CN108779473A - 用于制备具有环二核苷酸的病毒颗粒的方法和所述颗粒用于治疗癌症的用途 - Google Patents

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马泰奥·真蒂利
佐藤毅史
贾恩·雷温克尔
安妮·布里奇曼
塔玛拉·达韦纳
乔纳森·梅尔费特
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Institut Curie
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France National Medical Association Of Health And Research
Institut Curie
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Abstract

本发明涉及用于制备包含免疫原性环二核苷酸的病毒样颗粒的方法以及其用于治疗癌症的用途。

Description

用于制备具有环二核苷酸的病毒颗粒的方法和所述颗粒用于 治疗癌症的用途
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是疫苗和肿瘤学领域。
背景技术
最近已经将环二核苷酸描述为免疫系统的有效细胞质佐剂。它们诱导如针对HIV(人类免疫缺陷病毒)和HSV(单纯疱疹病毒)以及针对癌症的抗病毒先天性免疫反应(WO2005/087238；WO2007/054279；WO2013/185052)。先前在细菌中鉴定了环二核苷酸，并且已知环二核苷酸是免疫刺激性的。
在鉴定到环二核苷酸cGAMP(2'-3'-环GMP-AMP)也存在于脊椎动物中并且是由酶cGAS在识别细胞质DNA后内源合成的之后，该领域最近获得了很多关注。
环GMP-AMP合酶(cGAS)是一种细胞质DNA传感器，其通过催化第二信使cGAMP的合成来进行信号转导。cGAS以序列非特异性方式结合双链DNA，并且这诱导其酶促位点的构象变化，从而允许环GMP-AMP(cGAMP)合成((Wu等人,2012,Science,339,826-830；Sun等人,2012,Science,339,786-791；WO2014/099824；Ablasser等人,2013,Nature,498,380-384)。后生动物cGAMP具有规范的3'-5'和罕见的2'-5'磷酸二酯键二者。cGAMP结合并活化干扰素基因刺激因子(STING)。通过传达来自上游DNA传感器的信号以活化转录因子如IRF3，所述转录因子继而又驱动IFN基因转录，STING在细胞质DNA传感中起重要作用。干扰素(IFN)在针对病毒感染的免疫反应中起关键作用。IFN表达是由被病毒存在的传感器(包括细胞质DNA传感器)活化的信号转导通路诱导的。
然而，环二核苷酸不能有效地穿过细胞的质膜，并且当在没有载体的情况下使用时具有有限的效力。目前的载体主要由基于脂质的复合物如脂质转染胺(lipofectamin)组成，所述基于脂质的复合物由于其毒性而在体内具有有限的用途。
因此，非常需要环二核苷酸、特别是有前景的cGAMP的运载(vectorization)工具。
发明内容
本发明提供了利用带包膜的病毒样颗粒进行的环二核苷酸、特别是cGAMP的新型运载。实际上，环二核苷酸，特别是cGAMP，可以被包装到带包膜的病毒样颗粒(VLP)或病毒粒子中，并诱导先天性免疫反应，特别是干扰素反应。更具体地，为了能够运载环二核苷酸，特别是cGAMP，VLP需要是带包膜的以通过VLP与靶细胞的融合来优化环二核苷酸、特别是cGAMP的递送。具体地，本发明人已显示，施用VLP令人惊讶地改善了cGAMP的作用，特别是其针对肿瘤的作用。在一个优选实施方式中，肿瘤内施用VLP与cGAMP的增加的作用相关。
本发明涉及一种包含脂蛋白包膜的病毒样颗粒，所述脂蛋白包膜包括病毒融合性糖蛋白，其中所述病毒样颗粒含有包装在所述病毒样颗粒中的环二核苷酸，所述病毒样颗粒用于治疗癌症。优选地，病毒样颗粒还包含来自逆转录病毒科的衣壳。
优选地，病毒融合性糖蛋白是来自以下的糖蛋白：逆转录病毒科(包括慢病毒和逆转录病毒)、疱疹病毒科、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、丁型肝炎病毒、正粘病毒科、副粘病毒科、丝状病毒科、弹状病毒科、布尼亚病毒科或正痘病毒科(例如天花)，优选正粘病毒、逆转录病毒或弹状病毒。具体地，病毒融合性糖蛋白可以是来自以下的糖蛋白：HIV(人类免疫缺陷病毒)，包括HIV-1和HIV-2；流感，包括A型流感(例如亚型H5N1和H1N1)和B型流感；托高土病毒(thogotovirus)；或VSV(水泡性口腔炎病毒)。
优选地，逆转录病毒衣壳来自逆转录病毒科，优选慢病毒和逆转录病毒。更优选地，逆转录病毒衣壳来自HIV或MLV(鼠白血病病毒)。
优选地，环二核苷酸选自环二单磷酸腺苷(c-di-AMP)、环二单磷酸鸟苷(c-di-GMP)和环单磷酸鸟苷-单磷酸腺苷(cGAMP)。更优选地，环二核苷酸是cGAMP(2'-3'-环GMP-AMP)或cGAMP(3'-3'-环GMP-AMP)。
任选地，本发明的病毒样颗粒还可以包含抗原或任何其他目的蛋白质或核酸，优选肿瘤相关抗原，或其组合。
本发明涉及本文公开的病毒样颗粒，其作为药物，特别是作为疫苗或作为疫苗佐剂。本发明还涉及一种药物组合物、疫苗组合物或兽医用组合物，其包含本文公开的病毒样颗粒、药学上可接受的载体和任选的抗原或治疗性活性剂，用于治疗癌症。
本发明还涉及一种治疗受试者的癌症的方法，所述方法包含施用本文公开的病毒样颗粒或本文公开的组合物。本发明涉及本文公开的病毒样颗粒或组合物用于制造治疗受试者的癌症的药物或疫苗的用途。
本发明还涉及一种药物组合物、疫苗组合物或兽医用组合物，其包含本文公开的病毒样颗粒、药学上可接受的载体和至少一种肿瘤相关抗原。
优选地，病毒样颗粒通过静脉内、皮下或肿瘤内途径施用。在最优选的实施方式中，病毒样颗粒通过肿瘤内途径施用。
附图说明
图1.cGAS重构的293T细胞中所产生的HIV-1-GFP在感染细胞中诱导IFN。(A)实验设置的示意图。(B)用IFNβ启动子报告基因(p125-F-Luc)和pRL-TK(作为对照)转染HEK293细胞。6-8小时后，如所示用来自表达cGAS的生产细胞的HIV-1-GFP感染细胞(MOI＝1)或保持未感染。24小时后分析F-Luc活性并将其标准化为R-Luc。m-cGAS-AA是催化失活的突变体。(C)24小时后洗涤HIV-1-GFP感染细胞，并且再过48小时后，通过生物测定法来分析上清液中的IFN(左)，并且收集细胞用于FACS分析。显示GFP阳性细胞的百分比(右)。楔形表示10、5、2、1、0.5和0.1的MOI。(D)从如(C)中感染(MOI＝1)的细胞中提取RNA。通过RT Q-PCR相对于18S rRNA来定量指示的mRNA。(E)用HIV-1-GFP(MOI＝5)或仙台病毒(SeV，楔形表示1、0.5和0.1的MOI)感染所示基因型的BMDM。24小时后通过ELISA测试上清液的mIFNα。n.d.，未检测到。(F)如(E)中所示来感染BMDM，并且通过RT Q-PCR相对于GAPDH mRNA来定量指示的mRNA。黑色楔形表示5和1的MOI，并且灰色楔形表示1、0.5和0.1的MOI。柱条显示两个(B、D、E)或四个(C、F)重复样品的平均值，并且误差条表示范围(B、D、E)或标准偏差(C、F)。
图2.HEK293细胞表达STING并对cGAMP作出响应而诱导IFN。(A)通过Western印迹测试来自THP1和HEK293细胞的细胞提取物的STING表达。在制图期间剪掉了无关的干扰泳道。(B)用IFNβ启动子报告基因(p125-F-Luc)和用pRL-TK(作为对照)瞬时转染2×105个HEK293细胞。24小时后，用2μg 2'-3'-cGAMP或仅用脂质转染胺(对照)转染细胞。再过24小时后分析荧光素酶活性，并将F-Luc活性以标准化为R-Luc的形式显示。柱条显示两个重复样品的平均值并且误差条表示范围。
IFN生物测定法：(C)使用慢病毒递送用pGreenFire-ISRE转导HEK293细胞。通过连续稀释获得克隆，并且基于对IFN的反应，选择克隆3C11。将25,000个3C11细胞接种在96孔板中，并添加重组人类IFNα2。24小时后，裂解细胞并测量萤火虫荧光素酶活性。将未处理细胞中的背景生物发光设定为1。柱条显示两个重复样品的平均值并且误差条表示范围。
野生型和突变cGAS在病毒生产细胞中同等地表达。(D)转染后72小时裂解293T病毒生产细胞，并使用识别FLAG标签的单克隆抗体通过Western印迹测定cGAS蛋白水平。
cGAS重构的细胞中产生的腺病毒-GFP(Ad-GFP)不会在新感染的靶细胞中触发IFN。(E)在HEK293细胞中产生Ad-GFP。将一些病毒生产细胞用cGAS表达构建体共转染。然后使用病毒储液感染新鲜的HEK293细胞。楔形表示0.01和0.001μl接种物。通过生物测定法测试Ad-GFP感染细胞的IFN产生。使用指示剂量的重组IFNα来证实生物测定法的反应性。柱条显示两个重复样品的平均值并且误差条表示范围。(F)通过FACS监测感染。
图3.由来自cGAS表达细胞的HIV-1-GFP触发的IFN诱导不依赖于病毒核酸。(A)用DNA酶I处理或不处理病毒储液，然后将其如图1(MOI＝1)中所示用于感染细胞。作为对照，分别将培养基和m-cGAS质粒与DNA酶I一起温育，然后添加到细胞中或转染。(B)从如所示转染的生产细胞(上清液，SUP)中收集HIV-1-GFP。通过离心从等分试样中沉淀HIV-1-GFP，并重新悬浮于新鲜培养基中(沉淀，PEL)。然后感染细胞(MOI＝1)。(C)在奈韦拉平(Nev)或雷特格韦(Ral)存在下感染细胞(MOI＝1)。通过FACS测定感染细胞的百分比(右)。(D)用100、50或5μl(楔形)来自产生HIV-1-GFP或病毒样颗粒(VLP)的细胞的上清液感染细胞。(E)用VSV-G或THOV-G将HIV-1-GFP假型化，并使用来自生产细胞的上清液(VSV-G：1和0.1μl；THOV-G：100和10μl)感染细胞。(F)在用m-cGAS重构的细胞中产生HIV-1-GFP，所述细胞还用20μM GW4869、60μM Ac-DEVD-CHO处理或未处理(对照)。用10、1或0.1μl(楔形)上清液感染新鲜细胞。在所有图中，将细胞感染24小时，洗涤并再过48小时后，通过生物测定法来分析上清液中的IFN。柱条显示两个(B、C、D、E)、三个(F)或四个(A)重复样品的平均值，并且误差条表示范围(B、C、D、E)或标准偏差(A、F)。
图4.来自HIV-1-GFP的小分子提取物诱导IFN，该HIV-1-GFP来自cGAS重构的生产细胞。(A)实验设置的示意图。(B)将来自在cGAS不存在下(第一组柱条)或在野生型或突变cGAS存在下(第2和第3组柱条)产生的病毒的提取物添加到毛地黄皂苷通透化的THP1细胞中。通过生物测定法评估THP1上清液中的IFN。灰色楔形表示从来自107个感染单位的提取物开始的1:2稀释系列。作为对照，将合成的cGAMP直接添加到THP1细胞中(最后一组柱条)或加入培养基中，然后包括在提取程序(第四组柱条)中。黑色楔形表示从50ng cGAMP开始的1:3稀释系列。(C)将来自在cGAS存在下产生的107个感染单位的HIV-1-GFP的提取物在有或者没有SVPDE的情况下温育1小时，然后添加到毛地黄皂苷通透化的THP1细胞中。通过生物测定法评估THP1上清液中的IFN。楔形表示1:3稀释系列。(D)通过斑点印迹探测在cGAS不存在或存在下或在生物素-cGAMP转染的细胞中产生的HIV-1-GFP的生物素(左)。然后再探测剥离膜的p24(右)。楔形表示从2×106个感染单位开始的1:10稀释系列。
图5.用来自cGAS重构的生产细胞的HIV-1-GFP感染树突状细胞诱导CD86表达和IFN分泌。在指示的MOI下用HIV-1-GFP感染来源于两个供体的单核细胞的人类树突状细胞。48小时后，通过FACS分析CD86表达。(A)显示CD86+细胞的百分比。(B)显示CD86中值荧光强度。(C)在IFN生物测定法中测试上清液。(A-C)显示来自每个供体的重复感染的平均数据；误差条表示范围。注意到，这些效应在Vpx不存在的情况下观察到。
图6.cGAS慢病毒载体活化树突状细胞。(A)在存在或不存在Vpx的情况下用编码BFP-2A或BFP-2A-cGAS的慢病毒感染单核细胞后的BFP和CD86表达。(B)在无Vpx下，如(a)中使用滴定的病毒的情况下的CD86表达，以及最高剂量下的统计学分析(配对t检验；n＝4；***p<0.001)。(C)在无Vpx下，如(a)中使用滴定的病毒的情况下的IP-10产生，以及最高剂量下的统计学分析(针对转换为对数的数据，配对t检验；n＝4；**p<0.01)。(D)用编码BFP-2A或BFP-2A-cGAS的慢病毒或用在编码cGAS的非慢病毒质粒(PSTCD-cGAS)存在下产生的VLP感染单核细胞后的BFP和CD86表达。(E)如(d)中的CD86表达和IP-10产生(n＝5，CD86表达分析的配对t检验，IP-10的转换为对数的数据的配对t检验；***p<0.001，**p<0.01，ns＝不显著)。
图7.cGAS慢病毒载体活化单核细胞和完全分化的树突状细胞。(A)在Vpx不存在下用BFP编码载体和cGAS编码载体转导单核细胞，接着在具有GM-CSF和IL-4的DC中分化后96h的CD14和DC-SIGN表达(n＝2)。(B)用BFP-2A慢病毒和BFP-2A-cGAS慢病毒感染已建立的来源于单核细胞的树突状细胞后48h的BFP和CD86表达。(C)如(B)中的CD86表达(n＝3)。(D)图6D中使用的生产细胞和沉淀的上清液中的Gag、cGAS和肌动蛋白的免疫印迹。
图8.HIV颗粒传递由cGAS引发的先天性信号。(A)用使用BFP-2A-cGAS载体、Gag/Pol和VSV-G产生的慢病毒感染单核细胞后的BFP和CD86表达。用完整上清液或用10kDa截留装置过滤后的保留物和滤液感染细胞。显示了四个中的代表性实验。(B)用差异分级的上清液对单核细胞进行剂量反应感染的CD86表达和IP-10产生，所述上清液含有由表达野生型cGAS或缺乏DNA结合结构域(ΔDBD)的无活性cGAS突变体的293FT产生的VLP。指示了用于感染的各级分的体积和与初始上清液相比的相应浓度系数(n＝3；绘制的平均值和SEM)。(C)如(B)中通过完整上清液的差异离心获得的级分中的Gag和cGAS的免疫印迹(代表三个实验)。(D)如(B)中通过完整上清液的差异离心获得的级分中的外来体标志物衔接蛋白-1(syntenin-1)、CD63、CD81和CD9的免疫印迹。(代表三个实验)。(E)(A)中的实验的CD86表达分析(n＝4；配对t检验；**p<0.01，ns＝不显著)。
图9.病毒颗粒包装和转移cGAMP。(A)在有或没有STING编码质粒的情况下，在IFNβ启动子控制下用荧光素酶报告质粒转染的293FT细胞。用滴定量的如下上清液刺激细胞：来自在鼠cGAS存在(cGAS病毒颗粒)或不存在(对照病毒颗粒)下产生病毒颗粒的细胞的上清液，以及来自表达鼠cGAS的(无Gag/Pol无VSV-G的cGAS)、用合成的cGAMP使用脂质转染胺刺激的、或用编码cGAS的质粒转染的(cGAS转染)细胞的上清液。显示了三个独立实验中的一个代表性实验。(B)在通透化的PMA分化的THP-1细胞暴露于合成的2'-3'-cGAMP(左图)或暴露于来自293FT转染的细胞和沉淀的病毒颗粒的benzonase抗性提取物之后测量的I型IFN活性。在cGAS或催化失活的突变体E225A/D227A存在下用慢病毒包装质粒转染293FT细胞(右图)。显示了三个独立实验中的一个代表性实验。(C)(A)中使用的VLP生产细胞中Gag、cGAS和肌动蛋白的免疫印迹。
图10.病毒颗粒转移cGAMP是逆转录病毒的保守特性。(A)在将单核细胞暴露于用表达Gag/Pol和VSV-G的质粒以及编码cGAS、cGAS E225A/D227A或对照的质粒的组合转染的细胞的无细胞上清液后，DC中的BFP和CD86表达。(B)如(a)中的CD86表达和IP-10产生的分析(n＝6；CD86表达的配对t检验，IP-10产生的转换为对数的数据的配对t检验；****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，*0.01<p<0.05)。(C)生产细胞和沉淀的无细胞上清液中的Gag、VSV-G、cGAS和肌动蛋白的免疫印迹。(D)用慢病毒颗粒感染单核细胞后，DC中的CD86表达和IP-10产生，其中所述慢病毒颗粒用流感H1N1(左图)或H5N1(右图)包膜蛋白假型化并且在鼠cGAS存在或不存在下产生(n＝4；如(B)中分析)。(E)用γ逆转录病毒颗粒感染单核细胞后，DC中的CD86表达和IP-10产生，其中所述γ逆转录病毒颗粒在cGAS存在或不存在下用MLV 10A1Gag/Pol产生并且用VSV-G假型化(n＝4；如(B)中分析)。(F)在AZT存在下，用在鼠cGAS存在或不存在下产生的CCR5向性HIV-1病毒颗粒感染单核细胞后，DC中的CD86表达和IP-10产生(n＝4；如(B)中分析)。
