CN116096403A - 针对pr的致病生物免疫原的通用疫苗卵子生物特异性和跨组保护 - Google Patents

针对pr的致病生物免疫原的通用疫苗卵子生物特异性和跨组保护 Download PDF

Info

Publication number
CN116096403A
CN116096403A CN202080098295.4A CN202080098295A CN116096403A CN 116096403 A CN116096403 A CN 116096403A CN 202080098295 A CN202080098295 A CN 202080098295A CN 116096403 A CN116096403 A CN 116096403A
Authority
CN
China
Prior art keywords
virus
cells
vaccine
viral
infection
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202080098295.4A
Other languages
English (en)
Inventor
徐建青
X·Y·张
J·王
L·Y·朱
B·W·卢比特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sino American Biotechnology Holding Co
Original Assignee
Sino American Biotechnology Holding Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sino American Biotechnology Holding Co filed Critical Sino American Biotechnology Holding Co
Publication of CN116096403A publication Critical patent/CN116096403A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10311—Siphoviridae
    • C12N2795/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本公开部分地提供了一种用以开发针对病原体的疫苗的基于载体的初免和加强平台，所述疫苗被定制以引发靶向保守病毒表位的广泛T细胞反应。通用疫苗被制备成针对选自病毒、细菌、真菌或原生动物的感染性病原生物体的免疫原，其包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，所述多核苷酸包含编码至少一种多肽抗原或其免疫原性片段的开放阅读框，其中所述多肽抗原或其所述免疫原性片段包含富含CD8+T细胞识别抗原的保守内部蛋白。所述初免和加强平台的有效性在包括完全功能性人免疫系统的人源化小鼠模型中进行了测试。

