KR20230160242A - 림프구 표적화된 렌티바이러스 벡터 - Google Patents

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몰리 알. 퍼킨스
케빈 엠. 프리드먼
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켈로니아 테라퓨틱스, 인코포레이티드
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Abstract

표적화 단백질을 특징으로 하는 세포에 대한 전달 및 이에 의한 발현을 위한 돌연변이된 이종성 외피 단백질, 표적화 단백질 및 적어도 하나의 전이유전자를 포함하는 렌티바이러스 벡터가 본원에 제공된다. 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 방법 및 재료, 표적 세포를 형질도입하는 방법 및 본 개시내용에 따른 렌티바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포가 또한 제공된다.

Description

림프구 표적화된 렌티바이러스 벡터
서열 목록에 관한 설명
본 출원과 연관된 서열 목록은 종이 사본 대신에 텍스트 형식으로 제공되고, 본원에 의해 본 명세서로 참고로 포함된다. 서열 목록을 함유하는 텍스트 파일의 명칭은 930207_401WO_SEQUENCE_LISTING.txt이다. 텍스트 파일은 158 KB이고, 2022년 2월 25일에 생성되었고, EFS 웹을 통해 전자로 제출된다.
렌티바이러스 벡터는 유전자 변형된 세포 치료제, 특히 T 세포 치료제에서 중요한 역할을 한다. 최근에 허가된 T 세포 치료제는 치료학적 분자(예를 들면, 키메라 항원 수용체(CAR))를 T 림프구로 형질도입하기 위해 레트로바이러스 벡터에 의존한다. CAR T 세포 생산에 연관된 위험은 전이유전자에 의한 다른 세포 유형의 형질도입이다. 넓은 세포 향성(tropism)을 갖는 통합 벡터, 예를 들면 VSV-G 외피 단백질에 의해 위형화된 렌티바이러스 벡터의 사용은 희귀하지만 심각한 안전성 우려를 나타낼 수 있다.
도 1은 3세대 LVV 생산 시스템에 사용하기에 적합한 헬퍼 플라스미드의 도식적 표시이다.
도 2a-2b는 LDL 수용체 결합(Trop-002, Trop-051, Trop-052, Trop-055 및 Trop-061) 및 T 세포 표적화 단백질 CD80을 무효화하기 위해 돌연변이된 VSV-G 외피를 보유하는 렌티바이러스 벡터에 의한 주카트(Jurkat) T 세포 및 라지(Raji) B 세포의 온타깃 및 오프타깃 진입을 보여주는 그래프(도 2a) 및 FACS 선도(도 2b)를 도시한다. 도 2a에서, 온타깃 진입은 왼쪽 막대이고, 오프타깃은 각각의 샘플의 오른쪽 막대이다. T 세포에서 동족 리간드에 대한 T 세포 표적화 단백질의 결합은 렌티바이러스 벡터의 진입으로 이어지고, 리포터 녹색 형광 단백질(GFP)의 후속하는 발현이 측정된다.
도 3a-3b는 (도 3a) VSV-G 패키징 플라스미드로부터 발현된 T 세포 표적화 단백질 CD80이 HEK293 생산자 세포의 표면에서 돌연변이된 VSV-G와 비교적 동등한 수준으로 발현되고; (도 3b) 이 접근법에 의해 생성된 LVV가 표적화된 주카트 T 세포를 형질도입할 수 있지만, 라지 B 세포를 형질도입하지 않는다는 것을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 4는 (상부 열) Rev 패키징 플라스미드 또는 돌연변이된 VSV-G 패키징 플라스미드로 CD80 표적화 단백질을 클로닝하여서 생성된 LVV를 사용한 HEK293T 생산자 세포의 표면에서의 CD80 및 돌연변이된 VSV-G의 발현 수준; 및 (하부) Rev 패키징 플라스미드 또는 돌연변이된 VSV-G 패키징 플라스미드로 CD80 표적화 단백질을 클로닝하여서 생성된 LVV가 표적화된 주카트 T 세포를 형질도입한다는 것을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 5는 (왼쪽) CD80 플라스미드 농도의 함수로서 5개의 플라스미드 패키징 시스템을 사용한 HEK293T 생산자 세포의 표면에서의 CD80 표적화 단백질 발현; 및 (오른쪽) 5개의 플라스미드 패키징 시스템에 의해 생성된 LVV가 표적화된 주카트 T 세포를 형질도입하고, 형질도입 효율이 CD80 패키징 플라스미드 농도와 연관된다는 것을 도시한다.
도 6a-6d는 부착성 HEK293 또는 현탁 HEK293 생산자 세포에서 생산된 림프구 표적화 LVV의 역가를 도시한다. LVV는 원심분리(도 6a) 또는 음이온 교환 크로마토그래피, 이후 접선 흐름 여과(도 6b)에 의해 HEK293 부착성 세포 배양 배지로부터 수확되었다. LVV는 음이온 교환 크로마토그래피(도 6c)에 의해 HEK293 현탁 세포 배양 배지로부터 수확되었다. AEX/TFF에 의한 농축은 순도 및 회수의 높은 수준을 갖는 LVV 조제물을 생성시켰다(도 6d).
도 7은 BCMA CAR 전이유전자를 포함하는 LVV 또는 BCMA CAR 전이유전자를 포함하는 T 세포 표적화 LVV(항-CD3 및 CD80)를 갖는 건강한 인간 공여자로부터의 PBMC에서 T 세포 형질도입을 시험하기 위한 도식을 도시한다. 하부 오른쪽에 도시된 그래프는 낮은 MOI에서도 T 세포 표적화 LVV가 표준 LVV보다 높은 수준에서 T 세포를 형질도입하고, T 세포 표적화 LVV가 표준 LVV와 반대로 IL-2 및 외인성 활성화 항체(항-CD3 및 항-CD28)의 존재 없이 T 세포를 형질도입할 수 있다는 것을 나타낸다.
도 8은 3명의 상이한 공여자로부터 얻어지고 외인성 활성화 항-CD3 및 항-CD28 항체의 존재 또는 부재 하에 표준 LVV 또는 T 세포 재지향된 LVV(항-CD3 및 CD80)를 사용하여 형질도입된 PBMC로부터의 T 세포 확장을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 9는 CD19 CAR 전이유전자를 포함하는 LVV 또는 CD19 CAR 전이유전자를 포함하는 T 세포 표적화 LVV(항-CD3 및 CD80)를 갖는 건강한 인간 공여자로부터의 PBMC에서 T 세포 형질도입을 시험하기 위한 도식을 도시한다. 하부 오른쪽에 도시된 그래프는 T 세포 표적화 LVV가 표준 LVV보다 높은 수준에서 T 세포를 형질도입하고, T 세포 표적화 LVV가 표준 LVV와 반대로 외인성 활성화 항체(항-CD3 및 항-CD28)의 존재 없이 T 세포를 형질도입할 수 있다는 것을 보여준다.
도 10은 T 세포 표적화 LVV를 생성하기 위해 사용된 항-CD3 표적화 단백질(VH-VL 배향 및 VL-VH 배향에서의 12F6)에 의한 T 세포 형질도입 효율 및 T 세포 활성화의 수준을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 11은 BCMA CAR T 세포가 표준 LVV 또는 T 세포 재지향된 LVV(항-CD3 및 CD80)에 의해 생성되든 BCMA 음성 세포주에 의해 관찰되지 않는 BCMA 양성 세포주와 배양 후 T 세포 효과기 사이토카인(TNFα - 왼쪽; TNFα 및 IFNγ - 오른쪽)의 발현 증가를 나타낸다는 것을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 12a-12b는 T 세포 표적화 LVV를 사용한 전이유전자의 생체내 전달을 보여주는 그래프를 도시한다: (도 12a) T 세포 표적화 LVV(항-CD3 및 CD80)는 인간화된 마우스 모델(n=5)에서 인간 T 세포(CD3+)를 특이적으로 형질도입하고 인간 B 세포(CD20+)를 형질도입하지 않고; (도 12b) T 세포 표적화 LVV는 형질도입하지 않은 표준 LVV와 비교하여 CD8+ 및 CD8-(CD4) T 세포 둘 다를 형질도입한다.
도 13은 CD80 표적화 LVV가 표준 LVV와 비교하여 CD4 T 세포의 형질도입을 향상시킨다는 것을 보여주는 그래프를 도시한다.
도 14는 T 세포 표적화 (항-CD3 및 CD80) LVV가 표적 주카트 T 세포를 형질도입하지만, 표준 LVV와 비교하여 오프타깃 종양 세포(라지, Ramos, Jeko-1 및 NALM-6)를 형질도입하지 않는다는 것을 보여주는 그래프를 도시한다.
조작된 렌티바이러스 벡터가 본원에 기재되어 있다. 렌티바이러스 벡터는 표적화 단백질을 특징으로 하는 세포에 대한 전달 및 이에 의한 발현을 위한 돌연변이된 이종성 외피 단백질, 표적화 단백질 및 적어도 하나의 전이유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화 단백질은 예를 들면 림프구 또는 T 세포를 포함하는 면역 세포를 표적화하도록 선택된다. 소정의 이러한 실시형태에서, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 휴지 림프구, 예를 들면 T 세포를 선택적으로 표적화하고 효율적으로 형질도입할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 외인성 T 세포 자극제의 부재 하에 T 세포를 형질도입하고/하거나 활성화할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 표준 렌티바이러스 벡터와 비교하여 CD4 T 세포의 형질도입을 향상시킨다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 돌연변이된 env 및 표적화 단백질을 혼입한 렌티바이러스 벡터는 또 다른 융합성 env 단백질(예를 들면, 코칼 env, 파라믹소바이러스 env, 절두된 VSV-G env)을 혼입한 표준 LVV와 비교하여 고역가 LVV 산물을 생산할 수 있다.
본원에 기재된 렌티바이러스 벡터를 생산하기 위한 방법 및 재료, 표적 세포를 형질도입하는 방법 및 본 개시내용에 따른 렌티바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포가 또한 제공된다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 렌티바이러스 벡터 및/또는 이러한 벡터에 의해 형질도입된 세포는 벡터에 의해 전달된 전이유전자를 발현하는 세포의 존재에 반응하는 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용될 수 있다.
정의
본 개시내용을 더 자세히 기술하기 전에, 이는 본원에 사용되는 소정의 용어의 정의를 제공하도록 이의 이해에 도움이 될 수 있다.
본 설명에서, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는, 달리 표시되지 않는 한, 언급된 범위 내의 임의의 정수의 값 및 적절할 때 이의 분수(예컨대, 정수의 1/10 및 1/100)를 포함한다고 이해되어야 한다. 또한, 임의의 물리적 특징, 예컨대 중합체 아단위, 크기 또는 두께에 관한 본원에 언급된 임의의 숫자 범위는 달리 표시되지 않는 한 언급된 범위 내의 임의의 정수를 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 것과 같이, "약"의 용어는 달리 표시되지 않는 한 표시된 범위, 값 또는 구조의 ± 20%를 의미한다. 본원에 사용된 것과 같은 "일" 및 "하나"의 용어가 열거된 성분의 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 대안(예를 들면, "또는")의 사용은 대안의 하나, 둘 다, 또는 이들의 임의의 조합을 의미하도록 이해되어야 한다. 본원에 사용된 것과 같이, "포함한다", "갖는다" 및 "수반한다"의 용어는 동의어로 사용되고, 상기 용어 및 이의 변형어는 비제한적인 것으로서 해석되도록 의도된다.
항체 기술의 분야에서의 당업자에 의해 이해되는 용어는 각각 본원에 달리 명확히 다르게 정의되지 않는 한 당해 분야에서 획득된 의미가 주어진다. "항체"의 용어는 가장 넓은 의미로 사용되고, 다중클론 항체 및 단일클론 항체를 포함한다. "항체"는 디설파이드 결합에 의해 상호연결된 적어도 2개의 중(H)쇄 및 2개의 경(L)쇄를 포함하는 온전한 항체뿐만 아니라 표적 분자에 결합하는 용량을 갖거나 보유하는 온전한 항체의 항원 결합 부분(또는 항원 결합 도메인)을 지칭할 수 있다. 항체는 면역글로불린의 자연 발생, 재조합으로 생산된, 유전적으로 조작된 또는 변형된 형태, 예를 들면 인트라바디, 펩티바디, 나노바디, 단일 도메인 항체, SMIP, 다중특이적 항체(예를 들면, 이중특이적 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 텐덤 디-scFv, 텐덤 트리-scFv, ADAPTIR)일 수 있다. 단일클론 항체 또는 이의 항원 결합 부분은 비인간, 키메라, 인간화 또는 인간, 바람직하게는 인간화 또는 인간일 수 있다. 면역글로불린 구조 및 기능은 예를 들면 Harlow 등, Eds., Antibodies: A Laboratory Manual, Chapter 14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 1988)에 검토되어 있다. 온전한 항체의 "항원 결합 부분" 또는 "항원 결합 도메인"은 온전한 항체의 부분을 나타내고 온전한 항체의 항원 결정 가변 영역 또는 상보성 결정 영역을 지칭하는 "항체 단편"을 포함하도록 의도된다. 항체 단편의 예는 항체 단편으로부터 형성된 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편, Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디, 선형 항체, scFv 항체, VH 및 다중특이적 항체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. "Fab"(단편 항원 결합)는 항원에 결합하는 항체의 부분이고, 사슬간 디설파이드 결합을 통해 경쇄에 연결된 중쇄의 가변 영역 및 CH1을 포함한다. 항체는 IgG 및 이의 하위종류(IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 임의의 종류 또는 하위종류일 수 있다.
항체의 맥락에서 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"의 용어는 항원에 대한 항체의 결합에 관여된 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변 도메인(또는 영역)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FR) 및 3개의 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. (예를 들면, Kindt 등 Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007) 참조). 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원 결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리될 수 있다. 예를 들면, Portolano 등, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 등, Nature 352:624-628 (1991) 참조.
"고가변 영역" 또는 "HVR"과 동의어인 "상보성 결정 영역" 및 "CDR"의 용어는 항원 특이성 및/또는 결합 친화도를 부여하는 항체 가변 영역 내의 아미노산의 비인접 서열을 지칭하는 것으로 당해 분야에 알려져 있다. 일반적으로, 각각의 중쇄 가변 영역에서의 3개의 CDR(HCDR1, HCDR2, HCDR3) 및 각각의 경쇄 가변 영역에서의 3개의 CDR(LCDR1, LCDR2, LCDR3)이 있다.
본원에 사용된 것과 같이, "결합 도메인", "결합 영역" 및 "결합 모이어티"의 용어는 표적 분자(예를 들면, 종양 항원)에 특이적으로 그리고 비공유로 결합하거나 이것과 회합하거나 이것을 통합하거나 인식하거나 조합하는 능력을 보유하는 펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질과 같은 분자를 지칭한다. 결합 도메인은 생물학적 분자 또는 관심 있는 다른 표적에 대한 임의의 자연 발생, 합성, 반합성 또는 재조합으로 생산된 결합 파트너를 포함한다. 일부 실시형태에서, 결합 도메인은 항원 결합 도메인, 예컨대 항체 또는 이의 기능적 결합 도메인 또는 항원 결합 부분이다. 예시적인 결합 도메인은 단일 사슬 항체 가변 영역(예를 들면, 도메인 항체, sFv, scFv, Fab), 수용체 엑토도메인(예를 들면, TNF-α), 리간드(예를 들면, 사이토카인, 케모카인) 또는 생물학적 분자에 결합하는 특정 능력에 대해 선택된 합성 폴리펩타이드를 포함한다.
"주요 조직적합성 복합 분자"(MHC 분자)는 세포 표면에 펩타이드 항원을 전달하는 당단백질을 지칭한다. MHC 클래스 I 분자는 막 스패닝 α 사슬(3개의 α 도메인을 가짐) 및 비공유로 회합된 β2 마이크로글로불린으로 이루어진 이종이합체이다. MHC 클래스 II 분자는 둘 다 막에 걸친 2개의 막관통 당단백질인 α 및 β로 이루어진다. 각각의 사슬은 2개의 도메인을 갖는다. MHC 클래스 I 분자는 세포 표면에 시토졸에 기원하는 펩타이드를 전달하고, 여기서 펩타이드:MHC 복합체는 CD8+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 클래스 II 분자는 세포 표면에 혈관계에 기원하는 펩타이드를 전달하고, 여기서 이것은 CD4+ T 세포에 의해 인식된다. MHC 분자는 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유류를 포함하는 다양한 동물 종 유래일 수 있다.
"키메라 항원 수용체"(CAR)는 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않고 세포의 표면에서 발현될 때 수용체로서 기능할 수 있는 방식으로 함께 연결된 2개 이상의 구별되는 도메인을 포함하는 키메라 융합 단백질을 지칭한다. CAR은 일반적으로 표적 항원에 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인, 선택적 세포외 스페이서 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인(예를 들면, 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)) 및 선택적으로 세포내 공동자극 도메인을 포함)으로 이루어진다. 소정의 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 세포내 신호전달 도메인 및 세포내 공동자극 도메인(예를 들면, 4-1BB)을 함유하는 ITAM(예를 들면, CD3ζ)을 갖는다. 소정의 실시형태에서, CAR은 단일 폴리펩타이드 사슬로서 합성되거나 핵산 분자에 의해 단일 사슬 폴리펩타이드로서 암호화된다.
특정한 표적에 특이적으로 결합하는 본 개시내용의 결합 도메인을 확인할 뿐만 아니라 결합 도메인 친화도를 결정하기 위한 각종 검정, 예컨대 웨스턴 블롯, ELISA, 분석적 초원심분리, 분광법, 표면 플라즈몬 공명(BIACORE®) 분석 및 MHC 사합체 분석이 알려져 있다(또한, 예를 들면, Scatchard 등, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660, 1949; Wilson, Science 295:2103, 2002; Wolff 등, Cancer Res. 53:2560, 1993; Altman 등, Science 274:94-96, 1996; 및 미국 특허 제5,283,173호, 제5,468,614호 또는 균등물 참조). 본원에 사용된 것과 같이, "특이적으로 결합한다"는 샘플에서 임의의 다른 분자 또는 성분과 유의하게 회합하거나 통합하지 않으면서 105 M-1 이상인 친화도 또는 Ka(즉, 1/M의 단위로 특정한 결합 상호작용의 평형 회합 상수)에 의한 표적 분자에 대한 결합 도메인 또는 이의 융합 단백질의 회합 또는 통합을 지칭한다.
"항원" 및 "Ag"의 용어는 면역 반응을 유도할 수 있는 분자를 지칭한다. 유도된 면역 반응은 항체 생산, 특이적 면역학적 수용성 세포의 활성화 또는 둘 다를 수반할 수 있다. 단백질, 당단백질 및 당지질을 포함하는 거대분자는 항원으로서 작용할 수 있다. 항원은 재조합 또는 게놈 DNA로부터 유래될 수 있다. 본원에서 고려되는 것과 같이, 항원은 결코 (i) 오로지 유전자의 전장 뉴클레오타이드 서열 또는 (ii) "유전자"에 의해 암호화될 필요가 없다. 항원은 생성되거나 합성될 수 있거나, 항원은 생물학적 샘플로부터 유래될 수 있다. 이러한 생물학적 샘플은 조직 샘플, 종양 샘플, 세포 또는 생물학적 유체를 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"에피토프" 또는 "항원 에피토프"의 용어는 동족 면역 결합 분자, 예컨대 항체 또는 이의 단편(예를 들면, scFv), T 세포 수용체(TCR), CAR 또는 다른 결합 분자, 도메인 또는 단백질에 의해 특이적으로 결합된 항원 내의 임의의 분자, 구조, 아미노산 서열 또는 단백질 결정부위를 포함한다. 에피토프 결정인자는 일반적으로 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적으로 활성인 표면 그룹을 함유하고, 특정 3차원 구조 특징뿐만 아니라 특정 전하 특징을 가질 수 있다. 에피토프는 선형 에피토프 또는 구성적 에피토프일 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, "효과기 도메인"은 적절한 신호를 수신할 때 효과기 도메인을 발현하는 세포에서 생물학적 반응 또는 생리학적 반응을 직접적으로 또는 간접적으로 촉진할 수 있는 융합 단백질 또는 키메라 수용체의 세포내 부분이다. 소정의 실시형태에서, 효과기 도메인은 결합할 때 신호를 수신하는 단백질 또는 단백질 복합체의 부분이다. 다른 실시형태에서, 효과기 도메인은 효과기 도메인으로부터 신호를 촉발하는 표적 분자에 직접적으로 결합하는 단백질 또는 단백질 복합체의 부분이다. 예를 들면, 표적 분자에 대한 CAR의 결합에 반응하여, 효과기 도메인은 숙주 세포의 내부로 신호를 전달하여 효과기 기능을 가져올 수 있다. 효과기 도메인은 이것이 하나 이상의 신호전달 도메인 또는 모티프를 함유할 때 세포 반응을 직접적으로 촉진할 수 있다. 다른 실시형태에서, 효과기 도메인은 세포 반응을 직접적으로 촉진하는 하나 이상의 다른 단백질과의 회합에 의해 세포 반응을 간접적으로 촉진할 것이다.
"연접 아미노산" 또는 "연접 아미노산 잔기"는 폴리펩타이드의 2개의 인접한 모티프, 영역 또는 도메인 사이의 1개 이상(예를 들면, 약 2개 내지 20개)의 아미노산 잔기를 지칭한다. 연접 아미노산은 키메라 단백질의 작제물 설계로부터 생길 수 있다(예를 들면, 융합 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 작제 동안 제한 효소 부위의 사용으로 생긴 아미노산 잔기).
"질환"은 대상체가 항상성을 유지시킬 수 없고, 질환이 개선되지 않으면 대상체의 건강이 계속해서 악화하는 대상체의 건강 상태이다. 이에 반해, 대상체에서의 "장애" 또는 "원치 않는 병태"는 대상체가 항상성을 유지시킬 수 있지만, 대상체의 건강 상태가 장애 또는 원치 않는 병태의 부재 하에서보다 덜 유리한 건강 상태이다. 장애 또는 원치 않는 병태는 치료되지 않으면 대상체의 건강 상태의 추가의 감소를 반드시 생성하지는 않는다.
"핵산 분자" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 cDNA, 게놈 DNA 및 합성 DNA를 포함하는 RNA 또는 DNA의 형태일 수 있다. 핵산 분자는 자연 발생 뉴클레오타이드(예컨대, 데옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드), 자연 발생 뉴클레오타이드의 유사체(예를 들면, 자연 발생 뉴클레오타이드의 α-거울상이성질체 형태) 또는 둘 다의 조합으로 이루어질 수 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 당 모이어티 또는 피리미딘 또는 푸린 염기 모이어티의 변형 또는 대체를 가질 수 있다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트 및 기타를 포함한다. 핵산 분자는 이중 가닥 또는 단일 가닥일 수 있고, 단일 가닥이면 코딩 가닥 또는 비코딩(안티센스 가닥)일 수 있다. 코딩 분자는 당해 분야에 알려진 코딩 서열과 동일한 암호화 서열을 가질 수 있거나, 유전 코드의 중복 또는 축퇴성의 결과로서 또는 스플라이싱에 의해 동일한 폴리펩타이드를 암호화할 수 있는 상이한 코딩 서열을 가질 수 있다.
"암호화"는 뉴클레오타이드(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA)의 한정된 서열 또는 아미노산의 한정된 서열을 갖는 생물학적 과정에서 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 작용하는 특정 폴리뉴클레오타이드 서열, 예컨대 DNA, cDNA 및 mRNA 서열의 고유한 특성 및 이로부터 생긴 생물학적 특성을 지칭한다. 따라서, 폴리뉴클레오타이드는 그 폴리뉴클레오타이드에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산하면 단백질을 암호화한다. 코딩 가닥 및 비코딩 가닥 둘 다는 단백질 또는 폴리뉴클레오타이드의 다른 산물을 암호화하는 것으로 지칭될 수 있다. 달리 기술되지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로의 축퇴성 버전이고 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, "내인성" 또는 "자연적"의 용어는 유전자, 단백질, 화합물, 분자 또는 활성의 자연 발생 변이체를 포함하는 숙주 또는 숙주 세포에 보통 존재하는 유전자, 단백질, 화합물, 분자 또는 활성을 지칭한다.
본원에 사용된 것과 같이, "동종성" 또는 "동족체"는 예를 들면 동일한 숙주 세포, 상이한 숙주 세포, 상이한 유기체, 상이한 균주, 상이한 종으로부터 제2 유전자 또는 활성과 혈통에 의해 관련된 숙주 세포로부터의 분자 또는 활성을 지칭한다. 예를 들면, 이종성 분자 또는 그 분자를 암호화하는 이종성 유전자는 각각 분자를 암호화하는 자연적 숙주 세포 분자 또는 유전자에 동종성일 수 있고, 선택적으로 변경된 구조, 서열, 발현 수준 또는 이들의 임의의 조합을 가질 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, "이종성" 핵산 분자, 작제물 또는 서열은 숙주 세포에 자연적이 아니지만, 숙주 세포로부터의 핵산 분자 또는 핵산 분자의 부분에 동종성일 수 있는 핵산 분자 또는 핵산 분자의 부분을 지칭한다. 이종성 핵산 분자, 작제물 또는 서열의 원천은 상이한 속 또는 종 유래일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이종성 핵산 분자는 자연 발생이 아니다. 소정의 실시형태에서, 이종성 핵산 분자는 예를 들면 접합, 형질변환, 형질주입, 형질도입, 전기천공 또는 기타에 의해 숙주 세포 또는 숙주 게놈으로 첨가되고(즉, 내인성 또는 자연적이 아님), 첨가된 분자는 숙주 세포 게놈으로 통합되거나 염색체외 유전 재료로서(예를 들면, 플라스미드 또는 자가 복제 벡터의 다른 형태로서) 존재할 수 있고, 다수의 카피로 존재할 수 있다. 게다가, "이종성"은 숙주 세포가 동종성 단백질 또는 활성을 암호화하더라도 숙주 세포로 도입된 비내인성 핵산 분자에 의해 암호화된 비자연적 효소, 단백질 또는 다른 활성을 지칭한다.
본원에 사용된 것과 같이, "조작된", "재조합", "돌연변이체", "변형된" 또는 "비자연적"의 용어는 이종성 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 유기체, 미생물, 세포, 핵산 분자 또는 벡터를 지칭하거나, 인간 중재에 의해 유전적으로 조작된, 즉 이종성 핵산 분자의 도입에 의해 변형된 세포 또는 미생물을 지칭하거나, 내인성 핵산 분자 또는 유전자의 발현이 제어되거나 하향조절되거나 구성적이도록 변경된 세포 또는 미생물을 지칭하고, 이러한 변경 또는 변형은 유전 조작에 의해 도입될 수 있다. 인간 생성된 유전 변경은 예를 들면 하나 이상의 단백질, 키메라 수용체 또는 효소를 암호화하는 핵산 분자(발현 제어 요소, 예컨대 프로모터를 포함할 수 있음)를 도입하는 변형, 또는 다른 핵산 분자 첨가, 결실, 치환, 또는 세포의 유전 물질의 다른 기능적 파괴 또는 이것에 대한 첨가를 포함할 수 있다. 예시적인 변형은 코딩 영역 또는 이의 기능적 단편에서 기준 또는 모 분자로부터의 이종성 또는 동종성 폴리펩타이드를 포함한다. 추가의 예시적인 변형은 예를 들면 변형이 유전자 또는 오페론의 발현을 변경하는 비암호화 조절 영역에서의 변형을 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, "전이유전자"의 용어는 숙주 세포에서 발현이 원해지고 유전 조작 기법에 의해 세포로 운반된 관심 있는 단백질(예를 들면, CAR)을 암호화하는 유전자 또는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 전이유전자는 치료학적 관심 있는 단백질뿐만 아니라 리포터, 태그, 마커, 자살 단백질 등인 단백질을 암호화할 수 있다. 전이유전자는 천연 원천, 천연 유전자의 변형, 또는 재조합 또는 합성 분자 유래일 수 있다. 소정의 실시형태에서, 전이유전자는 벡터의 성분이다.
