JP2020200243A - 抗癌剤耐性抑制剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】免疫チェックポイント分子等の免疫系で抑制的に作用するタンパク質に対して阻害的に作用し、癌に対する免疫能を向上させることができる天然由来の成分を提供する。【解決手段】コムラサキシメジ（Lepista sordida）抽出物を有効成分として含有する、抗癌剤耐性抑制剤を提供する。【選択図】なし
Description
本発明は、免疫チェックポイント阻害機能を有する抗癌剤耐性抑制剤に関し、より具体的には、コムラサキシメジ（Lepista sordida）抽出物を有効成分として含有する、免疫チェックポイント分子等の免疫系で抑制的に作用するタンパク質の発現・機能に対して阻害的に作用する抗癌剤耐性抑制剤に関する。
日本の原因疾患別死亡者数で最も多いのは悪性腫瘍（癌）であり、現在2人に1人が癌を発症し、3人に1人が癌により死亡するといわれている。世界保健機構（WHO）によれば、2005年の世界の5800万人の死亡のうち、悪性腫瘍による死亡は13%（760万人）を占める。死亡原因になった悪性腫瘍のうち、最多のものは肺癌（130万人）で、胃癌（100万人）、肝癌、大腸癌、乳癌などが続く。日本では、約7万人が肺癌で亡くなっていると報告されている。
近年、癌細胞が免疫の働きにブレーキをかけて、免疫細胞の活性化を阻害していることが判明してきている。免疫細胞の攻撃を阻止するこのブレーキを解除し、免疫細胞を再び活性化して、癌細胞を攻撃するようにする新たな治療法が注目されている。
上記の癌細胞のメカニズムにおいて免疫抑制性シグナルを誘導し得る分子は「免疫チェックポイント分子」と呼ばれており、PD-1（Programmed cell death-1）リガンド経路に関与するT細胞上のPD-1受容体及び癌細胞上で発現するリガンドPD-L1（Programmed cell death ligand 1）及びPD-L2（Programmed cell death ligand 2）、CTLA4（負の補助刺激受容体）経路に関与するT細胞上のCTLA4受容体等が知られている（非特許文献１及び２）。
PD-1分子は、CD28（正の補助刺激受容体）ファミリーに属する免疫抑制性補助シグナル受容体であり、活性化したT細胞、B細胞及び骨髄系細胞に発現し、そのリガンドとの結合によって、抗原特異的にT細胞活性を抑制することが示された（非特許文献１）。PD-1のリガンドとしては、B7ファミリーに属するPD-L1及びPD-L2が知られている。PD-1経路は、癌細胞に対する免疫の抑制に関与しているとされており、この経路を標的とした抗PD-1抗体や抗PD-L1抗体が癌治療薬候補として期待され、抗体医薬の開発が進んでいる（特許文献１〜３）。
また、それぞれの癌に特有な遺伝子変異が存在することがわかってきている。肺癌では「ALK融合遺伝子変異」、「EGFR遺伝子変異」といった遺伝子変異がみられ、これら以外にもさまざまな遺伝子変異のタイプが存在することが判明している。EGFR（上皮増殖因子受容体）は、癌細胞表面に存在し、癌細胞が増殖するためのスイッチのような役割を果たしている。このEGFRを構成する遺伝子の一部（チロシナーゼ部位）に変異があると、癌細胞を増殖させるスイッチが常にオンとなっているような状態となり、癌細胞が限りなく増殖してしまう。肺癌では、これらの遺伝子変異をターゲットとした「個別化治療」を行うことができるようになりつつあり、EGFRチロシナーゼ阻害剤（EGFR−TKI）や抗EGFR抗体等が開発されているが、投与を続けると耐性をもち、効果が弱まるなどの問題も指摘されている。
最近、受容体チロシンキナーゼであるAXLキナーゼの活性化が新たなEGFR-TKI耐性機序となることが報告された。さらに、AXLと上皮間葉転換（EMT）との関連が指摘され、予後の悪化や腫瘍増大、転移にも関与することが報告されている。AXLは様々な癌において過剰発現し、増殖や進展に関与しており、また、AXLの活性化はEGFR-TKIの他、抗癌剤シスプラチンやHER2標的薬ラパチニブ等、種々の抗癌剤の耐性獲得に関与していることが知られている。
一方、キノコ類は、古来より東洋医学にも使用されており、悪性腫瘍の予防や治療に対しても、免疫強化やアポトーシスの誘導などにより有益であるとされている。
しかしながら、キノコ等の天然物から得られる化合物で、上述のAXLの阻害効果や免疫チェックポイント阻害効果等に関する報告はあまり知られていない。
しかしながら、キノコ等の天然物から得られる化合物で、上述のAXLの阻害効果や免疫チェックポイント阻害効果等に関する報告はあまり知られていない。
Annu Rev Immunol, 26: 677-704, 2008
Nature 328: 267-270, 1987
上記の免疫チェックポイント分子に対して阻害的に作用する薬剤、いわゆる「免疫チェックポイント阻害剤」は、臨床的にも効果が認められつつある。しかしながら、抗体医薬による治療は非常に費用がかかるために、患者にとっての負担は過度なものとなり得る。
本発明の目的は、免疫チェックポイント分子等の、その発現の上昇によって免疫系で抑制的に作用するタンパク質に対して阻害的に作用し、癌に対する免疫能を向上させることができる天然由来の成分を提供することである。