图11.慢病毒介导的cGAMP转移由各种融合性包膜糖蛋白介导。(A)用滴定剂量的慢病毒颗粒感染单核细胞后，DC中的CD86表达和IP-10产生，其中所述慢病毒颗粒用流感(左图)或H5Na(右图)包膜蛋白假型化并且在cGAS不存在或存在下产生(n＝4)。(B)用滴定剂量的γ逆转录病毒颗粒感染单核细胞后，DC中的CD86表达和IP-10产生，其中所述γ逆转录病毒颗粒在cGAS存在或不存在下用MLV 10A1Gag/Pol产生并且用VSV-G假型化(n＝4)。(C)在AZT存在下，用在鼠cGAS存在或不存在下产生的CCR5向性HIV-1病毒颗粒感染单核细胞后，DC中的CD86表达和IP-10产生。(D)生产细胞和沉淀的上清液中的MLV Gag、VSV-G、cGAS和肌动蛋白的免疫印迹。(E)生产细胞和沉淀的上清液中的HIV-1Gag、VSV-G、cGAS和肌动蛋白的免疫印迹。
图12.病毒介导的在细胞之间转移cGAMP的模型。在病毒生产细胞中，cGAS产生cGAMP。cGAMP被包装到细胞外囊泡和病毒颗粒中。病毒颗粒可以与细胞膜有效融合并将cGAMP递送至靶细胞的细胞质。cGAMP继而又活化STING并且诱导先天性免疫反应。细胞外囊泡也可包装cGAMP，但靶细胞活化的效率低于融合性病毒颗粒。
图13.病毒颗粒转移cGAMP在生理学相关的cGAS表达水平下发生。(A)在通透化的PMA处理的THP-1细胞暴露于来自HeLa转染细胞的耐热benzonase抗性提取物和沉淀物质之后测量的I型IFN活性。HeLa细胞未转染，用空载体转染或用Gag/Pol表达载体和VSV-G表达载体转染。(n＝3)。(B)用如(A)中转染的HeLa细胞所产生的超速离心过滤物质刺激PMA处理的THP-1细胞以及可溶性IP-10产生定量(n＝3)。(C)在有或没有STING编码质粒的情况下，在IFN-β启动子控制下用荧光素酶报告质粒转染的293FT细胞。将细胞用滴定量的来自转染的HeLa细胞的超速离心物质刺激，使用脂质转染胺用合成的2'-3'cGAMP刺激或用编码组成性活性蛋白RIG-I N228的质粒转染。(n＝3)
图14.cGAMP含量定量和VLP的递送功效。(a)从MLV Gag VLP(将OVA表达为与Gag的C末端的框内融合物)和HIV Gag VLP进行的小分子提取，以及通过生物测定法用内部添加对照进行的cGAMP定量，包括所述内部添加对照是为了估计病毒制备物中的cGAMP含量。各点表示1:3稀释度。估计在最高剂量(浓缩制备物中的最终浓度：660ng/ml)下MLV Gag VLPcGAMP含量是100ng cGAMP的1/3；估计在最高剂量(浓缩制备物中的最终浓度：220ng/ml)下HIV Gag VLP cGAMP含量是100ng cGAMP的1/9。(b)用MLV Gag和HIV Gag病毒制备物感染来自两个独立供体的单核细胞。基于(a)中的生物测定法和用于cGAMP刺激的病毒制备物的估计cGAMP含量在x轴上表示，并且通过共刺激分子CD86的上调测量的单核细胞上的相应活性在y轴上显示。在诱导树突状细胞成熟方面，MLV Gag和HIV Gag VLP比与脂质转染胺复合的2'3'-cGAMP的效率高约1,000倍，并且比2'3'-cGAMP的效率高约10,000倍。
图15.含有特定抗原(图A至E)或不含特定抗原(图F至H)的cGAS-VLP的辅助性。(图15A)在连续3倍稀释的3种不同剂量下用含有cGAMP和Ova蛋白的VLP对小鼠进行皮下免疫接种。对照小鼠接受含有cGAMP且不含抗原的VLP，或与合成的cGAMP(10μg)(InVivogen)或CpG(40μg)(Trilink Technologies)(作为佐剂)一起施用的OVA蛋白(20μg)。(图15B)实验方案。首先对小鼠(6只/组)进行免疫接种，并且在11天后，分析血液中的免疫反应。在第14天，通过皮下移植B16-OVA黑素瘤肿瘤细胞，并且在11天后，分析小鼠血液中的免疫反应。(图15C)在VLP免疫接种之后通过IFN-g产生细胞测量和四聚体检测来分析CD8T细胞反应。将结果表示为各个小鼠的平均值±SEM。(图15D)接着在肿瘤移植之后通过测量IFN-g产生细胞来分析CD8反应。(图15E)各组肿瘤生长的独立曲线。(图15F)实验组接受3倍连续稀释的3种不同剂量的cGAMP-VLPS。对照小鼠接受PBS盐水溶液。(图15G)实验方案。首先向小鼠(7或8只/组)移植B16-OVA黑素瘤肿瘤，12天后肿瘤内注射cGAMP-VLP。10天后，分析血液中的免疫反应。(图15H)通过定量IFN-g产生细胞和四聚体检测来分析CD8T细胞反应。将结果表示为各个小鼠的平均值±SEM。
图16.cGAMP-VLP快速诱导IFN-β表达。(图16A)皮下注射PBS、Ova-cGAMP-VLP、cGAMP-VLP、Ova蛋白+cGAMP或Ova蛋白+CpG后3小时，血清中IFN-β的浓度。参见图15A。(图16B)肿瘤内注射PBS或cGAMP-VLP后3小时，血清中IFN-β的浓度。参见图15F。
图17.cGAMP-VLP中cGAMP的存在是在亚最佳抗原剂量下在体内诱导疫苗佐剂效应所需要的。(图17A)小鼠组和治疗的描述。基于通过ELISA测量的在VLP中含有的p30蛋白的量的定量来标准化VLP的注射剂量。(图17B)实验的概述。(图17C)利用ELISPOT通过IFN-g产生细胞测量的，如(B)中所述皮下注射后11天的Ova抗原特异性CD8T细胞反应。
具体实施方式
本发明涉及一种包含脂蛋白包膜的病毒样颗粒(VLP)，所述脂蛋白包膜包括病毒融合性糖蛋白，其中所述病毒样颗粒含有包装在所述病毒样颗粒中的环二核苷酸，特别是cGAMP，所述病毒样颗粒用于治疗受试者的癌症。
本发明还涉及包含脂蛋白包膜的带包膜的VLP用于将环二核苷酸、特别是cGAMP运载或递送到癌细胞的用途，所述脂蛋白包膜包括病毒融合性糖蛋白。
本发明还涉及一种制备含有环二核苷酸、特别是cGAMP并且包含脂蛋白包膜的带包膜的VLP的方法，所述脂蛋白包膜包括病毒融合性糖蛋白。
本发明最后涉及包含带包膜的VLP的病毒样颗粒用于诱导针对癌细胞的免疫反应的用途，所述带包膜的VLP包含包括病毒融合性糖蛋白的脂蛋白包膜，并且在VLP中含有环二核苷酸，特别是cGAMP。本发明涉及所述病毒样颗粒作为疫苗或疫苗佐剂的用途。因此，本发明涉及一种药物组合物或疫苗组合物，其包含含有环二核苷酸、特别是cGAMP并且包含逆转录病毒衣壳蛋白的带包膜的VLP。本发明涉及含有环二核苷酸、特别是cGAMP并且包含逆转录病毒衣壳蛋白的带包膜的VLP作为药物、特别是用于治疗癌症的用途。
本发明人显示，本发明的VLP适合于诱导肿瘤特异性T细胞反应，而直接施用cGAMP不能在高得多的cGAMP剂量下显著诱导这种反应。据显示，当与肿瘤抗基因组合使用时，cGAMP-VLP能够完全抑制肿瘤生长。
定义
编码序列：术语“编码序列”是指多核苷酸，其直接指定多肽的氨基酸序列。编码序列的边界通常由开放阅读框确定，开放阅读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
控制序列：术语“控制序列”是指编码本发明的酶的多核苷酸的表达所必需的核酸序列。相对于编码酶的多核苷酸，控制序列可以是天然的(即来自相同的基因)或异源的(即来自不同的基因和/或不同的物种)。优选地，控制序列是异源的。本领域技术人员目前使用的众所周知的控制序列是优选的。这些控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子以及转录和翻译终止信号。控制序列可具有连接子以用于引入特定的限制性位点，所述限制性位点促进控制序列与编码酶的多核苷酸的编码区的连接。控制序列和编码序列的功能性组合可被称为表达盒。
表达：术语“表达”包括多肽生产中所涉及的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
表达载体：术语“表达载体”是指线性或环状DNA分子，其包含编码本发明的酶的多核苷酸并且与为多核苷酸的表达所提供的控制序列可操作地连接。于是，表达载体包含适合于表达本发明的酶的表达盒。
重组体：重组体是指通过遗传工程改造产生的核酸构建体、载体和蛋白质。
异源：在宿主细胞、载体或核酸构建体的情况下，它表示通过遗传工程改造而被引入到宿主细胞、载体或核酸构建体中的环二核苷酸合酶的编码序列。在宿主细胞的情况下，它可以指环二核苷酸合酶的编码序列来源于与其所引入的细胞不同的来源(例如，人类相对于小鼠或小鼠相对于人类)。或者，它也可以指环二核苷酸合酶的编码序列来自与其所引入的细胞相同的物种，但由于其环境不是天然的，例如因为其受不是其天然启动子的启动子控制，或将其在不同于其天然位置的位置处引入，因此被认为是异源的。
核酸构建体：术语“核酸构建体”是指包含一个或多个控制序列的单链或双链核酸分子，其被修饰成以原本天然不存在的方式含有核酸区段，或其是合成的。
可操作地连接：术语“可操作地连接”是指如下配置，其中将控制序列置于相对于编码序列适当的位置处，使得控制序列指导编码序列的表达。
佐剂：在活性抗原的免疫接种中添加和/或共配制以提高或引发或调节针对活性抗原的体液和/或细胞介导的免疫反应的物质。优选地，佐剂还能提高或引发先天性免疫反应。
抗原：能引起细胞或体液免疫反应的结构。
治疗或疗法：旨在产生个体(例如哺乳动物，特别是人类)的病状的有益变化的过程。涵盖人类和兽医治疗两者。有益变化可以包括以下中的一种或多种：功能恢复，症状减少，疾病、病症或病状的限制或延迟，或者患者病状、疾病或病症的恶化的预防、限制或延迟。具体地，在本文中使用时，术语“治疗”是指如下免疫原性组合物的任何施用，其部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症和/或病状(例如病毒感染)的一种或多种症状或特征或所述疾病的易感性，延迟其发作，降低其严重性和/或降低其发生率。这种治疗可以是治疗未表现出相关疾病、病症和/或病状的征兆的受试者和/或仅表现出疾病、病症和/或病状的早期征兆的受试者。或者或另外，这种治疗可以是治疗表现出相关疾病、病症和/或病状的一种或多种确定征兆的受试者。在某些实施方式中，术语“治疗”是指对患者进行疫苗接种。
VLP或病毒样颗粒：类似于病毒，但无感染性。其不含任何野生型病毒遗传物质，并且更优选地任何病毒感染性遗传物质。病毒结构蛋白如包膜或衣壳的表达引起VLP的自组装。VLP可以是病毒体(即，没有衣壳的脂蛋白包膜)以及包含衣壳和脂蛋白包膜两者的VLP。
融合蛋白：指包括至少两个区段的多肽，这些区段不天然地包括在单个肽中。
治疗性活性剂或活性成分：指化学物质，其在施用于受试者时表现出治疗活性。作为非限制性实例，其包括抑制剂、配体(例如受体激动剂或拮抗剂)、辅因子、抗炎药(甾体和非甾体)、抗病毒药、抗真菌药、抗寄生虫药、抗精神病剂、镇痛剂、抗血栓剂、抗血小板剂、抗凝剂、抗糖尿病药、他汀类、毒素、抗微生物剂、抗组胺剂、代谢物、抗代谢剂、血管活性剂、血管扩张剂、心血管药、化疗剂、抗氧化剂、磷脂、抗增殖剂和肝素。
病毒样颗粒
本发明涉及一种包含脂蛋白包膜的病毒样颗粒(VLP)，所述脂蛋白包膜包括病毒融合性糖蛋白，其中所述病毒样颗粒含有包装在所述病毒样颗粒中的环二核苷酸。
病毒融合性糖蛋白可以是来自以下的糖蛋白或数种糖蛋白的组合：逆转录病毒科(包括慢病毒和逆转录病毒，例如α逆转录病毒、β逆转录病毒、γ逆转录病毒，δ逆转录病毒、ε逆转录病毒)、疱疹病毒科、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、丁型肝炎病毒、正粘病毒科、副粘病毒科、丝状病毒科、弹状病毒科、布尼亚病毒科或正痘病毒科(例如天花)。在一个优选方面中，病毒融合性糖蛋白来自黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、布尼亚病毒科或嗜肝DNA病毒科。在一个特定方面中，病毒融合性糖蛋白来自正粘病毒、弹状病毒科或逆转录病毒科。
更具体地，病毒融合性糖蛋白可以来自丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)(包括HIV-1和HIV-2)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、美洲狮慢病毒、牛免疫缺陷病毒(BIV)、杰姆布拉纳病病毒(Jembrana disease virus)、马感染性贫血病毒、维斯纳/梅迪病毒(Visna/maedi virus)、山羊关节炎脑炎病毒、猫白血病病毒(FeLV)、鼠白血病病毒(MLV)、牛白血病病毒(BLV)、人类T淋巴细胞病毒(HTLV，例如HTLV-1、-2、-3或-4)、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、禽肉瘤白血病病毒、新城疫病毒(ND)、登革热病毒(Dengue virus)、汉坦病毒(Hantaan virus)、A或B型流感病毒(例如H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3、H10N7、H7N9或其任何组合)、乙型肝炎病毒(HBV)、水泡性口腔炎病毒(VSV)、麻疹病毒(MV)、托高土病毒、疱疹病毒(包括HSV-1和HSV-2)、巨细胞病毒(CMV)、爱巴病毒(Epstein-Barr virus；EBV)、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)、埃博拉病毒(Ebola virus)或马尔堡病毒(Marburg virus)、墨莱溪谷脑炎病毒(Murray Valleyencephalitis virus)、呼吸道合胞病毒(RSV)、日本脑炎病毒、黄热病病毒、西尼罗河病毒(West Nile virus)。在一个非常特定的方面中，病毒融合性糖蛋白是来自以下的糖蛋白：HIV(人类免疫缺陷病毒)(包括HIV-1和HIV-2)、托高土病毒、奇昆古尼亚热病病毒(Chikungunya virus)、人类严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS CoV)和VSV(水泡性口腔炎病毒)。在一个特定实施方式中，病毒融合性糖蛋白是人类T淋巴细胞病毒，特别是HTLV-1、-2或-3。
在一个特定实施方式中，病毒融合性糖蛋白可以非穷举地选自：HBV的HBsAg(例如M-、S-或L-HBsAg)、HCV的E1和/或E2蛋白(例如WO2014/128568)、流感的HA(血球凝集素)和NA(神经氨酸酶)、VSV的糖蛋白G、埃博拉或马尔堡病毒的糖蛋白GP、慢病毒的糖蛋白Gp120(或其CD4结合结构域)和Gp41、登革热病毒的包膜蛋白(DENV E)和前膜蛋白(prM DENV)、汉坦病毒的两种包膜糖蛋白、奇昆古尼亚热病病毒的糖蛋白E2、新城病毒的糖蛋白HN和F、劳氏肉瘤病毒的gp85和gp37以及墨莱溪谷脑炎病毒的蛋白E和prM。病毒糖蛋白可以是野生型蛋白质的衍生物，例如通过截短(例如去除细胞质结构域)或通过引入突变产生的衍生物。
任选地，病毒糖蛋白可以与目的抗原或靶向部分融合或共价结合。
或者，脂蛋白包膜或VLP还可以包含其他目的蛋白例如抗原、靶向部分或免疫刺激性粘附分子和细胞因子，如膜结合的CD40配体(CD40L)、膜锚定的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，以提高VLP免疫原性。其还可以进一步包含鞭毛蛋白，特别是膜锚定的鞭毛蛋白，特别是与流感组合的鞭毛蛋白。
除病毒糖蛋白和衣壳蛋白之外，还可以包括在VLP中的抗原的非穷举清单。更具体地，VLP还可以包括来自以下的抗原：肿瘤相关抗原，如Her2/neu、CEA(癌胚抗原)、HER2/neu、MAGE2和MAGE3(黑素瘤相关抗原)、RAS、间皮素或p53；HIV，如Vpr、Vpx、Vpu、Vif和Env；细菌，如白色念珠菌(C.albicans)SAP2(分泌的天冬氨酰蛋白酶2)、艰难梭菌(Clostridiumdifficile)；寄生虫，如恶性疟原虫(P.falciform)蛋白，如CSP(环子孢子蛋白)，AMA-1(顶膜抗原-1)、TRAP/SSP2(子孢子表面蛋白2)、LSA(肝期抗原)、Pf Exp1(Pf输出蛋白1)、SALSA(Pf抗原2子孢子和肝期抗原)、STARP(子孢子富含苏氨酸和天冬酰胺的蛋白质)或WO2011/138251中公开的任何蛋白质。
