CN103314104A - 基于慢病毒载体的抗疟疾免疫化合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用源自RNA病毒的确定的异源病毒包膜蛋白假型化的慢病毒载体颗粒，所述慢病毒载体颗粒在其基因组中包含至少一个重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码至少一个具有能够感染哺乳动物宿主的疟原虫属寄生虫的抗原的表位的多肽。所述慢病毒载体颗粒用于引发抗疟疾寄生虫的免疫应答。
Description
本发明涉及基于慢病毒载体的抗疟疾免疫化合物。
鉴于在疫苗策略的设计中已观察到的妨碍，导致高死亡率和发病率的许多疾病例如疟疾仍然使得必需开发能够引发强T细胞介导的免疫和有利地强劲的体液免疫应答的新型疫苗平台。在影响人类的寄生虫感染中，已针对疟疾进行了许多尝试以获得此类疫苗。
然而，关于疟疾，只有包含辐照减毒的子孢子(sporozoite)的疫苗始终一致地在啮齿类动物(Nussenzweig R.S.等人,Nature 216,160-162(1967))、猴子(Gwadz；R.W.等人,Bull World Health Organ57 Suppl 1,165-173(1979))和人(Clyde,D.F.等人,Am J.Med Sci266,169-177(1973)中诱导杀菌免疫。虽然非常有趣，但在其可被认为有希望用于大规模接种之前，辐照子孢子疫苗法仍然需要克服许多挑战，特别是涉及安全、生产、贮存和分发的挑战。
在综述文章中，Limbach K.J.和Richie T.L.(Parasitimmunology,2009,31,501-519)已考虑过不同的、可获得的抗疟疾疫苗平台，所述平台基于将病毒载体用作引发免疫应答的抗原的递送工具。此类平台包括基于以痘病毒为载体的(poxvirus-vectored)疟疾抗原或以腺病毒为载体(adenovirus-vectored)的疟疾抗原而设计的疫苗，两种类型的载体特别地都在牵涉异源引发-加强施用方案的方法中被提出。除了此类基于痘病毒或腺病毒的技术以外，该综述的作者还公开，相应地考虑到以黄热病病毒为载体的策略或以甲病毒复制子为载体的策略，新型载体系统在动物模型中可能是非常有前景的。他们还设想了各种潜在地令人感兴趣的方法来克服在设计疫苗载体(所述疫苗载体可在哺乳动物宿主中有效提供长效免疫并且满足给人类宿主施用所需的安全性要求)中持续存在的困难。此类方法包括抗原的异源递送方法的组合、佐剂或免疫调节组分的使用。
为了克服至少一些当测定提及的现有技术中的疫苗组合物时观察到的缺点，本发明人已考虑了这样的方法，其以慢病毒载体为新型接种平台的基础，以期开发抗疟疾的预防性疫苗。
疟疾为由按蚊属(Anophele)蚊子传播给宿主的疾病并且在许多国家为地方病，其在这些国家中每年造成数百万人的死亡。除死亡率外，疟疾在其为地方病的国家中在很大一部分群体中引发疾病，从而引起了这些国家的医学和经济学关注。
已知疟原虫属(Plasmodium)寄生虫的5个种感染人：间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、诺氏疟原虫(Plasmodium knowlesi)(17)和恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)，后者为引起几乎全部死亡案例的疟疾病原体。人的感染始于源自雌蚊的子孢子形式的寄生虫的接种。这些形式的寄生虫被快速地从血流转移至人宿主的肝脏，在肝脏中它们继续侵入肝细胞。取决于疟原虫的株系，寄生虫的肝内周期的持续时间为5至15天，恶性疟原虫的肝内周期持续时间较短(约5.5天)。由于在感染的细胞中的无性复制，寄生虫在肝脏中扩增，产生了裂殖子形式的寄生虫。在裂殖子从肝细胞释放后，它们继续向相应于人宿主的感染的症状期的血液阶段感染(blood-stage infection)进展。因此，裂殖子快速地通过特定的膜受体渗入红细胞(红血球)。红细胞的裂殖子侵入相应于周期的红内期，其持续48至72小时(取决于疟原虫的株系)。在该阶段中，裂殖子经历多次核分裂，导致更多裂殖子的释放，所述裂殖子能够侵入其它红细胞，从而重复周期。在人中，症状性疾病为红细胞侵入效应，红细胞破坏和宿主应答的结果。在感染过程中，一些寄生虫形式分化(differenciate)为配子母细胞，其随后被蚊子摄入，并且在蚊子中它们经历孢子生殖周期(sporogoniccycle)，产生随后感染人的子孢子。
由于感染周期包括在人体中的不同阶段和寄生虫的不同形式，因此已提出各种策略，以递送疫苗物质，并且疟原虫的各种抗原已被提出作为免疫应答的靶，特别是当需要体液抗体应答时。
适用于引起或促进免疫应答的靶候选物可包括各种抗原(以期设计疫苗)，并且因此包括“肝期(liver-stage)抗原”(也称为“红细胞前期(pre-erythrocytic stage)抗原”)和/或“血液阶段抗原”。
在本发明的框架内，本发明人已首先考虑，疟疾寄生虫的红细胞前期抗原可有利地用于引发在群体水平上一致有效的保护性免疫应答，因为它们比寄生虫在人中的周期的更晚期出现的抗原显示更小的变异性。本发明人还已考虑，对于长期的抗疟疾保护作用，适合于引发细胞应答的手段是必需的，并且可有利地由体液应答补充。
本发明人因此确定，保护性免疫应答需要有效效应细胞和记忆细胞的发生和发展，并且所述应答应当足够强，以超过对于天然感染观察到的免疫应答的功效。
本发明因此提供了基于慢病毒的新型载体，其用作用于制备或开发疟疾疫苗的平台，所述载体，除了作为免疫组合物的有效成分的递送工具外，还使得能够确定适合用于引发强劲且长效的免疫应答(当施用给人时)的适当的免疫模式，如在通常用于疟疾的鼠模型中证明的。
本发明因此涉及慢病毒载体颗粒，其为慢病毒载体颗料，特别是无复制能力的慢病毒载体颗粒，特别是无复制能力的基于HIV的载体颗粒，其特征在于(i)它们用确定的异源病毒包膜蛋白或源自RNA病毒的病毒包膜蛋白来进行假型化(pseudotyped)，和(ii)它们在其基因组中包含至少一个重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码至少一个具有能够感染哺乳动物宿主的疟原虫属寄生虫的红细胞前期抗原的表位的多肽，其中所述表位包括T-表位。
在本发明的具体实施方案中，疟原虫属寄生虫的红细胞前期抗原的编码的多肽还包括B-表位。
根据本发明，慢病毒载体颗粒设计为表达精通型(proficient)颗粒(即，具有整合能力(integrative-competent))或表达缺陷型颗粒(即，不具有整合能力(integrative-incompetent))。
表述“疟疾寄生虫”和“疟原虫属寄生虫”在本申请中可互换使用。它们是指，与在哺乳动物特别地人宿主中的周期的不同阶段相关的寄生虫的每一种形式和所有形式，具体地包括子孢子，特别是在接种后存在于血流中的子孢子或在肝细胞中产生的子孢子、裂殖子，特别地包括在肝细胞中产生的裂殖子(红细胞前期的形式，且包括周期的红内期的形式例如周期的红细胞中包含的裂殖子)。寄生虫的此类形式的特征在于各种特异性抗原，所述抗原在本领域是公知的，且已被鉴定，并且还可参考感染的阶段来命名。
表述“T-表位”和“B-表位”是指，分别参与由T细胞驱动的适应性免疫应答和由B细胞驱动的免疫应答的抗原决定簇。特别地，当在适当的条件下被递送至宿主时，所述T表位和B表位分别引发T细胞和B细胞免疫应答。
本发明中定义的慢病毒载体颗粒(或慢病毒载体或基于慢病毒的载体颗粒)为由下述组成的假型化的慢病毒载体：具有源自与提供慢病毒载体颗粒的载体基因组的特定慢病毒(特别是HIV，特别是HIV-1)不同的病毒的包膜蛋白的载体颗粒。因此，所述包膜蛋白相对于颗粒的载体基因组，为“异源”病毒包膜蛋白。在下文中，当提及“包膜蛋白”时，其包括适合于进行本发明的任何类型的包膜蛋白。
当在本申请中提及“慢病毒”载体(基于慢病毒的载体)时，其在具体的实施方案中包括，基于HIV的载体和特别地基于HIV-1的载体。
根据本发明的慢病毒载体为置换型载体，意指编码慢病毒蛋白质的原始慢病毒序列在载体的基因组中基本上被缺失或，当存在时，被修饰，特别地被突变，特别地被截短，以阻止生物学活性的慢病毒蛋白质的表达，特别地，在HIV的情况下，阻止所述转移载体表达功能性ENV、GAG和POL蛋白以及任选地慢病毒特别是HIV的其它结构蛋白和/或辅助蛋白和/或调控蛋白。
载体颗粒的“载体基因组”为还包含编码疟疾寄生虫的多肽的目的多核苷酸或转基因的重组载体。载体基因组的基于慢病毒的序列以及多核苷酸/转基因由质粒载体携带，从而产生也称为“序列载体”的“转移载体”。因此，这些表述在本申请中可互换使用。
本文中定义的载体基因组因此，除置于用于其表达的适当调控序列的控制之下的所谓的重组多核苷酸外，还包含原始慢病毒基因组的序列，所述原始慢病毒基因组的序列为所述基因组的非编码区并且是提供DNA或RNA合成和加工的识别信号所必需的(最小病毒基因组)。这些序列是包装、逆转录和转录并且也是实现本发明的特殊目的所必需的顺式作用序列，它们包含有利于细胞的入核运输和因此有利于转基因在所述细胞中的转移效率的功能性序列，此类元件被描述为DNAFlap元件并且包含存在于慢病毒基因组序列中或一些反转录因子例如酵母的反转录因子中的所谓中央cPPT-CTS核苷酸结构域或由其组成。
用于制备本发明的慢病毒载体的载体基因组的结构和组成基于本领域描述的原理，且基于最初在(Zennou等人,2000；Firat H.等人,2002；VandenDriessche T.等人)中公开的此类慢病毒载体的实例。该类型的构建体已保藏在CNCM(Institut Pasteur,France)，如本文中将提及的。在该方面，也参考专利申请WO 99/55892、WO 01/27300和WO 01/27304中的公开内容，包括保藏的生物材料。
根据本发明的具体实施方案，载体基因组可以为置换型载体，其中2个长末端重复(LTR)之间的所有病毒蛋白质编码序列已被编码疟疾寄生虫的多肽的重组多核苷酸替换，并且其中DNA-Flap元件已重新插入与本文中描述的所需的顺式作用序列关联。与颗粒的制备相关的关于载体基因组的组成的其它特征已被公开。
本发明的慢病毒载体颗粒可在其基因组中包含超过一个编码至少一个具有本文中公开的红细胞前期抗原的表位的多肽的重组多核苷酸。特别地，所述载体基因组包含在基因组中连续的或分开的两个多核苷酸，并且所述两个多核苷酸编码疟原虫属寄生虫的红细胞前期的相同或不同抗原的不同多肽，或不同形式的疟疾寄生虫的不同抗原(特别是寄生虫的红细胞前期的抗原和红内期的抗原)的不同多肽。
在具体实施方案中，载体基因组包含两个重组多核苷酸，其每一个编码不同的多肽并且每一个多肽源自相同阶段的不同抗原。
关于表述“具有/携带抗原的表位的多肽”，根据本发明其意指，可以为疟原虫属寄生虫的天然抗原，其突变形式，特别地此类天然抗原的片段以及特别地此类天然抗原的截短形式的多肽。多肽具有足以提供一个或数个表位的氨基酸序列，并且因此可具有至少约4个氨基酸残基，特别地约4至约8个氨基酸残基(对于构象B表位)或至少约9个氨基酸残基，特别地约9至约19个氨基酸残基(对于连续T表位)的长度。
在本发明的具体实施方案中，慢病毒载体颗粒的重组多核苷酸编码疟疾寄生虫的抗原的截短形式，特别地，因全长(即天然)抗原的功能性结构域的缺失而产生的片段(当所述结构域对于引发宿主的免疫应答是有害的或是无用的时)。
在本发明的具体实施方案中，慢病毒载体颗粒在其基因组中包含至少一个重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码来自疟原虫属寄生虫特别地恶性疟原虫或三日疟原虫、间日疟原虫、卵形疟原虫或诺氏疟原虫的环子孢子蛋白的抗原的多肽。其特别地为CSP的截短形式，特别是缺乏CSP的GPI锚定基序的多肽。
在本发明的实施方案中，慢病毒载体颗粒在其基因组中包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸，可能地除了CSP的抗原的多肽以外，还编码选自下述的抗原的多肽：子孢子表面蛋白2(TRAP/SSP2)、肝期抗原(LSA，特别地LSA3)、Pf输出蛋白1(Pf Exp1)/Py肝细胞红细胞蛋白(PyHEP17)以及Pf抗原2(其中Pf代表恶性疟原虫并且Py代表约氏疟原虫(Plamsodium yoelii))、子孢子和肝期抗原(SALSA)、子孢子富含苏氨酸和天冬酰胺(STARP)或其它红细胞前期抗原。
