグナル伝達を低減するためにフラジェリンサブユニットｆｌｉＣおよびｆｌｊＢの両方を欠くように遺伝子改変した。ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢの欠失は、ＹＳ１６４６のａｓｄ遺伝子欠失株（ＡＳＴ－１０１）の染色体へ連続的に遺伝子改変させた。

ｆｌｉＣの欠失
この例では、実施例１に詳細に記載され、図３４に図式的に示されるDatsenkoおよびWannerの方法［Proc Natl Acad Sci USA 97:6640-6645 (2000)］の修正を使用して、ＡＳＴ－１０１株の染色体からｆｌｉＣを欠失させた。ｆｌｉＣ遺伝子に隣接する２２４および２４５塩基の相同な配列を含有する合成ｆｌｉＣ遺伝子相同性アーム配列を注文し、ｐＳＬ０１４７と呼ばれるプラスミドにクローニングした（配列番号２３０）。ｃｒｅ／ｌｏｘ ｐ部位と隣接するカナマイシン遺伝子カセットを、次いでｐＳＬ０１４７にクローニングし、ｆｌｉＣ遺伝子ノックアウトカセットを、次いで、プライマーｆｌｉｃ－１（配列番号２３２）およびｆｌｉｃ－２（配列番号２３３）を用いてＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を担持するＡＳＴ－１０１株に電気穿孔によって導入した。電気穿孔細胞をＳＯＣ＋ＤＡＰ培地に回収し、カナマイシン（２０μｇ／ｍＬ）およびジアミノピメリン酸（ＤＡＰ、５０μｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ寒天プレートにプレーティングした。コロニーを選択し、ノックアウト断片の挿入について、プライマーｆｌｉｃ－３（配列番号２３４）およびｆｌｉｃ－４（配列番号２３５）を使用するＰＣＲによってスクリーニングした。ｐＫＤ４６を、次いで、選択したカナマイシン耐性株を４２℃で培養して除去し、アンピシリン耐性の喪失についてスクリーニングした。カナマイシン耐性マーカーを、次いで、Ｃｒｅリコンビナーゼ（ｐＪＷ１６８０）を発現する温度感受性プラスミドの電気穿孔によって除去し、Ａｍｐ^Ｒコロニーを３０℃で選択した；ｐＪＷ１６８はその後、培養物を４２℃で成長させて排除した。選択したｆｌｉＣノックアウトクローンを、次いで、破壊部位に隣接するプライマー（ｆｌｉｃ－３およびｆｌｉｃ－４）を使用するＰＣＲ、およびアガロースゲルでの電気泳動移動度の評価によって、カナマイシンマーカーの喪失についてテストした。

ｆｌｊＢの欠失
ｆｌｊＢを、次いで、上記に記載した方法の修正を使用してａｓｄ／ｆｌｉＣ欠失ＹＳ１６４６株で欠失させた。ｆｌｉＣ遺伝子に隣接する、それぞれ２４９および２１３塩基の左側および右側配列を含有する合成ｆｌｊＢ遺伝子相同性アーム配列を合成し、ｐＳＬ０１４８と呼ばれるプラスミドにクローニングした（配列番号２３１）。ｃｒｅ／ｌｏｘＰ部位と隣接するカナマイシン遺伝子カセットを、次いでｐＳＬ０１４８にクローニングし、ｆｌｊＢ遺伝子ノックアウトカセットを、次いで、プライマーｆｌｊｂ－１（配列番号２３６）およびｆｌｊｂ－２（配列番号２３７）を用いてＰＣＲ増幅し、ゲル精製し、温度感受性ラムダレッド組換えプラスミドｐＫＤ４６を担持するＡＳＴ－１０１に電気穿孔によって導入した。カナマイシン耐性遺伝子を、次いで、上記に記載したようにｃｒｅ介在性組換えによって除去し、温度感受性プラスミドは非許容温度での成長によって除去した。ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢ遺伝子ノックアウト配列を、プライマーｆｌｉｃ－３およびｆｌｉｃ－４またはｆｌｊｂ－３（配列番号２３８）およびｆｌｊｂ－４（配列番号２３９）を使用するＰＣＲによって増幅し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。ＹＳ１６４６のこのａｓｄ^－／ｆｌｉＣ^－／ｆｌｊＢ^－突然変異体誘導体をＡＳＴ－１１１と名付けた。

遺伝子改変Ｓ．ティフィムリウムフラジェリンノックアウト株のインビトロでの特徴付け
本明細書でＡＳＴ－１１１またはＡＳＤ／ＦＬＧと呼ばれる、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢの両方の欠失を有するＹＳ１６４６由来ａｓｄ突然変異体株を、１０マイクロリットルの一晩培養物をスイミングプレート（０．３％寒天および５０ｍｇ／ｍＬ ＤＡＰを含有するＬＢ）にスポットして、遊泳運動性について評価した。運動性はＹＳ１６４６およびａｓｄ欠失株ＡＳＴ－１０１で観察されたが、ａｓｄ／ｆｌｉＣ／ｆｌｊＢ欠失株ＡＳＴ－１１１では運動性が明白ではなかった。ＡＳＴ－１１１株に、次いで、ｐＡＴＩｓｈＴＲＥＸ１（ａｓｄ遺伝子およびＴＲＥＸ１を標的にするｓｈＲＮＡを含有するプラスミド）を電気穿孔してＡＳＴ－１１２を作製し、ＤＡＰの非存在下でのその成長率を評価した。図３５に示すようにＡＳＤ／ＦＬＧ（ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）株ＡＳＴ－１１２は、補充ＤＡＰの非存在下、ＬＢで複製することができ、ｐＡＴＩｓｈＴＲＥＸ１を含有するａｓｄ株（ＡＳＴ－１０８）と同等の速度で成長した。これらのデータは、フラジェリンの排除は、Ｓ．ティフィムリウムのインビトロでの適応度を低下させないことを示している。

フラジェリンサブユニットの排除は、マクロファージにおけるピロトーシスを低下させる。これを証明するために、５×１０^５マウスＲＡＷ－ｄｕａｌ（商標）マクロファージ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、サンディエゴ、Ｃａ．）を、ゲンタマイシン保護アッセイで、ＡＳＴ－１１８と名付けられた低コピーｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを有するａｓｄ／ｆｌｉＣ／ｆｌｊＢ欠失株、または同じプラスミドを有するａｓｄ欠失株（ＡＳＴ－１１７）に約１００のＭＯＩで感染させた。感染の２４時間後、培養上清物を回収し、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＬＤＨ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、Ｍａ．）を使用して、細胞死のマーカーとしての乳酸脱水素酵素放出について評価した。ＡＳＴ－１１７は７５％の最大ＬＤＨ放出を誘導し、一方ＡＳＴ－１１８は５４％の最大ＬＤＨ放出を誘導した。これは、フラジェリン遺伝子の欠失がＳ．ティフィムリウム誘導ピロトーシスを低減することを示すものである。

ｓｈＴｒｅｘ１プラスミドを含有するＡＳＤ／ＦＬＧノックアウト株は、親ａｓｄ株と比べて抗腫瘍活性の強化、インターフェロンガンマ応答の強化、およびマウスにおける腫瘍定着の増加を示す。
結腸癌のマウスモデルで投与されたフラジェリンノックアウト株の影響を評価するために、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり１０匹のマウス）に、ＣＴ２６（１００μＬ ＰＢＳ中、２×１０^５細胞）を右側腹部へＳＣ接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、ｐＡＴＩＫａｎ－ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するＡＳＤ／ＦＬＧ株（ＡＳＴ－１１３）または同じｐＡＴＩＫａｎ－ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを有するＡＳＤ株（ＡＳＴ－１１０）５×１０^６ＣＦＵの週３回投与をＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。初回ＩＶ投与の６時間後、マウスを採血し、血漿を回収し、Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙキットを使用して炎症促進性サイトカインについて評価し、ＦＡＣＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。

