CN110036033A - 嵌合吞噬受体分子 - Google Patents

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Abstract

本公开内容涉及嵌合吞噬受体分子，经修饰以包含吞噬细胞的吞噬分子的宿主细胞，以及制备和使用此类受体分子和经修饰的细胞的方法。

Description

嵌合吞噬受体分子
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本形式提供以替代纸质副本，并且通过引用在此并入本说明书。包含序列表的文本文件名为200265_401WO_SEQUENCE_LISTING.txt。该文本文件为275KB，于2017年9月26日创建，并通过EFS-Web以电子形式提交。
背景技术
吞噬作用有两种基本类型，其受靶点、细胞类型和周围环境的影响。抗微生物吞噬作用清除和降解引起疾病的微生物，通过细胞因子和趋化因子分泌诱导促炎信号传导，并募集免疫细胞以产生有效的炎性应答。通常将这种类型的吞噬作用称为“炎性吞噬作用”(或“免疫原性吞噬作用”)。然而，在一些情况下(如某些持续感染)，抗炎性应答可能出现在微生物摄入之后。抗微生物吞噬作用通常由专门的髓系吞噬细胞(如未成熟的树突状细胞(DC)和巨噬细胞)以及由组织驻留免疫细胞进行。
相反的是，受损的、自身来源的凋亡细胞或细胞碎片的吞噬作用(例如，胞葬作用)通常是非炎性(也称为“非免疫原性”)过程。每天数十亿受损、濒死和不需要的细胞都会发生凋亡。不需要的细胞包括例如在发育过程中产生的过量细胞、衰老细胞、受感染的细胞(胞内细菌或病毒)、转化细胞或恶性细胞以及被细胞毒剂不可逆损伤的细胞。吞噬细胞对凋亡细胞执行特异性的迅速清除，但不会对周围组织造成损伤或诱导促炎性免疫应答。凋亡细胞清除的步骤包括：(1)从凋亡细胞释放“来找我”的信号以便向凋亡细胞的位置募集吞噬细胞；(2)暴露于凋亡细胞表面上的“吃掉我”的信号被吞噬细胞通过特异性受体所结合；(3)细胞骨架重排以吞噬凋亡细胞；以及(4)消化摄入的凋亡细胞并激发特异性吞噬应答(例如，分泌抗炎性细胞因子)。
对治疗感染、炎性疾病、免疫疾病和各种癌症的新组合物和方法存在持续的需求。本申请公开的方法和组合物通过在治疗各种癌症、急性和慢性感染、炎症、免疫和选定的神经系统疾病中增强从机体去除感染、转化、恶性、凋亡、受损或坏死的细胞或颗粒来满足这些需求。
发明内容
本申请描述了嵌合吞噬受体。在某些实施方式中，嵌合吞噬受体(单数为“CER”和复数为“CERs”)包含胞外域、跨膜结构域和胞内吞噬信号传导结构域。跨膜结构域位于胞外域和吞噬信号传导结构域之间并将这两者连接在一起。胞外域包含结合结构域和位于结合结构域和跨膜结构域之间并将这两者连接在一起的可选的胞外间隔区结构域。在某些实施方式中，本申请所述的嵌合吞噬受体是嵌合蛋白，其具有：(a)靶向促吞噬标记物或与疾病、病症、病况或感染相关的靶抗原的胞外域，(b)跨膜结构域和(c)吞噬信号传导结构域。在某些实施方式中，吞噬信号传导结构域包含稳态吞噬结构域和促炎性吞噬结构域的至少一种。在一些实施方式中，吞噬信号传导结构域包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域。在特定实施方式中，嵌合吞噬受体是单链嵌合蛋白。可以对嵌合吞噬受体进行设计以产生对靶细胞/器官/组织/区域的炎性应答。虽然凋亡细胞清除通常是非炎性过程，但是在某些情况下炎症对宿主可能是有利的，例如在清除凋亡肿瘤细胞以诱导对残留肿瘤细胞的免疫应答的情况下。
在一些实施方式中，CER的胞外域包含对促吞噬标记物具有特异性的结合结构域。在某些此类实施方式中，胞外域包含磷脂酰丝氨酸(PtdSer)结合结构域。在本申请所述CER的实施方式中，PtdSer结合结构域可以包含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域1(Tim1)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域4(Tim4)或T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(Tim3)的胞外域的全部或一部分。在其他实施方式中，PtdSer结合结构域可以包含来自FA58C2、GAS6、蛋白S、因子VII、因子IX、因子X或凝血酶原PS的结合结构域的全部或一部分。
在进一步的实施方式中，胞外域与靶抗原结合。在某些此类实施方式中，胞外域包含Fc受体(FcR)胞外域的全部或一部分，例如FcGR1、FcGR2A、FcGR2B2、FcGR2C、FcGR3A、FcεR1和FcαR1。在其中胞外域结合靶抗原的其他实施方式中，胞外域可以包含抗体或其抗原结合结构域。例如，胞外域可以包含选自胞内抗体、肽抗体、纳米抗体、单域抗体、SMIP和多特异性抗体的抗体或抗原结合结构域。在某些此类实施方式中，胞外域包含Fab结合结构域。在其他此类实施方式中，胞外域包含scFv。
在CER的胞外域与促吞噬标记物或靶抗原结合后，CER的吞噬信号传导结构域刺激吞噬信号传导的活性。因此，激活后，包含在CER中的吞噬信号传导结构域转导引导宿主细胞吞噬的效应功能信号。在某些实施方式中，CER的吞噬信号传导结构域包含稳态吞噬信号传导结构域。稳态吞噬信号传导结构域的实例包括MRC1、ItgB5、MERTK、Tyro3和Axl信号传导结构域。在其他实施方式中，吞噬信号传导结构域包含促炎性吞噬信号传导结构域。促炎性吞噬信号传导结构域的实例包括Traf6、Syk、MyD88、Zap70、FcγR1、FcγR2A、FcγR2B2、FcγR2C、FcγR3A、FcεR1、FcαR1、BAFF-R、NFAM1、DAP12和CD79b信号传导结构域。在另外的实施方式中，吞噬信号传导结构域包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域。在此类实施方式中，主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域可以独立地选自稳态和促炎性吞噬信号传导结构域，包括本申请所述的那些。
在进一步的方面中，本公开内容涉及基因修饰以表达CER的细胞。在特定的实施方式中，单一的、天然存在的受体蛋白未显示出CER赋予的吞噬表型。在其他实施方式中，根据本说明书的CER赋予了未天然显示出吞噬活性的细胞吞噬表型。在某些实施方式中，对细胞进行基因修饰以使其表达靶向与死亡、濒死、损伤、感染或坏死的细胞相关的促吞噬标记物的CER。在其他实施方式中，对细胞进行基因修饰以表达靶向与感染性微生物或感染性颗粒诱导的分子相关的标记物(如抗体)的CER。在此类实施方式中，通过与靶向的感染性微生物或由感染性颗粒诱导的靶向分子相关的标记物的CER结合后，基因修饰的细胞促进靶向的细胞或微生物的清除或降解。在其他特定的实施方式中，对细胞进行基因修饰以表达靶向通常不引发吞噬的抗原标记物的CER。例如，在此类实施方式中，CER的胞外域可以包含抗体或抗体的抗原结合部分，如对抗原标记物具有特异性的Fab结合结构域或scFv。在某些此类实施方式中，抗原标记物可以是与疾病、病症或其他不良病况相关的异常细胞的表面蛋白、糖蛋白或糖脂特征。在此类实施方式中，通过CER与抗原标记物结合后，经基因修饰的细胞促进异常细胞的清除或降解。
在进一步的实施方式中，还可以对经CER修饰的细胞进行进一步修饰以共表达小GTPase。可以使用编码CER和小GTPase这两者的载体将小GTPase引入经CER修饰的细胞。或者，可以使用与引入CER所使用的载体分开的载体将小GTPase引入已经是或将是经CER修饰细胞的细胞中。
在更进一步的方面中，本公开内容涉及一种治疗患有疾病、病症或不良病况的对象的方法。这些方法的实施方式包括向对象施用治疗有效量的包含一种或多种CER的药物组合物或者经基因修饰以表达一种或多种根据本发明所述的CER的细胞群。
在其他方面中，本公开内容提供了改变宿主细胞的吞噬表型的方法。在某些实施方式中，此类方法包括以下一种或多种：通过在天然不显示吞噬表型的宿主细胞中引入并表达CER生产表达吞噬表型的细胞群的方法；通过在宿主细胞中引入并表达CER改变细胞群的吞噬表型的方法，其中CER赋予对宿主细胞天然不靶向的促吞噬标记物或抗原标记物具有特异性的吞噬表型；以及通过在宿主细胞中引入并表达CER增强细胞群的吞噬表型的方法，其中CER对宿主细胞天然靶向的促吞噬标记物或抗原标记物具有特异性并且宿主细胞表达CER增强了宿主细胞对显示出被靶向的促炎性或抗原标记物的细胞、微生物或颗粒的吞噬作用。
附图说明
图1A-1D显示了嵌合吞噬受体(CER)的示意图。图1A显示了具有对磷脂酰丝氨酸具有特异性的胞外域(Tim4和scFv)并且包含单一吞噬信号传导结构域的两个示例性CER。图1B显示了具有对磷脂酰丝氨酸具有特异性的结合结构域(Tim4和scFv)并且包含含有主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域的吞噬信号传导结构域的两个示例性CER。将辅助或次要吞噬信号传导结构域整合至CER可以增强吞噬应答，即使在不表达针对辅助受体的配体的情况下也是如此。图1C显示了具有包含Fab或FcR的胞外域并且包含单一吞噬信号传导结构域的两个示例性CER。图1D显示了具有包含Fab或FcR的胞外域并且包含含有主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域的吞噬信号传导结构域的两个示例性CER。“TMD”＝跨膜结构域。
图2A和2B显示了示例性CER载体。图2A中所示的CER载体包含单一吞噬信号传导结构域。图2B中所示的CER载体包含含有主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域的吞噬信号传导结构域。“ECD”＝胞外域。
图3A和3B显示了对天然淋巴细胞和具有本公开内容的CER修饰的淋巴细胞的比较。图3A显示了内源性淋巴细胞。图3B显示了具有本公开内容的CER修饰的淋巴细胞。
图4显示了施用本公开内容的CER的示例性方法。
图5A–5C显示了示例性的治疗时间线。图5A显示了使用具有CER修饰的细胞治疗的治疗方案。图5B显示了与非吞噬性T细胞免疫疗法组合使用的CER-修饰细胞的治疗方案。图5C显示了与单克隆抗体、常规化疗或放疗组合使用的CER-修饰细胞的治疗方案。
图6A-6F显示了Tim4-MERTK嵌合吞噬受体(CER)介导的凋亡靶细胞的体外吞噬作用。图6A显示了Tim4-MERTK CER的示意图。ECD＝胞外域；TMD＝跨膜结构域；ESD＝吞噬信号传导结构域。图6B显示了使用pMSCV逆转录病毒载体转导的小鼠Ba/F3B-细胞的荧光活化细胞分选(FACS)图，所述pMSCV逆转录病毒载体包含编码图6A的Tim4-MERTK CER的核苷酸序列和编码绿色荧光蛋白(GFP)的核苷酸序列。通过使用流式细胞术利用针对绿色荧光蛋白标记物和Tim4的染色分选阳性Ba/F3B-细胞转导物，表明在Ba/F3B-细胞的细胞膜上存在Tim4-MERTK CER。图6C显示了通过FACS定量的，在孵育后2小时和24小时，表达Tim4-MERTK嵌合吞噬受体的Ba/F3B-细胞对凋亡的原代胸腺细胞吞噬作用的条形图。使用含有编码Tim4和GFP的核苷酸序列的pMSCV转导的BA/F3B-细胞作为阴性对照。图6D显示了说明Tim4-MERTK CER表面表达的量以及靶细胞孵育持续时间与凋亡的原代胸腺细胞吞噬作用之间的相关性的线图。图6E显示了来自荧光显微镜的图像，其显示了表达Tim4-MERTK CER的细胞吞噬pHrodo Red染料染色的凋亡原代胸腺细胞。黄色三角表示吞噬溶酶体内的凋亡原代胸腺细胞；白色方块表示未吞噬凋亡原代胸腺细胞的低强度染色。图6F显示了pHrodo Red和Tim4-MERTK CER表达双阳性Ba/F3细胞的FACS和直方图，证明了体外吞噬作用。
图7A-7B显示了Tim4-MERTK嵌合吞噬受体(CER)介导的凋亡靶细胞的吞噬。图7A显示了在孵育12小时和48小时时Tim4-MERTK CER-介导的靶向凋亡胸腺细胞的清除的延时图像。超过95％的靶细胞在4天内被消除。在表达Tim4的对照Ba/F3细胞存在的情况下(下图)(白色箭头指向胸腺细胞)，持续存在凋亡胸腺细胞的图。图7B显示了对对照(表达Tim4的Ba/F3细胞)和表达Tim4-MERTK CER的Ba/F3细胞样品中每个高倍镜显微视野中存在的胸腺细胞数进行定量的线图。图7B表明凋亡胸腺细胞被表达Tim4-MERTK CER的淋巴细胞基本上完全消除。
图8A-8C显示了Tim4-MERTK嵌合吞噬受体介导的Raji Burkitt淋巴瘤细胞的清除。图8A显示了pHrodo Red和Tim4-MERTK CER表达双阳性的Ba/F3细胞的FACS图，证明了体外吞噬作用，以及图8B显示了与表达Tim4的对照Ba/F3B-细胞相比，表达Tim4-MERTK CER的Ba/F3B-细胞对Raji Burkitt淋巴瘤细胞吞噬作用的条形图。图8C显示了Tim4-MERTK CER-介导的Raji Burkitt淋巴瘤细胞清除的荧光显微照片。
图9A-9F显示了FA58C2-MERTK嵌合吞噬受体(CER)介导的凋亡靶细胞的体外吞噬作用。图9A显示了FA58C2-MERTK CER的示意图。图9B显示了通过FACS定量的孵育后2小时和24小时，表达FA58C2-MERTK CER的Ba/F3B-细胞对凋亡原代胸腺细胞的吞噬作用。将使用含有编码Tim4和GFP的核苷酸序列的pMSCV转导的BA/F3B-细胞作为阴性对照。图9C显示了说明FA58C2-MERTK CER表面表达的量以及靶细胞孵育持续时间与凋亡的原代胸腺细胞吞噬作用之间的相关性的线图。图9D显示了来自荧光显微镜的图像，其显示了表达FA58C3-MERTK CER的细胞吞噬pHrodo Red染料染色的凋亡原代胸腺细胞。黄色三角表示吞噬溶酶体内的凋亡原代胸腺细胞。图9E显示了FACS的图并且图9F显示了pHrodo Red和FA58C2-MERTK CER表达双阳性Ba/F3细胞的直方图，证明了体外吞噬作用。
图10A-10E显示了小GTPase Rac1增强CER介导的吞噬作用。图10A显示了由P2A序列分隔的FA58C2-MERTK CER和Rac1或Rab5的双顺反子逆转录病毒表达盒(上图)和所得到的共表达的FA58C2-MERTK CER和GTPase(Rac1)(下图)的示意图。图10B显示了在表达FA58C2-MERTK CER或FA58C2-MERTK CER+Rac1的Ba/F3B-细胞中孵育24小时时，FA58C2-MERTK CER表面表达的量与凋亡原代胸腺细胞的吞噬作用的相关性的线图。图10C显示了来自荧光显微镜的图像，其显示了表达FA58C3-MERTK CER+Rac1的细胞吞噬pHrodo Red染料染色的凋亡原代胸腺细胞。图10D显示了FACS的图并且图10E显示了pHrodo Red和FA58C2-MERTK CER+Rac1表达双阳性Ba/F3细胞的直方图，证明了体外吞噬作用。
图11A-11E显示了FA58C2-Syk CER-介导的靶凋亡细胞的体外吞噬作用。图11A显示了FA58C2-Syk CER的逆转录病毒表达盒和由P2A序列分隔的FA58C2-Syk CER和小GTPaseRac1的双顺反子逆转录病毒表达盒(上图)以及所得到的共表达的FA58C2-Syk CER和Rac1(下图)的示意图。图11B显示了通过FACS定量的孵育后2小时和24小时，表达FA58C2-SykCER或FA58C2-Syk CER+Rac1的Ba/F3B-细胞对凋亡原代胸腺细胞的吞噬作用的条形图。将使用含有编码Tim4和绿色荧光蛋白的核苷酸序列的pMSCV转导的BA/F3B-细胞作为阴性对照。图11C显示了在表达FA58C2-Syk CER或FA58C2-Syk CER+Rac1的Ba/F3B-细胞中孵育24小时，FA58C2-Syk CER表面表达的量与凋亡原代胸腺细胞的吞噬作用的相关性的线图。加入小GTPase Rac1增强吞噬作用。图11D显示了表达FA58C3-Syk CER+Rac1的细胞吞噬pHrodo Red染料染色的凋亡原代胸腺细胞的荧光显微图像。黄色三角表示吞噬溶酶体内的凋亡原代胸腺细胞。图11E显示了pHrodo Red和FA58C2-Syk CER+Rac1表达双阳性Ba/F3细胞的FACS的图，证明了体外吞噬作用。
图12A-12D显示了小GTPase Rab5的共表达增强CER介导的吞噬作用。图12A显示了由P2A序列分隔的FA58C2-Syk CER和小GTPase Rab5的双顺反子逆转录病毒表达盒(上图)和所得到的共表达的FA58C2-Syk CER和Rab5(下图)的示意图。图12B显示了通过FACS定量的孵育后2小时，表达FA58C2-Syk CER-或FA58C2-Syk CER+Rab5的Ba/F3B-细胞对凋亡原代胸腺细胞的吞噬作用的条形图。将使用含有编码Tim4和GFP的核苷酸序列的pMSCV转导的BA/F3B-细胞作为阴性对照。图12C显示了表达FA58C3-Syk CER+Rab5的细胞吞噬pHrodoRed染料染色的凋亡原代胸腺细胞的荧光显微图像。图12D显示了pHrodo Red以及FA58C2-Syk CER表达双阳性Ba/F3细胞(左图)、FA58C2-Syk CER+Rab5表达Ba/F3细胞(中图)或Tim4对照的FACS的图，证明了表达FA58C2-Syk CER细胞的体外吞噬作用(9％)以及加入Rab5增加吞噬作用(12.5％)。
图13A-13H显示了CD19-MERTK嵌合吞噬受体(CER)介导的靶B-细胞的体外吞噬。图13A显示了CD19-MERTK CER的逆转录病毒表达盒(上图)和所得到的共表达的CD19-MERTKCER(下图)的示意图。图13B显示了由P2A序列分隔的CD19-MERTK CER和小GTPase Rac1的双顺反子逆转录病毒表达盒的逆转录病毒表达盒(上图)和所得到的共表达的CD19-MERTKCER和Rac1(下图)的示意图。图13C显示了通过FACS定量的孵育后2小时和24小时表达CD19-MERTK CER-或CD19-MERTK CER+Rac1的Ba/F3B-细胞的Raji Burkitt淋巴瘤细胞吞噬作用的条形图。将使用含有编码Tim4和GFP的核苷酸序列的pMSCV转导的BA/F3B-细胞作为阴性对照。图13D显示了说明在表达CD19-MERTK CER的Ba/F3B-细胞中孵育24小时CD19-MERTKCER表面表达的量与Raji Burkitt淋巴瘤细胞吞噬作用的相关性的线图。图13E显示了来自荧光显微镜的图像，其显示了表达CD19-MERTK CER+Rac1的细胞吞噬pHrodo Red染料染色的Raji Burkitt淋巴瘤细胞。黄色三角表示吞噬溶酶体内的Raji Burkitt淋巴瘤细胞。图13F显示了pHrodo Red和CD19-MERTK CER表达双阳性Ba/F3细胞的FACS的图，证明了与RajiBurkitt淋巴瘤靶细胞孵育2小时和与Raji Burkitt淋巴瘤靶细胞孵育24小时的体外吞噬作用(图13G)。图13H显示了吞噬pHrodo Red染料染色的Raji Burkitt淋巴瘤细胞的表达CD19-MERTK CER的细胞的荧光显微镜图像。白色箭头表示吞噬事件。
图14显示了表1和2，其示出了根据本公开内容的CER的实例。
图15显示了表3，其示出了根据本公开内容的CER的实例。
图16显示了慢病毒载体的载体图谱，所述慢病毒载体包含具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的“CER01”嵌合吞噬受体。CER01包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域和MERTK信号传导结构域。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER01序列分隔。
图17A-D显示了使用CER01转导的Ba/F3小鼠细胞的FACS纯化。用生物素标记的西妥昔单抗(抗-EGFR抗体)，然后用与R-藻红蛋白缀合的链霉亲和素(SA-PE)，进行FACS在未转导的Ba/F3细胞(图17A)和使用含有CER01-T2A-EGFRt的慢病毒转导的Ba/F3小鼠B细胞(图17B)中在转导后48小时检测EGFR的表达情况。使用FACS选择表达CER+EGFRt+的细胞(图17C)并扩增用于下游测定。图17D显示了EGFRt纯化后未转导的Ba/F3对照细胞。
图18A-B显示了CER01+Ba/F3小鼠B细胞体外吞噬使用地塞米松处理的胸腺细胞。图18A显示了使用EGFRt+对照转导的Ba/F3细胞与使用地塞米松处理的胸腺细胞共培养的荧光显微镜图像；图18B显示了使用CER01转导的Ba/F3细胞与使用地塞米松处理的胸腺细胞共培养的荧光显微镜图像(白色箭头表示吞噬事件)。图18B一部分的高放大倍数图像如右侧所示。
图19A-B显示了CER01+Ba/F3效应细胞的FACS分析(图19A)以及通过测量pHrodoRed和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群定量CER01+Ba/F3小鼠B细胞对使用地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬(图19B)。
图20A-B描述了CER01+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞的吞噬指数。图20A显示了与使用地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER01+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞的吞噬细胞百分率和杂交捕获值的表。图20B显示了CER01+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞的吞噬指数的图。
图21显示了CER01+Ba/F3细胞吞噬CT26结肠癌细胞的荧光显微镜图像。白色箭头表示吞噬事件。
图22A-B–使用杂交捕捉算法在吞噬测定的荧光图像上检测CER01+Ba/F3细胞CELLTRACE Violet染色区域内的pHrodo Red染色的靶细胞的荧光。图22A显示了从CER01+Ba/F3细胞中提取的CT26靶细胞区域的杂交细胞计数的直方图，以及图22B显示了EGFRt+对照Ba/F3细胞的杂交细胞计数。面积比表示Ba/F3细胞内CT26细胞的重叠区域。
图23显示了从CER01+Ba/F3细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞中提取的CT26靶细胞区域的杂交细胞计数的散点图。面积比表示Ba/F3细胞内CT26细胞的重叠区域。
图24A-B显示了CER01+Ba/F3细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞与CT26结肠癌细胞共培养的吞噬频率(A)和吞噬指数(B)。
图25显示了A20淋巴瘤细胞被CER01+Ba/F3细胞吞噬的荧光显微镜图像。白色箭头表示吞噬事件。
图26A-B使用杂交捕捉算法在吞噬测定的荧光图像上检测CER01+Ba/F3细胞CELLTRACE Violet染色区域内的pHrodo Red染色的靶细胞的荧光。图26A显示了从CER01+Ba/F3细胞中提取的A20靶细胞区域的杂交细胞计数的直方图，以及图26B显示了EGFRt+对照Ba/F3细胞的杂交细胞计数。面积比表示Ba/F3细胞内A20细胞的重叠区域。
图27显示了从CER01+Ba/F3细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞中提取的A20靶细胞区域的杂交细胞计数的散点图。面积比表示Ba/F3细胞内A20细胞的重叠区域。
图28显示了CER01+Ba/F3细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞与A20细胞共培养的吞噬指数的图。
图29显示了WR19L T细胞淋巴瘤细胞被CER01+Ba/F3细胞吞噬的显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图30显示了WR19L细胞被CER01+Ba/F3细胞吞噬的频率的图。
图31A-B显示了CER01+人原代B细胞的转导和扩增。图31A显示了对使用CER01转导的人原代B细胞(右侧直方图)和对照B细胞(左侧直方图)的FACS分析，先使用抗-EGFR抗体，然后使用抗-Tim4Kat5-18抗体。图31B显示了扩增24小时、48小时和72小时时的纯化的CER01+B细胞。
图32A-B显示了与用截短的EGFR转染的对照人原代B细胞(图32B)相比CER01+人原代B细胞(图32A)对经星孢菌素处理的Jurkat细胞体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图33显示了通过FACS分析的CER01+人原代B细胞对经星孢菌素处理的、pHrodoRed染色的Jurkat细胞的吞噬作用。对活的CD19+、别藻蓝蛋白(APC)标记的细胞进行门控(左图)，并且将双阳性染色事件(APC和pHrodo Red)的频率定义为吞噬事件(右图)。
图34显示了经星孢菌素处理的Jurkat细胞与CER01+人原代B细胞共孵育的吞噬作用的频率图。
图35显示了CER01+人原代B细胞对经奥沙利铂和氟尿嘧啶处理的Jurkat细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图36显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:83所示的氨基酸序列的“CER08”嵌合吞噬受体。CER08包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域和Tyro3信号传导结构域。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER08序列分隔。
图37A-B显示了在经地塞米松处理、pHrodo Red染色的胸腺细胞与CELLTRACEViolet染色CER08+小鼠Ba/F3细胞的共培养中，经CER08+修饰的活Ba/F3细胞(图37A)和表示吞噬作用频率的pHrodo red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群(图37B)的FACS图。
图38显示了与EGFRt+Ba/F3对照细胞(上面的照片)相比CER08+Ba/F3细胞(下面的照片)对经地塞米松处理的胸腺细胞吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
图39A-B显示了CER08+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞的吞噬指数。图39A显示了与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER08+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞吞噬细胞百分比值和杂交捕获值的表。图39B显示了CER08+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞吞噬指数的图。
图40显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:84所示的氨基酸序列的“CER09”嵌合吞噬受体。CER09包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域和DAP12信号传导结构域。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER09序列分隔。
图41A-B显示了在经地塞米松处理pHrodo Red染色的胸腺细胞与CELLTRACEViolet染色CER09+小鼠Ba/F3细胞的共培养中，经CER09+修饰的活Ba/F3细胞(图41A)和表示吞噬作用频率的pHrodo red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群(图42B)的FACS图。
图42A-B显示了与EGFRt+Ba/F3对照细胞(图42A)相比CER09+Ba/F3细胞(图42B)对经地塞米松处理的胸腺细胞吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
图43A-B显示了CER09+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞的吞噬指数。图43A显示了与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER09+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞吞噬细胞百分比值和杂交捕获值的表。图43B显示了CER09+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞吞噬指数的图。
图44A-B显示了CER09+Ba/F3细胞(图44A)和EGFRt+对照Ba/F3细胞(图44B)对经星孢菌素处理的CT26结肠癌细胞体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图45显示了从CER09+Ba/F3细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞中提取的CT26靶细胞区域的杂交细胞计数的散点图。面积比表示Ba/F3细胞内CT26细胞的面积。
图46显示了与经星孢菌素处理的CT26细胞共同孵育的CER09+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞的吞噬指数。
图47显示了CER09+Ba/F3细胞对经星孢菌素处理的W19L淋巴瘤细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图48显示了CER09+Ba/F3细胞对经星孢菌素处理的A20淋巴瘤细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图49A-B显示了CER09+人原代B细胞的转导和扩增。图49A显示了使用CER09转导的人原代B细胞(右侧直方图)和对照B细胞(左侧直方图)的FACS分析，先使用抗-EGFR抗体，然后使用抗-Tim4Kat5-18抗体。图49B显示了扩增24小时、48小时和72小时时的纯化的CER09+B细胞。
图50显示了通过FACS分析的CER09+人原代B细胞对经星孢菌素处理的、pHrodoRed染色的Jurkat细胞的吞噬作用。对活的CD19+、别藻蓝蛋白(APC)标记的细胞进行门控(左图)，并且将双阳性染色事件(APC和pHrodo Red)的频率定义为吞噬事件(右图)。
图51显示了CER09+人原代B细胞或对照EGFRt+人原代B细胞对经星孢菌素处理的Jurkat细胞的吞噬作用的频率图。
图52显示了CER09+人原代B细胞(左侧照片)或EGFRt+人原代B细胞(右侧照片)对经星孢菌素处理的Jurkat细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图53显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列的“CER10”嵌合吞噬受体。CER10包含Tim4结合结构域、Dap12跨膜结构域和DAP12信号传导结构域。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒P2A序列与CER10序列分隔。
图54A-B显示了CER10+Ba/F3效应细胞的FACS分析(图54A)以及通过测量pHrodoRed和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群定量CER10+Ba/F3小鼠B细胞对使用地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬(图54B)。
图55A-B显示了CER10+Ba/F3细胞(图55B)或对照EGFRt+Ba/F3细胞(图55A)对经地塞米松处理的胸腺细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
图56A-B显示了CER10+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞的吞噬指数。图56A显示了与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER10+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞吞噬细胞百分比值和杂交捕获值的表。图56B显示了CER10+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞吞噬指数的图。
图57显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:87所示的氨基酸序列的“CER11”嵌合吞噬受体。CER11包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域和Axl信号传导结构域。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER11序列分隔。
图58A-B显示了CER11+Ba/F3效应细胞的FACS分析(图58A)以及通过测量pHrodoRed和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群定量CER11+Ba/F3小鼠B细胞对使用地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬(图58B)。
图59A-B显示了CER11+Ba/F3细胞(图59B)或对照EGFRt+Ba/F3细胞(图59A)对经地塞米松处理的胸腺细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
图60A-B显示了CER11+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞的吞噬指数。图60A显示了与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER11+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞吞噬细胞百分比值和杂交捕获值的表。图60B显示了CER11+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞吞噬指数的图。
图61A-B显示了CER11+Ba/F3细胞(左侧照片)或对照EGFRt+Ba/F3细胞(右侧照片)对经星孢菌素处理的CT26结肠癌细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图62显示了从CER11+Ba/F3细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞中提取的CT26靶细胞区域的杂交细胞计数的散点图。面积比表示Ba/F3细胞内CT26细胞的面积。
图63显示了表示CER11+Ba/F3对WR19L细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图64A-B显示了CER11+Ba/F3效应细胞的FACS分析(图64A)以及通过测量pHrodoRed和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群定量CER10+Ba/F3小鼠B细胞对WR19L淋巴瘤细胞的吞噬(图64B)。
图65A-B显示了CER11+Ba/F3细胞(左侧照片)或对照EGFRt+Ba/F3细胞(右侧照片)对经星孢菌素处理的A20淋巴瘤细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图66显示了与经星孢菌素处理的A20细胞共培养的CER11+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞的吞噬指数。
图67显示了CER11+人原代B细胞(左侧照片)或对照EGFRt+人原代B细胞(右侧照片)对经奥沙利铂和氟尿嘧啶处理的Jurkat细胞体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图68显示了CER11+人原代B细胞对经吉西他滨处理的COLO320HSR结肠癌细胞体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图69显示了CER11+人原代B细胞对经紫杉醇处理的A204横纹肌肉瘤细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。箭头表示吞噬事件。
图70显示了CER11+人原代B细胞对经紫杉醇或紫杉醇+吉西他滨处理的H1703非小细胞肺癌细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。箭头表示吞噬事件。
图71显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:90所示的氨基酸序列的“CER12”嵌合吞噬受体。CER12包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域和FcεRIγ信号传导结构域。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER12序列分隔。
图72A-B显示了CER12+Ba/F3效应细胞的FACS分析(图72A)以及通过测量pHrodoRed和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群定量CER12+Ba/F3小鼠B细胞对胸腺细胞的吞噬(图72B)。
图73A-B显示了CER12+Ba/F3细胞(图73B)或对照EGFRt+Ba/F3细胞(图73A)对地塞米松处理的胸腺细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
图74A-B显示了CER12+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞的吞噬指数。图74A显示了与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER12+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞吞噬细胞百分比值和杂交捕获值的表。图74B显示了CER12+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞吞噬指数的图。
图75显示了CER12+Ba/F3细胞对经星孢菌素处理的WR19L淋巴细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图76显示了CER12+Ba/F3细胞对经星孢菌素处理的A20淋巴瘤细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图77显示了与经星孢菌素处理的A20细胞共同孵育的CER12+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞的吞噬指数。
图78显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:91所示的氨基酸序列的“CER13”嵌合吞噬受体。CER13包含Tim4结合结构域、FcεRIγ跨膜结构域和FcεRIγ信号传导结构域。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER13序列分隔。
图79A-B显示了CER13+Ba/F3效应细胞的FACS分析(图79A)以及通过测量pHrodoRed和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群定量CER13+Ba/F3小鼠B细胞对胸腺细胞的吞噬(图79B)。
图80显示了CER13+人原代B细胞对经紫杉醇和吉西他滨处理的Colo320HSR结肠癌细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。箭头表示吞噬事件。
图81显示了CER13+人原代B细胞对经紫杉醇处理的A204横纹肌肉瘤细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。箭头表示吞噬事件。
图82显示了CER13+人原代B细胞对经紫杉醇和吉西他滨处理的Colo320HSR结肠癌细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。箭头表示吞噬事件。
图83显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:79所示的氨基酸序列的“CER15”嵌合吞噬受体。CER15包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域和截短的MyD88信号传导结构域。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER15序列分隔。
图84A-B显示了CER15+Ba/F3效应细胞的FACS分析(图84A)以及通过测量pHrodoRed和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群定量CER15+Ba/F3小鼠B细胞对胸腺细胞的吞噬(图84B)。
图85A-B显示了CER15+Ba/F3细胞(图85B)或对照EGFRt+Ba/F3细胞(图85A)对经地塞米松处理的胸腺细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
图86A-B显示了CER15+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞的吞噬指数。图86A显示了与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER15+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞吞噬细胞百分比值和杂交捕获值的表。图86B显示了CER15+细胞或EGFRt+对照Ba/F3细胞吞噬指数的图。
图87显示了CER15+Ba/F3细胞对经星孢菌素处理的CT26结肠癌细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图88显示了CER15+Ba/F3细胞对经星孢菌素处理的WR19L淋巴瘤细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图89显示了CER15+Ba/F3细胞对经星孢菌素处理的A20淋巴瘤细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图90A-B显示了CER15+人原代B细胞的转导和扩增。图90A显示了对使用CER15转导的人原代B细胞(右侧直方图)和对照B细胞(左侧直方图)的FACS分析，先使用抗-EGFR抗体，然后使用抗-Tim4Kat5-18抗体。图90B显示了扩增24小时、48小时和72小时时的纯化的CER15+B细胞。
图91显示了通过FACS分析的CER15+人原代B细胞对经星孢菌素处理的、pHrodoRed染色的Jurkat细胞的吞噬作用。对活的CD19+、别藻蓝蛋白(APC)标记的细胞进行门控(左图)，并且将双阳性染色事件(APC和pHrodo Red)的频率定义为吞噬事件(右图)。
图92显示了与使用截短的EGFR转导的对照人原代B细胞相比，与经星孢菌素处理的Jurkat细胞共同孵育的CER15+人原代B细胞吞噬作用频率的图。
图93A-B显示了与使用截短的EGFR转导的对照人原代B细胞(图93B)相比，CER15+人原代B细胞(图93A)对经星孢菌素处理的Jurkat细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图94显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:80所示的氨基酸序列的“CER16”嵌合吞噬受体。CER16包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域和MyD88信号传导结构域。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER16序列分隔。
图95显示了CER16+人原代B细胞对经奥沙利铂和氟尿嘧啶处理的Jurkat细胞的体外吞噬作用的荧光显微图像。白色箭头表示吞噬事件。
图96显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:93所示的氨基酸序列的“CER25”嵌合吞噬受体。CER25包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域和NFAM1信号传导结构域。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER25序列分隔。
图97A-B显示了与使用截短的EGFR转导的对照Ba/F3细胞(图97A)相比，通过测量pHrodo Red和CELLTRACE Violet染色双阳性的细胞群确定的CER25+Ba/F3小鼠B细胞(图97B)对经地塞米松处理的胸腺细胞吞噬作用的FACS定量。
图98显示了与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER25+Ba/F3细胞体外吞噬作用的荧光显微图像。右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。白色箭头表示吞噬事件。
图99显示了与使用截短的EGFR转导的Ba/F3细胞相比，与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER25+Ba/F3细胞吞噬指数的图。
图100显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:95所示的氨基酸序列的“CER85”嵌合吞噬受体。CER85包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域、主要吞噬信号传导结构域(截短的MyD88信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(BAFFR信号传导结构域)。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER85序列分隔。
图101A-B显示了与使用截短的EGFR转导的对照Ba/F3细胞(图101B)相比，通过测量pHrodo Red和CELLTRACE Violet染色双阳性的细胞群确定的CER85+Ba/F3小鼠B细胞(图101A)对经地塞米松处理的胸腺细胞吞噬作用的FACS定量。
图102显示了与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER85+Ba/F3细胞体外吞噬作用的荧光显微图像。右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。白色箭头表示吞噬事件。
图103显示了与使用截短的EGFR转导的Ba/F3细胞相比，与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER85+Ba/F3细胞吞噬指数的图。
图104显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:96所示的氨基酸序列的“CER86”嵌合吞噬受体。CER86包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域、主要吞噬信号传导结构域(截短的MyD88信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(DAP12信号传导结构域)。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER86序列分隔。