本発明者等は、食用キノコ等の天然物由来の様々な抽出画分における薬理効果について長年にわたって研究を継続している。その中で、驚くべきことに、コムラサキシメジの抽出物中に免疫チェックポイント分子及びAXLの発現を阻害する有効成分が含まれることを見出した。
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
すなわち、本発明は以下を提供するものである。
１．コムラサキシメジ（Lepista sordida）抽出物を有効成分として含有する、抗癌剤耐性抑制剤。
２．前記抽出物が酢酸エチル可溶画分、エタノール可溶画分又は水可溶画分である、上記１記載の抗癌剤耐性抑制剤。
３．免疫チェックポイント分子の発現を阻害する、上記１又は２記載の抗癌剤耐性抑制剤。
４．免疫チェックポイント分子がPD-L1及び／又はPD-L2である、上記３記載の抗癌剤耐性抑制剤。
５．AXLの発現を阻害する、上記１〜４のいずれか記載の抗癌剤耐性抑制剤。
６．前記抽出物が、2-アザヒポキサンチン（AHX）、2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）、及びイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）の少なくとも1種を含む、上記１〜５のいずれか記載の抗癌剤耐性抑制剤。
７．上記１〜６のいずれか記載の抗癌剤耐性抑制剤を含有する、癌治療剤。
８．2-アザヒポキサンチン（AHX）、2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）、及びイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）から選択される少なくとも1種の化合物を含む抗癌剤耐性抑制剤。
２．前記抽出物が酢酸エチル可溶画分、エタノール可溶画分又は水可溶画分である、上記１記載の抗癌剤耐性抑制剤。
３．免疫チェックポイント分子の発現を阻害する、上記１又は２記載の抗癌剤耐性抑制剤。
４．免疫チェックポイント分子がPD-L1及び／又はPD-L2である、上記３記載の抗癌剤耐性抑制剤。
５．AXLの発現を阻害する、上記１〜４のいずれか記載の抗癌剤耐性抑制剤。
６．前記抽出物が、2-アザヒポキサンチン（AHX）、2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）、及びイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）の少なくとも1種を含む、上記１〜５のいずれか記載の抗癌剤耐性抑制剤。
７．上記１〜６のいずれか記載の抗癌剤耐性抑制剤を含有する、癌治療剤。
８．2-アザヒポキサンチン（AHX）、2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）、及びイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）から選択される少なくとも1種の化合物を含む抗癌剤耐性抑制剤。
本発明により、免疫チェックポイント分子等の免疫系で抑制的に作用するタンパク質に対して阻害的に作用し、癌に対する免疫応答を促進させ得る天然由来の薬剤が提供される。
本発明は、コムラサキシメジ（Lepista sordida）抽出物を有効成分として含有する、抗癌剤耐性抑制剤を提供する。本発明において、「抗癌剤耐性抑制剤」とは、抗癌剤治療に対して耐性を発揮するように作用し得るメカニズム、例えば免疫チェックポイント分子の発現の上昇や、AXLの活性化を抑制し得る効果を有する物質を意図する。
コムラサキシメジ抽出物
本発明で使用するコムラサキシメジ（Lepista sordida）は、キシメジ科ムラサキシメジ属に属するキノコであり、例えば静岡県静岡市で採取することができ、人工的に栽培することもできる。
本発明で使用するコムラサキシメジ（Lepista sordida）は、キシメジ科ムラサキシメジ属に属するキノコであり、例えば静岡県静岡市で採取することができ、人工的に栽培することもできる。
本発明の抽出物は、特に限定するものではないが、例えば、コムラサキシメジ培養ろ液を減圧下で濃縮後、ヘキサン、酢酸エチル、エタノールで抽出し、それらの可溶画分又は水可溶画分を減圧濃縮して得ることができる。本発明において好適に使用できる抽出物は、上記のヘキサン可溶画分、酢酸エチル可溶画分、エタノール可溶画分、水可溶画分のいずれを用いても良く、特に限定するものではないが、特に水可溶画分、酢酸エチル可溶画分及びエタノール可溶画分を好適に使用することができる。これらの画分に含まれる成分が本発明の抗癌剤耐性抑制効果を有し得ることから、上記に関わらず、コムラサキシメジ培養ろ液をそのまま用いても良く、また酢酸エチル又はエタノールで抽出する工程を含む製法であれば、本発明のコムラサキシメジ抽出物を取得することができる。
本発明の抽出物を得るためには、上記の工程に加えて、更なる工程、例えば粉砕工程・分離工程・精製工程・濃縮工程・乾燥工程等を含めることができる。
本発明の抽出物を得るためには、上記の工程に加えて、更なる工程、例えば粉砕工程・分離工程・精製工程・濃縮工程・乾燥工程等を含めることができる。