図３６に示すように、鞭毛を作ることができず、およびｐＡＴＩｓｈＴｒｅｘ１プラスミドを含有するＡＳＴ－１１３株（ＡＳＤ／ＦＬＧ ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）は、親ＡＳＤ ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１株ＡＳＴ－１１０と比べて腫瘍制御の強化、およびＰＢＳ対照と比べて有意な腫瘍制御を示した（ＴＧＩ ５４％、ｐ＝０．０２、１７日目）。

ＩＶ注射後６時間での全身性血清サイトカインのレベルを比較すると、ＡＳＴ－１１３株によって誘発されたサイトカインは、鞭毛を作ることができる親ＡＳＴ－１１０株と比べてＴＮＦ－αおよびＩＬ－６に関して同等であった。強力な抗腫瘍免疫サイトカインＩＦＮ－γのレベルは、ＡＳＴ－１１０と比べてＡＳＴ－１１３で有意により高かった。これは、フラジェリン欠損株が、親ａｓｄノックアウト株より優れた抗腫瘍効力を提供することができることを示唆するものである（図３７）。

腫瘍移植後３５日目（遺伝子改変サルモネラ療法の最終投与後１２日目）に、上記に記載したように、１群当たり３匹のマウスを安楽死させ、腫瘍をホモジナイズし、ＬＢプレートにプレーティングして腫瘍組織１グラム当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）数を数えた。図３８に示すように、ａｓｄ遺伝子欠失しか有さず、および同じプラスミドを含有する株（ＡＳＴ－１１０）だけでなく、ｆｌｉＣおよびｆｌｊＢを欠失し、ならびにｐＡＴＩｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するＡＳＴ－１１３株も、少なくとも腫瘍に定着することができた。ＡＳＴ－１１３は、ＡＳＴ－１１０の平均２．１×１０^６ｃｆｕ／ｇ腫瘍と比べて、組織１グラム当たり平均１．２×１０^７ＣＦＵで腫瘍に定着した。これは、フラジェリンの欠如が、機能性鞭毛を有する株の５倍を超える腫瘍定着の増加をもたらし得ることを示唆するものである。まとめると、これらのデータは、当技術分野からの予測に反して、腫瘍定着に鞭毛は必要でないだけでなく、その喪失は腫瘍定着および抗腫瘍免疫を強化することができることを示している。

プラスミドデリバリーの強化のためのｃｙｔｏＬＬＯを発現するように遺伝子改変されたＳ．ティフィムリウム
この例では、実施例１に記載されたＹＳ１６４６のａｓｄ欠失株（ＡＳＴ－１０１）を更に改変して、サルモネラ属菌株の細胞質に蓄積するシグナル配列を欠くリステリオリシンＯ（ＬＬＯ）タンパク質（本明細書ではｃｙｔｏＬＬＯと呼ばれる）を発現させた。ＬＬＯは、リステリア・モノサイトゲネスから分泌され、細菌のファゴソームエスケープ（ｐｈａｇｏｓｏｍａｌ ｅｓｃａｐｅ）を介在するコレステロール依存性の膜孔形成細胞溶解素である。コドン２～２４個を欠失したＬＬＯをコードする遺伝子を、サルモネラ菌での発現に最適化されたコドンにより合成した。ｃｙｔｏＬＬＯのオープンリーディングフレームの配列は、配列番号２４０にある。ｃｙｔｏＬＬＯ遺伝子を、Ｓ．ティフィムリウムにおける転写を誘導するプロモーター（以下に再現された配列番号２４１）の制御下に置いた。実施例１に記載されているDatsenkoおよびWanner［Proc Natl Acad Sci USA (2000) 97:6640-6645］の方法の修正を使用して、ｃｙｔｏＬＬＯ発現カセットをａｓｄ欠失株ＡＳＴ－１０１のノックアウトａｓｄ座に単一コピーで挿入した。

ｃｙｔｏＬＬＯ発現カセットがａｓｄ座に挿入されたａｓｄ欠失株（本明細書ではＡＳＤ／ＬＬＯまたはＡＳＴ－１１４と呼ばれる）を、実施例７に記載されているように、外来ＤＡＰの非存在下で株を成長させ、プラスミド維持に対して選択を行い、ｓｈＴＲＥＸ１の発現を駆動するＵ６プロモーターも含有するａｓｄ遺伝子をコードするｐＡＴＩプラスミドによる電気穿孔によって更に改変した（本明細書ではＡＳＤ／ＬＬＯ（ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）またはＡＳＴ－１１５と呼ばれる）。図３９に示すように、ＡＳＤ／ＬＬＯ（ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）株ＡＳＴ－１１５は、同じプラスミド（ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）を含有するａｓｄ欠失株、ＡＳＴ－１１０と同等の速度で成長した。これは、ＬＬＯノックインがインビトロでの細菌の適応度に影響を与えないことを示している。

ｃｙｔｏＬＬＯを産生するように遺伝子改変されたＳ．ティフィムリウムは、強力な抗腫瘍活性を示す
ｃｙｔｏＬＬＯ遺伝子ノックインが抗腫瘍効果をもたらしたかどうかを決定するために、ＡＳＤ／ＬＬＯ（ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）株ＡＳＴ－１１５を結腸癌のマウスモデルで評価した。この試験のために、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり８匹のマウス）に、ＣＴ２６（１００μＬ ＰＢＳ中、２×１０^５細胞）を右側腹部へＳＣ接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１１５の単回投与をＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。

図４０に示すように、ａｓｄ株ＡＳＤ／ＬＬＯ（ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）へのｃｙｔｏＬＬＯ遺伝子の添加は、ＰＢＳ対照と比べて非常に有意な腫瘍制御（ＴＧＩ ７６％、ｐ＝０．００２、２８日目）、および単回投与後の、ＴＲＥＸ１ ｓｈＲＮＡプラスミド含有株を複数回投与で与えた以前の試験と同等の有効性を示した。これらのデータは、より多くのプラスミドをサイトゾルにデリバリーし、より大きな遺伝子ノックダウンをもたらし、それによってＴＲＥＸ１等の標的に対するＲＮＡｉの治療有効性を改善するというｃｙｔｏＬＬＯ介在性利点を示している。

Ｓ．ティフィムリウムのアデノシン栄養要求性株
本明細書で提供される株は、アデノシンに対して栄養要求性であるように遺伝子改変される。その結果、株はインビボで弱毒化される。その理由は、正常組織の低アデノシン濃度では株は複製することができず、したがって定着は主に、アデノシンレベルが高い固形腫瘍微小環境で生じるためである。サルモネラ属菌株ＹＳ１６４６（ＡＳＴ－１００）は野生型株ＡＴＣＣ１４０２８の誘導体であり、ｐｕｒＩ遺伝子の破壊のためにプリンに対して栄養要求性であるように遺伝子改変された［Low et al., (2004) Methods Mol. Med 90:47-60］。ＹＳ１６４６の全ゲノムのその後の分析は、ｐｕｒＩ遺伝子（ｐｕｒＭと同義）は実際に欠失されないが、代わりに染色体逆位によって破壊されること［Broadway et al. (2014) J.Biotechnol. 20:177-178］、および遺伝子全体は、挿入配列と隣接するＹＳ１６４６染色体の２つの部分内に依然として含有されること（そのうち１つは、活性トランスポザーゼを有する）を示した。染色体再結合（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）によって破壊されたｐｕｒＩ遺伝子の完全な遺伝子配列の存在は、野生型遺伝子の復帰可能性を残す。ＹＳ１６４６のプリン栄養要求性がインビトロでの連続継代後に安定であることは以前に示されているが、復帰率がどれほどであるかは明らかでなかった［Clairmont et al. (2000) J. Infect. Dis. 181:1996-2002］。

