CN116987157B - 一种弹状病毒包膜蛋白、含其的靶向慢病毒载体及其应用 - Google Patents
一种弹状病毒包膜蛋白、含其的靶向慢病毒载体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种弹状病毒包膜蛋白、含其的靶向慢病毒载体及其应用。所述弹状病毒包膜蛋白包括如SEQ ID NO:1或2所示的氨基酸序列。包膜蛋白组合包含所述的弹状病毒包膜蛋白；以及靶向蛋白，所述靶向蛋白依次由以下元件组成：跨膜结构域、接头序列和单链抗体。重组慢病毒载体包含所述的包膜蛋白组合。本发明的重组慢病毒载体有效提高了针对人CD34+造血干细胞的转导效率和特异性，为将来体内递送奠定基础，增加了安全性的同时极大的降低了治疗成本，具有较大的实用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术及生物医学技术领域，尤其涉及一种弹状病毒包膜蛋白、含其的靶向慢病毒载体、制备方法及其应用。
背景技术
无论在基础科研还是临床研究中，基因治疗已经在众多方向上展现出广泛应用前景。作为基因治疗系统的组成部分之一，递送平台负责保护核酸序列不被过度消耗并递送至适当位置发挥功能。而病毒介导的基因递送系统是利用病毒载体将核酸注入宿主细胞的能力来实现递送。这类载体包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒等，它们相较于其野生型病毒缺少了与自身复制相关的基因以保障其应用时的安全性。在递送途径上，它们包含离体递送和体内递送两种类型。在离体递送系统中，需先将目标组织细胞从机体中分离培养，再进行遗传物质的植入。在体内递送系统中，遗传物质直接转移到目标组织中，这意味着可以省略繁多的体外操作步骤。为了实现这一目标，病毒表面包膜蛋白需要具备极高的靶向性，否则它们在进入机体后很快会被消耗殆尽。水疱性口炎病毒（VSV）是弹状病毒科的一种包膜病毒。其表面的包膜糖蛋白VSV-G是病毒附着和进入宿主细胞的决定因素，包含约500个氨基酸，通过三聚体的形式存在于成熟病毒颗粒的表面。这种形式的蛋白质使病毒能够借助普遍表达的低密度脂蛋白受体（LDL-R）进入宿主细胞内，因此被广泛应用于病毒载体的假型化以实现基因递送。近年来，许多研究者致力于改变病毒载体的趋向性，已有研究针对VSV-G识别LDL-R的拓扑结构进行晶体解构，希望在保持其融合能力完整性的基础上影响二者的结合，以便根据需求来实现针对特定细胞的受体进行靶向递送，这对促进基因治疗在临床上的广泛应用有着重要意义。
水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)已成为生物医学应用最通用的假型化病毒包膜蛋白类型之一，作为I型跨膜糖蛋白通过N端的胞外受体结合域识别其天然受体，即低密度脂蛋白受体（LDL-R）。针对VSV-G的第8、47、209、354号氨基酸进行突变（H8A、K47Q、Y209A和R354A）能够在一定程度上消除其对LDL-R受体的亲和力，但研究中也发现即便对该4个位点的氨基酸同时进行突变，仍然会保留较低水平的结合（[1] Nikolic J, et al. NatCommun. 2018; [2] Dobson CS, et al. Nat Methods. 2022; [3] Yu B, et al. Cell.2022）。在面临细胞数量庞大的体内环境时这将展现出一定的脱靶情况，因此亟待更为有效的手段破坏其天然受体的结合。
由于其广泛的细胞嗜性，VSV-G支持将基因高效递送到大部分细胞类型中，例如神经元、骨髓干细胞、胰岛素肿瘤细胞等，但现有的野生型VSV-G仍然面临着一系列新的挑战：（1）野生型VSV-G假型化载体无法实现针对混合细胞中的特定细胞进行靶向递送，（2）现有突变体方案仍然会保留较低水平的脱靶，无法展现较高的水平特异性。因此亟须一种提高靶向载体在基因递送时的特异性产品或方法。
发明内容
为解决现有技术中缺乏具有高特异性的靶向载体或靶向递送方法的问题，本发明提供了一种包膜蛋白、含其的靶向慢病毒载体及制备方法和应用。
本发明的技术方案之一为提供了一种弹状病毒包膜蛋白，其中，所述弹状病毒包膜蛋白包括如SEQ ID NO: 1或2 所示的氨基酸序列。
在一些优选的实施例中，所述的弹状病毒包膜蛋白还包括信号肽，所述信号肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO: 3或4所示。
本发明的技术方案之二为提供了一种多核苷酸，其中，其编码如技术方案之一所述的弹状病毒包膜蛋白。
在一些优选的实施例中，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 6或7所示。
本发明的技术方案之三为提供了一种膜融合蛋白质粒，其中，其包含如技术方案之二所述的多核苷酸。
在一些优选的实施例中，所述膜融合蛋白质粒还包含巨细胞病毒增强子、巨细胞病毒启动子、人β-珠蛋白内含子、科扎克共有序列和/或人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号；和/或，所述膜融合蛋白质粒的质粒骨架为pMD2.G。其中巨细胞病毒增强子、巨细胞病毒启动子、人β-珠蛋白内含子、科扎克共有序列和/或人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号可以为常用质粒pMD2.G（Addgene，编号：12259，https://www.addgene.org/12259/）的元件。