本発明者等は更に、上記の工程で得られた画分から、更に有効成分となる化合物を単離した。特に限定するものではないが、コムラサキシメジ抽出物中の有効成分である化合物は、例えば酢酸エチル可溶画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー、分取TLC、逆相HPLC等の当分野で通常用いられる手段を用いて分画することで、単離することができる。
あるいは、例えばエタノール可溶画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相HPLC等の当分野で通常用いられる手段を用いて分画することで、単離することができる。
あるいはまた、コムラサキシメジ菌糸体を破砕し、水を含む溶媒で抽出した後、逆相クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー等の当分野で通常用いられる手段を用いて分画することで、単離することができる。
コムラサキシメジ抽出物には、以下の化合物が含有される。
あるいは、例えばエタノール可溶画分をシリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相HPLC等の当分野で通常用いられる手段を用いて分画することで、単離することができる。
あるいはまた、コムラサキシメジ菌糸体を破砕し、水を含む溶媒で抽出した後、逆相クロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー等の当分野で通常用いられる手段を用いて分画することで、単離することができる。
コムラサキシメジ抽出物には、以下の化合物が含有される。
下記の構造を有する化合物は、2-アザヒポキサンチン（AHX）の化学名を有し、実施例に記載する工程を用い、コムラサキシメジの酢酸エチル可溶画分を各種クロマトグラフィーに供することによって、コムラサキシメジ培養ろ液12 Lから57mgの収量で単離することができた。しかしながら、コムラサキシメジが天然物であることから、化合物AHXの含有量は、コムラサキシメジを採取する場所・時期、あるいは栽培若しくは培養条件等によって異なり得る。
下記の構造を有する化合物は、2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）の化学名を有し、実施例に記載する工程を用い、コムラサキシメジの酢酸エチル可溶画分を各種クロマトグラフィーに供することによって単離することができ、コムラサキシメジ菌糸体1kgから2.2mgの収量で単離することができた。しかしながら、化合物AOHの含有量は、コムラサキシメジを採取する場所・時期、あるいは栽培若しくは培養条件等によって異なり得る。
下記の構造を有する化合物は、イミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）の化学名を有し、実施例に記載する工程を用い、コムラサキシメジのエタノール可溶画分を各種クロマトグラフィーに供することによって、コムラサキシメジ培養ろ液12 Lから2.2mgの収量で単離することができた。しかしながら、化合物ICAの含有量は、コムラサキシメジを採取する場所・時期、あるいは栽培若しくは培養条件等によって異なり得る。
下記の実施例では、上記の化合物において、2-アザヒポキサンチン（AHX）、2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）及びイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）のいずれもin vitroにおいてAXLの発現上昇を抑制し、また免疫チェックポイント分子の発現上昇を抑制することが確認された。従って、特に限定するものではないが、本発明において使用されるコムラサキシメジ抽出物は、2-アザヒポキサンチン（AHX）、2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）及びイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）のいずれか1種以上を含むように製造することが好ましい。
従って、本発明はまた、2-アザヒポキサンチン（AHX）、2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）及びイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）の少なくとも1種を含有する抗癌剤耐性抑制剤を提供する。これらの化合物は、コムラサキシメジ抽出物から単離されたものであっても、化学的に合成されたものであっても良い。
免疫チェックポイント分子
本発明のコムラサキシメジ抽出物に含まれる化合物は、免疫チェックポイント分子の発現を阻害することができる。特に、本発明において、その発現が阻害される免疫チェックポイント分子としては、PD-L1及びPD-L2が挙げられる。
本発明のコムラサキシメジ抽出物に含まれる化合物は、免疫チェックポイント分子の発現を阻害することができる。特に、本発明において、その発現が阻害される免疫チェックポイント分子としては、PD-L1及びPD-L2が挙げられる。
