JP5937574B2 - レンチウイルスベクターに基づくマラリアに対する免疫学的化合物 - Google Patents

Description

本発明は、レンチウイルスベクターに基づくマラリアに対する免疫学的化合物に関する。

ワクチン戦略の設計において観察される障害を考慮しても、高い死亡率及び罹患率を導く多くの疾患、例えばマラリアは、強力なＴ細胞媒介性免疫、及び有利に強力な体液性免疫応答を誘発することを可能にする新規のワクチンプラットフォームの開発を未だ必要とする。ヒトに感染する寄生性感染の中で、マラリアは、斯かるワクチンのための多数の試みが提案されている疾患である。

しかしながら、マラリアに関して、放射線で弱毒化されたスポロゾイトを含むワクチンのみが、齧歯動物（Ｎｕｓｓｅｎｚｗｅｉｇ Ｒ．Ｓ．ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ２１６，１６０−１６２（１９６７））、サル（Ｇｗａｄｚ；Ｒ．Ｗ．ｅｔ ａｌ，Ｂｕｌｌ Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎ ５７ Ｓｕｐｐｌ １，１６５−１７３ （１９７９））、及びヒト（Ｃｌｙｄｅ，Ｄ．Ｆ．ｅｔ ａｌ，Ａｍ Ｊ．Ｍｅｄ Ｓｃｉ ２６６，１６９−１７７（１９７３））において、無菌免疫（ｓｔｅｒｉｌｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を一貫して誘導する。大変興味深いことにもかかわらず、集団ワクチン接種に有望であると考えられる前に、放射線照射されたスポロゾイトワクチン手法は、特に安全性、製造、保存、及び配給に関する多数の課題を克服する必要がある。

総説において、Ｌｉｍｂａｃｈ Ｋ．Ｊ．＆Ｒｉｃｈｉｅ Ｔ．Ｌ．（Ｐａｒａｓｉｔ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００９，３１，５０１−５１９）は、マラリアに対する様々な利用可能なワクチンプラットフォームを考察しており、それは、免疫応答を誘発する抗原の送達手段としてウイルスベクターの使用に基づく。斯かるプラットフォームは、ポックス・ウイルスベクター化マラリア抗原、又はアデノウイルスベクター化マラリア抗原に基づいて設計されたワクチンを含み、双方の種類のベクターは、とりわけ、投与についての異種のプライム・ブースト接種法療法に関する手法において提案される。これらのポックス・ウイルス又はアデノウイルスに基づく技術とは別に、総説の著者らは、新規ベクターシステムが、適宜、黄熱ベクター化戦略、又はアルファウイルスレプリコンベクター化戦略を考慮する動物モデルにおいて有望であり得ることを開示する。それらはまた、哺乳動物宿主において長続きする免疫を提供するのに効果的であり得、ヒト宿主に投与のための安全性の要求を満たし得る、ワクチンベクターの設計における残存する困難性を克服するための、様々な可能性を有する興味深い方法を予測する。斯かる方法は、抗原のための異種の送達手段の組み合わせ、アジュバントの使用又は免疫調節成分の使用を含む。

先行技術の提案されているワクチン組成物を評価する場合に観察される少なくともいくつかの欠点を克服するために、発明者らは、マラリアに対する予防用ワクチンを開発することを目的とする新規ワクチン接種プラットフォームのための基礎として、レンチウイルスベクターの手法を検討している。

マラリアは、ハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅ）により宿主に媒介され、毎年何百人もの死者が発生する、多くの国における風土病である病理である。死亡率はさておき、マラリアは、それが風土病である国の人口の多数の罹患状態を引き起こし、それにより、これらの国に医学的及び経済的に主要な懸案事項をもたらす。

５種のプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）寄生虫：プラスモディウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、プラスモディウム・オバール（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、プラスモディウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモディウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）（１７）、及びプラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）は、ヒトに感染することが知られており、最後者は、ほぼ全て死亡症例をもたらすマラリアの病原体である。ヒトにおける感染は、雌性蚊に由来する寄生虫のスポロゾイト形態の接種で開始する。寄生虫のこれらの形態は、それらが肝細胞の侵入を開始した場合、血流からヒト宿主の肝臓に迅速に移る。プラスモディウム属の株に依存して、寄生虫の肝臓内サイクルの持続期間は、５〜１５日であり、Ｐ．ファルシパルム（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）については、短い（約５．５日）。寄生虫は、感染した細胞における無性複製の結果として、肝臓において増幅し、寄生虫のメロゾイト形態を生じる。メロゾイトが肝細胞から放出（ｌｉｂｅｒａｔｉｏｎ）された後、それらは、ヒト宿主における感染の兆候段階に対応する血液ステージ感染に進行する。従って、メロゾイトは特異的膜受容体を介して、赤血球（ｒｅｄ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌｓ）（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ））に迅速に浸透する。赤血球のメロゾイト侵襲は、プラスモディウム属の株に依存して４８〜７２時間続く、サイクルの赤血球ステージに対応する。このステージの間、メロゾイトは、更なるメロゾイトの放出を生じる複数核分裂を経て、それは更なる赤血球の侵襲の実行、従ってサイクルを繰り返すことを可能にする。ヒトにおいて、症候性疾患は、赤血球の侵襲、それらの破壊、及び宿主の反応の作用の結果である。感染の間、いくつかの寄生形態は、蚊により摂取される生殖母体として区別され、それらがスポロゾイトのサイクルを経る場合、ヒトに感染するスポロゾイトを生じる。

人体における異なるステージ、及び寄生虫の異なる形態を含む感染のサイクルのために、様々な戦略は、ワクチン成分を送達するために提案されており、プラスモディウム属の様々な抗原は、特に体液性抗体反応に取り組む場合、免疫応答の標的として提案されている。

免疫応答を引き起こす、又は向上させるのに好適な標的候補は、ワクチンを設計するために様々な抗原を含んでもよく、従って、「肝臓ステージ抗原」（また、「前赤血球ステージ抗原」としても称される）及び／又は「血液ステージ抗原」を含んでもよい。

本発明の範囲内で、発明者らは、マラリア寄生虫の前赤血球ステージ抗原がヒトにおける寄生虫のサイクルの後期のステージにおいて現われる抗原よりも低い変動性を示すので、それらが集団のレベルにおいて均一に有効である保護免疫応答を誘発するために有利に用いられ得ることを、主に考慮している。発明者らはまた、マラリアに対する長期の保護のために、細胞性応答を誘発するのに好適な手段は必要であり、体液性応答により有利に補われることを考慮している。

発明者らは、従って、保護免疫応答が、有効なエフェクター細胞及びメモリー細胞の発生及び発達を要求し、前記応答が、天然の感染について観察される免疫応答の効率を上回るのに十分に強力であるべきであることを見つけ出している。

本発明は、従って、マラリアのために一般的に用いられるネズミモデルにおいて証明されるように、ヒトに適用される場合、免疫組成物のための有効成分の送達手段に加えて、強力で長続きする免疫応答を誘発するのに好適な適切な免疫付与パターンの決定を可能にする、マラリアワクチンの調製又は開発のための新規プラットフォームとして、新規レンチウイルスに基づくベクターを提供する。

本発明は、従って、レンチウイルスベクター粒子、特に複製能力の無いレンチウイルスベクター粒子、特に（ｉ）それらが、ＲＮＡウイルス由来の異種のウイルスエンベロープタンパク質（単数）又はウイルスエンベロープタンパク質（複数）で偽型化され、（ｉｉ）それらが、それらのゲノム中に、哺乳動物宿主を感染することのできるプラスモディウム属寄生虫の前赤血球ステージ抗原のエピトープ（単数又は複数）を有する少なくとも１つのポリペプチド（単数又は複数）をコードする少なくとも１つの組み換えポリヌクレオチドを含む点（前記エピトープ（単数又は複数）は、Ｔ−エピトープ（単数又は複数）を含む）、に特徴付けられる、複製能力の無いＨＩＶに基づくベクター粒子である、レンチウイルスベクター粒子に関する。

非統合性レンチウイルスベクターに基づくワクチン接種は、肝臓ステージ発症の完全な阻害を与える。Ａ．研究設計。ナイーブマウスは、第０週間において、１００ｎｇのＶＳＶ−Ｇ Ｉｎｄｉａｎａ（ＶＳＶ−Ｇ Ｉｎｄ）エンベロープで偽型化されたＴＲＩＰ．ＮＩ ＣＳ粒子で０週間においてプライムされ、その後、第８週において、１５００ｎｇのＶＳＶ−Ｇ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ（ＶＳＶ−Ｇ ＮＪ）エンベロープで偽型化されたＴＲＩＰ．ＮＩ ＣＳ粒子でブーストされた。ワクチン接種されたマウスの一つの群は、８０，０００スポロゾイト（ｓｐｚ）のプラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）（１７ＸＮＬ−ｇｆｐ⁺株）でチャレンジされ、保護効果は、４０時間後の肝臓寄生虫負荷（ｌｏａｄ）を定量することにより、測定された。ワクチン接種されたマウスの二つ目の群は、５００ｓｐｚのプラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）（１７ＸＮＬ−ｇｆｐ⁺株）でチャレンジされ、保護効果は、ギムザ染色された血液塗抹標本により、注射の３日後から１４日目まで１日おきに寄生虫血症の血液ステージをモニタリングすることにより評価された。二つの場合では、チャレンジは、最後の免疫付与の１ヶ月後に行なわれた。Ｂ．チャレンジされたマウスの肝臓中のＰ．ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）１８Ｓ ｒＲＮＡについてのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて定量された寄生虫負荷の結果。データは、個別の対照マウス（ｎ＝５）、及びワクチン接種されたマウス（ｎ＝４）において検出されたプラスモディウム属１８Ｓ ｒＲＮＡのコピーの数として表される。２点の平均＋／−ＳＤが、示される。Ｃ．寄生虫血症の血液ステージのモニタリングの結果。０は、寄生虫の不存在を示し、＋は寄生虫の存在を示す。

Ａ．研究設計。マウスは、１００ｎｇのＶＳＶ−Ｇ Ｉｎｄｉａｎａ（ＶＳＶ−Ｇ Ｉｎｄ）エンベロープで偽型化されたＴＲＩＰ．ＮＩ ＣＳ粒子でプライムされ、第８週後、１５００ｎｇのＶＳＶ−Ｇ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ （ＶＳＶ−Ｇ ＮＪ）エンベロープで偽型化されたＴＲＩＰ．ＮＩ ＣＳ粒子でブーストされ、５ヶ月後に、１５００ｎｇのＶＳＶ−Ｇ Ｃｏｃａｌで偽型化されたＴＲＩＰ．ＮＩ ＣＳ粒子で三度目の免疫付与を受けた。ワクチン接種されたマウスは、１ヶ月後、５００ｓｐｚのプラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）でチャレンジされ、保護効果は、ギムザ染色された血液塗抹標本により、注射の３日後から１６日目まで１日おきに寄生虫血症の血液ステージをモニタリングすることにより評価された。Ｂ．非統合性レンチウイルスベクターに基づく投与計画後、スポロゾイトチャレンジに対して完全に保護されたマウスのパーセンテージ。Ｃ．ナイーブマウス（ＣＯ−黒色曲線）、完全に保護されたワクチン接種されたマウス（ＶＡＣ−薄灰色曲線）、及び部分的に保護されたワクチン接種されたマウス（ＶＡＣ−灰色曲線）の平均は、表される。Ｄ．チャレンジの１０日後の、ナイーブマウス（ＣＯ−黒色曲線）、部分的に保護されたワクチン接種されたマウス（ＶＡＣ−灰色）、及び完全に保護されたワクチン接種されたマウス（ＶＡＣ−灰色）からの寄生虫血症の平均。

５００スポロゾイトのプラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）を用いた最終的な死亡（チャレンジの３週間後）における、ワクチン接種された（ＶＡＣ）、又はされていない（ＣＯ）マウスからの脾臓及び肝臓の全体的な形態学。

チャレンジの３週間後、ワクチン接種されたマウスの脾細胞からのＣＳタンパク質特異的Ｔ細胞応答。エクスビボＩＦＮ ＥＬＩＳＰＯＴは、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）でチャレンジの３週間後に回収された、ワクチン接種されたマウスからの脾細胞を用いて行なわれた。脾細胞は、ＣＤ８⁺又はＣＤ４⁺で画定されたエピトープを再提示する合成ペプチドで刺激された。データは、二つのウェルのスポット形成細胞（ｓｆｃ）の平均＋／−ＳＤとして表される。保護された群においてｎ＝５、及び未保護の群においてｎ＝３。*：未保護の群と異なる（ｐ＜０．０５）。

最適化された非統合性レンチウイルスベクターは、マラリアに対する長期の無菌保護を与える。（ａ）ワクチンスケジュール。マウスは、１００ｎｇのＶＳＶ−Ｇ Ｉｎｄｉａｎａエンベロープで偽型化されたＴＲＩＰ．ＮＩ ＣＳＰ粒子でプライムされ、８週間後に、１５００ｎｇのＶＳＶ−Ｇ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙエンベロープで偽型化されたＴＲＩＰ．ＮＩ ＣＳＰ粒子でブーストされた。５ヶ月後、それらは、ＶＳＶ−Ｇ Ｃｏｃａｌエンベロープで偽型化されたＴＲＩＰ．ＮＩ ＣＳ粒子（１５００ｎｇ）の３回目の注射を受けた。動物は、６ヶ月後、５００スポロゾイトのプラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）（１７ＸＮＬ株）でチャレンジされ、保護効率は、注射の３日目から１６日目まで１日おきに血液ステージ寄生虫血症をモニタリングすることにより評価された。（ｂ）チャレンジの１０日後の、ナイーブマウス（ＣＯ−黒色）、部分的に保護されたワクチン接種されたマウス（ＶＡＣ−淡灰色（中央））、及び完全に保護されたワクチン接種されたマウス（ＶＡＣ−灰色（右））からの寄生虫血症の平均。（ｃ）最終的な死亡（チャレンジの３週間後）におけるマウスの脾臓、骨髄、及び肝臓からのＣＳＰ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞の％の四量体分析。黒色のバーは、部分的に保護されたワクチン接種されたマウスを示し、白色のバーは、完全に保護されたワクチン接種されたマウスを示す。（ｄ）マウスの脾臓、骨髄、及び肝臓におけるＣＳＰ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＮＦ−ｇ ＥＬＩＳＰＯＴ定量。*Ｐ＜０．０５（スチューデントのｔ−テスト）。

Ｈｅｐ１７特異的Ｔ細胞応答は、非統合性レンチウイルスベクターにより誘導された。ナイーブマウス（ｎ＝５／群）は、様々な用量（１００又は６００ｎｇ）のＨｅｐ１７についてコードする非統合性レンチウイルスベクターの単回注射で腹腔内に免疫付与された、又はされなかった（−）。免疫付与後１１日目において、ＣＤ８⁺Ｔ細胞エピトープ（Ａ）、及びＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープ（Ｂ）に対するＨｅｐ１７特異的細胞性免疫応答は、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ、ＳＦＣ、スポット形成細胞により評価された。

Ｈｅｐ１７特異的Ｔ細胞応答は、統合性レンチウイルスベクターにより誘導された。ナイーブマウス（ｎ＝５／群）は、Ｈｅｐ１７についてコードする統合性レンチウイルスベクター（１ｘ１０⁷ＴＵ）の単回注射で筋肉内に免疫付与された（又はされなかった：−）。免疫付与後１１日目において、ＣＤ８⁺Ｔ細胞エピトープ（Ａ）、及びＣＤ４⁺Ｔ細胞エピトープ（Ｂ）に対するＨｅｐ１７特異的細胞性免疫応答は、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ、ＳＦＣ、スポット形成細胞により評価された。

レンチウイルス粒子で共免疫付与後、ＣＳ−及びＨｅｐ１７特異的Ｔ細胞応答は誘発した。ナイーブマウス（ｎ＝５／群）は、ＣＳ（図Ａ及びＢにおいてＣＳＰと称される）又はＨｅｐ１７（図Ｃ及びＤにおいてＨｅｐ１７と称される）についてコードする統合性レンチウイルスベクター（１ｘ１０⁷ＴＵ）の単回注射で筋肉内に免疫付与された。共免疫付与実験のために、ナイーブマウスは、一方の四頭筋にＴＲＩＰ．Ｉ ＣＳを、他方の四頭筋にＴＲＩＰ．Ｉ Ｈｅｐ１７粒子を注射された（図Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤにおいてＣＳＰ＋Ｈｅｐと称される）。免疫付与後１１日目において、ＣＳ特異的細胞性免疫応答（Ａ）及びＨｅｐ１７特異的細胞性免疫応答（Ｃ）は、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ、ＳＦＣ、スポット形成細胞により評価された。インビボ細胞傷害性アッセイについて、免疫付与されたマウスは、ＣＳペプチド（Ｃ）又はＨｅｐ１７ペプチド（Ｄ）でパルスされた標的細胞で、１１日後に注射された。特異的な死亡のパーセンテージは、材料及び方法の欄の記載に従って、１８時間後に決定された。

ＭＳＰ１₄₂についてコードする非統合性レンチウイルスベクターの単回投与は、強力で特異的な抗体反応を誘発する。Ａ．大人のマウスの群（ｎ＝５）は、ＴＲＩＰ．Ｉ ＭＳＰ１₄₂の段階的な用量で腹腔内に免疫付与された。２１日後、プール血清（１群あたり５匹のマウス）は、ＭＳＰ−１₁₉特異的抗体の存在について評価された。Ｂ．マウスは、１００ｎｇのＶＳＶ−Ｇ Ｉｎｄｉａｎａエンベロープで偽型化されたＴＲＩＰ．Ｉ ＭＳＰ１₄₂粒子でプライムされた。３ヶ月後、マウスは、１０００ｎｇのＶＳＶ−Ｇ ｃｏｃａｌエンベロープで偽型化されたＴＲＩＰ．ＮＩ ＭＳＰ１₄₂粒子でブーストされた。結果は、最後の免疫付与の３週間後、マウスの血清において検出されるＭＳＰ−１₁₉特異的抗体の平均力価である。

図１０は、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）ＣＳＰタンパク質、及びコンセンサスの配列のアライメントである。