图105显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:130所示的氨基酸序列的“CER87”嵌合吞噬受体。CER87包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域、主要吞噬信号传导结构域(BAFFR信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(截短的MyD88信号传导结构域)。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER87序列分隔。
图106A-B显示了与使用截短的EGFR转导的对照Ba/F3细胞(图106B)相比，通过测量pHrodo Red和CELLTRACE Violet染色双阳性的细胞群确定的CER87+Ba/F3小鼠B细胞(图106A)对经地塞米松处理的胸腺细胞吞噬作用的FACS定量。
图107显示了与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER87+Ba/F3细胞体外吞噬作用的荧光显微图像。右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。白色箭头表示吞噬事件。
图108显示了与使用截短的EGFR转导的Ba/F3细胞相比，与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER87+Ba/F3细胞吞噬指数的图。
图109显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:131所示的氨基酸序列的“CER88”嵌合吞噬受体。CER88包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域、主要吞噬信号传导结构域(DAP12信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(截短的MyD88信号传导结构域)。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER88序列分隔。
图110显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:98所示的氨基酸序列的“CER89”嵌合吞噬受体。CER89包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域、主要吞噬信号传导结构域(截短的MyD88信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(CD79b信号传导结构域)。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER89序列分隔。
图111显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:100所示的氨基酸序列的“CER90”嵌合吞噬受体。CER90包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域、主要吞噬信号传导结构域(截短的MyD88信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(NFAM1信号传导结构域)。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER90序列分隔。
图112显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:105所示的氨基酸序列的“CER91”嵌合吞噬受体。CER91包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域、主要吞噬信号传导结构域(截短的MyD88信号传导结构域)、通过病毒T2A序列与CER序列分隔的编码Rab5a的序列，以及编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与Rab5a序列分隔。
图113A-B显示了与使用截短的EGFR转导的对照Ba/F3细胞(图113B)相比，通过测量pHrodo Red和CELLTRACE Violet染色双阳性的细胞群确定的CER91+Ba/F3小鼠B细胞(图113A)对经地塞米松处理的胸腺细胞吞噬作用的FACS定量。
图114显示了与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER91+Ba/F3细胞体外吞噬作用的荧光显微图像。右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。白色箭头表示吞噬事件。
图115显示了与使用截短的EGFR转导的对照Ba/F3细胞相比，与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER91+Ba/F3细胞吞噬指数的图。
图116显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:133所示的氨基酸序列的“CER92”嵌合吞噬受体。CER92包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域、主要吞噬信号传导结构域(MERTK信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(截短的MyD88信号传导结构域)。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER92序列分隔。
图117A-B显示了与使用截短的EGFR转导的对照Ba/F3细胞(图117B)相比，通过测量pHrodo Red和CELLTRACE Violet染色双阳性的细胞群确定的CER92+Ba/F3小鼠B细胞(图117A)对经地塞米松处理的胸腺细胞吞噬作用的FACS定量。
图118显示了与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER92+Ba/F3细胞体外吞噬作用的荧光显微图像。右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。白色箭头表示吞噬事件。
图119显示了与使用截短的EGFR转导的对照Ba/F3细胞相比，与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER92+Ba/F3细胞吞噬指数的图。
图120显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:103所示的氨基酸序列的“CER93”嵌合吞噬受体。CER93包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域、主要吞噬信号传导结构域(MERTK信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(BAFFR信号传导结构域)。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER93序列分隔。
图121A-B显示了与使用截短的EGFR转导的对照Ba/F3细胞(图121B)相比，通过测量pHrodo Red和CELLTRACE Violet染色双阳性的细胞群确定的CER93+Ba/F3小鼠B细胞(图121A)对经地塞米松处理的胸腺细胞吞噬作用的FACS定量。
图122显示了与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER93+Ba/F3细胞体外吞噬作用的荧光显微图像。右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。白色箭头表示吞噬事件。
图123显示了与使用截短的EGFR转导的对照Ba/F3细胞相比，与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER93+Ba/F3细胞吞噬指数的图。
图124显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:134所示的氨基酸序列的“CER94”嵌合吞噬受体。CER94包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域、主要吞噬信号传导结构域(MERTK信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(DAP12信号传导结构域)。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER94序列分隔。
图125显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:152所示的氨基酸序列的“CER97”嵌合吞噬受体。CER97包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域、主要吞噬信号传导结构域(Axl信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(DAP12信号传导结构域)。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER97序列分隔。
图126显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:153所示的氨基酸序列的“CER98”嵌合吞噬受体。CER98包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域、主要吞噬信号传导结构域(Axl信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(CD79b信号传导结构域)。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER98序列分隔。
图127显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:101所示的氨基酸序列的“CER95”嵌合吞噬受体。CER95包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域、主要吞噬信号传导结构域(MERTK信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(CD79b信号传导结构域)。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER95序列分隔。
图128显示了慢病毒载体的载体图谱，其包含具有SEQ ID NO:102所示的氨基酸序列的“CER96”嵌合吞噬受体。CER96包含Tim4结合结构域、Tim4跨膜结构域、主要吞噬信号传导结构域(MERTK信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(NFAM1信号传导结构域)。慢病毒载体还包含编码截短的EGFR的序列(SEQ ID NO:121)，其通过病毒T2A序列与CER96序列分隔。
图129显示了与使用截短的EGFRt转导的对照Ba/F3细胞相比，与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的多种CER+Ba/F3细胞的吞噬指数。
图130显示了与使用截短的EGFRt转导的对照Ba/F3细胞相比，与星孢菌素处理的CT26结肠癌细胞共培养的多种CER+Ba/F3细胞的吞噬指数。
图131显示了与使用截短的EGFRt转导的对照Ba/F3细胞相比，与星孢菌素处理的A20淋巴瘤细胞共培养的多种CER+Ba/F3细胞的吞噬指数。
图132A-C显示了在淋巴瘤小鼠模型中CER01(Tim4MerTk)治疗与低剂量辐射的体内协同作用。图132A显示了联合治疗方案的示例性时间轴。图132B显示了在未经治疗的小鼠、接受射线+对照T细胞的小鼠或接受射线+经CER01修饰T细胞的小鼠中测量的肿瘤尺寸。
图133A-B显示了在淋巴瘤小鼠模型中CER01(Tim4MerTk)治疗与嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法的体内协同作用。图133A显示了联合治疗方案的示例性时间轴。图133B显示了与接受抗-CD19CAR修饰的T细胞和pMSCV空逆转录病毒载体修饰的T细胞的对照小鼠相比(左侧照片)，在接受抗-CD19CAR修饰的T细胞和CER修饰的B细胞(n＝3)或T细胞(n＝2)的小鼠中CER融合后第4天肿瘤尺寸的荧光素酶成像(右侧图像)。
图134显示了示例性三联疗法的时间轴，其包括放疗、CER免疫疗法(例如，靶向表达磷脂酰丝氨酸的细胞)以及随后进行的TCR或CAR免疫疗法。
具体实施方式
本申请描述了嵌合蛋白，其包含(a)胞外域，其包含胞外结合结构域和任选地胞外间隔区结构域，(b)跨膜结构域，和(c)吞噬信号传导结构域，以及编码所述嵌合蛋白的核酸分子。此外，提供了经修饰以表达这些嵌合蛋白的细胞以及用于向需要其的对象递送此类经修饰的细胞的方法和组合物。在本申请中将所述嵌合蛋白称为“嵌合吞噬受体(chimericengulfment receptor)”或“嵌合吞噬受体(chimeric engulfment receptors)”(“CER”是单数形式和“CERs”是复数形式)。本申请所述的嵌合吞噬受体能够赋予经基因修饰以表达所述嵌合吞噬受体的宿主细胞吞噬表型。在某些此类实施方式中，如本申请所述的CER的表达赋予了未天然地显示出吞噬表型的宿主细胞吞噬表型。在其他此类实施方式中，宿主细胞表达如本申请所述的CER赋予了对宿主细胞不天然靶向的促吞噬标记物或抗原标记物具有特异性的吞噬表型。在另外其他的此类实施方式中，宿主细胞表达如本申请所述的CER赋予了对宿主细胞天然靶向的促吞噬标记物或抗原标记物具有特异性的吞噬表型，并且宿主细胞表达CER增强了宿主细胞对显示出被靶向的促吞噬或抗原标记物的细胞、微生物或颗粒的吞噬作用。
在某些实施方式中，CER靶向与凋亡、死亡、濒死、损伤、感染或坏死细胞相关的吞噬标记物。在其他实施方式中，CER靶向与感染性微生物或颗粒相关的抗体结合细胞。在另外的实施方式中，CER靶向与疾病、病症或其他不利病况相关的异常细胞或错折叠蛋白显示出的抗原标记物。
可以将根据本说明书的一种或多种CER转导至细胞并在其中表达，此类细胞如T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、淋巴前体细胞、树突细胞、朗格汉斯细胞和骨髓细胞。在某些实施方式中，除了对CER进行工程化改造以使其与特定靶分子(例如，吞噬标记物或抗原标记物)结合以外，还对CER的吞噬信号传导结构域进行选择以提供所需的吞噬活性。在一个此类实施方式中，对吞噬信号传导结构域进行选择以诱导稳态吞噬信号传导。在另一个此类实施方式中，对吞噬信号传导结构域进行选择以诱导促炎性吞噬信号传导。在又一个实施方式中，吞噬信号传导结构域包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域。主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域可以均是稳态吞噬信号传导结构域、均是促炎性吞噬信号传导结构域或者主要吞噬信号传导结构域可以是稳态吞噬信号传导结构域并且次要吞噬信号传导结构域可以是促炎性吞噬信号传导结构域(反之亦然)。
可以将经基因修饰以表达一个或多个根据本说明书的CER的宿主细胞用于特异性吞噬表达CER的胞外域结合的靶分子的靶细胞或颗粒。在某些实施方式中，所述靶细胞或颗粒可以是与感染、疾病、病症或其他不利病况相关的肿瘤细胞、癌细胞、微生物(例如，细菌、真菌、病毒)、原生动物寄生虫、异常细胞或错折叠蛋白。在进一步的实施方式中，将经基因修饰以表达一个或多个根据本说明书的CER的宿主细胞用于在对象中治疗癌症、感染性疾病(病毒、细菌、真菌、原生动物)、炎性疾病、免疫疾病(例如，自身免疫性疾病)或神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)，作为主要疗法或者作为辅助或联合疗法。可以对本公开内容的CER进行设计以通过选择稳态吞噬信号传导结构域或促炎性吞噬信号传导结构域赋予其特异性的吞噬表型(例如，稳态(非免疫原性)或促炎性(免疫原性))，其取决于靶分子和治疗适应证。不希望受到理论的束缚，可以将包含促炎性吞噬结构域的CER用于改善癌症的微环境和增强肿瘤消退。
定义
在更详细地阐述本公开内容之前，提供在本申请中使用的某些术语的定义，可能有助于理解本公开内容。
在本说明书中，除非另有说明，否则应将任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围理解为包括所述范围内的任何整数的值，并且在适当时，包括其分数(例如，整数的十分之一和百分之一)。此外，除非另有说明，否则本申请所述的与任何物理特征(如聚合物亚单元、尺寸或厚度)相关的任何数值范围均应被理解为包括在所述范围内的任何整数。如在本申请中所使用的，除非另有说明，否则术语“约”表示所示范围、值或结构的±20％。应当理解的是，如在本申请中所使用的，术语“一个(a)”和“一个(an)”指所列举组分的“一个或多个”。应将替代(例如，“或”)的使用理解为其中之一、两者都或其任意组合。如在本申请中所使用的，术语“包括”、“具有”和“包含”同义地使用，该术语及其变体其旨在被解释为是非限制性的。
除非本申请中有不同的明确定义，否则抗体技术领域的技术人员应按本领域中给出的含义理解术语。术语“抗体”以最广义使用，并且包括多克隆和单克隆抗体。“抗体”可以指完整抗体，其包含彼此之间通过二硫键连接的至少两条重链(H)和两条轻链(L)，以及具有或保持与靶分子结合能力的完整抗体的抗原结合部分(或抗原结合结构域)。抗体可以是天然存在的、重组生产的、基因工程改造的或免疫球蛋白的修饰形式，例如胞内抗体、肽体、纳米抗体、单域抗体、SMIP、多特异性抗体(例如，双特异性抗体、双体、三体、四体、串联di-scFV、串联tri-scFv、ADAPTIR)。单克隆抗体或其抗原结合部分可以是非人源的、嵌合的、人源化的或人源的，优选人源化的或人源的。在例如Harlow等编著，Antibodies:ALaboratory Manual,Chapter 14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,1988)中对免疫球蛋白的结构和功能进行了综述。完整抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合结构域”旨在包括这样的“抗体片段”：其表示完整抗体的一部分并且指完整抗体的抗原决定可变区或互补性决定区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段、Fab’-SH、F(ab’)2、双体、线形抗体、scFv抗体、VH和由抗体片段形成的多特异性抗体。“Fab”(抗原结合片段)是抗体的一部分，其与抗原结合并且包括与轻链通过链间二硫键连接的重链的可变区和CH1。抗体可以是任何类别或亚类，包括IgG及其亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgE、IgA和IgD。
术语“可变区”或“可变结构域”指参与抗体与抗原结合的抗体重链或轻链的结构域。天然抗体重链和轻链(分别为VH和VL)的可变结构域通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如，Kindt等，Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007).)。单个VH或VL结构域可以足以赋予抗原结合特异性。此外，可以通过使用与特定抗原结合的抗体的VH或VL结构域分别筛选互补性VL或VH结构域的文库，以分离与该抗原结合的抗体。参见例如，Portolano等，J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等，Nature 352:624-628(1991)。
与“高变区”或“HVR”同义的术语“互补性决定区”和“CDR”是本领域公知的，指抗体可变区内不连续的氨基酸序列，其赋予了抗原特异性和/或结合亲和性。在通常情况下，在每个重链可变区中有3个CDR(HCDR1、HCDR2、HCDR3)并且在每个轻链可变区中有3个CDR(LCDR1、LCDR2、LCDR3)。
术语“抗原”和“Ag”指激发免疫应答的分子。所激发的免疫应答可以参与抗体产生、特异性免疫活性细胞的激活或者这两者。大分子(包括蛋白、糖蛋白和糖脂)可以作为抗原。抗原可以来自重组的或基因组DNA。如本申请所考虑的，抗原不需要(i)仅由基因的全长核苷酸序列编码或者(ii)完全不需要由“基因”编码。可以产生或合成抗原，或者抗原可以来自生物样品。此类生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物体液。
术语“表位”或“抗原表位”包括抗原内的任何分子、结构、氨基酸序列或蛋白决定簇，其被同源免疫结合分子特异性结合，如抗体或其片段(例如，scFv)、T细胞受体(TCR)、嵌合吞噬受体或者其他结合分子、结构域或蛋白。表位决定簇通常含有分子的化学活性表面基团，如氨基酸或糖侧链，并且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以是线形表位或构象表位。
术语“抗肿瘤效应”指可以表现为缩小肿瘤体积、减少肿瘤细胞数、减少转移数、延长预期寿命或改善与癌症病况相关的各种生理症状的生物学效应。“抗肿瘤效应”还可以表现为防止恶性血液病或肿瘤形成。
“自身免疫性疾病”指由自身免疫应答导致的病症。自身免疫性疾病是由对自身抗原不适宜的过度应答导致的。自身免疫应答可能涉及产生自身抗体的自身反应性B细胞、自身反应性T细胞或者这两者。如在本申请中所使用的“自身抗体”是由对象产生的结合至同样由该对象产生的自身抗原的抗体。
“自体的”指来自随后将重新引入的同一对象的任何物质。
“同种异体的”指来自同一物种的不同对象的移植物。
如在本申请中所使用的，术语“结合结构域”、“结合区”和“结合部分”指具有特异性地和非共价地结合、缔合、联合(unite)、识别或组合靶分子(例如，PtdSer、IgG抗体、IgE抗体、IgA抗体、CD138、CD38、CD33、CD123、CD79b、间皮素、PSMA、BCMA、ROR1、MUC-16、L1CAM、CD22、CD19、EGFRviii、VEGFR-2或GD2)能力的分子(如肽、寡肽、多肽或蛋白)。结合结构域包括任何天然存在的、合成的、半合成或重组产生的针对目标生物分子或其他靶点的结合配偶体。在一些实施方式中，结合结构域是抗原结合结构域，如抗体或者其有功能的结合结构域或抗原结合部分。示例性结合结构域包括单链抗体可变区(例如，结构域抗体、sFv、scFv、Fab)、受体胞外域(例如，TNF-α)、配体(例如，细胞因子、趋化因子)或者因具有与生物分子的特异性结合能力而选择的合成多肽。
已知有多种测定可用于鉴定本公开中的与特定靶点特异性结合的结合结构域，以及确定结合结构域的亲和性，如Western印迹、ELISA和分析(亦参见例如，Scatchard等，Ann.N.Y.Acad.Sci.51:660,1949；和美国专利号5,283,173、5,468,614或其同等物)。如在本申请中所使用的，“特异性结合”指结合结构域或其融合蛋白以等于或大于105M-1的亲和性或Ka(即，特定结合相互作用的平衡缔合常数，单位为1/M)与靶分子缔合或联合，但是不与样品中的任何其他分子或成分显著缔合或联合。
将如在本申请中所使用的术语“癌症”定义为以异常细胞的快速和失控生长为特征的疾病。异常细胞可以形成实体瘤或构成恶性血液病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
“疾病”是一种对象的健康状况，其中对象不能维持稳态，并且其中如果疾病不能得到改善，则对象的健康继续恶化。而相反的是，对象的“病症”或“不利病况”是其中对象能够维持稳态的健康状况，但健康状况不如其没有病症或不利病况时。如果不进行治疗，病症或不利病况不一定会导致对象健康状况的进一步下降。
“微生物(microbe)”或“微生物(microorganism)”指任何种类的细菌、病毒、古细菌或真菌。
“颗粒”指直径至少100nm且至多6μm并且来自活细胞或生物体的细胞片段或小物体。颗粒可以是病毒颗粒、小矿物颗粒、细胞碎片或合成颗粒。
“编码”指特定多核苷酸序列(如DNA、cDNA和mRNA序列)的固有性质，以作为在生物加工过程中合成其他聚合物和大分子的模板，其具有确定的核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)序列或确定的氨基酸序列以及由此产生的生物性质。
因此，如果与多核苷酸对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白，则该多核苷酸编码该蛋白。编码链和非编码链均可以称为编码蛋白或其他产物的多核苷酸。
除非另有明示，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此简并并且编码相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。
如在本申请中所使用的，术语“内源性的”或“天然的”指在宿主或宿主细胞中通常存在的基因、蛋白、化合物、分子或活性。
如在本申请中所使用的，术语“吞噬”指受体介导的过程，其中直径大于100nm的内源性或外源性细胞或颗粒被本公开内容的吞噬细胞或宿主细胞内化。吞噬通常由多个步骤组成：(1)通过吞噬受体直接或间接地(通过桥接分子)与靶细胞或颗粒上的促吞噬标记物或抗原标记物结合束缚靶细胞或颗粒；以及(2)内化或吞噬整个靶细胞或颗粒或者其部分。在某些实施方式中，可以通过吞噬细胞或宿主细胞的细胞骨架重排以形成吞噬体(含有内化靶对象的膜结合小室)发生内化。吞噬还可以包括吞噬体的成熟，其中吞噬体变得酸性增加并且与溶酶体融合(以形成吞噬溶酶体)，随后吞噬的靶对象被降解(例如，“吞噬作用”)。或者，在吞噬中可能未观察到吞噬体-溶酶体融合。在又一个实施方式中，在完全降解之前，吞噬体可以将其内容物回流或排出到胞外环境中。在一些实施方式中，吞噬指吞噬作用。在一些实施方式中，吞噬包括本公开内容的宿主细胞的吞噬细胞将靶细胞或颗粒束缚，但不发生内化。在一些实施方式中，吞噬包括本公开内容的宿主细胞的吞噬细胞将靶细胞或颗粒束缚以及部分靶细胞或颗粒内化。
如在本申请中所使用的，术语“吞噬作用”指细胞或大颗粒(>0.5μm)的吞噬过程，其中发生束缚靶细胞或颗粒、吞噬所述靶细胞或颗粒以及降解内化的靶细胞或颗粒。在某些实施方式中，吞噬作用包括形成包围内化的靶细胞或颗粒的吞噬体，以及使吞噬体与溶酶体融合以形成吞噬溶酶体，其中内容物被降解。在某些实施方式中，在吞噬作用期间，在本公开内容的吞噬细胞或宿主细胞上表达的CER与由靶细胞或颗粒表达的吞噬标记物结合后，形成吞噬突触；在吞噬突触上产生富含肌动蛋白的吞噬杯；吞噬臂通过细胞骨架重排在靶细胞或颗粒周围延伸；最后，通过由马达蛋白产生的力将靶细胞或颗粒拉入吞噬细胞或宿主细胞。如在本申请中所使用的，“吞噬作用”包括“胞葬”过程，其特别地指以非炎性方式对凋亡或坏死细胞的吞噬作用。
如在本申请中所使用的，术语“促吞噬标记物”指凋亡、坏死、焦亡(pyroptotic)或受感染的细胞在其表面上显示出的分别有别于非凋亡、非坏死、非焦亡、肿瘤或非受感染的细胞的部分(例如，蛋白、脂质或多糖)。促吞噬标记物可以是在凋亡或坏死细胞上表面暴露的胞内部分，在凋亡或坏死细胞上具有改变的糖基化或改变的表面电荷的部分或者与凋亡、坏死、焦亡或肿瘤细胞结合的血清部分。凋亡细胞促吞噬标记物的实例包括磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、ICAM-3、氧化的低密度脂蛋白、钙网蛋白、膜联蛋白I、补体C1q和血小板反应蛋白。坏死、肿瘤和焦亡细胞也在细胞表面上暴露PtdSer促吞噬标记物。吞噬受体能够直接地或使用与促吞噬标记物结合的可溶性桥接分子作为中间体间接地检测(或结合)靶细胞(例如，损伤、感染、凋亡、坏死、焦亡或肿瘤细胞)上的促凋亡标记物。
“吞噬信号传导结构域”指胞内效应结构域，其在与由宿主细胞表达的CER胞外域靶向的靶分子(例如，促吞噬标记物或抗原标记物)结合后，激活在宿主细胞中导致吞噬的一个或多个信号传导通路，在特定的实施方式中包括宿主细胞的细胞骨架重排和与标记物或抗原相关的靶分子、微生物或颗粒的内化。在某些实施方式中，吞噬信号传导结构域激活导致对靶细胞、微生物或颗粒的吞噬作用的一个或多个信号传导通路。在某些实施方式中，吞噬信号传导结构域包含主要吞噬信号传导结构域。在某些其他实施方式中，吞噬信号传导结构域包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域。主要吞噬信号传导结构域可以是稳态吞噬信号传导结构域或促炎性吞噬信号传导结构域。在其中吞噬信号传导结构域包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域的实施方式中，主要吞噬信号传导结构域可以是稳态吞噬信号传导结构域或促炎性吞噬信号传导结构域。类似地，次要吞噬信号传导结构域可以选自稳态吞噬信号传导结构域或促炎性吞噬信号传导结构域。在某些实施方式中，CER包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域，其均为稳态吞噬信号传导结构域。在某些其他实施方式中，CER包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域，其均为促炎性吞噬信号传导结构域。在另外的实施方式中，CER包含主要吞噬信号传导结构域，其是稳态吞噬信号传导结构域，和次要吞噬信号传导结构域，其是促炎性吞噬信号传导结构域。在另外的实施方式中，CER包含主要吞噬信号传导结构域，其是促炎性吞噬信号传导结构域，和次要吞噬信号传导结构域，其是稳态吞噬信号传导结构域。
术语“稳态吞噬信号传导结构域”指效应结构域，其(i)刺激靶细胞、微生物或颗粒的吞噬，但不是(ii)来自通常刺激炎性或免疫原性应答的内源性受体或信号传导分子。在一些实施方式中，稳态吞噬信号传导结构域刺激宿主细胞分泌抗炎性和/或免疫抑制性细胞因子，如TGF-β和IL-10。在某些实施方式中，稳态吞噬信号的刺激抑制、减弱或消除局部组织环境中的炎症。还可以将稳态吞噬信号传导结构域称为“非炎性”吞噬信号传导结构域或“非免疫原性”吞噬信号传导结构域。
“促炎性吞噬信号传导结构域”指效应结构域，其(i)刺激靶细胞、微生物或颗粒的吞噬，并且(ii)来自内源性受体或信号传导分子，其通常刺激下述中的一种或多种：(a)宿主细胞分泌炎性细胞因子，如TNFα、IL-1、IL-6、IL-12和IL-23，(b)宿主细胞分泌炎性趋化因子，如CCL5(RANTES)、CXCL9和CXCL10，(c)细胞表面共刺激标记物的上调，如CD80、CD86、HLA-DR、CD40、HVEM和4-1BBL，以及(d)一个或多个信号传导级联(如NF-κB)的激活，其诱导、增强或补充化疗、基于抗体的免疫疗法或细胞疗法，如T细胞靶向疗法。在某些实施方式中，刺激促炎性吞噬信号传导促进局部组织环境中的炎症。还可以将促炎性吞噬信号传导结构域称为“免疫原性”吞噬信号传导结构域或“炎性”吞噬信号传导结构域。
如在本申请中所使用的，“效应结构域”是融合蛋白或受体的胞内部分，当接受适宜信号时，在表达效应结构域的细胞中其能够直接或间接地促进生物或生理应答。在某些实施方式中，效应结构域是结合时接收信号的蛋白或蛋白复合物的一部分，或者直接结合触发来自该效应结构域的信号的靶分子。例如，对CER与靶分子的结合产生应答，效应结构域可以向宿主细胞的内部传导信号，激发效应功能，例如吞噬、吞噬溶酶体成熟、分泌抗炎性和/或免疫抑制性细胞因子、分泌炎性细胞因子和/或趋化因子。当效应结构域含有一个或多个信号传导结构域或基序时，其可以直接促进细胞应答。在其他实施方式中，效应结构域将通过与一个或多个直接促进细胞应答的其他蛋白结合来间接促进细胞应答。
如在本申请中所使用的，“异源性的”、“非内源性的”或“外源性的”指不是宿主细胞或对象天然存在的任何基因、蛋白、化合物、分子或活性，或者指是宿主或宿主细胞天然存在的，但是已改变或突变以使得其结构、活性或者这两者在天然和突变分子之间存在差异的任何基因、蛋白、化合物、分子或活性。在某些实施方式中，异源的、非内源的或外源的分子(例如，受体、配体)可能对于宿主细胞或对象不是内源性的，而可以通过缀合、转化、转染、电穿孔等将编码此类分子的核酸加入宿主细胞，其中所加入的核酸分子可以整合至宿主细胞基因组或可以作为染色体外遗传物质(例如，作为质粒或其他自我复制载体)存在。术语“同源的”或“同源物”指存在于或来自宿主细胞、物种或菌株的分子或活性。例如，异源性或外源性分子或编码所述分子的基因分别对于天然宿主或宿主细胞分子或编码所述分子的基因可以是同源的，但是其可以具有改变的结构、序列、表达水平或其组合。非内源性分子可以来自相同物种、不同物种或其组合。
“连接氨基酸”或“连接氨基酸残基”指多肽相邻基序、区域或结构域之间的一个或多个(例如，约2-20个)氨基酸残基。连接氨基酸可以由嵌合蛋白的构建体设计产生(例如，在编码融合蛋白的核酸分子的构建过程中使用限制性酶位点产生的氨基酸残基)。
“核酸分子”和“多核苷酸”可以是RNA或DNA形式，其包括cDNA、基因组DNA和合成DNA。核酸分子可以是双链的或单链的，如果是单链的，可以是编码链或非编码链(反义链)。编码分子可以具有与本领域公知的编码序列相同的编码序列，或者可以具有不同的编码序列，但是由于遗传密码的冗余性或简并性其能够编码相同多肽。
术语抗原“过表达的”或“过表达”指在细胞中异常高水平的抗原表达。过表达的抗原或抗原过表达通常与疾病状态相关，如在恶性血液病和在对象的特定组织或器官内形成实体瘤的细胞中。可以通过本领域公知的标准测定确定由肿瘤抗原过表达表征的实体瘤或恶性血液病。
如在本申请中所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可以互换使用，指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白或肽必需含有至少2个氨基酸，并且对可构成蛋白或肽序列的氨基酸的最大数量没有限制。多肽包括含有彼此之间通过肽键连接在一起的两个或多个氨基酸的任何肽或蛋白。如在本申请中所使用的，该术语既指短链又指更长的链，短链在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚物，更长的链在本领域中通常称为蛋白，其具有多种类型。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如在本申请中所使用的，术语“成熟多肽”或“成熟蛋白”指分泌或位于细胞膜或某些细胞器(例如，内质网、高尔基体或内含体)内并且不包含N-末端信号肽的蛋白或多肽。
“信号肽”也称为“信号序列”、“前导序列”、“前导肽”、“定位信号”或“定位序列”，是一种位于新合成蛋白的N-末端来运往分泌途径的短肽(通常的长度为15-30个氨基酸)。信号肽通常包含在N-末端的一段短的亲水性带正电的氨基酸，中间的5-15个残基的疏水性结构域和具有信号肽酶切割位点的C-末端区域。在真核生物中，信号肽促使新合成的蛋白转位至内质网，在内质网信号肽被信号肽酶切割，产生成熟的蛋白，然后前往其适宜的目的地。
两条或多条核酸或氨基酸序列之间的“同一性百分比”是序列共有的相同位置的函数(即，同一性％＝相同位置数/位置总数x 100)，其要考虑为优化两条或多条序列比对而需要引入的空位数以及每个空位的长度。可以使用数学算法，如BLAST和空位BLAST程序，以其缺省参数(例如Altschul等，J.Mol.Biol.215:403,1990；亦参见在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST的BLASTN)实现序列比对以及确定两条或多条序列之间的同一性百分比。
在本领域中将“保守性取代”认为是一种氨基酸取代具有相似性质的另一种氨基酸。示例性的保守性取代是本领域熟知的(参见例如，WO 97/09433，第10页，公开日：1997年3月13日；Lehninger,Biochemistry，第2版；Worth Publishers,Inc.NY:NY(1975),pp.71-77；Lewin,Genes IV,Oxford University Press,NY and Cell Press,Cambridge,MA(1990),p.8)。
术语“嵌合”指非内源性的并且包含结合或连接在一起的序列(在自然界中通常不会结合或连接在一起)的任何核酸分子或蛋白。例如，嵌合核酸分子可以包含来自不同来源的调控序列和编码序列，或者来自相同来源但是以不同于天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。
如在本申请中所使用的，将术语“启动子”定义为启动多核苷酸序列的特异性转录所需要的，由细胞的合成机制或所引入的合成机制识别的DNA序列。
如在本申请中所使用的，术语“启动子/调控序列”指表达与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物所需要的核酸序列。在一些情况下，该序列可以是核心启动子序列，在另一些情况下，该序列也可以包含增强子序列和基因产物的表达所需要的其他调控元件。启动子/调控序列可以是例如在组织中以特异性的方式表达基因产物的序列。
“组成型”启动子是这样一种核苷酸序列，当其与编码或确定基因产物的多核苷酸序列可操作地连接时，导致所述基因产物在细胞的大多数或所有生理条件下在该细胞中产生。
“诱导型”启动子是这样一种核苷酸序列，当其与编码或确定基因产物的多核苷酸序列可操作地连接时，仅当在细胞中存在与所述启动子对应的诱导物时，才导致在该细胞中大量产生所述基因产物。
“组织特异性”启动子是这样一种核苷酸序列，当其与编码或确定基因的多核苷酸可操作地连接时，仅当细胞是与所述启动子对应的组织类型中的细胞时，才导致在该细胞中大量产生所述基因产物。
术语“对象”、“患者”和“个体”在本申请中可以互换使用，并且旨在包括在其中能够激发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。对象的实例包括人、灵长类、奶牛、马、绵羊、犬、猫、小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、猪及其转基因物种。
术语“T细胞”指T细胞谱系的细胞。“T细胞谱系的细胞”指显示T细胞或者其前体或祖细胞的至少一种表型特征的细胞，其是不同于其他淋巴细胞以及红细胞或髓细胞谱系细胞的细胞。此类表型特征可以包括T细胞特异性的一种或多种蛋白的表达(例如，CD3+、CD4+、CD8+)，或者T细胞特异性的生理学、形态学、功能或免疫学特征。例如，T细胞谱系的细胞可以是定向于T细胞谱系的祖细胞或前体细胞；CD25+未成熟的和未活化的T细胞；经历过CD4或CD8谱系定向的细胞；CD4+CD8+双阳性的胸腺细胞祖细胞；单阳性CD4+或CD8+；TCRαβ或TCRγδ；或者成熟的和有功能的或活化的T细胞。术语“T细胞”包括幼稚T细胞(CD45RA+、CCR7+、CD62L+、CD27+、CD45RO-)、中央记忆T细胞(CD45RO+、CD62L+、CD8+)、效应记忆T细胞(CD45RA+、CD45RO-、CCR7-、CD62L-、CD27-)、粘膜相关恒定T细胞、自然杀伤T细胞和组织驻留T细胞。
术语“B细胞”指B细胞谱系的细胞。“B细胞谱系的细胞”指显示B细胞或者其前体或祖细胞的至少一种表型特征的细胞，其是不同于其他淋巴细胞以及红细胞或髓细胞谱系细胞的细胞。此类表型特征可以包括B细胞特异性的一种或多种蛋白的表达(例如，CD19+、CD72+、CD24+、CD20+)，或者B细胞特异性的生理学、形态学、功能或免疫学特征。例如，B细胞谱系的细胞可以是定向于B细胞谱系的祖细胞或前体细胞(例如，前-原-B细胞、原-B细胞和前-B细胞)；未成熟的和未活化的B细胞或者成熟的和功能性的或活化的B细胞。因此，“B细胞”包括幼稚B细胞、浆细胞、调节性B细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、淋巴浆细胞样细胞、浆母细胞和记忆B细胞(例如，CD27+、IgD-)。
本公开内容的嵌合蛋白或表达嵌合蛋白的细胞(例如，CER或表达CER的细胞)的“治疗有效量”或“有效量”指足以导致待治疗的疾病、病症或不利病况的一种或多种症状改善的蛋白或细胞的量。当涉及单独的活性成分或表达单一活性成分的细胞单独施用时，治疗有效剂量指成分或表达单独成分的细胞的有效量。当涉及联用时，治疗有效剂量指活性成分或者辅助活性成分与表达活性成分的细胞联用时产生治疗作用的联用的量，无论其是连续施用还是同时施用。
“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”或“改善”指对对象疾病、病症或不利病况的医疗管理。在通常情况下，以足以激发治疗或预防益处的量施用包含表达本公开内容的CER的宿主细胞的适宜剂量或治疗方案。治疗或预防/防止益处包括改善临床结局；减轻或缓解与疾病、病症或不利病况相关的症状；减少症状的发生；改善生活质量；延长无疾病状态；降低疾病、病症或不利病况的程度；稳定疾病状态；推迟疾病进展；缓解；存活；延长生存期；或其任意组合。
如在本申请中所使用的，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”指启动子相对于多核苷酸处于正确的位置和方向，以控制RNA聚合酶的转录起始和该多核苷酸的表达。
“载体”是能够转运另一核酸的核酸分子。载体可以是例如质粒、粘粒、病毒或噬菌体。还应将该术语解释为包括促进核酸转移至细胞中的非质粒和非病毒化合物。“表达载体”指当其存在于适宜环境中时能够指引由载体携带的一个或多个基因编码的蛋白表达的载体。
在某些实施方式中，载体是病毒载体。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、γ逆转录病毒载体和慢病毒载体。“逆转录病毒”是具有RNA基因组的病毒。“γ逆转录病毒”指逆转录病毒科的一个属。γ逆转录病毒的实例包括小鼠干细胞病毒、小鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽类网状内皮细胞增生病毒。“慢病毒”指能够感染分裂和非分裂细胞的逆转录病毒的一个属。慢病毒的实例包括但不限于HIV(人类免疫缺陷病毒，包括1型HIV和2型HIV)、马感染性贫血病毒、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛免疫缺陷病毒(BIV)和猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。
在其他实施方式中，载体是非病毒载体。非病毒载体的实例包括基于脂质的DNA载体、经修饰的mRNA(modRNA)、自身扩增mRNA、封闭式线形双链体(CELiD)DNA和转座子介导的基因转移(PiggyBac,Sleeping Beauty)。当使用非病毒递送系统时，递送载剂可以是脂质体。可以使用脂质制剂在体外、离体或体内将核酸引入宿主细胞。核酸可以包封在脂质体内部，散布在脂质体的脂质双层内、通过将脂质体与核酸结合在一起的连接分子附接至脂质体，包含在胶束内或与之复合或者以其他方式与脂质结合。
其他定义贯穿于本公开内容通篇之中。
嵌合吞噬受体(CER)
本申请描述了嵌合吞噬受体(CER)。在特定实施方式中，CER是一种嵌合的、单链蛋白，其包含通过跨膜结构域连接在一起的胞外域和吞噬信号传导结构域。胞外域包含胞外结合结构域和任选地胞外间隔区结构域。当在宿主细胞中表达时，CER赋予经修饰的宿主细胞吞噬表型(将宿主细胞“转变”为吞噬表型)，所述吞噬表型对在靶细胞、微生物、颗粒或其他物质上存在或表达的所选定的促吞噬标记物或抗原标记物具有特异性。在某些实施方式中，CER赋予经修饰的宿主细胞吞噬作用表型，所述吞噬作用表型对在靶细胞、微生物、颗粒或其他物质上存在或表达的所选定的促吞噬标记物或抗原标记物具有特异性。在特定CER的实施方式中，嵌合蛋白从氨基末端到羧基末端包含：胞外域，其具有对靶分子具有特异性的结合结构域和可选的胞外间隔区结构域；跨膜结构域和吞噬信号传导结构域(参见例如，图1A和1B)。
可以对本申请公开的CER的组成部分进行选择和排布以提供所需的吞噬表型。例如，在某些实施方式中，胞外域可以包含对下述具有特异性的结合结构域：(i)与凋亡、死亡、濒死、损伤或坏死细胞相关的促吞噬标记物；或(ii)与感染、疾病、病症或其他不利病况相关的由外来的(例如，微生物)、受感染的或异常细胞所展示的抗原标记物。
吞噬信号传导结构域可以包含驱动靶细胞吞噬的一个或多个效应(也称为“信号传导”)结构域。通过胞外域与被靶向的促吞噬或抗原标记物的结合触发吞噬信号传导结构域的信号传导。在某些实施方式中，吞噬信号传导结构域包含主要吞噬信号传导结构域。在特定实施方式中，选择主要吞噬信号传导结构域以启动稳态吞噬应答。或者，在其他实施方式中，选择主要吞噬信号传导结构域以启动促炎性吞噬应答。在另外的实施方式中，吞噬信号传导结构域包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域，其中主要和次要吞噬信号传导结构域均是稳态信号传导结构域、均是促炎性信号传导结构域或者各一个(以任何顺序)。可以对根据本公开内容的CER进行工程化改造，以便在各种治疗背景下(例如，清除凋亡、死亡、濒死、损伤、感染或坏死细胞，清除导致感染性疾病的微生物和清除与疾病、病症或不利病况相关的异常细胞)应用，同时提供补充所需治疗结果的吞噬信号传导(例如，稳态或促炎性吞噬信号传导)。
图3A和3B提供了对天然淋巴细胞与使用本公开内容的CER的实施方式修饰的淋巴细胞进行功能比较。图3A显示了内源性淋巴细胞，并且如图中所示，天然淋巴细胞未显示出吞噬表型。然而，如图3B中所示，经修饰以表达如本申请所述CER的淋巴细胞显示出对靶癌细胞特异性的吞噬表型，导致靶癌细胞的吞噬(例如，吞噬作用)和消除。甚至进一步地，如图3B中所示，在某些实施方式中，可以对CER进行工程化改造以驱动吞噬过程的极化。在特定实施方式中，可以对在根据本说明书中的CER中包含的吞噬信号传导结构域进行选择以驱动稳态吞噬信号传导或促炎性吞噬信号传导。
本申请进一步详细描述了本公开内容的融合蛋白的组成部分。
胞外域
如本申请所述，CER包含对靶分子具有特异性的胞外域。在某些实施方式中，胞外域包含特异性结合被靶向的促吞噬标记物或抗原的胞外结合结构域。通过结合结构域与靶分子的结合可以阻断靶分子(例如，受体或配体)与另一分子之间的相互作用，例如干扰、降低或消除靶分子的某些功能(例如，信号传导)。在一些实施方式中，靶分子的结合可以诱导某些生物途径或者识别靶分子或表达靶分子的细胞以进行消除。
结合结构域可以是与目标靶分子特异性结合的任何多肽或肽。结合结构域的来源包括受体结合结构域、配体结合结构域以及抗体或抗原结合部分，如来自包括人、啮齿类、禽类或绵羊在内的不同物种的抗体可变区(其可以是抗体、sFv、scFv、Fab、基于scFv的grababody或者可溶性VH结构域或域抗体)。结合结构域的其他来源包括来自其他物种抗体的可变区，如骆驼科(来自骆驼、单峰驼或美洲驼；Ghahroudi等，FEBS Lett.414:521,1997；Vincke等，J.Biol.Chem.284:3273,2009；Hamers-Casterman等，Nature 363:446,1993和Nguyen等，J.Mol.Biol.275:413,1998)、护士鲨(Roux等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)95:11804,1998)、斑点银鲛(Nguyen等，Immunogen.54:39,2002)或七鳃鳗(Herrin等，Proc.Nat′l.Acad.Sci.(USA)105:2040,2008和Alder等，Nat.Immunol.9:319,2008)。这些抗体仅使用重链可变区形成抗原结合区，即这些功能性抗体仅为重链的同源二聚体(称为“重链抗体”)(Jespers等，Nat.Biotechnol.22:1161,2004；Cortez-Retamozo等，CancerRes.64:2853,2004；Baral等，Nature Med.12:580,2006；和Barthelemy等，J.Biol.Chem.283:3639,2008)。