PD-L1（CD274とも呼ばれる）及びPD-L2（CD273とも呼ばれる）は免疫グロブリンファミリーに属する55kDのI型膜タンパク質であるPD-1（programmed cell death 1）のリガンドとして知られている。ヒトPD-L1 cDNAの塩基配列情報等はGenBank accession No. AF233516（NCBIデータベース等でGene ID: 29126）又はNM_014143、ヒトPD-L2 cDNAの塩基配列情報等はGenBank accession No.NM_025239（Gene ID: 80380）からそれぞれ取得することができる。
AXL
本発明のコムラサキシメジ抽出物に含まれる化合物はまた、AXLの発現を阻害することができる。
AXL（AXL receptor tyrosine kinase）は、受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーで、細胞増殖や分化の制御に関与する複雑なシグナル伝達ネットワークに関わっており、発癌にも関与することが知られている。ヒトAXL cDNAの塩基配列情報等はNCBIデータベース等でGenBank accession No. NM_001699（Gene ID: 558）として取得することができる。
本発明のコムラサキシメジ抽出物に含まれる化合物はまた、AXLの発現を阻害することができる。
AXL（AXL receptor tyrosine kinase）は、受容体チロシンキナーゼファミリーのメンバーで、細胞増殖や分化の制御に関与する複雑なシグナル伝達ネットワークに関わっており、発癌にも関与することが知られている。ヒトAXL cDNAの塩基配列情報等はNCBIデータベース等でGenBank accession No. NM_001699（Gene ID: 558）として取得することができる。
発現の阻害の評価
上記の分子の発現の阻害は、これらの分子を発現する細胞を含むin vitro又はin vivoの系で確認することができる。in vitroの系としては、PD-L1又はPD-L2を発現する標的細胞を含む系を利用することができる。AXLについても、AXL分子を発現する標的細胞を含む系を利用することができる。
あるいはまた、これらの分子の発現の阻害は、例えば癌を発症させた動物モデルを用いて確認することができる。
上記の分子の発現の阻害は、これらの分子を発現する細胞を含むin vitro又はin vivoの系で確認することができる。in vitroの系としては、PD-L1又はPD-L2を発現する標的細胞を含む系を利用することができる。AXLについても、AXL分子を発現する標的細胞を含む系を利用することができる。
あるいはまた、これらの分子の発現の阻害は、例えば癌を発症させた動物モデルを用いて確認することができる。
本発明者等のグループでは、ヒトEGFR変異型（ヒト[L858R]EGFR）肺癌モデルマウスを独自に開発し、研究を行っている。このマウスは、ドキシサイクリンの存在下において肺特異的にヒト[L858R]EGFRが活性化するため、人為的に肺癌を発症させることができ、本発明の効果の確認に使用することができる（WO 2017/026383 A1）。
しかしながら、意図的に癌を発症させた動物モデルは数多く知られており、使用可能な動物モデルは、上記のものに限定されるものではない。このようなマウスの作製は、例えばPoliti K. et al., Genes & Development 20: 1496-1510, 2006、Ji H. et al., Cell 2006 Jun; 9(6): 485-95に記載されている。
in vitro及びin vivoにおける遺伝子の発現は、特に限定するものではないが、例えば上記のin vitro又はin vivoの実験系を用いて本発明の抽出物を添加（投与）したサンプル及び添加（投与）していないサンプルからmRNAを抽出し、逆転写反応によってcDNA化する。目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチドの塩基配列情報に基づいて作製したプライマーを用いたPCR法によるcDNAの増幅を行った後、その発現量を確認することができる。プライマーはまた、プライマーセットとして市販されているものを使用することもできる。この場合、当分野において通常行われているように、発現量が一定であると考えられるグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（GAPDH）の発現に対する比として発現量を表すことができる。本発明の抽出物によるこれらの分子の発現の阻害の有無は、本発明の抽出物を添加（投与）しない場合との比較によって決定することができる。
また、in vitro又はin vivoにおける実験系において、上記の発現の阻害が認められた場合の免疫応答を、例えば活性化T細胞からのサイトカインの放出、標的細胞の生存率の変化、腫瘍組織の顕微鏡画像等によって確認することで、これらの分子の機能の阻害の有無を決定することもできる。
癌治療剤
本発明は、上記の抗癌剤耐性抑制剤を含有する癌治療剤を提供する。本発明の癌治療剤は、上記のコムラサキシメジ抽出物、またはその有効成分であることが見出された2-アザヒポキサンチン（AHX）、2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）及びイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）の少なくとも1種を含有し得る。