항원의 "과발현된" 또는 "과발현"의 용어는 세포에서의 항원 발현의 비정상적으로 높은 수준을 지칭한다. 과발현된 항원 또는 항원의 과발현은 예컨대 혈액학적 악성상태 및 대상체의 특정 조직 또는 장기 내에 고형 종양을 형성하는 세포에서 질환 상태와 대개 연관된다. 종양 항원의 과발현을 특징으로 하는 고형 종양 또는 혈액학적 악성상태는 당해 분야에 알려진 표준 검정에 의해 결정될 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이, "펩타이드," "폴리펩타이드," 및 "단백질"의 용어는 상호교환 가능하게 사용되고, 펩타이드 결합에 의해 공유 연결된 아미노산 잔기로 이루어진 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유해야 하고, 단백질 또는 펩타이드의 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 제한이 없다. 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질을 포함한다. 본원에 사용된 것과 같이, 상기 용어는 예를 들면 흔히 당해 분야에서 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머로도 지칭되는 짧은 사슬 및 일반적으로 당해 분야에서 많은 유형이 있는 단백질로 지칭되는 더 긴 사슬 둘 다를 지칭한다. "폴리펩타이드"는 다른 것들 중에서 예를 들면 생물학적 활성 단편, 실질적으로 동종성인 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이합체, 이종이합체, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 자연 펩타이드, 재조합 펩타이드, 합성 펩타이드 또는 이들의 조합을 포함한다.
본원에 사용된 것과 같이, "성숙 폴리펩타이드" 또는 "성숙 단백질"의 용어는 세포막에서 또는 소정의 세포 소기관(예를 들면, 소포체, 골지 또는 엔도솜)에서 분비되거나 국재화된 단백질 또는 폴리펩타이드를 지칭하고, 부분적으로 절단된 N-말단 신호 서열(예를 들면, 남은 신호 서열의 하나 이상의 아미노산이지만, 전체 신호 서열보다 적음)을 포함하거나, N-말단 신호 서열(즉, 단백질 또는 폴리펩타이드로부터 예컨대 내인성 절단 과정에 의해 전부 제거된 N-말단 신호 서열)을 포함하지 않는다.
"신호 펩타이드", "리더 서열", "리더 펩타이드", "국재화 신호" 또는 "국재화 서열"로도 지칭되는 "신호 서열"은 혈장 막 또는 분비 경로에 예정된 새로 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 짧은 펩타이드(보통 13개 내지 36개의 아미노산 길이)이다. 신호 서열은 통상적으로 N-말단에서의 친수성, 양으로 하전된 아미노산, 5개 내지 15개의 잔기의 중앙 소수성 도메인 및 신호 서열에 대한 절단 부위를 갖는 C-말단 영역의 짧은 스트레치를 포함한다. 진핵세포에서, 신호 서열은 소포체로의 새로 합성된 단백질의 전위를 촉진하고, 여기서 이것은 신호 펩티다제에 의해 절단되어서, 성숙 단백질을 생성하고, 이것은 이후 이의 적절한 목적지로 진행한다. 신호 서열 길이 및 아미노산 조성의 다양성은 절단 부위를 정확하게 예측하는 것이 어렵게 한다. 신호 서열이 기재된 본원에서의 폴리펩타이드 서열 공개에 대해, 신호 서열이 없거나 부분 신호 서열을 갖는 폴리펩타이드 서열이 또한 고려된다.
2개 이상의 핵산 또는 아미노산 서열 사이의 "퍼센트 동일성"은, 2개 이상의 서열의 정렬을 최적화하기 위해 도입될 필요가 있는 갭의 수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열이 공유하는 동일한 위치의 수의 함수(즉, % 동일성 = 동일한 위치의 수/위치의 총 수 x 100)이다. 2개 이상의 서열 사이의 서열의 비교 및 퍼센트 동일성의 결정은 이의 디폴트 매개변수에서 수학적 알고리즘, 예컨대 BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하여 달성될 수 있다(예를 들면, Altschul 등, J. Mol. Biol. 215:403, 1990; 또한 www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST에서 BLASTN 참조).
"보존적 치환"은 유사한 특성을 갖는 또 다른 아미노산에 대한 하나의 아미노산의 치환으로서 당해 분야에서 인식된다. 예시적인 보존적 치환은 당해 분야에 잘 알려져 있다(예를 들면, WO 97/09433호, 10 페이지, 1997년 3월 13일 공개; Lehninger, Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY:NY (1975), pp.71-77; Lewin, Genes IV, Oxford University Press, NY 및 Cell Press, Cambridge, MA (1990), p. 8 참조).
"키메라"의 용어는 내인성이 아니고 자연에서 자연적으로 함께 결합되거나 연결된 것으로 발견되지 않는 결합되거나 연결된 서열의 조합을 포함하는 임의의 핵산 분자 또는 단백질을 지칭한다. 예를 들면, 키메라 핵산 분자는 다수의 상이한 유전자로부터의 다양한 도메인을 암호화하는 핵산을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 키메라 핵산 분자는 상이한 원천으로부터 유래된 조절 서열 및 코딩 서열, 또는 동일한 원천으로부터 유래되지만 자연에서 발견된 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 것과 같이 "프로모터"의 용어는 폴리뉴클레오타이드 서열의 특정 전사를 개시하는 데 필요한 세포의 합성 기계 또는 도입된 합성 기계에 의해 인식된 DNA 서열로서 정의된다.
본원에 사용된 것과 같이 "프로모터/조절 서열"의 용어는 프로모터/조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자 산물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 경우에, 이 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있고, 다른 경우에, 이 서열은 인핸서 서열 및 유전자 산물의 발현에 필요한 다른 조절 요소를 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들면 조직 특이적 방식으로 유전자 산물을 발현하는 것일 수 있다.
"구성적" 프로모터는 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결될때 유전자 산물을 암호화하거나 특정화하거나, 유전자 산물이 세포의 대부분의 또는 모든 생리학적 조건 하에 세포에서 생산되게 하는 뉴클레오타이드 서열이다.
"유도성" 프로모터는 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결될때 유전자 산물을 암호화하거나 특정화하거나, 유전자 산물이 실질적으로 오직 프로모터에 상응하는 인듀서가 세포에 존재할 때 세포에서 생산되게 하는 뉴클레오타이드 서열이다.
"조직 특이적" 프로모터는 폴리뉴클레오타이드와 작동 가능하게 연결될 때 유전자를 암호화하거나 이것에 의해 특정화되거나, 유전자 산물이 실질적으로 오직 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포이면 세포에서 생산되게 하는 뉴클레오타이드 서열이다.
본원에 사용된 것과 같이 "전사 제어 하에" 또는 "작동 가능하게 연결된"의 구절은 프로모터가 RNA 중합효소에 의한 전사 및 폴리뉴클레오타이드의 발현의 개시를 제어하기 위해 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 정확한 위치 및 배향에 있다는 것을 의미한다.
"벡터"는 또 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자이다. 벡터는 예를 들면 플라스미드, 코스미드, 바이러스 또는 파지일 수 있다. 상기 용어는 또한 세포로의 핵산의 운반을 수월하게 하는 비플라스미드 및 비바이러스 화합물을 의미하도록 해석되어야 한다. "발현 벡터"는 이것이 적절한 환경에 존재할 때 벡터가 보유하는 하나 이상의 전이유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현을 지시할 수 있는 벡터이다. 본원에 기재된 것과 같은 벡터에 의해 발현되는 하나 이상의 전이유전자는 발현 카세트에서 암호화된다.
"렌티바이러스 벡터"는 렌티바이러스로부터 유래된 벡터이고, 벡터가 보유하는 하나 이상의 유전자의 발현에 필요한 하나 이상의 렌티바이러스 패키징 단백질 및/또는 하나 이상의 렌티바이러스 단백질을 포함한다. "LVV"의 약어는 렌티바이러스 벡터(단수)뿐만 아니라 다수의 렌티바이러스 벡터(복수)를 지칭하도록 본원에서 사용된다.
"렌티바이러스"는 분열 세포 및 비분열 세포를 감염시킬 수 있는 레트로바이러스의 속을 지칭한다. 렌티바이러스의 예는 HIV 1형 및 HIV 2형을 포함하는 HIV(인간 면역결핍 바이러스), 말 감염성 빈혈 바이러스, 고양이과 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역결핍 바이러스(BIV) 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"레트로바이러스"는 단일 가닥 양성 센스 RNA 분자를 갖는 RNA 바이러스를 지칭한다. 레트로바이러스는 역전사효소 효소 및 인터그라제 효소를 포함한다. 표적 세포로 진입 시, 레트로바이러스는 이의 RNA 분자를 DNA 분자로 전사시키기 위해 이의 역전사효소를 이용한다. 후속하여, 인터그라제 효소는 DNA 분자를 숙주 세포 게놈으로 통합시키도록 사용된다. 숙주 세포 게놈으로 통합 시, 레트로바이러스로부터의 서열은 프로바이러스(예를 들면, 프로바이러스 서열 또는 프로빔스 서열)로 지칭된다.
본원에 사용된 것과 같이 "발현 카세트"의 용어는 숙주 세포에서 적어도 하나의 전이유전자 및 이의 발현을 제어하는 조절 서열(예를 들면, 프로모터, 3'UTR)을 포함하는 벡터 핵산의 별개의 성분을 지칭한다. 텐덤 발현 카세트는 적어도 2개의 전이유전자의 텐덤 발현을 위해 조절 서열의 동일한 세트의 제어 하에 적어도 2개의 전이유전자를 포함하는 벡터 핵산의 성분을 지칭한다. 소정의 실시형태에서, 텐덤 발현 카세트는 동일한 프로모터의 제어 하에 적어도 2개의 전이유전자를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 제1 전이유전자 및 제2 전이유전자는 단일 mRNA로부터 2개의 단백질의 공동발현을 허용하도록 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 푸린 절단 부위 또는 자가 절단 바이러스 2A 펩타이드에 의해 분리된다.
"면역계 세포" 또는 "면역 세포"의 용어는 골수에서 조혈 줄기 세포로부터 기원하는 면역계의 임의의 세포를 의미한다. 조혈 줄기 세포는 골수성 조상 세포(골수성 세포, 예컨대 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 거핵구 및 과립구를 생성시킴) 및 림프성 조상 세포(림프성 세포, 예컨대 T 세포, B 세포 및 자연 살해(NK) 세포를 생성시킴)인 2개의 주요 계통을 생성시킨다. 예시적인 면역계 세포는 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, CD4- CD8- 이중 음성 T 세포, γδ T 세포, 조절 T 세포, 자연 살해 세포 및 수지상 세포를 포함한다. 대식세포 및 수지상 세포는 펩타이드와 복합체된 APC의 표면에서 주요 조직적합성 복합체(MHC) 수용체가 T 세포의 표면에서 TCR과 상호작용할 때 T 세포를 활성화할 수 있는 특수 세포인 "항원 제시 세포" 또는 "APC"로도 지칭될 수 있다.
"림프구"의 용어는 적혈구 또는 골수성 계통의 세포로부터 세포를 구별하는 림프구 또는 이의 전구체 또는 조상의 적어도 하나의 표현형 특징을 보여주는 세포인 림프성 기원의 면역 세포를 지칭한다. "림프구"의 용어는 T 세포, B 세포 및 자연 살해(NK) 세포를 포함한다.
"T 세포"의 용어는 T 세포 계통의 세포를 지칭한다. "T 세포 계통의 세포"는 다른 림프성 세포로부터의 세포 및 적혈구 또는 골수성 계통의 세포를 구별하는 T 세포 또는 이의 전구체 또는 조상의 적어도 하나의 표현형 특징을 보여주는 세포를 지칭한다. 이러한 표현형 특징은 T 세포(예를 들면, CD3+, CD4+, CD8+)에 특이적인 하나 이상의 단백질의 발현 또는 T 세포에 특이적인 생리학적, 형태학적, 기능적 또는 면역학적 특징을 포함할 수 있다. 예를 들면, T 세포 계통의 세포는 T 세포 계통에 전용인 조상 또는 전구 세포; CD25+ 미숙 및 불활성화 T 세포; CD4 또는 CD8 계통 책무를 겪는 세포; CD4+CD8+ 이중 양성인 흉선세포 조상 세포; 단일 양성 CD4+ 또는 CD8+; TCRαβ 또는 TCR γδ; 또는 성숙 및 기능적 또는 활성화 T 세포일 수 있다. "T 세포"의 용어는 미경험 T 세포(CD45RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD45RO-), 중앙 기억 T 세포(CD45RA-, CD45RO+, CD62L+, CCR7+, CD27+), 효과기 기억 T 세포(CD45RA-, CD45RO+, CCR7-, CD62L-, CD27-), 점액 연관 불변체 T(MAIT) 세포, γδ T 세포, Treg, 자연 살해 T 세포 및 조직 거주 T 세포를 포함한다.
"자연 살해 세포" 또는 "NK 세포"의 용어는 대형 과립 림프구(LGL)를 지칭하고, 공통 림프성 조상 생성 B 및 T 림프구로부터 분화된 세포의 제3 종류를 구성한다. NK 세포는 골수, 림프절, 비장, 편도 및 흉선에서 분화하고 성숙하는 것으로 알려져 있고, 여기서 이것은 이후 순환으로 들어간다. NK 세포는 표현형으로, 기원에 의해 그리고 각각의 효과기 기능에 의해 자연 살해 T 세포(NKT)와 다르고; 대개, NKT 세포 활성은 IFNγ를 분비하여 NK 세포 활성을 촉진한다. NKT 세포와 반대로, NK 세포는 T-세포 항원 수용체(TCR) 또는 pan T 마커 CD3 또는 표면 면역글로불린(Ig) B 세포 수용체를 발현하지 않지만, 이것은 보통 인간에서 표면 마커 CD16(FcγRIII) 및 CD56, C57BL/6 마우스에서 NK1.1 또는 NK1.2를 발현한다. 인간 NK 세포의 80% 이하는 또한 CD8을 발현한다.
"B 세포"의 용어는 B 세포 계통의 세포를 지칭한다. "B 세포 계통의 세포"는 다른 림프성 세포로부터의 세포 및 적혈구 또는 골수성 계통의 세포를 구별하는 B 세포 또는 이의 전구체 또는 조상의 적어도 하나의 표현형 특징을 보여주는 세포를 지칭한다. 이러한 표현형 특징은 B 세포(예를 들면, CD19+, CD72+, CD24+, CD20+, CD21+, CD22+, CD38+, CD40+, CD72+, CD32b+, CD268+, CD269+, CD267+, CD86+, CD80+, CD40+, CD52+, CD138+, CD27+, CD28+, CD21+, CD23+, CD84+, CD257+, CD270+, CD37+ 및 CD74+ 중 하나 이상에 양성인 세포)에 특이적인 하나 이상의 단백질의 발현 또는 B 세포에 특이적인 생리학적, 형태학적, 기능적 또는 면역학적 특징을 포함할 수 있다. 예를 들면, B 세포 계통의 세포는 B 세포 계통에 전용인 조상 또는 전구 세포(예를 들면, 프리-프로-B 세포, 프로-B 세포 및 프리-B 세포); 미숙 및 불활성화 B 세포 또는 성숙 및 기능적 또는 활성화 B 세포일 수 있다. 따라서, "B 세포"는 미경험 B 세포, 혈장 세포, 조절 B 세포, 변연계 B 세포, 소포성 B 세포, 림프형질구성 세포, 형질모 세포 및 기억 B 세포(예를 들면, CD27+, IgD-)를 포함한다.
표면에서 면역 수용체(예를 들면, CAR)를 발현하는 세포(예를 들면, T 세포)와 관련하여 "세포용해 활성"이라고도 칭하는 "세포독성 활성"의 용어는 (예를 들면, CAR을 통한) 항원 특이적 신호전달 시 세포가 표적 세포가 아폽토시스를 겪게 유도한다는 것을 의미한다. 일부 실시형태에서, 세포독성 세포는 과립으로부터 세포독소, 예컨대 페르포린, 그랜자임 및 그래눌리신의 방출을 통해 표적 세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있다. 페르포린은 표적 세포막으로 삽입하고, 물 및 염이 표적 세포로 신속하게 들어가게 하는 기공을 형성한다. 그랜자임은 표적 세포에서 아폽토시스를 유도하는 세린 프로테아제이다. 그래눌리신은 또한 표적 세포막에서 기공을 형성할 수 있고, 전염증성 분자이다. 일부 실시형태에서, 세포독성 세포는 항원 특이적 신호전달 후에 T 세포에서 상향조절된 Fas 리간드의 상호작용을 통해 표적 세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있고, Fas 분자는 표적 세포에서 발현된다. Fas는 다수의 상이한 세포의 표면에서의 아폽토시스-신호전달 수용체 분자이다.
"질환"은 대상체가 항상성을 유지시킬 수 없고, 질환이 개선되지 않으면 대상체의 건강이 계속해서 악화하는 대상체의 건강 상태이다. 이에 반해, 대상체에서의 "장애" 또는 "원치 않는 병태"는 대상체가 항상성을 유지시킬 수 있지만, 대상체의 건강 상태가 장애 또는 원치 않는 병태의 부재 하에서보다 덜 유리한 건강 상태이다. 장애 또는 원치 않는 병태는 치료되지 않으면 대상체의 건강 상태의 추가의 감소를 반드시 생성하지는 않는다.
본원에 사용된 것과 같이 "암"의 용어는 비정상 세포의 신속하고 제어되지 않는 성장을 특징으로 하는 질환으로서 정의된다. 비정상 세포는 고형 종양을 형성하거나 조혈 악성상태를 구성할 수 있다. 암 세포는 국소로 또는 혈류 및 림프 시스템을 통해 다른 신체 부분으로 확산할 수 있다. 다양한 암의 예는 유방암, 전립선암, 난소암, 자궁경부암, 피부암, 췌장암, 결장직장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프종, 백혈병 및 기타를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"대상체", "환자" 및 "개체"의 용어는 본원에서 상호교환 가능하게 사용되고, 면역 반응을 이끌어낼 수 있는 살아 있는 유기체(예를 들면, 포유류)를 포함하도록 의도된다. 대상체의 예는 인간, 영장류, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 돼지 및 이들의 형질전환 종을 포함한다.
"입양 세포 면역요법" 또는 "입양 면역요법"은 자연 발생 또는 유전 조작된, 질환 항원 특이적 면역 세포(예를 들면, T 세포)의 투여를 지칭한다. 입양 세포 면역요법은 자가(면역 세포는 수혜자 유래임), 동종이계(면역 세포는 동일한 종의 공여자 유래임) 또는 동계(면역 세포는 수혜자와 유전적으로 동일한 공여자 유래임)일 수 있다.
"자가"는 이것이 나중에 재도입되는 동일한 대상체로부터 유래된 이식편(예를 들면, 장기, 조직, 세포)을 지칭한다.
"동종이계"는 동일한 종의 상이한 대상체로부터 유래된 이식편을 지칭한다.
본원에 기재된 것과 같은 렌티바이러스 벡터 또는 렌티바이러스 벡터에 의해 형질도입된 세포(예를 들면, 렌티바이러스 벡터의 전이유전자에 의해 암호화된 것과 같은 CAR을 발현하는 T 세포)의 "치료학적 유효량" 또는 "유효량"은 치료되는 질환, 장애 또는 원치 않는 병태의 하나 이상의 증상의 개선을 생성시키기에 충분한 렌티바이러스 입자 또는 세포의 양을 지칭한다.
"치료한다" 또는 "치료" 또는 "개선한다"는 대상체의 질환, 장애 또는 원치 않는 병태의 의학적 관리를 지칭한다. 일반적으로, 본 개시내용의 CAR을 발현하는 렌티바이러스 벡터 또는 세포를 포함하는 적절한 용량 또는 치료 요법은 치료학적 이익 또는 예방학적 이익을 이끌어내기에 충분한 양으로 투여된다. 치료학적 이익 또는 예방학적/예방적 이익은 개선된 임상 결과; 질환, 장애 또는 원치 않는 병태와 연관된 증상의 줄어듬 또는 완화; 감소된 증상 발생; 개선된 삶의 질; 더 긴 질환무 상태; 질환, 장애 또는 원치 않는 병태의 정도의 감소; 질환 상태의 안정화; 질환 진행의 지연; 관해; 생존; 연장된 생존; 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
"항종양 효과"의 용어는 종양 부피의 감소, 종양 세포의 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가 또는 암성 병태와 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선에 의해 입증될 수 있는 생물학적 효과를 지칭한다. "항종양 효과"는 또한 조혈 악성상태 또는 종양 형성의 예방에 의해 입증될 수 있다.
추가 정의는 본 개시내용에 걸쳐 제공된다.
렌티바이러스 벡터
렌티바이러스는 통상적으로 숙주 게놈으로 통합하는 이의 능력으로 인해 서서히 발생하는 질환을 생성시키는 레트로바이러스의 속이다. 변형된 렌티바이러스 게놈은 숙주 세포로의 핵산의 전달을 위한 바이러스 벡터로서 유용하다.
본 개시내용은 돌연변이된 이종성 외피 단백질 및 향성 한정 분자를 포함하는 바이러스 외피("표적화 단백질"로도 지칭됨)를 포함하는 자가 불활성화 렌티바이러스 벡터("LVV")를 제공한다. 본원에 기재된 LVV는 전이유전자를 추가로 포함하고, LVV는 표적 면역 세포에 특이적으로 결합하고 전이유전자가 면역 세포에 의해 발현되도록 표적 면역 세포를 형질도입할 수 있다. 일부 실시형태에서, LVV는 하나 초과의 전이유전자를 운반할 수 있다. 추가의 특정 실시형태에서, 전이유전자는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화한다.
돌연변이된 바이러스 외피 단백질
본원에 기재된 것과 같은 렌티바이러스 벡터는 돌연변이의 부재 하에 세포 부착 및 막 융합 둘 다를 매개하는 돌연변이된 이종성 바이러스 외피 단백질에 의해 위형화된다. 특정한 실시형태에서, 돌연변이된 외피 단백질은 외피 단백질의 융합성 특성을 보존하면서 이의 자연적 표적에 결합하는 외피 단백질의 능력을 억제하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이종성 외피 단백질은 VSV-G 단백질의 융합성 기능을 보존하면서 저밀도 지단백질 수용체("LDL-R")에 대한 VSV-G의 결합을 억제하는 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 수포성 구내염 바이러스 G 단백질("VSV-G", "VSV-G 외피 단백질" 또는 "VSV-G 단백질")이다.
자연적 표적에 결합하는 외피 단백질의 능력을 언급할 때, "억제한다" 및 "억제하는"의 용어는 자연적 표적에 대한 외피 단백질에 의한 결합의 완전한 제거뿐만 아니라 자연적 표적에 대한 외피 단백질에 의한 결합의 유의한 감소 둘 다를 포함한다. 특정한 실시형태에서, "유의한 감소"는 자연적 표적에 대한 결합의 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 적어도 50%, 적어도 45%, 적어도 40%, 적어도 35%, 적어도 30%, 적어도 25%, 적어도 20%, 적어도 15% 및 적어도 10%의 감소로부터 선택된 감소를 지칭한다.
표 10에 기재된 핵산 및 아미노산 서열은 야생형 VSV-G 외피 단백질에 대한 기준 서열 및 본 개시내용에 따른 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질의 예를 제공한다. 서열 번호 77은 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 기준 핵산 서열이고, 서열 번호 78은 기준 VSV-G 외피 단백질의 아미노산 서열이다. 서열 번호 87은 기준 VSV-G 외피 단백질의 절단 가능한 신호 펩타이드를 암호화하는 핵산 서열이다. 서열 번호 88은 기준 VSV-G 외피 단백질의 절단 가능한 신호 펩타이드의 아미노산 서열이다. 서열 번호 89는 신호 서열이 없는 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 기준 핵산 서열이다. 서열 번호 90은 서열이 없는 기준 VSV-G 외피 단백질의 아미노산 서열이다. 본원에 개시된 VSV-G 돌연변이의 위치 및 성질은 각각 서열 번호 87의 N-말단 신호 서열이 없는 서열 번호 77 및 서열 번호 88의 N-말단 신호 서열이 없는 서열 번호 78에 의해 제공된 핵산 서열 및 아미노산 서열을 참조하여 기재되어 있다. 따라서, 돌연변이 위치를 확인하는 목적을 위한 VSV-G env 아미노산 서열의 1번 위치의 언급은 리신(K)인 서열 번호 78의 야생형 VSV-G 아미노산 서열의 17번 위치 또는 서열 번호 90의 야생형 VSV-G 아미노산 서열의 1번 위치를 지칭한다.
일부 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 아미노산 위치 H8, N9, Q10, K47, K50, A51, S183, S179, N180, I182, M184, Y209, I347, T350, T352, E353, R354에서의 돌연변이, N9와 Q10 사이의 TT의 삽입, H8과 N9 사이의 GGS의 삽입, N9와 Q10 사이의 GGS의 삽입, N208과 Y209 사이의 TT의 삽입, P46과 K47 사이의 GGS의 삽입, N208과 Y209 사이의 GGS의 삽입, 및/또는 잔기 1-8의 결실을 포함한다. 소정의 실시형태에서, VSV-G 외피 단백질은 H8, N9, Q10, K47, K50, A51, S183, S179, N180, I182, M184, Y209, I347, T350, T352, E353, R354로부터 선택된 아미노산 위치에서의 2개 이상의 돌연변이, N9와 Q10 사이의 TT의 삽입, H8과 N9 사이의 GGS의 삽입, N9와 Q10 사이의 GGS의 삽입, N208과 Y209 사이의 TT의 삽입, P46과 K47 사이의 GGS의 삽입, N208과 Y209 사이의 GGS의 삽입, 및 잔기 1-8의 결실을 포함한다. 다른 실시형태에서, VSV-G 외피 단백질은 H8, N9, Q10, K47, K50, A51, S183, S179, N180, I182, M184, Y209, I347, T350, T352, E353, R354로부터 선택된 아미노산 위치에서의 3개 이상의 돌연변이, N9와 Q10 사이의 TT의 삽입, H8과 N9 사이의 GGS의 삽입, N9와 Q10 사이의 GGS의 삽입, N208과 Y209 사이의 TT의 삽입, P46과 K47 사이의 GGS의 삽입, N208과 Y209 사이의 GGS의 삽입, 및 잔기 1-8의 결실을 포함한다. 다른 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 H8A, K47A, K47Q, Y209A, R354A, 및/또는 R354Q 돌연변이를 포함한다. 더욱 다른 실시형태에서, VSV-G 외피 단백질은 N9, Q10, K50, A51, S183, S179, N180, I182, M184, I347, T350, T352 및 E353으로부터 선택된 하나 이상의 돌연변이, N9와 Q10 사이의 TT의 삽입, H8과 N9 사이의 GGS의 삽입, N9와 Q10 사이의 GGS의 삽입, N208과 Y209 사이의 TT의 삽입, P46과 K47 사이의 GGS의 삽입, N208과 Y209 사이의 GGS의 삽입, 및 잔기 1-8의 결실을 포함한다. 더욱 다른 실시형태에서, VSV-G 외피 단백질은 N9, Q10, K50, A51, S183, S179, N180, I182, M184, I347, T350, T352 및 E353 중 하나 이상에서의 돌연변이로부터 선택된 2개 이상의 돌연변이, N9와 Q10 사이의 TT의 삽입, H8과 N9 사이의 GGS의 삽입, N9와 Q10 사이의 GGS의 삽입, N208과 Y209 사이의 TT의 삽입, P46과 K47 사이의 GGS의 삽입, N208과 Y209 사이의 GGS의 삽입, 및 잔기 1-8의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 H8A, N9A, Q10A, K47A, K47Q, N180A, I182A, Y209A, T352A, T352W, E353A, R354A 및 R354Q 돌연변이 중 1개 이상으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 H8A, K47A, K47Q, Y209A, R354A 및 R354Q 돌연변이 중 1개 이상으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 K47 돌연변이 및 R354 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 K47Q 돌연변이 및 R354A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 N180 돌연변이, I182 돌연변이, T352 돌연변이 및 E353 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 N180A 돌연변이, I182A 돌연변이, T352A 돌연변이 및 E353A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 T352 돌연변이 및 E353 돌연변이를 포함한다. 추가의 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 T352W 돌연변이 및 E353A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 N9 돌연변이, Q10 돌연변이 및 N180 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 N9A 돌연변이, Q10A 돌연변이 및 N180A 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 H8과 N9 사이의 GGS의 삽입 및 N9와 Q10 사이의 GGS의 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 N9와 Q10 사이의 TT의 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 P46과 K47 사이의 GGS의 삽입을 포함한다. 다른 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 관련 개시내용이 본원에 참고로 포함된 Nikolic 등, "Structural basis for the recognition of LDL-receptor family members by VSV glycoprotein." Nature Comm., 2018, 9:1029에 기재된 것과 같다.