在本发明的具体实施方案中，疟疾寄生虫的抗原的多肽为CSP蛋白的片段，并且其与疟疾寄生虫的另一种抗原(来自红细胞前期的抗原或来自红内期的抗原)的多肽由载体基因组共表达。可用于设计根据本发明的编码多肽的多核苷酸的红内期的抗原为裂殖子表面蛋白1(MSP2)，特别地裂殖子表面蛋白1(MSP-1)、裂殖子表面蛋白2(MSP-2)、裂殖子表面蛋白3(MSP-3)、裂殖子表面蛋白4(MSP-4)、裂殖子表面蛋白6(MSP-6)、环状体感染红细胞表面抗原(Ring-infected erythrocyte surface antigen，RESA)、棒状体相关蛋白1(Rhoptry associated protein 1，RAP-1)、顶膜抗原1(AMA-1)、红细胞结合抗原(EBA-175)、红细胞膜相关巨大蛋白或抗原332(Ag332)、dnaK-型分子伴侣、富含谷氨酸的蛋白质(GLURP)，特别地MSP3-GLURP融合蛋白(WO 2004/043488；参考文献28)、红细胞膜蛋白1(EMP-1)、丝氨酸重复抗原(SERA)、富含集簇的天冬酰胺的蛋白质(CARP)、环子孢子蛋白相关抗原前体(CRA)、细胞粘连连接的无性蛋白(Cytoadherence-linked asexual protein，CLAG)、酸性碱性重复抗原(Acid basic repeat antigen，ABRA)或101kDa疟疾抗原、棒状体抗原蛋白(RAP-2)、结节相关富组氨酸蛋白(Knob-associatedhistidine-rich protein，KHRP)、棒状体抗原蛋白(RAP)、半胱氨酸蛋白酶、假定蛋白质PFE1325w、保护性抗原(MAg-1)、果糖-二磷酸醛缩酶、核糖体磷蛋白P0、P-型ATP酶、葡萄糖调节蛋白(GRP78)、富含天冬酰胺和天冬氨酸的蛋白质(AARP1)、散在重复抗原(Interspersed repeat antigen)或PFE0070w。
可用于设计根据本发明的编码多肽的多核苷酸的有性阶段的抗原为有性阶段子孢子表面抗原、抗原Pfg27/25、抗原QF122、11-1多肽、配子母细胞-特异性表面蛋白(Pfs230)、动合子表面蛋白(P25)、壳多糖酶、多药抗性蛋白质(MRP)。
此类抗原是参考恶性疟原虫公开的，并且可在其它疟原虫属的种中具有对应物。它们报导于Vaughan K.等人(18)中。
Vaughan K等人具体地公开了所述抗原的表位，其可由本领域技术人员用作制备用于本发明的载体的重组多核苷酸的基础。
疟原虫属寄生虫的上述抗原已公开于现有技术中，包括通过可在数据库中获得的它们的序列公开。
环子孢子蛋白(CSP)为用于制备本发明的慢病毒载体颗粒的优选抗原之一。其构成子孢子衣壳蛋白质，所述衣壳蛋白质在过去已被认为是保护性抗体的靶。除了其引发抗CS抗体的能力外，该抗原还包含T表位，特别地包括CD8+T细胞表位和CD4+T细胞表位。具体的CSP抗原通过它们的氨基酸序列公开为SEQ ID No 20、23、26、27、28、29、30、31或为SEQ ID No 32(这些序列的共有序列)。间日疟原虫的序列以AY674050.1在GenBank中给出。
在本发明的具体实施方案中，慢病毒载体颗粒在其基因组中具有重组多核苷酸，所述重组多核苷酸至少编码约氏疟原虫的CSP抗原的多肽(如实施例中举例说明的)或有利地恶性疟原虫的CSP抗原的多肽，例如相应于约氏疟原虫的缺乏GPI-锚定基序的所述CSP抗原的片段的多肽为具有序列SEQ ID No 21的CSP DGPI。所述GPI基序相应于约氏疟原虫的CSP抗原的天然氨基酸序列中的C末端部分的最后12个氨基酸残基。恶性疟原虫中的所述CSP蛋白质片段的对应物公开于附图和序列(对于天然蛋白质，SEQ ID No 23；对于缺乏GPI基序的序列，SEQ ID No 24；对于在N末端被截短的序列，SEQ ID No 25)中并且用于在适当的鼠模型中提供多肽引发保护性免疫应答和甚至抗疟疾的杀菌保护作用的能力的证据。
在本发明的具体实施方案中，慢病毒载体颗粒的多核苷酸具有经哺乳动物密码子优化的(CO)核苷酸序列，以及任选地所述颗粒的基因组的慢病毒序列具有经哺乳动物密码子优化的核苷酸序列。
已观察到经密码子优化的核苷酸序列，特别地当针对哺乳动物中，特别地人细胞中的表达进行优化时，使得能够在此类哺乳动物或人细胞中产生更高产率的颗粒。在实施例中举例说明了生产性细胞。因此，当给哺乳动物，特别地给人宿主施用本发明的慢病毒载体颗粒时，在所述宿主中产生更大量的颗粒，这有利于引发强免疫应答。
在本发明的具体实施方案中，本文中公开的慢病毒载体颗粒还在它们的基因组中包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码上文中公开的寄生虫周期的血液阶段的抗原和/或有性阶段的抗原的多肽。
多肽为天然抗原或其修饰形式，特别地包含T细胞表位或B细胞表位或两者的片段或由T细胞表位或B细胞表位或两者组成的片段。
由于施用本发明的慢病毒载体颗粒而表达的多肽的实例为，由下文中公开的载体质粒(或序列载体)编码的多肽。
本发明还特别地涉及于2010年4月20日保藏在CNCM(Paris,France)并且具有下列特征和登录号的此类载体质粒：
此类质粒描述于本申请的附图和序列中。它们所包含的转基因的序列来自约氏疟原虫。所述转基因可有利地被来自恶性疟原虫的适当序列替换。
本发明还涉及此类质粒的变体，其中编码疟原虫抗原的多肽的多核苷酸被修饰以编码其功能性免疫原性变体，或被来自另一种疟原虫株系特别地来自恶性疟原虫的密码子经优化的相应多核苷酸置换，被修饰以用本文中引述的启动子之一置换CMV启动子。
在保藏的质粒中，编码约氏疟原虫抗原的多肽的多核苷酸是经密码子优化的。
根据本发明，利用异源病毒包膜蛋白质或源自RNA病毒的包膜的病毒多聚蛋白(polyprotein)假型化慢病毒载体颗粒，所述RNA病毒不是提供慢病毒颗粒的基因组的慢病毒序列的慢病毒。
作为用于制备慢病毒载体颗粒的分型包膜蛋白的实例，本发明涉及水疱性口炎病毒(VSV)的病毒跨膜糖基化(所谓的G蛋白)包膜蛋白，所述蛋白质例如选自印地安纳株的VSV-G蛋白、新泽西株的VSV-G蛋白、Cocal株的VSV-G蛋白、伊斯法罕株的VSV-G蛋白、金迪普拉株的VSV-G蛋白、皮里株的VSV-G蛋白或SVCV株的VSV-G蛋白。
水疱性口炎病毒的包膜糖蛋白(VSV-G)为用作野生型病毒颗粒的表面衣壳的跨膜蛋白质。其也是工程改造的慢病毒载体的适当的衣壳蛋白。目前，9个病毒物种被明确分类在VSV属中，19种弹状病毒被临时分类在该属中，所有病毒都显示不同程度的交叉中和。当测序时，蛋白质G基因显示序列相似性。VSV-G蛋白包括N末端胞外结构域、跨膜区和C末端细胞质尾。其通过转运高尔基体网络(transGolginetwork)(内质网和高尔基体)被输出至细胞表面。
水疱性口炎印第安纳病毒(VSIV)和水疱性口炎新泽西病毒(VSNJV)为假型化本发明的慢病毒载体，或设计假型化慢病毒载体的重组包膜蛋白的优选株系。它们的VSV-G蛋白公开于GenBank中，其中存在几个株系。关于新泽西株的VSV-G，特别地参考具有登录号V01214的序列。关于印第安纳株的VSV-G，参考相应于株系JO2428的、在Genbank中具有登录号AAA48370.1的序列。
或者，在VSV中，金迪普拉病毒(CHPV)、Cocal病毒(COCV)、Perinet病毒(PERV)、皮里病毒(PIRYV)、SVCV或伊斯法罕病毒可以为良好的候选物，用于设计假型化包膜蛋白，以及特别地制备用于免疫的加强步骤的颗粒，因而当将本发明的载体颗粒用于引发-加强施用方案时提供第二包膜蛋白或第三包膜蛋白或其它包膜蛋白。当相应地使用时，Cocal病毒包膜蛋白对于引发-加强方案的晚期或最后施用是优选的。然而，当比较利用使用不同包膜制备的颗粒获得的载体滴度时，金迪普拉病毒(CHPV)和皮里病毒(PIRYV)可提供由于对于它们的受体的较低亲和力而具有低融合性的包膜蛋白。因此，在第一方法中，为了制备具有有效转导能力的颗粒，可将此类包膜排除在包膜的选择之外。
本文中提及的VSV-G蛋白的氨基酸序列和编码序列公开于专利申请WO 2009/019612中。此类氨基酸序列的具体实例也在本申请中提供为SEQ ID No 77、79、82、84、86、88、90。包含VSV-G编码序列的质粒描述于申请WO 2009/019612(其通过引用并入本文)中。质粒已被保藏在CNCM(Paris,France)。编码所述包膜蛋白的核苷酸序列在本申请中公开为SEQ ID No 76、78、81、83、85、87、89。
在本发明的具体实施方案中，所述第一和第二以及，如果有的话，所述第三或其它病毒包膜蛋白能够被抗原呈递细胞，特别地被树突细胞包括肝树突细胞通过融合和/或胞吞作用摄入。在具体的实施方案中，摄入效率可用作选择用于假型化的VSV包膜的特征。在这方面，转导的相对滴度(DC的滴度/其它转导的细胞例如293T细胞的滴度)可被当作测试，并且具有良好的与DC融合的相对能力的包膜将是优选的。转导的相对滴度在实施例中进行了举例说明。
抗原呈递细胞(APC)和特别地树突细胞(DC)是相应地用作免疫组合物的假型化的慢病毒载体的适当的靶细胞。
编码VSV包膜蛋白(VSV-G)的多核苷酸也靶向脾细胞，特别地抗原呈递细胞(APC)或树突细胞(DC)，或肝细胞，包括肝树突细胞、肝细胞或非实质细胞。
特定病毒的包膜蛋白，有时也称为表面蛋白，被陈述为“来源”于不同的生物体，特别地来源于不同的RNA病毒株，这意指在所述蛋白质中，在确定的RNA病毒中表达的相应蛋白质的基本特征得到保持。所述基本特征涉及蛋白质的结构或功能，并且特别地为使得所获得的蛋白质能够在用于假型化所述载体的载体颗粒表面表达的那些特征。因此包膜蛋白，当存在于载体颗粒上时，能够被识别并且内化于宿主的靶细胞中。
在具体实施方案中，化合物的试剂盒的适用于设计假型化慢病毒载体的蛋白质或糖蛋白以多聚蛋白的形式使用，例如三聚体形式的VSV-G蛋白。
包膜蛋白从包含所述蛋白质的编码序列的多核苷酸表达，所述多核苷酸被插入在用于制备本发明的慢病毒载体颗粒的质粒(称为包膜表达质粒或假型化env质粒)中。编码包膜蛋白的多核苷酸处于调控序列的控制之下以转录和/或表达编码序列(包括任选地转录后调控元件(PRE)，特别地多核苷酸例如旱獭肝炎病毒的元件，即可从Invitrogen获得的WPRE序列)。
因此，提供了核酸构建体，其包含适合在体内用于哺乳动物细胞，特别地人细胞的内部启动子和处于所述启动子的控制之下的编码包膜蛋白的核酸。包含该构建体的质粒用于转染或用于转导适用于制备颗粒的细胞。特别地，启动子可就它们的性质选择为组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子。合适的启动子的实例包括下列基因的启动子：公开于Jones S.等人(19)中的EF1α、人PGK、PPI(前胰岛素原)、thiodextrin、HLA DR不变链(P33)、HLA DR α链、铁蛋白L链或铁蛋白H链、凝乳酶β4、凝乳酶β10、抑半胱氨酸蛋白酶蛋白核糖体蛋白L41、CMVie或嵌合启动子例如GAG(CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白)。
此类启动子还可用于参与来自衣壳化质粒的gag-pol衍生的蛋白质的表达的表达调控序列中。
或者，当意欲将包膜表达质粒用于在稳定的包装细胞系中表达，特别地用于稳定表达(如连续表达的病毒颗粒)时，表达包膜蛋白的内部启动子有利地为诱导型启动子，例如Cockrell A.S.等人.(20)中公开的诱导型启动子。作为此类启动子的实例，参考四环素和蜕皮激素诱导型启动子。包装细胞系可以为STAR包装细胞系(参考文献20、21)或SODk包装细胞系例如SODk0衍生的细胞系，包括SODk1和SODk3(参考文献20、22、23、24)。
可选择地，可修饰用于表达假型化慢病毒载体颗粒所需的包膜蛋白的核苷酸序列，从而提供关于编码用作参照的天然包膜蛋白的核酸的变体。可进行修饰以改进用于制备载体颗粒的细胞和/或已转导的宿主细胞中的密码子选择(密码子优化)。可对其进行修饰，以表达与天然蛋白质不同的蛋白质，特别地具有增强的假型化能力、具有改善的生产水平或在阻止与化合物的试剂盒中使用的其它包膜蛋白的血清-中和(也称为交叉反应性蛋白质)方面具有增强的能力的蛋白质。
编码包膜蛋白的多核苷酸的此类修饰或包膜蛋白的修饰(以产生天然包膜的变体)可影响，特别地提高它们在细胞宿主中的生产水平或它们假型化载体颗粒的能力(可能通过提高与假病毒粒子结合的包膜蛋白的密度)。所述修饰可来源于所述蛋白质的氨基酸序列的突变，例如通过一个或数个核苷酸或核苷酸片段的添加、缺失或置换，或可涉及翻译后修饰，特别地涉及所述包膜蛋白的糖基化状态。
事实上，用于假型化本发明的慢病毒载体的包膜蛋白特别地为糖蛋白。
已显示，用水疱性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)来假型化病毒载体使得能够转导来自不同物种的许多种细胞类型。该VSV-G糖蛋白，除了其广泛向性外，当用于载体假型化时还具有引人注意的稳定性。因此，VSV-G已被用作评估其它假型的效率的标准(Cronin J.等人,2005)。