Description

针对PR的致病生物免疫原的通用疫苗卵子生物特异性和跨组 保护
相关应用
本申请要求2020年1月8日提交的美国非临时申请No.16/737,546的优先权，权利为针对Pr的致病生物免疫原的通用疫苗卵形生物特异性和跨组保护这是国际专利申请号的延续。PCT/CN2018/105020，于2018年9月11日向中国国家知识产权局受理局提交。
发明领域
所描述的发明通常涉及针对提供生物体特异性和跨组保护的致病生物体免疫原的通用疫苗。
序列表
即时应用程序包含以ASCII格式以电子方式提交的序列表，特此通过引用将其全部合并。所述ASCII副本创建于2020年12月17日，名为130189-00420_SL.txt大小为5，275字节。
背景
现有传染性和新出现的病原体继续在全世界造成显著的发病率和死亡率。仅在1990年，估计就有1600万人死于感染。尽管从那时起出现了许多新的治疗产品，但在2010年，由感染引起的死亡人数仅下降到1500万。这些死亡中的大多数是由少数病原体引起的：在大约1400种公认的人类病原体和寄生虫中，大多数死亡是由呼吸系统疾病，腹泻，艾滋病毒/艾滋病，结核病，疟疾，脑膜炎，百日咳，麻疹，乙型肝炎和性传播疾病(STDs)引起的(DyeC.2015年后：传染病健康与发展新时代。(2014)伦敦皇家学会哲学学报。B辑，生物科学，369(1645)，20130426.doi：10.1098/rstb.2013.0426).某些疾病被认为特别重要，例如，因为它们在出现时具有100％的致死率，例如，艾滋病毒/艾滋病；或者因为传染性病毒病原体引起的疾病超出了主要感染者的范围，例如由于感染寨卡病毒而出现出生缺陷。
用于对抗病原体的治疗产品包括预防性免疫接种，如疫苗，以及感染后治疗，如抗菌和抗病毒。疫苗是由致病微生物剂或微生物或病毒体的一种或几种特定抗原组成的治疗方法，其整套抗原在接受个体中诱导免疫反应和/或病原体本身的细胞反应(Cassone，A.，&Rappuoli，R.(2010)。通用疫苗：转向一种疫苗。生物.1(1)，e00042-10.doi：10.1128/mBio.00042-10)。疫苗通过诱导能够快速控制复制病原体或灭活其毒性成分的效应机制来保护。
一般来说，免疫反应是由个体和外来物质(例如，传染性微生物)之间的相遇引发的。受感染个体通过产生针对免疫原的抗原决定簇/表位的抗体分子产生体液免疫反应而快速反应，以及通过抗原特异性调节和效应T淋巴细胞(包括产生细胞因子的细胞和杀伤性T细胞，能够裂解感染细胞)的扩增和分化而介导的细胞免疫反应。具有给定微生物的初级免疫会唤起对该微生物上发现的抗原决定簇/表位具有特异性的抗体和T细胞；这些通常无法识别或仅识别由不相关的微生物表达的不良抗原决定簇(Paul，W.E.，“第1章：免疫系统：介绍”，Fundamental Immunology，第4版，Ed.Paul，W.E.，Lippicott-Raven出版社，费城，(1999年)，第102页)。
由于这种初始反应，免疫接种的个体发展出免疫记忆状态。如果再次遇到相同或密切相关的微生物，则会出现次要反应。这种二级反应通常包括更快，更大幅度的抗体反应，并且由与抗原结合的抗体组成，这些抗体具有更大的亲和力，并且更有效地从体内清除微生物，以及类似增强且通常更有效的T细胞反应。然而，对感染因子的免疫反应并不总是导致病原体的消除(Paul，W.E.，“第1章：免疫系统：介绍”，Fundamental Immunology，第4版，Ed.Paul，W.E.，Lippicott-Raven出版社，费城，(1999年)，第102页)。
人体免疫系统是细胞和分子的复杂排列，它们维持免疫稳态，通过消除所有被认为危险的元素来保持生物体的完整性。免疫系统中的反应一般可分为两条，称为“先天免疫”和“适应性免疫”。免疫的两个分支不是彼此独立地运作，而是协同工作以引发有效的免疫反应。
免疫系统的先天性臂是对病原体的非特异性快速反应，主要负责通过许多可溶性因素(包括补体系统和趋化因子/细胞因子系统)的初始炎症反应；和许多专门的细胞类型，包括肥大细胞，巨噬细胞，树突状细胞(DC)和自然杀伤细胞(NKs)。
适应性免疫臂涉及各种类型的细胞的特定，延迟和更持久的反应，这些细胞对特定抗原产生长期免疫记忆。它可以进一步细分为细胞和体液分支，前者主要由T细胞介导，后者由B细胞介导。该臂进一步包括适应性臂的细胞谱系成员，这些成员在先天臂中具有效应器功能，从而弥合了先天性和适应性免疫反应之间的差距。
一般来说，疫苗接种教育先天性和适应性免疫系统，以提高适应性T细胞和B细胞记忆反应，并提供快速保护，防止随后感染相关病毒。(Li，G.等人，“黄病毒疫苗接种中的记忆T细胞”，疫苗(2018)6：73)。
疫苗和疫苗接种
虽然疫苗接种为预防疾病和控制牛群感染疫情提供了一种具有成本效益的措施，但目前市场上的疫苗存在重大缺陷甚至失败。
开发的第一种疫苗是野生型疾病或相关疾病的野生型版本被“杀死”并交付的疫苗。虽然已知这种疫苗有效，但它们在接受者中具有严重疾病甚至死亡的重大风险。
开发的第二种疫苗是减毒疫苗。该疫苗基于从受感染的兔脑获得的材料，干燥是一个不确定的过程；以这种方式制备的疫苗经常引起严重的副作用。减毒疫苗现在大多基于在组织培养中生长的灭活病毒。狂犬病是第一种在实验室中减毒的病毒，用于制造人类疫苗。获得在组织培养物中长时间生长病毒的能力导致开发针对麻疹，脊髓灰质炎，风疹，流感，轮状病毒，结核病和伤寒的减毒疫苗。由于疫苗成分是活的，它们可以传播给未接种疫苗的受试者，将疫苗接种的影响扩大到整个社区(一般见Greenwood B.疫苗接种对全球健康的贡献：过去、现在和未来。(2014).伦敦皇家学会哲学学报.B辑，生物科学，369(1645)，20130433.doi：10.1098/rstb.2013.0433).
减毒活病毒疫苗是一种受欢迎的疫苗接种策略，部分原因是它们在1930年代黄热病病毒疫苗YF-17D方面取得了成功(Ghaffar，K.A.等人，“寨卡疫苗的快速通道和路障”，疫苗(2018)6，77；doi：10.3390/vaccines040077)。例如，单剂量的YF-17D疫苗能够诱导高滴度的中和抗体(nAb)，从而为至少95％的受者提供保护(同上，引用Barrett A.D.，TeuwenD.E.Curr。观点。免疫。(2009)21:308–313.doi：10.1016/j.coi.2009.05.018；Bonaldo，MCet al.，Hum.Vaccin.免疫剂。(2014)10:1256–1265.doi：10.4161/hv.28117).这一策略已被用于许多其他疾病，包括脊髓灰质炎，麻疹和腮腺炎(同上，引用Plitnick L.M.第9章-全球疫苗监管指南。在：Plitnick L.M.，Herzyk D.J.，编辑。新型生物制剂，生物仿制药，疫苗和专业生物制剂的非临床开发。学术出版社；美国加利福尼亚州圣地亚哥：(2013年)。第225-241页)。此外，与其他疫苗策略相比，减毒疫苗的生产具有成本效益且相当简单。
虽然减毒活疫苗具有能够通过单剂量引发免疫反应的优点，但缺点包括由于存在不良反应的风险，其在免疫功能低下或妊娠患者中的使用有限。事实上，由于这些疫苗含有活病毒，因此在减毒的疫苗株中可能会发生突变，并恢复到毒力，如口服脊髓灰质炎疫苗所示，这导致约200万受体中有一人瘫痪。此外，它们可能在免疫力受损的受试者中引起重大疾病，正如抗结核疫苗Bacille Calmette Guérin(BCG)在给予免疫缺陷患者(包括人类免疫缺陷病毒(HIV)感染患者)时所看到的那样。
接下来，研究人员开发了杀死病原体然后使用的灭杀疫苗。这些疫苗通常免疫原性差，并且经常引起显着的副作用，因此全细胞疫苗在很大程度上已经让位于亚单位疫苗，以及其他类型的疫苗。(一般见格林伍德B。疫苗接种对全球健康的贡献：过去、现在和未来。(2014).伦敦皇家学会哲学学报.B辑，生物科学，369(1645)，20130433.doi：10.1098/rstb.2013.0433).亚单位疫苗包括病原体的片段，即蛋白质或肽(Ghaffar，K.A.等人，“寨卡疫苗的快速通道和路障”，疫苗(2018)6，77；doi：10.3390/vaccines040077)。虽然亚单位疫苗通常是更安全的选择，因为它们往往免疫原性较差，因此需要佐剂和/或多剂量。
mRNA疫苗的使用是一种相对较新的趋势，已经越来越受欢迎(Ghaffar，K.A.等人，“寨卡疫苗的快速通道和障碍”，(2018)疫苗6，77；doi：10.3390/vaccines040077引用Plitnick L.M.第9章-疫苗全球监管指南。在：Plitnick L.M.，Herzyk D.J.，编辑。新型生物制剂，生物仿制药，疫苗和专业生物制剂的非临床开发。学术出版社；美国加利福尼亚州圣地亚哥：(2013年)。第225-241页)。作为最小的遗传构建体，mRNA仅包含表达特定编码蛋白质区域所需的元素。此外，mRNA无法与基因组相互作用，而只是作为信息的短暂载体。其用作疫苗平台的其他优点包括其安全性(Id.引用Lundstrom，K.，Futre Sci.OA(2018)4：FSO300 doi：10.4155/fsoa-2017-0151)。然而，利用mRNA作为疫苗设计方法的缺点之一是其被核糖核酸快速降解。
DNA疫苗是ZIKV爆发后最早为人体临床试验提出的疫苗平台之一(Id)。还探索了使用编码各种抗原的基因工程DNA质粒来诱导体液和细胞反应，以对抗寄生虫引起的各种传染病(Id.citing Cherif，MS等人，疫苗(2011)29：9038-9050；Cheng，PC et al.，PLoSNeg.Trop Dis.(2016)10：e00044594；doi：10.1371/journal.pntd.0004459)，细菌(同上，引用Li，X.et al.，Clin.疫苗免疫。2012；19:723–730.doi：10.1128/CVI.05700-11；Albrecht，MT，et al.，Med.Microbiol.(2012)65：505-509doi：10.1111/j.1574-695X.2012.00974.x).和其他病毒(同上，引用Donnelly，JJ等人，Nature Med.(1995)1：583-597doi：10.1038/nm0695-583；Porter，KR et al.，Vaccine(2012)30：36-341doi：10.1016/j.vaccine.2011.10.085).
腺病毒载体表达未知抗原蛋白的载体已被很好地研究用于基因和癌症治疗和疫苗(Id)。除了其广泛的安全性外，利用腺病毒载体的优点是它相对稳定，易于获得高滴度并且能够感染多种细胞系，这归因于其效力。尽管重组腺病毒载体由于其高转导效率和转基因表达而在今天被广泛使用，但存在针对该载体的预先存在的免疫力，因为大多数人群已经暴露于腺病毒(Id)。这在人类免疫缺陷病毒(HIV-1)IIb期疫苗试验中已被证明是有害的，其中基于载体的疫苗为HIV-1复制提供了有利条件(同上，引用Smaill，F.等人，Sci.Transl.Med.(2013)5：205ra134.doi：10.1126/scitranslmed.3006843)。
开发下一代疫苗将越来越具有挑战性，因为它们所针对的许多生物体具有复杂的结构和生命周期(例如疟疾寄生虫)，或者通过抗原多样性(例如，艾滋病毒和流感病毒)在智胜人类免疫反应方面非常有效。从理论上讲，使用已建立的技术，开发针对其他重要传染病靶点(如登革热或新型日冕病毒)的新疫苗应该更容易，但最近测试的登革热疫苗的适度有效性强调，即使在开发更传统的疫苗方面仍然存在挑战(Greenwood B.疫苗接种对全球健康的贡献：过去、现在和未来。(2014).伦敦皇家学会的哲学交易。B辑，生物科学，369(1645)，20130433.doi：10.1098/rstb.2013.0433).
因此，正在制定其他疫苗接种策略，以试图克服上述解决的失败。
影响全球当前人群的模范传染因子包括以下内容。
病毒
I)黄病毒科病毒
A)概述黄病毒科家庭
这黄病毒科家族包含小的包膜，阳性链病毒，其RNA基因组为9-13k碱基。它们通常是宿主特异性和致病性的。(Fermin，Gustavo和Paula Tennant。Viruses：MolecularBiology，Host Interactions and Applications to Biotechnology，由Jerome E.Foster编辑，Elsevier Science&Technology，2018年。ProQuest Ebook Central，https://ebookcentral.proquest.com/lib/jhu/detail.action？docID＝5322098).
该家族的11kb基因组编码，翻译并加工成三种结构蛋白-衣壳(C)，包膜(E)，膜(M)和七种非结构(NS)蛋白；NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。(Li，G.等人，“黄病毒疫苗接种中的记忆T细胞”，疫苗(2018)6：73)E蛋白是一种主要的病毒粒子表面蛋白，参与受体结合和膜融合，并在受感染的宿主中诱导中和抗体。同上。
黄病毒包括寨卡病毒(ZIKV)、登革热病毒(DENV)、黄热病病毒(YFV)、西尼罗河病毒(WNV)、日本脑炎病毒(JEV)、丙型肝炎病毒(HCV)和蜱传脑炎病毒(TBEV)。其他相关病毒包括但不限于瘟疫病毒属的经典猪瘟病毒和Pegivirus属的病毒。
i)丙型肝炎病毒(HCV)
丙型肝炎病毒(HCV)被归类为属肝病毒在家庭中黄病毒科.丙型肝炎病毒分布于全球，占急性病毒性肝炎的21％。(Ma，MM等人，在抗菌疗法和疫苗中。Yu，VL，Merigan，Jr，TCand Barriere，SL Eds，Williams&Wilkins，Baltimore，(2005)，pgs.病毒基因组表现出显着的遗传异质性，并且至少存在第二种基因型，每种基因型可以进一步细分为80多种不同的亚型。最常见的包括亚型1a、1b、2a、2b、2c、3a和4a。
HCV具有正感RNA基因组，编码单个3010氨基酸多蛋白。多蛋白需要由宿主和病毒蛋白酶处理。衣壳(C)蛋白是保守的，而包膜蛋白(E1和E2)的可变性更大，导致HCV的异质性(同上)。
ii)登革热病毒(DENV)
登革热是由登革热病毒(DENV)引起的急性发热性疾病，与伊蚊一样传播给人类。据估计，在热带和亚热带地区，每年有5000万至1亿人受到感染，其中超过25亿人处于危险之中。该病毒有四种血清型：DEN-1，DEN-2，DEN-3或DEN-4。在每个血清型中，都有显着的遗传多样性(Fermin，Gustavo和Paula Tennant。Viruses：Molecular Biology，HostInteractions and Applications to Biotechnology，由Jerome E.Foster编辑，ElsevierScience&Technology，2018年。ProQuest Ebook Central，https://ebookcentral.proquest.com/lib/jhu/detail.action？docID＝5322098).
iii)黄热病病毒(YFV)
黄热病病毒(YFV)是一种由伊蚊、血吸虫和萨贝特斯蚊虫叮咬传播的黄病毒。这种疾病的地理范围是非洲，南美洲，中美洲和加勒比地区。虽然它的遗传多样性研究不足，但已经提出了七种基因型：西非基因型I和II，东非基因型，东非/中非基因型，安哥拉基因型和南美基因型I和II(Fermin，Gustavo和Paula Tennant)。Viruses：Molecular Biology，Host Interactions and Applications to Biotechnology，由Jerome E.Foster编辑，Elsevier Science&Technology，2018年。ProQuest Ebook Central，https://ebookcentral.proquest.com/lib/jhu/detail.action？docID＝5322098).
iv)日本脑炎病毒(JEV)和西尼罗河病毒(WNV)
日本脑炎病毒(JEV)属于黄病毒属。其他相关病毒包括墨累谷脑炎病毒(MVEV)，圣路易斯脑炎病毒(SLEV)，西尼罗河病毒(WNV)，雅温得病毒，Cacipacore病毒，Koutango病毒和Usutu病毒。它们一起被称为日本脑炎(JE)组。日本脑炎通过蚊子媒介传播，通常来自库蚊属，在地理上发生在南亚、东南亚、东亚和太平洋地区。每年发现3.5万至5万例日本脑炎组病毒病例，每年有多达15 000人死亡。
西尼罗河病毒首先在乌干达的西尼罗河地区分离出来，并传播到南欧、亚洲、澳大利亚、中东和北美(Beth K.Schweitzer，Nora M.Chapman，Peter C.Iwen，概述黄病毒科，重点是日本脑炎组病毒，《检验医学》，第40卷，第8期，2009年8月，第493-499页，https://doi.org/10.1309/LM5YWS85NJPCWESW)。
v)寨卡病毒(ZIKV)
寨卡病毒(ZIKV)是一种虫媒病毒，可以通过伊蚊以及性互动传播给人类。作为黄病毒科阳性链RNA家族的成员，ZIKV与一些重要的人类病原体密切相关，如登革热病毒(DENV)，黄热病病毒(YFV)，西尼罗河病毒(WNV)，日本脑炎病毒(JEV)和蜱传脑炎病毒(TBEV)(Yang，C.等人，基于包膜蛋白结构开发针对寨卡病毒的中和抗体，“VirologicaSinica(2019)34：168-174，引用Wang Q，et al.J.Viorol.(2017)91：e01049-17).在这些黄病毒中，DENV是最接近ZIKV的一种。一些研究表明，从DENV或ZIKV感染的恢复期患者中分离出的中和抗体显示出交叉中和能力(Yang，引用Barba-Spaeth，G。等。自然(2016)536：48-53；王强等，科学翻译医学(2016)8：3695a179).ZIKV在拉丁美洲的出现主要发生在DENV流行地区。同上。
B)基于结构的黄病毒功能分析
整体ZIKV结构与其他黄病毒相似(Yang，C.等人，基于其包膜蛋白结构开发针对寨卡病毒的中和抗体，“Virologica Sinica(2019)34：168-174，引用Kostyuchenko，VA等人，Nature。(2016)533:425–428.doi：10.1038/nature17994；Sirohi，D.et al.，Science.2016；352:467–470.doi：10.1126/science.aaf5316).病毒粒子通常是球形的，基因组被衣壳覆盖，而衣壳又被脂质双层包围，其表面有包膜糖蛋白。病毒粒子通常具有单个小的碱性衣壳(C)蛋白，两到三个包膜蛋白(E)和一个前膜/膜(prM/M)蛋白(Fermin，Gustavo和Paula Tennant)。Viruses：Molecular Biology，Host Interactions andApplications to Biotechnology，由Jerome E.Foster编辑，Elsevier Science&Technology，2018年。ProQuest Ebook Central，https://ebookcentral.proquest.com/lib/jhu/detail.action？docID＝5322098).黄病毒包括10.8kb RNA基因组；RNA被翻译成单个多蛋白(长度为3423个氨基酸)，编码3个结构蛋白-衣壳(C)；膜(M)，由其前体前膜(prM)产生；和包膜(E)——以及7种非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)(图1)。顾名思义，结构蛋白形成病毒颗粒。非结构蛋白有助于基因组的复制和包装，以及颠覆宿主途径以支持病毒。(Devika Sirohi，Richard J Kuhn，寨卡病毒结构，成熟和受体，传染病杂志，第216卷，第suppl_10期，2017年12月15日，第S935-S944页，https://doi.org/10.1093/infdis/jix515)。
ZIKV由180拷贝的E蛋白组成，形成具有二十面体对称性的致密颗粒。E蛋白的每个拷贝在其外胚层中含有三个不同的结构域，分别称为DI，DII和DIII。结构域I(DI)包含E蛋白的N末端，结构域II(DII)是一种扩展的手指状结构，包括二聚化结构域以及介导病毒融合的pH敏感融合环。结构域III(DIII)是一种免疫球蛋白样结构域，可介导对靶细胞的附着(Id.，引用Robbiani，DF等人，Cell。(2017)169(597–609)：e511).这三个结构域通过两个称为茎锚的螺旋连接到病毒膜。DI，DII和DIII的排列使得将DI放置在中心，DII和DIII两侧形成单体。E单体以反平行方式与相邻单体相互作用以形成二聚体。三个E-二聚体彼此平行，形成一个称为“木筏”的结构单元(Id.，引用Kostyuchenko，VA等人，Nature。(2016)533:425–428.doi：10.1038/nature17994；Sirohi，D.et al.，Science.(2016)352:467–470.doi：10.1126/science.aaf5316；Sevvana，M.et al.Structure.2018；26:1169–1177.doi：10.1016/j.str.2018.05.006).
为了进入宿主细胞，E蛋白需要与靶细胞上的受体相互作用(Id.Citing Hasan，SSet al.，Nature Commun.(2017)8:14722.doi：10.1038/ncomms14722).迄今为止，尽管似乎没有特异性受体参与ZIKV与宿主细胞的相互作用，但DENV和其他黄病毒的研究表明，E蛋白可以结合许多细胞因子，例如C型凝集素受体，层粘连蛋白受体，T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域(TIM)和TYRO3，AXL和MER(TAM)受体，以及整合素αvβ3(同上引用Perera-Lecoin，M.等.病毒.(2013)6:69–88.doi：10.3390/v6010069；Sirohi，D.和Kuhn，RJ，科学。(2016)352:467–470.doi：10.1126/science.aaf5316).在与受体结合后，病毒粒子经历低pH依赖性内吞作用和E蛋白的构象重排，这发生在内体中。然后病毒膜与宿主膜融合，病毒的RNA基因组被释放到细胞质中(Id.，引用Stiasny，K.和Heinz，FX，J Gen Virol。(2006)87:2755–2766.doi：10.1099/vir.0.82210-0；哈里森，南卡罗来纳州，纳特公社。2017；8:14722.doi：10.1038/ncomms14722；Gerold，G.et al.Mol Cell蛋白质组学.(2017)16：S75–S91.doi：10.1074/mcp.R116.065649).然而，黄病毒进入宿主细胞的详细过程尚不完全清楚。
C)对黄病毒感染的免疫反应
人类黄病毒感染引起复杂的抗体(Ab)反应，其在免疫力和发病机制中也具有核心作用(Collins，M.H.，Serologic Tools and Strategies，以支持对抗寨卡病毒感染和疾病的干预试验，“Trop Med.Infect.Dis.(2019)4，68；doi：10.3390/tropicalmed4010068，引用Wahala，WMPB和De Silva，AM，Viruses(2011)3：2374-95；曼斯菲尔德，吉隆坡等人，J.Gen.Virol。(2011)92:2821-29；Allwinn，R.et al.，Med.Microbiol.免疫。(2002)190:199-202；Rey，F.A.et al，EMBO Rep.(2018)19：206-224).
ZIKV感染通常不明显，大约20％的感染者发展为自限性疾病，最常见的特征是皮疹，发烧，结膜炎和/或关节痛/肌痛(Collins，M.H.，血清学工具和策略，以支持干预试验以对抗寨卡病毒感染和疾病，“Trop Med.Infect.Dis.(2019)4，68；doi：10.3390/tropicalmed4010068，引用Duffy，MR等人的话。N.Engl.J.Med.(2009)360：2536–2543，Sampathkumar，P.，Mayo Clin.Proc.(2016)91：514–521，Brasil，P.et al.，N.Engl.J.Med.(2016)_375：2321-2334；Petersen，LR et al，N.Engl.J.Med.(2016)374：1552–1563).推测潜伏期小于一周，在大多数情况下症状持续时间小于一周(同上，引用Petersen，LR等人，N.Engl.J.Med.(2016)374：1552-1563)。病毒血症通常在症状发作后迅速清除，但感染病毒在感染后数周内已从精液中分离出来(Id.，引用Polen，KD等人，MMWR Morb。凡人。WklyRep.(2018)67，868；Arsuaga，M.等人，柳叶刀感染。Dis.92016)16：1107；Garcia-Bujalance，S.et al.，J.Clin.维罗尔。(2017)96：110-115)，和ZIKV RNA可以在感染后长时间在血液或阴道分泌物中检测到，特别是在怀孕期间(Id.，引用Driggers，RW等人，N.Engl.J.Med.(2016)374：2142-2151，Nguyen，SM等人，PLoS Pathog。(2017)13：e1006378；Reyes，Y.et al.，Emerg.感染。Dis.(2019)25：808–810)，并且在精液中至少6个月，(同上，引用Polen，KD等人，MMWR。莫布。凡人。Wkly.Rep.(2018)67：868；Nicastri，E.et al.，EuroSurveill.牛。欧洲马来电译欧洲公社。迪斯公牛。(2016)21，El Sahly，HM et al.，OpenForum Infect.Dis.(2019)6，ofy352，Lustig，Y.et al.，Eurosurveillance(2016)21：30269；罗西尼，G.等人，J.感染。(2017)75:242–245；Murray，KO等人，Emerg。感染。Dis.(2017)23，Fibriansah，G.et al.，Science(2015)349：88-91；Fibriansah，G.et al.，EMBOMol.Med.(2014)6：358-71；Kiermayr，S.et al.，J.Virol.(2009)83:8482-91).小头畸形和其他出生缺陷和神经发育问题是ZIKV感染最令人担忧的表现，当它发生在怀孕期间并且病毒垂直传播给胎儿时(同上，引用Miranda-Filho，DdB；et al.，Am.J.Public Health(2016)106：5998-600；雷诺兹，MR等人，莫布。凡人。Wkly Rep.(2017)66：366-73；Guilland，A.，BMJ(2016)352：i657；De Melo，ASO等人，JAMA Neurol.(2016)73：1407；Rice，ME et al，MMWRMorb.凡人。Wkly Rep.(2018)67：858).此外，在多个国家发生寨卡病毒疫情后，吉兰-巴雷综合征的发病率一直增加(同上，引用Dos Santos，T.等人，N.Engl.J.Med.(2016)375：1598-1601；Oehler，E.等人，Euro Surveill。(2014)19:20720；Cao-Lormeau，V-M等人，柳叶刀(2016)387：1531-39)。其他并发症和严重结局很少报道，从低血小板到死亡，通常在具有可能导致其疾病致病性的额外共病因素的患者中(同上，引用Sarmiento-Ospina，A.等人，柳叶刀感染。Krow-Lucal，ER等人，Emerg。感染。Dis.(2017)23：1260-67；科伦坡，TE等人，J.克林。维罗尔。(2017)96:20-25；Arauza-Ortega，L.et al.，Emerg.感染。Dis.(2016)22：925-27).
在病毒感染期间，体液免疫反应在其清除中起重要作用。抗体通过病毒中和或Fc介导的效应器功能(例如，ADCC和CDC)执行其保护作用(Yang，C.等人，基于其包膜蛋白结构的针对寨卡病毒的中和抗体的开发，“Virologica Sinica(2019)34：168-174，引用Lu，LL等人Nat Rev Immunol。(2018)18:46–61.doi：10.1038/nri.2017.106).
人抗体对ZIKV反应的关键特征已经从密切相关病毒的丰富经验中定义或推断出来。ZIKV反应性IgM可在症状发作后4-7天内检测到。ZIKV IgM检测可用于诊断有症状的感染和最近的无症状感染(Collins，M.H.，血清学工具和策略，以支持对抗寨卡病毒感染和疾病的干预试验，“Trop Med.Infect.Dis.(2019)4，68；doi：10.3390/tropicalmed4010068，引用Wahala，WMPB aqnd De Silva，AM，Viruses(2011)3：2374-95；曼斯菲尔德，吉隆坡等人，J.Gen.Virol。(2011)92:2821-29；Allwinn，R.et al.，Med.Microbiol.免疫。(2002)190:199-202；Rey，F.A.等人，EMBO Rep.(2018)19：206-224，引用Munoz-Jordan，JL，J.Infect。Dis.(2017)216：S951-S956).IgM检测仍可用于诊断先天性寨卡综合征(CZS)，但不再推荐用于评估可能暴露于ZIKV的非流行地区的无症状孕妇(同上，引用Adebanjo，T.，Morb.凡人。Wkly Rep.(2017)66：1089-99).阳性检测对ZIKV感染是支持性的，但不是确定性的，可能需要确认中和(同上，引用Munoz-Jordan，JL，J.Infect.Dis.(2017)216：S951-S956，Adebanjo，T.，Morb。凡人。Wkly Rep.(2017)66：1089-99).抗ZIKV IgM反应的持续时间尚不清楚，但在某些情况下可以持续超过12周(同上，引用Munoz-Jordan，JL，J.Infect.Dis.(2017)216：S951-S956；Rabe，IB et al.，Morb.凡人。Wkly代表(2016)65：543-46；Pasquier，C.et al.，Diagn.微生物。感染。Dis.(2018)90：26-30)，这限制了该测定的可靠性，以狭义地定义最近的ZIKV感染。
针对ZIKV的IgG在10-14天内可以检测到，并且可能持续数年，就像其他黄病毒一样(Id.，引用Peeling，RW等人，Nat.Rev.Microbiol。(2010)8：S30-S38，Munoz-Jordan，JL，J.Infect.Dis.(2017)216：S951-S956，Wahala，WMPB aqnd De Silva，AM，Viruses(2011)3：2374-95，Pasquier，C.et al.，Diagn.微生物。感染。(2018)90：26-30).IgG反应的动力学与血清学检测的性能有直接关系。检测IgG的测定可能要到发病后10至15天后(DPO)后才能达到峰值灵敏度(Id.，引用Balmaseda，A.等人，Proc.Natl Acad.Sci.USA (2017)114：8384-89)。此外，交叉反应性抗体(Abs)的大小及其相对丰度可能在感染后早期最高(同上，引用Lanciotti，R.S，et al.，Emerg。感染。Dis.(2008)14：1232-1239，Wahala，WMPB；de Silva，AM，Viruses(2011)3：2374-95，Premkumar，L.et al.，J.Clin.微生物。(2017)56(3)；DOI：10.1128/JCM.01504-17)，直到恢复期晚期才影响测定特异性。这些Abs的靶标包括结构蛋白以及非结构蛋白(ns)，最显着的是NS1(Id.，引用Stettler，K.等人，科学(2016)353(6301)：823；Slon Campos，JL，et al，Nat.Immunol.(2018)19:1189-98).一百八十个包膜蛋白(E)单体装饰ZIKV病毒体的表面，组织成头到尾的同源二聚体，进一步排列成更高阶的结构，使人字形外观和二十面体对称性(同上，引用Kostyuchenko，VA等人，Nature(2016)533：425-28；Sirohi，D.et al.，Science(2016)352：467-70).ZIKV和DENV E的保守率约为50％(同上，引用Primavada，L.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA(2016)113：7852-57；Stettler，K.等人，科学(2016)353(6301)：823，Kostyuchenko，VA等人，Nature(2016)533：425-28)，但同源性不是同质的；E域II的聚变环是高度保守的，而E域III是最发散的，可能更有可能被ZIKV特异性Ab反应靶向(同上，引用Stettler，K.等人，科学(2016)353(6301)：823；Robbiani，DF et al.，Cell(2017)：597-609；Premkumar，L.et al.，J.Clin.微生物。(2017)DOI：10.1128/JCM.01504-17；Slon Campos，JL，et al，Nat.Immunol.(2018)19:1189-98；Yu，L.et al.，JCI Insight(2017)2：93042).除表位外，黄病毒诱导的Abs在特异性，动力学和功能方面也有所不同。Abs可能对一种病毒非常具有特异性，或者对两种或多种病毒产生交叉反应(Id.，引用Allwinn，R.等人，Med.微生物。免疫。(2002)190:199-202；Heinz，FX，Stiasny，K.，J.Clin.维罗尔。(2012)55:289-95；Calisher，Ch，et al.，J.Gen.Virol.(1989)70:37-43).
结合Abs的一个子集也表现出中和特性，并且已经表明中和Abs(nAbs)倾向于结合血清型特异性表位，这些表位通常需要病毒颗粒的三维结构完整性(Id.，引用Wahala，WMPB和de Silva，AM，Viruses(2011)3：2374-95；Fibransah，G.et al.，Science(2015)349：8-91；Fibriansah，G.et al.，EMBO Mol.Med.(2014)6：358-71；Kiermayr，S.et al.，J.Virol.(2009)83:8482-91；Teoh，EP etal.，Sci.Trans.Med.(2012)4：139ra83，Kaufman，B.etal.，Proc.Natl Acad.Sci.USA(2010)107：18950-18955；De Alwis，R.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(2012)109：7439-44).在DENV感染中，中和不良，交叉反应性Abs，经常与前体膜蛋白(PrM)或融合环中的表位结合(Id.，引用Wahala，WMPB和de Silva，AM，Viruses(2011)3：2374-2395，Slon Campos，JL等人，Nat.Immunol。(2018)19：1189-98)，通过Ab依赖性增强(ADE)与严重疾病的病理生理学有关(同上，引用Halstead，SB，FY1000研究(2015)4：F1000；Katzelnick，LC，et al，Science(2017)358：929-932).仍然有人担心，先前DENV感染引发的非中和交叉反应性Ab可能会加剧ZIKV感染或增强垂直传播(同上，引用Bardina，SV等人，科学(2017)356：175-180；Brown，JA et al.，免疫(2019)50(3)：751-762.e5；Rathore，APS et al.，Sci.Adv.(2019)5：eaav3208；Zimmerman，MG等人，细胞宿主微生物(2018)24：731-742e6；Dejnirattisai，W.等人，Nature Immunol。(2016)17:1102-1108；Castanha，PM et al.，J.Infect.Dis.(2016)215：jiw638)；然而，有非人类灵长类动物的数据相反(同上，引用Pantoja，P.等人，国家通讯。(2017)8:15674；McCracken，MK etal，PLoS Pathog.(2017)13：e1006487)，并且没有人类流行病学数据支持该假设(同上，引用Halstead，SB Emerg。感染。Dis.(2017)23：569；Gordon A.et al.，PLoS med.(2019)16：e1002726；Martin-Acebes，MA，et al.，Front.细胞感染。微生物。(2018)8:44).ZIKV感染增强随后DENV感染的可能性研究得更少。
在日本脑炎组病毒中，据报道，由受感染蚊子叮咬引起的初始疾病局限于病毒复制开始的皮肤皮下区域。然后病毒随后从淋巴系统扩散到循环系统和内部器官，这可能涉及大脑和脊髓。在初始感染部位，CD3+T细胞的一个子集，即γδT细胞，已被证明受到刺激并产生细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)，其在疾病的初始阶段控制感染。随着疾病的进展，这些T细胞刺激αβT细胞(CD4/CD8阳性细胞的一个亚群)产生更多的IFN-γ。一旦在受感染的人类细胞内检测到病毒特异性双链RNA，细胞就会被刺激产生更多的IFN-α/β，试图抑制病毒在受感染细胞内的复制，从而防止病毒进一步扩散到正常组织。
巨噬细胞，B细胞和树突状细胞等免疫细胞被证明是参与人类对JE组病毒(特别是树突状细胞)免疫反应的重要抗原呈递细胞，因为它们位于皮肤中，这是初始暴露的部位。当病毒的载体释放到皮肤中时，这些细胞被刺激迁移到淋巴结，随后激活T细胞。研究表明，外周血中的CD4+T细胞和脑脊液中的CD8+T细胞有助于从组织中清除病毒。
补体系统还通过病毒通过膜攻击复合物对受感染细胞的细胞溶解活性传播以及通过启动B细胞对感染作出反应来发挥作用。体液免疫系统进一步产生抗体，作为防止早期感染和长期免疫再感染的尝试。IgM抗体在急性疾病期间产生。
然而，有些人发展为严重的病程，有些人只发展为轻度疾病。虽然抗体产生是免疫反应的关键组成部分，但如果没有细胞免疫系统的帮助，抗体本身不足以消除JE组感染。(Beth K.Schweitzer，Nora M.Chapman，Peter C.Iwen，Overview of the Flaviviridae，重点是日本脑炎组病毒，Laboratory Medicine，第40卷，第8期，2009年8月，第493-499页，https://doi.org/10.1309/LM5YWS85NJPCWESW)
B细胞和特异性抗体被认为对控制播散性黄病毒感染至关重要(Id.，引用DiamondM.S.等人，J.Virol。(2003)77:2578–2586.doi：10.1128/JVI.77.4.2578-2586.2003；Roehrig J.T.，et al.，Ann.N.Y.Acad.Sci.(2001)951：286–297.doi：10.1111/j.1749-6632.2001.tb02704.x).尽管中和抗体滴度是FDA接受的黄病毒疫苗免疫原性的主要终点，但越来越多的证据表明，虽然中和抗体与保护仅温和相关，但T细胞介导的免疫力可能在没有中和抗体的情况下起保护作用(Li，G.等人，“黄病毒疫苗接种中的记忆T细胞”，疫苗(2018)6：73，引用Akondy R.S.，Fitch M.，EdupugantiS.，Yang S.，Kissick H.T.，LiK.W.，Youngblood B.A.，Abdelsamed H.A.，McGuire D.J.，Cohen K.W.等人。接种疫苗后人类记忆CD8 T细胞的起源和分化。自然界。(2017)552:362–367.doi：10.1038/nature24633；Halstead S.B.实现安全，有效和持久的寨卡病毒疫苗：登革热的教训。柳叶刀感染。Dis.(2017)17：e378–e382.doi：10.1016/S1473-3099(17)30362-6；Sabchareon A.，etal.Lancet.(2012)380:1559–1567.doi：10.1016/S0140-6736(12)61428-7).
中和抗体主要与E蛋白上的表位有关，而大多数T细胞表位已被映射到黄病毒NS蛋白(Id.，引用Pierson T.C.等人，细胞宿主微生物。(2008)4:229–238.doi：10.1016/j.chom.2008.08.004；Weiskopf D.，Sette A.Front.免疫。(2014)5:93.doi：10.3389/fimmu.2014.00093).NS蛋白被认为在内质网(ER)的膜上共翻译组装，形成复制主管复合物，其由形态学上不同的膜结合区室组成，这些隔室在功能和NS蛋白组成方面也不同(Bollati，M.等人，抗病毒Res.(2010)87(2)：125-148，引用Mackenzie，J.，Traffic(2005)6：967-977)。CD4+和CD8+效应子和记忆T细胞已被证明直接有助于宿主保护性免疫反应，包括病毒清除，并为B细胞和抗体成熟提供帮助Li，G.等人，“黄病毒疫苗接种中的记忆T细胞”，疫苗(2018)6：73，引用Bassi M.R.等人，J.Immunol。(2015)194:1141–1153.doi：10.4049/jimmunol.1402605；Michlmayr D.，et al.，J.Immunol.(2016)196:4622–4631.doi：10.4049/jimmunol.1502452，Elong Ngono A.，et al.，Cell Host Microbe.(2017)21:35–46.doi：10.1016/j.chom.2016.12.010；Larena M.等人，J.Virol。(2011)；85:5446–5455.doi：10.1128/JVI.02611-10；Mathews J.H.等人，J.Virol。(1992)66:6555–6562；Sitati E.M.，Diamond M.S.，J.Virol.(2006)80:12060–12069.doi：10.1128/JVI.01650-06；Yauch L.E.等人，J.Immunol。(2009)182:4865–4873.doi：10.4049/jimmunol.0801974).
YFV-17D疫苗引起对黄热病的强烈体液免疫反应，疫苗接种后30年以上可在血清中检测到中和抗体；然而，对YFV-四聚体抗原具有特异性的记忆CD8+T细胞也可以在接种疫苗后至少10年扩展到效应池(同上，引用波兰J.D.，Calisher C.H.，Monath T.P.，DownsW.G.，Murphy K.在用17D黄热病疫苗免疫后30-35年中和抗体的持续存在。牛。世界卫生机构。1981；59:895–900；Wieten R.W.，Jonker E.F.F.，Leeuwen E.M.M.V.，RemmerswaalE.B.M.，Berge I.J.M.T.，VisserA.W.D.，Genderen P.J.J.V.，Goorhuis A.，Visser L.G.，Grobusch M.P.，et al.单次17D黄热病疫苗接种可提供终身免疫力；黄热病特异性中和抗体和疫苗接种后T细胞反应的表征。PLoS ONE.2016；11：e0149871.doi：10.1371/journal.pone.0149871).来自动物模型的最新证据表明，体液和细胞介导的免疫协同作用，产生YFV 17D疫苗接种后看到的持久免疫力。(同上，引用Watson A.M.，Lam L.K.，Klimstra W.B.，Ryman K.D.17D-204疫苗菌株诱导的对致命性黄热病病毒的保护是由体液免疫和CD4+介导的，而不是CD8+T细胞。PLoS Pathog.2016；12：e1005786.doi：10.1371/journal.ppat.1005786).
D)黄病毒疫苗开发与挑战或失败
在过去的七十年中，已经利用各种策略来开发黄病毒疫苗。目前，有效的疫苗已被批准供人类使用，以对抗YFV，JEV，DENV和TBEV感染。中和这些疫苗产生的抗体提供宿主保护；然而，T细胞介导的免疫作用尚未完全了解。(同上)。
寨卡病毒疫苗开发所追求的不同战略包括重组减毒活疫苗、纯化灭活疫苗(PIV)、DNA疫苗和病毒载体疫苗。今天，大多数针对ZIKV的疫苗都集中在诱导长寿命中和抗体(nAb)反应上。
虽然单一ZIKV疫苗的开发正在进行中，但Chattopadhyay及其同事探索了麻疹，腮腺炎，风疹和水痘(MMRV)疫苗模型之后的多种抗原方法(Id.，引用Chattopadhyay A.等人，疫苗)。(2018)36:3894–3900.doi：10.1016/j.vaccine.2018.05.095).在针对基孔肯雅病毒(CHIKV)和ZIKV的组合疫苗中，他们利用了表达CHIKV包膜多蛋白和ZIKV E蛋白的重组水疱性口炎病毒(VSV)。来自BALB/C小鼠的血清用单剂量107PFU重组VSV疫苗免疫，能够中和70％的ZIKV(巴西菌株PE243)，而那些给予两剂疫苗的小鼠能够中和80％的ZIKV。此外，来自BALB/C小鼠单次免疫的血清也能够中和100％的VSVΔG-eGFP/CHIKV假型。为了确定疫苗的保护功效，在用MR766寨卡病毒或CHIKV激发之前，对7周龄的A129小鼠进行肌肉注射免疫。接种疫苗的小鼠在感染任何一种病毒后都没有显示出病毒血症的迹象。尽管作者证明小鼠没有感染，但当受到挑战时，小鼠已经超过15周大。在这个特定的小鼠模型中，已知ZIKV感染不会导致小鼠死亡，但小鼠只会在感染后表现出短暂的疾病迹象。尽管如此，给予CHIKV的阴性对照小鼠在第3天就死于感染，而所有免疫小鼠都存活了下来。总体而言，该研究设法证明该疫苗能够预防免疫功能低下的小鼠的病毒血症，尽管作者没有提到任何感染的身体迹象。然而，没有证据表明该疫苗有助于在怀孕的水坝中诱导孕产妇nAb的产生，从而能够为新生儿提供保护。
利用预测算法软件，Zhang等人(Id.，引用张伟，李旭，林燕，田D.鉴定黄热病17D疫苗中NS4A和NS4B蛋白的三种H-2Kd限制性CTL表位。方法。2013；187:304–313.doi：10.1016/j.jviromet.2012.10.002)鉴定了YFV NS4A和NS4B蛋白中的三种无名表位，能够在YFV 17D免疫小鼠中引发强大的IFN-γ+CD3+CD8+T细胞反应。除了YFV 17D疫苗株外，还发现这些表位在几种YFV毒株中高度保守。已经表征了人类CD8+T细胞在YFV 17D感染过程中的效应功能。(同上，引用Blom K.，Braun M.，Ivarsson M.A.，Gonzalez V.D.，Falconer K.，MollM.，Ljunggren H.G.，Michaelsson J.，Sandberg J.K.原发性人类T细胞对黄热病病毒17D的反应的时间动力学，因为它从效应器成熟为记忆型反应。J.Immunol.2013；190：2150–2158.doi：10.4049/jimmunol.1202234)Blom等人发现，在感染后第10天、第14天和第90天之间，多功能效应器CD8+T细胞的下降，分别对应于峰值CD4+，效应器CD8+和效应记忆CD8+T细胞反应。此外，单功能CD8+T细胞在峰值CD4+T细胞反应期间表达CD107a，但后来转变为产生TNF-α作为其效应分子。虽然YFV特异性记忆CD8+T细胞表达与幼稚CD8+T细胞相似的表面分子，如CD45RA，CCR7，CD127和CD28(所有这些都与效应CD8+T细胞不同)，但记忆T细胞具有比幼稚细胞快得多的增殖动力学(同上，引用Akondy R.S.，Fitch M.，Edupuganti S.，YangS.，Kissick H.T.，李克卫，Youngblood B.A.，Abdelsamed H.A.，McGuire D.J.，CohenK.W.，et al.接种疫苗后人类记忆CD8 T细胞的起源和分化。自然界。2017；552:362–367.doi：10.1038/nature24633).
疫苗接种前的免疫状态和病毒复制都有助于疫苗接种时记忆T细胞的发育。CD8+记忆T细胞的进一步表征还表明，记忆池在感染后的前两周内广泛分裂，并且由每年分裂少于一次的静止细胞维持。与效应器CD8+T细胞不同，记忆CD8+T细胞不产生细胞毒性效应蛋白颗粒酶B或穿孔素。然而，颗粒酶B和穿孔素启动子处的CpG甲基化模式在两个细胞群之间没有显着差异，这表明表观遗传在维持持久记忆CD8+T细胞方面具有作用(Id.，引用AkondyR.S.，Fitch M.，Edupuganti S.，Yang S.，Kissick H.T.，Li K.W.，Youngblood B.A.，Abdelsamed H.A.，McGuire D.J.，Cohen K.W.等接种疫苗后人类记忆CD8 T细胞的起源和分化。自然界。2017；552:362–367.doi：10.1038/nature24633).
研究还表明，在病毒衣壳存在下，T细胞在产生乙型肝炎和丙型肝炎病毒的功能性免疫反应中起着重要作用(Garg，H.等人，病毒样颗粒疫苗的开发以及寨卡病毒的报告基因检测，J.Virol。(2017)91(20)：doi.orag/10.1128/JCI.00834-17，引用Duenas-Carrera S，Alvarez-Lajonchere L，Alvarez-Obregon JC，Herrera A，Lorenzo LJ，Pichardo D，Morales J.2000..
同样，对于登革热病毒4(DENV-4)，衣壳中的表位被细胞毒性T淋巴细胞(CTL)识别，这些细胞毒性T淋巴细胞与其他登革热病毒血清型具有交叉反应性(Id.，引用Gagnon，SJ等人(1996)J.Virol.70：141-147)。事实上，单独使用衣壳的免疫被证明可以产生一种保护性免疫反应，这种反应独立于中和抗体，并且在很大程度上依赖于细胞介导的免疫(Id.引用Lazo L，Hermida L，Zulueta A，Sanchez J，Lopez C，Silva R，Guillen G，GuzmanMG.2007)。来自登革热-2的重组衣壳蛋白诱导小鼠对同源病毒的保护。疫苗25：1064–1070。doi：10.1016/j.vaccine.2006.09.068).
此外，CD4 T细胞也可能作为专门的亚群参与保护。与裂解黄病毒感染的细胞有关(同上，引用Gagnon SJ，Zeng W，Kurane I，Ennis FA.1996。鉴定由血清型特异性识别的登革热4病毒衣壳蛋白上的两种表位和一组血清型交叉反应性人CD4+细胞毒性T淋巴细胞克隆。耶罗尔记70：141-147；Aihara H，Takasaki T，Matsutani T，Suzuki R，Kurane I.1998.日本脑炎病毒特异性人CD4(+)T细胞克隆的建立和表征：黄病毒交叉反应性，蛋白质识别和细胞毒性活性。J Virol72：8032–8036)。在病毒样颗粒(VLP)中包含衣壳需要功能性黄病毒蛋白酶，这里是WNV NS2B-3融合蛋白。NS2B-3融合蛋白编码序列本身长约2kb，可以包含在VLP平台，DNA疫苗和修饰的mRNA疫苗中。
II)副粘病毒科和肺病毒
A)副粘病毒科和肺病毒科概述
这副粘病毒科是包膜的、非分段的、负链的RNA病毒，包括属于两个亚科的主要人类病原体。这肺薇薇儿亚科包括呼吸道合胞病毒(RSV)和亚呼吸道病毒，而副粘液弧菌亚科包括，除其他外，麻疹病毒(MeV)，麻疹病毒属，腮腺炎病毒(MuV)的鲁布拉病毒属，人类副流感病毒(hPIV1-4)，以及最近出现的高致病性亨迪帕病毒亨德拉(HeV)和尼帕病毒(NiV)。这两个亚科的成员都对人类发病率和死亡率负有重大责任。特别是MeV，尽管有减毒活疫苗，但它仍然是全世界儿童死亡的主要原因。(Plemper，R.等人，麻疹病毒的结构和机制研究照亮副粘液病毒进入。PLoS Pathog.2011年6月；7(6)：e1002058).
副粘病毒颗粒是多形性的，具有脂质包膜，负极性的非分段RNA基因组以及病毒体表面密集堆积的糖蛋白。像横纹病毒、丝状病毒、博尔纳病毒和肺炎病毒一样，副粘病毒形成M目ononegavirales其特征是包膜病毒粒子，具有负极性的单链，非分段RNA基因组。(Cox，R.和Plemper，R.副粘病毒颗粒的结构和组织。Curr Opin Virol.2017年6月；24:105–114).
i)麻疹病毒(MeV)
麻疹病毒(MeV)是麻疹的病原体，是一种没有动物宿主的人类病毒，通过气溶胶或呼吸道飞沫有效传播。(格里芬麻疹中的免疫反应：病毒控制，清除和保护性免疫。病毒(2016)8：282；doi：10.3390/v8100282).
ii)腮腺炎病毒(MuV)
腮腺炎是由腮腺炎病毒(MuV)引起的，腮腺炎病毒是副粘病毒科包膜、非分段、负义RNA病毒家族。它是一种包膜颗粒，含有15，384个核苷酸的非分段负链RNA分子。MuV通过吸入或口腔接触受感染的呼吸道飞沫或分泌物通过呼吸途径传播，流行性腮腺炎的特征是疼痛的炎症症状，如腮腺炎和睾丸炎。该病毒具有高度嗜神经性，在大约一半的病例中具有中枢神经系统(CNS)感染的实验室证据。有症状的中枢神经系统感染发生频率较低；尽管如此，在引入常规疫苗接种之前，MuV是许多发达国家无菌性脑膜炎和病毒性脑炎的主要原因。(Rubin，S.等人，腮腺炎病毒的分子生物学，发病机制和病理学，“J.Pathol。(2015)235(2):242-252).
B)基于结构的副粘病毒功能分析
两种膜糖蛋白复合物，即附件(H，HN或G)和融合(F)蛋白，它们分别负责受体结合和通过病毒包膜与靶细胞膜融合进入细胞，对于副粘病毒家族的所有成员都是通用的。(柳Y，武田M，大野S，关F.麻疹病毒受体和趋向性。(2006)Jpn J InfectIon Dis.59：1–5).RNA基因组被病毒核衣壳(N)蛋白封装，形成螺旋核糖核蛋白(RNP)复合物，作为由病毒磷酸化(P)和大(L)蛋白组成的病毒RNA依赖性RNA聚合酶复合物的模板。基质(M)蛋白通过与RNP复合物中的N蛋白和膜包埋的糖蛋白复合物相互作用来组织颗粒组装。该家族的一些成员，例如红斑病毒属的病原体，除了这六种结构蛋白外，还含有一种小的疏水性(SH)跨膜蛋白。只有J型副粘病毒编码第四种整体膜蛋白，即跨膜蛋白(TM)，该蛋白刺激细胞间融合但不刺激病毒进入。(Li Z，Hung C，Paterson RG，Michel F，Fuentes S，et al.II型整体膜蛋白，J副粘液病毒TM促进细胞间融合。(2015)Proc Natl Acad Sci U S.112：12504–12509).
所有副粘液酶附着蛋白的外胚层由膜近端柄组成，其支持介导受体结合的末端球状头。(Plemper，R.等人，麻疹病毒的结构和机制研究照亮副粘液病毒进入。PLoSPathog.2011年6月；7(6)：e1002058).
在MeV中，靶细胞进入由两种病毒包膜糖蛋白介导，即附着(H)和融合(F)蛋白，它们形成复合物，实现包膜与靶细胞膜的合并。(Plemper，R.等人，麻疹病毒的结构和机制研究照亮副粘液病毒进入。PLoS Pathog.2011年6月；7(6)：e1002058).
腮腺炎病毒的包膜颗粒是多形性的，大小范围为100-600nm。在这种结构中是长而盘绕的电子致密核糖核蛋白(RNP)，其中包含MuV基因组。包裹的基因组包含七个串联连接的转录单元，按顺序排列：核(N)，V/P/I(V/磷酸-/I蛋白)，基质(M)，融合(F)，小疏水性(SH)，血凝素-神经氨酸酶(HN)和大(L)蛋白。可以在颗粒表面观察到小尖峰，对应于病毒HN和F糖蛋白。M蛋白与包膜，糖蛋白和核糖核蛋白(RNP)相互作用。V，I和SH蛋白在受感染的细胞中表达，但不被认为掺入病毒粒子中。
病毒复制和转录的模板是RNP复合物，它由N蛋白包裹的负链病毒RNA组成。RNA依赖性RNA聚合酶是L和P蛋白的复合物，作为复制品将负义(-)RNA复制到正义(+)RNA，并作为转录酶通过进入基因组3′末端的单个启动子从(-)RNP产生mRNA。在受感染的细胞中，HN和F糖蛋白通过内质网和高尔基体复合物运输到细胞表面。M蛋白参与将病毒RNP定位到表达F和HN糖蛋白的宿主细胞膜区域，促进感染细胞感染病毒粒子的萌芽。HN糖蛋白负责通过其受体唾液酸将新发芽的病毒附着到邻近细胞上，唾液酸大量存在于大多数动物细胞的表面上。HN糖蛋白与F糖蛋白协同作用，介导病毒到细胞的融合和细胞间膜的融合，促进病毒的传播。SH蛋白被认为通过阻断TNFα介导的细胞凋亡途径在逃避宿主抗病毒反应中发挥作用，并且对于病毒复制不是必需的。V蛋白和I蛋白由编码P蛋白的相同转录单元编码。与SH蛋白一样，V蛋白也参与逃避宿主抗病毒反应，在那里它抑制IFN的产生和信号传导。I蛋白的作用尚不清楚。(Rubin，S.等人，“流行性腮腺炎病毒的分子生物学，发病机制和病理学”。J帕索尔。2015年1月；235(2):242–252).
C)对副粘病毒感染的免疫反应
在将MeV引入呼吸道后，未成熟的肺树突状细胞(DC)或肺泡巨噬细胞捕获MeV并将其输送到区域淋巴结(LN)，在那里启动免疫反应，扩增病毒，并促进感染的传播。(勒德洛；柠檬；德弗里斯；麦奎德；米勒；范·阿梅隆根；尤克塞尔；Verburgh；奥斯特豪斯；de Swart，R.L.麻疹病毒感染猕猴上呼吸道上皮细胞是由上皮下免疫细胞介导的。J.维罗尔.2013,87,4033–4042)；梅斯曼；德弗里斯；麦奎德；杜普雷克斯；德·斯瓦特；Geijtenbeek，T.B.DC-SIGN+树突状细胞在非人灵长类动物麻疹病毒感染的发生和传播中的突出作用。PLoS ONE2012，7，e49573)。受感染的免疫细胞(B细胞、CD4+和CD8+记忆T细胞、单核细胞)然后进入循环并将病毒扩散到多个淋巴(例如脾脏、胸腺、LNs)和非淋巴样(例如皮肤、结膜、肾、肺、肝)器官，在那里它在内皮细胞、上皮细胞、淋巴细胞和巨噬细胞中复制。(德弗里斯；麦奎德；范·阿梅隆根；尤克塞尔；Verburgh；奥斯特豪斯；杜普雷克斯；de Swart，R.L.麻疹免疫抑制：猕猴模型的教训。PLoS Pathog.2012，8，e1002885)；(Moench，T.R.；格里芬；奥布里赫特；韦斯伯格；Johnson，R.T.有和无神经系统受累患者的急性麻疹：麻疹病毒抗原和RNA的分布。J.感染。Dis.1988，158，433–442)；(野泽，Y.；小野；安倍；佐久间；若狭，H.麻疹中Warthin-Finkeldey细胞的免疫组织化学研究。帕索尔。国际1994，44，442–447；麦切斯尼；米勒；罗塔；朱永德；安提帕；北卡罗来纳州莱什；艾哈迈德；贝里尼，W.J.实验性麻疹。I.正常和免疫宿主的发病机制。病毒学1997，233，74–84；莱特伍德；Nolan，R.麻疹中的上皮巨细胞作为酸在诊断中。J.百科1970,77,59–64；埃索伦；高桥；约翰逊；韦斯伯格；莫恩奇；韦瑟林；Griffin，D.E.急性致命性麻疹患儿的脑内皮细胞感染。克林。投资。1995,96,2478–2481；高桥；Umino，Y.；佐藤；小滨；池田；饭岛；藤泽，R.检测和比较麻疹和风疹中的病毒抗原。克林。感染。1996，22，36–39).
通常，对RNA病毒感染的先天反应主要由I型和III型IFN的受感染细胞产生主导。IFN的诱导是通过通过toll样受体或细胞质RNA解旋酶识别病毒RNA或蛋白质而发生的，这些解旋酶导致细胞质转录因子IFN调节因子(IRF)-3和活化B细胞的核因子kappa-轻链增强子(NFκB)的活化。IRF-3和NFκB易位到细胞核诱导早期反应蛋白的mRNA转录，例如活化时调节，正常T细胞表达和分泌/趋化因子(C-C基序)配体5(RANTES/CCL5)，IRF-7和IFN-β随后诱导具有抗病毒活性的IFN刺激基因(ISGs)，包括粘液病毒抵抗(Mx)，作用于RNA 1的腺苷脱氨酶(ADAR1)，ISG15，ISG56和IFN-α可以抑制病毒复制(Randall，R.E.；Goodbourn，S.干扰素和病毒：诱导，信号传导，抗病毒反应和病毒对策之间的相互作用。J.维罗尔将军.2008,89,1–47)；(米山市；藤田，T.识别先天免疫中的病毒核酸。牧师医生维罗尔。2010,20,4–22).
然而，由于通过MeV P，C和V蛋白的组合活性抑制干扰素(IFN)反应，初始先天免疫反应受到限制，这允许在10-14天的临床沉默潜伏期内广泛复制和传播病毒。(戴维斯；王明璋；伦尼克；满，F.；盖布尔斯克；梅斯曼；格林豪斯；Geijtenbeek，T.B.；杜普雷克斯；Gack，M.U.麻疹病毒V蛋白对磷酸酶PP1的拮抗作用是MDA5先天免疫逃逸所必需的。细胞宿主微生物(2014)16，19–30；凯斯勒；克雷默；Muller，C.P.麻疹病毒与早期诱导细胞因子的相互作用揭示了不同的野生型表型。病毒研究(2011)155，195–202；李忠；奥康斯基；Samuel，C.E.作用于RNA 1(ADAR1)的腺苷脱氨酶抑制麻疹病毒对干扰素的诱导。J.维罗尔.(2012),86,3787–3794；舒曼；普法勒；康泽尔曼麻疹病毒V蛋白与p65(RelA)结合以抑制NF-kappaB活性。J.维罗尔.(2011)85,3162–3171；蔡尔兹；兰德尔；Goodbourn，S.副粘病毒V蛋白与RNA解旋酶LGP2相互作用以抑制RIG-I依赖性干扰素诱导。J.维罗尔.(2012),86,3411–3421；蔡尔兹；安德烈耶娃；兰德尔；Goodbourn，S.副粘病毒V蛋白抑制mda-5的机制。J.维罗尔.(2009)83,1465–1473；凯格纳德；盖尔布瓦；拉伯纳迪尔；雅各布；琼斯；感染性绘图项目I-MAP；怀尔德；坦吉；Vidalain，P.O.麻疹病毒V蛋白阻断Jak1介导的STAT1磷酸化以逃避IFN-α/β信号传导。病毒学(2007)368，351–362；拉马钱德兰；巴黎人；Horvath，C.M.STAT2是甲虫病毒V蛋白介导的α/β干扰素信号传导抑制的主要靶标。J.维罗尔.(2008)82,8330–8338；希瓦科蒂；西维克；豪尔；舒尔茨；Griffin，D.E.通过麻疹病毒的野生型和疫苗株诱导树突状细胞产生I型和III型干扰素：缺陷干扰RNA的作用。J.维罗尔.(2013)87，7816-7827)，几乎没有证据表明麻疹期间IFN诱导(Shivakoti，R.；豪尔；亚当斯；林文华；杜普雷克斯；德·斯瓦特；Griffin，D.E.在用疫苗或野生型麻疹病毒株感染猕猴后，体内有限地产生I型或III型干扰素。J.干扰素细胞因子Res.(2015)35，292–301；于旭升；郑永明；史学士；钱富倩；王F.B.；刘晓刚；杨海；徐强；齐；扎先生；等。成人麻疹病毒感染诱导IL-10的产生，并与CD4+CD25+调节性T细胞增加有关。J.免疫学.(2008)181,7356–7366).
麻疹的首次出现是发热、流鼻涕、咳嗽和结膜炎的2-3天前驱症状，随后出现特征性斑丘疹，从面部和躯干扩散到四肢。皮疹是MeV特异性适应性细胞免疫反应的一种表现，与感染性病毒的清除相吻合。然而，从血液和组织中清除病毒RNA比清除感染性病毒慢得多，并且在皮疹消退后数周至数月内进行。RNA持久性的时期与宿主对感染的抵抗力下降相吻合，可以延长。恢复与对MeV再感染的终身保护有关。(米娜；梅特卡夫；德·斯瓦特；奥斯特豪斯；Grenfell，B.T.长期麻疹诱导的免疫调节会增加儿童传染病的总体死亡率。科学(2015)348，694–699).
有证据表明MeV感染会参与应激反应蛋白和炎症小体活化。在抗原呈递细胞(APC)中，MeV与DC特异性细胞间粘附分子-3抓取非整合素(DC-SIGN)的相互作用抑制RNA解旋酶活化，使感染增加应激诱导基因的表达而不诱导IFN(Shivakoti，R.；西维克；豪尔；舒尔茨；Griffin，D.E.通过麻疹病毒的野生型和疫苗株诱导树突状细胞产生I型和III型干扰素：缺陷干扰RNA的作用。J.维罗尔.(2013)87,7816–7827；梅斯曼；Zijlstra-Willems，E.M.；卡普泰因；德·斯瓦特；戴维斯；勒德洛；杜普雷克斯；加克；格林豪斯；Geijtenbeek，T.B.麻疹病毒通过DC-SIGN介导的PP1磷酸酶抑制树突状细胞中的RIG-I样受体激活。细胞宿主微生物(2014)16，31–42).体外研究表明，骨髓细胞的MeV感染刺激NACHT，LRR和PYD结构域含蛋白(NLRP3)炎性小体在有丝分裂素2依赖性过程中的组装，半胱天冬酶-1激活，然后成熟白细胞介素(IL)-1β和IL-18的裂解和分泌(Ichinohe，T.；山崎；小芝；柳柳，Y.线粒体蛋白线粒体蛋白线粒体2是RNA病毒感染后NLRP3炎症小体活化所必需的。美国国家科学院院刊(2013)110，17963–17968；科穆内；一之平；伊藤；Yanagi，Y.麻疹病毒V蛋白抑制NLRP3炎性小体介导的白细胞介素-1β分泌。J.维罗尔.(2011)85,13019–13026).MeV感染期间外周血单核细胞(PBMC)的转录分析显示炎症小体活化所需的NLRP3和IL-1βmRNA表达上调。麻疹期间先天反应的进一步体内证据包括NFκB诱导的蛋白质IL-6和IL-8/CXCL8的血浆水平升高(Zilliox，M.J.；莫斯；Griffin，D.E.麻疹病毒感染期间外周血单核细胞的基因表达变化。克林。疫苗免疫。(2007)14,918–923；菲利普斯；恩文武；奥科洛；Hassan，A.慢性营养不良尼日利亚儿童急性麻疹的代谢影响。J.努特.生物化学。(2004)15，281-288)和炎症小体产物IL-1β和IL-18(Zilliox，M.J.；莫斯；Griffin，D.E.麻疹病毒感染期间外周血单核细胞的基因表达变化。克林。疫苗免疫。(2007)14,918–923)；冈田；佐藤；片山；樋口；七条；土屋；北高山；竹内；安倍；冈部；等。麻疹患者和疫苗接受者之间与免疫抑制相关的宿主反应的比较分析。拱门维罗尔。(2001)146,859–874).因此，先天反应不包括IRF-3介导的I型或III型IFN诱导，但包括诱导NFκB和炎症小体相关细胞因子和趋化因子的子集，这些细胞因子和趋化因子对于启动适应性免疫应答很重要。
副粘病毒不仅被证明会破坏干扰素信号通路；仙台病毒(SeV)感染也使人和小鼠细胞对IFN-α/β无反应。
大多数副粘病毒通过使用替代起始密码子和mRNA编辑机制编码来自同一基因的P，V和C蛋白。P蛋白是病毒RNA聚合酶的结构成分，而V和C蛋白是病毒编码的辅助因子，其在一些副粘病毒中的功能是抑制IFNα/β信号通路。Didcock等人对SV5(猿猴病毒5)的V蛋白的研究表明，STAT1水平从感染后约4小时开始下降，最终变得无法检测到。Didcock，L.等人，“猿猴病毒5的V蛋白通过靶向STAT1进行蛋白酶体介导的降解来抑制干扰素信号传导，”J.Virol。(1999)73(12):9928-33).SV5 V蛋白降解STAT1和阻断IFN信号传导的能力由Andrejeva等人证实，使用2fTGH细胞组成表达SV5 V蛋白。Andrejeva，J等人，“分别由猿猴病毒5和人副流感病毒2型的V蛋白降解STAT1和STAT2：在α/β和γ干扰素存在下病毒复制的后果，”J.Virol。(2002)76(5):2159-67).这些结果表明，SV5 V蛋白通过靶向STAT1来阻断IFN信号传导，以实现蛋白体介导的降解。流行性腮腺炎病毒的富含半胱氨酸的V蛋白通过诱导STAT1的降解来抑制JAK/STAT途径。(Rubin，S.等人，“流行性腮腺炎病毒的分子生物学，发病机制和病理学”。J帕索尔。2015年1月；235(2):242–252)
STAT1还作为参与某些基因(包括半胱天冬酶和低分子多肽2(LMP2))的本构表达的分子。LMP2是蛋白酶体的一个亚基，参与T细胞抗原的处理。MHC I类抗原对于细胞表面膜上内源性病毒抗原的呈递是必需的。众所周知，IFN-γ信号通路通过诱导或激活ISGF-3复合物调节MHC I类表达。因此，已经假设STAT-1α的失活可能与MHC I类表达的降低相关。这种减少允许持续感染腮腺炎病毒的细胞逃脱宿主免疫监视。
流行性腮腺炎病毒诱导特异性IgM和IgG抗体的产生，其高血清水平是免疫系统暴露于病毒抗原的证据。
ii)T细胞对副肌氧病毒感染的反应
对单个猕猴的RNA清除和免疫反应的详细定量研究结合数学建模表明，T细胞反应(如IFN-γ产生细胞所示)与血液中传染性麻疹病毒的清除相关，但抗体和T细胞都需要解释病毒RNA的下降(Lin，W.H.；库约斯；亚当斯；格伦费尔；Griffin，D.E.麻疹病毒RNA的长期持久性是原发感染动态的特征。美国国家科学院院刊(2012)109，14989–14994).抗体被诱导到大多数病毒蛋白(Graves，M.；格里芬；约翰逊；赫希；德索里亚诺；罗登贝克；Vaisberg，A.在复杂和无并发症的麻疹病毒感染期间开发针对麻疹病毒多肽的抗体。J.维罗尔.(1984)49，409-412)，但功能不同的抗体和T细胞对不同位点清除的相对贡献尚不清楚。
免疫活化和淋巴细胞增殖，特别是对于CD4+T细胞，在皮疹消退后急性和数月内明显。在此期间，细胞因子产生从1型T细胞因子(例如IFN-γ)转变为2型细胞因子(例如IL-4，IL-10，IL-13)和产生IL-17的细胞(Lin，W.H.；维拉尔塔；亚当斯；罗兰；沙利文；Griffin，D.E.Vaxfectin佐剂可改善幼年恒河猴对编码麻疹病毒血凝素和融合蛋白的DNA疫苗的抗体反应。J.维罗尔.(2013)87,6560–6568)；沃德；约翰逊；韦斯伯格；饶雷吉；Griffin，D.E.细胞因子体外生成和天然麻疹病毒感染的淋巴组织增殖缺陷。克林。免疫。免疫变性醇。(1991)61,236–248；莫斯；瑞恩；蒙泽；Griffin，D.E.赞比亚儿童麻疹期间白细胞介素(IL)-4、IL-5和IL-10的差异调控。J.感染。Dis.(2002)186，879–887；格里芬；沃德，B.J.差异CD4T细胞活化在麻疹中。J.感染。Dis.(1993)，168，275–281.这种转变可能促进B细胞成熟，并有助于抗体分泌细胞的持续产生(Nair，N.；莫斯；斯科特；努加拉；恩德洛武；利洛；瑞恩；蒙泽；奎因；考森斯；赞比亚儿童的HIV-1感染损害了疫苗接种和感染后麻疹病毒特异性免疫球蛋白G的发育和亲和力成熟。J.感染。Dis.(2009)200，1031–1038).抗体质量的持续改善，如亲和力增加所证明，提示T滤泡辅助剂(T高频)细胞和B细胞选择在淋巴组织的生发中心。长寿命浆细胞的发育对于维持生命的血浆抗体水平是必要的(Amanna，I.J.；Slifka，M.K.确定浆细胞寿命和体液免疫持续时间的机制。免疫。修订版(2010)236，125–138)。
T细胞免疫也被认为对抗体水平低的个体具有直接保护作用(Ruckdeschel，J.C.；格拉齐亚诺；Mardiney，M.R.，Jr.额外的证据表明，细胞相关的免疫系统是抵御麻疹(rubeola)的主要宿主防御措施。细胞免疫。(1975)17,11–18).T细胞的抗病毒作用可以通过分泌抑制病毒复制的细胞因子(例如，IFN-γ)和通过感染细胞的细胞毒性消除来介导。由于T细胞不直接阻断感染，而是在感染发生后对控制或消除病毒感染的细胞作出反应，因此与中和抗体相比，T细胞对保护的贡献通常被认为是次要的。对猕猴的研究表明，单独使用T细胞免疫不能防止MeV感染或疾病，但确实有助于RNA清除和在挑战感染后产生强大的T细胞和抗体反应(Lin，W.H.；潘振华；亚当斯；劳伯；Griffin，D.E.疫苗诱导的麻疹病毒特异性T细胞不能预防感染或疾病，但有助于随后清除病毒RNA。mBio(2014)5，e01047).因此，免疫介导的清除和长寿命保护的产生需要开发有效和持久的MeV特异性抗体以及CD4+和CD8+T细胞反应。
研究人员已经证明，副粘病毒科在T细胞水平上交叉反应，但不在抗体水平上发生(Ziola，B.等人，“副粘病毒科病毒之间的T细胞交叉反应性”)。病毒免疫。(1987)1(2):111-9).腮腺炎病毒和副流感病毒之间的T细胞反应性是预期的，因为这些病毒具有血清学相关性。这些研究人员发现了呼吸道合胞病毒(RSV)，麻疹病毒和流行性腮腺炎病毒之间强大的双向T细胞交叉反应性。RSV通常在一岁之前感染儿童，因此许多儿童在达到MMR疫苗接种的推荐年龄(12-15个月)之前已经获得了T细胞免疫力。这意味着RSV诱导的T细胞通过与腮腺炎和麻疹病毒抗原的交叉反应，可能会影响随后对这些疫苗病毒中的一种或两种免疫力的发展。(Ziola，B.等人，“副粘病毒科病毒之间的T细胞交叉反应性”。病毒免疫。(1987)1(2):111-9)
已知红斑病毒靶向STAT1进行降解，这可能与MHC I类表达的降低有关。这种减少导致CTL激活减少，从而有利于腮腺炎病毒的复制和传播。细胞免疫在流行性腮腺炎病毒感染中的作用得到了来自实验动物以及人类的数据的支持。腮腺炎性脑膜炎是腮腺炎病毒感染的常见并发症，在中枢神经系统中积累的MuV特异性CTL可以在脑脊液(CSF)中检测到。研究人员已经证明，在流行性腮腺炎脑膜炎的急性期，CD8+和HLA-DR+细胞在脑脊液中增加，并且MuV抗原激活的细胞毒性抑制T细胞可能会积聚。其他人则专注于传染性中枢神经系统疾病患者的T细胞受体(TCR)基因库。他们评估了腮腺炎性脑膜炎患者T淋巴细胞中的TCR Vα基因表达，并表明在脑脊液中的使用很普遍，但偏向于每个患者的三个或更少的家庭。Vα基因的偏倚使用表明，具有显性Vα基因的T细胞可能是腮腺炎特异性T淋巴细胞，这些T淋巴细胞被选择性地招募到CNS中。(Flynn，M.，Chapter 6：对腮腺炎病毒的免疫反应。病毒学研究进展，5(2003)：97-115).
D)副粘病毒疫苗开发、挑战或失败
存在针对副粘病毒的许可疫苗，通常配制成腮腺炎，麻疹和风疹(MMR)儿科疫苗产品的成分，这些产品广泛分布在世界各地。
MMR疫苗通常仅推荐用于年龄较大的婴儿或1岁以上的儿童。这些儿童不再具有高滴度的母体保护性抗体，因此特别容易受到麻疹病毒感染。(Kowalzik F，Faber J和KnufM.MMR和MMRV疫苗。疫苗(2017)(Epub预印本)；DOI：10.1016/j.vaccine.2017.07.051)。因此，母体抗体可能会削弱幼儿的疫苗。(Jones BG，Sealy RE，Surman SL等人，基于仙台病毒的RSV疫苗在体内母体抗体模型中可防止RSV挑战。疫苗(2014)32：3264–3273).
III)托加病毒科和马托那病毒科
A)托加病毒科和马托那病毒科家族概述
家庭托加病毒科包括四个属：甲型病毒包括26种，鲁比病毒包括一个物种，瘟疫病毒包括三个物种，以及动脉病毒包括一个物种。该家族中对人类疾病重要的病毒包括：基孔肯雅病毒，东部马脑炎病毒，委内瑞拉马脑炎病毒和α病毒属的西部马脑炎病毒；和鲁比病毒属的风疹病毒。
托加病毒具有以下特征：球形病毒颗粒，直径为50-70nm，具有表面突起的包膜，其中包含两个或三个多肽，通常糖基化，包含核心蛋白和单链阳性RNA的核衣壳，其分子量约为4x106.通常，成熟是通过直径30-35nm的球形核衣壳通过细胞质膜萌芽而发生的，可能具有二十面体对称性。结构蛋白的翻译发生在亚基因组信使RNA上。几乎所有的甲型病毒物种都是通过蚊子传播的。传播也发生于经变(甲型病毒)或经胎盘传播(鲁比病毒和瘟疫病毒)。一个属的成员在血清学上是相关的，但与其他属的成员没有关系。
i)基孔肯雅病毒
基孔肯雅病毒(CHIKV)是一种人畜共患病毒，已在非洲和亚洲被发现，最近在北美和南美以及欧洲被发现。它通过伊蚊属的受感染蚊子叮咬传播；城市传播周期是可能的，因为受感染个体中病毒血症水平足够高。
CHIKV感染的病理学始于2-10天的潜伏期，然后发展到急性期，然后是慢性期。在急性期，据报道多关节痛，其在慢性期发展为慢性关节炎。在急性期，临床症状还包括高烧、严重的关节和肌肉疼痛、皮疹、虚弱和头痛以及淋巴细胞减少或淋巴细胞计数低、中度血小板减少或血小板计数低。
ii)风疹病毒(RV)
风疹病毒(RV)，一种单链、阳性RNA病毒鲁比病毒属，最近已从托加病毒科对一个新家庭，马托那韦里科.目前共有13种RV基因型(代表2个分支)已被识别，但目前全世界最常见的2种基因型1E和2B。(Perelygina L，Chen Mh，Suppiah S，Adebayo A，Abernathy E等人(2019)传染性疫苗衍生的风疹病毒在原发性免疫缺陷儿童的皮肤肉芽肿中出现，持续和进化。PLOS病原体15(10)：e1008080)。风疹在世界范围内以季节性分布发生。感染的高峰期在冬末或早春。在1970年代免疫接种计划实施之前，风疹是美国出生缺陷的主要原因。自1969年获得疫苗许可以来，美国没有发生过重大流行病，发病率下降了99％。持续存在的先天性风疹病例是由于未接种疫苗的易感年轻女性感染。(Parkman PD.Togaviruses：风疹病毒.在：男爵S，编辑。医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校；(1996)第55章.可从：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8200/)
该病通过直接或飞沫接触呼吸道分泌物传播。风疹病毒在呼吸系统的细胞中繁殖；随后是病毒血症扩散到靶器官。先天性感染通过胎盘传播。(Parkman PD.Togaviruses：风疹病毒.在：男爵S，编辑。医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校(1996年)第55章。可从以下位置获得：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8200/)。
风疹仍然是一个公共卫生问题。日本的风疹流行，2013年前6个月发生了11,000多例风疹病例，并发生了至少13例先天性风疹综合征(CRS)病例，这凸显了部分疫苗接种策略导致重大疫情的事实。在日本疫情中，70％的风疹病例发生在20至39岁的男性中，这表明仅向青春期女孩提供风疹疫苗的初始策略存在弱点。2012年，波兰和罗马尼亚也经历了风疹疫情，这些风疹主要影响男性，这是由于最初侧重于女性疫苗接种的疫苗接种策略。(兰伯特，N.，“风疹”柳叶刀。(2015)6月6；385(9984):2297–2307).
与麻疹病毒和流行性腮腺炎病毒一样，全球风疹病毒的免疫接种率明显下降。
限制现有风疹疫苗普遍使用的主要因素之一是担心“矛盾效应”-婴儿和幼儿中风疹免疫覆盖率持续较低可能会减少儿童期风疹的暴露，这可能导致育龄妇女的易感性增加与疫苗前时代相比，因为这些妇女既没有接种疫苗也没有接触病毒。(兰伯特，N.，“风疹”柳叶刀。(2015)6月6；385(9984):2297–2307).
此外，疫苗失败的发生率有限，这被认为是在预先存在的抗体中和活病毒疫苗株时发生的。例如，低水平免疫可能是由先前的感染引起的，例如细小病毒或EB病毒感染，或Rh因子的存在。(兰伯特，N.，“风疹”柳叶刀。(2015)6月6；385(9984):2297–2307).
B)基于结构的托加病毒和马顿病毒功能分析
RV是一种包膜病毒，具有9.6kb的单链阳性RNA基因组。病毒粒子的粒径范围为600至
Figure BDA0003838332750000361
大多数球形病毒粒子的直径约为
Figure BDA0003838332750000362
Figure BDA0003838332750000363
～31kDa)和糖蛋白E1(58kDa)和E2(42-47kDa)。衣壳蛋白与RNA基因组相互作用并形成核衣壳，其被E1和E2排列在其上的脂质膜包围。两种非结构蛋白p90和p150也由病毒编码，它们与病毒复制有关。
甲型病毒和RV具有相似的基因顺序和表达策略，但不同之处在于甲型病毒是二十面体的，它们的核衣壳在细胞质中组装，病毒粒子从质膜中芽，而RV病毒粒子是多形性的，核衣壳在高尔基体膜上组装，然后病毒萌芽进入该细胞器。RV病毒粒子的多态性一直是决定病毒颗粒结构的限制因素。与所有Togavirus一样，RV的结构蛋白被合成为与宿主细胞中的内质网相关的多蛋白前体。多蛋白被宿主细胞信号肽酶共翻译切割，但与甲型病毒衣壳蛋白不同，RV衣壳蛋白仍然通过疏水性E2信号肽附着在膜的细胞质侧。(Prasad，M.，etal.，风疹病毒衣壳蛋白结构及其在病毒组装和感染中的作用。美国国家科学院院刊(2013)12月10；110(50)：20105-10).
风疹病毒是一种球形、40至80nm、阳性、单链RNA病毒，具有尖峰状、含血凝素的表面突起。电子致密的30至35nm核心被脂蛋白包膜包围。风疹病毒含有包裹在宿主来源的脂质膜中的多形核衣壳。两个蛋白质尖峰E1和E2锚定在膜的外层。E1蛋白负责受体介导的内吞作用，是免疫显性抗原。针对E1中和结构域的抗体的测量可以用作针对风疹病毒的保护的相关因素。E2蛋白是膜结合的，并在E1蛋白行之间形成连接。(兰伯特，N.，“风疹”柳叶刀。(2015)6月6；385(9984):2297–2307).
人类是唯一已知的风疹病毒宿主，产后人际传播通过直接或飞沫接触感染者的呼吸道分泌物而发生。虽然围绕感染的早期事件表征不完全，但病毒几乎肯定会在呼吸道细胞中繁殖，延伸到局部淋巴结，然后经历病毒血症扩散到靶器官。随后在选定的靶器官(如脾脏和淋巴结)中进行额外复制，导致继发性病毒血症，风疹病毒广泛分布。此时(感染后约7天和皮疹发作前7至10天)，可以在血液和呼吸道分泌物中检测到病毒。病毒血症在皮疹发作后不久消失；它也与循环中和抗体的出现有关。然而，病毒从呼吸道排出可能在皮疹发作后持续长达28天。(Parkman PD.Togaviruses：风疹病毒.在：男爵S，编辑。医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校(1996年)。第55章.可从：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8200/)
C)对托加病毒科和马通病毒科病毒感染的免疫反应
细胞免疫在风疹中的作用尚不清楚，尽管从症状上讲，托加病毒科感染的定义是淋巴细胞减少和中度血小板减少症。
D)托加病毒科和马通病毒科疫苗开发、挑战或失败
目前在美国获准使用的活风疹病毒株是作为MMR疫苗一部分使用的RA27/3毒株。已知该疫苗在免疫功能正常的个体中持续有限时间，导致轻度并发症，如成年女性的短暂性关节痛或关节炎。疫苗病毒参与Fuchs葡萄膜炎的病理学也被怀疑。疫苗病毒与先天性缺陷无关，但在无意中接种了孕妇(Perelygina L，Chen Mh，Suppiah S，Adebayo A，Abernathy E等人)无意中接种了疫苗衍生的风疹病毒(Perelygina L，Chen Mh，SuppiahS，Adebayo A，Abernathy E等人)后，报告了胎儿的无症状持续感染(2019)感染性疫苗衍生的风疹病毒在原发性免疫缺陷儿童的皮肤肉芽肿中出现，持续存在和进化。PLOS病原体15(10)：e1008080)。关于MMR疫苗的进一步讨论可以在对副粘病毒的讨论中看到。
IV)丝状病毒
A)概述丝状体科家庭
家庭丝状体科是一系列包膜单链RNA(-)病毒，包括三个不同的属：单特异性Cuevavirus，埃博拉病毒(EBOV)和单特异性马尔堡病毒(MARV)。丝状病毒得名于它们表现出极端多态性的丝状或线状病毒粒子：病毒粒子可能呈U形，6形或圆形。它们的长度可能会有所不同，但它们通常具有
Figure BDA0003838332750000381
的均匀直径。
典型的丝状颗粒具有脂质包膜，上面覆盖着长度约为10nm的糖蛋白尖峰。在这个脂质包膜下是螺旋核衣壳。基因组长度约为19kb，由七种结构蛋白组成，其中病毒蛋白NP，VP35，VP30和L形成病毒核苷结构，L也是进行病毒转录和复制的RNA依赖性RNA聚合酶，GP是表面病毒糖蛋白，通过受体结合和融合介导进入宿主细胞；VP24和VP40是膜相关基质蛋白。(Fermin，Gustavo和Paula Tennant。Virus：Molecular Biology，Host Interactions andApplications to Biotechnology，由Jerome E.Foster编辑，Elsevier Science&Technology，2018。ProQuest Ebook Central，https://ebookcentral.proquest.com/lib/jhu/detail.action？docID＝5322098).
i)马尔堡马尔堡病毒(MARV)
马尔堡病毒属包含一个单一的物种，维多利亚湖马尔堡病毒，其中包含两种毒株：马尔堡病毒(MARV)和Ravn病毒(RAVV)。这种病毒只在地理上爆发过几次：马尔堡、德国、津巴布韦、南非、刚果民主共和国和安哥拉。
ii)埃博拉病毒(EBOV)
埃博拉病毒包括以下对人类具有致病性的物种：本迪布焦埃博拉病毒(BDBV)、扎伊尔埃博拉病毒(ZEV)、苏丹埃博拉病毒(SUDV)和Tai Forest埃博拉病毒(TAFV)。
B)基于结构的丝状病毒功能分析
丝状病毒共享一个共同的基因组组织，具有七个编码所有病毒蛋白的开放阅读框：核蛋白(NP)，病毒蛋白VP35和VP40，表面糖蛋白(GP)，病毒蛋白VP30和VP24以及“大”聚合酶(L)。(Martin，B.，用于抗病毒药物发现的丝状病毒蛋白：复制周期的结构/功能基础。抗病毒研究(2017)May；141：48-61).
丝状病毒通过GP的相互作用进入细胞，GP是包膜中唯一的病毒糖蛋白，具有两个不同的区域-GP1和GP2。GP1以I类膜融合蛋白的方式起作用，并具有受体结合区(RBR)。这种RBR在MARV和EBOV之间具有高氨基酸同一性(约47％)，并附着在被认为由两个丝状病毒属共享的细胞受体上。病毒通过内吞作用进入细胞，其中半胱氨酸蛋白酶切割病毒糖蛋白的GP1区域。这允许GP1与称为Niemann-Pick C1(NPC1)的内部内体蛋白受体结合。一旦发生这种情况，GP2区域促进病毒膜与内体膜的融合，病毒基因组被释放到细胞质中。病毒基因组转录成mRNA是由病毒核衣壳蛋白VP30的结合开始的，并且从3′末端开始。病毒蛋白L充当RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)，与其辅助因子VP35和宿主细胞的DNA拓扑异构酶一起协调基因组的复制。病毒基因组的翻译导致病毒蛋白的积累，VP35和NP启动抗原组的产生。这些抗原组反过来被用作产生额外病毒基因组的模板。然后病毒蛋白在细胞膜上积聚，其中病毒糖蛋白G棘刺插入宿主细胞膜。NP蛋白的表达导致宿主细胞中的包涵体，除NP外，宿主细胞还封装了蛋白质VP24，VP30，VP35和L，并与嵌入细胞膜中的G蛋白相关。然后，这会导致特征性丝状病毒粒子从细胞中萌芽，主要是在VP40的影响下。(Fermin，Gustavo和PaulaTennant。Viruses：Molecular Biology，Host Interactions and Applications toBiotechnology，由Jerome E.Foster编辑，Elsevier Science&Technology(2018)ProQuestEbook Central，https://ebookcentral.proquest.com/lib/jhu/detail.action？docID＝5322098)。
病毒糖蛋白GP允许进入单核细胞和巨噬细胞，随后对这些细胞的损伤导致与发烧和炎症相关的细胞因子的产生。它还允许病毒进入内皮细胞，对这些细胞的损伤直接导致血管完整性的丧失，从而导致出血。其他病毒蛋白在不同的感染点充当毒力因子。VP35隔离病毒RNA，帮助外来基因组逃避先天免疫的检测。该蛋白质还竞争性地抑制宿主IFN调节因子的激活，阻止IFN-β产生。VP24，VP 30和VP40也被证明是保护性宿主RNAi途径的抑制因子，进一步降低了先天免疫反应。EBOV还通过封端和聚腺苷酸化其mRNA来逃避细胞的免疫系统，该系统通过封端和聚腺苷酸化其mRNA来区分self-RNA(封端)和非自身RNA(无上限)-这是VP35精心策划的另一个过程。(Fermin，Gustavo和Paula Tennant。Viruses：MolecularBiology，Host Interactions and Applications to Biotechnology，由Jerome E.Foster编辑，Elsevier Science&Technology(2018)ProQuest Ebook Central)。
对丝状病毒感染的免疫反应。对表达埃博拉包膜糖蛋白的人副流感病毒3型载体疫苗的气溶胶给药不仅能够引发中和抗体，而且能够在猕猴的肺部产生CD103+T细胞反应。这些组织驻留记忆的很大一部分(T马币)T细胞是多官能的，对两个或多个活化标志物表现出阳性。此外，单剂量的这种疫苗可以100％保护免受感染挑战。由于在最近的埃博拉疫情中，很大一部分传播是通过皮肤接触传播的，因此通过瘢痕化接种疫苗被认为值得探索。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
C)丝虫科疫苗开发、挑战或失败
目前尚无针对EBOV或MARV感染的已批准疫苗，也没有针对丝状病毒的有效治疗方法。最初尝试生产丝状病毒疫苗的重点是使用灭活的全病毒粒子，在非人灵长类动物(NHP)模型中取得了好坏参半的成功。后来的研究开始测试病毒样颗粒，病毒载体或表达丝状病毒基因的质粒DNA作为疫苗平台。大多数平台都基于产生针对GP的免疫反应，希望产生中和抗体，以防止丝状病毒感染。然而，目前尚不清楚需要诱导哪些类型的免疫反应才能成功接种丝状病毒感染疫苗(Bradfute，Steven B等人的“丝状病毒疫苗”)。人类疫苗vol.7，6(2011)：701-11.doi：10.4161/hv.7.6.15398).
由于理论上的安全性问题，传统的疫苗平台，如减毒活疫苗和灭活病毒疫苗，不太可能用于人类。已经开发了几种动物模型来研究丝状病毒感染的发病机制并评估疫苗接种策略的有效性，但专家认为，动物模型和与疫苗接种工作的不一致仍然不能证明在人类中广泛接种疫苗是合理的。有必要进行进一步的研究来评估最理想的免疫策略，包括在广泛的人群中具有安全性和免疫原性的平台(Sarwar，Uzma N等人，“丝状病毒的出现和疫苗开发：旅行医学医疗保健从业者的观点”。旅行医学和传染病vol.9，3(2011)：126-34.doi：10.1016/j.tmaid.2010.05.003).
V)正粘病毒科病毒
A)正粘病毒科概述
这正粘病毒科家族由五属的分段单链RNA病毒组成：流感病毒A，流感病毒B，流感病毒C，Isa病毒和Thogotovirus。该家族之所以这样命名，是因为它的特点是病毒附着在细胞表面粘液蛋白上的能力(“粘液”在希腊语中是粘液的意思)，但与副粘液病毒科相比，它更“正统”-另一组RNA病毒(讨论en infra)，其特征还在于附着在产生粘液的细胞上的能力。甲型、乙型和丙型流感病毒，代表该科五属中的三种正粘病毒科，其特征在于分段的负链RNA基因组。测序已经证实，这些病毒具有共同的遗传祖先；然而，它们在遗传上已经分化，使得重排(意味着病毒之间病毒RNA片段的交换)据报道发生在每个属内，或者类型，但不是跨类型(Bouvier，Nicole M和Peter Palese。“流感病毒的生物学。疫苗卷26增刊4，增刊4(2008)：D49-53.doi：10.1016/j.vaccine.2008.07.039).
i)甲型、乙型和丙型流感病毒
流感病毒基因组可以随着时间的推移逐渐变化，由于催化复制周期的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的易出错性，积累新的突变。这种基因逐渐变化的过程被称为抗原漂移。由于正粘病毒基因组的分段性质，它们也可以进行基因组重排。例如，在同时感染两种相关病毒的细胞中，可能发生片段交换，产生可行且稳定的重排剂/新的遗传菌株。这种重排发生在自然界中，是遗传变异的重要来源。甲型流感病毒也可能经历突然的重大变化，例如，当来自动物种群的流感病毒获得感染人类的能力时，导致感染人类的流感病毒中产生新的HA和/或新的HA和NA蛋白，从而产生新的甲型流感亚型。这种“抗原转移”发生在2009年春天，当时一种带有北美猪、欧亚猪、人类和鸟类基因的H1N1病毒出现，感染了人类并迅速传播，引发了一场大流行。
流感菌株通常由嵌入在病毒颗粒膜中的HA和NA蛋白的抗原特性来定义。A型病毒根据血凝素(H1至H16)和神经氨酸酶(N1至N9)的性质分为血清学亚型。菌株分化还包括原产地宿主生物体、首次病毒分离的地理位置、菌株编号和分离年份，以及由与HA和NA蛋白的抗原描述相对应的数字定义，例如病毒A/California/04/09(H1N1)或病毒A/猪/Iowa/15/30(H1N1)。(Fermin，Gustavo和Paula Tennant。Viruses：Molecular Biology，HostInteractions and Applications to Biotechnology，由Jerome E.Foster编辑，ElsevierScience&Technology(2018)。ProQuest Ebook Central，https://ebookcentral.proquest.com/lib/jhu/detail.action？docID＝5322098).
B)基于结构的正粘病毒功能分析
正粘病毒颗粒呈球形或多形，直径范围为80至120nm。衣壳具有管状螺旋对称性，具有分段负极性RNA。典型的正粘病毒基因组被分割，由不同长度(50-150nm)的核糖核蛋白组成，周围是嵌入病毒糖蛋白和非糖基化蛋白的膜。以下膜相关病毒蛋白存在于病毒颗粒的表面：血凝素(HA，负责宿主细胞结合和病毒进入)，神经氨酸酶(NA，负责病毒出芽和释放)和基质蛋白(M2；参与病毒基因组复制的离子通道)。在病毒粒子中，RNA基因组片段与核蛋白(NP)结合，以及形成病毒RNA聚合酶复合物的几种病毒蛋白(RNA聚合酶酸性，RNA聚合酶碱性1和RNA聚合酶碱性2)(RNP)。RNP周围是一层基质蛋白1(M1)，它参与RNP的核转运。非结构蛋白1和2(NS1和NS2)分别参与调节病毒蛋白表达和复制，其中NS2也以低量存在。(Fermin，Gustavo和Paula Tennant。Viruses：MolecularBiology，Host Interactions andApplications to Biotechnology，由Jerome E.Foster编辑，Elsevier Science&Technology(2018)Pr oQuest Ebook Central，https://ebookcentral.proquest.com/lib/jhu/detail.action？docID＝5322098)。
甲型流感和乙型流感病毒有八个单链RNA(-)的基因组片段，丙型流感病毒有七个。RNA片段1，2和3分别编码PB2，PB1和PB-A(它们包含病毒聚合酶复合物P)，而片段4，5和6分别编码HA，NP和NA蛋白。片段7和8编码两个蛋白质，每个蛋白质具有重叠的读取框：M1/M2和NS1/NS2。丙型流感病毒与甲型和乙型流感病毒的不同之处在于缺乏NA基因。每个片段都有50个和30个未翻译区域(UTR)，这对于片段的转录、翻译、复制和高效打包成新的病毒颗粒至关重要。
流感病毒A，流感病毒B，流感病毒C在其病毒复制阶段具有相似性。第一阶段包括病毒通过受体N-乙酰神经氨酸(NeuAc)或唾液酸与病毒HA之间的相互作用对细胞的吸附。人类病毒通常存在于NeuAc相互作用中，其中糖苷以α2，6型键与半乳糖结合(禽类病毒通常以α2，3键存在)。在称为小病毒毒素的过程中，病毒通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞，由HA的HA1结构域促进。然后将病毒运输到细胞的内质网(ER)；内体内pH值的降低导致HA的HA2结构域的构象变化。构象变化介导病毒包膜和内体膜之间的融合，因此RNP被释放到细胞质中。RNP迁移到受感染细胞的细胞核，这是一种由病毒NP蛋白中的几个核定位信号驱动的现象。一旦进入细胞核，复制事件就开始了，互补RNA(+)(cRNA)被合成，并作为合成新病毒RNA(vRNA)的模板，同时作为信使RNA(mRNA)合成病毒蛋白的模板。mRNA的合成是通过称为cap-snacting的过程完成的，其中病毒通过其PA亚基从细胞RNA中侵占盖子，用作病毒mRNA合成的引物。这需要细胞DNA依赖性RNA聚合酶(Pol II)持续产生前mRNA。该病毒进一步利用Pol II对某些病毒产品的转录剪接能力，因为病毒缺乏这种活性。
负责复制和转录的病毒蛋白包括转录复合物(PB1，PB2和PA)和NP的三个亚基。这三个亚基复合物以顺序方式与细胞蛋白相互作用，合成vRNA和cRNA。另一个关键的病毒蛋白是NS1，它很早就表达，在调节病毒基因的表达中起着重要作用；它是抑制细胞mRNA合成的主要介质，因此是受感染细胞中宿主蛋白合成的主要介质。最终，vRNA与新合成的RNPs结合，这些RNA又与基质蛋白(M1)结合。vRNA-RNP复合物通过病毒NS2蛋白输出到细胞质中。RNP-M1-NS2复合物被引导到细胞膜，而合成时病毒表面蛋白(H，N和M2)分别位于内质网和高尔基体中。新病毒颗粒的组装是在感染上皮细胞的顶极进行的，距离感染开始仅八小时。M1蛋白与表面蛋白和RNP的内部队列相互作用，在病毒颗粒的萌芽中起着关键作用。每个病毒颗粒中包含八个RNA片段的机制尚不清楚。NA的唾液酸酶活性有助于病毒颗粒从细胞表面释放。它实际上破坏了H和NeuAc之间的键，从而避免了聚集体的形成。通常，细胞凋亡是由NA、NS1和PB1蛋白诱导的。(Fermin，Gustavo和Paula Tennant。Viruses：MolecularBiology，Host Interactions and Applications to Biotechnology，由Jerome E.Foster编辑，Elsevier Science&Technology(2018)ProQuest Ebook Central，https://ebookcentral.proquest.com/lib/jhu/detail.action？docID＝5322098)。
C)对正粘病毒科感染的免疫反应
对人类样本的分析表明，流感特异性T马币可以在肺组织中大量发现，突出了它们在自然感染中的作用。尽管表达低水平的颗粒酶B和CD107a，但这些CD8+T马币具有多样化的T细胞受体(TCR)库，高增殖能力，并且是多功能的(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.和Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).流感感染史表明，由于CD8+T马币的积累，可能对再次感染的保护水平更高在肺部。此外，恒河猴模型中对甲型流感病毒感染的自然免疫反应表明，肺中产生的流感特异性CD8+T细胞的很大一部分表型确认为CD69+CD103+T马币.与肺实质T马币不同，气道CD8+TRM细胞溶解性差，通过产生快速而强大的IFN-γ反应来参与早期病毒复制控制。旁观者CD8+T马币也可能通过抗原非特异性、NKG2D介导的免疫参与感染的早期免疫反应。功能T马币的产生预防异型亚型流感感染似乎依赖于CD4+T细胞的信号。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
CD4+T马币的作用也有报道。就像他们的CD8+同行一样，CD4+T马币在早期感染期间也会产生显著的IFN-γ反应。除了T马币的CD8+和CD4+子集，存在于肺部的NK1.1+双阴性T记忆细胞的一个子集也在流感感染中发挥作用。综上所述，这些研究和其他研究表明，T马币需要获得最佳保护。但是，与T马币不同在其他部位，如皮肤、肺T马币不会长时间维护。肺T马币的逐渐丧失似乎是对流感感染的异型免疫力丧失的原因。肺T马币表现出转录谱，使它们容易发生细胞凋亡。尽管证据相互矛盾，但似乎维持肺CD8+T马币群体依赖于循环CD8+T细胞的持续接种。然而，随着时间的推移，循环的CD8+T细胞采用转录谱，降低了它们分化成T马币的能力。.关于T马币的产生需要局部抗原的证据也存在相互矛盾的证据。在肺部。在小鼠模型中鼻内给予减毒流感活疫苗
Figure BDA0003838332750000461
诱导CD4+和CD8+TRM，其提供一定程度的跨菌株保护，独立于中医和抗体。鼻内给予PamCys2或AdjuplexTM已被证明具有产生保护性流感特异性肺CD8+T马币的能力与流感感染的自然反应相比，IFN-γ分泌潜力相似。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
D)正粘病毒科疫苗的开发，挑战或失败
流感病毒是相对简单的，含有RNA的病毒，具有很强的免疫原性表面蛋白，特别是HA。然而，它们的分割基因组和容易出错的RNA依赖性RNA聚合酶使这些病毒能够经历抗原转移和抗原漂移，这反过来又导致一系列哺乳动物和鸟类物种(包括人类)的适应性免疫反应的逃避。由于其适应能力，流感病毒继续扰乱生产针对该疾病的持久疫苗的努力(Bouvier，Nicole M和Peter Palese)。“流感病毒的生物学。疫苗第26卷增刊4，增刊4(2008)：D49-53).
当前流感疫苗提供的保护在很大程度上取决于针对病毒表面蛋白HA的球状头结构域的中和抗体的诱导，以阻止病毒进入。由于不同流感病毒支气管的HA头域变化很大，目前的季节性疫苗仅对匹配良好的流行病毒株有效。(参见赵，C.和徐，J.，Curr.Op.Immunol。(2018)53:1-6).
还采取了其他疫苗工作。例如，含有具有串联重复M2e表位的病毒样颗粒的疫苗通过诱导抗体产生异型免疫，并且与IFN-γ分泌CD8+T马币相关的保护.一种表达保守型流感核蛋白和基质蛋白1的修饰牛痘安卡拉载体病毒引发IFN-γ分泌CD4+T细胞和CD8+TRM响应。4-1BBL(CD137信号)与表达复制的流感核蛋白共同给药，通过鼻内途径刺激并增强肺CD8+T马币通过循环T细胞募集做出反应。在甲型流感感染之前，鼻内给予Fc融合的IL-7作为预处理，并在小鼠中显示出对致命挑战的保护能力。似乎Fc融合的IL-7将多克隆循环T细胞募集到肺部，随后以“T马币-像细胞”的形式驻留在肺组织中。抗体靶向疫苗接种策略，其中抗原与针对CD103+或DNGR-1+树突状细胞的单克隆抗体偶联，也被证明可以引发保护性CD8+T马币响应。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
VI)痘病毒科病毒
A)痘病毒科概述
痘病毒由一系列遗传相关的大型包膜DNA病毒组成，这些病毒仅在脊椎动物或无脊椎动物细胞的细胞质内复制。研究最深入的痘病毒属于正痘病毒属，包括天花病毒(天花的病原体，从自然界中根除)，牛痘病毒(VACV；现代天花疫苗，现在在巴西流行)，牛痘病毒(原始天花疫苗，欧洲土着，偶尔感染人类)和猴痘病毒(非洲土生土长，引起人类天花样疾病)。(莫斯，伯纳德。“痘病毒细胞进入：它需要多少蛋白质？”病毒vol.4，5(2012)：688-707.doi：10.3390/v4050688).
i)天花病毒(天花)
牛痘病毒是与天花病毒同科的正痘病毒属的痘病毒，通常在免疫功能正常的个体中引起非常轻微或无症状的感染。对牛痘病毒的免疫力也为天花提供了足够的保护，这使得在施用活牛痘病毒后可以根除天花。尽管消灭了天花，但鉴于该病毒有可能被用作生物武器，天花仍然是全球议程上的一个优先事项。由于这个原因和它作为载体的能力，牛痘病毒继续用于研究。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
B)基于结构的痘病毒功能分析
痘病毒，特别是正交病毒，是双链DNA基因组，长度约为200，000bp，编码约200种蛋白质，其中大多数在物种之间具有90％或更多的序列同一性。大量VARV分离株和其他OPXV的完整基因组序列是可用的。虽然所有OPCXV都编码同源蛋白以用于重要功能，例如进入，基因表达，基因组复制和病毒体组装，但在参与免疫逃逸和其他宿主相互作用的蛋白质方面存在差异。基本的传染性痘病毒颗粒是成熟的病毒粒子(MV)，它由含有基因组的核蛋白核心和完整的早期转录系统组成，两侧是侧体，周围是脂蛋白包膜。MV的一个子集被修饰的高尔基体或内体膜包围，通过微管运输到细胞外围，并通过胞吐作用作为包膜病毒粒子(EV)释放。EV由一个MV和一个含有八种EV特异性病毒蛋白的额外脂蛋白膜组成，尽管蛋白质组成方面存在其他细微差异。大多数EV仍然粘附在质膜上，并在长肌动蛋白的微绒毛尖端介导细胞间扩散，这对动物的毒力很重要。(莫斯，伯纳德。“天花疫苗：保护性免疫的目标。免疫学评论vol.239，1(2011)：8-26.doi：10.1111/j.1600-065X.2010.00975.x).
四种蛋白质使MV能够附着在细胞上。A27蛋白以三聚体和六聚体的形式存在于MV的表面，并结合肝素和细胞表面蛋白聚糖。H3是另一种MV表面蛋白，也结合肝素和细胞表面蛋白聚糖。D8是一种结合硫酸软骨素的MV表面蛋白。第四种附着蛋白A26与A27物理相关，并结合细胞表面层粘连蛋白。与细胞膜融合并核心进入细胞质需要至少12个额外的MV跨膜蛋白，这些蛋白形成称为进入融合复合物或EFC的复合物。有许多已知的进入蛋白质。暴露在EV外表面的跨膜蛋白包括A33，A34，A36，A56血凝素和B5。(莫斯，伯纳德。“天花疫苗：保护性免疫的目标。免疫学评论vol.239，1(2011)：8-26.doi：10.1111/j.1600-065X.2010.00975.x).
C)对痘病毒科的免疫反应
痘病毒感染通常遵循以下两个疗程之一：局部感染导致良性皮肤病变，或全身感染，导致病毒传播，通常为死亡。传染性软疣病毒(MCV)和Shope纤维瘤病毒(SFV)感染的局部发病机制已有充分记录。虽然发病机制和宿主对感染的反应有很大不同，但这两种痘病毒疾病都是自限性的，并且仍然局限于皮肤。然而，全身感染的特征是几个阶段，以病毒病变的爆炸性增长结束。小鼠的Ectromelia病毒感染始于皮肤感染，通常通过脚垫。经过一些复制后，病毒通过局部淋巴管传播到血液中，导致原发性病毒血症。然后，病毒在脾脏和肝脏中复制到高滴度，然后重新进入血液，导致继发性病毒血症。最后，病毒扩散到皮肤，严重的溃疡性病变皮疹非常迅速地克服了小鼠。人类天花病毒感染的疾病进展类似，死亡率高(Smith，S.和Kotwa，G.，“各种动物对痘病毒感染的免疫反应”)。微生物学批判性评论vol.28，3(2002)：https://doi.org/10.1080/1040-840291046722).
虽然脊椎动物获得性免疫系统的体液和细胞介导的免疫(CMI)成分共同参与宿主对感染的反应，但CMI对于清除痘病毒感染的细胞尤其重要。有效的CMI反应需要先天效应细胞(如自然杀伤(NK)细胞)和受过教育的效应细胞(如细胞毒性T淋巴细胞(CTL))在病毒复制和传播之前快速识别和消除受感染的细胞。一些病毒已经进化出机制来降低CMI反应的效率，包括掩盖感染的外在迹象，这种策略被命名为virostealth。(Seet，BT et al，Annu.Rev.Immunol(2003)21：377-423)；DOI：10.1146/annurev.immunol.21.120601.141049.痘病毒靶向许多先天免疫的主要介质，包括干扰素、肿瘤坏死因子、白细胞介素、补体和趋化因子。痘病毒还操纵各种细胞内信号转导途径，如凋亡反应。(同上)。
小鼠模型证明T马币对牛痘作出反应而产生，在介导对感染的保护方面起着重要作用。真皮居民γδT细胞也与皮肤牛痘感染的免疫反应有关。皮肤感染后，CD8+T细胞独立于CD4 T+细胞和IFN-γ招募，其中许多细胞随后假设T马币表型，能够在重新刺激时引发有效的炎症反应。局部牛痘皮肤接种可以在全球范围内播种皮肤组织，即使在具有长期T马币的偏远部位也是如此并且可以生成T马币非相关非淋巴器官(如肺和肝)的反应。多次暴露于同源病毒抗原也被证明选择性地扩增T马币.(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
在牛痘的肺部感染模型中，肺T的含量较高马币与更好地防止后续感染相关，如病毒载量快速降低所示。TRM似乎扩张得更快，并且局限于感染部位，如5-乙炔基-2′-脱氧尿苷增殖测定相比，与其循环辅助部分相比。鼻内给予αCD8抗体导致肺CD8+T细胞耗竭，导致先前受保护的小鼠变得容易受到感染，表明CD8+T马币在介导免疫力方面起着至关重要的作用。在另一项研究中，寄生虫实验表明，T马币在较短的时间内比中医更擅长清除牛痘病毒皮肤感染。事实上，即使没有中和抗体和中枢记忆T细胞(T厘米).(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
然而，牛痘特异性CD8+皮肤T马币似乎在多种微生物脓毒症感染期间招募循环效应细胞的能力受损。对牛痘肺部感染的研究表明，并非所有T马币同样有能力给予保护。例如，T马币与位于组织脉管系统的TRM相比，位于肺间质中的TRM更适合以接触依赖性方式快速杀死感染的肺细胞。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).此外，T马币发现于间质内，与血管相关性T马币不同，能够上调CD69的表达，可能表明在早期感染期间反应能力增强。上皮免疫途径(例如皮肤瘢痕形成和鼻内暴露)在产生保护性TRM反应方面显示出显著的疗效。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
