JP2020500153A - 抗ｐｌ２ｌ６０タンパク質抗体の抗腫瘍薬の製造における応用及び腫瘍治療方法 - Google Patents

Abstract

本公開は医薬技術分野に関し、ＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害する試薬及び抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体の、抗腫瘍薬の製造における応用を提供する。本公開はさらに抗腫瘍医薬組成物及び腫瘍治療方法を提供する。実験によって、接種するときにＫＡＯ３でヒト又はマウス腫瘍細胞を処理すると、マウス腫瘍の発生を効果的に阻害できることが確認される。また、ＫＡＯ３を作成したリンパ腫、乳癌、肺癌及び子宮頸部癌に注射すると、腫瘍成長を著しく阻害し、担癌マウスの生存を延長させることができる。ＫＡＯ３による阻害効果は腫瘍細胞表面で発現させたＫＡＯ３特異的抗原と関連する。ＫＡＯ３はＧ２／Ｍ期に細胞周期を停滞させ、ＤＮＡ合成を阻害し、補体を活性化させることで腫瘍アポトーシスを誘導する。従って、抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂ（ＫＡＯ３）は、癌を治療するための候補治療薬として期待できる。【選択図】図１

Description

本公開は生物医薬分野に属し、ＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害する試薬、抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体の抗腫瘍薬の製造における応用に関し、具体的には、抗ＰＬ２Ｌ６０タンパク質抗体の抗腫瘍薬の製造における応用、及び上記試薬又は抗体を含む医薬組成物、並びに腫瘍治療方法に関する。

本願は、２０１７年０９月０７日に中国特許庁に提出された出願番号が２０１７１０８０００２２．Ｘ、名称が「抗ＰＬ２Ｌ６０タンパク質抗体の抗腫瘍薬の製造における応用」の中国特許出願の優先権を主張し、その全内容が本願の一部として援用される。

「癌免疫治療」は、免疫学原理及び方法を利用して、腫瘍細胞の免疫原性及びエフェクター細胞の死滅に対する感受性を向上させ、生体の抗腫瘍免疫応答を活性化・強化させて、免疫細胞及びエフェクター分子を宿主体内に注入し、生体の免疫系とともに腫瘍を殺滅して、腫瘍成長を阻害し、様々な癌に対して良好な治療効果を有するため、注目を集めている。

しかし、癌免疫治療のターゲットは大部分が個別化されるものであり、ほとんどのターゲットは、すべての種類の癌でなく、少数の癌のみに分布する。また、これらの分子ターゲットは、癌特異的ではなく、正常細胞の機能にも必須である。従って、従来の免疫治療のボトルネックは、造血及び固形癌で広く発現されている特異的でかつ広域スペクトルを有するターゲット又は抗原の欠如である。

本公開の目的は、ＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害する試薬の抗腫瘍薬の製造における応用、抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体の抗腫瘍薬の製造における応用、及び新規な抗腫瘍医薬組成物、並びに腫瘍治療方法を提供することを含む。

本公開の上記目的のうちの少なくとも１つの目的を達成させるために、本公開は、以下の技術案を用いることができる。

本公開の第１形態は、ＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害する試薬の抗腫瘍薬の製造における応用を提供することを含む。

本公開の第２形態は、抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体の抗腫瘍薬の製造における応用を提供することを含む。

上記抗腫瘍薬はリンパ腫、黒色腫、乳癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸部癌、前立腺癌、胃癌、白血病、結腸直腸癌、結腸癌、卵巣癌又は精巣生殖細胞腫瘍の抗腫瘍薬を含む。

さらに、本公開に係る抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体は抗ＰＬ２Ｌタンパク質抗体であり、たとえば抗ＰＬ２Ｌ８０、ＰＬ２Ｌ８０Ａ、ＰＬ２Ｌ６０、ＰＬ２Ｌ６０Ａ、ＰＬ２Ｌ５０又はＰＬ２Ｌ４０タンパク質抗体であり、好ましくは抗ＰＬ２Ｌ６０タンパク質抗体である。

上記変異体において、ＰＬ２Ｌ６０は、主に前癌幹細胞（ｐＣＳＣｓ）及び各種類のヒト及びマウス腫瘍細胞系に発現され、発現レベルが全長ＰＩＷＩＬ２より遥かに高い。ＰＬ２Ｌ６０はＳＴＡＴ３及びＢＣＬ２遺伝子をアップレギュレートして腫瘍細胞の生存及び増殖をインビトロで促進してもよく、ＮＦ−κＢとともに腫瘍の発生を促進してもよく、これは各種の組織における腫瘍発展の共通経路を示す可能性がある。重要なことは、ＰＬ２Ｌ６０から誘導されるペプチドは各種タイプの癌に対する強い免疫源とすることができることである。研究の結果から示されるように、ＰＬ２Ｌタンパク質、特に抗ＰＬ２Ｌ６０モノクローナル抗体は、癌細胞アポトーシスを直接誘導したり、細胞増殖を阻害したり、細胞周期を停滞させたりするという独特な能力を示し、また、ＰＬ２Ｌ６０タンパク質は、ｐＣＳＣにより誘導されて腫瘍免疫（ＮＯＴＩ）を自然発生させるターゲットの１つであり、癌免疫治療の一般的なターゲットである可能性がある。

さらに、本公開に係る抗ＰＬ２Ｌ６０タンパク質抗体は、好ましくは、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＫＡＯ３モノクローナル抗体である。

さらに、ＰＬ２Ｌ６０タンパク質がＳＴＡＴ３及びＢＣＬ２遺伝子をアップレギュレートすることで腫瘍細胞の生存及び増殖をインビトロで促進できるため、抗ＰＬ２Ｌ６０タンパク質抗体は、ＳＴＡＴ３又はＢＣＬ２遺伝子活性化を阻害する抗体である。

さらに、ＫＡＯ３抗体は、ＰＬ２Ｌタンパク質に対して特異的なＣＲＡ−Ｔ細胞を製造することが期待できる。

本公開の第３形態は、ＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害する試薬と、薬学的に許容されるアジュバントとで構成されてもよく、抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体と、薬学的に許容されるアジュバントとで構成されてもよい抗腫瘍医薬組成物を提供することを含む。

本公開の第４形態は、ＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害することを含む腫瘍治療方法を提供することを含む。

上記腫瘍治療方法では、好ましくは、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＫＡＯ３モノクローナル抗体でＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害する。

腫瘍は、リンパ腫、黒色腫、乳癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸部癌、前立腺癌、胃癌、白血病、結腸直腸癌、結腸癌、卵巣癌及び精巣生殖細胞腫瘍のうちのいずれか１種を含み得る。

本公開の作用と効果は以下を含む。
本公開は、大量の実験により、ＰＬ２Ｌタンパク質が各種タイプの癌において幅広く発現しているため、固形及び造血幹細胞の免疫治療の広域スペクトルターゲットとして好ましいことを確認し、各種タイプのＰＬ２Ｌタンパク質から、癌細胞アポトーシスを直接誘導したり、細胞増殖、細胞周期を阻害したりする独特な能力を発現できるＰＬ２Ｌ６０タンパク質を取得するとともに、該タンパク質については抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂ（ＫＡＯ３）を研究した。