根据本发明，慢病毒载体颗粒为从用下述共转染的哺乳动物细胞回收的产物：
-载体质粒，其包含(i)慢病毒特别地HIV-1的包装、逆转录和转录所必需的顺式激活序列，且还包含功能性慢病毒的(特别地来源于HIV-1的)DNA flap元件，和(ii)处于表达调控序列的控制之下的编码本文中公开的疟疾寄生虫的抗原的多肽的多核苷酸，和任选地包含用于整合的序列；
-编码来源于RNA病毒的假型化包膜的表达质粒，所述表达质粒包含编码用于假型化的包膜蛋白的多核苷酸，其中所述包膜假型化蛋白质有利地来自VSV，并且特别地为VSV-G或其变体，以及，
-衣壳化质粒，其包含适用于产生具有整合能力的病毒颗粒的慢病毒特别地HIV-1的gag-pol包装序列，或适用于产生整合缺陷型载体颗粒的修饰的gag-pol包装序列。
本发明因此还涉及上述慢病毒载体颗粒，所述慢病毒载体颗粒为从具有下述的稳定细胞系回收的产物，
-载体质粒，其包含(i)慢病毒特别地HIV-1的包装、逆转录和转录所必需的顺式激活序列，且还包含功能性慢病毒特别地HIV-1的DNAflap元件，和任选地包含整合所必需的顺式激活序列，所述载体质粒还包含(ii)处于表达调控序列特别地启动子的控制之下的、疟原虫属寄生虫的cs基因的截短的经哺乳动物特别地人密码子优化的序列的多核苷酸；
-包含编码VSV-G包膜蛋白的多核苷酸的VSV-G包膜表达质粒，其中所述多核苷酸处于表达调控序列，特别地包含诱导型启动子的表达调控序列的控制之下，和；
-衣壳化质粒，其中衣壳化质粒包含适用于产生具有整合能力的载体颗粒的慢病毒特别地HIV-1的gag-pol编码序列，或适用于产生整合缺陷型载体颗粒的修饰的gag-pol编码序列，其中所述gag-pol序列来自与DNA flap元件相同的慢病毒亚家族，其中所述慢病毒gag-pol序列或修饰的gag-pol序列处于表达调控序列的控制之下。
表达本发明的载体颗粒的稳定细胞系特别地通过质粒的转导获得。
根据本申请中公开的任何实施方案，多核苷酸编码至少一种疟疾抗原的多肽。特别地，其编码这样的多肽，所述多肽为疟原虫属寄生虫特别地恶性疟原虫的cs基因的截短的经哺乳动物特别地人密码子优化的序列。
在具体的实施方案中，多核苷酸编码疟疾寄生虫的不同抗原的另一种多肽，或其编码起源于和/或衍生自所述寄生虫的不同抗原的两种或更多种多肽，如不同实施方案中公开的。因此，载体质粒可包含用于表达不同多肽的数个表达盒，或可包含双顺反子或多顺反子表达盒，其中编码不同多肽的多核苷酸通过病毒来源的IRES序列(内部核糖体进入位点)间隔，或其可编码融合蛋白。
载体基因组包含的并且控制编码疟疾寄生虫的抗原多肽的多核苷酸(作为转基因或在表达盒中)的表达的内部启动子可选自下列基因的启动子：Jones S.等人(19)中公开的EF1α、人PGK、PPI(前胰岛素原)、thiodextrin、HLA DR不变链(P33)、HLA DR α链、铁蛋白L链或铁蛋白H链、凝乳酶β4、凝乳酶β10或抑半胱氨酸蛋白酶蛋白核糖体蛋白L41、CMVie或嵌合启动子例如GAG(CMV早期增强子/鸡β肌动蛋白)。
上述内部启动子当中的启动子也可被选择用于表达包膜蛋白和包装(gag-pol来源的)蛋白。
或者，载体颗粒可通过将本文中公开的质粒共转染入稳定的包装细胞系(所述细胞系从而变得能够连续分泌载体颗粒)而产生。牵涉包膜蛋白的表达的表达调控序列中使用的启动子有利地为诱导型启动子。
当基于人慢病毒，特别地基于HIV病毒制备慢病毒载体颗粒时，可进行下列具体的实施方案。
根据本发明，慢病毒载体颗粒的基因组来源于人慢病毒，特别地来自HIV慢病毒。特别地，假型化的慢病毒载体为基于HIV的载体例如基于HIV-1或HIV-2的载体，特别地来源于HIV-1M例如来自BRU或LAI分离株。或者，提供载体基因组的必需序列的慢病毒载体可来源于能够转染人细胞的慢病毒，例如EIAV、CAEV、VISNA、FIV、BIV、SIV、HIV-2、HIV-O。
如上文中所述，当在其最终包含的重组多核苷酸之外考虑其时，载体基因组为置换型载体，其中原始慢病毒基因组中的2个长末端重复(LTR)之间的核酸已被限制为用于DNA或RNA合成和加工，包括用于转基因至宿主细胞的细胞核的有效递送的顺式作用序列，或至少被缺失或突变为使得能够表达慢病毒结构蛋白(包括生物学功能性GAG多聚蛋白和可能地POL和ENV蛋白)的必需核酸区段。
在具体的实施中，载体基因组对于生物学功能性GAG，有利地对于生物学功能性POL和ENV蛋白质的表达是有缺陷的。因此，载体基因组缺乏编码此类蛋白质的序列。
在具体的实施方案中，慢病毒的5'LTR和3'LTR序列用于载体基因组，但相对于原始慢病毒的3'LTR，所述3'-LTR至少在U3区域被修饰，其例如可缺失或部分缺失增强子。5'LTR也可被修饰，特别地在其启动子区域，其中例如可用不依赖于Tat的启动子置换U3内源性启动子。
在具体的实施方案中，载体基因组包含Vif-、Vpr、Vpu-和Nef-辅助基因(对于HIV-1慢病毒载体)的编码序列的一个或数个。或者，此类序列可被单独地或彼此缺失，或可以是无功能的。
慢病毒载体颗粒的载体基因组包含至少一个由DNA flap元件组成或包含所述DNA flap元件的多核苷酸作为插入的顺式作用片段。在具体的实施方案中，DNA flap被插入在编码疟疾抗原的多肽的多核苷酸的上游，并且有利地--虽然不是必需地--位于载体基因组的近中部位置。适用于本发明的DNA flap可获自逆转录病毒，特别地获自慢病毒，特别地人慢病毒，特别地HIV-1逆转录病毒，或获自逆转录病毒样生物例如逆转录转座子。或者其可获自CAEV(羊关节炎-脑炎病毒)病毒、EIAV(马感染性贫血病毒)病毒、VISNA病毒、SIV(猿猴免疫缺陷病毒)病毒或FIV(猫免疫缺陷病毒)病毒。DNA flap可合成(化学合成)制备或通过扩增DNA(例如通过聚合酶链式反应(PCR))从上文中定义的适当来源提供DNA Flap而制备。在更优选的实施方案中，DNA flap获自HIV逆转录病毒，例如HIV-1或HIV-2病毒，包括这两种类型的任何分离株。
DNA flap(如Zennou V.等人.参考文献27,2000,Cell第101卷,173-185或WO 99/55892和WO 01/27304中定义的)为处于一些慢病毒(特别地HIV)的基因组的中心的结构，其中其在特别地HIV逆转录过程中通常导致合成3链DNA结构，并且其用作HIV基因组入核转运的顺式决定簇。DNA flap使得能够在逆转录过程中通过中心多嘌呤管道(central polypurine tract，cPPT)和中央终止序列(CTS)顺式控制中央链置换事件。当插入慢病毒来源的载体中时，使得能够在逆转录过程中产生DNA flap的多核苷酸刺激基因转移效率并且补充入核转运水平至野生型水平(Zennou等人,Cell,2000)。
DNA flap的序列已公开于现有技术中，特别地公开于上述专利申请中。此类序列还公开为SEQ ID NO 69至SEQ ID NO 75。它们优选地作为片段(任选地具有另外的侧翼序列)，在优选地邻近载体基因组的中心的位置处插入载体基因组。或者，它们可正好插入在控制本发明的多核苷酸表达的启动子上游。插入在载体基因组中的包含DNAflap的所述片段，取决于其来源和制备方式，可具有约80至约200bp的序列。
根据具体的实施方案，DNA flap具有约90至约140个核苷酸的核苷酸序列。
在HIV-1中，DNA flap为稳定的99个核苷酸长的正链重叠序列。当用于本发明的慢病毒载体的基因组载体中时，其可作为更长的序列插入，特别地当其作为PCR片段制备时。包含提供DNA flap的结构的特别适当的多核苷酸为，包含HIV-1DNA的cPPT和CTS区域的178个碱基对的聚合酶链式反应(PCR)片段(Zennou等人2000)。
该PCR片段可特别地来源于HIV-1LAI特别地HIV1的pLAI3的感染性DNA克隆，作为相应于核苷酸4793至4971的序列片段。如果适当的话，将限制性位点添加至所获得的片段的一个或两个末端以进行克隆。例如，可将Nar I限制性位点添加至用于进行PCR反应的引物的5'末端。
因此，将本发明中使用的DNA flap从原始慢病毒基因组的pol基因的非必需5'和3'部分缺失，并且将其与不同来源的序列重组。
应指出的是，基因组载体中使用的DNA flap和编码GAG和POL多聚蛋白的衣壳化质粒的多核苷酸应当来源于相同的慢病毒亚家族或来自相同的逆转录病毒样生物。
优选地，基因组载体的其它顺式激活序列也来源于与提供DNAflap的相同的慢病毒或逆转录病毒样生物。
载体基因组还可包含用于克隆重组多核苷酸的一个或数个独特的限制性位点。
在优选实施方案中，在所述载体基因组中，慢病毒载体基因组的3'LTR序列缺乏至少激活子(增强子)和可能地U3区域的启动子。在另一个具体的实施方案中，3'LTR区域缺乏U3区域(delta U3)。在这方面，参考WO 01/27300和WO 01/27304中的说明书。
在具体的实施方案中，在载体基因组中，LTR 5'的U3区域被非慢病毒U3或被适合于驱动不依赖于tat的初级转录的启动子替代。在这样的情况下，载体不依赖于tat反式激活子。
载体基因组还包含psi(ψ)包装信号。包装信号来源于gag ORF的N末端片段。在具体的实施方案中，其序列可通过移码突变来修饰，以防止转基因的转录/翻译对gag肽的可能的转录/翻译的任何干扰。
载体基因组还可任选地包含选自剪接供体位点(SD)、剪接受体位点(SA)和/或Rev-应答元件(RRE)的元件。
根据具体的实施方案，载体质粒(或添加的基因组载体)包含下列用于转基因表达盒的顺式作用序列：
1.逆转录所需的LTR序列(长末端重复)，转录所需的序列，和任选地包括用于病毒DNA整合的序列。出于两个主要原因，使3'LTR在U3区域中至少缺失启动子以提供SIN载体(自灭活)，而不扰乱基因转移所必需的功能：第一，一旦DNA被整合在基因组中，避免宿主基因的反式激活，和第二，在逆转录后允许病毒顺式序列的自灭活。任选地，来自驱动基因组的转录的5'-LTR的tat-依赖性U3序列被非内源的启动子序列替代。因此，在靶细胞中，将只从内部启动子转录序列(转基因)。
2.病毒RNA衣壳化所必需的ψ区域。
3.RRE序列(REV应答元件)，其允许病毒信使RNA在结合Rev蛋白后从细胞核输出至细胞溶胶。
4.有利于入核转运的DNA flap元件(cPPT/CTS，通常包含在Pol中)。
5.任选地转录后元件，例如WPRE顺式激活序列(旱獭乙型肝炎病毒应答后元件(Post-Responsive Element))(其也被添加以优化mRNA的稳定性(Zufferey等人,1999))，基质或支架附着区(SAR和MAR序列)例如免疫球蛋白κ基因的基质或支架附着区(Park F.等人MolTher 2001；4：164-173)。
本发明的慢病毒载体为非复制型的(不具有复制能力的)，即，载体和慢病毒载体基因组被认为适合于减轻关于能够复制的慢病毒的忧虑，并且特别地不能在施用后从感染的宿主细胞形成新的颗粒出芽(particles budding)。这可以以公知的方法来实现，例如作为gag、pol或env基因在慢病毒基因组中的不存在或它们作为“功能性基因”的不存在的结果。gag和pol基因因此仅以反式方式提供。这也可通过缺失颗粒形成所需的其它病毒编码序列和/或顺式作用基因元件来实现。
关于“功能性”，其意指被正确转录的和/或正确表达的基因。因此，如果存在于本发明的慢病毒载体基因组中，则在该实施方案中包含不能单独转录或未完全转录的gag、pol或env的序列；表述“未完全转录的”是指转录物gag、gag-pro或gag-pro-pol的改变，此类基因之一或此类基因的数个基因未被转录。还可在载体基因组中突变参与慢病毒复制的其它序列，以实现该状态。慢病毒载体的复制的不存在应当与慢病毒基因组的复制区别开。事实上，如之前所描述的，慢病毒基因组可包含复制起始点，从而确保慢病毒载体基因组的复制，而不一定确保载体颗粒的复制。
为了获得根据本发明的慢病毒载体，必需将载体基因组(作为载体质粒)在颗粒或假颗粒中衣壳化。因此，必须以反式将慢病毒蛋白质(除包膜蛋白外)提供给生产系统(特别地生产细胞)中的载体基因组，与载体基因组一起，借助于至少一个衣壳化质粒，所述衣壳化质粒具有gag基因，以及pol慢病毒基因或不具有整合能力的pol基因，并且优选缺乏Vif-,Vpr,Vpu-和Nef-辅助基因(对于HIV-1慢病毒载体)的一些或所有的编码序列。
使用具有编码被选择用于假型化慢病毒载体颗粒的包膜假型化蛋白质的多核苷酸的其它质粒。
在优选实施方案中，包装质粒仅编码病毒颗粒合成所必需的慢病毒蛋白质。相应地除去了其在质粒中的存在可提升安全性关注的辅助基因。因此，以反式提供的用于包装的病毒蛋白质各自如对于来源于HIV-1的那些所举例说明的：
1.GAG蛋白，用于构建基质(MA，具有表观分子量p17)、衣壳(CA,p24)和核衣壳(NC,p6)。