本发明的技术方案之四为提供了一种包膜蛋白组合，其中，其包含如技术方案之一所述的弹状病毒包膜蛋白；以及靶向蛋白，所述靶向蛋白依次由以下元件组成：跨膜结构域、接头序列和单链抗体。
优选地，所述跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO: 5或10所示；
和/或，所述接头序列为（G4S）3；
和/或，所述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO: 14所示。
本发明的技术方案之五为提供了一种包膜蛋白质粒，其中，其包含如技术方案之三所述的膜融合蛋白质粒，还包括靶向蛋白质粒；
其中，所述靶向蛋白质粒中编码跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；和/或，所述靶向蛋白质粒中编码接头序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示；和/或，所述靶向蛋白质粒中编码单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。
任选地，所述靶向蛋白质粒还包含巨细胞病毒增强子、巨细胞病毒启动子、人β-珠蛋白内含子、科扎克共有序列和/或人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号。其中巨细胞病毒增强子、巨细胞病毒启动子、人β-珠蛋白内含子、科扎克共有序列和/或人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号可以为常用质粒pMD2.G的元件。
在一些优选的实施例中，所述膜融合蛋白质粒和靶向蛋白质粒位于同一质粒上或分别位于不同质粒上；和/或，所述包膜蛋白质粒采用的骨架载体为pMD2.G。
本发明的技术方案之六为提供了一种慢病毒载体包装系统，其中，所述慢病毒载体包装系统包含如技术方案之五所述的包膜蛋白质粒；以及辅助包装质粒和/或穿梭载体质粒；其中，所述辅助包装质粒为psPAX2，所述穿梭载体质粒为pCDH。
优选地，所述辅助包装质粒、所述穿梭载体质粒、所述膜融合蛋白质粒和靶向蛋白质粒的质量比为(3-1):(6-1):(3-1):( 3-1)，例如为3:6:1:3。
本发明的技术方案之七为提供了一种转化体，其中，所述转化体转染了如技术方案之五所述的包膜蛋白质粒或如技术方案之六所述的慢病毒载体包装系统；其中，所述转化体的受体细胞为真核细胞，优选动物细胞，更优选地HEK293T细胞。
本发明的技术方案之八为提供了一种重组慢病毒载体，其中，其包含如技术方案之四所述的包膜蛋白组合；或，其由培养如技术方案之七所述的转化体获得。
本发明的技术方案之九为提供了一种制备重组慢病毒载体的方法，其中，培养如技术方案之七所述的转化体，获得所述重组慢病毒载体。
本发明的技术方案之十为提供了一种药物组合物，其中，其包含如技术方案之七所述的转化体或如技术方案之八所述的重组慢病毒载体。
本发明的技术方案之十一为提供了一种试剂盒，其中，所述试剂盒包含如技术方案之五所述的包膜蛋白质粒、如技术方案之六所述的慢病毒载体包装系统、如技术方案之七所述的转化体、如技术方案之八所述的重组慢病毒载体和/或如技术方案之十所述的药物组合物。
本发明的技术方案之十二为提供了一种含如技术方案之八所述的重组慢病毒载体的细胞，其中，所述细胞为靶细胞或非靶细胞；所述靶细胞为Jurkat-CD34细胞或CD34造血干细胞；所述非靶细胞为Jurkat细胞。
本发明的技术方案之十三为提供了一种如技术方案之一所述的弹状病毒包膜蛋白，如技术方案之二所述的多核苷酸，如技术方案之三所述的膜融合蛋白质粒、如技术方案之四所述的包膜蛋白组合、如技术方案之五所述的包膜蛋白质粒、如技术方案之六所述的慢病毒载体包装系统、如技术方案之七所述的转化体、如技术方案之八所述的重组慢病毒载体、如技术方案之十所述的药物组合物或如技术方案之十一所述的试剂盒在制备基因治疗药物中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
（1）通过新设计的靶向慢病毒载体，有效提高递送载体工具的转导效率和特异性，将来体内递送能极大降低基因治疗成本。
（2）靶向慢病毒载体改造潜力较大，通过更换载体的特异性抗体可针对特定细胞类群实现靶向递送，进一步拓展现有的病毒载体的应用范围。
本发明中使用的靶向慢病毒载体有效提高了针对人CD34+造血干细胞的转导效率和特异性，为将来体内递送奠定基础，增加了安全性的同时极大的降低了治疗成本，具有较大的实用价值。
附图说明
图1为弹状病毒糖蛋白的受体结合活性位点分析。
图2为靶向慢病毒载体包膜蛋白质粒结构。
图3为弹状病毒突变体假型化慢病毒载体的转导测试示意图。
图4为装备靶向蛋白的重组慢病毒载体在靶细胞中的转导情况示意图。
图5为基于弹状病毒包膜蛋白突变体的靶向慢病毒载体在混合细胞中的靶向效果示意图。