実験した結果、接種するときにＫＡＯ３でヒト又はマウス腫瘍細胞を処理するとマウス腫瘍の発生を効果的に阻害できる。また、ＫＡＯ３を作成したリンパ腫、乳癌、肺癌及び子宮頸部癌等に注射すると、腫瘍成長を著しく阻害し、担癌マウスの生存を延長させることができる。ＫＡＯ３の阻害効果は腫瘍細胞表面で発現させたＫＡＯ３特異的抗原と関連する。ＫＡＯ３はＧ２／Ｍ期で細胞周期を停滞させ、ＤＮＡ合成を阻害し、且つ補体を活性化させることで腫瘍アポトーシスを誘導する。従って、抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂ（ＫＡＯ３）は、癌を治療する候補治療薬として期待できる。

従って、本公開は、抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂで抗腫瘍薬を製造するために新しい根拠を提供する。

ＰＬ２Ｌ６０タンパク質の癌細胞における発現の結果である。（Ａ）は、フローサイトメーターにより測定した抗ＰＬ２Ｌ６０モノクローナル抗体の結合活性の結果であり、平板で培養した細胞系（２Ｃ４、３２６ｔ−４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ａ５４９及びＨｅＬａ）表面ＰＬ２Ｌ６０タンパク質の発現をフローサイトメーターで分析する。ｃｅｌｌｓ ｔｒｉｐｐｅｒで細胞を収穫し、４℃条件においてＰＬ２Ｌ６０ｍＡｂで１時間染色し、次にＡＰＣ抱合ヤギ抗マウスＩｇＭで染色し、ＢＤ Ｃ６ソフトウェアを用いて分析する。（Ｂ）は免疫蛍光染色により検出したＰＬ２Ｌ６０の腫瘍細胞表面における発現である。（Ｃ）は免疫蛍光染色により検出したＰＬ２Ｌ６０の癌細胞系における細胞内発現である。（Ｄ）及び（Ｅ）は、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇで平板における癌細胞ＰＬ２Ｌ６０タンパク質の発現を分析した免疫ブロットの結果である。マウスＢ１６細胞系はＬＬＣ、Ｅ１４、３２６ｔ−４及び２Ｃ４を含み、ヒト細胞系はＨＣＴ１１６、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１を含む。（Ｆ−Ｇ）はマウス及びヒト腫瘍細胞株のＰＬ２Ｌ６０タンパク質発現の定量的分析である。 抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂ ＫＡＯ３による癌細胞増殖のインビトロ阻害及びアポトーシス誘導である。（Ａ）は、位相差顕微鏡下で観察したｍＡｂ ＫＡＯ３で４８時間処理した後の癌細胞の形態であり、バーは２５μｍを示す。（Ｂ）は抗ＰＬ２Ｌ６０モノクローナル抗体を４８時間処理した後の癌細胞をフローサイトメトリーで分析したものである。（Ｃ）は抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂの４８時間培養終了時の癌細胞に対する阻害作用である。（Ｄ）はｍＡｂ ＫＡＯ３上清（μｌ／ｍｌ）による癌細胞アポトーシス誘導の用量依存性作用の概要である。 細胞周期の分布図である。（Ａ）は２Ｃ４、３２６Ｔ−４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ａ５４９ ａｎｄ ＨｅＬａ 細胞系をＫＡＯ３で処理した後の細胞周期の分布図であり、（Ｂ）は対照群及び治療群のＧ０／Ｇ１期の細胞比率比較である。（Ｃ）はＳ期の細胞比率であり、（Ｄ）はＧ２／Ｍ期の細胞比率である。 癌細胞のＫＡＯ３前処理による腫瘍発生率への影響である。（Ａ）−（Ｅ）はそれぞれ、２Ｃ４、３２６Ｔ−４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ａ５４９ ａｎｄ ＨｅＬａ細胞系をＫＡＯ３で前処理及びＩｇＧで対照前処理した後の腫瘍発生率である（＊はｐ＜０．０５、＊＊＊はｐ＜０．００１である）。 ＫＡＯ３で異なる段階の担癌マウスを処理する効果である。（Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｊ及びＭ）はＫＡＯ３培養上清で前処理し又は培地（Ｒ１０Ｆ）を対照として前処理した癌細胞を接種したマウスの腫瘍大きさであり、次に対照治療を施す。Ａ：２Ｃ４、Ｄ：３２６Ｔ−４、Ｇ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｊ：Ａ５４９、Ｍ：ＨｅＬａ。（Ｂ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、ａｎｄ Ｎ）は、培地（Ｒ１０Ｆ）を対照として前処理した癌細胞を接種したマウスの腫瘍大きさであり、次にＫＡＯ３又は対照治療を施す。Ｂ：２Ｃ４、Ｅ：３２６Ｔ−４、Ｈ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｋ：Ａ５４９、Ｎ：ＨｅＬａ。（Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｏ）はＫＡＯ３で前処理した癌細胞を接種したマウスの腫瘍大きさであり、次にＫＡＯ３又は対照治療を施す。Ｃ：２Ｃ４、Ｆ：３２６Ｔ−４、Ｉ：ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｌ：Ａ５４９、Ｏ：ＨｅＬａ。（Ｐ）は異なる処理済みの腫瘍細胞の大きさである。２Ｃ４：３５日、３２６Ｔ−４：３０日、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：１００日、Ａ５４９：１００日、ＨｅＬａ：１００日。 補体依存細胞毒性（ＣＤＣ）実験の分析結果である。ＣＤＣ実験は本公開に説明された５種の細胞において行われ、（Ａ）はＰＩ陽性細胞の棒グラフである。（Ｂ）はＰＩ陽性細胞の統計的分析である。死亡細胞の百分率は抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂの抗腫瘍効果と正相関する。マウスｐＣＳＣｓ ２Ｃ４及びヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１はＣＤＣ実験において最も強い腫瘍溶解作用を示し、マウスリンパ腫細胞系３２６Ｔ−４及びヒト肺癌細胞系Ａ５４９はそれに次いでいる。ヒト子宮頸部癌細胞系ＨｅＬａのＣＤＣ効果は最も弱い。

本発明の実施例の目的、技術案及び利点をより明瞭にするために、以下、本公開の実施例における技術案を明瞭且つ完全に説明する。実施例において具体的な条件が明記されていない限り、通常の条件又は製造商が推薦する条件に従って行う。使用される試薬又は器械について、生産メーカーが明記されていない限り、いずれも市販される通常製品として購入できる。

以下、実施例及び図面を参照しながら、本公開について詳細に説明するが、下記実施例は本公開の範囲を限定するためのものでない。

本公開は、主にＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害する試薬の抗腫瘍薬の製造における応用、及び抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体の抗腫瘍薬の製造における応用に関する。

上記ＰＩＷＩＬ２は、通常、精巣に発現されるが、ＤＮＡ損害後には体細胞に活性化されて、クロマチン再構築によりＤＮＡ修復を促進し得る、従って、幹細胞の自己再生及び維持において重要な役割を果たす。乳癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸部癌、前立腺癌、胃癌、白血病、結腸直腸癌、結腸癌、卵巣癌及び精巣生殖細胞腫瘍を含む各種の原発性腫瘍及び腫瘍細胞系においては、ＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現は観察された。

