ES2295175T3 - Ensamblaje de particulas similares al virus (vlp) de la gripe de tipo salvaje y quimericas. - Google Patents

Abstract

Método para producir partículas similares al virus de la gripe (VLP), comprendiendo dicho método las etapas siguientes: (i) construir una molécula de ADN recombinante que, en términos de proteínas del virus de la gripe, codifica solamente la proteína estructural de la matriz (M1) del virus de la gripe; (ii) transfectar, infectar, o transformar de otra manera una célula hospedadora adecuada con dicha molécula de ADN recombinante, cultivar la célula hospedadora en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína estructural M1, de modo que las VLP se ensamblan en el interior de las células tras la expresión de la proteína estructural M1; y (iii) purificar las VLP a partir del sobrenadante del cultivo.

Description

Ensamblaje de partículas similares al virus (VLP) de la gripe de tipo salvaje y quiméricas.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a partículas similares al virus de la gripe que comprenden sólo la proteína de la matriz, y que pueden incluir, además, cualquiera de las proteínas estructurales del virus de la gripe.

Antecedentes de la invención

Los virus de la gripe comprenden los subtipos denominados A, B y C. Los virus de la gripe poseen un genoma de ARN segmentado, unicatenario, de sentido negativo, que codifica 10 polipéptidos que son necesarios para el ciclo celular del virus. Cada uno de los ocho segmentos de ARN de un genoma completo se incluye en la cápside con múltiples subunidades de la proteína de la nucleocápside (NP), y está asociado con algunas moléculas de la polimerasa trimérica (subunidades PB1, PB2 y PA), formando de este modo el complejo ribonucleoproteico (RNP) (cita bibliográfica 1). Estas estructuras están rodeadas por una capa de la proteína de la matriz (M1), que parece servir como nexo entre el núcleo y la envoltura vírica. La envoltura procedente de la célula hospedadora está tachonada con las dos principales glucoproteínas de la superficie codificadas por el virus: hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA), y una cantidad mucho menor de una pequeña proteína no glucosilada: M2 (1,2). La glucoproteína HA es cortada por una proteasa para formar HA1 y HA2.

La infección por el virus de la gripe se inicia con la adhesión de la hemaglutinina de la superficie a un receptor celular que contiene ácido siálico. La primera interacción entre el virus y la célula induce la captación de la partícula vírica en el interior de la célula por endocitosis mediada por receptor. En las condiciones de pH bajo del endosoma, la HA sufre un cambio conformacional que facilita la interacción del dominio NH_{2}-terminal hidrófobo de HA2 con la membrana del endosoma, lo que da lugar a la fusión de membranas y la liberación subsiguiente de los RNP del núcleo y de la proteína de la matriz (M1) en el citosol. La disociación de los RNP y las proteínas de la matriz tiene lugar en el citosol antes de que los RNP se transfieran al núcleo, en el que tienen lugar la transcripción y la replicación del genoma completo (3, 4).

Después de la transcripción primaria, las proteínas recién sintetizadas inician la replicación del genoma vírico, que a su vez aumenta la transcripción y la síntesis de proteínas. En este momento del ciclo vital del virus, las glucoproteínas de la superficie HA y NA comienzan a acumularse en zonas aisladas de la membrana plasmática, desde la que se liberarán los virus recién ensamblados. Se cree que el ensamblaje del virus comienza mediante algún tipo de interacción entre los dominio citoplásmico y/o transmembranario de las proteínas ancladas en la membrana y la proteína de la matriz (M1) subyacente, que a su vez mantiene una estrecha asociación con los RNP (5, 6). De forma colectiva, HA, NA, M1 y M2 constituyen las cuatro proteínas estructurales codificadas por el virus. Los contactos entre la proteína de la matriz M1 y los complejos RNP, así como el mecanismo por el que un grupo completo de ocho RNP se incorpora en la partícula madura del virión, no están bien definidos. Se cree que los contactos moleculares específicos entre los componentes estructurales determinan cómo se inicia el proceso de morfogénesis y progresa hasta llegar al ensamblaje de la partícula madura y su liberación por gemación de la superficie de la célula hospedadora.

La complejidad del proceso ha puesto de manifiesto problemas tales como: 1) La identificación de las proteínas víricas que son necesarias para el ensamblaje y la liberación por gemación. 2) El tipo de interacciones proteína-proteína y lípido-proteína entre la superficie y los componentes subyacentes que dirigen el proceso de ensamblaje y liberación por gemación. 3) Los mecanismos por los que los RNP se transfieren al lugar de ensamblaje, se incorporan en la partícula y se distribuyen a partir de segmentos análogos. 4) La naturaleza y la estequiometría de las interacciones, y la regulación del ensamblaje y la liberación por gemación. Todos estos acontecimientos tienen lugar en un ambiente celular complejo en el que algunas moléculas del hospedador pueden, o no, aumentar o interferir en la progresión del proceso de ensamblaje y liberación por gemación. Esto, a su vez, plantea las cuestiones de si las proteínas celulares intervienen realmente en el ensamblaje del virus, y de cómo las proteínas no víricas se excluyen generalmente de la superficie de las partículas emitidas por gemación.

Se han llevado a cabo un gran número de estudios para resolver algunas de estas cuestiones empleando virus de ARN con envoltura de diferentes familias (5); sin embargo, la mayoría de dichos problemas permanecen sin resolver en lo que respecta al virus de la gripe. Los estudios con familias de virus de ARN no segmentado (tales como Rhabdoviridae y Paramyxoviridae), que están algo relacionados desde el punto de vista morfológico y evolutivo con el virus de la gripe, han demostrado que la proteína de la matriz (M) del virus de la estomatitis vesicular (VSV), un rabdovirus, es, por sí misma, capaz de desprenderse por pinzamiento (liberarse por gemación) de la superficie celular en forma de partículas con membrana (7, 8). Además, la importancia las proteínas M en la gemación se refleja también en el hecho de que las copias de los virus de la rabia (otro rabdovirus) con una deleción en el gen que codifica la proteína superficial G siguen formándose y liberándose de las células infectadas (9). Investigaciones más recientes con el PIV-3 (un paramixovirus) han demostrado asimismo que las proteínas de la matriz junto con la proteína de la nucleocápside (NP) son capaces de asociarse en una estructura similar a un virus y liberarse por gemación de la superficie celular (10). No obstante, en lo que respecta al virus de la gripe, la expresión de estas dos proteínas utilizando replicones del virus de Semliki Forest no mostró asociación entre dichas proteínas o gemación de las vesículas con membrana (11).

La aplicación de técnicas de genética inversa con el virus de la gripe ha sido una estrategia útil para investigar las interacciones proteína-proteína entre los componentes estructurales. La importancia del dominio citoplásmico de las glucoproteínas en el ensamblaje del virus de la gripe ha sido estudiada recientemente (12, 13, 14), y se ha demostrado que la deleción de la cola de la HA reducía su incorporación en la partícula, así como la eficacia de la gemación, pero no afectaba a la morfología del virión. Por otra parte, los virus con una cola de NA eliminada presentaban una morfología filamentosa, y la incorporación de la NA en la envoltura estaba alterada. Además, las deleciones dobles parece que disminuían la eficacia de la gemación, así como la capacidad infecciosa, y cambiaban la morfología del virión, que era distinta de la obtenida en los virus con deleciones de la cola y en los virus de tipo salvaje. Aunque las deleciones dobles de la cola parecían afectar a la eficacia de la gemación y a la morfología de las partículas víricas, no suprimieron completamente el ensamblaje y la liberación de las partículas de viriones, lo que indica que la proteína M1 es capaz de dirigir el ensamblaje y liberación por gemación del virus (13).

De modo similar, las interacciones que tienen lugar entre la proteína de la matriz y la membrana plasmática parecen ser fundamentales para el ensamblaje y la liberación del virus. Sin embargo, la naturaleza física de esta asociación, ya sea que la proteína de la matriz esté completamente incrustada en la membrana plasmática o que esté simplemente adherida mediante interacciones electrostáticas, está todavía por determinar. Un estudio reciente que se ocupó de este problema indicaba claramente que la matriz y la membrana estaban asociadas por medio de interacciones electrostáticas, si bien no puede descartarse que una cierta cantidad de M1 este incrustada en la membrana (15). El papel fundamental que desempeñan las proteínas M1 y M2 en la estructura del virión maduro se refleja en la morfología esférica o filamentosa de las partículas cuando están presentes sustituciones de aminoácidos en cualquiera de dichas moléculas (16).

Las partículas similares a virus (VLP) han sido objeto de considerable interés en los últimos años como posibles candidatos para su inclusión en composiciones inmunógenas. Esto se debe a que las VLP contienen una o más proteínas superficiales presentadas en una conformación suficientemente similar a su conformación activa como para provocar una respuesta inmunitaria deseada. Al mismo tiempo, las VLP carecen del complemento de material genético necesario para producir la progenie vírica en un hospedador. Por consiguiente, a diferencia del virus de tipo salvaje, las VLP no pueden causar una infección con síntomas de una enfermedad o trastorno patológico. Por ejemplo, dos o tres proteínas de rotavirus (un virus de ARN bicatenario) han sido ensambladas en VLP, que provocaban una respuesta inmunitaria (17).

Los sistemas de expresión en baculovirus han sido ampliamente utilizados para investigar la morfogénesis y el ensamblaje de las VLP de virus sin envoltura que se autoensamblan en estructuras icosahédricas (18, 19, 20, 21). De modo similar, la expresión en células de insecto de las proteínas gag y/o env de diferentes miembros de la familia de retrovirus se ha utilizado también para estudiar el ensamblaje y la liberación por gemación de la estructura del núcleo de virus con envoltura (22, 23, 24, 25).

Hay una necesidad de evaluar la capacidad del sistema de expresión en baculovirus para producir VLP del virus de la gripe. En particular, hay una necesidad de identificar el número mínimo de proteínas del virus de la gripe que se ensamblarán en VLP, y de evaluar la morfología e inmunogenicidad de dichas VLP.

Sumario de la invención

Por consiguiente, un objetivo de la presente invención es identificar el número mínimo de proteínas del virus de la gripe que se ensamblarán en una VLP. Otro objetivo de la presente invención es generar VLP que contienen proteínas procedentes de más de un subtipo del virus de la gripe. Otro objetivo adicional de la presente invención es generar VLP quiméricas que contienen una proteína procedente de una fuente heteróloga, que no es el virus de la gripe. Otro objetivo adicional de la presente invención es formular composiciones inmunógenas y farmacéuticas que contienen una o más de las VLP mencionadas anteriormente.

Estos y otros objetivos de la invención que se examinan más adelante se alcanzan mediante el ensamblaje de VLP del virus de la gripe que comprenden por lo menos una proteína estructural del virus de la gripe, en la que dichas VLP incluyen siempre M1. En una forma de realización de la invención, las VLP contienen sólo M1 (que puede incorporar la proteína de la nucleocápside (NP)). Dichas VLP se producen construyendo una molécula de ADN recombinante que codifica M1, y transfectando, infectando o transformando de otra forma una célula hospedadora con dicha molécula de ADN recombinante, cultivando la célula hospedadora en condiciones que permiten la expresión de M1, de modo que las VLP se ensamblan dentro de las células tras la expresión de M1, y purificando las VLP a partir del sobrenadante del cultivo.

En otra forma de realización de la invención, las VLP comprenden, además, por lo menos una de las proteínas estructurales del virus de la gripe seleccionada de entre el grupo constituido por HA, NA y M2. Dichas VLP se producen construyendo una o más moléculas de ADN recombinante que codifican M1 junto con por lo menos una de HA, NA y M2; transfectando, infectando o transformando de otro modo una célula hospedadora adecuada con dichas una o más moléculas de ADN recombinante, cultivando la célula hospedadora en condiciones que permiten la expresión de dichas proteínas estructurales del virus de la gripe, de modo que las VLP se ensamblan en el interior de las células tras la expresión de las proteínas estructurales, y purificando las VLP a partir del sobrenadante del cultivo. Las VLP que contienen sólo M1 o M1 junto con por lo menos una de HA, NA y M2 se formulan con un diluyente o excipiente en forma de composición inmunógena para la inmunización de vertebrados contra la infección causada por el virus de la gripe.

En otra forma de realización adicional de la invención puede ser deseable producir VLP que contienen glucoproteínas de la superficie procedentes de diferentes subtipos del virus de la gripe. Dichas VLP, que contienen HA procedente de un subtipo y NA procedente de un subtipo distinto, se formulan con un diluyente o excipiente en forma de composición inmunógena bivalente para la inmunización de vertebrados contra la infección causada por los dos subtipos del virus de la gripe.

En otra forma de realización adicional de la presente invención, puede ser deseable producir VLP en las que una parte, o la totalidad, de HA o NA se sustituye por una fracción heteróloga no producida por el virus de la gripe, de modo que comprenden VLP quiméricas. Dichas fracciones incluyen, sin limitarse a las mismas, un péptido, polipéptido o proteína. En el caso en el que se vaya a sustituir sólo una parte de HA o NA, una parte de la secuencia de ADN en la molécula de ADN recombinante que codifica la HA o NA se sustituye por una secuencia de ADN que codifica el péptido, polipéptido o proteína que no pertenece al virus de la gripe. En el caso en el que se vaya a sustituir la totalidad de HA o NA, toda la secuencia de ADN en la molécula de ADN recombinante que codifica HA o NA se sustituye por una secuencia de ADN que codifica el péptido, polipéptido o proteína que no pertenece al virus de la gripe.

En un aspecto, dicho péptido, polipéptido o proteína que no pertenece al virus de la gripe procede de un microorganismo patógeno. Estas VLP quiméricas se formulan con un diluyente o excipiente en forma de composición inmunógena para la inmunización de vertebrados contra la infección causada por el microorganismo patógeno.

En otro aspecto, dicha fracción que no procede del virus de la gripe es una fracción con actividad farmacéutica. Estas VLP quiméricas se formulan con un diluyente o excipiente en forma de composición farmacéutica, y se administran en una cantidad eficaz para el tratamiento de vertebrados con dicha fracción que no procede del virus de la gripe.

En otro aspecto adicional, las VLP ensamblan y empaquetan RNP, y pueden, además, incorporar y expresar una secuencia heteróloga de nucleótidos.