本発明は、上記の抗癌剤耐性抑制剤を含有する癌治療剤を提供する。本発明の癌治療剤は、上記のコムラサキシメジ抽出物、またはその有効成分であることが見出された2-アザヒポキサンチン（AHX）、2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）及びイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）の少なくとも1種を含有し得る。
免疫チェックポイントは、あらゆる癌細胞に対する免疫応答において見られるメカニズムである。従って、本発明の癌治療剤は、免疫チェックポイント分子等の免疫系で抑制的に作用するタンパク質の発現を阻害して、標的細胞である癌細胞に対する免疫応答を増強することができる。従って、本発明の癌治療剤の対象となる疾患は、胃癌、肺癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、皮膚癌等が挙げられ、特に限定するものではない。
医薬組成物
本発明の抽出物は、単独で抗癌剤耐性抑制剤又は癌治療剤として使用することも可能であるが、医薬組成物の有効成分として使用することもできる。こうした医薬組成物には、更なる有効成分、例えば限定するものではないが抗癌剤、抗生物質、抗炎症剤、解熱剤、鎮痛剤等を含めることもできる。本発明の抽出物と更なる有効成分とは、別個に投与することもでき、また同時に、例えば単一の医薬組成物として配合することもできる。医薬組成物の形態、投与経路等は特に限定するものではなく、当分野において通常用いられる形態、投与経路を適宜選択することができるが、好ましくは経口投与、静脈注射等である。医薬組成物として製剤化する場合には、調剤において通常使用される賦形剤、増量剤、崩壊剤、防腐剤、着色料、甘味料、香料、被膜形成剤等を適宜配合することができる。本発明の抽出物は、注射剤としての投与も可能である。注射剤としての投与する場合、溶解補助剤等の使用、エマルジョン形態を利用することも可能である。
本発明の抽出物は、単独で抗癌剤耐性抑制剤又は癌治療剤として使用することも可能であるが、医薬組成物の有効成分として使用することもできる。こうした医薬組成物には、更なる有効成分、例えば限定するものではないが抗癌剤、抗生物質、抗炎症剤、解熱剤、鎮痛剤等を含めることもできる。本発明の抽出物と更なる有効成分とは、別個に投与することもでき、また同時に、例えば単一の医薬組成物として配合することもできる。医薬組成物の形態、投与経路等は特に限定するものではなく、当分野において通常用いられる形態、投与経路を適宜選択することができるが、好ましくは経口投与、静脈注射等である。医薬組成物として製剤化する場合には、調剤において通常使用される賦形剤、増量剤、崩壊剤、防腐剤、着色料、甘味料、香料、被膜形成剤等を適宜配合することができる。本発明の抽出物は、注射剤としての投与も可能である。注射剤としての投与する場合、溶解補助剤等の使用、エマルジョン形態を利用することも可能である。
抗癌剤耐性抑制剤として、又は医薬組成物として投与する場合、投与量は、投与経路、患者の年齢、体重、症状など、種々の要因を考慮して、適宜設定することができ、特に限定されないが、一般に1日当たり0.2〜8mg/kg体重、好ましくは1日当たり0.4〜4mg/kg体重の用量で使用可能である。投与の回数、頻度等は治療・予防が予期される疾患により、また投与対象者の体調等によって適宜調製し得る。
本発明の抗癌剤耐性抑制剤はまた、保健機能食品や病者用食品等の飲食品として、又はサプリメントとして使用することができる。飲食品又はサプリメントとして使用する場合、本発明の抽出物のヒトにおける推奨摂取量は、1日あたり好ましくは1 mg〜5 g、より好ましくは100 mg〜2 gの範囲である。飲食品又はサプリメントの形態は、粉末、錠剤、カプセル剤、液剤等のいずれの形態であっても良く、特に限定するものではない。この場合、医薬組成物と同様に、通常使用される賦形剤、増量剤、崩壊剤、防腐剤、着色料、甘味料、香料、被膜形成剤等を適宜配合することができる。また、一般的な食品と共に摂取するための形態とし、また食品中に混合することも可能である。
以下に本発明を実施例によって更に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
［実施例１ コムラサキシメジ抽出物の調製］
本発明において使用可能なコムラサキシメジ抽出物は、以下のようにして調製した。
PYG寒天上で20日間培養したコムラサキシメジの菌糸から5つの小片（5×5×3 mm）を採取し、500mL容三角フラスコに入れた300mlのPYG液体培地中に接種した。25℃で4週間、120rpmで撹拌しながら暗所でインキュベートした後、ろ過により菌糸体と培養ろ液に分離した。培養ろ液を減圧濃縮後、液−液分配を行い、n-ヘキサン可溶画分、酢酸エチル可溶画分（1.5 g）、エタノール可溶画分（2.0 g）、及び水可溶画分に分画し、それぞれをコムラサキシメジ抽出物として取得した（図１）。
［実施例１ コムラサキシメジ抽出物の調製］
本発明において使用可能なコムラサキシメジ抽出物は、以下のようにして調製した。