ＰＩＷＩＬ２は、複数種のシグナル伝達経路を調整することで腫瘍の発生を促進し、Ｓｔａｔ３／Ｂｃｌ−ＸＬ経路の活性化により腫瘍細胞のアポトーシスや死亡を阻害することができる。しかしながら、市販品として入手するほとんどのＰＩＷＩＬ２特異的抗体はその変異体から全長ＰＩＷＩＬ２を識別できない。なお、原発性乳癌及び子宮頸部癌の場合、全長ＰＩＷＩＬ２タンパク質は主にアポトーシス性腫瘍細胞に検出されるが、生体の腫瘍細胞では検出されていない。それに対して、ＰＩＷＩＬ２の変異体ＰＬ２Ｌタンパク質（例えばＰＬ２Ｌ６０）は、各種タイプの腫瘍組織及び腫瘍細胞系に大量で検出され、それは、ＰＩＷＩＬ２の腫瘍形成機能が主にＰＩＷＩＬ２変異体媒介性であることを示す。

ＰＩＷＩＬ２は、ＰＬ２Ｌ８０、ＰＬ２Ｌ８０Ａ、ＰＬ２Ｌ６０、ＰＬ２Ｌ６０Ａ、ＰＬ２Ｌ５０及びＰＬ２Ｌ４０等のタンパク質を含む複数種の変異体を有する。いくつかの変異体は、標準的なプロモーターでなく、遺伝子内のプロモータにより転写されるようである。全長ＰＩＷＩＬ２がＤＮＡ修復を媒介して、腫瘍発生初期のバリア遺伝子として作用し、腫瘍組織におけるアポトーシス性細胞死を促進できるが、ＰＬ２Ｌ６０及びＰＬ２Ｌ６０Ａなどのその変異体は腫瘍発生を促進できる。上記変異体のうち、ＰＬ２Ｌ６０は主に前癌性幹細胞（ｐＣＳＣｓ）及び各種タイプのヒトとマウスの腫瘍細胞系において発現され、レベルが全長ＰＩＷＩＬ２より遥かに高い。インビトロ実験では、ＰＬ２Ｌ６０はＳＴＡＴ３及びＢＣＬ２遺伝子をアップレギュレートすることで、腫瘍細胞の生存及び増殖を促進する。ＮＦ−κＢととともに腫瘍発生を促進することもでき、各種タイプの組織の腫瘍発展の共通経路である可能性がある。重要なことは、ＰＬ２Ｌ６０から誘導されたペプチドが各種タイプの癌を標的とする強免疫原とすることができることである。また、ＰＬ２Ｌ６０は、マウスの精巣細胞においても検出されることから、その配偶子発生又は発育での作用が示される。

発明者は、異化活性化したＰＩＷＩＬ２遺伝子の産物−ＰＩＷＩＬ２（ＰＬ２Ｌ６０）様タンパク質が広く各種の造血及び固形腫瘍において発現され、腫瘍細胞の増殖を促進してアポトーシスを阻害することで腫瘍の発生を媒介する。

従って、ＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害することで腫瘍を治療できる。つまり、ＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害する試薬又は抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体を抗腫瘍薬の製造に適用できる。

好ましくは、本公開に係る抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体はＰＬ２Ｌタンパク質抗体であり、たとえば抗ＰＬ２Ｌ８０、ＰＬ２Ｌ８０Ａ、ＰＬ２Ｌ６０、ＰＬ２Ｌ６０Ａ、ＰＬ２Ｌ５０及びＰＬ２Ｌ４０タンパク質抗体のうちの少なくとも１種を含み得る。

好ましくは、本公開に係る抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体は抗ＰＬ２Ｌ６０タンパク質抗体である。

本公開の発明者は、主にＰＩＷＩＬ２に対する、ｍＡｂ ＫＡＯ１、ｍＡｂ ＫＡＯ２、及びｍＡｂ ＫＡＯ３という３種のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を研究・開発した。免疫組織化学的染色測定及びタンパク質ブロッティング分析では、ｍＡｂ ＫＡＯ２及びｍＡｂ ＫＡＯ３はＰＬ２Ｌ６０に対してｍＡｂＫＡＯ１よりも強い親和力を有するものの、ｍＡｂＫＡＯ３はＰＬ２Ｌ６０に専用的に対するものであるため、癌を治療する候補治療薬として期待できるとされる。従って、本公開に用いる抗ＰＬ２Ｌ６０タンパク質抗体は、好ましくは配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＫＡＯ３モノクローナル抗体である。

また、本公開に係る抗ＰＬ２Ｌ６０タンパク質抗体はＳＴＡＴ３又はＢＣＬ２遺伝子活性化を阻害する抗体であってもよい。

さらに、本公開はさらに、たとえば上記ＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害する試薬と薬学的に許容されるアジュバントとで構成されてもよく、上記抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体と薬学的に許容されるアジュバントとで構成されてもよい抗腫瘍医薬組成物を提供する。

薬学的に許容されるアジュバントは薬物の生産及び処方の配合に使用される賦形剤及び添加剤であり、活性成分以外、薬物製剤に含まれる物質である。薬用アジュバントは、成形、担体、安定性向上以外、可溶化、溶解促進、徐放・放出制御等の重要な機能を有する。

好ましくは、薬用アジュバントは、たとえば充填剤、希釈剤、湿潤剤、接着剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング材、滴丸マトリックス及び凝縮液のうちの少なくとも１種を含み得る。具体的には、澱粉、デキストリン、乳糖、微結晶性セルロース、糖アルコール、エタノール、ゴムセメント、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルスターチナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、アエロジル、タルカムパウダ及びクエン酸トリエチル等が挙げられる。

医薬組成物における抗体として、上記抗ＰＬ２Ｌタンパク質抗体が挙げられ、好ましくはＫＡＯ３モノクローナル抗体である。且つ、抗ＰＬ２Ｌタンパク質抗体は、ＰＬ２Ｌ６０を標的とし及び／又はＳＴＡＴ３及びＢＣＬ２を阻害する治療用抗体であってもよい。

なお、本公開に係る医薬組成物における抗体のアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列、及び／又は複数アミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加により得られ且つＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と同じ生物学的活性を有する派生配列を含み得る。

また、本公開はさらに、ＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害することを含む腫瘍治療方法を提供する。好ましくは、上記ＫＡＯ３モノクローナル抗体でＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害する。ここでの腫瘍は、リンパ腫、黒色腫、乳癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸部癌、前立腺癌、胃癌、白血病、結腸直腸癌、結腸癌、卵巣癌及び精巣生殖細胞腫瘍のうちのいずれか１種を含む。

下記実施例において具体的な条件が明記されていない実験方法は、一般的には、通常の条件、又は製造メーカーにより推薦される条件に従って行われる。特に記載のない限り、物質の百分率及び部数はいずれも体積基準である。

本公開に用いる材料は以下のとおりである。

重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス：８〜１２週齢のマウスを用いて、これらマウスは動物無害化施設に飼育される。

ヒト細胞系：ヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト肺癌細胞系Ａ５４９及びヒト子宮頸部癌細胞系ＨｅＬａはすべてアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から入手される。細胞を１０％のウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）及び０．１ｍｇ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が添加された補充されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に保存する。