図１１は、プラスミドｐＴＲＩＰ−デルタＵ３−ＣＭＶ−ｅＧＦＰ（配列番号３３）の制限酵素地図である。

図１２は、プラスミドｐＴＲＩＰ−ΔＵ３−ＣＭＶ−ＭＳＰ１₄₂ＣＯ−ＷＰＲＥ（ＣＮＣＭ Ｉ−４３０３又は配列番号３４）の制限酵素地図である。

図１３は、プラスミドｐＴＲＩＰ−ΔＵ３−ＣＭＶ−Ｈｅｐ１７ ＣＯ−ＷＰＲＥ（ＣＮＣＭ Ｉ−４３０４又は配列番号３７）の制限酵素地図である。

図１４は、プラスミドｐＴＲＩＰ−ΔＵ３−ＣＭＶ−Ｈｅｐ１７ ΔＳＰ ＣＯ−ＷＰＲＥ（ＣＮＣＭ Ｉ−４３０５又は配列番号４０）の制限酵素地図である。

図１５は、プラスミドｐＴＲＩＰ−ΔＵ３−ＣＭＶ−ＣＳＰ ＣＯ−ＷＰＲＥ（ＣＮＣＭ Ｉ−４３０６又は配列番号４３）の制限酵素地図である。

図１６は、プラスミドｐＴＲＩＰ−ΔＵ３−ＣＭＶ−ＣＳＰ ΔＳＰ ＣＯ−ＷＰＲＥ（ＣＮＣＭ Ｉ−４３０７又は配列番号４５）の制限酵素地図である。

図１７は、プラスミドｐＴＲＩＰ−ΔＵ３−ＣＭＶ−ＣＳＰ ΔＧＰＩ ＣＯ−ＷＰＲＥ（ＣＮＣＭ Ｉ−４３０８又は配列番号４７）の制限酵素地図である。

本発明の特定の実施形態では、プラスモディウム属寄生虫の前赤血球ステージのコードされたポリペプチドは、Ｂ−エピトープ（単数又は複数）を更に含む。

本発明によれば、レンチウイルスベクター粒子は、能力のある（即ち、統合能力のある）、又は欠損した（即ち、統合能力のない）粒子のいずれかを発現するように設計される。

表現「マラリア寄生虫」及び「プラスモディウム属寄生虫」は、本願において互換的に用いられる。それらは、特にスポロゾイト、特に接種後に血流中に存在するスポロゾイト、又は肝細胞において発達するスポロゾイト、特に肝細胞において産生されるメロゾイトを含むメロゾイトを含む（前赤血球ステージの形態、及びサイクルの赤血球ステージの形態、例えば、サイクルの赤血球細胞に含まれるメロゾイトを含む）、哺乳動物、特にヒト宿主においてサイクルの様々なステージに関連する寄生虫の全ての形態を指す。寄生虫のこれらの形態は、当該技術分野においてよく知られており、同定されている様々な特異的抗原により特徴付けられ、感染のステージを参照することにより指定され得る。

表現「Ｔ−エピトープ」及び「Ｂ−エピトープ」は、Ｔ細胞により促される適応免疫応答、及びＢ細胞により促される免疫応答のそれぞれに関与する抗原決定基を意味する。特に、前記Ｔ−エピトープ及びそれぞれのＢ−エピトープは、好適な条件下で宿主に送達される場合、Ｔ細胞、それぞれのＢ細胞免疫応答を誘発する。

本発明において定義されるレンチウイルスベクター粒子（又はレンチウイルスベクター、若しくはレンチウイルスに基づくベクター粒子）は、特定のレンチウイルス、特にＨＩＶ、特にＨＩＶ−１と異なるウイルスに由来するエンベロープタンパク質（単数）又はエンベロープタンパク質（複数）を有するベクター粒子からなる、偽型化されたレンチウイルスベクターであり、それはレンチウイルスベクター粒子のベクターゲノムを提供する。従って、前記エンベロープタンパク質（単数）又はエンベロープタンパク質（複数）は、粒子のベクターゲノムに関して、「異種の」エンベロープタンパク質（単数）又はエンベロープタンパク質（複数）である。以下の頁では、「エンベロープタンパク質（単数又は複数）」はまた、本発明を実行するのに好適な任意の種類のエンベロープタンパク質（単数）又はエンベロープタンパク質（複数）を含むことを言及する。

本願において、特定の実施形態では、「レンチウイルス」ベクター（レンチウイルスに基づくベクター）は、ＨＩＶに基づくベクター、及び特にＨＩＶ−１に基づくベクターを含むことを言及する。

本発明によるレンチウイルスベクターは、置換のベクターであり、それは、生物学的に活性なレンチウイルスタンパク質の発現を防ぐために、特にＨＩＶの場合、機能性ＥＮＶ、ＧＡＧ、及びＰＯＬタンパク質、並びに任意でレンチウイルス、特にＨＩＶの更なる機能性及び／又はアクセサリー及び／又は制御タンパク質の前記輸送ベクターによる発現を防ぐために、レンチウイルスタンパク質をコードする元のレンチウイルスの配列が、ベクターのゲノムにおいて本質的に欠失している、又は存在する場合に改変され、特に変異誘発され、特に切断されていることを意味する。

ベクター粒子の「ベクターゲノム」は、マラリア寄生虫のポリペプチド（単数又は複数）をコードする対象のポリヌクレオチド又は導入遺伝子を含む組み換えベクターである。ベクターゲノムのレンチウイルスに基づく配列及びポリヌクレオチド／導入遺伝子は、プラスミドベクターにより産み出され、従って、「配列ベクター」としても称される「トランスファーベクター」を生じる。従って、これらの発現は、本願において互換的に用いられる。

本明細書で定義されるベクターゲノムは、従って、その発現のための適切な制御配列の制御下に置かれるいわゆる組み換えポリヌクレオチドとは別に、前記ゲノムの非コーディング領域であり、ＤＮＡ又はＲＮＡ合成及びプロセッシングのための認識シグナルを提供するために必要な元のレンチウイルスゲノムの配列（ミニウイルスゲノム）を含む。これらの配列は、パッケージング、逆転写及び転写のために、その上本発明の特定の目的のために必要であるシス作用配列であり、それらは、細胞における核内輸送、及び従って前記細胞における導入遺伝子輸送効率を助ける機能性配列を含み、そのエレメントは、ＤＮＡ Ｆｌａｐエレメントとして記載され、レンチウイルスゲノム配列、又はいくつかのレトロエレメント、例えば酵母のそれに存在するいわゆるセントラルｃＰＰＴ−ＣＴＳヌクレオチドドメインを含む、又はからなる。

本発明のレンチウイルスベクターを調製するために用いられるベクターゲノムの構造及び組成は、当該技術分野において記載される原理、及び（Ｚｅｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ，２０００；Ｆｉｒａｔ Ｈ．ｅｔ ａｌ，２００２；ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ Ｔ．ｅｔ ａｌ）に最初に開示された斯かるレンチウイルスベクターの実施例に基づく。この種類の構築物は、本明細書に言及されるように、ＣＮＣＭ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ，Ｆｒａｎｃｅ）において寄託されている。この点において、参照はまた、特許出願である、国際公開第９９／５５８９２号、国際公開第０１／２７３００号、及び国際公開第０１／２７３０４号における、寄託された生物材料を含む開示に対してなされる。

本発明の特定の実施形態によれば、ベクターゲノムは、２つの長い末端反復（ＬＴＲ）間の全てのウイルスタンパク質コーディング配列が、マラリア寄生虫のポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドで置き換えられた置換ベクターでもよく、ここでＤＮＡ−Ｆｌａｐエレメントは、本明細書に記載される要求されるシス作用配列に最挿入される。ベクターゲノムの組成に関する更なる特徴は、粒子の調製に関して開示される。

本発明のレンチウイルスベクター粒子は、そのゲノム中に、本明細書に開示されるような、前赤血球ステージ抗原のエピトープ（単数又は複数）を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする１超の組み換えポリヌクレオチドを含んでもよい。特に、前記ベクターゲノムは、ゲノム上に連続、又は分離しており、プラスモディウム属寄生虫の前赤血球ステージの同一若しくは異なる抗原のいずれかの異なるポリペプチド、又はマラリア寄生虫の異なる形態の異なる抗原の異なるポリペプチド、特に、寄生虫の前赤血球ステージの及び赤血球ステージの抗原をコードする、二つのポリヌクレオチドを含む。

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、二つの組み換えポリヌクレオチドを含み、それらのそれぞれは、異なるポリペプチド、及び同一のステージの異なる抗原由来の各ポリペプチドをコードする。

表現「抗原のエピトープ（単数又は複数）を有するポリペプチド」は、本発明によれば、プラスモディウム属寄生虫の天然の抗原、それらの変異誘発型、及び特に斯かる天然の抗原のフラグメント、及び特に、斯かる天然の抗原の切断型でもよいポリペプチドを意図する。ポリペプチドは、１又はいくつかのエピトープ（単数又は複数）を提供するのに十分なアミノ酸配列を有し、従って、立体配座のＢエピトープについて、少なくとも約４アミノ酸残基長、特に約４〜約８アミノ酸残基長、又は連続的なＴエピトープについて、少なくとも約９アミノ酸残基、特に約９〜約１９アミノ酸残基を有する。

本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子の組み換えポリヌクレオチドは、前記ドメインが、宿主における免疫応答の誘発に対して有用でない、又は有害である場合、マラリア寄生虫の抗原の切断型、特に完全長の（即ち、天然の）抗原の機能性ドメインの欠失をもたらすフラグメントをコードする。

本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子は、それらのゲノム中に、プラスモディウム属寄生虫、特にプラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、又はプラスモディウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモディウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、プラスモディウム・オバール（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）、又はプラスモディウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）のサーカムスポロゾイトタンパク質からの抗原のポリペプチド（単数又は複数）をコードする少なくとも１つの組み換えポリヌクレオチドを含む。それは、特にＣＳＰの切断型、及び特に、ＣＳＰのＧＰＩアンカーリングモチーフを欠失しているポリペプチドである。

本発明の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子は、場合によりＣＳＰの抗原のポリペプチドに加えて、それらのゲノム中に、スポロゾイト表面タンパク質２（ＴＲＡＰ／ＳＳＰ２）、肝臓ステージ抗原（ＬＳＡ、特にＬＳＡ３）、Ｐｆエクスポーティッドタンパク質１（Ｐｆ Ｅｘｐ１）／Ｐｙ肝細胞赤血球タンパク質（ＰｙＨＥＰ１７）、並びにＰｆ抗原２（ここで、Ｐｆは、プラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を表し、Ｐｙは、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｍｓｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）を表す）、スポロゾイト及び肝臓ステージ抗原（ＳＡＬＳＡ）、スポロゾイトスレオニン及びアスパラギンリッチ（ＳＴＡＲＰ）、又は他の前赤血球抗原の群から選択される抗原のポリペプチド（単数又は複数）をコードする組み換えポリヌクレオチドを含む。

本発明の特定の実施形態では、マラリア寄生虫の抗原のポリペプチドは、ＣＳＰタンパク質のフラグメントであり、それは、ベクターゲノムにより、前赤血球ステージからの抗原又は赤血球ステージの抗原のいずれかである、マラリア寄生虫の別の抗原のポリペプチドと共発現される。本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを設計するために用いられ得る赤血球ステージの抗原は、メロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ２）、特にメロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ−１）、メロゾイト表面タンパク質２（ＭＳＰ−２）、メロゾイト表面タンパク質３（ＭＳＰ−３）、メロゾイト表面タンパク質４（ＭＳＰ−４）、メロゾイト表面タンパク質６（ＭＳＰ−６）、リング−感染赤血球表面抗原（ＲＥＳＡ）、桿小体関連タンパク質１（ＲＡＰ−１）、頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）、赤血球結合抗原（ＥＢＡ−１７５）、赤血球膜結合巨大タンパク質又は抗原３３２（Ａｇ３３２）、ｄｎａＫ型分子シャペロン、グルタミン酸リッチタンパク質（ＧＬＵＲＰ）、特にＭＳＰ３−ＧＬＵＲＰ融合タンパク質（国際公開第２００４／０４３４８８号；ｒｅｆ２８）、赤血球膜タンパク質１（ＥＭＰ−１）、セリンリピート抗原（ＳＥＲＡ）、クラスター化したアスパラギンリッチタンパク質（ＣＡＲＰ）、サーカムスポロゾイトタンパク質関連抗原前駆体（ＣＲＡ）、細胞接着結合無性タンパク質（ＣＬＡＧ）、酸塩基リピート抗原（ＡＢＲＡ）又は１０１ｋＤａマラリア抗原、桿小体抗原タンパク質（ＲＡＰ−２）、Ｋｎｏｂ結合ヒスチジンリッチタンパク質（ＫＨＲＰ）、桿小体抗原タンパク質（ＲＡＰ）、システインプロテアーゼ、仮定的なタンパク質ＰＦＥ１３２５ｗ、保護抗原（ＭＡｇ−１）、フルクトース２リン酸アルドラーゼ、リボソームリンタンパク質Ｐ０、Ｐ型ＡＴＰａｓｅ、グルコース制御タンパク質（ＧＲＰ７８）、アスパラギン及びアスパラギン酸リッチタンパク質（ＡＡＲＰ１）、散在リピート抗原又はＰＦＥ００７０ｗである。

本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを設計するために用いられ得る有性ステージの抗原は、有性ステージ及びスポロゾイト表面抗原、抗原Ｐｆｇ２７／２５、抗原ＱＦ１２２、１１−１ポリペプチド、生殖母体特異的表面タンパク質（Ｐｆｓ２３０）、オーキネート表面タンパク質（Ｐ２５）、キチナーゼ、多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）である。

これらの抗原は、Ｐ．ファルシパルム（Ｐ．Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）を参照することにより開示され、他のプラスモディウム属種において同等のものを有し得る。それらは、Ｖａｕｇｈａｎ Ｋ．ｅｔ ａｌ（１８）に報告される。

Ｖａｕｇｈａｎ Ｋらは、特に、本発明のベクターに用いられる組み換えポリヌクレオチド（単数又は複数）を調製するために、基礎として当業者により用いられ得る前記抗原のエピトープを開示する。

プラスモディウム属寄生虫の前述の抗原は、先行技術に開示され。入手可能なデータベースであるそれらの配列を通して含まれる。

サーカムスポロゾイトタンパク質（ＣＳＰ）は、本発明のレンチウイルスベクター粒子の調製のための好ましい抗原の一つである。それは、保護抗体の標的として、従来認識されていたスポロゾイトコートタンパク質を構成する。抗ＣＳ抗体を誘発するその能力とは別に、この抗原は、特にＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ及びＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープを含む、Ｔ−エピトープを更に含む。特定のＣＳＰ抗原は、これらの配列の一致について、配列番号２０、２３、２６、２７、２８、２９、３０、３１、又は配列番号３２として、それらのアミノ酸配列を通じて開示される。Ｐ．ビバックス（Ｐ．ｖｉｖａｘ）の配列は、ＡＹ６７４０５０．１としてＧｅｎＢａｎｋに与えられる。

本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子は、それらのゲノム中に、実施例に例証されるようにプラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）の、又は有利にプラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＣＳＰ−抗原の少なくとも１つのポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを有し、例えば、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）中のＧＰＩ−アンカーリングモチーフを欠失している前記ＣＳＰ−抗原のフラグメントに対応するポリペプチドは、配列番号２１の配列を有するＣＳＰ ＤＧＰＩである。前記ＧＰＩモチーフは、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）のＣＳＰ抗原の天然のアミノ酸配列中のＣ−末端部分の最後の１２アミノ酸残基に対応する。Ｐ．ファルシパルム（Ｐ．Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）におけるＣＳＰタンパク質の前記フラグメントの同等物は、図及び配列に開示され（天然のタンパク質について配列番号２３、ＧＰＩモチーフの欠失した配列について配列番号２４、Ｎ末端の切断された配列について配列番号２５）、マラリアに対する保護免疫応答、及び無菌保護さえ誘発するポリペプチドの能力の、好適なネズミモデルにおける証拠を提供するために用いられる。

本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子のポリヌクレオチド（単数又は複数）は、哺乳動物コドン最適化（ＣＯ）ヌクレオチド配列を有し、任意で前記粒子のゲノムのレンチウイルス配列は、哺乳動物コドン最適化ヌクレオチド配列を有する。

特に、哺乳動物、特にヒト細胞において、発現について最適化された場合、コドン最適化ヌクレオチド配列は、斯かる哺乳動物又はヒト細胞において粒子の高い収率の産生を可能にすることが、観察されている。産生細胞は、実施例に例証される。従って、本発明のレンチウイルスベクター粒子が哺乳動物、特にヒト宿主に投与される場合、粒子の高い量は、強力な免疫応答の誘発を助ける前記宿主において産生される。

本発明の特定の実施形態では、本明細書で開示されるレンチウイルスベクター粒子は、それらのゲノム中に、上記で開示されるような寄生虫のサイクルの血液ステージの抗原、及び／又は有性ステージの抗原のポリペプチドをコードする組み換えポリヌクレオチドを更に含む。

ポリペプチドは、天然の抗原、又はそれらの修飾型、特に、Ｔ細胞エピトープ（単数又は複数）若しくはＢ−細胞エピトープ（単数又は複数）、又は双方を含む、又はからなるフラグメントである。

本発明のレンチウイルスベクター粒子の投与の結果として表現されるポリペプチドの例は、本明細書の下記で開示されるベクタープラスミド（又は配列ベクター）によりコードされるポリペプチドである。

本発明はまた、２０１０年４月２０日にＣＮＣＭ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）において寄託され、以下の特徴及び登録番号を有するこれらのベクタープラスミドに特に関する。

これらのプラスミドは、本願の図及び配列に記載される。それらが含む導入遺伝子の配列は、Ｐ．ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）由来である。前記導入遺伝子は、Ｐ．ファルシパルム（Ｐ．Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）由来の適切な配列により、有利に置き換えられてもよい。

本発明はまた、プラスモディウム属抗原のポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドが、それらの機能性免疫原性変異体をコードするために改変され、又は別のプラスモディウム属株、特にプラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）からの最適化されたポリヌクレオチドコドンに対応することにより置換される、又はＣＭＶプロモーターを本明細書に記載のプロモーターの一つにより置換するために改変される場合、これらのプラスミドの変異体に関する。

寄託されるプラスミドでは、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐａｌｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）抗原のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、最適化されたコドンである。

本発明によれば、レンチウイルスベクター粒子は、異種のウイルスエンベロープタンパク質、又はレンチウイルス粒子のゲノムのレンチウイルス配列を提供するレンチウイルスではない、ＲＮＡウイルスに由来するエンベロープのウイルスポリタンパク質で偽型化される。

レンチウイルスベクター粒子の調製のためのエンベロープタンパク質を分類する例として、本発明は、例えば、Ｉｎｄｉａｎａ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、Ｃｏｃａｌ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、Ｉｓｆａｈａｎ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、Ｐｙｒｉ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、又はＳＶＣＶ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）の群から選択される水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）のウイルス膜貫通型糖化（いわゆるＧタンパク質）エンベロープタンパク質（単数又は複数）に関する。

水疱性口内炎ウイルスのエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）は、野生型粒子の表面コートとして機能する膜貫通型タンパク質である。それはまた、操作されたレンチウイルスベクターに好適なコートタンパク質である。現在、９つのウイルス種は、ＶＳＶジェンダー（ｇｅｎｄｅｒ）に最終的に分類され、１９のラブドウイルスは、暫定的にこのジェンダーに分類され、全ては交差中和の様々な程度を示す。配列決定される場合、タンパク質Ｇ遺伝子は、配列相同性を示す。ＶＳＶ−Ｇタンパク質は、Ｎ末端エクトドメイン、膜貫通領域、及びＣ末端細胞質尾部を提示する。それは、トランスゴルジネットワーク（小胞体及びゴルジ装置）を介して細胞表面に輸送される。