Cualquiera de las composiciones inmunógenas y farmacéuticas anteriores puede comprender también un adyuvante.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 presenta un vector de transferencia cuádruple de baculovirus (cuádruple estructural) que porta cuatro genes de la cepa A/Udorn/72 (H3N2) del virus de la gripe. La transcripción de los genes HA y M1 del virus de la gripe está dirigida por el promotor de la polihedrina (abreviado como "pH"), mientras que la transcripción de M2 y NA está dirigida por el promotor p10. Este vector se transfirió junto con el ADN linealizado de baculovirus en células de insecto Sf9 para generar el recombinante cuádruple (HA/Q).

La Figura 2 presenta la estructura de una quimera de VSV-G/HA. Los 14 aminoácidos de la cola citoplásmica y los 29 aminoácidos del dominio transmembranario de la HA del virus de la gripe se fusionaron en fase con el ectodominio de la glucoproteína superficial VSV-G (SEC ID nº: 1).

La Figura 3 presenta los análisis de inmunoelectrotransferencia de proteínas del virus de la gripe y de la proteína G del VSV, expresadas en células Sf9 infectadas por baculovirus recombinantes cuádruples (HA/Q28 o VSV-G/Q). En la Figura 3A, las proteínas HA, M1 y M2 del virus de la gripe se detectaron en el sobrenadante de células Sf9 infectadas con el recombinante cuádruple HA/Q28 (72 horas después de la infección), utilizando una mezcla de anticuerpos monoclonales anti-HA, anti-M1 y M2 (calle 1); las proteínas HA y M1 también se detectaron en el sedimento de células (calle 2). Las células MDCK infectadas con la cepa A/Udorn/72 (H3N2) del virus de la gripe fueron utilizadas como testigo (calle 3).

La Figura 3B presenta la expresión de la proteína G del VSV, así como de las proteínas M1 y M2 del virus de la gripe, en células Sf9 infectadas con VSV-G/Q (proteína G de longitud completa). La expresión se detectó en los sedimentos de células (calle 2) y el sobrenadante del cultivo (calle 3), cuando se analizaba con una mezcla anticuerpos monoclonales anti-G, anti-M1 y M2. Las células Sf9 no infectadas (calle 1), las células BHK infectadas con VSV (calle 4) y las células MDCK infectadas con la cepa A/Udorn/72 (H3N2) del virus de la gripe (calle 5) se utilizaron como testigos negativos y positivos, respectivamente.

La Figura 4 presenta el análisis de inmunofluorescencia de células Sf9 infectadas con un baculovirus recombinante cuádruple (HA/Q28). Los cultivos en cajas de células Sf9 fueron infectados con HA/Q28 a una MoI de 1, y se incubaron durante 72 horas. En ese momento, las cajas individuales se fijaron con metanol-acetona y se incubaron secuencialmente con los anticuerpos primarios y secundarios. La expresión de HA (Figura 4A), M1 (Figura 4B) o HA/M1 (Figura 4C) se detectó utilizando los filtros adecuados.

La Figura 5 presenta el análisis de inmunofluorescencia de células Sf9 infectadas con HA/Q28. Los cultivos en cajas fueron infectados con HA/Q28 a una MOI de 1, y se incubaron durante 72 horas. En ese momento, las cajas individuales se fijaron con paraformaldehído, y se incubaron secuencialmente con los anticuerpos primarios y secundarios. La expresión de HA (Figura 5A), NA (Figura 5B) o HA/NA (Figura 5C) se detectó utilizando los filtros adecuados.

La Figura 6 presenta el análisis de inmunofluorescencia de células Sf9 infectadas con HA/Q28. Los cultivos en cajas de células Sf9 fueron infectados con HA/Q28 a una MOI de 1, y se incubaron durante 72 horas. En ese momento, las cajas individuales se fijaron con paraformaldehído, y se incubaron secuencialmente con los anticuerpos primarios y secundarios. La expresión de M2 se detectó utilizando los filtros adecuados.

La Figura 7 presenta el análisis de inmunofluorescencia de células Sf9 infectadas con VSV-G/Q (la longitud completa del gen de la HA del virus de la gripe en HA/Q28 sustituida por la longitud completa del gen de la proteína G del VSV). Los cultivos en cajas fueron infectados con VSV-G/Q a una MOI de 1, y se incubaron durante 72 horas. En ese momento, las cajas individuales se fijaron con metanol-acetona y se incubaron secuencialmente con los anticuerpos primarios y secundarios. La expresión de VSV G se detectó utilizando los filtros adecuados.

La Figura 8 presenta los análisis de la formación de VLP por centrifugación en gradiente de iodixanol. La Figura 8A presenta los resultados obtenidos cuando se analizan fracciones de HA/Q28 por inmunoelectrotransferencia con una mezcla de anticuerpos monoclonales anti-HA y M1. Las calles 1 a 8 representan fracciones recogidas desde la boca al fondo del tubo; la calle 9 es un testigo con células MDCK infectadas con la cepa A/Udorn/72 (H3N2) del virus de la gripe. La Figura 8B presenta los resultados obtenidos cuando se analizan fracciones de VSV-G/Q por inmunoelectrotransferencia con una mezcla anticuerpos monoclonales anti-VSV-G, anti-M1 y anti-M2. Las calles 1 a 8 representan fracciones recogidas desde la boca al fondo del tubo; la calle 9 es una mezcla de células BHK infectadas con VSV y células MDCK infectadas con el virus de la gripe, combinadas como testigo.

La Figura 8C presenta los resultados obtenidos cuando los sobrenadantes concentrados de células Sf9 doblemente infectadas (recombinante único con M1 y NP) se purificaron y se analizaron con una mezcla anticuerpos anti-M1 y anti-NP. Las calles 1 a 8 representan fracciones del gradiente recogidas desde la boca al fondo del tubo; la calle 9 representa células MDCK infectadas con el virus de la gripe, como testigo.

La Figura 9 presenta los análisis de inmunoelectrotransferencia de los sobrenadantes del cultivo de células Sf9 infectadas con M1 sólo o con baculovirus recombinantes individuales de HA/Q28 más NP. La Figura 9A presenta el análisis de las fracciones procedentes del sobrenadante de la infección con M1 sólo, que fueron analizados con anticuerpo anti-M1. Las calles 1 a 8 representan fracciones recogidas desde la boca al fondo; la calle 9 representa células MDCK infectadas con el virus de la gripe, como testigo. La Figura 9B presenta los resultados obtenidos cuando el sobrenadante de células Sf9 infectadas doblemente (baculovirus recombinantes individuales de HA/Q28 más NP) se purificó y analizó con una mezcla de anticuerpos anti-HA, anti-M1 y anti-NP. Las calles 1 a 8 representan fracciones recogidas desde la boca hasta el fondo del tubo; la calle 9 representa el mismo testigo que en la Figura 9A.

La Figura 10 presenta una micrografía electrónica de VLP del virus de la gripe con tinción negativa, purificadas a partir del medio de cultivo de células Sf9 infectadas con un recombinante cuádruple HA/Q28.

La Figura 11 presenta micrografías electrónicas de VLP del virus de la gripe marcadas con anticuerpos conjugados con oro. En la Figura 11A (tres vistas), las VLP se analizaron con un anticuerpo monoclonal anti-HA y se sometieron a tinción de contraste con esferas de oro acopladas a anticuerpos contra la IgG de ratón. En la Figura 11B, las VLP se analizaron con anticuerpo monoclonal anti-NA y se sometieron a tinción de contraste como en la Figura 11A.

La Figura 12 presenta inmunoelectrotransferencias de células infectadas con el virus de la gripe, analizadas con mezclas de sueros de ratones inmunizados con VLP de HA/Q28. En la Figura 12A se presentan los resultados obtenidos con suero mezclado de un primer par de ratones. En la Figura 12B se presentan los resultados obtenidos con suero mezclado de un segundo par de ratones. En cada una de las Figuras 12A y B, calle 1: células MDCK no infectadas, como testigo; calle 2: células MDCK infectadas con virus de la gripe A. El análisis de las células MDCK no infectadas demostró una banda no específica situada ligeramente por encima de la de M1, que también estaba presente en las células infectadas con el virus de la gripe.

La Figura 13 presenta inmunoelectrotransferencias de células infectadas con VSV y analizadas con mezclas de suero de ratones inmunizados con VLP quiméricas de VSV-G/Q. En la Figura 13A se presentan los resultados obtenidos con suero mezclado de un primer par de ratones. En la Figura 13B se presentan los resultados obtenidos con suero mezclado de un segundo par de ratones. En cada una de las Figuras 13A y B: calle 1: células BHK no infectadas, como testigo; calle 2: células BHK infectadas con VSV; calle 3: células MDCK no infectadas, como testigo; calle 4: células MDCK infectadas con el virus de la gripe.

La Figura 14 presenta un vector de transferencia cuádruple de baculovirus que porta cuatro genes de la cepa A/Udorn/72 (H3N2) del virus de la gripe, incluidos los tres genes que codifican las subunidades de la polimerasa y la nucleoproteína. La transcripción de los genes PB1 y PA del virus de la gripe, que están situados en orientaciones opuestas, está dirigida por el promotor de la polihedrina (abreviado como "promotor pH"), mientras que la transcripción de los genes PB2 y NP, situados también en orientaciones opuestas, está dirigida por el promotor p10. Los cuatro genes fueron subclonados en el vector de transferencia de baculovirus PAcAB4, y después empleados junto con el ADN linealizado de baculovirus para cotransfectar células de insecto Sf9 y generar el recombinante cuádruple.

La Figura 15 presenta la medición de la actividad luciferasa en unidades lumínicas relativas (RLU) en células de riñón de cría de hámster (BHK) no infectadas (testigo) e infectadas con VLP.

La Figura 16 presenta la expresión de la proteína fluorescente de verde (GFP) en células BHK tras la infección con VLP que portan el gen de la GFP. Las flechas indican células BHK que expresan GFP.

Descripción detallada de la invención

El ensamblaje y la liberación de partículas víricas con envoltura a partir de la superficie de las células infectadas por el virus es un proceso complejo y gradual. Requiere las interacciones concertadas de proteínas glucosiladas y no glucosiladas, codificadas por el virus, con zonas aisladas de la membrana plasmática para iniciar el ensamblaje de la partícula del virión. Además de estos componentes, los ácidos nucleicos con cápside proteica, que representan el material genético del virus, se incorporan asimismo en la estructura para completar el proceso de morfogénesis, que termina con el desprendimiento por pinzamiento, o gemación, de la partícula madura del virión a partir de la superficie celular. Las interacciones moleculares exactas y las contribuciones de los diferentes componentes estructurales en el ensamblaje y la liberación final de una partícula completa del virión no están bien caracterizadas.

La presente invención describe el ensamblaje y la liberación de partículas similares al virus de la gripe (VLP) a partir de la superficie de células infectadas con vectores recombinantes que expresan las proteínas estructurales del virus de la gripe. Diversos sistemas de expresión son adecuados para la generación de VLP. La invención se ilustra con células de insecto infectadas con baculovirus recombinantes que expresan las proteínas estructurales del virus de la gripe.

Con el objeto de definir las moléculas necesarias para el ensamblaje y la liberación por gemación del virus de la gripe se construyeron una serie de baculovirus recombinantes con un único gen y con cuatro genes. Los recombinantes expresaban cuatro proteínas estructurales del virus de la gripe (HA, NA, M1 y M2) en células de Spodoptera frugiperda 9 (Sf9). Las células Sf9 son una línea celular de insecto (número de acceso de la ATCC: CRL 1711) que derivan de la línea celular SF21. Aunque se describe un vector de transferencia que codifica las cuatro proteínas estructurales, la utilización de dos a cuatro vectores de transferencia que codifican de forma colectiva estas cuatro proteínas está comprendida asimismo dentro del alcance de la presente invención.

Con el objeto de obtener recombinantes cuádruples, se construyó un único vector de transferencia de baculovirus que codificaba las cuatro proteínas estructurales de la cepa A/Udorn/72 (H3N2) del virus de la gripe utilizando una estrategia con un vector lanzadera que facilitaba la clonación reduciendo el tamaño del plásmido de trabajo y aumentando el número de sitios de restricción. En el vector de transferencia final, los genes del virus de la gripe estaba localizados corriente abajo de los promotores p10 (NA y M2) y de polihedrina (HA y M1) del baculovirus, que había sido situados para dirigir la transcripción de los genes en direcciones opuestas (Figura 1).

Los baculovirus recombinantes cuádruples (HA, NA, M1 y M2) se obtuvieron por transfección simultánea de células Sf9 con ADN vírico linealizado y ADN del vector de transferencia. Se seleccionaron algunas placas víricas recombinantes, que se purificaron después empleando dos tandas adicionales de aislamiento en placas. Sobre la base del nivel de expresión de proteínas determinada por inmunoelectrotransferencia, se seleccionó este vector de transferencia recombinante cuádruple, denominado HA/Q28, para su utilización en experimentos posteriores.

Una característica prominente de esta construcción era que los sitios donadores y aceptores de corte y empalme en el gen M1 habían sido mutados para impedir el corte y empalme del ARNm de M1. De lo contrario, el ARNm de M1 habría sufrido corte y empalme para formar el ARNm de M2, dando lugar a un nivel reducido de expresión de la proteína M1. El ADN de M2 se introdujo en el vector de transferencia en forma de gen independiente.

Con el objeto de investigar si la expresión de estas cuatro proteínas estructurales del virus de la gripe era suficiente para dirigir el ensamblaje y la liberación por gemación de las VLP del virus de la gripe a partir de la superficie de las células de insecto Sf9 infectadas con el baculovirus recombinante cuádruple HA/Q28, se analizaron los sobrenadantes del cultivo por inmunoelectrotransferencia para determinar la presencia de las proteínas M1 y HA. El medio de cultivo se recogió 72 horas después de la infección, se aclaró a 4.000 x g durante 30 minutos, y el material suspendido restante se concentró después por centrifugación a 200.000 x g durante dos horas.

El análisis por inmunoelectrotransferencia del sobrenadante concentrado procedente de células infectadas empleando una combinación de anticuerpos monoclonales anti-HA, M1 y M2 demostró una expresión significativa de las proteínas HA, M1, y M2 del virus de la gripe (Figura 3A). La proteína HA parecía migrar de forma diferente a la de la HA procedente de células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) infectadas con la cepa A/Udorn/72 (H3N2) del virus de la gripe, que puede ser reflejo de las varias formas de glucosilación de esta proteína. Por otra parte, las proteínas M1 y M2 migraban de forma similar a las expresadas en células MDCK infectadas con el virus de la gripe (Figura 3A, calles 1 a 3). La expresión las proteínas NA se detectó por inmunoelectrotransferencia empleando un anticuerpo policlonal de ratón que también reconocía HA, M1 y M2 (datos no mostrados).