带包膜的VLP可以包括数种、特别是两种或更多种不同的表位/抗原，所述表位/抗原选自(a)相同病毒的不同病毒株和/或(b)相同病毒的不同血清型和/或(c)特异性针对不同宿主的不同病毒株。本发明的不同病毒株是例如不同流感病毒株，例如A型流感病毒株H1N1、H5N1、H9N1、H1N2、H2N2、H3N2或H9N2，或B型流感病毒或C型流感病毒。不同的血清型是例如人类乳头瘤病毒(HPV)的不同血清型，例如血清型6、11、16、18、31、33、35、39、45、48、52、58、62、66、68、70、73和82，以及来自原致癌类型HPV 5、8、14、17、20和47或来自乳头瘤相关类型HPV 6、11、13、26、28、32和60。
例如，WO14068001公开了具有CMV表面蛋白的VLP。表面蛋白可以选自gpUL75(gH)、gpUL115(gL)、gpUL55(gB)、gpUL74(gO)、gpUL100(gM)、gpUL73(gN)、gpUL128、gpUL130和gpUL131A。VLP还可以包含CMV被膜(tegument)蛋白，如pUL83和pUL32。CMV蛋白可以来自选自以下的不同株：Towne、Toledo、AD169、Merlin、TB20和VR1814株。
在另一个实施例中，VLP包含HPV的L1蛋白或其抗原性片段。具体地，VLP至少包括来自HPV16和HPV18以及任选地来自HPV6和HPV11的L1蛋白。
在流感疫苗的情况下，VLP包含HA和NA表面蛋白。其可以进一步或替代地包括M1和/或M2蛋白，特别是M2的外部结构域。
本文公开的病毒样颗粒优选还包含衣壳。优选地，衣壳来自逆转录病毒科。逆转录病毒科包括慢病毒和逆转录病毒，例如α逆转录病毒、β逆转录病毒、γ逆转录病毒，δ逆转录病毒、ε逆转录病毒。例如，衣壳来自人类免疫缺陷病毒(HIV)(包括HIV-1和HIV-2)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、美洲狮慢病毒、牛免疫缺陷病毒(BIV)、山羊关节炎脑炎病毒、猫白血病病毒(FeLV)、鼠白血病病毒(MLV)、牛白血病病毒(BLV)、人类T淋巴细胞病毒(HTLV，例如HTLV-1、-2、-3或-4)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、禽肉瘤白血病病毒、马感染性贫血病毒、莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)。更优选地，逆转录病毒衣壳来自HIV或MLV(鼠白血病病毒)。
包装在所述病毒样颗粒中的环二核苷酸是普遍存在的小分子第二信使，其能够直接结合内质网驻留受体STING(干扰素基因刺激因子)并活化诱导I型干扰素和核因子κB(NFκB)依赖性炎性细胞因子表达的信号转导通路。其包括环二单磷酸腺苷(c-di-AMP)、环二单磷酸鸟苷(c-di-GMP)，更具体地c[G(2',5')pG(3',5')p]和c[G(3',5')pG(3',5')p]，以及环单磷酸鸟苷-单磷酸腺苷(cGAMP)，更具体地c[G(2',5')pA(3',5')p]和c[G(3',5')pA(3',5')p]。在一个优选实施方式中，VLP含有至少0.015ng/ml的cGAMP。
用于制备含有环二核苷酸的病毒样颗粒的方法。
本发明人惊讶地观察到，当相应的环二核苷酸合酶如cGAS、二鸟苷酸环化酶或二腺苷酸环化酶在细胞中与VLP的组分共表达时，可以制备含有环二核苷酸、特别是cGAMP的VLP。然而，本发明人确定VLP需要是带包膜的VLP。因此，本发明涉及一种制备含有环二核苷酸、特别是c-di-GMP、c-di-AMP或cGAMP的带包膜的病毒样颗粒的方法，所述方法包含在细胞中共表达环二核苷酸合酶如cGAS、二鸟苷酸环化酶或二腺苷酸环化酶和带包膜的病毒样颗粒的蛋白。
环二核苷酸合酶也称为二核苷酸环化酶，并且属于核苷酸转移酶超家族。其包括属于EC 2.7.7.86的环GMP-AMP合酶、属于EC 2.7.7.85的二腺苷酸环化酶和属于EC2.7.7.65的二鸟苷酸环化酶。
cGAS是环GMP-AMP合酶。最近已鉴定并表征了这个家族的数个成员，特别是鼠cGAS和人类cGAS(Wu等人,2012,Science,339,826-830；Sun等人,2012,Science,339,786-791)。UniprotKB ID No Q8N884中提及了人类cGAS。NCBI RefSeq中公开的参考序列对于氨基酸序列来说为NP_612450.2，并且对于mRNA序列来说为NM_138441.2。
UniprotKB ID No Q8C6L5中提及了鼠cGAS。NCBI RefSeq中公开的参考序列对于氨基酸序列来说为NP_775562.2，并且对于mRNA序列来说为NM_173386.4。
cGAS也已在牛、猪和霍乱弧菌(Vibrio cholera)血清型O1中充分表征(分别参见UniprotKB ID No E1BGN7、I3LM39和Q9KVG7)，并且还可以见于果蝇(Drosophila)(例如黑腹果蝇(D.melanogaster))、斑马鱼(zebrafish)(斑马担尼鱼(D.rerio))、安乐蜥(A.carolinensis)、大熊猫(A.melanoleuca)、意蜂(A.mellifera)、佛罗里达文昌鱼(B.floridae)、斗牛犬(C.lupus familiaris)、欧洲野马(E.caballus)、家猫(F.catus)、原鸡(G.gallus)、低地大猩猩(G.gorilla gorilla)、大乳头水螅(H magnipapillata)、肩突硬蜱(I.scapularis)、短翅芫菁(M.brevicollis)、家蝇(M.domestica)、野生火鸡(M.gallopavo)、恒河猴(M.mulatta)、海葵(N.vectensis)、金小蜂(N.vitrioennis)、鸭嘴兽(O.anatinus)、家养绵羊(O.aries)、家兔(O.cuniculus)、青鳉(O.latipes)、苏门达腊猩猩(P.abelii)、东非狒狒(P.anubis)、倭黑猩猩(P.paniscus)、黑猩猩(P.troglodytes)、褐家鼠(R.norvegicus)、袋獾(S.harrisii)、赤拟谷盗(T.castaneum)、斑胸草雀(T.guttata)和热带爪蟾(X.tropicalis)或非洲爪蟾(X.laevis)(Wu等人,2014,Nucleic AcidsResearch,42,8243-8257，其公开内容通过引用并入)。在一个优选实施方式中，使用编码人类或鼠cGAS的核酸序列。
环二核苷酸cGAMP可以是cGAMP(2'-3'-环GMP-AMP)或cGAMP(3'-3'-环GMP-AMP)。在第一实施方式中，cGAMP是cGAMP(2'-3'-环GMP-AMP)[也称为环[G(2',5')pA(3',5')p]；CAS号：1441190-66-4)。在第二实施方式中，cGAMP可以是cGAMP(3'-3'-环GMP-AMP)[也称为环A-P(3'-5')G-P(3'-5')；CAS号：849214-04-6]。
在一个优选实施方式中，使用人类或鼠cGAS来制备cGAMP(2'-3'-环GMP-AMP)。在另一个优选实施方式中，使用来自霍乱弧菌血清型O1的cGAS来制备cGAMP(3'-3'-环GMP-AMP)。
二腺苷酸环化酶是环二AMP合酶。其也可称为DisA(DNA完整性扫描蛋白)或CdaA。已经鉴定了这个家族的许多成员(参见Corrigan和Gründling,2013,Nature,11,513-524；其公开内容通过引用并入)。例如，二腺苷酸环化酶可以选自以下的酶：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(UniProt No P37573)、单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes)(UniProt No Q8Y5E4)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(UniProt No D5TK88)和海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(UniProt No Q9WY43)。
二鸟苷酸环化酶是环二GMP合酶。已经鉴定了这个家族的数个成员(参见Massie等人,2012,PNAS,109,12746-12751；其公开内容通过引用并入)。例如，二鸟苷酸环化酶可以选自以下的酶：海栖热袍菌(Thermotoga maritima)(UniProt No Q9X2A8)、Desulfotaleapsychrophila(UniProt No Q6ARU5)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)(UniProt No Q2GKF8)、大肠杆菌(E.coli)(UniProt No P0AA89)、霍乱弧菌(Vibriochloerae)(UniProt No Q9KPJ7)、弧形茎菌(Caulobacter vibrioides)(UniProt NoQ9A5I5)、荧光假单胞菌(UniProt No Q3K751或Q3KFC4)、除烃海杆菌(Marinobacterhydrocarbonoclasticus)(UniProt No A1U3W3)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)(Q9I4M8)。
环二核苷酸合酶还包含其保持环二核苷酸合成活性的变体。具体地，其包括具有标签部分(特别是可用于酶的纯化或固定的标签部分)的环二核苷酸合酶。这种标签是本领域技术人员公知的，例如His标签(His6)、FLAG标签、HA标签(来源于流感蛋白血细胞凝集素的表位)、麦芽糖结合蛋白(MPB)、MYC标签(来源于人类原癌蛋白MYC的表位)或GST标签(小谷胱甘肽-S-转移酶)。其还包括具有突变、特别是改善环二核苷酸合成活性的突变的变体。这些变体可以通过1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代、缺失和/或添加而变化。优选地，变体与野生型环二核苷酸合酶具有至少75、80、85、90、95或99％的同一性。变体可以通过本领域中公知的各种技术获得。具体地，用于改变编码野生型蛋白质的DNA序列的技术的实例包括但不限于定点诱变、随机诱变和合成寡核苷酸构建。
在本文中使用时，术语“序列同一性”或“同一性”是指来自两个多肽序列的对齐的位置的匹配(一致的氨基酸残基)数(％)。通过在对齐以便使重叠和同一性最大化并在同时使序列空位最小化时比较序列来确定序列同一性。具体地，序列同一性可以根据两个序列的长度使用许多数学全局或局部对齐算法中的任一种来确定。优选使用全局对齐算法(例如Needleman和Wunsch算法；Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol 48:443)来对齐类似长度的序列，所述算法在全部长度上最佳地对齐序列，而优选使用局部对齐算法(例如Smith和Waterman算法(Smith和Waterman,1981,Adv.Appl.Math.2:482)或Altschul算法(Altschul等人,1997,Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Altschul等人,2005,FEBSJ.272:5101-5109))来对齐具有基本上不同长度的序列。用于确定氨基酸序列同一性百分比的对齐可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如使用互联网网站如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/上可获得的公共可用计算机软件。本领域技术人员可以确定用于测量对齐的适当参数，包括在所比较序列的全长上实现最大对齐所需的任何算法。出于本文的目的，氨基酸序列同一性％值是指使用逐对序列对齐程序EMBOSS Needle产生的值，EMBOSS Needle使用Needleman-Wunsch算法来产生两个序列的最佳全局对齐，其中所有搜索参数被设置为默认值，即评分矩阵＝BLOSUM62，空位开放＝10，空位延长＝0.5，末端空位罚分＝错误，末端空位开放＝10以及末端空位延长＝0.5。
环二核苷酸合酶编码序列在核酸构建体中，该核酸构建体包括该环二核苷酸合酶在细胞中表达的所有必需元件，特别是在宿主细胞中转录和翻译所需的元件。优选地，环二核苷酸合酶编码序列在细胞中过表达。因此，环二核苷酸合酶编码序列的编码序列受强启动子如启动子PGK、CMV、泛素、MHC-II、β2-微球蛋白、CAG、SV40、SFFV LTR、EF1a、逆转录病毒LTR的控制。
类似地，带包膜的病毒样颗粒的蛋白、特别是包膜的糖蛋白和衣壳蛋白的编码序列被包含在核酸构建体中，该核酸构建体包括所述蛋白质在细胞中表达的所有必需元件，特别是在宿主细胞中转录和翻译所需的元件。
细胞中环二核苷酸合酶的编码序列可以是游离的，例如在表达载体中，或可以并入细胞的染色体中。任选地，环二核苷酸合酶的编码序列可以在与包含带包膜的病毒样颗粒的蛋白的编码序列的载体不同的表达载体中。或者，环二核苷酸合酶的编码序列和带包膜的病毒样颗粒的蛋白的编码序列被包含在同一个表达载体中。
因此，当环二核苷酸合酶的编码序列和带包膜的病毒样颗粒的蛋白的编码序列不被包含在同一个表达载体或构建体中时，本发明涉及核酸构建体或表达载体的组合或试剂盒，其包含：至少一种包含编码环二核苷酸合酶的序列的核酸构建体或表达载体，以及一种包含编码带包膜的病毒样颗粒的至少一种蛋白、特别是包膜糖蛋白和/或衣壳的序列的核酸构建体或表达载体。
本发明涉及一种核酸构建体或表达载体，其包含编码环二核苷酸合酶的序列和编码病毒融合性糖蛋白的序列和/或编码衣壳、特别是来自逆转录病毒科的衣壳的序列。优选地，核酸构建体或表达载体包含编码衣壳、特别是来自逆转录病毒科的衣壳的序列和编码病毒融合性糖蛋白的序列。融合性糖蛋白、环二核苷酸合酶和衣壳可以是上面所描述的任一种。在一个优选实施方式中，核酸构建体或表达载体包含编码cGAS的序列，所述序列特别是受强启动子的控制。任选地，核酸构建体或表达载体还可以包含编码抗原或目的蛋白或目的核酸(siRNA、miRNA、反义核酸等)的序列。
可用于本发明的表达载体非穷举地包括真核表达载体，特别是哺乳动物表达载体；基于病毒的表达载体；杆状病毒表达载体；植物表达载体和质粒表达载体。合适的表达载体可以来源于病毒，如杆状病毒、乳多泡病毒(如SV40)、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒和逆转录病毒、特别是慢病毒、或其组合。
任何真核细胞都可以用于所述方法中。例如，用于生产的细胞可以是哺乳动物细胞，例如COS-1细胞、CHO(中国仓鼠卵巢)(US 4,889,803；US 5,047,335)、HEK(人类胚肾)细胞系如293和293T细胞系和HL-116细胞系、Vero细胞系、BHK(幼仓鼠肾)细胞系；植物细胞(例如烟草(N.bethamiana))；昆虫细胞，如来源于草地夜蛾(Spodoptera frugiperda；Sf)的细胞(如Sf-9细胞)、SF21、Hi-5、Express Sf+和S2Schneider细胞，特别是杆状病毒-昆虫细胞表达系统；禽细胞。
本发明涉及包含上述核酸构建体或表达载体的重组宿主细胞。
本发明涉及一种用于产生如上所述的病毒样颗粒的方法，所述病毒样颗粒包含包装在所述病毒样颗粒中的环二核苷酸，其中所述方法包含：
在允许环二核苷酸和病毒融合性糖蛋白在真核宿主细胞中合成和产生活性的条件下，在所述细胞中共表达环二核苷酸合酶和病毒融合性糖蛋白；和
回收由所述细胞产生的病毒样颗粒。
优选地，宿主细胞还共表达来自逆转录病毒科的衣壳。融合性糖蛋白、环二核苷酸合酶和衣壳可以是上述蛋白质中的任一种。
在一个特定实施方式中，该方法还可以包含将编码病毒融合性糖蛋白的核酸构建体或表达载体引入宿主细胞中的初步步骤。其还可以包含将编码环二核苷酸合酶的核酸构建体或表达载体和/或编码衣壳蛋白的核酸构建体或表达载体引入宿主细胞中。在一个优选实施方式中，该方法包含通过转染将双链DNA、特别是通过转染将核酸构建体或表达载体引入宿主细胞中的步骤。
在一个优选实施方式中，环二核苷酸合酶是cGAS，特别是人类或鼠cGAS，更优选是鼠cGAS。在另一个实施方式中，环二核苷酸合酶是来自霍乱弧菌血清型O1的cGAS。
用于产生VLP的方法是本领域技术人员公知的(Zeltins,2013,Mol Biotechnol,53,92-107，其公开内容通过引用并入本文中)：特别是在杆状病毒表达系统中(Liu等人,2013,Protein Exper Purif,90,104-116；Sokolenko等人,2012,Biotechnol Adv,30,766-81；Vicente等人,2011,J Invertebr Pathol,107增刊,S42-48；其公开内容通过引用并入本文中)；在植物中(Scotti和Rybicki,2013,Expert Rev Vaccines.,12,211-24；Chen和Lai,2013,Hum Vaccin Immunother.,9,26-49；其公开内容通过引用并入本文中)，在禽表达系统中。实际上，数种基于VLP的疫苗已经可购得。关于综述，请参考例如Kushnir等人(2012,Vaccine,31,58-83)以及Grgacic和Anderson(2006,Methods,40,60-65)；其公开内容通过引用并入本文中。