2.POL编码的酶：整合酶、蛋白酶和逆转录酶。
3.TAT和REV调节蛋白，当TAT是起始LTR-介导的转录所必需的时；可省略TAT表达，如果将5'LTR的U3区置换为不依赖于tat驱动转录的启动子的话。REV可被修饰，和从而用于例如重组蛋白质，所述重组蛋白使得能够识别载体基因组中替代RRE序列的结构域，或用作使得能够通过其RBD(RNA结合结构域)结合RRE序列的片段。
为了避免从包装质粒包含的基因产生的mRNA在病毒颗粒中的任何包装，从包装质粒中除去ψ区域。将异源启动子插入质粒以避免重组问题，以及将poly-A尾添加在编码蛋白质的序列的3'。适当的启动子已在上文中公开。
包膜质粒编码本文中公开的用于假型化的包膜蛋白，其处于内部启动子的控制之下，如本文中公开的。
用于制备本发明的慢病毒载体颗粒的任何或所有描述的质粒可在编码蛋白质的区段中进行密码子优化(CO)。优选进行根据本发明的密码子优化，以改善质粒中包含的编码序列在哺乳动物细胞，特别地人细胞中的翻译。根据本发明，密码子优化特别适合于直接或间接促进载体颗粒的制备或促进它们被宿主(对所述宿主施用了它们)的细胞摄入，或提高编码疟疾寄生虫的抗原的多肽的多核苷酸(转基因)至宿主的经转导的细胞的基因组中的转移效率。用于优化密码子的方法在本领域是公知的，并且特别地使用可获得的程序进行密码子优化以获得该效应。在实施例中例举的本发明的pTRIP或pThV质粒中包含的编码序列中举例说明密码子优化。
在本发明的具体实施方案中，假型化的慢病毒载体也是不具有整合能力的，或可选择地是不具有整合能力的。在这样的情况下，载体基因组和从而其包含的重组多核苷酸不整合入转导的细胞的基因组或已对其施用了载体基因组的宿主的细胞的基因组。
本发明涉及慢病毒载体在免疫原性组合物中的用途，其中表达的整合酶蛋白是有缺陷的，并且所述慢病毒载体还特别地包含编码至少一个具有疟原虫属寄生虫的红细胞前期抗原的表位的多肽的多核苷酸。
“不具有整合能力的”意指，整合酶(优选慢病毒来源的整合酶)缺乏将慢病毒基因组整合入宿主细胞的基因组的能力，即，整合酶蛋白经突变特异性地改变了其整合酶活性。
不具有整合能力的慢病毒载体通过修饰编码整合酶的pol基因(从而导致编码在整合活性上有缺陷的整合酶的突变的pol基因)来获得，所述修饰的pol基因包含在衣壳化质粒中。此类不具有整合能力的慢病毒载体已描述于专利申请WO 2006/010834中。因此，蛋白质的整合酶能力被改变，然而GAG、PRO和POL蛋白质从衣壳化质粒的正确表达和/或衣壳和从而载体颗粒的形成，以及在整合步骤之前或之后的病毒周期的其它步骤例如逆转录、入核转运，未受影响。当其能够进行的整合以下述方式被改变时：与包含相应的野生型整合酶的慢病毒载体相比较，整合步骤以低于1/1000，优选低于1/10000的比率发生，整合酶被认为是有缺陷的。
在本发明的具体实施方案中，缺陷型整合酶由1类突变，优选氨基酸置换(1个氨基酸的置换)或短缺失(满足缺陷型整合酶的表达的要求)导致。在pol基因内进行突变。此类载体可携带在酶的催化结构域中具有突变D64V的缺陷型整合酶，其特异性阻断整合步骤的DNA切割和连接反应。D64V突变使假型化HIV-1的整合减少直至野生型的1/10,000，但保持它们转导非分裂细胞的能力，从而允许有效的转基因表达。
Pol基因中适合于影响HIV-1整合酶的整合酶能力的其它突变为下列突变：H12N、H12C、H16C、H16V、S81R、D41A、K42A、H51A、Q53C、D55V、D64E、D64V、E69A、K71A、E85A、E87A、D116N、D116I、D116A、N120G、N120I、N120E、E152G、E152A、D-35-E、K156E、K156A、E157A、K159E、K159A、K160A、R166A、D167A、E170A、H171A、K173A、K186Q、K186T、K188T、E198A、R199C、R199T、R199A、D202A、K211A、Q214L、Q216L、Q221L、W235F、W235E、K236S、K236A、K246A、G247W、D253A、R262A、R263A和K264H。
在具体的实施方案中，在下列位置D64、D116或E152的任一位置，或在这些位置(所述位置在蛋白质的催化位点中)的几个位置上进行pol基因的突变。这些位置上的任何置换是适当的，包括上述的那些。
另一个提出的置换为，用氨基酸残基AAH置换氨基酸残基RRK(位置262至264)。
在本发明的具体实施方案中，当慢病毒载体不具有整合能力时，慢病毒基因组还包含复制起始点(ori)，其序列取决于必须在其中表达慢病毒基因组的细胞的性质。所述复制起始点可来自真核生物来源，优选哺乳动物来源，最优选人来源。或者，其可以为病毒来源，特别地来自DNA环状附加体病毒(episomic viruse)例如SV40或RPS。本发明的实施方案有利地具有插入本发明的慢病毒载体的慢病毒基因组的复制起始点。事实上，当慢病毒基因组不能整合入细胞宿主基因组(由于缺陷型整合酶)时，慢病毒基因组在经历频繁细胞分裂的细胞中丢失；这在免疫细胞例如B或T细胞中尤其如此。复制起始点的存在确保至少一个慢病毒基因组存在于每一个细胞中，即使在细胞分裂后，从而使免疫应答的效率最大化。
本发明的慢病毒载体的慢病毒载体基因组可特别地来源于在1999年10月11日在编号I-2330下保藏在CNCM(Paris,France)的HIV-1质粒pTRIPΔU3.CMV-GFP(也在WO01/27300中描述)中。pTRIPΔU3.CMV-eGFP的序列提供为SEQ ID No 35并且描述于图11中。
当载体基因组来源于此类特定质粒时，将本申请中公开的重组多核苷酸的序列插入其中，作为对GFP编码片段的添加或置换。GFP编码序列也可被不同的标记物置换。CMV启动子也可被另一种启动子，特别地上文中公开的启动子之一(特别地与转基因的表达相关的启动子)置换。
可任选地缺失也包含在特定的保藏的pTRIP载体中的WPRE序列。
可在用所述质粒转染适当的细胞(例如哺乳动物细胞或人细胞，例如由293T细胞举例说明的人胚肾细胞)后，或通过其它方法产生载体颗粒。在用于表达慢病毒颗粒的细胞中，所有或一些质粒可用于稳定地表达它们的编码多核苷酸，或瞬时或半稳定地表达它们的编码多核苷酸。
产生的颗粒的浓度可通过测量细胞上清液的P24(HIV-1的衣壳蛋白)含量来测定。
本发明的慢病毒载体，一旦被施用给宿主，就感染宿主细胞，可能地特定细胞，这取决于用于假型化其的包膜蛋白。感染导致慢病毒载体基因组释放至宿主细胞的细胞质中，并在细胞质中发生逆转录。一旦形成三链体形式(通过DNA flap)，慢病毒载体基因组就被输送入细胞核，在细胞核中编码疟疾寄生虫的抗原的多肽的多核苷酸通过细胞机器进行表达。当转导非分裂细胞(例如DC)时，表达可以是稳定的。当转导分裂细胞例如B细胞时，在复制起始点不存在于慢病毒基因组中的情况下，由于核酸稀释和分裂，表达是暂时的。表达可以通过提供复制起始点(确保慢病毒载体基因组在细胞分裂后适当地扩散到子细胞中)来延长。稳定性和/或表达还可通过在载体基因组中插入MAR(基质结合区域(Matrix Associated Region))或SAR(支架结合区域(Scaffold Associated Region))元件来增加。
事实上，此类SAR或MAR区域为富含AT的序列，能够将慢病毒基因组锚定至细胞染色体的基质，从而调节编码至少一个抗原多肽的多核苷酸的转录，和特别地刺激转基因的基因表达和改善染色质的可及性。
如果慢病毒基因组为非整合性的，则其不整合入宿主细胞基因组。然而，由转基因编码的所述至少一个多肽被充足表达并且表达足够长的时间以被加工，与MHC分子缔合，并且最终导向细胞表面。取决于编码疟疾寄生虫的抗原的多肽的多核苷酸的性质，与MHC抗原缔合的至少一个多肽表位触发体液或细胞免疫应答。
除非另外指出，或除非在技术上是不相关的，否则可按照任何可能的组合来组合本申请中公开的关于慢病毒颗粒，特别地关于它们的包膜蛋白或重组多核苷酸的结构或用途的各种特征、实施方案或实例的特征。
本发明还涉及用于给哺乳动物宿主单独施用的化合物的组合，其至少包含：
(i)利用第一确定的异源病毒包膜假型化蛋白质假型化的本发明的慢病毒载体颗粒；
(ii)与(i)中的慢病毒载体颗粒分开地提供的本发明的慢病毒载体颗粒，其用与所述第一异源病毒包膜假型化蛋白质不同的第二确定的异源病毒包膜假型化蛋白质假型化；
其中所述第一和第二病毒包膜假型化蛋白质彼此不发生血清中和并且适用于哺乳动物细胞特别地人细胞的体内转导。
表述“化合物的组合”或可选择地“化合物的试剂盒”意指，将构成试剂盒或组合的活性成分的慢病毒载体颗粒作为分开的化合物提供于所述试剂盒或组合中，并且意欲用于给宿主分开施用，特别地在时间上分开施用。因此，本发明使得能够在有此需要的宿主中进行引发-加强施用，其中第一施用步骤引发免疫，特别地细胞免疫应答和较晚的施用步骤加强免疫应答，包括细胞免疫应答。对于每一个施用步骤，优选地，载体颗粒的假型化包膜蛋白与其它步骤中使用的包膜蛋白不同。因此，本发明的试剂盒或组合中的分开的化合物至少因它们的假型化包膜蛋白的差异而具有不同的颗粒。
因此，在时间上分开地给有此需要的宿主，特别地哺乳动物宿主，特别地人宿主提供试剂盒的化合物。
因此，所述慢病毒载体可提供于分开的包装中，或可存在于用于其分开使用的共同的包装中。
因此，包括在包装中的并且包括使用说明的说明书可指出，利用不同的假型化包膜蛋白质假型化的所述慢病毒载体颗粒在时间上分开施用，特别地用于引发和随后加强宿主的免疫应答。
根据本发明，在化合物的组合中，提供了利用第一确定的异源病毒假型化包膜蛋白假型化的慢病毒载体颗粒，和利用第二确定的异源病毒假型化包膜蛋白假型化的慢病毒载体颗粒。因此，所述第一与第二异源病毒包膜蛋白质是不同的，并且特别地源自不同的病毒株。因此，本发明的化合物的试剂盒的分开的化合物中包含的慢病毒载体颗粒彼此不同，至少由于用于假型化载体颗粒的特定假型化包膜蛋白。
在本发明的具体实施方案中，化合物的组合包含第三或其他类型的慢病毒载体颗粒，其中第三慢病毒载体的假型化包膜蛋白与所述第一和第二假型化包膜蛋白不同，并且特别地源自不同的病毒株。
当连续施用具有不同假型化包膜的颗粒时，下列关于所述包膜的施用顺序可以是优选的：印地安纳病毒；新泽西病毒；伊斯法罕病毒；SVCV/Cocal病毒。因为Cocal假型化的慢病毒载体血清中和数种其它包膜，因此，当将用Cocal包膜制备颗粒时，在接种计划表中，优选地将用它们假型化的颗粒作为施用方案中的最后一种颗粒施用。
除了它们的假型化包膜蛋白外，本发明的慢病毒载体可以相同，特别地可具有相同的载体基因组。
或者，它们的载体基因组可以不同，只要它们具有相同的重组的确定的多核苷酸(也称为转基因)，特别地相同的重组多核苷酸。
在本发明的另一个实施方案中，慢病毒载体的载体基因组相异在于具有至少一个不同的重组多核苷酸，只要所述不同的多核苷酸的至少一个编码具有共同的抗原决定族或共同的表位的多肽。因此，不同多核苷酸可以是彼此的变体，其编码相同或变异的多肽，或可包括编码不同多肽的序列。
特定的化合物的试剂盒包括慢病毒载体，其中在分开的化合物的至少一种中，载体利用包含来源于不同病毒(特别地VSV的不同种或不同属)的不同包膜蛋白的组合的结构域或片段的重组假型化包膜蛋白来进行假型化。
在本发明的具体实施方案中，第一、第二和如果有的话，第三或其他假型化包膜蛋白中的至少一个为包含印第安纳株的VSV-G的输出决定簇(export determinant)的重组包膜蛋白。
印第安纳株的VSV-G的输出决定簇为，由包膜的开放阅读框架的细胞质片段编码的多肽。
印第安纳株的VSV-G的输出决定簇为在细胞质尾中包含或具有氨基酸序列YTDI E的多肽(Nishimua N.等人.2002)。
所述重组包膜蛋白可包含印第安纳株的VSV-G的细胞质尾，其为被疏水跨膜结构域分隔的VSV-G的细胞内部分。
特定的化合物的试剂盒包含慢病毒载体，其中它们中的一个或两个或更多个利用包含印第安纳VSV的细胞质结构域和不同VSV血清型的株系的胞外结构域的重组包膜蛋白来假型化。跨膜结构域也可以为印第安纳株VSV-G之一。
特定的化合物的试剂盒包括慢病毒载体，其中它们的一个或两个利用包含印第安纳VSV的跨膜结构域和细胞质结构域以及新泽西VSV的胞外结构域的重组包膜蛋白来进行假型化。
其它适当的修饰包括促进假型化的突变，特别地点突变。可通过置换或缺失一个或数个氨基酸残基来在跨膜结构域中进行VSV-G蛋白的此类突变。适当的突变的其它实例公开于Fredericksen B.L.等人(1995)或Nishimura N.等人(2003)中。
特别地，也可以修饰VSV-G的糖基化状态，以在给宿主施用时，提高用此类VSV-G蛋白假型化的慢病毒载体的转导效率。