Los resultados examinados más adelante demuestran que la expresión de cuatro proteínas estructurales del virus de la gripe es suficiente para el ensamblaje y la liberación por gemación de las VLP a partir de la superficie de células de insecto Sf9. La expresión de la proteína de la nucleocápside (NP), además de estas cuatro proteínas, dio lugar a la formación de VLP que incorporaban la proteína NP en la partícula. Además, la expresión de la proteína M1 sola produjo la liberación de VLP, que también pueden incorporar la NP de la nucleocápside cuando se coexpresa con M1. Además, la sustitución del gen de HA con la proteína G completa del virus de la estomatitis vesicular, o con un híbrido de HA/G en el recombinante cuádruple, provocaba el ensamblaje y la liberación de VLP quiméricas. Todas estas VLP se obtienen por métodos convencionales de purificación tras la secreción de las VLP en el medio.

Con el objeto de evaluar si glucoproteínas heterólogas que no pertenecen al virus de la gripe pueden incorporarse en la superficie de las VLP del virus de la gripe, se construyeron dos baculovirus recombinantes cuádruples quiméricos. El primero, denominado VSV-G/Q, tenía sustituida la secuencia de ADN que codifica la proteína HA del virus de la gripe con una secuencia de ADN que codifica la glucoproteína G completa del virus de la estomatitis vesicular (VSV). El segundo, denominado VSV-G/HA-Q, portaba una secuencia híbrida de ADN que codifica el ectodominio de la proteína G del VSV y el dominio transmembranario y la cola citoplásmica de la proteína HA del virus de la gripe (ver la Figura 2). Ambos recombinantes contenían los genes de las tres proteínas estructurales del virus de la gripe: M1, NA y M2.

Estas construcciones fueron sometidas a los mismos estudios de caracterización empleados con las VLP del virus de la gripe de tipo salvaje, y los resultados indicaban que la infección de células de insecto Sf9 con cualquiera de las construcciones dirigía el ensamblaje y la liberación de partículas similares al virus de la gripe, que portaban las proteínas G del VSV en su superficie. Ambos virus recombinantes eran capaces de dirigir la expresión de las cuatro proteínas (M1, M2, NA y VSV-G), que eran secretadas asimismo en el medio.

El análisis por inmunoelectrotransferencia de células Sf9 infectadas con VSV-G/Q demostró que la proteína G del VSV, así como las proteínas M1 y M2 del virus de la gripe, se expresaban 72 horas después de la infección (Figura 3B). Además, el sobrenadante concentrado de células infectadas mostró una inmunoelectrotransferencia positiva cuando se analizaba con anticuerpos contra la proteína G del VSV y las proteínas M1 y M2 del virus de la gripe (Figura 3B,
calle 3).

Los métodos descritos anteriormente para la proteína G del VSV se aplican fácilmente a la incorporación de otras glucoproteínas que no pertenecen al virus de la gripe, que tienen interés biológico, en la superficie de las VLP, así como a la incorporación de una fracción no producida por el virus de la gripe. Dichas fracciones incluyen, sin limitarse a las mismas, un péptido, polipéptido o proteína. Como se examina más adelante, dichas VLP se utilizan como composiciones inmunógenas en estudios de la interacción receptor-ligando, y/o como sistema para el suministro de la fracción que no procede del virus de la gripe como parte de una composición farmacéutica.

Para evaluar de modo adicional la expresión y la localización celular de las proteínas del virus de la gripe en células Sf9, se llevó a cabo un análisis por inmunofluorescencia de células infectadas con el baculovirus recombinante HA/Q28, purificado en placas. Estos experimentos demostraron que se expresaban las cuatro proteínas estructurales del virus de la gripe, como lo indica la inmunofluorescencia indirecta (Figuras 4 a 6). Los experimentos de tinción doble con anticuerpos anti-HA y anti-NA demostraron que estas glucoproteínas de la superficie se localizaban en la periferia de las células infectadas con cierto grado de superposición (Figura 5C). Estos resultados indicaban que estas importantes glucoproteínas compartían la localización en zonas aisladas de la superficie de las células de insecto infectadas, lo que es similar a lo esperado en una infección natural de células de mamífero por el virus de la gripe.

De modo similar, la tinción de inmunofluorescencia doble de células Sf9 infectadas por HA/Q28 con una mezcla de anticuerpos monoclonales contra HA y M1 demostró que las proteínas de la superficie y la proteína de la matriz M1 parecían compartir la localización en zonas concretas de la membrana celular (Figura 4C).

Por otra parte, la inmunofluorescencia de células Sf9 infectadas con baculovirus recombinante M1 demostró que la proteína M1 se acumulaba predominantemente en el núcleo de las células infectadas, y sólo se observaban pequeñas cantidades en la superficie celular (datos no mostrados). El perfil de distribución de la proteína M1 en células infectadas no parecía alterarse por el hecho de que la proteína M1 se expresarse como gen único o como recombinante cuádruple junto con HA, NA y M2 (Figura 4). Además, la infección simultánea de células Sf9 con recombinantes únicos de M1 y NP no mostró redistribución de dichas proteínas en las células, en comparación con las células Sf9 infectadas de forma individual con recombinantes de M1 o de NP (datos no mostrados).

De este modo, los análisis de inmunoelectrotransferencia y de inmunofluorescencia de células infectadas demostraron claramente que estas cuatro proteínas no sólo estaban presentes en las células y los sobrenadantes de las células, sino que también compartían la localización en zonas aisladas de la membrana plasmática, lo que apuntaba a una posible asociación entre dichas proteínas estructurales.

Los estudios de inmunofluorescencia de células Sf9 infectadas con un recombinante de VSV-G/Q demostraron que la proteína G del VSV no sólo se expresaba, sino que también parecía acumularse en la periferia de las células infectadas.

Debido a que los estudios de inmunofluorescencia demostraron que dichas proteínas compartían la localización en la superficie celular, se decidió averiguar si estas cuatro proteínas víricas eran suficientes para dirigir la formación y liberación de las VLP a partir de la superficie de las células infectadas. Específicamente, con el objeto de investigar si dichas proteínas se liberaban de la célula como consecuencia de las lesiones y muerte de las células, o debido a que se ensamblaban para formar VLP que se liberaban por gemación a partir de la superficie celular, los sobrenadantes concentrados de células Sf9 infectadas con HA/Q28 fueron sometidos a centrifugación en gradiente de velocidad (200.000 x g durante 3,5 horas) con iodixanol (26). Como se especifica de forma individual, las fracciones que contenían las proteínas de interés se sometieron a una purificación adicional en un gradiente de sacarosa de 20-60%.

El análisis de inmunoelectrotransferencia de las fracciones recogidas demostró que HA y M1 comigraban a través del gradiente, alcanzando una concentración máxima en la fracción 2 (Figura 8A, calle 2). Estas proteínas también se encontraron en las fracciones 3 y 4 adyacentes, así como en las fracciones 7 y 8 (Figura 8A). La detección de HA y M1 en dichas fracciones inferiores (hacia el fondo del gradiente) se debía probablemente a la asociación de dichas proteínas con el baculovirus, que en estas condiciones se sitúa en bandas en las fracciones 7 y 8 (datos no mostrados).

Se realizó un experimento similar con las construcciones VSV-G/HA-Q (quimera) y VSV-G/Q (de longitud completa). Como se observó en el caso de HA/Q28, la fracción 2 de un gradiente de iodixanol contenía la proteína G del VSV y las proteínas M1 y M2 del virus de la gripe, como demuestra el análisis de inmunoelectrotransferencia (Figura 8B, calle 2). Cuando se infectaban células Sf9 con un recombinante cuádruple que portaba la VSV-G de longitud completa en vez de la HA, todas las proteínas analizadas (VSV-G, M1 y M2) estaban también presentes tanto en el sobrenadante concentrado como en las fracciones 2 y 3 del gradiente de iodixanol (Figura 3B, calle 3, y Figura 8B). Estos resultados indican que la infección de células Sf9 con el cuádruple VSV-G/HA-Q (quimera) o con VSV-G/Q (de longitud completa) dirigía el ensamblaje y la liberación de VLP del virus de la gripe que portaban la proteína G del VSV en su superficie.

En vista del hecho de que algunas partículas de HA/Q28 examinadas con el microscopio electrónico no presentaban puntas detectables en la superficie (ver más adelante), se planteó la cuestión de si la proteína de la matriz del virus de la gripe es suficiente, por sí misma, para dirigir el ensamblaje y la liberación de partículas vesiculares. Para investigar este problema, se infectaron células de insecto Sf9 con un baculovirus recombinante M1 durante 72 horas, y los sobrenadantes concentrados del cultivo se sometieron al mismo análisis descrito anteriormente. El análisis por inmunoelectrotransferencia de las fracciones del sobrenadante del gradiente de iodixanol demostró que la proteína de la matriz se concentraba en las fracciones 2 y 3, un perfil de migración similar al de las VLP liberadas a partir de células Sf9 infectadas con HA/Q28 (Figura 9A).

Existen pruebas sólidas (3) de que la proteína de la matriz (M1) desempeña una función importante en el trasporte del complejo ribonucleoproteico (RNP) desde el núcleo hasta la superficie celular, en la que tiene lugar el ensamblaje del virus. La asociación entre la matriz y el RNP podría estar mediada por contactos con NP, el ARN del virión, o ambos. Por consiguiente, era de interés evaluar si la proteína de la nucleocápside (NP) se incorporaba en la VLP cuando se coinfectaban células Sf9 con el recombinante cuádruple HA/Q28 y con un baculovirus recombinante individual de NP. Los análisis de inmunoelectrotransferencia de la fracción 2 del gradiente demostraron que la proteína NP de la nucleocápside realmente se incorporaba en las VLP resultantes (Figura 9B). Este resultado planteó la cuestión de qué proteínas establecían contacto con NP para permitir la incorporación de NP en la partícula.

Para estudiar este problema se utilizaron baculovirus recombinantes individuales de M1 y de NP. La expresión simultánea de M1 y NP en células Sf9 produjo partículas con membrana compuestas de ambas proteínas. Esto permitió la evaluación de las posibles interacciones entre dichas dos proteínas en ausencia de ARN del virus de la gripe definido con extremos precisos. El análisis de inmunoelectrotransferencia de partículas, purificadas en gradiente, procedentes de células Sf9 infectadas doblemente con recombinantes de M1 y de NP demostró que M1 y NP compartían la localización en las mismas fracciones (Figura 8C). Por otra parte, la infección con un recombinante de NP solo no indujo la liberación de las partículas, y no demostró la presencia de NP reactiva en ninguna de las fracciones (datos no mostrados). Estos resultados indican que la interacción entre M1 y NP era suficientemente fuerte como para incluir la NP en las partículas que contenían M1 incluso en ausencia de ARN.

Sobre la base de la localización de la proteína NP en el virus de la gripe, y de otros estudios sobre el ensamblaje de la partícula (10), es razonable inferir que la proteína NP mantiene contacto con la proteína de la matriz M1 y que, como resultado de esta interacción, se incorpora en la VLP. En las células infectadas con el virus de la gripe, el transporte de RNP del núcleo al lugar del ensamblaje del virus en la membrana plasmática tiene lugar tras la asociación con la proteína de la matriz mediante un mecanismo que no está bien caracterizado.

Se ha demostrado (27) que la proteína NP se une no sólo al ARN del virus de la gripe, sino que también puede unirse con menor afinidad a ARN no específico. Por consiguiente, este resultado no descarta la posibilidad de que el ARN sea necesario para la integración productiva entre M1 y NP.

Por tanto, se concluye que la proteína de la matriz no sólo inicia las interacciones moleculares que dan lugar al ensamblaje y la liberación de las partículas, sino que es también capaz de unirse a la NP de la nucleocápside e incorporarla en la partícula. En las células infectadas con el virus de la gripe, la proteína M1 se asocia con los RNP en el proceso de transporte y ensamblaje del virus. En el caso recombinantes individuales de M1, estas otras estructuras del virus de la gripe no están presentes; no obstante, sigue teniendo lugar la liberación por gemación. La NP puede asociarse con M1 en forma de monómeros u oligómeros, o tras la unión al ARN celular. Cualquiera que sea la naturaleza de la asociación, está claro que las proteínas M1 y NP expresadas en células de insecto se unen con suficiente afinidad para ensamblarse en una vesícula, que es capaz de salir de la célula.

Para caracterizar adicionalmente la naturaleza de la asociación entre las proteínas del virus de la gripe que comigraban en las fracciones 2 y 3, se llevó a cabo una evaluación por microscopía electrónica del material presente de dichas fracciones.

El examen por microscopía electrónica de la fracción 2 demostró la presencia de una elevada concentración de partículas vesiculares y no vesiculares tachonadas con proyecciones superficiales, que eran muy similares a las partículas víricas y subvíricas del virus de la gripe (Figura 10). La forma y las características estructurales las VLP variaban en función de sus posiciones en el gradiente. Las puntas que sobresalían de la superficie de algunas vesículas parecían similares a las HA y NA del virus de la gripe, en el sentido de que sobresalían hacia el exterior de la superficie de las partículas, como lo hacen en el caso de la superficie del virus de la gripe.

Las proyecciones presentes en algunas VLP de la fracción 2 eran significativamente similares a las puntas de HA presentes en el virus de la gripe (Figura 10). La morfología de NA es menos clara en las muestras que contenían tan amplia variedad de proyecciones en punta. La fracción 3 presentaba una gama similar de partículas a una concentración elevada; sin embargo, parecía contener una mayor concentración de agregados de membranas que la fracción 2 (datos no mostrados).

La fracciones que demostraron tener el máximo número de VLP del virus de la gripe en el estudio de microscopía electrónica también contenían las máximas concentraciones de las proteínas M1 y HA, según el análisis de inmunoelectrotransferencia. Las VLP, que estaban cubiertas de proyecciones superficiales de longitudes desde aproximadamente 75 nm hasta 150 nm, eran claramente similares al virus de la gripe en tamaño y morfología.