可以根据任何已知技术如离心、色谱法等回收和/或纯化产生的VLP。
本发明涉及作为药物或疫苗佐剂的上述病毒样颗粒。本发明涉及上述病毒样颗粒用于制造药物或疫苗、特别是针对癌症的药物或疫苗的用途。所以，本发明涉及一种药物组合物、疫苗组合物或兽医用组合物，其包含本文所公开的病毒样颗粒和药学上可接受的载体或赋形剂。组合物还可以包含佐剂。组合物还可以包含一种或多种其它治疗活性物质或与一种或多种其它治疗活性物质组合施用。
本发明涉及用作药物或疫苗佐剂的本文所公开的表达载体或其组合。实际上，可以向受试者施用表达载体，并且在表达载体在受体细胞中表达时，所述细胞在体内产生上述病毒样颗粒。因此，本发明涉及一种药物组合物、疫苗组合物或兽医用组合物，所述组合物包含表达载体或其组合以及药学上可接受的载体或赋形剂。本发明涉及上述表达载体或其组合用于制造药物或疫苗、特别是针对癌症的药物或疫苗的用途。表达载体或其组合包含产生本文所公开的VLP所必需的蛋白质的编码序列。
类似地，上述宿主细胞也可用作疫苗佐剂或疫苗。实际上，当将这些宿主细胞施用于受试者时，所述宿主细胞在体内产生上述病毒样颗粒。在这种情况下，宿主细胞可以是来自接受受试者的细胞，所述细胞在施用前已经被遗传工程改造，或者宿主细胞是与受试者相容的宿主细胞。因此，本发明涉及一种药物组合物、疫苗组合物或兽医用组合物，其包含宿主细胞和药学上可接受的载体或赋形剂。本发明涉及上述宿主细胞用于制造药物或疫苗、特别是针对癌症的药物或疫苗的用途。宿主细胞能够产生本文所公开的VLP。
本发明的药物组合物可以另外包含药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂在本文中使用时可以是或包含适合于期望的特定剂型的溶剂、分散介质、稀释剂或其他液体媒介物、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等。《雷明顿：药学科学与实践(Remington's The Science and Practice of Pharmacy)》,第21版,A.R.Gennaro,(Lippincott,Williams&Wilkins,Baltimore,MD,2006)公开了用于配制药物组合物的各种赋形剂和用于制备药物组合物的已知技术。除非任何常规赋形剂介质与物质或其衍生物不相容，例如因为产生任何不期望的生物学效应或以有害方式与药物组合物的任何其他组分相互作用，否则其使用被认为落在本发明的范围内。药学上可接受的赋形剂可以是防腐剂、惰性稀释剂、分散剂、表面活性剂和/或乳化剂、缓冲剂等。合适的赋形剂包括例如水、盐水、右旋糖、蔗糖、海藻糖、甘油、乙醇等以及其组合。此外，如果需要的话，疫苗可以含有辅助物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂或提高疫苗有效性的佐剂。在一些实施方式中，药物组合物包含一种或多种防腐剂。在一些实施方式中，药物组合物不包含防腐剂。
本文所公开的药物组合物可以包含佐剂。根据本发明可以使用任何佐剂。已知大量佐剂；许多这些化合物的有用概要由美国国立卫生研究院(National Institutes ofHealth)制订并且可以找到所述概要(www.niaid.nih.gov/daids/vaccine/pdf/compendium.pdf)。还参见Allison(1998,Dev.Biol.Stand.,92:3-11；通过引用并入本文中)，Unkeless等人(1998,Annu.Rev.Immunol.,6:251-281；通过引用并入本文中)和Phillips等人(1992,Vaccine,10:151-158；通过引用并入本文中)。本领域中已知数百种不同的佐剂并且其可以用于本发明的实践中。可根据本发明使用的示例性佐剂包括但不限于细胞因子、凝胶型佐剂(例如氢氧化铝、磷酸铝、磷酸钙等)；微生物佐剂(例如包括CpG基序的免疫调节性DNA序列；内毒素，如单磷酰脂质A；外毒素，如霍乱毒素、大肠杆菌热不稳定毒素和百日咳毒素；胞壁酰二肽等)；基于油乳剂和乳化剂的佐剂(例如弗氏佐剂(Freund'sAdjuvant)、MF59[Novartis]、SAF等)；颗粒佐剂(例如脂质体、可生物降解的微球、皂苷等)；合成佐剂(例如非离子嵌段共聚物、胞壁酰肽类似物、聚磷腈、合成多核苷酸等)；和/或其组合。其它示例性佐剂包括一些聚合物(例如聚磷腈；描述于美国专利5,500,161中，该专利通过引用并入本文中)、Q57、QS21、角鲨烯、四氯十氧化物等。先前已在上文标题为“药物组合物”的部分中更详细描述了药学上可接受的赋形剂。
药物组合物可以任选地包含一种或多种其它治疗活性物质，特别是抗原(例如上文所公开的)，和/或与所述一种或多种其它治疗活性物质组合施用。
本文所公开的药物组合物可用于诱导或提高免疫反应。本发明涉及一种用于诱导或提高有需要的受试者的免疫反应的方法，所述方法包含施用治疗有效量的本文所公开的药物组合物。
免疫反应可以指细胞免疫、体液免疫或可以包括两者。免疫反应也可能限于免疫系统的一部分。例如，在某些实施方式中，免疫原性组合物可以诱导增加的IFNγ反应。在某些实施方式中，免疫原性组合物可以诱导粘膜IgA反应(例如在鼻和/或直肠洗液中所测量的)。在某些实施方式中，免疫原性组合物可以诱导全身性IgG反应(例如在血清中所测量的)。在某些实施方式中，免疫原性组合物可以诱导病毒中和性抗体或中和性抗体反应。在某些实施方式中，免疫原性组合物可以诱导CTL反应。
因此，所述药物组合物或兽医用组合物可用作疫苗或疫苗佐剂。其还可用于治疗癌症。本发明涉及一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包含施用治疗有效量的本文所公开的药物组合物。
癌症可以选自包含以下的非穷举清单：卵巢癌、宫颈癌、乳癌、前列腺癌、恶性黑色素瘤、肾癌、膀胱癌、结肠直肠癌或结肠癌、淋巴瘤、胰腺癌、肺癌、胶质母细胞瘤、胶质瘤、甲状腺癌、头颈癌、肝癌、骨髓瘤、急性骨髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、非霍奇金氏淋巴瘤(non-Hodgkin's lymphoma)、神经母细胞瘤、胃癌和肉瘤。
在本文中使用时，术语“疫苗接种”是指施用旨在产生例如针对致病因子(例如病毒)的免疫反应的组合物。出于本发明的目的，疫苗接种可以在暴露于致病因子之前、期间和/或之后施用，并且在某些实施方式中，在暴露于所述因子之前、期间和/或之后不久施用。在一些实施方式中，疫苗接种包括多次施用疫苗接种组合物，所述多次施用在时间上适当地间隔开。
在本文中使用时，术语“治疗有效量”是指足以在适用于任何医疗的合理利益/风险比下对所治疗的受试者提供治疗效果的量。治疗效果可以是客观的(即可通过一些测试或标志物测量)或主观的(即受试者给出效果的指示或感觉到效果)。具体地，“治疗有效量”是指治疗性蛋白质或组合物的如下量，其有效治疗、改善或预防期望疾病或病状，或表现出可检测的治疗或预防效果，例如通过改善与疾病相关的症状、预防或延迟疾病的发作和/或还减轻疾病症状的严重性或频率来实现的。治疗有效量通常以可包含多个单位剂量的给药方案施用。对于任何特定的免疫原性组合物，治疗有效量(和/或有效给药方案内的适当单位剂量)可以变化，例如根据施用途径、与其他药剂的组合而变化。此外，任何特定患者的特定治疗有效量(和/或单位剂量)可取决于多种因素，包括所治疗的病症和病症的严重性；所用特定药剂的活性；使用的特定组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；施用时间、施用途径和/或所用特定免疫原性组合物的排泄或代谢速率；治疗的持续时间；以及医学领域中公知的类似因素。
在本文中使用时，术语“改善”是指预防、减少或减轻病态，或改善受试者的病态。改善包括但不需要完全恢复或完全预防疾病、病症或病状。术语“预防”是指延迟疾病、病症或病状的发作。当疾病、病症或病状的发作已被延迟预定时段时，可以认为是完全预防。
在本文中使用时，术语“剂型”和“单位剂型”是指用于待治疗患者的治疗剂的物理离散单位。每个单位含有经计算可产生期望治疗效果的预定量的活性物质。然而，应理解，组合物的总剂量由主治医师在合理的医学判断范围内决定。
在本文中使用时，术语“给药方案”(或“治疗方案”)是一组单位剂量(通常多于一个)，所述单位剂量通常相隔一段时间而分开地施用于受试者。在一些实施方式中，给定的治疗剂具有推荐的给药方案，其可以包括一个或多个剂量。在一些实施方式中，给药方案包含多个剂量，每个剂量彼此相隔相同长度的时间段；在一些实施方式中，给药方案包含多个剂量和分隔各个剂量的至少两个不同时间段。
在本文中使用时，术语“受试者”、“个体”或“患者”是指人类或非人类哺乳动物受试者。治疗的个体(也称为“患者”或“受试者”)是患有癌症的个体(胎儿、婴儿、儿童、青少年或成人)。在一些实施方式中，受试者是人类。在一些其他实施方式中，受试者是动物，尤其是宠物(例如猫和狗)、农场动物(例如牛、猪、绵羊、兔、猪、鱼、家禽)、马。
药物组合物、兽医用组合物或疫苗组合物可以通过任何便利的施用途径施用或适合于通过任何便利的施用途径施用。例如，涵盖的途径是皮下、肌肉内、粘膜(例如舌下、鼻内、直肠内、阴道内或支气管内)、静脉内或肿瘤内途径。优选的施用途径是肿瘤内和全身施用，例如静脉内施用。然而，在优选的实施方式中，涵盖的途径是肿瘤内。
例如，本文提供的药物组合物可以以无菌可注射形式(例如适合于皮下注射或静脉内输注的形式)提供。例如，在一些实施方式中，药物组合物以适合于注射的液体剂型提供。在一些实施方式中，药物组合物作为粉末(例如冻干和/或灭菌粉末)，任选地在真空下提供，其在注射前用水性稀释剂(例如水、缓冲液、盐溶液等)重构。在一些实施方式中，药物组合物用水、氯化钠溶液、乙酸钠溶液、苯甲醇溶液、磷酸盐缓冲盐水等稀释和/或重构。在一些实施方式中，应将粉末与水性稀释剂轻轻混合(例如不振荡)。
药物组合物可以以可冷藏和/或冷冻的形式提供。或者，其可以以不能冷藏和/或冷冻的形式提供。任选地，重构的溶液和/或液体剂型可以在重构后存储一段时间(例如2小时、12小时、24小时、2天、5天、7天、10天、2周、1个月、两个月或更长时间)。
本文所述药物组合物的制剂可通过药理学领域中已知或之后开发的任何方法制备。这些制备方法包括如下步骤：将活性成分与一种或多种赋形剂和/或一种或多种其它辅助成分结合，然后在必要和/或需要时，将产物成形和/或包装成期望的单个或多个剂量单位。
根据本发明的药物组合物可以作为单一单位剂量和/或多个单一单位剂量大量制备、包装和/或销售。
根据本发明的药物组合物中活性成分、药学上可接受的赋形剂和/或任何其他成分的相对量可以根据所治疗受试者的身份、身材和/或病状和/或根据组合物的施用途径而变化。例如，组合物可以包含0.1％至100％(w/w)活性成分。
本文所述的组合物通常以诱导免疫反应所必需的量和时间或足以诱导免疫反应的量和时间施用。给药方案可以由单个剂量或一段时间内的多个剂量组成。待施用的免疫原性组合物(例如VLP)的准确量可以因受试者而异，并且可取决于数种因素。因此，应理解，通常，所使用的精确剂量由处方医师确定，并且不仅取决于受试者的重量和施用途径，而且取决于受试者的年龄和症状的严重性和/或感染的风险。在第一方面，特定量的药物组合物作为单个剂量施用。或者，特定量的药物组合物作为超过一个的剂量施用(例如相隔1-12个月的1-3个剂量)。替代地，特定量的药物组合物作为单个剂量数次施用(例如相隔1-12个月的1-3个剂量)。药物组合物可以初始剂量和至少一个加强剂量施用。
本文公开的方法可用于兽医应用，例如犬科动物和猫科动物应用。在需要时，本文的方法也可以与农场动物一起使用，如绵羊、禽、牛、猪和马品种。
实施例
实施例1
本发明人显示，当在cGAS表达细胞中产生慢病毒颗粒时，cGAMP可以被并入慢病毒颗粒中。cGAMP转移至感染细胞中并触发STING依赖性I型干扰素(IFN)诱导。
这种效应不依赖于逆转录和整合，并且可以加速抗病毒反应并拓宽其中IFN被诱导的细胞谱。
结果
在感染细胞中触发cGAS依赖性IFN反应的病毒包含逆转录病毒，包括人类免疫缺陷病毒(HIV)。据认为，对HIV的反应涉及cGAS检测到逆转录后产生的病毒cDNA，从而在发生cDNA检测的相同细胞中引起IFN基因转录。然而，可以想到的是，如果感染性病毒在其中携带cGAMP第二信使，则逆转录病毒感染后的IFN诱导也可以独立于逆转录或cGAS而发生。本发明人假设cGAMP可以被包装到HIV-1颗粒中并在新感染的细胞中引发IFN反应，而不依赖于所述细胞的cGAS表达，从而增强了先天性抗病毒免疫。
为了测试这一想法，本发明人在293T细胞中产生了基于HIV-1的慢病毒载体，293T细胞是一种不表达cGAS的人类细胞系。用水泡性口腔炎病毒糖蛋白(VSV-G)将病毒颗粒假型化，并且病毒基因组在env开放阅读框中含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)。这些病毒(下面称为HIV-1-GFP)由于缺乏功能性env而无法复制。除了病毒产生所需的两种质粒(pNL4-3-ΔE-EGFP和pVSV-G)之外，将一些293T细胞用野生型m-cGAS或催化失活的m-cGAS-G198A/S199A(m-cGAS-AA)的表达构建体共转染(Sun等人,2013,Science,339,786-791)。然后使用滴定的病毒储液感染新鲜的HEK293细胞(图1A)，其表达内源性STING(图2A)并对cGAMP作出响应而诱导IFN(图2B)。从cGAS表达细胞收集的HIV-1-GFP触发IFNβ启动子报告基因的诱导，而在不存在外源cGAS或存在突变cGAS的情况下产生的病毒则没有(图1B)。接着，发明人通过将来自感染细胞的上清液转移至报告细胞系(HEK293-ISRE-luc)来分析IFN分泌，其中萤火虫荧光素酶表达由干扰素刺激的反应元件驱动(图2C)。在cGAS表达细胞中产生的病毒储液触发IFN分泌，而对照病毒则没有(图1C)。这些病毒储液的感染性是相当的(图1C)，并且野生型和突变cGAS在病毒生产细胞中以类似的水平表达(图2D)。此外，当病毒生产细胞中存在cGAS时，感染细胞特异性地诱导IFNβ、IFI44和IFIT1mRNA，从而进一步证实IFN和干扰素刺激基因(ISG)的诱导(图1D)。本发明人接着感染了原代的小鼠骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)。在用cGAS重构的293T细胞中所产生的HIV-1-GFP感染的BMDM中，IFN和ISG的诱导增加(图1E、F)。STING缺陷型BMDM不会对相同的病毒制备物作出响应而诱导IFN和ISG，但由仙台病毒(Sendai virus)感染触发的RIG-I依赖性IFN产生是正常的(图1E、F)。
为了排除新鲜感染的细胞产生IFN是因为质粒DNA或可溶性因子的转移的可能性，本发明人用DNA酶处理病毒制备物或通过离心沉淀病毒粒子。两种处理均未影响cGAS表达细胞中产生的HIV-1-GFP诱导IFN的能力(图3A、B)。此外，靶细胞中的IFN反应不依赖于逆转录和整合，如分别用奈韦拉平(nevirapine)和雷特格韦(raltegravir)进行药理学抑制所显示的(图3C)。此外，当从表达cGAS的生产细胞中收集时，缺乏病毒RNA基因组的病毒样颗粒在靶细胞中诱导IFN(图3D)，从而证实在这种情形下的IFN诱导既不是因为病毒基因组，也不是因为其逆转录产物。用托高土病毒糖蛋白取代VSV-G不会减少来自cGAS表达细胞的病毒储液的IFN诱导特性，从而证实这些效应与VSV-G假型化无关(图3E)。HIV-1-GFP储液可能含有外来体和其他带包膜的囊泡，如凋亡体。在病毒制备期间用外来体抑制剂GW4869(Li等人,2013,Nat Immunol,14,793-803)或半胱天冬酶抑制剂Ac-DEVD-CHO处理cGAS重构的生产细胞不会减少HIV-1-GFP的IFN诱导(图3F)，这与病毒粒子中存在IFN诱导活性的想法一致。