マウスリンパ腫細胞系２Ｃ４及び３２６Ｔ−４は実験室において自ら製造される：細胞をＣＯ２（ｖ／ｖ）５％を含む加湿インキュベーターに入れ、３７℃でＲ１０Ｆ（ＲＰＭＩ １６４０に１０ｍｍｏｌ／Ｌのウシ胎仔血清を加え、５ｍｍｏｌ／Ｌのグルタミン、５０ｍｍｏｌ／Ｌの２−メチルアセトフェノン、１００Ｕ／ｍＬのペニシリン及び１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充する）に保存する。

抗ＰＬ２Ｌ６０モノクローナル抗体（ＫＡＯ３ｍＡｂ、アイソタイプＩｇＭ）は、モノクローナル抗体の製造フローに従って実験室において自ら製造されるものであり、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される。

参照として、本公開におけるモノクローナル抗体の製造フローはたとえば（１）〜（５）を含む。

（１）動物免疫
動物免疫は、標的抗原でマウスを免疫して、マウスに感作Ｂリンパ細胞を発生させる過程である。一般的に６−８週齢のメスＢａｌｂ／ｃマウスを用い、あらかじめ定められた免疫プログラムに従って免疫注射を行う。抗原は血液循環又はリンパ循環を介して末梢免疫器に入り、対応したＢリンパ細胞がクローン、活性化、増殖、分化をして、感作Ｂリンパ細胞となるように刺激する。

（２）細胞融合
二酸化炭素ガスでマウスを殺して、無菌操作で脾臓を取り出し、平皿内で押して粉砕し、脾臓細胞懸濁液を調製する。用意した同系骨髄腫細胞とマウス脾臓細胞を所定比率で混合して、融和促進剤であるポリエチレングリコールを加える。ポリエチレングリコールの作用下で、各種のリンパ細胞が骨髄腫細胞と融和してハイブリドーマ細胞を形成する。

（３）選択的培養
選択的培養の目的は、融和したハイブリドーマ細胞をスクリーニングすることであり、好ましくは、たとえばＨＡＴ選択的培地を用いることができる。ＨＡＴ培地において、融和していない骨髄腫細胞はヒポキサンチン−グアニンホスホリボシル基転移酵素がなく、挽回方法でＤＮＡを合成できないため、死亡する。融和していないリンパ細胞はヒポキサンチン−グアニンホスホリボシル基転移酵素を有するが、それ自体がインビトロで長期的に生存できないため徐々に死亡する。融和したハイブリドーマ細胞だけは、脾臓細胞からヒポキサンチン−グアニンホスホリボシル基転移酵素を取得し、且つ骨髄腫細胞の無限増殖の特性を有するため、ＨＡＴ培地において生存して増殖できる。

（４）ハイブリドーマ陽性クローンのスクリーニング及びクローン化
ＨＡＴ培地に成長したハイブリドーマ細胞は、少数だけが所定の特異的モノクローナル抗体を分泌する細胞であることから、スクリーニング及びクローン化を行わなければならない。好ましくは、たとえば制限希釈法でハイブリドーマ細胞のクローン化培養を行うことができる。柔軟、迅速且つ特異的な免疫学方法を用いて、所要のモノクローナル抗体を生産できる陽性ハイブリドーマ細胞をスクリーニングして、クローン増幅を行う。それが分泌したモノクローナル抗体の免疫グロブリンクラス、サブクラス、特異性、親和力を全面的に同定し、抗原のエピトープ及びその分子量を認識した後、タイムリーに凍結保存する。

（５）モノクローナル抗体の大量製造
モノクローナル抗体を大量で製造する場合、動物インビボ誘導法及びインビトロ培養法を用いることができる。インビボ誘導法は以下を含む。Ｂａｌｂ／ｃマウスを用いて、まず０．５ｍｌの液体パラフィン又はプリスタンを腹腔内注射して前処理する。１−２週間後、ハイブリドーマ細胞を腹腔内接種する。ハイブリドーマ細胞がマウス腹腔内で増殖してモノクローナル抗体を発生させて分泌する。約１−２週間後、マウス腹部が膨張する。射出器で腹水を抽出し、大量のモノクローナル抗体を取得する。また、インビトロ培養法は以下を含む。ハイブリドーマ細胞を培養瓶に入れて培養する。培養過程において、ハイブリドーマ細胞がモノクローナル抗体を発生させて分泌し、培養上清を収集し、細胞及びその破片を遠心除去して、所要のモノクローナル抗体は得られ得る。

本公開の発明者はＰＩＷＩＬ２に対する、ｍＡｂ ＫＡＯ１、ｍＡｂ ＫＡＯ２、及びｍＡｂ ＫＡＯ３という合計３種のモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）を研究・開発した。ｍＡｂＫＡＯ３がＰＬ２Ｌ６０専用であるため、以下の分析方法はいずれも好ましくはＫＡＯ３モノクローナル抗体を用いる。

以下、本公開に用いる分析方法及び実験結果について詳細に説明する。

一、分析方法
フローサイトメーター分析
参照として、たとえば０．２５％のトリプシン−ＥＤＴＡ（１ｍＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて癌細胞を１−３分間解離し、セルソーティング緩衝液（１％のウシ胎仔血清を含むＰＢＳ）で細胞を洗浄し、次に４℃で抗ＰＬ２Ｌ６０ｍＡｂｓで１時間インキュベートする。細胞とフィコエリトリン抱合ヤギ抗マウスＩｇＭ（１：２５０希釈、Ｂｉｏｌｉｇｅｎｄ）を４℃で３０分間インキュベートする。最終的に洗浄した後、細胞を１％のＦＢＳを含むＰＢＳで再懸濁させて、フローサイトメトリー（ＢＤ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）により分析する。細胞表面及び細胞内を蛍光抗体法で染色する。

表面を染色して、腫瘍細胞を収集し、ＰＢＳに腫瘍細胞を再懸濁させて、細胞濃度を５×１０６／ｍｌにし、細胞懸濁液（１×１０^６個の細胞／ウェル）０．２ｍＬを９６ウェルプレートに加える。細胞を（１０００ｒｐｍ、５分間）回転させて上清を捨てる。ＰＢＳ １００μＬに抗ＰＬ２Ｌ６０モノクローナル抗体ＫＡＯ３を加えて、５秒間回転させる。サンプルを４℃で３０分間インキュベートする。ＰＢＳで細胞を２回洗浄する。上清を捨てて、１％パラホルムアルデヒドを含む１００μｌＰＢＳを各ウェルに加えて、細胞を固定する。

細胞内染色の場合、カバースリップに培養した腫瘍細胞を２％パラホルムアルデヒドにおいて２０分間固定し、次に洗浄し、その後、１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳで３０分間ブロッキングする。室温下で、細胞と抗−ＰＬ２Ｌ６０ｍＡｂ（ＫＡＯ３、１：１００希釈）を１％ウシ血清アルブミンにおいてインキュベートする。１時間インキュベートした後、細胞を洗浄してＦＩＴＣヤギ抗マウス抗体（ＩｇＭ、Ｂｉｏｌｉｇｅｎｄ）とともにインキュベートする。染色剤、たとえば４′,６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ、１：５００）で細胞核を染色する。

Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ
トリプシンで収穫する前、細胞サンプルを冷たいＰＢＳで２回洗浄し、次にタンパク質で試薬分解細胞を抽出する。ＢＣＡタンパク質測定キット（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ、Ｓｈａｎｇｈａｉ、Ｃｈｉｎａ）を用いて全細胞分解物の総タンパク質濃度を測定し、次に１２％ポリアクリルアミドゲルでタンパク質を分離し、ポリフッかビニリデン膜に移す。

ＴＢＳ／ツイーン２０（ＴＢＳＴ）において５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いてブロッキングした後、４℃で特異的一次抗体を用いて一晩インキュベートし、ＴＢＳ−Ｔで膜を５分間洗浄し、洗浄を３回繰り返す。次に、膜とセイヨウワサビペルオキシダーゼ抱合抗マウスＩｇＭ二次抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ,Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ,ＣＡ,ＵＳＡ）を室温下で１時間インキュベートし、次にＴＢＳＴで５分間洗浄して３回繰り返す。次にＥＣＬ化学発光検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で膜を分析する。

本研究には、抗ＰＩＷＩＬ２ポリクローナル抗体（発明者のチームで製造される）抗体を用い、且つ画像がＫｏｄａｋ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｔａｔｉｏｎ ２０００Ｒ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ、ＵＳＡ）により取得される。

ＣＣＫ−８分析
ＣＣＫ−８分析（Ｄｏｊｉｎｄｏ,Ｊａｐａｎ）により抗ＰＬ２Ｌ６０ｍＡｂ（ＫＡＯ３）による細胞活性への影響を評定する。ＣＣＫ−８測定を行うために、細胞と濃度勾配（１、２、４及び８μｇ／ｍｌ）を有するＫＡＯ３とを最終体積２００μＬの１０％ＦＢＳ含有培地において混合し、同じ濃度のＩｇＧを対照として用いる。次に、連続的に希釈したＰＬ２Ｌ６０抗体又は対照ＩｇＧを２×１０^３個の細胞／ウェルの密度で平底９６ウェルプレートに接種する。４８時間インキュベートした後、ＣＣＫ−８試薬１０μＬを９６ウェル測定プレート（ウェルに新鮮なフェノールスルホンフタレインなし培地１００μＬが含まれる）の各ウェルに移し、プレートを３７℃、５％ＣＯ_２の湿潤雰囲気に１−４時間インキュベートする。次にＳｐｅｃｔｒａR Ｍａｘ Ｍ５シリーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて４９０ｎｍでの吸光度（Ａ）を記録する。

（Ａ_サンプル−Ａ_空白）／（Ａ_対照−Ａ_空白）×１００％により細胞活性を計算する。実験ごとに少なくとも３回繰り返し、実験ごとに３つの反復を設定する。

アポトーシス測定
ＫＡＯ３で２４時間処理した後、細胞を収穫して予備冷却したＰＢＳで２回洗浄する。ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を希釈し、次にアネキシンＶ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）及びヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）を含む混合物を結合緩衝液において暗所で１５分間インキュベートする。アネキシンＶ−ＡＰＣ及びＰＩでアポトーシス細胞を検出して、フローサイトメーター（ＢＤ、Ｃ６）を用いて分析する。初期のアポトーシス細胞をＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ−ＡＰＣアポトーシス検出キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で測定する。ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、Ｓｉｇｍａ）で染色してアポトーシス細胞核を検出する。合計３回の独立実験を行う。

細胞周期分析
細胞を冷凍した７５％エタノールに固定して、ＰＢＳにおいて、１００μｇ／ｍｌリボ核酸酵素（Ｔｉａｎｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）と５０μｇ／ｍＬ ＰＩ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を含有するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液で細胞周期分析染色を行い、細胞周期の各段階の細胞百分率をＣ６フローサイトメーター（ＢＤ）で測定する。

抗腫瘍実験
細胞（ＰＢＳ ２００μＬあたりの細胞濃度が５×１０^６である）をＳＣＩＤマウスの鼠蹊部に注射する。腫瘍が発生した後、担癌マウスを、群１、対照→対照群、群２、対照→ＫＡＯ３、群３、ＫＡＯ３→対照群、群４、ＫＡＯ３→ＫＡＯ３という４群にランダムに分ける。ＫＡＯ３又はアイソタイプＩｇＧを２週間原位置で注射する。２日おきにノギスで腫瘍の長さ及び幅を測定し、腫瘍の直径が２ｃｍになると、マウスを安楽死させる。

補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）分析
補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）の標的細胞を５×１０^４個の細胞／ウェルの濃度で平板に接種する。テスト抗体を所定の最終濃度で活性化又は熱不活性化（６０℃、３０分間）したヒト血清（２５％最終血清濃度、Ｐａｔｈｗａｙ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｄｏｒｋｉｎｇ、ＵＫ）に加える。

平板を３７℃で３時間インキュベートし、次に細胞活性試薬を加える。Ｔｒｉｔｏｎ１ Ｘ−１００を対照細胞のウェルに加えて最大分解コントロールを作成する。３７℃で１時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｌｕｓ、Ｊａｐａｎ）により蛍光を測定する。

あらゆる実験データは少なくとも３回の独立実験から取得される。実験数値は平均値±標準偏差（ＳＤ）の形として示され、実験群と対応する対照をｓｔｕｄｅｎｔ ｔテスト（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔ）で比較する。３群以上の群を一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）で比較する。ｐ値が０．０５より小さいと、差は有意であるとみなされる。＊はｐ値＜０．０５、＊＊はｐ値＜０．０１、＊＊＊はｐ値＜０．００１を示す。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を用いて生存分析を行い、ログランクテストでテスト群間の有意差をテストし、Ｓｐｅａｒｍａｎで相関係数を分析して測定する。

なお、上記分析方法における分析パラメータ、分析条件及び使用される試薬等はいずれも実験の具体的な条件及び状況に応じて適切に調整できる。

二、実験結果
タンパク質の癌細胞での発現
免疫組織化学的検出により、原発性乳癌及び子宮頸部癌の場合、全長ＰＩＷＩＬ２タンパク質は主にアポトーシス性腫瘍細胞において検出されるが、生体腫瘍細胞にはほぼ検出されていない。それに対して、ＰＩＷＩＬ２変異体ＰＬ２Ｌタンパク質（例えばＰＬ２Ｌ６０）は各種タイプの腫瘍組織及び腫瘍細胞系において大量で検出され、それは、ＰＩＷＩＬ２の腫瘍形成機能が主にＰＩＷＩＬ２変異体で媒介される可能性があることを示す。従って、ＰＬ２Ｌタンパク質は、各種タイプの癌に幅広く発現されるため、固形及び造血幹細胞の免疫治療の広域スペクトルターゲットとして理想的である。

この仮説を検証するために、まず、モノクローナル抗体（ｍＡｂ ＫＡＯ３）でヒトとマウスの相同のＰＩＷＩＬ２ペプチドついて、ＰＬ２Ｌタンパク質の各種タイプの腫瘍細胞系の細胞表面での発現を研究する。細胞質以外、マウス造血前癌幹細胞（ｐＣＳＣｓ）系２Ｃ４、癌幹細胞（ＣＳＣ）系３２６Ｔ−４及びヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、肺癌細胞系Ａ５４９及び子宮頸部癌細胞系ＨｅＬａを含む腫瘍細胞系の表面に、ＰＬ２Ｌタンパク質はフローサイトメトリー及び蛍光顕微鏡（図１Ａ−Ｂ）により検出される。