Para caracterizar adicionalmente la estructura de las partículas de M1, se examinaron por microscopía electrónica estas dos fracciones del gradiente. El examen por microscopía electrónica con tinción negativa demostró un alto número de vesículas de formas variables que no portaban puntas en su superficie (datos no mostrados).

Para determinar si las células infectadas con baculovirus liberaban de forma espontánea vesículas, o si la asociación de la proteína M1 con la superficie celular era suficiente para dirigir la salida de la partícula, se examinaron fracciones similares de gradientes de sobrenadantes concentrados de células Sf9 infectadas con baculovirus de tipo salvaje o con baculovirus recombinante de NP por microscopía electrónica. No se detectó ninguna de las otras proteínas (NP, HA) en estas fracciones cuando se empleaba para el análisis el sobrenadante de células Sf9 infectadas con los correspondientes recombinantes individuales. Estos resultados indicaban que la proteína de la matriz era por sí misma suficiente para dirigir el ensamblaje y la liberación de las VLP a partir de la superficie de células de
insecto.

La composición proteica de las puntas que sobresalían de la superficie de las VLP se investigó por microscopía electrónica de los antígenos superficiales marcados con anticuerpos conjugados con oro, que se realizaron con anticuerpos monoclonales específicos para HA y NA (que eran los mismos utilizados en los experimentos de inmunofluorescencia). Este examen demostró que el principal antígeno superficial del virus de la gripe, HA, estaba realmente presente en la superficie de las VLP, como lo indicaba la presencia de microesferas de oro (Figura 11A). Este dato confirmaba lo que se suponía por la evaluación estructural de las puntas visualizadas por tinción negativa y microscopía electrónica (Figura 10). De modo similar, el empleo de anticuerpos anti-NA marcados con oro y la microscopía electrónica, también demostraron la presencia de la glucoproteína NA en la superficie de las VLP, si bien de forma menos abundante que la HA (Figura 11B).

Se intentó detectar la presencia de las proteínas M2 en la superficie de las VLP empleando anticuerpos policlonales de conejo marcados con oro y generados contra péptidos que abarcaban los 18 aminoácidos del extremo aminoterminal de la proteína M2. La proteína M2 no se detectó en la superficie de la partícula, a pesar de que estaba presente en las fracciones del gradiente sometidas a microscopía electrónica con anticuerpos conjugados con oro (IEM). No obstante, esta observación no es sorprendente, debido a que la IEM no es un sistema suficientemente sensible para detectar cantidades pequeñas de proteínas e, incluso con el virus nativo de la gripe, se produce muy poca proteína M2, que es difícil de detectar.

Cuando las VLP quiméricas de virus de la gripe-VSV se purificaron y examinaron por microscopía electrónica, se comprobó que tenían una morfología similar a la de las VLP del virus de la gripe. Además, el análisis con anticuerpos marcados con oro demostró que portaban glucoproteínas de la superficie que reaccionaban con anticuerpos anti-G (datos no mostrados).

Las partículas generadas con cualquiera de las construcciones no parecían presentar diferencias morfológicas significativas. El contenido de proteínas G en la superficie de ambas partículas parecía ser similar, lo que indicaba que la interacción potencialmente favorable entre la parte de HA de la quimera G/HA y la M1 subyacente en la membrana no aumentó significativamente el nivel de incorporación de G en la partícula.

Para evaluar la inmunogenicidad de las VLP del virus de la gripe de tipo salvaje y las VLP quiméricas (que contenían VSV-G), se inmunizaron dos grupos de ratones Balb/c por vía intramuscular con HA/Q28 o con VSV-G/Q, formulando cada grupo de VLP con fosfato de aluminio. Todos los ratones de cada grupo recibieron una inyección de sensibilización y dos inyecciones de refuerzo a intervalos de dos semanas. Dos semanas después de la última inmunización se extrajeron muestras de sangre y se determinó la presencia de anticuerpos contra el correspondiente antígeno por inmunoelectrotransferencia (para ambos tipos de VLP), inhibición de la hemaglutinación (para HA/Q28) y una prueba de neutralización del suero (para VSV-G/Q).

El análisis por inmunoelectrotransferencia demostró que los sueros de ratones inmunizados con el virus de la gripe HA/Q 28 reconocían el virus de la gripe utilizado como inmunógeno de prueba (predominantemente HA y M1; Figura 12A y B, calle 2). De modo similar, los sueros de ratones inmunizados con las VLP quiméricas VSV-G/Q reconocían la proteína G del VSV (Figura 13A y B, calle 2).

La forma de realización de una prueba de inhibición de la hemaglutinación del virus de la gripe (IHA) demostró que los sueros de ratones inmunizados con HA/Q28 presentaban un título IHA de 96 IHAU, que era más de dos veces mayor que el obtenido con ratones testigo no inmunizados (32 IHAU). Esta respuesta era casi igual a la del título IHA de 128 IHAU generado con dos inmunizaciones intranasales (separadas por dos semanas) con la cepa A/Hong Kong (H3N2) viva del virus de la gripe (cortesía del Dr. Mbawuike, Baylor College of Medicine), que servía como testigo positivo.

La neutralización del VSV por sueros de ratones inmunizados con VSV-G/Q demostró que una dilución tan elevada como 1/64 neutralizaba completamente un título patrón de VSV, impidiendo de esta forma la formación de placas en la monocapa de células.

Estos resultados demostraron que las VLP del virus de la gripe generaban una respuesta de anticuerpos que no sólo reconocía al virus de la gripe de tipo salvaje en inmunoelectrotransferencias, sino que inhibía la hemaglutinación del virus de la gripe. Es más, la inmunización de ratones con VLP quiméricas que portaban la proteína G del VSV generó una respuesta humoral de anticuerpos que reconocían la proteína G del VSV de tipo salvaje en una inmunoelectrotransferencia, e impedían asimismo la infección por el VSV en una prueba de neutralización del suero.

También pueden utilizarse otros tipos de células hospedadoras, aparte de las células de insecto, con uno o más vectores recombinantes que codifican proteínas estructurales del virus de la gripe (y, si se desea, una proteína que no pertenece al virus de la gripe) con el objeto de producir VLP. Los estudios con la proteína M del VSV demostraron que esta propiedad la presentaban tanto los tipos celulares de insecto (8) como los de mamífero (7). Además, la expresión de las proteínas de la matriz M y NP del virus paragripal (otro virus de ARN no segmentado, de cadena negativa) en células de mamífero dio lugar a la formación y liberación de partículas similares a virus (10).

Otros tipos celulares adecuados para su utilización como células hospedadoras incluyen células hospedadoras de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino, fibroblastos de embrión de pollo, células BHK, células SW13 humanas) y levaduras (tales como Pichia, Saccharomyces). La utilización de células de mamífero o de levadura puede dar lugar a la expresión de proteínas con perfil de glucosilación más similar a las proteínas de tipo salvaje que el que puede obtenerse con las células de insecto.

Los vectores recombinantes adecuados para el suministro de genes, además de baculovirus, incluyen, sin limitarse a los mismos, virus tales como el virus vacunal y otros poxvirus, virus Sindbis, adenovirus, virus de la encefalitis equina venezolana y otros alfavirus, así como ADN plasmídico.

Los vectores recombinantes pueden incluir promotores y otros elementos reguladores (tales como una señal de poliadenilación) eficaces para dirigir la expresión de las proteínas del virus de la gripe (y de virus que no son el de la gripe) para producir VLP en el correspondiente tipo de célula hospedadora. Las células hospedadoras se transfectan, se infectan, o se transforman de otro modo empleando técnicas convencionales conocidas en la técnica. Dichas técnicas también incluyen, sin limitarse a las mismas, transducción, electroporación y lipofección.

Como se describe la presente memoria, la expresión con un baculovirus recombinante cuádruple de las cuatro proteínas estructurales el virus de la gripe (HA, NA, M1, M2) fue suficiente para dirigir el ensamblaje y la liberación de VLP a partir de la superficie de células de insecto Sf9. Esta es la primera descripción de la formación de VLP del virus de la gripe producidas sólo con cuatro proteínas estructurales. De hecho, las VLP pueden estar compuestas tan sólo de una proteína estructural, M1. Por consiguiente, la presente invención incluye VLP compuestas de M1 sólo, M1 más una o dos de HA, NA y M2, así como dichas cuatro proteínas estructurales.

Las VLP ensambladas presentan una semejanza estrecha con el virus de la gripe de tipo salvaje en lo que se refiere a su tamaño, morfología la partícula, y estructura fina de las puntas de la superficie. Además, la formación de VLP en ausencia de RNP de la gripe indica que los RNP no son necesarios para el ensamblaje y la liberación de las partículas.

Esta nueva estrategia para el ensamblaje de VLP del virus de la gripe es de gran importancia para el diseño de composiciones inmunógenas contra nuevas variantes de la gripe. Una característica importante de este sistema es la capacidad de sustituir las glucoproteínas de la superficie con diferentes subtipos de HA y/o NA, lo que permitirá la actualización de las formulaciones con nuevas variantes antigénicas de dichas proteínas. Cuando se identifiquen variantes antigénicas de dichas glucoproteínas, las VLP pueden actualizarse para incluir dichas nuevas variantes. De este modo, incluso glucoproteínas de la superficie extremadamente peligrosas, como H1N1 (procedente de la gripe española de 1918) o una combinación de HA y NA con potencial pandémico, podrían ser incorporadas en las VLP sin preocuparse por las implicaciones de la liberación de genes que no han circulado en los seres humanos durante varios decenios. Esto se debe a que las VLP no son infecciosas, no se replican, y no pueden provocar enfermedades.

Además, la posibilidad de incorporar glucoproteínas heterólogas en la superficie de las VLP hace atractiva esta estrategia no sólo como sistema de suministro, sino que puede permitir también la orientación a tipos celulares específicos (tropismo) en función de las glucoproteínas superficiales incorporadas en sus superficies. En una forma de realización, las VLP contienen la cola citoplásmica y el dominio transmembranario de la HA y el dominio externo de una glucoproteína que no pertenece al virus de la gripe, lo que facilita la generación de partículas quiméricas útiles para inmunizaciones multivalentes.

En resumen, se ha demostrado que las partículas, de tipo salvaje y quiméricas, similares al virus de la gripe pueden ensamblarse y liberarse a partir de la superficie de células Sf9 tras la expresión de tan sólo una a cuatro de las proteínas estructurales víricas, siempre y cuando se exprese también la proteína de la matriz M1. También se ha demostrado que la proteína M1 es capaz de dirigir la liberación de partículas vesiculares que contienen NP cuando ambas están presentes juntas.

En otra forma de realización de la invención, se logró la formación y subsiguiente inclusión en cápsides de complejos ribonucleoproteicos (RNP) (que contienen las tres subunidades de la polimerasa, PA, PB1 y PB2, así como la nucleoproteína NP) en las VLP. Se generó un segundo baculovirus recombinante cuádruple (Figura 14) que expresaba de forma simultánea en células de insecto Sf9 las tres subunidades de la polimerasa y NP.

Para evaluar la formación y la inclusión en cápsides de RNP, se sintetizó in vitro un molde de ARN de sentido negativo que codificaba la luciferasa en la orientación antisentido, flanqueado por las regiones conservadas y no codificantes en 3' y 5' de los extremos de la NP del virus de la gripe. La transfección de células de insecto Sf9 con el ARN generado in vitro y la subsiguiente coinfección con Q28 y con el segundo recombinante cuádruple dio lugar al ensamblaje y la liberación de VLP que portaban el gen del receptor, así como la polimerasa y NP. Los sobrenadantes concentrados de células Sf9 transfectadas/infectadas se transfirieron a una monocapa de células de riñón de cría de hámster (BHK), se incubaron, y las células se lisaron con un tampón de lisis para el ensayo de la luciferasa. Los lisados de células infectadas presentaban actividad luciferasa equivalente a 70-700 veces la de las células testigo no infectadas (Figura 15).

De modo similar, para evaluar la formación y la inclusión en cápsides de RNP, se sintetizó in vitro un molde de ARN de sentido negativo, que codificaba la proteína fluorescente verde (GFP) en la orientación antisentido, flanqueado por las regiones conservadas y no codificantes en 3' y 5' de los extremos de la NP del virus de la gripe. La transfección de células de insecto Sf9 con el ARN generado in vitro y la subsiguiente coinfección con Q28 y con el segundo recombinante cuádruple dio lugar al ensamblaje y la liberación de VLP que portaban el gen del receptor, así como la polimerasa y NP. Cuando se transfirieron los sobrenadantes concentrados de células Sf9 transfectadas/infectadas a una monocapa de células MDCK, se detectó la expresión de GFP (Figura 16).

Estos resultados indican que las partículas derivadas de baculovirus eran capaces de incluir los RNP en cápsides, que eran funcionales para la transcripción primaria, como lo demuestra la expresión de luciferasa y de GFP. De este modo, las VLP son capaces de ensamblar y empaquetar los RNP, así como incorporar y expresar, además, una secuencia heteróloga de nucleótidos. Dicha secuencia heteróloga expresada incluye, sin limitarse a las mismas, una fracción heteróloga no producida por el virus de la gripe, incluido un péptido, polipéptido o proteína procedente de un microorganismo patógeno que no es el virus de la gripe, como se describe más adelante. Dicha secuencia heteróloga expresada incluye, además, un inmunomodulador para aumentar y/o cambiar la respuesta inmunitaria. Dichos inmunomoduladores incluyen, sin limitarse a los mismos, IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA) y GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, WA). Otras secuencias heterólogas expresadas incluyen anticuerpos monoclonales que sirven como fracciones para la orientación y/o el tratamiento.

Las VLP de la presente invención se utilizan para formular composiciones inmunógenas o farmacéuticas. Para ello, las VLP se ajustan hasta una concentración adecuada y se formulan con un adyuvante, diluyente o excipiente adecuados. Los medios aceptables desde el punto de vista fisiológico pueden utilizarse como excipientes y/o diluyentes, e incluyen, sin limitarse a los mismos: agua, un medio isotónico adecuado, glicerol, etanol y otros disolventes convencionales, solución salina tamponada con fosfato, y similares. Los adyuvantes adecuados incluyen, sin limitarse a los mismos, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, MPL^{TM} (monofosforil-lípido A 3-O-desacilado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT, en la actualidad: Corixa), análogos sintéticos del lípido A tales como 529 (Corixa), Stimulon^{TM} QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, MA), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA), polinucleótidos sintéticos tales como oligonucleótidos que contienen un motivo CpG (patente US nº 6.207.646 (28)), la toxina termolábil de E. coli, y la toxina colérica (bien en forma de tipo salvaje o mutante, por ejemplo, en la que el ácido glutámico en la posición aminoácida 29 está sustituido por otro aminoácido, preferentemente una histidina, con arreglo a la solicitud de patente internacional nº WO 00/18434 (29)).