水疱性口内炎Ｉｎｄｉａｎａウイルス（ＶＳＩＶ）及び水疱性口内炎Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙウイルス（ＶＳＮＪＶ）は、本発明のレンチウイルスベクターを偽型化するため、又はレンチウイルスベクターを偽型化するための組み換えエンベロープタンパク質（単数又は複数）を設計するための好ましい株である。それらのＶＳＶ−Ｇタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋに開示され、いくつかの株が存在している。ＶＳＶ−Ｇ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株について、参照は、登録番号Ｖ０１２１４を有する配列に対して特になされる。Ｉｎｄｉａｎａ株のＶＳＶ−Ｇについて、参照は、株ＪＯ２４２８に対応して、Ｇｅｎｂａｎｋにおいて、登録番号ＡＡＡ４８３７０．１を有する配列に対してなされる。

あるいは、ＶＳＶの中でも、チャンディプラウイルス（ＣＨＰＶ）、球菌ウイルス（ＣＯＣＶ）、ペリネウイルス（ＰＥＲＶ）、ピリウイルス（ＰＩＲＹＶ）、ＳＶＣＶ、又はイスファハンウイルスは、エンベロープタンパク質の偽型化を設計するための、及び特に免疫付与のブーストするステップに用いられる粒子を調製するための優れた候補となり得、従って、本発明のベクター粒子がプライム・ブースト接種法に用いられる場合、第二のエンベロープタンパク質（単数又は複数）、若しくは第三のエンベロープタンパク質（単数又は複数）、又は更なるエンベロープタンパク質（単数又は複数）を提供する。従って用いられる場合、球菌ウイルスエンベロープタンパク質（単数又は複数）は、プライム・ブースト接種法の後期又は最後の投与に好ましい。しかしながら、チャンディプラウイルス（ＣＨＰＶ）及びピリウイルス（ＰＩＲＹＶ）は、異なるエンベロープで調製される粒子で得られるベクター力価を比較する場合、それらの受容体についてのそれらの低い親和性の結果として、低い融合性を有するエンベロープタンパクを提供し得る。それ故、第一のアプローチでは、これらのエンベロープは、効率的な形質導入能力を有する粒子を調製するためのエンベロープの選択から排除されてもよい。

本明細書で言及されるＶＳＶ−Ｇタンパク質のアミノ酸配列及びコーディング配列は、特許出願、国際公開第２００９／０１９６１２号に開示される。これらのアミノ酸配列の特定の例はまた、配列番号７７、７９、８２、８４、８６、８８、９０として本願に提供される。ＶＳＶ−Ｇエンコーディング配列を含むプラスミドは、前記出願、国際公開第２００９／０１９６１２号に開示され、それは参照により援用される。プラスミドは、ＣＮＣＭ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）に寄託されている。前記エンベロープタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７６、７８、８１、８３、８５、８７、８９として本願に提供される。

本発明の特定の実施形態では、前記第一及び第二、及びもしあるのであれば、前記第三、又は更なるウイルスエンベロープタンパク質（単数又は複数）は、融合及び／又はエンドサイトーシスにより、抗原提示細胞、及び特に肝臓樹状細胞を含む樹状細胞により摂取され得る。特定の実施形態では、摂取の効率は、偽型化のためのＶＳＶのエンベロープを選択するための特徴として用いられてもよい。この点において、形質導入の相対的な力価（ＤＣの力価／他の形質導入された細胞、例えば２９３Ｔ細胞の力価）は、試験として考えられてもよく、ＤＣと融合する相対的に優れた能力を有するエンベロープは好ましい。形質導入の相対的な力価は、実施例に例証される。

抗原提示細胞（ＡＰＣ）、特に樹状細胞（ＤＣ）は、適宜免疫組成物として用いられる、偽型化されたレンチウイルスベクターの適切な標的細胞である。

ＶＳＶエンベロープタンパク質（単数又は複数）（ＶＳＶ−Ｇ）をコードするポリヌクレオチドはまた、脾細胞、特に抗原提示細胞（ＡＰＣ）又は樹状細胞（ＤＣ）、又は肝臓樹状細胞、肝細胞若しくは非実質細胞を含む肝臓細胞を標的とする。

特定のウイルスにおいて表面タンパク質としてしばしば指名されるエンベロープタンパク質（単数又は複数）は、異なる生物、特にＲＮＡウイルス株に「由来する」と称され、前記タンパク質（単数又は複数）において、決定されたＲＮＡウイルスにおいて発現される対応するタンパク質（単数又は複数）の本質的な特徴は、維持されることを意味する。前記の本質的な特徴は、タンパク質の構造又は機能に関連し、それは前記ベクターを偽型化するために、ベクター粒子の表面において、得られるタンパク質（単数又は複数）が発現されることを可能にするものである。エンベロープタンパク質は、従って、ベクター粒子上に存在する場合、宿主の標的細胞において認識され、内在化され得る。

特定の実施形態では、化合物のキットの偽型化されたレンチウイルスベクターの設計における使用に好適なタンパク質（単数又は複数）又は糖タンパク質（単数又は複数）は、多量体のタンパク質として用いられる（例えば三量体であるＶＳＶ−Ｇタンパク質）。

エンベロープタンパク質（単数又は複数）は、前記タンパク質（単数又は複数）についてのコーディング配列を含むポリヌクレオチドから発現され、そのポリヌクレオチドは、本発明のレンチウイルスベクター粒子の調製に用いられるプラスミド（設計されたエンベロープ発現プラスミド、又は偽型化ｅｎｖプラスミド）に挿入される。エンベロープタンパク質（単数又は複数）をコードするポリヌクレオチドは、コーディング配列の転写及び／又は発現のための制御配列（任意で、転写後制御エレメント（ＰＲＥ）、特にポリヌクレオチド、例えばウッドチャック肝炎ウイルスのエレメント、即ちＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られるＷＰＲＥ配列を含む）の制御下にある。

従って、インビボで哺乳動物細胞、特にヒト細胞における使用に好適な内在的プロモーター、及び前記プロモーターの制御下でエンベロープタンパク質をコードする核酸を含む、核酸構築物は提供される。この構築物を含むプラスミドは、粒子の調製に好適な細胞のトランスフェクション又は形質導入に用いられる。プロモーターは、特に、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、又は誘導可能なプロモーターとしてそれらの特性について選択されてもよい。好適なプロモーターの例は、以下の遺伝子：ＥＦ１α、ヒトＰＧＫ、ＰＰＩ（プレプロインスリン）、チオデキストリン、ＨＬＡ ＤＲ不変鎖（Ｐ３３）、ＨＬＡ ＤＲ アルファ鎖、フェリチンＬ鎖又はフェリチンＨ鎖、キモシンベータ４、キモシンベータ１０、システインリボソームタンパク質Ｌ４１、ＣＭＶｉｅ又はキメラプロモーター、例えばＪｏｎｅｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ（１９）に開示されるＧＡＧ（ＣＭＶ早期エンハンサー／チキンβアクチン）のプロモーターを含む。

これらのプロモーターはまた、キャプシド形成プラスミド由来のｇａｇ−ｐｏｌタンパク質の発現に関与する制御発現配列に用いられてもよい。

あるいは、エンベロープ発現プラスミドが好適なパッケージング細胞株における発現、特に、連続的に発現されるウイルス粒子としての安定的な発現を対象とする場合、エンベロープタンパク質（単数又は複数）を発現するための内在的プロモーターは、有利に、誘導可能プロモーター、例えばＣｏｃｋｒｅｌｌ Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．（２０）に開示されるものである。斯かるプロモーターの例として、参照は、テトラサイクリン及びエクジソン誘導可能プロモーターに対してなされる。パッケージング細胞株は、ＳＴＡＲパッケージング細胞株（ｒｅｆ２０、２１）又はＳＯＤｋパッケージング細胞株、例えばＳＯＤｋ１及びＳＯＤｋ３を含むＳＯＤｋ０由来細胞株（ｒｅｆ２０、２２、２３、２４）でもよい。

レンチウイルスベクター粒子を偽型化するために要求されるエンベロープタンパク質（単数又は複数）の発現のために用いられるヌクレオチド配列は、代替的に改変されてもよく、従って、参照として用いられる天然のエンベロープタンパク質（単数又は複数）をコードする核酸に関する変異体を提供する。改変は、ベクター粒子の調製のための細胞、及び／又は宿主の形質導入された細胞において、コドン頻度を改良するために実行される（コドン最適化）。それは、天然のタンパク質（単数又は複数）と異なるタンパク質、特に改良された偽型化能力、産生のレベルにおいて改良された能力、又は化合物のキットに用いられるエンベロープタンパク質（単数又は複数）との（交差反応性タンパク質としても称される）血清中和の予防に関して改良された能力を有するものを発現するために改変されてもよい。

エンベロープタンパク質（単数又は複数）をコードするポリヌクレオチドの斯かる改変、又は（天然のエンベロープの変異体を生成するための）エンベロープタンパク質（単数又は複数）の改変は、おそらく、偽ウイルスに関連してエンベロープタンパク質（単数又は複数）の密度を改良することにより、細胞宿主におけるそれらの産生のレベル、又はベクター粒子を偽型化するそれらの能力に影響を与え、特に改良し得る。前記改変は、前記タンパク質（単数又は複数）のアミノ酸配列における変異、例えば、１若しくはいくつかのヌクレオチド若しくはヌクレオチドフラグメントの付加、欠失又は置換に由来し得る、又は翻訳後修飾、特に前記エンベロープタンパク質（単数又は複数）の糖化状態に関連し得る。

本発明のレンチウイルスベクターを偽型化するために用いられるエンベロープタンパク質（単数又は複数）は、実際には、特に糖タンパク質である。

水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）を用いてウイルスベクターを偽型化することが、異なる種からの広い範囲の細胞種類の形質導入を可能にすることは、既に示されている。このＶＳＶ−Ｇ糖タンパク質は、その広い向性に加えて、ベクター偽型化に用いられる場合、興味深い安定性を有する。それ故、ＶＳＶ−Ｇは、他の偽型の効率を評価するための標準として用いられている（Ｃｒｏｎｉｎ Ｊ．ｅｔ ａｌ，２００５）。

本発明によれば、レンチウイルスベクター粒子は、以下：
・（ｉ）パッケージング、逆転写、及び転写に必要なレンチウイルス、特にＨＩＶ−１のシス作用配列を含み、更に機能性のレンチウイルス、特にＨＩＶ−１由来のＤＮＡ ｆｌａｐエレメント、及び（ｉｉ）制御発現配列の制御下で、本明細書に開示されるマラリア寄生虫の抗原のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、任意で統合のための配列を含む、ベクタープラスミド；
・ＲＮＡウイルス由来の偽型化エンベロープをコードする発現プラスミド、ここで前記発現プラスミドは、偽型化のためのエンベロープタンパク質（単数）又はタンパク質（複数）をコードするポリヌクレオチドを含み、前記エンベロープ偽型化タンパク質は、有利にＶＳＶ由来であり、特にＶＳＶ−Ｇ若しくはそれらの変異体由来である；及び
・レンチウイルス、特にＨＩＶ−１の、統合能力のあるベクター粒子の産生に好適なｇａｇ−ｐｏｌパッケージング配列、又は統合欠損ベクター粒子の産生に好適な改変されたｇａｇ−ｐｏｌパッケージング配列のいずれかを含む、キャプシド形成プラスミド、
を用いた、哺乳動物細胞の共トランスフェクションから回収される生成物である。

本発明はまた、従って、上述のレンチウイルスベクター粒子に関し、それは、以下：
・（ｉ）パッケージング、逆転写、及び転写に必要なレンチウイルス、特にＨＩＶ−１のシス作用配列を含み、機能性のレンチウイルス、特にＨＩＶ−１のＤＮＡ ｆｌａｐエレメントを更に含み、任意で統合に必要なシス作用配列を含むベクタープラスミド、ここで前記ベクタープラスミドは更に、（ｉｉ）制御発現配列、特にプロモーターの制御下で、プラスモディウム属寄生虫のｃｓ遺伝子の切断された、哺乳動物、特にヒトコドン最適化配列のポリヌクレオチドを含む；
・ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質（単数）又はエンベロープタンパク質（複数）をコードするポリヌクレオチドを含むＶＳＶ−Ｇエンベロープ発現プラスミド、ここで前記ポリヌクレオチドは、制御発現配列、特に誘導可能プロモーターを含む制御発現配列の制御下にある；及び
・キャプシド形成プラスミドがレンチウイルス、特にＨＩＶ−１の統合能力のあるベクター粒子の産生に好適なｇａｇ−ｐｏｌコーディング配列、又は統合欠損ベクター粒子の産生に好適な改変されたｇａｇ−ｐｏｌコーディング配列のいずれかを含み、前記ｇａｇ−ｐｏｌ配列がＤＮＡ ｆｌａｐエレメントとして同一のレンチウイルスサブファミリー由来であり、前記レンチウイルスｇａｇ−ｐｏｌ若しくは改変されたｇａｇ−ｐｏｌ配列が制御発現配列の制御下にある、キャプシド形成プラスミド；
を用いた安定的な細胞株から回収された生成物である。

本発明のベクター粒子を発現する安定的な細胞株は、特に、プラスミドの形質導入により得られる。

ポリヌクレオチドは、本願に開示される任意の実施形態によるマラリア抗原の少なくとも１つのポリペプチドをコードする。特に、それは、プラスモディウム属寄生虫、特にプラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のｃｓ遺伝子の切断された哺乳動物、特にヒトコドン最適化配列であるポリペプチドをコードする。

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、マラリア寄生虫の異なる抗原の別のポリペプチドをコードし、それは、様々な実施形態に開示されるように前記寄生虫の異なる抗原に起源する及び／又は由来する２又はそれ以上のポリペプチドをコードする。従って、ベクタープラスミドは、様々なポリペプチドの発現のためのいくつかの発現カセットを含んでもよく、又は様々なポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがウイルス起源のＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列により分離されている、ビシストロン若しくはマルチシストロンの発現カセットを含んでもよく、それは融合タンパク質（単数又は複数）をコードしてもよい。

ベクターゲノムに含まれ、（導入遺伝子として、又は発現カセットにおいて）マラリア寄生虫の抗原のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を制御する、内在プロモーターは、以下の遺伝子：ＥＦ１α、ヒトＰＧＫ、ＰＰＩ（プレプロインスリン）、チオデキストリン、ＨＬＡ ＤＲ不変鎖（Ｐ３３）、ＨＬＡ ＤＲ アルファ鎖、フェリチンＬ鎖又はフェリチンＨ鎖、キモシンベータ４、キモシンベータ１０、又はシステインリボソームタンパク質Ｌ４１、ＣＭＶｉｅ又はキメラプロモーター、例えばＪｏｎｅｓ Ｓ．ｅｔ ａｌ（１９）に開示されるＧＡＧ（ＣＭＶ早期エンハンサー／チキンβアクチン）のプロモーターから選択されてもよい。

上述の内在プロモーターの中のプロモーターは、エンベロープタンパク質（単数又は複数）及びパッケージング（ｇａｇ−ｐｏｌ由来）タンパク質の発現について選択されてもよい。

あるいは、ベクター粒子は、従ってベクター粒子を連続的に分泌し得る安定的なパッケージング細胞株において、本明細書で開示されるプラスミドの共トランスフェクションから産生され得る。エンベロープタンパク質（単数又は複数）の発現に関与する制御発現配列に用いられるプロモーターは、有利な誘導可能プロモーターである。

以下の特定の実施形態は、ヒトレンチウイルスに基づく、及び特にＨＩＶウイルスに基づくレンチウイルスベクター粒子を調製する場合に、実行されてもよい。

本発明によれば、レンチウイルスベクター粒子のゲノムは、ヒトレンチウイルス、特にＨＩＶレンチウイルスに由来する。特に、偽型化されたレンチウイルスベクターは、ＨＩＶに基づくベクター、例えばＨＩＶ−１、又はＨＩＶ−２に基づくベクターであり、特にＨＩＶ−１Ｍ、例えばＢＲＵ又はＬＡＩ単離物に由来する。あるいは、ベクターゲノムのために必要な配列を提供するレンチウイルスベクターは、レンチウイルス、例えば、ヒト細胞をトランスフェクトし得るＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ、ＶＩＳＮＡ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＳＩＶ、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−Ｏに由来してもよい。

上述のように、それが最終的に含む組み換えポリヌクレオチドと別に考慮される場合、ベクターゲノムは、元のレンチウイルスゲノム中の２つの長い末端反復（ＬＴＲ）間の核酸が、導入遺伝子の宿主中の細胞の核に効率的に送達するためにするために含む、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ合成及びプロセッシングのためのシス作用配列に限定されている、又は生物学的に機能的なＧＡＧポリタンパク質、並びに場合によりＰＯＬ及びＥＮＶタンパク質を含むレンチウイルス構造タンパク質の発現を可能にする必須の核酸部分について、少なくとも欠失若しくは変異誘発されている、代替ベクターである。

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、生物学的に機能的なＧＡＧ、並びに有利に、生物学的に機能的なＰＯＬ及びＥＮＶタンパク質の発現について欠損している。従って、ベクターゲノムは、これらのタンパク質をコードする配列を欠損している。

特定の実施形態では、レンチウイルスの５’ＬＴＲ及び３’ＬＴＲ配列は、ベクターゲノムに用いられるが、少なくとも３’−ＬＴＲは、例えばエンハンサーについて、欠失、若しくは部分的に欠失し得る少なくともＵ３領域において、元のレンチウイルスの３’ＬＴＲに関して改変される。５’ＬＴＲはまた、特に、例えばＴａｔ−独立プロモーターがＵ３内部のプロモーターと置換され得る場合、そのプロモーター領域において、改変されてもよい。

特定の実施形態では、ベクターゲノムは、（ＨＩＶ−１レンチウイルスベクターのための）Ｖｉｆ−、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ−及びＮｅｆ−アクセサリー遺伝子について、１又はいくつかのコーディング配列を含む。あるいは、これらの配列は、互いに独立して欠失し得、又は非機能的であり得る。

レンチウイルスベクター粒子のベクターゲノムは、挿入されるシス−作用フラグメントとして、ＤＮＡ ｆｌａｐエレメントに存在する、又は斯かるＤＮＡ ｆｌａｐエレメントを含む、少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、ＤＮＡ ｆｌａｐは、マラリア抗原のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの上流に挿入され、必ずではないが、有利に、ベクターゲノムのほぼ中央の位置に位置する。本発明に好適なＤＮＡ ｆｌａｐは、レトロウイルス、特にレンチウイルス、特にヒトレンチウイルス、特にＨＩＶ−１レトロウイルス、又はレトロウイルス様有機体、例えばレトロトランスポゾンから得られてもよい。それは、代替的に、ＣＡＥＶ（ヤギ関節炎脳炎ウイルス）ウイルス、ＥＩＡＶ（ウマ伝染性貧血ウイルス）ウイルス、ＶＩＳＮＡウイルス、ＳＩＶ（サル免疫不全ウイルス）ウイルス、又はＦＩＶ（ネコ免疫不全ウイルス）ウイルスから得られてもよい。ＤＮＡ ｆｌａｐは、合成的に（化学合成）、又は上述の適切な起源からのＤＮＡ ｆｌａｐを提供するＤＮＡの増幅により、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により調製されてもよい。より好ましい実施形態では、ＤＮＡ ｆｌａｐは、ＨＩＶレトロウイルス、例えば２つの種類の任意の単離物を含むＨＩＶ−１又はＨＩＶ−２ウイルスから得られる。