来自VSV的不同株系的VSV-G蛋白公开于附图中，并且它们的序列还可来源于数据库，特别地来自GenBank。特别地，印第安纳株和新泽西株的VSV-G蛋白可通过参考公开为GenBank#AF170624(对于新泽西株的VSV-G)或GenBank#M11048(对于印第安纳株)的序列来获得。
关于VSV的新泽西株和印第安纳株的糖蛋白，已提出在两个天冬酰胺残基(N180和N336)上的糖基化促进慢病毒载体的有效假型化。该特定的特征可用于本发明的慢病毒载体的制备。
下列编码VSV-G衍生的包膜蛋白的构建体为用于制备本发明的慢病毒载体颗粒的组合的构建体的具体实例，并且公开于WO2009/019612中。
已进行密码子优化的印第安纳株的VSV-G基因如SEQ ID No 76中所示。特定的衣壳化质粒为在2007年10月10日在编号I-3842下保藏在CNCM(Paris,France)的pThV-VSV.G(IND-CO)，或在2008年7月31日在编号CNCMI-4056下保藏的质粒构建体的可选择形式，其适用于制备具有来自VSV-G印第安纳株或新泽西株的包膜的假型化颗粒。其它构建体可从该特定的质粒衍生，特别地通过利用本申请中所列的启动子置换其启动子。
经密码子优化的新泽西株的VSV-G基因描述于SEQ ID No 78中。具体的衣壳化质粒为在2007年10月10日在编号I-3843下保藏在CNCM(Paris,France)中的pThV-VSV.G(NJ-CO)，或在2008年7月31日在编号CNCMI-4058下保藏的质粒构建体的可选择形式，其适用于制备具有来自VSV-G印第安纳株或新泽西株的包膜的假型化颗粒。其它构建体可从该特定的质粒衍生，特别地通过利用本申请中所列的启动子置换其启动子。
适合进行本发明的具有经密码子优化的序列的其它包膜基因在WO 2009/019612中进行了举例说明，并且特别地包括金迪普拉株的VSV-G基因及其表达产物、Cocal株的VSV-G基因及其表达产物、皮里株的VSV-G基因及其表达产物、伊斯法罕株的VSV-G基因及其表达产物、鲤鱼春季病毒血症病毒(Spring viremia carp virus)VSV-G基因及其表达产物。包含VSV-G Cocal株的包膜基因的特定衣壳化质粒为在2008年7月31日在编号CNCM I-4055下保藏在CNCM(Paris,France)的pThV-VSV.G(Cocal病毒-CO)。包含VSV-G伊斯法罕株的包膜基因的另一个特定的衣壳化质粒为在2008年7月31日在编号CNCMI-4057下保藏在CNCM(Paris,France)的pThV-VSV.G(ISFA-CO)。包含VSV-G鲤鱼春季病毒血症病毒的包膜基因的另一个特定的衣壳化质粒为在2008年7月31日在编号CNCM I-4059下保藏在CNCM(Paris,France)的pThV-VSV.G(SVCV-CO)。此类构建体公开于专利申请WO2009/019612中。
融合包膜蛋白，特别地包括不同病毒的VSV-G蛋白的数个不同片段的融合蛋白质，和编码此类蛋白质的核酸构建体用作可选择的实施方案并且也公开于WO 2009/019612中。特定的融合包膜为新泽西株包膜蛋白的胞外结构域与印第安纳株包膜蛋白的跨膜结构域和细胞质结构域之间的融合蛋白，如在本文提供的序列中举例说明的。
适合进行本发明的另一种融合包膜蛋白包含选自VSV-G金迪普拉株、VSV-G Cocal株、VSV-G皮里株、VSV-G伊斯法罕株或VSV-G SVCV的一种VSV-G蛋白的胞外结构域和VSV-G印第安纳株的跨膜和细胞质结构域。编码所述融合蛋白的核酸分子有利地为密码子优化的核酸。编码所述融合蛋白的核酸也描述为SEQ ID No 77、79、81、83、85、87、89。
在本发明的具体实施方案中，提供了化合物的组合，其中分开的化合物的慢病毒颗粒编码(i)CSP抗原的多肽或(ii)缺乏GPI锚定基序的CSP抗原(CSP deltaGPI)或在N末端被截短的CSP蛋白(CSP NTer或也称为CSP deltaSP)的多肽。
在具体的实施方案中，此类化合物或它们中的一些还编码至少一个另外的选自本文中公开的组中的疟疾寄生虫的抗原的多肽，所述抗原的不同多肽从相同的慢病毒颗粒或从不同的慢病毒颗粒表达。
在本发明的另一个具体实施方案中，此类化合物或它们中的一些还编码至少一个另外的选自本文中公开的组中的疟疾寄生虫的抗原的多肽。
本发明特别地涉及本文中定义的用于抗哺乳动物宿主，特别地人宿主的疟疾寄生虫感染或寄生虫-诱导的病症的预防性免疫的慢病毒载体颗粒或化合物的组合。
因此，慢病毒载体颗粒、包含所述慢病毒载体颗粒的组合物或本发明的化合物的组合，当给有此需要的宿主特别地给哺乳动物，特别地给人宿主施用时，引发免疫应答，包括抗疟疾寄生虫的抗原的原初淋巴细胞(
lymphocyte)的活化以及效应T细胞应答的产生和免疫记忆抗原特异性T细胞应答的产生。免疫应答可预防疟疾寄生虫的感染(当此类寄生虫作为子孢子被接种至宿主时)或可预防因子孢子形式的疟疾寄生虫的接种而导致的病理状态的发作或发展，或预防所述寄生虫的其它形式例如裂殖子形式的产生的后果的发作或发展。
因此，本发明的慢病毒载体颗粒或化合物的组合适合用于预防、控制或抑制由寄生虫的接种或由疟疾寄生虫的周期的红细胞外期即肝期的诱导而引起的病状的发作，并且在有利的实施方案中适合用于预防、缓解或抑制所述寄生虫的红细胞内期的发作或发展。有利地，已观察到，引发-加强施用方案中使用的本发明的慢病毒载体颗粒使得能够发展保护性免疫，特别地使得能够产生抗疟疾寄生虫-诱导的病症的杀菌保护作用。这样的杀菌保护作用可因控制寄生虫的周期中的肝脏感染时期(如果不在之前的话)的感染后果而产生。
在本发明的具体实施方案中，制备慢病毒载体颗粒的组合物，其中利用适当的施用媒介物配制所述慢病毒载体颗粒，以用于抗哺乳动物宿主特别地人宿主的疟疾寄生虫感染或寄生虫诱导的病症的预防性免疫。
可根据免疫组合物的施用途径选择生理上可接受的媒介物。在优选实施方案中，可进行肌内施用，或对于儿童，进行鼻内施用。
因此，化合物的组合可包括分开地提供的慢病毒载体颗粒的组合物，其中化合物的组合或试剂盒的每一种单独的组合物包含，利用确定的异源病毒假型化包膜蛋白假型化的慢病毒载体颗粒，并且其中所述假型化包膜蛋白不与化合物的组合或试剂盒的另一种组合物的慢病毒载体颗粒的假型化包膜蛋白交叉反应，发生血清中和。
因此，此类组合物或所述组合物的化合物的组合用于抗哺乳动物宿主，特别地人宿主的疟疾寄生虫感染或寄生虫诱导的病症的预防性免疫，所述用途牵涉包括下述的免疫模式：施用有效量的慢病毒颗粒以引发宿主的细胞免疫应答，和在较晚的时间施用有效量的慢病毒颗粒以加强宿主的细胞免疫应答，和任选地重复(一次或数次)所述用于加强的施用步骤，其中利用彼此不交叉中和的不同的假型化包膜蛋白来假型化引发或加强步骤的每一步骤中施用的慢病毒颗粒，并且其中所述引发和加强步骤在时间上相隔至少6周，特别地相隔至少8周。
在下列其中已按照引发-加强方案用本发明的慢病毒载体颗粒处理了小鼠模型的实施例中，本发明人已显示，按照这样的方案免疫的并且在最后一次免疫步骤之后6个月攻击的小鼠，对于显著比例的接种的小鼠(超过40%)仍显示杀菌保护作用，这说明，本发明的慢病毒载体颗粒在宿主中引发长效杀菌保护作用，因此构成了用于免疫的适当的化合物(特别地在人宿主中)。
本发明在具体的实施方案中涉及，如本文中定义的慢病毒载体颗粒或化合物的组合，其通过给药方案用于抗哺乳动物宿主，特别地人宿主的疟疾寄生虫感染或寄生虫诱导的病症的预防性免疫，所述给药方案包括分开地提供的所述慢病毒颗粒的剂量，其中意欲用于引发和加强细胞免疫应答的剂量为中等剂量，并且意欲用于加强细胞免疫应答的剂量比用于引发的剂量更高。
因此，当使用整合载体时，意欲用于引发和加强细胞的免疫应答的剂量(所述剂量用于所述施用模式)包括107TU至109TU的病毒颗粒，意欲用于儿童的剂量在107TU的范围内，意欲用于成人的剂量在109TU的范围内。当使用不具有整合能力的载体时，意欲用于引发和加强的剂量包括108至1010的慢病毒颗粒。
特别地，本发明的慢病毒载体颗粒或化合物的组合在具体的实施方案中通过给药和施用方案用于抗哺乳动物宿主，特别地人宿主的疟疾寄生虫感染或寄生虫诱导的病症的预防性免疫，所述给药和施用方案适合在宿主中获得下列效应的至少一个：
-引发抗人宿主的疟疾寄生虫感染，特别地由恶性疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫或卵形疟原虫引起的疟疾寄生虫感染的杀菌保护作用；
-抑制疟疾寄生虫的细胞外形式；
-预防由疟疾寄生虫引起的肝细胞感染或抑制感染的肝期扩增；
-引发抗疟疾寄生虫抗原的特异性T细胞免疫应答，特别地CD8+T细胞应答和/或特异性CD4+T细胞应答；
-引发抗寄生虫抗原的B细胞应答；
-控制寄生虫血症以减小或缓解疟疾寄生虫感染的效应；
-引发抗寄生虫感染或抗寄生虫诱导的病症的保护性细胞免疫；
-引发记忆T细胞免疫应答
-在疟疾寄生虫感染期间，引发CD4+和CD8+T细胞应答的更早和更高的反弹；
-在疟原虫感染后通过刺激肝内记忆淋巴细胞而引发更早和强的CT(CD8+T)应答；
-防止疟疾寄生虫逃脱免疫应答，从而允许长期控制疟疾寄生虫的感染。
在上述靶向效应中，当确定本发明的慢病毒颗粒的免疫方案时，有利地靶向细胞免疫应答(T细胞免疫应答)，特别地CD8介导的细胞免疫应答或CD4介导的细胞免疫应答，即，由活化的具有CD8或CD4受体的细胞，优选细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的免疫应答和记忆T细胞应答。
免疫应答还可包括由所述慢病毒载体颗粒引发的，针对所述慢病毒载体的至少一个多肽产生的体液应答，即，抗体。在具体的实施方案中，所述体液应答为保护性体液应答。保护性体液应答主要导致对其抗原具有高亲和力的成熟抗体，例如IgG。在具体的方面，保护性体液应答为T细胞依赖性的。在具体的实施方案中，保护性体液应答诱导中和抗体的产生。
在本发明的具体实施方案中，本发明的慢病毒载体，甚至当以具有缺陷型整合酶的形式使用时，也能够引发早期免疫应答。表述“早期免疫应答”是指，在组合物施用后约1周内赋予的保护性免疫应答(抗寄生虫或抗寄生虫诱导的病症的保护作用)。
在另一个特别有利的实施方案中，由本发明的慢病毒颗粒赋予的免疫应答为长效免疫应答，即，所述免疫应答包括记忆细胞应答，特别地中央记忆细胞应答；在具体的实施方案中，其在至少数月后仍然可被检测到，(如在实施例中对于小鼠举例说明的，在施用颗粒后至少6个月后仍然获得保护作用)，这允许认为，保护作用可在施用后在人宿主中持续数年。
当免疫应答包括体液应答时，可利用任何适当的方法例如ELISA、免疫荧光术(IFA)、焦点减少中和测试(focus reductionneutralization test，FRNT)、免疫沉淀或Western印迹，通过检测特异性抗体来显示长效应答。
在具体的实施方案中，在单次施用本发明的组合物后，利用非整合型基因转移载体来引发所述免疫应答，体液或细胞，早期免疫应答和/或长效免疫应答。
本发明还涉及，根据本文中的定义的慢病毒载体颗粒或化合物的组合用于制造免疫原性组合物的用途，所述免疫原性组合物用于抗哺乳动物宿主，特别地人宿主的疟疾寄生虫感染或寄生虫诱导的病症的预防性免疫。
本发明还涉及在哺乳动物宿主，特别地人宿主中提供免疫的方法，包括下述步骤：按照本公开内容施用本发明的慢病毒载体以引发免疫应答，和任选地重复施用步骤一次或数次以加强所述应答。
在本发明的具体实施方案中，可将慢病毒载体颗粒或化合物的组合与适用于给哺乳动物特别地人宿主施用的佐剂化合物，和/或与免疫刺激化合物，以及适当的递送媒介物结合使用。
可通过不同途径将上述组合物注射入宿主：皮下(s.c.)、真皮内(i.d.)、肌内(i.m.)或静脉内(i.v.)注射、口服施用和粘膜施用，特别地鼻内施用或吸入。待施用的量(剂量)取决于待治疗的受试者，包括考虑患者的状况、个体免疫系统的状态、施用途径和宿主的大小。可测定以载体颗粒的等同p24抗原的含量表示(对于HIV-1慢病毒载体)的适当的剂量范围。
当阅读举例说明慢病毒载体颗粒(其具有可与本说明书中给出的定义单独地组合的特征)的制备和应用的实施例和附图时，本发明的其它实例和特征将变得显然。
附图图例
图1.基于非整合型慢病毒载体的接种赋予肝期发展的总抑制。A.研究设计。在第0周利用100ng的用印第安纳株的VSV-G(VSV-GInd)包膜假型化的TRIP.NI CS颗粒初免初次接受实验的小鼠，随后在第8周用1500ng的利用新泽西株的VSV-G(VSV-G NJ)包膜假型化的TRIP.NI CS颗粒进行加强。用80.000个约氏疟原虫(17XNL-gfp+株)子孢子(spz)攻击一组接种疫苗的小鼠，40小时后通过定量肝脏寄生虫的载量来测量保护效率。用500个约氏疟原虫(17XNL-gfp+株)spz攻击第二组接种疫苗的小鼠，利用吉姆萨染色血涂片(Giemsa-stainedblood smears)，通过从注射后第3天至第14天每隔一天监测血液阶段的寄生虫血症来评估保护效率。在两种情况下，在最后一次免疫后1个月进行攻击。B.使用约氏疟原虫18S rRNA的实时RT-PCR在被攻击的小鼠的肝中定量的寄生虫载量的结果。数据表示为，在单独的对照小鼠(n=5)和接种疫苗的小鼠(n=4)中检测到的疟原虫属18S rRNA的拷贝数。显示了一式两份重复的平均值+/-SD。C.监测血液阶段的寄生虫血症的结果。0表示不存在寄生虫，+表示存在寄生虫。