En una forma de realización de la presente invención, la formulación que incluye las VLP está destinada para su utilización como composición inmunógena. El virus puede mezclarse con aditivos crioprotectores o estabilizantes tales como proteínas (por ejemplo, albúmina, gelatina), azúcares (por ejemplo, sacarosa, lactosa, sorbitol), aminoácidos (por ejemplo, glutamato de sodio), solución salina, u otros agentes protectores. Esta mezcla se mantiene en estado líquido, o se deseca o liofiliza después para su transporte y conservación, y se mezcla con agua inmediatamente antes de su administración.

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Las formulaciones que comprenden VLP que contienen sólo proteínas estructurales del virus de la gripe son útiles para inmunizar a un ser humano o a otro vertebrado para generar protección contra la infección por el virus de la gripe. De este modo, la presente invención proporciona además un método para inmunizar a un individuo para generar protección contra la infección por el virus de la gripe mediante la administración al individuo de una cantidad eficaz, desde el punto de vista de la inmunización, de una formulación de la composición inmunógena que incorpora VLP que contienen sólo proteínas estructurales del virus de la gripe, generadas como se ha descrito anteriormente en la presente memoria.

Las formulaciones que comprenden VLP que contienen glucoproteínas de la superficie procedentes de diferentes subtipos del virus de la gripe, tales como HA de un subtipo y NA de un subtipo diferente, se formulan con un diluyente o excipiente en forma de composición inmunógena bivalente para inmunizar a vertebrados contra la infección causada por dichos dos subtipos del virus de la gripe. Como se ha examinado anteriormente, cada una de HA y NA puede sustituirse cuando se identifiquen variantes antigénicas. De este modo, se construyen fácilmente VLP quiméricas actualizadas según los métodos descritos en la presente memoria.

Como alternativa, las composiciones inmunógenas multivalentes se preparan generando un grupo de VLP para cada cepa de interés del virus de la gripe, mezclando las VLP en profracciones adecuadas, y administrando la composición inmunógena resultante.

Las formulaciones de la presente invención también comprenden VLP en las que una parte, o la totalidad, de HA o NA se sustituye por una fracción heteróloga no producida por el virus de la gripe, de modo que se formen VLP quiméricas. Dichas fracciones incluyen, sin limitarse a las mismas, un péptido, polipéptido o proteína. En el caso en el que se vaya a sustituir sólo una parte de HA o NA, una parte de la secuencia de ADN en la molécula de ADN recombinante que codifica la HA o la NA se sustituye por una secuencia de ADN que codifica el péptido, polipéptido o proteína que no pertenece al virus de la gripe. En el caso en el que se vaya a sustituir la totalidad de HA o NA, toda la secuencia de ADN en la molécula de ADN recombinante que codifica la HA o la NA se sustituye por una secuencia de ADN que codifica el péptido, polipéptido o proteína que no pertenece al virus de la gripe.

Como alternativa, una fracción heteróloga como se ha descrito anteriormente, que no es producida por el virus de la gripe (o un segmento del virus de la gripe tal como el que codifica la NP), se incorpora en el interior de las VLP. Esto se logra coinfectando, cotransfectando, o cotransformando de otra manera una célula hospedadora adecuada con: (a) una o más moléculas de ADN recombinante que codifican cada una por lo menos una proteína estructural del virus de la gripe, en las que siempre se construye una molécula de ADN recombinante que codifica M1, y (b) una molécula de ADN recombinante que codifica la fracción heteróloga (o segmento del virus de la gripe), cultivando la célula hospedadora en condiciones que permiten la expresión de dicha por lo menos una proteína estructural del virus de la gripe, de modo que se ensamblan VLP en el interior de las células tras la expresión de por lo menos una proteína estructural del virus de la gripe, y purificando las VLP a partir del sobrenadante del cultivo. La fracción heteróloga (o proteína del virus de la gripe) se incorpora en el interior de las VLP.

En el caso en el que dicho péptido, polipéptido o proteína que no pertenece al virus de la gripe procede de un microorganismo patógeno, las VLP quiméricas resultantes se formulan con un diluyente o excipiente en forma de composición inmunógena para la inmunización de vertebrados contra la infección causada por el microorganismo patógeno (así como contra el virus de la gripe). Lo más típico es que la VLP quimérica incluya un antígeno superficial de un microorganismo patógeno que no es el virus de la gripe.

Dichos microorganismos patógenos que no son el virus de la gripe incluyen, sin limitarse a los mismos, los virus, bacterias, hongos o microorganismos parásitos que infectan a los vertebrados humanos y no humanos. Otros tipos de fracciones que no proceden del virus de la gripe incluyen, sin limitarse a las mismas, las procedentes de células cancerosas o células tumorales, anticuerpos monoclonales (utilizados, por ejemplo, como fracciones para la orientación y/o el tratamiento), alérgenos, proteína precursora del péptido amiloide, u otros componentes macromoleculares.

Los ejemplos de dichos virus incluyen, sin limitarse a los mismos, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de la inmunodeficiencia de los simios, virus respiratorio sincitial, virus paragripales de tipo 1-3, virus del herpes simple, citomegalovirus humano, virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, papilomavirus humano, poliovirus, rotavirus, calicivirus, virus del sarampión, virus de la parotiditis, virus de la rubéola, adenovirus, virus de la rabia, virus del moquillo canino, virus de la peste bovina, coronavirus, parvovirus, virus de la rinotraqueitis infecciosa, virus de la leucemia felina, virus de la peritonitis infecciosa felina, virus de la bursitis infecciosa aviar, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la enfermedad de Marek, virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino, virus de la arteritis equina, y varios virus de la encefalitis.

Los ejemplos de dichas bacterias incluyen, sin limitarse a las mismas, Haemophilus influenzae (tanto tipable como no tipable), Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerao, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, complejo de Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae y Mycoplasma gallisepticum.

Los ejemplos de dichos hongos incluyen, sin limitarse a los mismos, Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus e Histoplasma.

Los ejemplos de dichos parásitos incluyen, sin limitarse a los mismos, Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii y Pneumocystis carinii.

Los ejemplos de dichas células cancerosas o células tumorales incluyen, sin limitarse a las mismas, antígeno prostático específico, antígeno carcinoembrionario, MUC-1, Her2, CA-125 y MAGE-3.

Los ejemplos de dichos alérgenos incluyen, sin limitarse a los mismos, los descritos en la patente US nº 5.830.877 (30) y en la publicación de solicitud de patente internacional número WO 99/51259 (31), e incluyen polen, venenos de insecto, caspa de animales, esporas y fármacos (tales como penicilina) de hongos. Dichos componentes interfieren con la producción de anticuerpos de IgE, que es una causa conocida de reacciones alérgicas.

La proteína precursora del péptido amiloide (APP) ha sido involucrada en enfermedades con diversas denominaciones, tales como enfermedad de Alzheimer, amiloidosis o enfermedad amiloidogénica. El péptido amiloide \beta (también denominado péptido A\beta) es un fragmento de 42 aminoácidos de la APP, que se genera por procesamiento de la APP por las enzimas \beta- y \gamma-secretasa, y tiene la siguiente secuencia: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala (SEC ID nº: 2).

En algunos pacientes, el depósito de amiloide toma la forma de agregados de péptido A\beta. Sorprendentemente, se ha comprobado ahora que la administración del péptido A\beta aislado provoca una respuesta inmunitaria contra el componente de péptido A\beta de un depósito de amiloide en un hospedador vertebrado (32). Dichos péptidos A\beta han sido conectados asimismo a fracciones no relacionadas. De este modo, las VLP de la presente invención incluyen la expresión de dicho péptido A\beta en lugar de una parte, o de la totalidad, de la HA o la NA del virus de la gripe, así como fragmentos del péptido A\beta y anticuerpos contra el péptido A\beta o fragmentos del mismo. Uno de dichos fragmentos del péptido A\beta es el péptido de 28 aminoácidos que tienen la siguiente secuencia (33): Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (SEC ID nº: 3).

Una cantidad suficiente de la composición inmunógena descrita anteriormente en un número adecuado dosis se administra a un individuo para provocar una respuesta inmunitaria. Los expertos en la materia serán capaces de determinar fácilmente dichas cantidades y dosis. La administración puede realizarse mediante cualquier forma convencional eficaz, tal como por vía intranasal, parenteral, oral, o por vía tópica aplicada a cualquier superficie de las mucosas, tal como la superficie intranasal, oral, ocular, pulmonar, vaginal o rectal, por ejemplo, con un pulverizador en aerosol. La forma de administración preferida es la administración intranasal.

Dicho péptido, polipéptido o proteína que no pertenece al virus de la gripe también puede ser una fracción activa desde el punto de vista farmacéutico. Dichas fracciones incluyen, sin limitarse a las mismas, proteínas terapéuticas, factores de crecimiento, moduladores de la inmunidad, anticuerpos monoclonales, así como las fracciones mencionadas anteriormente en lo referente a composiciones inmunógenas. Dichas VLP quiméricas se formulan con un diluyente o excipiente como se ha descrito anteriormente, en forma de composición farmacéutica, y se administran en una cantidad eficaz para el tratamiento de vertebrados con dicho péptido, polipéptido o proteína que no pertenece al virus de la gripe. La cantidad eficaz puede ser determinada fácilmente por los expertos en la materia.

Las composiciones farmacéuticas precedentes pueden comprender también un adyuvante, como se ha descrito anteriormente.

Dicho péptido, polipéptido o proteína que no pertenece al virus de la gripe puede ser también un receptor o ligando útil en estudios de receptor-ligando. Por ejemplo, una glucoproteína que no pertenece al virus de la gripe se incluye en las VLP que se orientan a un receptor específico.

En todas estas composiciones inmunógenas o farmacéuticas, las VLP son capaces de provocar una respuesta inmunitaria cuando se administran a un hospedador vertebrado, pero no son capaces de causar síntomas de enfermedades, debido a que las VLP no contienen material genético y no pueden replicarse en el vertebrado.

Los siguientes ejemplos se exponen para facilitar la comprensión de la presente invención. El objeto de los ejemplos es exclusivamente ilustrativo, y no deben considerarse limitativos del alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Clonación del gen M2 del virus de la gripe en el vector de transferencia de baculovirus pAcAB4

El gen M2 del virus de la gripe, que es un producto de corte y empalme del ARNm de M1, se aisló por RT-PCR a partir de ARNm poliadenilado, extraído de células MDCK que habían sido infectadas con la cepa A/Udorn/72 (H3N2) del virus de la gripe. El gen M2 se clonó en forma de inserto de ADN en un vector pGemT (Promega) y se secuenció con cebadores específicos utilizando una reacción de secuenciación por terminación de la cadena con cromóforos y un secuenciador automático de ADN ABI 377 (Applied Biosystems).

El gen M2 se liberó del plásmido pGemT-M2 por digestión con la enzima de restricción EagI y se preparó para su clonación en el vector de transferencia de baculovirus pAcAB4 (PharMingen). Los fragmentos de ADN de M2 se rellenaron con la ADN-polimerasa (fragmento de Klenow) y se incorporaron conectores de BglII en los extremos por ligación con la ADN-ligasa de T4. Todas las enzimas y conectores fueron adquiridos a New England Biolabs (NEB). El vector de transferencia pAcAB4 se digirió después con BglII y se trató con fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIP). El inserto M2 se purificó después en gel (Qiagen) y se ligó en el vector de transferencia en una relación 3:1. Se seleccionó un clon positivo por análisis de restricción y se preparó ADN plasmídico a partir de 100 ml de cultivo de E. coli utilizando kits de purificación de plásmidos de Qiagen. Esta construcción se denominará en lo sucesivo pAcAB4/M2.

Ejemplo 2 Construcción de un vector intermediario ("lanzadera")

Debido a limitaciones en el número de sitios de restricción adecuados para clonar los genes del virus de la gripe en el vector de transferencia pAcAB4, se generó un vector lanzadera de clonación que porta tres promotores de baculovirus (dos de polihedrina y uno de p10) flanqueados por nuevos sitios de restricción que habían sido añadidos por PCR. Este vector lanzadera se construyó de la siguiente manera: El pAcAB4M2 (procedente del Ejemplo 1) se digirió con SmaI y se dividió en dos muestras. Una muestra de pAcAB4/M2-SmaI se digirió con XbaI, que liberó un fragmento de ADN de 400 nucleótidos. Este ADN se purificó en gel y se amplificó por PCR con dos cebadores, uno de los cuales incorporaba en un extremo del producto final los sitios PmeI (cursiva) y NotI (subrayado):

5' GTTTAAAC GCGGCCGCCGTATTTATAGGTTTTTTTATTA 3'

(SEC ID nº: 4)

5' TTTTATTACTAGTCCCGGGGATCTGTGATTGTAAAT 3'

(SEC ID nº: 5)

La otra muestra de pAcAB4/M2-SmaI se digirió con BamHI, y el fragmento de ADN SmaI/BamHI se purificó en gel y se amplificó asimismo por PCR con dos cebadores, uno de los cuales incorporaba en el producto final de PCR los sitios SacI (cursiva) y NheI (subrayado):

5' AAGAGCTC GCTAGCGTATTTATAGGTTTTTTTATTA 3'

(SEC ID nº: 6)

5' ACAATCACAGATCCCCGGGACTAGTAATAAAACCTAGA 3'

(SEC ID nº: 7)

Estos dos productos de PCR, que se superponen en los extremos no modificados, fueron utilizados en otra reacción de PCR con dos cebadores externos específicos para los nuevos sitios de enzimas de restricción incorporados:

5' GTTTAAACGCGGCCGCCG 3'

(SEC ID nº: 8)

5' AAGAGCTCGCTAGCGTA 3'

(SEC ID nº: 9)

Este ADN de PCR se digirió después con SacI/PmeI. El plásmido pNEB193 (Promega) se digirió también con SacI/PmeI y se ligó con el ADN digerido de la PCR con la ligasa de T4. Finalmente, este vector lanzadera resultante, pNEB193, porta un fragmento de ADN que contiene dos promotores de polihedrina y un promotor p10, flanqueados por nuevos sitios de restricción que se utilizan en la subsiguiente clonación del los genes HA, NA y M1 del virus de la gripe.