D)痘病毒科疫苗开发、挑战或失败
针对痘病毒的疫苗，特别是牛痘病毒的疫苗，已经开发出来，最终导致1980年全球消灭了天花。然而，这导致停止了天花疫苗接种，从而使人口可能易患天花病。它还使人口在生产VACC作为动物天花疫苗期间容易受到溢出的VACV的影响。动物和人类报告了新发和再发的痘病毒感染，特别是VACV样病毒，即水牛痘病毒(BPXV)，阿拉卡图巴病毒，坎塔加洛病毒，瓜拉尼病毒，帕萨坦波病毒，贝洛奥里藏特病毒，SPAn232病毒和BeAn 58058病毒(BAV)。同样，动物和人类中的猴痘病毒和orfvirus也经常被描述。然而，为这些病毒开发的疫苗具有交叉保护失败，因此已被发现对后续感染的控制没有实质性影响(参见Veerkyathappa，B.等人，“动物痘病毒疫苗：综合综述”。疫苗专家评论(2012)11(11)：1355-1374).
此外，虽然通过皮肤瘢痕化接种疫苗能够预防临床疾病(皮肤的粪便病变)，但并非所有通过全身途径(例如，肌内和腹膜内)接种疫苗的小鼠都受到保护，免受粪便病变的影响。此外，与皮下或腹膜内免疫的小鼠相比，通过皮肤瘢痕化免疫的小鼠在通过异源途径(鼻内)进行挑战时表现出更大的抗病性，尽管产生降低的抗体滴度。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
VII)横纹病毒科病毒
A)概述横纹病毒科家庭
横纹病毒科包括囊泡病毒，星历表病毒和Lyssavirus属，它们感染广泛的哺乳动物，包括人类；传播通常是媒介传播的，通常是食血昆虫或动物(即以血液为食的昆虫或动物)。莱沙病毒属有七种公认的基因型或物种，其中对人类最重要的是狂犬病病毒(RABV)。
ii)狂犬病病毒(RABV)
狂犬病病毒是Lyssavirus属的一个成员，通过受感染的动物传播给人类，通常通过在受损皮肤上咬伤，抓挠或舔舐，或通过粘膜上的感染性物质(即唾液或乳酸液)的投射。在非洲和亚洲的高患病率中可见，但治疗在很大程度上被忽视。每年，至少有1500万人在接触疑似狂犬病动物后接受治疗；然而，根据世卫组织的估计，亚洲和非洲仍有55,000人死亡。该疾病的主要宿主是狗，但食肉目和脊翅目的其他几种物种也充当不同物种(或基因型)的溶虫病毒的宿主。
B)基于结构的横纹病毒功能分析
所有单体病毒，如横纹病毒，都采用单部分基因组，其大小变化两倍，从～9k到19kb。单克隆病毒的抗基因组复制品编码位于单独的开放阅读框(ORF)中的几个位置保守的基因，这些基因可能穿插在不同谱系特有的基因中。从基因组的3'--到5'-末端的骨架基因的顺序是N-P-M-G-L，其中N是核蛋白，P-磷酸蛋白，M-基质蛋白，G-糖蛋白和L-大蛋白，也称为聚合酶。前四个基因的产物产生形成包膜病毒粒子的主要蛋白质，并且它们在某些病毒中可能以其他名称已知L基因编码多结构域蛋白，包括假定的RNA依赖性RNA聚合酶，该聚合酶与病毒粒子相关并介导病毒基因组的复制和表达。
C)对横纹病毒感染的免疫反应
狂犬病病毒与Lyssavirus属的所有成员一样，是嗜神经的，咬伤后会感染靠近咬伤部位的周围神经。然后，病毒通过逆行轴突转运移动到背根神经节，在那里可以检测到病毒复制。这种运动可能非常迅速：狂犬病病毒在培养的大鼠感觉神经元内的轴质转运达到12-24mm/天。它由外周神经元逆行运输，然后传递到二阶和高阶神经元而不会被神经胶质细胞吸收(狂犬病研究进展，爱思唯尔科学与技术(2011)。ProQuest Ebook Central，https://ebookcentral.proquest.com/lib/jhu/detail.action？docID＝710669第33-53页)。
看起来，身体直到到达神经系统(NS)才会检测到RABV。NS先天系统由细胞组成，例如小胶质细胞，星形胶质细胞和神经元，这些细胞表达诸如toll样受体(TLR)或视黄酸诱导基因-1(RIG-1样受体；RLR)，允许它们识别和响应危险信号和RABV编码的PAMPS，从而触发I型IFN的产生(主要是大脑中的IFN-β，没有IFN-α，也没有III型IFN-lambda)。(ResearchAdvances in Rabies，Elsevier Science&Technology(2011)ProQuest Ebook Central，https://ebookcentral.proquest.com/lib/jhu/detail.action？docID＝710669at page33-53)。
该感染是导致高水平神经系统疾病的原因，在没有及时给予由几剂疫苗和被动免疫预防组成的暴露后预防(PEP)的情况下，感染总是致命的。然而，当症状出现时，暴露后预防不再有效，并且没有特异性治疗可用。此外，当PEP的开始和暴露之间存在延迟时，PEP给药的效果会降低，并且在症状发作后不再有效。
i)T细胞对横纹病毒科病毒感染的反应
通常，神经系统的感染通过浸润T细胞来控制，例如，受感染的NS产生趋化因子，其吸引对病原体作出反应的CD8+细胞。在合同中，研究表明，尽管病毒抗原负载重，但在感染狂犬病病毒的神经元中，迁移的T细胞是凋亡的。(Research Advances in Rabies，Elsevier Science&Technology，(2011)ProQuest Ebook Central，https://ebookcentral.proquest.com/lib/jhu/detail.action？docID＝710669at page 34)。
单核白细胞，单核细胞和巨噬细胞在感染时被招募到神经系统。一旦被激活，来自外围表达表面粘附分子的T细胞和B细胞具有进入神经系统的能力。此条目独立于血脑屏障完整性。进入神经系统后，迁移免疫细胞面临不利的生存条件，限制了T细胞的活性。例如，T细胞活性可以通过血管肠肽，降钙素基因相关肽，去甲肾上腺素和α-黑素细胞刺激素等神经元分泌几种神经肽和神经递质来限制，这些神经元下调T细胞的活性。此外，RABV感染的大脑已被观察到上调降钙素相关基因肽，生长抑素和血管肠肽的表达，这三种分子已知有助于限制NS中的T细胞活性。
此外，RABV通过上调HLA-G，Fas-L和B7-H1的表达来逃避T细胞免疫，这些死亡配体在宿主细胞表面触发活化的T细胞中的死亡信号传导，当分别与T细胞表面的相应死亡受体CD8，Fas和PD-1相互作用时。RABV还通过调节死亡的表达来驱动T细胞进入细胞凋亡途径。
D)横纹病毒疫苗开发
在接触病毒之前或之后不久接种疫苗在预防疾病方面非常有效。早期的RABV疫苗来自各种动物来源的神经组织，在全世界都是有效且负担得起的。然而，这种类型的疫苗中髓鞘碱性蛋白的高含量导致少量致命的脑炎病例；因此，不建议使用这些类型的疫苗。
目前的疫苗由在连续细胞系中生长的灭活病毒组成。英国有两种疫苗被授权供人类使用，一种是安万特巴斯德生产的人二倍体细胞疫苗(HDCV)和凯龙生产的纯化雏鸡胚胎细胞疫苗(PCECV)。(Scott，T.P.，&Nel，L.H.(2016)。狂犬病病毒对免疫反应的颠覆。病毒，8(8)，231.doi：10.3390/v8080231).
暴露前疫苗接种，例如给予卫生保健和实验室工作人员以及前往狂犬病流行地区的旅行者的疫苗接种，在0天、7天和28天肌内注射三剂。免疫球蛋白M(IgM)可在HDCV接种后4天内检测到，IgG出现在第7天。后续研究表明，疫苗接种后反应持续长达2年；被动转移研究表明，IgG提供了最有效的疾病保护，可能是因为IgM无法穿透组织。及时的暴露后治疗或预防(PEP)是预防狂犬病的唯一有效治疗方法。(Scott，T.P.，&Nel，L.H.(2016)。狂犬病病毒对免疫反应的颠覆。病毒，8(8)，231.doi：10.3390/v8080231).
与暴露前疫苗接种不同，世界卫生组织(WHO)推荐的暴露后预防(PEP)方案包括在短时间内密集再暴露于疫苗。例如，标准疗程是在0，2，7，14和28天重复肌内接种。替代方案使用皮内接种，可以使用较少量的疫苗，因此在资源有限的情况下更具成本效益。这种方法正在得到广泛接受，特别是在亚洲。通过肌内途径对皮内注射的反应改善被认为是由于皮肤抗原呈递的改善，尽管这种解释尚未在RABV的实验中得到证实。(Scott，T.P.，&Nel，L.H.(2016)。狂犬病病毒对免疫反应的颠覆。病毒，8(8)，231.doi：10.3390/v8080231).
已经开发了一种人单克隆抗体的混合物(Bakker，A.B.等人(2005)。新型人单克隆抗体组合可有效中和天然狂犬病病毒变异体和个体体外逃逸突变体。J Virol 79，9062-8)，但缺乏确认安全性，耐受性和中和活性的数据。(Bakker，AB等人，(2008)“首次向人类施用针对狂犬病病毒的单克隆抗体混合物：安全性，耐受性和中和活性，”疫苗26，5922-7；deKruif，J.，et al.(2007).一种人单克隆抗体混合物，作为狂犬病暴露后预防的新成分。Annu Rev med 58，359-68)。
已经花费了大量的精力来开发一种在狂犬病患者中有效的治愈性治疗方法，但到目前为止还没有发现有效的治疗方法。到目前为止，很少有分子被报道对狂犬病病毒起作用。
II)疱疹病毒科病毒
A)疱疹病毒科概述
这疱疹病毒科家族是一个重要的病毒家族，由多种宿主的主要病原体组成。该家族被称为DNA病毒，包括至少八种已知可感染人类的病毒。该家族还包括一些感染对全球经济至关重要的其他哺乳动物的物种，包括畜牧业和竞争业，可能造成严重的经济损失。(Sharma，V.等人，疱疹病毒科比较基因组学，寻找人类感染菌株的潜在特征。Int JGenomics.2016；2016:9543274).
疱疹病毒科包括来自Alphaherpesvirinae亚科的病毒，例如水痘-带状疱疹病毒(VZV)，其引起俗称水痘和带状疱疹的疾病，人类疱疹病毒-1(HHV-1)，单纯疱疹病毒-1(HSV-1)，人类疱疹病毒-2(HHV-2)，单纯疱疹病毒-2(HSV-2)，人类疱疹病毒-3(HHV-3)，单纯疱疹病毒-3(HSV-3)，牛疱疹病毒-1(BHV-1)，牛疱疹病毒-5(BHV-5)，马疱疹病毒1(EHV-1)，马蹄疱疹病毒3(EHV-3)、马疱疹病毒4(EHV-4)、马疱疹病毒8(EHV-8)和马蹄疱疹病毒9(EHV-9)。(戴维森AJ.分类概述。在：Arvin A，Campadelli-Fiume G，Mocarski E等人，编辑。人类疱疹病毒：生物学，治疗和免疫预防。剑桥：剑桥大学出版社(2007)第1章.可从以下位置获得：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK47406/)。
此外，疱疹病毒科还包括来自Gammaherpesvirinae亚科的病毒，例如人疱疹病毒-4(HHV-4)，也称为爱泼斯坦-巴尔病毒，马疱疹病毒2(EHV-2)，马疱疹病毒5(EHV-5)和马疱疹病毒7(EHV-7)。(戴维森AJ.分类概述。在：Arvin A，Campadelli-Fiume G，Mocarski E等人，编辑。人类疱疹病毒：生物学，治疗和免疫预防。剑桥：剑桥大学出版社(2007)第1章.可从以下位置获得：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK47406/)。
i)水痘-带状疱疹病毒
水痘带状疱疹病毒(VZV)是水痘的病原体，是一种α-疱疹病毒，可以在背根神经节中建立潜伏期。病毒的再激活导致一种称为带状疱疹的痛苦疾病。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
ii)单纯疱疹病毒
HSV-1和HSV-2密切相关，在氨基酸水平上具有>80％的同一性。单纯疱疹病毒是一种嗜神经病毒，可侵入肛门生殖器和口腔的皮肤和粘膜内膜。单纯疱疹病毒可穿透表皮，尤其是最外层的角质化层较薄(例如阴唇、包皮内侧、面部唇部)、缺失(例如直肠、宫颈内膜、阴道)或创伤性破坏的地方。(Sandgren，K.等人，“了解天然单纯疱疹病毒免疫力，以告知下一步-生成疫苗设计。(2016)临床与转化免疫学5(7))。1型单纯疱疹病毒主要通过口腔传播，2型单纯疱疹病毒主要通过生殖器传播。传播需要亲密接触。(惠特利·疱疹病毒。在：男爵S，编辑。医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校(1996年)。第68章.可从以下位置获得：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK8157/)。
1型单纯疱疹病毒感染广泛存在，其血清阳性率可能覆盖世界人口的70％以上。在发展中国家，1型单纯疱疹病毒感染是普遍的，并且是在儿童早期通过亲密接触获得的。1型单纯疱疹病毒可在生命的每个阶段引起严重疾病，包括新生儿致命的播散性疾病、唇疱疹、眼病和成人致命的脑炎。(Zhang，Jie et al.“T细胞在单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染过程中的免疫反应。浙江大学学报.科学。B卷18，4(2017)：277-288。doi：10.1631/jzus.B1600460)。由HSV1/2引起的生殖器疱疹现在是最常见的性传播感染，并在新生儿中引起严重的疾病。此外，1型单纯疱疹病毒是西方国家传染性失明的主要原因。既往HSV2感染可导致2-全球艾滋病毒感染风险增加三倍。(Sandgren，K.等人，“了解天然单纯疱疹病毒免疫力，以告知下一步-生成疫苗设计。(2016)临床与转化免疫学5(7))。
iii)牛疱疹病毒
牛疱疹病毒1(BHV-1)，也称为传染性牛鼻气管炎病毒，属于Α疱疹病毒亚科，与HSV-1和HSV-2具有许多生物学特性。BHV-1感染可引起结膜炎、肺炎、生殖器疾病、流产和称为运输热的上呼吸道感染。BHV-1不是与运输热相关的唯一感染因子，但它通过免疫抑制受感染的牛来引发这种疾病。BHV-1诱导的免疫抑制经常导致继发性细菌感染(例如，溶血性巴氏杆菌,多杀性巴氏杆菌和嗜血杆菌)，可引起肺炎。(克林顿·琼斯，“单纯疱疹病毒1型和牛疱疹病毒1潜伏期”临床微生物学评论。(2003)16(1)79-95).
在美国，BHV-1感染每年使养牛业损失至少5亿美元。虽然有疫苗可用，但已知该病毒仍会导致幼牛疾病和奶牛流产。(同上)。
iv)马蹄疫病毒(EHV)
已报告有九种埃博拉病毒。EHV1，EHV3，EHV4，EHV8和EHV9物种已被归类为该属水痘病毒亚科甲叶植物科家庭疱疹病毒科订单疱疹病毒.EHV2和EHV5物种已被归入一个新属全分子病毒亚科Gamaherpesvirinae家庭疱疹病毒科订单疱疹病毒.物种EHV6和EHV7已被暂定为亚科中的物种甲叶植物科和伽马疱疹病毒e，分别。九种疱疹病毒中只有五种(即EHV1，2，3，4和5)具有在马身上产生疾病的能力。EHV3负责性皮开松，而EHV2和EHV5与特定疾病无关，但可能与上呼吸道疾病、不适宜、淋巴结肿大、免疫抑制、角膜结膜炎、全身不适和表现不佳有关。EHV1和EHV4都是影响全球马匹呼吸道的重要经济病毒。然而，只有EHV1会导致流产和神经系统疾病(Kapoor等人，马疱疹病毒：简要回顾。(2014)动物和兽医科学进展2(2S)：46-54)。
B)基于结构的疱疹病毒科病毒功能分析
疱疹病毒科的病毒是球形的，包括四个主要组成部分：核心，衣壳，外罩和包膜。病毒粒子的直径取决于病毒种类，约为200nm。核心由以高密度包装成衣壳的线性双链DNA分子的单个拷贝组成。(戴维森AJ.分类概述。在：Arvin A，Campadelli-Fiume G，Mocarski E等人，编辑。人类疱疹病毒：生物学，治疗和免疫预防。剑桥：剑桥大学出版社(2007)第1章.可从以下位置获得：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK47406/)。二十面体疱疹病毒衣壳由5种保存疱疹病毒蛋白、主要衣壳蛋白(MCP、HSV-1UL19基因产物)、三重单体和二聚体蛋白(TRI1和TRI2、HSV-1UL38和UL18基因产物)、最小的衣壳蛋白(SCP、HSV-1 35基因产物)和门静脉蛋白(PORT、HSV-1UL6基因产物)组成。(小莫卡尔斯基疱疹病毒常见蛋白的比较分析。在：Arvin A，Campadelli-Fiume G，Mocarski E等人，编辑。人类疱疹病毒：生物学，治疗和免疫预防。剑桥：剑桥大学出版社(2007)第4章.可从以下位置获得：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK47403/)。
HSV-1是一种包膜、核复制和大型双链DNA病毒。HSV-1的基因组是一个约152kb的线性双链富含GC的DNA序列，包含两个称为长唯一区域(UL)和短唯一区域(US)的独特区域，它们编码至少84种蛋白质。HSV-1的基因组位于核衣壳内，其被一组tegument蛋白包围。核衣壳和tegument蛋白被脂质包膜包围，脂质包膜上镶嵌着糖蛋白，这对于结合和进入新的易感细胞非常重要。HSV-1生命周期的主要步骤是：进入宿主细胞，病毒基因表达，基因组复制，病毒体组装和新传染性病毒的释放。HSV-1的三类基因以连续的方式表达，包括即时早期(IE)基因，早期基因和晚期基因。IE基因的产物调节早期基因和晚期基因的表达。(Zhang，Jie et al.“T细胞在单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染过程中的免疫反应。浙江大学学报.科学。B卷18，4(2017)：277-288。doi：10.1631/jzus.B1600460)。
HSV-1与细胞的结合和进入由病毒糖蛋白和细胞因子介导。病毒进入的细胞介质(HveA或HVEM)主要在活化的T细胞中表达，属于肿瘤坏死因子(TNF)受体家族。1型单纯疱疹病毒进入上皮细胞和其他非类淋巴细胞是由类似于脊髓灰质炎病毒受体(HveB和HveC)的不相关膜糖蛋白介导的。HveC作为迄今为止检测的所有疱疹病毒(例如HSV-1、BHV-1和伪狂犬病病毒PRV)的入院介质具有活性。HveC在神经元中大量表达，并且可以阻断病毒进入几个神经元样细胞系。脱膜后，病毒基因组存在于细胞核中，病毒基因表达随之而来。HSV-1基因表达在三个不同的阶段进行时间调节：即早期(IE)，早期(E)和晚期(L)。IE RNA表达不需要蛋白质合成，并且受到tegument蛋白VP16和活性细胞周期蛋白依赖性激酶的刺激。E RNA的表达依赖于至少一种IE蛋白，通常E基因编码在病毒DNA合成中起作用的非结构蛋白。LRNA表达在病毒DNA复制后最大，需要IE蛋白表达大多数L蛋白是构成病毒粒子的结构蛋白。(Clinton Jones，“1型单纯疱疹病毒和牛疱疹病毒1潜伏期”(2003)临床微生物学评论，16(1)79-95)。
C)对疱疹病毒科病毒感染的免疫反应
HSV有效地感染表皮角质形成细胞和朗格汉斯细胞(LC；一种树突状细胞(DC))。然后它进入皮肤神经末梢，并沿着轴突运输到靠近脊柱(背根神经节)的神经细胞集合，以建立终生潜伏感染。在周期性再激活后，病毒沿着神经元运回粘膜，在那里它引起复发性病变，或无症状地脱落。(Sandgren，K.等人，“了解天然单纯疱疹病毒免疫力，以告知下一步-生成疫苗设计。(2016)临床与转化免疫学5(7))。
虽然有针对水痘和带状疱疹的疫苗，但最近的证据表明，T马币细胞可能是控制潜伏感染的关键参与者，潜伏感染是一种可以用来改进当前疫苗的现象。一项研究分析了来自不同年龄的人类供体的皮肤样本，这些供体经血清学证实为水痘带状疱疹病毒(VZV)阳性。来自样本组织中的80-90％的T细胞表达CD69，表明皮肤中的大多数T细胞是T马币细胞。来自受刺激的水痘带状疱疹病毒特异性T细胞的IL-2反应表明宿主年龄不影响反应细胞的数量。然而，发现来自老年供体的皮肤显示出较低的临床反应能力，并且在水痘带状疱疹病毒抗原挑战时减少CD4+T细胞浸润。这与Foxp3+细胞的比例较高相关。此外，T马币的老年皮肤以更高的量表达PD-1。总之，该数据表明VZV特异性T马币可能随着年龄的增长而抑制，这可以解释老年人水痘带状疱疹病毒再激活的高发生率。另一项利用人类三叉神经节样本的研究结果表明，T马币在控制三叉神经节潜伏感染方面不起作用。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
在HSV-1感染期间，病毒特异性CD8+T马币细胞在神经节和粘膜中产生。CD8+TRM细胞长期存在于非淋巴组织区室中，存在于脑，肾，关节和其他非屏障组织中，可触发保护性先天性和适应性免疫。不受理论限制，CD8+T马币细胞可以表达效应分子IFN-γ和颗粒酶B(GrB)；这些细胞不是从循环的CD8+T细胞池中补充的。(Zhang，Jie et al.“T细胞在单纯疱疹病毒1型(HSV-1)感染过程中的免疫反应。浙江大学学报.科学。B vol.18，4(2017)：277-288.doi：10.1631/jzus.B1600460)。
当小鼠的眼部HSV-1感染时，记忆CD8 T细胞选择性地积聚在潜伏感染的感觉神经节中。在C57BL/6小鼠中，在感觉神经节中发现的大多数CD8 T细胞对糖蛋白B衍生的HSV-1表位(gB-498-505)具有特异性，其已被证明可以阻断潜伏感染的临体神经节培养的HSV-1再激活；CD8 T细胞介导的保护的一个主要机制是通过IFN-γ分泌和释放无细胞毒性的裂解颗粒。据报道，在没有病毒抗原的情况下，原发感染消退后，一群非迁移病毒特异性CD8 T细胞在皮肤中持续存在。这些细胞被归类为T马币，一旦CD103进入表皮，就会上调CD103的表达，与它们的再循环对应物(CD69的高表达，CD62L的低表达)在表型上是不同的，并且它们明显改变其形态，变成树突状。与记忆CD4 T细胞相比，记忆CD4 T细胞主要局限于皮肤的真皮层，并且具有高度运动性并与血液平衡，T马币CD8 T细胞不会再循环，并且在感染控制后很长一段时间内都可以在表皮中找到。皮肤中记忆T细胞的迁移和持久性以及它们向T马币的转化被证明独立于同源抗原，但可能仅由局部炎症诱导。(Torti N，Oxenius A.T细胞记忆在持续性疱疹病毒感染的背景下。病毒。(2012)4(7):1116–1143.doi：10.3390/v4071116)；(Mackay L.K.，Stock A.T.，Ma J.Z.，Jones C.M.，Kent S.J.，Mueller S.N.，Heath W.R.，Carbone F.R.，Gebhardt T.在没有持续性局部抗原呈递的情况下通过组织驻留记忆T(TRM)细胞实现的长寿命上皮免疫。(2012)109:7037–7042).
Nakanishi等人使用小鼠阴道HSV-2感染模型表明，CD8 T淋巴细胞动员到病毒感染组织需要CD4 T细胞的帮助，不仅通过促进其扩增，而且通过IFNy产生诱导局部趋化因子分泌，这反过来又将效应CD8 T细胞吸引到感染部位。(Nakanishi Y.，Lu B.，Gerard C.，Iwasaki A.CD8(+)T淋巴细胞动员到病毒感染组织需要CD4(+)T细胞的帮助。自然(2009)462：510–513).
在HSV-1感染中，虽然特定的CD8 T细胞在局部感染时在感染部位积聚并持续存在(如皮肤，阴道和眼部感染模型所示)，但它们不会全身性地这样做，其中它们以低数量存在，静息T厘米表现型。然而，作为对全身性HSV-1感染的反应，gB-498-505-CD8 T细胞显示T细胞数量增加和维持断续器潜伏期的CD8 T细胞。这些细胞在受感染小鼠的整个生命周期中保持在恒定的高数量，并且永远不会失去其分泌IFNγ和增殖以应对继发感染的能力。虽然KLRG1-群体优于其KLRG1+，但KLRG1-和KLRG1+细胞在转移到淋巴细胞减少宿主时数量增加到相同的程度，并且两者都广泛分裂。据报道，HSV再感染对维持膨胀细胞的抗原依赖性不强。具体而言，HSV特异性细胞在幼稚受体中下降，但在全身感染的HSV-1小鼠中却没有下降，在60天内它们保持在稳定的数量(甚至略微增加)。此外，抗病毒化合物法昔洛韦阻断病毒复制对HSV的记忆充盈有重大影响，但如果在感染前开始治疗，则可完全抑制记忆充盈。(Torti N，Oxenius A.T细胞记忆在持续性疱疹病毒感染的背景下。病毒。(2012)4(7):1116–1143.doi：10.3390/v4071116).
对继发感染的易感性增加与BHV-1感染后细胞介导的免疫力降低相关。CD4+T细胞功能在小牛急性感染期间受损，因为BHV-1感染CD4+T细胞并诱导细胞凋亡。(ClintonJones，“1型单纯疱疹病毒和牛疱疹病毒1潜伏期”(2003)临床微生物学评论16(1)79-95)。
i)疱疹病毒科疫苗设计的挑战
疱疹病毒科疫苗设计的发展导致疫苗仅具有部分有效性。(Sandgren，K.等人，“了解天然单纯疱疹病毒免疫力，以告知下一步-生成疫苗设计。(2016)临床与转化免疫学5(7))。
III)吡卡那病毒科病毒
A)皮克纳病毒科概述
皮克纳病毒家族由大量小的RNA病毒组成，其中许多是人类和牲畜的重要病原体。Picornaviridae是最大的病毒家族之一，由14属组成，其中六属包括人类病原体。最著名的皮卡病毒是肠道病毒(包括脊髓灰质炎、PV和鼻病毒)、口蹄疫病毒(FMDV)和甲型肝炎病毒(HAV)。虽然感染通常是轻微的，但某些菌株可能导致大流行爆发，并伴有脑膜炎和/或瘫痪。(Norder，H.等人，“Picornavirus非结构蛋白作为具有广泛活性的新抗病毒的靶标。抗病毒研究89(2011)204-218)。该家族包括各种人类和动物疾病，如脊髓灰质炎，普通感冒，甲型肝炎，口蹄疫等。
皮克纳病毒包括一个单链阳性RNA基因组，该基因组约有7，000-8，500个核苷酸，在T＝1(准T＝3)二十面体蛋白衣壳内具有相似但不相同的组织，直径约为30nm。.基因组的5′末端与小肽(VPg)相连，3′末端与多(A)束终止。有一个开放的阅读框，两端是未翻译的区域(UTR)。5′UTR特别长(～600-1，200nts)，包含许多重要的复制和翻译控制元件，包括直接参与蛋白质翻译启动的内部核糖体进入位点。基因组被翻译成单个多蛋白，随后通过病毒编码的蛋白酶切割成成熟的蛋白质产物。结构蛋白位于多蛋白的三分之一的N末端内，而其余的包括参与修改细胞环境以优化病毒复制的蛋白质和直接负责复制的蛋白质。在一些皮克纳病毒(例如，肠道病毒)中，结构前体蛋白直接位于多蛋白的N端，而在其他(例如，口疮病毒和心脏病毒)中，结构前体之前是非结构性蛋白质序列。在大多数尖粒体病毒中，结构前体蛋白(P1)的N末端通过共价添加肉豆蔻酸残基进行修饰，这被认为在颗粒组装和细胞进入过程中都起着重要作用。P1通常约为90kD，并进一步蛋白水解处理成病毒衣壳中发现的成熟病毒蛋白(VP1-4或P1 A-D)。VP指定系统首先用于根据其表观分子量区分结构蛋白，而P1系统则描述它们在病毒基因组上的顺序。因此，P1A相当于VP4，P1B相当于VP2，P1C相当于VP3，P1D相当于VP。VP1-3共同形成病毒粒子的二十面体壳，而VP4分布在粒子的内表面。(Tuthill，Tobias J et al.“Picornaviruses”(2010)微生物学和免疫学的当前主题Vol.343：43-89。doi：10.1007/82_2010_37).
i)皮克纳病毒(FMDV)
口蹄疫病毒(口蹄疫病毒；皮克那病毒科；黄蚜病毒属)引起一种高度传染性的急性病毒。口蹄疫是一种难以控制和根除的疾病，因为它的宿主范围广，最小感染剂量低，复制速度快，病毒脱落水平高，传播方式多种。在反刍动物急性感染后发生的重要的亚临床差异使情况进一步复杂化：一些动物在亚临床上被感染长达3年(“口蹄疫病毒携带者”)，而另一些动物则在1至2周内完全清除病毒(“非携带者”)。世界动物卫生组织(OIE)确定的口蹄疫病毒携带者的定义是一种动物，在感染后超过28天可以从中恢复传染性口蹄疫病毒。(Eschbaumer，M.，“口蹄疫病毒感染幼牛和接种同源腺病毒载体疫苗的牛后，全身免疫反应和病毒持久性。(2016)BMC兽医研究第12卷，艺术。编号：205)。
该病毒以七种遗传和抗原不同的血清型出现-O，A，C，亚洲1和南部非洲地区(SAT)1-3。每种血清型在每个血清型中都有多个亚型。
B)基于结构的皮克纳病毒功能分析
皮克纳病毒家族在其家族成员中具有几种保守的蛋白质。这些蛋白质被称为领先蛋白质(L基因组区域)，衣壳蛋白(P1基因组区域)，膜蛋白(2B)，解旋酶(2C)，蛋白酶(3C)和聚合酶(3D)。
FMDV颗粒由约8，500个核苷酸的正链RNA分子组成，包裹在二十面体衣壳内。基因组编码一种独特的多蛋白，其中四种结构蛋白(P1A，P1B，P1C和P1D；分别称为VP4，VP2，VP3和VP1)和九种非结构蛋白被病毒蛋白酶切割。(Guzman，E.等人，口蹄疫病毒疫苗接种后交叉反应CD8+T细胞反应的诱导。(2010)J.病毒学，第84卷，第23期，第12375-12384页)。
具体而言，病毒基因组的长度约为8.3kb，并封闭在蛋白质衣壳中。RNA基因组包含一个大型开放阅读框架，编码来自P1多肽的四种病毒结构蛋白(VP1，VP2，VP3和VP4)和来自P2和P3多肽的七种非结构蛋白(Lpro，2A，2B，2C，3A，3b，3Cpro和3Dpol)。5'和3'未翻译区域(UTR)对于病毒复制和翻译很重要。衣壳含有60个拷贝，每个拷贝有四种不同的结构蛋白(VP1-4)。VP1–3暴露在表面，而VP4被内化。FMDV衣壳的晶体学结构表明，免疫表位主要存在于结构元件之间的表面取向互连环上。G-H环内高度保守的Arg-Gly-Asp(RGD)氨基酸基序在病毒进入宿主细胞中起主要作用，并有助于宿主的保护性免疫。αV整合素受体家族与G-H环结合，用于受体介导的病毒进入。宿主细胞上没有这种受体会降低病毒进入的能力。低保真度RNA聚合酶导致容易出错的病毒复制和基因组突变。免疫学关键部位的受累可导致口蹄疫病毒免疫变异的出现。(Singh，K.R.等人，(2019)“口蹄疫病毒：免疫生物学，疫苗进展和疫苗接种策略解决疫苗失败-印度视角”。疫苗7(3)，90).
C)对吡咯那病毒科病毒感染的免疫反应
体温过高和口鼻黏膜、指间裂、冠状动脉束、乳房和上皮上出现水疱性病变是该疾病的主要特征。口蹄疫导致食欲不振和体重下降、产奶量下降、吃水力下降以及晚期妊娠动物流产。(Singh，K.R.等人，(2019)“口蹄疫病毒：免疫生物学，疫苗进展和疫苗接种策略解决疫苗失败-印度视角”。疫苗7(3)，90).具体而言，易感动物的口蹄疫病毒感染导致感染后1-3天的病毒血症，随后临床疾病迅速发作，潜伏期为2-10天。(Díaz-San Segundo F，Rodríguez-Calvo T，de Avila A，Sevilla N(2009)猪口蹄疫病毒急性感染期间的免疫抑制由IL-10介导。PLoS One 4(5)：e5659)。
对口蹄疫病毒的保护通常与血清中高水平的循环中和抗体的诱导有关；这些中和抗体最早可在感染后4天发现，尽管这种反应并不能确保临床保护，并且中和抗体水平低的动物仍然可以受到保护。这表明细胞介导的免疫可能在消除病毒方面发挥作用。因此，鉴于暴露于病毒导致产生T细胞依赖性中和IgG类抗体，以及随后的T细胞依赖性记忆，似乎必须刺激CD4+细胞。(Díaz-San Segundo F，Rodríguez-Calvo T，de Avila A，Sevilla N(2009)猪口蹄疫病毒急性感染期间的免疫抑制由IL-10介导。PLoS One 4(5)：e5659)。
D)吡咯烷酮虫科疫苗开发
控制措施包括屠宰、限制牲畜流动和为易感动物接种疫苗。目前开发的灭活口蹄疫疫苗主要通过中和抗体产生短期的血清型特异性保护，并且保护通常与高水平的中和抗体相关。(Carr，B Veronica et al.(2013)“CD4+T细胞对接种疫苗的牛口蹄疫病毒的反应”，J.General Virology vol.94，Pt 1：97-107.doi：10.1099/vir.0.045732-0)。
全世界正在进行的努力正在努力改进现有疫苗或开发替代疫苗配方以进行有效疫苗接种。最近的一些方法，包括病毒样颗粒，基因缺失的修饰病毒疫苗和载体介导的疫苗，已经得到了不同的成功。其他被提倡的选择包括使用不处理活病毒的疫苗，如DNA疫苗，肽疫苗和亚单位疫苗。目前，所有这些疫苗都处于实验阶段，尚未在现场进行测试。(Singh，K.R.等人，(2019)“口蹄疫病毒：免疫生物学，疫苗进展和疫苗接种策略解决疫苗失败-印度视角”。疫苗7(3)，90).
疫苗可用于PV，HAV和FMDV。当口服疫苗给予免疫功能低下的个体时，它们可能被长期感染，并且多年来一直是疫苗衍生病毒变体的分泌物。对于这些或其他微小病毒，没有有效的预防措施。
现有的疫苗不能预防原发性感染，只能针对全身性临床疾病提供保护。目前疫苗的缺点包括病毒排出阻滞不足，未能预防病毒携带者，免疫持续时间短以及难以区分接种疫苗和受感染动物。(Carr，B Veronica et al.(2013)“CD4+T细胞对接种疫苗的牛口蹄疫病毒的反应”，J.General Virology Vol.94，Pt 1：97-107.doi：10.1099/vir.0.045732-0)。目前针对血清型O、A和亚洲1的化学灭活三价疫苗存在局限性，包括需要生物安全III级设施来大规模生产病毒抗原、热性和仅具有短寿命的免疫力。(Singh，K.R.等人，(2019)“口蹄疫病毒：免疫生物学，疫苗进展和疫苗接种策略解决疫苗失败-印度视角”。疫苗7(3)，90).
此外，对一种血清型的免疫不能提供对其他血清型的保护，有时也不能对同一血清型内的变异提供保护。(同上)。
实施疫苗接种的主要困难之一是无法区分接种疫苗的动物和受感染/康复的动物，后者可能仍在传播病毒。(Guzman，E.，et al.(2010)“口蹄疫病毒疫苗接种后交叉反应CD8+T细胞反应的诱导”，J.Virology，Vol.84，No.23，p.12375–12384)。
IV)肝病毒科病毒
A)肝病毒科概述
肝病毒科家族，其成员属包括原肝炎病毒和禽肝炎病毒，是球形的，偶尔是多形性的，直径为42-50nm，阴性染色后没有明显的表面突起。在冷冻电镜图片中可以看到投影。外层对洗涤剂敏感，包膜含有表面蛋白，并围绕着一个由一种主要蛋白质组成的核心蛋白质组成的二十面体核衣壳核心。核衣壳包裹着病毒基因组(DNA)，病毒DNA聚合酶和相关细胞蛋白，包括蛋白激酶和伴侣，它们似乎在病毒DNA合成的启动中起作用。(金，安德鲁。病毒分类：国际病毒分类委员会第九次报告。爱思唯尔，2011)。
肝病毒感染诱导表面蛋白的过量产生，这些表面蛋白作为多形性脂蛋白颗粒与病毒一起分泌到血液中。基因组由部分双链DNA组成，该DNA通过碱基配对保持在两条DNA链的5′末端之间的粘性重叠中以环状构象形式存在。正肝病毒的内聚重叠长度约为240bp，阿维肝那病毒的内聚重叠长度约为50bp，不同家族成员的基因组大小范围为3.0至3.3kb。病毒粒子和空的亚病毒颗粒可能含有两个或三个表面蛋白，具有共同的C端，但由于翻译起始位点不同，N端不同。核心蛋白在C端具有大的N端结构域和小的RNA结合结构域。高于阈值浓度的核心蛋白可以通过二聚体自组装，在没有其他病毒成分的情况下完成核衣壳。(金，安德鲁。病毒分类：国际病毒分类委员会第九次报告。爱思唯尔，2011)。
i)乙型肝炎病毒(HBV)
乙型肝炎病毒(HBV)是正肝炎病毒属的一部分。慢性病毒性肝炎感染是一个主要的公共卫生问题，估计全球有2.9亿人感染乙型肝炎病毒。这种病毒在人类群体中已经存在了30,000>，并且在某些环境中仍然非常普遍。(Lumley，Sheila F等人(2018)“乙型肝炎病毒适应CD8+T细胞反应：宿主和病原体的后果”。免疫学前沿第9卷1561，doi：10.3389/fimmu.2018.01561)。
B)基于结构的肝病毒科病毒功能分析
乙型肝炎病毒是小型的包膜性病毒，主要是嗜肝病毒。大多数核衣壳核心直径约为36nm，含有240个核心蛋白亚基，而少数核衣壳核心核心基的直径约为32nm，仅由180个亚基组成。(金，安德鲁。病毒分类：国际病毒分类委员会第九次报告。爱思唯尔，2011)。
HBV的血压仅为3，200bp，是所有已知致病病毒中基因组最小的之一。部分双链DNA(dsDNA)环状基因组由四个基因组成，X，聚合酶(P)，核(C)和表面(S)，并且很大比例的基因组编码在重叠的开放阅读框上。在转录过程中，部分dsDNA基因组被“完成”以形成完全的dsDNA分子，随后被超线圈以形成共价闭合的环状DNA(cccDNA)。该cccDNA由HBV逆转录酶(RT)反向转录，RT是一种缺乏3'-5'核酸外切酶校对能力的酶，因此在每轮复制期间将突变引入HBV基因组(在鸭肝病毒中，突变率估计在0.8×10-5和4.5之间×每次复制每个核苷酸10-5个替换)。产生的突变导致病毒准种，由显性基因型组成，周围环绕着密切相关的HBV变体云。(Lumley，Sheila F等人(2018)“乙型肝炎病毒适应CD8+T细胞反应：宿主和病原体的后果”。免疫学前沿vol.9，1561，doi：10.3389/fimmu.2018.01561).
C)对肝那病毒科感染的免疫反应
HBV在人类中引起不同程度的肝病。乙型肝炎病毒感染可以是急性或慢性的；虽然成人感染的慢性发病率相对较低(约5％)，但新生儿感染通常具有较高的持续性。慢性感染大多是无症状的，但HBV携带者有发生危及生命的肝硬化和肝癌的风险。(Busca，Aurelia和Ashok Kumar。(2014)“乙型肝炎病毒(HBV)感染的先天免疫反应”。病毒学杂志第11卷22，doi：10.1186/1743-422X-11-22)。
两项研究均利用人供体肝脏组织和配对血液样本，分析了TRM的作用。在病毒性肝炎的背景下。一项研究侧重于乙型肝炎病毒感染(HBV)患者，而另一项研究则包括HBV或丙型肝炎病毒感染患者。来自部分控制HBV感染的患者的肝T细胞比例较高，具有T马币表型，与健康对照组相比。鉴于健康和HBV感染个体肝脏中T细胞的总数相似，T马币细胞增加了三倍数字似乎是由于T细胞采用T马币细胞的易感性增加病毒感染的肝脏组织中的表型，而不是先前存在的T马币的扩张.在慢性丙型肝炎患者中，共表达CD69和CD103的T细胞数量增加了四倍。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。“系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
病毒载量与肝脏T马币的相互关系数字表明T马币在感染控制中起着至关重要的作用。T马币的离体刺激表现出异质抗原特异性，许多HBV抗原能够启动效应反应。然而，病毒包膜肽似乎产生最大的诱导IFNγ，TNFα和IL-2的产生能力。T马币分析来自健康的肝脏组织显示，与非常驻对应部分相比，颗粒酶B的表达明显减少。这表明肝性T马币细胞溶解能力低于循环T细胞。(同上)。
然而，肝T马币的慢性乙型肝炎(CHB)患者与健康对照组相比，颗粒酶B的表达量明显更高。肝脏T马币与非常驻T记忆细胞相比，抑制性分子PD-1的表达也增加。在没有受到理论限制的情况下，鉴于肝脏在过滤肠系膜循环中大量抗原排出的作用，颗粒酶B的下调和PD-1在健康肝脏组织中上调可能是旨在预防免疫病理学的预防措施。这在病毒性肝炎感染中非常重要，因为免疫病理学主要涉及导致肝硬化和肝细胞癌的病毒性肝炎的进展。T马币增加颗粒酶的产量在CHB患者中，可能是暴发性肝炎发病机制的一部分。(同上)。
D)肝那病毒科疫苗开发
第一种HBV疫苗是从无症状HBV携带者的血浆中以纯化的灭活HBsAg颗粒的形式制备的。后来，开发了含有主要(s)小蛋白质的r-HBsAg疫苗，该蛋白质跨越亲水性氨基酸124-149作为显性免疫原性表位。乙型肝炎病毒疫苗接种诱导中和抗体(抗HBs)，其主要针对从A到H的所有HBV基因型中HBsAg的“a”决定因素。r-HBsAg疫苗可诱导抗HBs的活性合成和延长的免疫记忆，从而提供持续的保护。从加强疫苗接种后抗HBs水平的大幅，快速增加中可以识别出5年或更长时间的持续记忆，即使在那些通过可用的商业试剂盒测量的显示无法检测到的抗HBs的人中也是如此。使用体外酶联免疫吸附测定(spot-ELISA)，表明能够诱导抗HBs的记忆B淋巴细胞的数量不会随着抗HBs水平的下降而减少。疫苗抗原的剂量和结构都会影响一抗反应以及免疫记忆的发展。(Said，Zeinab Nabil Ahmed和Kouka SaadeldinAbdelwahab。(2015)“诱导对乙型肝炎病毒的免疫力”。世界肝病学杂志，第7卷，12：1660-70。doi：10.4254/wjh.v7.i12.1660).
目前的疫苗接种和治疗方法受到诊断和治疗可及性差、药物和疫苗逃逸突变体、治疗停止或免疫抑制后病毒反弹以及缺乏治愈性治疗的阻碍。
V)逆转录病毒科病毒
A)逆转录病毒科概述
家庭逆转录病毒科是一大类多样化的包膜RNA病毒，包括以下属：α逆转录病毒，Beta逆转录病毒，Delta逆转录病毒，Epsilon逆转录病毒，Gamma逆转录病毒，慢病毒和Spumavirus。逆转录病毒科病毒包括慢病毒属的成员，慢病毒是复杂的逆转录病毒，包括人类病原体，如人类免疫缺陷病毒(HIV)和马传染性贫血(EIAV)以及猫免疫缺陷病毒。其他逆转录病毒家族包括人类T淋巴营养病毒(HTLV)和包括乙型肝炎(HVB)的Hepadnaviridae。逆转录病毒科的成员的特征在于在其复制周期中用逆转录酶将其RNA基因组转录成线性双链DNA的能力。在复制周期中，病毒dsDNA通常作为DNA前病毒整合到宿主基因组中，其可以保持沉默(即潜伏)或具有转录活性以产生病毒粒子(Fermin，Gustavo和Paula Tennant)。Viruses：Molecular Biology，Host Interactions and Applications toBiotechnology，由Jerome E.Foster编辑，Elsevier Science&Technology(2018)。ProQuest Ebook Central，https://ebookcentral.proquest.com/lib/jhu/detail.action？docID＝5322098).
许多慢病毒病毒的特征可能是潜伏期长和进行性感染，其中病毒逃避宿主的免疫反应。慢病毒将遗传信息插入宿主细胞的脱氧核糖核酸(DNA)，并具有在分裂和非分裂细胞中复制的独特能力。
所有复制能力的逆转录病毒，包括HIV，都含有以下三个基因：gag(组抗原，编码核心和基质蛋白，p24和p17)，pol(聚合酶，编码酶蛋白，逆转录酶，RNAase，蛋白酶和整合酶)和env(编码包膜和跨膜糖蛋白，gp 120和gp 41)(Welles，L.和Yarchoan，R.，在抗菌疗法和疫苗中。Yu，VL，Merigan，Jr，TC and Barriere，SL Eds，Williams&Wilkins，Baltimore，(2005)，pgs.1264-1287)。它们共享抗原的存在，复制能力和病毒包膜。
i)人类免疫缺陷病毒(HIV)
人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种复杂的逆转录病毒，可以通过人体的切口，开口或粘膜交换液体(例如精液，阴道和肛门粘液，血液和母乳)从灵长类动物传播给人类，并在人与人之间传播。HIV是一种快速突变和重组的RNA病毒，具有相当大的遗传多样性，仅在HIVI型(HIV-1)的主要组中就有九种亚型，快速周转率和持久性。HIV-1可以进一步分为4个病毒组或分离物：M，N，O和P。HIV的另一个主要群体是HIV Type 2(HIV-2)(Moss，J.(2013)“HIV/AIDS Review”放射学技术，第84卷，第3期，247-267)。大多数与艾滋病毒/艾滋病有关的死亡集中在南非，然而，艾滋病毒感染是全球性的，包括撒哈拉以南非洲、美国、欧洲和亚洲(同上)。
B)基于结构的逆转录病毒功能分析
成熟的HIV颗粒是圆形的，直径约为100nm，外层脂质膜作为其包膜。包膜包含72个旋钮，由Env蛋白的三聚体组成。gp120表面蛋白(SU)的三聚体通过跨膜蛋白gp41(TM)的三聚体锚定在膜上。构象依赖性中和表位在gp120蛋白上发现。这些存在于天然蛋白质上，但仅在未折叠的变性蛋白质上部分表达。病毒包膜由脂质双层组成，在成熟的病毒颗粒中，包膜蛋白SU和TM组成。它覆盖由基质蛋白形成的对称外衣壳膜(MA，p17)。锥形衣壳由内衣壳蛋白p24(CA)组装而成。根据截面平面的不同，衣壳显示为圆锥、环或椭圆。衣壳的锥形极连接到外衣壳膜上。两个相同的病毒基因组RNA分子位于衣壳内，病毒酶RT/RNase H和IN的几个分子与核酸结合。病毒颗粒中还存在寡肽，寡肽是在病毒粒子成熟期间通过前体蛋白的蛋白水解处理(p55，p160)从细胞释放后产生的。(德国血液咨询委员会(ArbeitskreisBlut)，“血液传播病原体评估”亚组。(2016)“人类免疫缺陷病毒(HIV)”。输血医学和血液治疗：德国血液移植医学与免疫麻醉学的器官，Vol.43，3：203-22.doi：10.1159/000445852).
C)逆转录病毒感染的免疫反应
在感染的第一阶段，称为原发感染阶段，感染者的免疫系统开始通过产生HIV抗体(响应HIV抗原，这一过程称为血清转换)和细胞毒性淋巴细胞来对病毒作出反应。血清转换后，临床无症状期通常在初始HIV感染后出现，其中外周血中的HIV水平下降，但在淋巴结中具有高度功能以破坏CD4淋巴细胞。随着患者的免疫系统因组织和淋巴结的过度损伤，病毒突变以及T细胞的破坏增加和替代减少而恶化，免疫系统逐渐受损(参见Moss，J.(2013)“HIV/AIDS评论”放射学技术，第84卷，第3期，247-267)。在第二阶段，实验室结果表明每μL血液中有14％至29％的CD4+T细胞和轻度症状被感知。在第三阶段，CD4+T细胞计数低于14％，并且可见晚期症状。到第四阶段，已经发展为获得性免疫缺陷综合征，并出现严重症状。(同上)。
T细胞数量的大幅减少会严重削弱免疫系统。随着CD4淋巴细胞计数减少到少于200个细胞/μL血液，免疫系统通常会预防的某些机会性感染的出现可能会引发有症状的HIV感染。例如肺炎、腹泻、眼部感染和脑膜炎。HIV患者也容易患上癌症和疾病，例如卡波西肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、HIV脑病、进行性多灶性白质脑病、淋巴样间质性肺炎和HIV消瘦综合征。(同上)。
HIV最初感染CD4+CCR5+T细胞。然后，病毒通过血液从粘膜相关的淋巴组织传播到其他淋巴组织，特别是在肠道相关的淋巴组织中，它可以大量复制。见同上。在急性HIV-1感染中，记忆CD4+T细胞从淋巴系统中大量耗尽，特别是在涉及病毒直接靶向和旁观者激活诱导的细胞死亡的肠道中(参见Mattapallil JJ，Douek DC，Hill B，Nishimura Y，Martin M，Roederer M(2005)大规模感染和记忆丧失CD4+急性SIV感染期间多个组织中的T细胞。自然434：1093–1097；另见Douek DC，Brenchley JM，Betts MR，Ambrozak DR，Hill BJ，OkamotoY，Casazza JP，Kuruppu J，Kunstman K，Wolinsky S等人(2002)HIV优先感染HIV特异性CD4+T细胞。自然417：95-98)。这适用于所有记忆CD4+T细胞群，但HIV特异性群体可能优先感染和破坏(参见Douek DC，Roederer M，Koup RA(2009)艾滋病免疫发病中的新兴概念。AnnuRev med 60：471–484)。然而，即使在存在高水平病毒血症的情况下，HIV特异性CD4+T细胞被感染的百分比通常也只有百分之几或更少，这表明尽管在非常高的病毒血症时期被激活，但这些细胞中的大多数仍以某种方式逃脱了感染。
尽管CD4+T细胞最初和持续受损，并且缺乏可检测的HIV特异性CD4+T辅助细胞，但发现CD8+T细胞对HIV在感染者中的反应的大小和广度是强大的，其直接效应器功能如此之大，以至于可以很容易地在艾滋病患者的外周血和新分离的淋巴细胞和芽肺泡灌洗中检测到它。(沃克，B和麦克迈克尔，A。“T细胞对HIV的反应。(2012年11月)《冷泉哈布透视医学》2(11)：a007054；引用Murray，HW等人(1984)“获得性免疫缺陷综合征中淋巴因子和免疫(γ)干扰素的产生受损。Lane，HC等人(1985年)“获得性免疫缺陷综合征患者免疫功能的定性分析；可溶性抗原识别选择性缺陷的证据，“N.Engl.J.Med.313：79-84)。急性期CD8+T细胞反应发生在急性期蛋白和促炎细胞因子的情况下。最初的反应是狭隘的，主要针对Env和Nef的表位，这些区域是病毒中变化最大的区域之一。反应的广度随着时间的推移而增加，参与识别感染细胞的HLA等位基因的数量也随之增加。动物模型中的免疫研究表明，CD8+T细胞区室具有巨大的扩增能力，而不会影响幼稚的CD4+，CD8+或B细胞群的大小，同时保留对其他病原体的CD8+T细胞群的记忆。HIV特异性CD8+T细胞反应在整个病程中仍然是可检测的，并且实际上在进行性感染的人中比在受控感染者中更广泛和更高。(同上，引用(Vezys，V.等人(2009)“记忆CD8 T细胞区室随着免疫学经验而增长”，Nature 457：196-199；PereyraF.等人(2008)“在没有治疗的情况下控制HIV感染的人的遗传和免疫异质性”，J.Infect。第197页：563-571)。
感染慢性期反应的特异性反复表明，Gag靶向与较低的病毒载量有关。(同上，引用Edwards，BH等人(2002)“功能性CD8+T细胞对人类免疫缺陷病毒1型的gag蛋白的反应幅度与血浆中的病毒载量成反比。J Virol 76：2298–2305；Zuniga，R.等人(2006)Gag p24特异性细胞毒性T淋巴细胞的相对优势与人类免疫缺陷病毒控制有关。J Virol 80：3122–3125；Kiepiela等人(2007)“CD8+T细胞对不同HIV蛋白的反应与病毒载量有不一致的关联。NatMed 13：46-53)。在一项针对C型分支病毒感染者的大型研究中，Gag特异性反应越广泛，病毒载量越低，而且有些矛盾的是，Env特异性反应越广泛，病毒载量越高。(同上；引用Kiepiela等人(2007)“CD8+T细胞对不同HIV蛋白的反应与病毒载量有不一致的关联。纳特地中海13：46–53；Ngumbela，KC等人(2008)“靶向HLA-B*5802提出的CD8T细胞env表位与HIV疾病进展的标志物和缺乏选择压力有关。AIDS Res Hum逆转录病毒24：72-82)。
通常，在HIV-1感染者中，T细胞反应以CD8+T细胞为主。这些比被病毒破坏的CD4+T细胞反应强得多。(同上，引用(Ramduth，D等人(2005)HIV-1分支C蛋白在引发CD8+和CD4+细胞反应中的差异免疫原性。J Infect Dis 192：1588–1596)。在CD4+T细胞通过抗体输注或遗传耗尽的小鼠模型中，CD8+T细胞反应受到严重损害。(同上，引用(Janssen，EM等人，2003)CD4+T细胞是CD8+T淋巴细胞二次扩增和记忆所必需的。自然421：852–856；Shedlock，DJ和Shen，H(2003)CD4 T细胞的要求有助于产生功能性CD8 T细胞记忆。科学300：337–339；Sun，JC和Bevan，MJ(2003)急性感染后CD8 T细胞记忆缺陷，没有CD4 T细胞的帮助。科学300：339–342).在抗原刺激下，它们迅速扩张到疲惫，并且它们的IL-2依赖性进展到长期记忆群体被废除。(同上，引用(Kamimura，D和Bevan，MJ(2007)幼稚CD8+T细胞在体内IL-2抗IL-2复合物治疗后分化成保护性记忆样细胞。J Exp Med 204：1803–1812)。在HIV-1感染中，CD4+T细胞虽然大大耗尽，但并非完全不存在，但CD8+T细胞反应发展中的异常可能与CD4+T细胞帮助的部分丧失或剩余细胞的功能受损一致(同上，引用(Pitcher，CJ等人(1999)HIV-1特异性CD4+T细胞在大多数具有活动性HIV-1感染的个体中可以检测到，但随着病毒的长期抑制而下降。Nat Med 5：518-525)。
慢性感染者的横断面数据表明，强烈的CD4+T细胞反应与有效的CD8+T细胞反应之间存在联系。(同上，引用(Kalams，SA等人(1999)在人类免疫缺陷病毒1型感染中病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞与辅助反应之间的关系。J Virol 73：6715–6720)。最近的数据表明CD4+T细胞使IL-21在维持CD8+反应方面特别重要。(同上，引用(Chevalier MF，Jülg B，PyoA，Flanders M，Ranasinghe S，Soghoian DZ，Kwon DS，Rychert J，Lian J，Muller MI，etal.HIV-1-特异性白细胞介素-21+二氧化硫+T细胞反应有助于通过调节HIV特异性CD8来持久控制病毒+T细胞功能。(2011)J Virol 85：733–741；Williams LD，Bansal A，Sabbaj S，Heath SL，Song W，Tang J，Zajac AJ，Goepfert PA白细胞介素-21产生HIV-1特异性CD8 T细胞在精英控制器中优先可见。(2011)J Virol 85：2316–2324))。虽然早期研究表明缺乏CD4+T细胞反应，但据报道，当患者早期接受抗逆转录病毒药物治疗时，可以挽救对HIV抗原的强CD4+T细胞反应。
抗病毒CD8+T细胞首先被鉴定为介导病毒感染细胞裂解的T细胞，通常被称为细胞毒性T淋巴细胞(Id.，引用Plata F.等人(1975)在小鼠肉瘤病毒系统中体外产生细胞溶解性T淋巴细胞的原发性和继发性体外生成。Eur J Immunol 5：227-233)。虽然大多数抗原特异性CD8+T细胞具有这种活性，但它们还可以使用其他效应机制。这些包括干扰素γ，IL-2，TNF-α，MIP-1α(更名为CCL3)，MIP-1β(CCL4)和RANTES(CCL5)的产生。然而，这种效应器功能可能并不总是存在，可能需要几天才能出现。相比之下，记忆CD8+T细胞在几个小时内迅速反应产生干扰素γ。(同上，引用Lalvani，A.等人(1997)CD8+记忆T细胞中的快速效应器功能。J Exp Med 186：859–865)。裂解颗粒的产生需要更长的时间，但一旦激活，效应器记忆CD8+T细胞可以在几分钟内释放穿孔素和颗粒酶。(同上，引用Barber，DL等人(2003)尖端：通过记忆CD8 T细胞快速体内杀伤。J Immunol 171：27-31)。当TCR遇到弱结合的自身抗原时，激活记忆T细胞中裂解功能的延迟可能保护身体免受自身免疫攻击。
虽然溶性电位可能仍然是必不可少的，但在慢性感染期间，一旦病毒设定点建立，CD8+T细胞的其他功能可能变得更加重要，尽管裂解电位可能仍然是必不可少的。(同上，引用(Betts，MR和Harari，A(2008)HIV中保护性T细胞免疫反应的表型和功能。Curr Opin HIVAIDS 3：349–355)。在控制病毒良好的患者中，T细胞比急性感染更安静。许多研究表明，那些很好地控制HIV-1的人中的T细胞是多官能的，不仅显示出细胞溶解潜力，而且还具有产生细胞因子和趋化因子的能力，尽管目前尚不清楚这是因果关系。(同上，引用(Betts，MR和Harari，A(2008)HIV中保护性T细胞免疫反应的表型和功能。Curr Opin HIV AIDS 3：349–355)。在没有过度激活和疲惫的情况下，长时间的抗原刺激，如在缓慢的进展者中发生的那样，可能有利于多种功能的表达。IL-2的产生对于CD8+T细胞的长期持久性可能很重要，并且可以由CD8+T细胞本身或CD4+T细胞提供，CD4+T细胞在疾病进展缓慢的细胞中存活得更好。(同上；引用(Rosenberg，ES等人，1997)与病毒血症控制相关的剧烈HIV-1特异性CD4+T细胞反应。科学278：1447–1450；Zimmerli，SC et al.(2005)HIV-1-特异性IFN-γ/IL-2分泌CD8 T细胞支持HIV-1特异性CD8 T细胞的CD4非依赖性增殖。国家科学院院刊102：7239-7244)。在HIV-2感染中也进行了类似的观察，其中精英控制者相对常见。(同上；引用(Duvall，MG等人，2008)多功能T细胞反应是HIV-2感染的标志。Eur J Immunol 38：350–363)。这些发现与CD4+T细胞耗尽小鼠的数据完全一致，这些数据显示了IL-2在维持长期CD8+T细胞记忆中的重要性。(同上；引用Williams MA，Tyznik AJ，Bevan MJ(2006)启动期间的白细胞介素-2信号是CD8二次扩增所必需的+记忆T细胞。自然441：890–893))。
有证据表明，CD8+T细胞在控制早期HIV感染方面至关重要。对人体组织样本的研究表明，T马币在多个部位(包括胃肠道和女性生殖道)响应HIV感染而产生。此外，似乎自然控制感染的个体具有T马币与没有产生多功能免疫反应的个体相比，能够产生最高的多功能免疫反应(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).但是，T马币与病毒血症个体相比，控制感染个体的HIV特异性CD8+T细胞区内的人群代表性不足。(同上)
与不同部位的其他感染相似，CD8+T马币在HIV的背景下，可以根据CD103的表达将其细分为两个子集(also称为人粘膜淋巴细胞抗原1，αEββ7整合素).对宫颈外皮和经血的分析显示，HIV感染的女性更容易感染CD103-T马币与健康个体相比。CD103表达的减少可以解释为HIV诱导的CD4+T细胞的消耗，这似乎对于为CD8+T细胞提供上调CD103的帮助至关重要。与CD103+相比，外切宫铁饼的CD103-群体更接近上皮的基底膜。来自受感染个体的CD103+人群似乎表达了更高水平的PD-1。在另一项研究中，脂肪PD-1+CD4+T马币，在HIV感染期间似乎保持相对不活跃，并可能作为HIV的宿主。因此，慢性激活的T马币和T马币暴露于免疫调节环境(如脂肪组织)可能无法引起完全的效应器反应，有利于HIV感染的进展。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
HIV似乎还具有破坏CCR5介导的CD8+T细胞迁移到宫颈粘膜的能力，从而损害T马币的发育人口。人体研究表明，T马币，尤其是CD8+T马币，在抗HIV感染中起重要作用在猕猴的猿猴免疫缺陷病毒模型中，静脉注射SIVmac239Δnef产生了CD8+T马币的种群在参与保护的阴道组织和肠道中。在小鼠模型中，这是一种粘膜疫苗接种策略，其中鼻内给予表达HIV-1Gag蛋白p24的流感载体，然后阴道内加强剂诱导CD8+T马币在阴道里。抗原刺激这些CD8+T马币导致B细胞，自然杀伤细胞和CD4+T细胞的募集。虽然先天性和适应性免疫细胞的募集可能有益于早期病毒清除，但在HIV的背景下，CD4+T细胞的募集可能是有害的，因为它们是HIV的靶标。因此，通过主要和拉取疫苗接种策略将CD4+T细胞偶然募集到HIV进入部位(女性生殖道和直肠)可能会无意中增加对感染的易感性。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
D)逆转录病毒科病毒疫苗开发
逆转录病毒、慢病毒，特别是艾滋病毒的疫苗开发在很大程度上没有成功。抗体和细胞毒性T淋巴细胞都是在感染HIV时产生的(Seabright，G.E.等人，(2019)“HIV疫苗设计中的蛋白质和聚糖模拟”，J.MOl/Biol.431(12)：2223-2247)。然而，对疫苗有一些保护性免疫反应，这些疫苗调用T细胞介导的免疫，多功能抗体反应，抗体依赖性细胞毒性和广泛中和抗体(bNab)(MacGregor，R.等人(2002)“在正常志愿者中诱导T细胞反应，这些志愿者免疫含有HIV-1env和rev的基于DNA的腔肠。艾滋病16，2137-2143)。
尽管对人类免疫缺陷病毒(HIV)病的发病机制及其关键抗原靶点的结构有了越来越多的了解，但开发针对HIV的有效疫苗的努力仍然失败。
为HIV开发的援引T细胞介导的免疫力的DNA疫苗仍然缺乏诱导长期免疫反应的能力。例如，编码env和rev的DNA疫苗被证明可以诱导CD4+T细胞反应并且不能很好地诱导CD8+T细胞反应(MacGregor，R.等人(2002)“在正常志愿者中诱导T细胞反应，这些志愿者免疫了含有HIV-1env和rev的基于DNA的腔肠。艾滋病16，2137-2143)。在编码gag和pol基因的DNA疫苗中也看到了类似的结果(Tavel，J.A.等人，(2007)“在HIV-1-血清阴性受试者中通过无需要装置施用的Gag-Pol候选HIV-1DNA疫苗的安全性和免疫原性”。
细菌
VI)角膜杆菌科
A)棒状杆菌科概述
家庭棒状杆菌科由近90种棒状杆菌属和单特异性Turicella属组成。Turicella作为一个属的地位得到了表型特征的支持。两个分类群在目中形成一个不同的分支棒状杆菌这显然与相关家族菜科和椿科分开。大多数棒状杆菌物种含有22-36个碳的霉菌酸。棒状杆菌科的成员在不同的环境中被发现。密切相关的生物体白喉棒状杆菌(C.白喉)，溃疡棒状杆菌和假结核棒状杆菌是唯一可能产生强效外毒素的物种，即白喉毒素和磷脂酶D，两者在致病性中都起着重要作用。(Tauch A.，Sandbote J.(2014)The FamilyCorynebacteriaceae.在：Rosenberg E.，DeLong E.F.，Lory S.，Stackebrandt E.，Thompson F.(eds)The Prokaryotes.施普林格，柏林，海德堡)。
C.白喉引起白喉，这是一种主要感染儿童的疾病。在美国、欧洲和东欧，最近爆发的白喉主要发生在酗酒者和/或吸毒者中。(墨菲JR.白喉棒状杆菌.(1996)In：Baron S，編輯医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校；第32章)。白喉病例进一步发生在印度、印度尼西亚、尼泊尔、安哥拉和巴西。
i)棒状杆菌白喉(三.白喉)
C.白喉是一种非运动性、非胶囊状、俱乐部形、革兰氏阳性芽孢杆菌，已知可产生白喉毒素。致毒菌株是携带白喉毒素(毒素)结构基因的棒状噬菌体家族之一的溶原菌株。C.白喉根据菌落形态分为生物型(mitis，intermedius和gravis)，以及基于棒状噬菌体敏感性的溶菌型。(墨菲JR.白喉棒状杆菌.(1996)In：Baron S，编辑医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校；第32章)。最严重的疾病与重症生物型有关。
C.白喉通过飞沫，分泌物或直接接触传播。已经记录了非毒素菌株向产毒表型的原位溶原转化。感染仅在人类中传播，尽管已经从马中分离出产毒菌株。在维持免疫规划的地区，孤立的疾病暴发通常与最近访问白喉流行的亚热带地区的携带者有关。大规模疾病暴发可能发生在没有维持积极免疫计划的人群中。(墨菲JR.白喉棒状杆菌.(1996)In：Baron S，编辑医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校。第32章)。
B)基于结构的角膜细菌功能分析
白喉毒素可以通过蛋白水解切割成两个片段：N端片段A(催化结构域)和片段B(跨膜和受体结合结构域)。片段A催化伸长因子2的NAD+依赖性ADP-核糖基化，从而抑制真核细胞中的蛋白质合成。片段B与细胞表面受体结合并促进片段A递送到细胞质基质。(墨菲JR.白喉棒状杆菌.(1996)In：Baron S，編輯医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校。第32章)。
C)对角膜杆菌科细菌感染的免疫反应
临床白喉有两种类型：鼻咽和皮肤白喉。咽部白喉的症状从轻度咽炎到假膜气道阻塞引起的缺氧不等。颈部淋巴结受累可能导致颈部严重肿胀(牛颈白喉)，患者可能发热(≥103°F)。皮肤白喉的皮肤病变通常由灰褐色假膜覆盖。危及生命的全身性并发症，主要是运动功能丧失(例如吞咽困难)和充血性心力衰竭，可能是白喉毒素对外周运动神经元和心肌的作用所致。(墨菲JR.白喉棒状杆菌.(1996)In：Baron S，編輯医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校。第32章)。
无症状的鼻咽携带在白喉流行地区很常见。在易感个体中，产毒菌株通过在鼻咽或皮肤病变中繁殖和分泌白喉毒素来引起疾病。白喉病变通常由纤维蛋白、细菌和炎性细胞组成的假膜覆盖。
i)T细胞对角膜杆菌科细菌感染的反应
关于T细胞对角膜杆菌科细菌感染的反应的信息有限，主要是因为细菌具有许多禁用先天免疫反应的机制。虽然致病性棒状杆菌在宿主防御系统方面的逃逸机制通常还没有得到很好的理解，但据了解，来自角质杆菌科细菌的毒素，如白喉角膜杆菌与人类先天免疫系统相互作用，并可能导致系统故障(Weerasekera，D.等人，(2019)“白喉棒状杆菌和溃疡棒状杆菌诱导人巨噬细胞系坏死菌株从全身性致命病例中分离出来感染“Int.J.Mol.Sci.20，4109)。
在先天系统不因感染而致残的情况下，T细胞反应可以被视为对抗角膜杆菌科细菌的关键。例如C.假性结核是一种细胞内病原体，可以在宿主细胞中复制并获得相对于宿主的选择性优势；对细菌的保护性免疫反应基于TH1细胞反应和细菌毒株感染诱导T的产生H1反应相关细胞因子，如IFN-γ。用细菌刺激小鼠脾细胞后IFN-γ和TNF的产生是由MAPKp38和ERK 1/2信号通路的激活驱动的。接种抗IFN-γ抗体的小鼠在器官中显示出细菌增殖增加，并且接种抗TNF抗体也导致更高的菌血症(Oliverira等人，“属的见解”棒状杆菌：确定致病性和非致病性物种的作用。(2017)前线.微生物学，8：1937).
D)角膜细菌疫苗开发
白喉类毒素、破伤风类毒素和百日咳抗原被联合用于全世界儿童免疫接种的白喉-破伤风-百日咳疫苗(DTP)。百白破也可能与其他疫苗抗原联合使用，如乙型肝炎表面抗原(HBsAg)和乙型流感嗜血杆菌(Hib)偶联物作为五价疫苗，并与灭活脊髓灰质炎疫苗(IPV)联合作为六价疫苗。破伤风-白喉(Td，低剂量白喉类毒素)制剂和破伤风-白喉-无细胞百日咳(Tdap)制剂分别从5岁和3岁开始使用。在3剂含百白破疫苗的初级系列疫苗之后，94-100％的儿童具有保护性抗白喉抗体水平>0.01IU/mL，但需要加强剂量以确保持续保护。疫苗的有效性可以在疫情环境中看到：关于疫苗有效性的最新数据来自1990年代前苏联国家的流行病。病例对照研究表明，3剂或更多剂量的白喉类毒素诱导95.5％(95％CI：92.1–97.4％)对2岁以下儿童的保护有效性<15年.接种5剂或更多剂这种疫苗后，保护作用提高到98.4％(95％CI：96.5–99.3％)。(World Health Organization,(2017)“Summary ofWHO Position Paper on Diphtheria Vaccines,August 2017”.取自https://www.who.int/immunization/policy/position_papers/diphtheria/en/).
i)角膜杆菌科细菌疫苗设计的挑战
白喉疫苗涉及引起急性感染而非慢性感染的微生物。他们依靠高于定义阈值的特异性抗体水平作为替代标志物进行保护。刺激主要效应器臂，细胞介导的免疫(CMI)和抗体以开发针对细胞内生物体的有效疫苗的重要性已越来越多地成为人们关注的焦点。(Salerno-Goncalves，R.，“细胞介导的免疫和疫苗开发的挑战。(2006)趋势微生物。12月；14(12):536-42.Epub格式2006年10月19日)。
此外，白喉和破伤风(由破伤风梭菌)是类毒素是热灭活或化学灭活的毒素，它们保留了免疫原性，但缺乏天然毒素诱导宿主损伤的能力。虽然使用类毒素疫苗实际上已经消除了接种疫苗人群中的白喉和破伤风，但它们在预防疾病方面的成功与白喉或破伤风的恢复不能可靠地赋予疾病复发免疫力的事实形成鲜明对比。从疾病中恢复后缺乏持久的免疫力可能反映了毒素能够诱发损害的速度，损害可以通过少量毒素介导和/或天然毒素不具有高度免疫原性，每种方法都可能排除对毒素产生保护性抗体反应。因此，白喉或破伤风的恢复可能涉及与类毒素疫苗接种引起的免疫机制和/或对不同决定因素的免疫反应。因此，双醚感染可能是不可预测的。(Casadevall，A.，et al.，“Exploiting the Redundancyin the Immune System”Journal of Experimental Medicine(2003)197(11)1401-1404)。
VII)分枝杆菌科
A)分枝杆菌科概述
只有一个属，分枝杆菌属，在分枝杆菌科。属于该属的生物包括牛分枝杆菌和结核分枝杆菌，这两者都会导致人类和其他动物的结核病(TB)。结核病是有记录以来最古老的人类疾病之一，仍然是传染病中最大的杀手之一，尽管全世界都在使用减毒活疫苗和几种抗生素，但每年约有200万人死亡。结核病的地理发病率从北美、亚洲、俄罗斯西部以及非洲南部和中部传播。(史密斯，伊萨尔。“结核分枝杆菌的发病机制和毒力的分子决定因素。临床微生物学评论vol.16，3(2003)：463-96.doi：10.1128/cmr.16.3.463-496.2003).
i)牛分枝杆菌(Mbc)
牛分枝杆菌，(Mbv)是牛结核病的致病因子。牛支原体可以通过食用受污染的、未经高温消毒的乳制品、接触暴露的伤口或吸入感染牛支原体的动物呼出的空气中的细菌而传播给人类。
ii)结核分枝杆菌(Mtb)
结核分枝杆菌(Mtb)是一种抗酸染色细胞内细菌，是结核病的致病因子。致命的感染可以表现为肺部疾病，以及额外的肺部疾病。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).结核病是免疫功能低下个体的一种重要疾病，例如，三分之一的暴露于HIV阴性的个体受到感染，其中3％至5％在第一年发展为结核病。另有3％至5％的感染者在以后的生活中发展为结核病。据认为，非HIV感染患者的大多数成人结核病是由先前存在的感染的重新激活引起的。感染结核分枝杆菌的艾滋病毒阳性者在一生中的某个时候有50％的机会发生再激活(继发性)结核病。这些个体和其他免疫抑制的人也可能新感染结核分枝杆菌，并且在许多情况下显示出迅速进展为活动性疾病。(史密斯，伊萨尔。“结核分枝杆菌的发病机制和毒力的分子决定因素。临床微生物学评论vol.16，3(2003)：463-96.doi：10.1128/cmr.16.3.463-496.2003).
B)基于结构的分枝杆菌科细菌功能分析
分枝杆菌是细长的弯曲棒，耐酸，耐酸，碱和脱水。细胞壁含有复杂的蜡和糖脂。体外富集培养基的倍增非常缓慢，倍增时间为18至24小时；临床分离株可能需要4至6周才能生长。细胞包膜(E)在分枝杆菌适应细胞内生长方面至关重要。它们也被称为具有胶囊状结构，这对于其细胞包膜的通透性屏障和保护宿主细胞吞噬活性很重要。胶囊包含表面抗原，包括外层蛋白(OL)，以及包膜结构(CAP)蛋白。其他重要的结构成分包括磷脂基质(PL和PIM)，壁蛋白(P)，细胞壁骨架(CWS)，长尺寸嗜酸性粒细胞(LAM)，其通过细胞膜(CM)通过E锚定(Rastogi，N.等人，“分枝杆菌：命名法和发病机制的介绍”。科学技术研究报，2001)，20(1)，21-54).
C)对分枝杆菌科细菌感染的免疫反应
细菌通过空气传播进入肺泡。它们抵抗肺泡巨噬细胞的破坏并繁殖，形成原发性病变或结节。然后它们扩散到区域淋巴结，进入循环，并重新播种肺部。(史密斯，伊萨尔。“结核分枝杆菌的发病机制和毒力的分子决定因素。(2003)临床微生物学评论，Vol.16，3463-96.doi：10.1128/cmr.16.3.463-496.2003).细胞介导的超敏反应导致组织破坏。
易感性受遗传、种族和外在因素的影响，例如，对免疫系统的侮辱以及宿主的营养和生理状态。获得性耐药性由T淋巴细胞介导，T淋巴细胞直接裂解受感染的巨噬细胞或通过可溶性介质(例如，γIFN)激活它们以破坏细胞内杆菌；抗体不起保护作用。
i)T细胞对分枝杆菌科细菌感染的反应
对人类感染的研究结核分枝杆菌已经表明，使用小鼠实验感染获得的许多结果也适用于人类。众所周知，细胞介导的反应在保护中很重要，并且似乎涉及T细胞的几个亚群。对分枝杆菌的保护性免疫被认为主要由T辅助者介导(TH1 CD4+和CD8+T细胞分泌干扰素γ(IFN-γ)，但其他T细胞群，如γδT细胞和自然杀伤(NK)T细胞，也可能受累。具体而言，IFN-γ和其他Th1细胞因子上调巨噬细胞
Figure BDA0003838332750000871
的抗菌功能以杀死它们所携带的杆菌。活化
Figure BDA0003838332750000873
的杀菌和抑菌功能可以在体外证明，但很明显，毒力分枝杆菌很难杀死。除了那些涉及
Figure BDA0003838332750000872
的机制之外，可能还有其他机制参与杀死致命的分枝杆菌。细胞毒性T淋巴细胞(CTL)具有杀死感染结核分枝杆菌的人和小鼠
Figure BDA0003838332750000874
的能力。(Skinner，Margot A等人(2003)“在牛结核病实验性感染期间对牛分枝杆菌的细胞毒性T细胞反应。免疫学，Vol.110，2：234-41.doi：10.1046/j.1365-2567.2003.01731.x).
牛CTL已被证明可以杀死感染其他细胞内病原体的细胞。至少在体外，CTL直接杀灭分枝杆菌已被证明，并且颗粒溶解素等分子参与CTL的细胞毒性颗粒，与这种杀伤有关。CTL也可能在更有效的抗原呈递中发挥作用，因此从受感染细胞释放的细胞内分枝杆菌可以被更熟练的抗原呈递细胞吸收。(Skinner，Margot A等人，“在牛结核病实验性感染期间，对牛分枝杆菌的细胞毒性T细胞反应。免疫学，2003，Vol.110，2：234-41.doi：10.1046/j.1365-2567.2003.01731.x).早在6周后牛分枝杆菌感染，CD4+T厘米在长期抗原刺激的PBMC培养物中检测到细胞(CD45RO+，CCR7+)，这些细胞具有特异性(即rESAT-6：CFP-10)或复合(即PPDb)抗原的召回刺激牛分枝杆菌.通过ELISPOT或细胞内细胞因子染色通过IFN-γ产生检测到的抗原特异性CD4细胞在长期PBMC培养物中占主导地位
Figure BDA0003838332750000881
T厘米细胞(CD45RO+/CCR7+)，其余为T断续器细胞(CD45RO+/CCR7-，～23％)。牛T厘米高度增殖，因为长期培养细胞的抗原再刺激诱导CD4+细胞的强健增殖，显着超过短期培养细胞的增殖。对重复刺激培养物的进一步表型分析表明，牛T的亚群厘米恢复到效应器(两者均为T断续器和T效应)重复暴露于M.bovis抗原。(Maggioli MF，Palmer MV，Thacker TC，Vordermeier HM，Waters WR(2015)牛结核病免疫反应中效应子和记忆T细胞亚群的表征。PLOS ONE 10(4)：e0122571)。
T厘米和体外反应在M.tb-感染患者和T丢失厘米反应(通过培养的IFN-γELISPOT测量)与临床疾病进展相关。同样，T厘米在没有体外IFN-γ产生的情况下的反应表明通过自愈或抗分枝杆菌治疗可以缓解疾病，从而加强病原体清除对中医功能和/或维持的作用。尽管存在T厘米细胞，接受治愈性治疗的患者仍然容易受到M.tb再次感染。例如，在一项关于小牛的实验中，每头牛都有轻度进展性疾病，并且在培养和离体IFN-γELISPOT测定中都对结核病抗原有反应-类似于在轻度活性形式M.tb感染。流式细胞术分析表明，两者均为T断续器和T厘米细胞在感染后相对较早(感染后3周)被引出。不确定是否T厘米随着疾病的进展，动物的反应会减少，但经常有报道称，处于感染晚期的动物对细胞介导的免疫力测量结果过敏，在皮肤试验或离体IFN-γ测定中产生假阴性结果。(Maggioli MF，Palmer MV，Thacker TC，Vordermeier HM，Waters WR(2015)牛结核病免疫反应中效应子和记忆T细胞亚群的表征。PLOS ONE 10(4)：e0122571)。
淋巴细胞归巢和运输到炎症部位和淋巴器官是由许多表面粘附分子(如CCR7，CD62L和CD44)的表达介导的。CD62L介导细胞粘附于外周淋巴结血管地址蛋白(例如GlyCAM-1和MAdCAM-1)。CD62L在幼稚和记忆T细胞上的表达促进了继发性淋巴器官内皮细胞的滚动，有助于免疫反应的区室化。T细胞上的CD44表达在激活时受到调控，从而通过与透明质酸和纤连蛋白的相互作用促进细胞外基质的运动。已知抗原特异性T细胞的体外刺激可上调CD44，同时下调CD62L在人，小鼠和牛中的表达。与人类一样，在离体刺激下表达CD44的牛T细胞经常共表达CD45RO，同时下调CD62L。研究表明，CD44细胞上CD44的表达在T断续器之间没有差异和离体或长期培养条件下的效应细胞。研究还表明，CD62L的表达在效应细胞中受到下调，在T断续器上是中间体细胞，并且T厘米值较高细胞。虽然T厘米CD62L细胞高度表达，这些细胞保持CD44的高表达。记忆T细胞CD44表达水平的相关性对小鼠和人类都是有争议的。来自小鼠的数据表明，尽管CD44的表达对于T的早期扩增，运输和细胞因子产生是可有可无的。H1细胞；CD44的表达是细胞长期存活和对再感染的记忆反应所必需的。在人类和小鼠中，已知CCR7与CD62L一起在细胞归巢到继发性淋巴器官(SLO)中起主要作用。对于牛，CD4 T细胞迁移到SLO需要CCR7表达，而γδT细胞归巢到SLO不是由CCR7表达介导的。同样，在支原体支原体感染，在感染和病原体清除后报告了具有Tcm特征的CD4细胞亚群。在重新刺激时，表达CD62L的细胞具有高度增殖性，同时不易下调CCR7转录。相反，缺乏CD62L的细胞显示出更大的IFN-γ产生，较低的增殖和CCR7转录的下调。研究表明，在抗原刺激的反应中，中药细胞强烈增殖，并且能够切换到Tem和效应细胞(CCR7下调)。(Maggioli MF，PalmerMV，Thacker TC，Vordermeier HM，Waters WR(2015)牛结核病免疫反应中效应子和记忆T细胞亚群的表征。PLoS One 10(4)：e0122571)。
Mtb感染的免疫控制在很大程度上依赖于CD4+T细胞产生IFNγ，这增强了巨噬细胞对持续细胞内Mtb的杀伤，并导致细菌复制部位周围形成肉芽肿。一项临床研究表明，以前接触过结核病的个体可能具有肺居民TH1效应记忆细胞释放IFN-γ以响应Mtb抗原再暴露。然而，在原发感染期间，TB特异性T细胞活化和募集到肺部的延迟允许Mtb增殖，导致高细菌负担。气道驻留记忆T细胞(当时称为气道腔细胞)在介导结核病保护中的重要性早在T马币出现之前就已经描述过了.但是，这些单元格很可能表示相同的单元格类型。肺T马币黏膜疫苗接种诱导已被证明可有效限制细菌复制的早期控制。尽管CD4+T细胞在控制结核病中的作用明确，但疫苗研究的最新证据表明CD8+肺T马币在保护Mtb方面也起着重要作用。只有卡介苗的黏膜给药导致气道T马币的生成产生比CD8+T断续器更高水平的促炎细胞因子，包括IFN-γ.
分拣气道CD8+T马币的过继性转移来自BCG疫苗接种的小鼠在受体小鼠中表现出对Mtb挑战的增强保护。CD8+T马币的转移减少肺泡巨噬细胞的数量，同时增加感染肺组织中CD4+T细胞和B细胞的数量。据推测，CD8+T马币杀死Mtb感染的肺泡巨噬细胞，从而耗尽细菌的细胞内储库并限制进入肺实质。同样，通过鼻内途径施用的病毒载体疫苗SeV85AB和AdAg85A也被证明可以引发有利于CD8+而不是CD4+T马币产生的免疫反应。.在恒河猴模型中，递送一系列Mtb抗原(RhCMV/TB)的巨细胞病毒载体提供了针对结核病的重要保护，可能是通过它产生和维持病原体特异性CD4+和CD8+循环的能力，更重要的是选择性表达VLA-1的常驻记忆T细胞。
最后，使用缺乏sigH的减毒Mtb菌株进行气溶胶疫苗接种不仅导致大量表达CD69的T细胞流入肺部气道(可能包括TRM)，而且还对致命的Mtb挑战具有重要的长期保护作用。总的来说，这些研究表明，通过在肺部诱导肺部CD4+TRM和CD8+TRM，可以防止感染的建立和/或提供针对Mtb的灭菌免疫力。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
D)分枝杆菌科细菌疫苗开发
目前，牛分枝杆菌Calmette-Guérin(卡介苗)是唯一获得许可的结核病疫苗，可防止儿童传播。然而，卡介苗不能为成人提供足够强的肺结核免疫力，因此允许传播。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).虽然有可以预防结核病的疫苗和可以治疗结核病的药物(例如异烟肼；利福平；乙胺丁醇，吡嗪酰胺)，但结核菌对当前药物的耐药性越来越强。
VIII)杆菌科
A)芽孢杆菌科概述
芽孢杆菌科由形成内孢子的杆状细菌组成，有两个主要的细分：梭状芽胞杆菌属的厌氧孢子形成细菌，以及芽孢杆菌属的需氧或兼性厌氧孢子形成细菌，通常被称为ASB(好氧孢子携带者)。(特恩布尔印刷电路板。芽孢杆菌。(1996)In：Baron S，編輯医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校；第15章)。
i)炭疽杆菌(炭疽杆菌)
芽孢杆菌属的物种是杆状，内孢子形成需氧或兼性厌氧，革兰氏阳性细菌；在一些种类中，培养物可能随着年龄的增长而变成革兰氏阴性。该属的许多物种表现出广泛的生理能力，使它们能够生活在各种自然环境中。每个细胞只形成一个内生孢子。孢子耐热，耐冷，耐辐射，耐干燥和消毒剂。(特恩布尔印刷电路板。芽孢杆菌。(1996)In：Baron S，編輯医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校。第15章)。
炭疽杆菌是炭疽病的病原体，炭疽病在历史上一直折磨着人类。人类通过接触受感染的动物或动物产品而获得它。它也是一种潜在的生物恐怖主义剂。在人类中，这种疾病采取三种形式之一，这取决于感染途径。皮肤炭疽占全世界病例的95％以上，由皮肤病变感染引起；肠道炭疽是由摄入孢子引起的，通常在受感染的肉类中；和肺炭疽是由吸入孢子引起的。(特恩布尔印刷电路板。芽孢杆菌。(1996)In：Baron S，編輯医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校；第15章)。
B)基于结构的功能分析杆菌科细菌
致病性炭疽杆菌取决于两个毒力因子：多-y-D-谷氨酸多肽胶囊，其保护其免受宿主防御性吞噬细胞的吞噬作用，以及在生长的对数阶段产生的毒素。这种毒素由三种蛋白质组成：保护性抗原(PA)(82.7kDa)，致死因子(LF)(90.2kDa)和水肿因子(EF)(88.9kDa)。血液中和真核细胞表面的宿主蛋白酶通过切断20-kDa片段来激活保护性抗原，暴露LF和EF的结合位点。活化的63kDa PA多肽与宿主细胞表面的特异性受体结合，从而产生LF和EF竞争的二级结合位点。复合物(PA+LF或PA+EF)通过内吞作用内化，并且在内体酸化后，LF或EF通过PA介导的离子传导通道穿过膜进入细胞质基质。这类似于霍乱毒素的A-B结构功能模型，PA表现为B(结合)部分。EF是炭疽的特征性水肿，是一种钙调蛋白依赖性腺苷酸环化酶。(钙调蛋白是真核细胞中主要的细胞内钙受体)。唯一已知的其他细菌腺苷酸环化酶由百日咳博德特氏菌，但这两种毒素只有很小的共性。LF似乎是一种锌依赖性金属蛋白酶，尽管其底物和作用方式尚未阐明。炭疽杆菌的毒素和胶囊分别编码在两个大质粒上，分别称为pXO1(110MDa)和pX02(60MDa)。
110-MDa pXO1质粒含有基因帕格阿,莱夫和西亚编码保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)毒力因子。LF是一种锌介导的金属蛋白酶，可灭活宿主的MAPK途径。EF是一种腺苷酸环化酶，在钙调蛋白激活时，增加宿主中环AMP的细胞内浓度。PA可以结合宿主细胞上的毒素受体，形成可以结合LF或EF的七糖结构。然后，PA/LF/EF复合物可以作为致死毒素(LT)或水肿毒素(ET)掺入细胞中，统称为炭疽毒素。(Beierlein，J M和ACAnderson。(2011)“疫苗，炭疽毒素抑制剂和抗生素治疗炭疽杆菌的新发展。目前的药物化学卷18，33：5083-94).
C)对杆菌科细菌感染的免疫反应
虽然炭疽病仍然是最著名的芽孢杆菌病，但近年来，其他芽孢杆菌种类越来越多地与各种感染有关，包括脓肿、菌血症/败血症、伤口和烧伤感染、耳部感染、心内膜炎、脑膜炎、眼炎、骨髓炎、腹膜炎以及呼吸道和泌尿道感染。其中大多数是免疫性低下或其他免疫功能低下的宿主(如酗酒者和糖尿病患者)的继发性或混合感染，但很大一部分是其他健康个体的原发性感染。诱发这些类型感染的物种包括蜡样芽孢杆菌其次地衣双歧杆菌和枯草芽孢杆菌.阿尔韦芽孢杆菌，短芽孢杆菌，循环芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，槿榔芽孢杆菌，蒲公英杆菌，双歧杆菌，和苏林根双歧杆菌引起偶发感染。作为次要入侵者，芽孢杆菌物种可能通过产生干扰治疗的组织损伤毒素或代谢物(如青霉素酶)来加重先前存在的感染。(特恩布尔印刷电路板。芽孢杆菌。(1996)In：Baron S，編輯医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校。第15章)。
皮肤炭疽通常通过割伤或擦伤的污染而发生，尽管在一些国家，叮咬苍蝇也可能传播这种疾病。在2至3天的潜伏期后，接种部位会出现小丘疹或丘疹。周围的囊泡环形成。在接下来的几天里，中央丘疹溃疡，干燥和变黑，形成特征性焦痂。皮损无痛，周围有明显的水肿，可能延伸一段距离。只有当病变被化脓性微生物感染时，才会出现脓液和疼痛。同样，明显的淋巴管炎和发热通常提示继发感染。在大多数情况下，疾病仍然局限于初始病变并自发消退。主要危险是面部或颈部的病变可能肿胀以阻塞气道或可能引起继发性脑膜炎。然而，如果宿主防御力无法控制感染，则会发生暴发性败血症。大约20％未经治疗的皮肤炭疽病例进展为致命性败血症。然而炭疽杆菌对青霉素和其他常见抗生素敏感，因此几乎总是可以获得有效的治疗。(特恩布尔印刷电路板。芽孢杆菌。(1996)In：Baron S，編輯医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校。第15章)。
肠道炭疽类似于皮肤炭疽，但发生在肠粘膜上。在肺炭疽中，吸入的孢子通过肺泡巨噬细胞运输到纵隔淋巴结，在那里它们发芽和繁殖以引发全身性疾病。胃肠道和肺部炭疽都比皮肤型更危险，因为它们通常被识别得太晚，无法有效治疗。
D)芽孢杆菌科疫苗开发、挑战或失败
目前，一般公众无法获得疫苗，FDA批准用于治疗吸入性炭疽的抗生素很少。存在天然或工程细菌对抗生素耐药性的威胁。
已经开发的疫苗包括针对牲畜炭疽的无毒活疫苗。活孢子疫苗在一些国家使用，如前苏联，用于人类疫苗接种，然而，由于对残留毒力的担忧，美国和英国等西方国家尚未批准在人类中使用基于孢子的疫苗。相反，已经开发了一种使用保护性抗原诱导免疫的无细胞疫苗。由氢氧化铝沉淀法制备非包封甾烯菌株炭疽杆菌疫苗，炭疽疫苗吸附(AVA，现在称为
Figure BDA0003838332750000941
)是美国唯一获得FDA批准的炭疽疫苗。然而，强化给药方案和制剂的易用性和均匀性问题相结合，使疫苗的储备保持在较低水平，并阻止了对一般人群的给药。在目前的形式下，疫苗必须储存在4℃，这增加了储存成本并限制了位置。此外，在制备方法中固有的疫苗，其PA和其他细胞成分(包括LF和EF)的含量可能因批次而异。这可能是与疫苗相关的一些反应原性的原因(Beierlein，J M和A C Anderson。“疫苗，炭疽毒素抑制剂和炭疽杆菌抗生素治疗的新进展。目前的药物化学Vol.18，33(2011)：5083-94.doi：10.2174/092986711797636036).
IX)耶尔森菌科
A)耶尔森菌科概述
“肠细菌”目是该类中一大群多样化的革兰氏阴性，兼性厌氧，非孢子形成，杆状细菌丙种蛋白杆菌.该组的成员栖息在许多不同的生态位中，并在土壤，水中以及与包括植物，昆虫，动物和人类在内的生物体有关。许多成员肠细菌已被暗示为人类和动物的病原体，例如该物种大肠杆菌，肠道沙门氏菌和鼠疫耶尔森菌.(Adeolu，M.等人，“'肠杆菌'的基于基因组的系统发育和分类学：对肠杆菌或d.nov.的提案。分为肠杆菌科，Erwiniaceaefam.nov.，Pectobacteriaceae fam.nov.，Yersiniaceae fam.nov.，Hafniaceaefam.nov.，Morganellaceae fam.nov.和Budviciaceae fam.(2016)Intl J.Systemic&Evolutionary Microbiol.66(12)：从https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/ijsem/10.1099/ijsem.0.001485#abstract_content检索)。
i)鼠疫耶尔森菌(鼠疫杆菌)
鼠疫耶尔森菌，一种革兰氏阴性细菌和鼠疫病原体，被归类为生物恐怖主义的A类病原体。它因在历史上造成三次大规模流行病而臭名昭著，这些流行病造成数亿人死亡。其中一种形式，肺鼠疫，由于疾病进展的速度(典型的潜伏期为1至3天)而难以治疗，当个体出现症状时，他们往往接近死亡。(Adeolu，M.等人，“'肠杆菌'的基于基因组的系统发育和分类学：对肠杆菌或d.nov.的提案。分为肠杆菌科，Erwiniaceae fam.nov.，Pectobacteriaceae fam.nov.，Yersiniaceae fam.nov.，Hafniaceae fam.nov.，Morganellaceae fam.nov.和Budviciaceae fam.(2016)Intl J.Systemic&EvolutionaryMicrobiol.66(12)：从https://www.microbiologyresearch.org/content/journal/ijsem/10.1099/ijsem.0.001485#abstract_content检索)。
B)基于结构的耶尔森菌科细菌功能分析
鼠疫杆菌需要三种表征良好的毒力质粒pYV/pCD1、pPla/pPCP1和pFra/pMT1，以及染色体编码的毒力因子来引起疾病。
C)对耶尔森菌科细菌感染的免疫反应
鼠疫杆菌感染，无论是通过跳蚤叮咬还是通过呼吸道飞沫污染，都有一个残酷的转变，从缺乏免疫反应和临床症状，到爆发的炎症和致命的败血症，体内细菌丰富。这个滞后期被称为“炎症前期”和益处鼠疫杆菌，向淋巴结(腺鼠疫)或肺(肺鼠疫)迁移，以默默繁殖。如果不用适当的抗菌药物治疗，细菌会迅速从淋巴结的束缚中逸出，通过血液全身扩散，并导致致命的败血症。(Demeure，C.E.，Dussurget，O.，Mas Fiol，G.等人(2019)鼠疫耶尔森菌和瘟疫：关于进化，毒力决定因素，免疫颠覆，疫苗接种和诊断的最新观点。基因免疫20，357–370doi：10.1038/s41435-019-0065-0).
i)T细胞对耶尔森菌感染的反应
细胞介导的对细菌的保护通常依赖于1型免疫反应的发展，其特征在于分泌IFN-γ和TNF-α的病原体特异性T细胞的扩增以及CD8+细胞毒性T淋巴细胞反应。特鲁多研究所的研究表明，IFN-γ，TNF-α和一氧化氮合酶2是细胞免疫的关键元素，在体液防御致命肺部期间提供了关键的保护功能。鼠疫杆菌感染。用活体接种疫苗鼠疫杆菌(KIM5 pCD1+，pMT+，pPCP+，pgm-)可刺激CD4和CD8 T细胞，协同作用防止致命的肺部鼠疫杆菌感染。此外，转让鼠疫杆菌-引物T细胞以幼稚μ-MT小鼠防止致命的鼻内鼠疫杆菌挑战。这些研究证实，在没有抗体的情况下，细胞免疫可以保护动物免受肺部侵害。鼠疫杆菌感染.(Li，B.等人(2008)“鼠疫耶尔森氏菌与宿主免疫系统之间的相互作用”。感染与免疫Apr，76(5)1804-1811).
然而耶尔森氏菌具有通过直接抑制T淋巴细胞活化来影响适应性免疫的能力。YopH是第一个在细胞培养模型中抑制适应性免疫反应的效应蛋白。它通过诱导细胞经历线粒体调节的程序性细胞死亡来快速麻痹T细胞，但也确保细胞不会被恢复以诱导保护性免疫反应。功能分析假性结核Y.YopP表明，它可以抑制小鼠感染模型中CD8 T细胞反应的发展。
D)耶尔森菌科细菌疫苗开发
已经开发了三种类型的疫苗，即灭活全细胞(KWC)疫苗，减毒活疫苗(EV76)和重组亚单位疫苗，以对抗鼠疫。虽然KWC和EV76疫苗在动物模型中提供了针对鼠疫的保护，但两者都有副作用，需要重复免疫以发展人类免疫力。在西方世界，它们不再用于人类。EV76仍然是中国人类的首选疫苗。基于包膜蛋白F1和III型分泌系统蛋白之一LCRV的亚单位疫苗一直是最近努力的重点。这种亚单位疫苗已被证明可以保护小鼠免受鼠疫杆菌的呼吸道感染，并据报道已进入II期研究。然而，它未能充分保护非洲绿猴免受肺鼠疫的侵害。(Li，Beiet al.(2012)“长期康复的鼠疫患者对鼠疫耶尔森菌感染的体液和细胞免疫反应。临床和疫苗免疫学：CVI vol.19，2：228-34.doi：10.1128/CVI.05559-11)。
II)肠杆菌科
A)肠杆菌科概述
肠杆菌科是革兰氏阴性、兼性厌氧、非孢子形成棒的一族。该家族的特征包括运动性，过氧化氢酶阳性和氧化酶阴性；将硝酸盐还原为亚硝酸盐；和葡萄糖发酵产生的酸。但是，也有许多例外。目前，该科包括51属和238种。每个属的物种数量从1到22个不等。基因组大小从422，434bp(仅编码362个ORF)到6，450，897bp(编码5，909个ORF)不等。这肠杆菌科在自然界中无处不在。许多物种可以自由地生活在不同的生态位中，包括陆地和水生环境，有些物种仅与动物，植物或昆虫有关。许多是重要的人类，其他动物和/或植物病原体，导致一系列感染。(Octavia S.，Lan R.(2014)The Family Enterobacteriaceae.在：RosenbergE.，DeLong E.F.，Lory S.，Stackebrandt E.，Thompson F.(eds)The Prokaryotes.施普林格，柏林，海德堡)。
i)肠道沙门氏菌(S.enterica，S.Typhii)
沙门氏菌是该家族中的细菌属肠杆菌科它由一大群遗传相似的生物体组成，具有感染大量动物宿主的能力。动物和人类的大多数临床疾病是由肠道沙门氏菌亚种内的血清型引起的，其范围可以从局部胃肠炎到致命的播散性疾病。(Pham，Oanh H和StephenJMcSorley。(2015)“沙门氏菌感染的保护性宿主免疫反应”。未来微生物学，第10卷，1：101-10。doi：10.2217/fmb.14.98).
肠道沙门氏菌血清伤寒(S.伤寒i)，伤寒的病原体，是一种侵袭性细菌，快速有效地通过人类肠粘膜，其唯一的天然宿主，到达网状内皮系统。据估计，～2000年，在流行地区发生了21，650,000起伤寒和216，500例伤寒死亡。(Pham，Oanh H和Stephen J McSorley。(2015)“沙门氏菌感染的保护性宿主免疫反应”。未来微生物学，第10卷，1：101-10。doi：10.2217/fmb.14.98).该病通过粪-口途径传播，摄入受污染的水和食物，卫生设施不足，食用生奶制品、调味饮料和冰淇淋。这种疾病也可以通过食用在用污水和肥料灌溉的田地里种植的生水果和蔬菜来传播。(Marathe，S.，et al.(2012)“伤寒和疫苗开发：一个部分回答的问题。印度J Med Res.Feb；135(2):161–169).
B)基于结构的肠杆菌科细菌功能分析
所有测序的肠道细菌都有一条染色体，通常大小为4.3-5.0Mb。不同的菌株也可能以质粒的形式携带染色体外DNA。质粒通常携带与毒力或抗生素耐药性相关的基因，可以被认为是一个快速进化的基因库。比较不同肠道细菌的染色体可以确定一组常见的所谓“核心基因”，这些基因通常在肠道物种之间共享。这些核心基因可以被视为执行与肠道定植和传播(环境生存)的共同共享生活方式相关的“家庭”功能的基因。核心基因组主要由这些基因沿着单条染色体以相同的保守顺序排列来组织，这种特征被称为“synteny”。(StephenBaker，Gordon Dougan，(2007)肠道沙门氏菌血清伤寒的基因组，临床传染病，第45卷，第Supplement_1期，第S29-S33页)。
大多数伤寒沙门分离物表达Vi多糖胶囊。Vi胶囊的产生与一组位于被命名为SPI-7的新基因岛内的基因有关。该岛长134kb，编码各种推定的毒力相关基因簇，包括Vi位点，编码SPI-1的sopE效应蛋白的噬菌体，IV型pilus和假定的IV型分泌系统。SPI-7具有许多与水平获得DNA相关的典型特征，并且该结构指示几个独立的整合事件。还有一些证据表明，SPI-7可能能够以类似于共轭转座子的方式起作用。(Stephen Baker，Gordon Dougan，(2007)肠道沙门氏菌血清伤寒的基因组，临床传染病，第45卷，第Supplement_1期，第S29-S33页)。
此外，YfdX是一种原核蛋白，由几种致病细菌编码，包括肠道沙门氏菌血清型伤寒。(Lee，H.S.等人，(2019)“伤寒沙门氏菌YfdX的结构和生理学探索揭示了其在细菌抗生素应激和毒力中的双重功能。前面。微生物学，9：3329.doi：10.3389/fmicb.2018.03329).
C)对肠杆菌科细菌感染的免疫反应
沙门氏菌感染的确切临床结果在很大程度上取决于所涉及的个体血清型，受感染的宿主物种和个体的免疫学状态。(Marcelo B.Sztein，(2007)细胞介导的免疫和抗体反应由减弱的肠道沙门氏菌血清性伤寒菌株引起，用作人类活口服疫苗，临床传染病，第45卷，第Supplement_1期，第S15-S19页)。伤寒是由人类特异性革兰氏阴性病原体肠道沙门氏菌血清伤寒(S.Typhi)引起的全身性疾病。沙门氏菌引起的肠外感染是致命的。伤寒的发病率在贫困地区仍然很高，多药耐药性的出现使情况变得更糟。(Marathe，S.，et al.(2012)“伤寒和疫苗开发：一个部分回答的问题。印度J Med Res.Feb；135(2):161–169).
该病的潜伏期通常为10-14天，从8-15天不等，但可能短至5天，长至30或35天，具体取决于接种物的大小和宿主防御状态。该疾病的发生必须通过患者中存在病原体伤寒沙门氏菌或副伤寒沙门氏菌来确认，这需要从血液，粪便或骨髓中分离细菌。该试验的敏感性随着发热持续时间的增加而降低。另一种方法是Widal试验，该试验可识别血清中是否存在针对沙门氏菌特异性O(体细胞)和H(鞭毛)抗原的抗体，这些抗体仅在发病后第2周出现。(Marathe，S.等人，(2012)“伤寒和疫苗开发：一个部分回答的问题。印度J Med Res.二月；135(2):161–169).
伤寒沙门氏菌最初穿透小肠上皮细胞，然后通过血液扩散到其他器官，如脾脏，肝脏和骨髓，在那里这种细菌繁殖并重新进入血流，引起包括高烧在内的症状。(Lee，H.S.等人，(2019)“伤寒沙门氏菌YfdX的结构和生理学探索揭示了其在细菌抗生素应激和毒力中的双重功能。前面。微生物学，9：3329.doi：10.3389/fmicb.2018.03329).
CD4 T细胞活化最初检测于特化的微折叠细胞(M细胞)群体覆盖淋巴结构，称为Peyer's patchs(PPs)，然后在引流肠系膜淋巴结(MLN)口腔感染伤寒沙门氏菌后。这些伤寒沙门特异性CD4 T细胞被激活以表达表面CD69，并在几个小时后产生最大水平的白蛋白-2(IL-2)。研究表明，在初始感染后有如此大程度的CD4克隆扩张伤寒超过50％的外周T细胞显示出一些激活和获得效应功能的证据。这些扩大的T细胞群也获得了重新定位到受感染组织和分泌效应细胞因子的能力。最近的研究表明，除了直接的同源TCR刺激外，这种效应反应的引发还可能发生在对非同源刺激的反应中。T细胞的非同源激活已被广泛研究用于病毒特异性CD8 T细胞，并已被证明涉及炎症细胞因子，如IL-12和IL-18。此外，最近的一项研究表明，OVA特异性记忆CD8 T细胞可以通过非同源信号刺激伤寒感染。观察到这种机制需要NLRC4炎症小体活化和CD8α释放IL-18。+DC(Pham，Oanh H和Stephen J McSorley。“(2015)沙门氏菌感染的保护性宿主免疫反应。未来微生物学第10卷，1：101-10。doi：10.2217/fmb.14.98).
D)肠杆菌科细菌疫苗开发
目前，只有两种获得许可的伤寒疫苗――一种亚基(Vi PS)和一种减毒活伤寒沙门氏菌菌株(Ty21a)――在市售。(Marathe，S.，et al.(2012)“伤寒和疫苗开发：一个部分回答的问题。印度J Med Res.Feb；135(2):161–169).
1896年，热杀灭苯酚保存和丙酮杀灭冻干注射全细胞伤寒疫苗在英国和德国产生和使用。1960年在南斯拉夫，苏联，波兰和圭亚那进行的一项试验评估了这种疫苗的功效。这种疫苗仍在少数国家使用，但由于副作用，大多数国家已经撤回了这种疫苗的使用。灭活全细胞疫苗在9-34％的受体中引起局部炎症，疼痛，全身发热，不适和疾病样症状。(Marathe，S.，et al.(2012)“伤寒和疫苗开发：一个部分回答的问题。印度医学杂志135(2)：161–169)。
然后开发了一种可注射的亚单位疫苗Vi-多糖疫苗(赛诺菲巴斯德公司将其作为Typhim Vi出售，葛兰素史克公司以Typherix的名义出售)。这种疫苗有一定的缺点：它在2岁以下的儿童中是非免疫原性的，不能诱导加强作用。许多伤寒沙门氏菌菌株对Vi多糖呈阴性或失去Vi抗原，在这种情况下，Vi-PS疫苗将无法保护患者。(Marathe，S.，et al.(2012)“伤寒和疫苗开发：一个部分回答的问题。印度医学杂志135(2)：161–169)。
Ty21a是第一种口服减毒沙门氏菌活疫苗(由Berna Biotech(现为Crucell)作为Vivotif出售，并通过野生伤寒沙门氏菌菌株Ty2的化学诱变在瑞士开发。但是，Ty21a具有某些缺点。为了获得足够的免疫力，高数字(109)的细菌需要口服剂量；建议仅5-6岁以上的儿童使用。这种疫苗具有高度酸性，因此当Ty21a口服喂养时，胃酸必须中和或绕过。(Marathe，S.，et al.(2012)“伤寒和疫苗开发：一个部分回答的问题。印度医学杂志135(2)：161–169)。
目前可用的伤寒疫苗都不是理想的。Ty21a(唯一获得许可的减毒口服活疫苗)和纯化的Vi荚膜多糖疫苗耐受性良好，但只有适度的保护作用。
伤寒沙门氏菌的多药耐药菌株的出现使该疾病的情况及其现有抗生素的治疗进一步复杂化。(Pham，Oanh H和Stephen J McSorley。(2015)“沙门氏菌感染的保护性宿主免疫反应”。未来微生物学第10卷，1：101-10。doi：10.2217/fmb.14.98).
目前尚无对副伤寒有效的许可疫苗。沙门氏菌多药耐药菌株的日益出现使现有抗生素的治疗更加复杂。
III)立克次氏体
A)立克次氏体家族概述
立克次体是蜱虫，虱子，跳蚤，螨虫，螨虫和哺乳动物中发现的专性细胞内革兰氏阴性细菌的多样化集合。它们包括属立克次体，埃利希亚，东方，和科西埃拉.这些人畜共患病原体引起感染，在血液中传播到许多器官。(沃克·立克次体。(1996)In：Baron S，編輯医学微生物学。第4版。加尔维斯顿(德克萨斯州)：德克萨斯大学加尔维斯顿医学分校。第38章.可从以下位置获得：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7624/).立克次体属的成员传统上分为两个主要组，斑疹热组(SFG)和斑疹伤寒组(TG)，大多数已知物种属于SFG。两个物种，伤寒立克次体和立克次体前期，组成TG。立克次体生物在除南极洲以外的所有大陆上都被发现。由于气候条件以及媒介和自然宿主的限制，大多数立克次体物种是区域锁定的。然而，有全球分布的立克次体，例如立克次氏体和伤寒立克次体。这两种立克次体通过跳蚤传播，明显偏离了大多数需要蜱虫载体的立克次体，后者往往局限于蜱虫的地理分布。已知窝藏和传播立克次体的其他媒介是螨虫(立克次体)和虱子(立克次体前期).(Mohammad Yazid Abdad，Rita Abou Abdallah，Pierre-Edouard Fournier，John Stenos，Shawn Vasoo，(2018)“立克次体的流行病学和诊断简明回顾：立克次氏体和东方菌属。临床微生物学杂志56(8)e01728-17)。
i)立克次体前期(R.prowazekii)
R prowazekii，经典流行斑疹伤寒的病原体，由人体(服装)虱子传播，人蹄莲(但不是头虱)来自活动性人类病例或健康携带者或亚临床病例，即所谓的Brill-Zinsser病。典型的情况在布隆迪疫情中显而易见，该疫情始于1995年在恩戈齐的一所监狱，蔓延到中部高地(1500多米)难民营的营养不良居民，造成50 000多例病例，死亡率为2.6％。体虱粪便中的传染因子通常通过抓挠虱子叮咬部位来接种，但在封闭社区的流行病中，可以吸入干虱子粪便的气溶胶。最近对生物体的基因组进行了测序，为立克次体与细胞内线粒体之间的进化关系提供了新的证据。(Cowan，G.(2000)“立克次体疾病：斑疹伤寒组发烧-综述。研究生医学杂志第76，895卷：269-72。doi：10.1136/pmj.76.895.269).
i)伤寒立克次体(伤寒)
伤寒沙门感染引起的疾病与流行性斑疹伤寒相似，但比流行性斑疹伤寒更轻微。未经治疗的病例的病死率低于5％。R mooseri(伤寒)，地方性斑疹伤寒的病原体由大鼠跳蚤携带异种球菌，并且通常在市场，谷物商店，啤酒厂和垃圾场感染人类。它通常是一种轻微的疾病，但在难民营中会变得更加具有侵略性，甚至可能是致命的。(Cowan，G.(2000)“立克次体疾病：斑疹伤寒组发烧-综述。研究生医学杂志第76卷，895：269-72。doi：10.1136/pmj.76.895.269).
B)立克次氏菌结构功能分析
伤寒沙门是一种专性细胞内病原体。为了生存，繁殖并成功建立感染，立克次体需要粘附并侵入靶向宿主细胞。斑疹热组立克次体细菌(立克次氏体,非洲立克次体,R.conorii,黑龙江立克次体,立克次氏体,立克次体,日本立克次体,立克次体,山地立克次体,立克次氏体,孔雀立克次体,立克次体,R.立克次体,西伯利亚立克次体和立克次体(拥有两种表征良好的表面暴露蛋白，称为OmpA和OmpB；OmpA在斑疹伤寒组生物体上未发现。其他推定的立克次体粘附素，由基因Adr1(RC1281)编码R.conorii和Adr2(RP828)在R.prowazekii随后通过基于蛋白质组学的分析进行鉴定，并提出参与立克次体宿主侵袭。至少有17种表面细胞抗原(Sca)编码类似于自转转蛋白的蛋白质，参与立克次体粘附到宿主细胞受体。四个(Sca0(OmpA)，Sca1，Sca2和Sca5(OmpB))已被证明在立克次体粘附，侵袭或两者中起重要作用。立克次体的Sca4在局灶性粘连部位的细胞中与长春花素共定位，并通过在所有立克次体物种中保守的两个长春花素结合位点结合并激活长春花素。Ku70是位于细胞质和质膜中的核DNA依赖性蛋白激酶的亚基，作为立克次体OmpB的受体，因此在立克次体内化中起重要作用。立克次体可能利用膜溶蛋白，溶血素C和磷脂酶D，编码tlyC和普德阿基因分别破坏吞噬细胞膜并获得宿主细胞质基质。磷脂酶A2(PLA2)样活性也参与立克次体进入宿主细胞-该基因RT0522(帕特2)中伤寒沙门编码PLA2活性。进一步RT0590(帕特1)编码者伤寒沙门还被证明具有PLA2活性，这是感染期间粘附和进入宿主细胞所必需的。与RT0522(帕特2)，其中76％的立克次体基因组伤寒杆菌pat1在所有立克次体基因组中普遍存在，并被表达，分泌到宿主细胞质基质中，并被未识别的宿主激活剂功能激活，以产生其PLA2活性。
称为IV型分泌系统(T4SSs)的典型膜相关转运蛋白系统，其将效应子递送到靶宿主细胞中，由11个VirB蛋白(VirB1-VirB11)和VirD4组成。已知这些分泌系统在DNA转移到其他细菌和宿主细胞中起作用，既可以从细胞外环境获得遗传物质，也可以释放到细胞外环境中，以及将毒素，毒力因子或其他效应介质注入宿主细胞质中。伤寒沙门编码VirD4、VirB3、VirB10、VirB11的同源物，VirB4、VirB8和VirB9各两个拷贝，以及五个与VirB6同源的不同基因。1型分泌系统的三个主要结构特征是属于TolC家族的外膜蛋白，周质膜融合蛋白和与内蛋白相关的ATP结合转运蛋白。此外，立克次体拮抗素重复蛋白-1(RARP-1)在所有立克次体基因组中都是保守的，并且与相邻基因共同转录RT0217编码假设的蛋白质和RT0216(TolC)和分泌者伤寒沙门以TolC依赖性的方式，并假设是立克次体毒力机制的一部分(Sahni，Sanjeev K等人(2013)“立克次体发病机制和免疫力的最新分子见解”。未来的微生物学第8，10卷：1265-88)。
对立克次体感染的免疫反应活立克次体可能在原始感染后数月或数年内潜伏在宿主组织中。对立克次体的免疫反应最初涉及先天免疫反应，然后是体液和细胞介导的适应性免疫反应。虽然适应性免疫反应需要时间发展，但先天反应在感染的初始部位与立克次体密切相关。虽然树突状细胞(DC)和专业吞噬细胞在感染早期阶段的作用尚不清楚，但立克次体似乎在失活巨噬细胞中生长。抗原呈递细胞(树突状细胞和单核细胞)以及受感染的内皮细胞可能是立克次体在感染早期全身扩散的手段，而不是充分的控制手段。然而，随着时间的推移，内皮细胞，吞噬细胞，DC和自然杀伤(NK)细胞被入侵的立克次体激活，产生富含细胞因子和趋化因子的环境，这是增强先天免疫反应以更好地处理感染所必需的。
正如被动转移研究所证明的那样，单独抗体不能有效控制立克次体感染。然而，立克次体的抗体包衣可增强立克次体的吞噬作用和体外消化。细胞免疫反应能够保护宿主免受各种立克次体感染，如被动转移研究所示。特别是，T淋巴细胞是必要的；更具体地说，CD8+T淋巴细胞对于针对立克次体的有效免疫反应至关重要(Richards，A.L.(2004)。立克次体疫苗：新旧疫苗。疫苗专家评论，3(5)，541-55)。