특정 실시형태에서, 돌연변이체 VSV 외피 단백질은 K47Q 돌연변이 및 R354A 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 돌연변이체 VSV-G 외피 단백질은 서열 번호 74에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 돌연변이체 VSV 외피 단백질은 N180A 돌연변이, I182A 돌연변이, T352A 돌연변이 및 E353A 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 돌연변이체 VSV-G 외피 단백질은 서열 번호 93에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 돌연변이체 VSV 외피 단백질은 T352W 돌연변이 및 E353A 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 돌연변이체 VSV-G 외피 단백질은 서열 번호 95에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 돌연변이체 VSV 외피 단백질은 N9A 돌연변이, Q10A 돌연변이 및 N180A 돌연변이를 포함한다. 특정 실시형태에서, 돌연변이체 VSV-G 외피 단백질은 서열 번호 97에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 돌연변이체 VSV 외피 단백질은 N9와 Q10 돌연변이 사이의 TT의 삽입을 포함한다. 특정 실시형태에서, 돌연변이체 VSV-G 외피 단백질은 서열 번호 99에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 돌연변이체 VSV 외피 단백질은 P46과 K47 돌연변이 사이의 GGS의 삽입을 포함한다. 특정 실시형태에서, 돌연변이체 VSV-G 외피 단백질은 서열 번호 101에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
특정 실시형태에서, 돌연변이체 VSV 외피 단백질은 H8과 N9 사이의 GGS의 삽입 및 N9와 Q10 사이의 GGS의 삽입을 포함한다. 특정 실시형태에서, 돌연변이체 VSV-G 외피 단백질은 서열 번호 103에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
표적화 단백질
표적화 단백질은 바이러스 외피에서 디스플레이된 막 결합 단백질이고, 림프구 표적화 도메인을 포함하는 세포외 도메인 및 막관통 도메인을 포함한다. 림프구 표적화 도메인은 아미노산 서열을 갖고 표적 림프구 세포 표면에서 표적 분자 또는 리간드(예를 들면, 동족 단백질 또는 리간드)에 대한 결합 파트너인 임의의 단백질 또는 펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 림프구 표적화 도메인은 T 세포 표적화 도메인이다. 일부 실시형태에서, 림프구 표적화 도메인은 NK 세포 표적화 도메인이다. 일부 실시형태에서, 림프구 표적화 도메인은 B 세포 표적화 도메인이다. 예를 들면, 소정의 실시형태에서, 표적화 단백질의 세포외 도메인은 한정된 세포 집단, 예컨대 세포 표면에서의 표적화된 단백질 또는 리간드의 존재를 특징으로 하는 림프구의 집단의 표면에서 단백질 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 림프구 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 림프구 표적화 도메인은 예를 들면 T 세포, B 세포 또는 자연 살해(NK) 세포와 같은 림프구의 특정 유형을 표적화한다. 일부 실시형태에서, 표적화 단백질은 막관통 도메인과 세포외 도메인 사이에 위치한 세포외 링커 또는 힌지 도메인을 추가적으로 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적화 단백질은 전장 세포 표면 단백질 또는 수용체이고, 각각의 성분(예를 들면, 세포외 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 도메인의 각각)은 단일 단백질 또는 수용체로부터 유래된다. 다른 실시형태에서, 표적화 단백질은 상이한 단백질 또는 수용체로부터 유래된 적어도 2개의 성분을 갖는 키메라 단백질이다. 일부 실시형태에서, 인간, 영장류, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그 및 돼지를 포함하는 포유류 종으로부터 표적화 단백질을 얻는다. 일부 실시형태에서, 표적화 단백질은 완전 인간 서열이다. 일부 실시형태에서, 표적화 단백질은 인간 서열 성분(들) 및 또 다른 종으로부터의 성분(들) 또는 합성 성분(들)을 포함하는 키메라 서열이다. 일부 실시형태에서, 키메라 표적화 단백질은 완전 합성 단백질일 수 있다. 더욱 다른 실시형태에서, 키메라 표적화 단백질은 완전 합성 단백질인 세포외 도메인, 세포외 결합 도메인, 막관통 도메인, 세포내 도메인, 힌지 도메인 또는 링커 중 하나 이상을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 림프구 표적화 도메인은 항체를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 세포외 표적화 도메인은 전장 항체, 항체 단편, 나노바디 또는 단일 사슬 Fv 단편(scFv)일 수 있다.
특정한 실시형태에서, 표적화 분자는 예를 들면 T 세포 항원, T 세포 표면 수용체 또는 표적화된 T 세포의 표면에서 존재하는 임의의 다른 단백질을 포함하는 T 세포 표면 마커에 특이적으로 결합하는 T 세포 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화 단백질은 CD3, CD28, CD80, 4-1BB, AhR, CD3, CD2, CD7, CD4, CD8, CD25, CD44, CD45RA, CD47, CD62L, CD69, CD94, CD95, CD127, CD161, CD183(CXCR3), CD184(CXCR4), CD185(CXCR5), CD193(CCR3), CD194(CCR4), CD195(CCR5), CD196(CCR6), CD197(CCR7), CCR10, PD-1, TCRa/b, CD5, CD27, CD45RO, CD45RB, CD57, CD103, CD122, P2RX7, TIGIT, LAG-3, TIM-3, IL6ST 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 T 세포 마커에 특이적으로 결합한다.
추가의 실시형태에서, 표적화 단백질은 γδ TCR, V델타1, V델타2, NKG2D(KLRK1, CD314) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 γδ T 세포 마커에 특이적으로 결합한다.
다른 실시형태에서, 표적화 단백질은 불변체 TCR(Va24-Ja18), CD185(CXCR5), CXCR6, IL-21R 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 NK T 세포 마커에 특이적으로 결합한다.
다른 실시형태에서, 표적화 단백질은 Va7.2, Ja33, CXCR6, IL-18R, KLRB1(CD161), VLA4(알파4베타1 인테그린) 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 MAIT 세포 마커에 특이적으로 결합한다.
다른 실시형태에서, 표적화 단백질은 CD56, NKp46, CD16, KIR(들), NKG2 단백질(예를 들면, NKG2D(KLRK1, CD314)), KLRB1(CD161), KLRD1(cd94), IL2Rb(CD122), IL-21R, SLAMF6(CD352), SLAMF7(CD319), IL-18R 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 NK 세포 마커에 특이적으로 결합한다.
다른 실시형태에서, 표적화 단백질은 CD19, CD20, CD21, CD22, CD24, CD38, CD40, CD72, CD32b, CD268, CD269, CD267, CD86, CD80, CD52, CD138, CD27, CD28, CD23, CD84, CD257, CD270, CD37, CD74 및 CD269 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 B 세포 마커에 특이적으로 결합한다.
실시형태에서, 표적화 단백질은 CD80, CD27, CD28 및 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 림프구 마커(예를 들면, B 세포 및 T 세포)에 특이적으로 결합한다.
표적화 단백질의 일부 실시형태에서, 링커는 막관통 도메인과 림프구 표적화 도메인 사이에 위치한다. 링커는 아미노산 링커이고, 경질 링커, 가요성 링커 또는 올리고머화된 링커일 수 있다. 경질 링커는 가요성이 결여된 아미노산 서열이다(예를 들면, 적어도 하나의 프롤린을 포함할 수 있다). 일부 실시형태에서, 경질 링커는 혈소판 유래 성장 인자 수용체(PDGFR) 스톡 또는 CD8a 스톡을 포함한다. 일부 실시형태에서, PDGFR 스톡은 AVGQDTQEVIVVPHSLPFK(서열 번호 104)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, PDGFR 스톡은 ASAKPTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEAARPAAGGAVHTRGLDFAK(서열 번호 105)를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
가요성 링커는 많은 자유도를 갖는 아미노산 서열이다(예를 들면, 작은 측쇄를 갖는 복수의 아미노산, 예를 들면 글리신 또는 알라닌을 포함할 수 있다). 일부 실시형태에서, 가요성 링커는 GAPGAS를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가요성 링커는 GAPGSGGGGSGGGGSAS(서열 번호 106)로 이루어진 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가요성 링커는 GGGGS를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가요성 링커는 GGGS를 포함하는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 가요성 링커는 (GAPGAS)N, (G3S)N 또는 (G4S)N을 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 N은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 초과이다.
올리고머화된 링커는 또 다른 관련된 아미노산으로 올리고머화할 수 있는 아미노산이다. 일부 실시형태에서, 올리고머화된 링커는 이합체, 삼합체 또는 사합체를 형성할 수 있는 아미노산 서열이다. 일부 실시형태에서, 올리고머화된 링커는 IgG4 힌지 도메인(예를 들면, ESKYGPPCPPCPAVGQDTQEVIVVPHSLPFK(서열 번호 107))을 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고머화된 링커는 사합체성 꼬인 코일을 형성할 수 있는 아미노산 서열(예를 들면, ASGGGGSGELAAIKQELAAIKKELAAIKWELAAIKQGAG(서열 번호 108))을 포함한다. 일부 실시형태에서, 올리고머화된 링커는 이합체성 꼬인 코일을 형성할 수 있는 아미노산 서열(예를 들면, ASESKYGPPCPPCP(서열 번호 109))을 포함한다.
표적화 단백질은 통상적으로 신호 서열(국재화 서열의 신호 펩타이드로도 지칭됨)을 포함할 것이다. 신호 서열은 표적화 단백질의 N-말단 또는 C-말단 단부에 배치될 수 있다. 신호 서열은 표적화 단백질을 렌티바이러스 벡터의 외피로서 작용하는 막으로 전위시키도록 기능한다. 본원에 기재된 것과 같은 표적화 단백질에 포함될 수 있는 신호 서열의 비제한적인 예는 Ig 카파 리더 서열(예를 들면, METDTLLLWVLLLWVPGSTG(서열 번호 110)를 포함하는 쥣과 Ig 카파 리더 서열), CD8a 신호 펩타이드 서열(예를 들면, MALPVTALLLPLALLLHAARP(서열 번호 12)를 포함하는 CD8a 신호 펩타이드) 및 B2M 신호 펩타이드 서열(예를 들면, MSRSVALAVLALLSLSGLEA(서열 번호 123)를 포함하는 B2M 신호 펩타이드 서열)을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 성숙 표적화 단백질은 전장 신호 서열의 하나 이상의 아미노산을 보유하는 부분적으로 절단된 신호 서열을 갖는다. 다른 실시형태에서, 신호 펩티다제에 의한 절단은 신호 서열을 완전히 제거하여서, 신호 서열이 완전히 결여된 성숙 표적화 단백질을 생성시킨다.
일부 실시형태에서, 표적화 단백질은 CD80 단백질이다. 표적화 단백질이 CD80 단백질인 경우, 이것은 서열 번호 6에 따른 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, CD80 단백질은 서열 번호 4에 따른 신호 펩타이드 및 서열 번호 8에 따른 막관통 및 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 렌티바이러스 벡터에 포함된 CD80 표적화 단백질은 서열 번호 2, 또는 서열 번호 4의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 2에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적화 단백질이 CD80 단백질인 경우, 이것은 서열 번호 6과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 세포외 도메인을 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, CD80 단백질은 서열 번호 4와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 신호 펩타이드, 및/또는 서열 번호 8과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 막관통 및 세포내 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 렌티바이러스 벡터에 포함된 CD80 표적화 단백질은 서열 번호 2, 또는 서열 번호 4의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 2와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CD80 표적화 단백질을 포함하는 렌티바이러스 벡터는 표준 LVV에 의한 형질도입과 비교하여 총 CD4 및 CD8 T 세포의 상대 백분율로서 CD8 T 세포에 비해 향상된 형질도입 CD4 T 세포를 나타낸다. 본원에 사용된 것과 같이, "표준 렌티바이러스 벡터" 또는 "표준 LVV"는 본 개시내용의 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질 및 림프구 표적화 단백질을 함유하지 않는 렌티바이러스 벡터를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 표준 LVV는 3세대 LVV 패키징 시스템을 사용하여 생성된다. 일부 실시형태에서, CD80 표적화 단백질을 포함하는 렌티바이러스 벡터는 표준 LVV와 비교하여 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 초과의 총 CD4 및 CD8 T 세포의 상대 백분율로서 CD8 T 세포에 비해 CD4 T 세포의 형질도입을 향상시킨다.
일부 실시형태에서, 표적화 단백질은 항-CD3 표적화 단백질이다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 표적화 단백질은 예를 들면 scFv를 포함하는 항체 또는 이의 결합 단편이다. 표적화 단백질이 항-CD3 표적화 단백질인 경우, 이것은 서열 번호 14에 따른 경쇄 가변 영역, 서열 번호 16에 따른 G3S 링커 및 서열 번호 18에 따른 중쇄 가변 영역을 갖는 항-CD3 scFv를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 표적화 단백질은 서열 번호 115에 따른 경쇄 가변 영역, 서열 번호 16에 따른 G3S 링커 및 서열 번호 113에 따른 중쇄 가변 영역을 갖는 항-CD3 scFv를 포함할 수 있다. 기재된 것과 같은 항-CD3 표적화 단백질은 서열 번호 12에 따른 신호 펩타이드 및 서열 번호 20에 따른 힌지 및 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 렌티바이러스 벡터에 포함된 항-CD3 표적화 단백질은 서열 번호 10 또는 서열 번호 12의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 10에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 렌티바이러스 벡터에 포함된 항-CD3 표적화 단백질은 서열 번호 117 또는 서열 번호 12의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 117에 따른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적화 단백질이 항-CD3 표적화 단백질인 경우, 이것은 서열 번호 14와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 18과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 항-CD3 scFv를 포함할 수 있다. 기재된 것과 같은 항-CD3 표적화 단백질은 서열 번호 12와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 신호 펩타이드 및 서열 번호 20과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 힌지 및 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 렌티바이러스 벡터에 포함된 항-CD3 표적화 단백질은 서열 번호 10 또는 서열 번호 12의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 10과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 표적화 단백질이 항-CD3 표적화 단백질인 경우, 이것은 서열 번호 115와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 113과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 항-CD3 scFv를 포함할 수 있다. 기재된 것과 같은 항-CD3 표적화 단백질은 서열 번호 12와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 신호 펩타이드 및 서열 번호 20과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 힌지 및 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 기재된 것과 같은 렌티바이러스 벡터에 포함된 항-CD3 표적화 단백질은 서열 번호 117 또는 서열 번호 12의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 117과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
더욱 추가의 실시형태에서, 본 설명에 따른 렌티바이러스 벡터는 다수의 상이한 림프구 표적화 도메인을 갖는 다중 표적화 단백질 또는 단일 표적화 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 적어도 2개의 표적화 단백질을 포함할 수 있고, 각각의 표적화 단백질은 상이한 표적에 특이적으로 결합하는 NK 세포 표적화 도메인을 갖는다. 또 다른 예에서, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 적어도 2개의 표적화 단백질을 포함할 수 있고, 각각의 표적화 단백질은 상이한 표적에 특이적으로 결합하는 T 세포 표적화 도메인을 갖는다. 또 다른 예에서, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 적어도 2개의 표적화 단백질을 포함할 수 있고, 각각의 표적화 단백질은 상이한 표적에 특이적으로 결합하는 B 세포 표적화 도메인을 갖는다. 더 또 다른 예에서, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 적어도 2개의 표적화 단백질을 포함할 수 있고, 제1 표적화 단백질은 T 세포 표적화 도메인을 갖고 제2 표적화 단백질은 NK 세포 표적화 도메인을 갖는다. 더 또 다른 예에서, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 적어도 2개의 표적화 단백질을 포함할 수 있고, 제1 표적화 단백질은 T 세포 표적화 도메인을 갖고 제2 표적화 단백질은 B 세포 표적화 도메인을 갖는다. 더 또 다른 예에서, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 적어도 2개의 표적화 단백질을 포함할 수 있고, 제1 표적화 단백질은 B 세포 표적화 도메인을 갖고 제2 표적화 단백질은 NK 세포 표적화 도메인을 갖는다. 대안적인 실시형태에서, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 2개 이상의 상이한 림프구 표적화 도메인, 2개 이상의 상이한 T 세포 표적화 도메인, 2개 이상의 상이한 NK 세포 표적화 도메인 또는 2개 이상의 상이한 B 세포 표적화 도메인을 갖는 단일 표적화 단백질(예를 들면, 이중특이적 또는 다중특이적 표적화 단백질)을 포함한다. 임의의 이러한 실시형태에서, 표적화 단백질에 포함된 T 림프구 표적화 도메인은 임의의 본원에 기재된 것으로부터 선택될 수 있다. 더 또 다른 예에서, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 적어도 2개의 표적화 단백질을 포함할 수 있고, 제1 표적화 단백질은 림프구 표적화 도메인을 갖고 제2 표적화 단백질은 T 세포 표적화 도메인을 갖는다. 더 또 다른 예에서, 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 적어도 2개의 표적화 단백질을 포함할 수 있고, 제1 표적화 단백질은 림프구 표적화 도메인을 갖고 제2 표적화 단백질은 B 세포 표적화 도메인을 갖는다.
예시적인 실시형태에서, 다중 표적화 단백질을 갖는 렌티바이러스 벡터는 각각 표 1 및 표 2에 자세히 기재된 것과 같은 CD80 표적화 단백질 및 항-CD3 표적화 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, CD80 표적화 단백질은 서열 번호 2, 또는 서열 번호 4의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 2에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 표적화 단백질은 서열 번호 10 또는 서열 번호 12의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 10에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 표적화 단백질은 서열 번호 117 또는 서열 번호 12의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 117에 따른 아미노산 서열을 포함한다. 렌티바이러스 벡터가 CD80 표적화 단백질 및 항-CD3 표적화 단백질을 포함하는 경우, 표적화 단백질은 렌티바이러스 벡터를 생산하는 데 사용된 별개의 발현 벡터에서 암호화될 수 있다. 대안적으로, CD80 표적화 단백질 및 항-CD3 표적화 단백질 둘 다는 텐덤 발현 카세트에서 암호화될 수 있어서, 렌티바이러스 벡터의 생산를 위한 표적화 단백질 둘 다의 발현을 제공하는 단일 발현 벡터에서 단일 발현 카세트를 제공한다. 동일한 발현 카세트로부터 발현된 CD80 표적화 단백질 및 항-CD3 표적화 단백질에 대한 핵산 서열 및 상응하는 아미노산 서열의 예시적인 실시형태는 표 3에 제공된다. 이러한 실시형태에서, 2개의 표적화 단백질은 P2A 자가 절단 펩타이드에 의해 연결될 수 있다. 표 3은 P2A 서열을 통해 항-CD3 결합 단백질에 연결된 CD80 결합 단백질을 포함하는 텐덤 발현 카세트에 사용될 수 있는 예시적인 핵산을 제공한다. 특정한 실시형태에서, P2A 서열은 서열 번호 29와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화되고, P2A 서열의 아미노산 서열은 서열 번호 30과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 결합 단백질에 연결된 CD80 결합 단백질을 포함하는 텐덤 발현 카세트는 서열 번호 21의 핵산 서열을 포함하거나 서열 번호 21과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 결합 단백질에 연결된 CD80 결합 단백질을 포함하는 텐덤 발현 카세트는 서열 번호 22 또는 서열 번호 24의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 22의 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 결합 단백질에 연결된 CD80 결합 단백질을 포함하는 텐덤 발현 카세트는 서열 번호 22 또는 서열 번호 24의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 22와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한다.
전이유전자
본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 벡터에 의해 표적화된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)로 전달되고 이에 의해 발현된 하나 이상의 단백질을 암호화하는 전이유전자를 포함한다. 특정한 실시형태에서, 전이유전자는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 세포내 신호전달 도메인이되, 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함하는 것; 및 세포외 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화한다.
본 개시내용의 CAR에 사용하기에 적합한 결합 도메인은 임의의 항원 결합 폴리펩타이드를 포함한다. 결합 도메인은 표적 질환 항원에 특이적인 예를 들면 전장 중쇄, Fab 단편, Fab', F(ab')2, sFv, VH 도메인, VL 도메인, dAb, VHH, CDR 및 scFv를 포함하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, CAR 결합 도메인은 쥣과, 키메라, 인간 또는 인간화이다. 추가의 실시형태에서, CAR 결합 도메인은 인간 또는 인간화인 VH 영역 및 VL 영역을 갖는 scFv이다. 추가의 실시형태에서, CAR 결합 도메인은 VH 영역 및 VL 영역을 연결하는 (GGGS)N 링커 또는 (GGGGS)N 링커(여기서, N = 1 내지 10)를 갖는 scFv이다. 다른 실시형태에서, CAR 결합 도메인은 VH 영역 및 VL 영역을 연결하는 서열 번호 64를 포함하는 링커를 갖는 scFv이다.
본 개시내용의 CAR의 세포외 도메인에 의해 결합된 표적 분자는 표적 세포에서 발견되거나 이것과 연관되어 있을 수 있다. 예시적인 표적 세포는 암 세포, 자가면역 질환 또는 장애, 신경퇴행성 질환, 또는 염증성 질환 또는 장애, 간염성 미생물(예를 들면, 박테리아, 바이러스 또는 진균)과 연관된 세포 및 감염된 세포(예를 들면, 바이러스 감염된 세포)를 포함한다. 감염성 유기체, 예컨대 포유류 기생충의 세포는 또한 표적 세포로서 고려된다.
본원에 기재된 것과 같은 CAR에 포함된 세포외 도메인은 각종 표적 분자 중 하나 이상을 표적화하는 결합 도메인을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, CAR은 종양 항원에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함한다. 일부 이러한 실시형태에서, CAR 결합 도메인은 CD19, BCMA, 알파 폴레이트 수용체, 5T4, Ab 인테그린, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD52, CD70, CD79a, CD79b, CD80, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FLT3, Fra, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-A1 + MAGE1, HLA-A2 + MAGE1, HLA-A3 + MAGE1, HLA-A1 + NY-ESO-1, HLA-A2 + NY-ESO-1, HLA-A3 + NY-ESO-1, HLADR, IL-11R알파, IL-13 R알파2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2d 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 서바이빈, TAG72, TEMs, VEGFR2, BAFF-R, 클라우딘18.2, CD86, FcRL5, GPRC5 및 TACI 중 하나 이상에 특이적으로 결합한다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용에 기재된 렌티바이러스 벡터의 전이유전자에 의해 암호화된 CAR의 세포외 도메인은 선택적으로 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 세포외 비신호전달 스페이서 또는 링커 도메인을 포함한다. 이러한 스페이서 또는 링커 도메인은 포함되는 경우 적절한 세포-대-세포 접촉, 결합 및 활성화가 추가로 가능하게 하도록 숙주 세포 표면으로부터 멀리 결합 도메인을 위치시킬 수 있다. 세포외 스페이서 도메인은 일반적으로 CAR의 세포외 결합 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치한다. 세포외 스페이서의 길이는 선택된 표적 분자, 선택된 결합 에피토프, 결합 도메인 크기 및 친화도에 기초하여 표적 분자 결합을 최적화하도록 변할 수 있다(예를 들면, Guest 등, J. Immunother. 28:203-11, 2005; PCT 공보 WO 2014/031687호 참조). 소정의 실시형태에서, 세포외 스페이서 도메인은 면역글로불린 힌지 영역(예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgD)이다. 면역글로불린 힌지 영역은 야생형 면역글로불린 힌지 영역 또는 변경된 야생형 면역글로불린 힌지 영역일 수 있다. 변경된 IgG4 힌지 영역은 힌지 영역이 본원에 그 전문이 참고로 포함된 PCT 공보 WO 2014/031687호에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 세포외 스페이서 도메인은 ESKYGPPCPPCP(서열 번호 118)의 아미노산 서열을 갖는 변형된 IgG4 힌지 영역을 포함한다.
본원에 기재된 CAR에 사용될 수 있는 힌지 영역의 다른 예는 야생형일 수 있는 CD8a, CD4, CD28 및 CD7 또는 이의 변이체와 같은 1형 막 단백질의 세포외 영역으로부터의 힌지 영역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포외 스페이서 도메인은 CH1 도메인, CH2 도메인, CH3 도메인 또는 이들의 조합으로부터 선택된 면역글로불린 Fc 도메인의 전부 또는 일부를 포함한다(예를 들면, 스페이서가 본원에 그 전문이 참고로 포함된 PCT 공보 WO2014/031687호 참조). 더 추가의 실시형태에서, 세포외 스페이서 도메인은 II형 C-렉틴의 스톡 영역(C형 렉틴 도메인과 막관통 도메인 사이에 위치한 세포외 도메인)을 포함할 수 있다. II형 C-렉틴은 CD23, CD69, CD72, CD94, NKG2A 및 NKG2D를 포함한다.
본 개시내용의 CAR은 세포외 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 연결하고 이들 사이에 위치한 막관통 도메인을 포함한다. 막관통 도메인은 통상적으로 약 15개의 아미노산 내지 약 30개의 아미노산의 길이의 범위이다. 막관통 도메인은 숙주 세포막을 횡단하고 숙주 세포막에서 CAR을 앵커링하는 소수성 알파 나선이다. 막관통 도메인은 존재하면 결합 도메인 또는 세포외 스페이서 도메인에 직접적으로 융합될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 막관통 도메인은 통합 막 단백질(예를 들면, 수용체, 분화 클러스터(CD) 분자, 효소, 수송체, 세포 부착 분자 또는 기타)로부터 유래된다. 막관통 도메인은 세포외 도메인 또는 세포내 신호전달 도메인과 동일한 분자로부터 선택될 수 있다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인 및 세포외 도메인은 각각 상이한 분자로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 각각 상이한 분자로부터 선택된다. 더 다른 실시형태에서, 막관통 도메인, 세포외 도메인 및 세포내 신호전달 도메인은 각각 상이한 분자로부터 선택된다.
본 개시내용의 CAR에 사용하기 위한 예시적인 막관통 도메인은 CD28, CD2, CD4, CD8a, CD5, CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD9, CD16, CD22, CD25, CD27, CD33, CD37, CD40, CD45, CD64, CD79A, CD79B, CD80, CD86, CD95(Fas), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD154(CD40L), CD200R, CD223(LAG3), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), CD279(PD-1), CD300, CD357(GITR), A2aR, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, GAL9, KIR, Lck, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PTCH2, ROR2, Ryk, Slp76, SIRPα, pTα, TCRα, TCRβ, TIM3, TRIM, LPA5 및 Zap70 막관통 도메인을 포함한다. CD8a 힌지 영역을 갖는 예시적인 CD8a 막관통 도메인은 서열 번호 52의 아미노산 서열을 포함한다.
CAR의 세포내 신호전달 도메인은 세포내 효과기 도메인이고, 표적 분자에 대한 CAR의 세포외 도메인의 결합에 반응하여 세포에 기능적 신호를 전파할 수 있고, 면역 세포, 예를 들면 CAR을 발현하도록 조작된 T 세포의 정상 효과기 기능 또는 반응 중 적어도 하나를 활성화한다. 일부 실시형태에서, CAR은 T 세포의 기능, 예컨대 세포용해 활성 또는 T 헬퍼 활성, 예컨대 사이토카인 또는 다른 인자의 분비를 유도한다. 세포내 신호전달 도메인은 충분한 신호전달 활성을 보유하는 세포내 신호전달 분자의 임의의 부분일 수 있다. 일부 실시형태에서, 항원 수용체 성분(예를 들면, TCR) 또는 공동자극 분자로부터 세포내 신호전달 도메인을 얻는다. 일부 실시형태에서, 항원 수용체 또는 공동자극 분자의 전장 세포내 신호전달 도메인이 사용된다. 일부 실시형태에서, 항원 수용체 또는 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인의 절두된 부분이 사용되고, 단 절두된 부분은 충분한 신호 전달 활성을 보유한다. 추가의 실시형태에서, 세포내 신호전달 도메인은 항원 수용체 공동자극 분자의 세포내 신호전달 도메인의 전장 부분 또는 절두된 부분의 변이체이고, 단 변이체는 충분한 신호 전달 활성을 보유한다(즉, 기능적 변이체임).
소정의 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 신호전달 도메인을 함유하는 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM)를 포함한다. 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM은 일반적으로 YXXL/I-X6-8-YXXL/I의 보존된 모티프를 지칭하는 적어도 1개(1개, 2개, 3개, 4개 또는 초과)의 ITAM을 함유한다. 신호전달 도메인을 함유하는 ITAM은 항원 결합 또는 리간드 관여 후에 T 세포 활성화 신호전달을 개시할 수 있다. ITAM-신호전달 도메인은 예를 들면 CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD5, CD22, CD79a, CD278(ICOS), DAP10, DAP12, FcRγ 및 CD66d의 세포내 신호전달 도메인을 포함한다. 본 개시내용의 CAR에 사용될 수 있는 예시적인 CD3ζ 신호전달 도메인은 서열 번호 56 또는 서열 번호 122의 아미노산 서열을 포함한다.