アデノシンを提供した場合、ＹＳ１６４６は最少培地で複製することができるのに対し、野生型親株ＡＴＣＣ１４０２８は、アデノシンを補充しない最少培地で成長し得ることが本明細書で示される。ＹＳ１６４６をＬＢ培地で一晩成長させ、Ｍ９最少培地で洗浄し、アデノシンを含有しないか、またはアデノシンの濃度を高めたＭ９最少培地に希釈した。３７℃でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、１５分ごとにＯＤ_６００を読み取って成長を測定した。

図４１に示すように、アデノシンを１１～３００マイクロモルにわたる濃度で提供した場合、ＹＳ１６４６は複製することができたが、Ｍ９単独または１３０ナノモルアデノシンを補充したＭ９では複製することが完全にできなかった。これらのデータは、ｐｕｒＩ突然変異体が、腫瘍微小環境で見出されるアデノシンの濃度で複製することができるが、正常組織で見出される濃度では複製できないことを示している。本明細書で例証される遺伝子改変アデノシン栄養要求性株は、野生型への復帰を防ぐためにｐｕｒＩオープンリーディングフレームの全て、または部分が染色体から欠失される株を含む。そのような遺伝子欠失は、実施例１に記載されているラムダレッド系を利用して達成することができる。

実施例１に記載のようにａｓｄ遺伝子欠失（ＡＳＤ）を含有するように更に遺伝子改変されたｐｕｒＩ破壊を含有するサルモネラ属菌株、または実施例８に記載のようにｆｌｉＣおよびｆｌｊＢの欠失ならびに（ＡＳＤ／ＦＬＧ）を有するように更に遺伝子改変されたａｓｄ遺伝子欠失、または実施例９に記載のようにｃｙｔｏＬＬＯを発現するように更に遺伝子改変され（ＡＳＤ／ｃＬＬＯ）、および実施例７に記載のようにａｓｄを発現する低コピー数プラスミド（ｐＡＴＩｌｏｗ）で相補したａｓｄ突然変異体（それぞれ、株ＡＳＴ－１１７、ＡＳＴ－１１８、およびＡＳＴ－１１９）もまた、Ｍ９最少培地での成長について評価した。図４２のデータは、アデノシンを１１～３００マイクロモルにわたる濃度で提供した場合、各株は複製することができたが、Ｍ９単独または１３０ナノモルアデノシンを補充したＭ９では複製することが完全にできなかったことを示している。

ａｓｄ遺伝子相補を含む株のａｓｄ遺伝子相補系インビトロ成長の特徴付けおよび使用
プラスミドを含有する細菌株の適応度を評価するために、３７℃でＳｐｅｃｔｒａｍａｘプレートリーダーを使用し、１５分ごとにＯＤ_６００を読み取ってＬＢ液体培地で成長曲線を行った。図４３に示すように、低コピープラスミドｐＥＱＵ６－ｓｈＴＲＥＸ１を含有するＹＳ１６４６（ＡＳＴ－１０４）は、プラスミドを含有しないＹＳ１６４６（ＡＳＴ－１００）と同等に成長した。ａｓｄ栄養要求性を相補し得るａｓｄ遺伝子を含む高コピーｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを有するａｓｄ突然変異体株（ＡＳＴ－１１０）は、ＤＡＰの非存在下のＬＢで複製することができたが、ＹＳ１６４６より遅く成長した。低コピー数の複製起点およびａｓｄ栄養要求性を相補し得るａｓｄ遺伝子を含むｓｈＴＲＥＸ－１発現プラスミド（ｐＡＴＩｌｏｗ－ｓｈＴＲＥＸ１）を含有するａｓｄ欠失株、株ＡＳＴ－１１７は、ＡＳＴ－１１０より速い速度で成長した。これらのデータは、ａｓｄ遺伝子栄養要求性を相補する低コピー数プラスミドは、Ｓ．ティフィムリウムのインビトロでのより迅速な複製速度を可能にすることから、高コピー数プラスミドより優れていることを示している。

ａｓｄ相補株の細胞内成長
高および低コピープラスミド上のａｓｄを相補したａｓｄ突然変異体の適応度を測定するために、マウス腫瘍細胞株において細胞内で複製する細菌株の能力を、ゲンタマイシン保護アッセイを使用して評価した。このアッセイでは、マウスメラノーマＢ１６．Ｆ１０細胞またはマウス結腸がんＣＴ２６細胞を、相補的ａｓｄ遺伝子を含有し、および高コピー複製起点、ＡＳＴ－１１０（ＡＳＤ ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）または低コピー複製起点、ＡＳＴ－１１７（ＡＳＤ ｐＡＴＩ低コピー－ｓｈＴＲＥＸ１）のどちらかを有するプラスミドを含有するａｓｄ突然変異体サルモネラ属菌株に感染させた。細胞を、１細胞当たり約５個の細菌の多重度で３０分間感染させ、次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、ゲンタマイシンを含有する培地を添加して細胞外細菌を死滅させた。細胞内細菌は細胞膜を通過することができないことから、ゲンタマイシンによって死滅されない。感染後の様々な時点で、細胞単層を水による浸透圧ショックによって溶解し、細胞溶解物を希釈し、ＬＢ寒天にプレーティングして生存コロニー形成単位（ＣＦＵ）を数えた。

図４４に示すように、高コピープラスミドで相補したａｓｄ突然変異体株、ＡＳＴ－１１０は、ＣＦＵが最初に減少したものの、Ｂ１６．Ｆ１０細胞で成長することができたが、ＣＴ２６細胞では成長できなかった。これは、ａｓｄ遺伝子相補系が哺乳動物腫瘍細胞の内部の成長を支持するのに十分であることを示すものである。低コピープラスミドを含有するａｓｄ突然変異体株、ＡＳＴ－１１７は、両方の細胞タイプに侵入し、複製することができた。これは、低コピープラスミドにおけるａｓｄ遺伝子相補が、哺乳動物細胞の内部で頑強なａｓｄ突然変異体成長を可能にすることを示すものである。低コピープラスミドを有する株は、高コピープラスミドを有する株と比べて、両方の腫瘍細胞タイプでより多い数まで複製した。これは、低コピープラスミドを有するサルモネラ属菌株が、高コピープラスミドを有する株より適応度を強化したことを示している。

相補系を使用した腫瘍におけるプラスミド維持
この例では、ＣＴ２６腫瘍担持マウスを、ＴＲＥＸ１を標的にするｓｈＲＮＡを発現するプラスミド（ｐＥＱＵ６－ＴＲＥＸ１）を含有するＹＳ１６４６、株ＡＳＴ－１０４、または機能性ａｓｄ遺伝子およびＴＲＥＸ１を標的にするｓｈＲＮＡを有するプラスミド（ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）を含有するＹＳ１６４６のａｓｄ欠失株、株ＡＳＴ－１１０で処置した。最後のサルモネラ注射後１２日目に、腫瘍をホモジナイズし、ホモジネートを連続希釈し、ＬＢ寒天プレートにプレーティングして存在するＣＦＵの総数を数えるか、またはカナマイシンを含有するＬＢプレートにプレーティングしてカナマイシン耐性コロニーの数を数えた。

図４５に示すように、ｓｈＲＮＡプラスミドを維持するための選択圧を持たなかったＳ．ティフィムリウム、ＡＳＴ－１０４は、カナマイシン耐性（ＫａｎＲ）コロニーのパーセントが１０％未満であったことから、プラスミド喪失を示した。プラスミド維持のためのａｓｄ遺伝子相補系を使用した株、ＡＳＴ－１１０は、ほぼ同数のカナマイシン耐性およびカナマイシン感受性ＣＦＵを有した。これらのデータは、ａｓｄ遺伝子相補系が、マウスにおける腫瘍微小環境の文脈でプラスミドを維持するのに十分であることを示している。

