JP7141630B2 - 免疫チェックポイント阻害剤及びその製造方法 - Google Patents
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Description
1.ヒメマツタケ(Agarigus blazei Murill)アルカリ抽出物又は亜臨界水抽出物を有効成分として含有する、抗癌剤耐性抑制剤。
2.免疫チェックポイント分子の発現及び/又は機能を阻害する免疫チェックポイント阻害剤である、上記1記載の抗癌剤耐性抑制剤。
3.免疫チェックポイント分子がPD-1、PD-L1、PD-L2及び/又はCTLA4分子である、上記2記載の抗癌剤耐性抑制剤。
4.AXL、ADAM17及び/若しくはHMGB1の発現及び/又は機能を阻害する、上記1~3のいずれか記載の抗癌剤耐性抑制剤。
5.ヒメマツタケアルカリ抽出物又は亜臨界水抽出物が分子量100,000未満の有効成分を含む、上記1~4のいずれか記載の抗癌剤耐性抑制剤。
6.前記有効成分がSDS-ポリアクリルアミド電気泳動で17kD、26kD、又は36kDに検出されるタンパク質の1種以上を含む、上記1~5のいずれか記載の抗癌剤耐性抑制剤。
7.前記有効成分が0.3 M~3.0 M NaCl濃度で溶出した後に回収した成分を含む、上記1~6のいずれか記載の抗癌剤耐性抑制剤。
8.上記1~7のいずれか記載の抗癌剤耐性抑制剤を含有する、癌治療剤。
9.以下の工程:
(a)ヒメマツタケ子実体に対して80-100℃の熱水を用いる抽出工程、及び
(b)上記工程(a)で得られる残渣に対して3-10% NaOH水溶液を用いる抽出工程を含み、上記工程(b)で得られたろ液をヒメマツタケアルカリ抽出物として取得する、上記1~7のいずれか記載の抗癌剤耐性抑制剤の製造方法。
10.以下の工程:
(a)ヒメマツタケ子実体に対して80-100℃の熱水を用いる抽出工程、及び
(b)上記工程(a)で得られる残渣に対して気圧2-5MPa、温度120-200℃の亜臨界水を用いる抽出工程を含み、上記工程(b)で得られた抽出液をヒメマツタケ亜臨界水抽出物として取得する、上記1~7のいずれか記載の抗癌剤耐性抑制剤の製造方法。
本発明で使用するヒメマツタケ(Agarigus blazei Murill)は、ハラタケ属のキノコであり、別名カワリハラタケともいう。その担子菌はブラジル国サンパウロ州ピエダーテ市郊外で採取されたものであり、工業技術院生命工学工業技術研究所に微工研菌第4731号として寄託されていたが、現在では、例えば株式会社岩出菌学研究所から岩出101株として容易に入手可能である。
これらの知見に基づき、本発明における有効成分を更に濃縮・単離・精製することも本発明の範囲である。
本発明のヒメマツタケアルカリ抽出物又は亜臨界水抽出物を有効成分として含有する抗癌剤耐性抑制剤は、免疫チェックポイント分子の発現及び/又は機能を阻害する。
本発明のヒメマツタケアルカリ抽出物又は亜臨界水抽出物を有効成分として含有する抗癌剤耐性抑制剤はまた、AXL、ADAM17及び/若しくはHMGB1の発現及び/又は機能を阻害する。
上記の分子の発現の阻害は、これらの分子を発現する細胞を含むin vitro又はin vivoの系で確認することができる。in vitroの系としては、PD-1を発現する活性化T細胞及び/又はPD-L1若しくはPD-L2を発現する標的細胞を含む系を利用することができる。あるいはまた、CTLA4を発現する活性化T細胞及び/又はそのリガンドであるB7-1若しくはB7-2を発現する標的細胞を含む系を利用することができる。当業者であれば、抗原を提示する標的細胞上の主要組織適合性複合体をT細胞受容体が認識し得るように、抗原の種類、主要組織適合性複合体の型、T細胞等の組合せを考慮して、このような系を作製することができる。AXL、ADAM17、HMGB1についても、これらの分子を発現する標的細胞を含む系を利用することができる。