PYG寒天上で20日間培養したコムラサキシメジの菌糸から5つの小片（5×5×3 mm）を採取し、500mL容三角フラスコに入れた300mlのPYG液体培地中に接種した。25℃で4週間、120rpmで撹拌しながら暗所でインキュベートした後、ろ過により菌糸体と培養ろ液に分離した。培養ろ液を減圧濃縮後、液−液分配を行い、n-ヘキサン可溶画分、酢酸エチル可溶画分（1.5 g）、エタノール可溶画分（2.0 g）、及び水可溶画分に分画し、それぞれをコムラサキシメジ抽出物として取得した（図１）。
［実施例２ 化合物の単離］
実施例１で取得したコムラサキシメジ抽出物のうち、酢酸エチル可溶画分（1.5 g）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（silica gel 60N, Merck 100-200 mesh; 内径 30 mm × 520 mm; 溶媒：CH2Cl2/MeOH 95:5, 85:15, 7:3, 4:6; MeOH, それぞれ1.0 L）により溶出させて分画して20画分を取得した。
実施例１で取得したコムラサキシメジ抽出物のうち、酢酸エチル可溶画分（1.5 g）をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（silica gel 60N, Merck 100-200 mesh; 内径 30 mm × 520 mm; 溶媒：CH2Cl2/MeOH 95:5, 85:15, 7:3, 4:6; MeOH, それぞれ1.0 L）により溶出させて分画して20画分を取得した。
それらのうち、画分15（520 mg）を更に分取TLC（20 × 20 cm, silica gel 60 F254; CH2Cl2/MeOH 80:20）で分離して7画分を取得した（画分15-1〜7）。それらのうち、画分15-6（140 mg）を、Develosil C30-UG-15/30 (内径50 mm × 500 mm, 15〜30μm; 野村化学株式会社; 流速 25 mL/分; 注入量 20 mL; 5% MeOH; 254 nmのUV検出; 保持時間 176.8 分) 及びC30-UG-5 (内径20 mm × 250 mm, 5μm; 流速 5 mL/分; 注入量 1 mL; H2O; 220 nmのUV検出; 保持時間 84.3 分) カラムによる逆相HPLCで更に分離し、再結晶して2-アザヒポキサンチン (AHX; 57 mg)を得た（図２）。
［実施例３ 化合物の単離２］
実施例１で取得したコムラサキシメジ抽出物のうち、エタノール可溶画分（2.1 g）をODSフラッシュカラムクロマトグラフィー（Wakogel 50C-18; 内径30 mm ×520 mm; 溶媒：MeOH/H2O 1:9, 1:1, MeOH, それぞれ1.0 L）により3つの画分に分画した。それらのうち、画分1（1.5 g）を逆相HPLC（Develosil C30-UG-15/30 カラム (内径50 mm × 500 mm, 15-30 μm; 野村化学株式会社; 流速 = 25 mL/分; 注入量 = 35 mL; H2O; 230 nmのUV検出; 保持時間 = 85.2 分) により更にバイオアッセイの結果を指標として9画分に分画した（画分1-1〜9）。画分1-6（27 mg）を逆相HPLC（Develosil C30-UG-5 カラム (内径20 mm × 250 mm, 5μm; 流速 = 5 mL/分; 注入量 = 0.5 mL H2O; 230 nmのUV検出; 保持時間 = 28.4分）により更に分画し、再結晶してイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA; 2.2 mg; ろ液中0.0017%）を得た（図３）。
実施例１で取得したコムラサキシメジ抽出物のうち、エタノール可溶画分（2.1 g）をODSフラッシュカラムクロマトグラフィー（Wakogel 50C-18; 内径30 mm ×520 mm; 溶媒：MeOH/H2O 1:9, 1:1, MeOH, それぞれ1.0 L）により3つの画分に分画した。それらのうち、画分1（1.5 g）を逆相HPLC（Develosil C30-UG-15/30 カラム (内径50 mm × 500 mm, 15-30 μm; 野村化学株式会社; 流速 = 25 mL/分; 注入量 = 35 mL; H2O; 230 nmのUV検出; 保持時間 = 85.2 分) により更にバイオアッセイの結果を指標として9画分に分画した（画分1-1〜9）。画分1-6（27 mg）を逆相HPLC（Develosil C30-UG-5 カラム (内径20 mm × 250 mm, 5μm; 流速 = 5 mL/分; 注入量 = 0.5 mL H2O; 230 nmのUV検出; 保持時間 = 28.4分）により更に分画し、再結晶してイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA; 2.2 mg; ろ液中0.0017%）を得た（図３）。
［実施例４ 化合物の検出］