图6为靶向慢病毒载体在临床血液样品中靶向测试结果示意图。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明提供了一种靶向特定细胞类群的重组慢病毒载体，能够实现高效且特异的基因递送。该病毒载体基于第三代慢病毒载体进行设计，专门针对慢病毒包膜蛋白进行改造，可以在不同细胞群体中实现靶向性基因递送。该发明中使用的慢病毒载体为假型化复制缺陷型慢病毒载体，完全敲除了病毒原有基因，本身不具有致病性。包膜蛋白为靶向改造后的水泡性口炎病毒糖蛋白（VSV-G），在保证其融合功能完整的基础上改造其与受体结合的氨基酸位点，以使其不再具备广泛的细胞趋向性，再通过额外添加的靶向蛋白使其特异结合靶细胞，以实现针对特定细胞高效且特异的基因递送。该重组慢病毒载体由第三代慢病毒辅助包装质粒、穿梭载体质粒以及包膜蛋白质粒共转染包装细胞系获得，所述包膜蛋白包括膜融合蛋白和靶向蛋白，膜融合蛋白质粒主要由以下元件组成（图2的A）：巨细胞病毒增强子（CMV enhancer）, 巨细胞病毒启动子（CMV promoter），人β-珠蛋白内含子（β-globin intron），科扎克共有序列（Kozak），弹状病毒糖蛋白突变体（G Mutant）编码区序列，人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号（β-globin poly A）。靶向蛋白质粒主要由以下元件组成（图2的B）：巨细胞病毒增强子（CMV enhancer）, 巨细胞病毒启动子（CMV promoter），人β-珠蛋白内含子（β-globin intron），科扎克共有序列（Kozak），靶向蛋白（Target protein）编码区序列，人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号（β-globin poly A）。
基于弹状病毒包膜蛋白假型化的靶向慢病毒载体，能够附着在宿主细胞受体上，并通过网格蛋白介导的内吞机制促进病毒进入。虽然在过去的几十年间，已有以水泡性口炎病毒为代表的弹状病毒包膜蛋白进行假型化的慢病毒载体，但广泛的细胞嗜性使其无法有效针对特定细胞类型如人CD34+造血干细胞进行基因递送，其载体结构有待进一步优化。
为了研发一种更加高效、特异的靶向慢病毒载体，本申请发明人对弹状病毒包膜蛋白进行了蛋白质结构分析，通过人工智能预测其受体结合关键位点，再通过实验验证重组慢病毒载体在造血干细胞中的递送效率和特异性，最终获得本申请的靶向慢病毒载体，即通过弹状病毒糖蛋白突变体（G Mutant）和靶向蛋白（Target）进行假型化的重组慢病毒载体。
本申请的慢病毒载体能够在不同细胞群体中靶向特定细胞类群，该载体对于常规慢病毒载体转导效率较低的CD34+造血干细胞也能完成高效转导。另外，基于此开发的载体将来能够用于体内直接靶向造血干细胞进行基因递送，减少应用过程中由动员、清髓、感染与培养等体外操作所引入的风险，可以有效降低造血干基因治疗的风险及成本，对于促使造血干细胞基因治疗更广泛的临床应用，缩短治疗进程，减少治疗费用有着重要意义。
实施例1：重组慢病毒载体包膜蛋白的结构分析
本例的重组慢病毒载体基于第三代慢病毒载体，针对病毒包膜蛋白进行假型化替换。已有研究针对野生型水泡性口炎病毒包膜蛋白VSV-G与其受体LDL-R的半胱氨酸重复序列结构域（CR）进行X射线衍射分析其结构基础（https://doi.org/10.2210/pdb5OYL/pdb），本例通过人工智能AlphaFold2（https://alphafold.ebi.ac.uk/）解析该结构的候选关键氨基酸位点，同时可通过结构分析软件PyMol（https://pymol.org/）对候选关键氨基酸位点进行改造标注。
实施例2：重组慢病毒载体包膜蛋白质粒的构建
本例的重组慢病毒载体包膜蛋白的膜融合蛋白是在弹状病毒糖蛋白基础上进行靶向改造。野生型弹状病毒包膜蛋白及其序列包括VSV-G（https://www.uniprot.org/uniprotkb/P04884/entry）和COCV-G（https://www.uniprot.org/uniprotkb/O56677/entry），通过引物引入氨基酸位点突变，第331号异亮氨酸（I）突变为丙氨酸（A），以构建针对候选关键氨基酸位点的蛋白突变体（G Mutant）。本例的重组慢病毒载体包膜蛋白的靶向蛋白由以下元件依次组成：跨膜结构域（TMD）、接头序列（Linker）以及单链抗体（scFv）。
本例使用的慢病毒包膜蛋白骨架载体为pMD2.G（Addgene，编号：12259），选择限制性内切酶PmlI（New England Biolabs，R0532L）和PstI（New England Biolabs，R3140M）将其线性化，再根据线性化载体末端序列设计Gibson组装引物分别扩增膜融合蛋白编码区序列以及靶向蛋白编码区序列。然后取0.2pmol的扩增产物与0.05pmol的线性化载体混合并使用去离子水将总体积补充至10μl，再加入10μl的2×Gibson Assembly Master Mix（NewEngland Biolabs，E2611L）混匀后于50℃孵育1小时，立即置于冰上冷却，并使用大肠杆菌Stbl3感受态细胞进行热激转化，在含氨苄青霉素的固体LB平板上37℃培养过夜，挑选单克隆进行菌落PCR鉴定，对阳性菌落进行一代测序验证，测序正确的质粒统一扩大培养和质粒提取。成功构建获得的重组慢病毒载体中代表性包膜蛋白质粒如图2的A所示。所有病毒蛋白编码区与对应引物的序列合成以及测序工作均由北京六合华大基因科技有限公司完成。