細胞内の蛍光抗体法分析（図１Ｃ）を行ったところ、Ｐｌ２Ｌ６０タンパク質は主に各種タイプのヒト及びマウスの腫瘍細胞の細胞質に発現されており、異なる癌細胞には有意差がない。タンパク質ブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）データに示されるように、ＰＬ２Ｌ６０総タンパク質は、各種タイプのヒト及びマウスの腫瘍細胞系に高発現されており、ｐＣＳＣｓ ２Ｃ４の細胞質での発現量が最も高い（図１Ｄ−Ｇ）。

ＫＡＯ３ ｍＡｂの細胞毒性
インビトロ実験では、ＰＬ２Ｌ６０はＳＴＡＴ３及びＢＣＬ２遺伝子をアップレギュレートすることで腫瘍細胞の生存及び増殖を促進でき、さらにＮＦ−κＢタンパク質とともに腫瘍発生を促進できる。従って、ＰＬ２Ｌ６０に対するモノクローナル抗体を生成することで癌増殖を阻害する抗体を開発した。現在、増殖を直接阻害してアポトーシスを誘導することのできる抗ＰＬ２Ｌ６０抗体に関する公開報告がなかった。現在の研究では、新しく産生した抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂがこの能力を有するか否かを調べた。

ＫＡＯ３ｍＡｂは、例えばＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ａ５４９、ＨｅＬａ、２Ｃ４及び３２６Ｔ−４などの癌細胞アポトーシスを誘導できる（図２）。ＫＡＯ３治療前、対照群及び実験群の癌細胞の形態がほとんど一致し、対照細胞は良好に成長しており、多角形をして、４８ｈ培養した後、大きさが均一である。抗ＰＬ２Ｌ６０ｍＡｂ ＫＡＯ３で細胞を４８時間処理した後、高出力顕微鏡下で観察したところ、細胞クロマチンが失われて、細胞数が著しく減少し、細胞の形態が不規則的になり、いくつかの細胞が丸くなる。ハイパワー顕微鏡下で視認可能な核染色体及び減少した細胞質の空胞を観察した（図２Ａ）。懸濁液における半独立細胞、アポトーシス細胞の数が急激に増加した（図２Ｂ及び図２Ｃ）。具体的には、異なる用量の抗ＰＬ２Ｌ６０抗体で４８時間（１、２、４及び８μｌ／ウェルのｍＡｂ ＫＡＯ３上清液）処理した後、細胞活性は低下した（図２Ｄ）。

これらの結果から示されるように、抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂ ＫＡＯ３は５種の癌細胞株の細胞増殖を顕著に阻害できる（図２Ｄ）。全体的には、これらの結果は抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂ（ＫＡＯ３）がアポトーシス誘導方法により癌細胞の細胞毒性活性を誘導できる可能性があることを示した。

ＫＡＯ３ ｍＡｂ誘導癌細胞での細胞周期停滞
図３Ａは抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂ（ＫＡＯ３）で処理した後の２Ｃ４、３２６Ｔ−４、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ａ５４９及びＨｅＬａの細胞周期分布を示す。対照細胞に比べて、抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂ（ＫＡＯ３）で４８ｈ処理した後、癌細胞Ｇ０／Ｇ１期の割合が僅かに低下し、Ｓ期の細胞百分率があまり変化しない。Ｇ２／Ｍ期の細胞の数が増加する。Ａ５４９細胞のＧ２／Ｍ期の細胞の数が最も多い。Ｇ０／Ｇ１及びＧ２／Ｍ期の割合が急激に増加し、Ｓ期の細胞百分率がＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＨｅＬａ細胞において急激に低下する。Ｇ０／Ｇ１、Ｓ及びＧ２／Ｍ期の２Ｃ４細胞の変化は最大である。３２６Ｔ−４細胞は有意な変化がない（図３Ｂ−図３Ｄ）。要するに、ＰＩ／ＦＡＣＳ分析により示されるように、抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂ（ＫＡＯ３）は５種の癌細胞系において顕著なＧ２／Ｍ期停滞を引き起こす。

抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂ ＫＡＯ３による異種移植腫の治療
抗ＰＬ２Ｌ６０モノクローナル抗体（ＫＡＯ３）による治療が癌細胞成長を破壊するとともに癌細胞のアポトーシスをインビトロで誘導するため、ＫＡＯ３は腫瘍成長のインビボ直接阻害に用いられ得るか否かを研究した。ＫＡＯ３による腫瘍細胞の腫瘍形成性への影響を研究するために、腫瘍治療プログラムを、腫瘍発生の初期段階と腫瘍治療段階の２段階に分ける。

まず、ヒト及びマウス癌細胞をＫＡＯ３ハイブリドーマ又は培地の培養上清に懸濁させ、次にＳＣＩＤマウスに接種し、細胞をアイソタイプＩｇＧで処理して対照とする。腫瘍が形成した後、異なる治療群の担癌マウスを２群に分け、２日おきに１群の担癌マウスにＫＡＯ３を原位置で注射し、別の１群にアイソタイプＩｇＧを注射して対照とし、腫瘍成長を観察した。

腫瘍が発生した最初段階に、平均腫瘍直径が０．５ｃｍに近くなったとき、異なる群の腫瘍発生率をカウントする。ＳＣＩＤマウスではｐＣＳＣｓの腫瘍発生がほとんど完全にＫＡＯ３ｍＡｂで阻害されることを発見した。観察した１５０日内に、３３％のマウス（３／９）だけは接種後の１０、６７及び１１８日目に腫瘍を発生させた。それに対して、対照群のすべてのマウス（１００％）は接種後の３週間内に腫瘍を発生させた。ＫＡＯ３で前処理したＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を接種したマウスの腫瘍発生率は５０％であるが、対照群は８３％である。他の３種の細胞系の腫瘍発生率は１００％であり、ＫＡＯ３前処理群と対照群とは差がない（図４Ａ−図４Ｅ）。

腫瘍生長動力学による更なる分析から示されるように、ＫＡＯ３で前処理したｐＣＳＣｓの腫瘍成長速度は対照（中等処理）由来のｐＣＳＣｓの腫瘍成長より低い（図５Ａ）。対照群腫瘍にＫＡＯ３ｍＡｂ上清５０μｌが注射された後、ｍＡｂで著しく阻害される（図５Ｂ）。ＫＡＯ３ｍＡｂで前処理されたｐＣＳＣｓからの、且つ６７及び１１８日目に成長した腫瘍がほとんど完全にｍＡｂで阻害される（図５Ｃ）。その結果から示されるように、ｍＡｂ ＫＡＯ３はｐＣＳＣｓの腫瘍発生を効果的に予防し、作成された腫瘍の成長を阻害することができる。程度が異なるが、マウス造血幹細胞（ＣＳＣｓ、クローン３２６Ｔ−４）及び３２６Ｔ−４の同じ治療もＳＣＩＤマウスの腫瘍形成性又は腫瘍成長阻害を引き起こす（図５Ｄ−図５Ｆ）。