ＤＮＡ ｆｌａｐ（Ｚｅｎｎｏｕ Ｖ．ｅｔ ａｌ．ｒｅｆ２７，２０００，Ｃｅｌｌ ｖｏｌ １０１，１７３−１８５に、又は国際公開第９９／５５８９２号、及び国際公開第０１／２７３０４号に定義される）は、それが特にＨＩＶ逆転写の間に通常合成される３重鎖ＤＮＡ構造を生じる場合、いくつかのレンチウイルス、特にＨＩＶのゲノムの中央にあり、ＨＩＶゲノム核内輸送のシス決定因子として作用する構造である。ＤＮＡ ｆｌａｐは、逆転写の間、セントラルポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）及びセントラル末端配列（ＣＴＳ）により、シスで制御される中央鎖置き換えイベントを可能にする。レンチウイルス由来ベクターに挿入される場合、逆転写の間、ＤＮＡ ｆｌａｐを産生することを可能にするポリヌクレオチドは、遺伝子輸送効率を刺激し、野生型レベルまで核内輸送レベルを補う（Ｚｅｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０００）。

ＤＮＡ ｆｌａｐの配列は、先行技術、特に上述の特許出願に開示されている。これらの配列はまた、配列番号６９〜配列番号７５として開示される。それらは、好ましくは前記ベクターゲノムの中央近くの位置において、ベクターゲノム中に、任意で更なるフランキング配列と共に、好ましくは、フラグメントとして挿入される。或いは、それらは、本発明のポリヌクレオチド（単数又は複数）の発現を制御するプロモーターからすぐ上流に挿入されてもよい。ベクターゲノムに挿入された、ＤＮＡ ｆｌａｐを含む前記フラグメントは、その起源及び調製に依存して、約８０〜約２００ｂｐの配列を有してもよい。

特定の実施形態によれば、ＤＮＡ ｆｌａｐは、約９０〜約１４０ヌクレオチドのヌクレオチド配列を有する。

ＨＩＶ−１では、ＤＮＡ ｆｌａｐは、安定的な９９ヌクレオチド長のプラス鎖オーバーラップである。本発明のレンチウイルスベクターのゲノムベクターに用いられる場合、それは、特にそれがＰＣＲフラグメントとして調製される場合、長い配列として挿入されてもよい。ＤＮＡ ｆｌａｐを提供する構造を含む特定の適切なポリヌクレオチドは、ＨＩＶ−１ ＤＮＡのｃＰＰＴ及びＣＴＳ領域を含む１７８塩基対のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）フラグメントである（Ｚｅｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ ２０００）。

このＰＣＲフラグメントは、ヌクレオチド４７９３〜４９７１の配列に対応するフラグメントとして、ＨＩＶ−１ ＬＡＩの伝染性のＤＮＡクローン、特にＨＩＶ１のｐＬＡＩ３に特に由来してもよい。適切な場合、制限酵素認識部位は、クローニングのために、得られるフラグメントの一方又は双方の末端に付加される。例えば、Ｎａｒ Ｉ制限酵素認識部位は、ＰＣＲ反応を行なうために用いられるプライマーの５’末端に付加されてもよい。

それ故、本発明に用いられるＤＮＡ ｆｌａｐは、元のレンチウイルスゲノムのｐｏｌ遺伝子の必要でない５’及び３’部分から欠失され、異なる起源の配列と再結合される。

ゲノムベクターに用いられるＤＮＡ ｆｌａｐ、並びにＧＡＧ及びＰＯＬポリタンパク質をコードするキャプシド形成プラスミドのポリヌクレオチドは、同一のレンチウイルスサブファミリー、又は同一のレトロウイルス様有機物由来であるべきであることは、特定されている。

好ましくは、ゲノムベクターの他のシス作用配列はまた、ＤＮＡ ｆｌａｐを提供するもののように、同一のレンチウイルス、又は同一のレトロウイルス様有機物由来である。

ベクターゲノムは、組み換えポリヌクレオチドをクローニングするための１又はいくつかの独自の制限酵素認識部位（単数又は複数）を更に含む。

好ましい実施形態では、前記ベクターゲノムにおいて、レンチウイルスベクターゲノムの３’ＬＴＲ配列は、少なくともアクチベータ−（エンハンサー）及び或いはＵ３領域のプロモーターを欠損している。別の特定の実施形態では、３’ＬＴＲ領域は、Ｕ３領域を欠損している（デルタＵ３）。この点において、参照は、国際公開第０１／２７３００号及び国際公開第０１／２７３０４号における記載に対してなされる。

特定の実施形態では、前記ベクターゲノムにおいて、ＬＴＲ５’のＵ３領域は、ｔａｔ−独立第一転写を実行するために好適な非レンチウイルスＵ３、又はプロモーターにより置き換えられる。斯かる場合、ベクターは、ｔａｔトランスアクチベーターから独立している。

ベクターゲノムはまた、プサイ（Ψ）パッケージングシグナルを含む。パッケージングシグナルは、ｇａｇＯＲＦのＮ末端フラグメントに由来する。特定の実施形態では、その配列は、可能性のあるｇａｇペプチドの転写／翻訳と、導入遺伝子のそれとの任意の干渉を防ぐために、フレームシフト変異（単数又は複数）により改変され得る。

ベクターゲノムはまた、任意で、スプライスドナー部位（ＳＤ）、スプライスアクセプター部位（ＳＡ）、及び／又はＲｅｖ応答エレメント（ＲＲＥ）の中で選択されるエレメントを含んでもよい。

特定の実施形態によれば、ベクタープラスミド（又は付加されたゲノムベクター）は、遺伝子組み換え発現カセットのための、以下のシス作用配列を含む：
１．逆転写に要求されるＬＴＲ配列（長い末端反復）、該配列は、転写のために要求され、ウイルスＤＮＡ統合のための配列を任意で含む。３’ＬＴＲは、二つの主な理由：第一に、ＤＮＡがゲノムに統合されてすぐの、宿主遺伝子のトランス活性化を避けるため、及び第二に、逆転写（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）後、ウイルスのシス配列の自己不活性化を可能にするために、遺伝子輸送のために必要な機能を撹乱させることなく、少なくとも（自己不活性化する）ＳＩＮベクターを提供するために、プロモーターについて、Ｕ３領域において欠失している。任意で、ゲノムの転写を促す５’−ＬＴＲからのｔａｔ−依存Ｕ３配列は、非内因性プロモーター配列により置き換えられる。従って、標的細胞において、内在プロモーターからの配列のみが転写される（導入遺伝子）。
２．ウイルスＲＮＡキャプシド形成のために必要なΨ領域。
３．Ｒｅｖタンパク質の結合後に、核から細胞質ゾルまでのウイルスのＲＮＡメッセンジャーの輸送を可能にする、ＲＲＥ配列（ＲＥＶ応答エレメント）。
４．核内への輸送を容易にするＤＮＡ ｆｌａｐエレメント（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ、通常Ｐｏｌに含まれる）
５．任意で、転写後エレメント、例えばｍＲＮＡの安定性を最適化するためにまた付加されるＷＰＲＥシス作用配列（ウッドチャック肝炎Ｂ型ウイルス応答後エレメント）、マトリックス又はスキャホールド付着領域（ＳＡＲ及びＭＡＲ配列）、例えば免疫グロブリン−カッパ遺伝子の配列（Ｐａｒｋ Ｆ．ｅｔ ａｌ Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００１；４：１６４−１７３）。

本発明のレンチウイルスベクターは、非複製的であり（複製能力が無い）、即ちベクター及びレンチウイルスベクターゲノムは、複製能力を有するレンチウイルスに関する懸念事項を緩和するために好適であると見なされ、特に投与後、感染した宿主細胞から出芽する新規の粒子を形成し得ない。これは、レンチウイルスゲノムにおけるｇａｇ、ｐｏｌ若しくはｅｎｖ遺伝子の不在、又は「機能性遺伝子」としてのそれらの不在の結果として、よく知られている方法において達成され得る。ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子は、従って、トランスにおいてのみ提供される。これはまた、粒子形成に必要な、他のウイルスコーディング配列（単数又は複数）及び／又はシス作用遺伝子エレメントを欠失させることにより達成され得る。

「機能性の」（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）とは、正確に転写される、及び／又は正確に発現される遺伝子を意味する。従って、この実施形態では、本発明のレンチウイルスベクターゲノムに存在する場合、ｇａｇ、ｐｏｌ又はｅｎｖの配列は、個別に、転写されない、又は不完全に転写される、のいずれかである。表現「不完全に転写される」とは、転写産物であるｇａｇ、ｇａｇ−ｐｒｏ若しくはｇａｇ−ｐｒｏ−ｐｏｌ、これらの一つ又はこれらのいくつかが転写されない、改変を意味する。レンチウイルス複製に関与する他の配列はまた、この状態を達成するために、ベクターゲノムにおいて変異誘発されてもよい。レンチウイルスベクターの複製の不在は、レンチウイルスゲノムの複製から際立つべきである。実際、前述のように、レンチウイルスゲノムは、ベクター粒子の複製を必ずしも確実にすることなく、レンチウイルスベクターゲノムの複製を確実にする、複製の起源を含んでもよい。

レンチウイルスベクターを得るために、本発明によれば、（ベクタープラスミドとして）ベクターゲノムは、粒子又は偽粒子においてキャプシド形成されるべきである。従って、エンベロープタンパク質を除いて、レンチウイルスタンパク質は、ｇａｇ遺伝子、及びｐｏｌレンチウイルス遺伝子又は統合能力の無いｐｏｌ遺伝子のどちらかを有し、並びに（ＨＩＶ−１レンチウイルスベクターのための）Ｖｉｆ−、Ｖｐｒ、Ｖｐｕ及びＮｅｆ−アクセサリー遺伝子のためのいくつか若しくは全てのコーディング配列を好ましくは欠損している、少なくとも１つのキャプシド形成プラスミドに頼るベクターゲノムと共に、産生システム、特に産生細胞において、ベクターゲノムに対してトランスで提供されるべきである。

レンチウイルスベクター粒子を偽型化するために選択されるエンベロープ偽型化タンパク質（単数又は複数）をコードするポリヌクレオチドを有する更なるプラスミドは、用いられる。

好ましい実施形態では、パッケージングプラスミドは、ウイルス粒子合成に必須のレンチウイルスタンパク質のみをコードする。プラスミド中のその存在が安全性の懸念を生じ得るアクセサリー遺伝子は、適宜除かれる。従って、パッケージングのためにトランスで運ばれるウイルスタンパク質は、それぞれＨＩＶ−１に由来するものについて例証される：
１．マトリックス（ＭＡ、見かけの分子量 ｐ１７）、キャプシド（ＣＡ、ｐ２４）及びヌクレオキャプシド（ＮＣ、ｐ６）の結合のためのＧＡＧタンパク質。
２．酵素：インテグラーゼ、プロテアーゼ、及び逆転写酵素をコードするＰＯＬ。
３．ＴＡＴ及びＲＥＶ制御タンパク質、ここでＴＡＴは、ＬＴＲ媒介転写の開始に必要であり；５’ＬＴＲのＵ３領域がｔａｔ−独立転写に促されるプロモーターと置換される場合、ＴＡＴ発現は除かれてもよい。ＲＥＶは改変されてもよく、例えばドメインの認識がベクターゲノム中のＲＲＥ配列を置き換える得る、組み換えタンパク質に適宜用いられてもよく、又はそのＲＢＤ（ＲＮＡ結合ドメイン）を通してはＲＲＥ配列と結合し得るフラグメントとして用いられてもよい。

ウイルス粒子におけるパッケージングプラスミドに含まれる遺伝子から産生されるｍＲＮＡの任意のパッケージングを避けるために、Ψ領域は、パッケージングプラスミドから取り除かれる。異種のプロモーターは、組み換え問題を避けるためにプラスミドに挿入され、ポリＡ尾部は、タンパク質をコードする配列から３’に付加される。適切なプロモーターは、上記に開示されている。

エンベローププラスミドは、本明細書で開示される内在プロモーターの制御下で、本明細書で開示される偽型化のためのエンベロープタンパク質（単数又は複数）をコードする。

本発明のレンチウイルスベクター粒子の調製のための任意の、又は全ての記載されるプラスミドは、タンパク質をコードする部分において最適化されたコドン（ＣＯ）でもよい。本発明のコドン最適化は、好ましくは、哺乳動物細胞、特にヒト細胞において、プラスミドに含まれるコーディング配列の翻訳を改良するために行なわれる。本発明によれば、コドン最適化は、直接的に、又は間接的にベクター粒子の調製を改良するのに、又はそれらが投与される宿主の細胞によるそれらの取り込みを改良するのに、又は宿主の形質導入された細胞のゲノムにおけるマラリア寄生虫の抗原のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（導入遺伝子）の輸送の効率を改良するのに、特に好適である。コドンを最適化するための方法は、当該技術分野においてよく知られており、コドン最適化は、その旨の使用可能なプログラムを用いるために特に行なわれる。コドン最適化は、実施例で例証される本発明の、記載されるｐＴＲＩＰ又はｐＴｈＶプラスミドに含まれるコーディング配列について例証される。

本発明の特定の実施形態では、偽型化されたレンチウイルスベクターはまた、あるいは、統合能力がない。斯かる場合では、ベクターゲノム、及び従ってそれを含む組み換えポリヌクレオチドは、形質導入された細胞又はそれが投与された宿主の細胞のゲノムに統合されない。

本発明は、レンチウイルスベクターの使用に関し、ここで、発現されたインテグラーゼタンパク質が欠損しており、それは更に、免疫原性組成物において、プラスモディウム属寄生虫の前赤血球ステージ抗原のエピトープ（単数又は複数）を有する少なくとも１つのポリペプチドを特にコードするポリヌクレオチドを含む。

「統合能力がない」とは、好ましくはレンチウイルス起源のインテグラーゼが宿主細胞のゲノムへのレンチウイルスゲノムの統合の能力を欠損している、即ち、そのインテグラーゼ活性を特に改変するために変異誘発されたインテグラーゼタンパク質であることを意味する。

統合能力のないレンチウイルスベクターは、統合能力が欠損したインテグラーゼをコードする変異誘発されたｐｏｌ遺伝子をもたらす、インテグラーゼをコードするｐｏｌ遺伝子を改変することにより得られ、ここで、前記変異誘発されたｐｏｌ遺伝子は、キャプシド形成プラスミドに含まれる。斯かる統合能力のないレンチウイルスベクターは、特許出願国際公開第２００６／０１０８３４号に記載されている。従って、タンパク質のインテグラーゼ能力は、改変される一方で、ＧＡＧ、ＰＲＯ及びＰＯＬタンパク質のキャプシド形成プラスミドからの正確な発現、及び／又はキャプシド及び従ってベクター粒子の形成、並びに統合ステップに先立つ又は続く他のウイルスサイクルの他のステップ、例えば逆転写、核内への輸送は、無傷である。インテグラーゼは、可能であるべき統合が、対応する野生型のインテグラーゼを含むレンチウイルスベクターと比較した場合、統合ステップが１／１０００未満、好ましくは１／１００００未満で行なわれる方法において改変される場合、欠損している。

本発明の特定の実施形態では、欠損しているインテグラーゼは、クラス１の変異、好ましくはアミノ酸置換（１−アミノ酸置換）又は欠損しているインテグラーゼの発現の必要条件を充足する短い欠失に由来する。変異は、ｐｏｌ遺伝子内で行なわれる。これらのベクターは、統合ステップのＤＮＡ切断及び連結反応を特異的に阻害する酵素の触媒ドメインにおいて変異Ｄ６４Ｖを有する欠損しているインテグラーゼを有してもよい。Ｄ６４Ｖ変異は、偽型化されたＨＩＶ−１の統合を、野生型の最大１／１０，０００まで減少させるが、効率的な導入遺伝子発現を可能にする非分割細胞を形質導入するそれらの能力を維持する。

ＨＩＶ−１のインテグラーゼのインテグラーゼ能力に影響を与えるのに適するｐｏｌ遺伝子における他の変異は、以下：Ｈ１２Ｎ，Ｈ１２Ｃ，Ｈ１６Ｃ，Ｈ１６Ｖ，Ｓ８１Ｒ，Ｄ４１Ａ，Ｋ４２Ａ，Ｈ５１Ａ，Ｑ５３Ｃ，Ｄ５５Ｖ，Ｄ６４Ｅ，Ｄ６４Ｖ，Ｅ６９Ａ，Ｋ７１Ａ，Ｅ８５Ａ，Ｅ８７Ａ，Ｄ１１６Ｎ，Ｄ１１６Ｉ，Ｄ１１６Ａ，Ｎ１２０Ｇ，Ｎ１２０Ｉ，Ｎ１２０Ｅ，Ｅ１５２Ｇ，Ｅ１５２Ａ，Ｄ−３５−Ｅ，Ｋ１５６Ｅ，Ｋ１５６Ａ，Ｅ１５７Ａ，Ｋ１５９Ｅ，Ｋ１５９Ａ，Ｋ１６０Ａ，Ｒ１６６Ａ，Ｄ１６７Ａ，Ｅ１７０Ａ，Ｈ１７１Ａ，Ｋ１７３Ａ，Ｋ１８６Ｑ，Ｋ１８６Ｔ，Ｋ１８８Ｔ，Ｅ１９８Ａ，Ｒ１９９Ｃ，Ｒ１９９Ｔ，Ｒ１９９Ａ，Ｄ２０２Ａ，Ｋ２１１Ａ，Ｑ２１４Ｌ，Ｑ２１６Ｌ，Ｑ２２１Ｌ，Ｗ２３５Ｆ，Ｗ２３５Ｅ，Ｋ２３６Ｓ，Ｋ２３６Ａ，Ｋ２４６Ａ，Ｇ２４７Ｗ，Ｄ２５３Ａ，Ｒ２６２Ａ，Ｒ２６３Ａ及びＫ２６４Ｈである。

特定の実施形態では、ｐｏｌ遺伝子における変異は、タンパク質の触媒部位である、以下の位置Ｄ６４、Ｄ１１６若しくはＥ１５２のいずれか、又はこれらの位置のいくつかにおいて、行なわれる。これらの位置における任意の置換は、好適であり、上述のものを含む。

別の提案された置換は、アミノ酸残基ＲＲＫ（位置２６２〜２６４）のアミノ酸残基ＡＡＨによる置き換えである。

本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクターが統合能力を有していない場合、レンチウイルスゲノムは、レンチウイルスゲノムが発現される必要がある場合、その配列が細胞の性質に依存する、複製起源（ｏｒｉ）を更に含む。前記複製起源は、真核生物由来、好ましくは哺乳動物由来、最も好ましくはヒト由来でもよい。それは、あるいは、ウイルス由来、特にＤＮＡ環状エピソームウイルス、例えばＳＶ４０又はＲＰＳ由来でもよい。本発明のレンチウイルスベクターのレンチウイルスゲノムに挿入される複製起源を有することは、本発明の有利な実施形態である。実際、レンチウイルスゲノムが（欠損したインテグラーゼのために）細胞宿主ゲノムに統合されない場合、レンチウイルスゲノムは、頻繁な細胞分裂を経る細胞において消失し；これは、特に免疫細胞、例えばＢ又はＴ細胞にあてはまる。複製起源の存在は、少なくとも１つのレンチウイルスゲノムが細胞分裂後でさえ各細胞に存在し、従って、免疫応答の効率性を最大化する。