实施例3：重组慢病毒载体的制备
本例的重组慢病毒载体由包膜蛋白质粒和三代慢病毒包装质粒系统共转染HEK293T细胞。具体操作如下：
首先利用DMEM高糖培养基将HEK293T细胞密度调整为4×105个/ml，取2ml细胞悬液均匀接种于六孔培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h至汇合度约为80%。其中，DMEM高糖培养基中包含10%胎牛血清、1%双抗、1%L-谷氨酰胺溶液以及1%非必需氨基酸溶液。重组慢病毒载体的质粒总体系采用4μg，包括辅助质粒psPAX2（Addgene，编号：12260），穿梭质粒pCDH（基于pCDH-EF1a-eFFly-eGFP（Addgene，编号：104834，https://www.addgene.org/104834/），在CDS区仅保留EGFP），膜融合蛋白质粒pF，靶向蛋白质粒pT（见图2的A和B），质量比为3:6:1:3，使用转染试剂DNA Transfection Reagent（POLYPLUS，CPT117）共转染HEK293T，48h后收集细胞培养上清液并通过0.45μm滤膜过滤除去细胞沉淀，与病毒浓缩剂Lenti-X Concentrator（TAKARA，631232）混匀，4℃、15000g离心1h，除去上清，使用100μl培养基将沉淀重悬为病毒储存液，适量分装后于-80℃长期保存。
实施例4：病毒滴度评估
通过病毒RNA提取试剂盒（TIANGEN，DP315）提取10μl病毒储存液中的RNA，使用Lenti-X™ qRT-PCR Titration Kit（CLONTECH，631235）定量，以梯度稀释的病毒标准品做标准曲线对样品中慢病毒载体拷贝数（VCN）进行绝对定量，通过载体拷贝数乘以储存液稀释比例计算得到病毒滴度。病毒滴度计算公式如下：
实施例5：慢病毒转导
利用对应的RPMI 1640培养基将靶细胞（Jurkat-CD34）或/和非靶细胞（Jurkat）以及临床血液细胞样品密度调整为5×104个/ml，取1ml细胞悬液均匀接种于十二孔培养板中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h。除去原培养基，DPBS缓冲液清洗两次彻底去除原培养基，利用培养基按照MOI 10-20稀释病毒储存液，混匀加入靶/非靶细胞，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后除去上清液，DPBS缓冲液清洗两次，加入新鲜培养基继续培养48小时。
实施例6：目的基因表达情况及转导阳性率评估
通过荧光倒置荧光显微镜（OLYMPUS，IX73）观察并拍摄转导后细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达，再通过流式细胞仪（Beckmem CytoFLEX）评估细胞转导阳性率。先吸除原培养基，DPBS缓冲液清洗两次彻底去除原培养基，将细胞吹打成细胞悬液，调整细胞密度至1×105个/ml后取1 ml转移到1.5 ml离心管中，500g，5min离心，弃上清液后用0.5ml DPBS缓冲液清洗1遍；再次500g，5min离心，若需要在流式细胞仪中区分靶细胞和非靶细胞，则利用CD34-PE流式抗体（BIOLEGEND，CD34-581-04）对细胞进行半小时染色，500g，5min离心弃上清后用0.2ml DPBS缓冲液清洗一次，再次500g，5min离心重悬细胞，经细胞滤网过滤至流式管管底，吹打混匀细胞悬液后将流式管置于流式细胞仪上样槽，等待上样。在FSC/SSC图中调整门的位置、大小和形状，圈住目标细胞群，调节荧光通道的电压PE通道用于区分CD34阳性的靶细胞和CD34阴性的非靶细胞，FITC通道用于区分GFP阳性的转导阳性细胞和GFP阴性的转导阴性细胞，记录并保存数据。转导阳性率为GFP阳性细胞在总体细胞中占比，在混合细胞转导阳性率分为两部分：靶细胞与非靶细胞中的转导阳性率，靶细胞转导阳性率为靶细胞中GFP阳性细胞在总靶细胞中的占比，非靶细胞转导阳性率为非靶细胞中GFP阳性细胞在总非靶细胞中的占比。
实施例7：重组慢病毒载体包膜蛋白的结构分析
为了寻找膜融合蛋白结合受体的候选关键氨基酸位点，通过人工智能AlphaFold2（https://alphafold.ebi.ac.uk/）解析VSV-G与其受体LDL-R的半胱氨酸重复序列结构域（CR）的候选关键氨基酸位点，同时利用结构分析软件PyMol（https://pymol.org/）对候选关键氨基酸位点进行改造标注，如图1。
实施例8：重组慢病毒载体包膜蛋白质粒结构