CAR 세포내 신호전달 도메인은 주요 또는 전통적(예를 들면, ITAM 유래) 활성화 신호와 함께 활성화될 때 T 세포 반응, 예컨대 T 세포 활성화, 사이토카인 생성, 증식, 분화, 생존, 효과기 기능 또는 이들의 조합을 촉진하거나 향상시키는 공동자극 신호전달 도메인을 선택적으로 포함한다. CAR에 사용하기 위한 공동자극 신호전달 도메인은 예를 들면 CD27, CD28, CD40L, GITR, NKG2C, CARD1, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX-40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD226, CD270(HVEM), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), DAP10, LAT, LFA-1, LIGHT, NKG2C, NKD2C, SLP76, TRIM, ZAP70 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 공동자극 신호전달 도메인은 OX40, CD2, CD27, CD28, ICAM-1, LFA-1(CD11a/CD18), ICOS(CD278) 또는 4-1BB(CD137) 신호전달 도메인을 포함한다. 예시적인 4-1BB 공동자극 신호전달 도메인은 서열 번호 54의 아미노산 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, CAR은 1개, 2개 또는 초과의 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 CAR은 1세대 CAR, 2세대 CAR 또는 3세대 CAR이다. 1세대 CAR은 일반적으로 T 세포 활성화 신호를 제공하기 위해 CD3ζ의 세포내 신호전달 도메인, FcγRI 또는 다른 ITAM 함유 활성화 도메인을 포함하는 세포내 신호전달 도메인을 갖는다. 2세대 CAR은 공동자극 신호전달 도메인(예를 들면, 내인성 T 세포 공동자극 수용체로부터의 공동자극 신호전달 도메인, 예컨대 CD28, 4-1BB 또는 ICOS)을 추가로 포함한다. 3세대 CAR은 ITAM 함유 활성화 도메인, 제1 공동자극 신호전달 도메인 및 제2 공동자극 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 세포외 도메인, 결합 도메인, 링커, 막관통 도메인, 세포내 신호전달 도메인 또는 공동자극 도메인 중 하나 이상은 연접 아미노산을 포함한다. "연접 아미노산" 또는 "연접 아미노산 잔기"는 단백질의 2개의 인접한 도메인, 모티프, 영역, 모듈 또는 단편 사이의, 예컨대 결합 도메인과 인접한 링커 사이의, 막관통 도메인과 인접한 세포외 또는 세포내 도메인 사이의 또는 (예를 들면, 링커와 인접한 결합 도메인 사이에 또는 링커와 인접한 힌지 사이에) 2개의 도메인, 모티프, 영역, 모듈 또는 단편을 연결하는 링커의 일 말단 또는 양 말단에서의 1개 이상(예를 들면, 약 2개 내지 20개)의 아미노산 잔기를 지칭한다. 연접 아미노산은 융합 단백질의 작제물 설계로부터 생길 수 있다(예를 들면, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 작제 동안 제한 효소 부위 또는 자가 절단 펩타이드 서열의 사용으로 생긴 아미노산 잔기). 예를 들면, 융합 단백질의 막관통 도메인은 아미노-말단 단부, 카복시-말단 단부 또는 둘 다에서 하나 이상의 연접 아미노산을 가질 수 있다.
특정 실시형태에서, 전이유전자는 항-CD19 CAR 분자를 암호화한다. 이러한 실시형태에서, 세포외 결합 도메인은 서열 번호 46의 항-CD19 경쇄 가변 영역, 서열 번호 48의 G4S 링커 및 서열 번호 50의 항-CD19 중쇄 가변 영역을 갖는 표 4에 자세히 기재된 것과 같은 scFv를 포함할 수 있다. 본 설명의 맥락에서 유용한 항-CD19 CAR은 서열 번호 52의 CD8a 힌지 및 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 항-CD19 CAR은 서열 번호 54에 따른 4-1BB 공동자극 도메인 및 서열 번호 56에 따른 CD3ζ 효과기 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 전이유전자에 의해 암호화된 항-CD19 CAR은 서열 번호 42 또는 서열 번호 44의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 42에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시형태에서, 전이유전자는 항-CD19 CAR 분자를 암호화하고, 세포외 결합 도메인은 서열 번호 46과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 항-CD19 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 50과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 항-CD19 중쇄 가변 영역을 갖는 scFv를 포함할 수 있다. 본 설명의 맥락에서 유용한 항-CD19 CAR은 서열 번호 52와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 CD8a 힌지 및 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 항-CD19 CAR은 서열 번호 54와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인 및 서열 번호 56과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 CD3ζ 효과기 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 전이유전자에 의해 암호화된 항-CD19 CAR은 서열 번호 42 또는 서열 번호 44의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 42와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
다른 실시형태에서, 전이유전자는 항-BCMA CAR 분자를 암호화한다. 이러한 실시형태에서, 세포외 결합 도메인은 서열 번호 62의 항-BCMA 경쇄 가변 영역, 서열 번호 64의 링커 및 서열 번호 66의 항-BCMA 중쇄 가변 영역을 갖는 표 5에 자세히 기재된 것과 같은 scFv를 포함할 수 있다. 본 설명의 맥락에서 유용한 항-BCMA CAR은 서열 번호 52의 CD8a 힌지 및 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 항-BCMA CAR은 서열 번호 54에 따른 4-1BB 공동자극 도메인 및 서열 번호 122에 따른 CD3ζ 효과기 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 전이유전자에 의해 암호화된 항-BCMA CAR은 서열 번호 58 또는 서열 번호 60의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 58에 따른 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 전이유전자는 항-BCMA CAR 분자를 암호화한다. 이러한 실시형태에서, 세포외 결합 도메인은 서열 번호 62와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 항-BCMA 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 66과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 항-BCMA 중쇄 가변 영역을 갖는 scFv를 포함할 수 있다. 본 설명의 맥락에서 유용한 항-BCMA CAR은 서열 번호 52와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 CD8a 힌지 및 막관통 도메인을 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 항-BCMA CAR은 서열 번호 54와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인 및 서열 번호 122와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 CD3ζ 효과기 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 전이유전자에 의해 암호화된 항-BCMA CAR은 서열 번호 58 또는 서열 번호 60의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 58과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는다.
본 개시내용의 CAR은 인간, 영장류, 소, 말, 염소, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 돼지, 이의 형질전환 종 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 임의의 포유류 종으로부터 유래된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 키메라 항원 수용체는 쥣과, 키메라, 인간 또는 인간화이다.
렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법
개시된 LVV를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. LVV는 이의 성분을 재조합 플라스미드 DNA 벡터로 조합하여 레트로바이러스 게놈에 기초하여 개발되었다. 이후, 플라스미드 DNA 벡터는 렌티바이러스 입자 생산에 필요한 유전자를 전달하기 위해 생산자 세포주로 형질주입될 수 있다. LVV 패키징 시스템은 일반적으로 관심 있는 전이유전자를 암호화하는 운반 플라스미드, 외피 플라스미드(예를 들면, VSV-G) 및 패키징 플라스미드(들)를 포함한다. 2세대 LVV 패키징 시스템은 Gag, Pol, Rev 및 Tat 유전자를 암호화하는 단일 패키징 플라스미드 및 별개의 Env 플라스미드를 함유한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법은 LVV를 생산하기 위해 3세대 벡터 시스템을 이용한다. 3세대 벡터 생산 시스템은 2세대 LVV 패키징 시스템의 안정성을 개선하고, 통상적으로 3개의 패키징 플라스미드인 VSV-G, GagPol 및 Rev와 조합된 전이유전자 플라스미드를 포함하는 4개의 플라스미드 시스템이다. 따라서, Rev 및 GagPol은 2개의 플라스미드로 분리된다. Tat는 또한 운반 플라스미드에서 이종성 프로모터(예를 들면, CMV 또는 RSV 프로모터)에 융합된 키메라 5' LTR의 첨가에 의해 3세대 LVV 패키징 시스템으로부터 제거된다. gag 유전자는 기질, 캡시드 및 뉴클레오캡시드를 포함하는 바이러스의 구조 단백질을 포함하는 Gag 폴리단백질 전구체를 암호화한다. pol 유전자는 프로테아제, 역전사효소 및 인테그라제를 포함하는 복제에 필수적인 렌티바이러스의 효소 기능을 공급하는 Pol 폴리단백질 전구체를 암호화한다. rev 유전자는 바이러스 복제 동안 비스플라이싱된 및 단일로 스플라이싱된 HIV RNA의 핵 배출을 허용하도록 Rev 반응 요소(RRE)에 결합하는 Rev 단백질을 암호화한다. Gag 및 Pol 폴리단백질 전구체는 바이러스 입자의 생산 동안 절단된다.
본 개시내용의 LVV를 생산하기 위해 사용될 수 있는 생산자 세포는 인간 배아 신장(HEK) 293 세포 및 이의 유도체를 포함한다. 생산자 세포는 부착성 세포주, 예컨대 HEK293T 생산자 세포 또는 현탁 세포주, 예컨대 HEK293T/17 SF 생산자 세포일 수 있다.
전이유전자 플라스미드는 3개의 패키징 플라스미드인 GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드와 조합되고, 생산자 세포, 예컨대 HEK293 생산자 세포를 형질주입하도록 사용된다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포는 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질주입된다. 일부 실시형태에서, 패키징 플라스미드의 비는 질량에 의해 결정된다. 일부 실시형태에서, 전이유전자 플라스미드 및 GagPol 플라스미드의 각각의 질량은 VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 각각의 질량보다 높다. 일부 실시형태에서, 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비는 약 1:1:1:1 내지 약 5:4:1:1이다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포를 약 2:1:1:1 내지 약 5:4:1:1에서의 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질주입한다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포를 약 2:1:1:1에서의 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질주입한다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포를 약 3:1:1:1에서의 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질주입한다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포를 약 3.125:3.125:2.5:1.25에서의 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질주입한다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포를 약 4:2:1:1에서의 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질주입한다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포를 약 5:4:1:1에서의 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질주입한다. 생산적 렌티바이러스 입자는 생산자 세포 배양 배지로부터 수확된다. LVV 입자를 생산하기 위한 예시적인 재료 및 방법은 내용이 본원에 참고로 포함된 Production of Lentiviral Vectors, Merten 등, Molecular Therapy - Methods & Clinical Development (2016), 3, 16017에 기재되어 있다. 3세대 생산 시스템은 조사 및 개발 및 임상 목적을 위해 사용된다. 3세대 LVV 생산 시스템에 사용하기에 적합한 헬퍼 플라스미드의 도식적 표시는 도 1에 제공된다.
전이유전자 플라스미드는 생성된 LVV에 의해 표적화된 림프구(예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)로 운반되고 캡시드화, 역전사 및 통합을 위해 시스-작용 요소에 의해 플랭킹된 전이유전자 발현 카세트를 함유하는 렌티바이러스 골격을 포함하는 유일한 유전 재료를 암호화한다. 특정 실시형태에서, 전이유전자 플라스미드는 일단 표적 세포로 전달되면 바이러스 LTR의 전사 용량의 소실을 야기하는 3' LTR의 U3 요소에서의 결실을 포함한다. 전이유전자 플라스미드에 포함된 발현 카세트는 표적 세포로의 도입 및 표적 세포에 의한 발현을 위해 단일 이종성 단백질(예를 들면, 본원에 기재된 것과 같은 단일 CAR) 또는 다수의 이종성 단백질(예를 들면, 본원에 기재된 것과 같은 다수의 CAR)을 암호화할 수 있다.
4개의 플라스미드 LVV 시스템 중 일부 실시형태에서, VSV-G env 플라스미드는 본원에 개시된 것과 같은 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질 및 표적화 단백질을 암호화하는 텐덤 발현 카세트를 포함한다. 특정 실시형태에서, VSV-G env 플라스미드에 포함된 텐덤 발현 카세트는 제1 신호 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 푸린 절단 부위 또는 바이러스 2A 펩타이드 중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 제2 신호 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 돌연변이체 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 5'에 위치한다. 다른 실시형태에서, 돌연변이체 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 3'에 위치한다. 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 돌연변이된 VSV-G를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 IRES, 푸린 절단 부위 또는 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 텐덤 카세트에서 분리되고, 이는 단일 mRNA로부터의 2개의 단백질의 공동발현을 허용한다. 소정의 실시형태에서, 바이러스 2A 펩타이드는 돼지 테스코바이러스-1(P2A), 토세아 아시그나(Thosea asigna) 바이러스(T2A), 말 비염 A 바이러스(E2A), 수족구병 바이러스(F2A) 또는 이들의 변이체이다. 바이러스 2A 펩타이드에 대한 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열의 특정 예는 표 7에 제공된다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 이전의 청구항 중 어느 하나에 따른 림프구 표적화된 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 생산자 세포를 GagPol 플라스미드, Rev 플라스미드, 전이유전자 플라스미드 및 VSV-G env 플라스미드로 형질주입하는 것으로서, GagPol 플라스미드는 렌티바이러스 gag 유전자 및 렌티바이러스 pol 유전자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 생산자 세포 내에 렌티바이러스 gag 폴리단백질 및 렌티바이러스 pol 폴리단백질을 발현할 수 있고;
Rev 플라스미드는 렌티바이러스 rev 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 생산자 세포 내에 렌티바이러스 rev 단백질을 발현할 수 있고; 전이유전자 플라스미드는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트를 포함하고; VSV-G env 플라스미드는 텐덤 발현 카세트를 포함하고 텐덤 발현 카세트는 본원에 개시된 것과 같은 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 본원에 개시된 것과 같은 림프구 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, VSV-G env 플라스미드는 생산자 세포 내에 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질 및 림프구 표적화 단백질을 발현할 수 있는 것; 생산자 세포를 배양 배지에서 배양하는 것; 및 배양 배지로부터 렌티바이러스 벡터를 수확하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 생산자 세포는 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질주입된다. 일부 실시형태에서, 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비는 약 1:1:1:1 내지 약 5:4:1:1이다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포를 약 2:1:1:1 내지 약 5:4:1:1에서의 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질주입한다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포를 약 2:1:1:1에서의 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질주입한다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포를 약 3:1:1:1에서의 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질주입한다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포를 약 3.125:3.125:2.5:1.25에서의 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질주입한다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포를 약 4:2:1:1에서의 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질주입한다. 일부 실시형태에서, 생산자 세포를 약 5:4:1:1에서의 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질주입한다.
하나의 실시형태에서, VSV-G env 플라스미드의 텐덤 발현 카세트는 항-CD3 표적화 단백질 및 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 텐덤 발현 카세트는 서열 번호 68과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는 서열 번호 67과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태는 표 8에 더 자세히 기재되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 텐덤 발현 카세트는 서열 번호 32의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 68과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는, 서열 번호 31의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 67과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 표 8에 예시된 것처럼, 항-CD3 표적화 단백질은 P2A 자가 절단 펩타이드를 통해 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질로부터 분리된다. 소정의 실시형태에서, 그 P2A 펩타이드는 서열 번호 69와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있고, P2A 펩타이드는 서열 번호 70과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 수 있다.
또 다른 실시형태에서, VSV-G env 플라스미드의 텐덤 발현 카세트는 CD80 표적화 단백질 및 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 텐덤 발현 카세트는 서열 번호 76의 아미노산 서열을 암호화하는 서열 번호 75에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태는 표 9에 더 자세히 기재되어 있다. 표 9에 예시된 것처럼, CD80 표적화 단백질은 서열 번호 69에 의해 암호화되고 서열 번호 70에 따른 아미노산 서열을 갖는 P2A 자가 절단 펩타이드를 통해 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질로부터 분리된다.
일부 실시형태에서, VSV-G env 플라스미드의 텐덤 발현 카세트가 CD80 표적화 단백질 및 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 경우, 텐덤 발현 카세트는 서열 번호 76과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는, 서열 번호 75와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, CD80 표적화 단백질은 서열 번호 69와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된 P2A 자가 절단 펩타이드를 통해 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질로부터 분리되고, P2A 자가 절단 펩타이드는 서열 번호 70과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, VSV-G env 플라스미드의 텐덤 발현 카세트는 CD80 표적화 단백질, 항-CD3 표적화 단백질 및 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 암호화한다. 예를 들면, 특정 실시형태에서, 텐덤 발현 카세트는 서열 번호 2의 아미노산 서열을 암호화하는 서열 번호 1에 따른 CD80 표적화 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 텐덤 발현 카세트는 서열 번호 10의 아미노산 서열을 암호화하는 서열 번호 9에 따른 항-CD3 표적화 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태는 표 3에 더 자세히 기재되어 있다. 표 3에 예시된 것처럼, CD80 표적화 단백질은 서열 번호 29에 의해 암호화되고 서열 번호 30에 따른 아미노산 서열을 갖는 P2A 자가 절단 펩타이드를 통해 항-CD3 표적화 단백질로부터 분리된다.
일부 실시형태에서, VSV-G env 플라스미드의 텐덤 발현 카세트가 CD80 표적화 단백질, 항-CD3 표적화 단백질 및 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 경우, 텐덤 발현 카세트는 서열 번호 22와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화하는, 서열 번호 21과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 CD80 표적화 단백질 및 항-CD3 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, CD80 표적화 단백질은 서열 번호 29와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 핵산 서열에 의해 암호화된 P2A 자가 절단 펩타이드를 통해 항-CD3 표적화 단백질로부터 분리되고, P2A 자가 절단 펩타이드는 서열 번호 30과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산을 포함한다.
일부 실시형태에서, VSV-G env 플라스미드의 텐덤 발현 카세트가 CD80 표적화 단백질, 항-CD3 표적화 단백질 및 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 경우, CD80 표적화 단백질 및 항-CD3 표적화 단백질은 2A 자가 절단 펩타이드를 통해 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질로부터 분리된다.
4개의 플라스미드 LVV 시스템 중 일부 실시형태에서, GagPol 플라스미드는 본원에 개시된 것과 같은 Gag 폴리단백질 전구체 및 Pol 폴리단백질 전구체 및 표적화 단백질을 암호화하는 텐덤 발현 카세트를 포함한다. 특정 실시형태에서, GagPol 플라스미드에 포함된 텐덤 발현 카세트는 제1 신호 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 푸린 절단 부위 또는 바이러스 2A 펩타이드 중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 제2 신호 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 Gag 폴리단백질 전구체 및 Pol 폴리단백질 전구체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, Gag 폴리단백질 전구체 및 Pol 폴리단백질 전구체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 5'에 위치한다. 다른 실시형태에서, Gag 폴리단백질 전구체 및 Pol 폴리단백질 전구체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 3'에 위치한다. 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 Gag 폴리단백질 전구체 및 Pol 폴리단백질 전구체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 IRES, 푸린 절단 부위 또는 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 텐덤 카세트에서 분리되고, 이는 단일 mRNA로부터의 Gag 폴리단백질 전구체 및 Pol 폴리단백질 전구체 및 표적화 단백질의 공동발현을 허용한다. 소정의 실시형태에서, 바이러스 2A 펩타이드는 돼지 테스코바이러스-1(P2A), 토세아 아시그나 바이러스(T2A), 말 비염 A 바이러스(E2A), 수족구병 바이러스(F2A) 또는 이들의 변이체이다. 바이러스 2A 펩타이드에 대한 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열의 특정 예는 표 7에 제공된다.
일부 실시형태에서, Gag 폴리단백질 전구체 및 Pol 폴리단백질 전구체 및 표적화 단백질을 암호화하는 텐덤 발현 카세트를 함유하는 GagPol 플라스미드는 VSV-G env 플라스미드보다 더 높은 몰 농도로 생산자 세포로 형질주입된다. 일부 실시형태에서, Gag 폴리단백질 전구체 및 Pol 폴리단백질 전구체 및 표적화 단백질을 암호화하는 텐덤 발현 카세트를 함유하는 GagPol 플라스미드는 VSV-G env 플라스미드보다 더 낮은 몰 농도로 생산자 세포로 형질주입된다.
하나의 실시형태에서, GagPol 플라스미드의 텐덤 발현 카세트는 항-CD3 표적화 단백질 및 Gag 폴리단백질 전구체 및 Pol 폴리단백질 전구체를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 표적화 단백질은 P2A 자가 절단 펩타이드를 통해 Gag 폴리단백질 전구체 및 Pol 폴리단백질 전구체로부터 분리된다.
또 다른 실시형태에서, GagPol 플라스미드의 텐덤 발현 카세트는 CD80 표적화 단백질 및 Gag 폴리단백질 전구체 및 Pol 폴리단백질 전구체를 암호화한다. 일부 실시형태에서, CD80 표적화 단백질은 P2A 자가 절단 펩타이드를 통해 Gag 폴리단백질 전구체 및 Pol 폴리단백질 전구체로부터 분리된다.
4개의 플라스미드 LVV 시스템 중 일부 실시형태에서, Rev 플라스미드는 본원에 개시된 것과 같은 Rev 단백질 및 표적화 단백질을 암호화하는 텐덤 발현 카세트를 포함한다. 특정 실시형태에서, Rev 플라스미드에 포함된 텐덤 발현 카세트는 제1 신호 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 푸린 절단 부위 또는 바이러스 2A 펩타이드 중 하나를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 제2 신호 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 Rev 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 소정의 실시형태에서, Rev 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 5'에 위치한다. 다른 실시형태에서, Rev 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 3'에 위치한다. 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 Rev 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 IRES, 푸린 절단 부위 또는 바이러스 2A 펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 텐덤 카세트에서 분리되고, 이는 단일 mRNA로부터의 Rev 단백질 및 표적화 단백질의 공동발현을 허용한다. 소정의 실시형태에서, 바이러스 2A 펩타이드는 돼지 테스코바이러스-1(P2A), 토세아 아시그나 바이러스(T2A), 말 비염 A 바이러스(E2A), 수족구병 바이러스(F2A) 또는 이들의 변이체이다. 바이러스 2A 펩타이드에 대한 아미노산 및 뉴클레오타이드 서열의 특정 예는 표 7에 제공된다.
일부 실시형태에서, Rev 단백질 및 표적화 단백질을 암호화하는 텐덤 발현 카세트를 함유하는 Rev 플라스미드는 VSV-G env 플라스미드보다 더 높은 몰 농도로 생산자 세포로 형질주입된다. 일부 실시형태에서, Rev 단백질 및 표적화 단백질을 암호화하는 텐덤 발현 카세트를 함유하는 Rev 플라스미드는 VSV-G env 플라스미드보다 더 낮은 몰 농도로 생산자 세포로 형질주입된다.
일 실시형태에서, Rev 플라스미드의 텐덤 발현 카세트는 항-CD3 표적화 단백질 및 Rev 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 표적화 단백질은 P2A 자가 절단 펩타이드를 통해 Rev 단백질로부터 분리된다.
또 다른 실시형태에서, GagPol 플라스미드의 텐덤 발현 카세트는 CD80 표적화 단백질 및 Rev 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, CD80 표적화 단백질은 P2A 자가 절단 펩타이드를 통해 Rev 단백질로부터 분리된다.
4개의 플라스미드인, 본 개시내용의 3세대 렌티바이러스 벡터 시스템에 사용될 수 있는 돌연변이된 VSV-G 서열의 예는 표 10에 제공된다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용에 따른 LVV를 생산하는 방법은 5개의 플라스미드 시스템을 이용할 수 있다. 5개의 플라스미드 시스템이 사용되는 경우, LVV 생산 시스템은 3세대 벡터 시스템으로부터 4개의 플라스미드(즉, 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, Env 플라스미드 및 VSV-G env 플라스미드)를 이용한다. 게다가, 본원에 기재된 것과 같은 5개의 플라스미드 시스템은 표적화 단백질을 암호화하는 제5 플라스미드("표적화 단백질 플라스미드")를 포함한다. 5개의 플라스미드 시스템에 포함된 GagPol 및 Env 패키징 플라스미드는 Production of Lentiviral Vectors, Merten 등, Molecular Therapy - Methods & Clinical Development (2016), 3, 16017에 기재된 것과 같은 표준 패키징 플라스미드일 수 있다. 전이유전자 플라스미드는 본 개시내용에 따른 하나 이상의 CAR 전이유전자를 암호화하는 발현 카세트를 포함하고, VSV-G env 플라스미드는 본원에 기재된 것과 같은 돌연변이체 VSV-G를 암호화하는 발현 카세트를 포함한다.
일부 실시형태에서, 제5 플라스미드는 CD80 표적화 단백질을 암호화하는 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제5 플라스미드는 항-CD3 표적화 단백질을 암호화하는 발현 카세트를 포함한다. 일부 실시형태에서, 제5 플라스미드는 CD80 표적화 단백질 및 항-CD3 표적화 단백질을 암호화하는 발현 카세트를 포함한다. 제5 플라스미드에 사용될 수 있는 CD80 표적화 단백질 및 항-CD3 표적화 단백질의 예는 표 1-3에 제공된다.
소정의 실시형태에서, 본 개시내용은 이전의 청구항 중 어느 하나에 따른 림프구 표적화된 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법을 제공하고, 상기 방법은 생산자 세포를 GagPol 플라스미드, Rev 플라스미드, 전이유전자 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 림프구 표적화 단백질 플라스미드로 형질주입하는 것으로서; GagPol 플라스미드는 렌티바이러스 gag 유전자 및 렌티바이러스 pol 유전자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 생산자 세포 내에 렌티바이러스 gag 단백질 및 렌티바이러스 pol 단백질을 발현할 수 있고; Rev 플라스미드는 렌티바이러스 rev 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 생산자 세포 내에 렌티바이러스 rev 단백질을 발현할 수 있고; 전이유전자 플라스미드는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트를 포함하고; VSV-G env 플라스미드는 본원에 기재된 것과 같은 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 생산자 세포 내에 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 발현할 수 있고; 림프구 표적화 단백질 플라스미드는 본원에 기재된 것과 같은 림프구 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고 생산자 세포 내에 림프구 표적화 단백질을 발현할 수 있는 것; 생산자 세포를 배양 배지에서 배양하는 것; 및 배양 배지로부터 렌티바이러스 벡터를 수확하는 것을 포함한다.
일부 실시형태에서, 생산자 세포는 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드, Rev 플라스미드 및 림프구 표적화 플라스미드의 정해진 비로 형질주입된다. 림프구 표적화 플라스미드는 VSV-G env 플라스미드에 대해 (질량 기준) 약 0.25 내지 약 5의 비일 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 4개의 패키징 플라스미드 시스템(전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드, VSV-G env 플라스미드, Rev 플라스미드)에 대한 정해진 비를 이용하여, 림프구 표적화 단백질 플라스미드의 비는 VSV-G env 플라스미드에 대해 조정될 수 있다. 예를 들면, 림프구 표적화된 플라스미드는 VSV-G env 플라스미드에 대해 약 0.25:1, 0.5:1, 1:1, 1.25:1, 1.5:1, 1.75:1, 2:1, 2.25:1, 2.5:1, 2.75:1, 3:1, 3.25:1, 3.5:1, 3.75:1, 4:1, 4.25:1, 4.5:1, 4.75:1 또는 5:1의 비일 수 있다.
5개의 플라스미드의 조합을 이용하는 LVV 생산 방법의 실시형태에서, 제5 플라스미드는 표적화 단백질 플라스미드이고, 하나 이상의 표적화 단백질을 암호화하는 발현 카세트를 포함한다. 예를 들면, 표적화 단백질 플라스미드는 CD80 표적화 단백질, 항-CD3 표적화 단백질 또는 CD80 표적화 단백질과 항-CD3 표적화 단백질 둘 다를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 표적화 단백질 벡터 플라스미드는 서열 번호 2에 따른 CD80 표적화 단백질을 암호화하는 서열 번호 1에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 다른 실시형태에서, 표적화 단백질 플라스미드는 서열 번호 10에 따른 항-CD3 표적화 단백질을 암호화하는 서열 번호 9에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 다른 실시형태에서, 표적화 단백질 플라스미드는 서열 번호 117에 따른 항-CD3 표적화 단백질을 암호화하는 서열 번호 116에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트를 포함한다. 다른 실시형태에서, 표적화 단백질 플라스미드는 서열 번호 22에 따른 폴리펩타이드를 암호화하는 서열 번호 21에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 텐덤 발현 카세트를 포함한다. 5개의 플라스미드인, 본 개시내용의 3세대 렌티바이러스 벡터 시스템에 사용될 수 있는 돌연변이된 VSV-G 서열의 예는 표 10에 제공된다.