在一些实施方式中，胞外域与促吞噬标记物结合。在某些此类实施方式中，由胞外域靶向的促吞噬标记物是磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、ICAM-3、氧化的低密度脂蛋白、钙网蛋白、膜联蛋白I、补体C1q或血小板反应蛋白。在进一步的实施方式中，与促吞噬标记物结合的胞外域来自内源性吞噬受体或吞噬受体的可溶性桥接分子(例如，GAS6、蛋白S、MFG-E8)。在一些实施方式中，使用整个胞外部分(对于跨膜分子)、整个桥接分子或吞噬受体或桥接分子截短的部分，条件是该截短的部分保持对促吞噬标记物足够的结合活性(即，功能性变体)。在进一步的实施方式中，用于胞外域的吞噬受体或桥接分子的胞外部分是整个胞外部分(对于跨膜分子)、整个桥接分子或吞噬受体或桥接分子的变体，条件是该变体保持对促吞噬标记物足够的结合活性(即，功能性变体)。
在一些实施方式中，胞外域包含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域1(Tim1)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域4(Tim4)、T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域3(Tim3)、stabilin-2、RAGE或Fc受体(FcR)胞外域。在特定的实施方式中，FcR胞外域可以包含来自FcγR1、FcγR2A、FcγR2B2、FcγR2C、FcγR3A、FcεR1或FcαR1的结合结构域。在进一步的实施方式中，胞外域可以包含来自Tim1、Tim4、Tim3、stabilin-2、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、脑特异性血管生成抑制剂1(BAI1)、乳脂肪球蛋白-EGF因子8蛋白(MFG-E8)(例如，介导与PtdSer高亲和性结合的FA58C2结构域)、生长停滞特异性6(GAS6)、蛋白S、蛋白C、因子II、因子VII、因子IX、因子X、β2-糖蛋白I、α5β3整合素和其他整合素、CR3补体受体、CR4补体受体、CD14、CD93、膜联蛋白V、磷脂酰丝氨酸受体(PSr)、凝血酶原或清道夫受体如清道夫受体B(例如，SRB1(CD36))、清道夫受体C(SRC)(例如，LOX-1、SRCL)、清道夫受体D(SRD)(例如，CD68、巨噬唾液酸蛋白)和PSOX的PtdSer结合结构域。
在一些实施方式中，胞外域包含或者是与下列序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％同一性的序列：含有SEQ ID NO:31的氨基酸序列或SEQ ID NO:31的氨基酸16-292的FcγRI结合结构域，含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列或SEQ ID NO:28的氨基酸21-290的TIM1结合结构域，含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列或SEQ ID NO:29的氨基酸25-314的TIM4结合结构域，含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列或SEQ ID NO:34的氨基酸22-202的TIM3结合结构域，含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的FA58C2结合结构域，含有SEQ IDNO:32的氨基酸序列或SEQ ID NO:32的氨基酸31-94的GAS6结合结构域，含有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的BAI1结合结构域或者含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列或SEQ ID NO:33的氨基酸25-87的蛋白S结合结构域。在某些其他实施方式中，胞外域由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列包含或者是与下列序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％同一性的序列：根据SEQ ID NO:4的编码FcγRI结合结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:1的编码TIM1结合结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:2的编码TIM4结合结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:7的编码TIM3结合结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:3的编码FA58C2结合结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:5的编码GAS6结合结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:135的编码BAI1结合结构域的多核苷酸或根据SEQ ID NO:6的编码蛋白S结合结构域的多核苷酸序列。
在其他实施方式中，胞外域来自下述中的至少一种：CD14，其结合至ICAM3；清道夫受体胞外域，其结合至氧化的LDL；凝集素，其结合至改变的糖；CD36，其结合至血小板反应蛋白；或者LRP1/CD91或凝集素部分，其结合至钙网蛋白。
在另外的实施方式中，胞外域包含对目标靶分子具有特异性的抗体或其抗原结合片段，如含有VH和VL区的单链Fv片段(scFv)。在某些实施方式中，抗体是嵌合的、人源的或人源化的。在进一步的实施方式中，VH和VL区是人的或人源化的。在特定实施方式中，胞外域是与促吞噬标记物特异性结合的抗体或其抗原结合部分。对磷脂酰丝氨酸具有特异性的抗体是本领域公知的(参见，美国专利号7,247,303；Khogeer等，2015,Lupus 24:186-90；Gerber等，2015,Am.J.Nucl.Med.Mol.Imaging,5:493-503，其全部内容均通过引用并入本申请)。在特定实施方式中，目标靶分子是肿瘤抗原，例如CD138、CD38、CD33、CD123、CD72、CD79a、CD79b、间皮素、PSMA、BCMA、ROR1、MUC-16、L1CAM、CD22、CD19、CD20、CD23、CD24、CD37、CD30、CA125、CD56、c-Met、EGFR、GD-3、HPV E6、HPV E7、MUC-1、HER2、叶酸受体α、CD97、CD171、CD179a、CD44v6、WT1、VEGF-α、VEGFR1、IL-13Rα1、IL-13Rα2、IL-11Rα、PSA、FcRH5、NKG2D配体、NY-ESO-1、TAG-72、CEA、肝配蛋白A2、肝配蛋白B2、Lewis A抗原、Lewis Y抗原、MAGE、MAGE-A1、RAGE-1、叶酸受体β、EGFRviii、VEGFR-2、LGR5、SSX2、AKAP-4、FLT3、岩藻糖基GM1、GM3、o-乙酰基-GD2和GD2，以及示例性VH和VL区包括分别为抗-CD138、-CD38、-CD33、-CD123、-CD72、-CD79a、-CD79b、-间皮素、-PSMA、-BCMA、-ROR1、-MUC-16、-L1CAM、-CD22、-CD19、-CD20、-CD23、-CD24、-CD37、-CD30、-CA125、-CD56、-c-Met、-EGFR、-GD-3、-HPV E6、-HPV E7、-MUC-1、-HER2、-叶酸受体α、-CD97、-CD171、-CD179a、-CD44v6、-WT1、-VEGF-α、-VEGFR1、-IL-13Rα1、-IL-13Rα2、-IL-11Rα、-PSA、-FcRH5、-NKG2D配体、-NY-ESO-1、-TAG-72、-CEA、-肝配蛋白A2、-肝配蛋白B2、-Lewis A抗原、-Lewis Y抗原、-MAGE、-MAGE-A1、-RAGE-1、-叶酸受体β、-EGFRviii、-VEGFR-2、-LGR5、-SSX2、-AKAP-4、-FLT3、-岩藻糖基GM1、-GM3、-o-乙酰基-GD2和-GD2特异性单克隆抗体的片段。
在进一步的实施方式中，胞外域包含对目标靶点具有特异性的Fab。在此类实施方式中，目标靶点包括CD138、CD38、CD33、CD123、CD72、CD79a、CD79b、间皮素、PSMA、BCMA、ROR1、MUC-16、L1CAM、CD22、CD19、CD20、CD23、CD24、CD37、CD30、CA125、CD56、c-Met、EGFR、GD-3、HPV E6、HPV E7、MUC-1、HER2、叶酸受体α、CD97、CD171、CD179a、CD44v6、WT1、VEGF-α、VEGFR1、IL-13Rα1、IL-13Rα2、IL-11Rα、PSA、FcRH5、NKG2D配体、NY-ESO-1、TAG-72、CEA、肝配蛋白A2、肝配蛋白B2、Lewis A抗原、Lewis Y抗原、MAGE、MAGE-A1、RAGE-1、叶酸受体β、EGFRviii、VEGFR-2、LGR5、SSX2、AKAP-4、FLT3、岩藻糖基GM1、GM3、o-乙酰基-GD2和GD2，以及Fab区分别包括抗-CD138、-CD38、-CD33、-CD123、-CD72、-CD79a、-CD79b、-间皮素、-PSMA、-BCMA、-ROR1、-MUC-16、-L1CAM、-CD22、-CD19、-CD20、-CD23、-CD24、-CD37、-CD30、-CA125、-CD56、-c-Met、-EGFR、-GD-3、-HPV E6、-HPV E7、-MUC-1、-HER2、-叶酸受体α、-CD97、-CD171、-CD179a、-CD44v6、-WT1、-VEGF-α、-VEGFR1、-IL-13Rα1、-IL-13Rα2、-IL-11Rα、-PSA、-FcRH5、-NKG2D配体、-NY-ESO-1、-TAG-72、-CEA、-肝配蛋白A2、-肝配蛋白B2、-Lewis A抗原、-Lewis Y抗原、-MAGE、MAGE-A1、-RAGE-1、-叶酸受体β、-EGFRviii、-VEGFR-2、-LGR5、-SSX2、AKAP-4、-FLT3、-岩藻糖基GM1、-GM3、-o-乙酰基-GD2和-GD2特异性单克隆抗体的部分。
由本公开内容的CER的胞外域特异性结合的靶分子可以存在于目标细胞(“靶细胞”)上或与之结合。示例性的靶细胞包括癌细胞、与自身免疫性疾病或病症或者与炎性疾病或病症相关的细胞以及感染性微生物(例如，细菌、病毒或真菌)或受感染的细胞(例如，病毒感染的细胞)。感染性生物(如哺乳动物的寄生虫)的细胞也被认为是靶细胞。
在一些实施方式中，胞外域任选地包含胞外、非信号传导间隔区或接头结构域。在包含其的情况下，此类间隔区或接头结构域可以使结合结构域的位置远离宿主细胞表面以进一步实现适宜的细胞/细胞接触、结合和活化。胞外间隔区结构域通常位于胞外结合结构域和跨膜结构域之间。可以根据选择的靶分子、选择的结合表位、结合结构域尺寸和亲和性改变胞外间隔区的长度以优化靶分子的结合(参见例如，Guest等，J.Immunother.28:203-11,2005；PCT公开号WO 2014/031687)。在某些实施方式中，胞外间隔区结构域是免疫球蛋白铰链区(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD)。免疫球蛋白铰链区可以是野生型免疫球蛋白铰链区或改变的野生型免疫球蛋白铰链区。改变的IgG4铰链区如PCT公开号WO2014/031687中所述，其铰链区的全部内容通过引用并入本申请。在一个特定的实施方式中，胞外间隔区结构域包含经修饰的IgG4铰链区，其具有氨基酸序列ESKYGPPCPPCP(SEQ ID NO:67)。可以在本申请所述CER中使用的铰链区的其他实例包括在1型膜蛋白(如，CD8a、CD4、CD28和CD7，其可以是野生型的或其变体)的胞外区域中存在的铰链区。在进一步的实施方式中，胞外间隔区结构域包含选自下述的免疫球蛋白Fc结构域的全部或部分：CH1结构域、CH2结构域、CH3结构域或其组合(参见例如，PCT公开号WO2014/031687，其间隔区的全部内容通过引用并入本申请)。在进一步的实施方式中，胞外间隔区结构域可以包含II型C-凝集素的茎区(位于C型凝集素结构域和跨膜结构域之间的胞外域)。II型C-凝集素包括CD23、CD69、CD72、CD94、NKG2A和NKG2D。在进一步的实施方式中，胞外间隔区结构域可以来自MERTK。
吞噬信号传导结构域
CER的吞噬信号传导结构域是胞内效应结构域并且能够响应于CER的胞外域与靶分子的结合而将功能性信号传递给细胞。在某些实施方式中，吞噬信号传导结构域可以包含一个或多个稳态吞噬信号传导结构域，一个或多个促炎性信号传导结构域或者稳态信号传导结构域和促炎性信号传导结构域两者。
在某些实施方式中，吞噬信号传导结构域是内源性吞噬受体的胞内信号传导结构域。可以从其中获得吞噬信号传导结构域的内源性吞噬受体的实例包括Mer酪氨酸激酶(MERTK)、Tyro3蛋白酪氨酸激酶、Axl受体酪氨酸激酶、BAI1、1型甘露糖受体C(MRC1)和Fc受体(FcR)(例如，FcγR1、FcγR2A、FcγR2B2、FcγR2C、FcγR3A、FcεR1或FcαR1)。在其他实施方式中，吞噬信号传导结构域是与吞噬作用过程中的信号传导途径相关的内源性激酶或适体蛋白的胞内信号传导结构域。与吞噬作用信号传导途径相关的激酶的实例包括脾脏相关酪氨酸激酶(SYK)、T细胞受体相关蛋白激酶70的zeta链(Zap70)和磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)。
吞噬信号传导结构域可以是保留足够信号传导活性的吞噬信号传导分子的任何部分。在一些实施方式中，使用吞噬信号传导分子的全长或全长胞内部分。在一些实施方式中，使用吞噬信号传导分子或吞噬信号传导分子的胞内部分的截短部分，条件是该截短部分保留足够信号传导活性。在进一步的实施方式中，吞噬信号传导结构域是完整吞噬信号传导分子或其截短部分的变体，条件是该变体保留足够信号传导活性(即，功能性变体)。
在某些实施方式中，吞噬信号传导结构域包含稳态吞噬信号传导结构域，例如MRC1信号传导结构域、ItgB5信号传导结构域、MERTK信号传导结构域、Tyro3信号传导结构域、Axl信号传导结构域、BAI1信号传导结构域或ELMO信号传导结构域。在更特定的实施方式中，吞噬信号传导结构域包含稳态吞噬信号传导结构域，所述稳态吞噬信号传导结构域包含或是与如下序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％同一性的序列：含有SEQID NO:56的氨基酸序列的MRC1信号传导结构域，含有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的ItgB5信号传导结构域，含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的MERTK信号传导结构域，含有SEQ IDNO:45的氨基酸序列的Tyro3信号传导结构域，含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的Ax1信号传导结构域，含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的BAI1信号传导结构域或含有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的ELMO信号传导结构域。在其他实施方式中，吞噬信号传导结构域包含稳态吞噬信号传导结构域，并且稳态吞噬信号传导结构域由多核苷酸序列编码，所述多核苷酸序列包含或是与如下序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％同一性的序列编码：根据SEQ ID NO:55的编码MRC1信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:137的编码ItgB5信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:138的编码MERTK信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:18的编码Tyro3信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:17的编码Ax1信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:139的编码BAI1信号传导结构域的多核苷酸或根据SEQ ID NO:140的编码ELMO信号传导结构域的多核苷酸。
在某些实施方式中，通过稳态吞噬信号传导结构域的信号传导导致至少一种抗炎性细胞因子和免疫抑制性细胞因子的表达。在特定实施方式中，抗炎性细胞因子和免疫抑制性细胞因子中的至少一种是TGF-β、IL-10或者这两者。
在某些实施方式中，吞噬信号传导结构域包含促炎性吞噬信号传导结构域，例如Traf6信号传导结构域、Syk信号传导结构域、MyD88信号传导结构域、截短的MyD88信号传导结构域(例如，包含死亡结构域但缺乏Toll/白介素-1受体(TIR)同源结构域)、Zap70信号传导结构域、PI3K信号传导结构域、FcR信号传导结构域(包括FcγR1信号传导结构域、FcγR2A信号传导结构域、FcγR2C信号传导结构域、FcγR2B2信号传导结构域、FcγR3A信号传导结构域、FcγR2C信号传导结构域、FcγR3A信号传导结构域、FcεR1信号传导结构域和FcαR1信号传导结构域)、B-细胞活化因子受体(BAFF-R)信号传导结构域、DAP12(也称为TYRO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白(TYROBP))信号传导结构域、具有ITAM基序1的NFAT活化蛋白(NFAM1)信号传导结构域或CD79b信号传导结构域。
在特定实施方式中，吞噬信号传导结构域包含促炎性吞噬信号传导结构域，所述促炎性吞噬信号传导结构域包含或是与如下序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％同一性的序列：含有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的Traf6信号传导结构域，含有SEQID NO:46的氨基酸序列的Syk信号传导结构域，含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的MyD88信号传导结构域，含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的截短MyD88信号传导结构域，含有SEQ IDNO:47的氨基酸序列的Zap70信号传导结构域，含有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的FcεRIγ信号传导结构域，含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的FcγR1信号传导结构域，含有SEQ IDNO:49的氨基酸序列的FcγR2A信号传导结构域，含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的FcγR2C信号传导结构域，含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的FcγR3A信号传导结构域，含有SEQID NO:94的氨基酸序列的BAFF-R信号传导结构域，含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的DAP12信号传导结构域，含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的NFAM1信号传导结构域，含有SEQID NO:132的氨基酸序列的截短NFAM1信号传导结构域或含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CD79b信号传导结构域。
在其他实施方式中，吞噬信号传导结构域包含促炎性吞噬信号传导结构域，并且所述促炎性信号传导结构域由多核苷酸序列提供，所述多核苷酸序列包含或是与如下具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％同一性的序列：根据SEQ ID NO:27的编码Traf6信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:19的编码Syk信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:26的编码MyD88信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:99的编码截短MyD88信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:20的编码Zap70的多核苷酸，根据SEQID NO:141的编码FcεRIγ信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:21的编码FcγR1信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:22的编码FcγR2A信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:23的编码FcγR2C信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:24的编码FcγR3A信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:126的编码BAFF-R信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:127的编码DAP12信号传导结构域的多核苷酸，根据SEQ ID NO:129的编码NFAM1信号传导结构域的多核苷酸或根据SEQ ID NO:128的编码CD79b信号传导结构域的多核苷酸。
在进一步的实施方式中，通过促炎性吞噬信号传导结构域的信号传导导致至少一种炎性细胞因子、炎性趋化因子或共刺激细胞表面标记物的表达。在进一步的实施方式中，炎性细胞因子是TNFα、IL-1、IL-6、IL-12或IL-23；炎性趋化因子是CCL5(RANTES)、CXCL9或CXCL10；和共刺激细胞表面标记物是CD80、CD86、HLA-DR、CD40、HVEM或4-1BBL；或者其任意组合。
在进一步的实施方式中，CER的吞噬信号传导结构域可以包含一个以上信号传导结构域。在某些此类实施方式中，吞噬信号传导结构域包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域。在其中吞噬信号传导结构域包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域的实施方式中，所述主要吞噬信号传导结构域可以是稳态吞噬信号传导结构域或促炎性吞噬信号传导结构域。类似地，所述次要吞噬信号传导结构域可以选自稳态吞噬信号传导结构域或促炎性吞噬信号传导结构域。在某些实施方式中，CER包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域，其均为稳态吞噬信号传导结构域。在某些其他实施方式中，CER包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域，其均为促炎性吞噬信号传导结构域。在另外的实施方式中，CER包含主要吞噬信号传导结构域(其为稳态吞噬信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(其为促炎性吞噬信号传导结构域)。在又一个实施方式中，CER包含主要吞噬信号传导结构域(其为促炎性吞噬信号传导结构域)和次要吞噬信号传导结构域(其为稳态吞噬信号传导结构域)。在其中主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域均为稳态吞噬信号传导结构域或均为促炎性信号传导结构域的那些实施方式中，初级和次要吞噬信号传导结构域可以是相同的或不同的。在特定的实施方式中，作为主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域的结构域选自一个或多个本申请所述的特定信号传导结构域，包括MRC1、ItgB5、MERTK、ELMO、BAI1、Tyro3、Axl、Traf6、Syk、MyD88、Zap70、PI3K、FcγR1、FcγR2A、FcγR2B2、FcγR2C、FcγR3A、FcεR1、FcαR1、BAFF-R、DAP12、NFAM1和CD79b。
在某些实施方式中，主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域的存在增强了CER的吞噬活性，增强了CER修饰宿主细胞的持久性，增强了CER修饰宿主细胞的扩增或其组合。在一个特定的实施方式中，次要吞噬信号传导结构域(其为促炎性信号传导结构域)和主要吞噬信号传导结构域(其为稳态吞噬信号传导结构域)的包含增强了CER的吞噬活性，增强了CER修饰宿主细胞的持久性，增强了CER修饰宿主细胞的扩增或其组合。
跨膜结构域
跨膜结构域将胞外域和吞噬信号传导结构域连接在一起并位于这两者之间。跨膜结构域是横贯宿主细胞膜的一种疏水性α螺旋。跨膜结构域可以直接与结合结构域融合在一起或者与胞外间隔区结构域融合在一起(如果存在的话)。在某些实施方式中，跨膜结构域来自整合膜蛋白(例如，受体、分化簇(CD)分子、酶、转运蛋白、细胞粘附分子等)。跨膜结构域可以与CER中包含的胞外域或吞噬信号传导结构域天然地结合在一起(例如，CER包含Tim4结合结构域和Tim4跨膜结构域)。在某些实施方式中，跨膜结构域和胞外域来自不同分子，跨膜结构域和吞噬信号传导结构域来自不同分子，或者跨膜结构域、胞外域和吞噬信号传导结构域均来自不同分子。
在某些实施方式中，跨膜结构域是Tim1跨膜结构域、Tim4跨膜结构域、FcR跨膜结构域(例如，FcγR1、FcγR2A、FcγR2B2、FcγR2C、FcγR3A、FcεR1或FcαR1跨膜结构域)、CD8a跨膜结构域、MERTK跨膜结构域、Axl跨膜结构域、Tyro3跨膜结构域、BAI1跨膜结构域、CD4跨膜结构域、CD28跨膜结构域、MRC1跨膜结构域或DAP12跨膜结构域。
在特定的实施方式中，跨膜结构域包含或是与如下序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％同一性的序列：含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的Tim1跨膜结构域，含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的Tim4跨膜结构域，含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的FcγRI跨膜结构域，含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的FcεRIγ跨膜结构域，含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CD8a跨膜结构域，含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的MERTK跨膜结构域，含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的Ax1跨膜结构域，含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的Tyro3跨膜结构域，含有SEQ ID NO:142的氨基酸序列的BAI1跨膜结构域，如SEQ ID NO:68的氨基酸序列所示的CD28跨膜结构域，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CD4跨膜结构域，含有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的MRC1跨膜结构域或含有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的DAP12跨膜结构域。在其他实施方式中，跨膜结构域由多核苷酸序列提供，所述多核苷酸序列包含或是与如下序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％同一性的序列：根据SEQ ID NO:8的编码Tim1跨膜结构域的多核苷酸序列，根据SEQ ID NO:9的编码Tim4跨膜结构域的多核苷酸序列，根据SEQ ID NO:85的编码FcεRIγ跨膜结构域的多核苷酸序列，根据SEQ ID NO:10的编码FcγRI跨膜结构域的多核苷酸序列，根据SEQ ID NO:11的编码CD8a跨膜结构域的多核苷酸序列，根据SEQ ID NO:12的编码MERTK跨膜结构域的多核苷酸序列，根据SEQ ID NO:13的编码Ax1跨膜结构域的多核苷酸序列，根据SEQ ID NO:14的编码Tyro3跨膜结构域的多核苷酸序列，根据SEQ ID NO:144的编码CD28跨膜结构域的多核苷酸序列，根据SEQ ID NO:143的编码BAI1跨膜结构域的多核苷酸序列，根据SEQ ID NO:15的编码CD4跨膜结构域的多核苷酸序列或者根据SEQ ID NO:145的编码DAP12跨膜结构域的多核苷酸序列。
应当理解的是，本申请所述CER的一个结构域和另一个结构域的直接融合不排除间插连接氨基酸的存在。连接氨基酸可以是天然的或非天然的(例如，由嵌合蛋白的构建设计产生)。
CER的实例
可以以各种组合选择和排布如本申请所公开的CER的组成部分以便向宿主细胞提供所需的吞噬表型。除了诱导由被CER修饰的宿主细胞靶向的分子表达或表征的细胞、微生物或颗粒的吞噬以外，可以根据靶细胞或颗粒、疾病状态和所需的治疗结果对如本申请所述的CER进行设计以启动稳态吞噬应答或促炎性吞噬应答。
在一个方面中，本公开内容提供了一种嵌合吞噬受体(CER)，所述嵌合吞噬受体包含单链嵌合蛋白，所述单链嵌合蛋白包含：胞外域，其含有与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)结合的结合结构域；吞噬信号传导结构域；和跨膜结构域，其位于胞外域和吞噬信号传导结构域之间并将这两者连接在一起。
在某些实施方式中，胞外域还包含胞外间隔区结构域，其位于结合结构域和跨膜结构域之间。
在CER的某些实施方式中，所述CER包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域，吞噬信号传导结构域是稳态吞噬信号传导结构域或促炎性吞噬信号传导结构域。在某些此类实施方式中，稳态吞噬信号传导结构域或促炎性吞噬信号传导结构域可以选自本申请所述的那些中的一种或多种。在CER的其他实施方式中，所述CER包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域，吞噬信号传导结构域包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域。主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域可以均是稳态吞噬信号传导结构域、促炎性吞噬信号传导结构域或者这两者(以任何顺序)。在某些此类实施方式中，包含在主要信号传导结构域和次要信号传导结构域中的稳态吞噬信号传导结构域或促炎性吞噬信号传导结构域可以选自本申请所述的稳态吞噬信号传导结构域和促炎性吞噬信号传导结构域中的一种或多种。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的一个实施方式包含含有TIM4 PtdSer结合结构域的胞外域，含有TIM4跨膜结构域的跨膜结构域和含有MERTK信号传导结构域的吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER01”)(参见例如，图6A)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽包含SEQ ID NO:71中除信号肽序列(SEQ ID NO:71的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有FA58C2PtdSer结合结构域和含有经修饰IgG4铰链区的胞外间隔区结构域的胞外域，含有CD28跨膜结构域的跨膜结构域和含有MERTK信号传导结构域的吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER03”)(参见例如，图9A)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽包含SEQ ID NO:75中除信号肽序列(SEQID NO:75的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的又一个实施方式包含含有FA58C2PtdSer结合结构域和含有经修饰IgG4铰链区的胞外间隔区结构域的胞外域，含有CD28跨膜结构域的跨膜结构域和含有SYK信号传导结构域的吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER04”)(参见例如，图11A)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽包含SEQ ID NO:70中除信号肽序列(SEQ IDNO:70的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有TIM4结合结构域的胞外域，含有TIM4跨膜结构域的跨膜结构域和含有Tyro3信号传导结构域的吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER08”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:83的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽包含SEQ ID NO:83中除信号肽序列(SEQ ID NO:83的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有TIM4结合结构域的胞外域，含有TIM4跨膜结构域的跨膜结构域和含有DAP12信号传导结构域的吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER09”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:84的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽包含SEQ ID NO:84中除信号肽序列(SEQ ID NO:84的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有TIM4结合结构域的胞外域，含有DAP12跨膜结构域的跨膜结构域和含有DAP12信号传导结构域的吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER10”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽包含SEQ ID NO:86中除信号肽序列(SEQ ID NO:86的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有TIM4结合结构域的胞外域，含有TIM4跨膜结构域的跨膜结构域和含有Axl信号传导结构域的吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER11”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQID NO:87的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:87中除信号肽序列(SEQ ID NO:87的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有TIM4结合结构域的胞外域，含有TIM4跨膜结构域的跨膜结构域和含有FcεRIγ信号传导结构域的吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER12”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:90中除信号肽序列(SEQ ID NO:90的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有TIM4结合结构域的胞外域，含有FcεRIγ跨膜结构域的跨膜结构域和含有FcεRIγ信号传导结构域的吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER13”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽包含SEQ ID NO:91中除信号肽序列(SEQ ID NO:91的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域和含有截短的MyD88信号传导结构域的吞噬信号传导结构域，所述截短的MyD88信号传导结构域包含死亡结构域但缺乏TIR结构域(在本申请中也称为“CER15”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:79的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:79中除信号肽序列(SEQ ID NO:79的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域和含有MyD88信号传导结构域的吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER16”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:80的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:80中除信号肽序列(SEQ ID NO:80的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域和含有NFAM1信号传导结构域的吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER25”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:93中除信号肽序列(SEQ ID NO:93的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有截短的MyD88信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有BAFF-R信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER85”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:95的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:95中除信号肽序列(SEQ IDNO:95的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有截短的MyD88信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有DAP12信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER86”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:96中除信号肽序列(SEQ IDNO:96的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有截短的MyD88信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有CD79b信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER89”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:98中除信号肽序列(SEQ IDNO:99的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有截短的MyD88信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有NFAM1信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER90”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:100中除信号肽序列(SEQ IDNO:100的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有MERTK信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有CD79b信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER95”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:101中除信号肽序列(SEQ ID NO:101的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有MERTK信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有NFAM1信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER96”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:102中除信号肽序列(SEQ ID NO:102的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有MERTK信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有BAFF-R信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER93”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:103中除信号肽序列(SEQ ID NO:103的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有BAFF-R信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有截短的MyD88信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER87”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:130中除信号肽序列(SEQ IDNO:130的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有DAP12信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有截短的MyD88信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER88”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:131的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:131中除信号肽序列(SEQ IDNO:131的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有MERTK信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有截短的MyD88信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER92”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:133的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:133中除信号肽序列(SEQ IDNO:133的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有MERTK信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有DAP12信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER94”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:134的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:134中除信号肽序列(SEQ ID NO:134的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有MERTK信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有NFAM1信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER96”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:102中除信号肽序列(SEQ ID NO:102的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有MERTK信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有截短的NFAM1信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“具有截短的NFAM1的CER96”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQID NO:116的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽包含SEQ ID NO:116中除信号肽序列(SEQ ID NO:116的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有BAFFR信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有截短的MyD88信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER87”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:130的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽包含SEQ ID NO:130中除信号肽序列(SEQ ID NO:130的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有Axl信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有DAP12信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER97”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:152的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:152中除信号肽序列(SEQ ID NO:152的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与PtdSer结合的结合结构域的胞外域的CER的另一个实施方式包含含有Tim4结合结构域的胞外域，含有Tim4跨膜结构域的跨膜结构域，含有Axl信号传导结构域的主要吞噬信号传导结构域和含有CD79b信号传导结构域的次要吞噬信号传导结构域(在本申请中也称为“CER98”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:153的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:153中除信号肽序列(SEQ ID NO:153的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