本例的重组慢病毒载体包膜蛋白质粒结构如图2所示。包膜蛋白包括膜融合蛋白和靶向蛋白，膜融合蛋白质粒pF主要由以下元件组成（图2的A）：巨细胞病毒增强子（CMVenhancer），巨细胞病毒启动子（CMV promoter），人β-珠蛋白内含子（β-globin intron），科扎克共有序列（Kozak），弹状病毒糖蛋白突变体（G Mutant）编码区序列，人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号（β-globin poly A）。靶向蛋白质粒pT主要由以下元件组成（图2的B）：巨细胞病毒增强子（CMV enhancer），巨细胞病毒启动子（CMV promoter），人β-珠蛋白内含子（β-globin intron），科扎克共有序列（Kozak），靶向蛋白（Target protein）编码区序列，人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号（β-globin poly A）。其中靶向蛋白编码区包括PDGFR跨膜区（TMD）（https://www.uniprot.org/uniprotkb/P09619/entry），接头序列（Linker）如SEQID NO:12所示，G为甘氨酸，S为丝氨酸，以及单链抗体scFv（氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示）。
实施例9：膜融合蛋白假型化的重组慢病毒载体转导测试
利用构建的弹状病毒包膜蛋白突变体质粒进行慢病毒载体包装，通过GFP的表达对转导阳性率进行定量以衡量载体的基因递送能力。GFP表达如图3的A所示，转导阳性率与病毒滴度如图3的B、C所示。结果显示，在不装备靶向蛋白且滴度无显著差别情况下，相较于野生型弹状病毒包膜蛋白，已报道的K47Q/R354A双位点突变体的重组慢病毒载体在Jurkat细胞中转导效率从野生型的90%降低至3%左右，而I331A单位点突变体的慢病毒载体能够降低至1%以下。
实施例10：装备靶向蛋白的重组慢病毒载体转导测试
为了确定蛋白突变体的融合功能完整性，联合靶向蛋白再测试靶向慢病毒载体的转导效率。GFP表达情况如图4的A所示，流式结果如图4的B所示，转导阳性率与病毒滴度情况如图4的C所示。结果显示，在装备靶向蛋白且滴度无显著差别情况下，已报道的K47Q/R354A双位点突变体的重组慢病毒载体在靶细胞中转导效率由3%提升至60%左右，而I331A单位点突变体的重组慢病毒载体在靶细胞中转导效率由0.02%提升至60%左右，这表明该突变体的脱靶效率更低，因此将其作为靶向慢病毒载体TarV的膜融合蛋白用于后续测试。
实施例11：靶向慢病毒载体在混合细胞中靶向测试
为了测试靶向慢病毒载体在混合细胞中的靶向效果，在1靶:3非靶细胞的混合细胞中进行靶向慢病毒载体的转导测试。流式结果如图5的A所示，基于弹状包膜蛋白如VSVG和COCVG假型化的不同靶向慢病毒载体TarV均能针对混合细胞中50%的CD34阳性Jurkat靶细胞进行靶向转导，并且在CD34阴性Jurkat非靶细胞中这一比例在1%以下，而野生型VSVG或COCVG则无法区分靶细胞与非靶细胞进行靶向递送（图5的B）。
实施例12：靶向慢病毒载体在临床血液样品中靶向测试
为了测试靶向慢病毒载体在临床样品中的靶向效果，将血液细胞接种于培养板中进行靶向慢病毒载体的靶向测试。流式结果如图6的A所示，临床血液样品中CD34阳性的造血干细胞仅占总体血液细胞的0.6%，而靶向慢病毒载体能够针对60%以上的CD34阳性造血干细胞进行靶向转导，并且在CD34阴性非靶细胞中这一比例在1%以下，而野生型VSVG则无法区分进行靶向递送（图6的B）。
本发明所使用的序列如下所示：
VSV-G氨基酸序列（SEQ ID NO: 1）
KFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAAIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNDICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISTDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGDKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPVFTIINGTLKYFETRYARVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSLGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDETLFFGDTGLSKNPIEFVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIYLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK
COCV-G氨基酸序列（SEQ ID NO: 2）
KFSIVFPQSQKGNWKNVPSSYHYCPSSSDQNWHNDLLGITMKVKMPKTHKAIQADGWMCHAAKWITTCDFRWYGPKYITHSIHSIQPTSEQCKESIKQTKQGTWMSPGFPPQNCGYATVTDSVAVVVQATPHHVLVDEYTGEWIDSQFPNGKCETEECETVHNSTVWYSDYKVTGLCDATLVDTEITFFSEDGKKESIGKPNTGYRSNYFAYEKGDKVCKMNYCKHAGVRLPSGVWFEFVDQDVYAAAKLPECPVGATISAPTQTSVDVSLILDVERILDYSLCQETWSKIRSKQPVSPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYARIDIDNPIISKMVGKISGSQTERELWTEWFPYEGVEIGPNGILKTPTGYKFPLFMIGHGMLDSDLHKTSQAEVFEHPHLAEAPKQLPEEETLFFGDTGISKNPVELIEGWFSSWKSTVVTFFFAIGVFILLYVVARIVIAVRYRYQGSNNKRIYNDIEMSRFRK