本発明の前記レンチウイルスベクターのレンチウイルスベクターゲノムは、特に、番号Ｉ−２３３０の下で、１９９９年１０月１１日にＣＮＣＭ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）に寄託されたＨＩＶ−１プラスミドｐＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−ＧＦＰ（国際公開第０１／２７３００号にも記載される）に由来してもよい。ｐＴＲＩＰΔＵ３．ＣＭＶ−ｅＧＦＰの配列は、配列番号３５として提供され、図１１に記載される。

ベクターゲノムがこれらの特定のプラスミドに由来する場合、本願において開示される組み換えポリヌクレオチドの配列は、ＧＦＰコーディングフラグメントに加えて、又は置き換えて、それらに挿入される、ＧＦＰコーディング配列はまた、異なるマーカーに置換されてもよい。ＣＭＶプロモーターはまた、別のプロモーター、特に、導入遺伝子の発現に特に関連して開示されるプロモーターの一つに置換されてもよい。

特定の寄託されたｐＴＲＩＰベクターに含まれるＷＰＲＥ配列はまた、任意で欠失していてもよい。

ベクター粒子は、前記プラスミド、又は他のプロセスにより、適切な細胞（例えば哺乳動物細胞又はヒト細胞、例えば２９３Ｔ細胞に例証されるヒト胚腎臓細胞）のトランスフェクション後、産生され得る。レンチウイルス粒子の発現に用いられる細胞では、それらのコーディングポリヌクレオチドを安定的に発現させるための、又はそれらのコーディングポリヌクレオチドを一時的に若しくは半安定的に発現させるための、全て又はいくつかのプラスミドが用いられてもよい。

産生される粒子の濃度は、細胞上清のＰ２４（ＨＩＶ−１のキャプシドタンパク質）含量を測定することにより、決定され得る。

本発明のレンチウイルスベクターは、宿主に投与されると、それで偽型化されたエンベロープタンパク質に依存して、宿主の細胞、場合により特異的な細胞に感染する。感染は、逆転写（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）が行なわれる場合、宿主細胞の細胞質へのレンチウイルスベクターゲノムの放出を導く。（ＤＮＡ ｆｌａｐを介した）３重鎖形態下で、マラリア寄生虫の抗原（単数又は複数）のポリペプチド（単数又は複数）をコードするポリヌクレオチド（単数又は複数）が、細胞性機構を介して発現される場合、レンチウイルスベクターゲノムは、核内に輸送される。非分裂細胞（例えばＤＣ）が形質導入される場合、発現は安定的であってもよい。分裂細胞、例えばＢ細胞が形質導入される場合、発現は、核酸希釈及び細胞分裂のために、レンチウイルスゲノムの複製起源の不在において一時的である。発現は、細胞分裂後、娘細胞へのレンチウイルスベクターゲノムの適切な拡散を確かにする複製起源を提供することにより、より長くしてもよい。安定性及び／又は発現はまた、ベクターゲノムにおけるＭＡＲ（マトリックス結合領域）又はＳＡＲ（スキャホールド結合領域）エレメントの挿入により増加してもよい。

実際、これらのＳＡＲ又はＭＡＲ領域は、ＡＴリッチ配列であり、細胞染色体，のマトリックスにレンチウイルスゲノムをアンカーし得、従って、少なくとも１つの抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの転写を制御し、特に導入遺伝子の遺伝子発現を刺激し、クロマチン接近可能性を向上させる。

レンチウイルスゲノムが非統合性である場合、それは、宿主細胞ゲノムに統合しない。それにも関わらず、導入遺伝子によりコードされる少なくとも１つのポリペプチドは、十分に発現され、十分にプロセスされ、ＭＨＣ分子と結合し、最終的に細胞表面に向かう。マラリア寄生虫の抗原（単数又は複数）のポリペプチド（単数又は複数）をコードするポリヌクレオチド（単数又は複数）の性質に依存して、ＭＨＣ分子と結合する少なくとも１つのポリペプチドエピトープは、体液性又は細胞性免疫応答を引き起こす。

他に指定のない限り、又は技術的に関連のない限り、任意のウイルスの特性、特にそれらのエンベロープタンパク質（単数又は複数）若しくは組み換えポリヌクレオチドに関するレンチウイルス粒子の構造又は使用の実施形態又は実施例に関する本願に開示される特性は、任意の可能性のある組み合わせにより、組み合わされてもよい。

本発明は、哺乳動物宿主への分離した投与のための、化合物の組み合わせに更に関し、それは、少なくとも以下：
（ｉ）第一の決定された異種の、ウイルスエンベロープ偽型化タンパク質（単数）又はウイルスエンベロープ偽型化タンパク質（複数）で偽型化された本発明のレンチウイルスベクター粒子；
（ｉｉ）（ｉ）におけるレンチウイルスベクター粒子とは別に提供される、前記第一の異種のウイルスエンベロープ偽型化タンパク質（単数又は複数）とは異なる、第二の決定された異種のウイルスエンベロープ偽型化タンパク質（単数）又はウイルスエンベロープ偽型化タンパク質（複数）で偽型化された本発明のレンチウイルスベクター粒子；
ここで、前記第一及び第二のウイルスエンベロープ偽型化タンパク質（単数又は複数）は、互いに血清中和せず、哺乳動物細胞、特にヒト細胞のインビボ形質導入に好適である；
を含む。

表現「化合物の組み合わせ」或いは「化合物のキット」は、活性成分のキット又は組み合わせを構成するレンチウイルスベクター粒子が、前記キット又は組み合わせにおいて分離した化合物として提供され、宿主への分離した投与、特に時間内の分離した投与が意図されることを意味する。従って、本発明は、それらを必要とする宿主において、第一の投与ステップが、免疫、特に細胞性免疫応答を誘発し、後の投与ステップ（単数又は複数）が、細胞性免疫応答を誘導する免疫応答をブーストする、プライム・ブースト投与を行なうことを可能にする。投与の各ステップについて、ベクター粒子の偽型化エンベロープタンパク質（単数又は複数）は、他のステップ（単数又は複数）において用いられるものと異なる。従って、本発明のキット又は組み合わせの分離した化合物は、少なくともそれらの偽型化するエンベロープタンパク質における違いのために、異なる粒子を有する。

キットの化合物は、従って、それを必要とする宿主、特に哺乳動物宿主、特にヒト宿主に時間内に分離して提供される。

従って、前記レンチウイルスベクターは、分離したッケージで提供され得、それの分離した使用のために、共通のパッケージで提供される。

それ故、パッケージに含まれ、使用のための指示を含む注意は、異なる偽型化エンベロープタンパク質（単数）又は偽型化エンベロープタンパク質（複数）で偽型化される前記レンチウイルスベクター粒子が、時間内で分離した投与のために、特に宿主における免疫応答をプライムし、続いてブーストするためであることを指してもよい。

本発明に従って、化合物の組み合わせでは、第一の決定された異種のウイルス偽型化エンベロープタンパク質（単数）又はウイルス偽型化エンベロープタンパク質（複数）で偽型化されるレンチウイルスベクター粒子、及び第二の決定された異種のウイルス偽型化エンベロープタンパク質（単数）又はウイルス偽型化エンベロープタンパク質（複数）で偽型化されるレンチウイルスベクター粒子は、提供される。従って、前記第一及び第二の異種のウイルスエンベロープタンパク質（単数又は複数）は異なり、特に異なるウイルス株に由来する。従って、本発明の化合物のキットの分離された化合物に含まれるレンチウイルスベクター粒子は、少なくともベクター粒子を偽型化するために用いられる特定の偽型化エンベロープタンパク質（単数又は複数）のために、互いに異なっている。

本発明の特定の実施形態では、化合物の組み合わせは、第三の、又は更なる種類のレンチウイルスベクター粒子を含み、ここで、第三のレンチウイルスベクターの偽型化エンベロープタンパク質（単数又は複数）は、前記第一及び第二の偽型化エンベロープタンパク質（単数又は複数）と異なり、特に、異なるウイルス株に由来する。

異なる偽型化エンベロープを有する粒子が、首尾よく投与される場合、前記エンベロープに関して、以下の順序：Ｉｎｄｉａｎａ；Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ；Ｉｓｆａｈａｎ；ＳＶＣＶ／Ｃｏｃａｌでの投与が好ましい。Ｃｏｃａｌで偽型化されたレンチウイルスベクターは、いくつかの他のエンベロープを血清中和するので、それは、ワクチン接種クロノロジー（ｃｈｒｏｎｏｌｏｇｙ）において、Ｃｏｃａｌエンベロープが粒子の調製に用いられる場合、投与計画において、最後の一つとして、それらで偽型化された粒子を投与することが好ましい。

それらの偽型化エンベロープタンパク質（単数又は複数）とは別に、本発明のレンチウイルスベクターは、同一でもよく、特に同一のベクターゲノムを有してもよい。

あるいは、それらが、同一の組み換えの決定されたポリヌクレオチド（導入遺伝子とも称される）、特に同一の組み換えポリヌクレオチドを有する場合、それらのベクターゲノムは異なってもよい。

本発明の別の実施形態では、レンチウイルスベクターのベクターゲノムは、少なくとも１つの前記の異なるポリヌクレオチドが、共通の抗原決定基（単数又は複数）又は共通のエピトープ（単数又は複数）を有するポリペプチド（単数又は複数）をコードする場合、少なくとも１つの異なる組み換えポリヌクレオチドを有することにより異なる。それ故、異なるポリヌクレオチドは、互いに、同一の若しくは変異体のポリペプチドをコードする変異体でもよく、異なるポリペプチドをコードする配列を含んでもよい。

化合物の特定のキットは、レンチウイルスベクターを含み、ここで、少なくとも１つの分離している化合物では、ベクターは、異なるウイルス、特にＶＳＶの異なる種の異なる属の、異なるエンベロープタンパク質（単数又は複数）由来の結合したドメイン又はフラグメントを含む、組み換え偽型化エンベロープタンパク質（単数又は複数）で偽型化される。

本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つの第一、第二の、及びもしあれば第三の、又は更なる偽型化エンベロープタンパク質（単数又は複数）は、Ｉｎｄｉａｎａ株のＶＳＶ−Ｇの輸送決定因子を含む組み換えエンベロープタンパク質（単数又は複数）である。

Ｉｎｄｉａｎａ株のＶＳＶ−Ｇの輸送決定因子は、エンベロープのオープンリーディングフレームの細胞質フラグメントによりコードされるポリペプチドである。

Ｉｎｄｉａｎａ株のＶＳＶ−Ｇの輸送決定因子は、細胞質尾部におけるアミノ酸配列ＹＴＤＩＥを含む、又は有するポリペプチドである（Ｎｉｓｈｉｍｕａ Ｎ．ｅｔ ａｌ．２００２）。

前記組み換えエンベロープタンパク質（単数又は複数）は、疎水性膜貫通ドメインにより区切られたＶＳＶ−Ｇの細胞内部分であるＩｎｄｉａｎａ株のＶＳＶ−Ｇの細胞質尾部を含んでもよい。

化合物の特定のキットは、レンチウイルスベクターを含み、ここでそれらの１又は２又はそれ以上は、ｉｎｄｉａｎａＶＳＶの細胞質ドメイン、及び異なるＶＳＶ血清型の株のエクトドメインを含む組み換えエンベロープタンパク質（単数又は複数）で偽型化される。

化合物の特定のキットは、レンチウイルスベクターを含み、ここでそれらの一方又は双方は、ｉｎｄｉａｎａ ＶＳＶの膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン、並びにＮｅｗ−Ｊｅｒｓｅｙ ＶＳＶのエクトドメインを含む、組み換えエンベロープタンパク質（単数又は複数）で偽型化される。

適切な他の改変は、変異、特に点変異を含み、それは偽型化を改良する。ＶＳＶ−Ｇタンパク質についての斯かる変異は、１若しくはいくつかのアミノ酸残基を置換すること、又は欠失することにより、膜貫通ドメインにおいて行なわれてもよい。適切な変異の他の例は、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｅｎ Ｂ．Ｌ．ｅｔ ａｌ （１９９５）又はＮｉｓｈｉｍｕｒａ Ｎ．ｅｔ ａｌ（２００３）に開示される。

宿主に投与される場合、これらのＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化されるレンチウイルスベクターの形質導入効率を向上させるために、ＶＳＶ−Ｇの糖化状態を改変することは、特に有力である。

ＶＳＶの様々な株からのＶＳＶ−Ｇタンパク質は、図に開示され、それらの配列はまた、データベース、特にＧｅｎＢａｎｋに由来し得る。特に、Ｉｎｄｉａｎａ及びＮｅｗ−Ｊｅｒｓｅｙ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質は、Ｎｅｗ−Ｊｅｒｓｅｙ ＶＳＶ−ＧについてＧｅｎＢａｎｋ ＃ＡＦ１７０６２４、又はＩｎｄｉａｎａ株についてＧｅｎＢａｎｋ＃Ｍ１１０４８として開示される配列に対して、参照により得られ得る。

ＶＳＶのＮｅｗ−Ｊｅｒｓｅｙ及びＩｎｄｉａｎａ株の糖タンパク質を考慮して、２個のアスパラギン残基（Ｎ１８０及びＮ３３６）における糖化が、レンチウイルスベクターの効率的な偽型化を助けることが提案されている。この特定の特性は、本発明のレンチウイルスベクターの調製に適用されてもよい。

ＶＳＶ−Ｇ由来のエンベロープタンパク質をコードする以下の構築物は、本発明のレンチウイルスベクター粒子の組み合わせの調製に使用のための構築物の特定の例であり、国際公開第２００９／０１９６１２号に開示される。

配列番号７６に示される、最適化されたコドンであるＶＳＶ−Ｇ Ｉｎｄｉａｎａ遺伝子。特定のキャプシド形成プラスミドは、番号Ｉ−３８４２の下で、２００７年１０月１０日にＣＮＣＭ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）に寄託されたｐＴｈＶ−ＶＳＶ．Ｇ（ＩＮＤ−ＣＯ）であり、プラスミド構築物の代替型では、番号ＣＮＣＭ Ｉ−４０５６の下で、２００８年７月３１日に寄託されており、ＶＳＶ−Ｇ Ｉｎｄｉａｎａ Ｎｅｗ−Ｊｅｒｓｅｙからのエンベロープで偽型化された粒子の調製に使用のために好適である。他の構築物は、特に、プロモーターを本願において列挙されたものの中のプロモーターで置換することによる、この特定のプラスミド由来でもよい。

最適化されたＶＳＶ−Ｇ Ｎｅｗ−Ｊｅｒｓｅｙ遺伝子コドンは、配列番号７８に開示される。特定のキャプシド形成プラスミドは、特定のキャプシド形成プラスミドは、番号Ｉ−３８４３の下で、２００７年１０月１０日にＣＮＣＭ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）に寄託されたｐＴｈＶ−ＶＳＶ．Ｇ（ＮＪ−ＣＯ）であり、プラスミド構築物の代替型では、番号ＣＮＣＭ Ｉ−４０５８の下で、２００８年７月３１日に寄託されており、ＶＳＶ−Ｇ Ｉｎｄｉａｎａ Ｎｅｗ−Ｊｅｒｓｅｙからのエンベロープで偽型化された粒子の調製に使用のために好適である。他の構築物は、特に、プロモーターを本願において列挙されたものの中のプロモーターで置換することによる、この特定のプラスミド由来でもよい。

コドン最適化配列を有する、本発明を実行するために好適な他のエンベロープ遺伝子は、国際公開第２００９／０１９６１２号に例証され、特にＶＳＶ−Ｇ Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ遺伝子及びその発現産物、ＶＳＶ−Ｇ Ｃｏｃａｌ遺伝子及びその発現産物、ＶＳＶ−Ｇ Ｐｉｒｙ遺伝子及びその発現産物、ＶＳＶ−Ｇ Ｉｓｆａｈａｎ遺伝子及びその発現産物、ＶＳＶ−Ｇ Ｓｐｒｉｎｇ ｖｉｒｅｍｉａ ｃａｒｐウイルス遺伝子及びその発現産物を含む。ＶＳＶ−Ｇ Ｃｏｃａｌについてのエンベロープ遺伝子を含む特定のキャプシド形成プラスミドは、番号ＣＮＣＭ Ｉ−４０５５の下で、２００８年７月３１日にＣＮＣＭ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）に寄託されているｐＴｈＶ−ＶＳＶ．Ｇ（ＣＯＣＡＬ−ＣＯ）である。ＶＳＶ−Ｇ Ｉｓｆａｈａｎについてのエンベロープ遺伝子を含む別の特定のキャプシド形成プラスミドは、番号ＣＮＣＭ Ｉ−４０５７の下で、２００８年７月３１日にＣＮＣＭ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）に寄託されているｐＴｈＶ−ＶＳＶ．Ｇ（ＩＳＦＡ−ＣＯ）である。ＶＳＶ−Ｇ Ｓｐｒｉｎｇ ｖｉｒｅｍｉａ ｃａｒｐウイルスについてのエンベロープ遺伝子を含む別の特定のキャプシド形成プラスミドは、番号ＣＮＣＭ Ｉ−４０５９の下で、２００８年７月３１日にＣＮＣＭ（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）に寄託されているｐＴｈＶ−ＶＳＶ．Ｇ（ＳＶＣＶ−ＣＯ）である。これらの構築物は、特許出願国際公開第２００９／０１９６１２号に開示される。

融合エンベロープタンパク質、特に異なるウイルスのＶＳＶ−Ｇタンパク質のいくつかの異なるフラグメントを含む融合タンパク、及び斯かるタンパク質をコードする核酸構築物は、代替の実施形態として用いられ、また国際公開第２００９／０１９６１２号に開示される。特定の融合エンベロープは、本明細書で提供される配列に示されるように、Ｎｅｗ−Ｊｅｒｓｅｙエンベロープタンパク質のエクトドメインとＩｎｄｉａｎａエンベロープタンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞質ドメイン間の融合である。

本発明を実行するために好適な別の融合エンベロープタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇ Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ、ＶＳＶ−Ｇ Ｃｏｃａｌ、ＶＳＶ−Ｇ Ｐｙｒｉ、ＶＳＶ−Ｇ Ｉｓｆａｈａｎ又はＶＳＶ−Ｇ ＳＶＣＶ、並びにＶＳＶ−Ｇ Ｉｎｄｉａｎａの膜貫通及び細胞質ドメインの中から選択される一つのＶＳＶ−Ｇタンパク質のエクトドメインを含む。前記融合タンパク質をコードする核酸分子は、有利には、コドン最適化核酸である。融合タンパク質をコードする核酸はまた、配列番号７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９として記載される。

本発明の特定の実施形態では、化合物の組み合わせは提供され、ここで分離した化合物のレンチウイルス粒子は、（ｉ）ＣＳＰ抗原のポリペプチド、又は（ｉｉ）ＧＰＩ−アンカーリングモチーフを欠損したＣＳＰ抗原（ＣＳＰデルタＧＰＩ）、若しくはＮ−末端の切断されたＣＳＰタンパク質ポリペプチド（ＣＳＰ ＮＴｅｒ又はまたＣＳＰデルタＳＰ）のをコードする。

特定の実施形態では、これらの化合物又はそれらのいくつかは、本明細書に開示される群において選択されるマラリア寄生虫の抗原の少なくとも１つの更なるポリペプチドをコードし、ここで前記抗原の異なるポリペプチドは、同一のレンチウイルス粒子又は異なるレンチウイルス粒子のいずれかから発現される。