4개의 플라스미드 패키징 시스템에서, 형질도입된 세포의 표면에 대한 림프구 표적화 단백질의 농도는 표적화 단백질을 함유하는 플라스미드의 농도와 연관될 수 있다. 예를 들면, 림프구 표적화 단백질 플라스미드 플라스미드가 VSV-G env 플라스미드에 함유되면, 형질도입된 세포의 표면에서의 림프구 표적화 단백질의 농도는 VSV-G env 플라스미드의 농도와 연관될 수 있다. 또 다른 예에서, 림프구 표적화 단백질 플라스미드 플라스미드가 GagPol 플라스미드에 함유되면, 형질도입된 세포의 표면에서의 림프구 표적화 단백질의 농도는 GagPol 플라스미드의 농도와 연관될 수 있다. 또 다른 예에서, 림프구 표적화 단백질 플라스미드 플라스미드가 Rev 플라스미드에 함유되면, 형질도입된 세포의 표면에서의 림프구 표적화 단백질의 농도는 Rev 플라스미드의 농도와 연관될 수 있다. 5개의 플라스미드 패키징 시스템에서, 형질도입된 세포의 표면에 대한 림프구 표적화 단백질의 농도는 표적화 단백질을 함유하는 플라스미드의 농도와 연관될 수 있다.
4개의 플라스미드 패키징 시스템에서, 형질도입 효율은 표적화 단백질을 함유하는 플라스미드의 농도와 연관될 수 있다. 예를 들면, 림프구 표적화 단백질 플라스미드 플라스미드가 VSV-G env 플라스미드에 함유되면, 형질도입 효율은 VSV-G env 플라스미드의 농도와 연관될 수 있다. 또 다른 예에서, 림프구 표적화 단백질 플라스미드 플라스미드가 GagPol 플라스미드에 함유되면, 형질도입 효율은 GagPol 플라스미드의 농도와 연관될 수 있다. 또 다른 예에서, 림프구 표적화 단백질 플라스미드 플라스미드가 Rev 플라스미드에 함유되면, 형질도입 효율은 Rev 플라스미드의 농도와 연관될 수 있다. 5개의 플라스미드 패키징 시스템에서, 형질도입 효율은 림프구 표적화 단백질 플라스미드의 농도와 연관될 수 있다.
생산자 세포의 형질주입 후에, 렌티바이러스 입자 생성물은 세포 상청액 또는 배양 배지로부터 수확될 수 있다. 효능 또는 안전성에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 성분을 최소화하면서 LVV 회수를 최대화하기 위한 LVV의 하류 공정이 당해 분야에 알려져 있다. 통상적인 공정은 세포 및 이의 잔해를 제거하는 것을 포함하는 순차적인 정제 단계, 이어서 LVV의 농후화 및 숙주 세포 또는 혈청 단백질, 핵산 및 지질의 제거를 수반한다. LVV 산물은 안정성을 위해 적합한 제형 완충액으로 교환하고 이후 마지막으로 저장 또는 적용 전에 멸균 여과를 겪기 전에 추가로 농축될 수 있다. 청징 단계는 응집물 및 세포 잔해와 같은 큰 불순물을 제거하기 위해 초기에 수확된 LVV 상청액에서 수행될 수 있다. 일부 실시형태에서, 청징 단계는 원심분리 및/또는 종래의 흐름 여과를 포함한다. 일부 실시형태에서, 청징 단계는 뉴클레아제 분해 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, LVV 산물은 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, 음이온 교환 크로마토그래피)를 포함하는 추가의 정제 단계를 겪는다. LVV는 또한 예를 들면 접선 흐름 여과 또는 한외여과/정용여과에 의해 농축될 수 있다. 일부 실시형태에서, 배양 배지로부터 LVV를 수확하는 것은 원심분리를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 배지로부터 LVV를 수확하는 것은 음이온 교환 크로마토그래피를 포함한다. 일부 실시형태에서, 배양 배지로부터 LVV를 수확하는 것은 음이온 교환 크로마토그래피 및 접선 흐름 여과를 포함한다.
일부 실시형태에서, 돌연변이된 VSV-G env 및 하나 이상의 림프구 표적화 단백질을 혼입하는 본원에 기재된 렌티바이러스 벡터는 또 다른 융합성 env 단백질(예를 들면, 코칼 env, 파라믹소바이러스 env, 절두된 VSV-G env)을 혼입한 표준 LVV와 비교하여 고역가 LVV 산물을 생성할 수 있다. 본원에 사용된 것과 같이 바이러스 역가는 mL당 형질도입 단위(TU)에 의해 측정된 것과 같은 감염성 바이러스 입자 역가를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 LVV의 역가는 농축된 LVV 산물에서 측정된 것과 같이 적어도 1e7 TU/mL, 적어도 1e8 TU/mL, 적어도 1e9 TU/mL, 적어도 1e10 TU/mL, 적어도 1e11 TU/mL 또는 적어도 1e12 TU/mL이다. 일부 실시형태에서, 본원에 기재된 LVV의 역가는 농축된 LVV 산물에서 약 1e7 TU/mL 내지 약 1e12 TU/mL이다.
조작된 림프구
본원에 기재된 LVV는 LVV가 보유하는 전이유전자에 의해 암호화된 CAR을 발현하도록 표적화된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)를 변형시키도록 사용될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조작된 림프구는 림프구를 본 개시내용의 LVV와 접촉시켜서 본 개시내용에 따른 LVV에 의해 형질도입된다. 이러한 실시형태에서, 조작된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)는 LVV가 보유하는 전이유전자에 의해 암호화된 CAR을 발현한다. 이 림프구는 본원에서 "CAR 변형된 림프구"로도 지칭된다. 특정 실시형태에서, 조작된 T 세포는 본원에서 "CAR 변형된 T 세포"로 지칭된다. 다른 특정 실시형태에서, 조작된 NK 세포는 본원에서 "CAR 변형된 NK 세포"로 지칭된다. 특정 실시형태에서, 조작된 T 세포는 본원에서 "CAR 변형된 B 세포"로 지칭된다. 특정 실시형태에서 CAR 변형된 T 세포는 본원에 기재된 LVV가 보유하는 전이유전자에 의해 암호화된 CAR을 발현하고, 미경험 T 세포(CD45RA+, CCR7+, CD62L+, CD27+, CD45RO-), 중앙 기억 T 세포(CD45RA-, CD45RO+, CD62L+, CCR7+, CD27+), 효과기 기억 T 세포(CD45RA-, CD45RO+, CCR7-, CD62L-, CD27-), γδ T 세포, 점막 연관 불변체 T(MAIT) 세포, Treg, 자연 살해 T 세포 및 조직 거주 T 세포로부터 선택된다.
본원에 기재된 LVV가 보유하는 표적화된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)의 형질도입은 생체외 또는 생체내 수행될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)는 인간, 마우스, 래트 또는 다른 포유류로부터 유래된 주요 세포 또는 세포주일 수 있다. 림프구는 포유류로부터 얻어지면 혈액, 골수, 림프절, 흉선 또는 다른 조직 또는 유체를 포함하는 많은 원천으로부터 얻어질 수 있다. 림프구 조성물(예를 들면, T 세포 조성물, B 세포 조성물 또는 NK 세포 조성물)은 농후화되거나 정제될 수 있다. T 세포주는 당해 분야에 잘 알려져 있고, 이들의 일부는 Sandberg 등, Leukemia 21:230, 2000에 기재되어 있다. 소정의 실시형태에서, T 세포는 TCRα 유전자, TCRβ 유전자 또는 둘 다의 내인성 발현이 결여된다. 이러한 T 세포는 자연적으로 TCRα 및 β 사슬의 내인성 발현이 결여되거나 발현(예를 들면, TCR α 및 β 사슬을 발현하지 않는 형질전환 마우스로부터의 T 세포 또는 TCR α 및 β 사슬의 발현을 억제하도록 조작된 세포)을 차단하거나 TCRα 사슬, TCRβ 사슬 또는 유전자 둘 다를 넉아웃하도록 변형될 수 있다.
일부 실시형태에서, CAR 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 의한 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)의 유전 변형 전에, 림프구(예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)의 원천은 대상체(예를 들면, 전혈, 말초혈 단핵 세포(PBMC), 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수, 흉막 삼출, 비장 조직)로부터 얻어질 수 있다. 림프구, T 세포, B 세포 또는 NK 세포는 당해 분야에 알려진 방법을 사용하여 대상체로부터 취한 샘플로부터 농후화되거나 단리될 수 있다. 예를 들면, T 세포는 적혈구의 저긴장 용해를 위해 알려진 방법을 사용하여 대상체로부터 취한 전혈 샘플에서 농후화될 수 있거나, T 세포는 알려진 구배 침강, 예를 들면, Ficoll® 감소) 기법을 사용하여 대상체로부터 취한 샘플로부터 단리될 수 있다. 대안적으로, T 세포는 자기 항체 표지된 비드, 이어서 칼럼 분리를 사용하여 전혈로부터 단리될 수 있다. 특정 숙주 세포 하위집단은 알려진 기법에 따라 수집되고, 알려진 기법, 예컨대 항체에 대한 친화도 결합, 유세포분석법 및/또는 면역자기 선택에 의해 농후화되거나 고갈될 수 있다. 일부 실시형태에서, 농후화 및/또는 고갈 단계 후, 대상체로부터 얻은 T 세포가 LVV에 의해 형질도입되고 LVV가 보유하는 전이유전자에 의해 암호화된 CAR을 발현하도록 T 세포는 LVV와 접촉하여 배치된다. 일부 실시형태에서, 농후화 및/또는 고갈 단계 후, 대상체로부터 얻은 NK 세포가 LVV에 의해 형질도입되고 LVV가 보유하는 전이유전자에 의해 암호화된 CAR을 발현하도록 NK 세포는 LVV와 접촉하여 배치된다. 일부 실시형태에서, 농후화 및/또는 고갈 단계 후, 대상체로부터 얻은 B 세포가 LVV에 의해 형질도입되고 LVV가 보유하는 전이유전자에 의해 암호화된 CAR을 발현하도록 B 세포는 LVV와 접촉하여 배치된다.
일반적으로, 휴지 T 세포, 예컨대 휴지 CD4 및 CD8 림프구, 휴지 B 세포 및 휴지 NK 세포는 렌티바이러스 벡터에 의한 유전 형질도입에 불응성이다. 정지 T 세포 또는 미경험 T 세포로도 알려진 휴지 T 세포는 유사분열상 활성이 아니거나 항원 제시 세포, 예컨대 대식세포 또는 수지상 세포에서 제시된 동족 항원에 노출되지 않은 T 세포를 지칭한다. 휴지 T 세포에 대한 마커의 예는 CD28이다. 대안적으로, 휴지 T 세포가 아니라 활성화된 T 세포에서 발현된 마커는 예를 들면 4-1BB, PD-1 및 HLA-DR을 포함한다. 유사하게, 휴지 B 세포 및 휴지 NK 세포는 각각 유사분열상 활성이 아니거나 동족 항원에 노출되지 않은 B 세포 및 NK 세포를 지칭한다. 휴지 B 세포에 대한 마커의 예는 CD21 및 CD23, 및 CD80, CD86, CD95 또는 CD25의 부재를 포함한다. 활성화된 NK 세포에서 발현된 CD137 및 GITR은 휴지 NK 세포에서 부재한다. 그 결과, 렌티바이러스 벡터를 사용한 T 세포, B 세포 또는 NK 세포의 형질도입을 수월하게 하기 위해, T 세포, B 세포 또는 NK 세포는 통상적으로 렌티바이러스 벡터를 통한 유전 변형이 발생할 수 있기 전에 자극 시약을 사용하여 시험관내 활성화된다. 자극 및 형질도입 후, 유전 변형된 세포는 이후 통상적으로 시험관내 확장되고 후속하여 환자로 재도입된다. 그러나, 본원에 기재된 LVV는 휴지 T 세포, B 세포 및/또는 휴지 NK 세포를 형질도입할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 본 설명에 따라 LVV에 의해 T 세포를 형질도입하는 방법은 LVV를 T 세포의 집단과 접촉하게 두는 것을 포함하고, 여기서 T 세포는 활성화되지 않고 T 세포는 형질도입 과정 동안 외인성 자극제에 노출되지 않는다. 일부 이러한 실시형태에서, T 세포가 활성화되지 않고 T 세포가 형질도입 과정 동안 외인성 자극제에 노출되지 않은 T 세포를 형질도입하는 방법은 CD80 표적화 단백질, 항-CD3 표적화 단백질 또는 CD80 표적화 단백질과 항-CD3 표적화 단백질 둘 다를 포함하는 LVV에 의해 T 세포를 형질도입하는 것을 포함한다. 외인성 T 세포 자극제의 예는 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편(즉, LVV의 부분이 아닌 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편), 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편(즉, LVV의 부분이 아닌 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편), 항-CD2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, IL-2, IL-7, IL-15, PHA 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 외인성 자극제는 가용성 형태의 T 세포와 접촉되거나 고체 기질, 예컨대 비드 또는 세포 배양 플레이트에서 부동화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체 둘 다 또는 이의 항원 결합 단편은 가용성 형태의 T 세포와 접촉되거나 고체 기질에 부동화된다. 항-CD3 항체의 예는 OKT3, UCTH1 및 BW264/56을 포함한다. 항-CD2 항체의 예는 LT2이다. 항-CD28 항체의 예는 15E8이다. 소정의 실시형태에서, 본 설명에 따라 LVV에 의해 NK 세포를 형질도입하는 방법은 LVV를 NK 세포의 집단과 접촉하게 두는 것을 포함하고, 여기서 NK 세포는 활성화되지 않고, NK 세포는 형질도입 과정 동안 외인성 자극제에 노출되지 않는다. 외인성 NK 세포 자극제의 예는 항-CD2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD335 항체 또는 이의 항원 결합 단편, IL-2, IL-15, IL-12, IL-18, IL-21 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 본 설명에 따라 LVV에 의해 B 세포를 형질도입하는 방법은 LVV를 B 세포의 집단과 접촉하게 두는 것을 포함하고, 여기서 B 세포는 활성화되지 않고 B 세포는 형질도입 과정 동안 외인성 자극제에 노출되지 않는다. 외인성 B 세포 자극제의 예는 CD154 및 혼합 Ig F(ab)2를 포함한다.
일부 실시형태에서, CD80 표적화 단백질 및 항-CD3 표적화 단백질을 갖는 렌티바이러스 벡터는 표준 LVV와 비교하여 CD4 및 CD8 T 세포 둘 다를 효과적으로 형질도입할 수 있다.
일부 실시형태에서, CD80 표적화 단백질 및 항-CD3 표적화 단백질을 갖는 렌티바이러스 벡터는 외인성 자극으로 처리된 표준 LVV에 의해 형질도입된 T 세포와 필적하는 수준으로 외인성 자극(예를 들면, T 세포 자극제)이 없는 T 세포를 활성화할 수 있다. 외인성 T 세포 자극제의 예는 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편(즉, LVV의 부분이 아닌 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편), 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편(즉, LVV의 부분이 아닌 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편), 항-CD2 항체 또는 이의 항원 결합 단편, IL-2, IL-7, IL-15, PHA 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 설명에 따른 LVV에 의해 T 세포를 형질도입하는 방법은 표준 LVV와 비교하여 CD4 T 세포의 향상된 형질도입을 나타낸다. 일부 이러한 실시형태에서, (예를 들면, CD4 및 CD8 T 세포로 이루어진) T 세포의 혼합 집단에서 CD4 T 세포의 형질도입을 향상시키는 방법은 CD80 표적화 단백질을 포함하는 본 설명에 따른 LVV에 의해 T 세포의 혼합 집단을 형질도입하는 것을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 설명에 따른 LVV에 의해 T 세포를 형질도입하는 방법은 CD4 및 CD8 T 세포 둘 다를 효과적으로 형질도입한다. 일부 이러한 실시형태에서, CD4 및 CD8 T 세포 둘 다가 효과적으로 형질도입되는 T 세포를 형질도입하는 방법은 CD80 표적화 단백질 및 항-CD3 표적화 단백질을 포함하는 LVV에 의해 T 세포를 형질도입하는 것을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 본 설명에 따른 LVV는 "스트레스" 조건 하에, 예를 들면 낮은 다중 감염도(MOI)에서 또는 형질도입 동안 외인성 IL-2에 의한 처리 없이 T 세포를 형질도입할 수 있다. 일부 실시형태에서, LVV는 CD80 표적화 단백질 및 항-CD3 표적화 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 설명에 따른 LVV는 비림프구 표적화 LVV보다 약 5배 내지 약 25배보다 낮은 LVV 농도에서 T 세포를 형질도입할 수 있다.
숙주 세포에서의 CAR 분자의 발현은 당해 분야에 알려진 방법, 예컨대 CAR 결합 도메인에 대한 형광 표지된 항원에 의한 염색 후에 정량적 PCR 또는 유세포분석법에 의해 평가될 수 있다.
숙주 세포에서의 CAR 분자의 발현은 T 세포 결합, 활성화 또는 유도의 결정을 포함하고 또한 항원 특이적인 T 세포 반응의 결정을 포함하는 숙주 T 세포 활성을 분석하기 위한 임의의 다수의 분야 인정된 방법론에 따라 기능적으로 규명될 수 있다. 예는 T 세포 증식, T 세포 사이토카인 방출, 항원 특이적 T 세포 자극, (예를 들면, 예비 로딩된 표적 세포로부터의 51Cr 또는 유로퓸 방출의 검출, 표적 세포에서 카스파제 활성의 유도, 표적 세포에 의한 락테이트 탈수소효소의 세포외 방출에 의한) CTL 활성, T 세포 표현형 마커 발현의 변경 및 T 세포 기능의 다른 측정치를 포함한다. 숙주 NK 세포 활성의 분석은 또한 유사한 방법론을 사용하여 분석될 수 있다. 이들 분석 및 유사한 분석을 수행하는 절차는 예를 들면 Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998)에서 찾아볼 수 있다. 또한, Current Protocols in Immunology; Weir, Handbook of Experimental Immunology, Blackwell Scientific, Boston, MA (1986); Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, Freeman Publishing, San Francisco, CA (1979); Green and Reed, Science 281:1309 (1998) 및 여기에 인용된 참고문헌을 참조한다. 사이토카인 수준은 예를 들면, ELISA, ELISPOT, 세포내 사이토카인 염색, 유세포분석법 및 이들의 임의의 조합(예를 들면, 세포내 사이토카인 염색 및 유세포분석법)을 포함하는 당해 분야에 알려진 방법에 따라 결정될 수 있다. 면역 세포 증식 및 항원 특이적 유발로부터 생긴 클론 팽창 또는 면역 반응의 자극은 말초혈 세포 또는 림프절로부터의 세포의 샘플에서 림프구, 예컨대 순환 림프구를 단리하는 것, 세포를 항원에 의해 자극하는 것 및 예컨대 삼중수소화된 티미딘의 혼입 또는 비방사능 검정과 같은 MTT 검정 및 기타에 의해 사이토카인 생성, 세포 증식 및/또는 세포 생존능력을 측정하는 것에 의해 결정될 수 있다.
치료를 위한 방법 및 조성물
일 양태에서, 본 개시내용은 유효량의 본원에 기재된 것과 같은 LVV, 본원에 기재된 것과 같은 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포) 또는 이의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 또 다른 양태에서, 본 설명에 따른 대상체에서 질환을 치료하는 방법은 하나 이상의 추가 치료제와 조합하여 유효량의 본원에 기재된 것과 같은 LVV, 본원에 기재된 것과 같은 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포) 또는 이의 약학 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
본 설명에 따른 LVV 또는 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)에 의해 치료될 수 있는 질환은 암을 포함한다. 입양 면역 및 유전자 치료는 다양한 암 유형(Morgan 등, Science 314:126, 2006; Schmitt 등, Hum. Gene Ther. 20:1240, 2009; June, J. Clin. Invest. 117:1466, 2007) 및 감염성 질환(Kitchen 등, PLoS One 4:38208, 2009; Rossi 등, Nat. Biotechnol. 25:1444, 2007; Zhang 등, PLoS Pathog. 6:e1001018, 2010; Luo 등, J. Mol. Med. 89:903, 2011)에 대한 유망한 치료이다.
고형 종양 및 백혈병을 포함하는 매우 다양한 암은 본원에 개시된 조성물 및 방법에 수정 가능하다. 본원에 기재된 수용체, 변형된 숙주 세포 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 예시적인 암은 유방, 전립선 및 결장의 선암종; 폐의 기관지 암종의 모든 유형; 골수성 백혈병; 흑색종; 간세포종; 신경모세포종; 유두종; 아푸도마; 분리종; 새종; 악성 카르시노이드 증후군; 카르시노이드 심장 질환; 및 암종(예를 들면, 왈커(Walker), 기저 세포, 기저편평, 브라운-피어스(Brown-Pearce), 유관, 에를리히(Ehrlich) 종양, 크렙스(Krebs) 2, 메르켈 세포, 점액성, 비소세포 폐, 귀리 세포, 유두성, 경성, 세기관지, 기관지, 편평 세포 및 이행 세포)을 포함한다. 본원에 기재된 수용체, 변형된 숙주 세포 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 암의 추가 유형은 조직구성 장애; 악성 조직구증; 백혈병; 호지킨병; 면역증식성 소형; 비호지킨 림프종; 형질세포종; 다발성 골수종; 만성 골수성 백혈병(CML); 급성 골수성 백혈병(AML); 형질세포종; 세망내피증; 흑색종; 연골모세포종; 연골종; 연골육종; 섬유종; 섬유육종; 거대 세포 종양; 조직구종; 지방종; 지방육종; 중피종; 점액종; 점액육종; 골종; 골육종; 연골종; 두개인두종; 난소고환종; 과오종; 중간엽종; 중신종; 근육종; 법랑모세포종; 시멘트종; 치아종; 기형종; 흉선종; 영양막 종양을 포함한다. 추가로, 하기 암 유형은 또한 본원에 기재된 수용체, 변형된 숙주 세포 및 조성물을 사용한 치료에 수정 가능한 것으로 또한 고려된다: 선암; 담관종; 진주종; 원주종; 낭샘암종; 낭선종; 입상 세포 종양; 음양모세포종; 간세포종; 한관종; 췌도 세포 종양; 라이디히 세포 종양; 유두종; 세르톨리 세포 종양; 난포막 세포 종양; 평활근종; 평활근육종; 근아세포종; 근종; 근육종; 횡문근종; 횡문근육종; 상의세포종; 신경절신경종; 신경교종; 수모세포종; 뇌수막종; 신경집종; 신경모세포종; 신경상피종; 신경섬유종; 신경종; 부신경절종; 비크롬친화성 부신경절종. 치료될 수 있는 암 유형은 또한 혈관각화종; 호산구증가증을 동반한 혈관림프성 과형성; 경화 혈관종; 혈관종증; 사구맥관종; 혈관내피종; 혈관종; 혈관주위세포종; 혈관육종; 림프관종; 림프관근종; 림프관육종; 송과체부종양; 암육종; 연골육종; 엽상낭육종; 섬유육종; 혈관육종; 평활근육종; 백혈육종; 지방육종; 림프관육종; 근육종; 점액육종; 난소 암종; 횡문근육종; 육종; 신생물; 신경섬유종증; 자궁경부 이형성증 및 복막암을 포함한다.
본원에 기재된 수용체, 변형된 숙주 세포 및 조성물을 사용하여 치료에 수정 가능한 과증식성 장애의 예는 B-세포 림프종(예컨대, 호지킨병, 비호지킨 림프종(NHL) 또는 중추 신경계 림프종의 다양한 형태)을 포함하는 B-세포 암(B-세포 악성상태), 백혈병(예컨대, 급성 림프아구성 백혈병(ALL), 만성 림프성 백혈병(CLL), 모발 세포 백혈병, 만성 골수성 백혈병의 B 세포 아구 변환, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병) 및 골수종(예컨대, 다발성 골수종)을 포함한다. 본원에 기재된 수용체, 변형된 숙주 세포 및 조성물을 사용하여 치료될 수 있는 추가 B 세포 암은 소형 림프구성 림프종, B-세포 전림프구성 백혈병, 림프형질세포 림프종, 비장 변연계 림프종, 혈장 세포 골수종, 골의 고립성 형질세포종, 골외 형질세포종, 점막 연관 림프성 조직의 결절외 변연계 B-세포 림프종(MALT), 결절 변연계 B-세포 림프종, 소포성 림프종, 외투 세포 림프종, 미만성 대형 B-세포 림프종, 종격(흉선) 대형 B-세포 림프종, 혈관내 대형 B-세포 림프종, 원발성 삼출 림프종, 버킷 림프종/백혈병, 불확실한 악성 잠재성의 B-세포 증식, 림프종모양 육아종증 및 이식후 림프증식성 장애를 포함한다.
본원에 개시된 조성물에 포함되고 대상체에게 투여되는 CAR 변형된 림프구는 CAR 변형된 T 세포, 예를 들면 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, 자연 살해 T 세포, 감마 델타 T 세포 또는 MAIT 세포; CAR 변형된 B 세포 또는 CAR 변형된 NK 세포를 포함할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 대상체를 치료하는 방법은 본 개시내용에 따라 유효량의 본원에 기재된 것과 같은 LVV 또는 CAR 변형된 림프구(즉, 하나 이상의 CAR을 발현하는 재조합 세포)를 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR 변형된 T 세포는 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, CAR 변형된 NK 세포는 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, CAR 변형된 B 세포는 대상체에게 투여된다. CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)는 대상체에게 이종발생성, 동계, 동종이계 또는 자가일 수 있다.
LVV 또는 CAR 조작된 림프구를 포함하는 약학 조성물은 의학 분야의 숙련자에 의해 결정된 것과 같이 치료되는(또는 예방되는) 질환 또는 병태에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 조성물의 적절한 용량, 적합한 지속기간 및 투여 빈도는 환자의 병태, 몸짓, 체중, 체표면적, 연령, 성별, 질환의 유형 및 중증도, 투여되는 특정한 치료제, 활성 성분의 특정한 형태, 투여 시간 및 방법 및 동시에 투여되는 다른 약물과 같은 인자에 의해 결정될 것이다. 본 개시내용은 LVV 또는 CAR 변형된 림프구 및 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 적합한 부형제는 물, 식염수, 덱스트로스, 글리세롤 또는 기타 및 이들의 조합을 포함한다. 다른 적합한 점적 매질은 식염수, Normosol R(Abbott), Plasma-Lyte A(Baxter), 물 중의 5% 덱스트로스 또는 링거(Ringer)의 락테이트를 포함하는 임의의 등장성 매질 제형일 수 있다.
약학 조성물에서 조작된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)의 치료 유효량은 적어도 하나의 세포(예를 들면, 하나의 CAR 변형된 T 세포)이고, 더 통상적으로 102 초과의 세포, 예를 들면, 최대 106, 최대 107, 최대 108의 세포, 최대 109의 세포, 최대 1010의 세포 또는 최대 1011 이상의 세포이다. 소정의 실시형태에서, 세포는 약 106 내지 약 1010개 세포/m2의 범위, 바람직하게는 약 107 내지 약 109개 세포/m2의 범위로 투여된다. 세포의 수는 조성물이 의도되는 궁극적인 용도뿐만 아니라 여기에 포함된 세포의 유형에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, CAR을 함유하도록 변형된 T 세포를 포함하는 조성물은 이러한 세포의 약 5% 내지 약 95% 또는 초과를 함유하는 T 세포 집단을 포함할 것이다. 소정의 실시형태에서, CAR 변형된 T 세포를 포함하는 조성물은 이러한 세포의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 초과를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 소정의 실시형태에서, CAR 변형된 NK 세포를 포함하는 조성물은 이러한 세포의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 초과를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 소정의 실시형태에서, CAR 변형된 B 세포를 포함하는 조성물은 이러한 세포의 적어도 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 초과를 포함하는 세포 집단을 포함한다. 본원에 제공된 용도를 위해, 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)는 일반적으로 500 ml 또는 미만, 250 ml 또는 미만 또는 100 ml 또는 미만의 역가의 부피이다. 그러므로 원하는 세포의 밀도는 통상적으로 104개 세포/ml 초과이고, 일반적으로 107개 세포/ml 초과, 일반적으로 108개 세포/ml 또는 초과이다. 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)는 단일 점적으로서 또는 시간의 범위에 걸쳐 다수의 점적에서 투여될 수 있다. CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)의 반복 점적은 질환 또는 질환 활성의 재발이 존재하면 일, 주, 달 또는 심지어 년에 의해 분리될 수 있다. 면역 세포의 임상적으로 관련된 수는 누적으로 106개, 107개, 108개, 109개, 1010개 또는 1011개 세포와 동등하거나 이를 초과하는 다수의 점적으로 나눠질 수 있다. 본원에 기재된 것과 같은 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포의 투여를 위한 바람직한 용량은 약 107개 세포/m2, 약 5 x 107개 세포/m2, 약 108개 세포/m2, 약 5 x 108개 세포/m2, 약 109개 세포/m2, 약 5 x 109개 세포/m2, 약 1010개 세포/m2, 약 5 x 1010개 세포/m2 또는 약 1011개 세포/m2이다.