图2.A.研究设计。用100ng的利用印第安纳株的VSV-G(VSV-GInd)包膜假型化的TRIP.NI CS颗粒引发并且在8周后用1500ng的利用新泽西株的VSV-G(VSV-G NJ)包膜假型化的TRIP.NI CS颗粒加强的小鼠在5个月后接受利用1500ng的用Cocal株的VSV-G假型化的TRIP.NI CS颗粒的第三免疫剂量。1个月后利用500个约氏疟原虫(17XNL株)spz攻击接种的小鼠，并利用吉姆萨染色血涂片，通过从注射后第3天至第16天每隔一天监测血液阶段的寄生虫血症来评估保护效率。B.在基于非整合型慢病毒载体的方案后被完全保护免受子孢子攻击的小鼠的百分比。C.描述了初次接受实验的小鼠(CO-黑色曲线)、被完全保护的接种的小鼠(VAC-浅灰色曲线)和被部分保护的接种的小鼠(VAC-灰色曲线)的寄生虫血症的平均值。D.攻击后10天，来自初次接受实验的小鼠(CO-黑色)、被部分保护的接种的小鼠(VAC-灰色)和被完全保护的接种的小鼠(VAC-灰色)的寄生虫血症的平均值。
图3.在利用500个约氏疟原虫子孢子的终杀伤时(攻击后3周)的来自接种的(VAC)或未接种的(CO)小鼠的脾和肝的总体形态学。
图4.攻击后3周来自接种的小鼠的脾细胞的CS蛋白特异性T细胞应答。使用在用约氏疟原虫攻击后3周收获的接种的小鼠的脾细胞进行离体IFN□ELISPOT。利用代表CD8+或CD4+确定的表位的合成的肽刺激脾细胞。数据表示为一式二份孔的斑点形成细胞(sfc)的平均值+/-SD。在被保护的组中，n=5，在未被保护的组中，n=3。*:与未被保护的组不同，p<0.05。
图5.经优化的非整合型慢病毒载体赋予抗疟疾的长期杀菌保护作用。(a)疫苗方案。小鼠用100ng的利用印第安纳株的VSV-G包膜假型化的TRIP.NI CSP颗粒引发，8周后用1500ng的利用新泽西株VSV-G包膜假型化的TRIP.NI CSP颗粒进行加强。5个月后，它们接受用Cocal株的VSV-G包膜假型化的TRIP.NI CS颗粒(1500ng)的第三次注射。6个月后，用500个约氏疟原虫(17XNL株)子孢子攻击动物，通过从注射后第3天直至第16天每隔一天监测血液阶段的寄生虫血症来评估保护效率。(b)攻击后10天，来自初次接受实验的小鼠(CO-黑色)、被部分保护的接种的小鼠(VAC-浅灰色(中间))和被完全保护的接种的小鼠(VAC-灰色(右边))的寄生虫血症的平均值。(c)在最终杀伤时(攻击后3周)来自小鼠的脾、骨髓和肝脏的CSP-特异性CD8+T细胞的百分比的四聚体分析。黑色条块表示被部分保护的接种的小鼠，白色条块表示被完全保护的接种的小鼠。(d)小鼠的脾、骨髓和肝脏中CSP-特异性CD8+T细胞的INF-g ELISPOT定量。*P<0.05(学生氏t-检验)。
图6.由非整合型慢病毒载体诱导的Hep17-特异性T细胞应答。用不同剂量(100或600ng)的编码Hep17的非整合型慢病毒载体的单次注射i.p.免疫初次接受实验的小鼠(n=5/组)或不免疫(-)所述小鼠。在免疫后11天，利用IFN-γELISPOT、SFC、斑点形成细胞评估抗CD8+T细胞表位(A)和CD4+T细胞表位(B)的Hep17-特异性细胞免疫应答。
图7.由整合型慢病毒载体诱导的Hep17-特异性T细胞应答。用编码Hep17的整合型慢病毒载体(1x107TU)的单次注射i.m.免疫(或不免疫：-)初次接受实验的小鼠(n=5/组)。在免疫后11天，利用IFN-γELISPOT、SFC、斑点形成细胞评估抗CD8+T细胞表位(A)和CD4+T细胞表位(B)的Hep17-特异性细胞免疫应答。
图8.在用慢病毒颗粒共免疫后引发的CS-和Hep17特异性T细胞应答。用编码CS(在图A和B中称为CSP)或Hep17(在图C和D中称为Hep17)的整合型慢病毒载体(1x107TU)的单次注射i.m.免疫初次接受实验的小鼠(n=5/组)。为了进行共免疫实验，将TRIP.I CS注射入初次接受实验的小鼠的一个四头肌并且将TRIP.I Hep17颗粒注射入相对的四头肌(在图A、B、C、D中命名为CSP+Hep)。在免疫后11天，利用IFN-γELISPOT、SFC、斑点形成细胞评估CS特异性细胞免疫应答(A)和Hep17-特异性细胞免疫应答(C)。为了进行体内细胞毒性测定，在第11天利用用CS肽(C)或Hep17肽(D)脉冲的靶细胞注射免疫的小鼠。在18小时后测定特异性杀伤的百分比，如材料和方法部分中所描述的。
图9.单次剂量的编码MSP142的非整合型慢病毒载体引发强的特异性抗体应答。A.用梯度剂量的TRIP.I MSP142腹膜内免疫成组的成年小鼠(n=5)。在21天后，就MSP-119-特异性抗体的存在分析混合血清(5只小鼠/组)。B.用100ng的利用印第安纳株的VSV-G包膜假型化的TRIP.IMSP142颗粒引发小鼠。3个月后，用1000ng的利用Cocal株的VSV-G包膜假型化的TRIP.NI MSP142颗粒加强小鼠。结果为在最后一次免疫后3周在小鼠的血清中检测到的MSP-119-特异性抗体的平均滴度。
图10.疟原虫CSP蛋白与共有序列的比对。
图11.质粒pTRIP-DeltaU3-CMV-eGFP(SEQ ID No 33)的限制性图谱。
图12.质粒pTRIP-ΔU3-CMV-MSP142CO-WPRE(CNCM I-4303或SEQID No 34)的限制性图谱。
图13.质粒pTRIP-ΔU3-CMV-Hep17CO-WPRE(CNCM I-4304或SEQID No 37)的限制性图谱。
图14.质粒pTRIP-ΔU3-CMV-Hep17ΔSP CO-WPRE(CNCM I-4305或SEQ ID No 40)的限制性图谱。
图15.质粒pTRIP-ΔU3-CMV-CSP CO-WPRE(CNCM I-4306或SEQ IDNo 43)的限制性图谱。
图16.质粒pTRIP-ΔU3-CMV-CSP ΔSP CO-WPRE(CNCM I-4307或SEQ ID No 45)的限制性图谱。
图17.质粒pTRIP-ΔU3-CMV-CSP ΔGPI CO-WPRE(CNCM I-4308或SEQ ID No 47)的限制性图谱。
实施例
为了评估慢病毒载体是否可代表可选择的策略，设计编码约氏疟原虫的环子孢子(CS)蛋白的截短形式(TRIP.NI CS)的非整合型慢病毒载体，并且在与疟疾相关的动物小鼠模型中进行测定。CS蛋白均匀地分布在子孢子的表面上并且也在感染的肝细胞上被检测到4，5。因此，抗CS蛋白的体液免疫应答的诱导减小了肝细胞的感染性，然而抗该抗原的细胞免疫应答杀死了寄生虫感染的肝细胞。该构思最近得到巧妙的研究支持，所述研究显示，CS蛋白为受辐照的子孢子免疫模型6中的保护性免疫的主要靶。此外，迄今为止在临床试验中测试的所有疫苗候选物当中，只有基于CS蛋白的疫苗RTS,S经显示显著减少地方流行的国家中的疟疾发病率和严重疟疾的病例7，8。
为了引发抗CS蛋白的最佳免疫应答，我们组合了3个策略：1)为升高转导的细胞的抗原表达水平，我们在载体骨架中插入了处于强巨细胞病毒启动子的控制下的CS蛋白的经哺乳动物密码子优化的序列，并且我们在下游添加转基因旱獭转录后调控元件序列以增强mRNA稳定性和至细胞质的输出；2)我们缺失了位于cs基因的3'末端的GPI锚定序列，因为已显示GPI-锚定基序的缺失增强了CS蛋白的免疫原性9；3)为了增强特异性免疫应答，和特别地为了保护小鼠免受子孢子攻击的感染，小鼠接受了基于LV的加强。为了避开在第一次免疫后诱导的中和抗-包膜抗体的存在，利用来自非交叉反应性血清型的VSV-G包膜(VSV-G印第安纳株用于引发，VSV-G新泽西株和Cocal株分别用于第一次和第二次加强)假型化用于加强免疫的慢病毒颗粒。
在第一系列实验中，利用中等剂量的TRIP.NI CS引发小鼠，8周后利用高剂量的TRIP.NI CS加强小鼠(图1a)。为了评估由该引发-加强方案诱导的保护作用，利用80.103个约氏疟原虫(17XNL gfp+株)子孢子(存在于蚊子中的寄生虫的侵入形式)攻击BALB/c小鼠。在完成免疫方案后4周进行攻击。在攻击后40小时，通过定量小鼠肝脏中的疟原虫的18S rRNA来测定肝期发展的抑制水平。为此目的，使用EXPRESSOne-Step
GreenERTM试剂盒(invitrogen)和用于扩增约氏疟原虫的18S rRNA的特异性引物，将肝提取的RNA用于疟原虫的18S rRNA序列的实时PCR扩增。如图1b中显示的，对于所有免疫的小鼠，寄生虫的肝期发展的抑制是完全的，即，通过定量RT-PCR未检测到寄生虫18S rRNA。在平行实验中，也通过就红内期的发生检查用500个约氏疟原虫子孢子攻击的免疫的小鼠的血涂片来评估保护作用。从攻击后第3天至14天每天获得外周血涂片，用吉姆萨染色，然后用显微镜检查，以确定免疫的小鼠是否被寄生虫感染(parasitemic)，即不能产生保护作用。如图1c中显示的，在60%的免疫的小鼠中产生完全保护作用。
在第二系列的实验中，我们添加了用Cocal株的VSV-G包膜假型化的TRIP.NI CS的第三次注射，所述Cocal株的VSV-G包膜不与抗印第安纳株和新泽西株血清型的抗体交叉反应。在最后一次加强后1个月，利用500个子孢子静脉内攻击免疫的小鼠(图2a)。利用吉姆萨染色的血涂片，通过从注射后第3天直至第21天每隔一天监测血液阶段的寄生虫血症来评估保护效率。5天后，所有初次接受实验的小鼠都显示明显的血液阶段的寄生虫血症。相比之下，62.5%的免疫的小鼠显示杀菌免疫(如通过在随后21天不存在寄生虫血症所确定的)(图2b)。此外，当与初次接受实验的小鼠比较时，产生寄生虫血症的免疫的小鼠显示明显延迟的红细胞侵入过程(图2c)。在攻击后第10天，被部分保护的免疫的小鼠与初次接受实验的小鼠相比，显示寄生虫血症的水平下降至1/2，这表明在该情况下，疫苗也提供寄生虫的免疫控制，虽然是部分的(图2d)。
肝脾肿大为疟疾的显著特征。我们因此对来自攻击后3周处死的小鼠的器官进行定性分析。用寄生虫感染的初次接受实验的小鼠显示显著的脾肿大(图3)。此外，脾和肝显示因在红细胞血红蛋白的降解过程中由寄生虫产生的疟原虫色素的积累而导致的黑色色素沉着。相比之下，8只接种的小鼠中有5只激发了杀菌免疫应答，该能力与展示正常尺寸和色素沉着的肝和脾的保护一致。
为了理解1/3的免疫的小鼠未显示杀菌保护作用的原因，我们评估了攻击后3周处死的接种的动物中的CS蛋白特异性免疫应答。被攻击的初次接受实验的小鼠未显示可检测的CS蛋白特异性IFN-μ产生性T细胞(数据未显示)。相比之下，在接种的组中，被完全保护的小鼠显示，与接种的但被部分保护的小鼠相比较，CSP-特异性T细胞应答增强至5至8倍，这强调了T细胞应答的强度对于免疫控制的重要性(图4)。
重要地，我们还在最后一次免疫后6个月进行了攻击实验。在该情况下，超过40%的接种的小鼠在攻击后仍然不产生可检测的寄生虫血症，从而证实了由我们的疫苗策略赋予的长效杀菌保护作用(图5)。
综上所述，这些数据证明，基于非整合型慢病毒载体的引发-加强方案可赋予很高程度的抗攻击性感染剂例如疟原虫的保护作用。
基于这些结果，我们目前正在开发多阶段疫苗方法(multi-stagevaccine approach)。该策略的原理是，通过诱导针对在肝期表达并且被T细胞应答靶向的抗原以及在血液阶段表达并且被抗体应答靶向的抗原的多重免疫应答来提高通过我们的疫苗方法所赋予的保护性功效。为此目的，我们已选择两个红细胞前期抗原(CS蛋白和肝细胞红细胞蛋白17kDa－HEP17)和一个红内期抗原(裂殖子表面蛋白1的42-kDa片段－MSP-142)。选择此类抗原，因为已显示特异于Hep17的细胞毒性T细胞应答具有抗子孢子攻击的部分保护作用并且特异于MSP-142的抗体应答也可保护小鼠免受血液阶段寄生虫的致死攻击10,11。如材料和方法部分中所述，构建编码Hep17或MSP-142的慢病毒载体。为了评估表达Hep17的慢病毒颗粒的单次注射的免疫原性，用100ng(3,2x107TU)或600ng(1,9x108 TU)的TRIP.NI Hep17免疫小鼠的组(n=5/组)，并通过Elispot测定特异性免疫应答。如图6中显示的，在用先前描述的9聚体和15聚体12刺激后在免疫的小鼠的脾中可检测到相对弱的CD8和CD4应答。