本発明の別の特定の実施形態では、これらの化合物又はそれらのいくつかは、本明細書に開示される群において選択されるマラリア寄生虫の抗原の少なくとも１つの更なるポリペプチドをコードする。

本発明は特に、、哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防免疫付与のために、本明細書で定義されるレンチウイルスベクター粒子、又は化合物の組み合わせに関する。

従って、レンチウイルスベクター粒子、それを含む組成物、又は本発明の化合物の組み合わせは、それらを必要とする宿主、特に哺乳動物、特にヒト宿主に投与される場合、ナイーブリンパ球の活性化、エフェクターＴ細胞応答の生成、並びにマラリア寄生虫の抗原（単数又は複数）に対する免疫記憶抗原−特異的Ｔ細胞応答の生成を含む免疫応答を誘発する。免疫応答は、斯かる寄生虫が宿主にスポロゾイトとして接種される場合にマラリア寄生虫による感染を防ぎ得る、又はスポロゾイトの形態においてマラリア寄生虫の接種に起因する病理状態の発症若しくは進行を防ぎ得る、又は前記寄生虫の更なる形態、例えばメロゾイト形態の発生の結果の発症若しくは進行を防ぎ得る。

従って、レンチウイルスベクター粒子又は本発明の化合物の組み合わせは、寄生虫の接種により、又はマラリア寄生虫のサイクルの赤血球外、即ち肝臓ステージの誘導により引き起こされる病理の発症の予防、制御、又は阻害に好適であり、有利な実施形態では、前記寄生虫の赤血球サイクルの発症及び進行を予防、緩和、又は阻害することに適している。有利なことに、投与のプライム・ブースト接種法に用いられる本発明のレンチウイルスベクター粒子は、保護免疫の発達を可能にし、特にマラリア寄生虫に誘導される病理に対して無菌保護を可能にすることが、観察されている。斯かる無菌保護は、もし前でない場合（ｉｆ ｎｏｔ ｂｅｆｏｒｅ）、寄生虫のサイクルにおいて、肝臓感染のステージにおける感染の結果を制御することに起因し得る。

本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子の組成物は調製され、ここで、前記レンチウイルスベクター粒子は、哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対して、予防的免疫付与に使用のための好適な投与ビヒクルと共に製剤化される。

生理学的に許容されるビヒクルは、免疫付与組成物の投与経路に関して選択されてもよい。好ましい実施形態では、投与は、筋肉内に、又は子供に対して鼻腔内に行なわれてもよい。

従って、化合物の組み合わせは、分離して提供されるレンチウイルスベクター粒子の組成物を含み、ここで化合物の組み合わせ又はキットのそれぞれの分離した組成物は、決定された異種のウイルス偽型化エンベロープタンパク質（単数）又はタンパク質（複数）で偽型化されるレンチウイルスベクター粒子を含み、前記偽型化エンベロープタンパク質は、化合物の組み合わせ又はキットの別の組成物のレンチウイルスベクター粒子の偽型化エンベロープタンパク質を血清中和するために、交差反応しない。

従って、斯かる組成物又は前記組成物の化合物の組み合わせは、哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対して、予防的免疫付与のために用いられ、前記使用は、宿主の細胞性免疫応答をプライムするための有効量のレンチウイルス粒子を投与すること、及び宿主の細胞性免疫応答をブーストするための有効量のレンチウイルス粒子を後で投与すること、及び任意でブーストの前記投与ステップを（一回又は何回か）繰り返すことを含む免疫付与パターンを含み、ここでプライム又はブーストするステップのそれぞれにおいて投与されるレンチウイルス粒子は、互いに交差中和をしない異なる偽型化エンベロープタンパク質（単数又は複数）で偽型化され、前記プライム又はブーストするステップは、少なくとも６週間、特に少なくとも８週間の時間が空けられる。

マウスモデルが本発明のレンチウイルスベクター粒子を用いるプライム・ブースト接種法に従って処置される実施例では、斯かる投与計画に従って免疫付与され、最後の免疫付与ステップの６ヶ月後にチャレンジされたマウスは、ワクチン接種されたマウスの著しい割合について（４０％超）、未だ無菌保護を示すことが、発明者らにより示されており、それは本発明のレンチウイルスベクター粒子が宿主において長続きする無菌保護を誘発し、それ故、特にヒト宿主において、免疫付与のための好適な化合物を構成することを例証する。

特定の実施形態では、本発明は、前記レンチウイルス粒子の、分離して提供される用量を含む投与計画において、哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与のための、本明細書で定義されるレンチウイルスベクター粒子又は化合物の組み合わせに関し、ここで、細胞性免疫応答をプライム及びブーストすることを目的とする用量は、中程度の用量であり、細胞性免疫応答をブースすることを目的とする用量は、プライムするのための用量より多い。

従って、投与パターンにおいて用いられる細胞性免疫応答をプライム及びブーストすることを目的とする用量は、統合性ベクターが用いられる場合、１０⁷ＴＵ〜１０⁹ＴＵのウイルス粒子を含み、子供について意図される用量は、１０⁷ＴＵの範囲であり、成人について、１０⁹ＴＵの範囲である。プライム及びブーストすることを目的とする用量は、統合能力を有さないベクターが用いられる場合、１０⁸〜１０¹⁰のレンチウイルス粒子を含む。

レンチウイルスベクター粒子又は本発明の化合物の組み合わせは、特定の実施形態では、宿主において、以下の効果：
・ヒト宿主において、特にプラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモディウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモディウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、プラスモディウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）又はプラスモディウム・オバール（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）によるマラリア寄生虫感染に対する、無菌保護を誘発すること；
・マラリア寄生虫の細胞外形態を阻害すること；
・マラリア寄生虫による肝細胞感染を予防すること、又は感染の肝臓ステージ増幅の阻害；
・マラリア寄生虫抗原（単数又は複数）に対する特異的Ｔ細胞免疫応答、特にＣＤ８＋Ｔ細胞応答及び／又は特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発すること；
・寄生虫抗原（単数又は複数）に対するＢ細胞応答を誘発すること；
・マラリア寄生虫による感染の影響を減少又は緩和するために寄生虫血症を制御すること；
・寄生虫による感染又は寄生虫により誘導される病理に対する保護細胞性免疫を誘発すること；
・メモリーＴ細胞免疫応答を誘発すること；
・マラリア寄生虫による感染の間、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答の早期の及び高い回復を誘発すること；
・プラスモディウム属感染に関して肝臓内のメモリーリンパ球を刺激することによる早期の強力なＣＴ（ＣＤ８＋Ｔ）応答を誘発すること；
・マラリア寄生虫が免疫応答から回避することを防ぐこと、従って、マラリア寄生虫による感染の長期の制御を可能にすること；
の少なくとも１つを得るために好適である用量、及び投与計画において、哺乳動物宿主、特にヒト宿主に、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与のために、特に用いられる。

上記の目的とする効果の中でも、細胞性免疫応答（Ｔ細胞免疫応答）、特にＣＤ８媒介細胞性免疫応答又はＣＤ４媒介細胞性免疫応答、即ちＣＤ８又はＣＤ４受容体、好ましくは細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びメモリーＴ細胞応答を含む、活性化された細胞により媒介される免疫応答は、本発明のレンチウイルス粒子の免疫付与計画が定義される場合、有利に目的とされる。

免疫応答はまた、体液性応答、即ちレンチウイルスベクターの前記の少なくとも１つのポリペプチドに対して産生される、前記レンチウイルスベクター粒子により誘発される抗体を含む。特定の実施形態では、前記体液性応答は、保護体液性応答である。保護体液性応答は、主に、それらの抗原、例えばＩｇＧに対して高い親和性を有する成熟した抗体をもたらす。特定の態様では、保護体液性応答は、Ｔ細胞依存性である。特定の実施形態では、保護体液性応答は、中和抗体の産生を誘導する。

本発明の特定の実施形態では、本発明のレンチウイルスベクターは、欠損したインテグラーゼを有する形態において用いられる場合でさえ、早期の免疫応答を誘発し得る。表現「早期の免疫応答」は、組成物の投与後約１週間以内に与えられる保護免疫応答（寄生虫又は寄生虫に誘導される病理に対する保護）を意味する。

別の特定の有利な実施形態では、本発明のレンチウイルス粒子により与えられる免疫応答は、長続きする免疫応答であり、即ち、前記免疫応答は、メモリー細胞応答、及び特にセントラルメモリー細胞応答を含み；特定の実施形態では、それは、少なくとも数ヶ月間もなお検出され得（実施例において、マウスについて例証されるように、保護は粒子の投与後少なくとも６ヶ月後もなお得られる）、それは、保護が、投与後数年に亘りヒト宿主において続き得ると考えることが可能である。

免疫応答が体液性応答を含む場合、長続きする応答は、任意の好適な方法、例えばＥＬＩＳＡ。免疫蛍光法（ＩＦＡ）、フォーカス減少中和試験（ｆｏｃｕｓ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔｓ）（ＦＲＮＴ）、免疫沈降法、又はウエスタンブロット法による、特異的な抗体の検出により示され得る。

特定の実施形態では、前記免疫応答、体液性又は細胞性のいずれかの早期の免疫応答、及び／又は長続きする免疫応答は、本発明の組成物の１回の投与後、非統合性遺伝子輸送ベクターを用いて誘発される。

本発明はまた、哺乳動物宿主、特にヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与のための、免疫原性組成物の製造のための、本明細書で与えられる定義に従った、レンチウイルスベクター粒子の使用又は化合物の組み合わせの使用に関する。

本発明はまた、本開示に従って、免疫応答を誘発するための本発明のレンチウイルスベクターを投与するステップを含み、及び前記応答をブーストするための１回又は何回か投与ステップを任意で繰り返す、哺乳動物宿主、特にヒト宿主に免疫付与を提供する方法に関する。

本発明の特定の実施形態では、レンチウイルスベクター粒子又は化合物の組み合わせは、適切な送達ビヒクルとともに、哺乳動物、特にヒト宿主への投与に好適なアジュバント化合物、及び／又は免疫刺激化合物と関連して用いられてもよい。

上記で引用されている組成物は、様々な経路：皮下（ｓ．ｃ．）、皮内（ｉ．ｄ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、又は静脈内（ｉ．ｖ．）注射、経口投与、及び粘膜投与、特に鼻内注入、又は吸入を介して宿主に注入され得る。投与される量（投与量）は、治療される対照に依存し、患者の状態、個人の免疫系の状態、投与の経路、宿主のサイズを考慮することを含む。（ＨＩＶ−１レンチウイルスベクターについての）ベクター粒子の同等のｐ２４抗原の含量に関して表される好適な投与量範囲は、決定され得る。

本発明の他の実施例及び特徴は、実施例及び図を読む場合、明らかであり、それは、本願において、与えられる定義と個別に組み合わせられ得る特徴を有するレンチウイルスベクター粒子の調製及び適用を例証する。

レンチウイルスベクターが代替の戦略を象徴し得るかどうか評価するために、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）（ＴＲＩＰ．ＮＩ ＣＳ）のサーカムスポロゾイト（ＣＳ）タンパク質の切断された形態をコードする非統合性レンチウイルスベクターは、設計され、マラリアに関する動物マウスモデルにおいて評価された。ＣＳタンパク質は、スポロゾイトの表面に亘り均一に分布しており、感染された肝臓細胞においてまた検出される^4,5。従って、ＣＳタンパク質に対する体液性免疫応答の誘導は、肝細胞伝染力を減少させる一方で、この抗原に対する細胞性免疫応答は、寄生虫感染した肝細胞を死滅させる。この概念は、ＣＳタンパク質が、照射を受けたスポロゾイト免疫付与モデルにおける保護免疫の主な標的であることを例証した的確な研究により、近年支持されている⁶。更に、臨床試験においてこれまで試験されてきた全てのワクチン候補の中でも、ＣＳタンパク質に基づくワクチンＲＴＳ，Ｓのみは、風土病の国々において、著しいマラリアの発生率、及び重症のマラリアの症例を減少することを示している^7,8。

ＣＳタンパク質に対する最適な免疫応答を誘発するために、我々は、３つの戦略：１）形質導入された細胞における抗原発現のレベルを増加させること、ここで我々は、ベクターバックボーン（ｂａｃｋｏｎｅ）に、強力なサイトメガロウイルスプロモーターの制御下で、ＣＳタンパク質の哺乳動物コドン最適化配列を挿入し、我々は、ｍＲＮＡ安定性の向上、及び細胞質への輸送のために、ウッドチャック転写後制御エレメント配列を導入遺伝子の下流に付加した。；２）ＧＰＩアンカーリングモチーフの欠失が、ＣＳタンパク質の免疫原性を向上することを示しているので、我々は、ｃｓ遺伝子の３’末端に位置するＧＰＩアンカーリング配列を欠失させた⁹；３）特異的な免疫応答を減少させること、及び特に、スポロゾイトチャレンジによる感染からマウスを保護すること、ここでマウスはＬＶ−に基づくブースターを受けた、を組み合わせた。最初の免疫付与後に誘導された中和する抗−エンベロープ抗体の存在を回避するために、ブースト免疫付与に用いられるレンチウイルス粒子は、非交差反応血清型からＶＳＶ−Ｇエンベロープで偽型化された（プライムについてＶＳＶ−Ｇ Ｉｎｄｉａｎａ、第一及び第二のブーストについて、それぞれＶＳＶ−Ｇ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ及びＣｏｃａｌ）。

第一の一連の実験では、マウスは、中容量のＴＲＩＰ．ＮＩ ＣＳでプライムされ、８週間後に高容量のＴＲＩＰ．ＮＩ ＣＳでブーストされた（図１ａ）。このプライム・ブースト接種法により誘導された保護を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃマウスは、８０．１０³スポロゾイトのプラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）（１７ＸＮＬ ｇｆｐ＋株）（蚊中に存在する寄生虫の侵襲形態）でチャレンジされた。チャレンジは、免疫付与計画の完了の４週間後に行なわれた。チャレンジの４０時間後、肝臓ステージ発達の阻害のレベルは、マウスの肝臓中のプラスモディウム属の１８Ｓ ｒＲＮＡを定量することにより決定された。この目的のために、肝臓で抽出されたＲＮＡは、ＥＸＰＲＥＳＳ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＥＲ（登録商標）キット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びプラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）の１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅のための特異的なプライマーを用いたプラスモディウム属の１８Ｓ ｒＲＮＡ配列のリアルタイムＰＣＲ増幅に用いられた。図１ｂに示されるように、寄生虫の肝臓ステージ発達の阻害は、全ての免疫付与されたマウスについて完全であり、即ち寄生虫１８Ｓ ｒＲＮＡは、定量ＲＴ−ＰＣＲにより検出することはできなかった。並列実験では、保護はまた、免疫付与されたマウスの血液塗抹標本を検査することにより評価され、それは、赤血球ステージの発症について、５００プラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）スポロゾイトでチャレンジされた。末梢血塗抹標本は、免疫付与されたマウスが寄生虫血症を発症するかどうか、即ち、保護が発達し損なうかどうかを決定するために、チャレンジ後３〜１４日、毎日得られ、ギムザ染色され、顕微鏡により検査された。図１ｃに示されるように、完全な保護は、免疫付与されたマウスの６０％で生じた。

第二の一連の実験では、我々は、Ｉｎｄｉａｎａ及びＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ血清型に対する抗体と交差反応をしない、ＶＳＶ−Ｇ Ｃｏｃａｌエンベロープで偽型化されたＴＲＩＰ．ＮＩ ＣＳの第三の注射を加えた。最後のブーストから１ヶ月後、免疫付与されたマウスは、５００スポロゾイトで静脈内にチャレンジされた（図２ａ）。予防能力は、ギムザ染色された血液塗抹標本により、注射後３日目から２１日目まで、１日おきに血液ステージ寄生虫血症をモニタリングすることにより、評価された。５日後、全てのナイーブマウスは、明らかな血液ステージ寄生虫血症を示した。これに反して、６２，５％の免疫付与されたマウスは、無菌免疫を示した（続く２１日に亘る、寄生虫血症の不在により定義される）（図２ｂ）。更に、ナイーブマウスと比較して、寄生虫血症を発症している免疫付与されたマウスは、赤血球侵入の経過において、著しい遅延を示した（図２ｃ）。チャレンジの１０日後、部分的に保護された免疫付与されたマウスは、ナイーブマウスと比較して寄生虫血症のレベルにおいて２倍の減少を示し、この場合において、ワクチンが、部分的ではあるが、寄生虫の免疫制御を提供することを例証した（図２ｄ）。

肝脾腫大症は、マラリアの顕著な特徴である。我々は、その後、チャレンジの３週間後に屠殺されたマウスの臓器の定量分析を行なった。寄生虫に感染しているナイーブマウスは、大規模な脾腫を示した（図３）。更に、脾臓及び肝臓は、赤血球ヘモグロビンの消化の間、寄生虫により製造されるヘモゾインの蓄積に起因する暗い色素沈着を示した。これに対して、無菌免疫応答を備えたワクチン接種されたマウスの８匹中５匹の能力は、通常のサイズ及び色素沈着を示した肝臓及び脾臓の保存と一致した。

免疫付与されたマウスの１／３が無菌保護を示さなかった理由を理解するために、我々は、チャレンジの３週間後に屠殺されたワクチン接種された動物においてＣＳタンパク質特異的免疫応答を評価した。チャレンジされたナイーブマウスは、Ｔ細胞を産生する検出可能なＣＳタンパク質特異的ＩＦＮ−μを示さなかった（データは示されない）。これに対して、ワクチン接種された群において、完全に保護されたマウスは、ワクチン接種されたが部分的に保護されたマウスと比較して、５〜８倍高いＣＳＰ特異的Ｔ細胞応答を示し、免疫制御についてＴ細胞応答の強度の決定的な重要性を強調する（図４）。

重要なことには、我々はまた、最後の免疫付与から６ヶ月において、チャレンジ実験を実行した。この場合、４０％超のワクチン接種されたマウスは、チャレンジ後、検出可能な寄生虫血症を未だ発症しておらず、我々のワクチン戦略により与えられる長続きする無菌保護を例証する（図５）。

総合すると、これらのデータは、非統合性レンチウイルスベクターに基づくプライム・ブースト接種法が、感染体、例えばプラスモディウム属をチャレンジすることに対する高い程度の保護を与え得ることを例証した。