在另一个方面中，本公开内容提供了一种CER，所述CER包含单链嵌合蛋白，所述单链嵌合蛋白包含：胞外域，其包含与促吞噬标记物或靶抗原结合的结合结构域；促炎性吞噬信号传导结构域；和跨膜结构域，其位于胞外域和促炎性吞噬信号传导结构域之间并将这两者连接在一起。将此类CER特异性地“极化”以便在结合靶分子(例如，促吞噬标记物或靶抗原)后提供炎性或免疫原性表型。
在含有促炎性吞噬信号传导结构域的CER的某些实施方式中，胞外域还包含位于结合结构域和跨膜结构域之间的胞外间隔区结构域。
在又一个方面中，本公开内容提供了一种CER，所述CER包含单链嵌合蛋白，所述单链嵌合蛋白包含：胞外域，其包含与促吞噬标记物或靶抗原结合的结合结构域；吞噬信号传导结构域，其包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域；和跨膜结构域，其位于胞外域和促炎性吞噬信号传导结构域之间并将这两者连接在一起。主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域均可以是稳态吞噬信号传导结构域、促炎性吞噬信号传导结构域或者这两者(以任何顺序)。
在包含含有主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域的吞噬信号传导结构域的CER的某些实施方式中，胞外域还包含位于结合结构域和跨膜结构域之间的胞外间隔区结构域。
在又一个方面中，本公开内容提供了一种CER，所述CER包含单链嵌合蛋白，所述单链嵌合蛋白包含：胞外域，其包含与促吞噬标记物或靶抗原结合的scFv；吞噬信号传导结构域；和跨膜结构域，其位于胞外域和吞噬信号传导结构域之间并将这两者连接在一起，其中跨膜结构域和吞噬信号传导结构域均来自不同分子。
在包含含有与促吞噬标记物或靶抗原结合的scFv的胞外域的CER的某些实施方式中，胞外域还包含位于结合结构域和跨膜结构域之间的胞外间隔区结构域。
包含含有与促吞噬标记物或靶抗原结合的scFv的胞外域的CER的一个实施方式包含胞外域，其含有对CD19具有特异性的scFv结合结构域(例如，FMC63scFv(SEQ ID NO:66))和含有经修饰IgG4铰链区的胞外间隔区结构域；吞噬信号传导结构域，其含有MERTK信号传导结构域；和跨膜结构域，其含有位于胞外域和吞噬信号传导结构域之间并将其连接在一起的CD28跨膜结构域；其中胞外间隔区结构域位于结合结构域和跨膜结构域之间(也称为“CER40”)(参见例如，图13A)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:64中除信号肽序列(SEQ ID NO:64的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
包含含有与促吞噬标记物或靶抗原结合的scFv的胞外域的CER的另一个实施方式包含胞外域，其含有对间皮素具有特异性的scFv(例如，M912scFv，SEQ ID NO:106的氨基酸23-264，SEQ ID NO:106的氨基酸1-22为信号肽)和含有经修饰IgG4铰链区的胞外间隔区结构域；吞噬信号传导结构域，其包含截短的MyD88信号传导结构域；和跨膜结构域，其包含位于胞外域和吞噬信号传导结构域之间并将其连接在一起的Tim4跨膜结构域；其中胞外间隔区结构域位于scFv和跨膜结构域之间(在本申请中也称为“CER50”)。在某些实施方式中，此类CER包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列。在一些实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ IDNO:107中除信号肽序列(SEQ ID NO:107的氨基酸1-22)以外的氨基酸序列。
在某些实施方式中，在宿主细胞表面上表达的CER与其相关的靶分子结合后，在宿主细胞表面上发生CER横向成簇，增加了局部CER的浓度。成簇由在靶细胞或颗粒表面上存在的多价配体所驱动。
在某些实施方式中，在宿主细胞表面上表达的CER与其相关的靶分子结合后，发生CER二聚化或三聚化，其将胞内吞噬信号传导结构域桥接在一起，然后成为胞内激酶的靶点。
在某些实施方式中，当在宿主细胞表面上表达时，本公开内容的CER能够束缚、内化和加工(降解)靶分子或颗粒(例如，吞噬(phagocytosing)靶点)。在其他实施方式中，本公开内容的CER能够束缚和内化靶分子或颗粒(例如，吞噬(engulfing)靶点)。在一些实施方式中，吞噬体内的靶分子或颗粒可以在吞噬体成熟之前或成熟期间排出。而且，内化可以包括内化被CER的胞外域所结合的整个细胞或颗粒，或者可以包括内化被CER的胞外域所结合的细胞或颗粒的一块或一部分。
在某些实施方式中，本公开内容的CER束缚靶分子或颗粒但不发生内化。表达CER的宿主细胞可以吞噬或束缚多个靶细胞或颗粒。不希望受到理论的束缚，即使在不存在靶细胞或颗粒的内化和降解的情况下，表达CER的宿主细胞对靶细胞或颗粒的束缚可能导致靶细胞或颗粒的降解或促进炎症环境，这是在某些治疗背景下(例如，癌症)所需要的。
根据本说明书的CER的实施方式如表1-3，图6A、9A、10A、11A、12A、13A、13B，序列表和实施例所示。
宿主细胞和核酸
在某些方面中，本公开内容提供了编码任意一种或多种本申请所述的CER的核酸分子。编码所需CER的核酸序列可以使用本领域公知的重组方法使用标准技术获得或产生，如通过筛选来自表达所需序列或其部分的细胞的文库，通过从已知包含所述序列的载体衍生序列，或者通过直接从含有所述序列的细胞或组织分离序列或其部分。或者，可以合成生产而非克隆目标序列。
编码本申请提供的CER组合物的多核苷酸可以来自任何动物，如人类、灵长类、奶牛、马、绵羊、犬、猫、小鼠、大鼠、家兔、豚鼠或猪。在某些实施方式中，编码CER的多核苷酸与该多核苷酸所插入的宿主细胞来自相同的动物物种。
编码本申请提供的CER组合物的多核苷酸还可以包含编码信号肽(也称为前导肽或信号序列)的序列，信号肽位于CER的氨基末端，用于将前体蛋白靶向分泌途径。在细胞加工和CER定位至细胞膜的过程中，任选地将信号肽从胞外域的N-末端切割下来。已经从其上切割或除去信号肽序列的多肽也可以称为成熟多肽。可以用于本公开内容的CER中的信号肽的实例包括来自内源性分泌蛋白的信号肽，包括例如GM-CSF(SEQ ID NO:65的氨基酸序列)和Tim4(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)。在某些实施方式中，本公开内容的CER的多核苷酸或多肽序列包含来自成熟多肽的序列。本领域技术人员应当理解的是，对于包含信号肽序列的本申请公开的序列，可以使用另一信号肽替代所述信号肽序列，所述另一信号肽能够将所编码的蛋白运输细胞外基质。
在某些实施方式中，编码本公开内容的CER的核酸分子经密码子优化以便在靶宿主细胞中有效表达。
可以将编码所需CER的核酸分子插入适宜载体(例如，病毒载体、非病毒质粒载体和非病毒载体，如基于脂质的DNA载体、经修饰的mRNA(modRNA)、自我扩增mRNA、CELiD和转座子介导的基因转移(PiggyBac,Sleeping Beauty))，用于引入目标宿主细胞(例如，T细胞、自然杀伤细胞、B细胞、淋巴细胞前体细胞、抗原提呈细胞、朗格汉斯细胞或骨髓细胞)。可以将编码本公开内容的CER的核酸分子克隆至任何适宜载体中，如表达载体、复制载体、探针生成载体或测序载体。在某些实施方式中，将编码胞外域的核酸序列，编码跨膜结构域的核酸序列和编码吞噬信号传导结构域的核酸序列连接在一起形成单一的多核苷酸，然后将其插入载体中。在其他实施方式中，可以将编码胞外域的核酸序列，编码跨膜结构域的核酸序列和编码吞噬信号传导结构域的核酸序列分别插入载体中，使得所得到的氨基酸序列产生功能性CER。在本申请中将编码CER的载体称为“CER载体”。
在某些实施方式中，载体包含编码一种CER的核酸分子。在其他实施方式中，载体包含编码两种或多种CER的一种或多种核酸分子。在一个实施方式中，可以将分别编码CER的两种或多种核酸分子顺序克隆至载体的不同的多个克隆位点，每种CER在不同启动子的调控下表达。在另一个实施方式中，将编码多个CER的单一核酸分子克隆至克隆位点并由单一启动子表达，每个CER彼此之间由IRES或病毒2A肽序列所分隔，以使得来自单一开放阅读框架(例如，多顺反子载体)的多个基因共表达。在某些实施方式中，病毒2A肽是T2A(SEQ IDNO:147)、P2A(SEQ ID NO:104)、E2A(SEQ ID NO:148)或F2A(SEQ ID NO:149)。
在一些实施方式中，使用能够使转基因长期整合至子代细胞并在期间复制的载体。实例包括病毒载体，如腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、痘病毒或逆转录病毒，如慢病毒。可以使用来自慢病毒的载体以实现长期基因转移，并且其与其他载体相比具有额外的优势，包括能够转导非增殖细胞(如肝细胞)并且具有较低免疫原性。
在某些实施方式中，可以构建CER载体以优化空间和时间控制。例如，CER载体可以包含启动子元件以优化空间和时间控制。在一些实施方式中，CER载体包含组织特异性启动子或增强子，其能够向器官或病理微环境(如肿瘤或感染组织)特异性诱导CER。“增强子”是附加的启动子元件，其可以协同或独立地起作用以激活转录。在其他实施方式中，CER载体包含组成型启动子。在另外的实施方式中，CER载体包含诱导型启动子。
在进一步的实施方式中，CER载体可以包含归巢受体(如CCR4或CXCR4)以便在体内改善归巢和抗肿瘤活性。
在需要时间控制的情况下，CER载体可以包含能够使得转导细胞诱导性耗竭的元件。例如，此类载体可以包含诱导型自杀基因。自杀基因可以是凋亡基因或赋予对试剂(例如，药物)敏感性的基因，如化学诱导型半胱天冬酶9(iCASP9)、化学诱导型Fas或HSV-TK(赋予对更昔洛韦的敏感性)。在进一步的实施方式中，可以对CER载体进行设计以表达已知的细胞表面抗原，其在输注相关抗体后，能够耗竭转导的细胞。可以用于耗竭转导的细胞的细胞表面抗原及其相关抗体的实例包括CD20和利妥昔单抗、RQR8(CD34和CD20表位的组合，能够进行CD34选择和抗-CD20缺失)和利妥昔单抗以及EGFR和西妥昔单抗。
也可以将诱导型载体系统用于诱导型CER的表达，如用多西环素激活转基因表达的四环素(Tet)-On载体系统(Heinz等，Hum.Gene Ther.2011,22:166-76)。诱导型CER表达也可以通过使用选择性钩(RUSH)系统进行驻留，所述驻留是基于锚定于内质网膜上的链霉亲和素和引入的CER结构的链霉亲和素结合蛋白来实现，其中向该系统加入生物素导致CER从内质网释放(Agaugue等，2015,Mol.Ther.23(Suppl.1):S88)。
如在本申请中所使用的，术语“重组的”或“非天然的”指生物体、微生物、细胞、核酸分子或载体包含至少一个遗传改变或已通过引入外源性核酸分子进行了修饰，其中此类改变或修饰通过基因工程改造引入。遗传改变包括例如引入编码蛋白、嵌合蛋白或酶的可表达核酸分子的修饰，或者其他核酸分子的添加、缺失、取代，或其他细胞遗传物质功能性破坏。其他修饰包括例如非编码调控区，其中所述修饰改变基因或操纵子的表达。在某些实施方式中，可以通过引入编码如本申请所述CER的核酸以使细胞表达定位于细胞表面的CER，从而将来自对象的细胞(如T细胞)基因修饰成非天然的或重组的细胞(例如，非天然或重组的T细胞)。
在本申请中将编码核心病毒的载体称为“病毒载体”。存在大量适用于本公开内容的组合物的病毒载体，包括经鉴定用于人类基因疗法应用的那些(参见，Pfeifer和Verma,Ann.Rev.Genomics Hum.Genet.2:177,2001)。适宜病毒载体包括基于RNA病毒的载体，如来源于逆转录病毒的载体，例如来源于莫洛尼小鼠白血病病毒(MLV)的载体，以及包括来源于更复杂的逆转录病毒的载体，例如来源于慢病毒的载体。来源于HIV-1的载体属于这一类别。其他实例包括来源于HIV-2、FIV、马传染性贫血病毒、SIV和Maedi-Visna病毒(绵羊慢病毒)的慢病毒载体。使用逆转录病毒和慢病毒载体以及包装细胞用于使用含有嵌合受体转基因的病毒颗粒转导哺乳动物宿主细胞的方法是本领域公知的并且此前已有描述，例如，在美国专利号8,119,772；Walchli等，PLoS One 6:327930,2011；Zhao等，J.Immunol.174:4415,2005；Engels等，Hum.Gene Ther.14:1155,2003；Frecha等，Mol.Ther.18:1748,2010；Verhoeyen等，Methods Mol.Biol.506:97,2009中。逆转录病毒和慢病毒载体构建体以及表达系统也是能够购买得到的。
在某些实施方式中，病毒载体用于引入编码对靶点具有特异性的CER的非内源性核酸序列。病毒载体可以是逆转录病毒载体或慢病毒载体。病毒载体还可以包含编码用于转导的标记物的核酸序列。用于病毒载体的转导标记物是本领域公知的，并且包括选择标记物，其可以赋予药物抗性，或可检测标记物，如能够被如流式细胞术等方法检测到的荧光标记物或细胞表面蛋白。在特定实施方式中，病毒载体还包含用于转导的基因标记物，所述基因标记物包含荧光蛋白(例如，绿色、黄色)、人CD2的胞外域或截短的人EGFR(编码SEQ IDNO:121的氨基酸序列)(huEGFRt；参见，Wang等，Blood 118:1255,2011)。当病毒载体基因组包含将在宿主细胞中作为单独转录物表达的多个核酸序列时，所述病毒载体还可以包含在两个(或更多个)转录物之间的附加序列，从而能够进行双顺反子或多顺反子表达。在病毒载体中使用的此类序列的实例包括内部核糖体进入位点(IRES)、弗林蛋白酶切割位点、病毒2A肽(例如，T2A、P2A、E2A、F2A)或其任意组合。
图2A和2B提供了说明性的CER载体。图2A中所示的CER载体包含单一吞噬信号传导结构域。图2B中所示的CER载体包含含有主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域的吞噬信号传导结构域。
还可以将其他病毒载体用于多核苷酸递送，包括DNA病毒载体，包括例如基于腺病毒的载体和基于腺相关病毒(AAV)的载体；来自单纯疱疹病毒(HSV)的载体，包括扩增子载体、复制缺陷HSV和减毒HSV(Krisky等，Gene Ther.5:1517,1998)。
还可以将最近开发用于基因疗法用途的其他病毒载体与本公开内容的组合物和方法一起使用。此类载体包括来自杆状病毒和α-病毒的那些(Jolly,D J.1999.EmergingViral Vectors.pp 209-40in Friedmann T.ed.The Development of Human GeneTherapy.New York:Cold Spring Harbor Lab)，或质粒载体(如睡美人或其他转座子载体)。在一些实施方式中，病毒或质粒载体还包含用于转导的基因标记物(例如，绿色荧光蛋白，huEGFRt(编码SEQ ID NO:121的氨基酸序列))。
在某些实施方式中，将基因编辑方法用于修饰宿主细胞基因组以包含编码本公开内容的CER的多核苷酸。基因编辑或基因组编辑是一种基因工程方法，其中使用基因工程核酸内切酶从宿主细胞的基因组中插入、替代或除去DNA。核酸酶在基因组中的靶基因座处形成特异性的双链断裂。然后，宿主细胞的内源性DNA修复途径修复所诱导的一个或多个断裂，例如通过非同源末端连接(NHEJ)和同源重组。在基因编辑中使用的示例性核酸内切酶包括锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应(TALE)核酸酶、成簇的规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas核酸酶系统(例如，CRISPR-Cas9)、大范围核酸酶或其组合。使用基因编辑核酸内切酶在包括B细胞和T细胞的免疫细胞中破坏或敲除基因或基因表达的方法是本领域公知的，并且例如在PCT公开号WO 2015/066262；WO 2013/074916；WO 2014/059173；Chu等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2016 113:12514-12519中对其进行了描述；每个方法的全部内容均通过引用并入本申请。
在某些实施方式中，对B细胞、淋巴前体细胞(包括常见的淋巴细胞前体细胞)、抗原提呈细胞(包括树突状细胞、朗格汉斯细胞)、骨髓前体细胞或成熟骨髓细胞进行修饰以包含编码本公开内容的CER的非内源性核酸分子。
在一些实施方式中，对B细胞进行遗传修饰以表达一种或多种CER。B细胞具有对作为宿主细胞可能是有利的某些性质，包括：运输到炎症部位(例如，淋巴结、肿瘤)，能够内化和提呈抗原，能够共刺激T细胞，高度增殖和自我更新(持续终生)。在某些实施方式中，CER修饰的B细胞能够将吞噬的靶细胞或吞噬的靶颗粒消化成更小的肽并通过MHC分子将其提呈至T细胞。CER修饰的B细胞的抗原提呈可能有助于抗原将免疫应答扩散至对非靶向抗原。B细胞包括定向于B细胞谱系(例如，前-原-B细胞、原-B细胞和前-B细胞)的祖细胞或前体细胞；未成熟和未活化的B细胞或者成熟的和功能性的或活化的B细胞。在某些实施方式中，B细胞可以是幼稚B细胞、浆细胞、调节性B细胞、边缘区B细胞、滤泡性B细胞、淋巴浆细胞样细胞、浆母细胞、记忆B细胞或其任意组合。可以根据幼稚B细胞上缺乏CD27的表达将记忆B细胞与幼稚B细胞相区分开。在某些实施方式中，B细胞可以是来自人类、小鼠、大鼠或其他哺乳动物的原代细胞或细胞系。B细胞系是本领域技术人员熟知的。如果从哺乳动物获得，B细胞可以从很多来源获得，包括血液、骨髓、脾脏、淋巴结或其他组织或体液。在某些实施方式中，B细胞是从肿瘤部位分离的(肿瘤浸润B细胞)。B细胞组分可以是富集的或纯化的。
在某些实施方式中，宿主B细胞内源性基因的表达被抑制、敲减或敲除。在B细胞中可以被抑制、敲减或敲除的内源性基因的实例包括B细胞受体(BCR)基因(例如，CD79b、IGH、IGκ、IGλ或其任意组合)，免疫检查点分子(例如，PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、B7-H3、B7-H4、HVEM、腺苷、GAL9、VISTA、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、PVRL2、PD-1、CTLA-4、BTLA、KIR、LAG3、TIM3、A2aR、CD244/2B4、CD160、TIGIT、LAIR-1、PVRIG/CD112R或其任意组合)或者其任意组合。可以在基因水平、转录水平、翻译水平或者其组合水平抑制、敲减或敲除BCR基因、免疫检查点分子基因或者这两者的表达。例如可以通过RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA等)或经工程改造的核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas核酸酶系统、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶或其任意组合)实现抑制、敲减或敲除BCR基因、免疫检查点分子基因或者这两者的方法。在一些实施方式中，通过将编码本公开内容的CER的多核苷酸插入内源性B细胞基因的基因座将内源性基因(例如，BCR基因或免疫检查点分子基因)敲除，如通过经工程改造的核酸内切酶。
在一些实施方式中，在细胞表面上能够表达本公开内容的CER的细胞是T细胞，包括CD4+、CD8+、幼稚(CD45RA+、CCR7+、CD62L+、CD27+、CD45RO-)、中央记忆(CD45RO+、CD62L+、CD8+)、效应记忆(CD45RA+、CD45RO-、CCR7-、CD62L-、CD27-)、病毒特异性、粘膜相关恒定、γδ(gd)、组织驻留T细胞和自然杀伤T细胞。在某些实施方式中，T细胞可以是来自人类、小鼠、大鼠或其他哺乳动物的原代细胞或细胞系。如果从哺乳动物获得，T细胞可以从很多来源获得，包括血液、骨髓、淋巴结、胸腺或其他组织或体液。在某些实施方式中，T细胞是从肿瘤部位分离的(肿瘤浸润T细胞)。T细胞组分可以是富集的或纯化的。T细胞系是本领域熟知的，其中的一些如Sandberg等，Leukemia 21:230,2000中所述。在某些实施方式中，使用缺乏TCRα和β链的内源性表达的T细胞。此类T细胞可以天然地缺乏TCRα和β链的内源性表达，或者可以已被修饰以阻断表达(例如，来自不表达TCRα和β链的转基因小鼠的T细胞，或者细胞已被操纵以抑制TCRα和β链的表达)，或者敲除TCRα链、TCRβ链或这两个基因。在某些实施方式中，在细胞表面上能够表达本公开内容的嵌合蛋白的细胞不是T细胞或T细胞谱系的细胞，而是祖细胞、干细胞或已被修饰以表达细胞表面抗-CD3的细胞。
在某些实施方式中，转染以表达本公开内容的CER的宿主T细胞是功能性T细胞，如病毒特异性T细胞、肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞、幼稚T细胞、记忆干T细胞、中央或效应记忆T细胞或者CD4+CD25+调节性T细胞。
在某些实施方式中，宿主T细胞内源性基因的表达被抑制、敲减或敲除。在T细胞中可以被抑制、敲减或敲除的内源性基因的实例包括TCR基因(TRA、TRB或者这两者)、HLA基因(I类HLA基因、II类HLA基因或者这两者)、免疫检查点分子(PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、B7-H3、B7-H4、HVEM、腺苷、GAL9、VISTA、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、PVRL2、PD-1、CTLA-4、BTLA、KIR、LAG3、TIM3、A2aR、CD244/2B4、CD160、TIGIT、LAIR-1、PVRIG/CD112R或其任意组合)或者其任意组合。可以在基因水平、转录水平、翻译水平或者其组合抑制、敲减或敲除TCR基因、HLA基因、免疫检查点分子基因或者其任意组合的表达。例如可以通过RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA等)或经工程改造的核酸内切酶(例如，CRISPR/Cas核酸酶系统、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶或其任意组合)实现抑制、敲减或敲除TCR基因、HLA基因、免疫检查点分子基因或者其任意组合的方法。在一些实施方式中，通过将编码本公开内容的CER的多核苷酸插入内源性T细胞基因的基因座将内源性基因(例如，TCR基因、HLA基因或免疫检查点分子基因)敲除，如通过经工程改造的核酸内切酶。
在某些实施方式中，可以对宿主细胞进行基因修饰以表达一种类型的CER。在其他实施方式中，宿主细胞可以表达至少两种或多种不同的CER。
在某些实施方式中，经修饰以表达一种或多种CER的宿主细胞群可以是B细胞群、T细胞群、自然杀伤细胞群、淋巴前体细胞群(包括常见淋巴细胞前体细胞)、抗原提呈细胞群(包括树突状细胞、朗格汉斯细胞)、骨髓前体细胞群、成熟骨髓细胞群或者其任意组合。在一个特定的实施方式中，经修饰以表达一种或多种CER的宿主细胞群是B细胞群、T细胞群或者这两者。
在某些实施方式中，在宿主细胞群中的每个宿主细胞表达相同的CER或一组CER。在其他实施方式中，宿主细胞群包含两个或多个宿主细胞亚群的混合物，其中每个亚群表达不同的CER或一组CER。
在某些实施方式中，经基因修饰以表达CER的宿主细胞还可以被修饰以共表达一种或多种小鸟苷三磷酸酶(GTPase)。Rho GTPase是一个小的(～21k Da)信号传导G蛋白家族并且也是一个Ras超家族的亚家族，其在多种细胞类型中调节肌动蛋白细胞骨架组织以及在吞噬作用过程中促进伪足延伸和吞噬体闭合(参见例如，Castellano等，2000,J.CellSci.113:2955-2961)。吞噬需要在束缚的细胞或颗粒下方进行F-肌动蛋白募集，并且F-肌动蛋白重排以允许导致细胞或颗粒内化的膜延伸。RhoGTPase包括RhoA、Rac1、Rac2、RhoG和CDC42。其他小GTPase(如Rap1)参与补体介导的吞噬作用的调控。小GTPase与CER的共表达可以促进宿主细胞对靶细胞或颗粒的内化和/或吞噬体形成。在一些实施方式中，编码GTPase的重组核酸分子在单独载体上而非含有CER的载体上编码。在其他实施方式中，编码GTPase的重组核酸分子在相同的含CER载体(其为多顺反子表达构建体)上编码。编码CER和一个或多个小GTPase的多核苷酸序列可以彼此之间被病毒2A肽序列(例如，T2A(SEQ IDNO:147)、P2A(SEQ ID NO:104)、E2A(SEQ ID NO:148)、F2A(SEQ ID NO:149))所分隔，以使得能够从单一开放阅读框架进行多顺反子表达。可以与CER共表达的GTPase的实例包括Rac1、Rac2、Rab5(也称为Rab5a)、Rab7、Rap1、RhoA、RhoG、CDC42或其任意组合。在特定的实施方式中，GTPase包含或者是与如下序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或至少100％同一性的序列：SEQ ID NO:76的Rac1氨基酸序列、SEQ ID NO:77的Rab5氨基酸序列、SEQ ID NO:122的Rab7氨基酸序列、SEQ ID NO:123的Rap1氨基酸序列、SEQ ID NO:124的RhoA氨基酸序列、SEQ ID NO:125的CDC42氨基酸序列或其任意组合。在多顺反子表达构建体的特定实施方式中，编码由P2A序列分隔的Tim4-MyD88t CER和小GTPase Rab5a的表达构建体可以包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列(CER9)。在又一个特定的实施方式中，CER成熟多肽序列包含SEQ ID NO:105中除氨基酸1-22的信号肽以外的序列。
在某些实施方式中，当制备表达如本申请所述的CER的宿主细胞(例如，B细胞或T细胞)时，可以向细胞培养物中加入促进宿主细胞(例如，B细胞或T细胞)增殖的一种或多种生长因子细胞因子。细胞因子可以是人源的或非人源的。可以用于促进T细胞增殖的示例性生长因子细胞因子包括IL-2、IL-15等。可以用于促进B细胞增殖的示例性生长因子细胞因子包括CD40L、IL-2、IL-4、IL-15、IL-21、BAFF等。
在进一步的实施方式中，使用选择性基因转移将CER载体定位至特定区域或器官。在一些实施方式中，使用选择性基因转移将CER载体定位至对象的肝或肺。
在使用CER载体对宿主细胞进行基因修饰之前，宿主细胞(例如，T细胞、B细胞、自然杀伤细胞等)的来源是从对象(例如，全血、外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织)中获得的，使用本领域公知的方法从其中分离宿主细胞。可以根据公知的技术收集特定宿主细胞亚群，并根据公知技术进行富集或耗竭，如与抗体亲和结合、流式细胞术和/免疫磁性选择。在富集和/或耗竭步骤并引入CER之后，可以根据公知的技术或其变化进行所需经修饰的宿主细胞的体外扩增，这对本领域技术人员而言将是显而易见的。
在某些实施方式中，包含根据本申请所述的任意实施方式的CER的宿主细胞(包括T细胞、B细胞、淋巴前体细胞、抗原提呈细胞、树突状细胞、朗格汉斯细胞、骨髓前体细胞和成熟骨髓细胞)对靶细胞具有约20至约1,500的吞噬指数。“吞噬指数”是转导的宿主细胞吞噬活性的量度，其通过计数预定时间段中在培养基中孵育的靶细胞和CER修饰宿主细胞的混悬液中每个CER修饰宿主细胞摄入的靶细胞数确定。可以通过[吞噬靶细胞的总数/计数的CER修饰细胞的总数(例如，吞噬频率)]x[每个CER+Ba/F3细胞的靶细胞染色的平均面积x100(例如，杂交捕获)]或者[吞噬颗粒的总数/计数的CER修饰细胞的总数]x[含有吞噬颗粒的CER修饰宿主细胞的数量/计数的CER细胞的总数]x100计算吞噬指数。在某些实施方式中，CER修饰细胞具有约30至约1,500；约40至约1,500；约50至约1,500；约75至约1,500；约100至约1,500；约200至约1,500；约300至约1,500；约400至约1,500；约500至约1,500；约20至约1,400；约30至约1,400；约40至约1,400；约50至约1,400；约100至约1,400；约200至约1,400；约300至约1,400；约400至约1,400；约500至约1,400；约20至约1,300；约30至约1,300；约40至约1,300；约50至约1,300；约100至约1,300；约200至约1,300；约300至约1,300；约400至约1,300；约500至约1,300；约20至约1,200；约30至约1,200；约40至约1,200；约50至约1,200；约100至约1,200；约200至约1,200；约300至约1,200；约400至约1,200；约500至约1,200；约20至约1,100；约30至约1,100；约40至约1,100；约50至约1,100；约100至约1,100；约200至约1,100；约300至约1,100；约400至约1,100；或约500至约1,100；约20至约1,000；约30至约1,000；约40至约1,000；约50至约1,000；约100至约1,000；约200至约1,000；约300至约1,000；约400至约1,000；或约500至约1,000；约20至约750；约30至约750；约40至约750；约50至约750；约100至约750；约200至约750；约300至约750；约400至约750；或约500至约750；约20至约500；约30至约500；约40至约500；约50至约500；约100至约500；约200至约500；或约300至约500的吞噬指数。在进一步的实施方式中，孵育时间是约2小时至约4小时、约2小时、约3小时或约4小时。在进一步的实施方式中，CER修饰细胞显示出的吞噬指数在统计学上显著高于使用截短的EGFR对照转导的细胞。可以使用本领域公知的和在实施例中进一步描述的方法计算吞噬指数，包括通过流式细胞术或荧光显微镜进行定量。
宿主细胞可以来自动物，如灵长类、奶牛、马、绵羊、犬、猫、小鼠、大鼠、家兔、豚鼠或猪。在一个优选的实施方式中，所述动物是人。宿主细胞可以来自健康对象或患有与抗原的表达相关的疾病的对象。
CER和经修饰以表达CER的细胞的用途
本公开内容提供了用于改变宿主细胞吞噬表型的方法。在一个方面中，本公开内容提供了用于生产显示出吞噬表型的细胞群的方法，所述方法包括向未天然显示出吞噬表型的宿主细胞群引入编码根据本申请所述的任何实施方式的至少一种CER或包含至少一种CER的载体的核酸分子；并且在宿主细胞群中表达所述至少一种CER。在某些实施方式中，所述吞噬表型是吞噬作用。
在另一个方面中，本公开内容提供了用于改变细胞群的吞噬表型的方法，所述方法包括向宿主细胞群引入编码根据本申请所述的任何实施方式的至少一种CER或包含至少一种CER的载体的核酸分子；并且在宿主细胞群中表达所述至少一种CER，其中所述至少一种CER赋予对宿主细胞未天然靶向的促吞噬标记物或抗原标记物(靶抗原)具有特异性的吞噬表型。在某些实施方式中，所述吞噬表型是吞噬作用。
在又一个方面中，本公开内容提供了用于增强细胞群的吞噬表型的方法，所述方法包括向宿主细胞群引入编码根据本申请所述的任何实施方式的至少一种CER或包含至少一种CER的载体的核酸分子；并且在宿主细胞群中表达所述至少一种CER，其中所述至少一种CER对宿主细胞天然靶向的促吞噬标记物或抗原标记物(靶抗原)具有特异性并且宿主细胞表达所述至少一种CER增强了宿主细胞对显示出被靶向的促吞噬或抗原标记物的细胞、微生物或颗粒的吞噬作用。
还可以将根据本申请所述的任何实施方式的CER，编码CER的核酸分子，包含CER的载体和表达CER的宿主细胞用于治疗患有疾病、病症或不利病况的对象的方法中。这些方法的实施方式包括向对象施用治疗有效量的根据本说明书的包含一种或多种CER的药物组合物，编码一种或多种CER的核酸分子，包含一种或多种CER的载体或经基因修饰以表达一种或多种CER的宿主细胞群。
可以使用表达如本公开内容所述的CER的细胞治疗的疾病包括癌症、感染性疾病(病毒、细菌、真菌、原生动物感染)、炎性疾病、免疫疾病(例如，自身免疫性疾病、炎性肠病、多发性硬化症)、退行性疾病(例如，关节和软骨)和神经退行性疾病(例如，阿尔茨海默氏病)。过继免疫和基因疗法是用于各种类型的癌症(Morgan等，Science314:126,2006；Schmitt等，Hum.Gene Ther.20:1240,2009；June,J.Clin.Invest.117:1466,2007)和感染性疾病(Kitchen等，PLoS One 4:38208,2009；Rossi等，Nat.Biotechnol.25:1444,2007；Zhang等，PLoS Pathog.6:e1001018,2010；Luo等，J.Mol.Med.89:903,2011)的有希望的疗法。
能够利用本公开内容的组合物和方法治疗的对象包括动物，如人类、灵长类、奶牛、马、绵羊、犬、猫、小鼠、大鼠、家兔、豚鼠或猪。对象可以是雄性或雌性，并且可以是任意适宜的年龄，包括婴儿、少年、青年、成年和老年对象。
多种癌症，包括实体瘤和白血病，均适于本申请公开的组合物和方法。可以治疗的示例性癌症类型包括乳腺、前列腺和结肠腺癌；所有形式的肺支气管肺癌；髓样白血病；黑色素瘤；肝癌；神经母细胞瘤；乳头状瘤；胺前体摄取与脱羧细胞瘤；迷芽瘤；鳃原瘤；恶性类癌综合征；类癌心脏病；和癌(例如，Walker癌、基底细胞癌、基底鳞状细胞癌、Brown-Pearce癌、导管癌、Ehrlich肿瘤、Krebs 2癌、Merkel细胞癌、粘液性癌、非小细胞肺癌、燕麦细胞癌、乳头状癌、硬癌、细支气管癌、支气管癌、磷状细胞癌和过渡细胞癌)。可以治疗的其他癌症类型包括组织细胞病；恶性组织细胞病；白血病；霍奇金氏病；免疫增生性小肠病；非霍奇金氏淋巴瘤；浆细胞瘤；多发性骨髓瘤；浆细胞瘤；网状内皮组织增殖；黑色素瘤；软骨母细胞瘤；软骨瘤；软骨肉瘤；纤维瘤；纤维肉瘤；巨细胞瘤；组织细胞瘤；脂肪瘤；脂肪肉瘤；间皮瘤；粘液瘤；粘液肉瘤；骨瘤；骨肉瘤；脊索瘤；颅咽管瘤；无性细胞瘤；错构瘤；间质瘤；中肾瘤；肌肉瘤；成釉细胞瘤；牙骨质瘤；牙瘤；畸胎瘤；胸腺瘤；滋养细胞肿瘤。而且，还考虑适于治疗下述类型的癌症：腺瘤；胆管瘤；胆脂瘤；圆柱瘤；囊腺癌；囊腺瘤；颗粒细胞瘤；两性胚胎细胞瘤；肝癌；汗腺瘤；胰岛细胞瘤；莱迪希细胞瘤；乳头状瘤；支持细胞瘤；卵泡膜细胞瘤；平滑肌瘤；平滑肌肉瘤；成肌细胞瘤；肌瘤；肌肉瘤；横纹肌瘤；横纹肌肉瘤；室管膜瘤；神经节细胞瘤；神经胶质瘤；髓母细胞瘤；脑膜瘤；神经鞘瘤；神经母细胞瘤；神经上皮瘤；神经纤维瘤；神经瘤；副神经节瘤；副神经节瘤非嗜铬细胞瘤。可以治疗的癌症类型还包括血管角化瘤；血管淋巴样增生伴嗜酸性粒细胞增多；血管瘤硬化；血管瘤病；血管球瘤；血管内皮瘤；血管瘤；血管外皮细胞瘤；血管肉瘤；淋巴管瘤；淋巴管肌瘤；淋巴管肉瘤；松果体瘤；癌肉瘤；软骨肉瘤；叶状囊肉瘤；纤维肉瘤；血管肉瘤；平滑肌肉瘤；白血病性肉瘤；脂肪肉瘤；淋巴管肉瘤；肌肉瘤；粘液肉瘤；卵巢癌；横纹肌肉瘤；肉瘤；赘生物；神经纤维瘤病和宫颈不典型增生。
适于CER疗法的示例性过度增生性病症是B细胞癌，包括B细胞淋巴瘤(如各种形式的霍奇金氏病、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)或中枢神经系统淋巴瘤)、白血病(如急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病、慢性髓性白血病的B母细胞转化)和骨髓瘤(如多发性骨髓瘤)。其他B细胞癌症包括小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞幼淋巴细胞白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞性骨髓瘤、骨单发浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)的节外边缘区B细胞淋巴瘤、淋巴结边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病、不确定恶性潜能的B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病和移植后淋巴组织增生性疾病。
炎性和自身免疫性疾病包括关节炎、类风湿性关节炎、青少年类风湿性关节炎、骨关节炎、多软骨炎、银屑病关节炎、银屑病、皮炎、多发性肌炎/皮肌炎、包涵体肌炎、炎性肌炎、中毒性表皮坏死松解症、系统性硬皮病和硬化症、CREST综合征、炎性肠病、克隆氏病、溃疡性结肠炎、呼吸窘迫综合征、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、肾小球肾炎、过敏性疾病、湿疹、哮喘、涉及T细胞浸润和慢性炎症反应的病况、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、白细胞粘附缺陷、系统性红斑狼疮(SLE)、亚急性皮肤红斑狼疮、盘状红斑狼疮、狼疮性脊髓炎、狼疮性脑炎、青少年发病的糖尿病、多发性硬化症、过敏性脑脊髓炎、视神经脊髓炎、风湿热、西登哈姆氏舞蹈病、与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性超敏反应相关的免疫应答、结核病、结节病、肉芽肿病，包括韦格纳肉芽肿和Churg-Strauss病、粒细胞缺乏症、血管炎(包括过敏性血管炎/脉管炎、ANCA和类风湿性血管炎)、再生障碍性贫血、Diamond Blackfan贫血、免疫性溶血性贫血，包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)、恶性贫血、纯红细胞再生障碍(PRCA)、因子VIII缺乏、甲型血友病、自身免疫性中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞渗出的疾病、中枢神经系统(CNS)炎性病症、阿尔茨海默氏病、多器官损伤综合征、重症肌无力、抗原-抗体复合物介导的疾病、抗肾小球基底膜疾病、抗磷脂抗体综合征、过敏性神经炎、Behcet病、Castleman综合征、Goodpasture综合征、Lambert-Eaton肌无力综合征、Reynaud综合征、Sjorgen综合征、Stevens-Johnson综合征、实体器官移植排斥反应、移植物抗宿主病(GVHD)、大疱性类天疱疮、天疱疮、自身免疫性多内分泌病、血清阴性脊柱关节病、雷特氏病、僵人综合征、巨细胞动脉炎、免疫复合性肾炎、IgA肾病、IgM多发性神经病或IgM介导的神经病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)、Henoch-Schonlein紫癜、自身免疫性血小板减少症、睾丸和卵巢自身免疫性疾病，包括自身免疫性睾丸炎和卵巢炎、原发性甲状腺功能减退症；自身免疫性内分泌疾病包括自身免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺功能减退症、艾迪生氏病、格雷夫斯氏病、自身免疫性多腺体综合征(或多腺内分泌综合征)、I型糖尿病(也称为胰岛素依赖性糖尿病)和席汉氏综合征；自身免疫性肝炎、淋巴样间质性肺炎(LIP)、闭塞性细支气管炎(非移植)、非特异性间质性肺炎(NSIP)、格林-巴利综合征、大血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(Takayasu)动脉炎)、中血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)、结节性多动脉炎(PAN)强直性脊柱炎、伯格氏病(IgA肾病)、急进性肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬化、口炎性腹泻(麸质肠病变)、冷球蛋白血症、与肝炎相关的冷球蛋白血症、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、冠状动脉疾病、家族性地中海热、显微镜下多血管炎、Cogan综合征、Wiskott-Aldrich综合征和血栓闭塞性脉管炎。在某些实施方式中，在治疗炎性疾病的背景下，设计具有稳态(非炎性)吞噬信号传导结构域的CER可能是优选的。
感染性疾病包括与感染因子相关的那些并且包括任意多种细菌(例如，致病性E.coli、S.typhimurium、P.aeruginosa、B.anthracis、C.botulinum、C.difficile、C.perfringens、H.pylori、V.cholerae、Listeria spp.、Rickettsia spp.、Chlamydiaspp.等)、分枝杆菌和寄生虫(包括原生动物任何已知的寄生虫成员)。感染性病毒包括真核病毒，如腺病毒、布尼亚病毒、疱疹病毒、乳多空病毒、乳头瘤病毒(例如，HPV)、副粘病毒、小核糖核酸病毒、弹状病毒(例如，狂犬病病毒)、正粘病毒(例如，流感病毒)、痘病毒(例如，牛痘病毒)、呼肠孤病毒、逆转录病毒、慢病毒(例如HIV)、黄病毒(例如，HCV，HBV)等。在某些实施方式中，将包含根据本公开内容的CER的组合物用于治疗能够在对象中建立持续感染的微生物的感染。
神经退行性疾病包括路易体病、脊髓灰质炎综合征、Shy-Draeger综合征、橄榄体脑小脑萎缩、帕金森氏病、多系统萎缩、纹状体神经变性、伴有泛素化包涵体的额颞叶变性(FLTD-U)、tau蛋白病(包括但不限于阿尔茨海默氏病和核上性麻痹)、朊病毒疾病(也称为传染性海绵状脑病，包括但不限于牛海绵状脑病、瘙痒病、Creutz-feldt-Jakob综合征、库鲁病、Gerstmann-Straussler-Scheinker病、慢性消耗性疾病和致命性家族性失眠症)、延髓麻痹、运动神经元病(包括肌萎缩性侧索硬化症(Lou Gherig病))和神经系统异常退行性疾病(包括但不限于卡纳万病、亨廷顿病、神经元蜡样质脂褐质沉积病、亚历山大病、图雷特综合征、Menkes扭结发综合征、科凯恩综合征、Halervorden-Spatz综合征、拉福拉病、雷特综合征、肝豆状核变性、莱施-尼汉综合征和Unverricht-Lundborg综合征)、痴呆(包括但不限于皮克病和脊髓小脑共济失调)、癌症(例如，CNS和/或脑部的，包括由身体其他部位的癌症导致的脑转移)。许多神经退行性疾病，包括阿尔茨海默氏病、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化症(Lou Gehrig病)和朊病毒病，都具有神经病理学特征异常蛋白的累积，如在阿尔茨海默氏病中的β淀粉样蛋白或tau；在帕金森氏病(PD)、路易体痴呆、多系统萎缩或阿尔茨海默氏病中的α-突触核蛋白；亨廷顿病中的亨廷顿蛋白，肌萎缩性侧索硬化症中的SOD1亨廷顿病或肌萎缩性侧索硬化症中具有多鸟苷酸(polyQ)重复的蛋白；在肌萎缩性侧索硬化症或FLTD-U中的TDP-43；或者在朊病毒病中的朊病毒蛋白(例如，PrPSc)。因此，在某些实施方式中，可以将CER疗法设计为靶向疾病相关蛋白以减少或阻止异常蛋白累积，从而延缓或防止神经退行性疾病的进展。
可以以细胞结合形式(例如，靶细胞群(成熟T细胞(例如，CD8+或CD4+T细胞)或T细胞谱系的其他细胞)的基因疗法)向对象施用本公开内容的CER。因此，例如，可以向对象施用本公开内容的CER，所述CER在T细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T细胞、B细胞、淋巴前体细胞、抗原提呈细胞、树突状细胞、朗格汉斯细胞、骨髓前体细胞、成熟骨髓细胞，包括其子集或其任意组合的表面上表达。在某些实施方式中，治疗患者的方法包括施用有效量的CER修饰的细胞(即，表达一种或多种CER的重组细胞)。在此类实施方式中，所述CER修饰的细胞是T细胞谱系、自然杀伤细胞谱系、自然杀伤T细胞谱系、B细胞谱系、淋巴前体细胞谱系、树突状细胞谱系、朗格汉斯细胞谱系、骨髓细胞谱系或其任意组合的异基因、同基因、同种异体或自体细胞。
包含CER修饰的细胞的药物组合物可以以由医疗领域的技术人员确定的适于所治疗(或预防)的疾病或病症的方式施用。将通过这些因素如患者病况、体格、体重、体表面积、年龄、性别、疾病的类型和敏感性、所施用的特定疗法、活性成分的特定形式、施用的时间和方法以及伴随施用的其他药物确定组合物施用的适宜剂量、适宜持续时间和频率。本公开内容提供了药物组合物，所述药物组合物包含CER修饰的细胞和药学上可接受的运载体、稀释剂或赋形剂。适宜的赋形剂包括水、盐水、右旋糖、甘油等及其组合。其他适宜的输注介质可以是任意的等渗介质制剂，包括盐水、Normosol R(Abbott)、Plasma-Lyte A(Baxter)、5％右旋糖的水溶液或林格氏乳酸盐。
在药物组合物中细胞的治疗有效量至少是1个细胞(例如，1个CER修饰的B细胞)或者更通常地是多于102个细胞，例如，多达106、多达107、多达108个细胞、多达109个细胞、多达1010个细胞或多达1011个细胞或者更多。在某些实施方式中，细胞以从约106至约1010个细胞/m2的范围，优选地约107至约109个细胞/m2的范围施用。细胞数量取决于组合物的最终用途以及其中包含的细胞类型。例如，含有经修饰以含有对特定抗原具有特异性的CER的细胞的组合物将包含含有约5％至约95％或更多此类细胞的细胞群。在某些实施方式中，包含CER修饰细胞的组合物包含含有至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多此类细胞的细胞群。对于本申请提供的用途，细胞通常为1升或更少、500ml或更少、250ml或更少或者100ml或更少体积。因此，所需细胞的密度通常大于104个细胞/ml，以及一般大于107个细胞/ml、一般为108个细胞/ml或更大。细胞可以作为单次输注或者在一段时间内的多次输注施用。如果存在疾病或疾病活动的复发，则CER修饰细胞的重复输注可以间隔数天、数周、数月或者甚至数年。可以将临床相关数量的免疫细胞分配至累积等于或超过106、107、108、109、1010或1011个细胞的多次输注中。用于施用包含本申请所述的重组表达载体的宿主细胞的优选剂量为约107个细胞/m2、约5x 107个细胞/m2、约108个细胞/m2、约5x 108个细胞/m2、约109个细胞/m2、约5x109个细胞/m2、约1010个细胞/m2、约5x 1010个细胞/m2或者约1011个细胞/m2。在某些实施方式中，给予CER修饰B细胞的组合物和CER修饰T细胞的组合物这两者，其可以同时、并行或顺序施用。
在一些实施方式中，如本申请所述的组合物静脉内、腹腔内、瘤内、骨髓内、淋巴结内和/或脑脊液内施用。在一些实施方式中，将嵌合吞噬受体工程化的组合物递送至肿瘤部位。