コムラサキシメジ菌糸体20 mgに抽出溶媒（MeOH : H2O : ギ酸 = 15 : 4 : 1) 1 mLを加え、ビーズ式細胞破砕機で破砕した（SUB-30*3, 4,500 rpm, 3分間×2）。破砕物を含む混合液を遠心分離（15,000×g, 10 分間）し、上清を抽出溶媒1 mLで平衡化したOasis HLBカラム（日本ウォーターズ株式会社）にロードし、溶出させた。溶出操作は2回繰り返し、合わせた溶出液を濃縮乾固した。
コムラサキシメジ菌糸体20 mgに抽出溶媒（MeOH : H2O : ギ酸 = 15 : 4 : 1) 1 mLを加え、ビーズ式細胞破砕機で破砕した（SUB-30*3, 4,500 rpm, 3分間×2）。破砕物を含む混合液を遠心分離（15,000×g, 10 分間）し、上清を抽出溶媒1 mLで平衡化したOasis HLBカラム（日本ウォーターズ株式会社）にロードし、溶出させた。溶出操作は2回繰り返し、合わせた溶出液を濃縮乾固した。
得られた固体を0.1 N塩酸500μLに溶解し、MeOHでコンディショニング及び0.1 N塩酸で平衡化したOasis MCXカラム（日本ウォーターズ株式会社）にロードした後、溶離液としての0.1 N塩酸1 mLをさらに流し、溶出画分１とした。
次いでMeOH 1 mLで洗浄した後、5%アンモニア水1 mLを流し、溶出したものを溶出画分2とした。
得られた溶出画分１及び２を濃縮後、80% アセトニトリル 150 μLに溶解し、遠心分離（15,000×g, 15分間）して、上清を採取してLC-MS/MSで分析した。
次いでMeOH 1 mLで洗浄した後、5%アンモニア水1 mLを流し、溶出したものを溶出画分2とした。
得られた溶出画分１及び２を濃縮後、80% アセトニトリル 150 μLに溶解し、遠心分離（15,000×g, 15分間）して、上清を採取してLC-MS/MSで分析した。
LC-MS/MS分析は、エレクトロスプレーイオン化プローブを備えたタンデムLTQ Orbitrap 質量分析装置（Thermo Fisher Scientific, Inc., Massachusetts, USA）と連結したUPLCシステム（株式会社島津製作所）を使用して実施した。
LC分析は以下の条件で実施した。
カラム：PC-HILIC（株式会社大阪ソーダ）
移動相：95% MeOH in 0.05% FA
カラムオーブン温度：40℃
流速：0.4 mL/分
注入量：10μL
カラム：PC-HILIC（株式会社大阪ソーダ）
移動相：95% MeOH in 0.05% FA
カラムオーブン温度：40℃
流速：0.4 mL/分
注入量：10μL
MS分析は以下の条件で実施した。
ネガティブ-ESIモード
シースガス流速：50 arb
補助ガス流速：10 arb
スプレー電圧：3 kV
キャピラリー温度：350℃
キャピラリー電圧：-1 V
チューブレンズ：-42 V
ネガティブ-ESIモード
シースガス流速：50 arb
補助ガス流速：10 arb
スプレー電圧：3 kV
キャピラリー温度：350℃
キャピラリー電圧：-1 V
チューブレンズ：-42 V
その結果、溶出画分１中にAHX及びAOH、溶出画分２中にICAが含まれることが確認できた（図４）。
図５に、コムラサキシメジ菌糸体に由来するAOHの分析結果を示す。溶出画分１のLC-MS/MSにより、AOHに由来するフラグメントイオン並びに親イオンのピークがそれぞれm/z96、m/z152に観察された。
図５に、コムラサキシメジ菌糸体に由来するAOHの分析結果を示す。溶出画分１のLC-MS/MSにより、AOHに由来するフラグメントイオン並びに親イオンのピークがそれぞれm/z96、m/z152に観察された。
［実施例５ ヒト肺癌細胞株A549における効果］
ヒト肺癌細胞株A549（the American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA, ) CCL185）を10％FBS含有DMEM培地中で37℃、5％CO2下で前培養後、12ウェルプレート上に、1×106個/ウェルの細胞濃度となるように調製した。
ヒト肺癌細胞株A549（the American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA, ) CCL185）を10％FBS含有DMEM培地中で37℃、5％CO2下で前培養後、12ウェルプレート上に、1×106個/ウェルの細胞濃度となるように調製した。
上記のプレート上に、2-アザヒポキサンチン（AHX）、イミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）及び2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）を、それぞれ最終濃度が20μg/mlとなるように添加し、37℃、5％CO2下で24時間培養した。