これらの結果に基づいて、我々は、現在、複数ステージのワクチン手法を開発している。この戦略の原理は、肝臓ステージにおいて発現され、Ｔ細胞応答により標的化される抗原、及び血液ステージにおいて発現され、抗体反応により標的化される抗原に対する、複数の免疫応答を誘導することによる我々のワクチン手法により与えられる保護効率を改良することである。この目的のために、我々は、二つの前赤血球ステージ抗原（ＣＳタンパク質及び肝細胞赤血球タンパク質１７ｋＤａ−ＨＥＰ１７）、及び一つの赤血球ステージ抗原（メロゾイト表面タンパク質１の４２−ｋＤａフラグメント−ＭＳＰ−１₄₂）を選択している。Ｈｅｐ１７に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答は、スポロゾイトチャレンジに対して部分的に保護的であり、ＭＳＰ−１₄₂に特異的な抗体反応が血液ステージ寄生虫での致死的チャレンジに対してマウスを保護し得ることを示しているので、これらの抗原は選択された^10,11。Ｈｅｐ１７又はＭＳＰ−１₄₂についてコードするレンチウイルスベクターは、材料及び方法の部分に詳述されるように構築された。Ｈｅｐ１７を発現するレンチウイルス粒子の単回注射の免疫原性を評価するために、マウスの群（ｎ＝５／群）は、１００ｎｇ（３．２ｘ１０⁷ＴＵ）又は６００ｎｇ（１．９ｘ１０⁸ＴＵ）のＴＲＩＰ．ＮＩ Ｈｅｐ１７で免疫付与され、特異的な免疫応答は、Ｅｌｉｓｐｏｔにより評価された。図６に示されるように、前述の９−ｍｅｒ及び１５−ｍｅｒを用いて刺激後、比較的弱いＣＤ８及びＣＤ４応答は、免疫付与されたマウスの脾臓において検出され得る¹²。

我々はまた、ＴＲＩＰ．Ｉ Ｈｅｐ１７レンチウイルス粒子の免疫原性を試験した。マウスの群（ｎ＝５）は、１ｘ１０⁷ＴＲＩＰ．Ｉ Ｈｅｐ１７粒子を用いて筋肉内に免疫付与された。Ｈｅｐ−１７特異的ＩＦＮｇ Ｅｌｉｓｐｏｔ反応は、免疫付与されたマウスからの脾細胞に関して、１１日後に評価された。図７に示されるように、最も強い反応は、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ（ＫＬ１４及びＥＫ１５）、及び一つのＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ（ＬＡ９）に対して検出された。我々はまた、ＴＲＩＰ．Ｉ ＣＳ粒子とともにＴＲＩＰ．Ｉ Ｈｅｐ１７粒子の共免疫付与後、得られたＴ細胞応答を評価した。マウスは、二つの注射：左の腿四頭筋に１ｘ１０⁷ＴＲＩＰ．Ｉ Ｈｅｐ１７粒子の一つの注射、及び右の腿四頭筋に１ｘ１０⁷ＴＲＩＰ．Ｉ ＣＳ粒子の一つの注射を受けた。平行して、マウスの群は、ＴＲＩＰ．Ｉ ＣＳ粒子単独（１ｘ１０⁷ＴＵ 筋肉内）、又はＴＲＩＰ．ＩＨｅｐ１７粒子単独（１ｘ１０⁷ＴＵ 筋肉内）で免疫付与された。１１日目において、免疫付与されたマウスの一部は、Ｅｌｉｓｐｏｔ実験のために屠殺された。ＴＲＩＰ．ＣＳ粒子単独、又はＴＲＩＰ．Ｉ ＣＳ及びＴＲＩＰ．Ｉ Ｈｅｐ１７粒子で免疫付与されたマウスのＣＳ特異的ＩＦＮｇＴ細胞の頻度間で大きな違いは存在しなかった（図８Ａ）。免疫付与されたマウスにおける細胞傷害性Ｔ細胞応答を評価するために、我々は、インビボ細胞傷害性アッセイ（材料及び方法に記載に従って）を実行した。１１日目において、ＴＲＩＰ．Ｉ ＣＳ粒子単独、又はＴＲＩＰ．Ｉ ＣＳ及びＨｅｐ１７粒子で共免疫付与されたマウスの群は、ＣＳペプチドを用いてパルスされた標的Ｔ細胞を用いて静脈注射によりチャレンジされた。期待されるよう、ＴＲＩＰ．Ｉ ＣＳ粒子で免疫付与されたマウスは、標的細胞を効率的に溶解し、我々は、ＴＲＩＰ．Ｉ ＣＳ粒子単独で免疫付与されたマウスの群と、ＴＲＩＰ．Ｉ ＣＳ及びＴＲＩＰ．Ｉ Ｈｅｐ１７粒子の双方を受けたマウスの群間で著しい違いは検出されなかった（図８Ｂ）。総合すると、これらの結果は、ＴＲＩＰ．Ｉ ＣＳ粒子で共投与されたＴＲＩＰ．Ｉ Ｈｅｐ１７粒子が、ＴＲＩＰ．Ｉ ＣＳ粒子により誘発されるＣＳ特異的Ｔ細胞応答と著しく干渉しないことを例証した。我々はまた、ＴＲＩＰ．Ｉ Ｈｅｐ１７単独で免疫付与された、又はＴＲＩＰ．Ｉ ＣＳ粒子で共投与されたマウスにおけるＨｅｐ１７−特異的ＩＦＮｇ Ｔ細胞の頻度を評価した。５つの９−ｍｅｒペプチドに対する刺激に応答する特異的Ｔ細胞の頻度（ＣＤ８＋Ｔ細胞エピトープ）は、２つの群で同様であり、これらは、ＫＬ１４エピトープ（ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープ）を用いた刺激後に測定された。際だって、ＣＤ４＋Ｔ細胞エピトープＥＫ１５に対して検出される応答は、ＴＲＩＰ．Ｉ Ｈｅｐ１７単独で免疫付与されたマウスにおいてよりも、共免疫付与されたマウスにおいて、２倍高かった（図８Ｃ）。図８Ｄに示されるように、Ｈｅｐ１７ペプチド−パルス標的に対するＴ細胞の細胞傷害能力はまた、ＴＲＩＰ．Ｉ Ｈｅｐ１７及びＴＲＩＰ．Ｉ ＣＳ粒子で共免疫付与されたマウスにおいて著しく減少した。集合的に、これらのデータは、ＣＳ−特異的免疫応答がＨｅｐ１７に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を増幅することを例証する。

我々は、次に、レンチウイルスベクターの、血液ステージマラリア抗原メロゾイト表面タンパク質−１（ＭＳＰ１）に対するＢ細胞応答を開始する能力を評価した。マウス（ｎ＝５）は、Ｎ末端において、カルレチクリンの分泌シグナルと融合した、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）（ＴＲＩＰ．Ｉ ＭＳＰ１₄₂）からのＭＳＰ１の４２−ｋＤａ領域をコードする、様々な用量の統合性レンチウイルスベクター（ＴＲＩＰ．Ｉ ＭＳＰ１₄₂）を用いて免疫付与された。免疫付与の３週間後、免疫付与されたマウスの各群から回収されたプール血清は、抗原の保護的Ｃ末端の１９−ｋＤａ領域（ＭＳＰ−１₁₉）^13,14に対する合計の抗−ＭＳＰ１抗体の存在について試験された。９Ａに示されるように、１ｘ１０⁶ＴＵと同じ程度の用量で免疫付与されたマウスは、抗−ＭＳＰ−１₁₉抗体の検出可能なレベルを示し、１ｘ１０⁷ＴＵのこのベクターを用いた免疫付与は、２ｘ１０³に達っする平均力価を有する抗−ＭＳＰ−１₁₉Ｉｇの強力な分泌を誘導した。レンチウイルスベクター免疫付与により与えられる抗−ＭＳＰ１応答が、第二の免疫付与により増幅され得るかどうかを知るために、ＶＳＶ−Ｇ Ｉｎｄｉａｎａエンベロープで偽型化された１００ｎｇのＴＲＩＰ．Ｉ ＭＳＰ１₄₂粒子で免疫付与されたマウスは、３ヶ月後、ＶＳＶ−Ｇ Ｃｏｃａｌエンベロープで偽型化された１０００ｎｇのＴＲＩＰ．ＮＩ ＭＳＰ１₄₂粒子でブーストされた（図９Ｂ）。最後の免疫付与の３週間後、抗−ＭＳＰ−１₁₉抗体のレベルは、プライム・ブーストされたマウスにおいて、４ｘ１０⁵の平均値に達した一方で、単にプライムされたマウスの血漿における力価は、２ｘ１０⁴であった。結論として、統合性レンチウイルスベクターを有する免疫付与は、寄生虫による赤血球細胞の感染に対して保護的であることを示す、強力な抗−ＭＳＰ−１₁₉ Ｉｇを誘導し得る。

材料及び方法
動物及び寄生虫
Ｂａｌｂ／ｃ Ｏｌａ Ｈｓｄ（６週齢、雌性）は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｎｎａｔ，Ｆｒａｎｃｅ）から購入された。全ての動物実験は、Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｔ ｔｈｅ Ｐａｓｔｅｕｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのガイドラインに従って実行された。感染実験は、プラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）（１７ＸＮＬ株）野生型、又は生きている蚊中でオーシスト及びスポロゾイトの検出を可能にするために、緑色蛍光タンパク質を発現する、遺伝的改変体を用いて行なわれた。プラスモディウム・ヨエリ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｙｏｅｌｉｉ）は、ステフェンスハマダラカ（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ）及びＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、代替のサイクルの推移（ｃｙｃｌｉｃ ｐａｓｓａｇｅｓ）により、維持された。蚊は、標準的な手順を用いて、Ｐａｓｔｅｕｒ ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＣｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ （ＣＥＰＩＡ）において飼育された。

プラスミドベクター構築
Ｐｙ ＣＳタンパク質（アミノ酸１−３６７；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ５８２９５）の全長についてコードする遺伝子の哺乳動物コドン最適化形態は、Ｇｅｎｅａｒｔにより合成された。ＧＰＩアンカーリングモチーフの欠失が、ＣＳタンパク質の免疫原性を向上させることが示されているので、我々は、最後の１１個のアミノ酸をコードする配列の欠失したｃｓ遺伝子のコドン最適化形態を構築した。この配列は、以下のオリゴヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏ）：（フォワード）５’ＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＡＴＧＣＡＣＣ−３’（下線はＢａｍＨＩ部位）；（リバース）５’−ＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＡＣＡＣＧＡＴＧＴＴＧＡＡＧＡＴＧＣ−３’（下線はＸｈｏＩ部位）を用いて、コドン最適化ｃｓ遺伝子のフラグメントのＰＣＲ増幅により得られた。得られた増幅産物は、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び配列（ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ ＣＳと称されるプラスミド）にクローンされた。ｐＴＲＩＰ ＣＳベクタープラスミドは、ＢａｍＨＩ／ＸｈｏＩ消化されたｐＴＲＩＰ ＣＭＶ−ＧＦＰ−ＷＰＲＥからのＧＦＰ配列を、ｐＣＲ ２．１−ＴＯＰＯ ＣＳの ＢａｍＨＩ／ｘｈｏＩ消化後得られる切断されたコドン最適化ＣＳ配列と置き換えることにより生成された。ｐＴＲＩＰ Ｈｅｐ１７について、ｋｏｚａｋ配列を含み、５’にＢａｍＨ１部位、及び３’にＸｈｏＩ部位を有する、Ｐｙ Ｈｅｐ１７遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号 Ｕ４３５３９）の哺乳動物コドン最適化配列（Ｇｅｎｅａｒｔ）は、ＢａｍＨ１／ＸｈｏＩ消化されたｐＴＲＩＰ ＣＭＶ−ＷＰＲＥにクローンされた。ＭＳＰ１構築物について、合成の哺乳動物コドン最適化配列（Ｇｅｎｅａｒｔ）は：Ｐｙ ＭＳＰ１₄₂（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号 ＪＯ４６６８）のコドン最適化配列に融合されたカルレチクリン（ＭＬＬＳＶＰＬＬＬＧＬＬＧＬＡＶＡ）の分泌シグナルについてコードする配列を含むために設計された。ＢａｍＨ１／ＸｈｏＩで消化される全体配列は、ＢａｍＨ１／ＸｈｏＩで消化されるｐＴＲＩＰ ＣＭＶ−ＷＰＲＥにクローンされた。

ｐＴＲＩＰベクターの配列は：配列番号３４、３７、４０、４３、４５及び４７としてそれぞれ指定される。

レンチウイルスベクター産生
ベクター粒子は、前述のように¹⁵、ベクタープラスミドｐＴＲＩＰ ＣＳ、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ発現プラスミド（ｐＨＣＭＶ−Ｇ）、及び統合が欠損しているベクター（インテグラーゼの触媒ドメインにおけるＤ６４Ｖ置換が、統合ステップのＤＮＡ切断及び連結反応を妨げる）の生産のための、ｐＤ６４Ｖキャプシド形成ＧＡＧ ＰＯＬプラスミドを用いて、２９３Ｔ細胞の一時的リン酸カルシウム共トランスフェクションにより、生産された。濃縮されたベクター粒子のｐ２４抗原含有量の定量は、市販のＨＩＶ−１ ｐ２４酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）キット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行なわれた。ＴＲＩＰ．Ｉ及びＴＲＩＰ．ＮＩ粒子のベクター力価は、アフィジコリン（ＳＩＧＭＡ）で処理されたＨｅＬａ細胞を形質導入すること、及び前述のように¹⁵定量ＰＣＲを行なうことにより、測定された。統合性及び非統合性レンチウイルスベクターの力価は、増殖を停止した細胞において測定されたｐ２４含量、及び定量ＰＣＲに従って、同様であった。

マウス免疫付与及びチャレンジ
６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスは、０．１ｍｌのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水に希釈された、ＶＳＶ−Ｇ Ｉｎｄｉａｎａエンベロープで偽型化された１００ｎｇのＴＲＩＰ．ＮＩ ＣＳベクター粒子で腹腔内に（ｉ．ｐ．）免疫付与された。８週間後、マウスは、ＶＳＶ−Ｇ Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙエンベロープで偽型化された１５００ｎｇのＴＲＩＰ．ＮＩ ＣＳベクター粒子で腹腔内にブーストされた。免疫付与された、及び対照のマウスのチャレンジは、最後の免疫付与から４週間又はそれ以上後の、静脈内に８０，０００のスポロゾイトの注射からなった。チャレンジの結果は、後に詳述する定量的なリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ法を用いることにより、マウスの肝臓における寄生虫負担を測定することにより、決定された。我々はまた、マウスの対照及び免疫付与された群において、３日目からチャレンジ後１４日まで、毎日得られるギムザ染色された薄い血液塗布標本の顕微鏡検査により、５００スポロゾイトの静脈内接種後、マウスが寄生虫血症を発症したかどうか測定した。簡潔に言うと、チャレンジされたマウスからの血液の小液滴は、顕微鏡スライド上に置かれた。液滴は、第二のスライドを用いて塗りつけられ、空気乾燥され、３０秒間１００％メタノール中で固定された。固定されたスライドは、水（Ｖｏｌｖｉｃ）で希釈された１０％ギムザ（Ｒｅａｃｔｆｓ ＲＡＬ）の新鮮な溶液中で３０分間染色され、水でリンスされ、空気中で乾燥された。スライドは、ｘ１００油浸対物レンズで観察された。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによるＰ．ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）の定量
チャレンジされたマウスの肝臓における寄生虫負荷の定量は、幾つかの修正ととともに、前述のように¹⁶行なわれた。チャレンジの４０時間後、肝臓は回収され、ＲＮＡはＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出された。２μｇのＲＮＡは、寄生虫特異的１８Ｓ ｒＲＮＡの定量に用いられた。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの反応は、ＥＸＰＲＥＳＳ Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＥＲ（商標）キット（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及びＰ．ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）の１８Ｓ ｒＲＮＡの増幅に特異的なプライマーを用いて行なわれた。プライマー（Ｓｉｇｍａ−Ｐｒｏｌｉｇｏ）の配列は：５’−ＧＧＧＧＡＴＴＧＧＴＴＴＴＧＡＣＧＴＴＴＴＴＧＣＧ−３’（フォワードプライマー）、及び５’−ＡＡＧＣＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＧＣＧＡＡＴＡＣＡＴＣＣＴＴＡＴ−３’（リバースプライマー）である。実験は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）装置（Ｒｏｃｈｅ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて行なわれた。寄生虫ＲＮＡコピーの量は、寄生虫の１８Ｓ ｃＤＮＡ ＰＣＲ増幅フラグメントを含むプラスミド構築物（ｐＣＲ ２．１−ＴＯＰＯプラスミド−Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の段階希釈により調製される内部標準曲線上への閾蛍光値の外挿法により評価された。

Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイ
ニトロセルロースマイクロプレート（ＭＡＨＡ Ｓ４５１０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）は、捕捉抗体（Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮｇ Ｅｌｉｓｐｏｔ ｐａｉｒ，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）でコートされ、１０％ＦＣＳが添加されたＲＰＭＩ １６４０ Ｇｌｕｔａｍａｘ、抗体、Ｈｅｐｅｓ、非必須アミノ酸、ｂ−メルカプトエタノール、及びピルビン酸ナトリウムからなる完全培地でブロックされた。ベクター免疫付与マウスからの脾細胞は、０．１２５ｘ１０⁶細胞／ウェルで３重にプレートに添加された。ＣＳ特異的ＣＤ８⁺Ｔ細胞応答の定量のために、脾細胞は、２μｇ／ｍｌのペプチド（ＰｏｌｙＰｅｐｔｉｄｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｆｒａｎｃｅ）、ＳＹＶＰＳＡＥＱＩ（Ｐｙ ＣＳ_280-288）又はＩＹＮＲＮＩＶＮＲＬ（Ｐｙ ＣＳ_58-67）とインキュベートされた。ＣＳ特異的ＣＤ４⁺Ｔ細胞応答を評価するために、脾細胞は、２μｇ／ｍｌのペプチドＳＹＶＰＳＡＥＱＩＬＥＦＶＫＱＩ（Ｐｙ ＣＳ_280-295）とインキュベートされた。２０時間後、スポットは、ビオチンコンジュゲート化抗体（Ｍｏｕｓｅ ＩＦＮｇ Ｅｌｉｓｐｏｔ ｐａｉｒ，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、続いてストレプトアビジン−ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ）、及びＢＣＩＰ／ＮＢ基質溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて明らかにされた。スポットは、Ｂｉｏｒｅａｄｅｒ ２０００（Ｂｉｏｓｙｓ，Ｋａｒｂｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて計測され、結果は、１００万個の脾細胞あたりのＩＦＮγスポット形成細胞（ｓｆｃ）として表わされた。同一のプロトコールは、Ｈｅｐ１７特異的Ｔ細胞応答の定量に適用された。Ｅｌｉｓｐｏｔ及びインビボ細胞傷害性アッセイにおいて刺激のために用いられるペプチドは、表１に要約される。

インビボ細胞傷害性アッセイ
標的細胞調製のために、ナイーブマウスからの脾細胞は、様々な濃度（高濃度、５μＭ；低濃度、１μＭ）のＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル、Ｖｙｂｒａｎｔ ＣＦＤＡ−ＳＥ 細胞追跡キット，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）で標識された。高濃度のＣＦＳＥで標識された脾細胞は、５μｇ／ｍｌにおいてペプチドの組み合わせでパルスされた。低用量のＣＦＳＥで染色された対照集団は、ペプチドを含まない培地中でインキュベートされた。各マウスは、眼窩後静脈を通して、各画分から等量の細胞を含む混合物の１０⁷ＣＦＳＥ−標識細胞を接種された。１５〜１８時間後、脾臓からの単一細胞の懸濁液は、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ ｓｏｆｔｗａｒｅ）により分析された。ペプチド−パルスされた細胞の消失は、免疫付与されたマウスに対するナイーブマウスにおける、パルスされた集団（Ｈｉｇｈ ＣＦＳＥ蛍光強度）と未パルスの集団（低濃度 ＣＦＳＥ蛍光強度）の比を比較することにより決定された。特異的な死亡のパーセンテージは、以下の計算：
（１−（（ＣＦＳＥ_低濃度ナイーブ／ＣＦＳＥ_高濃度ナイーブ）／（ＣＦＳＥ_低濃度免疫付与／ＣＦＳＥ_高濃度免疫付与）））*１００
に従って確立された。