我们还测试了TRIP.I Hep17慢病毒颗粒的免疫原性。用1x107TRIP.I Hep17颗粒im免疫小鼠的组(n=5)。11天后在来自免疫的小鼠的脾细胞上评估Hep-17-特异性I FNg Elispot应答。如图7中显示的，检测到针对CD4+T细胞表位(KL14和EK15)和针对一个CD8+T细胞表位(LA9)的最强劲的应答。我们还评估了在用TRIP.I Hep17颗粒与TRIP.I CS颗粒共免疫后获得的T细胞应答。小鼠接受两次注射：一次在左四头肌中注射1x107TRIP.I Hep17颗粒以及一次在右四头肌中注射1x107TRIP.I CS颗粒。平行地，单独用TRIP.ICS颗粒(1x107TUim)或单独用TRIP.I Hep17颗粒(1x107TU im)免疫小鼠的组。在第11天，将一部分免疫的小鼠处死以进行Elispot实验。在单独用TRIP.CS颗粒或用TRIP.I CS和TRIP.I Hep17颗粒免疫的小鼠的CS特异性IFNg T细胞的频率之间不存在巨大差异(图8A)。为了评估免疫的小鼠中的细胞毒性T细胞应答，我们进行体内细胞毒性测定(如材料和方法中所描述的)。在第11天，通过iv注射用CS肽脉冲的靶细胞而攻击单独用TRIP.I CS颗粒免疫或用TRIP.I CS和Hep17颗粒共免疫的小鼠的组。如所预期的，利用TRIP.I CS颗粒免疫的小鼠有效地裂解靶细胞，并且我们未检测到单独用TRIP.I CS颗粒免疫的小鼠的组与接受TRIP.I CS和TRIP.I Hep17颗粒的小鼠的组之间的显著差异(图8B)。综上所述，这些结果显示，与TRI P.I CS颗粒共施用的TRIP.I Hep17颗粒不会显著干扰由TRIP.I CS颗粒引发的CS-特异性T细胞应答。我们还评估了用TRIP.I Hep17(单独或与TRIP.I CS颗粒共施用)免疫的小鼠的Hep17-特异性IFNg T细胞的频率。响应5种9聚体肽(CD8+T细胞表位)的刺激的特异性T细胞的频率在两个组中是相同的，并且在用KL14表位(CD4+T细胞表位)刺激后测量的两个组的频率也是相同的。令人惊讶地，检测到的针对CD4+T细胞表位EK15的应答在共免疫的小鼠中为在单独用TRIP.I Hep17免疫的小鼠中的2倍(图8C)。如图8D中显示的，针对Hep17肽脉冲的靶的T细胞的细胞毒性能力在用TRIP.I Hep17和TRIP.I CS颗粒共免疫的小鼠中也得到极大的增加。总之，这些数据显示，CS特异性免疫应答增强特异于Hep17的细胞毒性T细胞应答。
我们接着评估了慢病毒载体起始针对血液阶段疟疾抗原裂殖子表面蛋白-1(MSP1)的B细胞应答的能力。用不同剂量的编码在N端与钙网蛋白(calreticuline)的分泌信号融合的来自约氏疟原虫的MSP1的42-kDa区域的整合型慢病毒载体(TRIP.I MSP142)免疫小鼠(n=5)。在免疫后3周，就针对抗原的保护性C末端19-kDa区域(MSP-119)13,14的总抗-MSP1抗体的存在，测试从每一组免疫的小鼠收集的混合血清。如图9A中所示，用低至1x106TU的剂量免疫的小鼠显示可检测水平的抗-MSP-119抗体并且利用1x107TU的该载体的免疫以达到2x 103的平均滴度诱导抗MSP-119Ig的强分泌。为了知道由慢病毒载体免疫赋予的抗-MSP1应答是否可被第二次免疫增强，3个月后用1000ng的利用Cocal株的VSV-G包膜假型化的TRIP.NI MSP142颗粒加强用100ng的利用印第安纳株的VSV-G包膜假型化的TRIP.I MSP142颗粒免疫的小鼠(图9B)。最后一次免疫后3周，引发-加强小鼠的抗-MSP-119抗体的水平达到4x 105的平均值，然而，仅进行引发的小鼠的血浆滴度为2x104。总之，利用整合型慢病毒载体的免疫可诱导已显示具有抗寄生虫对红细胞的感染的保护作用的强劲的抗-MSP-119 Ig。
材料和方法
动物和寄生虫。Balb/cOla Hsd(6周龄雌性)购自Harlan实验室(Gannat,France)。按照巴斯德研究所的Animal Care的指导方针进行所有动物实验。用野生型或经遗传修饰(以表达绿色荧光蛋白)的约氏疟原虫(17XNL株)进行感染实验，从而允许在活蚊子中检测卵囊(oocyst)和子孢子。通过斯氏按蚊(Anopheles stephensi)和Balb/c小鼠中的交替循环传代维持约氏疟原虫。使用标准方法在巴斯德研究所的Center for Production and Infection of Anopheles(CEPIA)饲养蚊子。
质粒载体的构建。由Geneart合成编码全长Py CS蛋白(氨基酸1-367；GenBank登录号M58295)的基因的经哺乳动物密码子优化的形式。由于已显示GPI-锚定基序的缺失增强CS蛋白的免疫原性，因此我们构建了缺失编码最后11个氨基酸的序列的cs基因的经密码子优化的形式。使用下列寡核苷酸(Sigma-Proligo):(正向)5'GGTACCGGATCCGCCACCATGAAGAAATGCACC-3'(下划线标示的为BamHI位点)；(反向)5'-AGCTCGAGTCATCACAGGCTGTTGGACACGATGTTGAAGATGC-3'(下划线标示的为XhoI位点)，通过PCR扩增密码子优化的cs基因的片段来获得该序列。将所得的扩增子克隆入pCR 2.1-TOPO质粒(Invitrogen)并且进行测序(质粒称为pCR 2.1-TOPO CS)。pTRIP CS载体质粒通过下述来产生：用在pCR 2.1-TOPO CS的BamHI/XhoI降解后获得的截短的密码子优化的CS序列替代来自BamHI/XhoI降解的pTRIP CMV-GFP-WPRE的GFP序列。为了产生pTRIP Hep17，将包含kozak序列并且在5'侧翼连接BamH1位点以及在3'侧翼连接XhoI位点的Py Hep17基因(GenBank登录号U43539)的经哺乳动物密码子优化的序列(Geneart)克隆入BamH1/XhoI降解的pTRIP CMV-WPRE。为了获得MSP1构建体，设计复合的经哺乳动物密码子优化的序列(Geneart)以包括：编码与Py MSP142(GenBank登录号JO4668)的密码子优化的序列融合的钙网蛋白的分泌信号(MLLSVPLLLGLLGLAVA)的序列。将BamH1/XhoI降解的完整序列克隆入BamH1/XhoI降解的pTRIPCMV-WPRE。
pTRIP载体的序列分别被命名为：SEQ ID NO 34、37、40、43、45和47。
慢病毒载体的产生。如之前所述15，通过用载体质粒pTRIP CS、VSV-G包膜表达质粒(pHCMV-G)和pD64V衣壳化GAG POL质粒(用于产生整合缺陷型载体(整合酶的催化结构域中的D64V置换阻断整合步骤的DNA切割和连接反应))瞬时磷酸钙共转染293T细胞来产生载体颗粒。利用商业HIV-1p24酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(PerkinElmer Life Sciences)来进行浓缩的载体颗粒的p24抗原含量的定量。通过转导用阿非科林(SIGMA)处理的HeLa细胞和如先前所述15进行定量PCR来测定TRIP.I和TRIP.NI颗粒的载体滴度。根据在生长停滞的细胞中测量的p24含量和定量PCR，整合型和非整合型慢病毒载体的滴度是相似的。
小鼠免疫和攻击。用100ng的在0.1ml达尔伯克磷酸缓冲盐溶液中稀释的利用印第安纳株的VSV-G包膜假型化的TRIP.NI CS载体颗粒腹膜内(i.p.)免疫6周龄BALB/c小鼠。8周后，用1500ng的利用新泽西株的VSV-G包膜假型化的TRIP.NI CS载体颗粒i.p.加强小鼠。对免疫的小鼠和对照小鼠的攻击由最后一次免疫后4周或更多周静脉内注射80,000个子孢子组成。攻击的结果通过使用随后详细描述的定量实时RT-PCR法测量小鼠的肝脏的寄生虫负荷来测定。我们还通过从攻击后第3天至第14天每天显微镜检查获得的吉姆萨染色的薄血涂片，确定在静脉内接种500个子孢子后小鼠的对照和免疫组中的小鼠是否发生寄生虫血症。简而言之，将来自被攻击的小鼠的一小滴血液置于显微镜载玻片上。通过使用第二个载玻片来涂抹血滴，然后风干，在100%甲醇中固定30秒。将经固定的载玻片在于水(Volvic)中稀释的10%吉姆萨(Reactfs RAL)的新鲜溶液中染色30分钟，然后用水漂洗，在空气中干燥。用x100油浸物镜观察载玻片。
通过实时RT-PCR定量约氏疟原虫。如先前所述16(进行了一些改进)，定量被攻击的小鼠的肝脏的寄生虫载量。在攻击后40小时，收获肝脏，利用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)提取RNA。将2μg的RNA用于定量寄生虫特异性18S rRNA。利用EXPRESS One-Step 
GreenERTM试剂盒(invitrogen)和用于扩增约氏疟原虫的18S rRNA的特异性引物进行实时RT-PCR的反应。引物(Sigma-Proligo)的序列为：5'-GGGGATTGGTTTTGACGTTTTTGCG-3'(正向引物)和5'-AAGCATTAAATAAAGCGAATACATCCTTAT-3'(反向引物)。利用Li ghtCyclerTM装置(Rochediagnostics)进行实验。通过将荧光阈值外推至从包含寄生虫的18ScDNA PCR-扩增片段的质粒构建体(pCR 2.1-TOPO质粒-Invitrogen)的系列稀释物制备的内部标准曲线上来估量寄生虫RNA拷贝的量。
Elispot测定。硝酸纤维素微量板(MAHA S4510,Millipore)用捕获抗体(Mouse IFNg Elispot pair,BD Pharmingen)进行包被，并用包含补充有10%FCS、抗生素、Hepes、非必需氨基酸、β-巯基乙醇和丙酮酸钠的RPMI 1640 Glutamax的完全培养基进行封闭。以一式三份将来自载体免疫的小鼠的脾细胞以0.125x106个细胞/孔添加至板中。为了定量CS特异性CD8+T细胞应答，将脾细胞与2μg/ml的肽(PolyPeptide Laboratories France)SYVPSAEQI (Py CS280-288)或IYNRNIVNRL(Py CS58-67)一起温育。为了评估CS特异性CD4+T细胞应答，将脾细胞与2μg/ml的肽SYVPSAEQILEFVKQI(Py CS280-295)一起温育。20小时后，利用缀合有生物素的抗体(Mouse IFNg Elispot pair,BD Pharmingen)，然后利用链霉抗生物素蛋白-AP(Roche)和BCIP/NB底物溶液(Promega)来显示斑点。使用Bioreader 2000(Biosys,Karben,Germany)计数斑点，结果表示为IFNγ斑点形成细胞(sfc)/百万个脾细胞。将相同方案用于定量Hep17-特异性T细胞应答。在Elispot和体内细胞毒性测定中用于刺激的肽概述于表1中。
体内细胞毒性测定。为了制备靶细胞，用不同浓度(高，5μM；低，1μM)的CFSE(羧基荧光素-二乙酸琥珀酰亚胺酯，Vybrant CFDA-SEcell-tracer试剂盒,Molecular Probes)标记来自初次接受试验的小鼠的脾细胞。用5μg/ml的肽的组合脉冲用高浓度CFSE标记的脾细胞。将用低剂量的CFSE染色的对照群体于不含肽的培养基中温育。每一只小鼠通过通过眶后静脉接受包含相同数目的来自每一个级分的细胞的混合物的107个CFSE-标记的细胞。在15-18小时后，利用流式细胞术(Becton Dickinson,CellQuest software)分析来自脾脏的单细胞悬浮液。通过比较免疫的小鼠对初次接受实验的小鼠的脉冲的(高CFSE荧光强度)与未脉冲的(低CFSE荧光强度)群体的比率来测定肽脉冲的细胞的消失。按照下列算式确定特异性杀伤的百分比：(1-((初次接受实验的CFSE低/初次接受实验的CFSE高)/(免疫的CFSE低/免疫的CFSE高)))*100。
表1.CS和Hep17合成肽的序列
重组MSP119蛋白。使用正向引物5'-CGTGGATCCATGGACGGCATGGATCTGCTG-3'和反向引物5'-GATGAATTCGGAGCTGCTGCTGCAGAACACG-3'从pTRIP MSP142通过PCR扩增约氏疟原虫YM MSP119(aa 1649-1757)，将其克隆入谷胱甘肽S-转移酶(GST)-融合蛋白表达载体pGEX-2T(Amersham Biosciences,Bucks,UK)。用pGEX-2T MSP119转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21s tar(Invitrogen)，并按照制造商的说明书(pGEX载体，GST基因融合系统，Amersham)进行生长和诱导。在诱导BL21的蛋白质表达后，收获细胞，使用BugBuster试剂(Novagen)进行裂解。按照制造商的说明书，使用GST结合纯化试剂盒(Novagen)通过GST结合树脂层析纯化重组蛋白质。
血清抗体应答的测量。在最后一次免疫后3周收集血清，以利用酶联免疫吸附测定(ELISA)评估MSP119特异性抗体。将重组GST-MSP119融合蛋白或GST对照以2μg/ml(于PBS中)在4℃下过夜吸附至96孔Nunc-Immuno Maxisorp板(Fischer Scientific,Wohlen,Germany)。在用0.05%的于PBS中的Tween 20洗涤3次后，通过添加100μl的包含10%的胎牛血清(FBS)的PBS在室温下封闭孔1小时。利用0.05%的于PBS中的Tween 20洗涤板3次，向孔中添加100μl的血清的10倍系列稀释物。在室温下温育2小时后，洗涤孔，将100μl于PBS 10%FBS中以1/4000稀释的过氧化物酶山羊抗-小鼠免疫球蛋白(H+L)(Jackson Immuno Research)添加至每一个孔中。在室温下温育1小时后，洗涤孔，将100μl四甲基联苯胺底物试剂(BDPharmingen)添加至每一个孔中。将板在室温下温育30分钟，添加100μl的1N H2SO4以终止反应。在450nm处读取板的光密度。终点滴度计算为，引发2倍非免疫小鼠的血清的光密度的最大稀释度的倒数。
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PCT/RO/134表
PCT/RO/134表(1998年7月，2004年1月再版)
Claims (22)
1.一种慢病毒载体颗粒，(i)其利用源自RNA病毒的确定的异源病毒包膜蛋白质进行假型化，和(ii)其在其基因组中包含至少一个重组多核苷酸，所述重组多核苷酸编码至少一个具有能够感染哺乳动物宿主的疟原虫属寄生虫的红细胞前期抗原的表位的多肽，其中所述表位包括T表位和任选地B表位。
2.权利要求1的慢病毒载体，其为不具有复制能力的基于HIV的载体颗粒。
3.权利要求1的慢病毒载体颗粒，其中至少一个重组多核苷酸包含核酸序列，所述核酸序列编码来自感染人的疟原虫属寄生虫的环子孢子蛋白(CSP)的抗原的多肽，或编码选自下述的抗原的多肽：子孢子表面蛋白2(TRAP/SSP2)、肝期抗原(LSA)、LSA3、Pf输出蛋白1(PfExp1)、Pf抗原2子孢子和肝期抗原(SALSA)、子孢子富含苏氨酸和天冬酰胺蛋白(STARP)。
4.前述权利要求的任一项的慢病毒载体颗粒，其在其基因组中包含编码选自下述的多肽的多核苷酸：裂殖子表面蛋白1(MSP2)，特别地裂殖子表面蛋白1(MSP-1)、裂殖子表面蛋白2(MSP-2)、裂殖子表面蛋白3(MSP-3)、裂殖子表面蛋白4(MSP-4)、裂殖子表面蛋白6(MSP-6)、MSP3-GLURP融合蛋白、环状体感染红细胞表面抗原(RESA)、棒状体相关蛋白1(RAP-1)、顶膜抗原1(AMA-1)、红细胞结合抗原(EBA-175)、红细胞膜相关巨大蛋白或抗原332(Ag332)、dnaK-型分子伴侣、富含谷氨酸的蛋白质(GLURP)，特别地MSP3-GLURP融合蛋白、红细胞膜蛋白1(EMP-1)、丝氨酸重复抗原(SERA)、富含集簇的天冬酰胺的蛋白质(CARP)、环子孢子蛋白相关抗原前体(CRA)、细胞粘连连接的无性蛋白(CLAG)、酸性碱性重复抗原(ABRA)或101kDa疟疾抗原、棒状体抗原蛋白(RAP-2)、结节相关富组氨酸蛋白(KHRP)、棒状体抗原蛋白(RAP)、半胱氨酸蛋白酶、假定蛋白质PFE1325w、保护性抗原(MAg-1)、果糖-二磷酸醛缩酶、核糖体磷蛋白P0、P-型ATP酶、葡萄糖调节蛋白(GRP78)、富含天冬酰胺和天冬氨酸的蛋白质(AARP1)、散在重复抗原或PFE0070w，和/或编码选自下述的多肽的多核苷酸：有性阶段的子孢子表面抗原、抗原Pfg27/25、抗原QF122、11-1多肽、配子母细胞-特异性表面蛋白(Pfs230)、动合子表面蛋白(P25)、壳多糖酶、多药抗性蛋白质(MRP)。
5.前述权利要求的任一项的慢病毒载体颗粒，其中所述重组多核苷酸具有经哺乳动物密码子优化的核苷酸序列并且任选地基因组的基于HIV的序列具有经哺乳动物密码子优化的核苷酸序列。
6.前述权利要求的任一项的慢病毒载体颗粒，其中重组多核苷酸至少编码CSP抗原的多肽，所述多肽缺失所述CSP的GPI-锚定基序。
7.前述权利要求的任一项的慢病毒载体颗粒，其选自整合缺陷型载体颗粒或具有整合能力的载体颗粒。
8.前述权利要求的任一项的慢病毒载体颗粒，其利用选自下述的水疱性口炎病毒(VSV)的病毒跨膜糖基化(G)包膜蛋白进行假型化：印第安纳株的VSV-G蛋白、新泽西株的VSV-G蛋白、Cocal株的VSV-G蛋白、伊斯法罕株的VSV-G蛋白、金迪普拉株的VSV-G蛋白、皮里株的VSV-G蛋白或SVCV株的VSV-G蛋白。
9.前述权利要求的任一项的慢病毒载体颗粒，其为从用下述共转染的哺乳动物细胞回收的产物：
-载体质粒，其包含(i)慢病毒特别地HIV-1的包装、逆转录和转录所必需的顺式激活序列，且还包含功能性慢病毒特别地HIV-1的DNAflap元件，和任选地包含整合所必需的顺式激活序列，所述载体质粒还包含(ii)处于表达调控序列特别地启动子的控制之下的、疟原虫属寄生虫的cs基因的截短的经哺乳动物特别地人密码子优化的序列的多核苷酸；
-包含编码VSV-G包膜蛋白的多核苷酸的VSV-G包膜表达质粒，其中所述多核苷酸处于表达调控序列的控制之下，和，
-衣壳化质粒，其中衣壳化质粒包含适用于产生具有整合能力的载体颗粒的慢病毒特别地HIV-1的gag-pol编码序列，或适用于产生整合缺陷型载体颗粒的修饰的gag-pol编码序列，其中所述gag-pol序列来自与DNA flap元件相同的慢病毒亚家族，其中所述gag-pol或修饰的gag-pol序列处于表达调控序列的控制之下。
10.前述权利要求的任一项的慢病毒载体颗粒，其为从具有下述的稳定细胞系回收的产物：
-载体质粒，其包含(i)慢病毒特别地HIV-1的包装、逆转录和转录所必需的顺式激活序列，且还包含功能性慢病毒特别地HIV-1的DNAflap元件，和任选地包含整合所必需的顺式激活序列，所述载体质粒还包含(ii)处于表达调控序列特别地启动子的控制之下的、疟原虫属寄生虫的cs基因的截短的经哺乳动物特别地人密码子优化的序列的多核苷酸；
-包含编码VSV-G包膜蛋白的多核苷酸的VSV-G包膜表达质粒，其中所述多核苷酸处于表达调控序列，特别地包含诱导型启动子的表达调控序列控制之下，和；
-衣壳化质粒，其中衣壳化质粒包含适用于产生具有整合能力的载体颗粒的慢病毒特别地HIV-1的gag-pol编码序列或适用于产生整合缺陷型载体颗粒的修饰的gag-pol编码序列，其中所述gag-pol序列来自与DNA flap元件相同的慢病毒亚家族，其中所述慢病毒gag-pol或修饰的gag-pol序列处于表达调控序列的控制之下。
11.前述权利要求的任一项的慢病毒颗粒，其载体基因组包含基于慢病毒的序列，特别地基于HIV-1的序列，所述序列缺乏功能性慢病毒基因并且包含包装、逆转录和转录所必需的顺式激活序列，且还包含功能性慢病毒特别地HIV-1的DNA flap元件，所述载体基因组的特征还在于，所述顺式激活序列中的至少一个为如下的经修饰的多核苷酸：
a)来自慢病毒基因组的3'LTR序列被截短并且缺乏U3区域的增强子；
b)来自慢病毒基因组的3'LTR序列被截短并且缺乏U3区域或在U3区域中具有部分缺失；
c)LTR5'的U3区域被非慢病毒U3区域或被适合于驱动不依赖于tat的初级转录的启动子替代。
12.一种用于给哺乳动物宿主分开施用的化合物的组合，其至少包括：
(i)利用第一确定的异源病毒包膜蛋白质进行假型化的前述权利要求的任一项中定义的慢病毒载体颗粒；
(ii)与(i)中的慢病毒载体颗粒分开地提供的、用与所述第一异源病毒包膜蛋白质不同的第二确定的异源病毒包膜蛋白质假型化的前述权利要求的任一项中定义的慢病毒载体颗粒；
其中所述第一和第二病毒包膜蛋白彼此不发生血清中和，并且适合用于哺乳动物细胞的体内转导。
13.前述权利要求的化合物的组合，其中所述第一和第二病毒包膜蛋白为:
-分别地印第安纳株的VSV-G和新泽西株的VSV-G，或反之亦然，或，
-其中所述第一和第二包膜蛋白的一个或两个为天然印第安纳株的VSV-G或/和新泽西株的VSV-G的修饰形式，或，
-其中所述第一和第二包膜蛋白的至少一个为嵌合VSV-G蛋白，其中下列结构域的至少一个来自印第安纳株：输出决定YTDIE、细胞质尾、跨膜结构域或细胞质结构域，或，
-所述第一病毒包膜蛋白为印第安纳株的VSV-G或新泽西株的VSV-G，并且所述第二病毒包膜蛋白选自Cocal株的VSV-G蛋白、伊斯法罕株的VSV-G蛋白、金迪普拉株的VSV-G蛋白、皮里株的VSV-G蛋白和SVCV株的VSV-G蛋白。
14.权利要求9或10的分开提供的化合物的组合，其中所述慢病毒颗粒编码不同的多肽，包括(i)CSP抗原的多肽或缺乏GPI锚定基序的CSP抗原的多肽，和(ii)至少一种另外的选自子孢子表面蛋白2(TRAP/SSP2)、肝期抗原(LSA)、Pf输出蛋白1(Pf Exp1)、Pf抗原2的疟疾寄生虫的抗原的多肽，所述抗原的所述不同的多肽从相同慢病毒颗粒表达或从不同慢病毒颗粒表达。
15.前述权利要求的任一项的分开提供的化合物的组合，其中慢病毒颗粒编码选自裂殖子表面蛋白1(Msp-1)、裂殖子表面蛋白2(Msp-2)、顶膜抗原1(AMA-1)、丝氨酸重复抗原(SERA)、GLURP抗原、Pf 155/RESA(环状体感染红细胞表面抗原)或棒状体相关蛋白1(RAP-1)或棒状体相关蛋白2(RAP-2)的多肽。
16.前述权利要求的任一项的慢病毒载体颗粒或化合物的组合，用于抗哺乳动物宿主，特别地人宿主的疟疾寄生虫感染或寄生虫诱导的病症的预防性免疫。
17.前述权利要求的任一项中定义的慢病毒载体颗粒的组合物或化合物的组合，其利用适当的施用媒介物来配制，用于抗哺乳动物宿主，特别地人宿主的疟疾寄生虫感染或寄生虫诱导的病症的预防性免疫，所述用途牵涉包括下述的免疫模式：施用有效量的慢病毒颗粒以引发宿主的细胞免疫应答，和在较晚的时间上施用有效量的慢病毒颗粒以加强宿主的细胞免疫应答，和任选地重复所述用于加强的施用步骤，其中利用彼此不发生血清中和的不同的包膜蛋白来假型化引发或加强步骤的每一个步骤中施用的慢病毒颗粒，并且其中所述引发和加强步骤在时间上相隔至少6周，特别地相隔至少8周。
18.前述权利要求的任一项的慢病毒载体颗粒或化合物的组合，其通过给药方案用于抗哺乳动物宿主，特别地人宿主的疟疾寄生虫感染或寄生虫诱导的病症的预防性免疫，所述给药方案包括分开地提供的所述慢病毒颗粒的剂量，其中意欲用于引发细胞免疫应答的剂量为中等剂量并且意欲用于加强细胞免疫应答的剂量比用于引发的剂量高。
19.前述权利要求的任一项的慢病毒载体颗粒或化合物的组合，其通过给药方案用于抗哺乳动物宿主，特别地人宿主的疟疾寄生虫感染或寄生虫诱导的病症的预防性免疫，所述给药方案包括分开地提供的所述慢病毒颗粒的剂量，其中当使用具有整合能力的载体颗粒时，意欲用于引发和意欲用于加强细胞免疫应答的剂量包括107至109的慢病毒颗粒，并且当使用不具有整合能力的载体时，意欲用于引发和意欲用于加强细胞免疫应答的剂量包括108至1010的慢病毒颗粒。
20.前述权利要求的任一项的慢病毒载体颗粒或化合物的组合，其通过给药和施用方案用于抗哺乳动物宿主，特别地人宿主的疟疾寄生虫感染或寄生虫诱导的病症的预防性免疫，所述给药和施用方案适合在宿主中获得至少一个下列效应：
(I)引发抗人宿主的疟疾寄生虫感染，特别地由恶性疟原虫、三日疟原虫、间日疟原虫、诺氏疟原虫或卵形疟原虫引起的疟疾寄生虫感染的杀菌保护作用；
(II)抑制疟疾寄生虫的细胞外形式；
(III)预防疟疾寄生虫的肝细胞感染或抑制感染的肝期扩增；
(IV)引发抗疟疾寄生虫抗原的特异性T细胞免疫应答，特别地CD8+T细胞应答和/或特异性CD4+T细胞应答；
(V)引发抗寄生虫抗原的B细胞应答；
(VI)控制寄生虫血症以减小或缓解疟疾寄生虫感染的效应；
(VII)引发抗寄生虫感染或抗寄生虫诱导的病症的保护性细胞免疫；
(VIII)引发记忆T细胞免疫应答；
(IX)在疟疾寄生虫感染期间，引发CD4+和CD8+T细胞应答的更早和更高的反弹；
(X)在疟原虫感染后通过刺激肝内记忆性淋巴细胞引发更早和强的CT(CD8+T)应答；
(XI)防止疟疾寄生虫逃脱免疫应答，从而允许长期控制疟疾寄生虫的感染。
21.前述权利要求的任一项定义的慢病毒载体颗粒或化合物的组合用于制造免疫原性组合物的用途，所述组合物用于抗哺乳动物宿主特别地人宿主的疟疾寄生虫感染或寄生虫诱导的病症的预防性免疫。
22.前述权利要求的任一项的慢病毒载体颗粒或化合物的组合，其与佐剂化合物和/或与免疫刺激化合物以及适当的递送媒介物结合，用于抗哺乳动物宿主特别地人宿主的疟疾寄生虫感染或寄生虫诱导的病症的预防性免疫。
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