C)立克次体细菌疫苗开发
最初的斑疹伤寒疫苗使用杀死的，被磨碎的受感染虱子肠道。接下来，大规模开发了一种杀死的受感染小鼠肺疫苗，从福尔马林杀死的R.prowazekii肺组织制剂中，通过差异离心提取。然而，由于从受感染的肺部制备的疫苗(实验室动物打喷嚏产生传染性气溶胶)的实验室获得斑疹伤寒的重大危害，因此寻求替代疫苗。(理查兹，A.L.(2004)。立克次体疫苗：新旧疫苗。疫苗专家评论，3(5)，541-55)。
考克斯疫苗(R.prowazekii Breinl)在鸡胚的蛋黄囊中培养(提取乙醚并杀死福尔马林)是美国获准生产的主要疫苗。然而，它并没有提供全面的感染保护，但疫苗似乎确实使疾病更短，更轻微，并防止了流行性斑疹伤寒的死亡。此外，缺乏标准化、关于疫苗效力和不良副作用(注射部位疼痛和压痛、由于内毒素含量高而引起的发热和对卵黄囊含量的超敏反应)的充分信息将使其无法达到细菌疫苗的现代标准。(理查兹，A.L.(2004)。立克次体疫苗：新旧疫苗。疫苗专家评论，3(5)，541-55)。然后研究了活疫苗，但也没有发现它们是标准化的，也没有理想地获得足够的免疫反应。
立克次体灭亡疫苗需要大量的抗原，多个剂量和时间才能产生短暂且不完整的同源免疫力。(理查兹，A.L.(2004)。立克次体疫苗：新旧疫苗。疫苗专家评论，3(5)，541-55)。没有一种疫苗能够针对任何立克次体药物提供长期保护。
P罗托佐安寄生虫
IV)疟原虫科
A)疟原虫科概述
疟原虫科，顺序中的一个家庭血孢子虫包括疟原虫，对人类健康很重要的属疟原虫包括疟疾寄生虫。疟原虫在其生命周期中有两个专性宿主，一个是蚊子宿主，它也是脊椎动物宿主的载体。迄今为止检查的所有疟原虫物种都有14条染色体，一条线粒体和一种质体。像Apicomplexa门中的其他寄生虫一样，Plasmodia具有专门的顶端细胞器复合物，称为微粒，rhoptries和致密颗粒。它们还有一个退化的质体细胞器，即apicoplast，它有自己的基因组和基因表达机制。(世界卫生组织(2014)“疟疾和一些多瘤病毒(SV40，BK，JC和Merkel细胞病毒)”IARC关于评估人类致癌风险的专著第104卷，第41-120页)。
i)恶性疟原虫(恶性疟原虫)、间日疟原虫、疟原虫、卵形疟原虫和诺氏疟原虫
疟原虫有5种类型(P)。导致人类疟疾的物种：恶性疟原虫，P。间日，疟原虫，卵形疟原虫和P.knowlesi.恶性疟原虫是迄今为止最致命的。每年有5亿例疟疾病例，其中每年约有100万至200万人死于该病。该病主要由5岁以下儿童提出，每年约有100万儿童死亡。(Todryk，Stephen M和Michael Walther。(2005)“建立更好的T细胞诱导疟疾疫苗”。免疫学，第115卷，2：163-9。doi：10.1111/j.1365-2567.2005.02154.x).
B)基于结构的疟原虫科寄生虫功能分析
在受感染的雌性按蚊的血粉中，从苍蝇的唾液腺中注射5-20个孢子体；它们进入血液并在30分钟至1小时内迅速侵入肝细胞。孢子体表达几种表面蛋白，其中两种是高表达的抗原；包孢子体(CS)蛋白和血栓性联粘蛋白(TRAP)。一旦进入肝细胞，就会表达其他抗原，包括肝期抗原-1(LSA-1)和LSA-3，并输出(Exp)-1。裂殖子的发育大约需要1周，通常每个原始孢子体有20,000-40,000个，它们在肝细胞破裂后释放到血液中。Merozoites表达一系列与孢子体有很大不同的血液阶段抗原，例如裂殖子表面蛋白(MSP)-1，-2和-3，顶端膜抗原(AMA)-1和富含谷氨酸的蛋白质(GLURP)，侵入红细胞，复制并导致红细胞破裂，从而释放更多的裂殖子。经过几个血液阶段的周期后，一部分裂殖子分化成雄性和雌性配子体，如果在血粉中被蚊子摄入，在蚊子肠道内形成卵囊，从而产生能够感染新宿主的孢子体。虽然感染的血液阶段可能导致宿主的严重疾病，在某些情况下导致死亡，但反复暴露后临床免疫力会发展，不仅可以预防严重形式的疾病，而且最终降低寄生虫血症的水平。然而，几乎没有见过表明防止再次感染的无菌免疫力。针对肝脏阶段接种疫苗的目的是诱导，特别是在风险最大的幼儿中，无菌免疫或达到血液阶段的寄生虫数量充分减少以减轻疾病。后一种效果也将为有益的自然免疫力的发展提供机会。(Todryk，Stephen M和MichaelWalther。(2005)“建立更好的T细胞诱导疟疾疫苗”。免疫学，第115卷，2：163-9。doi：10.1111/j.1365-2567.2005.02154.x).
对疟原虫科寄生虫感染的免疫反应对疟原虫感染的自然免疫涉及体液、CD4+和CD8+T细胞反应的混合物。然而，肝T马币已成为预防疟疾的一个有希望的目标。与T马币不同上皮，如肺、肠和皮肤，肝-T马币似乎位于正弦(肝脏的血管)中，而不是实质组织中。这些血管的重度开窗结构和明显的缓慢血液流速允许T马币穿过器官而不被送入循环。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).
肝脏正弦蛋白为T马币的密切相互作用提供了主要生态位和抗原呈递细胞，如Kupffer细胞和树突状细胞。这允许快速检测抗原。每个肝细胞也与正弦细胞密切相关，从而可以轻松进入肝脏T马币用于评估表面抗原表现。活体内成像显示这些T马币每分钟遍历约10μm，如皮肤HSV-1感染所报告，T马币假设为变形杆菌形式，延伸树突以检查肝脏的抗原。而不是依靠CD103-αE整合素相互作用来维持组织驻留，肝脏T马币似乎利用了粘附分子LFA-1。恒河猴P.knowlesi评估孢子体免疫的感染模型显示产生肝脏T马币的能力.这些T马币似乎具有保护作用，因为它们的消耗导致免疫力丧失。(Muruganandah，V.，Sathkumara，H.D.，Navarro，S.，&Kupz，A.(2018)。系统综述：常驻记忆T细胞在传染病中的作用及其与疫苗开发的相关性。免疫学前沿，9，1574。doi：10.3389/fimmu.2018.01574).这种策略产生的免疫力归因于CD8+肝脏TRM数量的增加。
C)疟原虫科疫苗开发与挑战或失败
尽管进行了广泛的研究，并且有几种候选药物利用了几种疫苗设计，但只有一种针对疟原虫科寄生虫的公开疫苗。大多数疫苗，如重组疫苗、基于DNA和转基因的疫苗，最终被证明具有有限的功效，不能产生长期免疫力。(James，S.，“Malaria VaccineDevelopment Status Report”Foundation for the National Institute of Health(1999年)，见www.researchgate.net/publication/266879756_Malaria_Vaccine_Development_Status_Report)。尽管有缺点，RTS，S/AS01疫苗，也称为Mosquirix断续器，是世界上第一个批准的疟疾疫苗(Bharati，K.(2019)“疟疾疫苗开发：挑战和前景”。临床与诊断研究杂志。8月，卷13(8)：AB01-AB03.
研究人员推测，疟疾疫苗的开发具有挑战性，因为寄生虫的基因组比细菌和病毒基因组更复杂。此外，寄生虫将在其生命周期中经历几个阶段，繁殖阶段将改变靶向抗原(Bharati，K.(2019)“疟疾疫苗开发：挑战和前景”。临床与诊断研究杂志。8月，卷13(8)：AB01-AB03.
疫苗接种介导的保护及其缺点
疫苗诱导的免疫效应子本质上是由B淋巴细胞产生的抗体，其能够特异性地与毒素或病原体结合。其他潜在的效应子是细胞毒性CD8+T淋巴细胞，其可能通过识别和杀死受感染细胞或分泌特异性抗病毒细胞因子和CD4+T辅助剂(TH)淋巴细胞。这些TH细胞可以通过细胞因子的产生来帮助保护，并为B和CD8+T细胞反应的产生和维持提供支持。效应器CD4+TH细胞最初被细分为T辅助1(TH1)或T辅助器2(TH2)亚群分别取决于其主要细胞因子产生(干扰素-γ或白细胞介素[IL)-4)。TH越来越多的细胞被证明包括大量具有不同细胞因子产生和归巢能力的亚群。例如，滤泡T辅助器(fTH)细胞被特殊装备并放置在淋巴结中，以支持有效的B细胞活化和分化成抗体分泌细胞；它们被确定为直接控制抗体反应和介导佐剂。T助手17(TH17)基本上可以抵御定植于皮肤和粘膜的细胞外细菌，招募嗜中性粒细胞并促进局部炎症。这些效应子由调节性T细胞(T注册)参与维持免疫耐受性。
虽然疫苗的性质对引发的免疫效应子的类型产生直接影响，但通过免疫过程诱导抗原特异性免疫效应子(和/或免疫记忆细胞)并不意味着产生的抗体，细胞或细胞因子代表疫苗功效的替代物，甚至相关(Rueckert C，Guzmán CA(2012)疫苗：从实证发展到理性设计。PLoS Pathog 8(11)：e1003001。doi：10.1371/journal.ppat.1003001).
目前疫苗接种工作提供的保护在很大程度上取决于中和抗体的诱导。抗体介导的病毒中和是抗体与病毒颗粒对接导致的病毒传染性的直接抑制。当病毒粒子与细胞表面受体结合的过程被抑制时，或者当病毒粒子与细胞内体或质膜的融合过程被破坏时，就会发生中和。中和抗体精确靶向特异性抗原。除了直接干扰病毒进入细胞外，抗体还可以通过其Fc片段进一步抵消病毒感染，触发免疫调节机制，包括ADCC，抗体依赖性细胞致病性(ADCP)和CDCC。
然而，中和抗体保护有其局限性。首先，疫苗开发过程本身存在许多问题，例如动物模型不可用。其次，病原体以多种变异形式出现，并可能经历突变以实现免疫逃逸。第三，疫苗诱导的免疫力可能不足以赋予长期免疫力。第四，尽管有实验模型，但一些疫苗可能无法引发所需的功能反应。第五，有许多人群特定的挑战可能会改变对疫苗的免疫反应。第六，关于保护机制的信息不足，以及充分激活靶向机制所需的抗原/表位。
首先，疫苗开发是一个复杂而漫长的过程，由于缺乏足够的动物模型而受到阻碍。例如，在定位中黄病毒科病毒，目前还没有完美的小动物模型用于临床前检测；到目前为止，非人类灵长类动物(NHP)是该病毒的天然宿主之一，是Lee&Ng深入讨论过的最好的临床前模型(Id.，引用Lee，CYP，Ng，LFP，(2018)微生物感染。然而，在NHP上测试疫苗及其维护的成本极高，这给疫苗开发带来了很高的障碍。
其次，病原体通常具有多种菌株和变异，导致抗原转移或抗原漂移。流感病毒利用RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)催化复制周期；RdRp容易出错，因此在称为“抗原漂移”的过程中积累新的突变并随着时间的推移改变基因组。(Fermin，Gustavo和Paula Tennant。(2018)Viruses：Molecular Biology，Host Interactions and Applications toBiotechnology，由Jerome E.Foster，Elsevier Science&Technology编辑。ProQuestEbook Central，https://ebookcentral.proquest.com/lib/jhu/detail.action？docID＝5322098).抗原转移还使一些流感毒株适应新物种，例如最近观察到的禽流感。此外，分割的基因组，如正粘病毒的那些，它们可以进行基因组重排。此外，当蛋白质抗原在不同菌株之间高度可变时，产生的抗体是非中和的。(Stanley A.Plotkin，(2015)疫苗开发的复杂性增加，传染病杂志，第212卷，第Suppl_1期，第S12–S16页，https://doi.org/10.1093/infdis/jiu568)。
在针对横纹病毒科的病毒疫苗的开发过程中，这些病毒的快速进化以及由此产生的高度多样性和适应性是病毒毒力，趋向性，宿主范围，传播以及因此而永久化的主要驱动力。这种遗传变异性的一个重要决定因素是RNA依赖性RNA聚合酶的易出错性，在病毒复制过程中，可能导致RNA基因组之间的高突变率，序列缺失，插入和重组。由于缺乏与RNA复制体相关的有效校对和复制后修复活动，RNA病毒的突变率估计在大约10之间变化。3至105每个核苷酸拷贝的替换。因此，病毒种群不断受到进化驱动力量的影响，遗传多样化是病毒进化中的常见过程。从长远来看，这导致新变种，物种或属的分离，为实现havdovirus疫苗提供了挑战。(Scott，T.P.，&Nel，L.H.(2016)。狂犬病病毒对免疫反应的颠覆。病毒，8(8)，231.doi：10.3390/v8080231).
考虑P时鳞毛蕨科疫苗开发中，目前针对血清型O、A和亚洲1型口蹄疫病毒的化学灭活三价疫苗受到限制，包括热性，并且只有短暂的免疫力。(Singh，K.R.等人，(2019)“口蹄疫病毒：免疫生物学，疫苗进展和疫苗接种策略解决疫苗失败-印度视角”。疫苗，7(3)，90).此外，对一种血清型的免疫不能提供对其他血清型的保护，有时甚至不能对同一血清型内的变异提供保护。(同上)。
人类免疫缺陷病毒(HIV)的极端多样性，家庭成员逆转录病毒科是疫苗开发的主要障碍，因为属于不同亚型的菌株在某些蛋白质(例如env蛋白质)中可能相差35％。因此，虽然一些疫苗可能对某些病毒分支有效，但它们可能对其他分支无效(参见Hsu，D.等人，(2017)“HIV疫苗开发进展”人类疫苗和免疫治疗学13(5)：1018-1030)。
第三，目前的疫苗显示出部分疗效和效应记忆短的迹象。例如，疱疹病毒科疫苗设计的发展导致疫苗仅具有部分功效。(Sandgren，K.等人，(2016)“了解天然单纯疱疹病毒免疫力以告知下一步-生成疫苗设计。临床与转化免疫学5(7))。
而百日咳无细胞疫苗取代了整个灭活细菌疫苗，解决了反应原性(能够引起免疫反应)的问题，百日咳(百日咳)在发达国家进入标准使用后重新出现。虽然菌株变化可能起作用，但主要问题是抗体的快速减弱，特别是对百日咳毒素的抗体(Stanley A.Plotkin，(2015)疫苗开发的复杂性增加，传染病杂志，第212卷，第suppl_1期，7月页S12–S16，https://doi.org/10.1093/infdis/jiu568)。
免疫接种耶尔森菌科细菌疫苗(EV76)仅获得大约6至12个月的保护(Li，Bei等人(2012)“长期康复的鼠疫患者对鼠疫耶尔森菌感染的体液和细胞免疫反应。临床和疫苗免疫学：CVI第19卷，2：228-34。doi：10.1128/CVI.05559-11)。
众所周知，没有一种疫苗能够对任何立克次体药物提供长期保护。(奥斯特洛，安克。(2017)“对立克次体的免疫反应：来自小鼠感染模型的教训。医学微生物学与免疫学vol.206，6：403-417).
第五，接种疫苗是否会产生所需的免疫反应可能是不可预测的。例如，在设计针对虫媒病毒ZIKV的治疗性单克隆抗体疫苗时，由于它们之间的序列和抗原相似性，存在异源黄病毒感染的抗体依赖性增强(ADE)的风险。登革热和西尼罗河免疫血清的ZIKV的ADE已在体外显示，并由登革热和西尼罗河免疫血清诱导在免疫抑制小鼠中。Sairol，CA等人(2018)，微生物趋势。26(3):186-190.在这种现象中，携带FcR的细胞可以吸收和内化抗体包被病毒并进一步感染(Yang，C.等人，(2019)基于其包膜蛋白结构开发针对寨卡病毒的中和抗体，“Virologica Sinica 34：168-174，引用Dowd，KA和Pierson，TC，(2011)病毒学。已经提出了几个因素来解释为什么单克隆抗体不能中和病毒，而是增强感染：(1)这些单克隆抗体的中和活性太弱，无法中和病毒。(2)E蛋白的阻断位点不影响病毒感染能力。(3)这些中和单克隆抗体的浓度太低，无法中和病毒。
第五，人群特定因素也可能影响疫苗效力。例如，在体内实现病毒疫苗的复制和/或效应功能之前，在体内中和病毒疫苗可能是疫苗功效降低的原因(Stanley A.Plotkin(2015)疫苗开发的复杂性增加，传染病杂志，第212卷，第Suppl_1期，第S12–S16页，https://doi.org/10.1093/infdis/jiu568)。
据报道，轮状病毒疫苗在发达国家对婴儿胃肠炎非常有效，但在热带贫穷国家，其有效性大大降低(见id)。
同样，在托加维里达例如，当预先存在的抗体中和活病毒株时，人们认为会发生疫苗失败的发生。有人提出，低水平免疫可能是由先前的感染引起的，例如细小病毒或EB病毒感染，或Rh因子的存在。(兰伯特，N.，(2015)“风疹”柳叶刀。6月6；385(9984):2297–2307).
其他人口因素包括免疫功能低下或脆弱人群。例如，在副粘病毒中，存在一些疫苗，但MMR疫苗通常仅推荐用于年龄较大的婴儿或1岁以上的儿童，他们不再具有高滴度时具有保护性母体抗体，因此特别容易受到麻疹病毒感染。(Kowalzik F，Faber J和Knuf M.(2017)MMR和MMRV疫苗。疫苗。(Epub提前打印)；DOI：10.1016/j.vaccine.2017.07.051)。因此，母体抗体可能会削弱幼儿的疫苗。(Jones BG，Sealy RE，Surman SL等人(2014)基于仙台病毒的RSV疫苗在体内母体抗体模型中防止RSV挑战。疫苗32：3264-3273)。影响CD4 T细胞(例如HIV感染)和IL-12/IFN-γ/STAT1信号通路的免疫缺陷导致人类结核分枝杆菌感染时疾病更严重。(Maggioli MF，Palmer MV，Thacker TC，Vordermeier HM，Waters WR(2015)牛结核病免疫反应中效应子和记忆T细胞亚群的表征。PLOS ONE 10(4)：e0122571)。
副粘病毒和肺炎病毒经常袭击最年轻婴儿的呼吸道。对儿科呼吸道炎症的恐惧是有道理的，因为过多的细胞流入气道会阻断呼吸，这就是1960年代FI-RSV疫苗所发生的情况。(Chin J，Magoffin RL，Shearer LA等人(1969)在儿科人群中呼吸道合胞病毒疫苗和三价副流感病毒疫苗的现场评估。Am J Epidemiol 89：449–463)。为了避免与FI疫苗观察到的后果类似的后果，新的呼吸道病毒疫苗必须诱导平衡的炎症反应，在呼吸组织中具有aa强，急性，局部免疫反应，以支持快速病毒清除并避免组织损伤和随之而来的增强的炎症反应，但呼吸组织中的初始细胞募集不能大到收缩气道的程度。(Penkert RR，Surman SL，Jones BG等人(2016)维生素A缺乏的小鼠在呼吸道病毒感染后表现出增加的病毒抗原和增强的细胞因子/趋化因子产生，尽管存在FoxP3+T细胞。Int Immunol 28：139–152)。
另一个挑战是缺乏社区意识。由于副粘病毒和肺炎病毒感染引起的发病率和死亡率被低估，因此不了解潜在保护性疫苗的价值。最年幼儿童的急性下呼吸道病毒感染最常由副粘病毒或肺炎病毒引起。(Nair H，Nokes DJ，Gessner BD等人(2010)幼儿呼吸道合胞病毒引起的急性下呼吸道感染的全球负担：系统评价和荟萃分析。柳叶刀375：1545-1555)；(Shi T，McAllister DA，O'Brien KL等人(2017)2015年幼儿呼吸道合胞病毒引起的急性下呼吸道感染的全球，区域和国家疾病负担估计：系统综述和建模研究。柳叶刀390：946-958)。事实上，对安全的自满和担忧，以及哲学和宗教对疫苗接种的反对，导致麻疹在许多工业化国家重新成为一种地方病。(Griffin，D.，(2016)麻疹中的免疫反应：病毒控制，清除和保护性免疫。病毒2016，8，282；doi：10.3390/v8100282).
此外，最近的趋势表明，疫苗诱导的副粘病毒免疫力减弱。(de Wit，J.等人(2019)“人类CD4+T细胞对腮腺炎病毒的反应靶向广泛认可的核蛋白表位。病毒学杂志，93(6)e01883-18；DOI：10.1128/JVI.01883-18)。例如，尽管减毒活MuV疫苗的疫苗接种覆盖率很高，但在过去十年中，全世界已经报告了几起流行性腮腺炎疫情，特别是在接种疫苗的年轻人中(3，4)。此外，在发展中国家维持目前的群众运动战略方面存在后勤和财政困难，导致与以前由MMR疫苗预防的疾病有关的死亡人数死灰复燃。
最后，缺乏对保护机制、病毒复制和结构以及充分激活靶向保护机制所需的抗原/表位的知识，可能会使疫苗开发复杂化。例如，最近的数据显示，登革热病毒的结构根据病毒复制发生的温度而有所不同。在细胞培养或人类中，在37℃下，病毒的结构膨胀，而在蚊子的较低温度下，颗粒更紧凑。有人提出，暴露在疫苗病毒上的表位可能不会暴露在蚊子挑战病毒上，因此蚊子挑战病毒能够在不被中和的情况下进入细胞。(Stanley A.Plotkin，(2015)疫苗开发的复杂性增加，传染病杂志，第212卷，第Suppl_1期，第S12–S16页，https://doi.org/10.1093/infdis/jiu568)。
据报道，只有病毒复制诱导同型抗体(意味着具有类型特异性的免疫反应)，但在针对登革热1型，2型，3型和4型的登革热疫苗中，疫苗诱导自身的同型抗体和异型抗体(意味着与不同类型的交叉反应)到登革热2型。然而，2型病毒不会复制，因此不会诱导同型抗体。因此，试图产生通用中和抗体可能需要考虑同型和异型抗体之间的差异，因为它可能涉及对保护至关重要的表位特异性的差异。(Stanley A.Plotkin(2015)疫苗开发的复杂性日益增加，传染病杂志，第212卷，第Suppl_1期，2015年7月，第S12–S16页，https://doi.org/10.1093/infdis/jiu568)。
此外，许多疫苗具有高度特异性，只关注一种病原体或疾病。当单独使用多种疫苗时，其被人群接受的程度会降低，因为它们需要增加就诊次数，管理，副作用和成本。当新疫苗获得批准时，将其插入既定的疫苗接种时间表而不影响疫苗接种的依从性可能会成为问题。(Dye C.(2014)2015年之后：健康和发展新时代的传染病。伦敦皇家学会的哲学交易。B辑，生物科学，369(1645)，20130426.doi：10.1098/rstb.2013.0426).
即使在目前的免疫/疫苗接种时间表内，大多数疫苗接种计划(其重点是通过常规免疫接种最大限度地减少病例和死亡人数)也不是根除运动。然而，有很大一部分人群变得容易受到现有疫苗设定的时间表的影响，例如婴儿和青少年，他们的免疫系统尚未发育到足以接受可用疫苗(例如，乙型肝炎和人瘤病毒，它们分别是肝癌和宫颈癌的原因)。其他人群，如年龄较大的儿童、青少年和成人，在婴儿接种疫苗(如百日咳)时只获得了有限时间的保护，或者没有接种疫苗的保护措施，以免在婴儿期错过疫苗接种。此外，越来越多的老年人对威胁生命的感染(如流感)的免疫系统减弱。(Dye C(2014)2015年后：传染病健康与发展新时代。伦敦皇家学会的哲学交易。B辑，生物科学，369(1645)，20130426.doi：10.1098/rstb.2013.0426).
总而言之，尽管开发了疫苗，但全世界病原体的发病率和死亡率并没有真正下降。没有普遍接受的策略和工具来合理设计疫苗，疫苗开发通常仍然是一个繁琐且昂贵的经验过程。在许多情况下，由于对保护机制的了解不足，合理设计的疫苗没有成功。虽然对抗病原体的免疫清除机制是已知的，但不同效应机制的具体贡献仅针对少数病原体进行了很好的表征。目前还不清楚是什么决定了病原体提供的所有可能的抗原选择中的免疫原性和特定表位的选择。例如，尚不清楚哪些因素决定了显性或平衡的免疫反应，以及导致对每个个体病原体进行长期保护的机制是什么(Dye C.(2014)2015年后：传染病健康与发展新时代。伦敦皇家学会的哲学交易。B辑，生物科学，369(1645)，20130426.doi：10.1098/rstb.2013.0426).
细胞介导的反应依赖于特定T细胞与靶细胞或抗原呈递细胞之间的直接相互作用，其在I类或II类MHC分子的背景下显示特异性抗原。
CD4+和CD8+T细胞表位存在于许多病毒蛋白中(Jaye，A.；赫伯茨；贾洛；阿塔巴尼；克莱因；霍格豪特；基德；范埃尔斯；Whittle，H.C.(2003)对麻疹患者中占主导地位的HLA-A*02限制性麻疹病毒表位的剧烈但短期的γ干扰素T细胞反应。J.Virol.，77，5014–5016)；(太田，M.O.；恩德洛武；哦，S.；皮亚西里西普；别佐夫斯基；莫斯；Griffin，D.E.(2007)血凝素蛋白是麻疹病毒特异性HLA-A2限制性CD8+T细胞在麻疹期间和疫苗接种后反应的主要靶标。J.感染。第195、1799-1807页)；(谢伦斯；梅林；蹄子，I.；斯皮克斯；波伦；van Gaans-vanden Brink，J.A.；科斯塔；文内马；克·斯米尔；范巴勒；等人(2015)HLA的麻疹病毒表位呈现：对表位选择，优势和微变的新见解。前面。免疫。6，546)和MeV特异性细胞毒性CD8+T淋巴细胞，产生IFN-γ型CD4+和CD8+T细胞，以及T细胞活化的可溶性指标(例如β2微球蛋白，细胞因子和可溶性CD4，CD8和Fas)，在感染性病毒被清除时在疾病的皮疹期期间循环(Lin，W.H.；库约斯；亚当斯；格伦费尔；Griffin，D.E.(2012)麻疹病毒RNA的长期持久性是原发感染动力学的特征。美国国家科学院院刊109，14989–14994)；(格里芬；莫恩奇；约翰逊；林多·德·索里亚诺，I.；Vaisberg，A.(1986)天然麻疹病毒感染期间的外周血单核细胞：细胞表面表型和活化证据。克林。免疫。免疫变性醇。40,305–312)；格里芬；沃德；朱阿雷吉；约翰逊；Vaisberg，A.(1992)麻疹期间的免疫激活：复杂和无并发症疾病中血浆和脑脊液中的β2-微球蛋白。J.感染。第166，1170-1173页)；格里芬；沃德；饶雷吉；约翰逊；Vaisberg，A.(1990)麻疹期间的免疫激活：复杂和无并发症疾病中血浆和脑脊液中的干扰素-γ和新蝶呤。J.感染。第161，449-453页；格里芬；沃德；饶雷吉；约翰逊；Vaisberg，A.(1989)麻疹中的免疫激活。N.Engl.J.Med.320，1667–1672；沃德；约翰逊；韦斯伯格；饶雷吉；Griffin，D.E.(1990)天然麻疹病毒感染中外周单核细胞的自发增殖：分裂细胞的鉴定以及与丝裂原反应性的相关性。克林。免疫。免疫变性醇。55,315–326；贾耶；马格努森；萨迪克；科拉；Whittle，H.C.(1998年)冈比亚儿童感染期间和接种疫苗后对麻疹抗原的细胞毒性T淋巴细胞的体外分析。克林。Investig.，102，1969–1977)。实验性感染的猕猴CD8+T细胞的耗竭导致更高和更长时间的病毒血症(Permar，S.R.；克伦普；曼斯菲尔德；金伟瑾；戈尔戈内；利夫顿，文学硕士；威廉姆斯；施密茨；雷曼；阿克斯特尔姆；et al.(2003)CD8(+)淋巴细胞在控制和清除恒河猴麻疹病毒感染中的作用。J.维罗尔.77，4396-4400)和CD8+T细胞可以控制病毒在体外传播(De Vries，R.D.；尤克塞尔；奥斯特豪斯；de Swart，R.L.(2010)特异性CD8(+)T淋巴细胞控制麻疹病毒的传播。Eur.J.Immunol.40,388–395).当CD4+和CD8+T细胞浸润病毒复制部位时(Polack，F.P.；奥瓦特；李淑贤；努萨里；瓦尔萨马基斯；莱弗曼；迪万；亚当斯；Griffin，D.E.(1999)恒河猴中非典型麻疹的产生：在融合抑制抗体存在下由免疫复合物形成和嗜酸性粒细胞介导的疾病的证据。Nat.Med.5，629–634)，传染性病毒迅速下降到检测不到的水平，皮疹消退，发烧消退。
所描述的本发明提供了基于载体的启动和增强平台，以开发针对病原体的疫苗，这些疫苗被定制为通过表达病原体蛋白的保守序列来引发针对保守的病毒表位的广泛T细胞反应。
发明内容
根据一个方面，所描述的本发明提供了一种针对来自病毒、细菌、真菌或原生动物的感染性致病生物体的免疫原的通用疫苗，该原型包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其包含编码至少一种多肽抗原或其免疫原性片段的开放阅读框，其中多肽抗原，或其免疫原性片段，包括富含CD8+T细胞识别抗原的保守内部蛋白质。(a)其中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位由长度为8-11个残基的肽组成；和(b)其中，响应于疫苗而引发的免疫应答包括以下一种或多种：(i)将一个或多个T细胞群活化至疫苗中存在的至少一种抗原；或(ii)中和病原体的传染性；或(iii)包括破坏病原体的抗原特异性反应；裂解感染病原体的细胞，或两者兼而有之；与控件相比。
根据通用疫苗的一个实施方案，活化的细胞群包括活化的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。根据一些实施方案，活化的CTL包括一个或多个NK细胞群、NKT细胞群、LAK细胞群、CIK细胞群、MAIT细胞群、CD8+CTL群体或CD4+CTL群体。
根据一些实施方案，保守的免疫原性多肽或免疫原性片段是病毒内部基质蛋白、病毒衣壳蛋白、病毒核蛋白、病毒核蛋白、病毒糖蛋白、病毒磷酸蛋白、病毒包膜蛋白、病毒蛋白酶、逆转录酶或病毒聚合酶。
根据一些实施方案，通用疫苗的制备方法包括从共识氨基酸序列中鉴定和选择高度保守的传染性病原体或其富集于CD8+T细胞识别抗原中的免疫原性片段；b.构建(a)中高度保守的内部蛋白质的免疫原序列；c.构建：i.链霉菌噬菌体SV1.0 DNA载体，包括(b)的免疫原序列；ii.基于腺病毒的(AdV)载体，包括(b)的免疫原序列；iii.基于(b)的免疫原序列的减毒，复制能力强的重组牛痘病毒(VV)载体；d.分别繁殖包含编码免疫原的每种重组载体(c)中用于在体内免疫受试者的量，其量有效地诱导或刺激治疗或预防细胞介导的对感染性病原体感染的免疫反应：i.通过用(c)(i)的噬菌体DNA载体免疫来启动完全的人体免疫系统；ii.通过免疫(c)(ii)的AdV载体，然后是(c)(iii)的VV载体，或(c)(iii)的VV载体，然后是(c)(ii)的AdV载体来增强完全的人体免疫系统。根据一些实施方案，保守的免疫原性蛋白或免疫原性片段是病毒内部基质蛋白、病毒衣壳蛋白、病毒核蛋白、病毒核蛋白、病毒糖蛋白、病毒磷酸蛋白、病毒包膜蛋白、病毒蛋白酶、逆转录酶或病毒聚合酶。
根据另一方面，所描述的本发明提供了一种编码至少一种RNA多核苷酸的工程核酸，该核苷酸包含编码至少一种多肽抗原或其免疫原性片段的开放阅读框，其中多肽抗原或其免疫原性片段，包含富集在CD8+T细胞识别抗原中的保守内部蛋白质的通用疫苗。
根据另一方面，本发明提供一种表达载体，其包含工程核酸编码至少一种RNA多核苷酸，其包含编码至少一种多肽抗原或其免疫原性片段的开放阅读框，其中多肽抗原或其免疫原性片段，包含富集在CD8+T细胞识别抗原中的保守内部蛋白质的通用疫苗。
根据另一方面，本发明提供一种宿主细胞，其包含编码至少一种RNA多核苷酸的工程核酸，该核苷酸包含编码至少一种多肽抗原或其免疫原性片段的开放阅读框，其中多肽抗原或其免疫原性片段，包含富集在CD8+T细胞识别抗原中的保守内部蛋白质的通用疫苗。
根据另一方面，所描述的本发明提供了一种在受试者中诱导免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用针对选自病毒、细菌、真菌或原生动物的传染性致病生物体的免疫原的通用疫苗，该疫苗包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其开放阅读框编码至少一种抗原多肽或其免疫原性片段，其中，抗原肽或其免疫原性片段包含富集在CD8+T细胞识别抗原中的保守内部蛋白，其中CD8+T细胞识别抗原由长度为8-11个残基的肽组成；并且其中响应于疫苗而产生的免疫应答可包括以下一种或多种：(i)激活一个或多个T细胞群，以靶向疫苗中存在的抗原；(二)中和病原体的传染性；(iii)抗原特异性反应，包括破坏传染性致病生物体；裂解感染感染感染性致病微生物的细胞，或两者兼而有之；与控件相比。根据一个实施方案，该方法包括用链霉菌噬菌体SV1.0 DNA载体启动受试者，该DNA载体包含编码富集在CD8+T细胞识别抗原中的保守内部蛋白的第一免疫原序列，然后用基于腺病毒(AdV)载体或基于衰减的，复制能力的重组牛痘病毒(VV)载体促进受试者，该载体包含编码在CD8+T中富集的保守内部蛋白质的第二免疫原序列。细胞识别抗原。根据一些实施方案，该方法包括通过皮内注射、鼻内注射或肌肉注射向受试者施用疫苗。根据一些实施方案，启动剂量的给药方式和加强剂量的给药方式是不同的。根据一些实施方案，受试者是表型NOD-scidγc-/-或BALB/c Rag2-/-γc-/-的小鼠。根据一些实施方案，该方法包括将表型NOD-scidγc-/-表型小鼠与人C34+CD133+脐带血细胞重组，作为新生儿注射到NOD-scidγc-/-小鼠中。
根据另一方面，本发明提供了一种在包含完全人类功能免疫系统的动物模型中诱导泛流感特异性细胞免疫应答的方法，该模型包括：(1)从共识氨基酸序列中鉴定和选择富含CD8+T细胞识别抗原的多个高度保守的内部流感病毒蛋白；(2)构建(a)中高度保守的流感病毒蛋白的串联免疫原序列；(3)构建：a.a.链霉菌噬菌体SV1.0 DNA载体，包括(b)的串联免疫原序列；b.基于腺病毒的(AdV)载体，包括(b)的串联免疫原序列；c.一种减毒的、复制能力强的基于牛痘病毒的重组(VV)载体，包括(b)的串联免疫原序列；(4)分别繁殖各重组载体，包括编码的免疫原(3)；(5)通过：a.通过用噬菌体DNA载体3(a)免疫来启动包含体内完全人类功能免疫系统的动物模型；b.通过用3(b)的AdV载体接种3(c)的VV载体，或3(c)的VV载体，然后用3(b)的AdV载体免疫，增强完全的人体免疫系统；(6)在免疫接种后(5)，挑战包括用甲型/PR8型流感(H1N1)或甲型流感/上海(H7N9)病毒免疫的完全人类功能免疫系统的动物模型。
根据一个实施方案，该方法包括通过皮内注射、鼻内或肌内注射向受试者施用疫苗。根据一些实施方案，单剂量和加强剂量的给药方式是不同的。根据一些实施方案，动物模型是表型NOD-scidγc-/-或BALB/c Rag2-/-γc-/-的小鼠。根据一些实施方案，该方法包括将表型NOD-scidγc-/-表型小鼠与人C34+CD133+脐带血细胞重组为新生儿心内注射到NOD-scidγc-/-小鼠中。根据一些实施方案，该方法包括重组表型BALB/c Rag2-/-γc-/-包括从人胎儿肝脏中分离出的CD34+造血祖细胞(HPCs)的小鼠肝内转移到新生儿BALB/cRag2-/-γc-/-中。根据一些实施方案，动物模型中的泛流感特异性细胞免疫应答可有效减少未免疫重组小鼠群体中感染的传播。
附图简述
图1A-图1C示出了通过三种不同的疫苗平台进行免疫原的设计和表达。图1A是在氨基酸守恒和CD8+T细胞表位预测的基础上对流感MI，M2，NP，PA，PB1，PB2序列进行设计两种合成免疫原PB1PAM1(SEQ ID NO：1)和PB2NPM2(SEQ ID NO：2)的示意图。图1A将“(GGGGS)3”披露为SEQ ID NO：28。图1B和图1C显示免疫原与蛋白质印迹的表达。图1B显示蛋白质印迹的结果，证实DNA载体pSV1.0，腺病毒载体AdC68和牛痘载体TTV有效表达免疫原SEQ IDNO：1。与流感基质蛋白1抗体孵育后，在不含免疫原SEQ ID NO：1序列的空载体pSV1.0，AdC68和TTV中未发现特异性条带，而在含有免疫原SEQ ID NO：1序列的载体中未发现显着的～130kD条带，证明DNA载体pSV1.0，腺病毒载体AdC68和牛痘载体TTV有效表达免疫原SEQID NO：1。与β肌动蛋白抗体一起孵育后，检测～42kD蛋白条带进一步证明实验步骤准确，结果可靠。图1C示出了免疫印迹的结果，其证实了pSV1.0的DNA载体、腺病毒载体AdC68和牛痘载体TTV可以有效表达免疫原SEQ ID NO：2。与流感基质蛋白2抗体孵育后，在不含免疫原SEQ ID NO：2序列的空载体pSV1.0，AdC68和TTV中未发现特异性条带，而在含有免疫原SEQID NO：2序列的载体中未发现显着的～130kD条带，证明DNA载体pSV1.0，腺病毒载体AdC68和牛痘载体TTV有效表达免疫原SEQ ID NO：2。与β肌动蛋白抗体一起孵育后，检测～42kD蛋白条带进一步证明实验步骤准确，结果可靠。
图2A-图2D显示通过DNA原发病毒载体疫苗增强引起的流感特异性T细胞免疫应答。图2A是免疫方案的示意图。图2B、图2C和图2D显示接种疫苗的小鼠中引发的细胞反应。接种疫苗的C57小鼠的脾细胞在疫苗接种后四周分离，并进行IFN-γELISpot测定(图2B)和细胞内细胞因子染色测定(图2C、图2D).IFN-γELISpot测定是针对单个甲型流感病毒特异性肽的刺激而进行的，并描述为每10个点形成细胞(SFCs)的数量6脾细胞。共测试了十六种肽(表4).细胞内细胞因子染色测定在用由所有16个肽组成的肽池刺激时进行，并表示为IFN-γ，TNF-α和CD107a表达单阳性或双阳性CD8+T细胞的百分比。所有实验一式三份进行；误差线表示为标准偏差(SD)；其中***表示p<0.001；其中**表示p<0.01；和其中*表示p<0.05.
图3A-图3E显示DNA原始病毒载体疫苗增强策略，在接种疫苗的小鼠中提供对PR8/(H1N1)和H7N9病毒的保护。小鼠按照中概述的时间表进行免疫接种图2A，四周后，使用50050％组织培养感染剂量(TCID50)的A/PR8(H1N1)或100TCID50A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)流感病毒。感染后，每天监测小鼠(每组n＝5)的体重(图3A、图.3D)生存(图3B、图3E)或核糖核酸表达(图3C、图3F).每组5只小鼠在感染后第5天处死，分离肺组织进行RNA提取，然后对病毒RNA进行RT-PCR定量以确定相对病毒载量。误差线代表SD；其中***表示p<0.001；其中**表示p<0.01；和其中*表示p<0.05.
图4A-图4E显示鼻内给予AdC68可显著增强呼吸站性记忆和较少的全身记忆T细胞反应。图4A是免疫方案的示意图。对照组通过肌内注射(i.m.)途径接种1剂对照pSV1.0载体(100μg)和2剂对照AdC68空载体(lx10)11vp)分别通过肌内(i.m.)和鼻内(i.n.)途径。实验组按指示的顺序依次用DNA，AdC68和TTV免疫，肌内途径被视为默认省略，而鼻内给药标记为“i.n”。在接种疫苗四周后分离脾细胞和支气管肺泡灌洗液(BAL)，以测量流感特异性免疫反应。图4B显示了对SPlenocyte响应于单个指示的流感特异性表位肽的刺激的IFN-γELISpot测定的结果。图4C显示了IFN-γELISpot测定BAL对NP-1和PB2-1肽刺激的反应的结果。图4D和图4E显示细胞内细胞因子染色测定的结果，以测量CD8+细胞分泌IFN-γ，TNF-α或两者，以及CD107a表达细胞后用肽池刺激的CD107a细胞的诱导。所有测定都是一式三份进行的，误差线代表SD；其中***表示p<0.001；其中**表示p<0.01；和其中*表示p<0.05.
图5A-5F显示AdC68的鼻内给药可以更好地防止流感的致命挑战。按照图4A中概述的方案对小鼠进行不同的组合免疫，四周后用致死剂量的PRS或H7N9甲型流感病毒进行挑战。显示如下：(图5A、图5D)病毒挑战小鼠的体重曲线(n＝5)。(图5B、图5E)病毒感染小鼠的存活曲线(n＝5)。(图5C、图5F)病毒激发后第5天的相对肺病毒载量，通过流感特异性RNA的RT-PCR定量测量(n＝5)。误差线表示SD，其中***表示p<0.001；其中**表示p<0.01；和其中*表示p<0.05.
图6A-图6F显示呼吸道驻留和全身记忆T细胞对于全面保护至关重要。小鼠的序贯免疫和病毒激发基本上按照以下方法进行：图5A，除了在激发期间随意将所有小鼠暴露于含有2μl/ml溶解的FTY720的饮用水中。显示的是：(图6A，图6DPR8感染小鼠在病毒激发期间的体重曲线(n＝5)。(图6B、图6E)H7N9感染小鼠的生存曲线(n＝5)。(图6C、图6F)感染小鼠中相对肺病毒载量(n＝5)在病毒激发后第5天通过流感特异性RNA的RT-PCR定量测量。误差线代表SD；其中***表示p<0.001；其中**表示p<0.01；和其中*表示p<0.05.
图7显示了DNA prime-AdC68增强和DNA prime-TTV增强策略在递送保守的流感表位以提高流感病毒特异性抗体免疫应答方面的比较。免疫接种后免疫小鼠血清中的抗M2和抗NP IgG水平。对照组接种了三剂对照载体pSV1.0 i.m.(100ug)。实验组接种了两剂DNA疫苗和一剂AdC68或TTV疫苗。在疫苗接种后4周获得血清，并使用ELISA检测抗M2和抗NP IgG滴度。误差线代表SD；其中***表示p<0.001；其中**表示p<0.01；和其中*表示p<0.05.
图8显示了通过肌内和鼻内途径对DNA，AdC68和TTV疫苗组合免疫诱导的流感病毒特异性抗体免疫反应的评估。免疫接种后在免疫小鼠血清中测定抗M2和抗NP IgG水平。对照组接种了一剂对照载体pSV1.0 i.m(100μg)和两剂对照载体AdC68-empty i.n./i.m.(1x10)11vp)；实验组依次用DNA，AdC68和TTV免疫，其顺序为指示的顺序；对于两个AdC68给药途径，只有鼻内途径表示为i.n.，而肌内途径被视为默认途径，并且未注明。在疫苗接种后4周获得血清，并使用ELISA检测抗M2和抗NP IgG滴度。误差线代表SD；其中***表示p<0.001；其中**表示p<0.01；和其中*表示p<0.05.
图9A-图9C显示基于免疫原的流感特异性T细胞免疫反应测定。图9A显示通过ELISpot测定的小鼠脾脏细胞中流感特异性T细胞免疫反应的水平。结果表明，对照小鼠未显示形成斑点的细胞，也没有表现出流感特异性T细胞免疫应答；腺病毒组对NP-2和PB2-1表位均表现出更高水平的细胞反应；牛痘组小鼠对NP-2，NP-3，PB1-1，PB1-3，PA-3和其他表位具有更高的T细胞免疫反应。图9B显示用细胞内细胞因子干扰素γ(IFNγ)和肿瘤坏死因子α(TNFα)染色检测小鼠脾脏细胞中流感特异性免疫应答的水平。结果显示在图9B证明在对照组中未观察到表达IFNγ和TNFα的T细胞，而在腺病毒组和牛痘组中观察到它们，从而显示出具有流感特征的T细胞免疫应答。图9C显示通过细胞内因子CD107a染色检测小鼠脾细胞中流感特异性免疫应答的水平。结果显示在图9C证明在对照组中未观察到表达CD107a的T细胞，而在腺病毒组中观察到，因此具有具有流感特征的T细胞免疫应答。
图10A-图10F显示基于免疫原的H1N1和H7N9流感病毒保护作用的评估。图10A和图10B显示小鼠体重曲线。感染H1N1和H7N9流感病毒后，对照组体重持续下降，而腺病毒组和牛痘组的体重先下降后增加。图10C和图10D显示小鼠的存活曲线。感染H1N1流感病毒后，对照组所有小鼠死亡，而腺病毒组和牛痘组小鼠存活至14天。图10E和图10F显示感染后第5天小鼠肺部病毒载量的检测。感染H1N1和H7N9流感病毒后，腺病毒组和牛痘组的肺病毒载量低于对照组。
图11A-图11D显示检测不同免疫方法诱导的流感特异性T细胞免疫应答。图11A显示通过ELISpot测定的小鼠脾脏细胞中流感特异性T细胞免疫反应的水平。在对照组1小鼠中未观察到流感特异性T细胞免疫应答；而对照组2，3和实验组1，2中存在高水平的T细胞免疫反应(对照组和实验组描述在表5).图11B通过ELISpot测定显示小鼠肺灌洗细胞中流感特异性免疫应答的水平。在肽NP-2和PB2-1的刺激下，对照组1、2和3未发现斑点细胞，这些组的肺部无法建立流感特异性免疫应答。在实验组1和2中观察到更多的斑点细胞，显示出高水平的流感特异性T细胞免疫反应。图11C显示用细胞内细胞因子IFNγ和TNFα染色检测小鼠脾细胞中流感特异性免疫应答的水平。结果显示，对照组1未观察到表达IFNγ和TNFα的T细胞，对照组2、3和实验组1、2均观察到T细胞，从而显示甲型流感诱导的T细胞免疫应答。图11D显示通过CD107a染色检测小鼠脾脏细胞中流感特异性免疫反应的水平。结果表明，对照组3和实验组2的T细胞可以表达CD107a，从而具有具有流感特征的T细胞免疫应答。
图12A-图12F显示不同方法免疫对感染H1N1和H7N9流感病毒的小鼠的保护作用。图12A和图12B显示小鼠体重曲线。当进行组合免疫时，实验组1和2小鼠在H1N1和H7N9流感病毒感染后恢复，然后反弹，结果优于对照组1，2和3。图12C和图12D显示小鼠生存曲线。当进行组合免疫时，实验组1和2小鼠在H1N1和H7N9流感病毒感染后存活至14天。相比之下，对照组1，2和3中的小鼠在第14天之前死亡。图12E和图12F显示H1N1和H7N9流感激发后第5天在小鼠肺部检测到病毒载量。如图所示，在病毒激发后，实验组1和2小鼠的病毒载量略低于对照组1，2和3。
图13A-图13F显示流感病毒激发后小鼠在鼻免疫增强中的保护作用的评价。图13A和图13B显示小鼠体重曲线。H1N1和H7N9流感病毒激发试验后，实验组1+FTY720(芬戈莫德)小鼠和实验组2+FTY720小鼠体重先出现下降，体重随之上升，结果较对照组1+FTY720好。图13C和图13D显示小鼠的存活曲线。在H1N1和H7N9流感病毒挑战后，实验组1+FTY720和实验组2+FTY720的部分小鼠存活至14天，结果优于对照组+FTY720小鼠。图13E和图13F显示病毒激发后第5天肺病毒载量的检测。H1N1和H7N9流感病毒激发试验后，实验组1+FTY720小鼠和实验组2+FTY720小鼠的病毒载量均低于对照组+FTY720小鼠。
详细说明
虽然提高对病毒感染的体液免疫力是许多当前常规疫苗的目标，例如流感疫苗，但这种疫苗通常没有交叉保护作用。此外，大多数保守的病毒蛋白位于病毒内，因此抗体无法触及。确定在病毒感染期间由抗原呈递细胞自然产生的肽表位将允许开发其他疫苗制剂(即基于肽)可以诱导稳健和交叉反应的T细胞反应。本公开描述了靶向保守型病毒T细胞表位的通用疫苗。本公开部分基于病毒特异性CD8+T细胞的鉴定，这些CD8+T细胞具有广谱抗病毒作用，重要的是，可以杀死感染不同病毒亚型的细胞。
所描述的免疫原和包含其免疫原的疫苗与目前的疫苗策略相比具有许多优点。其中一个优点是，免疫原包括高度保守的病毒CD8+T细胞表位，其与具有高亲和力的人MHC I类分子结合，并且能够诱导广谱的高水平病毒特异性T细胞免疫。值得注意的是，广泛的免疫反应可以有效地响应由于抗原漂移和抗原转移而从宿主免疫反应中逃逸的病毒，并且可能进一步在不同病毒亚型之间赋予交叉保护作用。本文中描述的免疫方法，在一些实施方案中，采用多个不同的载体进行序贯免疫，并使用不同的接种方法有效地激活广谱T细胞的局部和全身免疫应答，以增强跨不同病毒亚型的免疫应答。因此，本公开提供了通过各种不同的疫苗载体更全面、更有效和永久地刺激免疫系统的组合物和方法，这些载体被战略性地组合以提供更广泛和更有效的病毒保护。
定义
除非另有定义，否则此处使用的所有技术和科学术语均具有与本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管任何与本文描述的方法和材料相似或等效的方法和材料都可以用于本公开实施例的实践或测试中，但现在描述了优选的方法、装置和材料。此处提及的所有出版物均通过引用并入。此处的任何内容均不得解释为承认该披露无权因事先披露而提前披露。
如说明书和所附权利要求书中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指称，除非上下文另有明确规定。
本文使用的术语“约”是指诸如量、时间持续时间等可测量值时，意指包含±20％、±10％、±5％、±1％、±0.9％、±0.8％、±0.7％、±0.6％、±0.5％、±0.4％、±0.3％、±0.2％或±0.1％的变化，因为这种变化适合于执行所公开的方法。
说明书和权利要求书中此处使用的短语“和/或”应理解为指如此连体的元件的“其中一项或两项”，即，在某些情况下结合存在，在其他情况下分离存在的元素。除“和/或”条款具体指明的要素外，还可以选择存在其他要素，无论这些要素是否与具体指明的要素相关或无关，除非明确指出相反的情况。因此，作为非限制性示例，当与诸如“包含”之类的开放式语言结合使用时，对“A和/或B”的引用可以指不带B的A(任选地包括B以外的元素)。根据一些实施例，以B不带A(任选地包括A以外的元素)；在另一个实施例中，要同时对A和B(任选地包括其它元件)；等。
如说明书和权利要求书中所用，“或”应理解为与上述定义的“和/或”具有相同的含义。例如，在将清单中的项目分开时，“或”或“和/或”应解释为包括在内的，即，则包括至少一个元素，但也包括多个元素或元素列表，以及(可选)其他未列出的项目。只有明确标明相反的术语，例如“只有一个”或“恰好是一个”，或者在权利要求中使用时，“由”，才是指只包括一些或一系列元素中的一个元素。一般而言，此处使用的术语“或”应仅解释为表示排他性替代项(即“一个或另一个，但不是两者”)在权利要求中使用时，“任一”、“一个”、“只有一个”或“恰好是其中之一”“基本上由”使用时，应具有专利法领域使用的通常含义。
如本文所用，短语“从X到Y的整数”是指包含端点的任何整数。也就是说，在公开范围的情况下，范围中的每个整数(包括端点)都会被公开。例如，短语“从X到Y的整数”公开了1，2，3，4或5以及范围1到5。
如本文所用，当用于定义产品、组合物和方法时，术语“包括”(以及任何形式的包含，例如“包括”和“包含”)、“具有”(以及具有的任何形式的，例如“有”和“有”)，“包括”(以及任何形式的包括，例如“包括”和“包括”)或“包含”(以及任何形式的包含，例如“包含”和“包含”)是开放式的，并且不排除额外的，未引用的元素或方法步骤。因此，当多肽“包含”氨基酸序列时，该氨基酸序列可能是该多肽的最终氨基酸序列的一部分。这样的多肽可以具有多达几百个额外的氨基酸残基(例如：标记和靶向肽，如本文所述)。“基本上由”是指排除具有任何重要意义的其他组成部分或步骤。因此，主要由所举成分组成的组合物不会排除痕量污染物和药学上可接受的载体。多肽“基本上由”氨基酸序列组成，当这种氨基酸序列存在时，最终只有少数额外的氨基酸残基。“由”是指排除超过微量元素的其他组分或步骤。例如，当多肽不包含任何氨基酸但背诵的氨基酸序列时，多肽“由”氨基酸序列“组成”。
如本文所用，“基本相等”是指在给定的测量度量下与异常或正常范围相关的已知范围内。例如，如果对照样品来自患病患者，则基本等于在异常范围内。如果对照样本来自已知未被测试病情的患者，则基本等于该给定指标的正常范围内。
除非另有定义，否则此处使用的所有技术和科学术语均具有与本公开内容相关的本领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管任何与本文描述的方法和材料相似或等效的方法和材料都可以用于本公开内容的测试实践中，但优选的材料和方法在本文中描述。
术语“激活”，“刺激”，“增强”，“增加”和/或“诱导”(以及类似术语)可以互换使用，通常是指直接或间接地改善或增加相对于自然，预期或平均值或相对于控制条件的浓度，水平，功能，活动或行为的行为。“激活”是指由细胞表面部分连接诱导的主要反应。例如，在受体的背景下，这种刺激需要受体的连接和随后的信号转导事件。此外，刺激事件可以激活细胞并上调或下调分子的表达或分泌。因此，即使没有直接的信号转导事件，细胞表面部分的连接也可能导致细胞骨架结构的重组，或细胞表面部分的合并，其中每个部分都可能有助于增强，修饰或改变随后的细胞反应。
本文使用的术语“激活CD8+T细胞”或“CD8+T细胞激活”是指(例如：，信号传导事件)引起或导致CD8+T细胞(CTL)的一个或多个细胞应答，选自：增殖，分化，细胞因子分泌，细胞毒性效应分子释放，细胞毒性活性和活化标志物的表达。如本文所用，“活化的CD8+T细胞”是指已经接收到激活信号的CD8+T细胞，因而表现出一种或多种细胞应答，选自增殖、分化、细胞因子分泌、细胞毒性效应分子释放、细胞毒性活性和活化标志物的表达。用于测定CD8+T细胞活化的合适测定是本领域已知的，并且在此描述。
本文使用的术语“激活NK细胞”或“NK细胞激活”是指(例如：，一种信号传导事件)，导致或导致NK细胞能够杀死MHC I类表达缺陷的细胞。如本文所用，“活化的NK细胞”是指已经接收到激活信号的NK细胞，因此能够杀死MHC表达不足的细胞。用于测量NK细胞活化的合适测定是本领域已知的，并且在此描述。
本文使用的术语“主动免疫”是指本文使用的术语“主动免疫”是指产生主动免疫，指由自然获得性感染或故意接种疫苗(人工主动免疫)产生的免疫。
术语“过继免疫”和“获得性免疫”可互换使用，以指由活淋巴细胞从免疫细胞源转移而产生的被动细胞介导的免疫。
本文使用的术语“佐剂”是指当与特异性免疫原(例如：制剂中的VLP)将增强或以其他方式改变或修改由此产生的免疫反应。免疫反应的修饰包括增强或扩大抗体和细胞免疫反应的一种或两种特异性。免疫反应的改变也可能意味着减少或抑制某些抗原特异性免疫反应。
术语“给药”及其适用于哺乳动物、细胞、组织、器官或生物体液的各种语法形式，如本文所用，意指但不限于外源性配体、试剂、安慰剂、小分子、药剂、治疗剂、诊断剂或组合物与受试者、细胞、组织、器官或生物体液的接触，等等。“管理”可以指，例如：，治疗，药代动力学，诊断，研究，安慰剂和实验方法。“管理”还包括体外和离体治疗，例如：，由试剂、诊断、结合组成或由另一个细胞组成。
术语“氨基酸残基”或“氨基酸”或“残基”在本文中可互换使用，以指被掺入蛋白质、多肽或肽中的氨基酸，包括但不限于天然存在的氨基酸和已知的天然氨基酸类似物，其能够以与天然存在的氨基酸类似的方式发挥作用。所述氨基酸可以是L-或D-氨基酸。氨基酸可以被合成氨基酸取代，合成氨基酸被改变以增加肽的半衰期，增加肽的效力，或增加肽的生物利用度。氨基酸的单字母名称在本文中主要使用。这种单字母名称如下：A是丙氨酸；C是半胱氨酸；D是天冬氨酸；E是谷氨酸；F是苯丙氨酸；G是甘氨酸；H是组氨酸；我是异亮氨酸；K是赖氨酸；L是亮氨酸；M是蛋氨酸；N是天冬酰胺；P是脯氨酸；Q是谷氨酰胺；R是精氨酸；S是丝氨酸；T是苏氨酸；V是缬氨酸；W是色氨酸；Y是酪氨酸。以下代表彼此保守替代的氨基酸组：1)丙氨酸(A)，丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，蛋氨酸(M)，缬氨酸(V)；和6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)。
本文使用的术语“抗原”是指含有一种或多种表位(线性，构象或两者)的分子，这些表位将刺激宿主的免疫系统做出体液和/或细胞抗原特异性反应。该术语与术语“免疫原”互换使用。通常，B细胞表位将包括至少约5个氨基酸，但可以小至3-4个氨基酸。T细胞表位，如CTL表位，将包括至少约7-9个氨基酸，以及至少约12-20个氨基酸的帮助性T细胞表位。通常，表位将包括约7至15个氨基酸，例如9，10，12或15个氨基酸。该术语包括与天然序列相比的修饰，例如缺失，添加和替换(通常在性质上保守)，只要蛋白质保持引发免疫反应的能力，如本文所定义。这些修饰可能是故意的，如通过定点诱变，也可能是偶然的，例如通过产生抗原的宿主的突变。
本文使用的术语“抗原呈递”是指抗原以与MHC分子结合的肽片段的形式在细胞表面上显示。
本文使用的术语“抗原呈递细胞(APC)”是指能够在其表面上处理和显示与主要组织相容性复合物(MHC)分子相关的外来抗原的细胞。
术语“B淋巴细胞”或“B细胞”可互换使用，以指代一类广泛的淋巴细胞，它们是抗体分泌细胞的前体。免疫球蛋白，B细胞的受体，与可溶性分子或颗粒表面上的单个表位结合。B细胞受体看到在天然分子表面表达的表位。抗体和B细胞受体进化为与细胞外液中的微生物结合并防止微生物。
术语“结合”及其各种语法形式意味着化学物质之间的持久吸引力。结合特异性涉及与特定伴侣的结合和不与其他分子的结合。功能上重要的结合可能发生在从低到高的亲和力范围内，设计元素可以抑制不需要的交叉相互作用。翻译后修饰也可以改变相互作用的化学和结构。“混杂结合”可能涉及结构可塑性的程度，这可能导致不同的残基子集对于与不同伴侣的结合很重要。“相对结合特异性”是一种特征，即在生化系统中，分子与其靶标或伴侣的差异性相互作用，从而根据单个靶标或伴侣的身份显着影响它们。
本文使用的术语“分支”是指来自共同祖先的相关生物体。
本文使用的术语“细胞系”是指从单个细胞发育而来的永久建立的细胞培养物，因此由具有均匀遗传组成的细胞组成，这些细胞将无限期地增殖。
本文使用的术语“编码区”是指基因中在其自然基因组环境中自然或通常编码该基因表达产物的部分，即，区域编码体内用于基因的天然表达产物。编码区可以来自正常的、突变的或改变的基因，或者甚至可以来自DNA序列或基因，使用本领域技术人员熟知的DNA合成方法在实验室中完全合成。“编码序列”或“编码”所选多肽的序列是一种核酸分子，其被转录(在DNA的情况下)并翻译(在mRNA的情况下)成多肽体内当置于适当的调节序列(或“控制元件”)的控制之下时。编码序列的边界由5'(氨基)末端的起始密码子和3'(羧基)末端的翻译终止密码子确定。编码序列可以包括但不限于来自病毒、原核或真核mRNA的cDNA，来自病毒或原核DNA的基因组DNA序列，甚至合成的DNA序列。转录终止序列可以位于编码序列的3′处。
本文使用的术语“组分”是指构成部分、元素或成分。
本文使用的术语“组合物”是指由两种或多种物质的混合物形成的材料。
如本文所用，本文所用的术语“病症”是指各种健康状态，并且意在包括由任何潜在机制或病症引起的病症或病症。
如本文所用，术语“共识序列”用于描述理论上具有代表性的核苷酸或氨基酸序列，其中每个核苷酸或氨基酸是自然界中发生的不同序列中在该位点最常出现的核苷酸或氨基酸。该短语还指近似于理论共识的实际序列。例如，共识序列可用于表示已知的保守序列集，该序列集是多肽中的氨基酸序列或DNA或RNA中核苷酸的序列，该序列在多个物种中相似。
术语“接触”及其在本文中使用的各种语法形式，是指触摸或直接或局部接近的状态或条件。将组合物接触到目标目的地可以通过本领域技术人员已知的任何给药手段发生。
本文使用的术语“控制元件”是DNA区域的通用术语，例如与基因相邻(或内部)的启动子或增强子，其允许通过转录因子的结合来调节基因表达。典型的“对照元件”，包括但不限于转录启动子、转录增强子元件、转录终止信号、聚腺苷酸化序列(位于翻译终止密码子3′)、用于优化翻译起始序列的序列(位于编码序列5′)和翻译终止序列；和/或控制开放染色质结构的序列元件参见例如：，麦考恩等。(1995)PNAS USA 92：5431-5435；Kochetovet al(1998)FEBS Letts.440:351-355.
如本文所用，术语“交叉保护”用于描述对病毒、细菌、寄生虫或其他病原体的至少两个亚组、亚型、菌株和/或变体的免疫力，同时接种一个亚组、亚型、菌株和/或其变体。
术语“培养物”及其本文使用的其他语法形式是指细胞群在人造培养基中的底物上生长和增殖的过程。
本文使用的术语“细胞毒性T淋巴细胞”(CTLs)是指效应器CD8+T细胞。细胞毒性T细胞通过诱导其靶标发生细胞凋亡来杀死它们。它们通过外在和内在途径诱导靶细胞经历程序性细胞死亡。
本文使用的术语“树突状细胞”或“DC”是指在向T细胞提供外来抗原的各种淋巴和非淋巴组织中发现的各种形态学上相似的细胞类型的多样化群体，参见Steinman，Ann.Rev.Immunol。9:271-296(1991).
本文使用的术语“衍生自”是指包括从原产地接收、获取或修改某物的任何方法。
术语“可检测标记物”包括可选标记物和测定标记物。
本文使用的术语“可检测响应”是指可以在测定中检测到的任何信号或响应，这些信号或响应可以在有或没有检测试剂的情况下进行。可检测的响应包括但不限于放射性衰变和能量(例如：，荧光，紫外线，红外线，可见光)发射，吸收，偏振，荧光，磷光，透射，反射或共振转移。可检测的响应还包括色谱迁移率、浊度、电泳迁移率、质谱、紫外光谱、红外光谱、核磁共振光谱和X射线衍射。或者，可检测的响应可以是测定测定生物材料的一个或多个性质的结果，例如熔点，密度，电导率，表面声波，催化活性或元素组成。“检测试剂”是产生可检测响应的任何分子，指示存在或不存在感兴趣的物质。检测试剂包括各种分子中的任何一种，例如抗体、核酸序列和酶。为了便于检测，检测试剂可包含标记物。
术语“分化”及其在本文中使用的各种语法形式，是指随着细胞或组织的组织水平或复杂性的增加而发展的过程，伴随着更专门的功能。
本文使用的术语“剂量”是指一次处方的治疗物质的量。
本文使用的术语“有效剂量”，通常是指包含本文所述的感染因子或病原体的内部保守蛋白或其免疫原片段的免疫原的量，或包含该免疫原的疫苗，足以诱导免疫，预防和/或改善感染或减轻至少一种感染症状和/或增强含有免疫原。有效剂量可指含有免疫原的免疫原或疫苗的量足以延缓或尽量减少感染的发作。有效剂量也可指免疫原或疫苗的量，其包含免疫原，其在治疗或管理感染中提供治疗益处。此外，有效剂量是相对于免疫原或疫苗的量，其包含单独或与其它疗法组合的免疫原或疫苗，其在治疗或管理感染中提供治疗益处。有效剂量也可能是足以增强受试者(例如：，人类)自身对随后暴露于传染因子的免疫反应。可以监测免疫水平，例如：，通过测量中和分泌物和/或血清抗体的量，例如：，通过斑块中和、补体固定、酶联免疫吸附剂或微中性化测定。在疫苗的情况下，“有效剂量”是预防疾病和/或减轻症状严重程度的剂量。
本文使用的术语“有效量”是指包含免疫原或疫苗的量，该免疫原是实现所需生物效果所必需的或足以实现的。组合物的有效量将是达到选定结果的量，并且这种量可以作为本领域技术人员的常规实验来确定。例如，用于预防、治疗和/或改善感染的有效量可以是引起免疫系统激活所必需的量，从而导致在暴露于包含本公开的免疫原的免疫原或疫苗时产生抗原特异性免疫应答。该术语也是“足够量”的同义词。
本文使用的术语“效应细胞”是指执行最终响应或功能的细胞。例如，免疫系统的主要效应细胞是活化的淋巴细胞和吞噬细胞。
本文使用的术语“富集”是指增加所需物质的比例，例如，相对于其在细胞群中的固有频率增加亚型细胞的相对频率。正选择、负选择或两者通常被认为是任何富集方案所必需的。选择方法包括但不限于磁分离和流式细胞计数系统。无论用于富集的特定技术如何，选择过程中使用的特定标记物都是至关重要的，因为发育阶段和激活特异性反应可以改变细胞的抗原谱。
本文使用的术语“扩增CD8+T细胞”或“CD8+T细胞扩增”是指CD8+T细胞群经历一系列细胞分裂从而增加细胞数量的过程。术语“扩增的CD8+T细胞”涉及通过CD8+T细胞扩增获得的CD8+T细胞。用于测量T细胞扩增的合适测定是本领域已知的，并且在此描述。
本文使用的术语“扩增NK细胞”或“NK细胞扩增”是指NK细胞群经历一系列细胞分裂从而增加细胞数量的过程。术语“扩增的NK细胞”涉及通过NK细胞扩增获得的NK细胞。用于测量NK细胞扩增的合适测定是本领域已知的，并且在此描述。
术语“扩增I型NKT细胞群”或“I型NKT细胞扩增”是指一个过程，其中一组INKT细胞经历一系列细胞分裂，从而扩大细胞数量(例如，体外文化)。
本文使用的术语“表达”或“表达”，意在包括mRNA的生物合成，多肽生物合成，多肽活化，例如：，通过翻译后修饰，或通过改变亚细胞位置或通过招募染色质来激活表达。表达式可以是，例如：，通过许多方法增加，包括：增加编码多肽的基因数量，增加基因的转录(例如通过将基因置于组成启动子的控制下)，增加基因的翻译，敲除竞争性基因，或这些和/或其他方法的组合。
本文使用的术语“表达载体”是指包含宿主细胞中表达的基因的DNA分子。通常，基因表达被置于某些调节元件的控制之下，包括但不限于启动子、组织特异性调节元件和增强子。这种基因据说与调节元件“可操作地联系在一起”。
本文使用的术语“流式细胞术”是指用于询问细胞表型和特征的工具。当细胞或粒子在液体流中通过激光(通过受激发射辐射进行光放大)/光束通过传感区域时，它感应细胞或粒子。测量微观颗粒的相对光散射和颜色区分荧光。细胞的流动分析和分化基于大小，粒度以及细胞是否以抗体或染料的形式携带荧光分子。当细胞通过激光束时，光向各个方向散射，并且从轴线以低角度(0.5-10°)向前散射的光与球体半径的平方成正比，因此与细胞或粒子的大小成正比。光可能进入细胞；因此，90°光(直角，侧面)散射可以用荧光染料连接的抗体标记或用荧光膜，细胞质或核染料染色。因此，可以促进细胞类型的分化，膜受体和抗原的存在，膜电位，pH值，酶活性和DNA含量。流式细胞仪是多参数的，记录每个细胞的多次测量；因此，有可能在异质种群中识别同质亚群(Marion G.Macey，流式细胞术：原理和应用，Humana出版社，2007)。荧光活化细胞分选(FACS)允许分离物理特征过于相似的不同细胞群，以按大小或密度进行分离，使用荧光标签来检测差异表达的表面蛋白质，从而可以在物理上均匀的细胞群之间进行细微的区分。
术语“功能等效”或“功能等效”在本文中可互换使用，以指具有相似或相同作用或用途的物质、分子、多核苷酸、蛋白质、肽或多肽。
如本文所用，术语“基因”被广泛用于指与给定RNA或蛋白质的表达相关的核酸的任何片段。因此，基因包括编码表达RNA的区域(通常包括多肽编码序列)，并且通常包括其表达所需的调节序列。基因可以从多种来源获得，包括从感兴趣的来源克隆或从已知或预测的序列信息合成，并且可以包括设计为具有特定所需参数的序列。
本文使用的术语“群体免疫”是指通过接种他人疫苗和减少自然感染库而产生的人群中未接种疫苗的个体的保护。
本文使用的术语“异质亚型免疫”(“HIS”)是指基于对所有病毒株中保守的抗原的免疫识别的免疫。
本文使用的术语“异型”用于指具有不同或不寻常的类型或形式(例如，病毒，细菌，寄生虫或其他病原体的不同亚组，亚型，菌株和/或变体)。
本文使用的术语“同型”用于指具有相同类型或形式的，例如，相同的亚组，亚型，菌株和/或病毒，细菌，寄生虫或其他病原体的变体。
本文使用的术语“免疫应答”和“免疫介导”，意在本文可互换使用，以指代受试者免疫系统的任何功能表达，针对外来或自身抗原，无论这些反应的后果对受试者是有益还是有害。本文所用的抗原或组合物的术语“免疫反应”，是指在受试者中对存在于感兴趣的组合物中的抗原的体液和/或细胞免疫应答的发展。就本公开而言，“体液免疫应答”是指由抗体分子介导的免疫应答，而“细胞免疫应答”是指由T淋巴细胞和/或其他白细胞介导的免疫应答。细胞免疫的一个重要方面涉及细胞溶解T细胞(“CTL”)的抗原特异性反应。CTL对肽抗原具有特异性，这些抗原与主要组织相容性复合物(MHC)编码的蛋白质结合并在细胞表面表达。CTL有助于诱导和促进细胞内微生物的破坏，或裂解感染这些微生物的细胞。细胞免疫的另一个方面涉及辅助性T细胞的抗原特异性反应。辅助性T细胞的作用是帮助刺激非特异性效应细胞的功能，并将其活性集中在其表面上显示与MHC分子相关的肽抗原的细胞上。“细胞免疫反应”也指由活化的T细胞和/或其他白细胞产生的细胞因子，趋化因子和其他此类分子的产生，包括来自CD4+和CD8+T细胞的细胞。因此，免疫反应可能包括以下一种或多种作用：B细胞产生抗体；和/或抑制性T细胞和/或γΔT细胞的活化，特异性地针对感兴趣的组合物或疫苗中存在的一个或多个抗原。这些反应可能有助于中和感染性，和/或介导抗体补体或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，为免疫宿主提供保护。这种反应可以使用标准免疫测定和中和测定来确定，这是本领域公知的。
本文使用的术语“整合到基因组中”是指重组DNA序列同时连接到包含宿主细胞基因组的基因组DNA。
本文使用的术语“隔离”是指将材料从其原始环境中移除(例如：，如果自然环境是自然发生的)。例如，存在于活体动物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是分离的，而是从自然系统中的一些或全部共存物质中分离出的相同的多核苷酸或多肽。根据一些实施方案，特定细胞类型的分离群体是指大于10％纯、大于20％、大于30％纯、大于40％、大于50％纯、大于60％纯、大于70％纯、大于80％、大于90％或大于95％纯。
本文使用的术语“标记”是指通过引入可追溯的成分来区分化合物、结构、蛋白质、肽、抗体、细胞或细胞组分的过程。常见的可追溯成分包括但不限于荧光抗体、荧光团、染料或荧光染料、染色剂或荧光染料、标记物、荧光标记物、化学染色剂、差分染色剂、差异标记物和放射性同位素。
本文使用的术语“淋巴细胞”是指在全身淋巴组织和正常成人中形成的小白细胞，约占循环血液中白细胞总数的22-28％，在保护身体免受疾病侵害方面起着重要作用。单个淋巴细胞的专门之处在于它们致力于对一组有限的结构相关抗原作出反应。这种承诺存在于免疫系统与给定抗原首次接触之前，通过淋巴细胞表面膜上存在抗原上决定簇(表位)特异性受体来表达。每个淋巴细胞拥有一组受体，所有这些受体都具有相同的组合位点。一组或克隆淋巴细胞在其受体的组合区域的结构上与另一个克隆不同，因此在它可以识别的表位上不同。淋巴细胞之间的差异不仅在于其受体的特异性，还在于其功能。
术语“标记物”或“细胞表面标记物”在本文中可互换使用，以指在特定类型细胞表面发现的抗原决定簇或表位。细胞表面标记物可以促进细胞类型的表征，其鉴定以及最终的分离。细胞分选技术基于细胞生物标志物，其中细胞表面标记物可用于阳性选择或阴性选择，即，用于从细胞群中包含或排除。
术语“中介”及其在这里使用的各种语法形式，是指带来结果。
本文使用的术语“MHC(主要组织相容性复合物)分子”是指由主要组织相容性复合物(MHC)的基因编码的无处不在的细胞表面糖蛋白的大家族之一。它们结合外来抗原的肽片段，并将其呈现给T细胞以诱导免疫反应。由一系列高度多态性基因编码的I类MHC分子存在于几乎所有细胞类型上，并在病毒感染细胞表面存在病毒肽，在那里它们被细胞毒性T细胞识别。在MHC I类机制中，外来肽被内吞以在抗原呈递细胞内转运。然后，至少一些外来蛋白质被胞质蛋白酶体蛋白水解以形成短肽，其被转运到抗原呈递细胞的内质网的腔内。在那里，外来肽被加载到MHC I类分子上，并通过囊泡运输到抗原呈递细胞的细胞表面，以便CD8+细胞毒性T细胞识别。例如，癌细胞上的MHC I表达是T细胞检测和破坏所必需的，而细胞毒性T淋巴细胞(CTLs，CD8+)需要MHC I类分子在靶细胞上呈递肿瘤抗原，以描绘自我和非自我。肿瘤逃避宿主免疫反应的最常见方法之一是肿瘤细胞下调MHC I类分子表达，使得肿瘤具有低MHCI表达，从而使任何内源性或治疗性抗肿瘤T细胞反应无效(海沃氏等。，儿科血癌。2015年4月；62(4):571–576).大多数情况下，肿瘤细胞上MHC表达的丧失是由表观遗传事件和MHC位点和/或抗原处理机制的转录下调介导的。缺乏加工的肽抗原导致MHC表达降低，因为空的MHC分子在细胞表面上不稳定。
存在于专业抗原呈递细胞上的II类MHC分子将外源肽呈递给辅助性T细胞。外来肽在内体的酸性环境中内吞和降解，这意味着肽永远不会出现在细胞质基质中，并且保留在拓扑学上等同于细胞外空间的亚细胞区室中。肽与专门的内体隔室中预组装的MHC II类蛋白质结合，然后加载的MHC II类分子被运输到抗原呈递细胞的质膜上以呈现给CD4+辅助T细胞。(阿尔贝茨等。《细胞分子生物学》第4版，加兰科学，纽约(2002年)，第1407页。抗原也可以通过从供体细胞表面获得MHC II类分子来加载到抗原呈递细胞上。肽-MHC转移(交叉敷料)涉及在供体细胞内产生肽-MHC II类复合物，并随后将其转移到受体抗原呈递细胞，然后其能够呈现完整，基本上未处理的肽-MHC II类复合物以帮助T细胞。(坎帕纳，S.等。，免疫。文学(2015)168(2)：349-54).当内源性抗原通过自噬降解时，MHC II类也可以呈递。(施密德，D.等。(2007)免疫26(1)：79-92).
术语“修改”及其在本文中使用的各种语法形式，意在指形式或质量的变化。
术语“调制”及其在本文中使用的各种语法形式，是指调节，改变，适应或调整到一定程度或比例。这种调制可以是任何变化，包括不可察觉的变化。
本文中使用的关于肿瘤细胞的免疫应答的术语“修饰的”或“调节的”是指通过一种或多种重组DNA技术改变对肿瘤细胞的免疫应答的形式或特征，使得免疫细胞能够识别和杀死肿瘤细胞。
本文使用的术语“自然杀伤(NK)细胞”是指与T细胞和B细胞属于同一家族的淋巴细胞，分类为I组先天性淋巴细胞。它们具有在没有任何启动或先前激活的情况下杀死肿瘤细胞的能力，与细胞毒性T细胞相反，后者需要通过抗原呈递细胞启动。NK细胞分泌IFNγ和TNFα等细胞因子，它们作用于其他免疫细胞，如巨噬细胞和树突状细胞，以增强免疫反应。NK细胞表面的激活受体识别癌细胞和感染细胞表面表达的分子，并打开NK细胞。抑制性受体作为NK细胞杀伤的检查。大多数正常健康细胞表达MHCI受体，将其标记为“自我”。NK细胞表面的抑制性受体识别同源MHCI，它关闭NK细胞，阻止其杀死。一旦决定杀死，NK细胞就会释放含有穿孔素和颗粒酶的细胞毒性颗粒，从而导致靶细胞的裂解。自然杀伤反应性，包括细胞因子分泌和细胞毒性，由几种生殖系编码的抑制和激活受体(如杀手免疫球蛋白样受体(KIRs)和天然细胞毒性受体(NCRs))的平衡控制。靶细胞上MHC I类分子的存在是NK细胞上MHC I类特异性受体(杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR))的一种抑制配体。KIR受体的参与阻断了NK激活，并且矛盾的是，通过触发失活信号来保持它们对连续遭遇的反应能力。因此，如果KIR能够与MHC I类充分结合，则这种参与可能会覆盖杀伤信号并允许靶细胞存活。相反，如果NK细胞无法充分结合靶细胞上的MHC I类，则靶细胞的杀伤可能会继续进行。因此，那些表达低MHC I类并且被认为能够逃避T细胞介导的攻击的肿瘤可能容易受到NK细胞介导的免疫反应的影响。
本文使用的术语“自然杀伤T细胞”或“NKT”是指不变的自然杀伤T(iNKT)细胞，也称为I型NKT细胞，以及表达CD3和αβT细胞(TCR)或γΔT细胞(以下简称“自然杀伤αβT细胞”)或γΔT细胞(以下简称“自然杀伤γΔT细胞”)的非不变性(Vα24-和Vα24+)自然杀伤T细胞的所有亚群，所有这些都已证明对CD1抗原提出的非蛋白质抗原有反应的能力。所描述的方法所包含的非不变NKT细胞与I型NKT细胞共享共同的通常归因于自然杀伤(NK)细胞的表面受体的表达，以及αβ或γΔTCR基因位点的TCR重排/重组。
本文使用的术语“不变性自然杀伤T细胞”旨在与术语“iNKT”互换使用，并且意味着指表达受限TCR库的T细胞受体(TCR)α表达细胞的子集，该TCR库在人类中由Vα24-Ja18TCRα链组成，例如，与Vβ11TCRβ链偶联。iNKT旨在涵盖CD3+Vα24+I型NKT细胞(CD3+CD4+CD8-Vα24+，CD3+CD4-CD8-+Vα24-.+和CD3+CD4-CD8-Vα24+)的所有亚群以及这些细胞，这些细胞可以通过基因表达或其他免疫分析确认为I型NKT细胞，但Vα24(CD3+Vα24-)的表面表达下调。这包括表达或不表达调节转录因子FOXP3的细胞。与传统T细胞不同，传统T细胞主要识别MHC分子呈递的肽抗原，iNKT细胞识别由非多态性MHC 1类CD1d呈递的糖脂抗原。
本文使用的术语“非扩增”是指尚未在培养物中生长的细胞群(体外)以增加细胞群中的细胞数量。
术语“非复制”或“复制受损”病毒是指在大多数正常哺乳动物细胞或正常原代人类细胞中无法显着复制的病毒。
本文使用的术语“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且，除非另有限制，否则包括具有天然核苷酸本质性质的已知类似物，因为它们以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交(例如：、肽核酸)。在公开方法中有用的核酸分子包括编码本公开多肽或其片段的任何核酸分子。这种核酸分子不必与内源性核酸序列100％相同，但通常具有实质性的同一性。对内源性序列具有“实质性同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。在公开方法中有用的核酸分子包括编码本公开多肽或其片段的任何核酸分子。这种核酸分子不必与内源性核酸序列100％相同，但通常具有实质性的同一性。对内源性序列具有“实质性同一性”的多核苷酸通常能够与双链核酸分子的至少一条链杂交。通过“杂交”是指在互补的多核苷酸序列((例如：，本文中描述的基因)，或其部分，在各种严格的条件下。(请参阅，例如：，Wahl，G.M.和S.L.Berger(1987)方法酶。152:399；Kimmel，A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507).通过量化两股退火的速率来测量碱基不相容性的影响，可以提供关于被退火的两条链之间碱基序列相似性的信息。选择性杂交的核酸在严格的杂交条件下，将核酸序列杂交到指定的核酸靶序列，其检测程度更高(例如：，至少2倍于背景)比其杂交到非靶向核酸序列和大量排除非靶核酸。
本文使用的术语“核苷酸序列”是指脱氧核糖核苷酸的杂聚物。编码特定肽、寡肽或多肽的核苷酸序列可以是天然存在的，也可以是合成构建的。
本文使用的术语“开放阅读框架”是指DNA分子中具有编码肽或蛋白质的潜力的核苷酸序列：它以起始三元组(ATG)开头，后跟一串三元组，每个三元组编码氨基酸，并以停止三元组(TAA，TAG或TGA)。
此处使用的短语“可操作地链接”是指(1)第一序列或结构域被充分地定位在第二序列或结构域的近端，以便第一序列或结构域可以对第二序列或结构域施加影响，或者第二序列或结构域控制下的区域；(2)启动子与第二序列之间的功能连锁，其中启动子序列启动并介导对应于第二序列的DNA序列的转录。通常，可操作链接意味着被连接的核酸序列是连续的，并且在必要时加入两个蛋白质编码区域，位于同一读取框中。根据一些实施方案，短语“操作性连接”是指通过重组DNA技术或化学反应将两个或多个蛋白质结构域或多肽连接或结合的连接，使得所得融合蛋白质的每个蛋白质结构域或多肽保持其原始功能。
本文使用的术语“优化的病毒多肽”是指不是天然存在的病毒肽、多肽或蛋白质的免疫原性多肽。优化的病毒多肽序列最初是通过修改一种或多种天然存在的病毒基因产物(例如：、肽、多肽和蛋白质)以增加抗病毒免疫反应(例如：，免疫接种时产生的细胞或体液免疫反应(例如：，当掺入本公开的疫苗中时)的哺乳动物(例如：，人类)。因此，优化的病毒多肽可以对应于“亲本”病毒基因序列；或者，优化的病毒多肽可能不对应于特定的“亲本”病毒基因序列，但可能对应于来自各种病毒株或准物种的类似序列。可以包含在优化的病毒多肽中的病毒基因序列的修饰包括氨基酸添加，替换和缺失。根据本公开内容的一些实施方案，优化的病毒多肽是两个或多个天然存在的病毒基因产物(例如：，天然或临床病毒分离物)，其中每个潜在的表位(例如：，分析和修饰每个连续或重叠的氨基酸序列5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30或更多氨基酸的长度)以提高所得优化的病毒多肽的免疫原性。对应于不同病毒基因产物的优化病毒多肽也可以被融合，以促进掺入公开的疫苗中。生成优化的病毒多肽的方法描述于：例如：渔夫等。(2007)“用于全球HIV-I变体中潜在T-CeIl表位最佳覆盖的多价疫苗”，国家医学版13(1)：100-106和国际专利申请公开WO 2007/024941，本文通过引用并入。一旦生成优化的病毒多肽序列，就可以通过本文所述的标准技术生产或施用相应的多肽。
本文使用的术语“总生存期”(OS)是指从诊断日期或开始治疗疾病(例如癌症)开始的时间长度，即被诊断患有该疾病的患者仍然活着。
术语“肠胃外”及其本文使用的其他语法形式，是指通过口腔或消化道在体内发生的物质的施用。例如，本文使用的术语“胃肠外”是指通过注射(即，注射给药)，包括，例如皮下(即，皮肤下注射)，肌肉注射(即，注射到肌肉中)；静脉注射(即，注射到静脉中)，鞘内(即，注射到脊髓周围或大脑蛛网膜下的空间)，胸骨内注射或输注技术。
本文使用的术语“模式识别受体”或“PRRs”是指存在于细胞表面以识别细胞外病原体的受体；在内体中，它们感觉到细胞内入侵者，最后在细胞质中。它们认识到病原体的保守分子结构，称为病原体相关分子模式(PAMPs)，特定于微生物，对其生存能力至关重要。PRRs分为四个家族：Toll样受体(TLR)；核苷酸寡聚受体(NLR)；C型瘦素受体(CLR)和RIG-1样受体(RLR)。
术语“肽”在本文中用于指定一系列氨基酸残基，通常通过相邻氨基酸的α-氨基和羰基之间的肽键将一个连接到另一个。肽的长度通常为9个氨基酸，但长度可以短至8个氨基酸，长度可达14个氨基酸。当氨基酸长度大于约14个氨基酸时，该系列氨基酸被认为是“寡肽”，通常长达约30至40个残基。当氨基酸残基长度超过40个氨基酸残基时，该系列氨基酸残基称为“多肽”。
编码这种分子的肽、寡肽、多肽、蛋白质或多核苷酸是“免疫原性的”，因此如果本公开内容中免疫原能够诱导免疫应答的话。在本公开中，免疫原性更具体地定义为诱导CTL介导的反应的能力。因此，免疫原将是能够诱导免疫应答的分子，并且在本公开中，是能够诱导CTL应答的分子。免疫原可以具有一种或多种具有等效生物和免疫活性的亚型或剪接变体，因此在本公开的目的中也被认为是原始天然多肽的免疫原性等效物。
根据本公开内容，术语“百分比身份”或“同一百分比”，当指代序列时，是指将序列与所要求保护的或描述的序列进行比较，然后将所要求对的序列与所要求比较的序列(“参考序列”)进行比较(“比较序列”)。然后根据以下公式确定标识百分比：
百分比标识＝100[1-(C/R)]
其中C是参考序列和比较序列之间在对照序列和比较序列之间的比对长度上的差异数，其中(i)参考序列中在比较序列中没有相应对齐碱基或氨基酸的每个碱基或氨基酸，以及(ii)参考序列中的每个间隙和(iii)参考序列中的每个对齐碱基或氨基酸与比较序列中的排列碱或氨基酸不同，构成差异；R是参考序列中碱基或氨基酸的数量，与比较序列的比对长度，参考序列中产生的任何间隙也被计为碱基或氨基酸。
本文使用的术语“药物组合物”是指用于预防、降低强度、治愈或以其他方式治疗目标病症、综合征、病症或疾病的组合物。
本文使用的术语“药学上可接受的载体”是指任何基本上无毒的载体，通常可用于施用本公开内容的分离多肽将保持稳定和生物可利用性。药学上可接受的载体必须具有足够高的纯度和足够低的毒性，以使其适合于施用于被治疗的哺乳动物。还应保持活性剂的稳定性和生物利用度。药学上可接受的载体可以是液体或固体，并且被选择，考虑到计划的给药方式，以提供所需的体积，一致性等，当与活性剂和给定组合物的其它组分结合时。
本文使用的术语“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而没有过度毒性，刺激，过敏反应等并且与合理的益处/风险比相称的盐。当用于医学时，盐应该是药学上可接受的，但非药学上可接受的盐可以方便地用于制备其药学上可接受的盐。这些盐包括但不限于从以下酸制备的那些：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺、酒石酸、柠檬酸、甲烷磺酸、甲氨基、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。同样，这种盐可以制备成碱金属或碱土盐，例如羧酸基团的钠盐、钾盐或钙盐。“药学上可接受的盐”是指在合理的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的组织接触而没有过度毒性，刺激，过敏反应等并且与合理的益处/风险比相称的盐。药学上可接受的盐是本领域公知的。例如，P.H.Stahl，等。在“药物盐手册：性质，选择和使用”中详细描述了药学上可接受的盐(Wiley VCH，瑞士苏黎世：2002年)。这些盐可以在最终分离和纯化本公开内容中描述的化合物期间原位制备，或者通过游离碱官能团与合适的有机酸反应而单独制备。代表性的酸加成盐包括但不限于乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑酸盐、葡萄糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、富马酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐(isethionate)、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、帕莫酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐，丙酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，硫氰酸盐，磷酸盐，谷氨酸盐，碳酸氢盐，对甲苯磺酸盐和十一碳酸盐。此外，碱性含氮基团可以用诸如甲基、乙基、丙基和丁酰氯、溴化物和碘化物等低级烷基卤化物等试剂进行季铵化；二烷基硫酸盐，如二甲基，二乙基，二丁基和二戊基硫酸盐；长链卤化物，如癸基，月桂基，肉豆蔻基和硬脂酰氯，溴化物和碘化物；芳基烷基卤化物如苄基和苯乙基溴化物等。由此获得水或油溶性或分散性产品。可采用酸来形成药学上可接受的酸加成盐的实例包括诸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸的无机酸以及诸如草酸、马来酸、琥珀酸和柠檬酸的有机酸。碱性加成盐可以在最终分离和纯化本公开内容中描述的化合物期间通过使含羧酸的部分与合适的碱(例如氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)反应而原位制备，这些碱性加成盐是药学上可接受的金属阳离子，或者与氨或有机伯、仲或叔胺反应。药学上可接受的盐包括，但不限于，基于碱金属或碱土金属的阳离子，如锂、钠、钾、钙、镁和铝盐等以及无毒的季氨和胺阳离子，包括铵、四甲基铵、四乙基铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺等。其它可用于形成碱加成盐的具有代表性的有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶、哌嗪等。药学上可接受的盐也可以使用本领域公知的标准程序获得，例如通过将足够碱性的化合物如胺与提供生理上可接受的阴离子的合适酸反应。碱金属(例如钠、钾或锂)或碱土金属(例如钙或镁)的羧酸盐也可以制成。
术语“部分”，“片段”和“片段”在本文中用于多肽时，是指连续的残基序列，例如氨基酸残基，其序列形成较大序列的子集。例如，如果用任何常见的内肽酶(例如胰蛋白酶或糜蛋白酶)进行治疗，则由这种治疗产生的寡肽将代表起始多肽的部分，片段或片段。当用于多核苷酸时，这些术语是指用内切酶处理所述多核苷酸而产生的产物。
本文使用的术语“预防”是指动物，特别是哺乳动物，尤其是人类，在诱导或发病过程之前暴露于本公开内容的免疫原的预防过程的过程。如果一个人根据活着或前往流感大流行地区而处于任何流感感染的高风险中，则可以这样做。或者，免疫原可以施用于一般人群，就像任何传染病经常做的那样。或者，术语“抑制”通常用于描述其中疾病过程已经开始但所述条件的明显症状尚未实现的病症。因此，个体的细胞可能已被感染，但尚未临床识别出该疾病的外部迹象。在任何一种情况下，“预防”一词都可用于包括预防和抑制。
本文使用的术语“增殖”及其各种语法形式是指导致细胞数量增加的过程，并且由细胞分裂和细胞通过细胞死亡或分化造成的细胞损失之间的平衡来定义。
术语“保护”或“保护”受试者免于患上疾病或免于对本文所述的感染易感性是指部分或完全保护受试者。如本文所用，“充分保护”是指被治疗的受试者不会发展为由诸如病毒、细菌、真菌、原生动物、蠕虫和寄生虫等病原体引起的疾病或感染，或由癌细胞引起的疾病或感染。本文所用的“部分保护”是指受试者的某个子集可以在治疗后得到充分的保护，免于发生疾病或感染，或者受试者不会发展出与未治疗受试者相同严重程度的疾病或感染。
本文使用的术语“保护性免疫应答”或“保护性应答”是指由针对感染因子的抗体介导的免疫应答，其由脊椎动物(例如：，预防或改善感染或减轻至少一种症状。本公开的疫苗可以刺激抗体的产生，例如，中和感染因子，阻止感染因子进入细胞，阻止所述感染因子的复制，和/或保护宿主细胞免受感染和破坏。该术语也可以指由T淋巴细胞和/或其他白细胞介导的对脊椎动物(例如：，一个人)，预防或改善病毒感染或减少至少一种症状。
本文中用于描述核酸分子的术语“重组”是指基因组，cDNA，半合成或合成来源的多核苷酸，由于其起源或操纵：(1)与自然界中与其相关的全部或部分多核苷酸无关；和/或(2)与多核苷酸无关，而不是与自然界中连接的多核苷酸相连。术语“重组”用于蛋白质或多肽是指通过表达重组多核苷酸而产生的多肽。“重组宿主细胞”，“宿主细胞”，“细胞”，“细胞系”，“细胞培养物”和其他表示作为单细胞实体培养的原核微生物或真核细胞系的术语可以互换使用，并且是指可以或已经用作重组载体或其他转移DNA的受体的细胞，并且包括已转染的原始细胞的后代。据了解，由于偶然或故意的突变，单个亲本细胞的后代在形态学或基因组或总DNA补体上不一定与原始亲本完全相同。亲本细胞的后代与亲本细胞的后代足够相似，可以通过相关性质来表征，例如编码所需肽的核苷酸序列的存在，包括在此定义所期望的后代中，并且被上述术语所涵盖。
术语“重组”载体，如本文中使用的DNA质粒、假型慢病毒或逆转录病毒载体，意指其中材料(例如：，核酸或编码蛋白质)已被人为干预人工或合成(非自然)改变。可以在材料的自然环境或状态内或从其自然环境或状态中移除材料上进行更改。具体说来例如：，一种来自流感病毒的蛋白质在通过重组核酸的表达产生时是重组的。例如，“重组核酸”是通过重组核酸制成的，例如：，在克隆或其他程序中，或通过化学或其他诱变；而“重组多肽”或“重组蛋白”是通过表达重组核酸而产生的多肽或蛋白质。重组核酸的一些实施方案包括编码HA、NA和/或蛋白酶的开放阅读框，并且可以进一步包括非编码调节序列和内含子。
本文使用的术语“报告基因”(“报告基因”)或“测定标记”是指可以检测或容易鉴定和测量的基因和/或肽。报告基因的表达可以在RNA水平或蛋白质水平上测量。基因产物，其可以在实验测定方案中检测，包括但不限于标记酶、抗原、氨基酸序列标记、细胞表型标记、核酸序列标记物等。研究人员可以将报告基因附加到细胞培养物，细菌，动物或植物中的另一个感兴趣的基因上。例如，一些报告基因是可选择的标记物，或者赋予表达它们的生物体特征，从而可以很容易地鉴定和测定生物体。为了将报告基因引入生物体，研究人员可以将报告基因和感兴趣的基因放在同一DNA构建体中，以插入细胞或生物体中。对于培养物中的细菌或真核细胞，这可能是质粒的形式。常用的报告基因可包括但不限于荧光蛋白、荧光素酶、β-半乳糖苷酶和可选标记物，如氯霉素和卡诺霉素。
本文使用的术语“可选标记物”是指用表达构建体转化的细胞可以被选择或筛选的各种基因产物，包括耐药性标记物、可用于荧光活化细胞分选的抗原标记物、粘附标记物，例如用于粘附配体的受体允许选择性粘附等。
此处使用的术语“受试者”是指脊索动物亚门的任何成员，包括但不限于人类和其他灵长类动物，包括非人类灵长类动物，如黑猩猩和其他猿类和猴子物种；农场动物，如牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，如狗和猫；实验动物，包括啮齿动物，如小鼠，大鼠和豚鼠；鸟类，包括家养、野生和野禽，如鸡、火鸡等鸳鸟、鸭、雁等。该术语不表示特定的年龄。因此，成人和新生儿都打算被覆盖。上述系统旨在用于上述任何脊椎动物物种，因为所有这些脊椎动物的免疫系统都以类似的方式运作。
本文使用的短语“需要其受试者”是指(i)将根据所述公开施用疫苗的患者，(ii)根据所述公开内容接受疫苗的患者；或(iii)根据所述公开已接种疫苗，除非该短语的上下文和用法另有说明。
本文使用的术语“刺激免疫细胞”或“刺激免疫细胞”是指一个过程(例如：，涉及信号传导事件或刺激)引起或导致免疫细胞的细胞反应，例如激活和/或扩增，例如：一个CD8+T细胞。
本文使用的术语“基本相同”是指对参考氨基酸序列(例如，本文描述的任一氨基酸序列)或核酸序列(例如，本文所述的任何一个核酸序列)表现出至少50％同一性的多肽或核酸分子。例如，这样的序列是至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，或至少99％在氨基酸水平或核酸上与用于比较的序列相同。
序列同一性通常使用序列分析软件(例如，遗传学计算机组的序列分析软件包，威斯康星大学生物技术中心，1710 University Avenue，Madison，Wis.53705，BLAST，BESTFIT，GAP或PILUP/PRETTYBOX程序)进行测量。此类软件通过为各种替换，删除和/或其他修改分配同源度来匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下组中的取代：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。在确定同一度的示例性方法中，可以使用BLAST程序，其概率评分在e-3和e-100之间，指示密切相关的序列。
术语“T淋巴细胞”或“T细胞”可互换使用，以指介导各种免疫功能的细胞，包括帮助B细胞发育成产生抗体的细胞的能力，增加单核细胞/巨噬细胞杀菌作用的能力，抑制某些类型的免疫反应，直接杀死靶细胞，和炎症反应的动员。这些效应取决于它们对特定细胞表面分子的表达和细胞因子的分泌。T细胞识别其他细胞表面的抗原，并通过与这些抗原呈递细胞(APC)的相互作用和改变其行为来介导其功能。T细胞也可以根据其作为辅助T细胞的功能进行分类；参与诱导细胞免疫的T细胞；抑制性T细胞；和细胞毒性T细胞。
本文使用的术语“T细胞抗原”是指可以加工成肽的蛋白质或其片段，该肽可以与I类MHC，II类MHC，非经典MHC或CD1家族分子(统称为抗原呈递分子)结合，并且在这种组合中可以啮合T细胞上的T细胞受体。
本文使用的术语“T细胞表位”是指与I类或II类MHC分子结合并随后被T细胞识别的短肽分子。与I类MHC分子结合的T细胞表位通常长度为8-14个氨基酸，最典型的长度为9个氨基酸。与II类MHC分子结合的T细胞表位通常长度为12-20个氨基酸。在与11类MHC分子结合的表位的情况下，相同的T细胞表位可能共享一个共同的核心片段，但由于肽分子的末端不像在I类MHC分子肽结合裂裂中那样埋在II类MHC分子肽结合裂隙的结构中，因此羧基和氨基末端侧翼序列的长度不同。
本文使用的术语“T细胞介导的免疫应答”是指由于识别与抗原呈递细胞的细胞表面上的抗原呈递分子结合的T细胞抗原而发生的应答，以及T细胞上的共刺激分子与APC之间的其他相互作用。这种反应用于诱导T细胞增殖，迁移和效应分子的产生，包括细胞因子和其他可能损伤细胞的因子。
本文使用的术语“T细胞受体”(TCR)是指参与T细胞响应抗原活化的整膜蛋白的复合物。TCR由大多数由α和β链组成的T细胞表达。一小群T细胞表达由γ和δ链组成的受体。在α/βT细胞中有两个亚系：表达同源受体分子CD4(CD4+细胞)的亚系和表达CD8(CD8+细胞)的亚系。这些细胞在识别抗原的方式以及效应和调节功能方面存在差异。CD4+T细胞是免疫系统的主要调节细胞。它们的调节功能既取决于其细胞表面分子的表达，例如CD40配体，其表达在T细胞被激活时被诱导，以及它们在被激活时分泌的多种细胞因子。细胞因子可能对靶细胞直接有毒，并且可以调动有效的炎症机制。CD8+T细胞可以发育成细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，能够有效地裂解表达CTL识别的抗原的靶细胞。
本文使用的术语“治疗”是指(i)预防感染或再感染(如传统疫苗)中的任何一种，(ii)减轻或消除症状，以及(iii)实质性或完全消除有关病原体。治疗可以是预防性的(感染前)或治疗性的(感染后)。
术语“治疗量”、“治疗有效量”、“有效量”、“有效量”或“药学有效量”的活性剂可互换使用，以指足以提供预期的治疗益处的量。然而，剂量水平基于多种因素，包括损伤类型，年龄，体重，性别，患者的医疗状况，病情的严重程度，给药途径以及采用的特定活性剂。因此，剂量方案可能差异很大，但可以由医生使用标准方法常规确定。此外，术语“治疗量”、“治疗有效量”和“药学上有效量”包括所描述的组合物的预防或预防量。在所述公开的预防性或预防性应用中，药物组合物或药物被施用于易感于或以其他方式有疾病、病症或病症风险的患者，其量足以消除或降低风险，减轻严重程度或延缓疾病、病症或病症的发作，包括该疾病的生化、组织和/或行为症状，疾病或病症，其并发症，以及在疾病，病症或病症发展过程中出现的中间病理表型。通常优选使用最大剂量，即根据某些医学判断的最高安全剂量。术语“剂量”和“剂量”在本文中可互换使用。
本文使用的术语“治疗效果”意指治疗的结果，其结果被判断为是可取的和有益的。治疗效果可以直接或间接地包括阻止，减少或消除疾病表现。治疗效果还可以直接或间接地包括减少或消除疾病表现进展的停滞。
对于本文描述的任何治疗剂，治疗有效量可以从初步确定体外研究和/或动物模型。治疗有效剂量也可以从人类数据中确定。施用的剂量可以根据所施用化合物的相对生物利用度和效力进行调整。根据上述方法和其他公知方法调整剂量以达到最大疗效是在通常熟练的工匠的能力范围内。
确定治疗效果的一般原则，见嘉民和吉尔曼的《治疗学的药理学基础》第10版，McGraw-Hill(纽约)(2001年)，通过引用并入本文，总结如下。
药代动力学原理为修改剂量方案提供了基础，以获得所需程度的治疗效果，同时将不可接受的不良反应降至最低。在可以测量药物的血浆浓度并与治疗窗口相关的情况下，可以获得剂量修饰的额外指导。
如果药物产品含有相同的活性成分，并且在强度或浓度，剂型和给药途径方面相同，则被认为是药物当量。当两种产品中活性成分的生物利用度的速率和程度在合适的测试条件下没有显着差异时，两种药物等效药物产品被认为是生物等效的。
本文使用的术语“治疗窗口”是指在没有不可接受的毒性的情况下提供治疗疗效的浓度范围。在施用一定剂量的药物后，其效果通常显示特征性的时间模式。在药物浓度超过所需效果的最小有效浓度(“MEC”)之前，存在滞后期。在反应开始后，随着药物继续被吸收和分配，效果的强度增加。这达到峰值，之后药物消除导致效应强度下降，当药物浓度回落到MEC以下时，效果强度就会消失。因此，药物作用的持续时间由浓度超过MEC的时间段决定。治疗目标是在治疗窗口内获得并保持浓度，以最小的毒性获得所需的反应。对于期望的效果，低于MEC的药物反应将是亚治疗性的，而对于不良反应，毒性的可能性将增加到MEC以上。增加或减少药物剂量使反应曲线在强度尺度上上下移动，并用于调节药物的作用。增加剂量也会延长药物的作用持续时间，但存在增加不良反应可能性的风险。因此，除非药物是无毒的，否则增加剂量不是延长药物作用持续时间的有用策略。
相反，应给予另一剂量的药物以维持治疗窗口内的浓度。一般来说，药物治疗范围的下限似乎大约等于产生最大可能治疗效果的约一半的药物浓度，并且治疗范围的上限使得不超过约5％至约10％的患者将经历毒性作用。这些数字可能变化很大，一些患者可能从超过治疗范围的药物浓度中受益匪浅，而另一些患者可能在低得多的值下遭受显着的毒性。治疗目标是在治疗窗口内维持稳态药物水平。对于大多数药物，与该期望范围相关的实际浓度不是也不需要知道，并且足以理解疗效和毒性通常是浓度依赖性的，以及药物剂量和给药频率如何影响药物水平。对于导致疗效和毒性的浓度之间存在小(两到三倍)差异的少数药物，已经定义了与有效治疗相关的血浆浓度范围。
在这种情况下，目标水平策略是合理的，其中选择与功效和最小毒性相关的药物的所需目标稳态浓度(通常在血浆中)，并计算出预期达到该值的剂量。随后测量药物浓度，并在必要时调整剂量以更接近靶标。
在大多数临床情况下，药物以一系列重复剂量或作为连续输注给药，以维持与治疗窗口相关的药物的稳态浓度。为了维持所选的稳态或目标浓度(“维持剂量”)，调整药物给药速率，使得输入速率等于损失速率。如果临床医生选择血浆中所需的药物浓度，并且知道该药物在特定患者中的清除率和生物利用度，则可以计算适当的剂量和给药间隔。
本文使用的术语“接种疫苗”是指用疫苗治疗。
本文使用的术语“疫苗接种”是指用疫苗治疗。
本文使用的术语“疫苗”是指一种制剂，其形式能够施用于脊椎动物，并且其诱导保护性免疫反应，足以诱导免疫力，以预防和/或改善感染和/或减少至少一种感染症状和/或增强另一剂量制剂的功效。通常，疫苗包含常规的盐水或缓冲水溶液介质，其中本公开的组合物被悬浮或溶解。在这种形式中，本公开的组合物可以方便地用于预防、改善或以其他方式治疗病毒感染。一旦引入宿主，疫苗能够引起免疫反应，包括但不限于抗体和/或细胞因子的产生和/或细胞毒性T细胞，抗原呈递细胞，辅助性T细胞，树突状细胞和/或其他细胞反应的激活。
本文使用的术语“疫苗疗法”是指一种使用一种物质或一组物质来刺激免疫系统以破坏肿瘤或感染性微生物的治疗。
本文所用的肽或DNA序列的术语“变异”或“衍生物”是指从其原始序列修饰的不相同的肽或DNA序列。序列的差异可能由设计，顺序或结构的变化结果决定。设计更改可以专门设计并引入序列中以用于特定目的。可能会进行此类特定更改体外使用各种诱变技术。这种专门产生的序列变体可以被称为原始序列的“突变体”或“衍生物”。本文所用的关于细胞的术语“变异体”或“衍生物”是指已从其来源细胞系(例如：修饰以表达重组DNA序列)。
本文使用的术语“载体”是指包含可操作地链接到下游基因或编码区(例如：，编码多肽或多肽片段的cDNA或基因组DNA片段)。将载体引入受体细胞(例如：，原核细胞或真核细胞，例如：，细菌、酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞，取决于表达载体内的启动子)或生物体(包括，例如：，人类)允许细胞表达由载体编码的mRNA，然后将其翻译成编码优化的病毒多肽的公开。矢量体外转录/翻译在本领域也是公知的，并在本文中进一步描述。载体可以是基因工程质粒、病毒或人造染色体，来源于：例如：，一种噬菌体、腺病毒、逆转录病毒、痘病毒或疱疹病毒。
本文使用的术语“病毒样颗粒”或“VLP”是指非复制的病毒壳。VLP通常由一种或多种病毒蛋白组成，例如，但不限于那些称为衣壳、包衣、壳、表面和/或包膜蛋白的蛋白，或衍生自这些蛋白的颗粒形成多肽。VLP可以在适当的表达系统中重组蛋白表达时自发形成。生产特定VLP的方法在本领域是已知的，并在下面更全面地讨论。VLP在病毒蛋白重组表达后的存在可以使用本领域已知的常规技术来检测，例如通过电子显微镜、生物物理表征等。看例如：面包师傅等。，生物物理学。J.(1991)60：1445-1456；哈根湖等。，J.维罗尔。(1994)68:4503-4505.例如，VLP可以通过密度梯度离心分离和/或通过特征密度条带(例如：、示例)。或者，可以在所讨论的VLP制剂的玻璃化水样样品上进行冷冻电子显微镜检查，并在适当的曝光条件下记录图像。VLP纯化的其他方法包括但不限于色谱技术，例如亲和力，离子交换，尺寸排除和反相程序。
本文使用的术语“野生型”是指生物体的典型形式，菌株，基因，蛋白质，核酸，或其在自然界中发生的特征。野生型是指自然种群中最常见的表型。术语“野生型”和“自然发生”可以互换使用。
成分
根据一个方面，本公开提供了免疫原或其免疫原性部分，其被设计成针对如本文所述的感染因子的内部CD8+T细胞表位，通过使用感染因子的内部保守蛋白。如本文描述和实施例中更详细地描述的那样，共识氨基酸序列可以例如从Genbank数据库中可用的病毒株中推导出来，并且在氨基酸序列的每个位置具有最高发生频率的氨基酸可以用作该位点的共识氨基酸。因此，所得的蛋白质序列构成了每个位点的共享氨基酸，并且可以使用公开的在线CD8+T细胞表位预测软件进行分析，并且tools.immuneepitope.org/main/tcell/(可在syfpeithi.de在线获得，并在Singh H中描述，等。.(2003)生物信息学；19：1009-1014和穆塔夫齐M，等。(2006)Nat Biotechnol.24：817-819，其中的每一项的内容通过引用并入本文的全文)。然后，可以在优化哺乳动物密码子使用后修改序列。
根据一些实施方案，所述传染因子是属于病毒家族的病毒，但不限于由黄病毒科,副粘病毒科,托加病毒科,丝状体科,正粘病毒科,横纹病毒科和逆转录病毒科.根据一些实施方案，所述病毒来自黄病毒科科选自病毒属黄病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自黄病毒科科选自病毒属肝病毒.根据一些实施方案，来自黄病毒科的病毒选自来自该属的病毒。佩吉病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自黄病毒科科选自病毒属瘟疫病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自副粘病毒科家族是从病毒中选择的肺薇薇儿亚科。根据一些实施方案，所述病毒来自副粘病毒科家族是从病毒中选择的副粘液弧菌亚科。根据一些实施方案，所述病毒来自托加病毒科科属甲型病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自托加病毒科科属鲁比病毒。根据一些实施方案，所述病毒来自托加病毒科科属瘟疫病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自托加病毒科科属动脉病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自丝状体科科属奎瓦病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自丝状体科科属埃博拉病毒(EBOV)。根据一些实施方案，所述病毒来自丝状体科科属马尔堡病毒(马夫)。根据一些实施方案，所述病毒来自正粘病毒科科属甲型流感病毒根据一些实施方案，所述病毒来自正粘病毒科科属乙型流感病毒。根据一些实施方案，所述病毒来自正粘病毒科科属丙型流感病毒。根据一些实施方案，所述病毒来自正粘病毒科科属伊萨病毒。根据一些实施方案，所述病毒来自横纹病毒科科属水疱病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自横纹病毒科科属星表病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自横纹病毒科科属溶血杆菌病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自逆转录病毒科科属甲型逆转录病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自逆转录病毒科科属β逆转录病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自逆转录病毒科科属德尔塔逆转录病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自逆转录病毒科科属厄普西隆逆转录病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自逆转录病毒e科来自该属伽马逆转录病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自逆转录病毒科科属慢病毒.根据一些实施方案，所述病毒来自逆转录病毒科科属斯普马病毒.
示例性保守的病毒蛋白和相应的RefSeq Nos示于表1中，在实施例1A中。需要理解的是，表1仅仅是示例性的，并且在GenBank中公开提供的任何所需病毒的任何内部保守蛋白都可以用于本文描述的方法中。
根据一些实施方案，提供表达免疫原性结构域而不是整个蛋白质的核酸。这些部分(或片段)可以是足以成为免疫原性或抗原性的任何长度。可以使用本文所述的任何测定来确定免疫原性。片段可以是至少四个氨基酸长，或者例如5-9个氨基酸长，但也可以更长，例如例如：10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，30，40，50，60，70，80，90，100，500氨基酸的长度或介于两者之间。诱导对细菌，病毒，真菌或原生动物等病原体的保护性免疫反应的表位可以与编码具有免疫调节活性的蛋白质的异源基因序列结合，例如细胞因子，干扰素1型，γ-干扰素，集落刺激因子，白细胞介素-1，-2，-4，-5，-6，-12。
本文所述的免疫原包括具有氨基酸序列的多肽，其包含保守的CD8+T细胞抗原表位的感染因子根据本文所述的方法生成和选择，其中所述免疫原促进细胞毒性T淋巴细胞(CTL)介导的针对感染该试剂的各种细胞株的免疫应答。本公开还提供了编码多肽的核酸分子，其包括所述表位肽，并且其也可用于促进对受感染细胞的免疫应答。
本公开提供了包含编码本文所述多肽的多肽和核酸分子的组合物，其中寡肽和这种免疫原的多肽能够诱导对表达含有保守CD8+T细胞抗原的蛋白质的CTL反应的细胞，这些蛋白质根据本文所述的方法生成和选择的感染因子的内部抗原的保守CD8+T细胞表位，与I类MHC蛋白结合呈现，其细胞被感染因子的各种菌株感染。或者，本公开的免疫原可用于诱导CTL反应。体外.然后，可以将生成的CTL群体引入由感染因子引起的感染患者体内。或者，生成CTL的能力体外可作为感染因子感染的诊断。
本文中描述的免疫原包括维持与参考免疫原相同的生物活性的片段或其部分。例如，本文所述的免疫原或其片段包含感染因子特异性CD8+表位，其与人MHC I类分子具有高亲和力结合以引发CD8+T细胞反应。
免疫原
使用本文中描述的方法来鉴定和生成靶向保守的T细胞表位的通用疫苗，应该能够免疫广泛的感染因子，例如但不限于下面描述的那些。
根据一些实施方案，免疫原(即，如本文所述的保守免疫原)，通过诱导免疫反应，抑制传染病，例如：，减少或减轻传染病的原因或症状，或提高与传染病相关的参数的值。
根据一些实施方案，本公开的免疫原可以使用通常本领域技术人员公知的方法进行化学合成和纯化。免疫原也可以通过众所周知的重组DNA技术合成。根据一些实施方案，本公开的免疫原性肽和多肽是合成的，或者通过本领域已知的任何手段，包括那些涉及重组DNA技术的技术。
根据一些实施方案，本文所设想的肽的编码序列可以在市售的自动化DNA合成器上合成或修改为所需的氨基酸替换。编码序列可以转化或转染成合适的宿主以产生所需的融合蛋白。
考虑遗传修饰，包括密码子优化，RNA优化和/或添加高效的免疫红蛋白前导序列以增加构建体的免疫原性。
病毒免疫原