VSV-G信号肽（SEQ ID NO: 3）：
MKCLLYLAFLFIGVNC
COCV-G信号肽（SEQ ID NO: 4）
MNFLLLTFIVLPLCSHA
跨膜结构域（TMD）氨基酸序列（SEQ ID NO: 5）
VVISAILALVVLTIISLIILIML
VSV-G核苷酸序列（SEQ ID NO: 6）：
AAGTTCACCATAGTTTTTCCACACAACCAAAAAGGAAACTGGAAAAATGTTCCTTCTAATTACCATTATTGCCCGTCAAGCTCAGATTTAAATTGGCATAATGACTTAATAGGCACAGCCTTACAAGTCAAAATGCCCAAGAGTCACAAGGCTATTCAAGCAGACGGTTGGATGTGTCATGCTTCCAAATGGGTCACTACTTGTGATTTCCGCTGGTATGGACCGAAGTATATAACACATTCCATCCGATCCTTCACTCCATCTGTAGAACAATGCAAGGAAAGCATTGAACAAACGAAACAAGGAACTTGGCTGAATCCAGGCTTCCCTCCTCAAAGTTGTGGATATGCAACTGTGACGGATGCCGAAGCAGTGATTGTCCAGGTGACTCCTCACCATGTGCTGGTTGATGAATACACAGGAGAATGGGTTGATTCACAGTTCATCAACGGAAAATGCAGCAATTACATATGCCCCACTGTCCATAACTCTACAACCTGGCATTCTGACTATAAGGTCAAAGGGCTATGTGATTCTAACCTCATTTCCATGGACATCACCTTCTTCTCAGAGGACGGAGAGCTATCATCCCTGGGAAAGGAGGGCACAGGGTTCAGAAGTAACTACTTTGCTTATGAAACTGGAGGCAAGGCCTGCAAAATGCAATACTGCAAGCATTGGGGAGTCAGACTCCCATCAGGTGTCTGGTTCGAGATGGCTGATAAGGATCTCTTTGCTGCAGCCAGATTCCCTGAATGCCCAGAAGGGTCAAGTATCTCTGCTCCATCTCAGACCTCAGTGGATGTAAGTCTAATTCAGGACGTTGAGAGGATCTTGGATTATTCCCTCTGCCAAGAAACCTGGAGCAAAATCAGAGCGGGTCTTCCAATCTCTCCAGTGGATCTCAGCTATCTTGCTCCTAAAAACCCAGGAACCGGTCCTGCTTTCACCATAATCAATGGTACCCTAAAATACTTTGAGACCAGATACGCCAGAGTCGATATTGCTGCTCCAATCCTCTCAAGAATGGTCGGAATGATCAGTGGAACTACCACAGAAAGGGAACTGTGGGATGACTGGGCACCATATGAAGACGTGGAAATTGGACCCAATGGAGTTCTGAGGACCAGTTCAGGATATAAGTTTCCTTTATACATGATTGGACATGGTATGTTGGACTCCGATCTTCATCTTAGCTCAAAGGCTCAGGTGTTCGAACATCCTCACATTCAAGACGCTGCTTCGCAACTTCCTGATGATGAGAGTTTATTTTTTGGTGATACTGGGCTATCCAAAAATCCAATCGAGCTTGTAGAAGGTTGGTTCAGTAGTTGGAAAAGCTCTATTGCCTCTTTTTTCTTTATCATAGGGTTAATCATTGGACTATTCTTGGTTCTCCGAGTTGGTATCCATCTTTGCATTAAATTAAAGCACACCAAGAAAAGACAGATTTATACAGACATAGAGATGAACCGACTTGGAAAGTAA
COCV-G核苷酸序列（SEQ ID NO: 7）
AAGTTCAGCATCGTCTTTCCTCAGTCTCAGAAAGGAAACTGGAAAAACGTGCCCTCAAGTTATCATTATTGCCCTAGTTCTTCCGATCAGAATTGGCACAACGATCTCCTCGGGATCACCATGAAGGTCAAGATGCCCAAGACCCACAAGGCTATCCAGGCAGATGGGTGGATGTGCCATGCAGCCAAATGGATCACCACATGTGATTTCAGGTGGTACGGCCCAAAATACATCACCCATAGTATCCATTCTATCCAGCCAACCTCTGAACAGTGTAAAGAGTCTATAAAGCAGACAAAACAGGGAACCTGGATGAGTCCAGGCTTCCCCCCCCAGAATTGTGGGTATGCAACAGTCACCGACTCAGTGGCCGTTGTCGTGCAGGCTACTCCTCACCATGTGTTGGTCGATGAGTATACCGGCGAGTGGATCGATTCACAGTTCCCCAACGGAAAATGTGAGACCGAGGAATGTGAGACAGTGCACAACAGTACTGTGTGGTATTCTGACTACAAGGTCACGGGCTTGTGTGACGCCACATTGGTGGACACTGAGATCACCTTCTTCTCAGAAGATGGAAAAAAGGAGTCCATCGGGAAACCCAATACTGGGTATAGATCTAACTACTTTGCCTACGAGAAGGGAGACAAGGTGTGCAAGATGAACTATTGCAAACACGCAGGTGTGAGGTTGCCCTCAGGGGTATGGTTTGAATTTGTGGACCAAGACGTGTATGCCGCTGCAAAGTTGCCGGAGTGTCCCGTGGGTGCTACAATTAGCGCTCCAACACAAACCTCCGTCGACGTATCACTCATCCTGGATGTTGAGAGAATCCTGGATTATTCTCTGTGTCAAGAAACATGGAGTAAAATCCGATCCAAGCAGCCTGTGAGTCCCGTAGATCTGTCCTATCTGGCTCCTAAGAACCCTGGAACAGGACCCGCCTTTACCATTATCAATGGAACATTGAAGTACTTCGAGACACGCTATGCAAGAATTGATATCGATAACCCTATTATTAGCAAAATGGTGGGCAAAATTAGTGGAAGTCAGACGGAGAGAGAGCTGTGGACAGAGTGGTTCCCCTATGAAGGGGTGGAGATAGGACCAAACGGCATTCTCAAAACTCCCACGGGATACAAATTTCCTCTTTTTATGATTGGGCACGGAATGTTGGACTCTGACCTGCACAAGACAAGTCAGGCCGAGGTATTTGAGCACCCACACCTCGCTGAGGCTCCAAAACAGCTGCCGGAGGAGGAGACACTGTTCTTCGGTGACACAGGGATATCAAAGAACCCCGTGGAGCTCATCGAGGGTTGGTTTAGCTCCTGGAAGTCCACTGTTGTCACTTTCTTTTTCGCAATAGGCGTATTCATCCTTCTCTATGTCGTAGCGCGGATCGTGATTGCCGTGCGATACAGATATCAGGGATCAAACAATAAAAGGATCTACAATGATATCGAGATGAGCCGGTTTCGGAAGTGA
VSV-G信号肽核苷酸序列（SEQ ID NO: 8）
ATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGGGGTGAATTGC
COCV-G信号肽核苷酸序列（SEQ ID NO: 9）
ATGAACTTTCTGCTGTTGACCTTCATCGTCCTGCCACTGTGCAGCCATGCT
靶向质粒中核苷酸序列：依次为启动密码子（ATG）-跨膜结构域（TMD）-接头序列（Linker）-单链抗体（scFv）-6×His-tag-终止密码子（TAA）。其中，
跨膜结构域（TMD）的氨基酸序列（SEQ ID NO:10）
RPKKQWLMILIILSIITLVVLALIASIVVVTG
跨膜结构域的核苷酸序列（SEQ ID NO:11）
AGACCAAAGAAGCAGTGGTTGATGATCCTCATCATACTTTCTATCATCACACTGGTGGTGCTGGCCCTGATCGCATCTATCGTGGTCGTAACTGGG
接头（Linker）的氨基酸序列（SEQ ID NO:12）
GGGGSGGGGSGGGGS
接头的核苷酸序列（SEQ ID NO:13）
ggtggaggtggctctggtggaggaggctctggaggtggtggatca
scFv的氨基酸序列（SEQ ID NO:14）
AAQPAQIQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNWVRQAPGQGLKWMGWINTNTGEPKYAEEFKGRFALSLDTSVSTAYLQINSLKAEDTAVYFCARGYGNYARGAWLAYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDVLLTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQTIVHSNGNTYLEWFQQRPGQSPRLLIYQVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPRTFGGGTKVEIKRTVALERGS
scFv的核苷酸序列（SEQ ID NO:15）
gcggcccagccggcccagatccaactcgtccagtccggctcagagctaaagaaacccggagccagtgtaaaggtgagctgcaaagcatctgggtacacctttacaaactatggtatgaattgggttcgccaagcgccaggccagggactgaagtggatggggtggataaacacgaatactggtgaaccgaaatacgctgaggagttcaagggccgattcgccttatccttggacacctcagtctcgacagcatatcttcaaattaacagtctcaaagcggaggatacggctgtatacttttgtgcccggggatatgggaattacgcaagaggtgcgtggctcgcttattggggccagggaactctggtgaccgtttcttctggaggcggaggatctggcggagggggatccgggggaggcggatctgacgtcttgcttacccagtcccccctctcactaccagtaacactgggccaaccggcctcgatcagttgccgcagctctcagacgatagtgcactccaacggaaatacttacttagagtggttccaacagcgacctgggcaatcaccgcggttgcttatttatcaggtttcgaacagatttagtggtgtccctgataggttcagcggctctggctccgggaccgactttacactcaagatctcacgtgtagaagcagaggatgtgggtgtttactattgtttccaaggctcgcatgtcccccgcacgtttggagggggtactaaagtagaaataaagcgaactgtggctctcgagagaggttct
6×His-tag的核苷酸序列（SEQ ID NO:16）
catcaccatcaccatcac。
Claims (17)
1.一种弹状病毒包膜蛋白，其特征在于，所述弹状病毒包膜蛋白的氨基酸序列如SEQID NO: 1或2所示。
2.一种多核苷酸，其特征在于，其编码如权利要求1所述的弹状病毒包膜蛋白。
3. 如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 6或7所示。
4.一种膜融合蛋白质粒，其特征在于，其包含如权利要求2或3所述的多核苷酸。
5.如权利要求4所述的膜融合蛋白质粒，其特征在于，所述膜融合蛋白质粒还包含巨细胞病毒增强子、巨细胞病毒启动子、人β-珠蛋白内含子、科扎克共有序列和/或人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号；和/或，所述膜融合蛋白质粒的质粒骨架为pMD2.G。
6.一种包膜蛋白质粒，其特征在于，其包含如权利要求4或5所述的膜融合蛋白质粒，还包括靶向蛋白质粒；
所述靶向蛋白质粒中的靶向蛋白依次由以下元件组成：跨膜结构域、接头序列和单链抗体；
所述靶向蛋白质粒中编码单链抗体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 15所示。
7. 如权利要求6所述的包膜蛋白质粒，其特征在于，所述靶向蛋白质粒中编码跨膜结构域的核苷酸序列如SEQ ID NO: 11所示；和/或，所述靶向蛋白质粒中编码接头序列的核苷酸序列如SEQ ID NO: 13所示。
8.如权利要求6或7所述的包膜蛋白质粒，其特征在于，所述靶向蛋白质粒还包含巨细胞病毒增强子、巨细胞病毒启动子、人β-珠蛋白内含子、科扎克共有序列和/或人β-珠蛋白多聚腺苷酸化信号。
9.如权利要求6或7所述的包膜蛋白质粒，其特征在于，所述膜融合蛋白质粒和靶向蛋白质粒位于同一质粒上或分别位于不同质粒上；和/或，所述包膜蛋白质粒采用的骨架载体为pMD2.G。
10.一种慢病毒载体包装系统，其特征在于，所述慢病毒载体包装系统包含如权利要求6~9任一项所述的包膜蛋白质粒；以及辅助包装质粒和/或穿梭载体质粒；其中，所述辅助包装质粒为psPAX2，所述穿梭载体质粒为pCDH。
11.一种转化体，其特征在于，所述转化体转染了如权利要求6~9任一项所述的包膜蛋白质粒或如权利要求10所述的慢病毒载体包装系统；其中，所述转化体的受体细胞为真核细胞。
12.一种重组慢病毒载体，其特征在于，其由培养如权利要求11所述的转化体获得。
13.一种制备重组慢病毒载体的方法，其特征在于，培养如权利要求11所述的转化体，获得所述重组慢病毒载体。
14.一种药物组合物，其特征在于，其包含如权利要求11所述的转化体或如权利要求12所述的重组慢病毒载体。
15.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求6~9任一项所述的包膜蛋白质粒、如权利要求10所述的慢病毒载体包装系统、如权利要求11所述的转化体、如权利要求12所述的重组慢病毒载体和/或如权利要求14所述的药物组合物。
16.一种含如权利要求12所述的重组慢病毒载体的细胞，其特征在于，所述细胞为靶细胞或非靶细胞；所述靶细胞为Jurkat-CD34细胞或CD34造血干细胞；所述非靶细胞为Jurkat细胞。
17.一种如权利要求1所述的弹状病毒包膜蛋白、如权利要求2或3所述的多核苷酸、如权利要求4或5所述的膜融合蛋白质粒、如权利要求6~9任一项所述的包膜蛋白质粒、如权利要求10所述的慢病毒载体包装系统、如权利要求11所述的转化体、如权利要求12所述的重组慢病毒载体、如权利要求14所述的药物组合物或如权利要求15所述的试剂盒在制备基因治疗药物中的应用。
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| Surface-Engineered Lentiviral Vectors for Selective Gene Transfer into Subtypes of Lymphocytes;Annika M. Frank等;Molecular Therapy: Methods & Clinical Development;第12卷;第19-31页 * |
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