在一些实施方式中，将CER修饰的细胞与一种或多种其他疗法联合或组合施与对象。在此类实施方式中，所述一种或多种其他疗法可以是放疗、基因工程改造的细胞免疫疗法(例如，T细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞、巨噬细胞、嵌合抗原受体(CAR)疗法)、抗体疗法、免疫检查点分子抑制剂疗法或药物疗法，如化疗剂、治疗性肽、抗生素、抗病毒剂、抗真菌剂、抗炎剂或小分子疗法的一种或多种。在此类实施方式中，所述CER修饰细胞可以清除凋亡、死亡、濒死、损伤、感染或坏死细胞显示出的在一种或多种其他疗法背景下诱导的促凋亡标记物。在其中CER修饰细胞与一种或多种其他疗法联合施用的某些实施方式中，由于与CER疗法联用的相加或协同作用，因而一种或多种其他疗法可以以亚治疗剂量施用。联用疗法包括在其他疗法之前(例如，在其他疗法之前1天至30天或更多天)、与其他疗法同时(在同一天)或在其他疗法之后(例如，在其他疗法之后1天至30天或更多天)施用CER。在某些实施方式中，CER修饰的细胞在一种或多种其他疗法施用后施用。在进一步的实施方式中，在一种或多种其他疗法施用后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天施用CER修饰的细胞。在又一个实施方式中，在一种或多种附加疗法施用后4周内、3周内、2周内或1周内施用CER修饰的细胞。在一种或多种其他疗法涉及多次给药的情况下，CER修饰的细胞可以在一种或多种其他疗法首次给药后，在一种或多种其他疗法最后一次给药后或者一种或多种其他疗法多次给药之间施用。
三联疗法(射线+CER+CAR/或TCR)方案的实例如图134中所示。放疗后，向对象施用根据本公开内容的肿瘤抗原特异性CER修饰的宿主细胞(例如，包含与肿瘤抗原结合的结合结构域)以促进抗肿瘤免疫应答并将免疫激活细胞募集至肿瘤微环境中。在某些实施方式中，CER流向局部经照射的肿瘤并使肿瘤组织可以被免疫浸润和破坏(例如，通过表达炎性细胞因子、激活效应T细胞、激活树突状细胞、抑制调节性T细胞)，从而使肿瘤微环境对随后的过继性T细胞免疫疗法(例如，CAR或TCR免疫疗法)敏感。在某些实施方式中，在施用放疗后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天施用CER修饰的细胞。在进一步的实施方式中，在施用放疗后4周内、3周内、2周内或1周内施用CER修饰的细胞。在某些实施方式中，在CER疗法施用后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天或者在CER疗法施用后4周内、3周内、2周内或1周内施用CAR或TCR免疫疗法。在某些实施方式中，放疗、CAR或TCR免疫疗法或者这两者以亚治疗水平施用。
可以用于与CER疗法联用的放疗的实例包括外部光束放疗(例如，常规外部光束放疗、立体定向放疗、3维适形放疗、强度调制放疗、容积调制电弧疗法、粒子疗法、质子疗法和螺旋疗法)、近距离放射疗法、全身放射性同位素疗法、术中放疗或者其任意组合。
可以与CER疗法联用的被靶向的免疫检查点分子的实例包括PD-L1、PD-L2、CD80、CD86、B7-H3、B7-H4、HVEM、腺苷、GAL9、VISTA、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、PVRL2、PD-1、CTLA-4、BTLA、KIR、LAG3、TIM3、A2aR、CD244/2B4、CD160、TIGIT、LAIR-1、PVRIG/CD112R或者其任意组合。在某些实施方式中，免疫检查点分子抑制剂是抗体、肽、RNAi剂或小分子。对CTLA-4具有特异性的抗体可以是伊匹单抗或曲美母单抗。对PD-1具有特异性的抗体可以是pidilizumab、纳武单抗或派姆单抗。对PD-L1具体特异性的抗体可以是德瓦鲁单抗(durvalumab)、阿特珠单抗或阿维鲁单抗(avelumab)。
示例性的化疗剂包括烷化剂、基于铂的药剂、血管生成抑制剂(例如，VEGF通路抑制剂)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，EGF通路抑制剂)、B-Raf抑制剂、MEK抑制剂、mTOR抑制剂、细胞毒剂、染色质功能抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、微管抑制药、DNA损伤剂、抗代谢物(如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和糖修饰类似物)、DNA合成抑制剂、DNA相互作用剂(如嵌入剂)和DNA修复抑制剂。
考虑用于联用疗法的化疗剂的实例包括维罗非尼、达拉非尼、曲美替尼、考比替尼、阿那曲唑(瑞宁得)、比卡鲁胺(康士得)、硫酸博来霉素白消安(马利兰)、白消安注射液(白舒非)、卡培他滨(希罗达)、N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷、卡铂(铂尔定)、卡莫司汀苯丁酸氮芥(瘤可宁)、顺铂(普拉汀诺)、克拉屈滨环磷酰胺(或)、阿糖胞苷、阿糖胞苷(赛德萨)、阿糖胞苷脂质体注射液达卡巴嗪放线菌素(放线菌素D，Cosmegan)、盐酸柔红霉素柠檬酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松、多西紫杉醇(泰索帝)、盐酸多柔比星(阿霉素)、依托泊苷(凡毕士)、磷酸氟达拉滨(氟达华)、5-氟尿嘧啶 氟他胺替扎他滨、吉西他滨(二氟去氧胞苷)、羟基脲(爱治)、伊达比星异环磷酰胺伊立替康(开普拓)、L-天冬酰胺酶甲酰四氢叶酸钙、美法仑(爱克兰)、6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌(诺肖林)、吉妥单抗、紫杉醇phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、含卡莫司汀植入物的聚苯丙生20柠檬酸他莫昔芬替尼泊苷(威猛)、6-硫鸟嘌呤、硫噻吩、替拉扎明注射液盐酸托泊替康长春碱长春新碱和长春瑞滨
示例性的烷化剂包括氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯：乌拉莫司汀(Aminorualcil Uracil nitrogen )、氮芥环磷酰胺(癌得星RevimmuneTM)、异环磷酰胺美法伦(艾克兰)、苯丁酸氮芥(瘤可宁)、哌泊溴烷三亚乙基三聚氰胺三亚乙基硫代磷酰胺、替莫唑胺噻替派白消安(白舒非马利兰)、卡莫司汀洛莫司汀链脲菌素(链佐星)和达卡巴嗪其他示例性的烷化剂包括但不限于奥沙利铂(乐沙定)；替莫唑胺(和)；放线菌素(也称为放线菌素D，)；美法仑(也称为L-PAM，L-溶瘤毒素和苯丙氨酸氮芥，爱克兰)；六甲蜜胺(也称为六甲蜜胺(HMM)，克瘤灵)；卡莫司汀苯达莫司汀白消安(白舒非和马利兰)；卡铂(铂尔定)；洛莫司汀(也称为CCNU，)；顺铂(也称为CDDP，普拉汀诺和普拉汀诺-AQ)；苯丁酸氮芥(瘤可宁)；环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(也称为DTIC，DIC和咪唑羧酰胺，)；六甲蜜胺(也称为六甲蜜胺(HMM)，克瘤灵)；异环磷酰胺Prednumustine；甲基苄肼二氯甲基二乙胺(也称为氮芥、氮介和盐酸甲氯乙胺，链脲菌素(链佐星)；噻替哌(也称为硫代磷酰胺，TESPA和TSPA，)；环磷酰胺(癌得星 )；和盐酸苯达莫司汀(特雷达)。
示例性的基于铂的药剂包括卡铂、顺铂、奥沙利铂、奈达铂、吡铂、沙铂、菲铂和三铂四硝酸酯。
示例性的血管生成抑制剂包括但不限于A6(Angstrom Pharmaceuticals)、ABT-510(Abbott Laboratories)、ABT-627(阿曲生坦)(Abbott Laboratories/Xinlay)、ABT-869(Abbott Laboratories)、Actimid(CC4047，泊马度胺)(Celgene Corporation)、AdGVPEDF.11D(GenVec)、ADH-1(Exherin)(Adherex Technologies)、AEE788(Novartis)、AG-013736(阿西替尼)(Pfizer)、AG3340(普马司他)(Agouron Pharmaceuticals)、AGX1053(AngioGenex)、AGX51(AngioGenex)、ALN-VSP(ALN-VSP O2)(Alnylam Pharmaceuticals)、AMG 386(Amgen)、AMG706(Amgen)、阿帕替尼(YN968D1)(Jiangsu Hengrui Medicine)、AP23573(地磷莫司/MK8669)(Ariad Pharmaceuticals)、AQ4N(Novavea)、ARQ 197(ArQule)、ASA404(Novartis/Antisoma)、阿替莫德(Callisto Pharmaceuticals)、ATN-161(Attenuon)、AV-412(Aveo Pharmaceuticals)、AV-951(Aveo Pharmaceuticals)、阿瓦斯汀(贝伐单抗)(Genentech)、AZD2171(西地尼布/Recentin)(AstraZeneca)、BAY 57-9352(替拉替尼)(Bayer)、BEZ235(Novartis)、BIBF1120(Boehringer IngelheimPharmaceuticals)、BIBW 2992(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals)、BMS-275291(Bristol-Myers Squibb)、BMS-582664(布立尼布)(Bristol-Myers Squibb)、BMS-690514(Bristol-Myers Squibb)、骨化三醇、CCI-779(驮瑞塞尔)(Wyeth)、CDP-791(ImCloneSystems)、高粗榧碱(高三尖杉酯碱/HHT)(ChemGenex Therapeutics)、西乐葆(塞来昔布)(Pfizer)、CEP-7055(Cephalon/Sanofi)、CHIR-265(Chiron Corporation)、NGR-TNF、COL-3(Metastat)(Collagenex Pharaceuticals)、康普瑞汀(Oxigene)、CP-751,871(Figitumumab)(Pfizer)、CP-547,632(Pfizer)、CS-7017(Daiichi Sankyo Pharma)、CT-322(Angiocept)(Adnexus)、姜黄素、达肝素(法安明)(Pfizer)、双硫仑(安塔布司)、E7820(Eisai Limited)、E7080(Eisai Limited)、EMD 121974(西仑吉肽)(EMDPharmaceuticals)、ENMD-1198(EntreMed)、ENMD-2076(EntreMed)、恩度(Simcere)、爱比妥(ImClone/Bristol-Myers Squibb)、EZN-2208(Enzon Pharmaceuticals)、EZN-2968(EnzonPharmaceuticals)、GC1008(Genzyme)、染料木素、GSK1363089(Foretinib)(GlaxoSmithKline)、GW786034(帕唑帕尼)(GlaxoSmithKline)、GT-111(VascularBiogenics Ltd.)、IMC-1121B(雷莫芦单抗)(ImClone Systems)、IMC-18F1(ImCloneSystems)、IMC-3G3(ImClone LLC)、INCB007839(Incyte Corporation)、INGN 241(Introgen Therapeutics)、易瑞沙(ZD1839/吉非替尼)、LBH589(Faridak/Panobinostst)(Novartis)、Lucentis(雷珠单抗)(Genentech/Novartis)、LY317615(Enzastaurin)(EliLilly and Company)、Macugen(哌加他尼)(Pfizer)、MEDI522(Abegrin)(MedImmune)、MLN518(坦度替尼)(Millennium)、Neovastat(AE941/倍尼芬)(Aeterna Zentaris)、Nexavar(Bayer/Onyx)、NM-3(Genzyme Corporation)、那可丁(Cougar Biotechnology)、NPI-2358(Nereus Pharmaceuticals)、OSI-930(OSI)、Palomid 529(PalomaPharmaceuticals,Inc.)、Panzem胶囊剂(2ME2)(EntreMed)、Panzem NCD(2ME2)(EntreMed)、PF-02341066(Pfizer)、PF-04554878(Pfizer)、PI-88(Progen Industries/Medigen Biotechnology)、PKC412(Novartis)、茶多酚E(绿茶提取物)(Polypheno EInternational,Inc)、PPI-2458(Praecis Pharmaceuticals)、PTC299(PTCTherapeutics)、PTK787(瓦他拉尼)(Novartis)、PXD101(贝利司他)(CuraGenCorporation)、RAD001(依维莫司)(Novartis)、RAF265(Novartis)、瑞格非尼(BAY73-4506)(Bayer)、Revlimid(Celgene)、阿奈可他(Alcon Research)、SN38(脂质体)(Neopharm)、SNS-032(BMS-387032)(Sunesis)、SOM230(帕瑞肽)(Novartis)、角鲨胺(Genaera)、苏拉明、索坦(Pfizer)、特罗凯(Genentech)、TB-403(Thrombogenics)、Tempostatin(CollardBiopharmaceuticals)、四硫钼酸盐(Sigma-Aldrich)、TG100801(TargeGen)、沙利度胺(Celgene Corporation)、亭扎肝素钠、TKI258(Novartis)、TRC093(TraconPharmaceuticals Inc.)、VEGF Trap(阿柏西普)(Regeneron Pharmaceuticals)、VEGFTrap-Eye(Regeneron Pharmaceuticals)、Veglin(VasGene Therapeutics)、硼替佐米(Millennium)、XL184(Exelixis)、XL647(Exelixis)、XL784(Exelixis)、XL820(Exelixis)、XL999(Exelixis)、ZD6474(AstraZeneca)、伏立诺他(Merck)和ZSTK474。
示例性的血管内皮生长因子(VEGF)受体抑制剂包括但不限于贝伐单抗(阿瓦斯汀)、阿西替尼(英立达)；丙氨酸布立尼布(BMS-582664，(S)—((R)-1-(4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基氧基)-5-甲基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基氧基)丙-2-基)2-氨基丙酸酯)；索拉非尼帕唑帕尼苹果酸舒尼替尼(索坦)；西地尼布(AZD2171，CAS 288383-20-1)；尼达尼布(BIBF1120，CAS 928326-83-4)；Foretinib(GSK1363089)；替拉替尼(BAY57-9352，CAS 332012-40-5)；阿帕替尼(YN968D1，CAS 811803-05-1)；伊马替尼(格列卫)；帕纳替尼(AP24534，CAS943319-70-8)；Tivozanib(AV951，CAS475108-18-0)；瑞格非尼(BAY73-4506，CAS 755037-03-7)；瓦他拉尼二盐酸盐(PTK787，CAS 212141-51-0)；布立尼布(BMS-540215，CAS649735-46-6)；凡德他尼(或AZD6474)；莫特塞尼二磷酸盐(AMG706，CAS 857876-30-3，N-(2,3-二氢-3,3-二甲基-1H-吲哚-6-基)-2-[(4-吡啶基甲基)氨基]-3-吡啶甲酰胺，如PCT公开号WO 02/066470中所述)；多韦替尼二乳酸盐(TKI258，CAS 852433-84-2)；凡德他尼(ABT869，CAS 796967-16-3)；卡博替尼(XL184，CAS 849217-68-1)；来他替尼(CAS111358-88-4)；N-[5-[[[5-(1,1-二甲基乙基)-2-恶唑基]甲基]硫代]-2-噻唑基]-4-哌啶甲酰胺(BMS38703，CAS 345627-80-7)；(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647，CAS 781613-23-8)；4-甲基-3-[[1-甲基-6-(3-吡啶基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基]氨基]-N-[3-(三氟甲基)苯基]-苯甲酰胺(BHG712，CAS 940310-85-0)；和阿柏西普
示例性的EGF通路抑制剂包括但不限于酪氨酸磷酸化抑制剂46、EKB-569、厄洛替尼(特罗凯)、吉非替尼(易瑞沙)、爱必妥、尼妥珠单抗、拉帕替尼西妥昔单抗(抗-EGFR mAb)、188Re-标记的尼妥珠单抗(抗-EGFR mAb)，以及一般且具体地在WO 97/02266、EP 0 564 409、WO 99/03854、EP 0 520 722、EP 0 566 226、EP0 787 722、EP 0 837 063、美国专利号5,747,498、WO 98/10767、WO 97/30034、WO 97/49688、WO 97/38983和WO 96/33980中公开的那些化合物。示例性的EGFR抗体包括但不限于西妥昔单抗(爱必妥)；帕尼单抗马妥珠单抗(EMD-72000)；曲妥珠单抗(赫赛汀)；尼妥珠单抗(hR3)；扎妥木单抗；TheraCIM h-R3；MDX0447(CAS339151-96-1)；和ch806(mAb-806，CAS 946414-09-1)。示例性的表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂包括但不限于盐酸厄洛替尼(特罗凯)、吉非替尼(易瑞沙)；N-[4-[(3-氯-4-氟苯)氨基]-7-[[(3″S″)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺，)；凡德他尼拉帕替尼(3R,4R)-4-氨基-1-((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；卡奈替尼二盐酸盐(CI-1033)；6-[4-[(4-乙基-1-哌嗪基)甲基]苯基]-N-[(1R)-1-苯基乙基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-胺(AEE788，CAS 497839-62-0)；木利替尼(TAK165)；培利替尼(EKB569)；阿法替尼(BIBW2992)；来那替尼(HKI-272)；N-[4-[[1-[(3-氟苯基)甲基]-1H-吲唑-5-基]氨基]-5-甲基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基]-氨基甲酸、(3S)-3-吗啉基甲酯(BMS599626)；N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-喹唑啉胺(XL647，CAS 781613-23-8)；和4-[4-[[(1R)-1-苯基乙基]氨基]-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-6-基]-苯酚(PKI166，CAS 187724-61-4)。
示例性的mTOR抑制剂包括但不限于雷帕霉素(雷帕鸣)，及其类似物和衍生物；SDZ-RAD；替西罗莫司(驮瑞塞尔也称为CCI-779)；地磷莫司(此前称为deferolimus，二甲基次膦酸(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-2,3,10,14,20-戊氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基酯，也称为AP23573和MK8669，如在PCT公开号WO03/064383中所述)；依维莫司(或RAD001)；雷帕霉素(AY22989，西罗莫司)；司马皮莫德(CAS 164301-51-3)；(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502，CAS 1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉-4-基]甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰基-L-α-天冬氨酰基-L-丝氨酸-内盐(SF1126，CAS 936487-67-1)。
示例性的磷酸肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂包括但不限于4-[2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]吗啉(也称为GDC0941，并在PCT公开号WO 09/036082和WO 09/055730中描述)；2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈(也称为BEZ 235或NVP-BEZ 235，并在PCT公开号WO 06/122806中描述)；4-(三氟甲基)-5-(2,6-二吗啉嘧啶-4-基)吡啶-2-胺(也称为BKM120或NVP-BKM120，并在PCT公开号WO2007/084786中描述)；陶扎色替(VX680或MK-0457，CAS 639089-54-6)；(5Z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮(GSK1059615，CAS958852-01-2)；(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(乙酰氧基)-1-[(二-2-丙烯基氨基)亚甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氢-11-羟基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基-环戊[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2,7,10(1H)-三酮(PX866，CAS 502632-66-8)；和8-苯基-2-(吗啉-4-基)-色烯-4-酮(LY294002，CAS 154447-36-6)。示例性的蛋白激酶B(PKB)或AKT抑制剂包括但不限于8-[4-(1-氨基环丁基)苯]-9-苯基-1,2,4-噻唑并[3,4-f][1,6]萘啶-3(2H)-酮(MK-2206，CAS 1032349-93-1)；哌立福辛(KRX0401)；4-十二烷基-N-1,3,4-噻二唑-2-基-苯磺酰胺(PHT-427，CAS 1191951-57-1)；4-[2-(4-氨基-1,2,5-恶二唑-3-基)-1-乙基-7-[(3S)-3-哌啶基甲氧基]-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-4-基]-2-甲基-3-丁炔-2-醇(GSK690693，CAS 937174-76-0)；8-(1-羟基乙基)-2-甲氧基-3-[(4-甲氧基苯基)甲氧基]-6H-二苯并[b,d]吡喃-6-酮(palomid 529、P529或SG-00529)；Tricirbine(6-氨基-4-甲基-8-(β-D-呋喃核糖基)-4H,8H-吡咯并[4,3,2-de]嘧啶并[4,5-c]哒嗪)；(αS)-α-[[[5-(3-甲基-1H-吲唑-5-基)-3-吡啶基]氧基]甲基]-苯乙胺(A674563，CAS 552325-73-2)；4-[(4-氯苯基)甲基]-1-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-4-哌啶胺(CCT128930，CAS 885499-61-6)；4-(4-氯苯基)-4-[4-(1H-吡唑-4-基)苯基]-哌啶(AT7867，CAS 857531-00-1)；和Archexin(RX-0201，CAS 663232-27-7)。
图5A-5C、93和94示出了利用CER修饰细胞的方案的实施方式。如图5A中所示，在白细胞去除术后，可以离体处理和活化细胞，进行遗传修饰和扩增以准备输注到对象中。图5B显示了与常规基于T细胞的疗法联用的CER修饰细胞的示例性治疗方案。经工程化改造T细胞的初始输注诱导肿瘤细胞凋亡，其显示了抗肿瘤作用。然后输注CER修饰的细胞。CER修饰的细胞清除展示促吞噬标记物(例如，PtdSer)的肿瘤细胞，其促进肿瘤消退同时还绕开了T细胞抑制性肿瘤微环境。肿瘤微环境的改变继而使得肿瘤对T细胞疗法重新敏化，从而能够进行第二次的T细胞输注。治疗方法的另一实施方式如图5C中所示。图5C中的治疗方案利用了CER修饰的细胞与单克隆抗体疗法的组合。输注肿瘤特异性抗体(如靶向EGFR的西妥昔单抗或靶向CD20的利妥昔单抗)可以触发细胞死亡或诱导CER修饰的细胞所结合的靶向部分。随后，对象接受CER修饰的细胞，所述细胞结合至并清除与抗体结合的细胞。在此类实施方式中，所述CER的胞外域可以包含FcR结合结构域、PtdSer结合结构域或其他抗原结合结构域。
在另一种情况下，CER修饰的细胞可以与小分子抑制剂，如BTK抑制剂、MEK抑制剂、腺苷通路抑制剂A2AR拮抗剂、IDO1抑制剂、IMiD(如来那度胺)、PI3Kδ抑制剂、BRAF抑制剂或BCR-ABL抑制剂联用。
在某些实施方式中，本公开内容的方法包括耗竭步骤。从对象中除去CER的耗竭步骤可以发生在提供足够长时间的治疗益处后以减轻对对象的毒性。在此类实施方式中，CER载体包含诱导型自杀基因，如iCASP9、诱导型Fas或HSV-TK。类似地，可以将CER载体设计为表达已知的细胞表面抗原如CD20或截短的EGFR(SEQ ID NO:121)，其便于通过输注相关单克隆抗体(mAb)例如针对CD20的利妥昔单抗或针对EGFR的西妥昔单抗将转导的细胞耗竭。也可以将阿仑单抗用于耗竭转导的B细胞、T细胞或自然杀伤细胞，阿仑单抗靶向成熟淋巴细胞表面上存在的CD52。
在进一步的实施方式中，可以将本公开内容的表达CER的细胞用于诊断方法或成像方法，包括用于与本申请所鉴定的适应症或病况相关的方法。
实施例
实施例1
CER构建体的创建通过将编码CER蛋白或其部分的核酸分子与启动子可操作地连接，并将该构建体引入适于在真核生物中复制和整合的表达载体，实现编码CER的天然或合成的核酸分子的表达。载体含有转录和翻译终止子、起始序列和启动子，用于调控所需核酸序列的表达。为了评估CER蛋白或其部分的表达，可以将表达载体引入含有选择性标记物基因(如抗生素抗性基因或报告基因)的细胞，以便于从试图通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在单独的DNA片段上携带选择性标记物并将其用于共转染程序。选择性标记物或报告基因的翼侧具有适宜的调控序列以便使其能够在宿主细胞中表达。通过逆转录病毒载体将表达载体转移至宿主细胞中。为了证实在宿主细胞中存在重组DNA序列，进行包括RT-PCR和ELISA在内的多种测定。
CER性能的评价为了鉴定和表征CER，建立了使用逆转录病毒介导的候选CER转导重建吞噬细胞吞噬的体外系统。使用CER转导小鼠和人淋巴细胞系(其通常缺乏吞噬细胞的能力)以评估功能活性的获得情况。如果成功表达CER，则在异源细胞中发生吞噬。
除了其吞噬活性以外，还针对其下述能力对CER进行了评价：(1)极化细胞以释放炎性细胞因子和趋化因子；(2)活化下游增殖性通路，和；(3)使靶细胞具有非治疗诱导的抗性模式。为了评价候选CER，使用多维流式细胞术、细胞因子/趋化因子阵列和功能性测定(如下文所述)。
实施例2
体外吞噬作用小鼠原-B细胞系Ba/F3或人Jurkat T细胞在体外缺乏吞噬凋亡或肿瘤细胞的内在吞噬能力，将其作为初始筛选细胞系以鉴定先导CER候选物。在CER逆转录病毒转导后，对Ba/F3或Jurkat T细胞进行纯化、标记和免疫表型表征。在多种共表达条件下使用与已定义的靶细胞的体外共表达实验测量吞噬活性，通过FACS或发光显微镜测量吞噬作用。将具有胞外PtdSer靶向结构域的CER转导的Ba/F3或Jurkat T细胞与pHrodo标记的凋亡细胞共培养。该测定能够评价进入胞质溶酶体的凋亡细胞的吞噬作用。在其他情况下，将具有Fc受体胞外域的CER转导的Ba/F3或Jurkat T细胞与已使用抗体(如肿瘤特异性抗体)预孵育的靶细胞共同孵育，以测量这些细胞吞噬抗体包被的肿瘤细胞的能力。最后，将通过抗体结合部分(如单链可变片段)与肿瘤抗原结合的CER转导的Ba/F3或Jurkat T细胞与肿瘤细胞共培养，并对吞噬作用进行定量。在一些情况下，在进行共培养实验之间，使用常规化疗、放疗或小分子疗法对靶细胞进行预处理，以诱导“促吞噬”分子状态。在90分钟的共培养实验后，以标记的Ba/F3Jurkat转化体中细胞追踪阳性细胞的百分率对吞噬活性进行定量。
对条件培养基进行细胞因子/趋化因子阵列分析
平行地，收集来自Ba/F3或Jurkat T细胞转化体共培养实验的条件培养基，并分析炎性细胞因子/趋化因子释放测定的情况。对Ba/F3Jurkat转导之前和之后的细胞因子/趋化因子的变化情况和相对比较进行定量以评价功能性的获得情况。鉴定得到了通过如下两者将细胞极化为炎症状态的CER候选物：(1)下调参与未成熟的单核细胞和骨髓来源的抑制性细胞募集的免疫抑制性细胞因子(如IL-10和TGF-β)、单核细胞化学吸引物，以及(ii)上调炎症细胞因子TNFα、IL12p70、IFNα和IFNγ。
多维流式细胞术平行地使用多维细胞术对Ba/F3和Jurkat转化体进行分析以表征激活和抑制受体谱。激活谱可以包括CD137、CD69、HLA-DR、CD107a、CD123、CD11c、TNF、IFNγ、IL-2、颗粒酶、穿孔素、CD25、CD40L、CD80和CD86，而抑制谱可以包括PD-1、Tim-3、Lag-3、ICOS和CD172a。对培养物中的旁邻细胞进行免疫表型评价以确定治疗诱导的抗性模式。
增殖测定在存在或不存在外源性细胞因子或饲养细胞的条件下分析使用CER表达盒转导的原代人T细胞的组成性或非组成性生长模式。
下游的促炎性信号传导途径为了进一步检测下游的促炎性应答，进行磷酸-CYTOF以测量由候选CER激活的下游信号传导途径(如IkBtot、pSTAT1、p38和JNK)。
实施例3
体内分析为了在体内对CER修饰的细胞进行检测，使用了动物模型和离体实验。将人原代肿瘤细胞或异种移植物标本植入Nod/SCDγ小鼠。可以使用对CER表达盒具有特异性的引物对血液和组织标本进行液滴PCR(ddPCR)检测对经修饰CER细胞的扩增和持久性进行定量。为了离体分析CER细胞的功能性能力，在CER修饰的细胞过继转移后，通过FACS和组织染色对肿瘤组织和脾细胞进行处理和分析，以进行表型分型并证明体内吞噬作用。在体内监测肿瘤生长并进行定量。
实施例4
Tim4-MerTk嵌合吞噬受体(CER)“CER01”的构建
将包含信号肽(编码SEQ ID NO:72的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)和跨膜结构域(编码SEQ ID NO:74的氨基酸序列)(合起来具有SEQ ID NO:57的多核苷酸序列)融合至酪氨酸激酶MERTK的胞内激酶结构域(编码SEQ ID NO:58)以形成嵌合吞噬受体“CER01”(具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的Tim4-MERTK CER)(图6A)。MERTK受体酪氨酸激酶转导吞噬信号，并且Tim4最近已被描述为磷脂酰丝氨酸结合受体(Miyanishi等，Nature,2007,450:435-9；Nishi等，2014,Mol.CellBiol.34:1512-20)。然后，将Tim-4-MERTK嵌合吞噬受体核苷酸序列插入pMSCV(小鼠干细胞病毒)逆转录病毒载体。使用表达绿色荧光蛋白(GFP)作为转导标记物的pMSCV Tim4-MERTK逆转录病毒转导较早代数的小鼠Ba/F3B-细胞。培养扩增使用流式细胞术(FACS)通过GFP表达分选的阳性Ba/F3细胞转导物，并将其用于体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
使用10μM地塞米松孵育原代胸腺细胞24小时以诱导细胞死亡。然后在室温下使用含1μM pHrodo Red染料的PBS标记胸腺细胞15分钟，使用含10％胎牛血清的RPMI培养基洗涤两次，将其作为吞噬测定的靶细胞。将50μl pHrodo Red-标记的胸腺细胞(106/mL)与50μl表达Tim4-MERTK嵌合吞噬受体的分选的Ba/F3细胞(105/mL)共同孵育(靶细胞与效应细胞的比例为10：1)。使用pHrodo Red染料标记的靶细胞可以显示吞噬并转运至溶酶体中的细胞，因为其在酸性溶酶体环境中的光发射增强(Miksa等，2009,Immunol.Methods 342:71-7)。进行共培养实验，并在孵育后2hr、24hr、48hr和72hr通过荧光显微镜和FACS依次对Ba/F3GFP+细胞的吞噬作用进行定量。将使用表达Tim4和GFP的pMSCV载体(非吞噬受体)转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
在正常条件下，Ba/F3小鼠B-细胞系缺乏吞噬靶细胞的能力，因此选择其建立吞噬作用测定系统。首先考察了Tim4-MERTK CER-介导的对凋亡胸腺细胞的吞噬(图6A-F)。在小鼠Ba/F3B-细胞系中表达Tim4-MERTK CER显著增强对磷脂酰丝氨酸阳性(PtdSer+)胸腺细胞的吞噬摄取(图6C-6F)。荧光显微镜和FACS的观察结果表明吞噬作用的量与同靶细胞的孵育时间以及Tim4-MERTK CER表达的量相关(图6C-6D)。共同孵育2小时后，与对照组中的0％相比，21.6％的Tim4-MERTK CER转导的Ba/F3细胞吞噬了靶凋亡胸腺细胞(图6C)。在孵育24小时和孵育72小时时，具有吞噬作用的表达Tim4-MERTK CER的Ba/F3细胞数分别增至57.5％和75％(图6C-6D)。而且，表达最高量Tim4-MERTK CER的Ba/F3细胞显示出最大量的吞噬作用，其在最高表达量的四分位数内接近80％(图6D)，表明Tim4-MERTK CER具有浓度依赖性作用。
然后考察了Tim4-MERTK CER促进将摄取的靶细胞转移至吞噬溶酶体的能力。含有水解酶的溶酶体在较低pH的内环境中消化摄入的细胞(Arandjelovic等，2015,Nat.Immunol.16:907-17)。在这种情况下，pHrodo Red-标记的靶胸腺细胞的荧光强度增加。荧光显微镜的观察结果表明在大部分表达Tim4-MERTK CER的Ba/F3细胞内存在若干pHrodo Red-阳性细胞(图6E)。与该观察结果完全一致的是，靶细胞进入表达Tim4-MERTKCER的Ba/F3细胞的吞噬溶酶体与其清除相关。到第4天，97％的靶细胞已通过吞噬摄取和溶酶体降解被消除(图7A-7B)。这些结果表明加入Tim4-MERTK CER显著增强了PtdSer+细胞的清除。
为了考察表达CER的细胞清除肿瘤细胞的能力，检测了Tim4-MERTK CER-介导的Raji人Burkitt B-细胞淋巴瘤细胞系的吞噬作用(图8A-8B)。研究表明B-细胞受体(BCR)将PtdSer掺入抗-IgM活化的B细胞的膜微结构域中并且在异常信号传导活性(如组成型存在)的情况下活化Raji淋巴瘤细胞(Dillon等，2000,J.Immunol.164:1322-32)。在小鼠Ba/F3B-细胞系中表达Tim4-MERTK CER增强了对Raji细胞的吞噬摄入(图8A-8C)，表明Tim4-MERTKCER-介导抗肿瘤作用。
实施例5
FA58C2-MERTK CER“CER03”的构建
将来自巨噬细胞调理素MFGE8的磷脂酰丝氨酸结合基序FA58C2(SEQ ID NO:30的氨基酸序列)与经修饰的IgG4胞外间隔区结构域(SEQ ID NO:67的氨基酸序列)和共刺激分子CD28的跨膜结构域(SEQ ID NO:68的氨基酸序列)以及MERTK的胞质激酶结构域(SEQ IDNO:43的氨基酸序列)融合以形成嵌合吞噬受体“CER03”(FA58C2-MERTK CER)(SEQ ID NO:59的多核苷酸序列，SEQ ID NO:75的氨基酸序列)(图9A)。该构建体具有来源于GM-CSF的信号肽(编码SEQ ID NO:65的氨基酸序列)。MERTK受体酪氨酸激酶转导吞噬信号，并且已发现MFP-E8第二FA58C重复的C末端(C2)(在本申请中称为FA58C2)负责磷脂酰丝氨酸结合(Hanayama等，2002,Nature,417:182-7；Nishi等，同上)。然后将FA58C2-MERTK CER核苷酸序列插入pMSCV(小鼠干细胞病毒)逆转录病毒载体。使用表达绿色荧光蛋白(GFP)的pMSCVFA58C2-MERTK CER逆转录病毒转导较早代数的小鼠Ba/F3B-细胞。培养扩增使用流式细胞术(FACS)通过GFP表达分选的阳性Ba/F3细胞转导物，并将其用于体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
使用10μM地塞米松孵育原代胸腺细胞24小时以诱导细胞死亡。然后在室温下使用含1μM pHrodo Red染料的PBS标记胸腺细胞15分钟，使用含10％FBS的RPMI培养基洗涤两次，将其作为吞噬测定的靶细胞。将50μl pHrodo Red-标记的胸腺细胞(106/mL)与50μl表达FA58C2-MERTK的分选的Ba/F3B-细胞(105/mL)共同孵育(靶细胞与效应细胞的比例为10：1)。使用pHrodo Red染料标记的靶细胞可以显示吞噬并转运至溶酶体中的细胞，因为其在酸性溶酶体环境中的光发射增强(Miksa等，同上)。进行共培养实验，并在孵育后2hr、24hr、48hr和72hr通过荧光显微镜和FACS依次对Ba/F3GFP+细胞的吞噬作用进行定量。将使用表达Tim4和GFP的pMSCV载体(非吞噬受体)转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
首先考察了FA58C2-MERTK CER-介导的对凋亡胸腺细胞的吞噬(图9B-9F)。在小鼠Ba/F3B-细胞中表达FA58C2-MERTK CER显著增强对磷脂酰丝氨酸阳性(PtdSer+)胸腺细胞的吞噬摄取(图9B-9F)。荧光显微镜和FACS的观察结果表明吞噬作用的量与同靶细胞的孵育时间以及FA58C2-MERTK CER表达的量相关(图9B-9C)。共同孵育2小时后，与对照组中的0％相比，11％的FA58C2-MERTK CER转导的Ba/F3细胞进行了吞噬(图9B)。在孵育24小时时，具有吞噬作用的表达FA58C2-MERTK CER的Ba/F3细胞数增至48％(图9B-9F)。而且，表达最高量FA58C2-MERTK CER的Ba/F3细胞显示出最大量的吞噬作用(图9C)，表明FA58C2-MERTKCER具有浓度依赖性作用。
小GTPase对FA58C2-MerTk吞噬作用的影响
检测了加入小GTPase Rac1和/或Rab5a对表达CER的Ba/F3细胞吞噬作用的影响。Rho和Rab家族的GTPase调控巨噬细胞和未成熟树突状细胞对凋亡细胞的吞噬作用。为形成吞噬细胞的吞噬杯，巨噬细胞表达的整合素受体激活Rho家族GTPase中的Rac1以诱导肌动蛋白聚合(Albert等，2000,Nat.Cell Biol.2:899-905)。Rab5是GTPase Rab家族的成员，其调控吞噬体与内含体的融合，并且可能在溶酶体生物发生中起重要作用(Duclos等，2000,J.Cell Sci.113:3531-41)。使用双顺反子或三顺反子逆转录病毒表达盒(pMSCV FA58C2-MERTK-P2A-Rac1、pMSCV FA58C2-MERTK-P2A-Rab5a或pMSCV FA58C2-MERTK-P2A-Rac1-T2A-Rab5a)将编码Rac1(SEQ ID NO:60)、Rab5(SEQ ID NO:61)或者这两者(SEQ ID NO:62)的cDNA序列与FA58C2-MERTK共表达(图10A)。如图10B-10E所示，加入Rac1增加了FA58C2-MERTK CER-介导的靶凋亡胸腺细胞的吞噬(如图10E对比图9F中所示，56％对比48％)。而且，观察到摄入的胸腺细胞转移至吞噬溶酶体中。荧光显微镜的观察结果表明在大多数表达FA58C2-MERTK CER/Rac1的Ba/F3B-细胞的内部存在一些pHrodo Red-阳性的细胞(图10C)。
实施例6
FA58C2-Syk CER“CER04”的构建
将与GM-CSF来源的信号肽融合的来自巨噬细胞调理素MFGE8的磷脂酰丝氨酸结合基序FA58C2与经修饰的IgG4胞外间隔区结构域、共刺激分子CD28的跨膜结构域和Syk激酶结构域融合以形成嵌合吞噬受体“CER04”(FA58C2-Syk CER)(SEQ ID NO:63的多核苷酸序列，SEQ ID NO:70的氨基酸序列，图11A)。在COS细胞中聚集的Syk酪氨酸激酶结构域触发吞噬作用(Greenberg等，1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1103-7)。然后将FA58C2-SykCER核苷酸序列插入pMSCV(小鼠干细胞病毒)逆转录病毒载体。使用表达GFP荧光蛋白的pMSCV FA58C2-Syk逆转录病毒转导较早代数的小鼠Ba/F3B-细胞。培养扩增使用流式细胞术(FACS)通过GFP表达分选的阳性Ba/F3细胞转导物，并将其用于体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
如实施例4中所述，将原代胸腺细胞诱导为凋亡并使用pHrodo Red染料标记。如实施例4中所述，进行共培养实验，并通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3GFP+细胞的吞噬作用进行连续定量。将使用表达Tim4和GFP的pMSCV载体(非吞噬受体)转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
考察了FA58C2-Syk CER-介导的对凋亡胸腺细胞的吞噬作用(图11A-11E)。在小鼠Ba/F3B-细胞系中表达FA58C2-Syk CER强烈增强对磷脂酰丝氨酸阳性(PtdSer+)胸腺细胞的吞噬摄入(图11B-11E)。荧光显微镜和FACS的观察结果表明吞噬作用的量与靶细胞孵育时间以及FA58C2-Syk CER表达的量相关。共同孵育2小时后，与对照组中的0％相比，9.5％的FA58C2-Syk CER转导的Ba/F3细胞具有吞噬的靶凋亡胸腺细胞(图11B)。在孵育24小时时，具有吞噬作用的表达FA58C2-Syk CER的Ba/F3细胞数增至48％(图11B、11C和11E)。而且，表达最高量FA58C2-Syk CER的Ba/F3细胞显示出最大量的吞噬作用(图11C)，表明FA58C2-Syk CER具有浓度依赖性作用。
小GTPase Rab5对FA58C2-Syk吞噬作用的影响
利用Ba/F3细胞考察了加入小GTPase Rac1和/或Rab5a对吞噬作用的影响。使用双顺反子或三顺反子逆转录病毒表达盒(pMSCV FA58C2-Syk-P2A-Rac1、pMSCV FA58C2-Syk-P2A-Rab5a和pMSCV FA58C2-Syk-P2A-Rac1-T2A-Rab5a构建体)将编码Rac1(SEQ ID NO:60)和/或Rab5(SEQ ID NO:61)或者这两者(SEQ ID NO:62)的cDNA序列与FA58C2-Syk CER共表达(图11A，12A)。如图11B和11C中所示，加入Rac1增加FA58C2-Syk CER-介导的对靶凋亡胸腺细胞的吞噬。而且，加入Rab5也增加吞噬作用(图12B-12D)。
实施例7
CD19-MERTK CER“CER40”的构建
将与GM-CSF来源的信号肽(编码SEQ ID NO:65的氨基酸序列)融合的来源于FMC63小鼠IgG2a小鼠单克隆抗体的抗-CD19单链可变片段(scFv)(编码SEQ ID NO:66的氨基酸序列)与经修饰的IgG4胞外间隔区结构域(编码SEQ ID NO:65的氨基酸序列)、共刺激分子CD28的跨膜结构域(编码SEQ ID NO:68的氨基酸序列)和MERTK的胞内激酶结构域(SEQ IDNO:43的氨基酸序列)融合以形成嵌合吞噬受体“CER40”(CD19-MERTK CER)(具有SEQ IDNO:64的氨基酸序列)(图13A)(Kochenderfer等，2009,J.Immunother.32:689-702)。为增强吞噬作用，构建包含CD19-MERTK CER和Rac1的双顺反子逆转录病毒表达构建体(图13B)。然后将CD19-MERTK CER核苷酸序列插入pMSCV(小鼠干细胞病毒)逆转录病毒载体。使用表达绿色荧光蛋白(GFP)的pMSCV CD19-MERTK CER逆转录病毒转导较早代数的小鼠Ba/F3B-细胞。培养扩增使用流式细胞术(FACS)通过GFP表达分选的阳性Ba/F3细胞转导物，并将其用于体外研究。
对人淋巴瘤细胞系的吞噬活性
如实施例4中所示，使用1μM pHrodo Red染料标记Raji人Burkitt B-细胞淋巴瘤细胞(其是CD19+)并将其作为吞噬作用测定的靶细胞。如实施例4中所示，进行共培养实验，并通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3GFP+细胞的吞噬作用进行连续定量。将使用表达Tim4和GFP的pMSCV载体(非吞噬受体)转导的Ba/F3细胞以及未转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
首先考察了CD19-MERTK CER-介导的对Raji Burkitt B-细胞淋巴瘤细胞的吞噬作用(图13C-13F)。在小鼠Ba/F3B-细胞系中表达CD19-MERTK CER强烈增强对Raji淋巴瘤细胞的吞噬摄入(图13C-13G)。荧光显微镜和FACS的观察结果表明吞噬作用的量与靶细胞孵育时间以及CD19-MERTK CER表达的量相关。共同孵育24小时后，与对照组中的0％相比，17％的CD19-MERTK-P2A-Rac1CER转导的Ba/F3细胞具有吞噬的Raji Burkitt B-细胞淋巴瘤细胞(图13C，13G)。表达最高量CD19-MERTK CER的Ba/F3细胞显示出最大量的吞噬作用(图13D)，表明CD19-MERTK CER具有浓度依赖性作用。
考察了CD19-MERTK CER促进摄入的Raji细胞转移至吞噬溶酶体中的能力。荧光显微镜显示了在表达CD19-MERTK CER+Rac1-的Ba/F3细胞内存在pHrodo Red-阳性的完整Raji细胞(图13E)。图13H显示了表达CD19-MERTK CER的Ba/F3细胞对Raji细胞的吞噬作用(白色箭头表示吞噬作用)。这些结果表明表达CD19-MerTk CER具有以CD19特异性的方式消除靶点的能力。
实施例8
TIM4-MERTK CER“CER01”的构建
将编码如实施例4中所述的具有SEQ ID NO:71氨基酸序列的CER01的Tim-4-MERTK嵌合吞噬受体核苷酸序列插入pLenti慢病毒载体中。在含有补充了10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素和10ng/mL小鼠IL-3(Peprotech目录号#213-13)的RMPI1640培养基的12孔板中以50万个细胞/mL的密度培养小鼠Ba/F3B-细胞。为了转导Ba/F3细胞，将100μl表达Tim4-MERTK(CER01)和作为转导标记物的截短EGFR(也称为tEGFR或EGFRt)的pLenti慢病毒载体(见图16)和5μl TRANSDUXTM转导试剂稀释于0.5ml完全细胞生长培养基中并加入Ba/F3细胞。然后在32℃预热离心机中以270x g rpm将Ba/F3细胞离心1小时。在37℃下孵育Ba/F3细胞24小时。在完全细胞生长培养基中将Ba/F3细胞再扩增48小时。使用荧光活化细胞分选(FACS)(Sony Sorter SH800)通过使用标记的Tim4特异性抗体(Kat5-18,Abcam目录号#176486)或标记的EGFR特异性抗体(Cetixumab)染色对阳性Ba/F3细胞转导物进行分选(见图17A-B)。分选后，将经纯化和转导的含有慢病毒的Ba/F3细胞(见图17C)静置48小时，所述慢病毒含有Tim4-MERTK-T2A-截短的EGFR，随后将其用于吞噬作用测定。每个直方图中显示了具有阳性染色的细胞百分比。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