培養した細胞を1,500rpm、4℃、5分間の遠心分離に供し、A549細胞のペレットを回収した。細胞よりtotal RNAを抽出し、逆転写酵素 ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japan)を用いてRT-PCRを行い、AXL、PD-L1、及びPD-L2 mRNAの存在を調べた。RT-PCRは、AXL mRNAについては配列番号１（フォワードプライマー：TGCCATTGAGAGTCTAGCTGAC）及び２（リバースプライマー：TTAGCTCCCAGCACCGCGAC）、PD-L1 mRNAについては配列番号３（フォワードプライマー：GGACAAGCAGTGACCATCAAG）及び４（リバースプライマー：CCCAGAATTACCAAGTGAGTCCT）、PD-L2 mRNAについては配列番号５（フォワードプライマー：ACCGTGAAAGAGCCACTTTG）及び６（リバースプライマー：GCGACCCCATAGATGATTATGC）、対照としてのGAPDH mRNAについては配列番号７（フォワードプライマー：GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT）及び８（リバースプライマー：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG）のプライマーセットを用いて実施した。
結果を、図６〜８に示す。
結果を、図６〜８に示す。
その結果、2-アザヒポキサンチン（AHX）、2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）、及びイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）を添加したところ、本実施例の試験濃度でいずれの化合物もAXLの阻害効果を示した（図６）。免疫チェックポイント分子であるPD-L1では、AHX及びICAで有意差が認められ（図７）、PD-L2に関しては、化合物AOH及びICAで効果が確認できた（図８）。
尚、効果が確認されたN-3、2-アザヒポキサンチン（AHX）、2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）、及びイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）は、いずれもコムラサキシメジ（Lepista sordida）から単離されたものであっても、化学的に合成されたものであっても良く、またこれらの化合物を含有するコムラサキシメジ抽出物をそのまま使用しても同様の効果が期待される。
コムラサキシメジ抽出物は、抗癌剤耐性抑制効果を有する有効成分を含有しており、癌免疫療法において大いに効果がある可能性が示された。さらには、国民の大きな負担になると指摘されているがん治療における医療費問題も解決できる可能性も認められた。
Claims (8)
- コムラサキシメジ（Lepista sordida）抽出物を有効成分として含有する、抗癌剤耐性抑制剤。
- 前記抽出物が酢酸エチル可溶画分、エタノール可溶画分又は水可溶画分である、請求項１記載の抗癌剤耐性抑制剤。
- 免疫チェックポイント分子の発現を阻害する、請求項１又は２記載の抗癌剤耐性抑制剤。
- 免疫チェックポイント分子がPD-L1及び／又はPD-L2である、請求項３記載の抗癌剤耐性抑制剤。
- AXLの発現を阻害する、請求項１〜４のいずれか１項記載の抗癌剤耐性抑制剤。
- 前記抽出物が、2-アザヒポキサンチン（AHX）、2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）、及びイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）の少なくとも1種を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載の抗癌剤耐性抑制剤。
- 請求項１〜６のいずれか１項記載の抗癌剤耐性抑制剤を含有する、癌治療剤。
- 2-アザヒポキサンチン（AHX）、2-アザ-8-オキソヒポキサンチン（AOH）、及びイミダゾール-4-カルボキサミド（ICA）から選択される少なくとも1種の化合物を含む抗癌剤耐性抑制剤。
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| JP2019105950A JP2020200243A (ja) | 2019-06-06 | 2019-06-06 | 抗癌剤耐性抑制剤 |
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|---|---|---|---|---|
| WO2019014398A1 (en) * | 2017-07-11 | 2019-01-17 | Actym Therapeutics, Inc. | MODIFIED IMMUNOSTIMULATORY BACTERIAL STRAINS AND USES THEREOF |
-
2019
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| INT J CLIN EXP MED, vol. 9(11), JPN6023011535, 2016, pages 21458 - 21465, ISSN: 0005021440 * |
| INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES, vol. 60, JPN6023011534, 2013, pages 235 - 240, ISSN: 0005021441 * |
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