본원에 기재된 것과 같은 LVV 및/또는 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포) 조성물은 대상체에게 정맥내로, 복강내로, 종양내로, 골수로(예를 들면, 골내 투여), 림프절로(림프절내) 및/또는 뇌척수액으로 투여될 수 있다.
LVV 벡터 및/또는 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포) 조성물은 하나 이상의 추가 치료제와 조합되어 대상체에게 투여될 수 있다. 본 설명에 따른 LVV 벡터 또는 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포)와 조합되어 투여될 수 있는 치료제의 예는 방사선 치료, 입양 세포 면역치료제(예를 들면, 재조합 TCR, 향상된 친화도 TCR, CAR, TCR-CAR, scTCR 융합 단백질, 수지상 세포 백신), 항체 치료제, 면역 관문 분자 억제제 치료제, UV 광 치료, 전기 펄스 치료, 고강도 집중 초음파 치료, 세포용해 바이러스 치료제 또는 약학 치료제, 예컨대 화학치료제, 치료학적 펩타이드, 호르몬, 압타머, 항생제, 항바이러스제, 항진균제, 소염제, 소분자 치료제 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
방사선 치료는 외부 빔 방사선 치료(예를 들면, 종래의 외부 빔 방사선 치료, 정위 방사선, 3차원 등각 방사선 치료, 강도 변조 방사선 치료, 부피측정 변조 회전 치료, 입자 치료, 양성자 치료 및 오거 치료), 근접치료, 전신 방사성 동위원소 치료제, 수술중 방사선치료 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본원에 기재된 LVV 또는 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포) 조성물과 함께 사용될 수 있는 예시적인 항체는 리툭시맙, 페르투주맙, 트라스투주맙, 알렘투주맙, 이브리투모맙 툭세탄, 브렌툭시맙 베도틴, 세툭시맙, 베바시주맙, 아빅식시맙, 아달리무맙, 알레파셉트, 바실리지맙, 벨리무맙, 베즐로톡수맙, 카나키누맙, 세르톨리주맙 페골, 다클리주맙, 데노수맙, 에팔리주맙, 골리무맙, 올랄라투맙, 팔리비주맙, 파니투무맙 및 토실리주맙을 포함한다.
본원에 기재된 LVV 또는 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포) 조성물과 함께 사용될 수 있는 면역 관문 분자의 예시적인 억제제는 PD-L1, PD-L2, CD80, CD86, B7-H3, B7-H4, HVEM, 아데노신, GAL9, VISTA, CEACAM-1, CEACAM-3, CEACAM-5, PVRL2, PD-1, CTLA-4, BTLA, KIR, LAG3, TIM3, A2aR, CD244/2B4, CD160, TIGIT, LAIR-1, PVRIG/CD112R 또는 이들의 임의의 조합을 표적화하는 관문 억제제를 포함한다. 소정의 실시형태에서, 면역 관문 억제제는 항체, 펩타이드, RNAi 제제 또는 소분자일 수 있다. CTLA-4에 특이적인 항체는 이필리무맙 또는 트레멜리무맙일 수 있다. PD-1에 특이적인 항체는 피딜리주맙, 니볼루맙 또는 펨브롤리주맙일 수 있다. PD-L1에 특이적인 항체는 더발루맙, 아테졸리주맙 또는 아벨루맙일 수 있다.
본원에 기재된 LVV 또는 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포, B 세포 또는 NK 세포) 조성물과 함께 사용될 수 있는 예시적인 화학치료제는 알킬화제, 백금계 제제, 세포독성제, 염색질 기능의 억제제, 토포아이소머라제 억제제, 미세소관 억제 약물, DNA 손상제, 항대사물질(예컨대, 폴레이트 길항제, 피리미딘 유사체, 푸린 유사체 및 당 변형 유사체), DNA 합성 억제제, DNA 상호작용제(예컨대, 인터칼레이팅 제제) 및 DNA 회복 억제제를 포함할 수 있다.
본원에 언급된 것처럼, 화학치료제는 유사분열 또는 세포 분열을 억제하는 비특이적 세포독성제뿐만 아니라 종양 성장, 진행 및 전이에 관여된 특이적 분자를 표적화하여서 암 세포의 성장 및 확산을 차단하는 분자로 표적화된 치료제(예를 들면, 종양유전자)를 포함한다. 본원에 기재된 발현 카세트 조성물과 함께 사용하기 위한 예시적인 비특이적 화학치료제는 알킬화제, 백금계 제제, 세포독성제, 염색질 기능의 억제제, 토포아이소머라제 억제제, 미세소관 억제 약물, DNA 손상제, 항대사물질(예컨대, 폴레이트 길항제, 피리미딘 유사체, 푸린 유사체 및 당 변형 유사체), DNA 합성 억제제, DNA 상호작용제(예컨대, 인터칼레이팅 제제) 및 DNA 회복 억제제를 포함할 수 있다.
본원에서 고려되는 조합 치료제에 사용하기 위해 여겨되는 화학치료제의 예는 베무라페닙, 다브라페닙, 트라메티닙, 코비메티닙, 아나스트로졸(Arimidex®), 비칼루타미드(Casodex®), 블레오마이신 설페이트(Blenoxane®), 부술판(Myleran®), 부술판 주사(Busulfex®), 카페시타빈(Xeloda®), N4-펜톡시카보닐-5-데옥시-5-플루오로시티딘, 카보플라틴(Paraplatin®), 카르무스틴(BiCNU®), 클로르암부실(Leukeran®), 시스플라틴(Platinol®), 클라드리빈(Leustatin®), 사이클로포스파미드(Cytoxan® 또는 Neosar®), 시타라빈, 시토신 아라비노사이드(Cytosar-U®), 시타라빈 리포솜 주사(DepoCyt®), 다카르바진(DTIC-Dome®), 닥티노마이신(Actinomycin D, Cosmegan), 다우노루비신 하이드로클로라이드(Cerubidine®), 다우노루비신 시트레이트 리포솜 주사(DaunoXome®), 덱사메타손, 도세탁셀(Taxotere®), 독소루비신 하이드로클로라이드(Adriamycin®, Rubex®), 에토포사이드(Vepesid®), 플루다라빈 포스페이트(Fludara®), 5-플루오로우라실(Adrucil®, Efudex®), 플루타미드(Eulexin®), 테자시티빈, 겜시타빈(디플루오로데옥시시티딘), 하이드록시우레아(Hydrea®), 이다루비신(Idamycin®), 이포스파미드(IFEX®), 이리노테칸(Camptosar®), L-아스파라기나제(ELSPAR®), 류코보린 칼슘, 멜팔란(Alkeran®), 6-머캅토푸린(Purinethol®), 메토트렉세이트(Folex®), 미톡산트론(Novantrone®), 메이로타르그, 파클리탁셀(Taxol®), 페닉스(이트륨90/MX-DTPA), 펜토스타틴, 카르무스틴 이식물과 함께 폴리페프로산 20(Gliadel®), 프다브라(fdabra) 타목시펜 시트레이트(Nolvadex®), 테니포사이드(Vumon®), 6-티오구아닌, 티오테파, 티라파자민(Tirazone®), 주사용 토포테칸 하이드로클로라이드(Hycamptin®), 빈블라스틴(Velban®), 빈크리스틴(Oncovin®), 이브루티닙, 베네토클락스, 크리조티닙, 알렉티닙, 브리가티닙, 세리티닙 및 비노렐빈(Navelbine®)을 포함한다.
본원에서 고려되는 조합 치료제에 사용하기 위한 예시적인 알킬화제는 질소 머스타드, 에틸렌이민 유도체, 알킬 설포네이트, 니트로소우레아 및 트리아젠): 우라실 머스타드(Aminouracil Mustard®, Chlorethaminacil®, Demethyldopan®, Desmethyldopan®, Haemanthamine®, Nordopan®, Uracil nitrogen Mustard®, Uracillost®, Uracilmostaza®, Uramustin®, Uramustine®), 클로르메틴(Mustargen®), 사이클로포스파미드(Cytoxan®, Neosar®, Clafen®, Endoxan®, Procytox®, Revimmune™), 이포스파미드(Mitoxana®), 멜팔란(Alkeran®), 클로르암부실(Leukeran®), 피포브로만(Amedel®, Vercyte®), 트리에틸렌멜라민(Hemel®, Hexalen®, Hexastat®), 트리에틸렌티오포스포라민, 테모졸로마이드(Temodar®), 티오테파(Thioplex®), 부술판(Busilvex®, Myleran®), 카르무스틴(BiCNU®), 로무스틴(CeeNU®), 스트렙토조신(Zanosar®) 및 다카르바진(DTIC-Dome®)을 포함한다. 본원에서 고려되는 조합 치료제에 사용하기 위한 추가의 예시적인 알킬화제는 제한 없이 옥살리플라틴(Eloxatin®); 테모졸로마이드(Temodar® 및 Temodal®); 닥티노마이신(악티노마이신-D로도 알려짐, Cosmegen®); 멜팔란(L-PAM, L-사르콜리신 및 페닐알라닌 머스타드로도 알려짐, Alkeran®); 알트레타민(헥사메틸멜라민(HMM)으로도 알려짐, Hexalen®); 카르무스틴(BiCNU®); 벤다무스틴(Treanda®); 부술판(Busulfex® 및 Myleran®); 카보플라틴(Paraplatin®); 로무스틴(CCNU로도 알려짐, CeeNU®); 시스플라틴(CDDP로도 알려짐, Platinol® 및 Platinol®-AQ); 클로르암부실(Leukeran®); 사이클로포스파미드(Cytoxan® 및 Neosar®); 다카르바진(DTIC, DIC 및 이미다졸 카복사미드로도 알려짐, DTIC-Dome®); 알트레타민(헥사메틸멜라민(HMM)으로도 알려짐, Hexalen®); 이포스파미드(Ifex®); 프레드누무스틴; 프로카바진(Matulane®); 메클로르에타민(질소 머스타드, 무스틴 및 메클로로에타민 하이드로클로라이드로도 알려짐, Mustargen®); 스트렙토조신(Zanosar®); 티오테파(티오포스포아미드, TESPA 및 TSPA로도 알려짐, Thioplex®); 사이클로포스파미드(Endoxan®, Cytoxan®, Neosar®, Procytox®, Revimmune®); 및 벤다무스틴 HCl(Treanda®)을 포함한다.
본원에서 고려되는 조합 치료제에 사용하기 위한 예시적인 백금계 제제는 카보플라틴, 시스플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 피코플라틴, 사트라플라틴, 페난트리플라틴 및 트리플라틴 테트라니트레이트를 포함한다.
조합 치료제와 사용하기 위한 예시적인 저메틸화제는 아자시티딘 및 데시타빈을 포함한다.
본원에서 고려되는 조합 치료제와 사용하기 위한 예시적인 분자로 표적화된 억제제는 예를 들면 수용체 티로신 키나제 억제제, RAF 억제제, BCL-2 억제제, ABL 억제제, TRK 억제제, c-KIT 억제제, c-MET 억제제, CDK4/6 억제제, FAK 억제제, FGFR 억제제, FLT3 억제제, IDH1 억제제, IDH2 억제제, PDGFRA 억제제 및 RET 억제제를 포함하는 암 세포 성장 및 생존에 관여된 분자를 표적화하는 소분자를 포함한다.
예시적인 분자로 표적화된 치료제는 호르몬 길항제, 신호 전달 억제제, 유전자 발현 억제제(예를 들면, 번역 억제제), 아폽토시스 유도제, 혈관신생 억제제(예를 들면, VEGF 경로 억제제), 티로신 키나제 억제제(예를 들면, EGF/EGFR 경로 억제제), 성장 인자 억제제, GTPase 억제제, 세린/트레오닌 키나제 억제제, 전사 인자 억제제, 암과 연관된 유발자 돌연변이의 억제제, B-Raf 억제제, RAF 억제제, MEK 억제제, mTOR 억제제, 아데노신 경로 억제제, EGFR 억제제, PI3K 억제제, BCL2 억제제, VEGFR 억제제, MET 억제제, MYC 억제제, BCR-ABL 억제제, ABL 억제제, HER2 억제제, H-RAS 억제제, K-RAS 억제제, PDGFR 억제제, ALK 억제제, ROS1 억제제, BTK 억제제, TRK 억제제, c-KIT 억제제, c-MET 억제제, CDK4/6 억제제, FAK 억제제, FGFR 억제제, FLT3 억제제, IDH1 억제제, IDH2 억제제, PARP 억제제, PARP 억제제, PDGFRA 억제제 및 RET 억제제를 포함한다.
예시적인 혈관신생 억제제는 제한 없이 A6(Angstrom Pharmaceuticals), ABT-510(Abbott Laboratories), ABT-627(안트라센탄)(Abbott Laboratories/Xinlay), ABT-869(Abbott Laboratories), 악티미드(CC4047, 포말리도마이드)(Celgene Corporation), AdGVPEDF.11D(GenVec), ADH-1(엑스헤린)(Adherex Technologies), AEE788(Novartis), AG-013736(악시티닙)(Pfizer), AG3340(프리노마스타트)(Agouron Pharmaceuticals), AGX1053(AngioGenex), AGX51(AngioGenex), ALN-VSP(ALN-VSP O2)(Alnylam Pharmaceuticals), AMG 386(Amgen), AMG706(Amgen), 아파티닙(YN968D1)(Jiangsu Hengrui Medicine), AP23573(리다포롤리무스/MK8669)(Ariad Pharmaceuticals), AQ4N(Novavea), ARQ 197(ArQule), ASA404(Novartis/안티소마), 악티프리모드(Callisto Pharmaceuticals), ATN-161(아테누온(Attenuon)), AV-412(Aveo Pharmaceuticals), AV-951(Aveo Pharmaceuticals), 아바스틴(베바시주맙)(Genentech), AZD2171(세디라닙/레센틴)(AstraZeneca), BAY 57-9352(텔라티닙)(Bayer), BEZ235(Novartis), BIBF1120(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals), BIBW 2992(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals), BMS-275291(Bristol-Myers Squibb), BMS-582664(브리바닙)(Bristol-Myers Squibb), BMS-690514(Bristol-Myers Squibb), 칼시트리올, CCI-779(토리셀)(Wyeth), CDP-791(ImClone Systems), Ceflatonin(Homoharringtonine/HHT)(ChemGenex Therapeutics), 셀레브렉스(Celebrex)(셀레콕시브)(Pfizer), CEP-7055(세팔론/Sanofi), CHIR-265(Chiron Corporation), NGR-TNF, COL-3(메타스타트)(Collagenex Pharmaceuticals), 콤브레타스타틴(Oxigene), CP-751,871(필기투무맙)(Pfizer), CP-547,632(Pfizer), CS-7017(Daiichi Sankyo Pharma), CT-322(안지오셉트(Angiocept))(Adnexus), 커큐민, 달테파린(프라그민)(Pfizer), 디설피람(Antabuse), E7820(Eisai Limited), E7080(Eisai Limited), EMD 121974(실렌지타이드)(EMD Pharmaceuticals), ENMD-1198(EntreMed), ENMD-2076(EntreMed), Endostar(Simcere), Erbitux(ImClone/Bristol-Myers Squibb), EZN-2208(Enzon Pharmaceuticals), EZN-2968(Enzon Pharmaceuticals), GC1008(Genzyme), 제니스테인, GSK1363089(포레티닙)(GlaxoSmithKline), GW786034(파조파닙)(GlaxoSmithKline), GT-111(Vascular Biogenics Ltd.), IMC-1121B(라무시루맙)(ImClone Systems), IMC-18F1(ImClone Systems), IMC-3G3(ImClone LLC), INCB007839(Incyte Corporation), INGN 241(Introgen Therapeutics), Iressa(ZD1839/게피티닙), LBH589(Faridak/파노비노스타트)(Novartis), Lucentis(라니비주맙)(Genentech/Novartis), LY317615(엔자스타우린)(Eli Lilly and Company), Macugen(페갑타닙)(Pfizer), MEDI522(아베그린(Abegrin))(MedImmune), MLN518(탄두티닙)(Millennium), 네오바스타트(AE941/베네핀(Benefin))(Aeterna Zentaris), 넥사바(Bayer/Onyx), NM-3(Genzyme Corporation), 노스카핀(Cougar Biotechnology), NPI-2358(Nereus Pharmaceuticals), OSI-930(OSI), Palomid 529(Paloma Pharmaceuticals, Inc.), 판젬 캡슐(2ME2)(EntreMed), Panzem NCD(2ME2)(EntreMed), PF-02341066(Pfizer), PF-04554878(Pfizer), PI-88(Progen Industries/Medigen Biotechnology), PKC412(Novartis), Polyphenon E(녹차 추출물)(Polypheno E International, Inc.), PPI-2458(Praecis Pharmaceuticals), PTC299(PTC Therapeutics), PTK787(바탈라닙)(Novartis), PXD101(벨리노스타트)(CuraGen Corporation), RAD001(에버롤리무스)(Novartis), RAF265(Novartis), 레고라페닙(BAY73-4506)(Bayer), 레블리미드(Celgene), 레탄(Alcon Research), SN38(리포솜)(Neopharm), SNS-032(BMS-387032)(Sunesis), SOM230(파시레오타이드(Pasireotide))(Novartis), 스쿠알라민(Genaera), 수라민, 수텐트(Sutent)(Pfizer), 타쎄바(Genentech), TB-403(Thrombogenics), 템포스타틴(Collard BioPharmaceuticals), 테트라티오몰리브데이트(Sigma-Aldrich), TG100801(TargeGen), 탈리도마이드(Celgene Corporation), 틴자파린 나트륨, TKI258(Novartis), TRC093(Tracon Pharmaceuticals Inc.), VEGF Trap(아플리베르셉트)(Regeneron Pharmaceuticals), VEGF Trap-Eye(Regeneron Pharmaceuticals), 베글린(VasGene Therapeutics), 보르테조밉(Millennium), XL184(Exelixis), XL647(Exelixis), XL784(Exelixis), XL820(Exelixis), XL999(Exelixis), ZD6474(AstraZeneca), 보리토스타트(Merck) 및 ZSTK474를 포함한다.
예시적인 B-Raf 억제제는 베무라페닙, 다브라페닙 및 엔코라페닙을 포함한다.
예시적인 MEK 억제제는 비니메티닙, 코비메티닙, 레파메티닙, 셀루메티닙 및 트라메티닙을 포함한다.
예시적인 BTK 억제제는 이브루티닙, Loxo-305, 티라브루티닙, GDC-0853, 아칼라브루티닙, ONO-4059, 스페브루티닙, BGB-3111, HM71224 및 M7583을 포함한다.
예시적인 TRK 억제제는 엔트렉티닙, 라로트렉티닙, CH7057288, ONO-7579, LOXO-101, 레스타우르티닙 및 LOXO-195를 포함한다.
예시적인 c-KIT 억제제는 이마티닙, 수니티닙 및 포나티닙을 포함한다.
예시적인 c-MET 억제제는 카프마티닙, 크리조티닙, 티반티닙, 오나르투주맙, INCB28060, AMG-458, 사볼리티닙 및 테포티닙을 포함한다.
예시적인 CDK4/6 억제제는 팔보시클립, 리보시클립, 아베마시클립 및 트릴라시클립을 포함한다.
예시적인 FAK 억제제는 데팍티닙, GSK2256098, BI853520 및 PF-00562271을 포함한다.
예시적인 FGFR 억제제는 에르다피티닙, 페미가티닙, 인피그라티닙, 로가라티닙, AZD4547, BGJ398, FP-1039 및 ARQ 087을 포함한다.
예시적인 FLT-3 억제제는 퀴자르티닙, 크레놀라닙, 길테리티닙, 미도스타우린 및 레스타우르티닙을 포함한다.
예시적인 IDH1 억제제는 이보시데닙, BAY-1436032 및 AGI-5198을 포함한다.
예시적인 IDH2 억제제는 에나시데닙을 포함한다.
예시적인 PARP 억제제는 탈라조파립, 니라파립, 루카파립, 올라파립, 벨리파립, CEP 9722, E7016, AG014699, MK4827, BMN-673 및 파미파립(BGB-290)을 포함한다.
예시적인 PDGFRA 억제제는 이마티닙, 레고라페닙, 크레놀라닙 및 올라라투맙을 포함한다.
예시적인 pan-RAF 억제제는 벨바라페닙, LXH254, LY3009120, INU-152 및 HM95573을 포함한다.
예시적인 RET 억제제는 렌바티닙, 알렉티닙, 반데타닙, 카보잔티닙, BLU-667 및 LOXO-292를 포함한다.
예시적인 ROS1 억제제는 세리티닙, 로라티닙, 엔트렉티닙, 크리조티닙, TPX-0005 및 DS-6051b를 포함한다.
예시적인 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체 억제제는 베바시주맙(Avastin®), 악시티닙(Inlyta®); 브리바닙 알라니네이트(BMS-582664, (S)―((R)-1-(4-(4-플루오로-2-메틸-1H-인돌-5-일옥시)-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일옥시)프로판-2-일)2-아미노프로파노에이트); 소라피닙(Nexavar®); 파조파닙(Votrient®); 수니티닙 말레에이트(Sutent®); 세디라닙(AZD2171, CAS 288383-20-1); 바가테프(BIBF1120, CAS 928326-83-4); 포레티닙(GSK1363089); 텔라티닙(BAY57-9352, CAS 332012-40-5); 아파티닙(YN968D1, CAS 811803-05-1); 이마티닙(Gleevec®); 포나티닙(AP24534, CAS 943319-70-8); 티보자닙(AV951, CAS 475108-18-0); 레고라페닙(BAY73-4506, CAS 755037-03-7); 바탈라닙 디하이드로클로라이드(PTK787, CAS 212141-51-0); 브리바닙(BMS-540215, CAS 649735-46-6); 반데타닙(Caprelsa® 또는 AZD6474); 모테사닙 디포스페이트(AMG706, CAS 857876-30-3, PCT 공보 WO 02/066470호에 기재된 N-(2,3-디하이드로-3,3-디메틸-1H-인돌-6-일)-2-[(4-피리디닐메틸)아미노]-3-피리딘카복사미드); 도비티닙 이락트산(TKI258, CAS 852433-84-2); 린파닙(ABT869, CAS 796967-16-3); 카보잔티닙(XL184, CAS 849217-68-1); 레스타우르티닙(CAS 111358-88-4); N-[5-[[[5-(1,1-디메틸에틸)-2-옥사졸릴]메틸]티오]-2-티아졸릴]-4-피페리딘카복사미드(BMS38703, CAS 345627-80-7); (3R,4R)-4-아미노-1-((4-((3-메톡시페닐)아미노)피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-5-일)메틸)피페리딘-3-올(BMS690514); N-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[[(3aα,5β,6aα)-옥타하이드로-2-메틸사이클로펜타[c]피롤-5-일]메톡시]-4-퀴나졸린아민(XL647, CAS 781613-23-8); 4-메틸-3-[[1-메틸-6-(3-피리디닐)-1H-피라졸로[3,4-d]피리미딘-4-일]아미노]-N-[3-(트리플루오로메틸)페닐]-벤자미드(BHG712, CAS 940310-85-0); 및 Aflibercept(Eylea®)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
예시적인 EGF 경로 억제제는 제한 없이 티포스틴 46, EKB-569, 에를로티닙(Tarceva®), 게피티닙(Iressa®), 얼비툭스, 니모투주맙, 라파티닙(Tykerb®), 세툭시맙(항-EGFR mAb), 188Re 표지된 니모투주맙(항-EGFR mAb) 및 WO 97/02266호, EP 0 564 409호, WO 99/03854호, EP 0 520 722호, EP 0 566 226호, EP 0 787 722호, EP 0 837 063호, 미국 특허 제5,747,498호, WO 98/10767호, WO 97/30034호, WO 97/49688호, WO 97/38983호 및 WO 96/33980호에 일반적으로 그리고 구체적으로 개시된 화합물을 포함한다. 예시적인 EGFR 항체는 세툭시맙(Erbitux®); 파니투무맙(Vectibix®); 마투주맙(EMD-72000); 트라스투주맙(Herceptin®); 니모투주맙(hR3); 잘루투주맙; TheraCIM h-R3; MDX0447(CAS 339151-96-1); 및 ch806(mAb-806, CAS 946414-09-1)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 예시적인 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 억제제는 에를로티닙 하이드로클로라이드(Tarceva®); 세리티닙; 브리가티닙; 오시메리티닙; 이코티닙; 게피티닙(Iressa®); N-[4-[(3-클로로-4-플루오로페닐)아미노]-7-[[(3"S")-테트라하이드로-3-푸라닐]옥시]-6-퀴나졸리닐]-4(디메틸아미노)-2-부텐아미드, Tovok®); 반데타닙(Caprelsa®); 라파티닙(Tykerb®); (3R,4R)-4-아미노-1-((4-((3-메톡시페닐)아미노)피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-5-일)메틸)피페리딘-3-올(BMS690514); 카네르티닙 디하이드로클로라이드(CI-1033); 6-[4-[(4-에틸-1-피페라지닐)메틸]페닐]-N-[(1R)-1-페닐에틸]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민(AEE788, CAS 497839-62-0); 무브리티닙(TAK165); 펠리티닙(EKB569); 아파티닙(BIBW2992); 네라티닙(HKI-272); N-[4-[[1-[(3-플루오로페닐)메틸]-1H-인다졸-5-일]아미노]-5-메틸피롤로[2,1-f][1,2,4]트리아진-6-일]-카밤산, (3S)-3-모르폴리닐메틸 에스테르(BMS599626); N-(3,4-디클로로-2-플루오로페닐)-6-메톡시-7-[[(3aα,5β,6aα)-옥타하이드로-2-메틸사이클로펜타[c]피롤-5-일]메톡시]-4-퀴나졸린아민(XL647, CAS 781613-23-8); 4-[4-[[(1R)-1-페닐에틸]아미노]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-6-일]-페놀(PKI166, CAS 187724-61-4); 로셀리티닙을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
예시적인 mTOR 억제제는 제한 없이 라파마이신(Rapamune®) 및 이의 유사체 및 유도체; SDZ-RAD; 템시롤리무스(Torisel®; CCI-779로도 알려짐); 리다포롤리무스(이전에 데페롤리무스, (1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-디하이드록시-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-2,3,10,14,20-펜타옥소-11,36-디옥사-4-아자트리사이클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-12-일]프로필]-2-메톡시사이클로헥실 디메틸포스피네이트, AP23573 및 MK8669로도 알려지고 PCT 공보 WO 03/064383호에 기재됨); 에버롤리무스(Afinitor® 또는 RAD001); 라파마이신(AY22989, Sirolimus®); 시나피모드(CAS 164301-51-3); (5-{2,4-비스[(3S)-3-메틸모르폴린-4-일]피리도[2,3-d]피리미딘-7-일}-2-메톡시페닐)메탄올(AZD8055); 2-아미노-8-[트랜스-4-(2-하이드록시에톡시)사이클로헥실]-6-(6-메톡시-3-피리디닐)-4-메틸-피리도[2,3-d]피리미딘-7(8H)-온(PF04691502, CAS 1013101-36-4); 및 N2-[1,4-디옥소-[[4-(4-옥소-8-페닐-4H-1-벤조피란-2-일)모르폴리늄-4-일]메톡시]부틸]-L-아르기닐글리실-L-α-아스파르틸 L-세린-, 내부 염(SF1126, CAS 936487-67-1)을 포함한다.