在吞噬作用测定前一天，从C3H小鼠(Charles River LaboratoriesInternational,Inc.)中分离原代胸腺细胞。在含补充了10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的完全RPMI 1640生长培养基的6孔板中培养胸腺细胞。为了诱导凋亡以及在细胞表面上表达磷脂酰丝氨酸，使用1μM地塞米松处理胸腺细胞24小时。将未经处理的胸腺细胞作为阴性对照。从6孔板收集胸腺细胞，使用无菌1X PBS洗涤1次，然后使用含1ng/μl pH敏感性pHrodoTM Red染料(ThermoFisher Scientific，目录号#P36600)的PBS在室温下染色15分钟。随后，向细胞中补充生长培养基并洗涤1次以除去任何过量的pHrodo Red。以250,000个细胞/孔将pHrodo Red染色的胸腺细胞接种在含RMPI 1640完全培养基的平底96孔板中。
使用1X PBS洗涤1次如上所述制备的Ba/F3CER01+tEGFR+细胞并使用含1μMCELLTRACETM Violet染料(ThermoFisher Scientific，目录号#C34557)的PBS在37℃下染色10分钟。向经染色和转导的Ba/F3细胞中补充生长培养基，使用1X PBS洗涤1次以除去过量CELLTRACETM Violet，以约25,000个细胞/孔将细胞接种在含RPMI1640完全培养基的相同平底96孔板中。
将靶胸腺细胞与经染色的Ba/F3CER01+tEGFR+细胞以10:1的比例(靶细胞：效应细胞)在37℃下共培养3小时或过夜(～14小时)。孵育后，将板离心并使用补充了2％胎牛血清的PBS(pH 9)替代培养基。然后使用KEYENCE BZ-X710荧光显微镜(20X物镜)观察96孔板。然后还平行地设置双份96孔共培养板用于流式细胞术分析。将7-氨基放线菌素D(7-AAD)染料作为细胞活力染料，以及使用pHrodo Red染色靶胸腺细胞和使用CELLTRACE Violet染色效应细胞。将识别表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。荧光显微镜显示与截短的EGFR转导的Ba/F3对照细胞相比(见图18A)，CER01+Ba/F3细胞吞噬地塞米松处理的胸腺细胞(白色箭头表示吞噬事件)(见图18B)。在图18B的右下方显示了吞噬事件的高放大倍数。
通过FACS测量的Ba/F3效应细胞的量如图19A中所示。以通过FACS测量的pHrodoRed和CELLTRACE Violet染色双阳性细胞群对吞噬作用进行定量(见图19B)。
通过[吞噬的靶细胞总数/计数的CER修饰细胞的总数的平均值(例如，吞噬作用频率)]乘以[每个CER+Ba/F3细胞靶细胞染色的平均面积x100(例如，杂交捕获)]计算吞噬作用指数，并与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞进行比较(见图20A-B)。对小鼠细胞系的吞噬活性
在吞噬作用测定前一天，在含补充了10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的完全RPMI 1640生长培养基的6孔板中培养CT26小鼠结肠癌细胞，并使用1mM星孢菌素(STS)处理12小时以诱导凋亡。将未经处理的CT26细胞作为阴性对照。
在吞噬作用测定当天，收集CT26细胞，使用1X PBS洗涤两次以除去过量星孢菌素，然后使用含1ng/μl pHrodo Red的PBS在室温下染色15分钟。向CT26细胞中补充生长培养基，洗涤1次以除去过量pHrodo Red，并且以250,000个细胞/孔将细胞接种在含RPMI 1640完全培养基的平底96孔板中。
使用1X PBS洗涤1次如上所述制备的Ba/F3CER01+tEGFR+细胞并使用含1μMCELLTRACETM Violet染料(ThermoFisher Scientific，目录号#C34557)的PBS在37℃下染色10分钟。向经染色和转导的Ba/F3细胞中补充生长培养基，使用1X PBS洗涤1次以除去过量CELLTRACETM Violet，以约50,000个细胞/孔将细胞接种在含RPMI1640完全培养基的相同平底96孔板中。
将靶CT26细胞与经染色的CER01+tEGFR+细胞以5:1的比例(靶细胞：效应细胞)在37℃下共培养3小时。孵育后，将板离心并使用补充了2％胎牛血清的PBS(pH 9)替代培养基。然后使用KEYENCE BZ-X710荧光显微镜(20X物镜)观察96孔板。将使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。荧光显微镜显示的体外吞噬作用如图21中所示(白色箭头表示吞噬事件)。当吞噬时，使用pHrodo Red标记的CT26细胞在溶酶体的低pH区室内发荧光(以粉红色标出)。
将检测在CELLTRACE Violet染色区域内pHrodo Red荧光的杂交捕获算法用于荧光成像以便对吞噬的靶细胞面积/CER+B细胞面积进行定量。图22显示了提取使用CER01+EGFR+(图22A)或EGFR+对照(图22B)转导的Ba/F3细胞内CT26靶细胞面积的杂交细胞计数的直方图。图23显示了提取使用CER01+EGFR+或EGFR+对照转导的Ba/F3细胞内CT26靶细胞面积的杂交细胞计数的散点图。面积比表示Ba/F3细胞内CT26细胞的共定位面积。使用CER01+EGFR+或EGFR+对照转导的Ba/F3细胞吞噬作用的频率如图24A中所示。与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞相比的CER01+Ba/F3细胞的吞噬作用指数如图24B中所示。
如上所述，对Ba/F3CER01+EGFR+细胞进行转导、纯化并使用CELLTRACETM Violet染料标记。如上文使用CT26细胞的吞噬作用测定中所述的，将经星孢菌素处理并使用pHrodoRed染色的A20小鼠B细胞淋巴瘤细胞以5:1的比例(靶细胞：效应细胞)与经染色的CER01+tEGFR+细胞共培养。将使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。如上文使用CT26细胞进行的测定中所述的，利用荧光显微镜(KEYENCE BZ-X710荧光显微镜，20X物镜)，使用杂交捕获算法对吞噬事件进行定量。
显示靶A20细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图25中所示(白色箭头表示吞噬事件)。图26显示了提取使用CER01+EGFR+(图26A)或EGFR+对照(图26B)转导的Ba/F3细胞内A20靶细胞面积的杂交细胞计数的直方图。图27显示了提取使用CER01+EGFR+或EGFR+对照转导的Ba/F3细胞内A20靶细胞面积的杂交细胞计数的散点图。面积比表示Ba/F3细胞内A20细胞的共定位面积。与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞相比的CER01+Ba/F3细胞的吞噬作用指数如图28中所示。
如上文使用CT26细胞进行的测定中所述的，还将Ba/F3CER01+EGFR+细胞与经星孢菌素处理的WR19L小鼠T细胞淋巴瘤细胞共培养，使用靶细胞与效应细胞5:1的比例，共同孵育的时间为3小时。将使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。如上文所述，使用荧光显微镜对CER01+Ba/F3细胞对WR19L细胞的吞噬作用进行定量。显示体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图29中所示(白色箭头表示吞噬事件)。图30显示了使用CER01+EGFR+(+或-星孢菌素(STS))或EGFR+对照转导的Ba/F3细胞对WR19L细胞吞噬作用的频率。
人CER01+B细胞对人细胞系的吞噬活性
如上文针对Ba/F3细胞所述，使用表达截短的EGFR作为转导标记物的pLentiTim4-MERTK(CER01)慢病毒转导人原代B细胞，但是使用标记的抗-EGFR抗体(西妥昔单抗)然后使用Kat5-18抗体(Tim4特异性)(Abcam目录号#176486)染色利用FACS对转导的人B细胞进行分选(见图31A，其中右侧FACS图中的％表示表达Tim4结合结构域(CER01)的细胞的％)。扩增纯化的CER01+B细胞，并且在24小时、48小时和72小时成像，如图31B中所示。
在进行吞噬作用测定前一天，在含补充了10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的完全RPMI 1640生长培养基的6孔板中培养Jurkat人B淋巴瘤，并使用1mM星孢菌素处理3小时以诱导凋亡。使用1X PBS洗涤Jurkat细胞两次以除去过量星孢菌素，然后使用pHrodo Red(在PBS中1ng/μl)在室温下染色15分钟。在Jurkat细胞中加入生长培养基，洗涤1次以除去过量pHrodo Red，并且以约250,000个细胞/孔将细胞接种在含RPMI 1640完全培养基的平底96孔板中。
使用1X PBS洗涤转导的人原代B细胞1次，并使用含1μM CELLTRACE Violet的PBS在37℃下染色10分钟。向人原代B细胞中加入生长培养基，使用1X PBS洗涤1次以除去过量CELLTRACE Violet，并且以约50,000个细胞/孔将细胞接种在含RPMI 1640完全培养基的96孔板中。以靶细胞与效应细胞5:1的比例将人原代B细胞与Jurkat细胞在37℃下共培养3小时。孵育后，然后将共培养的板离心，使用补充了2％胎牛血清的PBS(pH 9)代替培养基。通过荧光显微镜(KEYENCE BZ-X710荧光显微镜，20X物镜)对吞噬事件进行定量。显示体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图32A中(CER01+B细胞)和图32B中(EGFR+对照)所示(白色箭头表示吞噬事件)。
还平行地设置双份96孔共培养板用于通过流式细胞术进行分析，使用10:1的靶细胞与效应细胞的比例(将约300,000个细胞/孔的pHrodo Red标记的星孢菌素处理的Jurkat细胞与约30,000个细胞/孔的CER01+转导的人原代B细胞共培养)。将共培养板1200rpm离心5分钟，使用含1:50稀释的别藻蓝蛋白(APC)标记的CD19抗体的FACS缓冲液(PBS+2％胎牛血清)替代培养基，以便对人原代B细胞进行染色。使用APC标记的CD19抗体在4℃下孵育人原代B细胞30分钟，洗涤1次，并向细胞培养板中加入含有DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)的FACS缓冲液，将其作为细胞活力的标记物。在FACS分析期间，对活CD19-APC阳性细胞进行门控(见图33左侧FACS曲线)，并且评价CD19阳性-pHrodo Red阳性事件(双阳性事件)的频率，将其定义为吞噬事件(见图33右侧FACS曲线)。图34显示了使用CER01+EGFR+或EGFR+对照转导的B细胞对Jurkat细胞吞噬作用的频率。
人CER01+B细胞对化疗处理的人细胞系的吞噬活性
如上文所述，使用表达截短的EGFR作为转导标记物的pLenti Tim4-MERTK(CER01)慢病毒转导人原代B细胞。在进行吞噬作用测定前一天，在含补充了10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的完全RPMI 1640生长培养基的6孔板中培养Jurkat人B淋巴瘤细胞，并使用奥沙利铂(5μM)和氟尿嘧啶(5-FU)(10μM)处理。次日，收集靶Jurkat细胞，使用1X PBS洗涤2次，并且使用pHrodo Red(在PBS中1ng/mL)在室温下染色15分钟。向Jurkat细胞中加入生长培养基，洗涤1次以除去过量的pHrodo Red，并且以约200,000个细胞/孔将细胞接种在含RPMI 1640完全培养基的平底96孔板中。使用1X PBS洗涤转导的人原代B细胞1次，然后使用CELLTRACE Violet(在PBS中1mM)在37℃下染色10分钟。向人原代B细胞中加入生长培养基，使用1X PBS洗涤1次以除去过量CELLTRACE Violet，并且以约50,000个细胞/孔将细胞接种在含RPMI完全培养基的96孔板中。以靶细胞与效应细胞4:1的比例将人原代B细胞与Jurkat细胞在37℃下共培养3小时。然后，使用配有20X物镜的Keyence BZ-X710显微镜将板成像。图35显示了CER01+人原代B细胞吞噬化疗处理的Jurkat细胞的荧光显微镜图像(右图显示了吞噬事件的吞噬情况；白色箭头表示吞噬作用)。
实施例9
TIM4-TYRO3 CER“CER08”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)(在一起具有SEQ ID NO:57的多核苷酸序列)与Tyro3胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:45)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER08”(Tim4-Tyro3CER，具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列)。Tyro3信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-Tyro3(CER08)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图36)。使用表达Tim4-Tyro3(CER08)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
如实施例8中所述，分离原代C3H小鼠胸腺细胞，使用地塞米松对其进行处理并使用pHrodo Red染色。如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER08+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，以靶细胞与效应细胞10:1的比例进行共培养实验，并通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3CER08+tEGFR+细胞的吞噬作用进行定量。将使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
通过FACS进行定量的存活CER08+转导的Ba/F3细胞的量如图37A中所示。根据通过FACS检测的pHrodo Red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群对吞噬作用频率进行定量(见图37B)。
荧光显微镜显示了与tEGFR转导的Ba/F3对照细胞相比CER08+Ba/F3细胞对经地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬作用(白色箭头表示吞噬事件)(见图38)。图38的右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
通过[吞噬的靶细胞总数/计数的CER修饰细胞的总数的平均值(例如，吞噬作用频率)]乘以[每个CER+Ba/F3细胞靶细胞染色的平均面积x100(例如，杂交捕获)]计算吞噬作用指数，并与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞进行比较(见图39A-B)。
实施例10
TIM4-DAP12 CER“CER09”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)(在一起具有SEQ ID NO:57的多核苷酸序列)与DAP12胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:82)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER09”(Tim4-DAP12CER，具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列)。DAP12转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-DAP12(CER09)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图40)。使用表达Tim4-DAP12(CER09)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
如实施例8中所述，分离原代C3H小鼠胸腺细胞，使用地塞米松对其进行处理并使用pHrodo Red染色。如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER09+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，以靶细胞与效应细胞10:1的比例进行Ba/F3CER09+tEGFR+细胞与原代胸腺细胞的共培养实验，并通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3 CER09+EGFR+细胞的吞噬作用进行定量。将使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
通过FACS进行定量的存活CER09+转导的Ba/F3细胞的量如图41A中所示。根据通过FACS检测的pHrodo Red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群对吞噬作用频率进行定量(见图41B)。
荧光显微镜显示了与tEGFR转导的Ba/F3对照细胞相比的CER09+Ba/F3细胞对经地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬作用(白色箭头表示吞噬事件)(见图42A-B)。图42B的右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
通过[吞噬的靶细胞总数/计数的CER修饰细胞的总数的平均值(例如，吞噬作用频率)]乘以[每个CER+Ba/F3细胞靶细胞染色的平均面积x100(例如，杂交捕获)]计算吞噬作用指数，并与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞进行比较(见图43A-B)。对小鼠细胞系的吞噬活性
如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER09+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，使用星孢菌素处理CT26小鼠结肠癌细胞并使用pHrodo Red标记上述细胞，并且以靶细胞与效应细胞5:1的比例将其与Ba/F3CER09+tEGFR+细胞共培养3小时。如实施例8中所述，通过荧光显微镜和FACS对CER09+Ba/F3细胞对CT26细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。显示CER09+Ba/F3细胞和EGFRt+对照细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图44A-B中所示(白色箭头表示吞噬事件)。当吞噬时，使用pHrodo Red标记的CT26细胞在溶酶体的低pH区室内发荧光(以粉红色标出)。
将检测在CELLTRACE Violet染色区域内pHrodo Red荧光的杂交捕获算法用于荧光成像以便对吞噬的靶细胞面积/CER+B细胞面积进行定量。图45显示了提取使用CER09+tEGFR+或tEGFR+对照转导的Ba/F3细胞内CT26靶细胞面积的杂交细胞计数的散点图。面积比表示Ba/F3细胞内CT26细胞的共定位面积。使用CER01+EGFR+或EGFR+对照转导的Ba/F3细胞吞噬作用的频率如图24A中所示。与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞相比的CER09+Ba/F3细胞的吞噬作用指数如图46中所示。
如实施例8中所述，使用星孢菌素处理WR19L小鼠淋巴瘤细胞并使用pHrodo Red标记上述细胞，并且以靶细胞与效应细胞5:1的比例将其与CELLTRACE Violet标记的Ba/F3CER09+EGFR+细胞共培养3小时。如实施例8中所述，通过荧光显微镜对CER09+Ba/F3细胞对WR19L细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。显示CER09+Ba/F3细胞对WR19L细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图47中所示(白色箭头表示吞噬事件)。
如实施例8中所述，使用星孢菌素处理A20小鼠淋巴瘤细胞并使用pHrodo Red标记上述细胞，并且以靶细胞与效应细胞5:1的比例将其与CELLTRACE Violet标记的Ba/F3CER09+EGFR+细胞共培养3小时。如实施例8中所述，通过荧光显微镜和FACS对CER09+Ba/F3细胞对A20细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。显示CER09+Ba/F3细胞对A20细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图48中所示(白色箭头表示吞噬事件)。
人CER09+B细胞对人细胞系的吞噬活性
如实施例8中所述，使用表达截短的EGFR作为转导标记物的pLenti Tim4-DAP12(CER09)慢病毒转导人原代B细胞。使用标记的抗-EGFR抗体(西妥昔单抗)然后使用Kat5-18抗体(Tim4特异性)(Abcam目录号#176486)染色利用FACS对转导的人B细胞进行分选(见图49A，其中右侧FACS图中的％表示表达Tim4结合结构域(CER09)的细胞的％)。扩增纯化的CER09+B细胞，并且在24小时、48小时和72小时成像，如图49B中所示。
使用星孢菌素处理Jurkat人T淋巴瘤并使用pHrodo Red标记上述细胞，并且在如实施例8中所述的吞噬作用测定中以靶细胞与效应细胞5:1的比例将其与CER09+人B细胞共培养，共同孵育的时间为3小时。如实施例8中所述，通过荧光显微镜和FACS对CER09+人B细胞对Jurkat细胞的吞噬作用进行定量。存活CD19阳性人原代B细胞的频率和CD19阳性-pHrodo Red阳性事件(双阳性事件)的频率如图50中所示(分别为左图和右图)。图51显示了使用CER09+tEGFR+或EGFR+对照转导的B细胞的吞噬作用频率。
显示CER09+人原代B细胞对Jurkat细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图52(左侧照片)中所示，以及显示tEGFR+人原代B细胞对Jurkat细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图52(右侧照片)中所示(白色箭头表示吞噬事件)。
实施例11
TIM4-DAP12-DAP12 CER“CER10”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与DAP12的跨膜结构域(SEQ ID NO:81)和胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:82)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER10”(Tim4-DAP12-DAP12CER，具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列)。DAP12信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-DAP12-DAP12(CER10)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过P2A序列(SEQ ID NO:104)所分隔(见图53)。使用表达Tim4-DAP12-DAP12(CER10)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
如实施例8中所述，分离原代C3H小鼠胸腺细胞，使用地塞米松对其进行处理，并使用pHrodo Red染色。如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER10+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，以靶细胞与效应细胞10:1的比例进行Ba/F3CER10+tEGFR+细胞和原代胸腺细胞共培养实验，以及通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3CER10+EGFR+细胞对靶胸腺细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
通过FACS进行定量的存活CER10+转导的Ba/F3细胞的量如图54A中所示。根据通过FACS检测的pHrodo Red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群对吞噬作用频率进行定量(见图54B)。
荧光显微镜显示了与tEGFR转导的Ba/F3对照细胞相比CER10+Ba/F3细胞对经地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬作用(白色箭头表示吞噬事件)(见图55A-B)。图55B的右下方显示了对吞噬事件的高倍放大。
通过[吞噬的靶细胞总数/计数的CER修饰细胞的总数的平均值(例如，吞噬作用频率)]乘以[每个CER+Ba/F3细胞靶细胞染色的平均面积x100(例如，杂交捕获)]计算吞噬作用指数，并与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞进行比较(见图56A-B)。
实施例12
TIM4-Axl CER“CER11”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与Ax1胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:44)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER11”(Tim4-Axl CER，具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列)。Axl信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-Axl(CER11)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图49)。使用表达Tim4-Axl(CER11)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
如实施例8中所述，分离原代C3H小鼠胸腺细胞，使用地塞米松对其进行处理，并使用pHrodo Red染色。如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER11+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，以靶细胞与效应细胞10:1的比例进行Ba/F3CER11+tEGFR+细胞和原代胸腺细胞共培养实验，以及通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3CER11+EGFR+细胞对靶胸腺细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
通过FACS进行定量的存活CER11+转导的Ba/F3细胞的量如图58A中所示。根据通过FACS检测的pHrodo Red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群对吞噬作用频率进行定量(见图58B)。
荧光显微镜显示了与tEGFR转导的Ba/F3对照细胞相比的CER11+Ba/F3细胞对经地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬作用(白色箭头表示吞噬事件)(见图59A-B)。图59B的右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
通过[吞噬的靶细胞总数/计数的CER修饰细胞的总数的平均值(例如，吞噬作用频率)]乘以[每个CER+Ba/F3细胞靶细胞染色的平均面积x100(例如，杂交捕获)]计算吞噬作用指数，并与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞进行比较(见图60A-B)。对小鼠细胞系的吞噬活性
如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER11+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，使用星孢菌素处理CT26小鼠结肠癌细胞并使用pHrodo Red标记上述细胞，并且以靶细胞与效应细胞5:1的比例将其与Ba/F3CER11+tEGFR+细胞共培养3小时。如实施例8中所述，通过荧光显微镜和FACS对CER11+Ba/F3细胞对CT26细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。显示CER11+Ba/F3细胞和EGFRt+对照Ba/F3细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图61A-B中所示(白色箭头表示吞噬事件)。当吞噬时，使用pHrodo Red标记的CT26细胞在溶酶体的低pH区室内发荧光(以粉红色标出)。
将检测在CELLTRACE Violet染色区域内pHrodo Red荧光的杂交捕获算法用于荧光成像以便对吞噬的靶细胞面积/CER+B细胞面积进行定量。图62显示了提取使用CER11+tEGFR+或tEGFR+对照转导的Ba/F3细胞内CT26靶细胞面积的杂交细胞计数的散点图。面积比表示Ba/F3细胞内CT26细胞的共定位面积。
如实施例8中所述，使用星孢菌素处理WR19L小鼠淋巴瘤细胞并使用pHrodo Red标记上述细胞，并且以靶细胞与效应细胞5:1的比例将其与CELLTRACE Violet标记的Ba/F3CER11+tEGFR+细胞共培养3小时。如实施例8中所述，通过荧光显微镜对CER11+Ba/F3细胞对WR19L细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。显示CER11+Ba/F3细胞对WR19L细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图63中所示(白色箭头表示吞噬事件)。通过FACS进行定量的存活CER11+转导的Ba/F3细胞的量如图64A中所示。根据通过FACS检测的pHrodo Red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群对吞噬作用频率进行定量(见图64B)。
如实施例8中所述，使用星孢菌素处理A20小鼠淋巴瘤细胞并使用pHrodo Red标记上述细胞，并且以靶细胞与效应细胞5:1的比例将其与CELLTRACE Violet标记的Ba/F3CER11+tEGFR+细胞共培养3小时。如实施例8中所述，通过荧光显微镜和FACS对CER11+Ba/F3细胞对A20细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。显示与EGFRt转导的Ba/F3对照相比(图65B)的CER11+Ba/F3细胞对A20细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图65A中所示(白色箭头表示吞噬事件)。计算CER11+Ba/F3细胞的吞噬作用指数并与EGFRt+对照细胞进行比较，如图66中所示。
人CER11+B细胞对化疗处理的人细胞系的吞噬活性
如实施例8中所述，使用表达截短的EGFR作为转导标记物的pLenti Tim4-Axl(CER11)慢病毒转导人原代B细胞。在进行吞噬作用测定前一天，在含补充了10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的完全RPMI 1640生长培养基的6孔板中培养Jurkat人B淋巴瘤细胞，并使用奥沙利铂(5μM)和氟尿嘧啶(5-FU)(10μM)处理。次日，收集靶Jurkat细胞，使用1XPBS洗涤2次，并且使用pHrodo Red(在PBS中1ng/mL)在室温下染色15分钟。向Jurkat细胞中加入生长培养基，洗涤1次以除去过量的pHrodo Red，并且以约200,000个细胞/孔将细胞接种在含RPMI 1640完全培养基的平底96孔板中。使用1X PBS洗涤转导的人原代B细胞1次，然后使用CELLTRACE Violet(在PBS中1mM)在37℃下染色10分钟。向人原代B细胞中加入生长培养基，使用1X PBS洗涤1次以除去过量CELLTRACE Violet，并且以约50,000个细胞/孔将细胞接种在含RPMI完全培养基的96孔板中。以靶细胞与效应细胞4:1的比例将人原代B细胞与Jurkat细胞在37℃下共培养3小时。然后，使用配有20X物镜的Keyence BZ-X710显微镜将板成像。图67显示了CER11+人原代B细胞吞噬化疗处理的Jurkat细胞的荧光显微镜图像(右图显示了吞噬事件的吞噬情况；白色箭头表示吞噬作用)。
如实施例8中所述，使用表达截短的EGFR作为转导标记物的pLenti Tim4-Axl(CER11)慢病毒转导人原代B细胞。在进行吞噬作用测定前一天，将Colo320HSR结肠癌细胞与诱导磷脂酰丝氨酸的化疗剂吉西他滨(10μM)在无血清培养基中孵育24小时。处理后，收集漂浮和粘附的靶细胞，离心，室温下在含pHrodo red(1ng/μL)的PBS中孵育15分钟，洗涤，然后接种在非粘附96孔板中。以靶细胞与效应细胞4:1的比例将表达CER11+的人B细胞与Colo320HSR细胞在37℃下共培养3小时。然后，使用配有20X物镜的Keyence BZ-X710显微镜将板成像(见图68；白色箭头表示吞噬事件)。
如实施例8中所述，使用表达截短的EGFR作为转导标记物的pLenti Tim4-Axl(CER11)慢病毒转导人原代B细胞。在进行吞噬作用测定前一天，将A204横纹肌肉瘤细胞与诱导磷脂酰丝氨酸的化疗剂紫杉醇，以及将H1703非小细胞肺癌(NSCLC)腺癌细胞与诱导磷脂酰丝氨酸的化疗剂紫杉醇(30μM)+吉西他滨(10μM)在无血清培养基中孵育24小时。处理后，收集漂浮和粘附的靶细胞，离心，室温下在含pHrodo red(1ng/μL)的PBS中孵育15分钟，洗涤，然后接种在非粘附96孔板中。以靶细胞与效应细胞4:1的比例将表达CER11+的人B细胞与A204或H1703细胞在37℃下共培养3小时。然后，使用配有20X物镜的Keyence BZ-X710显微镜将板成像(对于A204细胞见图69和对于H1703细胞见图70；白色箭头表示吞噬事件)。
实施例13
TIM4-FcεR1γCER“CER12”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与FcεR1γ胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:88)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER12”(Tim4-FcεR1γCER，具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列)。FcεR1γ信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-FcεR1γ(CER12)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图71)。使用表达Tim4-FcεR1γ(CER12)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
如实施例8中所述，分离原代C3H小鼠胸腺细胞，使用地塞米松对其进行处理，并使用pHrodo Red染色。如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER12+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，以靶细胞与效应细胞10:1的比例进行Ba/F3CER12+tEGFR+细胞和原代胸腺细胞共培养实验，以及通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3CER12+EGFR+细胞对靶胸腺细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
通过FACS进行定量的存活CER12+转导的Ba/F3细胞的量如图72A中所示。根据通过FACS检测的pHrodo Red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群对吞噬作用频率进行定量(见图72B)。
荧光显微镜显示了与tEGFR转导的Ba/F3对照细胞相比的CER12+Ba/F3细胞对经地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬作用(白色箭头表示吞噬事件)(见图73A-B)。图73B的右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
通过[吞噬的靶细胞总数/计数的CER修饰细胞的总数的平均值(例如，吞噬作用频率)]乘以[每个CER+Ba/F3细胞靶细胞染色的平均面积x100(例如，杂交捕获)]计算吞噬作用指数，并与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞进行比较(见图74A-B)。对小鼠细胞系的吞噬活性
如实施例8中所述，使用星孢菌素处理WR19L小鼠淋巴瘤细胞并使用pHrodo Red标记上述细胞，并且以靶细胞与效应细胞5:1的比例将其与CELLTRACE Violet标记的Ba/F3CER12+tEGFR+细胞共培养3小时。如实施例8中所述，通过荧光显微镜对CER12+Ba/F3细胞对WR19L细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。显示CER12+Ba/F3细胞对WR19L细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图75中所示(白色箭头表示吞噬事件)。
如实施例8中所述，使用星孢菌素处理A20小鼠淋巴瘤细胞并使用pHrodo Red标记上述细胞，并且以靶细胞与效应细胞5:1的比例将其与CELLTRACE Violet标记的Ba/F3CER12+tEGFR+细胞共培养3小时。如实施例8中所述，通过荧光显微镜和FACS对CER12+Ba/F3细胞对A20细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。显示CER12+Ba/F3细胞对A20细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图76中所示(白色箭头表示吞噬事件)。计算CER12+Ba/F3细胞的吞噬作用指数并与EGFRt+转导的Ba/F3对照细胞进行比较，如图77中所示。
实施例14
TIM4-FcεR1γ-FcεR1γCER“CER13”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与FcεR1γ跨膜结构域(SEQ ID NO:89的氨基酸序列)和胞内信号传导结构域(SEQ ID NO:88)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER13”(Tim4-FcεR1γ-FcεR1γCER，具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列)。FcεR1γ信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-FcεR1γ-FcεR1γ(CER13)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图78)。使用表达Tim4-FcεR1γ-FcεR1γ(CER13)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
如实施例8中所述，分离原代C3H小鼠胸腺细胞，使用地塞米松对其进行处理，并使用pHrodo Red染色。如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER13+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，以靶细胞与效应细胞10:1的比例进行Ba/F3CER13+tEGFR+细胞和原代胸腺细胞共培养实验，以及通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3CER13+EGFR+细胞对靶胸腺细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
通过FACS进行定量的存活CER13+转导的Ba/F3细胞的量如图64A中所示。根据通过FACS检测的pHrodo Red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群对吞噬作用频率进行定量(见图64B)。
人CER13+B细胞对化疗处理的人细胞系的吞噬活性
如实施例11中所述，使用表达截短的EGFR作为转导标记物的pLenti Tim4-FcεR1γ-FcεR1γ(CER13)慢病毒转导人原代B细胞。在进行吞噬作用测定前一天，将Colo320HSR结肠癌细胞与诱导磷脂酰丝氨酸的化疗剂吉西他滨(10μM)和紫杉醇(30μM)在无血清培养基中孵育24小时。处理后，收集漂浮和粘附的靶细胞，离心，室温下在含pHrodo red(1ng/μL)的PBS中孵育15分钟，洗涤，然后接种在非粘附96孔板中。以靶细胞与效应细胞4:1的比例将表达CER13+的人B细胞与Colo320HSR细胞在37℃下共培养3小时。然后，使用配有20X物镜的Keyence BZ-X710显微镜将板成像(见图680；白色箭头表示吞噬事件)。
如实施例11中所述，使用表达截短的EGFR作为转导标记物的pLenti Tim4-FcεR1γ-FcεR1γ(CER13)慢病毒转导人原代B细胞。在进行吞噬作用测定前一天，将A204横纹肌肉瘤细胞与诱导磷脂酰丝氨酸的化疗剂紫杉醇(30μM)，以及将H1703非小细胞肺癌(NSCLC)腺癌细胞与诱导磷脂酰丝氨酸的化疗剂紫杉醇(30μM)+吉西他滨(10μM)在无血清培养基中孵育24小时。处理后，收集漂浮和粘附的靶细胞，离心，室温下在含pHrodo red(1ng/μL)的PBS中孵育15分钟，洗涤，然后接种在非粘附96孔板中。以靶细胞与效应细胞4:1的比例将表达CER13+的人B细胞与A204或H1703细胞在37℃下共培养3小时。然后，使用配有20X物镜的Keyence BZ-X710显微镜将板成像(对于A204细胞见图81和对于H1703细胞见图82；白色箭头表示吞噬事件)。
实施例15
TIM4-MyD88t CER“CER15”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含死亡结构域但缺乏TIR结构域的截短的MyD88(MyD88t)(SEQ ID NO:78)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER15”(Tim4-MyD88t CER，具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列)。截短的MyD88转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-MyD88t(CER15)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图83)。使用表达Tim4-MyD88t(CER15)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
如实施例8中所述，分离原代C3H小鼠胸腺细胞，使用地塞米松对其进行处理，并使用pHrodo Red染色。如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER15+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，以靶细胞与效应细胞10:1的比例进行Ba/F3CER15+tEGFR+细胞和原代胸腺细胞共培养实验，以及通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3CER15+EGFR+细胞对靶胸腺细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
通过FACS进行定量的存活CER15+转导的Ba/F3细胞的量如图84A中所示。根据通过FACS检测的pHrodo Red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群对吞噬作用频率进行定量(见图84B)。
荧光显微镜显示了与tEGFR转导的Ba/F3对照细胞相比的CER15+Ba/F3细胞对经地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬作用(白色箭头表示吞噬事件)(见图85A-B)。图85B的右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
通过[吞噬的靶细胞总数/计数的CER修饰细胞的总数的平均值(例如，吞噬作用频率)]乘以[每个CER+Ba/F3细胞靶细胞染色的平均面积x100(例如，杂交捕获)]计算吞噬作用指数，并与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞进行比较(见图86A-B)。对小鼠细胞系的吞噬活性
如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER15+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，使用星孢菌素处理CT26小鼠结肠癌细胞并使用pHrodo Red标记上述细胞，并且以靶细胞与效应细胞5:1的比例将其与Ba/F3CER15+tEGFR+细胞共培养3小时。如实施例8中所述，通过荧光显微镜和FACS对CER15+Ba/F3细胞对CT26细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。显示CER15+Ba/F3细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图87中所示(白色箭头表示吞噬事件)。当吞噬时，使用pHrodo Red标记的CT26细胞在溶酶体的低pH区室内发荧光(以粉红色标出)。