ｍＡｂ ＫＡＯ３もヒトＰＬ２Ｌ６０タンパク質を認識するため、２Ｃ４ ｐＣＳＣ系の処理と同じ方法を用いて、ハイブリドーマＫＡＯ３の培養上清でヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト肺癌細胞系Ａ５４９及びヒト子宮頸部癌細胞系ＨｅＬａを処理したところ、類似した結果を観察し、すなわち、ＫＡＯ３ｍＡｂもヒト癌細胞の腫瘍発生及びＳＣＩＤマウスに作成された腫瘍成長を効果的に阻害できる（図５Ｇ−図５Ｐ）。その結果から明らかなように、ｍＡｂ ＫＡＯ３はヒト及びマウスの癌細胞を効果的に殺滅又は阻害できることを示した。

ｍＡｂ ＫＡＯ３の作用は２種の腫瘍に限定されず、程度が異なるが、マウス類造血幹細胞（ＣＳＣｓ、クローン３２６Ｔ−４）、ヒト肺癌細胞系Ａ５４９及びヒト子宮頸部癌細胞系ＨｅＬａの同じ治療も腫瘍形成性又はＳＣＩＤマウスの腫瘍成長の阻害作用を引き起こす。これらの結果により、ＫＡＯ３は腫瘍成長低下の点では対照よりも高い治療効果を有するという発見を証明する。ＫＡＯ３はヒト及びマウス腫瘍のインビボ成長を阻害できる。

ｍＡｂ ＫＡＯ３の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）
インビトロ補体の存在下で、ｍＡｂが腫瘍細胞を殺滅できるため、抗腫瘍治療効果は補体依存性細胞毒性の腫瘍細胞表面ＰＬ２Ｌ６０タンパク質の発現レベルと正相関する。従って、ＰＬ２Ｌ６０タンパク質は、癌受動免疫治療の適切なターゲットでもある。

その結果から示されるように、マウスｐＣＳＣ系２Ｃ４とヒト乳癌細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、ＣＤＣ実験において最も強い腫瘍溶解作用を示し、マウスリンパ腫細胞系３２６Ｔ−４及びヒト肺癌細胞系Ａ５４９はそれに次いており、ヒト子宮頸部癌細胞系ＨｅＬａのＣＤＣ効果は最も弱い（図６Ａ−Ｂ）。これらの結果はＰＬ２Ｌ６０タンパク質の癌細胞表面における発現レベルと一致する。さらに、抗ＰＬ２Ｌ６０のｍＡｂ ＫＡＯ３が腫瘍細胞表面のＰＬ２Ｌ６０タンパク質のターゲットであり、ＫＡＯ３がＣＤＣ依存メカニズムによりその抗腫瘍作用を発揮できることを示す。

前記のとおり、ＰＬ２Ｌ６０を標的とし及び／又はＳＴＡＴ３及びＢＣＬ２の活性化を阻害する治療用抗体の発展は、腫瘍を解消するという巨大な潜在力を有する。

本研究では、自分の実験室で開発されたｍＡｂ ＫＡＯ３を用いて、ＰＬ２Ｌタンパク質が癌免疫治療の通常ターゲットであるか否かをテストした。ｍＡｂ ＫＡＯ３の腫瘍発生及び腫瘍成長を阻害するときの発現の差異が癌細胞系（図１Ａ−図１Ｂ）間の表面ＫＡＯ３特異的抗原（すなわちＰＬ２Ｌタンパク質）の発現と関連するが、細胞内発現に関係がなく（図１Ｃ−図１Ｇ）、原因はＫＡＯ３ｍＡｂの腫瘍発生阻害能力が表面ＫＡＯ３ ＋細胞の百分率に関連することである。ＨｅＬａ及び３２６Ｔ−４細胞系は他の細胞系よりも含まれたＫＡＯ３ ＋細胞が少なく、ｍＡｂ ＫＡＯ３処理に対する感受性が低い（図５）。従って、ｍＡｂ ＫＡＯ３の治療効果は表面ＰＬ２Ｌタンパク質の発現量により決定される。

抗ＰＬ２Ｌ６０抗体がインビボで腫瘍を阻害するメカニズムはまだ不明である。公開されていない研究によれば、臨床環境において抗ＰＬ２Ｌ６０抗体が癌細胞アポトーシスを直接誘導することを証明しているため、現在、このような抗体が腫瘍細胞の増殖を直接阻害できるか否かについてはまだ不明である。本研究では、ＫＡＯ３ ｍＡｂ処理により、ヒト及びマウス癌細胞の増殖が阻害され、細胞周期Ｇ２／Ｍ期の細胞の百分率が用量依存的に顕著に向上し、特にＳ期の２Ｓ４細胞の百分率が著しく低下する。

ＫＡＯ３の抗腫瘍作用を研究した結果、癌細胞の細胞成長に対して強い阻害作用を有する。ＫＡＯ３はＧ２／Ｍ期に細胞周期停滞を用量依存的に誘導し、次にアポトーシスを引き起こし（図２−図３）、微小管解重合又はＮＦ−κＢ及びＳＴＡＴ３核転位の阻害に繋がると考えられ、さらに転写活性が阻害されることを証明した。腫瘍異種移植モデルにおいて、ＫＡＯ３は腫瘍成長を効果的に遅延させる（図４−図５）。研究結果によれば、抗ＰＬ２Ｌ６０抗体が腫瘍細胞の増殖を阻害し且つアポトーシスを誘導できる直接根拠を提供する。

その結果から示されるように、ＰＬ２Ｌタンパク質は、癌免疫治療の有効ターゲットである。ｍＡｂ ＫＡＯ３が各種タイプの腫瘍細胞系（たとえばリンパ腫、黒色腫、乳癌、肺癌、子宮頸部癌、肝癌、膀胱癌、前立腺癌、胃癌、白血病、結腸直腸癌、結腸癌、卵巣癌又は精巣生殖細胞腫瘍を含む）に発現される表面ＰＬ２Ｌタンパク質を認識できることをはじめて見出した。ｍＡｂ ＫＡＯ３はＧ２／Ｍ期の細胞周期停滞の誘導及び補体の活性化により、インビボではヒト及びマウス腫瘍の発生を効果的に阻害でき、インビトロでは腫細胞の増殖を阻害できる。その阻害作用は腫瘍細胞系における表面ＫＡＯ３ ＋細胞の数と緊密に関連する。

ＰＬ２Ｌ６０の細胞表面での低発現は、インビトロ及びインビボでＫＡＯ３の治療に対して顕著な反応が発生する可能性があり、これはこれらの癌細胞の幹／前駆細胞性質に関連する。ＫＡＯ３ｍＡｂの腫瘍幹／前駆細胞に対する阻害が非幹細胞癌細胞への作用より効果的であるため、ｐＣＳＣｓでのＰＬ２Ｌ６０の高レベル発現は、ｍＡｂ ＫＡＯ３の腫瘍形成性に対する阻害に対してより高感度である。なお、細胞系におけるＰＬ２Ｌ６０担持量の低い癌細胞は低腫瘍成長率に繋がる。これは、ＰＬ２Ｌ６０を持っている癌細胞が各発育段階の幹／前駆細胞癌細胞、又はＫＡＯ３ ｍＡｂの唯一なターゲットを代表する可能性がある。これらの結果から、ＰＬ２Ｌタンパク質は腫瘍発生に重要な役割を果たし、このため、癌免疫治療の効果的な通常ターゲットであることが証明された。この発見は癌免疫治療のため新しい場面を提供する。