本発明は、上記の抗癌剤耐性抑制剤を含有する癌治療剤を提供する。免疫チェックポイントは、あらゆる癌細胞に対する免役応答において見られるメカニズムである。従って、本発明の癌治療剤は、免疫チェックポイント分子等の免疫系で抑制的に作用するタンパク質の発現及び/又は機能を阻害して、標的細胞である癌細胞に対する免疫応答を増強することができる。従って、本発明の癌治療剤の対象となる疾患は、胃癌、肺癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、膵臓癌、肝臓癌、白血病、リンパ腫、骨髄腫、皮膚癌等が挙げられ、特に限定するものではない。
本発明の抽出物は、単独で抗癌剤耐性抑制剤又は癌治療剤として使用することも可能であるが、医薬組成物の有効成分として使用することもできる。こうした医薬組成物には、更なる有効成分、例えば限定するものではないが抗癌剤、抗生物質、抗炎症剤、解熱剤、鎮痛剤等を含めることもできる。本発明の抽出物と更なる有効成分とは、別個に投与することもでき、また同時に、例えば単一の医薬組成物として配合することもできる。医薬組成物の形態、投与経路等は特に限定するものではなく、当分野において通常用いられる形態、投与経路を適宜選択することができるが、好ましくは経口投与、静脈注射等である。医薬組成物として製剤化する場合には、調剤において通常使用される賦形剤、増量剤、崩壊剤、防腐剤、着色料、甘味料、香料、被膜形成剤等を適宜配合することができる。本発明の抽出物は、中性付近の水または水溶液に不溶であるが、アルカリ抽出すると中和しても水溶性であるため、注射剤としての投与も可能である。注射剤としての投与する場合、溶解補助剤等の使用、エマルジョン形態を利用することも可能である。
本発明はまた、上記の抗癌剤耐性抑制剤の製造方法を提供する。
(a)ヒメマツタケ子実体に対して約90℃(80-100℃)の熱水を用いる抽出工程、及び
(b)上記工程(a)で得られる残渣に対して約5%(3-10%) NaOH水溶液を用いる抽出工程
を含み、上記工程(b)で得られたろ液をヒメマツタケアルカリ抽出物として取得するものである。
(a)ヒメマツタケ子実体に対して約90℃(80-100℃)の熱水を用いる抽出工程、及び
(b)上記工程(a)で得られる残渣に対して気圧2-5MPa、温度120-200℃の亜臨界水を用いる抽出工程
を含み、上記工程(b)で得られた抽出液をヒメマツタケ亜臨界水抽出物として取得するものである。
本発明において使用可能な水不溶性抽出物の取得方法の一例を図1に示す。
0.3から3mm程度の大きさに粉砕したヒメマツタケ(岩出101株)の乾燥子実体100gから90℃(80-100℃)の熱水による抽出(約180分間)を行い、熱水抽出物44.2gを得た。抽出されずに残った残渣(55g)を今度は約30℃(25-40℃)にて24時間、約5%(3-10%)NaOH水溶液で抽出し、得られたろ液の画分を乾燥し(41.5g)、アルカリ抽出物として、以下の実験に使用した。
1.肺癌発症モデルマウスの作製
ヒト変異型EGFR(L858R)を発現するトランスジェニックマウスを作製し、肺特異的にEGFRを活性化する系を作製し、肺癌を発症させた。
上記で得られたトランスジェニックマウスを使用して、ヒメマツタケアルカリ抽出物の効果をin vivoで評価した。
上記と同様にして、ヒメマツタケアルカリ抽出物のAXL、ADAM17及びHMGB1の発現に対する効果をin vivoで評価した。図6~8の結果から明らかなように、対照群のマウス(Sal/NF)と比較して、ヒメマツタケ抽出物投与群(Sal/F2)では、AXL、ADAM17及びHMGB1の発現はいずれも有意に低下していた。
1.ヒト肺癌細胞株A549に対する用量依存的増殖阻害の確認
ヒト肺癌細胞株A549(the American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA))を10%FBS含有のDMEM培地中で37℃、5%CO2下で前培養後、12プレート上に、1×106個/ウェルとなるように調製した。
上記と同様に調製したA549を含むプレート上にアルカリ抽出物(F2)を最終濃度が20μg/mlになるように添加し、37℃、5%CO2下で24時間培養した。