組み換えＭＳＰ１₁₉タンパク質
Ｐ．ヨエリ（Ｐ．ｙｏｅｌｉｉ）ＹＭ ＭＳＰ１₁₉（ａａ１６４９−１７５７）は、ｐＴＲＩＰ ＭＳＰ１₄₂からのフォワードプライマー５’−ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＣＧＧＣＡＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧ−３’及びリバースプライマー５’−ＧＡＴＧＡＡＴＴＣＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＡＡＣＡＣＧ−３’を用いてＰＣＲにより増幅され、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）−融合タンパク質発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｓ，ＵＫ）にクローンされた。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１ ｓｔａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）は、ｐＧＥＸ−２Ｔ ＭＳＰ１₁₉で形質転換され、増殖及び誘導は、製造者の指示（ｐＧＥＸベクター、ＧＳＴ遺伝子融合システム、Ａｍｅｒｓｈａｍ）に従って行なわれた。ＢＬ２１においてタンパク質の発現の誘導後、細胞は回収され、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて溶解された。組み換えタンパク質は、製造者の指示に従って、ＧＳＴ結合タンパク質精製キット（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用いて、ＧＳＴ結合レジンクロマトグラフィーにより精製された。

血清抗体反応の測定
血清は、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によるＭＳＰ１₁₉特異的抗体の評価のために、最後の免疫付与の３週間後に回収された。組み換えＧＳＴ−ＭＳＰ１₁₉融合タンパク質又はＧＳＴ対照は、ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌにおいて、４℃で９６ウェルＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（ＦｉｓｃｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗｏｈｌｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に一晩吸着させた。ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で３回の洗浄後、ウェルは、室温で１時間、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む１００μｌのＰＢＳの添加により、ブロックされた。プレートは、ＰＢＳ中０．０５％Ｔｗｅｅｎ ２０で３回洗浄され、１００μｌの血清の１０倍段階希釈液が、ウェルに添加された。室温で２時間のインキュベーション後、ウェルは洗浄され、ＰＢＳ１０％ＦＢＳに１／４０００に希釈された１００μｌのペルオキシダーゼヤギ抗−マウス免疫グロブリン（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）は、各ウェルに添加された。室温で１時間のインキュベーション後、ウェルは洗浄され、１００μｌのテトラメチルベンジジン基質試薬（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）は、各ウェルに添加された。プレートは、室温で３０分間インキュベートされ、１００μｌの１Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄は、反応を停止するために添加された。プレートは、４５０ｎｍにおいて、光学密度について測定された。終点（ｅｎｄｐｏｉｎｔ）力価は、２倍の非免疫付与マウスからの血清の光学密度を誘発する、最後の希釈の逆数として計算された。

参考文献
1. Nussenzweig, R.S., et al Protective immunity produced by the injection of x-irradiated sporozoites of plasmodium berghei. Nature 216, 160-162 (1967).
2. Gwadz, R.W., et al Preliminary studies on vaccination of rhesus monkeys with irradiated sporozoites of Plasmodium knowlesi and characterization of surface antigens of these parasites. Bull World Health Organ 57 Suppl 1, 165-173 (1979).
3. Clyde, D.F., et al Immunization of man against sporozite-induced falciparum malaria. Am J Med Sci 266, 169-177 (1973).
4. Kappe, S.H., Buscaglia, C.A. & Nussenzweig, V. Plasmodium sporozoite molecular cell biology. Annu Rev Cell Dev Biol 20, 29-59 (2004).
5. Singh, A.P. et al. Plasmodium circumsporozoite protein promotes the development of the liver stages of the parasite. Cell 131, 492-504 (2007).
6. Kumar, K.A. et al. The circumsporozoite protein is an immunodominant protective antigen in irradiated sporozoites. Nature 444, 937-940 (2006).
7. Abdulla, S. et al. Safety and immunogenicity of RTS,S/AS02D malaria vaccine in infants. N Engl J Med 359, 2533-2544 (2008).
8. Bejon, P. et al. Efficacy of RTS,S/AS01E vaccine against malaria in children 5 to 17 months of age. N Engl J Med 359, 2521-2532 (2008).
9. Bruna-Romero, O., Rocha, C.D., Tsuji, M. & Gazzinelli, R.T. Enhanced protective immunity against malaria by vaccination with a recombinant adenovirus encoding the circumsporozoite protein of Plasmodium lacking the GPI-anchoring motif. Vaccine 22, 3575-3584 (2004).
10. Doolan, D.L. et al. Identification and characterization of the protective hepatocyte erythrocyte protein 17 kDa gene of Plasmodium yoelii, homolog of Plasmodium falciparum exported protein 1. J Biol Chem 271, 17861-17868 (1996).
11. Draper, S.J. et al. Effective induction of high-titer antibodies by viral vector vaccines. Nat Med 14, 819-821 (2008).
12. Dobano, C. & Doolan, D.L. Identification of minimal CD8+ and CD4+ T cell epitopes in the Plasmodium yoelii hepatocyte erythrocyte protein 17kDa. Mol Immunol 44, 3037-3048 (2007).
13. Hirunpetcharat, C. et al. Complete protective immunity induced in mice by immunization with the 19-kilodalton carboxyl-terminal fragment of the merozoite surface protein-1 (MSP1[19]) of Plasmodium yoelii expressed in Saccharomyces cerevisiae: correlation of protection with antigen-specific antibody titer, but not with effector CD4+ T cells. J Immunol 159, 3400-3411 (1997).
14. Ahlborg, N., et al Protective immune responses to the 42-kilodalton (kDa) region of Plasmodium yoelii merozoite surface protein 1 are induced by the C-terminal 19-kDa region but not by the adjacent 33-kDa region. Infect Immun 70, 820-825 (2002).
15. Coutant, F., Frenkiel, M.P., Despres, P. & Charneau, P. Protective antiviral immunity conferred by a nonintegrative lentiviral vector-based vaccine. PLoS ONE 3, e3973 (2008).
16. Bruna-Romero, O. et al. Detection of malaria liver-stages in mice infected through the bite of a single Anopheles mosquito using a highly sensitive real-time PCR. Int J Parasitol 31, 1499-1502 (2001).
17. Daneshvar, C. et al. Laboratory Features of Human Plasmodium knowlesi Infection - Clinical Infectious Diseases (2009); 49: 852-860.
18. Vaughan K et al., Meta-analysis of immune epitope data for all Plasmodia: overview and applications for malarial immunobiology and vaccine-related issues, Parasite Immunology, 2009, 31, 78-97
19. Jones Stephanie et al, Lentiviral vector design for optimal T cell receptor gene expression in the transduction of peripheral blood lymphocytes and tumor-infiltrating lymphocyte, Human Gene Therapy, 20: 630-640 (June 2009).
20. Cockrell A.S. et al., Gene delivery by lentivirus vectors. Mol. Biotehnol. (2007) 36 : 184-204.
21. Ikedia Y. et al. (2003). Continuous high titer HIV-1 vector production. Nature Biotechnology, 21 : 569-572.
22. Cockrell A.S. et al. (2006). A trans-lentiviral packaging cell line for high-titer conditional self-inactivating HIV-1 vectors. Molecular Therapy, 14 : 276-284.
23. Xu K. et al. (2001). Generation of a stable cell line producing high-titer self-inactivating lentiviral vectors.
24. Kafri. T. et al. (1999). A packaging cell line for lentivirus vectors. Journal of virolog 73 : 576-584.
25. Zenou V. et al (2000) HIV genome nuclear import is mediated by a central DNA flap Cell. 101: 173-185.
26. Firat H. et al. The Journal of Gene Medicine (2002); 4: 38-45.
27. VandenDriesshe T. et al (2002), Lentiviral vectors containing the Human Immunodeficiency Virus type-1 central polypurine tract can efficiently transduce nondividing hepatocytes and antigen-presenting cells in vivo. Blood. 2002 Aug 1; 100(3): 813-22.
28. Meral E. et al (2009) VACCINE, vol. 27, Issue 49, 16 November 2009, pages 6862-6868.
29. Cronin J et al (2005) - Altering the Tropism of Lentiviral vectors through Pseudotyping- Curr Gene Ther. 2005, August; 5(4): 387-398.
30. Fredericksen B.L. et al . J. Virol. 1995 - 69: 1435-1443.
31. Nishimura N et al. PNAS 2002 - 99; 6755-6760

Claims (13)

1. （ｉ）ＲＮＡウイルス由来の第一の決定された異種のウイルスエンベロープタンパク質（単数）又はウイルスエンベロープタンパク質（複数）で偽型化されるレンチウイルスベクター粒子であって、そのゲノム中に、哺乳動物宿主を感染し得るプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）寄生虫の前赤血球ステージのサーカムスポロゾイトタンパク質（ＣＳＰ）のエピトープ（単数又は複数）を有する少なくとも１つのポリペプチド（単数又は複数）をコードする少なくとも１つの組み換えポリヌクレオチドを含み、ここで前記エピトープ（単数又は複数）は、Ｔ−エピトープ（単数又は複数）及びＢ−エピトープ（単数又は複数）を含む、非統合的で、複製能力の無い、前記レンチウイルスベクター粒子；
   （ｉｉ）（ｉ）におけるレンチウイルスベクター粒子と別に提供される、前記第一の異種のウイルスエンベロープ（単数又は複数）と異なる、ＲＮＡウイルス由来の第二の決定された異種のウイルスエンベロープタンパク質（単数）又はウイルスエンベロープタンパク質（複数）で偽型化されるレンチウイルスベクター粒子であって、そのゲノム中に、哺乳動物宿主を感染し得るプラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）寄生虫の前赤血球ステージのサーカムスポロゾイトタンパク質（ＣＳＰ）のエピトープ（単数又は複数）を有する少なくとも１つのポリペプチド（単数又は複数）をコードする少なくとも１つの組み換えポリヌクレオチドを含み、ここで前記エピトープ（単数又は複数）は、Ｔ−エピトープ（単数又は複数）及びＢ−エピトープ（単数又は複数）を含む、非統合的で、複製能力の無い、前記レンチウイルスベクター粒子；
   ここで、前記第一及び第二のウイルスエンベロープタンパク質（単数又は複数）は、互いに血清中和せず、哺乳動物細胞のインビボ形質導入に好適である、
   を少なくとも含む、哺乳動物宿主に別々に投与するための化合物の組み合わせであって、
   前記（ｉ）及び（ii)におけるレンチウイルスベクター粒子は、
   ・パッケージング、逆転写、及び転写に必要なＨＩＶ−１のシス作用配列を含み、さらに、機能性のＨＩＶ−１のＤＮＡ ｆｌａｐエレメントを含み、さらに、制御発現配列の制御下にある、ＧＰＩ−アンカーリングモチーフを欠失したプラスモディウム属寄生虫の切断されたｃｓ遺伝子のヒトコドン最適化配列のポリヌクレオチドを含む、ベクタープラスミドであって、ここで前記シス作用配列は、切断され、Ｕ３領域を欠損している、又はＵ３領域において部分的に欠失している、ＨＩＶ−１ゲノムからの３’ＬＴＲ配列を少なくとも含む、前記ベクタープラスミド；
   ・Ｉｎｄｉａｎａ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、Ｃｏｃａｌ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、Ｉｓｆａｈａｎ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、Ｐｙｒｉ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）およびＳＶＣＶ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）から選択される、ＶＳＶ−Ｇエンベロープタンパク質（単数又は複数）をコードするポリヌクレオチドを含むＶＳＶ−Ｇエンベロープ発現プラスミドであって、前記ポリヌクレオチドは、制御発現配列の制御下にある、ＶＳＶ−Ｇエンベロープ発現プラスミド；及び
   ・統合能力が欠損したベクター粒子の産生に好適な改変されたＨＩＶ−１のｇａｇ−ｐｏｌコーディング配列を含むキャプシド形成プラスミドであって、ここで前記改変されたｇａｇ−ｐｏｌ配列が制御発現配列の制御下にある、キャプシド形成プラスミド；
   を用いた、哺乳動物細胞の共トランスフェクションから回収された生成物であり、
   ・前記第一及び第二のウイルスエンベロープタンパク質がそれぞれＩｎｄｉａｎａ株のＶＳＶ−Ｇ及びＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株のＶＳＶ−Ｇ、若しくはその逆である、又は
   ・前記第一及び第二のエンベロープタンパク質の１つ又は双方が、天然のＩｎｄｉａｎａ株のＶＳＶ−Ｇ若しくは／及びＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株のＶＳＶ−Ｇの改変型である、又は
   ・前記第一及び第二のエンベロープタンパク質の少なくとも一つが、キメラのＶＳＶ−Ｇタンパク質であって、ここで以下のドメイン：輸送決定因子ＹＴＤＩＥ、細胞質尾部、膜貫通ドメイン、又は細胞質ドメインの少なくとも一つが、Ｉｎｄｉａｎａ株由来である、又は
   ・第一のウイルスエンベロープタンパク質が、Ｉｎｄｉａｎａ株のＶＳＶ−Ｇ若しくはＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株のＶＳＶ−Ｇのいずれかであり、第二のウイルスエンベロープタンパク質が、Ｃｏｃａｌ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、Ｉｓｆａｈａｎ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、Ｃｈａｎｄｉｐｕｒａ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、Ｐｙｒｉ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）、及びＳＶＣＶ株のＶＳＶ−Ｇタンパク質（単数又は複数）の群から選択される、前記組み合わせ。
2. 前記第一及び第二のウイルスエンベロープタンパク質がそれぞれＩｎｄｉａｎａ株のＶＳＶ−Ｇ及びＮｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ株のＶＳＶ−Ｇ、若しくはその逆である、請求項１に記載の化合物の組み合わせ。
3. 前記レンチウイルス粒子が、（ｉ）ＣＳＰ抗原のポリペプチド、又はＧＰＩアンカーリングモチーフを欠損したＣＳＰ抗原のポリペプチド、及び（ｉｉ）スポロゾイト表面タンパク質２（ＴＲＡＰ／ＳＳＰ２）、肝臓ステージ抗原（ＬＳＡ）、Ｐｆエクスポーティッドタンパク質１（Ｐｆ Ｅｘｐ１）、Ｐｆ抗原２の群において選択されるマラリア寄生虫の抗原の少なくとも一つの更なるポリペプチドを含む、異なるポリペプチドをコードし、ここで、前記抗原の異なるポリペプチドが、同一のレンチウイルス粒子又は異なるレンチウイルス粒子から発現される、請求項１又は２に記載の、別々に提供される化合物の組み合わせ。
4. 前記レンチウイルス粒子が、メロゾイト表面タンパク質１（ＭＳＰ−１）、メロゾイト表面タンパク質２（ＭＳＰ−２）、頂端膜抗原１（ＡＭＡ−１）、セリンリピート抗原（ＳＥＲＡ）、ＧＬＵＲＰ抗原、Ｐｆ１５５／ＲＥＳＡ（リング−感染赤血球表面抗原）、又は桿小体関連タンパク質１（ＲＡＰ−１）若しくは桿小体関連タンパク質２（ＲＡＰ−２）の群において選択されるポリペプチドをコードする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の、別々に提供される、化合物の組み合わせ。
5. 哺乳動物宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与のための、別々に提供される請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の組み合わせ。
6. 哺乳動物宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与に使用のための好適な投与ビヒクルで製剤化され、ここで前記使用は、宿主の細胞性免疫応答をプライムするために有効量のレンチウイルス粒子を投与すること、及び宿主の細胞性免疫応答をブーストするために有効量のレンチウイルス粒子を後で投与することを含む免疫付与パターンを含み、ここでプライム又はブートするステップのそれぞれにおいて投与されるレンチウイルス粒子は、互いに血清中和をしない異なるエンベロープタンパク質（単数又は複数）で偽型化され、ここで前記プライム又はブーストするステップは、少なくとも６週間空けられる、別々に提供される請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の組み合わせ。
7. 前記免疫付与パターンが、ブーストについての前記投与ステップを繰り返すことをさらに含む、別々に提供される請求項６に記載の化合物の組み合わせ。
8. 別々に提供される用量の前記レンチウイルス粒子を含む投与計画において、哺乳動物宿主においてマラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫に用いられ、ここで、統合能力のないベクター粒子が用いられる場合、細胞性免疫応答をプライム及びブーストすることを目的とする用量は、１０⁸〜１０¹⁰のレンチウイルス粒子を含む、別々に提供される請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の組み合わせ。
9. 宿主において、少なくとも１つの以下の効果：
   （ＸＩＩ）ヒト宿主において、マラリア寄生虫感染に対する無菌保護を誘発すること；
   （ＸＩＩＩ）マラリア寄生虫の細胞外形態を阻害すること；
   （ＸＩＶ）マラリア寄生虫による肝細胞感染を予防すること、又は感染の肝臓ステージ増幅を阻害すること；
   （ＸＶ）マラリア寄生虫抗原（単数又は複数）に対する特異的Ｔ細胞免疫応答を誘発すること；
   （ＸＶＩ）寄生虫抗原（単数又は複数）に対するＢ細胞応答を誘発すること；
   （ＸＶＩＩ）マラリア寄生虫による感染の影響を減少又は緩和するために寄生虫血症を制御すること；
   （ＸＶＩＩＩ）寄生虫による感染又は寄生虫により誘導される病理に対する保護細胞性免疫を誘発すること；
   （ＸＩＸ）メモリーＴ細胞免疫応答を誘発すること；
   （ＸＸ）マラリア寄生虫による感染の間、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答の早期の及び高い回復を誘発すること；
   （ＸＸＩ）プラスモディウム属感染に関して肝臓内のメモリーリンパ球を刺激することによる早期の強力なＣＴ（ＣＤ８＋Ｔ）応答を誘発すること；
   （ＸＸＩＩ）マラリア寄生虫が免疫応答を回避することを防ぐこと、従って、マラリア寄生虫による感染の長期の制御を可能にすること；
   を得るために好適である、投与用量及び投与計画において、哺乳動物宿主における、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与に用いられる、別々に提供される請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の組み合わせ。
10. 前記マラリア寄生虫感染が、プラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモディウム・マラリアエ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｍａｌａｒｉａｅ）、プラスモディウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｖｉｖａｘ）、プラスモディウム・ノウレシ（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｋｎｏｗｌｅｓｉ）又はプラスモディウム・オバール（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｏｖａｌｅ）による感染である、別々に提供される請求項９に記載の化合物の組み合わせ。
11. 前記特異的Ｔ細胞免疫応答が、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答及び／又は特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答である、別々に提供される請求項９に記載の化合物の組み合わせ。
12. アジュバント化合物、及び／又は免疫付与化合物、及び適切な送達ビヒクルと関連して、哺乳動物宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与に用いられる、別々に提供される請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の組み合わせ。
13. ヒト宿主において、マラリア寄生虫感染又は寄生虫に誘導される病理に対する予防的免疫付与のために用いられる、別々に提供される請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物の組み合わせ。