接着，本发明人制备了来自病毒制备物的小分子提取物。在这个方案的过程中，蛋白质和核酸被降解和去除。将病毒提取物添加到用毛地黄皂苷轻度通透化的PMA分化的THP1细胞中，并且发明人分析了IFN分泌(图4A)。来自从野生型cGAS重构的生产细胞收集的HIV-1-GFP的提取物以剂量依赖性方式诱导THP1细胞的IFN分泌(图4B)。用切割cGAMP的蛇毒磷酸二酯酶I预温育提取物消除了这种效应(图4C)。为了进一步测试cGAMP是否存在于慢病毒颗粒中，本发明人用生物素标记的cGAMP转染病毒生产细胞。将沉淀的病毒储液点在尼龙膜上，然后用链亲和素探测。生物素-cGAMP确实可在病毒制备物中检测到(图4D)。cGAMP并入病毒颗粒中是一种选择性过程或基于扩散仍有待确定。HIV-1的脂质包膜可能在病毒颗粒从感染细胞出芽后包含病毒颗粒中的cGAMP。与这种概念一致的是，在cGAS重构的细胞中产生的无包膜腺病毒在新感染的细胞中不诱导IFN(图2E、F)。
合在一起，这些数据显示cGAMP可以被包装到带包膜的慢病毒病毒粒子中并通过STING在新感染的细胞中诱导IFN。这些结果对基因疗法和疫苗接种具有意义，因为在通常在cGAS缺陷型293T细胞中产生的慢病毒载体中并入cGAMP，在前一种情况下可能是不需要的，但在后一种情况下是有利的。实际上，含有cGAMP的病毒储液在没有Vpx递送的情况下在人类树突状细胞中有效诱导了IFN和共刺激分子CD86的表达(图5)。
cGAS通路的独特特征在于使用小的可扩散分子cGAMP，并且这对诱导先天性免疫反应具有重要意义。例如，cGAMP可以从病毒感染的细胞跨过间隙连接点扩散到邻近的未感染细胞中，在所述未感染细胞中通过STING诱导抗病毒状态。在本文中，本发明人显示cGAMP可以另外包装到HIV-1颗粒中，并且靶细胞的感染导致cGAMP递送到细胞质中并随后触发TING。这种特洛伊木马(Trojan horse)机制有效地允许感染细胞将其存在感染的消息传递给其他细胞。这可以用于拓宽引发IFN反应的细胞谱，因为通过cGAMP转移进行病毒传感并不需要逆转录，所述逆转录在一些细胞中被SAMHD1抑制。另外，病毒颗粒中cGAMP的转移可以加速IFN反应。最后，容易推测其他带包膜的病毒在其病毒粒子中携带cGAMP。总之，本发明人鉴定了一种在细胞之间传递先天性免疫的信号的新机制。
材料和方法
质粒
已在别处描述了FLAG-m-cGAS、FLAG-m-cGAS-G198A/S199A和m-Sting-HA pcDNA构建体(Sun等人,2013,Science,339,786-791；Burdette等人,2011,Nature,478,515-518)。pNL4-3-ΔE-EGFP来自NIH AIDS试剂项目。pCAAGS-THOV-G来自G.Kochs。pGreenFire-ISRE购自System Biosciences。以前已描述了pSIV4+、pVSV-G、p125-F-Luc和pRL-TK(Rehwinkel等人,2013,EMBO J,32,2454-2462；Rehwinkel等人,2010,Cell,140,397-408)。
细胞
如所描述的，使用20％L929上清液从新鲜骨髓获得BMDM(Rehwinkel等人,2013,EMBO J,32,2454-2462)。从具有40ng/ml GM-CSF和40ng/ml IL-4(Peprotech)5天的CD14+单核细胞获得人类树突状细胞。根据DC-SIGN染色，树突状细胞的纯度>95％。使用MACS分离柱和CD14微珠(Miltenyi)从PBMC分离CD14+单核细胞。使用lymphoprep(Alere,UK)从CD白细胞锥(NHS Blood&Transplant,Bristol,UK)收获PBMC。使HEK293细胞和293T细胞在DMEM培养基中生长。使THP1细胞、BMDM和人类树突状细胞在RPMI 1640培养基中生长。所有培养基含有10％FCS和2mM谷氨酰胺。另外将100单位/ml青霉素、100mg/ml链霉素和50μM 2-巯基乙醇添加到用于BMDM和人类树突状细胞的RPMI培养基中。
抗体、Western印迹和FACS
α-hSTING抗体来自Cell Signaling(目录号3337s；1:1000)，并与HRP偶联的第二抗体(GE Healthcare Life Science；目录号NA934；1:5000)一起用于Western印迹。α-FLAG和α-肌动蛋白HRP结合的抗体来自Sigma(目录号A8592，1:5000，和A3854，1:10,000)。α-CD86PE(克隆IT2.2)和α-CD209(DC-SIGN)APC(克隆eB-h209)来自eBioscience。使用1μg/mlDAPI(Sigma Aldrich)来排除死细胞。在Beckmann Coulter CyAn或BD BiosciencesLSRFortessa细胞分析仪上获取FACS数据。
小鼠
之前已经描述了STING缺陷型(Mpys-/-)动物(Jin等人,2011,The Journal ofImmunology,187,2595-2601)并且所述动物是在C57BL/6背景下。从2-3月龄的人道杀死的动物并从年龄和性别匹配的C57BL/6野生型对照动物获得股骨和胫骨。根据英国动物(科学程序)法案1986和动物护理的机构指南进行这项工作。这项工作得到了英国内政部(UKHome Office)授予的项目许可证(PPL No.40/3583)的批准，还得到了牛津大学的机构动物伦理委员会审查委员会(Institutional Animal Ethics Committee Review Board atthe University of Oxford)的批准。
IFN生物测定法
通过用来源于pGreenFire-ISRE的慢病毒转导HEK293细胞产生人类IFN报告细胞。通过有限稀释建立单克隆，并基于对IFN的反应性而选择克隆3C11。对于生物测定法，用细胞培养物上清液覆盖细胞，并且在24小时后，使用One-Glo荧光素酶测定系统(Promega)根据制造商的说明书来定量荧光素酶表达。如图2C所示，生物测定法的检测限为1.6U/mlhIFNα2(R&D systems)。
RT Q-PCR
已经描述了从细胞中提取RNA、逆转录和定量PCR(Rehwinkel等人,2013,EMBO J,32,2454-2462)。含有用于人类18S rRNA、IFNβ、IFI-44和IFIT1以及用于鼠GAPDH、IFIT1和IFI-44的引物和荧光探针的预先开发的Taqman测定试剂来自Applied Biosystems。
HIV-1-GFP产生
在使用FuGene HD(Promega，目录号E2311)以2:1:2的比率用pNL4-3-ΔE-EGFP、pVSV-G和m-cGAS(或m-cGAS-AA)转染的293T细胞中产生VSV-G假型化HIV-1-GFP。用pCAAGS-THOV-G代替VSV-G并使用1:1:1的质粒比来产生THOV-G假型化病毒。第二天更换培养基。此时，在一些实验中添加DEVD(60μM；A0835，Sigma)和GW4869(20μM；D1692，Sigma)。再过48小时后，过滤上清液(0.22μm)，并且在需要时，通过在20％蔗糖垫上离心(64,000g，2.5小时，4℃)而进行浓缩。通过用稀释系列的病毒储液感染293T细胞，然后进行GFP表达的FACS分析，将病毒滴度测定为感染单位/毫升。
如上在使用FuGene HD以2:1:1.6的比率用pNL4-3-ΔE-EGFP、pVSV-G和生物素-cGAMP(Biolog，目录号157-001)转染的293T细胞中产生含有生物素-cGAMP的HIV-1-GFP。
通过以2:1:2的比率用pSIV4+(Vpx缺陷型)、pVSV-G和m-cGAS或m-cGAS-AA转染293T细胞来产生VLP。第二天更换培养基。再过48小时后，收集VLP并且所述VLP作为HIV-1-GFP进行处理(见上文)。
HIV-1-GFP感染
将105个HEK293接种在24孔中。24小时后，在聚凝胺(8μg/ml)存在下添加病毒储液。18小时后更换培养基。再过48至72小时后，收集上清液和细胞，分别用于IFN生物测定法和FACS分析或RT Q-PCR分析。
对于IFNβ启动子报告基因测定来说，另外使用脂质转染胺2000用125ng p125-F-Luc和用25ng pRL-TK转染细胞。这在感染前6-8小时完成。感染后24小时分析荧光素酶活性，并将F-Luc活性标准化为R-Luc。
在一些实验中，在感染之前用奈韦拉平(5μM；目录号4666；NIH AIDS试剂项目)或雷特格韦(5μM；目录号11680；NIH AIDS试剂项目)将细胞处理1小时。或者，在感染之前，用DNA酶I(40μg/ml；Roche，11284932001)在37℃下预处理病毒储液或cGAS质粒1小时。
将4-8×105个BMDM接种在12孔中，并且在O/N温育后，通过旋转感染(1100g；90min；室温)在聚凝胺(8μg/ml)存在下进行感染。然后取出接种物并添加新鲜培养基。24小时后收获上清液和细胞。如(Rehwinkel等人,2013,EMBO J,32,2454-2462)中所述，通过ELISA检测mIFNα。
将0.5×105个人类树突状细胞接种在24孔中，并在聚凝胺(8μg/ml)存在下感染2小时。洗去接种物，并且用新鲜培养基培养细胞48小时。收获细胞用于FACS分析，并用IFN生物测定法测试上清液。
腺病毒
在使用FuGene HD用m-cGAS或m-cGAS-AA转染的HEK293细胞中或在未转染细胞中产生腺病毒。转染后2小时，用MOI为1的AdenoCreGfp病毒(目录号1700，Vector Biolabs)感染细胞。48小时后，通过冷冻、解冻和超声处理的三个循环从细胞收获病毒。
感染新鲜HEK293细胞18小时。接着洗涤细胞并向其提供新培养基。再过48小时后，收获上清液以用IFN生物测定法进行分析，并且收集细胞用于FACS分析。
仙台病毒
仙台病毒来自LGC standards(目录号VR-907)。通过将仙台病毒添加到培养基中来感染细胞。
小分子提取和THP1刺激
用于从病毒粒子提取小分子的方法改良自(Ablasser等人,2013,Nature,498,380-384)。将沉淀的病毒粒子重新悬浮于裂解缓冲液(1％Triton X-100、10mM Tris.HclpH 7.4、1mM NaCl、1mM EDTA和3mM MgCl2)中并在冰上放置20min。通过在4℃下以1000g离心10min来净化裂解产物。为了去除核酸，将样品在冰上用50U/ml benzonase(Sigma)处理45min。接着，通过两次连续的苯酚-氯仿提取，然后用氯仿洗涤去除痕量苯酚来去除蛋白质。使用Amicon Ultra 3kDa离心过滤器(Millipore，目录号UFC500396)过滤提取物，并通过在真空下离心来浓缩滤液。将样品重新悬浮于20μl水中并储存在-80℃下直至进一步使用。
使用改良自(31)的方案测量这些提取物中的cGAMP活性。将用30ng/ml PMA处理的100,000个THP-1细胞接种在96孔板中并放置过夜。接着用培养基洗涤细胞，并在37℃下用25μl含有病毒粒子提取物或2'3'-cGAMP标准品(目录号C161-005，Biolog)的通透化缓冲液(10μg/ml毛地黄皂苷、50mM Hepes pH 7.4、100mM KCl、3mM MgCl2、0.1mM DTT、85mM蔗糖、0.2％BSA、1mM ATP和0.1mM GTP)覆盖30min。接着，用培养基洗涤细胞，并添加75μl新鲜培养基。24小时后，在IFN生物测定法中测试上清液。
在一些实验中，在37℃下，将5μl提取物或1μg cGAMP在50mM Tris pH8.8、10mMMgCl2中在有或者没有0.002单位SVPDE(目录号P3243，Sigma)的情况下温育1小时。接着将处理的提取物和cGAMP在通透化缓冲液中连续稀释，并如上添加到THP1细胞中。
点印迹
将病毒制备物重新悬浮于裂解缓冲液(1％Triton X-100、10mM Tris.HCl pH7.4、1mM NaCl、1mM EDTA和3mM MgCl2)中并印到尼龙膜(ξ探针GT膜，目录号162-0197，Biorad)上，将尼龙膜干燥并UV交联(UV Stratalinker 2400；2×Autocross link，120,000μJ/cm2)。用链亲和素-HRP(目录号3310-9，Mabtech，1:1000)检测生物素-cGAMP。用0.2％叠氮化钠使HRP失活，并通过将膜暴露1小时来验证不存在残余信号。接着，依序用小鼠α-p24(目录号4313，Advance Bioscience Laboratory，1:5000)和α-小鼠HRP(目录号NA931VS，GEHealthcare Life Sciences，1:3000)重新探测膜。
实施例2
结果
为了研究cGAS功能，本发明人试图在来源于人类单核细胞的DC(树突状细胞)中控制其表达。他们产生了表达cGAS的慢病毒载体，产生了慢病毒颗粒并用无细胞病毒上清液感染单核细胞，接着使所述单核细胞在DC中分化。在分化的第4天，暴露于cGAS病毒的大多数分化的DC表达CD86并因此被活化，但通过报告荧光蛋白BFP的表达指示的转导效率较低(图6A)。相反，与未暴露于病毒的细胞相比，用仅编码BFP的慢病毒感染有效转导单核细胞但不增加活化的DC的百分比(图6A)。这证实了慢病毒载体感染的一般过程不是由单核细胞和DC传感的，并且其不能负责诱导在cGAS慢病毒载体的情况下观察到的活化。重要的是，DC完全分化，如DC-SIGN的表达和CD14的下调所示的(图7A)。cGAS慢病毒载体还活化在感染前完全分化的DC(图7B、图7C)。这指示活化性先天性免疫信号存在并且与表达cGAS的慢病毒载体感染DC的表观过程相关。
在DC中有效表达慢病毒编码的基因需要慢病毒蛋白Vpx，所述慢病毒蛋白Vpx减轻由SAMHD1强加的对HIV感染的组成性限制，从而使载体有效转导细胞。为了检查靶细胞中cGAS的表达是否为活化细胞所必需，本发明人从转导程序中省略了Vpx蛋白。在这种情况下，SAMHD1限制是活性的并且阻止有效转导，如在对照病毒的情况下检测不到报告荧光蛋白BFP所示(图6A，下图)。出乎意料的是，cGAS慢病毒对DC的活化在没有Vpx的情况下仍保留(图6A、8B)，从而表明靶细胞中不需要cGAS表达。活化不限于CD86表达，因为DC还产生了I型干扰素诱导型细胞因子IP-10(基因CXCL10)(图6C)。为了证实这一观察结果并排除低水平的cGAS载体转导负责活化，本发明人从非慢病毒质粒在cGAS表达细胞中产生了不含慢病毒基因组的HIV-1病毒样颗粒(VLP)(图7D)。如通过CD86表达(图6D)和IP-10产生(图6E)所测量的，来自cGAS表达细胞的含VLP的上清液将DC活化至与有转导能力的慢病毒载体相同的程度。因此，来自产生病毒颗粒并表达cGAS的细胞的上清液可以将先天性信号传输给免疫细胞。
为了确定这种信号的性质，本发明人首先在10kDa过滤器上对病毒上清液进行分级。保留物在单核细胞中有效诱导CD86表达和IP-10产生，而滤液中丧失活性，指示活性是由大于10kDa的组分所携带的(图8A、图8E)。然后，本发明人进行差异超速离心，以将细胞培养基中由细胞释放的各种类型的膜封闭囊泡(统称为细胞外囊泡(EV))与可溶性因子分离。首先是细胞碎片沉淀物(2,000g)，然后是大囊泡，如凋亡泡(10,000g)，最后是小EV，包括外来体和病毒(100,000g)。令人惊讶地，在这些超速离心后回收的培养物上清液几乎完全丧失活化单核细胞的能力(图8B)。相比之下，在100,000g沉淀物中回收到大多数活性，该沉淀物含有Gag以及一些外来体相关蛋白、四跨膜蛋白CD63、CD9和CD81以及细胞质衔接蛋白-1(图8B、图8C、图8D)。10,000g沉淀物中也存在一些活性，该沉淀物仅含有Gag且没有外来体标志物，而仅含有痕量Gag(未显示)的较大细胞碎片显示出边缘活性(图8B、图8C、图8D)。这些结果显示，由cGAS表达细胞传递至DC的先天性信号被包含在包括含Gag病毒颗粒的小EV中，而不是可扩散的可溶性因子中。
由EV传输的先天性信号可能是通过将cGAS蛋白包装和转移至靶细胞来介导的。本发明人不赞成这种假设，因为他们在沉淀的上清液中不能检测到cGAS蛋白(图7D)。作为替代的可能性，第二信使cGAMP因此可以传输先天性信号。cGAMP是细胞质中产生的675Da的小分子，因此可以被包装在病毒颗粒和EV中，因为这些结构含有来自生产细胞的细胞质。
本发明人推断如果cGAMP存在于来源于细胞的病毒颗粒中，则其应以STING依赖性但cGAS非依赖性方式活化I型干扰素反应。他们在缺乏可检测的cGAS表达(数据未显示)的293FT细胞中转染具有或不具有STING质粒的干扰素报告构建体。用脂质转染胺递送合成的cGAMP或转染cGAS表达质粒仅在STING存在下活化报告基因，从而验证了该测定(图9A、图9C)。由cGAS表达细胞产生的VLP在STING存在下活化报告基因，但在没有STING的情况下或在cGAS不存在下产生颗粒时未检测到活化(图9A)。来自不产生VLP的cGAS表达细胞的上清液在活化报告基因方面不太有效(图9A)。因此，病毒颗粒可以将来自生产细胞中的cGAS的先天性信号传输到靶细胞中的STING。为了进一步证实cGAMP存在于病毒颗粒中，本发明人使用基于通透化的THP-1和IFN报告细胞系的生物测定法(图9B)。他们从病毒生产细胞中提取小分子并且使VLP沉淀。如所预期的，从用cGAS转染的细胞中检测到cGAMP活性，但在对照细胞中没有检测到。令人惊讶地，在沉淀的VLP中也检测到cGAMP活性，并且当他们使用cGASE225A/D227A的催化突变体时这种活性丧失(图9B)。