Ejemplo 3 Clonación de los genes HA, NA y M1 del virus de la gripe en el vector lanzadera

Los genes HA, NA y matriz (M1) del virus de la gripe se recuperaron por RT-PCR a partir de ARN genómico purificado de la cepa A/Udorn/72 (H3N2) del virus de la gripe. Los tres genes fueron clonados en forma de insertos de ADN en los vectores pGemT o pGemTeasy (Promega) y se secuenciaron con cebadores específicos utilizando una reacción de secuenciación por terminación de la cadena con cromóforos y un secuenciador automático de ADN ABI 377. Los dos sitios donadores de corte y empalme del extremo 5' del gen M1 fueron mutados utilizando un kit QuikChange de Stratagene (pGT-M1 de corte y empalme) para impedir el posible corte y empalme del ARNm de M1 en las células hospedadoras.

Estos tres genes se clonaron en el vector lanzadera en tres etapas:

1) Clonación del gen M1

El plásmido pGemT/M1 (corte y empalme) (pGemT que porta el gen M1) se utilizó como molde en una reacción de PCR con cebadores 5' y 3' que introducían un sitio NheI y un sitio SacI, respectivamente, en el ADN amplificado. Este ADN de PCR se digirió después con NheI/SacI y se purificó en gel. De forma similar, el vector lanzadera pNEB193 se digirió con NheI/SacI y se purificó. El vector lanzadera y el inserto (M1 PCR) fueron ligados y amplificados en E. coli tras la transfección. El gen M1 se secuenció utilizando el reactivo BigDye (Perkin Elmer). El gen M1 fue colocado corriente abajo del promotor de polihedrina. El plásmido resultante se denominó pNEB193M1.

2) Clonación del gen HA

El plásmido pGemT/HA (pGemT que porta el gen HA) se digirió con SacII y se rellenaron los extremos. Se ligaron conectores de NotI al ADN digerido. El ADN se digirió después con NotI de modo que el inserto de HA se liberase y tuviese sitios NotI en cada extremo. El plásmido pNEB193M1 se digirió con NotI, se trató con fosfatasa de intestino de ternera (CIP) y el inserto de HA se ligó en dicho plásmido con ADN-ligasa de T4 (no direccional). Se utilizó la PCR para determinar la orientación del gen HA, que está bajo control transcripcional del promotor de polihedrina. El plásmido resultante se denominó pNEB193M1/HA.

3) Clonación del gen NA

El plásmido pGemT/NA3B (pGemT que porta el gen NA) se digirió primero con SacII y se rellenaron los extremos con ADN-polimerasa de T4. Después se liberó el gen NA por digestión con SpeI y se rellenó con el fragmento de Klenow, y el inserto de NA se ligó con extremos romos. A continuación, el pNEB193M1/HA se digirió con SmaI, y el inserto de NA se ligó con extremos romos. Se utilizó la PCR para determinar el clon que portaba el gen NA en la orientación correcta. El gen NA se colocó corriente abajo del promotor p10. El plásmido resultante se denominó pNEB193M1/HA/NA.

Ejemplo 4 Construcción de un vector de transferencia que contiene los genes M2, M1, HA y NA del virus de la gripe

Tras completar el procedimiento descrito en el Ejemplo 3, el vector lanzadera pNEB193M1/HA/NA contenía los genes M1, HA, y NA colocados bajo control regulador de la transcripción de promotores de baculovirus. Para liberar estos tres genes en forma de fragmento único de ADN, el vector lanzadera se digirió con PmeI/SacI. Este fragmento de ADN se ligó en pAcAB4M2 del Ejemplo 1 (que ya contenía el gen M2), que había sido modificado de la siguiente manera: Se introdujeron nuevos sitios de restricción en pAcAB4/M2 para facilitar la clonación del fragmento de ADN que contenía estos tres genes procedentes del vector lanzadera. Este plásmido pAcAB4/M2 se digirió después con XbaI, se rellenaron los extremos con ADN-polimerasa (fragmento de Klenow) y se añadieron conectores de PmeI con ADN-ligasa de T4. Este ADN se digirió después con PmeI y se ligó de nuevo para regenerar el sitio PmeI. De modo similar, el plásmido religado se digirió con BamHI, se rellenó con la ADN-polimerasa (fragmento de Klenow) y se añadieron conectores de SacI con la ligasa de T4. La digestión subsiguiente con SacI y la ligación restauró el sitio SacI. El vector pAcAB4/M2 resultante tenía dos nuevos sitios, PmeI y SacI. El vector se preparó para la inserción de genes adicionales del virus de la gripe por digestión con PmeI/SacI y purificación en gel. Todas las uniones fueron secuenciadas para verificar que no se habían introducido mutaciones durante la clonación de pNEB193. La construcción resultante se denominó HA/Q (ver la Figura 1), que es un vector de transferencia que porta cuatro genes del virus de la gripe (pAcAB4/M2/M1/HA/NA).

Ejemplo 5 Generación de vectores de transferencia quiméricos

La secuencia codificante de la proteína G del VSV se recuperó a partir del VSV por RT-PCR del ARN vírico con cebadores específicos para los extremos 3' y 5' del gen G (5' AACAGAGATCGATCTGT 3' (SEC ID nº: 10) y 5' CATAAAAATTAAAAATTAAAATATAATTAAGG 3' (SEC ID nº: 11)) y se clonó en el plásmido pGemT (Promega). El clon pGemT-VSV resultante se digirió con SacII y los extremos se hicieron romos con ADN-polimerasa de T4. Después se digirió con SpeI y se rellenaron los extremos con el fragmento de Klenow. Se añadieron conectores de NotI con la ligasa de T4, y después por se digirió de nuevo con NotI. A continuación, la secuencia codificante de la proteína G del VSV se ligó en el vector Q28, que había sido digerido con NotI para eliminar el gen HA. La orientación del gen se confirmó por PCR y secuenciación. Esta construcción se denominó vector de transferencia VSV-G.

En una forma de realización alternativa, se insertó sólo una parte del gen G del VSV. Un gen quimérico (ver la Figura 2) que contenía el ectodominio de la proteína G fusionado en fase con los dominios transmembranario (29 aminoácidos) y citoplásmico (14 aminoácidos) de HA fue generado por PCR de la siguiente manera: El dominio transmembranario y la cola citoplásmica del gen de la HA del virus de la gripe fueron amplificados a partir del clon pGemT-HA por PCR, y después se purificaron en gel. El ectodominio del gen G del VSV G se amplificó también por PCR y se purificó en gel. Ambos fragmentos de ADN fueron utilizados como moldes en una reacción de PCR con ADN-polimerasa de Pfu (Stratagene, La Jolla, CA) utilizando un cebador que correspondía al extremo 5' del gen G del VSV y al extremo 3' del gen HA. Se purificó en gel un fragmento de ADN de 1620 pb y se añadieron conectores de NotI con ligasa de T4, seguido por digestión con NotI. Este inserto se ligó en el vector HA/Q que había sido digerido con NotI para eliminar el gen HA. La construcción resultante generó el vector de transferencia VSV-G/HA (quimera).

Ejemplo 6 Transfección de baculovirus recombinantes cuádruples en células de insecto

Se sembraron células Sf9 (ATCC CRL 1711) en placas de 60 mm a una densidad de 2 x 10^{6} células por placa. Se mezclaron aproximadamente 2 \mug de vector de transferencia HA/Q con 0,5 \mug de ADN linealizado de BaculoGold (PharMingen) y se transfectaron células Sf9 con el ADN utilizando el kit de transfección de BaculoGold (Pharmingen). Se seleccionaron baculovirus recombinantes y se purificaron en tres rondas de purificación por placas. Uno de dichos recombinantes purificado por placas se denominó HA/Q28 y se seleccionó para estudios posteriores.

Además, el ADN del vector de transferencia cuádruple que portaba un gen VSV-G de longitud completa o un gen VSV-G/HA (quimera) se transfectó junto con el ADN linealizado de BaculoGold en células Sf9 como se ha descrito anteriormente, para generar los recombinantes VSV-G/Q y VSV-G/HA/Q. Los virus recombinantes se seleccionaron como se ha descrito anteriormente para el caso del HA/Q28. Todos los recombinantes fueron amplificados en células Sf9 hasta obtener un título de 7 x 10^{7} UFP/ml.

Ejemplo 7 Cultivo de células de insecto Sf9 e infección con baculovirus recombinantes

Todos los cultivos de células Sf9 se propagaron en suspensión en medio exento de suero. Las infecciones con baculovirus recombinantes se llevaron a cabo a una multiplicidad de infección (MOI) de 5. Los virus recombinantes se inocularon en las monocapas de células en un pequeño volumen, se dejó que se adsorbiesen durante 30 minutos a temperatura ambiente, y después se incubaron a 28ºC tras añadir nuevo medio exento de suero. Las células y los medios de cultivo se recogieron 72 horas después de la infección, a no ser que se especifique lo contrario, y se utilizaron para el análisis posterior de la expresión de proteínas y la formación de VLP.

Ejemplo 8 Clonación de genes individuales del virus de la gripe en el vector de transferencia pBlueBac4.5 y generación de baculovirus recombinantes individuales

El gen M1 de la cepa A/Udorn del virus de la gripe se clonó previamente en pGemT (pGT-M1 de corte y empalme, ver el Ejemplo 1 anterior). Para subclonar el gen M1, se digirió pGT-M1 con SacII, los extremos se hicieron romos con ADN-polimerasa de T4, y se añadieron conectores de SacI a los extremos con la ligasa de T4. El plásmido se digirió después con SacI/SalI y el M1 liberado se purificó en gel. El inserto se ligó en pBlueBac4.5 (Invitrogen), que había sido digerido con SacI/SalI, y se transformaron células DH5\alpha con la mezcla de ligación.

Para subclonar el gen HA en pBlueBac4.5, se digirió pGemT/HA (ver el Ejemplo 3 anterior) con SacII, y los extremos se hicieron romos con ADN-polimerasa de T4. Después, el ADN se digirió de nuevo con SalI para eliminar el inserto, y se purificó en gel. El inserto de HA se ligó en pBlueBac4.5 digerido con NheI (romo)/SalI, y se transformaron células competentes STBL2 de E. coli con la mezcla de ligación.

El pGemT-NA (ver el Ejemplo 3 anterior) se digirió con SacII y los extremos se hicieron romos con ADN-polimerasa de T4. Este ADN se digirió después con SpeI y se purificó en gel. El inserto se ligó en un vector pBlueBac4.5 que había sido digerido con NheI/SmaI, y se transformaron células competentes STBL2 de E. coli.

Cuando se comprobó, mediante secuenciación, que el ADN del vector de transferencia era correcto, se transfectaron células Sf9 con 5 \mug de cada clon pBlueBac y 10 \mug de ADN Bac & Blue (Invitrogen). La células Sf9 se cotransfectaron con estos ADN empleando transfección mediada por liposomas. Las células se incubaron durante cinco días, y el sobrenadante se purificó por placas. Se cultivaron placas azules individuales y se amplificaron en células Sf9, y se evaluó la expresión de proteínas mediante inmunoelectrotransferencias. El baculovirus recombinante de NP (que contenía el gen de la NP del virus de la gripe) utilizado en este trabajo se construyó como se ha descrito por Galarza et al. (27).

Ejemplo 9 Análisis de inmunoelectrotransferencia

El análisis de inmunoelectrotransferencia se utilizó para identificar proteínas en células Sf9 infectadas, sobrenadantes concentrados y fracciones de gradiente. Las muestras se resolvieron en un gel de SDS-PAGE al 10% (a no ser que se especifique otra cosa) y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa. Las inmunoelectrotransferencias se bloquearon en una solución de TBS (solución salina tamponada con Tris) que contenía leche en polvo desnatada al 5% y Tween-20 al 0,1%, y después se expusieron a una mezcla de anticuerpos monoclonales contra las proteínas HA, M1 (matriz) y M2 del virus de la gripe. El anticuerpo monoclonal de ratón contra la HA (clon 12CA5) fue adquirido a Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, IN). El anticuerpo monoclonal de ratón contra la M1 (clon GA2B) fue adquirido a Serotec (Raleigh, NC). El anticuerpo monoclonal de ratón contra la M2 fue adquirido al Mt. Sinai Hybridoma Center (Nueva York, NY). Los antígenos fueron visualizados en las inmunoelectrotransferencias con un anticuerpo secundario, conjugado con fosfatasa alcalina, contra la IgG de ratón (Promega). Los análisis de la formación de VLP en células Sf9 infectadas con una combinación única, doble, o triple de baculovirus recombinantes con genes individuales se llevaron a cabo de forma similar. Las muestras que contenían la proteína G del VSV fue analizadas exponiéndolas a un anticuerpo monoclonal de ratón contra la G (clon P5D4; Roche Molecular Biochemicals) en combinación con anticuerpos contra las proteínas M1 y M2 del virus de la gripe. Los resultados se presentan en la Figura 3.

Ejemplo 10 Inmunofluorescencia de células Sf9 infectadas

Se sembraron células Sf9 en ocho cámaras cuadradas (cultivos en cajas) y se infectaron con baculovirus recombinantes que contenían genes cuádruples o individuales a una MOI de 1. A las 72 horas después de la infección, las cajas individuales de células Sf9 se fijaron con metanol/acetona (2:1) o con paraformaldehído al 3%. Como etapa de bloqueo, las células fijadas se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía seroalbúmina bovina (BSA) al 3%. A continuación, se incubó cada portaobjetos de forma secuencial con una solución de anticuerpos primarios y secundarios. Se utilizó una combinación de anticuerpos monoclonales de rata contra la HA (Roche Molecular Biochemicals)/de ratón contra la M1 (ver el Ejemplo 9) (como anticuerpos primarios, dilución 1:100) y una combinación de anticuerpos caprinos, conjugados con rodamina, contra la inmunoglobulina de rata (Molecular Probes)/anticuerpos de oveja, conjugados con FITC, contra la inmunoglobulina de ratón (Sigma) (como anticuerpos secundarios), para examinar la expresión de HA y M1. Se utilizó una combinación de anticuerpos monoclonales de rata contra la HA/de conejo contra péptidos de la NA (fabricados a medida por Research Genetics) (como anticuerpos primarios, dilución 1:100) y anticuerpos caprinos, conjugados con rodamina, contra la inmunoglobulina de rata (Molecular Probes)/de oveja, conjugados con FITC, contra la inmunoglobulina de conejo (Sigma) (como anticuerpos secundarios) para examinar la expresión de NA y HA. Como alternativa a la rodamina, puede utilizarse un anticuerpo caprino, conjugado con Cy3, contra la inmunoglobulina de rata (Sigma). Cada reacción con el anticuerpo se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente y, entre las etapas, los portaobjetos fueron lavados tres veces con PBS. Las moléculas de FITC y rodamina emitían luz verde y roja, respectivamente, cuando se excitaban a longitudes de onda de 495 nm y 552 nm, que se discriminaban empleando filtros apropiados. Los resultados de los análisis de inmunofluorescencia se presentan en las Figuras 4 a 7.

Ejemplo 11 Purificación de VLP del virus de la gripe

Se sembraron células Sf9 a una densidad de 7,5 x 10^{7} células en matraces de cultivo de tejidos de 150 cm^{2}, y se las dejó sedimentar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células se infectaron con baculovirus recombinantes (HA/Q28, VSV-G/Q, VSV-G/HA/Q quimera o recombinante individual) a una MOI de 5, y se dejó transcurrir la infección durante 72 horas a 28ºC. Cuando se completó, el medio de cultivo se recogió y se sometió a centrifugación a baja velocidad (30 minutos a 4ºC y 2.000 x g). El sobrenadante se sometió después a centrifugación a 200.000 x g durante 90 minutos. En función del número de células infectadas inicialmente, los sedimentos resultantes se resuspendieron en 50 \mul o 500 \mul de 1 X PBS, se homogeneizaron mediante una breve sonicación, y a continuación se cargaron en la parte superior de un gradiente (densidad desde 1,08 g/ml hasta 1,32 g/ml) de iodixanol (Optiprep, Nycomed/Sigma). El gradiente se centrifugó a 200.000 x g durante 3,5 horas y las fracciones se recogieron por gravedad a partir del fondo del tubo utilizando un tubo microcapilar en forma de U. Se analizaron partes alícuotas de dichas fracciones por inmunoelectrotransferencia después de la SDS-PAGE. Las inmunoelectrotransferencias se exponen en las Figuras 8 y 9. Para purificar de forma adicional las partículas, las fracciones que contenían las VLP se sometieron a una segunda centrifugación en gradiente de sacarosa. Para la centrifugación de equilibrio en gradiente de sacarosa, la fracción previamente seleccionada se dializó con PBS y se depositó en un gradiente (en NTE) de sacarosa al 20-60% (p/p) y se centrifugó durante 22 horas a 4ºC y 150.000 x g. Tras la centrifugación, se recogieron fracciones de 0,5 ml a partir del fondo del tubo, como se ha descrito anteriormente, y se analizaron por inmunoelectrotransferencia tras la SDS-PAGE.

Las fracciones que contenían las VLP se examinaron después por microscopía electrónica empleando el marcado con anticuerpos conjugados con oro (ver el Ejemplo 12).

Ejemplo 12 Microscopía electrónica: Tinción negativa y marcado con anticuerpos conjugados con oro

Para la tinción negativa y el marcado con anticuerpos conjugados con oro, las VLP se concentraron a partir del sobrenadante del cultivo y se purificaron mediante dos centrifugaciones consecutivas en gradiente (ver el Ejemplo 11). Se colocaron partes alícuotas de las muestras en rejillas de plástico recubiertas con carbono y recién sometidas a descarga luminiscente, se lavaron suavemente con unas pocas gotas de agua destilada, se sometieron a tinción negativa con fosfotungstato de sodio al 2%, pH 6,5, y se visualizaron con un microscopio electrónico. En la Figura 10 se presenta una micrografía electrónica de VLP del virus de la gripe con tinción negativa.

Las muestras para el marcado con anticuerpos conjugados con oro de los antígenos superficiales de las VLP se sometieron a fijación previa con glutaraldehído al 0,5% durante cinco minutos, se colocaron en las rejillas como se ha descrito anteriormente, y se lavaron con unas pocas gotas de agua destilada. A continuación, se incubaron secuencialmente boca abajo sobre volúmenes de 100 \mul de las siguientes soluciones: anticuerpos primarios diluidos en PBS-BSA al 1% durante 30 minutos; tres veces con PBS-BSA al 1% durante cinco minutos cada vez; suspensión de las esferas de oro recubiertas con anticuerpo contra la IgG de ratón diluido en PBS-BSA al 1% (1:10) durante 30 minutos; tres veces con PBS-BSA al 1%, durante cinco minutos cada vez. Finalmente, se lavaron con unas pocas gotas de agua destilada, se tiñeron con acetato de uranilo al 2%, se secaron con aire y se examinaron en el microscopio electrónico. En la Figura 11 se presentan micrografías electrónicas de VLP del virus de la gripe marcadas con anticuerpos conjugados con oro y expuestas a anticuerpos monoclonales contra la HA o contra la NA, y sometidas a tinción negativa con esferas de oro conjugadas con anticuerpo contra la IgG de ratón.

Ejemplo 13 Incorporación de la nucleoproteína (NP) del virus de la gripe en VLP

Se coinfectaron células Sf9 con HA/Q28 y baculovirus recombinantes individuales de NP, o con baculovirus recombinantes individuales de NP y de M1. Los sobrenadantes concentrados de las células coinfectadas se purificaron como se ha descrito en el Ejemplo 11. En la Figura 9B se presenta una inmunoelectrotransferencia de la fracción que contenía tanto HA como NP, tal como se expresan en dichas células coinfectadas. En la Figura 8C se presenta una inmunoelectrotransferencia de la fracción que contenía NP y M1, tal como se expresan en dichas células coinfectadas.

Ejemplo 14 Inmunogenicidad de las VLP en ratones

Se inmunizaron dos grupos de ratones Balb/c (de 4-5 semanas de edad) por vía intramuscular con VLP de HA/Q28 (aproximadamente 1 \mug de HA) o con VLP de VSV-G/Q (aproximadamente 1 \mug de G), en el que cada grupo de VLP se formuló con fosfato de aluminio (200 \mug/dosis). Todos los ratones de cada grupo recibieron una inyección de sensibilización y dos inyecciones de refuerzo a intervalos de dos semanas. Dos semanas después de la última inmunización, se extrajeron muestras de sangre y se evaluó la presencia de anticuerpos frente al correspondiente antígeno mediante inmunoelectrotransferencia (para ambos tipos de VLP), prueba de inhibición de la hemaglutinación (IHA) (para HA/Q28) y una prueba de neutralización del suero (para VSV-G/Q). Las inmunoelectrotransferencias se presentan en la Figura 12 (para HA/Q28) y la Figura 13 (para VSV-G/Q). Los títulos de IHA se midieron en unidades de IHA (IHAU) y tenían los siguientes valores:

Ratones no inmunizados:

32 IHAU*

Testigo positivo:

128 IHAU

[virus de la gripe A/Hong Kong]

Mezcla de sueros HA/Q28:

96 IHAU

\quad

* Los ratones no inmunizados presentaron un título de inhibición, que puede ser debido a aglutininas no específicas. Todas las muestras fueron tratadas con caolín y calentadas a 56ºC durante 30 minutos con el objeto de inactivar los inhibidores no específicos y/o las aglutininas no específicas.

Para la prueba de neutralización del suero se colocaron diluciones crecientes de sueros de ratones inmunizados con VSV-G/Q sobre una monocapa de células que contenía VSV, se incubaron y se analizaron para determinar su capacidad de inhibir el virus, juzgada por el bloqueo de la formación de placas en la monocapa de células. Se comprobó que una dilución del suelo tan elevada como 1/64 neutralizaba completamente el título patrón de VSV (1 x 10^{6} UFP/ml).

Ejemplo 15 Empaquetamiento de complejos ribonucleoproteicos (RNP) en VLP del virus de la gripe y expresión de genes indicadores Construcción de baculovirus con polimerasa (subunidades PB1, PB2 y PA) y NP (vector de transferencia recombinante cuádruple)

Los tres genes que codifican las subunidades de la polimerasa (proteínas PB1, PB2 y PA) y la nucleoproteína NP de la cepa A/Udorn/72 (H3N2) del virus de la gripe se subclonaron en un solo vector de transferencia de baculovirus PAcAB4. Los genes PB1 y PA fueron situados en orientaciones opuestas bajo control transcripcional del promotor de polihedrina de baculovirus, mientras que los genes PB2 y NP, situados también en orientaciones opuestas, estaban bajo control transcripcional del promotor p10 de baculovirus. La cotransfección de células de insecto Sf9 con el ADN purificado del vector de transferencia, que porta los genes de la polimerasa y de la NP, y con ADN genómico linealizado de baculovirus, permitió la recombinación homóloga, que dio lugar a la transferencia de los genes de la polimerasa y de la NP en el ADN del baculovirus. Este episodio de recombinación intracelular generó el baculovirus recombinante cuádruple (Figura 14) que se liberó en el medio de cultivo. Se llevaron a cabo tres etapas consecutivas de purificación por placas/amplificación para seleccionar recombinantes cuádruples del vector de transferencia de baculovirus. Se llevó a cabo una PCR utilizando cebadores específicos de genes, para confirmar la presencia de los cuatro genes en los recombinantes cuádruples purificados. Se realizaron ensayos de inmunoelectrotransferencia con anticuerpos policlonales específicos anti-PB1, anti-PB2, anti-PA y anti-NP para evaluar la expresión de las tres subunidades de la polimerasa y de la NP (datos no mostrados).

Construcciones de genes indicadores

Se generaron plásmidos de ADN que contenían los genes de la luciferasa o de la proteína fluorescente verde (GFP) flanqueados por los extremos conservados 3' y 5' del virus de la gripe. Estas secuencias son necesarias para la transcripción/replicación y el empaquetamiento del genoma del virus de la gripe en una infección con virus de tipo salvaje. Además de las secuencias conservadas, los extremos 3' y 5' precisos son esenciales para un genoma funcional. Con el objeto de obtener estos extremos precisos, se añadió un promotor alterado de T7 al extremo 5' de la secuencia del virus de la gripe; después, la transcripción con la ARN-polimerasa de T7 generó extremos 5' precisos del virus de la gripe en los transcritos de ARN. Además, se generó un sitio restricción de BsaI en el extremo 3' de la secuencia del virus de la gripe. La digestión del plásmido con esta enzima de restricción produjo moldes de ADN con salientes en 5', que, en reacciones extendidas de transcripción con la ARN-polimerasa del T7, generaron moléculas de ARN con extremos 3' precisos del virus de la gripe. Estos genes indicadores modelo del virus de la gripe se utilizaron después para estudiar la actividad polimerasa, la inclusión del ARN en cápsides, y el empaquetamiento del ARN en partículas similares al virus de la gripe.

Empaquetamiento del gen indicador de la luciferasa en VLP

Se infectaron células de insecto Sf9 (MOI: 5) de forma simultánea con Q28 (HA, NA, M1, M2), y con recombinantes cuádruples (PB1, PB2, PA, NP) de vector de transferencia de baculovirus. Se dejó transcurrir la infección durante 48 horas y, en ese momento, se utilizaron 30 \mug de un ARN sintetizado in vitro que contenía el gen de la luciferasa en orientación inversa, flanqueado las secuencias de los extremos 3' y 5' del genoma del virus de la gripe, para transfectar células Sf9 utilizando el reactivo de transfección LT1 (Panvera, Madison, WI). Las células infectadas/transfectadas se incubaron durante otras 24 horas. Después se recogió el sobrenadante del cultivo, se aclaró por centrifugación a baja velocidad, y las VLP se concentraron por centrifugación durante dos horas a 2000 x g. Las VLP se resuspendieron en medio de cultivo y se aplicaron a una nueva monocapa de células de riñón de cría de hámster (BHK). Tras 48 horas de incubación, las células BHK se lisaron con tampón de lisis para el ensayo de la luciferasa, y se midió la actividad luciferasa en el extracto de células. La actividad luciferasa de fondo se determinó en células BHK no infectadas (testigo) utilizando un luminómetro, y los valores se situaban entre 50 y 500 unidades lumínicas relativas (RLU). Los lisados de células BHK infectadas con VLP mostraban unos valores de actividad luciferasa luciferasa de 36.000 RLU
(Figura 15).

Empaquetamiento del gen indicador de la proteína fluorescente verde (GFP) en VLP

Se realizaron experimentos similares de empaquetamiento de RNP en VLP utilizando el gen de la proteína fluorescente verde (GFP) como indicador. Las células de insecto Sf9 se infectaron/transfectaron siguiendo los parámetros descritos anteriormente. Se construyeron moléculas de ARN transfectado que contenían la secuencia codificante de GFP en la orientación antisentido, flanqueada por los extremos 3' y 5' del ARN del virus de la gripe. Se infectaron células BHK y células MDCK durante 24 horas con VLP, y después se midió la expresión de GFP utilizando un microscopio Zeiss y filtros de isotiocianato de fluoresceína (FITC). Había un pequeño número de células verdes, lo que indicaba que las VLP eran capaces de transferir el gen de la GFP, dando lugar a la expresión de la proteína fluorescente verde (Figura 16).