根据一些实施方案，本公开的疫苗对正粘病毒科病毒进行免疫。例如，正粘病毒科病毒是流感病毒A、流感病毒B、C型流感病毒或流感病毒D。根据一些实施方案，所述甲型流感病毒为H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3或H10N7。根据一些实施方案，正粘病毒科病毒是禽流感、猪流感、牛流感等的致病因子。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对腺病毒科病毒进行免疫。根据一些实施方案，所述腺病毒科病毒是血管腺病毒，人腺病毒类型为HAdV-1～57，人腺病毒属为HAdV-A至G等。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对副粘病毒科或肺炎病毒科进行免疫。例如，副粘病毒科或肺炎病毒科是麻疹病毒、腮腺炎病毒、人呼吸道合胞病毒、呼吸道合胞病毒、毒性新城疫、副粘液病毒、副流感病毒1、中期肺病毒、禽肺炎病毒和人偏肺病毒等。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对黄病毒科病毒进行免疫。例如，黄病毒科病毒是丙型肝炎病毒、登革热病毒、黄热病病毒、圣路易斯脑炎病毒、日本脑炎病毒、西尼罗河病毒、寨卡病毒、拉克罗斯病毒等。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对Pappilomarviridae或Polymaviridae病毒进行免疫。例如，Papilomarviridae或Polymaviridae病毒是人瘤病毒1-18，人多瘤病毒1-14等。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对疱疹病毒科病毒进行免疫。根据一些实施方案，疱疹病毒科病毒是α疱疹病毒、β疱疹病毒或γ疱疹病毒。例如，甲型疱疹病毒是水痘病毒、单纯病毒、传染性喉气管炎病毒等。例如水痘病毒是水痘-带状疱疹病毒、牛疱疹病毒、马疱疹病毒、伪狂犬病病毒等。例如，单纯疱疹病毒是单纯疱疹病毒1-6等。例如，γ疱疹病毒就是epstin-barr病毒。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对逆转录病毒科病毒进行免疫。例如，逆转录病毒科病毒是慢病毒、逆转录病毒、螺旋体病毒等。例如，慢病毒是人类免疫缺陷病毒1和人类免疫缺陷病毒2。例如，逆转录病毒是哺乳动物B型逆转录病毒、哺乳动物C型逆转录病毒、禽类C型逆转录病毒、D型逆转录病毒组、BLV-HTLV逆转录病毒等。例如，Spumaretrovirinae病毒是spumavirus等。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对横纹病毒科病毒进行免疫。例如，横纹病毒科病毒是水泡病毒、溶菌病毒、星历病毒、细胞横纹病毒和奈克哈布洛病毒等。例如，溶菌病毒就是狂犬病病毒。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对皮克那病毒科病毒进行免疫。例如，Picornaviridae病毒是apthhovirus，心脏病毒，肠道病毒，鼻病毒，肝病毒等。例如，所述阿普索病毒是牛鼻炎病毒、马鼻炎病毒、口蹄疫病毒等。例如，肝病毒是肝病毒A。例如，肠道病毒就是脊髓灰质炎病毒。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对呼肠孤病毒科病毒进行免疫。例如，呼肠孤病毒科病毒是正呼肠孤病毒、奥比病毒、轮状病毒、圆锥病毒、斐济病毒、植物病毒、稻瘟病毒等。例如，轮状病毒是轮状病毒胃肠炎。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对Poxyviridae病毒进行免疫。例如，(例如：、脊索环氧核苷、副痘病毒、阿维波氏病毒、己痘病毒、麻花病毒、穗状病毒、软体动物病毒和昆虫嘧啶类)
根据一些实施方案，本公开的疫苗对肝那病毒科病毒进行免疫。例如，肝那病毒科病毒是乙型肝炎。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对托加韦氏病毒科或马托那韦氏病毒进行免疫。例如，Togaviridae病毒是α病毒或rubivirus。例如，甲型病毒是辛德比斯病毒、委内瑞拉马脑炎病毒等。例如，红斑病毒是基孔肯雅病毒、风疹病毒等。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对沙粒病毒科病毒进行免疫。例如，沙粒病毒科病毒是肾病毒、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒、ippy病毒、拉沙病毒等。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对冠状病毒科病毒进行免疫。例如，冠状病毒科病毒是冠状病毒，托罗病毒，SARs样冠状病毒等。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对丝状病毒进行免疫。例如，Filoviridaefivus是埃博拉病毒，马尔堡马尔堡病毒等。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对汉塔韦病毒科病毒进行免疫。例如，汉塔病毒科病毒就是汉塔病毒。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对利维韦氏病毒进行免疫。例如，Leviviridae病毒是Levivirus，allolevirus等。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对猪病毒进行免疫。例如，猪病毒包括猪轮状病毒、猪细小病毒、牛腹泻病毒、新生儿小牛腹泻病毒、猪霍乱病毒、非洲猪瘟病毒、猪流感病毒等。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对马病毒进行免疫。例如，马病毒包括马流感病毒、马疱疹病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒等。
根据一些实施方案，本公开的疫苗对牛或牛病毒进行免疫。例如，牛病毒包括牛呼吸道合胞病毒、牛副流感病毒、牛病毒腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、口蹄疫病毒、蓬塔托罗病毒等。
根据本公开的一个方面，提供一种抗流感病毒重组载体疫苗，其通过使用抗流感疫苗免疫原或其免疫原片段或其组合在多个不同的载体中表达和构建。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种正粘病毒科的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，正粘病毒科病毒是流感病毒A、流感病毒B、C型流感病毒或流感病毒D。根据一些实施方案，所述甲型流感病毒为H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、H7N7、H1N2、H9N2、H7N2、H7N3或H10N7。根据一些实施方案，正粘病毒科病毒是禽流感、猪流感、牛流感等的致病因子。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种流感病毒内部保守蛋白，选自基质蛋白(M1，M2)、核蛋白(NP)、碱性聚合酶(PB1，PB2)和酸性聚合酶(PA)或其免疫原性片段。根据一些实施方案，本公开提供了广谱抗流感病毒免疫原或其免疫原性片段，或其组合，以及一种免疫方法，其特征在于，该免疫原包括至少一种选自基质蛋白(M1，M2)、核蛋白(NP)、碱性聚合酶(PB1，PB2)和酸性聚合酶(PA)或其免疫原性片段。根据一个实施方案，本公开的免疫原的共识序列可以通过本领域已知的方法和公开文献中找到，例如，在Genbank数据库中，Genbank加入号。JO2132；在航空，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：7639-7643；牛顿等。，1983，病毒学128：495-501；赵、陈、徐建青。迈向通用流感病毒疫苗：从自然感染到疫苗接种策略。第53卷，第1期，2018年，第1–6页，doi：10.1016/j.coi.2018.03.2020；或在达尔林普尔等。，1981年，载于《复制负链病毒》，Bishop and Compans(编辑)，Elsevier，N.Y.，第167页。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种腺病毒科病毒的保守蛋白。例如，腺病毒科病毒是血管腺病毒，人类腺病毒类型为HAdV-1～57，人腺病毒为HAdV-A至G等。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种腺病毒科病毒保守的E1A、E1B、E2、E3、E4、E5、L1、L2、L3、L4、L5蛋白。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种黄病毒科的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，黄病毒是寨卡病毒，登革热病毒等。根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种寨卡病毒保守衣壳蛋白(C)、膜蛋白(prM/M)、包膜蛋白(E)、聚合酶(NS5)或非结构蛋白(NS1、NS2A-B、NS3、NS4A-4B)或其免疫原性片段。黄病毒科病毒家族中保守蛋白的共识序列，例如寨卡病毒，在现有技术中是已知的。共识序列也可以如上文讨论的那样生成，也可以在文献中找到，例如在Shrivastava中等。，“寨卡病毒株的全基因组测序，变异分析，系统发育学和深度测序。性质：科学报告(2018)8：15843其全部通过引用并入本文。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种登革热病毒保守蛋白，例如保守衣壳蛋白(C)、基质蛋白(M)等。黄病毒科病毒家族中保守蛋白的共识序列，例如登革热病毒，在现有技术中是已知的。共识序列也可以如上文讨论的那样生成，也可以在文献中找到，例如，在Genbank加入号中。M19197；或在哈恩等。，(1988)，病毒学162：167-180。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种副粘病毒科或肺炎病毒科的保守蛋白，或其免疫原性片段。例如，副粘病毒或肺炎病毒就是麻疹病毒。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种麻疹病毒保守的内部基质蛋白(M)、核衣壳蛋白(N)、大蛋白(L)、口磷蛋白(P)、腐殖质素(HA)或其免疫原性片段。根据一个实施方案，本公开的免疫原的共识序列可以通过本领域已知的方法和公开文献中找到，例如，在RADECKE F.，BILLETERM.A.(1995)附录：麻疹病毒抗原组和蛋白质共识序列中。在：V.ter Meulen et al(eds)麻疹病毒.微生物学和免疫学的当前主题，第191卷。181-192施普林格，柏林，海德堡；(房委会)Genbank加入号。M81899；或在罗塔等。(1992)，病毒学188：135-142。
在另一个例子中，副粘病毒或肺炎病毒是人呼吸道合胞病毒。根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种保守的糖蛋白(G)、病毒蛋白(VP)、F糖蛋白(FG)或其免疫原性片段。根据一个实施方案，本公开的免疫原的共识序列可以通过本领域已知的方法和公开文献中找到，例如，在Genbank((G)：加入号。Z33429)；和在加西亚等。(1994)J.Virol.；柯林斯等。，(1984)美国国家科学院院刊81：7683)，它们通过引用并入本文。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种帕皮洛马病毒科或多马病毒科的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，状病毒科或多瘤病毒科病毒是人瘤病毒1-18，或人多瘤病毒1-14。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种保守的E1、E2、E3、E4、E5a、E5b、E6、E7、E8、L1、L2蛋白。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种托加病毒科的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，托加病毒是红斑病毒或风疹病毒。根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种风疹病毒保守衣壳蛋白(C)、包膜蛋白(E1，E2)和非结构蛋白(p90和p150)，或其免疫原性片段。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种Filoviridae病毒的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，丝状病毒是埃博拉病毒或马尔堡病毒。根据一些实施方案，本公开的免疫原oi\f包含至少一种埃博拉病毒保守核蛋白(NP)、病毒蛋白(VP35、VP24)、表面糖蛋白(GP)和大聚合酶(L)或其免疫原性片段。根据一个实施方案，本公开的免疫原的共识序列可以通过本领域已知的方法和公开文献中找到，例如，在JUN、SE-RAN、等。Ussery(2015)埃博拉病毒比较基因组学。FEMS微生物学评论，第39卷，第5期，第764-778页。https://doi.org/10.1093/femsre/fuv031；或在哈迪克，J.，等。，(2016)使用微阵列对埃博拉病毒和马尔堡病毒基因组进行测序。J.Med.Virol.88：1303–1308https://doi.org/10.1002/jmv.24487。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种马尔堡病毒保守蛋白，例如至少一种保守核蛋白(NP)、病毒蛋白(VP)、表面糖蛋白(GP)和大聚合酶(L)或其免疫原性片段。根据一个实施方案，本公开的免疫原的共识序列可以通过本领域已知的方法和公开文献中找到，例如在HARDICK，J.等。，(2016)使用微阵列对埃博拉病毒和马尔堡病毒基因组进行测序。J.Med.Virol.88:1303–1308.https://doi.org/10.1002/jmv.24487
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种保存的痘病毒科病毒蛋白或其免疫原性片段。例如，痘病毒就是天花病毒。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种天花病毒保守膜蛋白(A13、A17、A27、A28、A33、B5、D8、H3、L1)或其免疫原性片段。根据一个实施方案，本公开的免疫原的共识序列可以通过本领域已知的方法和公开文献中找到，例如，在森川，S.等。(2005)一种减毒LC16m8天花疫苗：全基因组序列分析和免疫保护诱导。病毒学杂志，第79卷，第18期。11873–11891.doi：10.1128/JVI.79.18.11873–11891.2005.
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种横纹病毒科病毒的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，横纹病毒就是狂犬病病毒。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种狂犬病病毒保守核蛋白(N)、磷酸蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)、大聚合酶(L)或其免疫原性片段。根据一个实施方案，本公开的免疫原的共识序列可以通过本领域已知的方法和公开文献中找到，例如，在TORDO，N.和KOUKNETZOFF，A.(1993)狂犬病病毒基因组：概述中。Onderstepoort Journal of Veterinary Research，60：263-269；或在博鲁基MK，等。(2013)跨物种传播期间宿主内狂犬病病毒群的超深度测序。PLoS Negl Trop Dis 7(11)：e2555。https://doi.org/10.1371/journal.pntd.0002555。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种疱疹病毒科的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，疱疹病毒就是单纯疱疹病毒。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种单纯疱疹病毒保守衣壳蛋白(MCP，SCP)、门静脉蛋白(PORT)和三联单体或二聚体蛋白(TRI1，TRI2)，或其免疫原性片段。在另一示例中，根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种保守的单纯疱疹病毒2型糖蛋白gB、gB、gC、gD和gE、HIV(GP-120，p17、GP-160、gag、po1、qp41、gp120、vif、tat、rev、nef、vpr、vpu、vpx抗原)、核糖核苷酸还原酶、α-TIF、ICP4、ICP8、1CP35、LAT相关蛋白、gB、gC、gD、gE、gH、gI、gJ和dD抗原等。根据一个实施方案，本公开的免疫原的共识序列可以通过本领域已知的方法和公开可用的文献中找到，例如，在Genbank加入中没有。M14923；和在Bzik等。(1986)，病毒学155：322-333。
在另一个例子中，疱疹病毒是伪狂犬病病毒。根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种伪狂犬病病毒保守的g50蛋白(gpD)、gpB、gI11蛋白(gpC)、糖蛋白H、糖蛋白E或其免疫基因片段。
在另一个例子中，疱疹病毒是传染性喉气管炎病毒。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种传染性喉气管炎病毒保守糖蛋白G或糖蛋白1蛋白或其免疫基因片段。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种视网病毒科的保守蛋白。例如，呼肠孤病毒科病毒是轮状病毒，例如轮状病毒胃肠炎。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种保守的轮状病毒胃肠炎糖蛋白、基质蛋白或其免疫基因片段。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种吡考那病毒科的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，皮克纳病毒是口蹄疫病毒。根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种口蹄疫病毒保守衣壳蛋白(P1)、膜蛋白(2B)、解旋酶(2C)、蛋白酶(3C)和聚合酶(3D)或其免疫原性片段。
在另一个例子中，皮克纳病毒是脊髓灰质炎病毒。根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种脊髓灰质炎病毒保守病毒蛋白(VP1)或其免疫基因片段。根据一个实施方案，本公开的免疫原的共识序列可以通过本领域已知的方法和公开文献中找到，例如在Emini中等。(1983)自然304：699。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种肝病毒科的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，肝病毒就是乙型肝炎病毒。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种乙型肝炎病毒保守包膜或表面蛋白(L，M，S)、核心蛋白(C)、X蛋白(X)和聚合酶(P)或其免疫原性片段。在另一个实施方案中，本公开的免疫原包括至少一种乙型肝炎病毒保守型乙型肝炎表面抗原(gp27S、gp36S、gp42S、p22c、po1、x)、乙型肝炎病毒核心蛋白和/或乙型肝炎病毒表面抗原或其免疫遗传片段。根据一个实施方案，本公开的免疫原的共识序列可以通过本领域已知的方法和公开文献中找到，例如，在英国专利公开号中。GB 2034323A1980年6月4日发布；在Ganem和Varmus(1987)Ann.Rev.Biochem。56:651-693；蒂奥莱斯等。，(1985)自然317：489-495；和伊藤等。，(1986)自然308：19；纽拉特等。(1986)疫苗4：34.
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种逆转录病毒科的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，逆转录病毒是人类免疫缺陷病毒。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种人免疫缺陷病毒保守衣壳蛋白(gag)、包膜蛋白(env)、聚合酶蛋白(pol)或蛋白酶蛋白(pro)或其免疫原性片段。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种猪病毒的至少一种保守蛋白。例如，猪病毒包括猪轮状病毒、猪细小病毒、牛腹泻病毒、新生儿小牛腹泻病毒、猪霍乱病毒、非洲猪瘟病毒、猪流感病毒等。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括猪病毒的至少一种保守蛋白，如猪轮状病毒或猪细小病毒保守糖蛋白38、猪衣壳蛋白、沙普氏水生保护性抗原、牛病毒性腹泻糖蛋白55、新生儿小牛腹泻病毒(Matsuno和Inouye(1983)感染和免疫39：155)、霍乱病毒、非洲猪瘟病毒、猪流感：猪流感血凝素和猪流感神经氨酸酶，或其免疫基因组片段。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种马病毒的至少一种保守蛋白。例如，马病毒包括马流感病毒、马疱疹病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒等。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括马病毒如马流感病毒或马疱疹病毒的至少一种马保守蛋白：马流感病毒A型/阿拉斯加91型神经氨酸酶、马流感病毒A型/迈阿密63型神经氨酸酶、马流感病毒A型/肯塔基81型神经氨酸酶、马疱疹病毒1型糖蛋白B，和马疱疹病毒1型糖蛋白D，或其免疫基因片段。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种牛病毒的至少一种保守蛋白。例如，牛病毒包括牛呼吸道合胞病毒、牛副流感病毒、牛病毒腹泻病毒、传染性牛鼻气管炎病毒、口蹄疫病毒、蓬塔托罗病毒等。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种牛病毒的保守蛋白，如牛呼吸道合胞病毒或牛副流感病毒：牛呼吸道合胞病毒附着蛋白(BRSVG)、牛呼吸道合胞病毒融合蛋白(BRSV F)、牛呼吸道合胞病毒核衣壳蛋白(BRSV N)、牛副流感病毒3型融合蛋白，以及牛副流感病毒3型血凝素神经氨酸酶)、牛病毒腹泻病毒糖蛋白48或糖蛋白53、传染性牛鼻气管炎病毒：传染性牛鼻气管炎病毒：传染性牛鼻气管炎病毒糖蛋白E或糖蛋白G、口蹄疫病毒、蓬塔托罗病毒(Dalrymple等。，1981年，载于《复制负链病毒》，Bishop和Compans(编辑)，Elsevier，N.Y.，第167页)，或其免疫基因组片段。
如本文所讨论的，根据一些实施方案，本公开的保守蛋白质被表示为包含病原体抗原序列的保守序列，其通过实现最高程度的保护来选择，从而避免同时施用中和抗体表位。此外，这些序列必须能够承受高突变率和新的遗传变异，这些变异对针对早期病原体亚型产生的免疫反应具有抗性，并破坏由改变的肽配体现象产生的免疫反应，如本文所述。因此，根据一些实施方案，本文所利用的保守蛋白质序列将被生成以克服病原体基因组变异。此外，根据一些实施方案，本文中使用的保守蛋白质序列还将被生成以实现对具有多种菌株、变体、组(分支、血清型或亚型)的病原体的交叉保护，以及对相关致病菌种、相关致病属和/或相关致病家族的交叉保护。
根据一些实施方案，保守序列表示为本发明中使用的共识序列，是通过衍生自不同菌株、变异、组、分支、血清型、亚型、种、属和/或科的病原体保守蛋白的多个序列比对生成的。
细菌免疫原
根据一些实施方案，抗原或免疫原性蛋白质片段或表位可衍生自致病细菌，包括但不限于：
炭疽
衣原体：衣原体蛋白酶样活性因子(CPAF)，主要外膜蛋白(MOMP)
分枝杆菌
军团菌：军团菌肽聚糖相关脂蛋白(PAL)、mip、鞭毛、OmpS、hsp60、主要分泌蛋白(MSP)
白喉：白喉毒素(奥迪伯特等。，1981年，《自然》289：543)
链球菌24M表位(Beachey，1985，Adv.Exp.Med.Biol.185：193)
淋球菌：淋球菌皮林(Rothbard和Schoolnik，1985，Adv.Exp.Med.Biol.185：247)，
支原体：支气管支原体。
结核分枝杆菌：结核分枝杆菌抗原85A，85B，MPT51，PPE44，分枝杆菌65-kDa热休克蛋白(DNA-hsp65)，6-kDa早期秘书抗原靶标(ESAT-6)
伤寒沙门氏菌
炭疽杆菌B.炭疽病保护性抗原(PA)
鼠疫耶尔森菌：鼠疫低钙反应蛋白V(LcrV)，F1和F1-V融合蛋白
土拉弗朗西斯菌
伤寒立克次体
梅毒螺旋体。
沙门氏菌：SpaO和H1a，外膜蛋白(OMPs)；
假单胞菌：铜绿假单胞菌OMPs，PcrV，OprF，OprI，PilA和突变的ToxA
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种角藻科细菌的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，角膜细菌是白喉角膜杆菌。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种白喉角质杆菌保守白喉毒素(tox)、白喉毒素抑制剂(dtxR)、pilin蛋白(spaA、spaB、spaC)或其免疫原性片段。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种保守的分枝杆菌科细菌蛋白或其免疫原性片段。例如，分枝杆菌科细菌是结核分枝杆菌。根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种Se蛋白(secA)。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种芽孢杆菌科细菌的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，杆菌细菌是炭疽杆菌.根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一个炭疽杆菌保守胶囊蛋白(capA)、s层蛋白(例如，sap或EA1)、毒力蛋白(例如，pX01，px02)和σ蛋白(例如，PA，ECF)或其免疫原性片段。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种耶尔森菌科细菌的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，耶尔森氏菌细菌就是鼠疫耶尔森氏菌。根据一些实施方案，本公开的免疫原包括至少一种鼠疫耶尔森菌保守外膜蛋白(bamA，Yops)、内杆蛋白(Yscl)、毒力蛋白(Lcru)或针状蛋白(YscF)或其免疫原性片段。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种肠杆菌科细菌的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，肠杆菌是肠道沙门氏菌血清伤寒.根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种保守的外膜蛋白(例如，STIV，Tolc)、毒力蛋白(例如Vi)、噬菌体蛋白、闭塞毒素家族蛋白(例如，Zot)或其免疫原性片段。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种立克次体细菌的保守蛋白或其免疫原性片段。例如，立克次体细菌是立克次体前期细菌。
真菌免疫原
根据一些实施方案，抗原或免疫原性蛋白片段或表位可衍生自致病真菌，包括但不限于：
球孢子菌炎：球孢子菌Ag2/Pra106，Prp2，磷脂酶(P1b)，α-甘露糖苷酶(Amn1)，天冬氨酰蛋白酶，凝胶
皮炎芽孢菌：皮炎芽生菌表面粘附素WI-1
新型隐球菌：新型隐球菌GXM及其肽类，以及甘露蛋白，隐孢子虫表面蛋白gp15和gp40，Cp23抗原，p23
白假丝酵母,
曲霉种类：曲霉菌Asp f 16，Asp f 2，Der p 1，和Fel d 1，棒状A，PEP2，曲霉菌HSP90，90-kDa过氧化氢酶
原生动物免疫原
根据一些实施方案，抗原或免疫原性蛋白片段或表位可衍生自致病性原生动物，包括但不限于：
恶性疟原虫,间日疟原虫,卵形疟原虫,疟原虫，疟原虫顶膜抗原1(AMA1)，25-kDa性阶段蛋白(Pfs25)，红细胞膜蛋白1(PfEMP1)环孢子体蛋白(CSP)，裂殖子表面蛋白-1(MSP1)
利什曼原虫种类：利什曼原虫半胱氨酸蛋白酶III型(CPC)
锥体虫物种(非洲和美洲)：苍白锥虫外膜脂蛋白，锥虫β-微管蛋白(STIB 806)，微管相关蛋白(MAP p15)，半胱氨酸蛋白酶(CP)
隐孢子虫，
等孢子虫种，
Naegleria fowleri,
棘阿米巴物种
巴拉穆蒂亚曼德里拉里斯,
弓形虫或
卡里尼肺孢子虫：卡氏肺孢子虫主要表面糖蛋白(MSG)，p55抗原
巴贝西亚
血吸虫病：曼氏血吸虫病Sm14，21.7和SmFim抗原，Tegument蛋白Sm29，26kDa消费税，日本血吸虫、SjCTPI、SjC23、Sj22.7或SjGST-32
弓形虫病：弓形虫表面抗原1(TgSAG1)，蛋白酶抑制剂-1(TgPI-1)，表面相关蛋白MIC2，MIC3，ROP2，GRA1-GRA7。
根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种等离子体科寄生虫的保守蛋白。例如，疟原虫是恶性疟原虫。根据一些实施方案，本公开的免疫原包含至少一种保守的环孢子体蛋白(CS)蛋白和血栓自联蛋白相关的粘附蛋白(TRAP)或其免疫原性片段。
T细胞表位预测
T细胞识别由自身部分(I类MHC)和外来部分(短肽)组成的表位。已知T细胞表位的外来肽部分由长度在8至11个残基之间的肽组成。简而言之，T细胞表位可以从分解病原体样本以测试T细胞对各种肽的活化，或者通过生物信息学工具预测病原体的T细胞表位来获取。
生物信息学工具
如上文所述和本领域已知的(例如在Khan中)等。，“一种系统生物信息学方法，用于选择基于表位的疫苗靶标。细胞免疫.(2006年)12月；244(2):141–147；和索里埃拉-格拉，等。，(2015)“用于表位预测的生物信息学工具概述：对疫苗开发的影响”。生物医学信息学杂志53:405–414；其全部通过引用并入本文)T细胞免疫应答是由与细胞膜表达的MHC分子结合的外来肽抗原的识别触发的.由于T细胞识别仅限于MHC分子呈现的那些肽，因此预测可以与MHC分子结合的肽是预测T细胞表位与MHC分子结合的基础，这些分子必须适合由MHC分子中的多态残基调节的特定化学和物理环境。因此，不同的MHC分子具有不同的肽结合特异性。此外，与同一MHC分子结合的肽通过序列相似性相关。反映肽-MHC结合剂(锚定残基)中氨基酸偏好的序列模式通常用于定义肽-MHC结合基序和预测肽-MHC结合。该数据在本领域是已知的，并且已被收集到包含MHC肽基序，MHC配体，T细胞表位以及MHC分子的氨基酸序列的数据库中。
数据库可以用作预测实验结果的预测工具，例如MHC I类或II类结合，以及MHC I类处理和免疫原性。T细胞处理预测将MHC结合与MHC I类细胞途径的其他部分(即蛋白酶体裂解和TAP转运)相结合，并从独立的实验数据集中生成。还有一些在洗脱的MHC配体上训练的预测因子，它们提供来自MHC结合和MHC处理呈递途径的信号的叠加。与单独使用MHC结合预测相比，处理预测工具在准确性方面提供了相对较小但具有统计学意义的显着提高。
结合预测方法有助于潜在表位的选择。本领域可用的方法是利用不同MHC等位基因的实验肽结合数据来训练机器学习算法，而机器学习算法又可用于预测任意肽的结合可能性或结合亲和力。
给定肽序列的亲和结合的预测和测量可以通过例如评分基质的计算来分析。通常，基质是使用已知结合剂不同位置的氨基酸频率或定量MHC结合数据构建的。前者表示肽序列与MHC分子的结合可能性，而后者则提供了量化肽结合亲和力的方法。在结合亲和力评分矩阵中，基于氨基酸及其在结合槽中的位置计算序列的结合亲和力。序列中每个残基的值相加，以产生整个序列的整体结合。通过改变基质的值来推导出特定于位置的评分基质，直到已知的，测量的肽的总和接近测量的亲和力。通过对矩阵系数求和、乘以或求平均值，并与预定阈值进行比较，获得共识分数。阈值已预先确定并校准到预测工具中，以实现机器学习。
MHC I类结合预测生成
可以使用单个或多个不同的预测算法搜索肽结合数据集，包括许多公开可用的预测网站，例如SYFPEITHI(在http://syfpeithi.de/BMI-AInfos.html找到)和BIMAS(在http://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/hla_bind/找到)，其中计算测量的结合亲和力评分与每种算法的预测评分(SYFPEITHI的启发式评分或BIMAS的结合评分的半衰期)之间的相关性。结合亲和力评分是MHC与分离肽之间的亲和力，通常表示为IC50浓度，IC50值低，意味着高亲和力结合剂。
结合亲和力阈值校准
阈值将允许计算真阴性、真阳性、假阴性和假阳性数。通过系统地将预测的分数阈值从低变为高，真阳性和假阳性的比率将计算为阈值的函数，以推导出ROC(接收器工作特性)曲线。此ROC曲线下的面积是AUC值。AUC值独立于预测尺度，因为它比较矩阵的秩，并且独立于数据集的组成，例如具有不同比例的粘合剂和非粘合剂。AUC值本质上是捕获给定两种肽(一种是粘合剂，另一种是非粘合剂)的概率，与非粘合剂相比，粘合剂的预测分数会更高。AUC值0.5等效于随机预测，值1.0等效于完美预测。
表位选择
选择潜在粘合剂有三种主要策略。第一种涉及选择IC50值(意味着一半最大抑制浓度，这是效力的量度，(即，与参考标准相比，产生给定强度的抑制作用所需的量)小于500nM的所有肽，这是先前与免疫原性相关的阈值。第二种策略是为每个等位基因/长度组合选择前1％的肽。第三种策略是选择百分位数等级低于1％的肽。
疫苗
根据某些方面，本公开提供了通过提供蛋白质和遗传构建体而产生的疫苗，这些蛋白质和基因构建体编码具有保守的内部CD8+T细胞表位的蛋白质，这些蛋白质和遗传构建体使它们作为免疫原特别有效，可以诱导针对各种病毒的免疫应答。根据一些实施方案，疫苗可以被提供以诱导治疗或预防性免疫应答。
根据一些实施方案，递送免疫原的装置是DNA疫苗、重组疫苗、蛋白质亚单位疫苗、包含免疫原的组合物、减毒疫苗或杀灭疫苗。根据一些实施方案，该疫苗包括选自一种或多种DNA疫苗的组合、一种或多种重组疫苗、一种或多种蛋白质亚单位疫苗、一种或多种包含免疫原的组合物、一种或多种减毒疫苗和一种或多种被杀死的疫苗。
根据一些实施方案，根据公开的疫苗可以递送到个体以调节个体免疫系统的活性，从而增强对病毒、细菌、真菌或原生动物感染的免疫应答。当编码蛋白质的核酸分子被个体的细胞吸收时，核苷酸序列在细胞中表达，从而将蛋白质传递给个体。
根据一些实施方案，重组疫苗是通过使用具有上述免疫原的多个不同疫苗载体构建的，并且每个免疫接种依次接种不同的重组载体疫苗。每种重组疫苗至少接种一次，疫苗接种计划包括至少一次呼吸道免疫和一次全身免疫。重组载体疫苗和接种方法的结合可以在呼吸系统和全身系统中实现高水平的T细胞免疫反应，从而使疫苗接受者获得对不同亚型病毒的免疫力。
根据一些实施方案，提供了组合物和方法，其对个体进行预防性和/或治疗性免疫选自的病毒家族，但不限于由黄病毒科、副粘病毒科、托加病毒科、丝裂病毒科、正粘病毒科、横纹病毒科和逆转录病毒科.
病毒载体疫苗
根据一些实施方案，减毒的、复制缺陷的病毒如牛痘病毒用于递送本文所述的外源性病毒、细菌、真菌或原生动物免疫原，其量有效地诱导或刺激细胞介导的免疫应答。如本文所述，任何一种或多种感兴趣的免疫原都可以插入到本文所述的病毒载体中。
痘病毒载体
由于痘病毒具有较大的基因组，因此它们可以很容易地用于递送广泛的遗传物质，包括多个基因(即，充当多价向量)。痘病毒基因组的大小范围从约130kbp到约300kbp(包括在内)，最多有300个基因，具体取决于病毒株。因此，可以将大片段的外源DNA插入这些病毒中，同时保持病毒基因组的稳定性。
痘病毒是一系列用途的有用载体，例如产生免疫反应的疫苗，开发新疫苗，输送所需蛋白质和基因治疗。痘病毒载体的优点包括：(i)易于生成和生产，(ii)基因组的大尺寸允许插入多个基因(即作为多价载体)，(iii)将基因有效地递送到多种细胞类型，包括抗原呈递细胞，(iv)高水平的蛋白质表达，(v)抗原向免疫系统的最佳呈递，(vi)引发细胞介导的免疫反应以及抗体反应的能力，(vii)使用来自不同属的痘病毒组合的能力，因为它们在免疫学上不是交叉反应的，以及(viii)在人类中将这种载体用作天花疫苗所获得的长期经验。
痘病毒是众所周知的细胞质病毒。这种病毒载体表达的遗传物质通常保留在细胞质中，除非采取特定步骤，否则不会无意中将遗传物质整合到宿主细胞基因中。由于痘病毒的非整合细胞质性质，痘病毒载体系统不会导致在其他细胞中长期存在。因此，载体和转化的细胞不会对宿主动物中远离靶细胞的位置的细胞产生不利影响。此外，痘病毒的大基因组使大基因能够插入基于痘的载体中。
痘病毒可以被基因工程改造，以包含和表达异源DNA，无论是否损害病毒的复制能力。根据一些实施方案，DNA编码一种或多种使用本文所述的方法测定的免疫原。根据一些实施方案，这种异源DNA可以编码广泛的蛋白质，例如诱导对一种或多种感染因子的保护的抗原，免疫调节蛋白质例如共刺激分子，或酶促蛋白质。
根据一些实施方案，本文中描述的疫苗组合物是基于痘病毒载体的。
许多痘病毒已被开发为表达异源蛋白的活病毒载体，例如减毒的牛痘病毒株修饰的牛痘安卡拉(MVA)和惠氏(Cepko等人，(1984)Cell 37：1053 1062；Morin et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：4626 4630；Lowe et al.，(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84：3896 3900；Panicali&Paoletti，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：4927 4931；Mackett et al.，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：7415 7419)。其他减毒的牛痘病毒株包括WR毒株，NYCBH毒株，ACAM2000，李斯特毒株，LC16 m8，Elstree-BNm，Copenhagen毒株和Tiantan毒株。
牛痘病毒是正痘病毒属的原型。它是一种双链DNA(脱氧核糖核酸)病毒，在实验条件下具有广泛的宿主范围(Fenner等人，1989年正痘病毒)。加利福尼亚州圣地亚哥：学术出版社；Damaso et al.，(2000)Virology 277：439-49)。改良的牛痘病毒安卡拉(MVA)或其衍生物是由安卡拉牛痘病毒株(CVA)在鸡胚胎成纤维细胞上长期连续传代而产生的(有关综述，见Mayr，A.等人，(1975)Infection，3：6-14。MVA病毒本身可以从许多公共存储库来源获得。例如，MVA是按照《布达佩斯条约》的要求，于1987年12月15日根据第1-721号保存人(美国专利号5,185,146号)存入CNCM(巴斯德研究所，国家微生物菌种收藏，25，rue duDocteur Roux，75724 Paris Cedex 15)；MVA病毒于1994年1月27日在欧洲细胞培养物收藏(ECACC)(CAMR，Porton Down，Salisbury，SP4 OJG，UK)的《布达佩斯条约》中沉积，保存编号为。V94012707)(美国专利号6,440,422和美国专利公开号2003/0013190)。此外，美国专利公开号2003/0013190进一步公开了在ECACC根据99101431号保存和ECACC临时加入号01021411存放的特定MVA菌株。市售载体包括THERION-MVA，THERION PRIFREE载体和THERION M系列载体(Therion Biologics Corporation，MA)。
MVA是由安卡拉牛痘病毒株(CVA)的鸡胚成纤维细胞的516个连续传代产生的(Mayr，A.等人[1975]感染3，6-14)。由于这些长期传代，从病毒中删除了大约31千个基因组序列碱基(删除I，II，III，IV，V和VI)，因此，由此产生的MVA病毒被描述为高度宿主细胞仅限于禽类细胞(Meyer，H.等人，[1991]J.Gen.Virol.72，1031-1038)。在各种动物模型中显示，所得的MVA具有显着的无毒性(Mayr，A.和Danner，K.[1978]Dev.Biol.Stand.41：225-34)。此外，这种MVA菌株已在临床试验中作为疫苗进行了测试，以免疫人类天花病(Mayr等人，[1987]Zbl.Bakt。海格。I，Abt.Org.B 167，375-390，Stickl et al.，[1974]Dtsch.med.Wschr.99，2386-2392)。这些研究涉及超过120,000人，包括高危患者，并证明与基于牛痘的疫苗相比，MVA在诱导良好特异性免疫反应的同时，其毒力或传染性降低。一般来说，如果病毒株已经失去其能力或仅在宿主细胞中生殖复制的能力降低，则该病毒株被视为减弱。
由于野生型VV和MVA的基因组都已测序，因此有可能克隆在复制特性方面与MVA具有一些相似之处的病毒，但在遗传上与MVA不同。这些可能具有相同的目的，或者可能比MVA更具免疫原性，同时由于其复制缺陷而同样安全。
根据一些实施方案，与野生型病毒相比，该病毒具有5％或更低的复制能力，或1％或更低。非复制病毒在正常原代人类细胞中100％缺乏复制。
病毒复制测定在本领域是已知的，并且可以对例如原代角质形成细胞上的牛痘病毒进行，并且在Liu等人J.Virol中进行了描述。2005,79:12,7363-70.非复制或复制受损的病毒可能已经变得如此自然(即它们可以从自然界中分离出来)或人为地，例如通过体外繁殖或遗传操作，例如删除对复制至关重要的基因。通常会有一种或几种可以生长病毒的细胞类型，例如用于MVA的CEF细胞。
根据一些实施方案，病毒的变化包括，例如，病毒的基因表达谱的改变。根据一些实施方案，修饰的病毒可以表达编码痘病毒外来的肽或多肽的基因或部分基因，即它们不会在野生型病毒中发现。这些外源、异源或外源性肽或多肽可以包括具有免疫原性的序列，例如细菌、病毒、真菌和原生动物抗原，或衍生自病毒载体以外的病毒的抗原序列。遗传物质可以插入病毒基因组内的适当位点以使重组病毒保持活力，即遗传物质可以插入病毒DNA中的某个位点(例如，病毒DNA中的非必需位点)，以确保重组病毒保留感染外来细胞和表达DNA的能力，同时保持所需的免疫原性和降低的毒力。例如，如上所述，MVA包含6个自然缺失位点，这些位点已被证明可用作插入位点。参见，例如，美国专利5,185,146号和美国专利6,440,422号，通过引用并入本文。根据一些实施方案，编码所需抗原的基因入到痘病毒的基因组中，其方式是允许它们与亲本病毒蛋白的正常补体的表达一起由该病毒表达。
修饰的痘病毒在靶细胞中具有较低的复制效率，这可以防止其他细胞的持续复制和感染。根据一些实施方案，修饰的痘病毒还可以改变有关病毒生命周期方面的特征，例如靶细胞特异性、感染途径、感染率、复制率、病毒粒子组装率和/或病毒传播速率。
根据一些实施方案，使用本文所述的方法确定的编码免疫原的插入基因可以操作地与启动子连接以表达插入的基因。启动子在本领域是公知的，并且可以很容易地根据宿主和细胞类型来选择。例如在痘病毒中，可以使用痘病毒启动子，如牛痘7.5K，40K，禽痘。在某些实施方案中，增强子元件也可以组合使用以增加表达水平。在某些实施方案中，可以使用可诱导的启动子，其在本领域也是公知的。代表性的痘病毒启动子包括昆虫促进剂、avipox启动子或正痘启动子，例如牛痘启动子，例如HH、11K或Pi。例如，来自牛痘的Ava I H区的Pi启动子在Wachsman等人，J.of Inf.Dis.155，1188-1197(1987)中进行了描述。该启动子来源于L变体WR牛痘菌株的Ava I H(Xho I G)片段，其中启动子从右向左定向转录。启动子的图谱位置距离Ava IH的5′端约1.3Kbp(千碱基对)，距离牛痘基因组的5′端约12.5Kbp，来自Hind III C/N交界处约8.5Kbp 5′。Hind III H启动子(本文中也称为“HH”和“H6”)序列是Rosel等人(1986)J.Virol的开放阅读框架H6的上游。60,436-449.11K启动子由Wittek(1984)J.Virol描述。[49，371-378]and Bertholet，C.et al.，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，2096-2100)。人们可以利用启动子是特定基因的早期还是晚期启动子。
根据一些实施方案，本文中描述的疫苗组合物是基于牛痘病毒载体的。根据一些实施方案，所述牛痘病毒载体为牛痘病毒天坛株(疫苗病毒天坛株，VTT)。牛痘病毒天坛毒株自20世纪20年代被中国科学家分离出来以来，作为天花疫苗在中国被广泛接种，并最终在中国消灭了天花。天坛菌株接种次数达到十多亿，其安全性已长期得到充分实践验证。天坛毒株疫苗的副作用发生率明显低于国际上使用的其他天花疫苗株，包括近年来美国生物恐怖主义中使用的纽约毒株。天坛牛痘载体具有广的宿主范围，高繁殖滴度，诱导免疫反应非常持久，并且插入外来基因的能力极大，理论上可达25-50kb。天坛菌株载体安全性高，免疫原性好，在体内能诱导较强的体液免疫和细胞免疫，免疫反应的持续时间远长于非复制载体。
根据一些实施方案，启动子由外部因素或提示调节，允许通过激活该外部因素或提示来控制由载体产生的多肽的水平。例如，热休克蛋白是由基因编码的蛋白质，其中启动子受温度调节。编码含金属蛋白金属硫氨酸的基因的启动子对Cd+离子有反应。掺入该启动子或受外部线索影响的另一启动子也使得能够调节包含抗原的多肽的产生。
根据一些实施方案，编码至少一个目的基因编码的核酸，例如本文所述的免疫原，可操作地与“可诱导”启动子相关联。诱导系统允许仔细调节基因表达。参见，Miller和Whelan，人类基因治疗，8：803-815(1997)。本文中使用的短语“可诱导启动子”或“诱导系统”包括其中可以使用外部递送的试剂调节启动子活性的系统。例如，这种系统包括使用来自大肠杆菌的lac抑制因子作为转录调节剂来调节来自携带lac操作者的哺乳动物细胞启动子的转录的系统(Brown等人，Cell，49：603-612，1987)；使用四环素抑制器的系统(tetR)(Gossen和Bujard，1992Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：5547-5551；Yao et al.，1998HumanGene Ther.9:1939-1950,；Shokelt等人，1995Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92.6522-6526)。其他此类系统包括FK506二聚体，VP16或p65使用castradiol，RU486/mifepristone，二酚muristerone或雷帕霉素。另一个例子是蜕皮松诱导系统(参见，例如Karns等人，2001 MBCBiotechnology 1：11，)。提供诱导系统，例如，来自Invitrogen，Clontech和Ariad。最好使用带有操纵子的抑制器的系统。这些启动子可以通过用部分痘痘启动子代替哺乳动物启动子来适应。
根据一些实施方案，引入“转录调节元件”或“TRE”用于调节目的基因。TRE是一种多核苷酸序列，优选DNA序列，它通过RNA聚合酶调节可操作连接的多核苷酸序列的转录以形成RNA。TRE增加宿主细胞中可操作连接的多核苷酸序列的转录，从而使TRE发挥作用。TRE包括增强子元件和/或病毒启动子元件，其可能来自也可能不来自同一基因。TRE的启动子和增强子组分可以处于任何方向和/或距目标编码序列的距离，并且只要获得所需的转录活性，就包含前述的多聚体。
根据一些实施方案，提供用于调节目的基因的“增强子”。增强子是一种衍生自基因的多核苷酸序列，该基因增加与启动子可操作连接的基因的转录，其程度大于启动子本身在与基因可操作连接时产生的转录激活，即它增加了启动子的转录。
调节元件(如TRE或增强剂)的活性通常取决于转录调节因子的存在和/或转录调节抑制剂的缺失。转录活化可以用本领域已知的许多方式来测量，但通常通过检测和/或定量mRNA或编码序列的蛋白质产物来测量(即，操作上与调节元件相连)。调节元件可以是不同的长度，也可以是不同的序列组成。通过转录活化，旨在使转录将在靶细胞中的基础水平以上增加至少约2倍，优选至少约5倍，优选至少约10倍，更优选至少约20倍。更优选至少约50倍，更优选至少约100倍，甚至更优选至少约200倍，甚至更优选至少约400-至约500倍，甚至更优选，至少约1000倍。基础水平通常是非靶细胞中的活性水平(如果有)，或者报告基因构建体的活性水平(如果有)，如在靶细胞类型中测试的那样缺乏感兴趣的TRE或增强子。
TREs序列中的某些点突变会降低转录因子结合和基因激活。本领域技术人员将认识到，已知转录因子结合位点内和周围的碱基的某些改变更有可能对基因活化和细胞特异性产生负面影响，而不参与转录因子结合的碱基的改变则不太可能具有这种效应。某些突变也会增加TRE活性。改变碱基的效果的测试可以通过本领域已知的任何方法在体外或体内进行，例如迁移率转移测定，或在TRE功能细胞和TRE非功能细胞中转染含有这些改变的载体。此外，本领域技术人员将认识到，可以在不改变序列调节转录的能力的情况下对TRE序列进行点突变和缺失。
腺病毒载体
腺相关病毒(AAV)是一种缺乏复制的细小病毒，其单链DNA基因组的长度约为4.7kb，包括145个核苷酸倒置末端重复序列(ITRs)。AAV血清型2(AAV2)基因组的核苷酸序列在Srivastava中呈现等。，(1983)J.Virol.，45：555-564，由Ruffing更正等。，(1994)J.Gen.Virol.，75：3385-3392.指导病毒DNA复制(rep)，封装/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在ITRs中。三个AAV启动子，p5，p19和p40(以其相对地图位置命名)，驱动编码代表和帽基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。两个重复启动子(p5和p19)加上单个AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)，导致从重复基因产生四种重复蛋白(Rep 78，Rep 68，Rep 52和Rep 40)。Rep 78和Rep 68分别从p5启动子处启动的未单剪和剪接转录本中表达，而Rep 52和Rep 40分别从p19启动子处启动的未拼接和剪接转录本中表达。Rep蛋白具有多种酶促特性，最终负责复制病毒基因组。Rep 78和68似乎参与AAV DNA复制和调节AAV启动子，而Rep 52和40似乎参与单链AAV DNA的形成。帽基因由p40启动子表达，它编码三种衣壳蛋白VP1，VP2和VP3。选择性剪接和非共识翻译起始位点是三种相关衣壳蛋白的产生。单个共识聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95。AAV的生命周期和遗传学在Muzyczka，(1992)微生物学和免疫学的当前主题，158：97-129中进行了综述。
当野生型AAV感染人类细胞时，病毒基因组可以整合到19号染色体中，导致细胞的潜在感染。除非细胞感染了辅助病毒(例如腺病毒或疱疹病毒)，否则不会产生感染性病毒。在腺病毒的情况下，基因E1A，E1B，E2A，E4和VA提供辅助功能。感染辅助病毒后，AAV前病毒被拯救和扩增，并产生AAV和腺病毒。
AAV具有独特的功能，使其在临床应用中将DNA递送到细胞方面具有吸引力，例如，作为基因治疗载体或免疫载体。培养物中细胞的AAV感染是非细胞病性的，人类和其他动物的自然感染是无症状和无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，允许在体内靶向许多不同的组织。AAV前病毒基因组作为质粒中的克隆DNA具有传染性，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导AAV复制、基因组封装和整合的信号包含在AAV基因组的ITRs中，基因组内部约4.3kb的部分或全部(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以被外源DNA取代，例如含有启动子的基因盒，感兴趣的DNA和聚腺苷酸化信号。所述代表蛋白和帽状蛋白可在反式中提供。AAV的另一个重要特征是它是一种非常稳定和丰盛的病毒。它很容易承受用于灭活腺病毒的条件(56°至65℃，持续数小时)，使AAV载体的冷保存不那么重要。AAV甚至可以冻干。最后，AAV感染的细胞对二重感染没有抵抗力。
rAAV的生产需要AAV rep78/68和rep52/40基因及其基因产物的表达，两侧是AAVITRs的靶向DNA，AAV辅助病毒提供的帮助器功能，以及包含这些成分的细胞系，该细胞系允许AAV复制。辅助病毒功能的例子是腺病毒基因E1，E2A，E4和VA(Carter，腺相关病毒辅助功能。(1989)在“细小病毒手册”第一卷(P.Tjissen，编辑)中CRC出版社，博卡拉顿，第255-282页)。野生型AAV(wt AAV)在AAV和腺病毒感染细胞后，是所有病毒中爆发量最大的病毒之一。这可能远远超过每个细胞100,000个颗粒(Aitken等。，2001Hum Gene Therapy，12：1907-1916)，而据报道一些rAAV生产系统每个细胞达到10e3或10e4个颗粒。代表蛋白对于重量AAV和rAAV复制以及完整感染性颗粒的组装都是绝对需要的，正如Carter所总结的那样等。，用于基因治疗的AAV载体。(2004)在“基因和细胞治疗：治疗机制和策略”，第二版(Ed.N.Templeton-Smith)，第53-101页，Marcel Dekker，纽约)。在AAV生产的复制阶段，代表蛋白的表达在转录水平上既自调控又高度协调，表现出阳性和负向调节活性。达到相当于WT AAV的rAAV载体生产水平所需的代表蛋白的相对比率尚未完全了解。见李等。，(1997)J Virol.，71：5236-5243；肖等。，(1998)J Virol，72：2224-2232；马图希塔等。，(1998)基因治疗，5：938-945；和卡特等。，用于基因治疗的AAV载体，载于“基因和细胞治疗：治疗机制和策略”，第二版(Ed.N.Templeton-Smith)，第53-101页，Marcel Dekker，纽约。已经描述了许多载体生产方法，这些方法通过解耦调节各自的启动子来改变rep 52/40和rep 78/68的相对比率。看例如：，Natsoulis，U.S.Pat.No.5,622,856；纳特苏利斯等。，美国专利号6,365,403；艾伦等。，美国专利号6,541,258；特伦佩等。，美国专利号5,837,484；弗洛特等。，美国专利号5,658,776；威尔逊等。美国专利号6,475,769；范与董，(1997)人类基因治疗，8：87-98；和文森特等。，(1997)J Virol，71：1897-1905.这种在转录处大和小的rep蛋白的解耦已经通过许多方法实现，包括完全或与异源启动子，诱导启动子以某种方式替代天然p5，p19和p40天然AAV启动子；或通过物理手段将组分放在单独的遗传元件上，包括但不限于单独的质粒；或利用单独的基因构建体转导或转染允许的细胞系，包括腺病毒或疱疹病毒等载体病毒；插入额外的间隔元件，或在单个遗传构建体中物理地重新排列rep基因或其调节序列。这些策略已被用于瞬时生产系统，其中一个或多个组分通过质粒转染引入许可细胞系；杂交病毒感染，如重组腺病毒、疱疹病毒或杆状病毒；或者在稳定细胞系方法中，利用从允许用于AAV生产的转化癌细胞(如HELA和293个细胞)中产生。
根据一些实施方案，本文中描述的疫苗组合物是基于腺病毒(Ad)载体的。
根据一些实施方案，本文中描述的疫苗组合物是基于Ad血清型5(AdHu5)。基于AdHu5的载体，在过去几十年中已在实验室和临床试验中进行了广泛的研究(Alonso-Padilla等。2016 Mol Ther.；24:6–16).已经证明，AdHu5载体可以在临床前和临床研究中引发有效的抗原特异性免疫应答(Alonso-Padilla 2016 Mol Ther.24:6–16；阿宾克等。2007 J Virol.；81:4654–4663).然而，尽管AdHu5载体已被证明非常有效，但AdHu5感染在人类中是地方性的。因此，已经测试了从不同物种中分离的腺病毒载体。特别是，黑猩猩腺病毒(AdCs)具有吸引力，因为它们可以在人类细胞系中培养，例如人类胚胎肾293细胞(HEK293)，并且在人群中血清阳性率较低，因为它们很少在人类中传播。此外，一些AdC可以诱导T细胞和B细胞免疫反应，与AdHu5(Quinn)等常用的人类Ad血清型相当。等。2013 JImmunol.；190:2720–2735；莱杰伍德等。2017 N Engl J Med.；376:928–938).
根据一些实施方案，本文中描述的疫苗组合物是基于衍生自黑猩猩的腺病毒(Ad)载体。根据一些实施方案，腺病毒载体是基于黑猩猩腺病毒分离物Y25(Hillis等。(1969)JImmunol 103：1089-109)。根据一些实施方案，腺病毒载体是基于AdC68(也称为Sad-V25；法里纳，等。(2001)病毒学杂志75：11603-11613，通过引用将其全部并入本文)。
黑猩猩腺病毒分离株Y25首先由Hillis描述等。((1969)J Immunol 103：1089-1095)。病毒基因组在GenBank加入号中表示。JN254802，通过引用将其全部并入本文。基因组序列数据已经证实了早期的血清学迹象，即这种腺病毒与人类腺病毒E病毒HAdV-4(Wigand R，等。(1989)病毒学30：1-9)。从类人猿中分离出的猿猴腺病毒(SAdV)在系统发育上与人类腺病毒(HAdV)没有区别，并且一起聚集成相同的病毒物种(人类腺病毒B，C和E)(Roy S，等。(2009)PLoS病原体5：e1000503).虽然HAdV-4是源自人类的人类腺病毒E的唯一代表，但许多黑猩猩腺病毒在系统发育上在物种E内分组，包括候选疫苗ChAd63，AdC68(SAdV-25)，AdC7(SAdV-24)和AdC6(SAdV-23)(Farina SF，等。(2001)病毒学杂志75：11603–11613；罗伊·等。(2004)病毒学324：361–372；罗伊·等。(2004)人类基因治疗15：519-530；雷耶斯-桑多瓦尔等。(2010)感染与免疫78：145–153；上述所有内容均通过引用并入本文全文)。系统发育分析表明，黑猩猩腺病毒Y25也与人腺病毒E病毒组。
来自Y25基因组的示例性序列按GenBank加入编号列出：
ChAd3 CS479276；ChAd63 CS479277；HAdV-5 AC_000008；SAdV-22AY530876；SAdV-25 AF394196，HAdV-1 AF534906；HAdV-2 J01917；HAdV-4 AY458656；HAdV-6 FJ349096；HAdV-12 X73487；HAdV-16 AY601636；；HAdV-30 DQ149628；HAdV-10 AB369368，AB330091；HAdV-17 HQ910407；HAdV-9 AJ854486；HAdV-37 AB448776；HAdV-8 AB448767；HAdV-7AB243119，AB243118；HAdV-11 AC_000015；HAdV-21AY601633；HAdV-34AY737797；HAdV-35AC_000019；HAdV-40NC_001454；HAdV-41DQ315364；SAdV-21 AC_000010；SAdV-23AY530877；SAdV-24 AY530878；HAdV-3 DQ086466；HAdV-18 GU191019；HAdV-31 AM749299；HAdV-19 AB448774；SAdV-25.2 FJ025918；SAdV-30 FJ025920；SAdV-26 FJ025923；SAdV-38FJ025922；SAdV-39 FJ025924；SAdV-36 FJ025917；SAdV-37.1 FJ025921；HAdV-14AY803294；SAdV-27.1 FJ025909；SAdV-28.1 FJ025914；SAdV-33 FJ025908；SAdV-35.1FJ025912；SAdV-31.1 FJ025906；SAdV-34 FJ025905；SAdV-40.1 FJ025907；SAdV-3NC_006144；Y25 JN254802
人体内针对黑猩猩腺病毒68型的抗体很少，这种腺病毒既能感染分裂细胞，也可以感染非分裂细胞，包括肺细胞、肝细胞、骨细胞、血管细胞、肌肉、大脑和中枢神经等。此外，它具有良好的基因稳定性和优异的表达外来基因的能力。它可以由HEK293细胞产生，并已广泛用于艾滋病，埃博拉，流感，疟疾和丙型肝炎等疫苗的研究。
Ad载体的生产，纯化和质量控制程序已经建立(Tatsis&Ertl，2004 Mol Ther 10：616-29)。广告载体诱导先天免疫反应，改善添加佐剂的需要。它们还诱导非常有效的B和CD8 T细胞反应，由于载体的低水平持久性，这些反应非常持久(Tatsis等。，2007，血液110：1916-23，).预先存在的针对常见人类血清型Ad病毒(如血清型5)的中和抗体会影响疫苗功效，可以通过使用来自其他物种(如黑猩猩)的血清型来避免，这些血清型通常既不在人类中循环，也不与人类血清型交叉反应(Xiang等。，2006年出现感染Dis 12：1596-99，)。在需要主要增强方案以实现足够效力的免疫反应的情况下，可以使用基于不同Ad血清型的载体(Tatsis&Ertl，2004 Mol Ther 10：616-29)。广告病毒和广告载体已被广泛用于耐受性良好的临床。它们可以通过各种途径应用，包括粘膜途径，如气道(Xiang等。，2003 J Virol77：10780-89，)或甚至在灌封时口服，如美国军方使用的Ad病毒4和7疫苗所示(里昂等。，2008年疫苗26：2890-98)。
单纯疱疹病毒载体
根据一些实施方案，本文中描述的疫苗组合物是基于单纯疱疹病毒(HSV)载体的。
对于HSV载体菌株的生产，可以从基因组中去除必需基因和非必需基因的组合，从而使病毒具有非致病性和最小的细胞毒性。载体病毒通常是通过删除两个基本的直接早期基因ICP4和ICP27中的一个或另一个或两个而产生的。这些需要在表达缺失基因的细胞系上生长。可以进行进一步的缺失以降低细胞毒性。为了产生允许在潜伏期进行基因表达的病毒，必须设计启动子，允许在此期间继续基因表达，这已被证明是HSV载体开发领域的一个相当大的挑战。然而，许多不同的启动子系统，每个系统都结合了HSV潜伏期相关转录本(LAT)区域的不同元素，确实使潜伏期期间的基因表达达到不同的效率水平。这些要么使用一种或另一种LAT启动剂(LAP1或LAP2；戈因斯等。,1994.病毒学J。68(4)：2239-2252)在潜伏期间直接驱动基因表达，或从LAT区域衍生的DNA片段赋予单个或成对的启动子长期活性。该元件，在本文中称为LAT P2(包括LAP2和其它上游序列；(nts 118866-112019-GenBank HE1CG))，随后已被证明不是作为真正的启动子，而是赋予放置在它附近的异源启动子长期活性，这些启动子在单独使用时在潜伏期不活跃。
根据一些实施方案，本公开的单纯疱疹病毒可衍生自例如HSV1或HSV2毒株或其衍生物，例如HSV1。衍生物包括含有来自HSV1和HSV2菌株的DNA的跨类型重组体。例如，衍生物与HSV1或HSV2基因组具有至少70％的序列同源性，例如至少80％，例如至少90％或95％。可用于获得本公开内容的病毒的其他衍生物包括在ICP4和/或ICP27中已经具有突变的菌株，例如在ICP4中具有缺失的菌株d120(DeLuca等。，1985年J.维罗尔。56(2):558-70).HSV菌株也在ICP27中缺失，例如Reef Hardy和Sandri-Goldin，1994 J.Virol。68(12)：7790-99和Rice and Knipe，1990 J.Virol。64(4)：1704-15(菌株d27-1)。在ICP4和ICP27中均有缺失的菌株在U.S.Pat.No.5,658,724和Samaniego中进行了描述等。1995 J·维罗尔69：5705-15(菌株d92)。
巨细胞病毒载体
根据一些实施方案，本文中描述的疫苗组合物是基于巨细胞病毒病毒(CMV)载体的。
巨细胞病毒是疱疹病毒家族β亚类的成员。它是一种大型(包含230千碱基基因组)的双链DNA病毒，可建立终身潜伏或持续感染。在美国等发达国家，大约70％的人口感染了巨细胞病毒。与爱泼斯坦巴尔病毒和卡波西肉瘤相关疱疹病毒等γ型疱疹病毒相比，巨细胞病毒是非转化和非致癌性的。
活的重组CMV产生针对重组抗原的免疫反应的能力已经在几份报告中得到证实(Hansen等人，2009 Nat.Med.15：293-299；Karrer等人，2004 J.Virol。78:2255-2264,).此外，已经证明，一种重组的，复制能力强的CMV被设计用于表达自我蛋白，将产生持久的，基于CD8+T细胞的免疫力，对抗表达自身蛋白的细胞(Lloyd等人，2003 Biol.Reprod.68：2024-2032，)。汉森等。使用表达SIV抗原的重组恒河猴CMV对恒河猴进行SIV免疫(汉森等。，2009年全国医学杂志15：293-299)。免疫诱导了大量活化的效应器记忆CD8+T细胞，这些细胞在外周组织中特异性地用于SIV，该细胞在整个研究的多年持续时间内持续存在。免疫接种的猴子受到实质性的保护，免受SIV挑战，这归因于激活的效应器记忆T细胞的存在。该研究还表明，对巨细胞病毒的预先存在的免疫力并不能阻止重组巨细胞病毒诱导新免疫反应的能力。
根据一些实施方案，本文公开的疫苗组合物包含重组的、复制缺陷的巨细胞病毒，其包含编码本公开的免疫原的异源核酸。根据一些实施方案，病毒潜伏期在受试者中建立，其潜伏期导致针对抗原的反复刺激的免疫应答。在具体实施方案中，反复刺激的免疫应答包括CD8+T细胞免疫应答。根据一些实施方案，异源免疫原包含病毒或肿瘤衍生的多肽。
根据一些实施方案，重组复制缺陷巨细胞病毒包括失活的gB、gD、gH或gL糖蛋白基因，例如通过敲除突变失活的gL糖蛋白。根据一些实施方案，编码免疫原的核酸可操作地与组成启动子相连。根据一些实施方案，编码免疫原的核酸可操作地与可诱导的启动子相连。根据一些实施方案，重组复制缺陷巨细胞病毒是一种小鼠巨细胞病毒。在其它实施方案中，重组复制缺陷巨细胞病毒是人巨细胞病毒，如AD 169、Davis、Toledo或Towne的CMV菌株。
病毒样颗粒(VLP)载体
根据一些实施方案，本公开内容提供来自真核细胞质膜的病毒样颗粒(VLP)，这些VLP在其表面上携带免疫原性病毒蛋白，如本文所述。VLP单独使用或与一种或多种额外的VLP和/或佐剂组合，可刺激免疫反应，防止病毒感染。
根据一些实施方案，VLP包括由编码基质蛋白M(也称为M1)和任选的M2蛋白的基因的天然存在和/或突变的核酸序列产生的病毒蛋白。基质蛋白M是形成所有可能的多价亚病毒结构疫苗组合的通用成分。M1和M2蛋白可能来自任何病毒。例如，根据一些实施方案，VLP的M1和/或M2蛋白衍生自流感基质蛋白。在其它实施方案中，VLP的M1和/或M2蛋白衍生自RSV或thogoto-virus。M1和/或M2蛋白可以被修饰(突变)，例如如本文或美国专利公开2008/0031895和2009/0022762中所公开的，通过引用并入其全文。.
VLP可以使用标准的重组技术制备。编码VLP形成蛋白的多核苷酸被引入宿主细胞，当蛋白质在细胞中表达时，它们组装成VLP。编码形成和/或掺入VLP的分子(结构和/或抗原多肽，包括修饰的抗原多肽)的多核苷酸序列可以使用重组方法获得，例如通过从表达该基因的细胞中筛选cDNA和基因组文库，或者通过从已知包含相同基因的载体中提取基因来获得。例如，含有编码自然发生或改变的细胞产物的序列的质粒可以从A.T.C.C.等保藏室或商业来源获得。含有目标核苷酸序列的质粒可以用适当的限制性内切酶消化，并且可以使用标准分子生物学技术将含有核苷酸序列的DNA片段插入到基因转移载体中。
或者，可以使用标准技术，例如cDNA或基因组DNA的苯酚提取和PCR，从表达或含有这些序列的细胞中获得cDNA序列。看例如：，萨姆布鲁克等。，上文，用于描述用于获取和分离DNA的技术。简而言之，来自表达目的基因的细胞的mRNA可以使用寡核苷酸dT或随机引物用逆转录酶逆转录。然后可以通过PCR扩增单链cDNA(参见美国专利Nos.4,683,202，4,683,195和4,800,159，另见PCR技术：DNA扩增的原理和应用，Erlich(编辑)，Stockton Press，1989))使用寡核苷酸引物在所需序列的任一侧互补序列。
感兴趣的核苷酸序列也可以使用DNA合成器(例如：，应用生物系统模型392DNA合成器，可从加利福尼亚州福斯特市的ABI获得。核苷酸序列可以用适当的密码子设计用于所需的表达产物。完整的序列由通过标准方法制备的重叠寡核苷酸组装而成，并组装成完整的编码序列。看例如：，边缘(1981)自然292：756；楠拜尔等。(1984)科学223：1299；杰等。(1984)J.Biol.Chem.259：6311.
根据一些实施方案，基质编码序列是RSV基质蛋白。在其它实施方案中，基质编码序列是流感基质蛋白。同样明显的是，基质编码序列可以包含一个或多个突变(修饰)，例如美国专利出版物2008/0031895和2009/0022762中描述的修饰基质蛋白。本文描述的VLP还可以包含附加的流感蛋白(野生型、修饰型(突变体)和/或野生型或突变体的杂交种)。
本文中描述的VLP中使用的任何蛋白质都可以是杂交(或嵌合)蛋白质。很明显，全部或部分多肽可以被其他病毒的序列和/或其他流感毒株的序列所取代。根据一些示例性实施方案，VLP的任何蛋白质都可以是杂交的，因为它们包括编码跨膜和/或细胞质尾结构域的异源序列，例如来自流感蛋白质的结构域，例如HA或NA。看例如：，美国专利公开号2008/0031895和2009/0022762。
在示例性实施方案中，用于形成流感VLP的序列表现出约60％至80％(或其之间的任何值，包括61％，62％，63％，64％，65％，66％，67％，68％，69％，70％，71％，72％，73％，74％，75％，76％，77％，78％和79％)序列同一性，以天然存在的病毒多核苷酸序列，更优选序列表现出约80％至100％(或其之间的任何值，包括81％，82％，83％，84％，85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％和99％序列同一到天然存在的多核苷酸序列。
这里描述的任何序列还可以包括附加序列。例如，为了进一步增强疫苗效力，杂交分子被表达并掺入亚病毒结构中。这些杂交分子通过在DNA水平上将编码基质蛋白基因的序列与编码佐剂或免疫调节部分的序列联系起来而产生。在亚病毒结构形成期间，这些杂交蛋白被掺入颗粒中或颗粒上，这取决于M1或可选的M2是否携带佐剂分子。掺入一种或多种免疫调节多肽(例如：，佐剂)进入本文所述的序列以形成VLP可以增强效力，因此减少刺激保护性免疫反应所需的抗原量。或者，一个或多个附加分子(多肽或小分子)可以包括在从本文所述的序列生产VLP之后的含有VLP的组合物中。
这些亚病毒结构不含传染性病毒核酸，并且它们不具有传染性，因此不需要化学灭活。缺乏化学处理保留了天然表位和蛋白质构象，增强了疫苗的免疫原性特征。
这里描述的序列可以以任意组合可操作地相互链接。例如，一个或多个序列可以来自相同的启动子和/或来自不同的启动子表达。如下所述，序列可以包含在一个或多个载体上。
表达载体
一旦包含编码希望掺入VLP中的多肽的序列的构建体被合成，就可以将它们克隆到任何合适的载体或复制子中以进行表达。许多克隆载体是本领域技术人员所公知的，并且具有本领域普通技术人员的人可以根据本说明书的教导和本领域已知的关于表达的信息，为任何给定的宿主细胞类型选择适当的载体和控制元件。一般见Ausubel等人，上文或Sambrook等人，同上。
可用于表达组装成VLP的序列的载体的非限制性示例，如本文所述，包括基于病毒的载体(例如：、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、慢病毒)、杆状病毒载体(参见，示例)、质粒载体、非病毒载体、哺乳动物载体、哺乳动物人工染色体(例如：，脂质体，颗粒载体等)及其组合。
表达向量通常包含编码序列和表达控制元素，这些元素允许在合适的主机中表达编码区域。对照元件通常包括启动子、翻译起始密码子、翻译和转录终止序列，以及用于将插入片段引入载体的插入位点。平移控制元件已由M.Kozak(例如：，科扎克，M.，妈妈。基因组7(8)：563-574，1996；Kozak，M.，Biochimie 76(9)：815-821，1994；Kozak，M.，细胞生物学杂志108(2)：229-241，1989；Kozak，M.，and Shatkin，A.J.，Methods Enzymol 60：360-375，1979)。
例如，哺乳动物细胞表达的典型启动子包括SV40早期启动子、CMV启动子如CMV即刻早期启动子(CMV启动子可以包括内含子A)、RSV、HIV-LTR、小鼠乳腺肿瘤病毒LTR启动子(MMLV-LTR)、FIV-LTR、腺病毒主要晚期启动子(Ad MLP)和单纯疱疹病毒启动子等。其他非病毒启动子，例如来自小鼠金属硫蛋白基因的启动子，也将用于哺乳动物表达。通常，转录终止和聚腺苷酸化序列也将存在，位于翻译终止密码子的3′处。优选地，还存在用于优化翻译起始的序列，位于编码序列的5′处。转录终止子/聚腺苷酸化信号的例子包括那些来自SV40的信号，如Sambrook中所述，等。，以及牛生长激素终止子序列。含有剪接供体和受体位点的内含子，也可以设计成本文所述的结构(Chapman等。，Nuc.酸研究(1991)19：3979-3986)。
增强子元件也可用于本文以增加哺乳动物结构体的表达水平。例子包括SV40早期基因增强子，如Dijkema中所述等。EMBO J.(1985)4：761，增强子/启动子来源于Rous肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)，如Gorman所述等。美国国家科学院科学项目(1982b)79：6777和源自人类巨细胞病毒的元素，如Boshart中所述等。，细胞(1985)41：521，例如CMV内含子A序列中包含的元素(Chapman等。，Nuc.酸研究(1991)19：3979-3986)。
根据一些实施方案，一个或多个载体可以包含一个或多个编码要掺入VLP中的蛋白质的序列。例如，单个载体可以携带编码VLP中发现的所有蛋白质的序列。或者，可以使用多个向量(例如：，多个构建体，每个编码单个多肽编码序列或多个构建体，每个编码一个或多个多肽编码序列)。在单个载体包含多个多肽编码序列的实施方案中，该序列可以操作地链接到相同或不同的转录控制元件(例如：，启动子)在同一载体内。此外，载体可能含有额外的基因表达控制序列，包括染色质开放元件，这些元件可防止转基因沉默并赋予一致，稳定和高水平的基因表达，而不管染色体整合位点如何。这些是位于家务基因附近的DNA序列基序，它们在载体中在整合的转基因周围创建转录活性的开放染色质环境，最大化转录和蛋白质表达，而不管转基因在染色体中的位置如何。
此外，一个或多个编码非病毒免疫原的序列，例如：，非流感蛋白，可以表达并掺入VLP中，包括但不限于包含和/或编码免疫调节分子(例如：，佐剂如下所述)，例如免疫调节寡核苷酸(例如：、CpGs)、细胞因子、解毒细菌毒素等。
VLP生产
然后使用本文中描述的序列和/或载体来转化适当的宿主细胞。编码形成本文所述的VLP的蛋白质的构建体为使用各种不同细胞类型(包括但不限于昆虫，真菌(酵母)和哺乳动物细胞)生产流感VLP提供了有效的手段。
根据一些实施方案，亚病毒结构疫苗在转染，建立连续细胞系(使用标准方案)和/或感染携带目标免疫原性基因的DNA构建体(例如：，流感基因)为本领域技术人员所熟知。通过驱动所选基因转录的真核或病毒启动子的序列优化，可以最大限度地提高亚病毒结构形成所需蛋白质的表达水平。亚病毒结构疫苗被释放到培养基中，从那里被纯化并随后配制成疫苗。亚病毒结构不具有传染性，因此不需要VLP失活，因为它对于一些已杀死的病毒疫苗是必需的
从本文所述的序列中表达的免疫原性多肽具有表面呈现的抗原糖蛋白自组装成VLP的能力允许这些VLP通过共同引入所需序列在许多宿主细胞中产生。序列(例如：，在一个或多个表达载体中)可以稳定地和/或以各种组合瞬时地整合到宿主细胞中。
合适的宿主细胞包括但不限于细菌、哺乳动物、杆状病毒/昆虫、酵母细胞、植物细胞和非洲爪蟾细胞。
例如，许多哺乳动物细胞系是本领域已知的，包括原代细胞以及来自美国类型培养物集(A.T.C.C.)的永生化细胞系，例如，但不限于，MDCK，BHK，VERO，MRC-5，WI-38，HT1080，293，293T，RD，COS-7，CHO，Jurkat，HUT，SUPT，C8166，MOLT4/clone8，MT-2，MT-4，H9，PM1，CEM，骨髓瘤细胞(例如：，SB20细胞)和CEMX174(例如，可以从A.T.C.C.获得此类细胞系)。
同样，细菌宿主如大肠杆菌，枯草芽孢杆菌和链球菌属，将与本表达构建体一起使用。
在本公开中有用的酵母宿主除其他外包括酿酒酵母、白色念珠菌、麦芽念珠菌、多形汉森纳菌、脆弱克鲁维菌、乳酸克鲁维菌、吉列里蒙氏菌、牧羊草、pombe裂殖酵母和脂解蓍草。真菌宿主包括，例如，曲霉菌。
用于杆状病毒表达载体的昆虫细胞除其他外，包括埃及伊蚊、加利福尼亚伊蚊、Bombyx mori、黑腹果蝇、节俭蝇和毛滴虫。参见，Latham&Galarza(2001)J.Virol。75(13):6154-6165；加拉扎等。(2005)病毒.免疫。18(1):244-51；以及200550186621和20060263804的美国专利出版物。
表达上述一个或多个序列的细胞系可以很容易地通过稳定地整合编码VLP蛋白的一个或多个表达载体构建体来产生给定本文提供的公开内容。调节稳定整合的流感序列(s)的启动子的表达可以是构成性的或可诱导的。因此，可以生成一种细胞系，其中一种或多种两种基质蛋白稳定地整合在一起，使得在引入本文所述的序列时(例如：，杂交蛋白)进入宿主细胞并表达由多核苷酸编码的蛋白质，形成呈现抗原糖蛋白的非复制病毒颗粒。
衍生VLP生产者细胞系的母细胞系可以从上述任何细胞中选择，包括例如哺乳动物、昆虫、酵母、细菌细胞系。在示例性实施方案中，所述细胞系是哺乳动物细胞系(例如：，293，RD，COS-7，CHO，BHK，MDCK，MDBK，MRC-5，VERO，HT1080和骨髓瘤细胞)。使用哺乳动物细胞生产流感VLP提供(i)VLP形成；(ii)正确的翻译后修饰(糖基化，棕榈化)和萌芽；(iii)没有非哺乳动物细胞污染物和(iv)易于纯化。
除了创建细胞系外，免疫原编码序列也可以在宿主细胞中短暂表达。合适的重组表达宿主细胞系统包括但不限于细菌、哺乳动物、杆状病毒/昆虫、牛痘病毒、Semliki森林病毒(SFV)、甲型病毒(如辛德比斯、委内瑞拉马脑炎(VEE))、哺乳动物、酵母和非洲爪蟾的表达系统，本领域公知。特别优选的表达系统是哺乳动物细胞系、牛痘、辛比斯、昆虫和酵母系统。
许多合适的表达系统是市售的，例如，包括以下：杆状病毒表达(Reilly，P.R.，等。，(1992年)杆状病毒表达载体：实验室手册；梁，等。，(1991)生物技术11：378；法明根；Clontech，Palo Alto，Calif.))，牛痘表达系统(Earl，P.L.，等。，“使用牛痘在哺乳动物细胞中表达蛋白质”(1991)在分子生物学的当前协议中(F.M.Ausubel，等。Eds.)，GreenePublishing Associates&Wiley Interscience，New York；莫斯等。，美国专利号5,135,855，1992年8月4日发行)，在细菌中的表达(Ausubel，F.M.，等。，分子生物学的当前协议，John Wiley和Sons，Inc.，Media Pa.；Clontech)，在酵母中的表达(Rosenberg，S.和Tekamp-Olson，P.，U.S.Pat.No.RE35，749，1998年3月17日发行，本文通过引用并入本文；Shuster，J.R.，U.S.Pat.No.5,629,203，1997年5月13日发布，本文通过引用并入本文；盖利森，G.，等。，(1992)安东尼·范·列文虎克，62(1-2)：79-93；罗曼诺斯，M.A.，等。，(1992)酵母8(6)：423-488；Goeddel，D.V.，(1990)酶学方法185；Guthrie，C.和G.R.Fink，(1991)酶学方法194)，在哺乳动物细胞中的表达(Clontech；Gibco-BRL，Ground Island，N.Y.；例如：，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(海恩斯，J.，等。，(1983)Nuc.酸。Res.1983 11：687-706；刘永峰，等。，(1984)摩尔细胞。生物学4：1469-1475；Kaufman，R.J.，“哺乳动物细胞中异源基因的选择和共扩增”，(1991年)，载于《酶学方法》，第185卷，第537-566页。Academic Press，Inc.，San Diego Calif.)，以及植物细胞中的表达(植物克隆载体，ClontechLaboratories，Inc.，Palo-Alto，Calif.，and Pharmacia LKB Biotechnology，Inc.，Piscataway，N.J.；胡德等。，(1986)J.细菌醇.168：1291-1301；内格尔，等。，(1990)FEMS微生物学。立67：325；一等。，“二元载体”等(1988)在植物分子生物学手册A3：1-19；三木，等。，第249-265页，以及其他(1987年)在植物DNA感染因子(Hohn，T.，等。，编辑。施普林格-维拉格，维也纳，奥地利；1997《植物分子生物学：基本技术》，P.G.Jones和J.M.Sutton，纽约，J.Wiley；Miglani，1998 Gurbachan Dictionary of Plant Genetics and MolecularBiology，New York，Food Products Press，；Henry，R.J.，1997 Practical Applicationsof Plant Molecular Biology，New York，Chapman&Hall)。
根据所选择的表达系统和宿主，VLP是由表达载体转化的生长宿主细胞产生的，在形成颗粒的多肽被表达并且可以形成VLP的条件下。选择适当的生长条件是本领域技术人员之一。如果VLP在细胞内形成并保留，则使用化学，物理或机械手段破坏细胞，从而裂解细胞并保持VLP基本完整。这些方法是本领域技术人员已知的，并且描述于：例如：，蛋白质纯化应用：实用方法，(E.L.V.Harris和S.Angal，Eds.，1990)。或者，VLP可以从周围的培养基中分泌和收获。
然后使用保持其完整性的方法分离(或基本上纯化)颗粒，例如，通过密度梯度离心，例如：、蔗糖梯度、PEG沉淀、造粒等(见，例如：，基恩鲍尔等。(1993)J.维罗尔.67：6929-6936)，以及标准纯化技术，包括：例如：、离子交换和凝胶过滤色谱。
细菌载体疫苗
根据一些实施方案，本文中描述的疫苗组合物是基于细菌载体的。
基因工程技术使得识别和删除重要的毒力基因成为可能，使致病细菌能够衰减，并产生无法恢复到其毒力形式的载体。已经描述了肠道沙门氏菌不同血清型的几种突变(血清型伤寒和伤寒，分别称为伤寒沙门氏菌和鼠伤寒沙门氏菌)，最常用的是aroA突变(以及aroC和aroD)，其阻断微生物合成芳香族化合物的能力。这使得细菌无法在宿主中繁殖，同时保持侵入小肠的能力，并持续感染足够长的时间以产生抗原并引发有效的免疫反应(Cárdenas和Clements，1992Clin Microbiol Rev 5：328-342)。其他可以减弱致病性的有用突变会影响腺嘌呤(pur)和鸟嘌呤(guaBA)以及外膜蛋白C和F(ompC，ompF)的生物合成，以及cAMP受体(cya/crp)的表达，UDP-半乳糖向UDP葡萄糖(galE)的转化，DNA重组和修复(recA，recBC)以及毒力基因(phoP，phoQ)(Mastroeni)的调节等.，2001兽医J 161：132–164).
单核细胞增多性李斯特菌感染(李斯特菌病)是一种罕见且可预防的食源性疾病，可导致菌血症、脑膜炎、胎儿流产和死亡，老年人、孕妇和免疫功能低下患者的风险最大。用于疫苗目的的单核细胞增多性李斯特菌的衰减已经使用自养突变体(Zhao等。，2005年感染Immun 73：5789-5798)或去除毒力因子，如基因actA和innerin B(inlB)(Brockstedt)等.，2004 Proc Natl Acad Sci U S A 101：13832–13837).
在已经研究过异源抗原递送的其他细菌物种中，包括戈登链球菌(Lee 2003，CurrOpin Infect Dis.2003；16：231-235；奥焦尼等。，1995，疫苗13：775–779)，霍乱弧菌(Kaperand Levine 1990，Res Microbiol.1990；141：901–906；席尔瓦等。，2008Biotechnol Lett30：571–579)，牛分枝杆菌(BCG)(Bastos等。，2009年疫苗。2009；27:6495–6503；NasserEddine和Kaufmann，2005，微生物感染7：939-946)，Yersinia enterocolitica(Leibiger)等。，2008年，疫苗26：6664-6670)和志贺氏菌(Barry)等。，2006，疫苗24：3727-3734)。其他已被研究用作疫苗载体的物种包括铜绿假单胞菌(Epaulard)等。，2006年摩尔·2006；14：656–661)，枯草芽孢杆菌等。，2003，感染免疫71：2810–2818；伊斯蒂卡托等。，2001，JBacteriol 183：6294–6301)，和分枝杆菌smegmatis(Lü等。，2009年疫苗。2009；27:972–978).在兽医领域，其他细菌已被用于产生针对异源抗原和载体本身的双重保护性免疫反应；这些包括丹毒藓属(小川)等。，2009，疫苗27：4543–4550)，没食性支原体等。，2008年，疫苗。2008；26：5449–5454)和假结核棒状杆菌(Moore等。，1999年，疫苗。1999；18:487–497).许多减毒活细菌疫苗被许可用于兽医，包括细胞内Lawsonia，Quitelococus(在aroA基因中删除)，流产衣原体，滑质支原体，Gallisepticum支原体(温度敏感突变体)和鸟博德特氏菌。大多数菌株被选为减毒菌株，但没有精确突变以促进衰减，并且不携带异源抗原(Meeusen等。，2007，Clin Microbiol Rev 20：489–510)。
基因疫苗
根据一些实施方案，本公开涉及用于递送核酸分子的组合物，其包含编码本文所述的保守免疫原性蛋白的核苷酸序列，该调节元件可操作地链接。本公开的各个方面涉及用于递送重组疫苗的组合物，该重组疫苗包括编码该公开内容的蛋白质的编码核苷酸序列；编码公开的蛋白质和/或包括公开的蛋白质的减毒活病原体；一种被杀死的病原体包括本公开的蛋白质；或组合物，例如脂质体或亚单位疫苗，其包含本公开的蛋白质。本公开还涉及包含组合物的可注射药物组合物。
如本文所述，根据本公开内容的疫苗递送到个体以调节个体免疫系统的活性，从而增强免疫应答。当编码蛋白质的核酸分子被个体的细胞吸收时，核苷酸序列在细胞中表达，从而将蛋白质传递给个体。这里还描述了在核酸分子(如质粒)上递送蛋白质的编码序列的方法，作为重组疫苗的一部分和作为减毒疫苗的一部分，作为分离的蛋白质或载体的蛋白质的一部分。
DNA疫苗在美国有描述。专利号5,593,972、5,739,118，5,817,637，5,830,876，5,962,428，5,981,505，5,580,859，5,703,055，5,676,594，以及其中引用的优先权申请，所有这些都通过引用并入本文。除了这些应用中描述的递送方案外，美国还描述了递送DNA的替代方法。专利4,945,050和5,036,006，通过引用并入本文的全文。
根据本公开内容的一些实施方案进行的遗传免疫在不使用感染因子或感染性载体的情况下引发有效的免疫应答。通常确实产生CTL反应的疫苗接种技术通过使用感染因子来产生CTL反应。在接种灭活疫苗、灭活疫苗或亚单位疫苗的个体中，通常不会表现出完全、广泛的免疫应答。本公开的一些实施方案以安全的方式实现免疫应答的完全补充，而没有与使用感染因子的疫苗接种相关的风险和问题。
根据本公开内容的某些实施方案，编码本文所述的保守型免疫原性蛋白的DNA或RNA被引入到个体或受试者的细胞中，在那里它被表达，从而产生靶蛋白。DNA或RNA与在个体细胞中表达所需的调节元件相关联。DNA的调节元件包括启动子和聚腺苷酸化信号。此外，其他元素，如Kozak区域，也可能包含在遗传构建体中。
基因疫苗的遗传构建体包括一个核苷酸序列，该序列编码本文所述的保守的免疫原性蛋白，可操作地与基因表达所需的调节元件相关联。因此，将DNA或RNA分子掺入活细胞中导致编码靶蛋白的DNA或RNA的表达，从而产生靶蛋白。
当被细胞吸收时，遗传构建体(包括编码本文所述的保守免疫原性蛋白的核苷酸序列)可作为功能性染色体外分子保留在细胞中，或者可以整合到细胞的染色体DNA中。DNA可以被引入细胞中，在那里它以质粒的形式作为单独的遗传物质。或者，可以将可以整合到染色体中的线性DNA引入细胞中。当将DNA引入细胞时，可以添加促进DNA整合到染色体中的试剂。有助于促进整合的DNA序列也可以包含在DNA分子中。由于整合到染色体DNA中必然需要对染色体进行操作，因此优选将DNA构建体维持为复制或非复制的染色体外分子。这降低了通过剪接到染色体中而损害细胞的风险，而不会影响疫苗的有效性。或者，可以将RNA施用于细胞。还考虑将遗传构建体作为线性小染色体提供，包括着丝粒，端粒和复制起源。
基因疫苗的基因构建体的必要元件包括编码本文所述保守的免疫原性蛋白的核苷酸序列，以及在接种疫苗的个体的细胞中表达该序列所需的调节元件。调节元件可操作地与编码靶蛋白以实现表达的DNA序列相关联。
如本文所述，编码保守免疫原性蛋白的分子是被翻译成蛋白质的蛋白质编码分子。这种分子包括DNA或RNA，其组成编码靶蛋白的核苷酸序列。这些分子可以是cDNA、基因组DNA、合成的DNA或其杂交物或RNA分子如mRNA。因此，如本文所用，术语“DNA构建体”、“遗传构建体”、“核酸分子”、“核酸”和“核苷酸序列”是指DNA和RNA分子。
编码本公开的免疫原的核酸可以用作组分，例如，DNA疫苗，其中编码序列作为裸DNA施用，或者，例如，编码免疫原的微基因可以存在于病毒载体中。编码序列可以在例如分枝杆菌、重组嵌合腺病毒或重组减毒水疱性口炎病毒中表达。编码序列还可以存在于例如复制或非复制的腺病毒载体、腺相关病毒载体、减毒结核分枝杆菌载体、卡介苗(BCG)载体、牛痘或改良牛痘(MVA)载体、另一种痘病毒载体、重组脊髓灰质炎和其他肠道病毒载体、沙门氏菌属细菌载体、志贺氏菌属细菌载体、志贺氏菌属细菌载体、委内瑞拉马脑炎病毒(VEE)载体、Semliki森林病毒载体或烟草花叶病毒载体。编码序列也可以表达为DNA质粒，例如具有活性启动子如CMV启动子。其它活向量也可用于表达公开的序列。本公开的免疫原的表达可以在患者自身的细胞中诱导，方法是将编码免疫原的核酸引入到这些细胞中，优选使用优化人细胞表达的密码子和启动子。制造和使用DNA疫苗的方法的例子在美国专利第5,580,859号，5,589,466号和5,703,055号中公开。
DNA分子基因表达所需的调节元件包括：启动子，起始密码子，终止密码子和聚腺苷酸化信号。此外，基因表达通常需要增强子。这些要素必须在接种疫苗的个体中可操作。此外，有必要将这些元素与编码靶蛋白的核苷酸序列操作性地联系起来，使得核苷酸序列可以在接种疫苗的个体的细胞中表达，从而可以产生靶蛋白。
起始密码子和终止密码子通常被认为是编码靶蛋白的核苷酸序列的一部分。然而，这些元素在接种疫苗的个体中是必需的。
同样，使用的启动子和聚腺苷酸化信号必须在接种疫苗的个体的细胞内起作用。
用于实践本公开的一些实施方案的启动子的实例，特别是在为人类生产基因疫苗时，包括但不限于来自猿猴病毒40(SV40)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、人类免疫缺陷病毒(HIV)如HIV长末端重复序列(LTR)启动子、Moloney病毒、ALV、巨细胞病毒(CMV)如巨细胞病毒即刻早期启动子(CMV IE)，EB病毒(EBV)，Rous肉瘤病毒(RSV)以及来自人类基因的启动子，如人类肌动蛋白，人类肌球蛋白，人类血红蛋白，人类肌肉肌酸和人类金属蛋白。
可用于实践本公开的一些实施方案的聚腺苷酸化信号的实例，特别是在生产人类遗传疫苗时，包括但不限于SV40聚腺苷酸化信号和LTR聚腺苷酸化信号。特别是，可以使用pCEP4质粒(加利福尼亚州圣地亚哥的Invitrogen)中的SV40聚腺苷酸化信号，称为SV40聚腺苷酸化信号。此外，牛生长激素(bgh)聚腺苷酸化信号可以达到这一目的。
除了DNA表达所需的调节元件外，其他元件也可以包含在DNA分子中。这些附加元件包括增强剂。增强子可以选自包括但不限于：人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌肉肌酸和病毒增强剂，例如来自CMV、RSV和EBV的病毒增强剂，例如CMV IE增强剂。
遗传构建体可以提供哺乳动物的复制起源，以便在染色体外维持构建体并在细胞中产生构建体的多个拷贝。来自Invitrogen(加利福尼亚州圣地亚哥)的质粒pCEP4和pREP4含有复制的Epstein Barr病毒起源和核抗原EBNA-1编码区，其产生高拷贝的间观复制而无需整合。
如果出于任何原因需要消除接受遗传构建体的细胞，则可以添加一个额外的元素作为细胞破坏的目标。可表达形式的疱疹胸苷激酶(tk)基因可以包含在遗传构建体中。当构造被引入到单元中时，将产生tk。药物冈昔洛韦可以施用于个体，并且该药物将导致选择性地杀死任何产生tk的细胞。因此，可以提供一种允许选择性破坏接种细胞的系统。
为了成为功能性遗传构建体，调节元件必须与编码靶蛋白的核苷酸序列可操作地连接。因此，起始和终止密码子必须与编码序列一起处于帧中。
编码目标蛋白的开放阅读框(ORF)和另一种或其他感兴趣的蛋白质可以引入到同一载体或不同载体上的细胞中。载体上的ORF可以由单独的启动子或单个启动子控制。在后一种产生多顺时信息的排列中，ORF将通过平移停止和开始信号分开。这些ORF之间存在内部核糖体进入位点(IRES)位点，允许通过内部启动双歧杆菌或多顺式mRNA的翻译来生产来自第二个目标ORF或第三个ORF等的表达产物。
当被细胞吸收时，遗传构建体可能作为功能性染色体外分子保留在细胞中和/或整合到细胞的染色体DNA中。DNA可以被引入细胞中，在那里它以质粒或质粒的形式作为单独的遗传物质。或者，可以将可以整合到染色体中的线性DNA引入细胞中。当将DNA引入细胞时，可以添加促进DNA整合到染色体中的试剂。有助于促进整合的DNA序列也可能包含在DNA分子中。或者，可以将RNA施用于细胞。还考虑将遗传构建体作为线性小染色体提供，包括着丝粒，端粒和复制起源。基因构建体可能仍然是存在于细胞中的衰减活微生物或重组微生物载体中遗传物质的一部分。基因构建体可能是重组病毒疫苗基因组的一部分，其中遗传物质要么整合到细胞的染色体中，要么保持染色体外。遗传构建体包括核酸分子基因表达所必需的调节元件。这些元素包括：启动子，起始密码子，终止密码子和聚腺苷酸化信号。此外，编码靶蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达通常需要增强子。有必要将这些元件与编码所需蛋白质的序列相关联，并且调节元件在施用它们的个体中可操作。
根据一些实施方案，为了最大化蛋白质的产生，可以选择非常适合于在其构建体施用的细胞中的基因表达的调节序列。此外，可以选择在细胞中转录最有效的密码子。具有本领域普通技术的人可以产生在细胞中起作用的DNA构建体。
根据一些使用蛋白质的实施方案，例如，具有本领域普通技术人员可以使用公知的技术生产和分离本公开的蛋白质。根据所使用的蛋白质的一些实施方案，例如，具有本领域普通技术人员的人可以使用公知的技术，将编码本公开的蛋白质的DNA分子插入到市售的表达载体中，以用于公知的表达系统。例如，市售质粒pSE420(Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥)可用于生产大肠杆菌中的蛋白质。例如，市售质粒pYES2(Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥)可用于生产酿酒酵母菌株。例如，市售的MAXBACTM完全杆状病毒表达系统(Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥)可用于昆虫细胞的生产。例如，市售质粒pcDNA I或pcDNA3(Invitrogen，加利福尼亚州圣地亚哥)可用于生产哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢细胞。具有本领域普通技术人员的人可以使用这些商业表达载体和系统或其它物质通过常规技术和现成的起始原料来生产蛋白质。(请参见例如：，萨姆布鲁克等。，(1989)分子克隆实验室手册，第二版冷泉港出版社。因此，所需的蛋白质可以在原核和真核系统中制备，从而产生蛋白质的加工形式的光谱。
具有本领域普通技术人员的人可以使用其它市售表达载体和系统，或者使用公知的方法和现成的起始原料生产载体。表达系统包含必要的对照序列，例如启动子和聚腺苷酸化信号，并且优选增强子是容易获得的并且在本领域已知的各种宿主中。看例如：，萨姆布鲁克等。，分子克隆实验室手册，第二版冷泉港出版社(1989年)。遗传构建体包括可操作地与启动子相连的蛋白质编码序列，该启动子在构建体转染的细胞系中具有功能。组成性启动子的例子包括来自巨细胞病毒或SV40的启动子。诱导启动子的例子包括小鼠乳腺白血病病毒或金属硫蛋白启动子。具有本领域普通技术人员的人可以很容易地产生可用于用DNA转染细胞的遗传构建体，该DNA编码来自现成的起始原料的蛋白质的公开的蛋白质。包括编码蛋白质的DNA的表达载体用于转化相容宿主，然后在外源DNA表达发生的条件下培养和维持。
产生的蛋白质通过裂解细胞或从培养基中分泌，作为本领域技术人员已知的适当和已知的从培养基中回收。具有本领域普通技术人员的人可以使用众所周知的技术，分离出使用这种表达系统生产的蛋白质。如上所述，使用特异性结合特定蛋白质的抗体从天然来源纯化蛋白质的方法可以同样应用于通过重组DNA方法产生的蛋白质的纯化。
除了通过重组技术生产蛋白质外，还可以使用自动肽合成器来生产分离的，基本上是纯的蛋白质。这种技术对于具有本领域普通技术人员公知的，并且如果衍生物具有在DNA编码蛋白质生产中未提供的替代物，则这些技术是有用的。
根据本公开内容的一些实施方案，基因疫苗可以直接施用于个体进行免疫或离体进入个体的除去细胞中，这些细胞在给药后重新植入。通过任何一种途径，遗传物质被引入到存在于个体体内的细胞中。
核酸分子可以使用几种公知技术中的任何一种来递送，包括DNA注射(也称为DNA疫苗接种)，重组载体如重组腺病毒，重组腺病毒相关病毒和重组牛痘。
基因疫苗的给药途径包括但不限于肌内、不经期、腹膜内、皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服以及局部、透皮、通过吸入或栓剂或通过灌洗到阴道、直肠、尿道、口含和舌下组织等粘膜组织。首选给药途径包括肌内、腹膜内、皮内和皮下注射。遗传构建体可以通过包括但不限于传统注射器，无针注射装置或“微弹丸轰击基因枪”的手段施用。
根据一些实施方案，核酸分子与施用多核苷酸功能增强剂或遗传疫苗促进剂(“GVF”)剂一起递送到细胞。多核苷酸功能增强剂在1994年1月26日提交的美国序列号5,593,972、5,962,428和国际申请序列号PCT/US94/00899中进行了描述。遗传疫苗促进剂在美国有描述。序列号021，579提交于1994年4月1日。与核酸分子一起给药的助剂可以作为与核酸分子的混合物给药，或者在给药核酸分子之前或之后同时单独给药。此外，其他可能具有转染剂和/或复制剂和/或炎症剂功能且可与GVF共同施用的药物包括生长因子，细胞因子和淋巴因子，例如a-干扰素，γ-干扰素，GM-CSF，血小板衍生生长因子(PDGF)，TNF，表皮生长因子(EGF)，IL-1，IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IL-12和IL-15以及成纤维细胞生长因子，表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)、Freunds不完全佐剂、LPS类似物包括单磷酸脂质A(WL)、穆拉明肽、醌类似物和囊泡如角鲨烯和角鲨烯，并且透明质酸也可以与遗传构建体一起使用根据一些实施方案，免疫调节蛋白可用作GVF。根据一些实施方案，核酸分子与PLG结合以提供以增强递送/摄取。
根据本公开的一些实施方案的遗传疫苗包含约1纳克至约1000微克的DNA。根据一些示例性实施方案，疫苗含有约10纳克至约800微克的DNA。根据一些示例性实施方案，疫苗含有约0.1至约500微克的DNA。根据一些示例性实施方案，疫苗含有约1至约350微克的DNA。根据一些示例性实施方案，疫苗含有约25至约250微克的DNA。根据一些示例性实施方案，疫苗含有约100微克DNA。
遗传构建体可以任选地配制一种或多种反应增强剂，例如：增强转染的化合物，即，转染剂；刺激细胞分裂的化合物，即、复制代理；刺激免疫细胞迁移到给药部位的化合物，即，炎症剂；增强免疫反应的化合物，即、具有两种或多种这些活动活性的佐剂或化合物。
根据一些实施方案，布比卡因，一种众所周知的和市售的药物化合物，在基因构建之前、同时或之后施用。布比卡因和遗传构建体可以以相同的组合物配制。布比卡因作为细胞刺激剂特别有用，因为它在施用于组织时具有许多性质和活性。布比卡因促进和促进细胞对遗传物质的摄取。因此，它是一种转染剂。将遗传构建体与布比卡因一起施用有助于遗传构建体进入细胞。布比卡因被认为会破坏或以其他方式使细胞膜更具渗透性。布比卡因刺激细胞分裂和复制。因此，布比卡因充当复制剂。布比卡因的施用也会刺激和损害组织。因此，它充当炎症剂，引发免疫细胞向给药部位的迁移和趋化性。除了通常存在于给药部位的细胞外，响应于炎症剂迁移到该部位的免疫系统细胞可以与施用的遗传物质和布比卡因接触。布比卡因作为转染剂，也可用于促进免疫系统的这些细胞对遗传物质的摄取。
除布比卡因外，甲哌卡因、利多卡因、普鲁卡因、卡波卡因、甲基布比卡因和其他作用类似的化合物可用作反应增强剂。这些药物充当细胞刺激剂，促进遗传构建体进入细胞的摄取并刺激细胞复制以及在给药部位启动炎症反应。
其他可作为转染剂和/或复制剂和/或炎性剂且可施用的预考虑的反应增强剂包括凝集素、生长因子、细胞因子和淋巴因子，如α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、gCSF、gMCSF、TNF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12以及胶原酶，成纤维细胞生长因子，雌激素，地塞米松，皂苷，表面活性剂如免疫刺激复合物(ISCOMS)，弗氏不完全佐剂，LPS类似物包括单磷酸脂质A(MPL)，穆拉酰肽，醌类似物和囊泡如角鲨烯和角鲨烷，透明质酸和透明质酸酶也可以与遗传构建体一起施用。根据一些实施方案，这些试剂的组合与遗传构建体一起共同施用。在其它实施方案中，编码这些试剂的基因被包括在相同或不同的基因结构中，用于试剂的共表达。
脂质免疫原
免疫原(例如：，本文公开的保守型免疫原)也可以直接与以下免疫原相连，或通过间隔物或连接子连接到：免疫原性载体如血清白蛋白、破伤风类毒素、锁孔边缘血蓝蛋白、葡聚糖或重组病毒颗粒；已知刺激T辅助细胞型免疫反应的免疫原性肽；细胞因子，如γ-干扰素或GMCSF；靶向剂，如抗体或受体配体；稳定剂如脂质；或多个表位与支链赖氨酸核心结构的偶联物，如Posnett等人描述的所谓“多重抗原肽”等，通过引用将其全部并入本文；一种化合物如聚乙二醇以增加肽的半衰期；或附加氨基酸，例如前导体或分泌序列，或用于纯化成熟序列的序列。间隔物和连接子通常由相对较小的中性分子组成。此外，这种连接子不需要由氨基酸组成，但只要它们提供正确的间距，任何低聚结构都可以，从而优化本公开的免疫原性活性的所需水平。因此，免疫原可以采取任何能够引发CTL反应的形式。
本领域技术人员将理解，一旦掌握了本文提供的教导，本文所述的疫苗组合物包含许多分子，其中一些分子要么在单个启动子/调节序列的控制下表达，要么在多个这样的序列的控制下表达。此外，本公开内容包括一种或多种疫苗的施用，其中各种疫苗编码不同的分子。也就是说，各种分子(例如：、保守的免疫原、共刺激配体、细胞因子等)可在顺式(即，在相同的疫苗载体和/或由相同的连续核酸编码或在同一疫苗载体内的单独核酸分子上)或反式(即，各种分子由不同的疫苗表达)。
确定免疫反应的方法
与疫苗接种相关的大多数免疫反应由CD4+辅助表型的特定T细胞控制，该表型介导效应抗体，细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或先天免疫效应细胞的激活。由此产生的抗原特异性T细胞反应需要具有适当的类型，涉及：辅助性T细胞(TH表达细胞因子和共刺激分子的细胞)和/或细胞毒性T淋巴细胞(CTL)，并且具有记忆和归巢能力，不应通过负反馈或免疫检查点耗尽或通电。需要一种制剂(抗原、载体、佐剂；其比例)和方案(包括免疫接种之间的次数和间隔以及疫苗接种途径)来产生适当的T细胞反应。这些T细胞的测量和表征提供了免疫原性和有效性的有用标志物，并为进一步开发疫苗的机制提供信息。
用于确定免疫应答的方法在本领域是已知的。根据一些实施方案，可以检查病毒病变以确定对病毒和/或抗原的免疫应答的发生。根据一些实施例，体外测定可用于确定免疫反应的发生。此类示例体外检测包括ELISA检测和细胞毒性T细胞(CTL)检测。根据一些实施方案，免疫应答是通过检测和/或量化抗体的相对量来测量的，该抗体特异性地识别通过施用包含抗原的活的、修饰的、非复制的或复制受损的痘病毒来治疗的受试者血清中的抗原，相对于未治疗的受试者中的抗体量。
用于测定样品中抗体的技术在本领域是已知的，并且包括例如三明治测定、ELISA和ELISpot。多克隆血清相对容易地通过注射具有有效量的免疫效应子或其抗原部分的合适的实验动物，从动物中收集血清并通过任何已知的免疫吸附剂技术分离特异性血清来制备。通过这种方法产生的抗体几乎可以用于任何类型的免疫测定。
在免疫测定中使用单克隆抗体是优选的，因为其能够大量产生单克隆抗体并且产物的均匀性。通过融合不朽细胞系和对免疫原性制剂致敏的淋巴细胞来制备用于单克隆抗体生产的杂交瘤细胞系可以通过本领域技术人员熟知的技术来实现。在其它实施方案中，ELISA测定可用于使用本领域已知的方法测定同种型特异性抗体的水平。
CTL测定可用于测定CTL的裂解活性，测量表达某种抗原的靶细胞的特异性裂解。免疫测定可用于测量激活(例如：，活化程度)的样品免疫细胞。“样本免疫细胞”是指来自任何来源的样品中所含的免疫细胞，包括来自人类患者、人类供体、动物或组织培养细胞系的免疫细胞。免疫细胞样品可以来源于外周血、淋巴结、骨髓、胸腺、任何其他组织来源，包括原位或切除的肿瘤，或来自组织或器官培养物。在分析之前，样品可以分馏或纯化以产生或富集特定的免疫细胞亚群。免疫细胞可以通过标准技术从其来源中分离和分离。