为了证实在提取物中测量的活性对应于cGAMP，本发明人使用合成的cGAMP进行了质谱分析。他们在沉淀的VLP中检测到cGAMP的存在。总体而言，这些数据提供了如下强有力的指示：病毒颗粒包装并转移第二信使cGAMP。
接着，本发明人检查了传输cGAMP需要哪些组分。当使用cGAS E225A/D227A时，病毒颗粒的cGAMP传输被消除，指示需要功能性cGAS蛋白(图10A)。通过表达病毒蛋白Gag/Pol和融合性病毒包膜蛋白VSV-G来产生VLP。省略Gag/Pol或VSV-G或两者的表达降低了上清液在DC中诱导CD86和IP-10的能力(图10A、10B)。缺乏VSV-G最强地降低了DC活化(图10A、10B)，指示融合性细胞外物质是主要的DC活化因子。本发明人证实，在不存在VSV-G的情况下，含有Gag的VLP仍存在于上清液中，并且在不存在Gag的情况下，分泌出含有VSV-G的EV(图10C)。总之，这指示cGAS和有融合能力的包括病毒颗粒的EV是传输cGAMP所需要的。
由细胞表达VSV-G引起管泡结构的产生。为了排除cGAMP的传输是VSV-G的特异性，本发明人产生了携带流感包膜蛋白H1N1和H5N1而不是VSV-G的VLP。在cGAS存在下产生的这些颗粒在所有情况下都活化了单核细胞(图10D、图11A、图11E)。本发明人接着考虑了cGAMP包装和转移至靶细胞是否是HIV-1颗粒特异性的。他们从另一种逆转录病毒(即γ逆转录病毒MLV)产生VLP，并发现所述VLP也可以传输cGAMP(图10E、图11B、图11D)。最后，他们检查了表达野生型CCR5向性包膜蛋白BaL的HIV-1颗粒是否可以转移cGAMP。实际上，他们发现在cGAS存在下产生的HIV-1颗粒可以传输cGAMP并在靶细胞中的先天性免疫反应中活化(图10F、图11C、图11E)。因此，cGAMP包装和转移至靶细胞是来自不同来源的逆转录病毒颗粒的一般特性。
总的来说，本结果提供了如下证据：cGAMP可以通过包装在病毒颗粒或有融合能力的EV中而在细胞之间转移，这定义了先天性免疫信号传输的新机制(图12)。先天性反应的传播通常归因于细胞因子(包括干扰素)的产生。随后的先天性信号诱导效应物分子的产生。有趣的是，一些抗病毒效应物可以包装到病毒颗粒和EV中，例如APOBEC3G，但效应物不直接诱导靶细胞中的先天性免疫反应。cGAMP具有在通过间隙连接物理连接的细胞之间扩散的能力。cGAMP的病毒转移不需要细胞之间的直接接触，这可以允许在生物体内或在宿主之间传输期间传输先天性信号转导分子。该过程可以使靶细胞中效应物反应的快速诱导最大化。有趣的是，由细菌产生的免疫刺激性环二核苷酸可以被递送到靶细胞中并诱导先天性免疫信号，从而提供与病毒介导的cGAMP转移相当的吸引力。
本结果另外指示，可以是外来体的并非来源于病毒细胞的EV也可以在某种程度上传输cGAMP。与此发现一致，EV可以在细胞之间传输细胞RNA。然而，在融合性病毒包膜蛋白不存在的情况下，传输cGAMP的效率较低。发明人推测，在来自未感染细胞的EV的情况下，与靶细胞膜的膜融合步骤是有限的。然而，除了cGAS的作为病毒传感器的功能之外，cGAS似乎还有助于设定未感染小鼠中干扰素诱导基因的强化水平，这在确定随后的感染易感性中起关键作用。虽然尚不知道cGAS的这种功能是否需要cGAMP合成，但是宿主EV的cGAMP传输可能有助于设定强化的干扰素反应。
本发明人证实，通过本发明的VLP运载cGAMP远比与脂质转染胺复合的2'3'-cGAMP(即MLV Gag和HIV Gag VLP的有效性高约1,000倍)并且比2'3'-cGAMP能更有效地诱导树突状细胞成熟(即MLV Gag和HIV Gag VLP的有效性高约10,000倍)(图14)。
发明人提出将cGAMP包装在病毒颗粒内可以解释为免疫标记过程。这可能允许感染细胞进一步将后代病毒表示为非自身或危险的，以警告后续的靶细胞。容易推测，其他信号转导分子也能被病毒颗粒包装和传播。
最后，通过在产生病毒颗粒的细胞中表达cGAMP合成酶进行cGAMP包装，提供了运载免疫原性环二核苷酸以获得治疗剂和疫苗的有吸引力的策略。
材料和方法
细胞
如先前所述培养293FT和HL-116细胞(Lahaye等人,2013,Immunity,39,1132-1142)。如先前所述从外周成人血液分离单核细胞(Lahaye等人,同上)。培养单核细胞，并且在10ng/ml的重组人类GM-CSF(Miltenyi)和50ng/ml的IL-4(Miltenyi)存在下，使所述单核细胞在具有Glutamax、10％FBS(Biowest或GIBCO)、青霉素-链霉素(GIBCO)、庆大霉素(50mg/ml，GIBCO)和HEPES(GIBCO)的RPMI培养基中分化成树突状细胞。在具有Glutamax、10％FBS(GIBCO)、青霉素-链霉素(GIBCO)的RPMI培养基中培养THP-1。
构建体
通过PCR从来源于单核细胞的树突状细胞制备的cDNA扩增人类cGAS WT开放阅读框。通过PCR从来源于C57BL6鼠骨髓的树突状细胞制备的cDNA扩增鼠cGAS WT开放阅读框。通过重叠PCR诱变获得人类cGAS E225A/D227A突变体。通过重叠PCR诱变获得ntcGAS以产生不能由先前所述的shRNA靶向的cGAS变体(Lahaye等人,同上)。合成(Invitrogen)产生mTagBFP2(Subach等人,2011,PLoS One,6,e28674)序列。质粒pSIV3+、psPAX2、pCMV-VSV-G和pTRIP-CMV如先前所述(Satoh等人,2013,Methods Mol Biol,960,401-409)。将BFP-2A、BFP-2A-FLAG-ntcGAS、BFP2AFLAG-cGAS E225A/D227A、Puro-2A克隆在pTRIP-CMV中。非慢病毒载体基于哺乳动物表达质粒pcDNA3.1-Hygro(+)(Invitrogen)。通过PCR将小鼠WT、人类WT cGAS、人类cGAS E225A/D227A、PSTCD-cGAS和PSTCD-cGASΔDBD克隆到pcDNA3.1-Hygro(+)中。谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)转羧基酶结构域(PSTCD)是链亲和素结合蛋白(Fukata等人,2013,J Cell Biol,202,145-161)。通过重叠PCR删除氨基酸区K173-I220和H390-C405来产生PSTCD-cGASΔDBD。除非另外说明，否则所有实验中使用cGAS的人类同种型。通过PCR从IMAGE克隆5762441克隆人类STING开放阅读框。该克隆在位置232处编码组氨酸残基，其通过重叠PCR诱变而被突变为精氨酸残基(Diner等人,2013,Cellreports,3,355-1361)。通过PCR将STING R232克隆到pMSCVhygro(Addgene)中。在所有最终构建体中，通过测序完全验证了源自PCR并包含用于克隆的限制性位点的完整DNA片段。IFNβ-pGL3质粒从Olivier Schwartz实验室(Pasteur Institute)获得。编码H1、H5和N1的流感包膜质粒从Adolfo García-Sastre实验室(Mount Sinai Medical Center)获得。MLV Gag/Pol由pCL-10A1表达(Naviaux等人,1996,J Virol,70,5701-5705)。具有复制能力的CCR5向性R5GFP构建体是先前所述的NL4-3/BaL env，其为Δnef，在nef中编码GFP(Lahaye等人,同上)。
病毒
如先前所述从293FT细胞产生病毒颗粒(Lahaye等人,同上)。通过在6孔板的每个孔中转染1μg psPAX2和0.4μg pCMV-VSV-G以及1.6μg哺乳动物表达质粒或慢病毒载体质粒来产生慢病毒病毒颗粒和病毒样颗粒。
对于CCR5向性NL4-3/BaL env病毒，将1.6μg pcDNA3.1-Hygro(+)-ms cGAS质粒与1.4μg R5GFP质粒共转染。对于流感假型化VLP，将1μg pcDNA3.1-Hygro(+)-ms cGAS质粒与1μg psPAX2、0.5μg H1或H5和0.5μg N1编码质粒共转染。对于MLV病毒颗粒，将1.6μgpTRIP-CMV-BFP-2A或pTRIP-CMV-BFP2A-FLAG-ntcGAS与1μg pCL-10A1和0.4μg pCMV-VSV-G混合。当省略psPAX2和/或pCMV-VSV-G时，用pcDNA3.1-Hygro(+)代替相同量的DNA。将含病毒的细胞上清液在0.45μM过滤器上系统过滤。
对于图14中使用的cGAMP OVA VLP和cGAMP VLP，如下浓缩和纯化病毒颗粒。将34ml来自293FT的粗上清液装入Ultra-Clear离心管(Beckman Coulter)中的6ml蔗糖(Sigma)垫(20％，溶解于PBS中)上，并在SW32转子(Beckman coulter)中以100,000g超速离心。将回收的病毒沉淀物重新悬浮于13ml PBS中，转移到新的Ultra-Clear离心管中，并在SW41转子(Beckman Coulter)中以100,000g超速离心。接着将回收的沉淀物重新悬浮于对于cGAMP OVA VLP来说750μl PBS中或重新悬浮于对于cGAMP VLP来说1350μl PBS中。将每种制备物的三份50μl等分试样转移到单独的管中，分别用于cGAMP提取、单核细胞感染和p24/p27ELISA。接着将所有等分试样在-80℃下冷冻直至进一步使用。
感染
将50,000个新分离的单核细胞或第4天分化的DC接种在96孔U形底板中，并在10ng/ml的人类重组GM-CSF(Miltenyi)和50ng/ml的IL-4(Miltenyi)存在下，在具有8μg/ml鱼精蛋白(Sigma)的200μl最终体积中进行感染。流感包膜假型化VLP和HIV1NL4-3/BaL env病毒的感染是通过在25℃下以1200g进行另一旋转接种步骤2小时来执行的。在指示Vpx时，通过添加50μl如先前所述产生的SIVmac VLP来递送Vpx(Lahaye等人,同上)。添加25μM AZT(Sigma)。对于荧光素酶测定，使用在存在或不存在pcDNA3.1-Hygro(+)-ms cGAS的情况下产生的VLP，在具有8μg/ml鱼精蛋白的2.5ml最终体积中感染293FT。
Western印迹
用PBS分离293FT细胞，并将细胞沉淀物在样品缓冲液(2％SDS、10％甘油、0.05MTris-HCl pH 6.8、0.025％溴酚蓝、0.05M DTT)中裂解。将病毒上清液在0.45μm下过滤，并在4℃下以16,000g离心2小时。除非另外说明，否则将病毒沉淀物在65μl样品缓冲液中裂解。将细胞和病毒蛋白质裂解产物在4％-20％SDS-PAGE凝胶(Biorad)上解析并转移到硝化纤维素膜(Biorad)上。用如下抗体进行蛋白质印迹：小鼠单克隆抗Gag(克隆183-H12-5C-内部产生)、小鼠单克隆抗VSV标签(克隆P5D4-内部产生)、兔多克隆抗MB21D1(Sigma)、小鼠单克隆抗肌动蛋白(克隆C4-Millipore)、来自MLV Gag的R187杂交瘤的上清液(Chesebro等人,1983,Virology,127,134-148)(由Marc Sitbon和Jean-Luc Battini提供)、小鼠单克隆抗CD9(克隆MM2/57-Millipore)、小鼠单克隆抗CD81(克隆B-11-Santa CruzBiotechnology)、小鼠单克隆抗CD63(克隆H5C6-BD Bioscience)、兔多克隆抗衔接蛋白-1(由Pascale Zimmerman慷慨提供)(Zimmermann等人,2001,Molecular Biology of thecell,12,339-350)和在PSTCD-cGAS蛋白质的情况下的链亲和素-HRP(Pierce)。在ChemiDocXRS Biorad成像仪上记录ECL信号。用Image Lab(Biorad)分析数据。
荧光素酶测定法
将293FT细胞在24孔板中进行铺板。第二天，用300ng含有IFNβ-pGL3和空载体pTRIP-CMV-Puro-2A或pMSCVhygro-STING R232的总DNA用TransIT-293(Mirus)转染细胞。第二天，去除培养基并用2.5ml来自293FT生产细胞的粗上清液更换。通过以500μl的最终体积进行脂质转染胺2000(Invitrogen)转染来递送3'3'cGAMP(InvivoGen)(1μg 3'3'cGAMP:1μl脂质转染胺2000)。24小时后，用PBS洗涤细胞，用Passive裂解缓冲液(Promega)裂解，并使用10μl裂解产物进行荧光素酶测定。使用荧光素酶测定试剂(Promega)测量荧光素酶活性。在FLUOstar OPTIMA微板读取器(BMG labtech)上获取发光。
cGAMP提取和生物测定法
该测定法改良自先前描述的方案(Woodward等人,2010,Science,328,1703-1705；Ablasser等人,2013,Nature,497,380-384；Wu等人,2012,Science,339,826-830)。如对于Western印迹所述回收293FT细胞和上清液。离心后，使细胞和病毒沉淀物在4℃下在裂解缓冲液(1mM NaCl、3mM MgCl2、1mM EDTA、10mM Tris-HCl pH7.4、1％Triton X-100)中裂解20分钟。将细胞和病毒裂解物以1000g离心10min，并在4℃下用50U/ml Benzonase(Sigma)处理上清液45分钟。接着使用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1，v/v-Sigma)提取悬浮液两轮，然后用Chlorophorm(VWR Chemicals)洗涤回收的水相。将剩余的水相装载到Amicon 3KDa截留柱(Millipore)上，并以14000g离心30分钟。接着在43℃下使洗脱的溶液在Savant DNASpeed Vac DNA 110中经受速度真空2小时。对于图14中使用的cGAMP OVA VLP和cGAMPVLP，向50μl等分试样中添加50μl无DNA酶/RNA酶的水(GIBCO)；接着将获得的100μl用400μl甲醇(VWR Chemicals)裂解以获得MeOH/H2O的80/20(v/v)混合物。使裂解产物进行5个冷冻和解冻循环，并在4℃下以16,000g离心20min。接着在43℃下使回收的上清液在Savant DNASpeed Vac DNA 110中经受速度真空2.5小时或在65℃下2.5小时。作为提取过程的内部对照，将已知量的2'3'-cGAMP加入MeOH/H2O的80/20(v/v)混合物中并作为病毒制备物提取，省略冷冻和解冻步骤。将沉淀物重新悬浮于25μl(苯酚:氯仿:异戊醇提取)或30μl(甲醇/水提取)无RNA酶-DNA酶的水(GIBCO)中并用于THP-1。在测定前24小时，将100,000个THP-1细胞重新悬浮于含有30ng/ml PMA(Sigma)的新鲜培养基中，并接种在96孔平底板中。然后洗涤PMA，并在37℃、5％CO2氛围下，在用含有50mM HEPES(GIBCO)、100mM KCl、3mM MgCl2、0.1mM DTT、85mM蔗糖(Sigma)、1mM ATP(Sigma)、1mM GTP(Sigma)、0.2％BSA(Euromedex)、0.001％毛地黄皂苷(Calbiochem)的缓冲液通透化期间用重新悬浮的样品处理THP-1细胞30分钟。同时用合成的2'3'cGAMP(InvivoGen)处理通透化的THP-1细胞。然后洗涤缓冲液，在细胞上添加新鲜培养基并温育过夜。对于用MeOH/H2O提取的样品，在初始刺激阶段期间添加50U/ml的benzonase。然后如所描述的，将上清液转移到HL-116细胞上来测量干扰素活性(Lahaye等人,同上)。
过滤
用1.6μg pTRIP-CMV-BFP-2A-FLAG-ntcGAS、1μg psPAX2和0.4μg pCMV-VSV-G转染293FT细胞，并如先前针对病毒产生所描述的进行处理。接着回收上清液，并且在4℃下以4,000g在Amicon 10KDa截留管(Millipore)上离心30分钟。将保留物重新悬浮在前述DC培养基中。然后使用重新悬浮的保留物和过滤的级分如先前所述处理单核细胞。
分级
通过以100000g过夜离心从含有10％FBS和青霉素-链霉素的含Glutamax的RPMI培养基中去除牛EV，然后在0.22μm下过滤。如对于病毒所描述的，转染293FT。转染后12小时，将培养基更换为新鲜的去除EV的培养基。30小时后，回收上清液并且在0.45μm下过滤。通过连续的超速离心步骤从条件培养基中分离囊泡：2,000g 20分钟(台式离心机)；9,000rpm25分钟(具有SW55Ti转子的超速离心机XL-100K Beckman，k_因子＝1,759.27，10,000g级分)；30,000rpm 1小时(具有SW55Ti转子的超速离心机XL-100K Beckman，k_因子＝169.44，100,000g级分)。将每种沉淀物悬浮于50μl PBS(western印迹)或600μl去除EV的培养基(感染单核细胞)中。剩余的100,000g级分的上清液仅用于感染单核细胞。
流式细胞术
在PBS、1％BSA(Euromedex)、1mM EDTA(GIBCO)中进行细胞表面染色。使用的抗体是抗人类CD86PE(克隆IT2.2-eBioscience)、抗人类CD14FITC(克隆61D3-eBioscience)和抗人类DC SIGN PE(克隆120507-R&D Systems)。将细胞在4℃下染色15分钟，洗涤两次并在1％多聚甲醛(Electron Microscopy Sciences)中固定。在FACSVerse(BD)或Accuri C6(BD)上获取数据并在FlowJo中分析。
IP-10蛋白定量
对来自处理的单核细胞的上清液的纯品或10倍稀释液(100,000g级分，流感假型化病毒颗粒，NL4-3/BaL env病毒)测量IP-10浓度。根据制造商的方案，通过人类IP-10细胞计数测定法(BD)测量IP-10浓度。在BD FACSVerse(BD)上获取数据并在FCAP阵列(BD)中分析。
统计学
在Prism(GraphPad)中进行统计学分析。
质谱法
将cGAMP提取程序后获得的提取物在溶液A(2％(v/v)乙腈/水、0.1％(v/v)甲酸)中稀释(1/1000、1/100或1/10)，并使用连接到QSTAR Elite四极杆飞行时间(Q-TOF)质谱仪(Applied Biosystems/MDS SCIEX)的主动分离毛细管HPLC系统(Ultimate 3000，Dionex，Germering，Germany)进行分析(1μL)。在200nL/min下，使用30min等度洗脱(5％(v/v)B，95％(v/v)A，以及流动相B，80％(v/v)乙腈/水，0.085％(v/v)甲酸)，在分析型C18柱(75μm内径×150mm长，填充有孔径为的3μm颗粒，C18PepMapTM，Dionex S.A.)上实现样品分离。使用设置为正离子模式并且电喷雾(ESI)电压为2.2kV的Analyst QS软件(2.0)进行数据获取。在300-800m/z的质量范围内获取TOF-MS全扫描1秒。接着使用产物获取方法在40eV碰撞能量(CE)下，每个循环2秒，在50-680m/z的质量范围内获取离子m/z 675.1的产物离子扫描，并在离子m/z 675.1的假选择反应监测(假SRM)模式下，在30eV CE下，每个循环1秒，在520-530m/z的质量范围内，在60eV CE下，每个循环1秒，在120-170m/z的质量范围内，和在40eV CE下，每个循环1秒，在460-490m/z的质量范围内获得三个产物离子扫描。
实施例3
结果
本发明人试图确定由病毒颗粒转移cGAMP是否会在生理学相关的cGAS表达水平下发生。HeLa细胞表达cGAS蛋白。HeLa细胞在稳态下不含可检测量的细胞内cGAMP，但在DNA刺激之后检测到。在HeLa中通过CRISPR/Cas9破坏cGAS基因在DNA刺激后消除了cGAMP产生。接着，本发明人收获了对照HeLa、DNA刺激的HeLa或用VLP编码质粒(其也提供DNA刺激)转染的HeLa的可沉淀的细胞外物质。在所有DNA刺激的HeLa的物质中检测到cGAMP，这与其包装在细胞外囊泡(EV)和病毒颗粒中一致(图13A)。然而，只有来源于HeLa的VLP在PMA处理的THP-1细胞中诱导IP-10产生，而来自对照HeLa或DNA刺激的HeLa的EV则不能诱导IP-10产生(图13B)。为了确定cGAMP被转移，本发明人在STING荧光素酶报告基因测定法中测试了该物质。来源于HeLa的VLP以STING依赖性方式活化干扰素启动子，但来自DNA刺激的HeLa的EV则不能(图13C)。总体而言，这些数据证实病毒颗粒和EV包装由内源性cGAS产生的cGAMP，但只有病毒物质可以有效转移第二信使cGAMP。
方法
HeLa转染
将每孔80万个HeLa细胞接种在6孔板中并在同一天进行转染。用7.5μl脂质转染胺2000(Invitrogen)和总共4μg DNA进行转染。在空载体转染的情况下，递送4μg pcDNA3.1-Hygro(+)。在VLP的情况下，转染3.5μg psPAX2和0.5μg pCMV-VSV-G。在HIVGFP的情况下，转染3.5μg HIVGFP env-nef-和0.5μg pCMV-VSV-G。14-16小时后更换培养基。接着在28-30小时后收获上清液并在0.45μm下系统过滤。为进行cGAMP提取和THP-1刺激，首先将上清液在4℃下以2000g离心20分钟，然后将30ml装载到Ultra-Clear离心管(Beckman Coulter)中并在SW32转子(Beckman coulter)中以100000g超速离心。对于IFN-β荧光素酶报告基因测定，跳过2000g离心。将获得的超速离心沉淀物重新悬浮于RPMI 10％FBS(GIBCO)、PenStrep中用于处理THP-1，重新悬浮于DMEM 10％FBS(GIBCO)、PenStrep中用于IFN-β荧光素酶报告基因测定，以及重新悬浮于500μl裂解缓冲液(1mM NaCl、3mM MgCl2、1mM EDTA、10mM Tris-HCl pH7.4、1％Triton X-100)中用于cGAMP提取。通过胰蛋白酶消化回收细胞，沉淀，用PBS洗涤，重新悬浮于裂解缓冲液中用于cGAMP提取，然后冷冻在-80℃下。
THP-1刺激
在刺激前一天，将100,000个THP-1细胞接种于96孔平底板中含有30ng/ml PMA(SIGMA)的新鲜培养基中。在刺激之前，将培养基更换为新鲜培养基，然后在8μl/ml鱼精蛋白(SIGMA)存在下用重新悬浮的超速离心物质处理细胞。刺激后48小时，收集上清液并储存在4℃下直至IP-10定量。
IP-10蛋白定量
对来自处理的THP-1的上清液的纯品或10倍稀释液测量IP-10浓度。根据制造商的方案，通过人类IP-10细胞计数测定法(BD)测量IP-10浓度。在BD FACSVerse(BD)上获取数据并在FCAP阵列(BD)中进行分析。
荧光素酶测定法
将45,000个293FT细胞在24孔板中进行铺板。第二天，用500ng包含200ng IFNβ-pGL3和300ng空载体pMSCV-hygro或pMSCV-hygro-STING R232的总DNA用TransIT-293(Mirus)转染细胞。对于RIG-1N228转染，将150ng pCAGGS-FlagRIGIN228与150ng空载体或STING表达载体共转染。第二天，除去培养基并在8μg/ml的鱼精蛋白(SIGMA)存在下更换为380μl重新悬浮的沉淀物质。在HIVGFP env-nef-(G)沉淀物的情况下，用25μM AZT(SIGMA)和10μM奈韦拉平(SIGMA)处理293FT细胞。通过以380μl的最终体积进行脂质转染胺2000(Invitrogen)转染来递送2'3'cGAMP(InvivoGen)(1μg 2'3'cGAMP:1μl脂质转染胺2000)。24小时后，用PBS洗涤细胞，并在Passive裂解缓冲液(Promega)中裂解。使用10μl裂解产物进行荧光素酶测定。使用荧光素酶测定试剂(Promega)测量荧光素酶活性。在FLUOstarOPTIMA微板读取器(BMG labtech)上获取发光。
cGAMP提取和生物测定法
如所描述的，回收细胞和上清液。使裂解产物进行5个冷冻解冻循环。接着使裂解产物在95℃下沸腾，在冰中冷却并在4℃下在台式离心机中以16000g离心20分钟。接着回收上清液并在4℃下用50U/ml Benzonase(Sigma)处理45分钟。接着使用苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1，v/v-Sigma)提取悬浮液两轮，然后用Chlorophorm(VWR Chemicals)洗涤回收的水相。将剩余的水相装载到Amicon 3KDa截留柱(Millipore)上，并以14000g离心30分钟。接着在65℃下使洗脱的溶液在Savant DNA Speed Vac DNA 110中经受速度真空2小时。将沉淀物重新悬浮于无RNA酶-DNA酶的水(GIBCO)中并用于THP-1。在测定前24小时，将100,000个THP-1细胞重新悬浮于含有30ng/ml PMA(Sigma)的新鲜培养基中，并接种在96孔平底板中。然后洗涤PMA，并在37℃、5％CO2氛围下，在用含有50mM HEPES(GIBCO)、100mM KCl、3mMMgCl2、0.1mM DTT、85mM蔗糖(Sigma)、1mM ATP(Sigma)、1mM GTP(Sigma)、0.2％BSA(Euromedex)、0.001％毛地黄皂苷(Calbiochem)的缓冲液通透化期间用重新悬浮的样品处理THP-1细胞30分钟。同时用合成的2'3'cGAMP(InvivoGen)处理通透化的THP-1细胞。然后洗涤缓冲液，在细胞上添加新鲜培养基并温育过夜。然后如所描述的，将上清液转移到HL-116细胞上来测量干扰素活性。
IFN的定量生物测定法
用HL116细胞系测定来自THP-1刺激细胞的上清液的IFN活性，所述HL116细胞系带有由IFN诱导型6-16启动子控制的荧光素酶报告基因，如先前所述(Uze'等人,1994)。简言之，使报告细胞暴露于细胞培养上清液5小时并测定荧光素酶活性(Promega)，接着通过使用由人类IFNα-2a(ImmunoTools)的连续稀释产生的标准曲线将荧光素酶活性转换成IFN活性。
实施例4
结果
为了测试cGAMP-VLP在预防性疫苗接种情形下控制肿瘤生长的活性，本发明人用Ova-cGAMP-VLP、对照cGAMP-VLP、Ova蛋白+cGAMP或Ova蛋白+CpG处理小鼠(图15A、B)。免疫接种后第11天，在Ova-cGAMP-VLP情形下检测到Ova特异性CD8+T细胞，但在对照VLP情形下未检测到(图15C)。在第14天移植表达Ova的肿瘤。在第25天，证实Ova特异性CD8+T细胞反应的存在并且该存在增加(图15D)。在未处理的小鼠和用对照cGAMP-VLP或Ova蛋白+cGAMP进行疫苗接种的小鼠中观察到肿瘤生长(图15E)。相反，Ova-cGAMP-VLP和Ova蛋白+CpG处理的小鼠中完全未见肿瘤生长。因此，这确定了Ova-cGAMP-VLP在体内能用作预防性疫苗来诱导CD8+T细胞反应并防止肿瘤生长。
接着，为了测试在不存在肿瘤抗原的情况下cGAMP作为治疗性免疫调节剂的活性，本发明人在小鼠中移植了表达Ova的肿瘤，并且在第12天用cGAMP-VLP或对照在肿瘤内进行处理(图15F、15G)。在cGAMP-VLP处理小鼠中，检测到Ova特异性CD8+T细胞反应，但在对照处理的小鼠中未检测到(图15H)。这确定了cGAMP-VLP可以提供治疗性免疫调节信号来诱导肿瘤特异性CD8+T细胞反应。
方法
小鼠和疫苗接种
5/6周龄的雌性C57BL/6J小鼠购自Charles River France。本文使用的动物的护理和使用严格地应用现行的关于实验和其他科学目的用脊椎动物的保护的欧洲和国家规章(设施许可证#C75-05-18)。其还符合根据实验动物护理和使用指南(NRC 2011)的国际公认的更换、减少和改进原则。向小鼠皮下(s.c.)注射到脚垫中或肿瘤内(i.t.)注射。
CD8+T细胞反应的定量
注射VLP后10天，通过眼眶后穿刺收集血液样品，并使用四聚体分析和通过ELISPOT定量IFN-g产生细胞来测量CD8+Ova特异性T细胞反应。用PE-结合的H-2Kb/SIINFEKL四聚体(Beckman Coulter)、抗CD8和抗TCR抗体(BD Biosciences)将总血细胞染色，然后进行红细胞裂解来定量OVA特异性CD8+T细胞。使用标准LSR-II流式细胞仪(BDBiosciences)分析细胞，并使用FlowJo软件分析FACS数据。将四聚体+细胞在TCR+CD8+细胞上进行门控。同时，在红细胞裂解后，通过ELISPOT在PBMC上测量产生IFNγ的OVA特异性CD4+或CD8+T细胞。简言之，用抗鼠IFNγ抗体(Diaclone)包被微板(Multiscreen HTS IP，Millipore)。将PBMC(0.2×106个/孔)在对照培养基或在257-264(SIINFEKL)I类限制性OVA肽(10μM)(Polypeptide Group,Strasbourg,France)存在下在完全培养基(RPMI-Glutamax，10％胎牛血清、抗生素、β-巯基乙醇)中培养过夜。用生物素化的抗IFNγ(匹配对，Diaclone)，然后用链亲和素-碱性磷酸酶(Mabtech)进行检测，并使用适当的底物(Biorad)来揭示。使用ELISPOT读取器系统ELR02(AID,Germany)对斑点进行计数，并且将结果表示为每0.2×106个PBMC中产生细胞因子的细胞数。
OVA特异性抗体反应的定量
免疫接种后12天，通过眼眶后穿刺收集血清，并通过标准ELISA测量OVA特异性免疫球蛋白。简言之，将Maxisorp 96孔板在4℃下用含OVA(10μg/ml)的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液包被。用PBS-5％奶封闭2h后，在室温下添加连续稀释的血清2h。在充分洗涤后，将碱性磷酸酶结合的抗小鼠IgG、IgG1或IgG2b(Jackson ImmunoResearch)添加到每个孔中，并将板在室温下温育1h。在充分洗涤后，添加即用型底物(Applied Biosystems)测量碱性磷酸酶活性。使用Centro LB 960发光计(Berthold)读取微板，并将样品血清与阳性标准曲线比较以将结果表示为任意单位(AU)。
体内肿瘤测定法
将0.5×106个B16F10-OVA细胞皮下施用到小鼠的剃毛侧腹中。使用卡尺每周测量肿瘤生长两次以确定肿瘤尺寸，肿瘤尺寸计算为(长度×宽度2)/2)。当肿瘤达到2cm3时将小鼠处死。
对于肿瘤预防实验，向小鼠注射VLP(Ova-cGAMP-VLP：估计每次注射11ng cGAMP和10ng MLV p30)并在14天后皮下注射肿瘤细胞。对于肿瘤治疗情形，皮下注射肿瘤细胞，并且当肿瘤达到30-100mm3时，向小鼠肿瘤内注射VLP(cGAMP-VLP：估计每次注射33ng cGAMP和43ng HIV p24)。
实施例5
已知cGAMP通过STING受体进行信号转导，引起IFN-β产生。为了测试cGAMP-VLP是否在体内活化IFN-β反应，本发明人在皮下注射Ova-cGAMP-VLP、cGAMP-VLP、Ova蛋白+cGAMP、Ova蛋白+CpG或PBS后3小时测量小鼠血清中IFN-β的浓度。本发明人确实观察到含有cGAMP的VLP和合成的cGAMP诱导了IFN-β的产生，但CpG或PBS则没有(图16A)。类似地，他们在肿瘤内注射cGAMP-VLP后3小时在血清中检测到IFN-β，但在PBS的情形下则没有。因此，cGAMP-VLP引起体内IFN-β诱导。
接着，本发明人想要确定Ova-cGAMP-VLP在预防性疫苗接种情形下的免疫原性是否需要在VLP中存在cGAMP。实际上，先前已显示cGAMP是佐剂。重要的是，通常在亚最佳抗原剂量下检测到佐剂特性，因此需要测试VLP的几个剂量。为了测试这一想法，本发明人向小鼠皮下注射一定剂量的Ova-cGAMP-VLP、不含cGAMP的OVA-VLP、Ova蛋白+cGAMP和Ova蛋白+CpG(图17A)。注射后11天，发明人通过ELISPOT测量Ova特异性IFN-g反应(图17B)。在最高剂量的VLP(剂量1)下，Ova-cGAMP-VLP和OVA-VLP均诱导CD8+T细胞的Ova特异性IFN-g反应，因此未揭示出Ova-cGAMP-VLP中含有的cGAMP的佐剂效应(图17C)。相反，在较低剂量的VLP(剂量1/3)下，只有Ova-cGAMP-VLP诱导了Ova特异性IFNg CD8+T细胞反应，而OVA-VLP则没有。因此，为了在疫苗接种情形下诱导佐剂效应，需要在VLP中存在cGAMP。
方法
血清中IFN-β浓度的测定
在用各种疫苗免疫接种后3h收集小鼠的血清。然后使用VeriKine-HS试剂盒(PBLlaboratories)按照制造商的说明书通过ELISA测量IFN-β。
(参见实施例4的方法)。
序列表
<110> 法国居里学院
法国国家卫生及研究医学协会
<120> 用于制备具有环二核苷酸的病毒颗粒的方法和所述颗粒用于治疗癌症的用途
<130> B2202PC
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 522
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Gln Pro Trp His Gly Lys Ala Met Gln Arg Ala Ser Glu Ala Gly
1 5 10 15
Ala Thr Ala Pro Lys Ala Ser Ala Arg Asn Ala Arg Gly Ala Pro Met
20 25 30
Asp Pro Thr Glu Ser Pro Ala Ala Pro Glu Ala Ala Leu Pro Lys Ala
35 40 45
Gly Lys Phe Gly Pro Ala Arg Lys Ser Gly Ser Arg Gln Lys Lys Ser
50 55 60
Ala Pro Asp Thr Gln Glu Arg Pro Pro Val Arg Ala Thr Gly Ala Arg
65 70 75 80
Ala Lys Lys Ala Pro Gln Arg Ala Gln Asp Thr Gln Pro Ser Asp Ala
85 90 95
Thr Ser Ala Pro Gly Ala Glu Gly Leu Glu Pro Pro Ala Ala Arg Glu
100 105 110
Pro Ala Leu Ser Arg Ala Gly Ser Cys Arg Gln Arg Gly Ala Arg Cys
115 120 125
Ser Thr Lys Pro Arg Pro Pro Pro Gly Pro Trp Asp Val Pro Ser Pro
130 135 140
Gly Leu Pro Val Ser Ala Pro Ile Leu Val Arg Arg Asp Ala Ala Pro
145 150 155 160
Gly Ala Ser Lys Leu Arg Ala Val Leu Glu Lys Leu Lys Leu Ser Arg
165 170 175
Asp Asp Ile Ser Thr Ala Ala Gly Met Val Lys Gly Val Val Asp His
180 185 190
Leu Leu Leu Arg Leu Lys Cys Asp Ser Ala Phe Arg Gly Val Gly Leu
195 200 205
Leu Asn Thr Gly Ser Tyr Tyr Glu His Val Lys Ile Ser Ala Pro Asn
210 215 220
Glu Phe Asp Val Met Phe Lys Leu Glu Val Pro Arg Ile Gln Leu Glu
225 230 235 240
Glu Tyr Ser Asn Thr Arg Ala Tyr Tyr Phe Val Lys Phe Lys Arg Asn
245 250 255
Pro Lys Glu Asn Pro Leu Ser Gln Phe Leu Glu Gly Glu Ile Leu Ser
260 265 270
Ala Ser Lys Met Leu Ser Lys Phe Arg Lys Ile Ile Lys Glu Glu Ile
275 280 285
Asn Asp Ile Lys Asp Thr Asp Val Ile Met Lys Arg Lys Arg Gly Gly
290 295 300
Ser Pro Ala Val Thr Leu Leu Ile Ser Glu Lys Ile Ser Val Asp Ile
305 310 315 320
Thr Leu Ala Leu Glu Ser Lys Ser Ser Trp Pro Ala Ser Thr Gln Glu
325 330 335
Gly Leu Arg Ile Gln Asn Trp Leu Ser Ala Lys Val Arg Lys Gln Leu
340 345 350
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355 360 365
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370 375 380
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385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
Asn Pro Gln Asp Ser Gln Trp Asp Arg Lys Asp Leu Gly Leu Cys Phe
450 455 460
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465 470 475 480
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485 490 495
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515 520
<210> 2
<211> 507
<212> PRT
<213> 家鼠（Mus musculus）
<400> 2
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1 5 10 15
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20 25 30
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35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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465 470 475 480
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485 490 495
Arg Asn Asn Gly Phe Pro Ile Phe Asp Lys Leu
500 505

Claims (13)

1.一种包含脂蛋白包膜的病毒样颗粒，所述脂蛋白包膜包括病毒融合性糖蛋白，其中所述病毒样颗粒含有包装在所述病毒样颗粒中的环单磷酸鸟苷-单磷酸腺苷(cGAMP)，所述病毒样颗粒用于治疗癌症。
2.根据权利要求1所述的供使用的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒还包含来自逆转录病毒科的衣壳。
3.根据权利要求1或2所述的供使用的病毒样颗粒，其中所述病毒融合性糖蛋白是来自以下的糖蛋白：逆转录病毒科(包括慢病毒和逆转录病毒)、疱疹病毒科、痘病毒科、嗜肝DNA病毒科、黄病毒科、披膜病毒科、冠状病毒科、丁型肝炎病毒、正粘病毒科、副粘病毒科、丝状病毒科、弹状病毒科、布尼亚病毒科或正痘病毒科(例如天花)，优选正粘病毒、逆转录病毒、弹状病毒。
4.根据权利要求1至3任一项所述的供使用的病毒样颗粒，其中所述病毒融合性糖蛋白是来自以下的糖蛋白：HIV(人类免疫缺陷病毒)，包括HIV-1和HIV-2；流感，包括A型流感(例如亚型H5N1和H1N1)和B型流感；托高土病毒；或VSV(水泡性口腔炎病毒)。
5.根据权利要求2至4任一项所述的供使用的病毒样颗粒，其中所述逆转录病毒衣壳来自逆转录病毒科，优选慢病毒和逆转录病毒。
6.根据权利要求2至4任一项所述的供使用的病毒样颗粒，其中所述逆转录病毒衣壳来自HIV或MLV(鼠白血病病毒)。
7.根据权利要求1至6任一项所述的供使用的病毒样颗粒，其中所述环二核苷酸是cGAMP(2'-3'-环GMP-AMP)。
8.根据权利要求1至6任一项所述的供使用的病毒样颗粒，其中所述环二核苷酸是cGAMP(3'-3'-环GMP-AMP)。
9.根据权利要求1至8任一项所述的供使用的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒还包含抗原或任何其他目的蛋白质或核酸，优选肿瘤相关抗原，或其组合。
10.根据权利要求1至9任一项所述的供使用的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒与抗原或治疗性活性剂组合使用。
11.根据权利要求1至10任一项所述的供使用的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒通过静脉内、皮下或肿瘤内途径施用。
12.根据权利要求11所述的供使用的病毒样颗粒，其中所述病毒样颗粒通过肿瘤内途径施用。
13.一种药物组合物、疫苗组合物或兽医用组合物，其包含根据权利要求1至10任一项所述的病毒样颗粒和至少一种肿瘤相关抗原。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021196808A1 (zh) * 2020-03-30 2021-10-07 杭州星鳌生物科技有限公司 一种新型抗新冠病毒治疗性疫苗及其制备方法和应用

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017233068C1 (en) 2016-03-18 2023-05-25 Immune Sensor, Llc Cyclic di-nucleotide compounds and methods of use
WO2019123414A1 (en) * 2017-12-22 2019-06-27 Straximm Llp Engineered viruses expressing cyclic gmp-amp synthase
WO2022223619A1 (en) 2021-04-20 2022-10-27 Institut Curie Compositions and methods for use in immunotherapy
WO2022223622A1 (en) 2021-04-20 2022-10-27 Institut Curie Compositions and methods for use in immunotherapy

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1662253A (zh) * 2002-06-20 2005-08-31 赛托斯生物技术公司 用作佐剂的包装的病毒样颗粒:制备方法与用途
CN1750812A (zh) * 2003-02-13 2006-03-22 贝斯特维勒控股公司 病毒颗粒样粒子
CN101146522A (zh) * 2004-12-03 2008-03-19 生物活性蛋白转运医疗公司 蛋白质输送系统
CN103348007A (zh) * 2010-12-22 2013-10-09 麦迪卡格公司 在植物中产生病毒样颗粒

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL71691A (en) 1984-04-27 1991-04-15 Yeda Res & Dev Production of interferon-ypsilon
US5047335A (en) 1988-12-21 1991-09-10 The Regents Of The University Of Calif. Process for controlling intracellular glycosylation of proteins
US5500161A (en) 1993-09-21 1996-03-19 Massachusetts Institute Of Technology And Virus Research Institute Method for making hydrophobic polymeric microparticles
WO2005089777A1 (en) 2004-03-15 2005-09-29 Karaolis David K R A method for inhibiting cancer cell proliferation or increasing cancer cell apoptosis
EP1782826A1 (en) 2005-11-08 2007-05-09 GBF Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH PQS and c-diGMP and its conjugates as adjuvants and their uses in pharmaceutical compositions
DK2385107T3 (en) 2010-05-03 2016-12-12 Pasteur Institut Lentiviral vector-based immunological compounds against malaria
WO2013185052A1 (en) * 2012-06-08 2013-12-12 Aduro Biotech Compostions and methods for cancer immunotherapy
KR20150076244A (ko) 2012-10-30 2015-07-06 레드박스 게엠베하 인간 시토메갈로바이러스 감염에 대한 재조합 입자 기재 백신
WO2014099824A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Board Of Regents, The University Of Texas System Pharmaceutical targeting of a mammalian cyclic di-nucleotide signaling pathway
WO2014128568A2 (en) 2013-02-25 2014-08-28 Variation Biotechnologies, Inc. Compositions and methods for treatment of hepatitis c
US10421971B2 (en) * 2014-01-15 2019-09-24 The University Of Chicago Anti-tumor therapy

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1662253A (zh) * 2002-06-20 2005-08-31 赛托斯生物技术公司 用作佐剂的包装的病毒样颗粒:制备方法与用途
CN1750812A (zh) * 2003-02-13 2006-03-22 贝斯特维勒控股公司 病毒颗粒样粒子
CN101146522A (zh) * 2004-12-03 2008-03-19 生物活性蛋白转运医疗公司 蛋白质输送系统
CN103348007A (zh) * 2010-12-22 2013-10-09 麦迪卡格公司 在植物中产生病毒样颗粒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. BRIDGEMAN ET AL: "Viruses transfer the antiviral second messenger cGAMP between cells", 《SCIENCE》 *
MATTEO GENTILI ET AL: "Transmission of innate immune signaling by packaging of cGAMP in viral particles", 《SCIENCE》 *
TIEJUN LI ET AL: "Antitumor Activity of cGAMP via Stimulation of cGAS-cGAMP-STING-IRF3 Mediated Innate Immune Response", 《SCIENTIFIC REPORTS》 *
仇书兴 等: "嵌合病毒样颗粒疫苗研究进展", 《国际生物制品学杂志》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2021196808A1 (zh) * 2020-03-30 2021-10-07 杭州星鳌生物科技有限公司 一种新型抗新冠病毒治疗性疫苗及其制备方法和应用

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