アルカリ抽出物(F2)を、14,000~100,000の分子量(A-1)、14,000未満の分子量(A-2)、水不溶性画分(A-3)の3種に分画し、A549細胞におけるPD-L1及びPD-L2の発現に対するそれぞれの画分の効果を実施例3と同様にして評価した。それぞれ最終濃度が20μg/mlになるようにプレートに添加した。対照(Ctrl)には生理食塩水を添加した。
実施例3と同様にして、別のヒト肺癌細胞株H3255(University of Texas Southwestern Medical Center (USA))に対する効果を実施例1で調製したアルカリ抽出物(F2)を用いて確認した。
抗癌剤耐性抑制効果を有する有効成分の探索のために、実施例4で得られた14,000~100,000の分子量の抽出液(A-1画分)を陰イオン交換クロマトグラフィー(TOYOPEARL DEAE-650、東ソー株式会社)にて分画した。
その結果、S4画分(0.3 M NaCl濃度で溶出)、S5画分(0.4 M NaCl濃度で溶出)、S6画分(0.5 M NaCl濃度で溶出)、S7画分(3.0 M NaCl濃度で溶出)において活性が高いことが判明した。
実施例6で取得したS1~S7画分をそれぞれSDS-ポリアクリルアミド電気泳動(SDS-PAGE)にかけ、銀染色によりタンパク質を検出した。その結果、図18及び19に示すように、A549細胞におけるPD-L1及びPD-L2発現抑制効果が高いS4-S7の画分で、17kD、26kD、及び36kDのバンドが濃くなっていることが確認できた。このことから、PD-L1及びPD-L2発現抑制効果をもたらす有効成分が17kD、26kD、又は36kDのバンドに含まれるタンパク質である可能性が示された。
Claims (7)
- ヒメマツタケ(Agaricus blazei Murrill)アルカリ抽出物又は亜臨界水抽出物を有効成分として含有し、免疫チェックポイント分子の発現及び/又は機能を阻害する免疫チェックポイント阻害剤であって、前記有効成分が、ヒメマツタケアルカリ抽出物又は亜臨界水抽出物を溶媒中の塩濃度を変えた陰イオン交換クロマトグラフィーで分画して0.3 M~3.0 M NaCl濃度で溶出した後に回収した成分を含む、前記免疫チェックポイント阻害剤。
- 免疫チェックポイント分子がPD-1、PD-L1、PD-L2及び/又はCTLA4分子である、請求項1記載の免疫チェックポイント阻害剤。
- AXL、ADAM17及び/若しくはHMGB1の発現及び/又は機能を阻害する、請求項1又は2記載の免疫チェックポイント阻害剤。
- ヒメマツタケアルカリ抽出物又は亜臨界水抽出物が分子量100,000未満の有効成分を含む、請求項1~3のいずれか1項記載の免疫チェックポイント阻害剤。
- 前記有効成分がSDS-ポリアクリルアミド電気泳動で17kD、26kD、又は36kDに検出されるタンパク質の1種以上を含む、請求項1~4のいずれか1項記載の免疫チェックポイント阻害剤。
- 以下の工程:
(a)ヒメマツタケ子実体に対して80-100℃の熱水を用いる抽出工程、及び
(b)上記工程(a)で得られる残渣に対して3-10% NaOH水溶液を用いる抽出工程を含み、上記工程(b)で得られたろ液をヒメマツタケアルカリ抽出物として取得する、請求項1~5のいずれか1項記載の免疫チェックポイント阻害剤の製造方法。 - 以下の工程:
(a)ヒメマツタケ子実体に対して80-100℃の熱水を用いる抽出工程、及び
(b)上記工程(a)で得られる残渣に対して気圧2-5MPa、温度120-200℃の亜臨界水を用いる抽出工程を含み、上記工程(b)で得られた抽出液をヒメマツタケ亜臨界水抽出物として取得する、請求項1~5のいずれか1項記載の免疫チェックポイント阻害剤の製造方法。
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Carbohydrate Research,1989年,186(2),267-273 |
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