免疫细胞包括非静息细胞和静息细胞，以及可以测定的免疫系统细胞，包括但不限于B淋巴细胞，T淋巴细胞，自然杀伤(NK)细胞，不变NKT(iNKT)细胞，淋巴因子活化杀伤(LAK)细胞，单核细胞，巨噬细胞，嗜中性粒细胞，粒细胞，肥大细胞，血小板，Langerhans细胞，干细胞，树突状细胞和外周血单核细胞。
可以测量的免疫细胞活性包括但不限于(1)通过测量细胞或DNA复制的细胞增殖；(2)增强的细胞因子产生，包括细胞因子的特异性测量，如γIFN，GM-CSF或TNF-α，IFN-α，IL-6，IL-10，IL-12；(3)细胞介导的靶标杀伤或裂解；(4)细胞分化；(5)免疫球蛋白的产生；(6)表型变化；(7)产生趋化因子或趋化性，即对具有趋化性反应的化他汀的能力；(8)免疫抑制，通过抑制其他一些免疫细胞类型的活性；(9)趋化因子分泌如IP-10；(10)共刺激分子(例如：、CD80、CD86)和成熟分子(例如：，CD83)，(12)II类MHC表达的上调；和(13)细胞凋亡，其是指在某些情况下活化的免疫细胞的碎片化，作为异常活化的指示。
报告分子可用于所描述的许多免疫测定。报告分子是一种分子，由于其化学性质，提供分析可识别的信号，允许检测抗原结合抗体。检测可以是定性的，也可以是定量的。在这种类型的测定中，最常用的报告分子是酶，荧光团或含有放射性核素的分子(即放射性同位素)和化学发光分子。在酶免疫测定的情况下，酶与第二种抗体偶联，通常通过戊二醛或高碘酸盐。然而，正如人们很容易认识到的那样，存在各种不同的共轭技术，这些技术对于熟练的工匠来说是现成的。常用的酶包括辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶等。通常选择与特定酶一起使用的底物，以便在相应的酶水解后生产可检测的颜色变化。合适的酶的实例包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。也可以使用荧光底物，其产生荧光产物而不是上述显色底物。在所有情况下，将酶标记的抗体添加到第一个抗体-抗原复合物中，允许其结合，然后将多余的试剂洗掉。然后将含有适当底物的溶液加入到抗体-抗原-抗体复合物中。底物将与与第二种抗体连接的酶反应，产生定性的视觉信号，该信号可以进一步定量，通常是分光光度法，以指示样品中存在的抗原量。或者，荧光化合物，如荧光素和罗丹明，可以在不改变其结合能力的情况下与抗体进行化学偶联。当用特定波长的光照明激活时，荧光染料标记的抗体吸附光能，诱导分子中激发的状态，然后以光学显微镜视觉上可检测到的特征颜色发射光。允许荧光标记的抗体与第一个抗体-抗原复合物结合。在洗掉未结合的试剂后，剩余的三级复合物然后暴露于适当波长的光下，观察到的荧光表明存在感兴趣的抗原。
测量与疫苗接种相关的记忆T细胞的能力对于确定疫苗的免疫原性非常重要，并且可能通过与感染和/或疾病保护呈正相关而成为功效的生物标志物。测量T细胞反应的重要因素是测量方法，何时进行这些测量以及在哪些位置。在疫苗接种方案期间，在循环PBMCs中测量的T细胞反应往往遵循适应性免疫反应的典型模式，即，初始暴露之后是滞后阶段，然后在大约一到两周时达到反应峰值(例如抗原特异性IFNγ反应)，最终稳定下来，回到幼稚反应引起的反应。由于启动产生的记忆，通过提升进行第二次曝光会产生更快，更大的响应。通过效应器T细胞(TE)消耗，然后这种反应稳定到比提振前更高的水平。因此，增强的目的是使T细胞达到假定的“保护”水平。迄今为止，尚未确定T细胞反应与对感染和疾病的保护程度之间的直接相关性用于临床。“QuantiferonTM”和ELISpot测试已经能够通过检测外周T细胞对特定TB抗原有反应的IFNγ分泌来检测高危个体中潜在的结核分枝杆菌感染。然而，接种结核病疫苗后的这种反应与预防感染无关。即使PBMC可能不是检测需要在特定组织(如粘膜)中起作用的反应性T细胞的理想位置，运输中的前体(如T断续器和T厘米)可通过专用或修改的技术进行测量。全血或PBMC的离体技术涉及暴露于疫苗抗原和反应的测量，通常在一天内发生。最常见的此类测试包括从血细胞中大量分泌细胞因子(全血测定/ELISA)以及通过流式细胞术和酶联免疫斑(ELISpot)测量细胞因子。这样做是为了在单细胞水平上识别反应细胞。可用流式细胞术参数数量的增加意味着可以使用单细胞质量细胞术和RNA测序将细胞识别为分泌或表达大量分子，从而允许它们在效应表型，记忆表型等内进行表征。血液中与疫苗接种相关的分子特征继续暗示T细胞的保护。虽然它更麻烦，但将一段时间的血细胞培养与抗原和其他因素相结合，可以使特定的记忆细胞如T厘米被揭示，因为文化促进了对T的分化断续器和/或TE.一种将全血与精确的疫苗制剂(佐剂中的抗原+TLR配体)一起培养的方法(Hakimi J.等人，2017 Hum Vaccin Immunother。9月2；13(9)：2130-2134)显示T细胞细胞因子分泌显著升高。这些结果表明，全血的成分与疫苗的成分相互作用，以一种可能模仿的方式促进T细胞再激活。体内事件。这种测定能够监测疫苗配方的效力，并测试疫苗接受者对疫苗作出反应的潜力。体内.能够模拟异位淋巴结构(记忆库)可能提供一种重建和研究疫苗反应的方法。体外.
其它示例性免疫测定如下所述。
细胞增殖检测：活化的免疫细胞增殖旨在包括细胞数量增加，细胞生长，细胞分裂或细胞扩增，通过细胞数量，细胞重量或放射性标记的核酸，氨基酸，蛋白质或其他前体分子的掺入来测量。作为一个例子，DNA复制是通过掺入放射性同位素标签来测量的。根据一些实施方案，受刺激的免疫细胞的培养物可以通过DNA合成来测量，方法是用烙化胸腺嘧啶(3H-Tdr)对培养物进行脉冲标记，3H-Tdr是一种被掺入新合成的DNA中的核苷前体。胸苷掺入提供了DNA合成速率的定量测量，其通常与细胞分裂速率成正比。金额3掺入培养细胞复制DNA中的H标记胸苷通过液体闪烁分光光度计中的闪烁计数测定。闪烁计数产生每分钟计数(cpm)的数据，然后可以用作免疫细胞反应性的标准测量。静息免疫细胞培养物中的cpm可以从引物免疫细胞中减去或除以cpm，这将产生刺激指数比。
流式细胞术也可用于通过用光散射、库尔特体积和荧光测量DNA来测量增殖，所有这些都是本领域众所周知的技术。
增强细胞因子生产检测：免疫细胞刺激的一个标准是细胞分泌细胞因子、淋巴因子或其他生长因子的能力。细胞因子的产生，包括细胞因子的特异性测量，如γIFN，GM-CSF或TNF-α，可以通过放射性免疫测定(RIA)，酶联免疫吸收测定(ELISA)，生物测定或信使RNA水平的测量进行。通常，通过这些免疫测定，使用对待测细胞因子的单克隆抗体来特异性结合并因此鉴定细胞因子。免疫测定是本领域公知的，并且可以包括竞争性测定和免疫测定，例如正向三明治免疫测定、反向三明治免疫测定和同时免疫测定。
在上述每种测定中，含细胞因子的样品与细胞因子特异性单克隆抗体一起孵育，条件和时间足以使细胞因子与单克隆抗体结合。通常，希望提供足以结合尽可能多的细胞因子和抗体的孵育条件，因为这将最大化信号。当然，抗体的具体浓度、孵育的温度和时间以及其他诸如测定条件可以变化，这取决于各种因素，包括样品中细胞因子的浓度、样品的性质等。本领域技术人员将能够通过采用常规实验来确定每个测定的操作和最佳测定条件。
细胞介导的靶细胞裂解测定：免疫细胞活化程度的另一种指标是免疫细胞介导的靶细胞裂解，其含义包括任何类型的细胞杀伤，包括细胞毒性T淋巴细胞活性，细胞凋亡以及由非静息免疫细胞分泌的分子诱导靶裂解刺激活性。细胞介导的淋巴溶解技术通常测量受刺激的免疫细胞裂解的能力51Cr标记的靶细胞。细胞毒性以51Cr在特定靶细胞中释放的百分比与51Cr从对照靶细胞释放。细胞杀伤也可以通过计数靶细胞的数量来测量，或者通过量化靶细胞生长的抑制来测量。
细胞分化检测：免疫细胞活性的另一个指标是免疫细胞分化和成熟。细胞分化可以通过几种不同的方式进行评估。一种这样的方法是测量细胞表型。免疫细胞的表型和任何表型变化都可以在免疫荧光染色后通过流式细胞术进行评估，这些单克隆抗体将结合各种免疫细胞类型特征的膜蛋白。
评估细胞分化的第二种方法是测量细胞功能。这可以通过测量细胞内或从细胞分泌的酶，mRNA，基因，蛋白质或其他代谢物的表达来生化地完成。生物测定也可用于测量功能性细胞分化。
免疫细胞表达多种细胞表面分子，可以用单克隆抗体或多克隆抗血清检测。已经分化或活化的免疫细胞也可以通过染色来列点，通过直接免疫荧光在培养细胞的固定涂片中存在特征性细胞表面蛋白。
成熟的B细胞可以在免疫测定中测量，例如，通过细胞表面抗原包括CD19和CD20，用荧光染料标记的单克隆抗体或可用于这些抗原的酶。已经分化成浆细胞的B细胞可以通过在培养细胞的固定涂片中通过直接免疫荧光染色细胞内免疫球蛋白来列点。
免疫球蛋白生产测定：B细胞活化，生成少量但可检出的多克隆免疫球蛋白。培养几天后，这些免疫球蛋白可通过放射免疫测定法或酶联免疫吸附测定(ELISA)方法进行测定。
产生免疫球蛋白的B细胞也可以通过反向溶血斑块测定来定量。在该测定中，红细胞被山羊或兔子抗人免疫球蛋白包被。将这些免疫球蛋白与活化的产生免疫球蛋白的淋巴细胞和半固体琼脂混合，并加入补体。溶血斑块的存在表明存在产生免疫球蛋白的细胞。
趋化因子测定：趋化因子是诱导或抑制免疫细胞迁移到血管、组织或器官中的分子，包括细胞迁移因子。免疫细胞的趋化因子可以通过流式细胞术测定，使用标记的单克隆抗体来检测趋化因子或被测定的因子。趋化因子也可以通过ELISA或其他免疫测定，生物测定，信使RNA水平以及通过直接测量(例如细胞计数)在专门的迁移室中的免疫细胞运动来测定。
追加分析：当添加到新鲜外周血单核细胞中时，自体离体活化细胞对“召回”抗原的反应增强，该抗原是外周血单核细胞先前接触过的抗原。当一起培养时，预浸或受刺激的免疫细胞应增强其他免疫细胞对“召回”抗原的反应。这些测定被称为“辅助”或“附加”测定。在该测定中，将引物或受刺激的免疫细胞添加到未处理的，通常是自体免疫细胞中，以确定未处理细胞的反应。添加的引物细胞可以被辐照以防止其增殖，从而简化了对未处理细胞活性的测量。这些测定在评估暴露于病毒的血液的细胞方面可能特别有用。加法测定可以测量增殖，细胞因子产生和靶细胞裂解，如本文所述。
上述测定免疫应答的附加方法和其它方法是本领域公知的。
使用方法
根据本公开的进一步实施方案，提供了用于降低感染风险的方法，该感染因子根据本公开内容进行疫苗接种。根据一些实施方案，一种方法包括向有需要的受试者施用足够量的免疫原或其蛋白质，以降低感染的风险。
根据本公开的进一步实施方案，提供了预防方法，包括对受试者进行病毒感染的疫苗接种和免疫的方法，例如：，流感感染，例如，但不限于，保护受试者免受流感感染，以降低或降低受试者感染或病理的概率，或降低或降低受试者对流感感染或病理学的易感性，或抑制或预防受试者的流感感染或降低在易感人群中的传播风险。
根据另一个实施方案，该方法包括用于诱导细胞免疫应答的过程体外即由病毒感染细胞表达的病毒特异性抗原，包括将CTL前体淋巴细胞与表达编码为病毒多肽的抗原呈递细胞接触，其中所述多核苷酸可操作地与启动子相连。与刺激器APCs上表达的MHC分子结合的外来病毒抗原可以作为对包含具有杀死病原体感染细胞能力的细胞群的响应T淋巴细胞的激活刺激，同时表现出对这种杀伤作用的抵抗力。杀死病原体感染细胞的能力可能是直接的，尽管细胞溶解或细胞毒性活动，或者间接地通过对靶向致病细胞的其他细胞和蛋白质进行免疫调节。有多种细胞可以显示这种效应器功能，例如NK细胞，NKT细胞，LAK细胞，CIK细胞，MAIT细胞，CD8+CTL，CD4+CTL(统称为“CTL”)。然后可以测量响应T淋巴细胞的增殖。
存在多种技术来测定活化的CTL的活性，并且在下面描述。
在抗原特异性CTL扩增后，激活的CTL随后被过继性地转移回患者体内，在那里它们将破坏其特定的靶细胞。将T细胞重新注入患者的方法在Honski的美国专利No.4,844,893中是众所周知的和例证，等。，以及美国第4,690,915号至罗森伯格。
肽特异性活化CTL可以在输注到患者之前从刺激器细胞中纯化。例如，针对细胞表面蛋白CD8的单克隆抗体(存在于CTL上)可以与各种分离技术(例如抗体淘金，流式细胞术分选和磁珠分离)结合使用，以纯化肽特异性CTL，使其远离任何剩余的非肽特异性淋巴细胞或刺激细胞。
因此，根据本公开的一些实施方案，用于降低感染病原体的风险、降低感染在人群中传播风险、或两者兼而有之的过程包括施用、活化CTL的产生。体外其量足以通过细胞因子的细化直接或间接地影响病原体感染细胞的破坏。
本公开的另一个实施方案是针对用于治疗有感染病原体风险的受试者、降低感染在人群中传播风险或两者兼而有之的方法，其中感染的特征在于病原体感染细胞表达任何I类MHC分子和内部CD8+T细胞表位，如使用本文所述的方法确定的那样，包括在体外产生针对表位或原始蛋白的活化CTL，并且以足以通过直接裂解破坏受感染细胞或通过细胞因子的阐述间接影响受感染细胞的破坏的量施用活化的CTL。
根据一些实施方案，离体生成的活化CTL可用于鉴定和分离针对肽的T细胞受体分子。编码T细胞受体α链和β链的基因可以被克隆到表达载体系统中，并在来自外周血的幼稚T细胞，来自淋巴结的T细胞或来自骨髓的T淋巴细胞祖细胞中转移和表达。然后，这些T细胞将表达肽特异性T细胞受体，然后具有抗病毒反应性，可用于感染的过继治疗，对抗多种异源亚型病毒。
除了它们用于治疗或预防目的外，本公开的免疫原性肽还可用作筛选和诊断剂。因此，本公开的免疫原性肽，加上CTL筛选的现代技术，使得能够筛选患者是否存在针对这些肽的特异性T细胞，作为病毒感染、暴露和免疫应答的测试。这种筛选的结果可能有助于确定使用本公开的免疫原继续使用本文公开的治疗方案的疗效。
含有本公开的一种或多种免疫原的组合物的治疗有效量足以诱导有效的CTL反应以预防、治愈或阻止人群中的疾病进展。因此，除其他事项外，该剂量将取决于所用免疫原的特性，疾病状况的性质，疾病状况的严重程度，在尚未检测到的情况下预防这种情况的任何需要的程度，需要这种施用的情况所决定的给药方式，接受这种给药的个人的体重和健康状况，以及临床医生或研究人员的合理判断。
药物组合物
通常，疫苗以水溶液或悬浮液的形式制备为注射剂。通常可以添加与活性成分相容且可用于药物用途的药物载体，稀释剂和赋形剂。
虽然本领域普通技术人员已知的任何合适的载体都可以采用在本公开的疫苗组合物中，但载体的类型将根据给药方式而变化。本公开的组合物可以配制用于任何适当的给药方式，包括例如局部、口服、鼻腔、静脉内、颅内、腹膜内、皮下或肌肉内给药。对于肠胃外给药，例如皮下注射，载体优选包含水、生理盐水、酒精、脂肪、蜡或缓冲剂。对于口服给药，上述任何载体或固体载体，如甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖和碳酸镁，都可以采用。可生物降解的微球(例如：，聚乳酸聚乙醇酸酯)也可以用作本公开内容的药物组合物的载体。合适的可生物降解微球公开，例如在美国专利4,897,268中；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344和5,942,252。修饰的乙型肝炎核心蛋白载体系统也是合适的，例如WO/9940934中描述的那些，以及其中引用的参考文献，所有这些都通过参考文献并入本文。还可以使用包含美国专利5,928,647中描述的颗粒蛋白复合物的载体，其能够在宿主中诱导I类限制性细胞毒性T淋巴细胞反应。
这样的组合物还可以包含缓冲液(例如：、中性缓冲盐水或磷酸盐缓冲盐水)、碳水化合物(例如：、葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸(如甘氨酸)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(如EDTA或谷胱甘肽)、佐剂(例如：，氢氧化铝)，使制剂与受体的血液等渗，低渗或弱高渗，悬浮剂，增稠剂和/或防腐剂的溶质。或者，本公开的组合物可以配制成冻干剂。化合物也可以使用众所周知的技术封装在脂质体中。
多种免疫刺激剂中的任何一种都可以任选地用于本公开的疫苗中。例如，可以包括佐剂。大多数佐剂含有一种旨在保护抗原免受快速分解代谢的物质，如氢氧化铝或矿物油，以及免疫反应的刺激剂，如脂质A、百日咳博塔黛菌或结核分枝杆菌衍生的蛋白质。示例性佐剂在商业上可用，例如弗罗因德不完全佐剂和完全佐剂(Difco实验室，底特律，密歇根州)；Merck Adjuvant 65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKlineBeecham，费城，宾夕法尼亚州)；铝盐，如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝；钙，铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生化多糖；多磷腈；可生物降解的微球；单磷酸脂质A和quilA.细胞因子，如GM-CSF或白细胞介素-2、-7或-12，也可用作佐剂。在本文中提供的基于HCMV和基于RhCMV的疫苗载体的背景下，佐剂组合物是可选的，但如果包括，则被设计为主要诱导T你好的免疫应答。类型。高水平的T你好-型细胞因子{例如：，IFN-γ，TNFα，IL-2和IL-12)倾向于诱导细胞介导的对施用抗原的免疫应答。相比之下，高水平的TH2-型细胞因子{例如：，IL-4，IL-5，IL-6和IL-10)倾向于诱导体液免疫反应。在应用本文提供的疫苗后，患者将支持包括T你好-和TH2-类型响应。例如，在响应主要为T你好的实施例中-类型，T你好的水平-型细胞因子将比T水平增加更大H2-型细胞因子。这些细胞因子的水平可以很容易地使用标准测定来评估。有关细胞因子家族的综述，请参阅Mosmann和Coffman，Ann.Rev.Immunol。7:145-173,1989.
根据一些实施方案，佐剂用于引出主要T你好采用-类型响应。这种佐剂包括，例如，单磷酸基脂质A的组合，优选3-de-O-酰基化的单磷酸基脂质A(3D-MPL)，以及铝盐。MPL佐剂可从Corixa公司(华盛顿州西雅图；参见美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)获得。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也诱导主要T你好响应。这种寡核苷酸是众所周知的，并且例如在WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利6,008,200和5,856,462中进行了描述。免疫刺激性DNA序列也由Sato描述，例如，由Sato描述等。，科学273：352，1996.另一个示例性佐剂是皂苷，例如QS21(Aquila Biopharaiaceuticals Inc.，Framingham，MA)，它可以单独使用或与其他佐剂联合使用。例如，增强系统涉及单磷酸脂质A和皂苷衍生物的组合，例如WO 94/00153中描述的QS21和3D-MPL的组合，或WO 96/33739中描述的QS21用胆固醇淬灭的较少反应性组合物。其它示例性配方包括水包油乳液和生育酚。WO 95/17210中描述了一种特别有效的佐剂制剂，涉及水包油乳液中的QS21，3D-MPL和生育酚。其他示例性佐剂包括Montanide ISA 720(法国Seppic)，SAF(美国加利福尼亚州凯龙)，ISCOMS(CSL)，MF-59(Chiron)，SBAS系列佐剂(例如：，SBAS-2或SBAS-4，可从比利时Rixensart的SmithKline Beecham获得)，Detox(Corixa，Hamilton，MT)，RC-529(Corixa，Hamilton，MT)和其他氨基烷基氨基葡萄糖酰胺4-磷酸盐(AGP)，例如在未决的美国专利申请序列号08/853,826和09/074,720中描述的那些，其公开内容全文通过引用并入本文。其它示例性佐剂包括聚氧乙烯醚，例如WO 99/52549 Al中描述的那些。
本文提供的任何疫苗都可以使用公知的方法制备，这些方法导致载体、任选的免疫应答增强剂和合适的载体或赋形剂的组合。本文中描述的组合物可作为缓释制剂(即，一种制剂，例如胶囊，海绵或凝胶(例如由多糖组成)，其影响给药后化合物的缓慢释放)。这种制剂通常可以使用公知的技术来制备(参见，例如：，库姆斯等。，疫苗74：1429-1438，1996)并通过例如口服，直肠或皮下植入，或通过在所需目标部位植入来施用。缓释制剂可含有分散在载体基质中的多肽、多核苷酸或抗体和/或包含在被速率控制膜包围的储液槽内。
用于此类制剂的载体具有生物相容性，并且也可能是可生物降解的；优选该制剂提供相对恒定水平的活性组分释放。这种载体包括聚(丙交酯-共乙二醇化物)、聚丙烯酸酯、乳胶、淀粉、纤维素、葡聚糖等的微粒。其他延迟释放载体包括超分子生物载体，其包括非液体亲水核心(例如：、交联多糖或低聚糖)和任选地，包含两亲性化合物的外层，例如磷脂(参见例如：、美国专利号5,151,254和PCT申请WO 94/20078、WO/94/23701和WO 96/06638)。缓释制剂中所含活性化合物的量取决于植入部位、释放速率和预期持续时间以及要治疗或预防的病症的性质。
无论所给予的组合物的性质如何，附加的疫苗组合物也可以伴随本公开的免疫原。因此，为了预防或治疗感染(例如：、预防性或治疗性疫苗)，含有本文公开的免疫原的组合物，此外，还可以含有其它疫苗药物。具有多种活性成分的这种组合物的使用由临床医生自行决定。
根据一些实施方案，公开的药物制剂中免疫原性多肽的浓度具有广泛的变化，包括从重量小于0.01％到高达50％或更多的任何地方。还必须考虑所得组合物的体积和粘度等因素。用于此类组合物的溶剂或稀释剂包括水、二甲基亚砜、PBS(磷酸盐缓冲盐水)、或盐水本身、或其它可能的载体或赋形剂。
根据一些实施方案，根据本公开内容的药物组合物包含约1纳克至约2000微克的DNA。根据一些优选的实施方案，根据本公开内容的药物组合物包含约5纳克至约1000微克的DNA。根据一些优选的实施方案，药物组合物含有约10纳克至约800微克的DNA。根据一些优选的实施方案，药物组合物含有约0.1至约500微克的DNA。根据一些优选的实施方案，药物组合物含有约1至约350微克的DNA。根据一些优选的实施方案，药物组合物含有约25至约250微克的DNA。根据一些优选的实施方案，药物组合物含有约100至约200微克的DNA。
本公开的肽和多肽还可以添加到专业的抗原呈递细胞中，例如已经离体制备的树突状细胞。
管理
根据本公开内容的免疫原性组合物可以通过各种途径施用于对付感染因子，以施用于个体或人群。该组合物可以肠胃外或口服给药，如果肠胃外，则全身或局部给药。肠外途径包括皮下、静脉、皮内、肌肉内、腹膜内、鼻内、透皮或颊部途径。可以采用一个或多个这样的路线。例如，胃肠外给药可以通过推注或随时间逐渐灌注。
根据一些实施方案，本公开内容提供了一种疫苗，其中本公开的免疫原以本文所公开的编码多肽或活性片段的多核苷酸的形式递送或施用，从而产生肽或多肽或活性片段。体内.多核苷酸可包含在合适的表达载体中并与药学上可接受的载体结合。各种各样的载体是可用的，并且对于本领域技术人员来说是显而易见的。可用于免疫方案的牛痘载体和方法在美国专利第4,722,848号中描述，其公开全文通过引用并入本文。
本文中描述的组合物可以在其它疫苗的交付之前、同时或之后施用。此外，给药部位可以与正在施用的其它疫苗组合物相同或不同。
用组合物治疗的剂量可以是单剂量方案或多剂量方案。多剂量方案是指一个主要接种疗程可以是1-10个单独的剂量，然后在随后的时间间隔内给予其他剂量，选择维持和/或加强免疫反应，例如在1-4个月时接种第二剂，如果需要，几个月后接种后续剂量。剂量方案也将，至少赋予，取决于方式的效力，使用的疫苗交付，受试者的需要，并取决于从业者的判断。
在本公开的特定实施方案中，每次注射都含有在免疫期间来自不同载体来源的重组疫苗。
Prime-Boost
根据本公开内容的一些实施方案，在上述疫苗免疫过程中，疫苗被免疫采用“原基和助推”免疫策略进行免疫，并且每个重组疫苗至少接种一次。根据一些实施方案，本公开涉及“素数和助推”免疫方案，其中通过施用启动组合物诱导的免疫应答通过施用助推组合物来增进。例如，在用遗传或DNA质粒疫苗启动后，可以使用亚基或蛋白质疫苗实现有效的增压。本公开的一些实施方案采用亚基或蛋白质疫苗，用于使用遗传或DNA质粒疫苗来增强针对抗原的免疫应答。
使用本公开的实施方案允许亚基或蛋白质疫苗来增强由DNA疫苗引发的免疫应答。也可以使用单价或其他多价疫苗。
有利的是，可以采用使用肌内免疫的疫苗接种方案作为主要和增强，构成适合于诱导免疫反应的一般免疫方案，例如：，在人类中。
本公开内容的一些实施方案在各个方面和实施方案中采用亚基或蛋白质疫苗来增强对通过先前施用编码抗原的核酸引发的抗原的免疫应答。
根据一些实施方案，本公开规定使用亚基或蛋白质疫苗来增强对抗原的免疫应答。
根据一些实施方案，本公开提供了一种诱导个体对抗原的免疫应答的方法，该方法包括向个体施用包含编码抗原的DNA疫苗如HA的启动组合物，然后施用包含亚基或蛋白质疫苗的增强组合物。
根据一些实施方案，本公开规定使用基因疫苗来启动和亚基或蛋白质疫苗来增强。
启动组合物可包含编码抗原的DNA，例如这种DNA是环状质粒的形式，其不能在哺乳动物细胞中复制。任何可选择的标志物都不应对临床上使用的抗生素产生耐药性，因此例如卡那霉素耐药性优于氨苄西林耐药性。抗原表达应由在哺乳动物细胞中活跃的启动子驱动，例如巨细胞病毒即刻早期(CMV IE)启动子。
根据本公开的一些实施方案，在施用启动组合物之后是用第一和第二增强组合物进行增压，所述第一和第二助推组合物彼此相同或不同，例如：，如下例所示。更进一步，可以在不偏离本公开的某些实施方案的情况下采用助推组合物。
启动和增强组合物中的一种或两种都可以包括佐剂或细胞因子，例如α-干扰素、γ-干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(gM-CSF)粒细胞集落刺激因子(gCSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12，或编码其的核酸。
助推组合物的施用通常在给药启动组合物后数周或数月，优选约2-3周或4周，或8周，或16周，或20周，或24周，或28周，或32周。根据一些实施方案，所述助推组合物配制为给药约1周、或2周、或3周、或4周、或5周、或6周、或7周、或8周、或9周、或16周、或20周、或24周、或28周、或32周后给药。
无论所给予的组合物的性质如何，附加的疫苗组合物也可以伴随本公开的免疫原。因此，为了预防或治疗病毒感染(例如：、预防性或治疗性疫苗)，含有本文公开的免疫原的组合物，此外，还可以含有其它疫苗药物。具有多种活性成分的这种组合物的使用由临床医生自行决定。
科目
根据一些实施方案，需要治疗的受试者是具有或有感染风险的受试者(例如：，受试者有或有感染病毒，细菌，真菌或原生动物感染的风险)。
免疫抑制期间的病毒感染是移植、风湿病和其他免疫缺陷疾病(例如：，艾滋病毒)。因此，可根据本公开的基于过继免疫的实施方案治疗的受试者包括免疫功能低下的受试者。
根据一些实施方案，“具有感染的受试者”是已经暴露于具有其体内具有急性或慢性可检测水平的微生物的感染性微生物或具有传染性微生物的体征和症状的受试者。评估和检测受试者感染的方法为本领域普通技术人员所熟知。“有感染风险的受试者”是可能预期与传染性微生物接触的受试者。这类受试者的例子是医务工作者或前往世界上感染率高的地区的人。根据一些实施方案，受试者处于感染风险的升高，因为受试者具有一个或多个具有感染的危险因素。感染的危险因素的例子包括，例如，免疫抑制、免疫功能低下、年龄、创伤、烧伤(例如：，热灼伤)，手术，异物，癌症，新生儿，特别是早产新生儿。感染的风险程度取决于受试者具有的风险因素的多样性和严重程度或大小。风险图表和预测算法可用于根据风险因素的存在和严重程度评估受试者的感染风险。评估受试者感染风险的其他方法为本领域普通技术人员所熟知。根据一些实施方案，处于感染风险升高的受试者可能是一个明显健康的受试者。“明显健康的受试者”是没有疾病体征或症状的受试者。
根据一些实施方案，考虑与目标人群的年龄相关的其他因素进行疫苗接种。这些因素包括但不限于合并症、地理因素(包括微生物流行)、营养状况和医源性免疫抑制。
包
为便于使用本公开的方法和组合物、任何疫苗成分和/或组合物，例如：、各种制剂中的病毒等，以及附加组分，如缓冲液、细胞、培养基，可用于实验或治疗性疫苗目的的包装，可以以试剂盒的形式包装。通常，除上述组件外，该套件还包含其他材料，其中可以包括：例如：、用于执行本公开方法的说明、包装材料和容器。
在提供一定范围值的情况下，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则每个干预值的单位为下限的十分之一，在该范围的上限和下限与该陈述范围内的任何其他陈述或干预值之间都包含在本发明中。这些较小范围的上限和下限可以独立地包含在较小的范围内，也包含在本发明中，受制于所述范围内的任何明确排除的限制。如果所述范围包括一个或两个限制，则排除这两个限制中的任何一个的范围也包括在本发明中。
除非另有定义，否则此处使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。尽管任何与本文描述的方法和材料相似或等效的方法和材料也可用于本发明的实践或测试，但已经描述了示例性方法和材料。此处提及的所有出版物均通过引用并入本文，以公开和描述与出版物相关的引用方法和/或材料。还应当理解的是，在本公开中，在使用单数的情况下，复数可以被推断出来，反之亦然，并且使用其中任何一种都不应被视为限制。
本文讨论的出版物仅用于在本申请的申请日期之前进行公开，并且每个出版物都通过引用全部并入。此处的任何内容均不得解释为承认本发明无权因先前的发明而提前公布。此外，所提供的出版日期可能与实际出版日期不同，后者可能需要独立确认。
例子
提出以下实施例是为了向本领域普通技术人员提供关于如何制造和使用本发明的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人所认为的发明的范围，也不旨在表示以下实验是全部或唯一进行的实验。已经努力确保所用数字(例如数量，温度等)的准确性，但应考虑一些实验误差和偏差。除非另有说明，否则份数为重量份，分子量为重均分子量，温度以摄氏度为单位，压力在大气压或接近大气压。
示例1：为保守蛋白质生成共识序列
示例1A：
仅作为示例，可以通过从制备的保守序列的致病性库中执行多个序列比对，并获得其鉴定的共识序列来实现对保守蛋白质的共识序列的使用。
病原体文库制备
根据一些实施方案，病原体文库将包含参考基因组或保守蛋白质序列，以及类似的基因组或保守蛋白质序列。
制备含有参考基因组或蛋白质序列的DNA文库可以通过本领域已知的方法生成。
例如，参考基因组/蛋白质序列可以如本文所述。简而言之，诸如国家生物技术信息中心(NCBI)(位于https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)之类的数据库，例如NCBI的GenBank，EMBL的核苷酸序列数据库，通用蛋白质资源(UniProt)和蛋白质数据库(PDB)，可以搜索所选病原体的参考基因组，然后可以过滤以指定表达的保守蛋白质的编码基因序列。进入NCBI数据库后，将在“所有数据库”下拉框下选择“基因组”。目标病原体的物种名称将被输入到搜索字段中并提交。将选择参考基因组选项。接下来，将在“相关主题”标题下选择“基因”选项。然后将过滤结果以产生蛋白质编码序列。然后，将创建一个自定义过滤器来过滤与蛋白质序列，变异信息，同源数据和/或计算为包含保守结构域的蛋白质相关的基因记录。或者，从基因组概述表中，可以选择蛋白质细节以显示保守表达的蛋白质。选择每个所需记录将生成用于多个序列比对的标识号或序列。
类似的基因组或蛋白质序列可以通过本领域已知的方法生成。例如，在所研究病原体的参考基因组记录的参考“相关主题”标题下选择“其他基因组”将为各种不同的菌株，变异，组，分支，血清型和亚型生成其他相关基因组。或者，病原体物种的各种不同菌株，变体，组，分支，血清型和亚型的基因组和蛋白质序列可以通过选择生物体或蛋白质记录从参考基因组记录的基因组组装和注释报告中获得。
或者，可以通过本领域已知的算法生成对相似的保守蛋白质序列的搜索，例如FASTA(在https://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta/发现)，ClustalW(在https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/发现)，HMMER(在http://hmmer.org/发现)，MMseqs2(在https://github.com/soedinglab/mmseqs2发现)和基本局部比对搜索工具(BLAST；在https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi发现)可用于生成相似的基因组或蛋白质序列。BLAST执行序列比对并进行评分，以查找给定查询序列的相似核苷酸或蛋白质序列。搜索将针对大型数据库(通常是nr数据库)执行，算法还将量化评分输出匹配的统计显著性。
搜索将最大化一个分数，该分数量化序列之间的相似性，给定特定的评分矩阵和差距惩罚。广泛使用的评分矩阵在本领域是已知的，包括点接受突变(PAM)矩阵和BLOcks取代矩阵(BLOSUM)。这些基质将量化所有氨基酸对之间的相似性，使得相同或相似的氨基酸对具有高分，而不同氨基酸对与低分数相关。间隙惩罚是针对间隙(开口)的，并将插入到其中一个对齐的序列中，以最大化相似性分数。与现有间隙的扩展相比，对于新的间隙，间隙惩罚更大。BLAST可以参数化以使用不同的评分矩阵和间隙惩罚，从而导致相同序列的不同比对。例如，参数可以限制对齐(相似)目标序列的最大数量，并且可以设置最大E-价值。TheE-值将量化相似性的统计显著性，其中较低的值对应于较显著的相似性。参数筛选器还包括在查询和数据库序列之间查找单词匹配项，其中使用较小的单词大小会使搜索更加敏感。“查询范围内的最大匹配项”参数限制匹配项的数量。
一旦提交，检索将产生相似的蛋白质，保守蛋白质的鉴定可以通过选择有限的鉴定匹配来过滤，表明发现的相似序列与参考序列匹配的百分比，例如50-100％，70-100％，80-100％，或90-100％。然后，可以通过选择所需的序列或识别号，以纯文本或FASTA格式制备病原体库。
序列比对
一旦文库包含基因组/蛋白质参考文献的序列及其类似序列，序列将被对齐。例如，请参阅下面的表1。
表1
Figure BDA0003838332750002331
Figure BDA0003838332750002341
Figure BDA0003838332750002351
Figure BDA0003838332750002361
如本文所述，有多个公开可用的工具可以对齐多个序列。ClustalOmega将用于创建多个序列比对(MSA)。这是将两个以上的同源核苷酸或氨基酸序列对齐在一起的过程，使得来自不同序列的同源残基尽可能多地排列在列中。序列比对可以是两种类型，即比较一系列字符或模式的两个(成对)或更多序列(多个)。这些序列将由程序逐步对齐(前两个序列，然后逐个对齐)。当序列与组对齐或两组序列之间存在比对时，将执行具有最高比对分数的比对。对齐方式中的间隙符号将替换为中性字符，如星号。
共识序列识别
共识序列将通过分析数据并识别所有序列中基本或完全均匀的区域来识别。将选择最保守的共识序列进行表位预测。
仅作为示例，逆转录病毒科病毒家族中保守蛋白质的共识序列，例如人类免疫缺陷病毒，在现有技术中是已知的，并且可以通过研究诸如
Figure BDA0003838332750002371
日本DNA数据库(DDBJ)或欧洲核苷酸档案(ENA)之类的数据库来找到病毒，并从为其中的每个病毒变体提供的序列中解析出共识序列。例如，人类免疫缺陷病毒的基因组及其血清型已被绘制并提交给GenBank。在https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome发现的国家生物技术信息中心(NCBI)基因组数据库的搜索，提供了代表性的基因组信息，例如HIV-1。主页提供了每个mRNA的记录，以及由基因组编码的蛋白质序列，并且显着地，记录的蛋白质序列将如上面表1中列出的那些。
选择该物种的所有参考或代表性基因组的列表(在提交时为499个)或基因组组装和注释报告显示所有基因组变异以及每个基因组变异的GenBank加入号或RefSeq加入号列表(组装列)。
选择第一个GenBank加入号将显示每个mRNA的记录，以及由第一个基因组变异编码的蛋白质序列。选择第二个GenBank加入号将显示每个mRNA的记录，以及由第二个基因组变体编码的蛋白质序列。可以重复选择整个基因组变异或蛋白质序列变异，直到找到所有或所有所需的变异。
基因组或蛋白质序列变体的下一个序列比对可以通过将所有变体输入到任何包含序列比对数据库的公开软件中找到，该软件能够对齐多个序列，例如在https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/发现的ClustalW2。在序列中导入选择DNA作为序列类型将产生序列的比对，该序列用星号显示变体之间的任何同源性。
接下来，识别在所有变体中基本或完全均匀的区域将提供共识序列同一性。如果存在任何单个核苷酸多态性，则可以用适当的IUB摆动碱基代码替换点突变，该代码可以从https://www.bioinformatics.org/sms/iupac.html中检索。
或者，可以使用银河系统等工具，在usegalaxy.org找到，在下载数据和选择适当的过滤器后，可以达成共识序列。
在另一种选择中，存在病毒特定的序列数据库，例如，对于HIV-1，可以从https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CONSENSUS/Consensus.html检索。可以通过选择适当的下载格式，计算机类型，区域和对齐的蛋白质选项来获得共识序列。在这种情况下，输入比对是从https://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/mainpage.html检索到的HIV序列数据库Web比对。这些序列在检索后进行了额外的注释。具体而言，共识序列中的问号已经解决，糖基化位点已经对齐。从输入来看，共识序列是使用共识网站构建的。共识序列是根据共识网站上的默认值计算的，除了它们是针对在比对中具有3个或更多(而不是4个或更多)序列的所有亚型组计算的。如果子类型组中的列包含相等数量的两个不同字母，则通过查看整个M组中的同一列并使用最常见的字母作为共识来解决并列。DNA共识序列中的大写字母表示核苷酸在用于达成共识的所有序列中一致保存在该位置。在非一元性的情况下，最常见的核苷酸以小写形式显示。通过多次插入和删除跨越的区域很难对齐。因此，排列锚定在糖基化位点上的这些区域，并保留跨越这些区域的最小元素。蛋白质共识序列始终是大写字母，表示该位置最常见的氨基酸。
示例1B：
有多个公开可用的数据库来推导蛋白质，DNA和/或RNA序列，例如NCBI的GenBank，EMBL的核苷酸序列数据库，Universal Protein Resource(UniProt；)和蛋白质数据库(PDB)。
病原体文库制备
制备含有参考基因组或蛋白质的DNA文库以及已知保守蛋白的相似序列可以通过本领域已知的方法生成。例如，NCBI检索“甲型流感病毒”，选择参考基因组“甲型流感病毒(A/Shanghai/02/2013(H7N9))”(RefSeq No.NC_026422.1)；选择其保存蛋白的蛋白质序列或鉴定号。
还将选择第二个参考基因组的蛋白质序列以获得多个序列比对，其中NCBI被搜索参考基因组“甲型流感病毒(A/Puerto Rico/8/1934(H1N1))”(RefSeq加入号)。NC_002018)。
表2
Figure BDA0003838332750002391
Figure BDA0003838332750002401
或者，BLASTP是一种通用的蛋白质序列比对程序，它将查询蛋白质序列与特定蛋白质数据库中的序列进行比较，它将搜索与所选保守蛋白质相似的共识序列。在“输入查询序列”框中，将输入选定的蛋白质参考序列(直接在文本框中或通过文件上传)。序列将以FASTA格式提供，或者查询蛋白将使用NCBI数据库中的加入号或NCBI gi编号进行标识。在“选择搜索集”框中，将选择目标生物体(病原体)(数据库当前可用，包括nr，RefSeq，PDB和SWISS-PROT)。将确保“程序选择”框选择BLASP。BLAST参数将设置为pre-选定的默认参数。将使用最大对齐目标序列数的默认值(值＝100)。默认的E值为10，这意味着大约10个相似的序列预计会偶然发现。将使用蛋白质的默认字大小(值＝6)。“查询范围内的最大匹配项”参数将设置为默认值0，这意味着没有限制。默认的评分矩阵和默认的差距惩罚设置将用作BLOSUM62和11用于打开差距，1用于扩大差距。一旦提交，将搜索并生成保守蛋白质的类似序列或识别号，并据此制备DNA文库。
序列比对
要对齐的序列将直接输入到文本框中或作为文件上传。序列将以纯文本或FASTA格式输入。将运行ClustalW2，并将生成跨序列具有均匀性的区域的图形表示。
共识序列识别
共识序列将通过分析数据并识别所有序列中基本或完全均匀的区域来识别。将选择最保守的共识序列进行表位预测。
示例2：表位预测
病原体的T细胞表位可以通过使用许多公开可用的数据库来预测。免疫表位数据库和分析资源(IEDB)，它将利用SYFPEITHI(在http://syfpeithi.de/BMI-AInfos.html发现)来预测T细胞表位。
MHC I类结合预测生成
为了执行I类结合预测，将给定保守蛋白质的至少一个共识序列(序列将以纯文本形式输入，以FASTA格式或通过指定包含蛋白质的文件)输入到IEDB中。将选择协商一致的搜索方法。MHC物种作为人类将被指定为包含多个等位基因和表位长度(例如，9，10，11，12，13，14)的选择选项。
结合亲和力阈值校准
为了确保结合亲和力数据的质量，将校准搜索以预测肽与小于500nM的IC50值结合，这是与80-90％的所有表位的免疫原性相关的既定阈值。
提交搜索后，蛋白质序列将被解析为指定长度的所有可能肽，并将计算每个肽的预测结合亲和力。该工具将预测的亲和力与大量随机选择的肽的亲和力进行比较，并分配一个百分位秩(较低的百分位秩对应于较高的结合亲和力)。预测工具将生成一个结果表，包括等位基因列、肽开始和结束位置、肽长度、肽序列、使用的方法和百分位数秩。默认情况下，结果将按预测的百分位数排名排序，但结果也可以按序列位置排序。
表位选择
将为每个等位基因/长度组合选择前1％的肽。
示例3.
以下示例是用但不限于以下材料和方法进行的。
免疫原序列设计与优化
从Genbank数据库中可用的约40,000株甲型流感病毒中推导出共识氨基酸序列。简要计算分析了约40,000株流感病毒株的M1，M2，NP，PB1，PB2和PA蛋白的氨基酸序列。在氨基酸序列的每个位置具有最高发生频率的氨基酸被用作该位点的共识氨基酸。蛋白质序列构成每个位点的共享氨基酸，从而获得M1、M2、NP、PB1、PB2和PA蛋白的共识氨基酸序列。
使用在线CD8+T细胞表位预测软件(可在线获得syfpeithi.de/(Singh H，RaghavaGP.ProPredl：预测混杂的MHC I类结合位点。生物信息学。2003；19：1009-1014)和tools.immuneepitope.org/main/tcell/(穆塔夫齐M，等。共识表位预测方法确定了小鼠T(CD8+)细胞对牛痘病毒反应的广度。国家生物技术。2006；24:817-819).在优化哺乳动物密码子使用后对序列进行了修改。
疫苗制造
生成两个串联的免疫原序列。其中一个称为PAPB1M1(SEQ ID NO：1)由部分PA和PB1序列以及全长M1序列组成。另一种称为NPPB2M2(SEQ ID NO：2)由部分PB2序列和NP和M2序列的全长组成。将两个免疫原序列克隆成三种类型的载体用于疫苗构建。对于DNA疫苗，pSV1.0载体被用作骨架载体。对于基于腺病毒的疫苗，免疫原序列首先被克隆到p-Shuttle载体中，然后亚克隆到El/E3删除的AdC68载体中。得到的向量分别被命名为AdC68-SEQ IDNO：1和AdC68-SEQ ID NO：2。将AdC68-SEQ ID NO：1和AdC68-SEQ ID NO：2线性化并转染到HEK293细胞中，生成腺病毒，通过CsCl梯度离心从上清液中纯化，然后通过紫外吸光度测定病毒颗粒数。对于基于TTV牛痘的疫苗，肽p2a用于连接免疫原SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2，并克隆到pSC65洗牌载体中并转染到TK143细胞中(本文中称为TTV-SEQ ID NO：1/2)。转染的细胞随后被重组野生型天坛病毒感染，然后进行BrdU筛选，产生使用Vero细胞扩增的重组病毒。
疫苗在免疫原表达中的验证
将基于DNA的疫苗载体转染到HEK293细胞中。基于AdC68和TTV牛痘的病毒疫苗分别用于感染HEK293细胞和Vero细胞。转染或感染的细胞在24小时或48小时后收获。使用免疫印迹分析疫苗编码免疫原的表达，使用抗M1单克隆抗体(abeam，ab22396)或抗M2单克隆抗体(Santa Cruz，sc-52026)。
免疫印迹法检测抗流感疫苗免疫原表达的具体步骤如下：
实验样品的制备
将pSV1.0-SEQ ID NO：1和pSV1.0-SEQ ID NO：2转染为293T细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)，48h后收集293T细胞。将细胞重悬于75μl细胞裂解物中，并加入25μl蛋白质上样缓冲液，然后在100℃下孵育10分钟。
293A细胞感染了AdC68-SEQ ID NO：1和AdC68-SEQ ID NO：2，并在24小时后收集。将细胞重悬于75μl细胞裂解物中，并加入25μl蛋白质上样缓冲液，然后在100℃下孵育10分钟。
TK143细胞感染了TTV-SEQ ID NO：1/2，并在48小时后收集。将细胞重悬于75μl细胞裂解物中，并加入25μl蛋白质上样缓冲液，然后在100℃下孵育10分钟。
(2)用8％聚丙烯酰胺分离凝胶进行蛋白质印迹实验。在室温下静置30分钟后，加入10％聚丙烯酰胺浓缩凝胶，并将梳子轻轻插入凝胶中，使凝胶凝固30分钟。倒入电泳缓冲液，慢慢取出梳子，然后按顺序加入制备的样品。在70伏特下进行电泳30分钟，然后将电压调节至90伏并持续1.5小时。将聚偏二氟乙烯(PVDF)膜在甲醇中活化30秒后，将海绵、滤纸和PVDF膜浸泡在蛋白质转印液中，然后按顺序放置。将转移装置和冰袋放置在转移罐中。转移过程在恒定流量200mA下保持2.5小时。蛋白质转移后，取出膜并用5％脱脂牛奶封闭1小时。流感基质蛋白1抗体(购自上海爱博康贸易有限公司)和流感基质蛋白2抗体(购自圣克鲁斯生物科技(上海)有限公司)，分别于1：1000和1：250添加。在振荡器上与一抗在室温下孵育2小时后，用含有吐温-20的磷酸盐缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟。将辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG二抗于1：5000加入到膜中，并在室温下孵育1小时。孵育后，将膜洗涤5次，每次洗涤5分钟。与底物溶液一起孵育后检测发光。
肌内注射小鼠模型中DNA疫苗原发病毒载体增殖策略lar免疫
从B&K Universal Group Limited(中国上海)购买了6-8周龄的雌性C57BL/6小鼠，并在复旦大学(中国上海)上海公共卫生临床中心的动物设施中以特定的无病原体(SPF)条件饲养。将小鼠分为两个对照组和两个实验组。小鼠是肌内注射免疫，指征载体组合。对于两个实验组，(1)DNA+AdC68组和(2)DNA+TTV组，动物接受两剂pSV1.0-PAPB1M1(50μg)和pSV1.0-NPPB2M2(50μg)作为主要剂量，两周后AdC68-PAPB1M1(5x1010vp)/AdC68-NPPB2M2(5x1010vp)或TTV-2a(1x107pfu)分别作为助推器。对于两个对照组，要么只有启动载体被空载体取代，要么启动载体和助推载体都被空载体取代。接种疫苗后四周，使用IFN-y ELISpot测定和细胞因子的细胞内染色，从每组中处死三只小鼠进行免疫原性评估。
DNA、AdC68和TTV疫苗的组合免疫，以及通过肌内或鼻内途径给药的AdC68
将6～8周龄的雌性C57BL/6小鼠分为5组。对照组与上述相同；四个实验组用不同顺序的三种疫苗接种AdC68疫苗，通过肌内(i.m.)或鼻内(i.n.)途径施用。组名表示顺序顺序，疫苗类型后跟途径(鼻内途径缩写为“i.n.”，默认肌内途径未注明)。接种疫苗四周后，每组中三只小鼠使用IFN-γELISpot测定和细胞因子的细胞内染色进行免疫原性评估。
IFN-γELISpot测定
使用小鼠进行酶联免疫吸附剂斑点(ELISpot)测定IFN-γELISpot kit(BDBioscience，Cat#551083).处死对照或接种疫苗的小鼠，分离支气管肺泡灌洗细胞和脾细胞。2x105将脾细胞一式三份接种在预先包被5μg/ml纯化的抗小鼠的96孔板中IFN-γ随后用对六种病毒免疫原(M2，M1，NP，PA，PB1，PB2)之一的肽以最终5μg/ml浓度刺激[表1]。总共使用了16种肽，其中一种用于M2，其余五种免疫原各3种。刺激24小时后，用去离子水洗涤细胞并暴露于100μl生物素化抗小鼠IFN-γ(2μg/ml)在室温下2小时，然后在加入100μ1链霉亲和素-HRP之前进行大量洗涤。在室温下孵育1小时后，洗涤细胞和100μl的基底溶液加入以形成斑点。用水停止反应，并使用自动ELISPOT软件确定斑点形成细胞(SFC)的数量(赛芝，中国北京)。
细胞因子的细胞内染色
如上所述制备脾细胞。2x106在抗小鼠CD107a-PE(BioLegend)抗体存在下，用由等量的上述所有16种肽组成的肽池刺激脾细胞1小时，然后暴露于1μ1/ml Brefeldin(BDBioscience)6小时。然后将细胞洗涤，并用表面特异性小鼠抗体LIVE/DEAD-AmyCan，CD3-PerCP-cy5.5，CD8-PB(BioLegend)染色。随后使用BD Cytofix/Cytoperm试剂盒对细胞进行透化，并通过FITC抗小鼠染色细胞内细胞因子IFN-γ抗体和PECy7抗小鼠TNFa抗体(BioLegend)。使用Fortessa流式细胞仪(BD Bioscience)测量样品，并使用FlowJo 10.0.6软件(Tree Star)分析数据。
甲型流感病毒的传染性挑战
接种疫苗四周后，小鼠接受甲型/PR8(H1N1)流感病毒或甲型流感/上海/4664T/2013(H7N9)病毒的挑战。在挑战后监测体重和存活率十四天；每组五只小鼠在激发后第五天处死，以确定病毒滴度并评估肺部的病理变化。在整个激发过程中，对照组的半只小鼠和两组鼻内小鼠随意暴露于含有浓度为2μ1/ml的溶解FTY720的饮用水中。所有与H7N9病毒相关的实验均按照复旦大学上海公共卫生临床中心机构生物安全委员会批准的标准操作规程在生物安全3级实验室进行。
肺病毒载量的测定
从肺组织中提取总RNA，并使用流感病毒特异性引物进行TaqMan实时逆转录PCR(RT-PCR)，以确定病毒载量的相对水平。对于归一化，使用甘油醛磷酸脱氢酶(GAPDH)作为参考基因。使用的热循环条件如下：42℃l0min，95℃lmin，45循环95℃15s和60℃45s(Keskin DB，等。Proc Natl Acad Sci US A.2015；112(7):2151-2156).使用REALPLE32.2软件(Eppendorf)分析数据。引物的顺序如下：
对于H7N9病毒检测：
F-5'-GAAGAGGCAATGCAAAATAGAATACA-3'(SEQ ID NO：3)，
R-5'-CCCGAAGCT AAACCARAGT ATCA-3'(SEQ ID NO：4)，
探头-5'-CCAGTCAAACTAAGCAGYGGCTACAAA-3'(SEQ ID NO：5)；
对于PR8病毒检测：
F-5'-GACCGATCCTGTCACCTGA-3'(SEQ ID NO：6)，
R-5'-AGGGCATTCTGGACAAAGCGTCTA-3'(SEQ ID NO：7)；
探头-5'-TGCAGTCCTCTCACTGGGCACG-3'(SEQ ID NO：8)；
对于GAPDH参考检测：
F-5'-CAATGTGTCCGTCGTGGATCT-3'(SEQ ID NO：9)，
R-5'-GTCCTCAGTGT AGCCCAAGA TG-3'(SEQ ID NO：10)，
探头-5'-CGTGCCGCCTGGAGAAACCTGCC-3'(SEQ ID NO：11).
统计分析
所有统计分析均使用GraphPad Prism 6.0(GraphPad Software，Inc.)进行。通过t检验或曼-惠特尼检验分析两组之间的比较。采用单因子方差分析了三组或更多组之间的比较。显著差异定义为p<0.05.
示例4.基于流感内部基因的疫苗的构建
一种通用的流感疫苗被设计成含有病毒内部抗原的保守CD8+T细胞表位。从基因库数据库中的约40,000株甲型流感病毒中推导出M1，M2，NP，PA，PB1，PB2免疫原的共识氨基酸序列。为了更有效地进行免疫原设计，根据syfpeithi.de/发现的在线预测工具，仅纳入PA，PB1和PB2中富含CD8+T细胞表位的序列(评分≥:29)和tools.immuneepitope.org/main/tcell/(百分位排名≤0.因此，产生了两个免疫原序列。一，表示为PAPB1M1免疫原(SEQ ID NO：1)，包括全长M1序列和所选的PA和PB1序列；另一种，表示为PB2NPM2的免疫原(SEQ ID NO：2)包括选定的PB2片段和全长NP、M2序列(图1A)。
构建疫苗以在三个平台中表达两种免疫原，包括DNA载体，E1/E3缺失的复制缺陷黑猩猩腺病毒(AdC68)和重组天坛牛痘病毒(TTV)。对于前两个平台，两种免疫原分别表达，导致两种基于DNA的疫苗(pSV1.0-PAPBIM1(SEQ ID NO：1)和pSV1.0-PB2NPM2(SEQ ID NO：2))和两种基于AdC68的疫苗(AdC68-PAPB1M1(SEQ ID NO：1)和AdC68-PB2NPM2(SEQ ID NO：2))；对于TTV平台，两种免疫原从单个牛痘疫苗中表达，即TTV-2a。通过转染或感染将所得疫苗引入培养细胞中，并且通过使用对甲型流感M1或M2抗原特异性的单克隆抗体进行蛋白质印迹来确定它们在细胞裂解物中编码免疫原的表达。
免疫原表达的蛋白质印迹测定的结果如图1B和图1B所示。1C.DNA载体pSV1.0、腺病毒载体AdC68和牛痘载体TTV均有效表达免疫原PAPBIM1(SEQ ID NO：1)。与流感基质蛋白1抗体孵育后，在不含免疫原SEQ ID NO序列的空载体pSV1.0、AdC68和TTV中未发现特异性条带：如图1所示，同时在含有免疫原SEQ ID NO：1序列的载体中发现了显著的～130kD条带，证明了DNA载体pSV1.0，腺病毒载体AdC68和牛痘载体TTV可以有效表达免疫原SEQ IDNO：1.与流感基质蛋白2抗体孵育后，在空载体pSV1.0中未发现特异性条带，AdC68和TTV其中不含免疫原PB2NPM2序列(SEQ ID NO：2)，而在含有免疫原SEQ ID NO：2序列的载体中发现了显著的～130kD条带，证明了DNA载体pSV1.0、腺病毒载体AdC68和牛痘载体TTV可以有效表达免疫原SEQ ID NO：2.与β肌动蛋白抗体孵育后，观察到蛋白质大小约为42kD的显著条带，进一步证明实验步骤准确，结果可靠。
示例5.基于抗流感疫苗免疫原的疫苗免疫原性检测
使用本公开内容中如实施例1所述的免疫原构建DNA载体疫苗、腺病毒载体疫苗和牛痘载体疫苗。对小鼠进行重组流感疫苗免疫，并在免疫完成4周后进行重组流感疫苗的免疫原性评价。
将六周龄C57BL/6小鼠随机分为三组：对照组，腺病毒组和牛痘组。具体免疫程序如下表3所示。免疫为肌内注射，剂量为pSV1.0 100μg，剂量为AdC68 1011病毒颗粒，pSV1.0-SEQ ID NO：1和pSV1.0-SEQ ID NO：2接种剂量50μg，AdC68-SEQ ID NO：1和AdC68-SEQ IDNO：2接种剂量5x1010每个病毒颗粒，和TTV-SEQ ID NO：1/2接种剂量107斑块形成单位。疫苗每两周接种一次。
表3.基于抗流感疫苗免疫原的小鼠实验
Figure BDA0003838332750002491
Figure BDA0003838332750002501
采用ELISpot和细胞因子细胞内染色(ICS)检测小鼠脾细胞中重组流感疫苗的免疫原性。
基于对SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的表位预测，以及报道常用的流感T细胞表位，选取16种表位单肽刺激小鼠T细胞免疫应答，分别命名为：M1-1、M1-2、M1-3、M2、NP-1、NP-2、NP-3、PB1-1、PB1-2、PB1-3、PB2-1、PB2-2、PB2-3、PA-1、PA-2、PA-3。
疫苗免疫原性试验结果如图9A-9C所示。ELISpot测定结果显示，对照小鼠未显示形成斑点的细胞，且未显示流感特异性T细胞免疫应答；腺病毒组对NP-2和PB2-1表位均表现出更高水平的细胞反应；牛痘组小鼠对NP-2，NP-3，PB1-1，PB1-3，PA-3和其他表位具有更高的T细胞免疫反应。
细胞内细胞因子染色，包括IFNγ，TNFα和CD107a，用于检测小鼠脾细胞中流感特异性免疫应答的水平。在对照组中未观察到表达IFNγ，TNFα和CD107a的T细胞，而在腺病毒组和牛痘组中观察到它们，从而显示出具有流感特征的T细胞免疫反应。
综上所述，本实验证实，抗流感疫苗免疫原SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2的表达均由不同的疫苗载体诱导T细胞的显著免疫应答。
示例6.DNA原发和病毒载体疫苗增强有效提高流感特异性CD8+T细胞反应
接下来，在小鼠中检查了新开发的疫苗诱导流感特异性细胞免疫反应的能力。将小鼠分为三组：对照组肌内免疫两剂对照载体pSV1.0(100ug)和一剂对照载体AdC68-空(1x10)11vp)。两个实验组分别为DNA+AdC68组和DNA+TTV组，肌内注射两剂pSV1.0-PAPB1MI(50μg)/pSV1.0-NPPB2M2(50μg)，然后肌内注射一剂AdC68-PAPB1M1(5xl010vp)/AdC68-NPPB2M2(5x1010vp)或TTV-2a(1x107pfu)分别(图2A)。接种疫苗四周后，每组三只小鼠被安乐死，并且脾细胞都是孤立为测量流感-sp埃克菲奇CD8+T细胞响应方式IFN-γELISpot测定(图2B)和细胞内细胞因子染色(ICS)测定(图2C和图2D)。
数据显示，在测试的所有16种流感特异性表位肽(表4)中，NP-2和PB2-1肽在诱导方面占主导地位。IFN-γ-为两个实验组生产免疫细胞。然而，DNA+AdC68组对这两种肽中的任何一种的细胞反应(NP-2肽为p＝0.006，PB2-1肽的p＝0.007)明显高于DNA+TTV组(图2B)。此外，还有更多IFN-γ+/TNF-a+，IFN-γ+细胞和CD107a+细胞出现在DNA+AdC68组中(p＝0.007IFN-γ+/TNF-a，+细胞，p＝0.029IFN-γ+细胞和p＝0.049对于CD107a+细胞)相比，DNA+TTV组在用由所有十六个肽组成的肽池刺激后(图2C和图2D)。相比之下，DNA+TTV组表现出更广泛的细胞反应，正如更多的肽所表明的那样，例如：，M2，NP-3，PB1-1，PB1-3，PA-1，PA-3，能够引发适度但可检测的IFN-γ从该组诱导免疫细胞(图2B)。因此，这些结果表明，DNA+AdC68方案在提高免疫优势T细胞反应方面更有效，而DNA+TTV方案在引发亚免疫优势T细胞反应方面似乎表现更好。
表4.甲型流感病毒特异性肽用于刺激脾细胞以定量T细胞反应
Figure BDA0003838332750002511
Figure BDA0003838332750002521
示例7.小鼠模型中的DNA主要/病毒载体增强方案提供了针对异源流感病毒挑战的保护
接下来，为了确定DNA主要/病毒载体增强方案的保护功效，使用了流感挑战的小鼠模型。如上所述，用假对照或疫苗对小鼠进行免疫，分成两组，四周后用500 50％组织培养感染剂量(TCID50)的A/PRS(H1N1)或100TCID50 A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)流感病毒进行挑战。然后监测体重十四天，并计算存活率。每组五只小鼠在激发后第五天安乐死，以确定肺病毒载量。
在用A/PR8(H1N1)病毒进行致命挑战后，假对照组中的小鼠迅速连续地减轻体重(图3A)。因此，这些小鼠在第7天和第12天之间死亡(图3B)。相比之下，尽管两个接种疫苗组的体重在PR8激发后也经历了最初的下降，但他们在第8天达到最低点，然后反弹(图3A)。因此，所有小鼠都存活了下来(图3B)。与对照组相比，肺病毒载量减少(DNA-AdC68组p＝0.07，DNA-TTV组p＝0.04)进一步证实了对接种PR8挑战的小鼠的保护(图3C)。有趣的是，与DNA-AdC68组(图3A)相比，DNA+TTV组的小鼠的体重下降较慢且较少，这与略低的病毒载量(图3C)一致，这表明DNA+TTV方案可以更好地防止PR8挑战。综上所述，这些数据表明，设计良好的T细胞疫苗能够针对PR8(H1N1)甲型流感病毒的致命挑战提供保护。
接下来，使用了非致死性H7N9激发模型(图3E)，因为两种方案都无法防止H7N9的致命挑战(数据未显示)。有趣的是，与对照组相比，两个接种疫苗组的初始损失和较早的体重恢复较少(图.3D)，这与肺中抑制的病毒复制一致(DNA-AdC68组p＝0.4，DNA-TTV组p＝0.16)(图3F)。因此，通过递送保守的流感特异性CD8+T细胞表位，DNA+AdC68和DNA+TTV方案都能够在小鼠模型中建立跨组保护。
示例8.鼻内注射腺病毒载体疫苗在联合治疗方案中引起剧烈的呼吸道驻留T细胞反应
为了进一步增强呼吸道和肺部驻留记忆T细胞，以改善对流感挑战的保护，在TTV肌内免疫之前或之后的鼻内接种AdC68在具有DNA肌内启动的组合方案中进行测试。采用肌内给药AdC68作为对照。所有组均按图4A中计划进行免疫接种，每组3只小鼠在接种疫苗后4周处死，用于免疫原性评估IFN-γELISpot检测和细胞内IFN-γ基于染色的流式细胞术测定。首先分析从接种疫苗的小鼠分离的脾细胞中的全身T细胞反应。IFN-γELISpot测定结果显示，在四组测试组中，DNA+TTV+AdC68组对免疫显性NP-2和PB21表位肽的细胞反应显着高于其他三组，显示出相当的反应(NP-2肽的p＝0.002，PB2-l肽的p＝0.008)(图4B和图4E)。相反，DNA+AdC68+TTV和DNA+AdC68 i.n.+TTV方案对亚显性表位的方案比其他两种方案的方案具有更有效的T细胞免疫应答(图4B)。在肽池刺激后，采用基于细胞内细胞因子染色的流式细胞术法对脾细胞进一步分析了其功能。如图4D所示，肌内给药AdC68的流感特异性更高IFN-γ+、TNF-α+和IFN-γ+TNF-α+双阳性T细胞比鼻内对应物。此外，在所有四组中，DNA+TTV+AdC68组CD107a+细胞诱导率最高(p＝0.049)(图4E)。综上所述，这些结果得出的结论是，肌内注射途径是触发全身免疫反应的更好途径，无论是在大小上还是在功能上。
接下来，IFN-γELISpot分析扩展到支气管肺泡灌洗(BAL)淋巴细胞。引人注目的是，只有DNA+AdC68 i.n.+TTV和DNA+TTV+AdC68 i.n.组在NP-2(DNA+AdC68 i.n.+TTV的p＝0.02，DNA+TTV+AdC68 i.n.的p＝006)和PB2-1表位肽(DNA+AdC68 i.n.+TTV组的p＝0.034，DNA+TTV+AdC68 i.n组的p＝0.047)(图4C)的刺激下显示出强大的BAL T细胞免疫细胞。因此，鼻内给药AdC68在诱导呼吸道和肺驻留T细胞方面比肌内给药具有显着的优势。
示例9.鼻内给药AdC68可更好地防止流感的致命挑战
接下来，评估PR8和H7N9挑战的组合免疫方案的保护效果。接受如图4所述接种疫苗的小鼠在最后一次接种后四周接受PR8流感病毒的500TCID50或H7N9流感病毒的500TCID50的挑战。
为了应对PR8挑战，两个AdC68鼻内免疫组经历了类似的体重减轻，其严重程度低于两个肌内免疫组(图5A)。这与后一组的第10天相比，第9天的初始损失较慢，体重较早反弹，导致反弹前的最低点重量更高。存活率证实了体重曲线，两个鼻内免疫组为100％，而两个肌内免疫组为60-80％(图5B)。相比之下，假对照组中的所有小鼠在第10天和第13天之间死亡，与如上所述的早期实验一致(图5B)。此外，发现鼻内给药似乎导致肺小瓶负荷减少，这在DNA+Adc68 i.n.+TTV组(p＝0.046)中尤其明显(图5C)。因此，尽管所有四种组合免疫方案都能够提供对PR8感染的保护，但鼻内接种AdC68疫苗的两种方案更有效。
对致死性H7N9挑战模型的研究进一步支持了上述观察结果。与肌内途径相比，鼻内途径具有优越的保护功效。这种优越性首先反映在体重的变化上，因为DNA+Adc68 i.n.+TTV和DNA+TTV+Adc68 i.n.组都表现出类似于PR8挑战中观察到的体重减轻曲线，体重在第9天达到最低点，然后反弹。相比之下，DNA+Adc68+TTV组和DNA+TTV+Adc68组的体重下降速度更快，没有恢复，类似于假对照组(图5D)。因此，两个鼻内免疫组的所有动物都存活了下来，而两个肌内免疫组中的大多数(如果不是全部)死亡(图5E)。
在激发试验后第5天对肺病毒载量的测量显示，与肌内疫苗接种相比，鼻内疫苗接种仅具有适度的优势(图5F)。不受理论的约束，推测诱导的细胞免疫除了抑制病毒复制(例如减少肺部炎症)之外，还可能发挥其他机制来减弱致病性。总而言之，H7N9挑战研究进一步强调了鼻内免疫在提高基于T细胞的流感疫苗的保护功效方面优于肌内免疫的优势。
示例10.呼吸系统驻留和全身记忆T细胞对于全面保护至关重要
由于DNA+AdC68 i.n.+TTV和DNA+TTV+Adc68 i.n.方案都能够提高呼吸道驻留和全身记忆T细胞，以便剖析这两者的贡献T细胞苏bpopulations到保护性免疫，芬戈莫德(FTY720)，一种靶向鞘氨醇-1-磷酸盐的免疫调节药物，用于防止T细胞从淋巴结或脾脏排出，但这不会影响呼吸道驻留记忆T细胞T细胞(Masopust D，等。J Exp Med.201'0；207(3):553-64).
当在致命的PR8激发试验期间暴露于FTY720时，DNA+AdC68 i.n.+TTV和DNA+TTV+Adc68 i.n.组与对照组相比都给予了部分保护，如体重曲线(图6A)和生存曲线(图6B)所证明的那样。保护效果似乎低于没有FTY720的情况下，体重减轻更快，体重恢复较晚；重要的是，DNA+AdC68 i.n+TTV组和DNA+TTV+AdC68 i.n.的存活率分别从100％下降到80％和60％(图6B)，并且观察到病毒复制的抑制力较小(图5C和6C)。尽管DNA+TTV+AdC68 i.n.组的存活率下降幅度更大(图6D，图6E和图6F)，但也观察到了类似的部分保护。应该注意的是，当暴露于FTY720 DNA+AdC68 i.n+TTV方案时，比DNA+TTV+AdC68 i.n.来自致命PR8和H7N9挑战(图6A，B，D和E)的存活率更高。总而言之，这些数据表明，仅由鼻内免疫诱导的呼吸道驻留T细胞能够提供显着的跨组保护，以应对流感挑战，正如DNA+AdC68 i.n.+TTV+FTY720组所显示的那样。此外，FTY720治疗导致存活率降低，特别是对于DNA+AdC68 i.n.+TTV组，认为呼吸道驻留和全身性T细胞对于完全保护性疗效至关重要。
实施例11：基于抗流感免疫原的保护效果评估
使用本公开内容的免疫原构建了如实施例1所述的DNA疫苗、腺病毒载体疫苗和牛痘载体疫苗，并用实施例1所述的重组流感疫苗进行免疫，并在免疫完成四周后评估重组流感疫苗的挑战保护效果。
使用H1N1和H7N9流感激发模型来评估免疫原的保护作用。H1N1流感挑战实验在生物安全2级实验室进行，H7N9流感挑战实验在生物安全3级实验室进行。
每只小鼠腹膜内注射50μl10％水合氯醛，并用50μl流感病毒挑战。H1N1流感病毒的组织感染剂量的一半为每只小鼠500病毒。H7N9流感病毒组织感染剂量的一半为每只小鼠100病毒。在激发后的第5天，每组处死5只小鼠，并取肺进行病毒载量测量。
感染挑战实验的结果如图10A-10F所示。在用致死剂量的H1N1流感病毒进行挑战后，对照组的小鼠继续减肥并在第12天死亡。腺病毒小鼠的体重在第9天开始上升，全部存活到14天。牛痘组体重减轻明显减慢，体重在第9天开始上升，所有小鼠存活至14天。
在用非致死剂量的H7N9流感病毒进行挑战后，对照小鼠的体重减少了近20％，体重在第9天上升。腺病毒组和牛痘组小鼠体重减轻小于10％，体重在第7天迅速反弹。
本实验表明，抗流感疫苗免疫原SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2通过不同疫苗载体的表达可对H1N1和H7N9流感病毒产生交叉保护作用，即，本公开中的两种免疫原对不同亚型的流感病毒具有广谱的保护。
实施例12：基于不同免疫方法的流感疫苗免疫原性检测
DNA疫苗、腺病毒载体疫苗和牛痘载体疫苗均使用本公开内容的抗流感免疫原构建，如实施例2所述。小鼠免疫是通过本公开的免疫方法进行的。免疫接种完成四周后，进行免疫原性试验，如实施例3所述。
将6周龄的C57BL/6小鼠随机分为5组：对照组1、对照组2、对照组3、实验组1和实验组2，其中实验组1和实验组2采用本发明的免疫方法。具体免疫程序如表5所示。pSV1.0的剂量为100μg，AdC68的剂量为1011病毒颗粒和pSV1.0-SEQ ID NO：1和pSV1.0-SEQ ID NO：2的剂量各为50μg，AdC68-SEQ ID NO：1和AdC68-SEQ ID NO：2的接种剂量为5x1010病毒颗粒，TTV和TTV-SEQ ID NO：1/2接种剂量为107斑块形成单元。疫苗每两周接种一次。
表5.基于不同免疫方法的小鼠免疫实验
Figure BDA0003838332750002571
Figure BDA0003838332750002581
疫苗免疫原性试验结果如图11A-图1所示。11D.ELISpot测定结果显示，在小鼠脾脏细胞中，在对照组1只小鼠中未观察到流感特异性T细胞免疫应答；而对照组2，3和实验组1，2中存在高水平的T细胞免疫反应。在小鼠肺灌洗液中，对照组1、2和3未发现斑点细胞，且在肺部无法再建立流感特异性免疫应答。实验组1和2显示更多的斑点形成细胞，即，实验组1和2显示使用本公开中疫苗接种方法的流感特异性T细胞免疫应答水平非常高。
使用IFNγ，TNFα和CD107a的细胞内细胞因子染色来检测小鼠脾细胞中流感特异性免疫应答的水平。结果显示，对照组1未观察到表达IFNγ和TNFα的T细胞，而对照组2、3和实验组1、2均观察到表达IFNγ和TNFα的T细胞，从而显示甲型流感诱导的T细胞免疫应答。
本试验证实，实验1组和实验组2采用不同重组载体疫苗的序贯免疫法，结合呼吸免疫和全身免疫，可有效在整个系统和肺部建立高水平的流感特异性免疫应答，优于对照组。
例13：基于不同免疫方法的流感疫苗对病毒激发的保护效果的评估
如本文所述对小鼠进行免疫接种，并使用H1N1和H7N9流感激发模型评估免疫原在最后一次疫苗免疫接种后四周对小鼠的保护作用。H1N1流感挑战实验在生物安全2级实验室进行，H7N9流感挑战实验在生物安全3级实验室进行。
每只小鼠腹膜内注射50μl10％水合氯醛，并用50μl流感病毒挑战。H1N1流感病毒的组织感染剂量的一半为每只小鼠500病毒。H7N9流感病毒的组织感染剂量的一半为每只小鼠500病毒。在激发后的第5天，每组处死5只小鼠，并取肺进行病毒载量测量。
防止病毒挑战实验的结果如图12A-图所示。12D.H1N1流感病毒激发试验后，对照组1的小鼠均在第13天死亡，而对照组2和3的小鼠表现出部分保护作用，其中80％和60％的小鼠分别存活到第14天。实验组1和2小鼠的体重在第10天上升，并且全部存活到本公开中的疫苗免疫方法的第14天。实验组2的病毒载量显著下降，显示出优异的保护作用。
H7N9流感病毒挑衅后，采用本公开的疫苗接种方法的实验组1和2的体重在第10天迅速上升，所有小鼠存活至第14天，在这2个实验组中显示出优异的保护作用。在其他组小鼠中没有显着的保护作用。
本实验证实，通过不同重组载体疫苗的序贯免疫，结合呼吸免疫和全身免疫，实验组1和实验组2，采用本公开的疫苗免疫方法，对H1N1和H7N9流感病毒表现出优异的交叉保护效果。在这两组中发现的保护作用优于对照组2和3，后者仅使用肌内注射途径。此外，当重组牛痘载体疫苗作为最后一种疫苗进行免疫接种时，疫苗具有最佳的保护作用。
例14：通过鼻内免疫评估流感病毒激发对小鼠的保护作用
如本文所述对小鼠进行免疫接种，并在小鼠最后一次疫苗免疫接种后四周使用H1N1和H7N9流感挑战模型评估免疫原的保护作用。对流感挑战的保护如实施例6所述。在整个挑战期间，小鼠继续饮用含有2μg/ml FTY720的水，FTY720是一种免疫抑制剂，可有效减少外周循环淋巴细胞的数量，但无法影响呼吸道驻留记忆T细胞。在H1N1和H7N9流感病毒致死剂量的挑战中使用FTY720来评估鼻内免疫方法是否具有增强作用。
实验结果如图13A-图13F所示。在小鼠接受H1N1和H7N9流感病毒的挑战后，实验组1+FTY720和实验组2+FTY720的小鼠均表现出部分保护作用。小鼠的体重在第11天开始上升，存活到第14天，病毒载量降低。保护效果优于对照组1+FTY720。
本实验证实，该疫苗的呼吸道接种方法有效增强了疫苗免疫对H1N1和H7N9流感病毒的保护作用。
目前的流感疫苗通过提高对菌株特异性HA和NA糖蛋白的体液免疫力而起作用。因此，它们未能对人类进行交叉保护，必须每年重新配制以匹配流行的流感毒株[39]。开发能够提供交叉保护的通用甲型流感疫苗的紧迫性越来越大[40]。交叉反应性流感疫苗的开发已经在免疫应答的体液臂(针对保守的HA茎或M2e)及其细胞臂上进行了探索，这些细胞臂靶向内部病毒蛋白比表面病毒糖蛋白保守得多[41]。最近对H7N9感染患者的研究进一步支持了基于T细胞的疫苗的潜力，这些研究揭示了有效和及时的CD8+T细胞反应在克服人类H7N9感染中的关键作用。本文提供了新的疫苗接种策略，其重点是有效递送交叉保守的流感特异性表位以诱导能够跨群保护的广谱T细胞反应。
这种新策略的第一步涉及设计免疫原以包含病毒内部抗原的保守T细胞表位。这是通过从大约40,000株甲型流感病毒株中推断出流感所有六种内部结构蛋白的共识氨基酸序列来实现的；对于PA，PB1和PB2，仅包括富含预测CD8+T细胞表位的序列。因此，生成了两种通用的T细胞表位集合免疫原，即PAPB1M1和PB2NPM2。预计PAPB1M1和PB2NPM2免疫原一起应提供接近全面覆盖甲型流感病毒内部保守的T细胞表位。事实上，两种免疫原以DNA素数的形式共同引入，然后是AdC68或TTV病毒载体的增强，不仅引起了T细胞对免疫显性表位的强烈反应，而且还引起了可识别的T细胞对亚免疫显性表位的反应，当TTV作为增强时，这更为明显。虽然目前尚不清楚这种扩大的T细胞免疫范围是否是小鼠流感感染模型中DNA主要/病毒载体增强疫苗接种方式所赋予的跨群体保护的基础，但它对于潜在的通用人类流感疫苗肯定是至关重要的。
开发基于T细胞的通用流感疫苗的主要挑战之一是，T细胞对同一流感感染或疫苗的反应在个体之间可能有很大差异，这主要是由于拥有不同的HLA等位基因(人类MHC的替代命名法)，限制了向T细胞显示的病毒肽的数量。用于识别[42]。在HLA限制下，含有多种保守病毒表位的流感疫苗比集中在特定保守表位上的疫苗更有可能提供更好的人群覆盖率。因此，设计的新疫苗有可能克服人类环境中的HLA挑战，符合通用流感疫苗的一个重要标准。如本文所述，构建三种类型的疫苗来表达PAPBIMI和PB2NPM2免疫原使得能够测试结合这三种疫苗的顺序免疫策略。这是一个难得的机会，因为对于病毒载体疫苗，由于第一次增强预先存在的载体免疫力，使用相同疫苗的第二次增强在大多数情况下是没有益处的。鉴于最近的发现，流感特异性组织居民记忆(Trm)，特别是局限于肺部的，是交叉保护对流感挑战所必需的[43，44]，肌内或鼻内途径用于施用基于AdC68的疫苗，并分析了对记忆T细胞诱导和保护效果的影响。结果表明，虽然肌内免疫在触发全身CD8+T细胞反应方面更有效，但只有鼻内免疫才能唤起有效的肺Trm。
因此，仅在鼻内免疫组中观察到对致命PR8和H7N9挑战的全面保护。一个有趣的观察结果是，感染早期肺病毒载量水平与减肥和存活率方面的保护功效略相关。不受理论限制，这可以通过Trm的多功能性来解释，Trm不仅直接清除病毒感染的细胞，而且还分泌细胞因子以创造敌对的局部环境来阻止病毒传播[45]。还有证据表明，Trm可能有助于将循环免疫细胞动员到病变组织中[46]。
最后，本文提供的结果描述了全身T细胞反应也介导鼻内免疫提供的保护的发现。FTY720治疗可防止循环T细胞归巢到受损的外围组织，从而损害了保护功效。有趣的是，最近的一些研究表明，循环记忆T细胞可以被招募到肺部并转化为Trm，因此对于Trm的持续维持至关重要。这一新发现表明，全身和呼吸系统驻留记忆T细胞可能不会独立行动，而是共同协调起来，以有效预防流感感染。
总之，本文描述的实例显示了用于递送嵌入在保守的内部病毒蛋白序列中的交叉保护表位的新型序贯免疫策略的开发和实施。通过证明该策略提高全身和肺部居民记忆T细胞的能力，从而在接种疫苗的小鼠中提供跨组保护，以应对致命的流感挑战，该策略作为未来开发通用流感疫苗的新途径的候选资格得到了证实。
示例15.使用用人类免疫系统成分重建的NSG小鼠评估候选疫苗
NSG(NOD-scid 11.2Rγnull)小鼠(来自杰克逊实验室，jax.org/jax-mice-and-services/find-and-order-jax-mice/nsg-portfolio)将按如下方式植入人类PBMC。从健康成人供体收集的新鲜全血与不含防腐剂的肝素一起用低内毒素PBS(PBSle)(生物色素)稀释(1：3)，并使用标准丝胶梯度离心富集白细胞部分。该界面将被收获并用PBSle洗涤两次。对于9周的重组方案，在静脉注射1×10之前，一天将用100cGy的亚致死剂量照射小鼠6人类多溴联苯；4周方案将使用10×10的单次静脉注射6PBMC，无需照射。小鼠将在重组后第42天或第14天首先接种疫苗，分别如下。包含完全人类功能免疫系统的小鼠将通过用实施例3中描述的PSV1.0噬菌体DNA载体启动完全人类免疫系统来免疫，然后通过用AdV载体或AAV载体免疫来增强完全人类免疫系统，然后是VV载体，或者VV载体接着AdV载体或AAV载体。
示例16.免疫反应和免疫细胞亚型选择性扩增的评估
将评估在实施例15中重组的NSG小鼠中获得的免疫应答的质量，然后选择性扩增CTL细胞亚群。
简而言之，将分离PBMCs，脾细胞或人类或小鼠来源的骨髓细胞，并在4℃下用适当的抗体混合物在黑暗中染色1小时。在洗涤(PBS中为1％(v/v)FBS)之后，细胞将用固定缓冲液(1％(v/v)FBS，PBS中的4％(w/v)PFA)固定30分钟，在黑暗中4℃下。将进行流血细胞测量分析，并使用FlowJo软件(TreeStar，Ashland，OR)分析流式细胞术数据。所有人源化小鼠模型的嵌合体将在每次实验之前通过量化以下人群进行评估：人类CD45+，人类CD45+小鼠CD45-；T细胞，CD45+CD3+；CD4+T细胞，CD45+CD3+CD4+；CD8+T细胞，CD45+CD3+CD8+；CD45+CD16+白细胞；B细胞，CD45+CD19；常规树突状细胞，CD45+CD11c+；NK/NKT细胞，CD45+CD56+；单核细胞，CD45+CD14+。小鼠免疫细胞亚群将按如下方式进行门控：鼠CD45+，人CD45-鼠CD45+；常规树突状细胞，CD45+CD3-CD19-NK1.1-TER119-Ly-6G/Gr1-CD11c+；浆细胞样树突状细胞，CD45+CD3-CD19-NK1.1-TER119-Ly-6G/Gr1-CD317+；单核细胞，CD45+CD3-CD19-NK1.1-TER119-Ly-6G/Gr1-CD11b+CD11c-F4/80-；巨噬细胞，CD45+CD3-CD19-NK1.1-TER119-Ly-6G/Gr1-CD11b+F4/80+。人类免疫细胞亚群将按如下方式进行门控：人类CD45+，人类CD45+鼠CD45-；T细胞，CD45+CD3+；CD4+T细胞，CD45+CD3+CD4+；CD8+T细胞，CD45+CD3+CD8+；骨髓细胞，CD45+CD3-CD19-(CD56+)CD33+；粒细胞，CD45+CD66b+；B细胞，CD45+CD3-CD19+；自然杀伤细胞，CD45+CD3-(CD19-)CD56+；自然杀伤T细胞和γδT细胞，CD45+CD3+(CD19-)CD56+；常规树突状细胞，CD45+CD3-CD19-(CD56-)(CD33+)CD11c+(BDCA1/3+)；CD45+CD3-CD19 CD123+，由单核细胞、浆细胞样树突状细胞、嗜碱性粒细胞和髓系前体组成的组；浆细胞样树突状细胞，CD45+CD3-CD19-(CD56-)BDCA-2+CD123+；单核细胞，CD45+CD3-CD19-(CD56-)CD14+；巨噬细胞，CD45+CD3-CD19-(CD56-)CD68+。
流式细胞术荧光团抗体补偿将使用AbCTM抗小鼠珠试剂盒(Life Technologies，Invitrogen，Foster City，CA，USA)进行。计数珠将被添加到每个样品之前的流式细胞术分析(AccuCheck计数珠，生命技术，Invitrogen，福斯特城，加利福尼亚州，美国)。
每个细胞组分的频率将显示为CD45+细胞的百分比，但CD4+和CD8+T细胞除外，它们将显示为CD3+T细胞的百分比。还将确定重要的骨髓亚群(CD14+单核细胞和CD11c+树突状细胞)和CD56+NK细胞的频率。
虽然本发明已经参照其具体实施方式进行了描述，但本领域技术人员应当理解，可以在不背离本发明的真正精神和范围的情况下进行各种更改和等效项的替代。此外，可以对采用特定情况、材料、物质组成、工艺、工艺步骤或步骤，对本发明的客观精神和范围进行许多修改。所有此类修改均在本文所附权利要求的范围内。
引用
[1]Russell RJ,Kerry PS,Stevens DJ,Steinhauer DA,Martin SR,Gamblin SJ,Skehel JJ.Structure of influenza hemagglutinin in complex with an inhibitorof membrane fusion.Proc Natl Acad Sci US A.2008；105(46):17736-17741.
[2]Gostin LO,Phelan A,Stoto MA,Kraemer JD,Reddy KS.Virus sharing,genetic sequencing,and global health security.Science.2014；345(6202):1295-1296.
[3]Horimoto T,Kawaoka Y.Influenza:lessons from past pandemics,warnings from current incidents.Nat Rev Microbiol.2005；3(8):591-601.
[4]Johnson NP,Mueller J.Updating the accounts:globalmortality of the1918-1920“Spanish”influenza pandemic.Bull Hist Med.2002；76(1):105-115
[5]Gao R,Gao B,Hu Y,Feng Z,Wang D,Hu W,et al.Human infection with anovel avian-origin influenza A(H7N9)virus.N Engl J Med.2013；368(20):1888-1897.
[6]Houser K,Subbarao K.Influenza Vaccines:Challenges andSolutions.Cell Host Microbe.2015；17(3):295-300.
[7]Hannoun C.The evolving history of influenza viruses and influenzavaccines.Expert Rev Vaccines.2013；12(9):1085-1094.
[8]Wang Z,Wan Y,Qiu C,Quinones-Parra S,Zhu Z,Loh L,et al.Recoveryfrom severe H7N9 disease is associated with diverse response mechanismsdominated by CDS+T cells.Nat Commun.2015；6:6833.
[9]Sridhar S,Begom S,Bermingham A,Hoschler K,Adamson W,[s}]Carman W,et al.Cellular immune correlates of protection against symptomatic pandemicinfluenza.Nat Med.2013；19(10):1305-12.
[10]Fan J,Liang X,Horton MS,Perry HC,Citron MP,Heidecker GJ,etal.Preclinical study of influenza virus A M2 peptide conjugate vaccines inmice,ferrets,and rhesus monkeys.Vaccine.2004；22(23-24):2993-3003.
[11]Valkenburg SA,Li OT,Mak PW,Mok CK,Nicholls JM,Guan Y,et al.IL-15adjuvanted multivalent vaccinia-based universal influenza vaccine requiresCD4+T cells for heterosubtypic protection.Proc Natl Acad Sci US A.2014；111(15):5676-81.
[12]Lamere MW,Moquin A,Lee FE,Misra RS,Blair PJ,Haynes L,etal.Regulation of antinucleoprotein IgG by systemic vaccination and its effecton influenza virus clearance.J Virol.2011；85(10):5027-5035.
[13]Pica N,Palese P.Toward a universal influenza virus vaccine:prospects and challenges.Annu Rev Med.2013；64:189-202.
[14]Uddback IE,Steffensen MA,Pedersen SR,Nazerai L,Thomsen AR,Christensen JP.PB1 as a potential target for increasing the breadth of T-cellmediated immunity to Influenza A.Sci Rep.2016；6:35033.
[15]Cox A,Dewhurst S.A Single Mutation at PB1 Residue 319Dramatically Increases the Safety of PR8 Live Attenuated Influenza Vaccine ina Murine Model without Compromising Vaccine Efficacy.J Virol.2015；90(5):2702-5.
[16]Jaiswal V,Chanumolu SK,Sharma P,Chauhan RS,Rout C.EpiCombFlu:exploring known influenza epitopes and their combination to design auniversal influenza vaccine.Bioinformatics.2013；29(15):1904-7.
[17]Brown LE,Kelso A.Prospects for an influenza vaccine that inducescross-protective cytotoxic T lymphocytes.Immunol Cell Biol.2009；87(4):300-8.
[18]Holloway R,Rasmussen SA,Zaza S,Cox NJ,Jermigan DB.Updatedpreparedness and response framework for influenza pandemics.MMWR RecommRep.2014；63(RR-06):1-18.
[19]Draper SJ,Heeney JL.Viruses as vaccine vectors for infectiousdiseases and cancer.Nat Rev Microbiol.2010；8(1):62-73.
[20]Stanekova Z,Varecykova E.Conserved epitopes of influenza A virusinducing protective immunity and their prospects for universal vaccinedevelopment.Viral J.2010；7:351.
[21]Wang X,Xing M,Zhang C,Yang Y,Chi YD,Tang XY,et al.Neutralizingantibody responses to enterovirus and adenovirus in healthy adults inChina.Emerg Microbes Infec.2014；3(5):e30.
[22]Xing M,Wang X,Chi Y,Zhou,D.Gene therapy for colorectal cancerusmg adenovirus-mediated full-length antibody,cetuximab.Oncotarget.2016；7(19):28262-72.
[23]Zhang S,Huang W,Zhou X,Zhao Q,Wang Q,Jia B.Seroprevalence ofneutralizing antibodies to human adenoviruses type-5 and type-26 andchimpanzee adenovirus type-68 in healthy Chinese adults.J Med Viral.2013；85(6):1077-84.
[24]Barouch DH,Alter G,Broge T,Linde C,Ackerman ME,Brown EP,etal.Protective Efficacy of Adenovirus/Protein Vaccines Against SIV Challengesin Rhesus Monkeys.Science.2015；349(6245):320-324.
[25]Stanley DA,Honko AN,Asiedu C,Trefry JC,Lau-Kilby AW,Johnson JC,etal.Chimpanzee adenovirus vaccine generates acute and durable protectiveimmunity against ebolavirus challenge.Nat Med.2014；20(10):1126-9.
[26]Huang X,Xu J,Qiu C,Ren L,Liu L,Wan Y,et al.Mucosa！priming withPEI/DNA complex and systemic boosting with recombinant TianTan vacciniastimulate vigorous mucosal and systemic immune responses.Vaccine.2007；25(14):2620-9
[27]Huang X,Liu L,Ren L,Qiu C,Wan Y,Xu J.Mucosal priming withreplicative Tiantan vaccinia and systemic boosting with DNA vaccine raisedstrong mucosa！and systemic HIV-specific immune responses.Vaccine.2007；25(52):8874-84.
[28]Singh H,Raghava GP.ProPredl:prediction of promiscuous MHC Class-Ibinding sites.Bioinformatics.2003；19:1009-1014.
[29]Moutaftsi M,Peters B,Pasquetto V,Tscharke DC,Sidney J,Bui HH,etal.A consensus epitope prediction approach identifies the breadth of murine T(CD8+)-cell responses to vaccinia virus.Nat Biotechnol.2006；24:817-819.
[30]Keskin DB,Reinhold BB,Zhang GL,Ivanov AR,Karger BL,ReinherzEL.Physical detection of influenza A epitopes identifies a stealth subset onhuman lung epithelium evading natural CD8 immunity.Proc Natl Acad Sci USA.2015；112(7):2151-2156.
[31]Halstead ES,Mueller YM,Altman JD,Katsikis PD.In vivo stimulationof CD137 broadens primary antiviral CD8+T cell responses.Nat Immunol.2002；3(6):536-41.
[32]Lawrence CW,Ream RM,Braciale TJ.Frequency,specificity,and sitesof expansion of CD8+T cells during primary pulmonary influenza virusinfection.J Immunol.2005；174(9):5332-40.
[33]Turner SJ,La Gruta NL,Stambas J,Diaz G,Doherty PC.Differentialtumor necrosis factor receptor 2-mediated editing of virus-specific CD8+effector T cells.Proc Natl Acad Sci US A.2004；101(10):3545-3550.
[34]Tussey LG,Rowland-Jones S,Zheng TS,Androlewicz MJ,Cresswell P,Frelinger JA,et al.Different MHC class I alleles compete for presentation ofoverlapping viral epitopes.Immunity.1995；3(1):65-77.
[35]Belz GT,Xie W,Doherty PC.Diversity of Epitope and CytokineProfiles for Primary and Secondary Influenza A Virus-Specific CD8+T CellResponses.J Immunol.2001；166(7):74627-4633.
[36]Chen W,Norbury CC,Cho Y,Yewdell JW,Bennink JR.Immunoproteasomesshape immunodominance hierarchies of antiviral CD8(+)T cells at the levels ofT cell repertoire and presentation of viral antigens.J Exp Med.2001；193(11):1319-26.
[37]Zhu Z,Yang Y,Feng Y,Shi B,Chen L,Zheng Y,et al.Infection ofinbred BALB/c and C57BL/6 and outbred Institute of Cancer Research mice withthe emerging H7N9 avian influenza virus.Emerg Microbes Infect.2013；2(8):e50.
[38]Masopust D,Choo D,Vezys V,Wherry EJ,Duraiswamy J,Akondy R,etal.Dynamic T cell migration program provides resident memory withinintestinal epithelium.J Exp Med.201’0；207(3):553-64
[39]Steel J,Lowen AC,Wang TT,Yondola M,Gao Q,Haye K,et al.Influenzavirus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain.mBio.2010；1(1).
[40]Grant E,Wu C,Chan KF,Eckle S,Bharadwaj M,Zou QM,etal.Nucleoprotein of influenza A virus is a major target of immunodominant CD8+T-cell responses.Immunol Cell Biol.2013；91(2):184-94.
[41]Saletti G,Gerlach T,Rimmelzwaan GF.Influenza vaccines:‘tailor-made’or‘one fits all’.2018；53:102-110.
[42]Clemens EB,van de Sandt C,Wong SS,Wakim LM,ValkenburgSA.Harnessing the Power of T Cells:The Promising Hope for a UniversalInfluenza Vaccine.Vaccines(Basel).2018；6(2).
[43]Wu T,Hu Y,Lee YT,Bouchard KR,Benechet A,Khanna K,et al.Lung-resident memory CD8 T cells(TRM)are indispensable for optimal cross-protection against pulmonary virus infection.J Leukoc Biol.2014；95(2):215-24.
[44]Zens KD,Chen JK,Farber DL.Vaccine-generated lung tissue-residentmemory T cells provide heterosubtypic protection to influenza infection.JCIInsight.2016；1(10).
[45]Ariotti S,Hogenbirk MA,Dijkgraaf FE,Visser LL,Hoekstra ME,SongJY,et al.T cell memory.Skin-resident memory CD8+T cells trigger a state oftissue-wide pathogen alert.Science.2014；346(6205):101-5.
[46]Schenkel JM,Fraser KA,Vezys V,Masopust D.Sensing and alarmfunction of resident memory CDS+T cells.Nat Immunol.2013；14(5):509-13.
[47]Sliitter B,Van Braeckel-Budimir N,Abboud G,Varga SM,Salek-Ardakani S,Harty JT.Dynamics of influenza-induced lung-resident memory Tcells underlie waning heterosubtypic immunity.Sci Immunol.2017；2(7).
Pizzolla A,Nguyen TH,Sant S,Jaffar J,Loudovaris T,Mannering SI,etal.Influenza-specific lung-resident memory T cells are proliferative andpolyfunctional and maintain diverse TCR profiles.J Clin Invest.2018；128(2):721-733.
<110> 徐建青(XU, JIAN QING)
张晓燕(ZHANG, XIAO YAN)
王静(WANG, JING)
朱凌燕(ZHU, LING YAN)
贝弗莉·W·柳比特(LUBIT, BEVERLY W.)
<120> 提供生物体特异性和跨组保护的针对病原生物体的免疫原的通用疫苗
<130> 130189-00401
<140>
<141>
<150> PCT/CN2018/105020
<151> 2018-09-11
<160> 28
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<400> 1
000
<210> 2
<400> 2
000
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述： 合成引物
<400> 3
gaagaggcaa tgcaaaatag aataca 26
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述： 合成引物
<400> 4
cccgaagcta aaccaragta tca 23
<210> 5
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述： 合成探针
<400> 5
ccagtcaaac taagcagygg ctacaaa 27
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述： 合成引物
<400> 6
gaccgatcct gtcacctctg a 21
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述： 合成引物
<400> 7
agggcattct ggacaaagcg tcta 24
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述： 合成探针
<400> 8
tgcagtcctc gctcactggg cacg 24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述： 合成引物
<400> 9
caatgtgtcc gtcgtggatc t 21
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述： 合成引物
<400> 10
gtcctcagtg tagcccaaga tg 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述： 合成探针
<400> 11
cgtgccgcct ggagaaacct gcc 23
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 12
Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu
1 5
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 13
Met Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met
1 5
<210> 14
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 14
Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu Ile
1 5
<210> 15
<211> 23
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 15
Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu Thr Pro Ile Arg Asn Glu Trp Gly Cys
1 5 10 15
Arg Cys Asn Asp Ser Ser Asp
20
<210> 16
<211> 10
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 16
Ala Thr Tyr Gln Arg Thr Arg Ala Leu Val
1 5 10
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 17
Ala Ser Asn Glu Asn Met Asp Thr Met
1 5
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 18
Ser Arg Tyr Trp Ala Ile Arg Thr Arg
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 19
Ser Ser Tyr Arg Arg Val Pro Gly Ile
1 5
<210> 20
<211> 10
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 20
Val Ser Gly Val Asn Glu Ser Ala Asp Met
1 5 10
<210> 21
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 21
Asp Gly Gly Pro Asn Leu Tyr Asn Ile
1 5
<210> 22
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 22
Ile Ser Pro Leu Met Val Ala Tyr Met
1 5
<210> 23
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 23
Val Leu Thr Gly Asn Leu Gln Thr Leu
1 5
<210> 24
<211> 10
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 24
Ser Val Leu Val Asn Thr Tyr Gln Trp Ile
1 5 10
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 25
Ser His Leu Arg Asn Asp Thr Asp Val Val
1 5 10
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 26
Thr Asp Val Val Asn Phe Val Ser Met
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 甲型流感病毒(Influenza A virus)
<400> 27
Val Glu Glu Gly Ser Ile Gly Lys Val
1 5
<210> 28
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 人工序列的描述： 合成肽
<400> 28
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15