ａｓｄ相補系を使用した抗腫瘍効果の強化
ａｓｄ相補系を、プラスミド喪失を防ぎ、Ｓ．ティフィムリウム株によるインビボでの阻害性ＲＮＡデリバリーの抗腫瘍効果を増強するように設計する。これをテストするために、ｓｈＴＲＥＸ１プラスミドを含有するａｓｄ欠失株（ＡＳＴ－１１０）、または機能性ａｓｄ遺伝子カセットを含有するスクランブル対照（ＡＳＴ－１０９）を、ｐＥＱＵ６－ｓｈＴＲＥＸ１を含有するＹＳ１６４６（ＡＳＴ－１０４、ａｓｄ遺伝子カセットを欠き、したがってプラスミド維持のための機構を有さないプラスミド）とマウス結腸癌モデルにおける抗腫瘍効果について比較した。この実験のために、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり８匹のマウス）に、ＣＴ２６（１００μＬ ＰＢＳ中、２×１０^５細胞）を右側腹部へＳＣ接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１０９（ｐＡＴＩ－ｓｈスクランブルで形質転換されたＡＳＤ）、ＡＳＴ－１１０（ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１で形質転換されたＡＳＤ）、またはＡＳＴ－１０４（ｐＥＱＵ６－ｓｈＴＲＥＸ１で形質転換されたＹＳ１６４６）を８日目および１８日目に２回ＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。

図４６に示すように、ＹＳ１６４６株ＡＳＴ－１０４は、経時的にプラスミド喪失を示したにもかかわらず、ＰＢＳと比べて腫瘍制御を示した（ＴＧＩ ７０％、２８日目）。ａｓｄ遺伝子相補系を有するｐＡＴＩプラスミドにスクランブル対照を含有するａｓｄ株（ＡＳＴ－１０９）は、ＰＢＳと比べて腫瘍制御を示した（ＴＧＩ ５１％、２５日目）。これは、ＣｐＧプラスミドのデリバリーの維持が抗腫瘍応答を刺激することを示唆するものである。ａｓｄ遺伝子相補系およびｓｈＴＲＥＸ１を有するプラスミドを含有するａｓｄ株（ＡＳＴ－１１０）は、ＰＢＳと比べて最も高い腫瘍成長阻害を示した（ＴＧＩ ８２％、ｐ＝０．００２、２５日目）。これらのデータは、遺伝子相補系またはｓｈＴＲＥＸ１がないプラスミドを含有するＹＳ１６４６と比較して、ａｓｄ相補系およびｓｈＴＲＥＸ１のデリバリーを使用してプラスミド喪失を防ぐことによって、効力の改善が達成されることを示している。

低コピープラスミドを有するＳ．ティフィムリウム株は、高コピープラスミドと比べて優れた抗腫瘍効果および腫瘍定着を示す
高コピーｓｈＴＲＥＸ１プラスミドに対して、ａｓｄ相補系を有する低コピーｓｈＴＲＥＸ１プラスミドの抗腫瘍効果を結腸癌のマウスモデルで比較するために、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり１０匹のマウス）に、ＣＴ２６（１００μＬ ＰＢＳ中、２×１０^５細胞）を右側腹部へＳＣ接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１１７［ＡＳＤ（ｐＡＴＩ Ｌｏｗ－ｓｈＴＲＥＸ１）］またはＡＳＴ－１１０［ＡＳＤ（ｐＡＴＩ－ｓｈＴＲＥＸ１）］の週２回投与をＩＶ注射し、陰性対照としてのＰＢＳ注射と比較した。図４７に示すように、低コピープラスミドを有する株、ＡＳＴ－１１７は、高コピープラスミドを有する株ＡＳＴ－１１０と比べて優れた抗腫瘍効果を示した（高ＴＧＩ ５９％、低ＴＧＩ ７９％、ｐ＝０．０４２、２５日目）。

この腫瘍成長阻害試験の終わりに、各群から４匹のマウスを安楽死させ、腫瘍および脾臓を上記に記載したようにホモジナイズして腫瘍定着および腫瘍対脾臓定着比を評価した。図４８Ａに示すように、低コピープラスミドを含有する株、ＡＳＴ－１１７は、高コピープラスミドを有する株、ＡＳＴ－１１０より１００倍を超える高いレベルで腫瘍に定着した。腫瘍および脾臓から回収したコロニーの比を計算すると、ＡＳＴ－１１７は、ＡＳＴ－１１０と比べて１０倍を超えるより高い腫瘍対脾臓定着比を有し（図４８Ｂ）、低コピープラスミドを有する株は、高コピープラスミドを有する株より腫瘍定着に対する特異度が大きかったことを示した。これらのデータは、干渉ＲＮＡをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子改変されたＳティフィムリウムは、プラスミドが低コピー数の複製起点を有する場合、腫瘍定着能力および抗腫瘍効果を改善したという以前には知られていない特質を示している。

対数期ｖｓ定常期で採取したＳ．ティフィムリウム
ｌｏｇ ｖｓ定常注射ストックの作製
サルモネラ・ティフィムリウムのサルモネラ病原性アイランド－１（ＳＰＩ－１）遺伝子は、対数成長中に誘導されることが示されている［Lundberg et al. (1999) Journal Of Bacteriology 181:3433-3437］。この病原性アイランドは、上皮細胞等の非食細胞、または固形腫瘍に由来する細胞における取り込みに不可欠である。後期ｌｏｇ中のＳＰＩ－１遺伝子の誘導はまた、マクロファージの迅速なピロトーシス（カスパーゼ－１依存性の炎症促進性プログラム細胞死）をもたらすことも示されている［Fink et al. (2007) Cell Microbiol. 9(11): 2562-2570］。

サルモネラ・ティフィムリウムベースの免疫療法の作製のための最適成長期を決定するために、一晩培養物を撹拌しながら３７℃、ＬＢで成長させて株を作製した。一晩培養物を、使い捨て振とうフラスコの新鮮なＬＢに希釈し、後期対数期についてはＯＤ_６００が１．０に達するまで、または定常期については培養がＯＤの増加を停止するまで（約２時間）成長させた。培養物をＰＢＳで洗浄し、凍結保存のために１．０のストック濃度ＯＤ_６００をもたらすＰＢＳ＋１５％グリセロールの容量で懸濁して、約１×１０^９ＣＦＵ／ｍＬで注射ストックを作製した。注射ストックを次いで－８０℃で保管した。

定常期まで成長した改変Ｓ．ティフィムリウム株は、対数期まで成長した株と比べて等価の抗腫瘍効力および優れた忍容性を示す
採取時の培養期がインビボ活性に与える影響を決定するために、改変サルモネラ・ティフィムリウム株の対数期ｖｓ定常期培養物を結腸癌のマウスモデルで評価した。６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり１０匹のマウス）に、ＣＴ２６（１００μＬ ＰＢＳ中、２×１０^５細胞）を右側腹部へＳＣ接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、対数期または定常期に採取した５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１０４（ｐＥＱＵ６－ｓｈＴＲＥＸ１で形質転換されたＹＳ１６４６）株の週３回投与をＩＶ注射し、ＰＢＳ対照と比較した。初回ＩＶ投与の６時間後、マウスを採血し、血漿を回収し、Ｍｏｕｓｅ Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ Ｂｅａｄ Ａｒｒａｙキットを使用して炎症促進性サイトカインについて評価し、ＦＡＣＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって分析した。

図４９Ａに示すように、ＡＳＴ－１０４ 対数期およびＡＳＴ－１０４定常期注射ストックは、ＰＢＳ対照群と比べて同等の抗腫瘍効果を示し（ｌｏｇ － ＴＧＩ ６７％、ｐ＝０．０４、定常 － ７７％ ｐ＝０．０１、２８日目）、定常期注射ストックはわずかにより良好な腫瘍成長阻害を示した。ＩＶ注射後６時間での全身性血清サイトカインのレベルを比較すると、対数期注射ストックによって誘発された炎症性サイトカインは、ＡＳＴ－１０４定常期株と比べて、ＴＮＦ－α（ｐ＝０．００７）、およびＩＬ－６（ｐ＝０．０１６）の両方に関して有意により高かった（図４９Ｂ）。これらのデータは、ＩＶ投与の前に細菌治療株を定常期まで成長させることは、炎症性毒性を有意に低減することができ、腫瘍成長阻害を改善することができることを示している。これは、治療指数が定常期に採取した材料を用いて改善され得ることを示唆するものである。

ＲＮＡｉのデリバリーのための自己溶解Ｓ．ティフィムリウム株の遺伝子改変
上記に記載したように、Ｓ．ティフィムリウムのａｓｄ遺伝子は、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素をコードする。この遺伝子の欠失により、細菌は、インビトロまたはインビボで成長するときジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）に対して栄養要求性となる。この例は、ａｓｄ欠失株（実施例１に記載）を使用する。該株は、ＤＡＰに対して栄養要求性であり、該株がインビボでの複製を欠損するようにａｓｄ相補遺伝子を含有しないＲＮＡｉのデリバリーに適したプラスミドを含有する。この株は、ＤＡＰの存在下、インビトロで増殖され、正常に成長し、次いで、ＤＡＰが存在しない哺乳動物宿主に免疫療法剤として投与され、細菌の自己溶解をもたらす。自己溶解株は、宿主細胞に侵入することができるが、哺乳動物組織におけるＤＡＰの欠如のため複製することができない。特質のこの組合せにより、ＲＮＡｉ介在性遺伝子ノックダウンおよび複製する株と比べた安全性の増加が可能になる。

この例では、ＹＳ１６４６のａｓｄ欠失株（ＡＳＴ－１０１、実施例１に記載）を、ｃｙｔｏＬＬＯを発現するように更に改変して株ＡＳＴ－１１４（実施例９に記載）を生成し、ＡＲＩ－２０３（ＴＲＥＸ１を標的にするマイクロＲＮＡ、実施例２に記載）をコードするプラスミドを含有するように電気穿孔して、株ＡＳＴ－１２０［ＡＳＤ／ＬＬＯ（ｐＥＱＵ６－ｍｉＴＲＥＸ１）］を作成した。この株を腫瘍担持マウスに導入すると、細菌は宿主細胞によって取り込まれ、サルモネラ含有液胞（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｖａｃｕｏｌｅ）（ＳＣＶ）に入る。この環境の中で、ＤＡＰの欠如は複製を防ぎ、ＳＣＶでの細菌の溶解をもたらす。ＡＳＴ－１２０の溶解により、プラスミドの放出、およびコレステロール含有ＳＶＣ膜に細孔を形成するｃｙｔｏＬＬＯの蓄積が可能になり、宿主細胞のサイトゾルへのプラスミドの効率的なデリバリーをもたらす。

ＤＡＰの存在下または非存在下のＬＢで複製する自己溶解株ＡＳＴ－１２０の能力を、３７℃でＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ３分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、１５分ごとにＯＤ_６００を読み取って評価した。図５０に示すように、ＡＳＴ－１２０は、５０μｇ／ｍＬ ＤＡＰを補充したＬＢで頑強に成長することができるが、ＬＢ単独では複製することができない。

マウスにおける自己溶解Ｓ．ティフィムリウムの弱毒化の増加
ｃｙｔｏＬＬＯおよびＴＲＥＸ１を標的にするマイクロＲＮＡをデリバリーするように遺伝子改変された自己溶解株ＡＳＴ－１２０が、ビルレンスを弱毒化されたかどうかを決定するために、半致死量（ＬＤ_５０）試験を行った。１×１０^６～５×１０^７ＣＦＵにわたるＡＳＴ－１２０の漸増用量を、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ＬＰＳに高度に感受性であるマウス株）にＩＶ投与した。ＩＶ投与後、ＡＳＴ－１２０は、全ての用量で十分に忍容性であり、単回投与後に一過性の体重減少が観察された。２回目の投与は、初回投与７日後に投与し、最も高い用量レベル（５×１０^７ＣＦＵ）の４匹中１匹のマウスが瀕死で見出され、安楽死を必要とした。ＡＳＴ－１２０を投与された全ての他のマウスが一過性の体重減少を経験したが、回復した。これらのデータは、ＴＲＥＸ１を標的にするマイクロＲＮＡをデリバリーするＳ．ティフィムリウム（ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｍ）の自己溶解株（ＡＳＴ－１２０）のＬＤ_５０が、５×１０^７ＣＦＵより大きいことを示唆している。ＶＮＰ２０００９株のＬＤ_５０は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスで約５×１０^６であることが知られている［Lee et al. (2000) International Journal of Toxicology 19:19-25］。これは、ＡＳＴ－１２０がＶＮＰ２０００９と比べて少なくとも１０倍弱毒化されることを示している。

自己溶解Ｓ．ティフィムリウムの抗腫瘍活性
ｃｙｔｏＬＬＯおよびＴＲＥＸ１を標的にするマイクロＲＮＡをデリバリーするように遺伝子改変された自己溶解株ＡＳＴ－１２０が、抗腫瘍応答をもたらすことができるかどうかを決定するために、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり１０匹）に、ＣＴ２６（１００μＬ ＰＢＳ中、２×１０^６細胞）を右側腹部へＳＣ接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、５×１０^６ＣＦＵの自己溶解株ＡＳＴ－１２０［ＡＳＤ／ＬＬＯ（ｐＥＱＵ６－ｍｉＴＲＥＸ１）］の単回投与をＩＶ注射し、対照としてＰＢＳで処置したマウスと比較した。図５１に示すように、ＰＢＳ単独で処置した動物と比べて、抗腫瘍応答がわずか１回の投与後に検出された（ＴＧＩ ５２．４％、ｐ＝０．０２、１７日目）。まとめると、これらのデータは、ＤＡＰ栄養要求性によって自己溶解性であるように遺伝子改変され、およびＴＲＥＸ１を標的にするＲＮＡｉのデリバリー用のプラスミドを含有するように遺伝子改変されたＳ．ティフィムリウムが見事に弱毒化され、抗腫瘍応答を誘発できることを示している。

忍容性の向上のために遺伝子改変された例示的な株
ａｄｒＡまたはｃｓｇＤ欠失
この例では、ｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失、ａｓｄ遺伝子欠失を含有し、および干渉ＲＮＡをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子改変されたサルモネラ・ティフィムリウムの生弱毒化株が、サルモネラ・ティフィムリウムのバイオフィルム形成に必要な遺伝子、ａｄｒＡを欠失させるために更に改変される。バイオフィルムを形成することができないサルモネラは、宿主食細胞によってより迅速に吸収され、より迅速に排除される。細胞内局在化におけるこの増加により、プラスミドデリバリーおよびＲＮＡ干渉による遺伝子ノックダウンの有効性は強化される。腫瘍／組織からのクリアランス速度の増加は、療法の忍容性を向上させ、バイオフィルム形成の欠如は、患者における人工器官および胆嚢への定着を妨げる。別の例では、ｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失、ａｓｄ遺伝子欠失を含有し、および干渉ＲＮＡをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子改変されたサルモネラ・ティフィムリウムの生弱毒化株が、ｃｓｇＤを欠失させるために更に改変される。この遺伝子はａｄｒＡの活性化に関与し、またＴＬＲ２アゴニストであるｃｕｒｌｉ線毛の発現も誘導する。ｃｓｇＤの喪失もまたバイオフィルム形成を防ぎ、ＴＬＲ２活性化の阻害という追加の利点があり、それによって細菌のビルレンスを更に低減し、ＲＮＡｉのデリバリーを強化する。

ｐａｇＰ欠失
この例では、ｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失、ａｓｄ遺伝子欠失を含有し、および干渉ＲＮＡをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子改変されたＳ．ティフィムリウムの生弱毒化株が、ｐａｇＰを欠失させるために更に改変される。ｐａｇＰ遺伝子は、Ｓ．ティフィムリウムの感染ライフサイクル中に誘導され、リピドＡをパルミトイル化（ｐａｌｍｉｔｙｌａｔｅ）する酵素をコードする。野生型Ｓ．ティフィムリウムでは、ｐａｇＰの発現は、ヘプタアシル化されたリピドＡをもたらす。リピドＡの末端アシル鎖を付加することができないｍｓｂＢ突然変異体では、ｐａｇＰの発現はヘキサアシル化ＬＰＳをもたらす。ヘキサアシル化ＬＰＳは、最も炎症促進性であることが示されている。この例では、ｐａｇＰおよびｍｓｂＢを欠失した株は、ペンタアシル化ＬＰＳしか産生できず、細菌が干渉ＲＮＡをデリバリーするように遺伝子改変される場合、炎症促進性サイトカインの低下、忍容性の強化、および適応免疫の増加を可能にする。

ｈｉｌＡ欠失
この例では、ｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失、ａｓｄ遺伝子欠失を含有し、および干渉ＲＮＡをコードするプラスミドをデリバリーするように遺伝子改変されたサルモネラ・ティフィムリウムの生弱毒化株が、ｈｉｌＡを欠失させるために更に改変される。ｈｉｌＡは、サルモネラ病原性アイランド－１（ＳＰＩ－１）関連３型分泌装置（Ｔ３ＳＳ）の発現に必要とされる調節遺伝子である。この分泌装置は、改変Ｓ．ティフィムリウムの取り込みを引き起こす上皮細胞等の非食宿主細胞のサイトゾルへのエフェクタータンパク質の注入に関与している。ＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳは、腸上皮層の通過に不可欠であることが示されているが、細菌が非経口的に注射される場合、感染には必ずしも必要でない。いくつかのタンパク質およびニードル複合体の注入自体も、インフラマソーム活性化および食細胞のピロトーシスを誘導し得る。この炎症促進性細胞死は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）死を直接誘導すること、およびサイトカイン環境を改変してメモリーＴ細胞の生成を妨げることによって、頑強な適応免疫応答の開始を制限する可能性がある。この例では、静脈内または腫瘍内のどちらかに投与される治療的サルモネラ・ティフィムリウム株からのｈｉｌＡ遺伝子の追加の欠失が、取り込みにＳＰＩ－１ Ｔ３ＳＳを必要としない食細胞に対してサルモネラ・ティフィムリウム感染を集中させ、次いでこれらの食細胞の寿命を延長させる。ｈｉｌＡ突然変異は炎症促進性サイトカインの量を低減し、療法の忍容性、および適応免疫応答の質を向上させる。

ＴＲＥＸ１発現は、複数のヒト腫瘍タイプにおいて上方調節される
ＴＲＥＸ１が、正常ヒト組織と比べて腫瘍組織で上方調節されて見出されるかどうかを評価するために、ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｅ ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベースを使用してＴＲＥＸ１遺伝子の相対的遺伝子発現を評価するための分析を行った。図５２に示すように、乳がん、前立腺がん、子宮がん、膀胱がんおよび子宮頸がんを含む広範な腫瘍タイプが、正常組織と比べてＴＲＥＸ１の有意な上方調節を示した（ｐ値：ＢＲＣＡ：７．７ｅ－１６；ＰＲＡＤ：９．４ｅ－１２；ＵＣＥＣ：２．５ｅ－０５；ＢＬＣＡ：３．７ｅ－０３；ＣＥＳＣ：７．７ｅ－０３）。更に、ＴＲＥＸ１は、腎臓がんの複数の形態で上方調節されて見出された（ｐ値：ＫＩＰＡＮ：８．９ｅ－３９；ＫＩＲＣ：９．６ｅ－３５；ＫＩＲＰ：５．８ｅ－１４；ＫＩＣＨ：４．９ｅ－０８）。これらのデータは、腫瘍進行と広く相関するＴＲＥＸ１上方調節の現象を立証し、本明細書で提供されるような有望ながん治療戦略として、この標的化を支持するものである。

複数の免疫標的に対するｓｈＲＮＡを含有する改変サルモネラ・ティフィムリウムｐＥＱＵ６株は、強力な抗腫瘍成長阻害を示す
マウス結腸腫瘍側腹部モデルにおける一連のｓｈＲＮＡ免疫標的の有効性を比較するために、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり１０匹のマウス）に、ＣＴ２６（１００μＬ ＰＢＳ中、２×１０^５細胞）を右側腹部および左側腹部にＳＣ接種した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、各々５×１０^６ＣＦＵのＹＳ１６４６、ＹＳ１６４６（ｐＥＱＵ６－ｓｈＶＩＳＴＡ）、ＹＳ１６４６（ｐＥＱＵ６－ｓｈベータカテニン）、またはＹＳ１６４６（ｐＥＱＵ６－ｓｈＴＧＦ－ベータ）を右側腹部腫瘍に４日空けて２回、腫瘍移植後１０日目および１４日目に腫瘍内（ＩＴ）注射し、ＰＢＳ対照と比較した。

ＡＳＴ－１２１（ｐＥＱＵ６－ｓｈＶＩＳＴＡを担持するＹＳ１６４６）のＩＴ注射は、ＰＢＳ対照と比べて、注射した腫瘍および遠位腫瘍で１つの完全応答を含む有意な腫瘍成長阻害を誘導し（注射した腫瘍＝ＴＧＩ ７５％、ｐ＝０．０１；遠位腫瘍ＴＧＩ＝ＴＧＩ ５７％、ｐ＝０．０４）、この治療様式を使用してこの免疫チェックポイントを阻害するインビボ効力を示した。ＡＳＴ－１２２（ｐＥＱＵ６－ｓｈＴＧＦ－ベータを担持するＹＳ１６４６）もまた、注射した病変および遠位病変の両方の強力な腫瘍阻害を示した（注射した腫瘍＝５２％；遠位ＴＧＩ＝４８．４％）。ＡＳＴ－１２３（ｐＥＱＵ６－ｓｈベータカテニンを担持するＹＳ１６４６）は、１つの完全応答を含む腫瘍成長阻害を示した（注射ＴＧＩ＝３３．１％、遠位ＴＧＩ＝ＴＧＩ １７％）。これらの株は、対数期ではなく定常期に調製した。対数期では、ＳＰＩ－１が最大限に上方調節され、腫瘍細胞標的化を強化し、ベータカテニンを標的にする有効性を改善すると予測された。

放射線療法は、ＴＲＥＸ１に対するマイクロＲＮＡをコードするプラスミドを含有する免疫刺激性細菌の腫瘍定着を強化し、免疫チェックポイント遮断との組合せで有効性を強化する
放射線療法は、Ｓ．ティフィムリウムと相乗作用して腫瘍成長阻害を促進することが示されている。以前の試験は、マウスＢ１６．Ｆ１０メラノーマ側腹部モデルにおける５×１０^５ＣＦＵのＳ．ティフィムリウム（ＹＳ１６４６）の単回ＩＶ投与と、これに続く１５Ｇｙ放射線との組合せによる腫瘍成長阻害の強化を示した（Bermudes et al. (2001) Biotechnol Genet Eng Rev. 18:1）。

細菌の腫瘍定着に対する放射線の効果を決定するために、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、１×１０^５マウスＴＳＡ乳癌細胞（１００μＬ ＰＢＳ中）を右側腹部へ皮下接種した。確立された腫瘍を担持するマウスに、以下を投与した：１）ＰＢＳ ＩＶと、これに続く０Ｇｙ放射線（１匹のマウス）；２）５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１０６（ｐＥＱＵ６－ｍｉＴＲＥＸ１、ＡＲＩ－２０３で形質転換されたＹＳ１６４６）のＩＶ注射と、これに続く４時間後の０Ｇｙ（３匹のマウス）；３）５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１０６と、これに続く４時間後の２０Ｇｙ（３匹のマウス）；４）２０Ｇｙと、これに続く４時間後の５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１０６（３匹のマウス）。放射線療法は、Vanpouille-Box et al. (2017) Nat Commun. 8:15618に記載されているＸＳｔｒａｈｌ ＳＡＲＲＰを使用して施行した。マウスを２４時間後に屠殺し、腫瘍を採取し、秤量した。１０ｍＬ滅菌ＰＢＳ中で腫瘍をホモジナイズし（Ｍチューブ、ＧｅｎｔｌｅＭＡＣｓ（商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）、次いで１０倍連続希釈を行い、カナマイシンを含有するＬＢ（ルリアブロス）寒天プレートにプレーティングした。翌日、コロニー形成単位（ＣＦＵ）をカウントし、腫瘍組織１グラム当たりのＣＦＵを計算した。

図５３に示すように、ＡＳＴ－１０６のＩＶ投与前の放射線２０Ｇｙの投与は、放射線なしでのＡＳＴ－１０６ ＩＶの単独投与より少ないＣＦＵ／ｇをもたらした。ＡＳＴ－１０６ ＩＶの投与後の放射線２０Ｇｙの投与は、逆のレジメンと比べて腫瘍定着の有意な強化を示した（ｐ＜０．０５）。

放射線２０Ｇｙを投与する前の、ｓｈＴＲＥＸ１を含有するＳ．ティフィムリウムのＩＶ投与が、ＴＲＥＸ１の活性を阻害し、放射線療法のアブスコパル活性を増強するかどうかを決定するために実験を行う。発明を実施するための形態に論じられているように、ＴＲＥＸ１は、チェックポイント阻害剤抗ＣＴＬＡ４を追加したとしても、放射線のアブスコパル抗腫瘍効果を抑制することが示されている。放射線療法の投与前に、ｓｈＴＲＥＸ１を含有するＳ．ティフィムリウムを投与する増強効果は、抗ＣＴＬＡ４または抗ＰＤ－１療法の存在下で更に強化される。

これを証明するために、改変Ｓ．ティフィムリウムｓｈＴＲＥＸ１の投与を、両側腹部ＴＳＡマウス乳癌モデルにおいて、抗ＣＴＬＡ４または抗ＰＤ－１免疫チェックポイント遮断の存在下または非存在下での２０Ｇｙの放射線療法と組み合わせる。これらの試験のために、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウスに、１×１０^５マウスＴＳＡ乳癌細胞（１００μＬ ＰＢＳ中）を右側腹部および左側腹部へ皮下接種する。確立された腫瘍を担持するマウスに、連日２０Ｇｙ、または８Ｇｙの３分割の２つの線量で、Vanpouille-Box et al.［(2017) Nat Commun. 8:15618］に記載されているようにＸＳｔｒａｈｌ ＳＡＲＲＰを使用して右側腹部腫瘍へ放射線療法を連日投与する。１～５×１０^６ＣＦＵの改変サルモネラ・ティフィムリウムｓｈＴＲＥＸ１、またはスクランブルｓｈＲＮＡ対照を含有する改変サルモネラ・ティフィムリウム（改変サルモネラ・ティフィムリウムｓｃｒ）を、最初の放射線処置の４時間後に開始し、４および７日後に繰り返されるＩＶ注射をマウスに投与する。いくつかのマウス群には、チェックポイント療法抗ＣＴＬＡ４もしくは抗ＰＤ－１（１００μｇ）またはアイソタイプ対照、ＩＰ、週２回を同時に投与する。最後のＩＶ改変サルモネラ・ティフィムリウム注射の７日後にマウスを採血し、免疫優勢ＣＤ８^＋Ｔ細胞エピトープＡＨ１［ＳＰＳＹＶＹＨＱＦ］特異的四量体に応答してＩＦＮ－γを産生する能力について、ＰＢＭＣをフローサイトメトリーによって評価する。別個のマウス群は、脾臓、腫瘍および腫瘍所属リンパ節を改変サルモネラ・ティフィムリウムＩＶ処置の４８時間後および７日後に採取し、フローサイトメトリーによってリンパ球および骨髄集団について評価し、ホモジナイズおよびＬＢ寒天プレートにプレーティングして組織をＣＦＵについて評価する。残りのマウスは、一次照射腫瘍および遠位（アブスコパル）腫瘍の腫瘍成長についてノギス測定によって評価し、完全な腫瘍退縮を示すマウスを自家腫瘍で再チャレンジし、年齢をマッチさせた腫瘍ナイーブマウスと比較する。別個のマウス群は、適応免疫の要件を証明するために、再チャレンジの前にＣＤ４^＋および／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞を除去する。これらのデータは、高線量放射線療法の文脈でのＴｒｅｘ１の阻害が、併用免疫療法の抗腫瘍免疫を強化することを示している。

抗ＴＲＥＸ１マイクロＲＮＡをコードするプラスミドを含有する改変サルモネラ・ティフィムリウム療法への抗ＰＤ－１抗体の追加は、両側腹部マウス結腸癌モデルにおける遠位腫瘍退縮をＣＤ８依存的に強化する
抗ＰＤ－１チェックポイント療法の追加がＡＳＴ－１０６（ＴＲＥＸ１に対するマイクロＲＮＡをコードするプラスミドを担持するＹＳ１６４６）の有効性を強化し得ることを示すために、６～８週齢のメスのＢＡＬＢ／ｃマウス（１群当たり１０匹のマウス）に、ＣＴ２６（１００μＬ ＰＢＳ中、２×１０^５細胞）を右側腹部および左側腹部へ皮下接種（ＳＣ）して腫瘍を確立した。確立された側腹部腫瘍を担持するマウスに、５×１０^６ＣＦＵのＡＳＴ－１０６（ｐＥＱＵ６－ｍｉＴＲＥＸ１、ＡＲＩ－２０３で形質転換されたＹＳ１６４６）、またはＡＳＴ－１０３（ｐＥＱＵ６－スクランブルｓｈＲＮＡで形質転換されたＹＳ１６４６）を、単独でまたは抗ＰＤ－１（４ｍｇ／ｋｇ、クローンＲＭＰ１－１４、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）の毎週ＩＰ注射との組合せのどちらかで、腫瘍移植後１０日目および１４日目に右側腹部腫瘍へ腫瘍内（ＩＴ）注射し、ＰＢＳ対照と比較した。原発腫瘍および遠位腫瘍有効性がＣＤ８α^＋Ｔ細胞およびＤＣに依存性であったかどうかを決定するために、ＩＴ注射前、５および７日目、次いで１０、１４および１７日目に抗ＣＤ８α除去抗体を群にＩＰ投与した（４ｍｇ／ｋｇ、クローン２．４３、ＢｉｏＸＣｅｌｌ）。

ｍｉＴＲＥＸ１をコードするプラスミドを含有するＹＳ１６４６株、ＡＳＴ－１０６のＩＴ注射は、ＰＢＳ対照と比べて、注射した腫瘍および遠位腫瘍で有意な腫瘍成長阻害を誘導した（注射ＴＧＩ：６７．５％、遠位ＴＧＩ：６７．２％；ｐ＝０．０２７）。この抗腫瘍活性は、ＣＤ８α^＋細胞の除去により完全に抑止され（注射ＴＧＩ：１４．６％、遠位ＴＧＩ：０％）、ＡＳＴ－１０６抗腫瘍活性に関する細胞溶解性ＣＤ８^＋Ｔ細胞およびＣＤ８α^＋ＤＣの要件を証明した。抗ＰＤ－１抗体とＡＳＴ－１０６との投与は、ＡＳＴ－１０６の活性を更に強化し、２／１０で完全寛解をもたらす。この効果はまた、ＣＤ８α^＋細胞除去時に完全に逆転した。ＡＳＴ－１０６ ｍｉＴＲＥＸ１と抗ＰＤ１ ｍＡｂとの組合せで処置されたマウス以外の、抗ＰＤ－１抗体とのスクランブル対照（ＡＳＴ－１０３）、または抗ＰＤ－１抗体単独を含む他のマウス群は、完全両側腹部寛解にはつながらなかった。これらのデータは、抗ＴＲＥＸ１阻害性マイクロＲＮＡをコードするプラスミドを含有する遺伝子改変Ｓ．ティフィムリウムが、強力なＣＤ８α依存性適応免疫応答を誘導することを示している。この活性は、抗ＰＤ－１チェックポイント療法と相乗的である。

追加の治療的細菌および併用療法の例
以下の表は、第１列にＲＮＡの標的を記載し；第２列は、プラスミド中のＲＮＡによってコードされる標的の組合せを記載し；第３列は、プラスミド中のコードされたＲＮＡのタイプ（フォーマット）を記載し；および第４列は、表または本明細書の免疫刺激性細菌との併用療法で使用され得る例示的な追加の治療剤を記載する。次の列は、細菌株のゲノムに対する改変を列挙し、最終列は、使用され得るプラスミドの特徴を記載する。列に列挙された要素はそれぞれ、表に列挙された、および本明細書の開示全体を通して提供される任意の他の要素／特徴と適合し得る。細菌は、任意の治療的細菌、特に本明細書の開示全体を通して列挙されたいずれか、例えば、ただし以下に限定されるものではないが、サルモネラ属、シゲラ属、Ｅ．コリ、ビフィドバクテリウム属、リケッチア属、ビブリオ属、リステリア属、クレブシエラ属、ボルデテラ属、ナイセリア属、アエロモナス属、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｅｓｅｌｌａ）、コレラ属、コリネバクテリウム属、シトロバクター属、クラミジア属、ヘモフィルス属、ブルセラ属、マイコバクテリウム属、マイコプラズマ属、レジオネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、ヘリコバクター属、バチルス属、およびエリジペロスリックス属であってもよい。そのような細菌の例は、Ｓ．ティフィムリウム等のサルモネラ属菌株である。サルモネラ・ティフィムリウム属菌株のうち、ＶＮＰ２０００９（ＡＴＣＣ ＃２０２１６５）、ＲＥ８８、ＳＬ７２０７、χ８４２９、χ８４３１、およびχ８４６８と名付けられた株はよく知られている株である。

当業者には変更が明らかであるため、本発明は、添付の特許請求の範囲の範囲によってのみ限定されることが意図される。

Claims (27)

1. 治療産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激性細菌であって、
   治療産物ががん治療薬であり；
   免疫刺激性細菌がサルモネラ属菌種であり；
   免疫刺激性細菌がアデノシン栄養要求性であり；
   免疫刺激性細菌がフラジェリン欠損であり、野生型細菌が鞭毛を含み；
   免疫刺激性細菌が１つまたは複数の遺伝子の欠失を含むことによって細菌がｐｕｒＩ^－（ｐｕｒＭ^－）、ｍｓｂＢ^－、ｐｕｒＤ^－、ｐａｇＰ^－、ａｄｒＡ^－、ｃｓｇＤ^－、およびｈｉｌＡ^－のうちの１つまたは複数であり；
   プラスミドが、低から中コピー数で存在し；
   低コピー数が２５未満コピーであり、中コピー数が２５から１５０コピーの間である、
   免疫刺激性細菌。
2. プラスミドが、低コピー数で存在する、請求項１に記載の免疫刺激性細菌。
3. アスパルテート－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ^－（ａｓｄ^－）である、請求項１または２に記載の免疫刺激性細菌。
4. ｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失、ａｓｄ欠失、およびａｄｒＡ欠失またはｃｓｇＤ欠失を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
5. ｍｓｂＢ^－である、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
6. 細菌性ゲノムがｍｓｂＢ欠失およびｐａｇＰ欠失を含むことによって細菌がｍｓｂＢ^－およびｐａｇＰ^－である、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
7. 細菌性ゲノムがｐｕｒＩ欠失、ｍｓｂＢ欠失、ａｓｄ欠失、およびｐａｇＰ欠失を含むことによって細菌がｐｕｒＩ^－、ｍｓｂＢ^－、ａｓｄ^－、およびｐａｇＰ^－である、請求項１から３のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
8. 細菌がフラジェリンサブユニットｆｌｉＣおよびｆｌｊＢをコードする遺伝子における欠失によってフラジェリン欠損とされている、請求項１から７のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
9. 野生型サルモネラ菌株由来であるサルモネラ属菌種である、請求項１から８のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
10. 弱毒化細菌由来である、請求項１から９のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
11. サルモネラ・ティフィムリウム菌株である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
12. 免疫刺激性細菌の親株が、ＡＳＴ－１００、ＶＮＰ２０００９、ＹＳ１６４６（ＡＴＣＣ ＃２０２１６５）、ＲＥ８８、ＳＬ７２０７、χ８４２９、χ８４３１、およびχ８４６８と称される菌株の中から選択される弱毒化サルモネラ・ティフィムリウム菌株、または野生型菌株またはＡＴＣＣ ＃１４０２８として寄託された菌株である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
13. 静止期において採取される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
14. プラスミドが、アスパルテート－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードするヌクレオチドの配列を含んでおらず、得られた菌株がａｓｄ^－であり、得られた菌株の複製がインビボで制限される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
15. がん治療薬が、免疫チェックポイント遺伝子および産物、ならびに免疫抑制性経路において役割を果たす他の標的、を抑制するか、阻害するか、遮断するか、そうでなければサイレンシングし、そして、この抑制すること、阻害すること、遮断すること、またはサイレンシングすることが抗腫瘍応答を改善する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
16. 治療産物が免疫刺激性であり、抗腫瘍応答を改善する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌。
17. インターフェロン遺伝子刺激因子（ＳＴＩＮＧ）アゴニストであるおよび／またはサイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）アゴニストである、請求項１６に記載の免疫刺激性細菌。
18. 治療産物をコードするプラスミドを含む免疫刺激性細菌であって、
    治療産物ががん治療薬であり；
    免疫刺激性細菌がサルモネラ属菌種であり；
    免疫刺激性細菌がアデノシン栄養要求性であり；
    免疫刺激性細菌がフラジェリン欠損であり、野生型細菌が鞭毛を含み；そして
    免疫刺激性細菌がｐｕｒＩ^－（ｐｕｒＭ^－）、ｍｓｂＢ^－、ｐｕｒＤ^－、ｐａｇＰ^－、ａｄｒＡ^－、ｃｓｇＤ^－、およびｈｉｌＡ^－のうちの１つまたは複数である、
    免疫刺激性細菌。
19. ｍｓｂＢ^－およびｐａｇＰ^－である、請求項１８に記載の免疫刺激性細菌。
20. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌を、薬学的に許容される媒体中に含む、医薬組成物。
21. 対象におけるがんまたは腫瘍または転移の処置に使用するための、請求項１から１９のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌を、薬学的に許容される媒体中に含む、医薬組成物。
22. 対象におけるがんまたは腫瘍または転移の処置に使用するための、請求項１から１９のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌または請求項２０に記載の医薬組成物。
23. 対象におけるがんまたは腫瘍または転移の処置に使用するための、請求項１から２０のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌または医薬組成物であって、処置が、第２の抗がん剤または処置を用いた組合せ療法を含む、免疫刺激性細菌または医薬組成物。
24. がんが、固形腫瘍または血液悪性腫瘍である、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物。
25. がんが、乳房、心臓、肺、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭頸部、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、精巣、子宮頸部および肝臓のがんの中から選択される、請求項２１から２４のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌もしくは医薬組成物。
26. ｃｄ７３^＋である腫瘍を有する対象の処置に使用するための請求項１から１９のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌であって、
    対象が、腫瘍生検または他の身体組織もしくは体液試料を試験することによって、ｃｄ７３^＋である腫瘍を有すると同定されている、免疫刺激性細菌。
27. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の免疫刺激性細菌を含む、単離された細胞。

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