예시적인 포스포이노시타이드 3-키나제(PI3K) 억제제는 두벨리십, 이델랄리십, 4-[2-(1H-인다졸-4-일)-6-[[4-(메틸설포닐)피페라진-1-일]메틸]티에노[3,2-d]피리미딘-4-일]모르폴린(GDC 0941로도 알려져 있고 PCT 공보 WO 09/036082호 및 WO 09/055730호에 기재됨); 2-메틸-2-[4-[3-메틸-2-옥소-8-(퀴놀린-3-일)-2,3-디하이드로이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]페닐]프로피오니트릴(BEZ 235 또는 NVP-BEZ 235로도 알려져 있고 PCT 공보 WO 06/122806호에 기재됨); 4-(트리플루오로메틸)-5-(2,6-디모르폴리노피리미딘-4-일)피리딘-2-아민(BKM120 또는 NVP-BKM120으로도 알려져 있고 PCT 공보 WO2007/084786호에 기재됨); 토자세르티닙(VX680 또는 MK-0457, CAS 639089-54-6); (5Z)-5-[[4-(4-피리디닐)-6-퀴놀리닐]메틸렌]-2,4-티아졸리딘디온(GSK1059615, CAS 958852-01-2); (1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(아세틸옥시)-1-[(디-2-프로페닐아미노)메틸렌]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-옥타하이드로-11-하이드록시-4-(메톡시메틸)-4a,6a-디메틸-사이클로펜타[5,6]나프토[1,2-c]피란-2,7,10(1H)-트리온(PX866, CAS 502632-66-8); 및 8-페닐-2-(모르폴린-4-일)-크로멘-4-온(LY294002, CAS 154447-36-6)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
예시적인 단백질 키나제 B(PKB) 또는 AKT 억제제는 8-[4-(1-아미노사이클로부틸)페닐]-9-페닐-1,2,4-트리아졸로[3,4-f][1,6]나프티리딘-3(2H)-온(MK-2206, CAS 1032349-93-1); 페리포신(KRX0401); 4-도데실-N-1,3,4-티아디아졸-2-일-벤젠설폰아미드(PHT-427, CAS 1191951-57-1); 4-[2-(4-아미노-1,2,5-옥사디아졸-3-일)-1-에틸-7-[(3S)-3-피페리디닐메톡시]-1H-이미다졸[4,5-c]피리딘-4-일]-2-메틸-3-부틴-2-올(GSK690693, CAS 937174-76-0); 8-(1-하이드록시에틸)-2-메톡시-3-[(4-메톡시페닐)메톡시]-6H-디벤조[b,d]피란-6-온(팔로미드 529, P529 또는 SG-00529); 트리시르빈(6-아미노-4-메틸-8-(β-D-리보푸라노실)-4H,8H-피롤로[4,3,2-de]피리미도[4,5-c]피리다진); (αS)-α-[[[5-(3-메틸-1H-인다졸-5-일)-3-피리디닐]옥시]메틸]-벤젠에탄아민(A674563, CAS 552325-73-2); 4-[(4-클로로페닐)메틸]-1-(7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일)-4-피페리딘아민(CCT128930, CAS 885499-61-6); 4-(4-클로로페닐)-4-[4-(1H 피라졸-4-일)페닐]-피페리딘(AT7867, CAS 857531-00-1); 및 알켁신(RX-0201, CAS 663232-27-7)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
소정의 실시형태에서, LVV 또는 CAR 변형된 T 세포와 조합되어 사용된 티로신 키나제 억제제는 역형성 림프종 키나제(ALK) 억제제이다. 예시적인 ALK 억제제는 크리조티닙, 세리티닙, 알렉티닙, 브리가티닙, 달란테르셉트, 엔트렉티닙 및 로라티닙을 포함한다.
LVV 또는 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)가 하나 이상의 추가 치료제와 조합되어 투여되는 소정의 실시형태에서, LVV, CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포 또는 NK 세포) 또는 하나 이상의 추가 치료제는 단일요법으로 투여되면 달리 준치료학적으로 여겨지는 용량으로 투여될 수 있다. 조합 치료제는 추가 치료제 전에(예를 들면, 추가 치료제 전 1일 내지 30일 또는 초과), 추가 치료제와 동시에(동일한 일자에) 또는 추가 치료제 후에(예를 들면, 추가 치료제 후 1일 내지 30일 또는 초과) 본원에 기재된 것과 같은 LVV 또는 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포 또는 NK 세포) 조성물의 투여를 포함한다. 소정의 실시형태에서, LVV 또는 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)는 하나 이상의 추가 치료제와 동시에 투여된다. 추가의 실시형태에서, LVV 또는 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)는 하나 이상의 추가 치료제의 투여 전 또는 후 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일, 21일, 22일, 23일, 24일, 25일, 26일, 27일, 28일, 29일 또는 30일에 투여된다. 더 추가의 실시형태에서, LVV 또는 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)는 하나 이상의 추가 치료제의 투여 전 또는 후 4주 내, 3주 내, 2주 내 또는 1주 내 투여된다. 하나 이상의 추가 치료제가 다수의 용량을 수반하는 경우, LVV 또는 CAR 변형된 림프구(예를 들면, T 세포 또는 NK 세포)는 하나 이상의 추가 치료제의 초기 용량 전 또는 후, 하나 이상의 추가 치료제의 최종 용량 후 또는 하나 이상의 추가 치료제의 다수의 용량 사이에 투여될 수 있다.
본 개시내용의 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 대상체는 동물, 예컨대 인간, 영장류, 소, 말, 양, 개, 고양이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그 또는 돼지를 포함한다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있고, 유아, 소년, 청소년, 성인 및 노인 대상체를 포함하는 임의의 적합한 연령일 수 있다.
실시예
실시예 1: 한정된 향성을 갖는 렌티바이러스 벡터를 생성하는 방법
3세대 생산 시스템을 사용하여 본원에 기재된 것과 같은 자가 불활성화 렌티바이러스 벡터(LVV)를 생산하였다. LVV에 의한 전달에 원하는 유전자 서열을 함유하는 발현 플라스미드를 3개의 패키징 플라스미드인 VSV-G, GagPol 및 Rev와 정해진 비로 조합하고, HEK293 생산자 세포를 형질주입하기 위해 사용하였다. 2-3일 후에 HEK293 배양 배지로부터 생산적 바이러스 입자를 수확하였다.
생성된 LVV가 3개의 패키징 플라스미드 중 하나로부터 발현된 본원에 기재된 것과 같은 비바이러스 표적화 단백질을 사용하여 또는 형질주입 믹스에 대한 제5 플라스미드의 첨가에 의해 재지향될 수 있는지를 결정하기 위해 이것의 향성을 시험하였다. LVV 벡터는 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 포함하고, 여기서 돌연변이된 VSV-G는 표적화 단백질을 정의하는 비바이러스성, 향성을 통해 바이러스 진입이 발생하도록 자연적 수용체에 대한 돌연변이된 VSV-G의 결합을 무효화하는 돌연변이를 포함한다. VSV-G의 LDL-수용체 결합 부위에서의 돌연변이는 이의 자연적 수용체에 대한 결합을 무효화하는 것으로 발견되었다. 각종 돌연변이(Trop-002(서열 번호 74), Trop-051(서열 번호 93), Trop-052(서열 번호 95), Trop-055(서열 번호 97) 또는 Trop-061(서열 번호 103))를 보유하는 VSV-G를 LVV에서 CD80(서열 번호 2)과 함께 발현시켰다. CD80은 T 세포 표면 수용체인 CD28 및 CTLA4에 대한 자연적 리간드이고, T 세포에 향성을 제공하고 B 세포에 향성을 제공하지 않는다. VSV-G에 대한 자연적 수용체에 대한 결합을 라지 B 세포의 형질도입에 의해 평가한다. VSV-G에서의 몇몇 돌연변이는 라지 B 세포의 형질도입을 막지만, 주카트 T 세포의 형질도입은 유지된다(도 2a-도 2b).
제1 방법에서, CD80(서열 번호 76)으로부터 유래된 향성 한정 표적화 단백질을 VSV-G 패키징 플라스미드로부터 발현시켰다. CD80은 T 세포 표면 수용체인 CD28 및 CTLA4에 대한 자연적 리간드이고, T 세포에 향성을 제공한다. 코돈 최적화된 CD80 분자(서열 번호 2를 암호화)를 LDL 수용체 결합을 무효화하기 위한 돌연변이를 함유하는 돌연변이된 VSV-G(Trop-002, 서열 번호 74를 암호화)의 하류에서 클로닝하고, 녹색 형광 단백질(GFP) 발현 LVV를 패키징하기 위해 사용하였다. CD80 및 VSV-G는 HEK293 생산자 세포의 표면에서 비교적 균등한 수준으로 발현되어서, LVV 입자의 필적하는 장식을 제시한다(도 3a). 이 접근법에 의해 생성된 LVV는 GFP 발현에 의해 평가된 것과 같이 T 세포를 형질도입할 수 있었다(도 3b).
제2 방법에서, 향성 한정 CD80 표적화 단백질(서열 번호 2를 암호화)을 Rev 패키징 플라스미드로 클로닝하고, VSV-G env(Trop-002(서열 번호 74)를 암호화) 플라스미드에 더 낮은 몰 농도로 형질주입하였다. GFP 발현 LVV를 패키징하기 위해, 변형된 플라스미드를 사용하였다. HEK-293 생산자 세포에서의 VSV-G 및 CD80 발현의 평가는 패키징 플라스미드의 몰 농도에 의해 경향화된 상대 발현 수준을 보여주었다. 3개의 패키징 접근법에 의해 생성된 LVV는 GFP 발현에 의해 평가된 것과 같이 T 세포를 형질도입할 수 있었다(도 4). Rev 플라스미드의 더 낮은 비로 인해 Rev 패키징 플라스미드에 함유된 CD80 표적화 단백질에 의해 패키징된 LVV에서 CD80의 발현 감소가 관찰되었다.
제3 방법에서, 향성 한정 CD80 표적화 단백질(서열 번호 2를 암호화)을 LVV(Trop-002 VSV-G env)를 생산하도록 의도된 HEK293 세포의 형질주입 동안 추가 플라스미드로서 첨가하였다. LVV 생산 동안 사용된 CD80 플라스미드의 양은 HEK293 생산자 세포에서의 발현과 연관되었고, LVV 입자의 장식을 나타낼 것이다. 이 패키징 접근법에 의해 생성된 LVV는 GFP 발현에 의해 평가된 것과 같이 T 세포를 형질도입할 수 있고, 형질도입 효율은 LVV 입자에서 CD80 수준과 연관되었다(도 5).
선택된 방법과 관계없이, 고역가, 향성 재지향된 LVV는 부착성 또는 현탁 HEK293 생산자 세포에 의해 생성되고, 원심분리 또는 음이온 교환 크로마토그래피(AEX), 이후 접선 흐름 여과(TFF)에 의해 농축될 수 있다(도 6a-도 6c). AEX/TFF에 의한 농축은 순도 및 회수의 높은 수준을 갖는 LVV 조제물을 생성시켰다(도 6d).
실시예 2: CD80 LVV에 의해 농후화된 CD4 T 세포
향성 한정 표적화 분자는 이 LVV에 의해 형질도입된 특이적 세포 유형을 정확히 정의한다. CD80, CD28에 대한 리간드는 T 세포에서 자연적으로 발현된다. 그러나, CD4 T 세포의 더 높은 빈도는 CD8 T 세포와 비교하여 인간 말초혈에서 CD28을 발현한다(80% 대 50%). LVV가 인간 PBMC를 형질도입하기 위해 사용된 CD80 표적화 단백질(서열 번호 76)에 의해 Trop-002 VSV-G 외피를 장식하기 위해 패키징될 때, 형질도입된 CD4 T 세포의 더 높은 조성은 형질도입된 CD8 T 세포와 비교하여 관찰되고 배양에서 1주 이하 동안 유지되었다(도 13).
실시예 3: T 세포 특이적 향성을 함유하는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 조작된 종양 반응성 T 세포의 생체외 생성을 위한 방법
흔한 3세대 패키징 시스템을 사용하는 표준 렌티바이러스 벡터(LVV)와 비교하여, 본원에 제공된 것과 같은 향성을 재지향시키기 위해 패키징된 LVV는 개선된 형질도입 효율 및 특이성을 가질 수 있다. 이용 가능한 바이러스 입자의 수준은 LVV 입자가 다른 원치 않는 세포 유형에 의해 채워지지 않으면서 불균질한 혼합물의 일부로서 특정 세포 유형을 형질도입할 때 증가될 것이다. CAR 분자에 의한 T 세포의 개선된 형질도입이 불균질한 말초혈 단핵 세포(PBMC) 혼합물에서 가능한지를 평가하였다. 다발성 골수종을 치료하기 위해 사용된 대표적인 항-BCMA CAR(서열 번호 58) 또는 비호지킨 림프종을 치료하기 위해 사용된 대표적인 항-CD19 CAR(서열 번호 42)을 사용하였다. 대조군으로서 GFP 리포터를 사용하였다. 항-CD3 표적화 단백질 및 CD80 표적화 단백질에 의해 외피를 장식하고 T 세포 표면 분자인 CD3, CD28 및 CTLA4를 향해 향성을 재지향시키도록 LVV를 패키징하였다. CD80 표적화 단백질을 Trop-002 VSV-G env 패키징 플라스미드(서열 번호 76)로 클로닝하고, 항-CD3 표적화 단백질(서열 번호 10을 암호화)을 제5 패키징 플라스미드로부터 발현시켰다.
서면 동의 후 건강한 공여자 백혈구성분채집술로부터 얻은 PBMC 내의 T 세포 형질도입의 효율을 시험하였다. PBMC를 적혈구 용해를 사용하여 농후화하고, 일치된 공여자를 통상적으로 CAR T 세포 형질도입에 사용된 것보다 5배 내지 25배 더 낮은 LVV 농도에서 표준 LVV 또는 T 세포 재지향된 향성(항-CD3 및 CD80)을 갖는 LVV에 의해 형질도입하였다. 항-BCMA CAR T 세포를 특이적으로 검출하기 위해 형광 표지된 BCMA 분자에 의한 염색 후 유세포분석법에 의해 항-BCMA CAR의 발현을 평가하였다. 극도로 낮은 바이러스 수준에 의해서도, T 세포 향성 LVV를 사용하여 형질도입된 T 세포는 표준 LVV와 비교하여 더 높은 수준의 형질도입을 보여주었다(도 7).
동일한 연구에서 항-BCMA CAR T 세포가 T 세포를 활성화하기 위해 항체 없이 생성될 수 있는지를 평가하였다. T 세포 활성화 항체(예를 들면, 항-CD28 및 항-CD3)는 통상적으로 CAR T 세포 생성 동안 표준 LVV를 사용한 형질도입에 필요하다. 표준 LVV가 실제로 정상 인간 1차 T 세포를 형질도입하기 위해 항체를 사용한 활성화를 요한다는 것이 확인되었다(도 7). 그에 반해, T 세포 재지향된 LVV(항-CD3 및 CD80)는 (IL-2 및 외인성 활성화 항체인 항-CD3 및 항-CD28의 존재 없이) 이전의 T 세포 활성화의 부재에서도 형질도입을 야기할 수 있다(도 7). T 세포 활성화의 결과는 IL-2를 함유하는 배지에서 배양될 때 후속 세포 팽창이다. 표준 LVV 또는 T 세포 재지향된 LVV(항-CD3 및 CD80) 후 외인성 활성화 항-CD3 및 항-CD28 항체의 존재 또는 부재에서 형질도입된 PBMC는 T 세포 재지향된 LVV가 항체 활성화의 부재에서도 T 세포를 독특하게 팽창시킬 수 있다는 것을 보여주었다(도 8). 또 다른 예에서, 항-CD19 CAR의 형질도입은 또한 T 세포 재지향된 LVV(항-CD3 및 CD80)를 사용할 때 이전의 T 세포 활성화 없이 달성되었다(도 9).
T 세포 활성화 및 형질도입 효율은 T 세포 재지향된 LVV를 생성하기 위해 사용된 항-CD3 항체의 선택에 의해 기술될 수 있다. VH(서열 번호 113)-VL(서열 번호 115) 배향 및 VL(서열 번호 115)-VH(서열 번호 113) 배향에서 12F6 결합 도메인을 갖는 외피 결합된 항-CD3 결합 단백질의 예는 가변적인 양의 T 세포 형질도입뿐만 아니라 T 세포 활성화를 야기하는 것으로 나타났다(도 10).
실시예 4: T 세포 표적화된 렌티바이러스 벡터의 T 세포 특이성
T 세포주 및 B 세포주의 패널(라지, Ramos, Jeko-1, NALM-6)의 형질도입에 의해 항-CD3 표적화 단백질(서열 번호 10) 및 CD80 표적화 단백질(서열 번호 2)에 의해 외피(Trop-002 VSV-G env)를 장식하기 위해 패키징된 LVV의 T 세포 특이성을 확인하였다. GFP 전이유전자에 대해 유세포분석법에 의해 평가된 이 세포주의 형질도입을 표준 LVV와 비교하였다. 표준 LVV 및 T 세포 표적화된 LVV 둘 다는 T 세포주(주카트)를 효과적으로 형질도입하였다. 표준 LVV는 모든 B 세포주를 효과적으로 형질도입하여서, 이 계통이 LVV 형질도입에 민감하지만, T 세포 표적화 LVV에 의한 실질적인 형질도입이 임의의 B 세포주에서 검출되지 않는다는 것을 확인시켜 준다(도 14).
실시예 5: T 세포 표적화된 렌티바이러스 벡터를 사용하여 생성된 종양 특이적 T 세포
본원에 기재된 방법을 사용하여, Trop-002 VSV-G env 및 CD80 표적화 단백질 및 항-CD3 표적화 단백질을 갖는 LVV에 의해 건강한 공여자로부터의 PBMC를 형질도입하여서 항-BCMA CAR(서열 번호 58)을 발현하는 T 세포를 생성하였다. T 세포 표적화 LVV를 생산하기 위해 CD80 표적화 단백질을 Trop-002 VSV-G env 패키징 플라스미드(서열 번호 76)로 클로닝하고, (서열 번호 10을 암호화하는) 항-CD3 표적화 단백질을 제5 패키징 플라스미드로부터 발현시켰다. 통상적으로 효과적인 LVV 매개된 유전자 운반(외인성 항-CD3 및 항-CD28)에 필요한 임의의 T 세포 자극의 부재 하에 T 세포 형질도입을 수행하였다.
처음에, T 세포 재지향된 LVV에 의해 생성된 항-BCMA CAR T 세포의 활성을 표준 LVV와 비교하여 조사하였다. BCMA 음성 세포주(Nalm-6) 또는 BCMA 양성 세포주(RPMI-8826)와 공동배양 후 인터페론 감마 및 종양 괴사 인자-알파에 대한 세포내 사이토카인 염색에 의해 항-종양 활성을 평가하였다. 항-BCMA CAR T 세포는 표준 LVV 또는 T 세포 재지향된 LVV에 의해 생성되든 BCMA 음성 세포주에 의해 관찰되지 않는 BCMA 양성 세포주와 배양 후 T 세포 효과기 사이토카인의 발현 증가를 나타냈다(도 11).
실시예 6: T 세포 향성 렌티바이러스 벡터를 사용한 유전 물질의 T 세포 특이적 생체내 전달 방법
T 세포 표적화된 LVV에 의한 T 세포의 효과적이고 특이적인 형질도입은 생체내 T 세포로의 유전 물질의 안전하고 효과적인 전달을 허용할 수 있었다. 이 가설을 시험하기 위해 GFP 발현, T 세포 표적화된 LVV에 의해 정맥내로 점적된 인간화된 마우스 모델을 사용하였다. Trop-002 돌연변이된 VSV-G를 갖고 항-CD3 표적화 단백질 및 CD80 표적화 단백질로 코팅된 LVV를 생산하였다. T 세포 표적화 LVV를 생산하기 위해 CD80 표적화 단백질을 Trop-002 VSV-G env 패키징 플라스미드(서열 번호 76)로 클로닝하고, (서열 번호 10을 암호화하는) 항-CD3 표적화 단백질을 제5 패키징 플라스미드로부터 발현시켰다.
면역손상된 NCG 마우스를 인간 PBMC의 정맥내 주사를 통해 인간화하고, 4일 동안 재조합 IL-2의 매일의 복강내 투여에 의해 지원하였다. PBMC 투여 후 1일에, T 세포 표적화된 렌티바이러스 벡터를 마우스에 정맥내로 투여하였다. 말초혈 및 비장 세포를 제7일에 수확하고, T 세포 특이성을 유세포분석법에 의해 평가하였다. GFP 양성 세포는 인간 T 세포(CD3+)에서만 검출되고 인간 B 세포(CD20+)에서 검출되지 않아서, LVV 형질도입의 T 세포 특이성을 확인시켜 준다(도 12a). GFP는 CD8+ 및 CD8-(CD4) T 세포 둘 다에서 검출되어서, T 세포 특이적 LVV가 생체내 CD4 및 CD8 T 세포 둘 다를 형질도입한다는 것을 나타낸다(도 12b).
특이적 T 세포 형질도입은 종양 세포를 형질도입하는 위험을 최소화하여서 다른 생체내 CAR 전달 접근법에 대한 핵심 안전성 이점을 갖는다. 검출 가능한 CD19 종양 세포를 갖는 만성 림프구성 백혈병 환자로부터의 PBMC를 사용하여 종양 세포의 형질도입이 없는 T 세포의 형질도입을 평가한다. PBMC를 T 세포 표적화된 LVV에 의해 형질도입하고, 형질도입된 세포를 유세포분석법을 사용하여 평가한다.
상기에 기재된 다양한 실시형태는 추가의 실시형태를 제공하도록 조합될 수 있다. 비제한적인 예로서 2021년 2월 26일에 출원된 미국 가출원 제63/154,639호를 포함하는 본 명세서에서 언급되고/되거나 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허 출원 공보, 미국 특허 출원, 외국 특허, 외국 특허 출원 및 비특허 공보의 모두는 그 전문이 본원에 참고로 포함된다. 실시형태의 양태는 더 추가의 실시형태를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공보의 개념을 이용하도록 필요하면 변형될 수 있다.
상기에 자세히 기재된 설명의 견지에서 실시형태에 이들 변화 및 다른 변화가 이루어질 수 있다. 일반적으로, 하기 청구항에서, 사용된 용어는 본 명세서 및 청구항에 개시된 특정 실시형태에 청구항을 제한하도록 해석되지 않아야 하지만, 이러한 청구항이 권한 부여한 등가물의 완전한 범위에 따라 모든 가능한 실시형태를 포함하도록 해석되어야 한다. 따라서, 청구항은 본 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
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atcaggtgga ggcagcggtg gcggatctca gatcgtgctg 480 agccagtccc cagccatcct gtctgccagc cctggcgaga aggtgaccat gacctgcaga 540 gcctcttctt ctgtttccta catgcactgg tatcagcaaa agcccggcag ctctcctaag 600 ccttggatct acgccacaag caacctggct agcggcgtgc ctgctcgctt cagcggcagc 660 ggcagcggca ccagctacag cctgaccatc agcagagtgg aagccgagga cgccgccacc 720 tactactgcc agcagtggtc ctctaatcct ccaacattcg gcggcggcac caagctggaa 780 accaaaagaa ccactacacc agcacctaga ccaccaacac ctgcgccaac catcgcatcg 840 cagccactgt ctctgcgccc agaggcatgc cggccagcag ctgggggcgc agtgcacaca 900 agggggctgg acttcgcatg tgatatctac atctgggcac cattggcagg gacttgtggg 960 gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgc 996 <210> 117 <211> 332 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Anti-CD3 (12F6) Full molecule <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(21) <223> signal peptide <400> 117 Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu 1 5 10 15 His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu 20 25 30 Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys 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Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 50 55 60 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 65 70 75 80 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 85 90 95 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 100 105 110 <210> 123 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> B2M signal peptide <400> 123 Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser 1 5 10 15 Gly Leu Glu Ala 20

Claims (100)

  1. 렌티바이러스 벡터로서,
    (a) 바이러스 외피로서,
    이종성 림프구 표적화 단백질로서, 림프구 표적화 단백질은
    림프구 표적화 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 및
    막관통 도메인을 포함하는, 이종성 림프구 표적화 단백질
    을 포함하는, 바이러스 외피; 및
    (b) LDL-R에 대한 억제된 결합을 나타내지만 막 융합을 매개하는 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질; 및
    (c) 이종성 전이유전자를 포함하는 발현 카세트
    를 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 이종성 림프구 표적화 단백질은 T 세포 표적화 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 이종성 T 세포 표적화 단백질인, 렌티바이러스 벡터.
  3. 제1항에 있어서, 이종성 림프구 표적화 단백질은 NK 세포 표적화 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 이종성 자연 살해(NK) 세포 표적화 단백질인, 렌티바이러스 벡터.
  4. 제1항에 있어서, 이종성 림프구 표적화 단백질은 B 세포 표적화 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 이종성 B 세포 표적화 단백질인, 렌티바이러스 벡터.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 이종성 림프구 표적화 단백질은
    (a) CD3, CD28, CD80, 4-1BB, AhR, CD3, CD2, CD7, CD4, CD8, CD25, CD44, CD45RA, CD47, CD62L, CD69, CD94, CD95, CD127, CD161, CD183(CXCR3), CD184(CXCR4), CD185(CXCR5), CD193(CCR3), CD194(CCR4), CD195(CCR5), CD196(CCR6), CD197(CCR7), CCR10, PD-1, TCRa/b, CD5, CD27, CD45RO, CD45RB, CD57, CD103, CD122, P2RX7, TIGIT, LAG-3, TIM-3 및 IL6ST 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 T 세포 마커;
    (b) γδ TCR, V델타1, V델타2 및 NKG2D(KLRK1, CD314)로부터 선택된 γδ T 세포 마커;
    (c) 불변체 TCR(Va24-Ja18), CD185(CXCR5), CXCR6 및 IL-21R 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 NK T 세포 마커; 또는
    (d) Va7.2, Ja33, CXCR6, IL-18R, KLRB1(CD161) 및 VLA4(알파4베타1 인테그린) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 MAIT 세포 마커
    에 특이적으로 결합하는 이종성 T 세포 표적화 단백질인, 렌티바이러스 벡터.
  6. 제1항, 제2항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 림프구 표적화 단백질은 CD3 단백질 또는 CD28 단백질에 특이적으로 결합하는 T 세포 표적화 도메인을 포함하는 세포외 도메인을 포함하는 이종성 T 세포 표적화 단백질인, 렌티바이러스 벡터.
  7. 제1항 또는 제3항에 있어서, 이종성 림프구 표적화 단백질은 CD56, NKp46, CD16, KIR(들), NKG2 단백질(예를 들면, NKG2D(KLRK1, CD314)), KLRB1(CD161), KLRD1(cd94), IL2Rb(CD122), IL-21R, SLAMF6(CD352), SLAMF7(CD319) 및 IL-18R 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 NK 세포 마커에 특이적으로 결합하는 이종성 NK 세포 표적화 단백질인, 렌티바이러스 벡터.
  8. 제1항 또는 제4항에 있어서, 이종성 림프구 표적화 단백질은 CD19, CD20, CD21, CD22, CD24, CD38, CD40, CD72, CD32b, CD268, CD269, CD267, CD86, CD80, CD52, CD138, CD27, CD28, CD23, CD84, CD257, CD270, CD37, CD74 및 CD269 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 B 세포 마커에 특이적으로 결합하는 B 세포 표적화 단백질인, 렌티바이러스 벡터.
  9. 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 단백질은 서열 번호 6과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 세포외 도메인을 포함하는 CD80 단백질을 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  10. 제1항, 제2항, 제5항, 제6항 및 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 단백질은 서열 번호 8과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 막관통 및 세포내 도메인을 포함하는 CD80 단백질을 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  11. 제1항, 제2항, 제5항, 제6항, 제9항 및 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 단백질은 서열 번호 2, 또는 서열 번호 4의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 2를 포함하는 CD80 단백질을 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  12. 제1항, 제2항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 단백질은 서열 번호 14와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 18과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 항-CD3 scFv를 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 표적화 단백질은 (i) 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 10; 또는 (ii) 서열 번호 117, 또는 서열 번호 12의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 117을 포함하는 항-CD3 표적화 단백질을 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포에서 발현된 것과 같은 표적화 단백질은 신호 서열을 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙 표적화 단백질은 신호 서열이 없는, 렌티바이러스 벡터.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 성숙 표적화 단백질은 신호 서열로부터의 적어도 하나의 아미노산을 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은
    H8, N9, Q10, K47, K50, A51, S183, S179, N180, I182, M184, Y209, I347, T350, T352, E353 및 R354에서의 돌연변이;
    N9와 Q10 사이의 TT의 삽입, H8과 N9 사이의 GGS의 삽입, N9와 Q10 사이의 GGS의 삽입, N208과 Y209 사이의 TT의 삽입, P46과 K47 사이의 GGS의 삽입 및 N208과 Y209 사이의 GGS의 삽입; 및
    잔기 1-8의 결실 중 1개 이상으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은
    H8, N9, Q10, K47, K50, A51, S183, S179, N180, I182, M184, Y209, I347, T350, T352, E353 및 R354에서의 돌연변이;
    N9와 Q10 사이의 TT의 삽입, H8과 N9 사이의 GGS의 삽입, N9와 Q10 사이의 GGS의 삽입, N208과 Y209 사이의 TT의 삽입, P46과 K47 사이의 GGS의 삽입 및 N208과 Y209 사이의 GGS의 삽입; 및
    잔기 1-8의 결실 중 2개 이상으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 H8A, N9A, Q10A, K47A, K47Q, N180A, I182A, Y209A, T352A, T352W, E353A, R354A 및 R354Q 중 1개 이상으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 H8A, K47A, K47Q, Y209A, R354A 및 R354Q 중 1개 이상으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은
    (a) K47 돌연변이 및 R354 돌연변이;
    (b) N180 돌연변이, I182 돌연변이, T352 돌연변이 및 E353 돌연변이;
    (c) T352 돌연변이 및 E353 돌연변이;
    (d) N9 돌연변이, Q10 돌연변이 및 N180 돌연변이; 또는
    (e) H8과 N9 사이의 GGS의 삽입 및 N9와 Q10 사이의 GGS의 삽입;
    (f) N9와 Q10 사이의 TT의 삽입; 또는
    (g) P46과 K47 사이의 GGS의 삽입을 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  22. 제21항에 있어서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은
    (a) K47Q 돌연변이 및 R354A 돌연변이;
    (b) N180A 돌연변이, I182A 돌연변이, T352A 돌연변이 및 E353A 돌연변이;
    (c) T352W 돌연변이 및 E353A 돌연변이; 또는
    (d) N9A 돌연변이, Q10A 돌연변이 및 N180A 돌연변이를 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 서열 번호 74, 93, 95, 97, 99 및 103 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 이종성 전이유전자는 표적 분자에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 세포내 신호전달 도메인으로서, 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 및 선택적으로 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는, 세포내 신호전달 도메인; 및 세포외 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는, 렌티바이러스 벡터.