前記のように、ＰＬ２Ｌ６０は癌治療のターゲット抗原として期待できる。ＰＬ２Ｌ６０の特定抗原エピトープとして、あらゆるデータはＫＡＯ３モノクローナル抗体の抗腫瘍活性が顕著であることを示した。

以上、本公開の基本原理、主な特徴及び本公開の利点が示されて、説明された。当業者であれば、本公開は上記実施例で限定されず、上記実施例及び明細書の記載は本公開の原理を説明するためのものに過ぎず、本公開の精神及び範囲から逸脱することなく、本公開に対する様々な変更や改良が可能であり、それらの変更や改良がいずれも本公開の保護範囲に属することを理解すべきである。本公開の保護範囲は添付の特許請求の範囲及びその同等物により限定される。

本公開に係るＰＬ２Ｌタンパク質は、各種タイプの癌において幅広く発現しているため、固形及び造血幹細胞の免疫治療の広域スペクトルターゲットとして好ましい。各種タイプのＰＬ２Ｌタンパク質から、癌細胞アポトーシスを直接誘導したり、細胞増殖、細胞周期を阻害したりする独特な能力を発現できるＰＬ２Ｌ６０タンパク質、特に抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂ（ＫＡＯ３）を取得する。接種するときにＫＡＯ３でヒト又はマウス腫瘍細胞を処理すると、マウス腫瘍の発生を効果的に阻害できる。また、ＫＡＯ３を作成したリンパ腫、乳癌、肺癌及び子宮頸部癌に注射すると、腫瘍成長を著しく阻害し、担癌マウスの生存を延長させることができる。ＫＡＯ３による阻害効果は腫瘍細胞表面で発現させたＫＡＯ３特異的抗原と関連する。ＫＡＯ３はＧ２／Ｍ期に細胞周期を停滞させ、ＤＮＡ合成を阻害し、補体を活性化させることで腫瘍アポトーシスを誘導する。従って、抗ＰＬ２Ｌ６０ ｍＡｂ（ＫＡＯ３）は、癌を治療するための候補治療薬として期待できる。

Claims (18)

1. ＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害する試薬の抗腫瘍薬の製造における応用。
2. 抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体の抗腫瘍薬の製造における応用。
3. 前記抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体は抗ＰＬ２Ｌタンパク質抗体である、ことを特徴とする請求項２に記載の抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体の抗腫瘍薬の製造における応用。
4. 前記抗ＰＬ２Ｌタンパク質抗体は抗ＰＬ２Ｌ８０、ＰＬ２Ｌ８０Ａ、ＰＬ２Ｌ６０、ＰＬ２Ｌ６０Ａ、ＰＬ２Ｌ５０及びＰＬ２Ｌ４０タンパク質抗体のうちの少なくとも１種を含む、ことを特徴とする請求項３に記載の抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体の抗腫瘍薬の製造における応用。
5. 前記抗ＰＬ２Ｌタンパク質抗体は抗ＰＬ２Ｌ６０タンパク質抗体である、ことを特徴とする請求項４に記載の抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体の抗腫瘍薬の製造における応用。
6. 前記抗ＰＬ２Ｌ６０タンパク質抗体はＫＡＯ３モノクローナル抗体であり、前記ＫＡＯ３モノクローナル抗体配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される、ことを特徴とする請求項５に記載の抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体の抗腫瘍薬の製造における応用。
7. 前記抗ＰＬ２Ｌ６０タンパク質抗体はＳＴＡＴ３又はＢＣＬ２遺伝子活性化を阻害する抗体である、ことを特徴とする請求項５に記載の抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体の抗腫瘍薬の製造における応用。
8. 前記腫瘍は乳癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸部癌、前立腺癌、胃癌、白血病、結腸直腸癌、結腸癌、卵巣癌及び精巣生殖細胞腫瘍のうちのいずれか１種を含む、ことを特徴とする請求項２−７のいずれかに記載の抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体の抗腫瘍薬の製造における応用である。
9. 請求項１に記載のＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害する試薬と、薬学的に許容されるアジュバントとで構成される、ことを特徴とする抗腫瘍医薬組成物。
10. 請求項２に記載の抗ＰＩＷＩＬ２遺伝子異常発現タンパク質抗体と、薬学的に許容されるアジュバントとで構成される、ことを特徴とする抗腫瘍医薬組成物。
11. 前記アジュバントは充填剤、希釈剤、湿潤剤、接着剤、崩壊剤、潤滑剤、コーティング材、滴丸マトリックス及び凝縮液のうちの少なくとも１種を含み、
    好ましくは、前記アジュバントは、澱粉、デキストリン、乳糖、微結晶性セルロース、糖アルコール、エタノール、ゴムセメント、ポリエチレングリコール、メチルセルロース、カルボキシメチルスターチナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、アエロジル、タルカムパウダ及びクエン酸トリエチルのうちの少なくとも１種を含む、ことを特徴とする請求項９又は１０に記載の医薬組成物。
12. 前記抗体は抗ＰＬ２Ｌタンパク質抗体である、ことを特徴とする請求項１０に記載の医薬組成物。
13. 前記抗体は抗ＰＬ２Ｌ８０、ＰＬ２Ｌ８０Ａ、ＰＬ２Ｌ６０、ＰＬ２Ｌ６０Ａ、ＰＬ２Ｌ５０及びＰＬ２Ｌ４０タンパク質抗体のうちの少なくとも１種を含む、ことを特徴とする請求項１０−１２のいずれかに記載の医薬組成物。
14. 前記抗体は抗ＰＬ２Ｌ６０タンパク質抗体である、ことを特徴とする請求項１０−１３のいずれかに記載の抗体。
15. 前記抗ＰＬ２Ｌ６０タンパク質抗体は、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＫＡＯ３モノクローナル抗体である、ことを特徴とする請求項１４に記載の抗体。
16. 前記抗体は、ＰＬ２Ｌ６０を標的とし及び／又はＳＴＡＴ３及びＢＣＬ２を阻害する治療用抗体であることを特徴とする請求項１０−１２のいずれかに記載の抗体。
17. 前記抗体のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示される配列、及び／又は、複数のアミノ酸残基の置換及び／又は欠失及び／又は添加により得られ且つＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１と同じ生物学的活性を有する派生配列を含む、ことを特徴とする請求項１０−１４のいずれかに記載の抗体。
18. ＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害することを含み、好ましくは、配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示されるＫＡＯ３モノクローナル抗体でＰＩＷＩＬ２遺伝子の異常発現を阻害し、
    前記腫瘍は、乳癌、肺癌、肝癌、膀胱癌、子宮頸部癌、前立腺癌、胃癌、白血病、結腸直腸癌、結腸癌、卵巣癌及び精巣生殖細胞腫瘍のうちのいずれか１種を含む、ことを特徴とする腫瘍治療方法。

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