如实施例8中所述，使用星孢菌素处理WR19L小鼠淋巴瘤细胞并使用pHrodo Red标记上述细胞，并且以靶细胞与效应细胞5:1的比例将其与CELLTRACE Violet标记的Ba/F3CER15+tEGFR+细胞共培养3小时。如实施例8中所述，通过荧光显微镜对CER15+Ba/F3细胞对WR19L细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。显示CER15+Ba/F3细胞对WR19L细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图88中所示(白色箭头表示吞噬事件)。
如实施例8中所述，使用星孢菌素处理A20小鼠淋巴瘤细胞并使用pHrodo Red标记上述细胞，并且以靶细胞与效应细胞5:1的比例将其与CELLTRACE Violet标记的Ba/F3CER15+tEGFR+细胞共培养3小时。如实施例8中所述，通过荧光显微镜和FACS对CER15+Ba/F3细胞对A20细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。显示CER15+Ba/F3细胞对A20细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图89中所示(白色箭头表示吞噬事件)。
人CER15+B细胞对人细胞系的吞噬活性
如实施例8中所述，使用表达截短的EGFR作为转导标记物的pLenti Tim4-MyD88t(CER15)慢病毒转导人原代B细胞。使用标记的抗-EGFR抗体(西妥昔单抗)然后使用Kat5-18抗体(Tim4特异性)(Abcam目录号#176486)染色利用FACS对转导的人B细胞进行分选(见图90A，其中右侧FACS图中的％表示表达Tim4结合结构域(CER15)的细胞的％)。扩增纯化的CER15+B细胞，并且在24小时、48小时和72小时成像，如图90B中所示。
使用星孢菌素处理Jurkat人T淋巴瘤并使用pHrodo Red标记上述细胞，并且在如实施例8中所述的吞噬作用测定中以靶细胞与效应细胞5:1的比例将其与CER15+原代B细胞共培养，共同孵育的时间为3小时。如实施例8中所述，通过荧光显微镜和FACS对CER15+人B细胞对Jurkat细胞的吞噬作用进行定量。存活CD19阳性人原代B细胞的频率和CD19阳性-pHrodo Red阳性事件(双阳性事件)的频率如图91中所示(分别为左图和右图)。图92显示了使用CER15+tEGFR+或EGFR+对照转导的原代人B细胞对Jurkat细胞的吞噬作用频率。
显示CER15+人原代B细胞对Jurkat细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图93A中所示，以及显示tEGFR+人原代B细胞对Jurkat细胞体外吞噬作用的荧光显微镜图像如图93B中所示(白色箭头表示吞噬事件)。
实施例16
TIM4-MyD88 CER“CER16”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含死亡结构域和TIR结构域的MyD88信号传导结构域(SEQ ID NO:53)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER16”(Tim4-MyD88CER，具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列)。MyD88转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-MyD88(CER16)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图94)。使用表达Tim4-MyD88(CER16)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
人CER16+B细胞对化疗处理的人细胞系的吞噬活性
如实施例8中所述，使用表达截短的EGFR作为转导标记物的pLenti Tim4-MyD88(CER16)慢病毒转导人原代B细胞。在进行吞噬作用测定前一天，在含补充了10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素的完全RPMI 1640生长培养基的6孔板中培养Jurkat人B淋巴瘤细胞，并使用奥沙利铂(5μM)和氟尿嘧啶(5-FU)(10μM)处理。次日，收集靶Jurkat细胞，使用1XPBS洗涤2次，并且使用pHrodo Red(在PBS中1ng/mL)在室温下染色15分钟。向Jurkat细胞中加入生长培养基，洗涤1次以除去过量的pHrodo Red，并且以约200,000个细胞/孔将细胞接种在含RPMI 1640完全培养基的平底96孔板中。使用1X PBS洗涤转导的人原代B细胞1次，然后使用CELLTRACE Violet(在PBS中1mM)在37℃下染色10分钟。向人原代B细胞中加入生长培养基，使用1X PBS洗涤1次以除去过量CELLTRACE Violet，并且以约50,000个细胞/孔将细胞接种在含RPMI完全培养基的96孔板中。以靶细胞与效应细胞4:1的比例将人原代B细胞与Jurkat细胞在37℃下共培养3小时。然后，使用配有20X物镜的Keyence BZ-X710显微镜将板成像。图95显示了CER16+人原代B细胞吞噬化疗处理的Jurkat细胞的荧光显微镜图像(白色箭头表示吞噬作用)。
实施例17
TIM4-NFAM1 CER“CER25”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与NFAM1信号传导结构域(SEQ ID NO:92)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER25”(Tim4-NFAM1CER，具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列)。NFAM1信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-NFAM1(CER25)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图96)。使用表达Tim4-NFAM1(CER25)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
如实施例8中所述，分离原代C3H小鼠胸腺细胞，使用地塞米松对其进行处理，并使用pHrodo Red染色。如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER25+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，以靶细胞与效应细胞10:1的比例进行Ba/F3CER25+tEGFR+细胞和原代胸腺细胞共培养实验，以及通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3CER25+EGFR+细胞对靶胸腺细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
通过FACS进行定量的存活CER25+转导的Ba/F3细胞的量如图97中所示。根据通过FACS检测的pHrodo Red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群对与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER25+Ba/F3细胞的吞噬作用频率进行定量(见图97B)。使用截短的EGFR转导的并与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的对照Ba/F3细胞的双阳性染色细胞的频率如图97A中所示。
荧光显微镜显示了与tEGFR转导的Ba/F3对照细胞相比CER25+Ba/F3细胞对经地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬作用(白色箭头表示吞噬事件)(见图98)。图98的右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
通过[吞噬的靶细胞总数/计数的CER修饰细胞的总数的平均值(例如，吞噬作用频率)]乘以[每个CER+Ba/F3细胞靶细胞染色的平均面积x100(例如，杂交捕获)]计算吞噬作用指数，并与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞进行比较(见图99)。
实施例18
TIM4-MyD88t-BAFFR CER“CER85”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含截短的MyD88的主要信号传导结构域(SEQ ID NO:78)和包含BAFF-R信号传导结构域的次要信号传导结构域(SEQ ID NO:94)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER85”(Tim4-MyD88t-BAFFRCER，具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列)。MyD88t或BAFF-R信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-MyD88t-BAFF4(CER85)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图100)。使用表达Tim4-MyD88t-BAFF4(CER85)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
如实施例8中所述，分离原代C3H小鼠胸腺细胞，使用地塞米松对其进行处理，并使用pHrodo Red染色。如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER85+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，以靶细胞与效应细胞10:1的比例进行Ba/F3CER85+tEGFR+细胞和原代胸腺细胞共培养实验，以及通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3CER85+EGFR+细胞对靶胸腺细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
通过FACS进行定量的存活CER85+转导的Ba/F3细胞的量如图101中所示。根据通过FACS检测的pHrodo Red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群对与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER85+Ba/F3细胞的吞噬作用频率进行定量(见图101A)。使用截短的EGFR转导的并与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的对照Ba/F3细胞的双阳性染色细胞的频率如图101B中所示。
荧光显微镜显示了与tEGFR转导的Ba/F3对照细胞相比CER85+Ba/F3细胞对经地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬作用(白色箭头表示吞噬事件)(见图102)。图102的右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
通过[吞噬的靶细胞总数/计数的CER修饰细胞的总数的平均值(例如，吞噬作用频率)]乘以[每个CER+Ba/F3细胞靶细胞染色的平均面积x100(例如，杂交捕获)]计算吞噬作用指数，并与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞进行比较(见图103)。
实施例19
TIM4-MyD88t-DAP12 CER“CER86”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含截短的MyD88的主要信号传导结构域(SEQ ID NO:78)和包含DAP12信号传导结构域的次要信号传导结构域(SEQ ID NO:82)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER86”(Tim4-MyD88t-DAP12CER，具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列)。MyD88t或DAP12信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-MyD88t-DAP12(CER86)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图104)。使用表达Tim4-MyD88t-DAP12(CER86)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
实施例20
TIM4-BAFFR-MYD88 CER“CER87”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含BAFF-R信号传导结构域的主要信号传导结构域(SEQ ID NO:94)和包含截短的MyD88信号传导结构域的次要信号传导结构域(SEQ ID NO:78)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER87”(Tim4-BAFFR-MyD88CER，具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列)。BAFF-R或截短的MyD88信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-BAFFR-MyD88(CER87)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图105)。使用表达Tim4-BAFFR-MyD88(CER87)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
如实施例8中所述，分离原代C3H小鼠胸腺细胞，使用地塞米松对其进行处理，并使用pHrodo Red染色。如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER87+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，以靶细胞与效应细胞10:1的比例进行Ba/F3CER87+tEGFR+细胞和原代胸腺细胞共培养实验，以及通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3CER87+EGFR+细胞对靶胸腺细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
通过FACS进行定量的存活CER87+转导的Ba/F3细胞的量如图106中所示。根据通过FACS检测的pHrodo Red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群对与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER87+Ba/F3细胞的吞噬作用频率进行定量(见图106B)。使用截短的EGFR转导的并与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的对照Ba/F3细胞的双阳性染色细胞的频率如图106A中所示。
荧光显微镜显示了与tEGFR转导的Ba/F3对照细胞相比CER87+Ba/F3细胞对经地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬作用(白色箭头表示吞噬事件)(见图107)。图107的右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
通过[吞噬的靶细胞总数/计数的CER修饰细胞的总数的平均值(例如，吞噬作用频率)]乘以[每个CER+Ba/F3细胞靶细胞染色的平均面积x100(例如，杂交捕获)]计算吞噬作用指数，并与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞进行比较(见图108)。
实施例21
TIM4-DAP12-MYD88 CER“CER88”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含DAP12信号传导结构域的主要信号传导结构域(SEQ ID NO:82)和包含截短的MyD88信号传导结构域的次要信号传导结构域(SEQ ID NO:78)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER88”(Tim4-DAP12-tMyD88CER，具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列)。DAP12或截短的MyD88信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-DAP12-MyD88(CER88)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图109)。使用表达Tim4-DAP12-MyD88(CER88)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
实施例22
TIM4-MYD88t-CD79b CER“CER89”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含截短的MyD88的主要信号传导结构域(SEQ ID NO:78)和包含CD79b信号传导结构域的次要信号传导结构域(SEQ ID NO:97)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER89”(Tim4-MyD88t-CD79bCER，具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列)。MyD88t或CD79b信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-MyD88t-CD79b(CER89)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图110)。使用表达Tim4-MyD88t-CD79b(CER89)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
实施例23
TIM4-MYD88t-NFAM1 CER“CER90”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含截短的MyD88的主要信号传导结构域(SEQ ID NO:78)和包含NFAM1信号传导结构域的次要信号传导结构域(SEQ ID NO:92)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER90”(Tim4-MyD88t-NFAM1，具有SEQ ID NO:100的氨基酸序列)。MyD88t或NFAM1信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-MyD88t-NFAM1(CER90)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图111)。使用表达Tim4-MyD88t-NFAM1(CER90)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
实施例24
TIM4-MYD88t-P2A-RAB5A CER“CER91”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与截短的MyD88信号传导结构域(SEQ ID NO:78)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER15”。MyD88t信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-MyD88t(CER15)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及Rab5a和作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其分别通过P2A序列和T2A序列所分隔(见图112)。使用表达Tim4-MyD88t-Rab5a(CER91，SEQ ID NO:105)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
如实施例8中所述，分离原代C3H小鼠胸腺细胞，使用地塞米松对其进行处理，并使用pHrodo Red染色。如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER91+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，以靶细胞与效应细胞10:1的比例进行Ba/F3CER91+tEGFR+细胞和原代胸腺细胞共培养实验，以及通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3CER91+EGFR+细胞对靶胸腺细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
通过FACS进行定量的存活CER91+转导的Ba/F3细胞的量如图113中所示。根据通过FACS检测的pHrodo Red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群对与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER91+Ba/F3细胞的吞噬作用频率进行定量(见图113A)。使用截短的EGFR转导的并与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的对照Ba/F3细胞的双阳性染色细胞的频率如图113B中所示。
荧光显微镜显示了与tEGFR转导的Ba/F3对照细胞相比CER91+Ba/F3细胞对经地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬作用(白色箭头表示吞噬事件)(见图114)。图114的右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
通过[吞噬的靶细胞总数/计数的CER修饰细胞的总数的平均值(例如，吞噬作用频率)]乘以[每个CER+Ba/F3细胞靶细胞染色的平均面积x100(例如，杂交捕获)]计算吞噬作用指数，并与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞进行比较(见图115)。
实施例25
TIM4-MERTK-MYD88 CER“CER92”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含MERTK信号传导结构域的主要信号传导结构域(SEQ ID NO:69)和包含截短的MyD88信号传导结构域的次要信号传导结构域(SEQ ID NO:78)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER92”(Tim4-MERTK-tMyD88CER，具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列)。MERTK或截短的MyD88信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-MERTK-tMyD88t(CER92)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图116)。使用表达Tim4-MERTK-tMyD88t(CER92)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
如实施例8中所述，分离原代C3H小鼠胸腺细胞，使用地塞米松对其进行处理，并使用pHrodo Red染色。如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER92+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，以靶细胞与效应细胞10:1的比例进行Ba/F3CER92+tEGFR+细胞和原代胸腺细胞共培养实验，以及通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3CER92+EGFR+细胞对靶胸腺细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
通过FACS进行定量的存活CER92+转导的Ba/F3细胞的量如图117中所示。根据通过FACS检测的pHrodo Red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群对与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER92+Ba/F3细胞的吞噬作用频率进行定量(见图117A)。使用截短的EGFR转导的并与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的对照Ba/F3细胞的双阳性染色细胞的频率如图117B中所示。
荧光显微镜显示了与tEGFR转导的Ba/F3对照细胞相比CER92+Ba/F3细胞对经地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬作用(白色箭头表示吞噬事件)(见图118)。图118的右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
通过[吞噬的靶细胞总数/计数的CER修饰细胞的总数的平均值(例如，吞噬作用频率)]乘以[每个CER+Ba/F3细胞靶细胞染色的平均面积x100(例如，杂交捕获)]计算吞噬作用指数，并与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞进行比较(见图119)。
实施例26
TIM4-MERTK-BAFFR CER“CER93”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含MERTK信号传导结构域的主要信号传导结构域(SEQ ID NO:43的氨基酸序列)和包含BAFF-R的次要信号传导结构域(SEQ ID NO:94的氨基酸序列)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER93”(Tim4-MERTK-BAFFR CER，具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列)。MERTK或BAFF-R信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-MERTK-BAFFR(CER93)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图120)。使用表达Tim4-MERTK-BAFFR(CER93)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
对原代凋亡胸腺细胞的吞噬活性
如实施例8中所述，分离原代C3H小鼠胸腺细胞，使用地塞米松对其进行处理，并使用pHrodo Red染色。如实施例8中所述，使用CELLTRACETM Violet染料标记Ba/F3CER93+tEGFR+细胞。如实施例8中所述，以靶细胞与效应细胞10:1的比例进行Ba/F3CER93+tEGFR+细胞和原代胸腺细胞共培养实验，以及通过荧光显微镜和FACS对Ba/F3CER93+EGFR+细胞对靶胸腺细胞的吞噬作用进行定量。使用表达截短的EGFR的pLenti载体转导的Ba/F3细胞作为阴性对照。
通过FACS进行定量的存活CER93+转导的Ba/F3细胞的量如图121中所示。根据通过FACS检测的pHrodo Red和CELLTRACE Violet双阳性染色细胞群对与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的CER93+Ba/F3细胞的吞噬作用频率进行定量(见图121A)。使用截短的EGFR转导的并与经地塞米松处理的胸腺细胞共培养的对照Ba/F3细胞的双阳性染色细胞的频率如图121B中所示。
荧光显微镜显示了与tEGFR转导的Ba/F3对照细胞相比CER93+Ba/F3细胞对经地塞米松处理的胸腺细胞的吞噬作用(白色箭头表示吞噬事件)(见图122)。图122的右侧显示了对吞噬事件的高倍放大。
通过[吞噬的靶细胞总数/计数的CER修饰细胞的总数的平均值(例如，吞噬作用频率)]乘以[每个CER+Ba/F3细胞靶细胞染色的平均面积x100(例如，杂交捕获)]计算吞噬作用指数，并与EGFRt转导的Ba/F3对照细胞进行比较(见图123)。
实施例27
TIM4-MERTK-DAP12 CER“CER94”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含MERTK信号传导结构域的主要信号传导结构域(SEQ ID NO:43的氨基酸序列)和包含DAP12信号传导结构域的次要信号传导结构域(SEQ ID NO:82的氨基酸序列)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER94”(Tim4-MERTK-DAP12CER，具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列)。MERTK或DAP12信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-MERTK-DAP12(CER94)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图124)。使用表达Tim4-MERTK-DAP12(CER94)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
实施例28
TIM4-AXL-DAP12 CER“CER97”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含Axl信号传导结构域的主要信号传导结构域(SEQ ID NO:44的氨基酸序列)和包含DAP12信号传导结构域的次要信号传导结构域(SEQ ID NO:82的氨基酸序列)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER97”(Tim4-AXL-DAP12CER，具有SEQ ID NO:152的氨基酸序列)。AXL或DAP12信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-AXL-DAP12(CER97)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图125)。使用表达Tim4-AXL-DAP12(CER97)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
实施例29
TIM4-AXL-CD79b CER“CER98”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含Axl信号传导结构域的主要信号传导结构域(SEQ ID NO:44的氨基酸序列)和包含CD79b信号传导结构域的次要信号传导结构域(SEQ ID NO:97的氨基酸序列)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER98”(Tim4-AXL-CD79b CER，具有SEQ ID NO:153的氨基酸序列)。Axl或CD79b信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-AXL-CD79B(CER98)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图126)。使用表达Tim4-AXL-CD79b(CER98)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
实施例30
TIM4-MERTK-CD79b CER“CER95”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含MERTK信号传导结构域的主要信号传导结构域(SEQ ID NO:43的氨基酸序列)和包含CD79b信号传导结构域的次要信号传导结构域(SEQ ID NO:97的氨基酸序列)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER95”(Tim4-MERTK-CD79b CER，具有SEQ ID NO:101的氨基酸序列)。MERTK或CD79b信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-MERTK-CD79b(CER95)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图127)。使用表达Tim4-MERTK-CD79b(CER95)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
实施例31
TIM4-MERTK-NFAM1 CER“CER96”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:72的氨基酸序列)和跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域(SEQ ID NO:73的氨基酸序列)与包含MERTK信号传导结构域的主要信号传导结构域(SEQ ID NO:43)和包含NFAM1信号传导结构域的次要信号传导结构域(SEQ ID NO:99)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER96”(Tim4-MERTK-NFAM1CER，具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列)。MERTK或NFAM1信号传导结构域转导吞噬信号，Tim4是磷脂酰丝氨酸结合受体。然后，将Tim4-MERTK-NFAM1(CER96)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔(见图128)。使用表达Tim4-MERTK-NFAM1(CER96)和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
还构建了CER96的变体，其具有与包含MERTK信号传导结构域的主要信号传导结构域和包含截短的NFAM1信号传导结构域的次要信号传导结构域融合在一起的包含信号肽和跨膜结构域的磷脂酰丝氨酸结合蛋白Tim4的胞外域，以形成具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的嵌合吞噬受体CER96t。
实施例32
M912scFv-IgG4-Tim4-MyD88t CER“CER50”的构建
将包含信号肽(SEQ ID NO:85的氨基酸序列)的包含来自间皮素特异性人单克隆抗体M912的scFv的胞外域(Feng等，2009,Mol.Cancer Ther.8:1113-1118)(SEQ ID NO:106的氨基酸序列)与经修饰的IgG4铰链区胞外间隔区结构域(SEQ ID NO:67)、Tim4跨膜结构域(SEQ ID NO:74的氨基酸序列)和截短的MyD88信号传导结构域(SEQ ID NO:69)融合在一起以形成嵌合吞噬受体“CER50”(M912scFv-IgG4-Tim4-MyD88t CER，具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列)。MyD88t信号传导结构域转导吞噬信号，M912scFv与同间皮素结合的细胞表面结合。然后，将M912scFv-IgG4-Tim4-MyD88t CER(CER50)嵌合吞噬受体核苷酸序列以及作为转导标记物的截短的EGFR插入pLenti慢病毒载体，其通过T2A序列所分隔。使用表达M912scFv-IgG4-Tim4-MyD88t和EGFRt的pLenti载体转导小鼠Ba/F3B-细胞，扩增并使用FACS对其进行分选，将其用于如实施例8中所述的体外研究。
实施例33
体外吞噬作用数据汇编
编辑了如前所述的针对各种细胞类型进行的CER+修饰Ba/F3细胞的吞噬作用数据。图129显示了具有CER01、CER08、CER09、CER10、CER11、CER12、CER15或EGFRt对照修饰的Ba/F3细胞与经地塞米松处理的原代胸腺细胞共培养的吞噬作用指数。图130显示了使用CER01、CER09、CER11、CER12、CER15或EGFRt对照转导的Ba/F3细胞与经星孢菌素处理的CT26结肠癌细胞共培养的吞噬作用指数。图131显示了使用CER01、CER09、CER11、CER12、CER15或EGFRt对照转导的Ba/F3细胞与经星孢菌素处理的A20淋巴瘤细胞共培养的吞噬作用指数。
实施例34
CER01在小鼠淋巴瘤模型中的吞噬活性
将编码具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的CER01的Tim4-MERTK CER的核苷酸序列(亦参见图6A)插入具有编码绿色荧光蛋白(GFP)的核苷酸序列的pMSCV逆转录病毒载体。在小鼠淋巴瘤模型中放疗和CER免疫疗法联用疗法方案的时间线如图132A中所示。
将0.5x 106个38c13小鼠B-细胞淋巴瘤细胞植入NOD scidγ(NSG)免疫缺陷小鼠。移植后4天，向肿瘤部位给予小鼠5Gy的聚焦照射，随后静脉注射给予6x 106个CER01+转导的小鼠T细胞(来自C3H/HeN-MTV-阴性小鼠)。使用精密卡尺在两个维度上测量肿瘤尺寸，在输注CER01+转导的T细胞后第4天进行荧光素酶成像。将pMSCV空逆转录病毒载体转导的T细胞作为对照。如图132B中的曲线所示，靶向磷脂酰丝氨酸的CER修饰的T细胞与低剂量放疗具有协同作用。如图132C中的照片所示，接受靶向磷脂酰丝氨酸的CER修饰的T细胞和低剂量放疗联合疗法的小鼠中的肿瘤生长减少。
在小鼠淋巴瘤模型中嵌合抗原受体(CAR)免疫疗法和CER免疫疗法替代联用疗法方案的时间线如图133A中所示。将0.5x 106个38c13淋巴瘤细胞植入NSG免疫缺陷小鼠。移植4天后，向小鼠输注5x 106个小鼠CD19-靶向的CAR-T细胞(“1D319z28”CAR，其具有抗-CD19 1D3scFv、CD3-ζ胞质结构域和CD28胞质结构域)。CAR修饰的T细胞输注后3天，向小鼠输注6x 106个CER01+转导的T细胞。使用精密卡尺在两个维度上测量肿瘤尺寸，在CER01+转导的T细胞或CER01+转导的B细胞输注后第4天进行荧光素酶成像(见图133B底部的照片)。将pMSCV空逆转录病毒载体转导的T细胞作为对照。如图133B中所示，靶向PtdSer+的CER+T细胞或CER+B细胞与低剂量CAR修饰的T细胞疗法具有协同作用。
可以将上文所述的各种实施方式组合以提供进一步的实施方式。在本说明书中提及的和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开文件、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利文献，包括2016年09月27日提交的美国专利申请号62/400,578，和2017年01月11日提交的美国专利申请号62/445,235的全部内容均通过引用并入本申请。如有必要，可以对实施方式的各方面进行修订，以使用各种专利、申请和公开文件的概念，以提供更进一步的实施方式。
根据以上的详细描述，可以对实施方式进行这些和其他改变。在通常情况下，在所附权利要求中，所使用的术语不应被解释为将权利要求限制于说明书和权利要求中公开的特定实施方式，而应被解释为包括所有可能的实施方式以及这些权利要求所赋予的等同物的全部范围。因此，权利要求不受本公开内容的限制。

Claims (151)

1.一种嵌合吞噬受体(CER)，所述嵌合吞噬受体包含单链嵌合蛋白，所述单链嵌合蛋白包含：
胞外域，所述胞外域包含与磷脂酰丝氨酸(PtdSer)结合的结合结构域；
吞噬信号传导结构域；和
位于所述胞外域和所述吞噬信号传导结构域之间并将这两者连接在一起的跨膜结构域。
2.根据权利要求1所述的CER，其中所述结合结构域包含PtdSer特异性scFv，或者来自Tim1、Tim4、Tim3、stabilin-2、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、脑特异性血管生成抑制剂1(BAI1)、乳脂肪球蛋白-EGF因子8蛋白(MFG-E8)、生长停滞特异性6(GAS6)、蛋白S、蛋白C、因子II、因子VII、因子IX、因子X、β2-糖蛋白I、α5β3整合素和其他整合素、CR3补体受体、CR4补体受体、CD14、CD93、膜联蛋白V、磷脂酰丝氨酸受体(PSr)、凝血酶原或清道夫受体的PtdSer结合结构域。
3.根据权利要求2所述的CER，其中所述结合结构域包含含有SEQ ID NO:28的氨基酸序列的TIM1结构域，含有SEQ ID NO:29的氨基酸序列的TIM4结构域，含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的Tim3结构域，含有SEQ ID NO:30的氨基酸序列的FA58C2结构域，含有SEQ IDNO:32的氨基酸序列的GAS6结构域，含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的蛋白S结合结构域或者含有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的BAI1结构域。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的CER，其中所述胞外域还包含位于所述结合结构域和跨膜结构域之间的胞外间隔区结构域。
5.根据权利要求4所述的CER，其中所述胞外间隔区结构域包含免疫球蛋白铰链区、1型膜蛋白的胞外区、II型C-凝集素的茎区、免疫球蛋白恒定区，或其片段。
6.根据权利要求5所述的CER，其中所述胞外间隔区结构域包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA或IgD铰链区。
7.根据权利要求6所述的CER，其中所述胞外间隔区结构域包含经修饰的IgG4铰链区，所述经修饰的IgG4铰链区含有SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
8.根据权利要求1-7中任意一项所述的CER，其中所述跨膜结构域包含Tim1、Tim4、Tim3、FcR、CD8a、CD28、MERTK、Axl、Tyro3、BAI1、CD4、DAP12或MRC1跨膜结构域。
9.根据权利要求8所述的CER，其中所述跨膜结构域包含含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的Tim1跨膜结构域，含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的Tim4跨膜结构域，含有SEQ IDNO:37的氨基酸序列的FcγRI跨膜结构域，含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CD8a跨膜结构域，含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的MERTK跨膜结构域，含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的Axl跨膜结构域，含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的Tyro3跨膜结构域，含有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的CD28跨膜结构域，含有SEQ ID NO:142的氨基酸序列的BAI1跨膜结构域，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CD4跨膜结构域，含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的FcεRIγ跨膜结构域，含有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的MRC1跨膜结构域或者含有SEQ IDNO:81的氨基酸序列的DAP12跨膜结构域。
10.根据权利要求8所述的CER，其中所述FcR跨膜结构域包含FcγR1、FcγR2A、FcγR2B2、FcγR2C、FcγR3A、FcεR1或FcαR1跨膜结构域。
11.根据权利要求1-10中任意一项所述的CER，其中所述吞噬信号传导结构域是稳态吞噬信号传导结构域或促炎性吞噬信号传导结构域。
12.根据权利要求11所述的CER，其中所述稳态吞噬信号传导结构域是ItgB5、MERTK、Tyro3、Axl、BAI1、ELMO或MRC1信号传导结构域。
13.根据权利要求11所述的CER，其中所述促炎性吞噬信号传导结构域是PI3K、Traf6、Syk、MyD88、Zap70、FcγR1、FcγR2A、FcγR2B2、FcγR2C、FcγR3A、FcεR1、FcαR1、BAFF-R、DAP12、NFAM1或CD79b信号传导结构域。
14.根据权利要求12所述的CER，其中所述稳态吞噬信号传导结构域是含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的MERTK信号传导结构域，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的Tyro3信号传导结构域，含有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的ItgB5信号传导结构域，含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的MRC1信号传导结构域，含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的BAI1信号传导结构域，含有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的ELMO信号传导结构域或含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的Ax1信号传导结构域。