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Bibliografía

1. Lamb, R. A., páginas 1-87 de The Influenza Viruses, R. M. Krug, ed. (Plenum Press, 1989).

2. Lamb, R. A., et al., Cell, 40,627-633 (1985).

3. Martin, K., y Helenius, A., Cell, 67, 117-130 (1991).

4. Shapiro, G. I., et al., J. Virology, 61, 764-773 (1987).

5. Garoff, H., et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62, 1171-1190 (1998).

6. Nayak, D. P., ASM News, 62, 411-414 (1996).

7. Justice, P. A., et al., J. Virol., 69, 3156-3160 (1995).

8. Li, Y., et al., J. Virol., 67, 4415-4420 (1993).

9. Mebatsion, T., et al., Cell, 84, 941-951 (1996).

10. Coronel, E. C., et al., J. Virol., 73, 7035-7038 (1999).

11. Zhao, H., et al., J. Gen. Virol., 79, 2435-2446 (1998).

12. Jin, H., EMBO J., 13, 5504-5515 (1994).

13. Jin, H., et al., EMBO J., 16, 1236-1247 (1997).

14. Zhang, J., et al., J. Virology, 74, 4634-4644 (2000).

15. Ruigrok, R. W. H., et al., Virology, 267, 289-298 (2000).

16. Roberts, P. C., et al., Virology, 240, 127-137 (1998).

17. Patente US nº 5.298.244.

18. Kirnbauer, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 89, 12180-12184 (1992).

19. Loudon, P. T., and Roy, P., Virology, 180, 798-802 (1991).

20. Rose, R. C., et al., J. Virology, 67, 1936-1944 (1993).

21. Zeng, C. Q.-Y., et al., J. Virology, 70, 2736-2742 (1996).

22. Gheysen, D., et al., Cell, 59, 103-112 (1989).

23. Nermut, M. V., et al., Virology, 198, 288-296 (1994).

24. Takahashi, H., et al., Virology. 256: 371-380 (1999).

25. Yamshchikov, G. V., et al., Virology, 214, 50-58 (1995).

26. Ford, T., et al., Analytical Biochem., 220, 360-366 (1994).

27. Galarza, J. M., et al., Virus Res., 24, 91-106 (1992).

28. Patente US nº 6.207.646.

29. Publicación de solicitud de patente internacional nº WO 00/18434.

30. Patente US nº 5.830.877.

31. Publicación de solicitud de patente internacional nº WO 99/51259.

32. Publicación de solicitud de patente internacional nº WO 99/27944.

33. Patente US nº 4.666.829.

<110> American Cyanamid Company

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<120> Ensamblaje de partículas similares al virus (VLP) de la gripe de tipo salvaje y quiméricas

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<130> AM100288PCT

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<140>

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<141>

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<150> PCT/US01/19890

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<151> 2001-06-21

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<160> 11

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 71

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: quimera de partes de la proteína G del virus de la estomatitis vesicular y de la proteína HA del virus de la gripe

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 42

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220> 1

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<223> Descripción de la secuencia artificial: aminoácidos 1-42 de la proteína humana precursora del péptido amiloide

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<400> 2

2

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<210> 3

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<211> 28

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<212> PRT

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: aminoácidos 1-28 de la proteína humana precursora del péptido amiloide

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<400> 3

3

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<210> 4

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<211> 39

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtttaaacgc ggccgccgta tttataggtt tttttatta

\hfill

39

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<210> 5

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 5

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ttttattact agtcccgggg atctgtgatt gtaaat

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36

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<210> 6

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<211> 36

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 6

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aagagctcgc tagcgtattt ataggttttt ttatta

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36

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<210> 7

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<211> 38

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 7

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acaatcacag atccccggga ctagtaataa aacctaga

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38

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<210> 8

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 8

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gtttaaacgc ggccgccg

\hfill

18

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<210> 9

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 9

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aagagctcgc tagcgta

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17

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<210> 10

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 10

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aacagagatc gatctgt

\hfill

17

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<210> 11

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: Cebador

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<400> 11

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cataaaaatt aaaaattaaa atataattaa gg

\hfill

32

Claims (29)

1. Método para producir partículas similares al virus de la gripe (VLP), comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

(i)

construir una molécula de ADN recombinante que, en términos de proteínas del virus de la gripe, codifica solamente la proteína estructural de la matriz (M1) del virus de la gripe;

(ii)

transfectar, infectar, o transformar de otra manera una célula hospedadora adecuada con dicha molécula de ADN recombinante, cultivar la célula hospedadora en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína estructural M1, de modo que las VLP se ensamblan en el interior de las células tras la expresión de la proteína estructural M1; y

(iii)

purificar las VLP a partir del sobrenadante del cultivo.

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2. Método para producir partículas similares al virus de la gripe (VLP), comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

(i)

construir una molécula de ADN recombinante que, en términos de proteínas del virus de la gripe, codifica solamente la proteína estructural de la matriz (M1) del virus de la gripe;

(ii)

transfectar, infectar, o transformar de otra manera una célula hospedadora adecuada con dicha molécula de ADN recombinante, cultivar la célula hospedadora en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína estructural M1, de modo que las VLP se ensamblan en el interior de las células tras la expresión de la proteína estructural M1; y cotransfectar, coinfectar, o cotransformar la célula hospedadora con una molécula de ADN recombinante que, en términos de proteínas del virus de la gripe, codifica solamente la proteína de la nucleocápside (NP) del virus de la gripe de manera que la NP se incorpora en el interior de las VLP; y

(iii)

purificar las VLP a partir del sobrenadante del cultivo.

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3. Método para producir partículas similares al virus de la gripe (VLP), comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

(i)

construir una molécula de ADN recombinante que, en términos de proteínas del virus de la gripe, codifica solamente la proteína estructural de la matriz (M1) del virus de la gripe;

(ii)

transfectar, infectar, o transformar de otra manera una célula hospedadora adecuada con dicha molécula de ADN recombinante, cultivar la célula hospedadora en condiciones que permiten la expresión de dicha proteína estructural M1, de modo que las VLP se ensamblan en el interior de las células tras la expresión de la proteína estructural M1; y cotransfectar, coinfectar, o cotransformar la célula hospedadora con una molécula de ADN recombinante que codifica solamente una fracción no producida por el virus de la gripe, de modo que la fracción no producida por el virus de la gripe se incorpora en el interior de las VLP; y

(iii)

purificar las VLP a partir del sobrenadante del cultivo.

4. Método para producir partículas similares al virus de la gripe (VLP), comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

(i)

construir una molécula de ADN recombinante que, en términos de proteínas del virus de la gripe, codifica solamente la proteína estructural de la matriz (M1) del virus de la gripe;

(ii)

construir una o más moléculas de ADN recombinante que codifican cada una por lo menos una, pero no más de la totalidad, de las proteínas estructurales del virus de la gripe seleccionadas de entre el grupo constituido por hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA) y el producto de corte y empalme del ARNm de M1 (M2);

(iii)

transfectar, infectar, o transformar de otra manera una célula hospedadora adecuada con dichas moléculas de ADN recombinante mencionadas en (i), y con las moléculas de ADN recombinante mencionadas en (ii), cultivar la célula hospedadora en condiciones que permiten la expresión de dichas proteínas estructurales del virus de la gripe, de modo que las VLP se ensamblan en el interior de las células tras la expresión de las proteínas estructurales del virus de la gripe; y

(iv)

purificar las VLP a partir del sobrenadante del cultivo.

5. Método según la reivindicación 4, en el que la HA y la NA proceden de diferentes subtipos del virus de la gripe.

6. Método para producir partículas quiméricas similares al virus de la gripe (VLP), comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

(i)

construir una molécula de ADN recombinante que, en términos de proteínas del virus de la gripe, codifica solamente la proteína estructural de la matriz (M1) del virus de la gripe;

(ii)

construir una o más moléculas de ADN recombinante que codifican cada una por lo menos una, pero no más de la totalidad de, las proteínas estructurales del virus de la gripe seleccionadas de entre el grupo constituido por hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA) y el producto de corte y empalme del ARNm de M1 (M2), con la salvedad de que una parte, o la totalidad, de las secuencias de ADN, HA o la NA han sido sustituidas por una secuencia de ADN que codifica una fracción que no pertenece al virus de la gripe;

(iii)

transfectar, infectar, o transformar de otra manera una célula hospedadora adecuada con las moléculas de ADN recombinante mencionadas en (i), y con las moléculas de ADN recombinante mencionadas en (ii), cultivar la célula hospedadora en condiciones que permiten la expresión de dichas proteínas estructurales del virus de la gripe, de modo que las VLP se ensamblan en el interior de las células tras la expresión de las proteínas estructurales del virus de la gripe; y

(iv)

purificar las VLP a partir del sobrenadante del cultivo.

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7. Método según la reivindicación 6, en el que la secuencia de ADN en la molécula de ADN recombinante que codifica la HA se sustituye por una secuencia de ADN que codifica la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV).

8. Método según la reivindicación 6, en el que la secuencia de ADN en una molécula de ADN recombinante codifica los dominios transmembranario y citoplásmico de la HA, pero el resto de la región codificante de la HA se sustituye por una secuencia de ADN que codifica el ectodominio de la proteína G del VSV.

9. Método para producir partículas similares al virus de la gripe (VLP), comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

(i)

construir una molécula de ADN recombinante que, en términos de proteínas del virus de la gripe, codifica solamente la proteína estructural de la matriz (M1) del virus de la gripe;

(ii)

construir una o más moléculas de ADN recombinante que codifican cada una por lo menos una, pero no más de la totalidad, de las proteínas estructurales del virus de la gripe seleccionadas de entre el grupo constituido por hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA) y el producto de corte y empalme del ARNm de M1 (M2);

(iii)

transfectar, infectar, o transformar de otra manera una célula hospedadora adecuada con las moléculas de ADN recombinante mencionadas en (i), y con las moléculas de ADN recombinante mencionadas en (ii), cultivar la célula hospedadora en condiciones que permiten la expresión de dichas proteínas estructurales del virus de la gripe, de modo que las VLP se ensamblan en el interior de las células tras la expresión de las proteínas estructurales del virus de la gripe; y cotransfectar, coinfectar, o cotransformar la célula hospedadora con una molécula de ADN recombinante que, en términos de proteínas del virus de la gripe, codifica solamente la proteína de la nucleocápside (NP) del virus de la gripe, de modo que la NP se incorpora en el interior de las VLP; y

(iv)

purificar las VLP a partir del sobrenadante del cultivo.

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10. Método para producir partículas similares al virus de la gripe (VLP), comprendiendo dicho método las etapas siguientes:

(i)

construir una molécula de ADN recombinante que, en términos de proteínas del virus de la gripe, codifica solamente la proteína estructural de la matriz (M1) del virus de la gripe;

(ii)

construir una o más moléculas de ADN recombinante que codifican cada una por lo menos una, pero no más de la totalidad, de las proteínas estructurales del virus de la gripe seleccionadas de entre el grupo constituido por hemaglutinina (HA), neuraminidasa (NA) y el producto de corte y empalme del ARNm de M1 (M2);

(iii)

transfectar, infectar, o transformar de otra manera una célula hospedadora adecuada con las moléculas de ADN recombinante mencionadas en (i), y con las moléculas de ADN recombinante mencionadas en (ii), cultivar la célula hospedadora en condiciones que permiten la expresión de dichas proteínas estructurales del virus de la gripe, de modo que las VLP se ensamblan en el interior de las células tras la expresión de las proteínas estructurales del virus de la gripe; y cotransfectar, coinfectar, o cotransformar la célula hospedadora con una molécula de ADN recombinante que codifica solamente una fracción no producida por el virus de la gripe, de modo que la fracción no producida por el virus de la gripe se incorpora en el interior de las VLP; y

(iv)

purificar las VLP a partir del sobrenadante del cultivo.

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11. VLP del virus de la gripe constituidas por la proteína estructural M1.

12. VLP del virus de la gripe constituidas por las proteínas estructurales M1 y NP.

13. VLP del virus de la gripe constituidas por la proteína estructural M1 y una fracción no producida por el virus de la gripe.

14. VLP del virus de la gripe constituidas por la proteína estructural M1 y por lo menos una, y como máximo la totalidad, de las proteínas estructurales del virus de la gripe seleccionadas de entre el grupo constituido por HA, NA y M2.

15. VLP del virus de la gripe según la reivindicación 14, en las que la HA y la NA proceden de diferentes subtipos del virus de la gripe.

16. VLP quiméricas del virus de la gripe constituidas por la proteína estructural M1 y por lo menos una, y como máximo la totalidad, de las proteínas estructurales del virus de la gripe seleccionadas de entre el grupo constituido por HA, NA y M2, con la salvedad de que una parte, o la totalidad, de la HA o la NA se sustituye por una fracción no producida por el virus de la gripe, de modo que comprenden VLP quiméricas.

17. VLP quiméricas según la reivindicación 16, en las que una parte, o la totalidad, de la HA o la NA se sustituye por un péptido, polipéptido o proteína producidos por un microorganismo patógeno.

18. VLP quiméricas según la reivindicación 17, en las que la HA se sustituye por la proteína G del VSV.

19. VLP quiméricas según la reivindicación 17, en las que están presentes los dominios transmembranario y citoplásmico de la HA, pero el resto de la región de la HA se sustituye por el ectodominio de la proteína G del
VSV.

20. VLP del virus de la gripe constituidas por la proteína estructural M1 y por NP y por lo menos por una, y como máximo la totalidad, de las proteínas estructurales del virus de la gripe seleccionadas de entre el grupo constituido por HA, NA y M2.

21. VLP del virus de la gripe constituidas por la proteína estructural M1 y una fracción no producida por el virus de la gripe, y por lo menos por una, y como máximo la totalidad, de las proteínas estructurales del virus de la gripe seleccionadas de entre el grupo constituido por HA, NA y M2.

22. Composición inmunógena que comprende las VLP según cualquiera de las reivindicaciones 11, 12, 13, 14, 17, 20 ó 21, junto con un diluyente o excipiente.

23. Composición inmunógena según la reivindicación 22, que comprende además un adyuvante.

24. Composición farmacéutica que comprende las VLP según la reivindicación 13 ó 16, junto con un diluyente o excipiente.

25. Composición farmacéutica según la reivindicación 24, que comprende además un adyuvante.

26. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, para su utilización como medicamento en un vertebrado.

27. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 26 en la fabricación de un medicamento destinado al tratamiento de la gripe en un vertebrado.

28. Célula hospedadora transfectada, infectada o transformada con una molécula de ADN recombinante que, en términos de proteínas del virus de la gripe, codifica solamente las proteínas M1, M2, HA y NA, y dicha célula, en términos de moléculas de ADN que codifican el virus de la gripe, se transfecta, se infecta o se transforma solamente con dicha molécula de ADN.

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29. Célula hospedadora transfectada, infectada o transformada con:

(i)

una molécula de ADN recombinante que, en términos de proteínas del virus de la gripe, codifica solamente las proteínas M1, M2, HA y NA; y

(ii)

una segunda molécula de ADN recombinante que codifica la nucleoproteína del virus de la gripe, y dicha célula, en términos de moléculas de ADN que codifican el virus de la gripe, se transfecta, se infecta o se transforma solamente con dichas moléculas de ADN.