Claims (23)

1.一种针对选自病毒、细菌、真菌或原生动物的感染性病原生物体的免疫原的通用疫苗，其包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，所述多核苷酸包含编码至少一种多肽抗原或其免疫原性片段的开放阅读框，其中所述多肽抗原或其所述免疫原性片段包含富含CD8+T细胞识别抗原的保守内部蛋白，
(a)其中细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位由长度为8-11个残基的肽组成，并且
(b)其中响应于所述疫苗而引发的免疫反应包括以下中的一个或多个：
相比于对照
(i)激活针对所述疫苗中存在的至少一种抗原的一种或多种T细胞群；或
(ii)中和所述病原体的感染性；或
(iii)包括所述病原体的破坏的抗原特异性反应；感染所述病原体的细胞的裂解，或两者。
2.根据权利要求1所述的通用疫苗，其中所激活的细胞群包括激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)。
3.根据权利要求2所述的通用疫苗，其中所述激活的CTL包括NK细胞群、NKT细胞群、LAK细胞群、CIK细胞群、MAIT细胞群、CD8+CTL群或CD4+CTL群中的一个或多个。
4.根据权利要求1所述的通用疫苗，其中所述保守的免疫原性多肽或免疫原性片段是病毒内部基质蛋白、病毒衣壳蛋白、病毒核蛋白、病毒核蛋白质、病毒糖蛋白、病毒磷蛋白、病毒包膜蛋白、病毒蛋白酶、逆转录酶或病毒聚合酶。
5.根据权利要求1所述的通用疫苗，其通过包括以下的方法制备：
a.从共有氨基酸序列中鉴定并选择感染性病原体或其免疫原性片段的富含CD8+T细胞识别抗原的高度保守的内部蛋白；
b.构建(a)中的所述高度保守的内部蛋白的免疫原序列；
c.构建：
i.包含(b)的所述免疫原序列的链霉菌属噬菌体SV1.0 DNA载体；
ii.包含(b)的所述免疫原序列的腺病毒基(AdV)载体；
iii.包含(b)的所述免疫原序列的减毒的复制型重组牛痘病毒基(VV)载体；
d.分别繁殖(c)中包含所编码的免疫原的所述重组载体中的每一种，以用于在体内以有效引发或刺激针对所述感染性病原体的感染的治疗性或预防性的细胞介导的免疫反应的量免疫受试者，这通过以下来实现：
i.通过用(c)(i)的所述噬菌体DNA载体进行免疫来初免完全人免疫系统；
ii.通过先使用(c)(ii)的所述AdV载体，接着使用(c)(iii)的所述VV载体，或先使用(c)(iii)的所述VV载体，接着使用(c)(ii)的所述AdV载体进行免疫来加强完全人免疫系统。
6.根据权利要求5所述的通过所述方法制备的通用疫苗，其中所述保守的免疫原性蛋白或免疫原性片段是病毒内部基质蛋白、病毒衣壳蛋白、病毒核蛋白、病毒核蛋白质、病毒糖蛋白、病毒磷蛋白、病毒包膜蛋白、病毒蛋白酶、逆转录酶或病毒聚合酶。
7.一种编码至少一种RNA多核苷酸的工程化核酸，所述多核苷酸包含编码至少一种多肽抗原或其免疫原性片段的开放阅读框，其中所述多肽抗原或其所述免疫原性片段包含根据权利要求1所述的通用疫苗的富含CD8+T细胞识别抗原的保守内部蛋白。
8.一种表达载体，其包含编码至少一种RNA多核苷酸的工程化核酸，所述多核苷酸包含编码至少一种多肽抗原或其免疫原性片段的开放阅读框，其中所述多肽抗原或其所述免疫原性片段包含根据权利要求1所述的通用疫苗的富含CD8+T细胞识别抗原的保守内部蛋白。
9.一种宿主细胞，其包含编码至少一种RNA多核苷酸的工程化核酸，所述多核苷酸包含编码至少一种多肽抗原或其免疫原性片段的开放阅读框，其中所述多肽抗原或其所述免疫原性片段包含根据权利要求1所述的通用疫苗的富含CD8+T细胞识别抗原的保守内部蛋白。
10.一种诱导受试者的免疫反应的方法，所述方法包括向所述受试者施用针对选自病毒、细菌、真菌或原生动物的感染性病原生物体的免疫原的通用疫苗，其包含至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，所述多核苷酸包含编码至少一种抗原性多肽或其免疫原性片段的开放阅读框，其中所述抗原性肽或其所述免疫原性片段包含富含CD8+T细胞识别抗原的保守内部蛋白，
其中CD8+T细胞识别抗原由长度为8-11个残基的肽组成，并且
其中响应于所述疫苗而产生的免疫反应包括以下中的一个或多个：
相比于对照
(i)激活针对所述疫苗中存在的一种或多种抗原的一种或多种T细胞群；或
(ii)中和所述病原体的感染性；或
(iii)包括所述感染性病原生物体的破坏的抗原特异性反应；感染所述感染性病原生物体的细胞的裂解，或两者。
11.根据权利要求10所述的方法，其包括用包含编码富含CD8+T细胞识别抗原的保守内部蛋白的第一免疫原序列的链霉菌属噬菌体SV1.0 DNA载体对所述受试者进行初免，并且接着用包含编码富含CD8+T细胞识别抗原的保守内部蛋白的第二免疫原序列的腺病毒基(AdV)载体或减毒的复制型重组牛痘病毒基(VV)载体对所述受试者进行加强。
12.根据权利要求10所述的方法，其包括通过皮内注射、鼻内或通过肌内注射向所述受试者施用所述疫苗。
13.根据权利要求10所述的方法，其中初免剂量的施用方式和加强剂量的施用方式是不同的。
14.根据权利要求10所述的方法，其中所述受试者是表型NOD-scidγc-/-或BALB/cRag2-/-γc-/-的小鼠。
15.根据权利要求10所述的方法，其包括重构表型NOD-scidγc-/-的小鼠，所述重构是通过将人C34+CD133+脐带血细胞心内注射到作为新生儿的NOD-scidγc-/-小鼠中。
16.根据权利要求10所述的方法，其包括重构表型BALB/c Rag2-/-γc-/-的小鼠，所述重构包括将从人胎肝分离的CD34+造血祖细胞(HPC)肝内转移到新生的BALB/c Rag2-/-γc-/-中。
17.一种用于在包括完全人功能性免疫系统的动物模型中体内诱导泛流感特异性细胞免疫反应的方法，其包括：
(1)从共有氨基酸序列中鉴定并选择多种富含CD8+T细胞识别抗原的高度保守的内部流感病毒蛋白；
(2)构建(a)中的所述高度保守的内部流感病毒蛋白的串联免疫原序列；
(3)构建：
a.包含(b)的所述串联免疫原序列的链霉菌属噬菌体SV1.0DNA载体；
b.包含(b)的所述串联免疫原序列的腺病毒基(AdV)载体；
c.包含(b)的所述串联免疫原序列的减毒的复制型重组牛痘病毒基(VV)载体；
(4)分别繁殖(3)中包含所编码的免疫原的所述重组载体中的每一种；
(5)通过以下方式在体内对包括完全人功能性免疫系统的所述动物模型进行免疫：
a.通过用3(a)的所述噬菌体DNA载体进行免疫来初免完全人免疫系统；
b.通过先使用3(b)的所述AdV载体，接着使用3(c)的所述VV载体，或先使用3(c)的所述VV载体，接着使用3(b)的所述AdV载体进行免疫来加强完全人免疫系统；以及
(6)在(5)中的所述免疫之后，使用甲型流感/PR8(H1N1)或甲型流感/上海(H7N9)病毒攻击包括经免疫的完全人功能性免疫系统的所述动物模型。
18.根据权利要求17所述的方法，其包括通过皮内注射、鼻内或通过肌内注射向所述受试者施用所述疫苗。
19.根据权利要求17所述的方法，其中单剂量和加强剂量的施用方式是不同的。
20.根据权利要求17所述的方法，其中所述动物模型是表型NOD-scidγc-/-或BALB/cRag2-/-γc-/-的小鼠。
21.根据权利要求17所述的方法，其包括重构表型NOD-scidγc-/-的小鼠，所述重构是通过将人C34+CD133+脐带血细胞心内注射到作为新生儿的NOD-scidγc-/-小鼠中。
22.根据权利要求17所述的方法，其包括重构表型BALB/c Rag2-/-γc-/-的小鼠，所述重构包括将从人胎肝分离的CD34+造血祖细胞(HPC)肝内转移到新生的BALB/c Rag2-/-γc-/-中。
23.根据权利要求17所述的方法，其中所述动物模型中的所述泛流感特异性细胞免疫反应有效减少感染在未免疫的重构小鼠群体中的传播。
CN202080098295.4A 2018-09-11 2020-12-18 针对pr的致病生物免疫原的通用疫苗卵子生物特异性和跨组保护 Pending CN116096403A (zh)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/CN2018/105020 WO2020051766A1 (zh) 2018-09-11 2018-09-11 一种广谱抗流感疫苗免疫原及其应用
US16/737546 2020-01-08
US16/737,546 US11471523B2 (en) 2018-09-11 2020-01-08 Universal vaccines against immunogens of pathogenic organisms that provide organism-specific and cross-group protection
PCT/US2020/066059 WO2021141758A1 (en) 2018-09-11 2020-12-18 Universal vaccines against immunogens of pathogenic organisms that provide organism-specific and cross-group protection