15.根据权利要求13所述的CER，其中所述促炎性吞噬信号传导结构域是含有SEQ IDNO:54的氨基酸序列的Traf6信号传导结构域，含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的Syk信号传导结构域，含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的MyD88信号传导结构域，含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的截短的MyD88信号传导结构域，含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的Zap70信号传导结构域，含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的FcγR1信号传导结构域，含有SEQ IDNO:49的氨基酸序列的FcγR2A信号传导结构域，含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的FcγR2C信号传导结构域，含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的FcγR3A信号传导结构域，含有SEQID NO:88的氨基酸序列的FcεRIγ信号传导结构域，含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的BAFF-R信号传导结构域，含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的DAP12信号传导结构域，含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的NFAM1信号传导结构域或含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CD79b信号传导结构域。
16.根据权利要求11、12或14中任意一项所述的CER，其中通过所述稳态吞噬信号传导结构域的信号传导导致至少一种抗炎性或免疫抑制性细胞因子的表达。
17.根据权利要求16所述的CER，其中所述抗炎性或免疫抑制性细胞因子是TGF-β、IL-10或者这两者。
18.根据权利要求11、13或15中任意一项所述的CER，其中通过所述促炎性吞噬信号传导结构域的信号传导导致至少一种炎性细胞因子、炎性趋化因子或共刺激细胞表面标记物的表达。
19.根据权利要求18所述的CER，其中所述炎性细胞因子是TNFα、IL-1、IL-6、IL-12或IL-23；所述炎性趋化因子是CCL5(RANTES)、CXCL9或CXCL10；并且所述共刺激细胞表面标记物是CD80、CD86、HLA-DR、CD40、HVEM或4-1BBL；或其任意组合。
20.根据权利要求1-10中任意一项所述的CER，其中所述吞噬信号传导结构域包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域。
21.根据权利要求20所述的CER，其中所述主要吞噬信号传导结构域是稳态吞噬信号传导结构域并且所述次要吞噬信号传导结构域是稳态吞噬信号传导结构域。
22.根据权利要求20所述的CER，其中所述主要吞噬信号传导结构域是促炎性吞噬信号传导结构域并且所述次要吞噬信号传导结构域是促炎性吞噬信号传导结构域。
23.根据权利要求20所述的CER，其中所述主要吞噬信号传导结构域是稳态吞噬信号传导结构域并且所述次要吞噬信号传导结构域是促炎性吞噬信号传导结构域。
24.根据权利要求20所述的CER，其中所述主要吞噬信号传导结构域是促炎性吞噬信号传导结构域并且所述次要吞噬信号传导结构域是稳态吞噬信号传导结构域。
25.根据权利要求21或22所述的CER，其中所述主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域是相同的或不同的。
26.根据权利要求21、23、24或25中任意一项所述的CER，其中所述稳态吞噬信号传导结构域是ItgB5、MERTK、Tyro3、Axl、BAI1、ELMO或MRC1信号传导结构域。
27.根据权利要求26所述的CER，其中所述稳态吞噬信号传导结构域是含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的MERTK信号传导结构域，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的Tyro3信号传导结构域，含有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的ItgB5信号传导结构域，含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的MRC1信号传导结构域，含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的BAI1信号传导结构域，含有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的ELMO信号传导结构域或含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的Ax1信号传导结构域。
28.根据权利要求22、23、24或25中任意一项所述的CER，其中所述促炎性吞噬信号传导结构域是PI3K、Traf6、Syk、MyD88、Zap70、FcγR1、FcγR2A、FcγR2B2、FcγR2C、FcγR3A、FcεR1、FcαR1、BAFF-R、DAP12、NFAM1或CD79b信号传导结构域。
29.根据权利要求28所述的CER，其中所述促炎性吞噬信号传导结构域是含有SEQ IDNO:54的氨基酸序列的Traf6信号传导结构域，含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的Syk信号传导结构域，含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的MyD88信号传导结构域，含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的截短的MyD88信号传导结构域，含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的Zap70信号传导结构域，含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的FcγR1信号传导结构域，含有SEQ IDNO:49的氨基酸序列的FcγR2A信号传导结构域，含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的FcγR2C信号传导结构域，含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的FcγR3A信号传导结构域，含有SEQID NO:88的氨基酸序列的FcεRIγ信号传导结构域，含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的BAFF-R信号传导结构域，含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的DAP12信号传导结构域，含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的NFAM1信号传导结构域或含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CD79b信号传导结构域。
30.根据权利要求1所述的CER，其中：
所述结合结构域选自Tim4 PtdSer结合结构域和FA58C2 PtdSer结合结构域，所述跨膜结构域选自Tim4跨膜结构域和CD28跨膜结构域，
所述吞噬信号传导结构域选自MERTK信号传导结构域和SYK信号传导结构域，并且
可选地，所述胞外域包含位于所述结合结构域和跨膜结构域之间的胞外间隔区结构域。
31.根据权利要求30所述的CER，其包含：所述Tim4 PtdSer结合结构域、所述Tim4跨膜结构域和所述MERTK信号传导结构域。
32.根据权利要求30所述的CER，其包含：所述FA58C2 PtdSer结合结构域、所述胞外间隔区结构域，其中所述胞外间隔区结构域包含IgG4铰链区、所述CD28跨膜结构域和所述MERTK信号传导结构域。
33.根据权利要求30所述的CER，其包含：所述FA58C2 PtdSer结合结构域、所述胞外间隔区结构域，其中所述胞外间隔区结构域包含IgG4铰链区、所述CD28跨膜结构域和所述SYK信号传导结构域。
34.根据权利要求30或31所述的CER，其中所述Tim4 PtdSer结合结构域包含SEQ IDNO:29的氨基酸序列。
35.根据权利要求30或31所述的CER，其中所述Tim4跨膜结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列。
36.根据权利要求30、31和32中任意一项所述的CER，其中所述MERTK信号传导结构域包含SEQ ID NO:69的氨基酸序列。
37.根据权利要求31所述的CER，其包含SEQ ID NO:71的氨基酸序列或SEQ ID NO:71的氨基酸23-776。
38.根据权利要求30、32和33中任意一项所述的CER，其中所述FA58C2 PtdSer结合结构域包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列。
39.根据权利要求30、32和33中任意一项所述的CER，其中所述CD28跨膜结构域包含SEQID NO:68的氨基酸序列。
40.根据权利要求32或33所述的CER，其中所述IgG4铰链区包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
41.根据权利要求30或33所述的CER，其中所述SYK信号传导结构域包含SEQ ID NO:46的氨基酸序列。
42.根据权利要求32所述的CER，包含SEQ ID NO:75的氨基酸序列或SEQ ID NO:75的氨基酸23-699。
43.根据权利要求33所述CER，包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或SEQ ID NO:70的氨基酸23-484。
44.一种嵌合吞噬受体(CER)，所述嵌合吞噬受体包含单链嵌合蛋白，所述单链嵌合蛋白包含：
胞外域，所述胞外域包含与促吞噬标记物或靶抗原结合的结合结构域；
促炎性吞噬信号传导结构域；和
位于所述胞外域和所述促炎性吞噬信号传导结构域之间并将这两者连接在一起的跨膜结构域。
45.根据权利要求44所述的CER，其中所述促吞噬标记物选自磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、ICAM-3、氧化低密度脂蛋白、钙网蛋白、膜联蛋白I、补体C1q和血小板反应蛋白。
46.根据权利要求45所述的CER，其包含与PtdSer结合且是PtdSer特异性scFv的结合结构域，或者来自Tim1、Tim4、Tim3、stabilin-2、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、脑特异性血管生成抑制剂1(BAI1)、乳脂肪球蛋白-EGF因子8蛋白(MFG-E8)、生长停滞特异性6(GAS6)、蛋白S、蛋白C、因子II、因子VII、因子IX、因子X、β2-糖蛋白I、α5β3整合素和其他整合素、CR3补体受体、CR4补体受体、CD14、CD93、膜联蛋白V、磷脂酰丝氨酸受体(PSr)、凝血酶原或清道夫受体的PtdSer结合结构域。
47.根据权利要求44所述的CER，其中所述结合结构域是肿瘤抗原特异性scFv。
48.根据权利要求47所述的CER，其中所述肿瘤抗原是CD138、CD38、CD33、CD123、CD72、CD79a、CD79b、间皮素、PSMA、BCMA、ROR1、MUC-16、L1CAM、CD22、CD19、CD20、CD23、CD24、CD37、CD30、CA125、CD56、c-Met、EGFR、GD-3、HPV E6、HPV E7、MUC-1、HER2、叶酸受体α、CD97、CD171、CD179a、CD44v6、WT1、VEGF-α、VEGFR1、IL-13Rα1、IL-13Rα2、IL-11Rα、PSA、FcRH5、NKG2D配体、NY-ESO-1、TAG-72、CEA、肝配蛋白A2、肝配蛋白B2、Lewis A抗原、Lewis Y抗原、MAGE、MAGE-A1、RAGE-1、叶酸受体β、EGFRviii、VEGFR-2、LGR5、SSX2、AKAP-4、FLT3、岩藻糖基GM1、GM3、o-乙酰基-GD2或GD2。
49.根据权利要求44所述的CER，其中所述结合结构域是对能够在宿主中建立持续感染的微生物抗原特异性的scFv。
50.根据权利要求44-49中任意一项所述的CER，其中所述胞外域还包含位于所述结合结构域和跨膜结构域之间的胞外间隔区结构域。
51.根据权利要求50所述的CER，其中所述胞外间隔区结构域包含免疫球蛋白铰链区、1型膜蛋白的胞外区、II型C-凝集素的茎区、免疫球蛋白恒定区，或其片段。
52.根据权利要求51所述的CER，其中所述胞外间隔区结构域包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA或IgD铰链区。
53.根据权利要求52所述的CER，其中所述胞外间隔区结构域包含经修饰的IgG4铰链区，所述经修饰的IgG4铰链区包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
54.根据权利要求44-53中任意一项所述的CER，其中所述跨膜结构域包含Tim1、Tim4、Tim3、FcR、CD8a、CD28、MERTK、Axl、Tyro3、BAI1、CD4、MRC1或DAP12跨膜结构域。
55.根据权利要求54所述的CER，其中所述跨膜结构域包含含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的Tim1跨膜结构域，含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的Tim4跨膜结构域，含有SEQ IDNO:37的氨基酸序列的FcγRI跨膜结构域，含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CD8a跨膜结构域，含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的MERTK跨膜结构域，含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的Axl跨膜结构域，含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的Tyro3跨膜结构域，含有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的CD28跨膜结构域，含有SEQ ID NO:142的氨基酸序列的BAI1跨膜结构域，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CD4跨膜结构域，含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的FcεRIγ跨膜结构域，含有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的MRC1跨膜结构域或者含有SEQ IDNO:81的氨基酸序列的DAP12跨膜结构域。
56.根据权利要求54所述的CER，其中所述FcR跨膜结构域包含FcγR1、FcγR2A、FcγR2B2、FcγR2C、FcγR3A、FcεR1或FcαR1跨膜结构域。
57.根据权利要求44-56中任意一项所述的CER，其中所述促炎性吞噬信号传导结构域是PI3K、Traf6、Syk、MyD88、Zap70、FcγR1、FcγR2A、FcγR2B2、FcγR2C、FcγR3A、FcεR1、FcαR1、BAFF-R、DAP12、NFAM1或CD79b信号传导结构域。
58.根据权利要求57所述的CER，其中所述促炎性吞噬信号传导结构域是含有SEQ IDNO:54的氨基酸序列的Traf6信号传导结构域，含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的Syk信号传导结构域，含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的MyD88信号传导结构域，含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的截短的MyD88信号传导结构域，含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的Zap70信号传导结构域，含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的FcγR1信号传导结构域，含有SEQ IDNO:49的氨基酸序列的FcγR2A信号传导结构域，含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的FcγR2C信号传导结构域，含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的FcγR3A信号传导结构域，含有SEQID NO:88的氨基酸序列的FcεRIγ信号传导结构域，含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的BAFF-R信号传导结构域，含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的DAP12信号传导结构域，含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的NFAM1信号传导结构域或含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CD79b信号传导结构域。
59.根据权利要求44-58中任意一项所述的CER，其中通过所述促炎性吞噬信号传导结构域的信号传导导致炎性细胞因子、炎性趋化因子或共刺激细胞表面标记物的至少一种的表达。
60.根据权利要求59所述的CER，其中所述炎性细胞因子是TNFα、IL-1、IL-6、IL-12或IL-23；所述炎性趋化因子是CCL5(RANTES)、CXCL9或CXCL10；和所述共刺激细胞表面标记物是CD80、CD86、HLA-DR、CD40、HVEM或4-1BBL；或其任意组合。
61.一种嵌合吞噬受体(CER)，所述嵌合吞噬受体包含单链嵌合蛋白，所述单链嵌合蛋白包含：
胞外域，所述胞外域包含与促吞噬标记物或靶抗原结合的结合结构域；
吞噬信号传导结构域，所述吞噬信号传导结构域包含主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域；和
位于所述胞外域和所述主要吞噬信号传导结构域之间并将这两者连接在一起的跨膜结构域。
62.根据权利要求61所述的CER，其中所述促吞噬标记物选自磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、ICAM-3、氧化低密度脂蛋白、钙网蛋白、膜联蛋白I、补体C1q和血小板反应蛋白。
63.根据权利要求62所述的CER，包含与PtdSer结合且是PtdSer特异性scFv的结合结构域，或者来自Tim1、Tim4、Tim3、stabilin-2、晚期糖基化终末产物受体(RAGE)、脑特异性血管生成抑制剂1(BAI1)、乳脂肪球蛋白-EGF因子8蛋白(MFG-E8)、生长停滞特异性6(GAS6)、蛋白S、蛋白C、因子II、因子VII、因子IX、因子X、β2-糖蛋白I、α5β3整合素和其他整合素、CR3补体受体、CR4补体受体、CD14、CD93、膜联蛋白V、磷脂酰丝氨酸受体(PSr)、凝血酶原或清道夫受体的PtdSer结合结构域。
64.根据权利要求61所述的CER，其中所述结合结构域是肿瘤抗原特异性scFv。
65.根据权利要求64所述的CER，其中所述肿瘤抗原是CD138、CD38、CD33、CD123、CD72、CD79a、CD79b、间皮素、PSMA、BCMA、ROR1、MUC-16、L1CAM、CD22、CD19、CD20、CD23、CD24、CD37、CD30、CA125、CD56、c-Met、EGFR、GD-3、HPV E6、HPV E7、MUC-1、HER2、叶酸受体α、CD97、CD171、CD179a、CD44v6、WT1、VEGF-α、VEGFR1、IL-13Rα2、IL-13Rα1、IL-11Rα、PSA、FcRH5、NKG2D配体、NY-ESO-1、TAG-72、CEA、肝配蛋白A2、肝配蛋白B2、Lewis A抗原、Lewis Y抗原、MAGE、MAGE-A1、RAGE-1、叶酸受体β、EGFRviii、VEGFR-2、LGR5、SSX2、AKAP-4、FLT3、岩藻糖基GM1、GM3、o-乙酰基-GD2或GD2。
66.根据权利要求61所述的CER，其中所述结合结构域是微生物抗原特异性scFv。
67.根据权利要求61-66中任意一项所述的CER，其中所述胞外域还包含位于所述结合结构域和跨膜结构域之间的胞外间隔区结构域。
68.根据权利要求67所述的CER，其中所述胞外间隔区结构域包含免疫球蛋白铰链区、1型膜蛋白的胞外区、II型C-凝集素的茎区、免疫球蛋白恒定区，或其片段。
69.根据权利要求68所述的CER，其中所述胞外间隔区结构域包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA或IgD铰链区。
70.根据权利要求69所述的CER，其中所述胞外间隔区结构域包含经修饰的IgG4铰链区，所述经修饰的IgG4铰链区包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
71.根据权利要求61-70中任意一项所述的CER，其中所述跨膜结构域包含Tim1、Tim4、Tim3、FcR、CD8a、CD28、MERTK、Axl、Tyro3、BAI1、CD4、MRC1或DAP12跨膜结构域。
72.根据权利要求71所述的CER，其中所述跨膜结构域包含含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的Tim1跨膜结构域，含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的Tim4跨膜结构域，含有SEQ IDNO:37的氨基酸序列的FcγRI跨膜结构域，含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CD8a跨膜结构域，含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的MERTK跨膜结构域，含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的Axl跨膜结构域，含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的Tyro3跨膜结构域，含有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的CD28跨膜结构域，含有SEQ ID NO:142的氨基酸序列的BAI1跨膜结构域，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CD4跨膜结构域，含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的FcεRIγ跨膜结构域，含有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的MRC1跨膜结构域或者含有SEQ IDNO:81的氨基酸序列的DAP12跨膜结构域。
73.根据权利要求71所述的CER，其中所述FcR跨膜结构域包含FcγR1、FcγR2A、FcγR2B2、FcγR2C、FcγR3A、FcεR1或FcαR1跨膜结构域。
74.根据权利要求61-73中任意一项所述的CER，其中所述主要吞噬信号传导结构域是稳态吞噬信号传导结构域并且所述次要吞噬信号传导结构域是稳态吞噬信号传导结构域。
75.根据权利要求61-73中任意一项所述的CER，其中所述主要吞噬信号传导结构域是促炎性吞噬信号传导结构域并且所述次要吞噬信号传导结构域是促炎性吞噬信号传导结构域。
76.根据权利要求61-73中任意一项所述的CER，其中所述主要吞噬信号传导结构域是稳态吞噬信号传导结构域并且所述次要吞噬信号传导结构域是促炎性吞噬信号传导结构域。
77.根据权利要求61-73中任意一项所述的CER，其中所述主要吞噬信号传导结构域是促炎性吞噬信号传导结构域并且所述次要吞噬信号传导结构域是稳态吞噬信号传导结构域。
78.根据权利要求74或75所述的CER，其中所述主要吞噬信号传导结构域和次要吞噬信号传导结构域是相同的或不同的。
79.根据权利要求74、76、77和78中任意一项所述的CER，其中所述稳态吞噬信号传导结构域是ItgB5、MERTK、Tyro3、Axl、BAI1、ELMO或MRC1信号传导结构域。
80.根据权利要求79所述的CER，其中所述稳态吞噬信号传导结构域是含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的MERTK信号传导结构域，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的Tyro3信号传导结构域，含有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的ItgB5信号传导结构域，含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的MRC1信号传导结构域，含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的BAI1信号传导结构域，含有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的ELMO信号传导结构域或含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的Ax1信号传导结构域。
81.根据权利要求75-78中任意一项所述的CER，其中所述促炎性吞噬信号传导结构域是PI3K、Traf6、Syk、MyD88、Zap70、FcγR1、FcγR2A、FcγR2B2、FcγR2C、FcγR3A、FcεR1、FcαR1、BAFF-R、DAP12、NFAM1或CD79b信号传导结构域。
82.根据权利要求81所述的CER，其中所述促炎性吞噬信号传导结构域是含有SEQ IDNO:54的氨基酸序列的Traf6信号传导结构域，含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的Syk信号传导结构域，含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的MyD88信号传导结构域，含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的截短的MyD88信号传导结构域，含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的Zap70信号传导结构域，含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的FcγR1信号传导结构域，含有SEQ IDNO:49的氨基酸序列的FcγR2A信号传导结构域，含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的FcγR2C信号传导结构域，含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的FcγR3A信号传导结构域，含有SEQID NO:88的氨基酸序列的FcεRIγ信号传导结构域，含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的BAFF-R信号传导结构域，含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的DAP12信号传导结构域，含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的NFAM1信号传导结构域或含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CD79b信号传导结构域。
83.一种嵌合吞噬受体(CER)，所述嵌合吞噬受体包含单链嵌合蛋白，所述单链嵌合蛋白包含：
胞外域，所述胞外域包含与促吞噬标记物或靶抗原结合的scFv；
吞噬信号传导结构域；和
位于所述胞外域和所述吞噬信号传导结构域之间并将这两者连接在一起的跨膜结构域，
其中所述跨膜结构域和吞噬信号传导结构域分别来自不同分子。
84.根据权利要求83所述的CER，其中与促吞噬标记物结合的所述scFv选自磷脂酰丝氨酸(PtdSer)、ICAM-3、氧化低密度脂蛋白、钙网蛋白、膜联蛋白I、补体C1q和血小板反应蛋白。
85.根据权利要求83所述的CER，其中所述scFv与肿瘤抗原结合。
86.根据权利要求85所述的CER，其中所述肿瘤抗原是CD138、CD38、CD33、CD123、CD72、CD79a、CD79b、间皮素、PSMA、BCMA、ROR1、MUC-16、L1CAM、CD22、CD19、CD20、CD23、CD24、CD37、CD30、CA125、CD56、c-Met、EGFR、GD-3、HPV E6、HPV E7、MUC-1、HER2、叶酸受体α、CD97、CD171、CD179a、CD44v6、WT1、VEGF-α、VEGFR1、IL-13Rα2、IL-11Rα、PSA、FcRH5、NKG2D配体、NY-ESO-1、TAG-72、CEA、肝配蛋白A2、肝配蛋白B2、Lewis A抗原、Lewis Y抗原、MAGE、MAGE-A1、RAGE-1、叶酸受体β、EGFRviii、VEGFR-2、LGR5、SSX2、AKAP-4、FLT3、岩藻糖基GM1、o-乙酰基-GD2或GD2。
87.根据权利要求83所述的CER，其中所述结合结构域是微生物抗原特异性scFv。
88.根据权利要求83-87中任意一项所述的CER，其中所述胞外域还包含位于所述结合结构域和跨膜结构域之间的胞外间隔区结构域。
89.根据权利要求88所述的CER，其中所述胞外间隔区结构域包含免疫球蛋白铰链区、1型膜蛋白的胞外区、II型C-凝集素的茎区、免疫球蛋白恒定区，或其片段。
90.根据权利要求89所述的CER，其中所述胞外间隔区结构域包含IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA或IgD铰链区。
91.根据权利要求90所述CER，其中所述胞外间隔区结构域包含经修饰的IgG4铰链区，所述经修饰的IgG4铰链区包含SEQ ID NO:67的氨基酸序列。
92.根据权利要求83-91中任意一项所述的CER，其中所述跨膜结构域包含Tim1、Tim4、Tim3、FcR、CD8a、CD28、MERTK、Axl、Tyro3、BAI1、CD4、MRC1或DAP12跨膜结构域。
93.根据权利要求92所述的CER，其中所述跨膜结构域包含含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的Tim1跨膜结构域，含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的Tim4跨膜结构域，含有SEQ IDNO:37的氨基酸序列的FcγRI跨膜结构域，含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的CD8a跨膜结构域，含有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的MERTK跨膜结构域，含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的Axl跨膜结构域，含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的Tyro3跨膜结构域，含有SEQ IDNO:68的氨基酸序列的CD28跨膜结构域，含有SEQ ID NO:142的氨基酸序列的BAI1跨膜结构域，含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的CD4跨膜结构域，含有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的FcεRIγ跨膜结构域，含有SEQ ID NO:118的氨基酸序列的MRC1跨膜结构域或者含有SEQ IDNO:81的氨基酸序列的DAP12跨膜结构域。
94.根据权利要求92所述的CER，其中所述FcR跨膜结构域包含FcγR1、FcγR2A、FcγR2B2、FcγR2C、FcγR3A、FcεR1或FcαR1跨膜结构域。
95.根据权利要求83-94中任意一项所述的CER，其中所述吞噬信号传导结构域是稳态吞噬信号传导结构域或促炎性吞噬信号传导结构域。
96.根据权利要求95所述的CER，其中所述稳态吞噬信号传导结构域是ItgB5、MERTK、Tyro3、Axl、BAI1、ELMO或MRC1信号传导结构域。
97.根据权利要求95所述的CER，其中所述促炎性吞噬信号传导结构域是PI3K、Traf6、Syk、MyD88、Zap70、FcγR1、FcγR2A、FcγR2B2、FcγR2C、FcγR3A、FcεR1、FcαR1、BAFF-R、DAP12、NFAM1或CD79b信号传导结构域。
98.根据权利要求96所述的CER，其中所述稳态吞噬信号传导结构域是含有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的MERTK信号传导结构域，含有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的Tyro3信号传导结构域，含有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的ItgB5信号传导结构域，含有SEQ ID NO:119的氨基酸序列的MRC1信号传导结构域，含有SEQ ID NO:136的氨基酸序列的BAI1信号传导结构域，含有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的ELMO信号传导结构域或含有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的Ax1信号传导结构域。
99.根据权利要求97所述的CER，其中所述促炎性吞噬信号传导结构域是含有SEQ IDNO:54的氨基酸序列的Traf6信号传导结构域，含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的Syk信号传导结构域，含有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的MyD88信号传导结构域，含有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的截短的MyD88信号传导结构域，含有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的Zap70信号传导结构域，含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的FcγR1信号传导结构域，含有SEQ IDNO:49的氨基酸序列的FcγR2A信号传导结构域，含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的FcγR2C信号传导结构域，含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的FcγR3A信号传导结构域，含有SEQID NO:88的氨基酸序列的FcεRIγ信号传导结构域，含有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的BAFF-R信号传导结构域，含有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的DAP12信号传导结构域，含有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的NFAM1信号传导结构域或含有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的CD79b信号传导结构域。
100.根据权利要求95、96和98中任意一项所述的CER，其中通过所述稳态吞噬信号传导结构域的信号传导导致至少一种抗炎性或免疫抑制性细胞因子的表达。
101.根据权利要求100所述的CER，其中所述抗炎性或免疫抑制性细胞因子是TGF-β、IL-10或者这两者。
102.根据权利要求95、97和99中任意一项所述的CER，其中通过所述促炎性吞噬信号传导结构域的信号传导导致至少一种炎性细胞因子、炎性趋化因子或共刺激细胞表面标记物的表达。
103.根据权利要求102所述的CER，其中所述炎性细胞因子是TNFα、IL-1、IL-6、IL-12或IL-23；所述炎性趋化因子是CCL5(RANTES)、CXCL9或CXCL10；并且所述共刺激细胞表面标记物是CD80、CD86、HLA-DR、CD40、HVEM或4-1BBL；或其任意组合。
104.根据权利要求83所述的CER，其包含：
胞外域，所述胞外域包含：含有与CD19特异性结合的scFv的结合结构域和含有IgG4铰链区的胞外间隔区结构域；
吞噬信号传导结构域，所述吞噬信号传导结构域包含MERTK信号传导结构域；
跨膜结构域，所述跨膜结构域包含位于所述胞外域和所述吞噬信号传导结构域之间并将这两者连接在一起的CD28跨膜结构域；
其中所述胞外间隔区结构域位于所述结合结构域和所述跨膜结构域之间。
105.根据权利要求104所述的CER，其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或SEQ ID NO:64的氨基酸23-783。
106.一种核酸分子，所述核酸分子编码根据权利要求1-105中任意一项所述的CER。
107.根据权利要求106所述的核酸分子，其还包含编码至少一种小GTPase的序列。
108.根据权利要求107所述的核酸分子，其中所述小GTPase是Rac1、Rab5、Rab7、Rap1、RhoA或CDC42。
109.根据权利要求108所述的核酸分子，其中所述小GTPase是含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的Rac1，含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的Rab5，含有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的Rab7，含有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的Rap1A，含有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的RhoA，含有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDC42或其任意组合。
110.根据权利要求107-109中任意一项所述的核酸分子，其中IRES序列、弗林切割位点序列或病毒2A肽序列位于编码CER的序列和编码小GTPase的序列之间。
111.根据权利要求106-110中任意一项所述的核酸分子，其还包含编码转导标记物、自杀基因或者这两者的序列。
112.根据权利要求111所述的核酸分子，其中所述转导标记物是截短的EGFR蛋白，所述截短的EGFR蛋白包含SEQ ID NO:121的氨基酸序列。
113.一种载体，所述载体包含根据权利要求106-112中任意一项所述的核酸分子。
114.根据权利要求113所述的载体，其中所述载体是多顺反子载体。
115.根据权利要求113或114所述的载体，其中所述载体是病毒载体、经修饰的mRNA载体或转座子介导的基因转移载体。
116.根据权利要求115所述的载体，其中所述病毒载体是逆转录病毒载体或慢病毒载体。
117.一种宿主细胞，所述宿主细胞包含根据权利要求1-105中任意一项所述的CER，根据权利要求106-112中任意一项所述的核酸或根据权利要求113-116中任意一项所述的载体。
118.根据权利要求117所述的宿主细胞，其包含至少两种不同的根据权利要求1-105中任意一项所述的CER。
119.根据权利要求117或118所述的宿主细胞，其还包含编码小GTPase的重组核酸分子。
120.根据权利要求119所述的宿主细胞，其中所述CER和所述小GTPase在相同载体上编码。
121.根据权利要求119所述的宿主细胞，其中所述CER和所述小GTPase在分开的载体上编码。
122.根据权利要求119-121中任意一项所述的宿主细胞，其中所述小GTPase是Rac1、Rab5、Rab7、Rap1、RhoA或CDC42。
123.根据权利要求122所述的宿主细胞，其中所述小GTPase是含有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的Rac1，含有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的Rab5，含有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的Rab7，含有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的Rap1A，含有SEQ ID NO:124的氨基酸序列的RhoA，含有SEQ ID NO:125的氨基酸序列的CDC42，或其任意组合。
124.根据权利要求117-123中任意一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是T细胞(包括CD4+、CD8+、幼稚(CD45 RA+、CCR7+、CD62L+、CD27+、CD45RO-)、中央记忆(CD45RO+、CD62L+、CD8+)、效应记忆(CD45RA+、CD45RO-、CCR7-、CD62L-、CD27-)、病毒特异性、粘膜相关恒定、γδ(gd)、自然杀伤和组织驻留T细胞)、自然杀伤细胞、B细胞、淋巴前体细胞(包括常见淋巴细胞前体细胞)、抗原提呈细胞(包括树突状细胞)、朗格汉斯细胞、骨髓前体细胞或成熟骨髓细胞。
125.根据权利要求124所述的宿主细胞，其中所述B细胞是幼稚B细胞、浆细胞、调节性B细胞、边缘区B细胞、滤泡性B细胞、淋巴浆细胞样细胞、浆母细胞或记忆B细胞。
126.根据权利要求117-125中任意一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是人细胞。
127.根据权利要求117-126中任意一项所述的宿主细胞，其中当所述CER的胞外域与所述促吞噬标记物或靶抗原结合时，所述宿主细胞显示出吞噬活性。
128.根据权利要求127所述的宿主细胞，其中当所述CER的胞外域与所述促吞噬标记物或靶抗原结合时，所述宿主细胞显示出吞噬细胞活性。
129.一种根据权利要求117-128中任意一项所述的宿主细胞的群。
130.根据权利要求129所述的宿主细胞的群，其包含T细胞、B细胞、自然杀伤细胞、淋巴前体细胞、抗原呈递细胞、朗格汉斯细胞、骨髓前体细胞、成熟骨髓细胞或其任意组合的群。
131.根据权利要求129或130所述的宿主细胞的群，其中所述宿主细胞的群经历富集步骤。
132.根据权利要求117-128中任意一项所述的宿主细胞或根据权利要求129-131中任意一项所述的宿主细胞的群，其中所述宿主细胞或宿主细胞的群对靶细胞显示出至少20的吞噬指数。
133.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求106-112中任意一项所述的核酸分子，根据权利要求113-116中任意一项所述的载体，根据权利要求117-128中任意一项所述的宿主细胞或根据权利要求129-131中任意一项所述的宿主细胞群，和药学上可接受的赋形剂。
134.一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的经基因修饰以表达根据权利要求1-105中任意一项所述的CER的细胞；根据权利要求117-128中任意一项所述的宿主细胞，根据权利要求129-131中任意一项所述的宿主细胞群或根据权利要求133所述的药物组合物。
135.一种治疗患有与肿瘤抗原过表达相关的疾病、病症或不利病况的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的经基因修饰以表达根据权利要求1-105中任意一项所述的CER的细胞；根据权利要求117-128中任意一项所述的宿主细胞，根据权利要求129-131中任意一项所述的宿主细胞群或根据权利要求133所述的药物组合物。
136.一种治疗患有自身免疫性疾病、病症或不利病况的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的经基因修饰以表达根据权利要求1-105中任意一项所述的CER的细胞；根据权利要求117-128中任意一项所述的宿主细胞，根据权利要求129-131中任意一项所述的宿主细胞群或根据权利要求133所述的药物组合物。
137.一种治疗或预防对象中感染性疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的经基因修饰以表达根据权利要求1-105中任意一项所述的CER的细胞；根据权利要求117-128中任意一项所述的宿主细胞，根据权利要求129-131中任意一项所述的宿主细胞群或根据权利要求133所述的药物组合物。
138.根据权利要求134-137中任意一项所述的方法，其中所述经基因修饰的细胞是T细胞(包括CD4+、CD8+、幼稚(CD45 RA+、CCR7+、CD62L+、CD27+、CD45RO-)、中央记忆(CD45RO+、CD62L+、CD8+)、效应记忆(CD45RA+、CD45RO-、CCR7-、CD62L-、CD27-)、病毒特异性、粘膜相关恒定、γδ(gd)、自然杀伤和组织驻留T细胞)、自然杀伤细胞、B细胞、淋巴前体细胞(包括常见淋巴细胞前体细胞)、抗原提呈细胞(包括树突状细胞)、朗格汉斯细胞、骨髓前体细胞或成熟骨髓细胞。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述B细胞是幼稚B细胞、浆细胞、调节性B细胞、边缘区B细胞、滤泡性B细胞、淋巴浆细胞样细胞、浆母细胞或记忆B细胞。
140.根据权利要求138或139所述的方法，其中所述经基因修饰的细胞是自体细胞。
141.根据权利要求138或139所述的方法，其中所述经基因修饰的细胞是同种异体细胞。
142.一种治疗患有癌症的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的根据权利要求113-116中任意一项所述的载体。
143.一种治疗患有与肿瘤抗原过表达相关的疾病、病症或不利病况的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的根据权利要求113-116中任意一项所述的载体。
144.一种治疗患有自身免疫性疾病、病症或不利病况的对象的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的根据权利要求113-116中任意一项所述的载体。
145.一种在对象中治疗感染性疾病的方法，所述方法包括向所述对象施用有效量的根据权利要求113-116中任意一项所述的载体。
146.根据权利要求142-145中任意一项所述的方法，其还包括施用第二载体，所述第二载体包含编码小GTPase的核酸分子。
147.根据权利要求146所述的方法，其中所述小GTPase是Rac1、Rab5、Rab7、Rap1、RhoA或CDC42。
148.根据权利要求134-147中任意一项所述的方法，其中将所述经基因修饰的细胞、宿主细胞群、药物组合物或载体与第二治疗剂联合向所述对象施用。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述第二治疗剂是抗体、放疗、化疗剂、细胞免疫疗法、抗生素、抗真菌剂或抗病毒剂。
150.根据权利要求148或149所述的方法，其中所述CER在所述第二治疗剂施用之后施用。
151.根据权利要求148-149中任意一项所述的方法，其中以亚治疗剂量施用所述第二治疗剂。
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