  25. 제24항에 있어서, 전이유전자에 의해 암호화된 CAR은
    (a) CD19, BCMA, 알파 폴레이트 수용체, 5T4, Ab 인테그린, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD52, CD70, CD79a, CD79b, CD80, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FLT3, Fra, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-A1 + MAGE1, HLA-A2 + MAGE1, HLA-A3 + MAGE1, HLA-A1 + NY-ESO-1, HLA-A2 + NY-ESO-1, HLA-A3 + NY-ESO-1, HLADR, IL-11R알파, IL-13 R알파2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2d 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 서바이빈, TAG72, TEMs, VEGFR2, BAFF-R, 클라우딘18.2, CD86, FcRL5, GPRC5 및 TACI 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 결합 도메인;
    (b) CD28, CD2, CD4, CD8a, CD5, CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD9, CD16, CD22, CD25, CD27, CD33, CD37, CD40, CD45, CD64, CD79A, CD79B, CD80, CD86, CD95(Fas), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD154(CD40L), CD200R, CD223(LAG3), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), CD279(PD-1), CD300, CD357(GITR), A2aR, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, GAL9, KIR, Lck, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PTCH2, ROR2, Ryk, Slp76, SIRPα, pTα, TCRα, TCRβ, TIM3, TRIM, LPA5 및 Zap70 막관통 도메인으로부터 선택된 막관통 도메인;
    (c) CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD5, CD22, CD79a, CD278(ICOS), DAP10, DAP12, FcRγ 및 CD66d 도메인으로부터 선택된 세포내 신호전달 도메인;
    (d) CD27, CD28, CD40L, GITR, NKG2C, CARD1, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX-40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD226, CD270(HVEM), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), DAP10, LAT, LFA-1, LIGHT, NKG2C, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70 도메인 중 하나 이상으로부터 선택된 공동자극 도메인; 및
    (e) 선택적으로, 결합 도메인과 막관통 도메인 사이의 세포외 비신호전달 링커 도메인으로서, 비신호전달 링커 도메인은
    (i) 야생형 또는 변형된 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgD 힌지 영역으로부터 선택된 면역글로불린 힌지 영역;
    (ii) 야생형 또는 변형된 CD8a, CD4, CD28 및 CD7 힌지 영역으로부터 선택된 힌지 영역;
    (iii) CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인 중 하나 이상으로부터 선택된 Fc 도메인의 전부 또는 일부; 및
    (iv) CD23, CD69, CD72, CD94, NKG2A 및 NKG2D의 스톡 영역으로부터 유래된 II형 C-렉틴의 스톡 영역
    으로부터 선택된, 세포외 비신호전달 링커 도메인
    을 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 전이유전자에 의해 암호화된 CAR은
    서열 번호 46과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 50과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD19 scFv를 포함하는 결합 도메인;
    서열 번호 52와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 CD8a 힌지 및 막관통 도메인;
    서열 번호 56과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 CD3ζ 효과기 도메인; 및
    서열 번호 54와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하는 항-CD19 CAR인, 렌티바이러스 벡터.
  27. 제26항에 있어서, 전이유전자에 의해 암호화된 CAR은 서열 번호 42, 또는 서열 번호 44의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 42를 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  28. 제24항 또는 제25항에 있어서, 전이유전자에 의해 암호화된 CAR은
    서열 번호 62와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 66과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-BCMA scFv를 포함하는 결합 도메인;
    서열 번호 52와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 CD8a 힌지 및 막관통 도메인;
    서열 번호 122와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 CD3ζ 효과기 도메인; 및
    서열 번호 54와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인을 포함하는 항-BCMA CAR인, 렌티바이러스 벡터.
  29. 제26항에 있어서, 전이유전자에 의해 암호화된 CAR은 서열 번호 58, 또는 서열 번호 60의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 58을 포함하는, 렌티바이러스 벡터.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 림프구 표적화된 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 생산자 세포를 GagPol 플라스미드, Rev 플라스미드, 전이유전자 플라스미드 및 VSV-G env 플라스미드로 형질주입하는 것으로서,
    (i) GagPol 플라스미드는 렌티바이러스 gag 유전자 및 렌티바이러스 pol 유전자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 생산자 세포 내에 렌티바이러스 Gag 폴리단백질 및 렌티바이러스 Pol 폴리단백질을 발현할 수 있고;
    (ii) Rev 플라스미드는 렌티바이러스 rev 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 생산자 세포 내에 렌티바이러스 Rev 단백질을 발현할 수 있고;
    (iii) 전이유전자 플라스미드는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트를 포함하고;
    (iv) VSV-G env 플라스미드는 텐덤 발현 카세트를 포함하고, 텐덤 발현 카세트는 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 림프구 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, VSV-G env 플라스미드는 생산자 세포 내에 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질 및 림프구 표적화 단백질을 발현할 수 있는 것;
    (b) 배양 배지에서 생산자 세포를 배양하는 것; 및
    (c) 배양 배지로부터 렌티바이러스 벡터를 수확하는 것을 포함하는, 방법.
  31. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 림프구 표적화된 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 생산자 세포를 GagPol 플라스미드, Rev 플라스미드, 전이유전자 플라스미드 및 VSV-G env 플라스미드로 형질주입하는 것으로서,
    (i) GagPol 플라스미드는 Gag 폴리단백질 전구체 및 Pol 폴리단백질 전구체 및 림프구 표적화 단백질을 암호화하는 텐덤 발현 카세트를 포함하고, GagPol 플라스미드는 생산자 세포 내에 렌티바이러스 Gag 폴리단백질, 렌티바이러스 Pol 폴리단백질 및 림프구 표적화 단백질을 발현할 수 있고;
    (ii) Rev 플라스미드는 렌티바이러스 rev 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 생산자 세포 내에 렌티바이러스 Rev 단백질을 발현할 수 있고;
    (iii) 전이유전자 플라스미드는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트를 포함하고;
    (iv) VSV-G env 플라스미드는 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, VSV-G env 플라스미드는 생산자 세포 내에 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 발현할 수 있는 것;
    (b) 배양 배지에서 생산자 세포를 배양하는 것; 및
    (c) 배양 배지로부터 렌티바이러스 벡터를 수확하는 것을 포함하는, 방법.
  32. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 림프구 표적화된 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 생산자 세포를 GagPol 플라스미드, Rev 플라스미드, 전이유전자 플라스미드 및 VSV-G env 플라스미드로 형질주입하는 것으로서,
    (i) GagPol 플라스미드는 렌티바이러스 gag 유전자 및 렌티바이러스 pol 유전자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 생산자 세포 내에 렌티바이러스 Gag 폴리단백질 및 렌티바이러스 Pol 폴리단백질을 발현할 수 있고;
    (ii) Rev 플라스미드는 텐덤 발현 카세트를 포함하고, 텐덤 발현 카세트는 렌티바이러스 rev 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및 림프구 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, Rev 플라스미드는 생산자 세포 내에 렌티바이러스 Rev 단백질 및 림프구 표적화 단백질을 발현할 수 있고;
    (iii) 전이유전자 플라스미드는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트를 포함하고;
    (iv) VSV-G env 플라스미드는 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, VSV-G env 플라스미드는 생산자 세포 내에 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 발현할 수 있는 것;
    (b) 배양 배지에서 생산자 세포를 배양하는 것; 및
    (c) 배양 배지로부터 렌티바이러스 벡터를 수확하는 것을 포함하는, 방법.
  33. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 림프구 표적화된 렌티바이러스 벡터를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은,
    (a) 생산자 세포를 GagPol 플라스미드, Rev 플라스미드, 전이유전자 플라스미드, VSV-G env 플라스미드 및 림프구 표적화 단백질 플라스미드에 의해 형질주입하는 것으로서,
    (i) GagPol 플라스미드는 렌티바이러스 gag 유전자 및 렌티바이러스 pol 유전자를 암호화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 생산자 세포 내에 렌티바이러스 Gag 폴리단백질 및 렌티바이러스 Pol 폴리단백질을 발현할 수 있고;
    (ii) Rev 플라스미드는 렌티바이러스 rev 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 생산자 세포 내에 렌티바이러스 Rev 단백질을 발현할 수 있고;
    (iii) 전이유전자 플라스미드는 CAR을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트를 포함하고;
    (iv) VSV-G env 플라스미드는 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 생산자 세포 내에 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질을 발현할 수 있고;
    (v) 림프구 표적화 단백질 플라스미드는 림프구 표적화 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 생산자 세포 내에 림프구 표적화 단백질을 발현할 수 있는 것;
    (b) 배양 배지에서 생산자 세포를 배양하는 것; 및
    (c) 배양 배지로부터 렌티바이러스 벡터를 수확하는 것을 포함하는, 방법.
  34. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구 표적화 단백질 플라스미드에 의해 암호화된 림프구 표적화 단백질은 T 세포 표적화 단백질인, 방법.
  35. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구 표적화 단백질 플라스미드에 의해 암호화된 림프구 표적화 단백질은 NK 세포 표적화 단백질인, 방법.
  36. 제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구 표적화 단백질 플라스미드에 의해 암호화된 림프구 표적화 단백질은 B 세포 표적화 단백질인, 방법.
  37. 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구 표적화 단백질 플라스미드에 의해 암호화된 림프구 표적화 단백질은
    (a) CD3, CD28, CD80, 4-1BB, AhR, CD3, CD2, CD7, CD4, CD8, CD25, CD44, CD45RA, CD47, CD62L, CD69, CD94, CD95, CD127, CD161, CD183(CXCR3), CD184(CXCR4), CD185(CXCR5), CD193(CCR3), CD194(CCR4), CD195(CCR5), CD196(CCR6), CD197(CCR7), CCR10, PD-1, TCRa/b, CD5, CD27, CD45RO, CD45RB, CD57, CD103, CD122, P2RX7, TIGIT, LAG-3, TIM-3 및 IL6ST 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 T 세포 마커;
    (b) γδ TCR, V델타1, V델타2 및 NKG2D(KLRK1, CD314 또는 이들의 임의의 조합)로부터 선택된 γδ T 세포 마커;
    (c) 불변체 TCR(Va24-Ja18), CD185(CXCR5), CXCR6 및 IL-21R 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 NK T 세포 마커; 또는
    (d) Va7.2, Ja33, CXCR6, IL-18R, KLRB1(CD161) 및 VLA4(알파4베타1 인테그린) 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 MAIT 세포 마커에 특이적으로 결합하는 T 세포 표적화 단백질인, 방법.
  38. 제37항에 있어서, 표적화 단백질은 서열 번호 6과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 세포외 도메인을 포함하는 CD80 단백질을 포함하는, 방법.
  39. 제37항 또는 제38항에 있어서, 표적화 단백질은 서열 번호 8과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 막관통 및 세포내 도메인을 포함하는 CD80 단백질을 포함하는, 방법.
  40. 제37항, 제38항 및 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 단백질은 서열 번호 2, 또는 서열 번호 4의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 2를 포함하는 CD80 단백질을 포함하는, 방법.
  41. 제30항 내지 제34항 및 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 단백질은 (i) 서열 번호 14와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 18과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 항-CD3 scFv; 또는 (ii) 서열 번호 115와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 113과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 갖는 항-CD3 scFv를 포함하는, 방법.
  42. 제30항 내지 제34항, 제37항 및 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 표적화 단백질은 (i) 서열 번호 10, 또는 서열 번호 12의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 10; 또는 (ii) 서열 번호 117, 또는 서열 번호 12의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 117을 포함하는 항-CD3 표적화 단백질을 포함하는, 방법.
  43. 제30항 내지 제33항 및 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구 표적화 단백질 플라스미드에 의해 암호화된 림프구 표적화 단백질은 CD56, NKp46, CD16, KIR(들), NKG2 단백질(예를 들면, NKG2D(KLRK1, CD314)), KLRB1(CD161), KLRD1(cd94), IL2Rb(CD122), IL-21R, SLAMF6(CD352), SLAMF7(CD319) 및 IL-18R 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 NK 세포 마커에 특이적으로 결합하는 NK 세포 표적화 단백질인, 방법.
  44. 제30항 내지 제33항 및 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 림프구 표적화 단백질 플라스미드에 의해 암호화된 림프구 표적화 단백질은 CD19, CD20, CD21, CD22, CD24, CD38, CD40, CD72, CD32b, CD268, CD269, CD267, CD86, CD80, CD52, CD138, CD27, CD28, CD23, CD84, CD257, CD270, CD37, CD74 및 CD269 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택된 B 세포 마커에 특이적으로 결합하는 B 세포 표적화 단백질인, 방법.
  45. 제30항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, VSV-G env 플라스미드에 의해 암호화된 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은
    H8, N9, Q10, K47, K50, A51, S183, S179, N180, I182, M184, Y209, I347, T350, T352, E353 및 R354에서의 돌연변이;
    N9와 Q10 사이의 TT의 삽입, H8과 N9 사이의 GGS의 삽입, N9와 Q10 사이의 GGS의 삽입, N208과 Y209 사이의 TT의 삽입, P46과 K47 사이의 GGS의 삽입 및 N208과 Y209 사이의 GGS의 삽입; 및
    잔기 1-8의 결실 중 1개 이상으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는, 방법.
  46. 제30항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, VSV-G env 플라스미드에 의해 암호화된 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은
    H8, N9, Q10, K47, K50, A51, S183, S179, N180, I182, M184, Y209, I347, T350, T352, E353 및 R354에서의 돌연변이;
    N9와 Q10 사이의 TT의 삽입, H8과 N9 사이의 GGS의 삽입, N9와 Q10 사이의 GGS의 삽입, N208과 Y209 사이의 TT의 삽입, P46과 K47 사이의 GGS의 삽입 및 N208과 Y209 사이의 GGS의 삽입; 및
    잔기 1-8의 결실 중 2개 이상으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는, 방법.
  47. 제30항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 H8A, N9A, Q10A, K47A, K47Q, N180A, I182A, Y209A, T352A, T352W, E353A, R354A 및 R354Q 중 1개 이상으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는, 방법.
  48. 제30항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, VSV-G env 플라스미드에 의해 암호화된 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 H8A, K47A, K47Q, Y209A, R354A 및 R354Q 중 1개 이상으로부터 선택된 돌연변이를 포함하는, 방법.
  49. 제30항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은
    (a) K47 돌연변이 및 R354 돌연변이;
    (b) N180 돌연변이, I182 돌연변이, T352 돌연변이 및 E353 돌연변이;
    (c) T352 돌연변이 및 E353 돌연변이;
    (d) N9 돌연변이, Q10 돌연변이 및 N180 돌연변이; 또는
    (e) H8과 N9 사이의 GGS의 삽입 및 N9와 Q10 사이의 GGS의 삽입;
    (f) N9와 Q10 사이의 TT의 삽입; 또는
    (g) P46과 K47 사이의 GGS의 삽입을 포함하는, 방법.
  50. 제49항에 있어서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은
    (a) K47Q 돌연변이 및 R354A 돌연변이;
    (b) N180A 돌연변이, I182A 돌연변이, T352A 돌연변이 및 E353A 돌연변이;
    (c) T352W 돌연변이 및 E353A 돌연변이; 또는
    (d) N9A 돌연변이, Q10A 돌연변이 및 N180A 돌연변이를 포함하는, 방법.
  51. 제30항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 돌연변이된 VSV-G 외피 단백질은 서열 번호 74, 93, 95, 97, 99 및 103 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  52. 제30항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 전이유전자 플라스미드에 의해 암호화된 CAR은 표적 분자에 특이적으로 결합하는 결합 도메인을 포함하는 세포외 도메인; 세포내 신호전달 도메인으로서, 세포내 신호전달 도메인은 면역수용체 티로신 기반 활성화 모티프(ITAM) 및 선택적으로 공동자극 신호전달 도메인을 포함하는, 세포내 신호전달 도메인; 및 세포외 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 연결하는 막관통 도메인을 포함하는, 방법.
  53. 제30항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 전이유전자 플라스미드에 의해 암호화된 CAR은
    (a) CD19, BCMA, 알파 폴레이트 수용체, 5T4, Ab 인테그린, B7-H3, B7-H6, CAIX, CD20, CD22, CD23, CD30, CD33, CD38, CD44, CD44v6, CD44v7/8, CD52, CD70, CD79a, CD79b, CD80, CD123, CD138, CD171, CEA, CSPG4, EGFR, ErbB2(HER2), EGFRvIII, EGP2, EGP40, EpCAM, FAP, 태아 AchR, FLT3, Fra, GD2, GD3, 글리피칸-3(GPC3), HLA-A1 + MAGE1, HLA-A2 + MAGE1, HLA-A3 + MAGE1, HLA-A1 + NY-ESO-1, HLA-A2 + NY-ESO-1, HLA-A3 + NY-ESO-1, HLADR, IL-11R알파, IL-13 R알파2, 람다, 루이스-Y, 카파, 메소텔린, Muc1, Muc16, NCAM, NKG2d 리간드, NY-ESO-1, PRAME, PSCA, PSMA, ROR1, SSX, 서바이빈, TAG72, TEMs, VEGFR2, BAFF-R, 클라우딘18.2, CD86, FcRL5, GPRC5 및 TACI 중 하나 이상에 특이적으로 결합하는 결합 도메인;
    (b) CD28, CD2, CD4, CD8a, CD5, CD3ε, CD3δ, CD3ζ, CD9, CD16, CD22, CD25, CD27, CD33, CD37, CD40, CD45, CD64, CD79A, CD79B, CD80, CD86, CD95(Fas), CD134(OX40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD154(CD40L), CD200R, CD223(LAG3), CD270(HVEM), CD272(BTLA), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), CD279(PD-1), CD300, CD357(GITR), A2aR, DAP10, FcRα, FcRβ, FcRγ, Fyn, GAL9, KIR, Lck, LAT, LRP, NKG2D, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, PTCH2, ROR2, Ryk, Slp76, SIRPα, pTα, TCRα, TCRβ, TIM3, TRIM, LPA5 및 Zap70 막관통 도메인으로부터 선택된 막관통 도메인;
    (c) CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD3ζ, CD5, CD22, CD79a, CD278(ICOS), DAP10, DAP12, FcRγ 및 CD66d 도메인으로부터 선택된 세포내 신호전달 도메인;
    (d) CD27, CD28, CD40L, GITR, NKG2C, CARD1, CD2, CD7, CD27, CD30, CD40, CD54(ICAM), CD83, CD134(OX-40), CD137(4-1BB), CD150(SLAMF1), CD152(CTLA4), CD223(LAG3), CD226, CD270(HVEM), CD273(PD-L2), CD274(PD-L1), CD278(ICOS), DAP10, LAT, LFA-1, LIGHT, NKG2C, NKD2C, SLP76, TRIM 및 ZAP70 도메인 중 하나 이상으로부터 선택된 공동자극 도메인; 및
    (e) 선택적으로, 결합 도메인과 막관통 도메인 사이의 세포외 비신호전달 링커 도메인이되, 비신호전달 링커 도메인은
    (i) 야생형 또는 변형된 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgD 힌지 영역으로부터 선택된 면역글로불린 힌지 영역;
    (ii) 야생형 또는 변형된 CD8a, CD4, CD28 및 CD7 힌지 영역으로부터 선택된 힌지 영역;
    (iii) CH1 도메인, CH2 도메인 및 CH3 도메인 중 하나 이상으로부터 선택된 Fc 도메인의 전부 또는 일부; 및
    (iv) CD23, CD69, CD72, CD94, NKG2A 및 NKG2D의 스톡 영역으로부터 유래된 II형 C-렉틴의 스톡 영역으로부터 선택된, 세포외 비신호전달 링커 도메인
    을 포함하는, 방법.
  54. 제30항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 전이유전자 플라스미드에 의해 암호화된 CAR은
    (a) 서열 번호 46과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 50과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-CD19 scFv를 포함하는 결합 도메인;
    (b) 서열 번호 52와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 CD8a 힌지 및 막관통 도메인;
    (c) 서열 번호 56과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 CD3ζ 효과기 도메인; 및
    (d) 서열 번호 54와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인
    을 포함하는 항-CD19 CAR인, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 전이유전자에 의해 암호화된 CAR은 서열 번호 42, 또는 서열 번호 44의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 42를 포함하는, 방법.
  56. 제30항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 전이유전자 플라스미드에 의해 암호화된 CAR은
    (a) 서열 번호 62와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 66과 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 중쇄 가변 영역을 포함하는 항-BCMA scFv를 포함하는 결합 도메인;
    (b) 서열 번호 52와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 CD8a 힌지 및 막관통 도메인;
    (c) 서열 번호 122와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 CD3ζ 효과기 도메인; 및
    (d) 서열 번호 54와 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 또는 100%의 동일성을 갖는 4-1BB 공동자극 도메인
    을 포함하는 항-BCMA CAR인, 방법.
  57. 제56항에 있어서, 전이유전자에 의해 암호화된 CAR은 서열 번호 58 또는 서열 번호 60의 신호 펩타이드가 없는 서열 번호 58을 포함하는, 방법.
  58. 제30항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 생산자 세포는 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드 및 VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질도입되고, 선택적으로 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드 및 VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비는 각각 약 1:1:1:1 내지 약 5:4:1:1인, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 생산자 세포는 약 4:2:1:1의 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드 및 VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질도입되는, 방법.
  60. 제58항에 있어서, 생산자 세포는 약 3.125:3.125:2.5:1.25의 전이유전자 플라스미드, GagPol 플라스미드 및 VSV-G env 플라스미드 및 Rev 플라스미드의 정해진 비로 형질도입되는, 방법.
  61. 제30항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지로부터 렌티바이러스 벡터를 수확하는 것는 원심분리, 음이온 교환, 크로마토그래피 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  62. 제30항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 배양 배지로부터 수확된 LVV 산물은 농축된 LVV 산물에서 약 1e7 TU/mL 내지 약 1e12 TU/mL의 바이러스 역가를 갖는, 방법.
  63. 이종성 전이유전자를 발현하는 T 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은,
    T 세포를 제1항, 제2항, 제5항, 제6항 및 제9항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 LVV로 형질도입하는 것으로서, T 세포의 형질도입은 T 세포에 의한 이종성 전이유전자의 발현을 생성시키는 것을 포함하는, 방법.
  64. 제63항에 있어서, T 세포는 휴지 T 세포인, 방법.
  65. 제63항 또는 제64항에 있어서, T 세포의를 형질도입하는 것은 생체내 또는 생체외 수행되는, 방법.
  66. 제63항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 LVV는 대상체에게 정맥내로, 복강내로, 종양내로, 골내로 또는 림프절내로 투여되는, 방법.
  67. 제63항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포를 형질도입하는 것은 하나 이상의 LVV를 갖는 대상체로부터 얻은 전혈 또는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 내에 T 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  68. 제63항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입은 외인성 T 세포 자극제의 사용 없이 달성되는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 외인성 T 세포 자극제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 둘 다를 포함하는, 방법.
  70. CAR을 발현하는 T 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은,
    T 세포를 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 LVV로 형질도입하는 것으로서, T 세포의 형질도입은 T 세포에 의한 CAR 전이유전자의 발현을 생성시키는 것을 포함하는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, T 세포는 휴지 T 세포인, 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, T 세포를 형질도입하는 것은 생체내 또는 생체외 수행되는, 방법.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 LVV는 대상체에게 정맥내로, 복강내로, 종양내로, 골내로 또는 림프절내로 투여되는, 방법.
  74. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포를 형질도입하는 것은 하나 이상의 LVV를 갖는 대상체로부터 얻은 전혈 또는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 내에 T 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  75. 제70항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입은 외인성 T 세포 자극제의 사용 없이 달성되는, 방법.
  76. 제75항에 있어서, 외인성 T 세포 자극제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 둘 다를 포함하는, 방법.
  77. 이종성 전이유전자를 발현하는 NK 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은,
    NK 세포를 제1항, 제3항, 제7항 및 제14항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 LVV로 형질도입하는 것으로서, NK 세포의 형질도입은 NK 세포에 의한 이종성 전이유전자의 발현을 생성시키는 것을 포함하는, 방법.
  78. 제77항에 있어서, NK 세포는 휴지 NK 세포인, 방법.
  79. 제77항 또는 제78항에 있어서, NK 세포를 형질도입하는 것은 생체내 또는 생체외 수행되는, 방법.
  80. 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 LVV는 대상체에게 정맥내로, 복강내로, 종양내로, 골내로 또는 림프절내로 투여되는, 방법.
  81. 제77항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포를 형질도입하는 것은 대상체로부터 얻은 전혈 또는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 내에 NK 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  82. 제77항 내지 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입은 외인성 NK 세포 자극제의 사용 없이 달성되는, 방법.
  83. CAR을 발현하는 NK 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은,
    NK 세포를 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 LVV로 형질도입하는 것으로서, NK 세포의 형질도입은 NK 세포에 의한 CAR 전이유전자의 발현을 생성시키는 것을 포함하는, 방법.
  84. 제83항에 있어서, NK 세포는 휴지 NK 세포인, 방법.
  85. 제83항 또는 제84항에 있어서, NK 세포를 형질도입하는 것은 생체내 또는 생체외 수행되는, 방법.
  86. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 LVV는 대상체에게 정맥내로, 복강내로, 종양내로, 골내로 또는 림프절내로 투여되는, 방법.
  87. 제83항 내지 제85항 중 어느 한 항에 있어서, NK 세포를 형질도입하는 것은 하나 이상의 LVV를 갖는 대상체로부터 얻은 전혈 또는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 내에 NK 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  88. 제83항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입은 외인성 NK 세포 자극제의 사용 없이 달성되는, 방법.
  89. 이종성 전이유전자를 발현하는 B 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은,
    B 세포를 제1항, 제4항, 제8항 및 제14항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 LVV로 형질도입하는 것으로서, B 세포의 형질도입은 B 세포에 의한 이종성 전이유전자의 발현을 생성시키는 것을 포함하는, 방법.
  90. 제89항에 있어서, B 세포는 휴지 B 세포인, 방법.
  91. 제89항 또는 제90항에 있어서, B 세포를 형질도입하는 것은 생체내 또는 생체외 수행되는, 방법.
  92. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 LVV는 대상체에게 정맥내로, 복강내로, 종양내로, 골내로 또는 림프절내로 투여되는, 방법.
  93. 제89항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, B 세포를 형질도입하는 것은 대상체로부터 얻은 전혈 또는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 내에 B 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  94. 제89항 내지 제93항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입은 B 세포 자극제의 사용 없이 달성되는, 방법.
  95. CAR을 발현하는 B 세포를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은,
    B 세포를 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 LVV로 형질도입하는 것으로서, NK 세포의 형질도입은 B 세포에 의한 CAR 전이유전자의 발현을 생성시키는 것을 포함하는, 방법.
  96. 제95항에 있어서, B 세포는 휴지 B 세포인, 방법.
  97. 제95항 또는 제96항에 있어서, B 세포를 형질도입하는 것은 생체내 또는 생체외 수행되는, 방법.
  98. 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 LVV는 대상체에게 정맥내로, 복강내로, 종양내로, 골내로 또는 림프절내로 투여되는, 방법.
  99. 제95항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, B 세포를 형질도입하는 것은 하나 이상의 LVV를 갖는 대상체로부터 얻은 전혈 또는 말초혈 단핵 세포(PBMC) 내에 B 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 방법.
  100. 제95항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 형질도입은 이종성 B 세포 자극제의 사용 없이 달성되는, 방법.
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