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116096403A true CN116096403A (zh) 2023-05-09

Family

ID=69776980

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880001963.XA Active CN111315407B (zh) 2018-09-11 2018-09-11 一种广谱抗流感疫苗免疫原及其应用
CN202080098295.4A Pending CN116096403A (zh) 2018-09-11 2020-12-18 针对pr的致病生物免疫原的通用疫苗卵子生物特异性和跨组保护

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201880001963.XA Active CN111315407B (zh) 2018-09-11 2018-09-11 一种广谱抗流感疫苗免疫原及其应用

Country Status (7)

Country Link
US (3) US20220118077A1 (zh)
EP (2) EP3851120A4 (zh)
JP (3) JP7320601B2 (zh)
CN (2) CN111315407B (zh)
AU (1) AU2020421142A1 (zh)
BR (1) BR112022013573A2 (zh)
WO (2) WO2020051766A1 (zh)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2018359556B2 (en) 2017-11-03 2021-12-02 Takeda Vaccines, Inc. Zika vaccines and immunogenic compositions, and methods of using the same
AU2018375789B2 (en) 2017-11-30 2021-11-11 Takeda Vaccines, Inc. Method for inactivating Zika virus and related methods
EP4031172A4 (en) * 2019-09-16 2024-02-21 Chen, Dalu METHOD FOR BLOCKING ASV INFECTION BY DISRUPTING CELL RECEPTORS
CN113117069B (zh) * 2020-05-29 2022-09-30 北京启辰生生物科技有限公司 抗新型冠状病毒疫苗及其制备方法
CN113024640B (zh) * 2020-12-28 2022-07-26 广州中医药大学顺德医院(佛山市顺德区中医院) 基于新冠病毒rbd与ace2受体结合结构域筛选的表位肽抗原检测中和抗体试剂盒
CN113171449B (zh) * 2021-04-27 2022-06-07 青岛农业大学 一种甲型流感病毒通用dna疫苗及其构建方法
WO2022246219A2 (en) * 2021-05-21 2022-11-24 The Regents Of The University Of California Coronavirus constructs and vaccines
EP4392568A1 (en) * 2021-08-27 2024-07-03 Cornell University Multivalent viral particles
CN113633764B (zh) * 2021-09-02 2024-05-14 中国食品药品检定研究院 一种含佐剂的新冠dna疫苗
CN116068192A (zh) * 2022-01-24 2023-05-05 中国农业大学 一种检测非洲猪瘟病毒抗体的ELISA检测试剂盒以及protein L的应用
WO2023164475A1 (en) * 2022-02-23 2023-08-31 Akeso Therapeutics, Inc. Modified invariant natural killer t cells expressing a chimeric antigen receptor and uses thereof
WO2024059635A2 (en) * 2022-09-13 2024-03-21 Oregon Health And Science University Universal t cell-based, cmv-vectored vaccine for influenza
CN116947982B (zh) * 2023-07-12 2024-05-14 吉林大学 三条优势表位肽序列及其在流感病毒疫苗的应用
CN117430664B (zh) * 2023-10-24 2024-04-09 暨南大学附属第六医院(东莞市东部中心医院) 一种甲型流感病毒t细胞抗原表位肽及其应用
CN118255849B (zh) * 2024-02-06 2024-10-01 中山大学·深圳 一种流感病毒通用疫苗及其制备方法与应用

Family Cites Families (63)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2444713A1 (fr) 1978-12-18 1980-07-18 Pasteur Institut Procede de production d'un adn comprenant le genome du virus de l'hepatite b et vecteur le comportant
US4722848A (en) 1982-12-08 1988-02-02 Health Research, Incorporated Method for immunizing animals with synthetically modified vaccinia virus
US4866034A (en) 1982-05-26 1989-09-12 Ribi Immunochem Research Inc. Refined detoxified endotoxin
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4876197A (en) 1983-02-22 1989-10-24 Chiron Corporation Eukaryotic regulatable transcription
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4690915A (en) 1985-08-08 1987-09-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adoptive immunotherapy as a treatment modality in humans
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US4877611A (en) 1986-04-15 1989-10-31 Ribi Immunochem Research Inc. Vaccine containing tumor antigens and adjuvants
US5135855A (en) 1986-09-03 1992-08-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Rapid, versatile and simple system for expressing genes in eukaryotic cells
US4844893A (en) 1986-10-07 1989-07-04 Scripps Clinic And Research Foundation EX vivo effector cell activation for target cell killing
US6024983A (en) 1986-10-24 2000-02-15 Southern Research Institute Composition for delivering bioactive agents for immune response and its preparation
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
CA1341245C (en) 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
KR920007887B1 (ko) 1989-08-29 1992-09-18 스즈키 지도오샤 고오교오 가부시키가이샤 내연기관의 배기가스 정화장치
WO1992001800A1 (en) 1990-07-20 1992-02-06 Chiron Corporation Method for integrative transformation of yeast using dispersed repetitive elements
NZ253137A (en) 1992-06-25 1996-08-27 Smithkline Beecham Biolog Vaccine comprising antigen and/or antigenic composition, qs21 (quillaja saponaria molina extract) and 3 de-o-acylated monophosphoryl lipid a.
DK0678034T3 (da) 1993-01-11 1999-11-08 Dana Farber Cancer Inst Inc Induktion af cytotoksiske T-lymfocytreaktioner
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
US5981505A (en) 1993-01-26 1999-11-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for delivery of genetic material
JP3952312B2 (ja) 1993-11-09 2007-08-01 メディカル カレッジ オブ オハイオ アデノ関連ウイルス複製遺伝子を発現可能な安定な細胞株
WO1995013365A1 (en) 1993-11-09 1995-05-18 Targeted Genetics Corporation Generation of high titers of recombinant aav vectors
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5739118A (en) 1994-04-01 1998-04-14 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
DK0772619T4 (da) 1994-07-15 2011-02-21 Univ Iowa Res Found Immunmodulatoriske oligonukleotider
NL9401820A (nl) 1994-11-02 1996-06-03 Meyn Maschf Inrichting voor het bewerken van aan zijn poten opgehangen gevogelte.
US5962428A (en) 1995-03-30 1999-10-05 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
UA56132C2 (uk) 1995-04-25 2003-05-15 Смітклайн Бічем Байолоджікалс С.А. Композиція вакцини (варіанти), спосіб стабілізації qs21 відносно гідролізу (варіанти), спосіб приготування композиції вакцини
UA68327C2 (en) 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
US6027931A (en) 1995-08-03 2000-02-22 Avigen, Inc. High-efficiency AA V helper functions
US5622856A (en) 1995-08-03 1997-04-22 Avigen High efficiency helper system for AAV vector production
JP2001506133A (ja) 1996-12-18 2001-05-15 ターゲティッド ジェネティクス コーポレイション 組換えａａｖベクターの産生における使用のための、ａａｖスプリット−パッケージング遺伝子およびこのような遺伝子を含む細胞株
US6355257B1 (en) 1997-05-08 2002-03-12 Corixa Corporation Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
US6113918A (en) 1997-05-08 2000-09-05 Ribi Immunochem Research, Inc. Aminoalkyl glucosamine phosphate compounds and their use as adjuvants and immunoeffectors
CA2304168A1 (en) 1997-09-19 1999-04-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and cell line useful for production of recombinant adeno-associated viruses
GB9727262D0 (en) 1997-12-24 1998-02-25 Smithkline Beecham Biolog Vaccine
TR200002338T2 (tr) 1998-02-12 2002-06-21 Immune Complex Corporation Stratejik olarak yenilenmiş hepatit B çekirdek proteinler.
JP2002511423A (ja) 1998-04-09 2002-04-16 スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
PL205922B1 (pl) 2000-03-14 2010-06-30 Bavarian Nordic As Zmodyfikowany wirus Ankara (MVA), zakażona nim komórka gospodarza, jego zastosowania, kompozycja farmaceutyczna i sposoby otrzymywania wirusa oraz sekwencji kwasu nukleinowego, peptydu i/lub polipeptydu
ES2295175T3 (es) 2000-06-23 2008-04-16 Wyeth Holdings Corporation Ensamblaje de particulas similares al virus (vlp) de la gripe de tipo salvaje y quimericas.
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
JP5331340B2 (ja) * 2004-05-18 2013-10-30 バイカル インコーポレイテッド インフルエンザウィルスワクチン組成物、及びその使用方法
EP1766034B1 (en) 2004-05-21 2014-03-19 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Alphavirus vectors for influenza virus vaccines
EP1877088B1 (en) * 2005-04-11 2014-12-17 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Vaccine against pandemic strains of influenza viruses
AU2006283101B2 (en) 2005-08-23 2013-03-07 Beth Israel Deaconess Medical Center Polyvalent vaccine
WO2007073513A2 (en) 2005-11-10 2007-06-28 Genvec, Inc. Method for propagating adenoviral vectors encoding inhibitory gene products
WO2007092792A2 (en) 2006-02-02 2007-08-16 Globeimmune, Inc. Yeast-based vaccine for inducing an immune response
US8778353B2 (en) 2006-05-01 2014-07-15 Technovax, Inc. Influenza virus-like particle (VLP) compositions
US9101578B2 (en) 2006-05-01 2015-08-11 Technovax, Inc. Polyvalent influenza virus-like particle (VLP) compositions
EP2069376A4 (en) * 2006-07-21 2013-10-16 Pharmexa Inc INDUCTION OF CELLULAR IMMUNE RESPONSES TO INFLUENZA VIRUS BY COMPOSITIONS OF PEPTIDES AND NUCLEIC ACIDS
HUE025149T2 (hu) * 2007-08-02 2016-01-28 Biondvax Pharmaceuticals Ltd Multimer multiepitóp influenza vakcinák
CN101716340A (zh) * 2009-10-28 2010-06-02 武汉华美生物工程有限公司 一种甲型h1n1流感病毒重组蛋白疫苗制备方法的建立
WO2012129295A1 (en) * 2011-03-21 2012-09-27 Vaxin Inc. Rapid and prolonged immunologic-therapeutic
EP3494989A1 (en) * 2012-01-26 2019-06-12 Longhorn Vaccines and Diagnostics, LLC Composite antigenic sequences and vaccines
KR101382244B1 (ko) * 2012-03-30 2014-04-08 재단법인 목암생명공학연구소 광범위한 인플루엔자 바이러스의 감염을 방어할 수 있는 ｔ―세포 기반 유니버설 플루 백신
WO2014086732A2 (en) * 2012-12-03 2014-06-12 Novartis Ag Influenza virus reassortment
RU2628690C2 (ru) 2015-11-06 2017-08-21 Общество С Ограниченной Ответственностью 'Фарминтерпрайсез' Аттенуированные гриппозные векторы для профилактики и/или лечения инфекционных заболеваний, а также для лечения онкологических заболеваний

Also Published As

Publication number Publication date
JP7320601B2 (ja) 2023-08-03
US20210100892A1 (en) 2021-04-08
US20220347287A1 (en) 2022-11-03
JP2022513558A (ja) 2022-02-09
AU2020421142A1 (en) 2022-08-18
JP2023510542A (ja) 2023-03-14
CN111315407B (zh) 2023-05-02
JP2023093541A (ja) 2023-07-04
US20220118077A1 (en) 2022-04-21
EP3851120A1 (en) 2021-07-21
CN111315407A (zh) 2020-06-19
EP4087603A4 (en) 2024-01-10
EP3851120A4 (en) 2022-04-27
BR112022013573A2 (pt) 2022-09-13
EP4087603A1 (en) 2022-11-16
WO2021141758A1 (en) 2021-07-15
US11471523B2 (en) 2022-10-18
WO2020051766A1 (zh) 2020-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11471523B2 (en) Universal vaccines against immunogens of pathogenic organisms that provide organism-specific and cross-group protection
Martínez-Flores et al. SARS-CoV-2 vaccines based on the spike glycoprotein and implications of new viral variants
Warfield et al. Induction of humoral and CD8+ T cell responses are required for protection against lethal Ebola virus infection
Zhou et al. Sensitivity to vaccines, therapeutic antibodies, and viral entry inhibitors and advances to counter the SARS-CoV-2 Omicron variant
ES2625406T3 (es) Glicoproteínas de CMV y vectores recombinantes
Koraka et al. A recombinant rabies vaccine expressing the trimeric form of the glycoprotein confers enhanced immunogenicity and protection in outbred mice
Mirzaei et al. Overview of the current promising approaches for the development of an effective severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) vaccine
JP2019509350A (ja) Ｄｎａ抗体構築物及びその使用方法
Lukashevich et al. Lassa virus diversity and feasibility for universal prophylactic vaccine
BR112019014082A2 (pt) Imunoterapia para hiv sem etapa de pré-imunização
Jiang et al. The variation of SARS-CoV-2 and advanced research on current vaccines
US11660335B2 (en) Vaccines against coronavirus and methods of use
US20150231226A1 (en) Novel attenuated dengue virus strains for vaccine application
US20220249651A1 (en) Universal vaccines against immunogens of pathogenic organisms that provide organism-specific and cross-group protection
Roukens et al. Intradermal vaccination to protect against yellow fever and influenza
Choi et al. A novel synthetic DNA vaccine elicits protective immune responses against Powassan virus
CA3168673A1 (en) Coronavirus vaccines
CN108779473A (zh) 用于制备具有环二核苷酸的病毒颗粒的方法和所述颗粒用于治疗癌症的用途
Ma et al. Host immunity and vaccine development against Dengue virus
DK2310510T3 (en) IDNA vaccines and methods for their use
Collett et al. Development of virus-like particles with inbuilt immunostimulatory properties as vaccine candidates
US20230310585A1 (en) Vaccine for viral pathogens
Swayze et al. Envelope protein E1 as vaccine target for western equine encephalitis virus
Tang et al. Development of a novel virus-like particle-based vaccine for preventing tick-borne encephalitis virus infection
Manfredi et al. Induction of SARS-CoV-2 N-specific CD8+ T cell immunity in lungs by engineered extracellular vesicles associates with strongly impaired viral replication

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination