MXPA02012254A

MXPA02012254A - Montaje de particulas quimericas semejantes al virus de influenza y del tipo silvestre.

Info

Publication number: MXPA02012254A
Application number: MXPA02012254A
Authority: MX
Inventors: Jose M Galarza
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 2000-06-23
Filing date: 2001-06-21
Publication date: 2003-04-25
Also published as: US20090239261A1; BR0111830B1; AU2001268662A1; US20050186621A1; EP1294892A2; KR100877019B1; WO2002000885A3; WO2002000885A9; AU2007201727B2; US7556940B2; AU2007201727A1; JP2004501647A; JP5008244B2; WO2002000885A2; EP1294892B1; DK1294892T3; PT1294892E; IL153290A0; CA2410297A1; CY1107835T1

Abstract

La presente invencion se refiere a particulas semejantes al virus de influenza (VLPs) que comprenden las proteinas estructurales HA, NA, M1 y M2. Las VLPs tambien son generadas conteniendo solo M1, como lo son las VLPs con M1 y cualquiera de uno o dos de HA, NA y M2. Las VLPs con HA de un subtipo de influenza y NA de un subtipo de influenza diferente tambien son descritas, como lo son las VLPs en las cuales una porcion o la totalidad de HA o NA es reemplazada por una porcion heterologa no producida por el virus de influenza, para que comprenda las VLPs quimericas.

Description

MONTAJE DE PARTICULAS QUIMERICAS SEMEJANTES AL VIRUS DE INFLUENZA Y DEL TIPO SILVESTRE Campo de la Invención Esta invención se refiere a partículas semej antes al virus de influenza compuestas de la proteína de la matriz sola, y pueden incluir además cualquiera de las proteínas estructurales de la influenza.

Antecedentes de la Invención Los virus de la influenza consiste de subtipos designados A, B y C. Los virus de la influenza poseen un genoma de ARN de hebra negativa única, segmentada, que codifica 10 polipéptidos que son requeridos para el ciclo de vida del virus. Cada uno de los ocho segmentos de ARN de un genoma completo es encapsidado con las subunidades múltiples de la proteína de nucleocápside (NP) y asociado con pocas moléculas de la polimerasa trimérica (subunidades PB1, PB2 y PA) , por lo cual se forma el complejo de ribonucleoproteína (RNP) (Entrada 1 de la bibliografía) . Rodeando estas estructuras está una capa de la proteína de la matriz (MI), la cual parece que sirve como un nexo entre el núcleo y la envoltura viral. Esta envoltura derivada de la célula del huésped es fijada con las dos glicoproteínas de la superficie Ref.143565 codificadas viralmente, principales, la hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) , y una cantidad mucho más pequeña de una proteína pequeña M2 no glicosilada (1, 2) . La glicoproteína HA es segmentada por una proteasa para formar HA1 y HA2. La infección viral de la influenza es iniciada por el montaje de la hemaglutinina superficial a un receptor celular que contenga el ácido siálico. Esta primera interacción de virus-célula induce la absorción de la partícula viral en la célula por endocitosis mediada por el receptor. Bajo las condiciones de pH bajo del endosoma, la HA padece un cambio de conformación que facilita la interacción del dominio terminal de NH2 hidrofóbico de HA2 y la membrana endosómica, conduciendo a la fusión de la membrana y la liberación subsiguiente de los RNPs del núcleo y la proteína de la matriz (MI) en el citosol . La disociación de los RNPs y las proteínas de la matriz ocurre en el citosol antes de que los RNPs sean translocados al núcleo en donde se lleva a cabo la transcripción y replicación del genoma completo (3, 4) . A continuación de la transcripción primaria, las proteínas sintetizadas recientemente inician la replicación del genoma viral lo cual a su vez incrementa la transcripción y síntesis de la proteína. En este punto del ciclo de vida del virus, las glicoproteínas superficiales HA y NA empiezan a acumularse en áreas discretas de la membrana del plasma desde donde será liberado el virus montado recientemente. El montaje del virus se supone que empieza por medio de alguna clase de interacción entre los dominios citoplásmico y/o de la transmembrana de las proteínas fijadas a la membrana y la proteína de la matriz (MI) fundamental, la cual a su vez mantiene una asociación estrecha con los RNPs (5, 6) . Colectivamente, HA, NA, MI y M2 constituyen las cuatro proteínas estructurales codificadas viralmente. Los contactos entre la proteína de la matriz MI y los complejos de RNP, así como el mecanismo por el cual un conjunto completo de ocho RNPs fue incorporado en la partícula del virión maduro, no han sido bien definidos. Los contactos moleculares específicos entre los componentes estructurales se supone que dictan como inicia y progresa el proceso de morfogénesis hasta el punto del montaje de partículas ('partióle assembly") maduras y el brote desde la superficie de la célula huésped. La complejidad del proceso ha ocasionado problemas tales como: 1) La identificación de cuales proteínas virales son requeridas para el montaje assembly" ) y brote. 2) El tipo de interacciones de proteína-proteína y lípido-lípido entre la superficie y los componentes fundamentales los cuales activan el proceso de montaje y brote. 3) Los mecanismos por los cuales los RNPs son llevados hacia el sitio de montaje, incorporados en la partícula y seleccionados de los segmentos análogos. 4) La naturaleza y estequiometría de las interacciones y la regulación de montaje y brote. La totalidad de estos eventos ocurren en un medio ambiente celular complejo en donde algunas moléculas del huésped pueden o no pueden mejorar o interferir con el avance del procese de montaje y brote. Esto, a su vez, conduce a los problemas de que si las proteínas celulares están involucradas realmente en el montaje viral y de cómo las proteínas no virales son excluidas generalmente de la superficie de las partículas que han brotado. Un gran número de estudios han sido llevados a cabo para resolver algunos de estos problemas con los virus de ARN con envoltura de diferentes familias (5); sin embargo la mayoría de estos problemas permanecen sin resolver con respecto al virus de la influenza. Los estudios con familias del virus del ARN no segmentado (tales como Rhabdoviridae y Paramyxoviridae) , los cuales están algo relacionados morfológica y evolucionariamente con la influenza, han mostrado que la proteína de la matriz (M) del virus de estomatitis vesicular del Rhabdovirus (VSV) es capaz por sí misma del estrangulamiento (brote) desde la superficie de la célula como partículas de la membrana (7, 8) . Además, la importancia de las proteínas M en el brote también es reflejado en el hecho de que las copias del virus de la rabia (otro Rhabdovirus) con una deleción del gen que codifica la proteína superficial G todavía son formadas y liberadas desde. las células infectadas (9) . El trabajo más reciente con PIV-3 (un Paramyxovirus ) también ha mostrado que las proteínas de la matriz junto con la proteína de la nucleocápside (NP) son capaces de asociarse en una estructura semejante al virus y brotar de la superficie de la célula (10) . Con respecto al virus de la influenza sin embargo, la expresión de estas dos proteínas utilizando los replicones del virus de Semliki Forest no mostraron ninguna asociación entre estas proteínas o el brote de las vesículas de la membrana (11) . Ha sido un método útil analizar las características genéticas, inversas del virus de la influenza para investigar las interacciones de proteína-proteína entre los componentes estructurales. La importancia del dominio citoplásmico de las glicoproteínas en el montaje de la influenza ha sido estudiada recientemente (12, 13, 14), y se ha mostrado que la deleción de la extremidad posterior de HA redujo su incorporación en la partícula así como la eficiencia del brote, pero no afectó la morfología del virión. Por otra parte, el virus con una extremidad posterior de NA delecionada mostró una morfología filamentosa y la incorporación de NA en la envoltura fue perjudicada. Además, las deleciones dobles parece que reducen la eficiencia del brote así como . la capacidad de infección y cambiaron la morfología del virión, los cuales fueron distinguibles de aquellos con deleciones de la extremidad posterior y del virus del tipo silvestre. Aunque las deleciones dobles de las extremidades posteriores pareció que afectan la eficiencia del brote y la morfología de las partículas del virus, las mismas no anularon completamente el montaje y la salida de las partículas del virión. Esto sugirió que la proteína MI es capaz de dirigir el montaje viral y el brote (13) . De manera semejante, las interacciones establecidas entre la proteína de la matriz y la membrana del plasma parece que van a ser críticas para el montaje y liberación del virus. Sin embargo, la naturaleza física de esta asociación, si la proteína de la matriz está intercalada completamente en la membrana del plasma o solamente unida por interacción electrostática, es un problema no resuelto. Un trabajo reciente que se dirige a esta cuestión sugirió fuertemente que la matriz y la membrana estuvieron asociadas a través de interacciones electrostáticas, pero no se podría excluir que una cierta cantidad de MI puede ser intercalada en la membrana (15) . El papel clave de las proteínas MI y M2 en la estructura del virión maduro es reflejada en la morfología esférica o filamentosa de las partículas cuando las substituciones de aminoácidos están presentes en cualquiera de estas moléculas (16) . Las partículas semejantes al virus (VLPs) han sido el objeto de mucho interés en los años recientes como candidatos potenciales para la inclusión de composiciones inmunogénicas . Esto es a causa de que las VLPs contienen una o más proteínas superficiales exhibidas en una conformación suficientemente semejante a su conformación natural de modo que las mismas pueden producir una respuesta inmune deseada. Al mismo tiempo, las VLPs carecen del complemento del material genético requerido para producir la progenie viral en un huésped. Por lo tanto, a diferencia del virus del tipo silvestre, las VLPs no pueden provocar una infección con los síntomas o la patología de la enfermedad. Por ejemplo, dos o tres proteínas del rotavirus (un virus de ARN de doble hebra) han sido montadas en las VLPs que provocaron una respuesta inmune ( 17 ) . Los sistemas de expresión del baculovirus han sido utilizados ampliamente para investigar la morfogénesis y el montaje de los virus sin envoltura que se unen- por sí mismos en estructuras icosahédricas (18, 19, 20, 21) . De manera semejante, la expresión en las células de insecto de las proteínas gag y/o env de diferentes miembros de la familia del retrovirus también ha sido utilizada para estudiar el montaje y el brote de la estructura del núcleo de los virus con envoltura (22, 23, 24, 25) . Existe una necesidad de evaluar la capacidad del sistema de expresión del baculovirus para producir VLPs de la influenza. En particular, existe una necesidad de identificar el número mínimo de las proteínas del virus de la influenza que se montarán en las VLPs y de evaluar la morfología y la inmunogenicidad de estas VLPs.

Breve Descripción de la Invención En consecuencia, es un objeto de esta invención identificar el número mínimo de proteínas del virus de la influenza las cuales se montarán en un VLP. Es un objeto adicional de esta invención generar VLPs que contengan proteínas de más de un subtipo del virus de la influenza. Todavía es un objeto adicional de esta invención generar VLPs quiméricos que contengan una proteína de una fuente diferente de la influenza, heteróloga. Todavía es otro objeto de esta invención formular composiciones inmunogénicas y farmacéuticas que contengan una o más de las VLPs mencionadas anteriormente . Estos y otros objetos de la invención como se describen posteriormente son logrados por el montaje de las VLPs de la influenza que comprenden al menos una proteína estructural del virus de la influenza, en donde las VLPs siempre incluyen MI. En una modalidad de la invención, las VLPs contiene solamente MI (el cual puede incorporar la proteína de la nucleocápside (NP) ) . Tales VLPs son producidas construyendo una molécula de ADN recombinante la cual codifica MI, transíectando, infectando o transformando de otra manera una célula huésped adecuada con la molécula de ADN recombinante, cultivando la célula huésped bajo condiciones las cuales permiten la expresión de MI, de modo que las VLPs sean montadas dentro de las células después de la expresión de MI, y purificando las VLPs del sobrenadante del cultivo. En otra modalidad de la invención, las VLPs comprenden además al menos una de las proreinas estructurales de la influenza seleccionadas del grupo que consiste de HA, NA y M2. Tales VLPs son producidas construyendo una o más moléculas de ADN recombinantes las cuales codifican MI más al menos uno de HA, NA y M2, transfectando, infectando o transformando de otra manera una célula huésped adecuada con una o más moléculas de ADN recombinante, cultivando la célula huésped bajo condiciones las cuales permiten la expresión de las proteínas estructurales del virus de influenza, de modo que las VLPs sean acopladas dentro de las células después de la expresión de las proteínas estructurales, .y purificando las VLPs del sobrenadante del cultivo. Las VLPs que contienen MI solamente o MI más al menos uno de HA, NA y M2 son formuladas con un diluyente o portador como una composición inmunogénica para inmunizar vertebrados contra la infección provocada por el virus de la influenza. En todavía otra modalidad de la invención, puede ser deseable producir VLPs que contienen glicoproteína superficiales de diferentes subtipos del virus de la influenza. Tales VLPs, las cuales contienen HA de un subtipo y NA de un subtipo diferente, son formuladas con un portador o diluyente como una composición inmunogénica bivalente para inmunizar a los vertebrados contra la infección provocada por estos dos subtipos del virus de la influenza. En todavía otra modalidad de esta invención, puede ser deseable producir VLPs en donde una porción o la totalidad del HA o NA sean reemplazadas por una porción heteróloga no producida por el virus de la influenza, para que comprenda VLPs quiméricas. Tales moléculas incluyen, pero no están limitadas a, un péptido, polipéptido o proteína. En donde solamente una porción de HA o NA va a ser reemplazada, una porción de la secuencia de ADN en la molécula de ADN recombinante la cual codifica HA o NA es reemplazada por una secuencia de ADN la cual codifica el péptido, polipéptido o proteína diferentes de la influenza. En donde el HA o NA completo va a ser reemplazado, la secuencia de ADN completa en la molécula de ADN recombinante que codifica HA o NA es reemplazada por una secuencia de ADN la cual codifica el péptido, polipéptido o proteína diferente de la influenza. En un aspecto, tal péptido, polipéptido o proteína diferente de la influenza es de un microorganismo patógeno. Estas VLPs quiméricas son formuladas con un portador o diluyente como una composición inmunogénica para inmunizar a los vertebrados contra la infección provocada por este microorganismo patógeno. En otro aspecto, tal porción diferente de la influenza es una porción activa farmacéuticamente. Estas VLPs quiméricas son formuladas con un portador o diluyente como una composición farmacéutica y administradas en una cantidad efectiva para el tratamiento de vertebrados con tal porción diferente de la influenza. En todavía otro aspecto, las VLPs acoplan y empacan los RNPs, y pueden además incorporar y expresar una secuencia de nucleótidos heterólogos . Cualquiera de las composiciones inmunogénicas y farmacéuticas previas pueden comprender además un adyuvante.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 muestra un vector de transferencia del baculovirus cuádruple (de estructura cuádruple) que lleva cuatro genes de la cepa A/Udorn/72 (H3N2) de la influenza. La transcripción de los genes HA y MI de la influenza es activada por el promotor de polihedrina (abreviado como ¾pH"), mientras que M2 y NA son activador por el promotor plO. Este vector fue transfectado junto con el ADN del baculovirus linearizado en células de insecto Sf9 para generar el recombinante cuádruple (HA/Q) . La Figura 2 muestra la estructura de una quimera de VSV-G/HA. Los 14 aminoácidos de la extremidad posterior citoplásmica y los 29 aminoácidos del dominio de la membrana de HA de la influenza fueron fusionados en la estructura con el ectodominio de la glicoproteina de la superficie de VSV-G (SEC ID NO: 1) . Las Figuras 3A-3B muestran los análisis de transferencia de Western de las proteínas de influenza y VSV G expresadas en las células Sf9 infectadas por recombinantes cuádruples del baculovirus (HA/Q28 y VSV-G/Q) . - En la Figura 3A, las proteínas HA, MI y M2 de la influenza fueron detectadas en el sobrenadante de las células Sf9 infectadas con el recombinante cuádruple HA/Q28 (72 horas después de la infección) , utilizando una mezcla de anticuerpos monoclonales anti-HA, anti-Ml y M2 (banda 1); los HA y MI también fueron detectados en las pelotillas de la célula (banda 2) . Las células de MDCK infectadas con A/Udorn/72 (H3N2) de la influenza fueron utilizadas como un control (banda 3) . La Figura 3B muestra la expresión de VSV G, así como las proteínas MI y M2 de la influenza, en las células Sf9 infectadas con VSV-G/Q (G de longitud completa) . La expresión fue detectada en las pelotillas de la célula (banda 2) y el sobrenadante del cultivo (banda 3), cuando se sondearon con una mezcla de anticuerpos monoclonales de anti-G, anti-Ml y M2. Las células Sf9 desinfectadas (banda 1), las células BH infectadas con VSV (banda 4) y las células MDCK infectadas con A/Udorn/72 (H3N2) de la influenza (banda 5) fueron utilizadas como los controles negativo y positivo, respectivamente . Las Figuras A-4C muestran el análisis por inmunofluorescencia de las células SF9 infectadas con un recombinante de baculovirus cuádruple (HA/028) . Los cultivos en cajas de las células Sf9 fueron infectadas con HA/Q28 en un MOI de 1 y se incubaron durante 72 horas. En este instante, las cajas individuales fueron fijadas con metanol-acetona y se incubaron secuencialmente con anticuerpos primarios y secundarios. La expresión de HA (Figura 4A) , MI (Figura 4B) o HA/MI (Figura 4C) fue detectada utilizando los filtros apropiados . Las Figuras 5A-5C muestran el análisis por inmunofluorescencia de las células Sf9 infectadas con HA/028. Los cultivos en cajas fueron infectados con HA/028 en un MOI de 1 y se incubaron durante 72 horas. Durante este periodo de tiempo, las cajas individuales fueron fijadas con paraformaldehido e incubadas secuencialmente con anticuerpos primarios y secundarios. La expresión de HA (Figura 5A) , NA (Figura 5B) o HA/NA (Figura 5C) fue detectada utilizando los filtros apropiados . La Figura 6 muestra el análisis de inmunofluorescencia de las células Sf9 infectadas con HA/Q28. Los cultivos en cajas de las células Sf9 fueron infectados con HA/Q28 en un MOI de 1 y se incubaron durante 72 horas.

Durante este período de tiempo, las cajas individuales fueron fijadas con paraformaldehído e incubadas secuencialmente con anticuerpos primarios y secundarios. La expresión de M2 fue detectada utilizando los filtros apropiados. La Figura 7 muestra el análisis de inmunofluorescencia de las células Sf9 infectadas con VSV-G/Q (gen HA de influenza de longitud completa en HA/Q28 reemplazada por el gen de VSV G de longitud completa) . Los cultivos en las cajas fueron infectados con VSV-G/Q en un MOI de 1 y se incubó durante 72 horas. Durante este período de tiempo, las cajas individuales fueron fijadas con metanol-acetona e incubadas secuencialmente con anticuerpos primarios y secundarios. La expresión de VSV G fue detectada utilizando los filtros apropiados. Las Figuras 8A-8B muestran los análisis de la formación de VLP por centrifugación con un gradiente de Iodixanol. La Figura 8A muestra los resultados cuando las fracciones de HA/Q28 fueron sondeadas por transferencia de Western con una mezcla de anticuerpos monoclonales anti-HA y MI. Las bandas 1-8 representan las fracciones colectadas desde la parte superior hasta la inferior del tubo; la banda 9 es un control infectado con A/Udorn/72 (H3N2) de la influenza de MDCK. La Figura 8B muestra los resultados cuando las fracciones de VSV-G/Q fueron sondeadas por transferencia de Western con una mezcla de anticuerpos monoclonales de anti-VSV-G, anti-Ml y anti-M2. Las bandas 1-8 representan las fracciones colectadas desde la parte superior hasta la inferior del tubo; la banda 9 es una mezcla de células de BHK infectadas con VSV y de células MDCK infectadas con influenza, combinadas como un control. La Figura 8C muestra los resultados cuando los sobrenadantes concentrados de las células Sf9 infectadas doblemente ( recombinantes únicos de MI y NP) fueron purificados y sondeados con una mezcla de anticuerpos anti-Ml y anti-NP. Las bandas 1-8 representan las fracciones de gradientes colectadas desde la parte superior hasta la inferior del tubo; la banda 9 es de células MDCK infectadas con influenza como un control. Las Figuras 9A-9B muestran los análisis de transferencia de Western de los sobrenadantes del cultivo de las células Sf9 infectadas con MI solo o HA/Q28 más recombinantes del baculovirus únicos de NP . La Figura 9A muestra el análisis de las fracciones derivadas del sobrenadante de la infección de MI único, las cuales fueron sondeadas con el anticuerpo anti-Ml. Las bandas 1-8 representan las fracciones colectadas desde la parte superior hasta la parte inferior del tubo; la banda 9 es de células de MDCK infectadas con influenza como un control. La Figura 9B muestra los resultados cuando el sobrenadante de las células de Sf9 infectadas doblemente (HA/Q28 más recombinantes del baculovirus únicos de NP) fue purificado y sondeado con una mezcla de anti-HA, anti-Ml y anti-NP . Las faj as 1-8 representan las fracciones colectadas desde la parte superior hasta la inferior del tubo ; la banda 9 es el mismo control que en la Figura 9A. La Figura 10 muestra una micrografía electrónica de VLPs de influenza teñidas negativamente puri ficadas del medio de cultivo de las células Sf9 infectadas con un HA/Q28 recombinante cuádruple . Las Figuras 11A-11B muestran micrografias electrónicas de VLPs de influenza etiquetadas con immunogold. En la Figura 11A (tres vistas ) , las VLPs fueron sondeadas con un anticuerpo monoclonal anti-HA. y contrateñidas con es feras de oro acopladas a IgG antiratón . En la Figura 11B, las VLPs fueron sondeadas con el anticuerpo monoclonal anti-NA y se contratiñeron como en la Figura 11A. Las Figuras 12A-12B muestran las transferencias de Western de las células infectadas con el virus de la influenza, sondeadas con substancias agrupadas del suero de los ratones inmunizados con VLPs de HA/Q28. En la Figura 12A, se muestran los resultados de los sueros agrupados de un primer par de dos ratones . En la Figura 12B, se muestran los resultados de los sueros agrupados de un segundo par de dos ratones . En cada una de las Figuras 12A y B, Banda 1 : células de MDCK no infectadas como un control ; banda 2 : células de MDCK infectadas con el virus A de la influenza. El sondeo de las células de MDCK no infectadas mostró una franj a no especi fica ligeramente arriba de aquella de MI, la cual también estuvo presente en las células infectadas con influenza. Las Figuras 13A-13B muestran las transferencias de las células infectadas con VSV sondeadas con substancias agrupadas de los sueros de ratones inmunizados con VLPs quiméricas de VSV-G/Q. En la Figura 13A, se muestran los resultados de los sueros agrupados de un primer par de dos ratones. En la Figura 13B, se muestran resultados de los sueros agrupados de un segundo par de dos ratones. En cada una de las Figuras 13A y B: Banda 1: células de BHK no infectadas; banda 2: células de BHK infectadas con VSV; banda 3: células de MDCK no infectadas como un control; banda 4: células de MDCK infectadas con influenza. La Figura 14 muestra un vector de transferencia de baculovirus cuádruple que lleva cuatro genes de la cepa A/Udorn/72 (H3N2) de la influenza, incluyendo los tres genes que codifican las subunidades de polimerasa y la nucleoproteina . La transcripción de los genes PB1 y PA de la influenza, los cuales están colocados en orientaciones opuestas, es activada por el promotor de polihedrina (abreviada como '"promotor de pH" ) , mientras que la transcripción de los genes PB2 y NP, también en orientaciones opuestas, es activada por el promotor plO. Los cuatro genes fueron subclonados en el vector de transferencia PAcAB4 del baculovirus, luego cotransfectados con el ADN del baculovirus linearizado en las células de insecto Sf9 para generar el recombinante cuádruple. La Figura 15 muestra la medición de la actividad de luciferasa en unidades luminosas relativas (RLUs) en las células del riñon del hámster bebé (BHK) infectadas con VLP y no infectadas (de control) . La Figura 16 muestra la expresión de la proteina fluorescente verde (GFP) en las células BHK a continuación de la infección con VLPs que llevan el gen GFP. Las flechas indican las células BHK que expresan GFP.

Descripción Detallada de la Invención El montaje y liberación de partículas virales con envoltura desde la superficie de las células infectadas con el virus es un proceso gradual y complejo. El mismo requiere las acciones concertadas de las proteínas glicosiladas y no glicosiladas codificadas por el virus, con áreas discretas de la membrana del plasma para iniciar el montaje de la partícula del virión. Además de estos componentes, los ácidos nucléicos encapsidados de la proteína, que representan el material genético del virus, también son incorporados en la estructura para complementar el proceso de mo fogénesis, el cual es complementado por el estrangulamiento o brote de la partícula madura del virión desde la superficie celular. Las interacciones molecular exactas y las contribuciones de los componentes estructurales diferentes en el conjunto y la liberación final de una partícula de virión completa no están bien caracterizados. La presente invención describe el montaje y liberación de partículas semejantes al virus de influenza (VLPs) desde la superficie de las células infectadas con los vectores . recombinantes los cuales expresaron las proteínas estructurales del virus de influenza. Una variedad de sistemas de expresión son adecuados para la generación de VLPs. La invención es ejemplificada con células de insectos infectadas con recombinantes de baculovirus que expresaron las proteínas estructurales del virus de influenza. Para definir las moléculas requeridas para el montaje y el brote del virus de influenza, se construyeron una serie de baculovirus de un solo gen y de genes cuádruples. Los recombinantes expresaron cuatro proteínas estructurales de influenza (HA, NA, MI y M2) en células de Spodoptera frugiperda 9 (Sf9) . Las células de Sf9 son una línea celular de insecto (número de acceso del ATCC CRL 1711) que es un derivado de la línea celular SF21. Aunque se describe un vector de transferencia que codifica todas las cuatro proteínas estructurales, el uso de dos a cuatro vectores de transferencia que codifican colectivamente estas cuatro proteínas también están dentro del alcance de esta invención .

Para obtener recombinantes cuádruples, un vector de transferencia del baculovirus único que codifica las cuatro proteínas estructurales de la cepa A/Udorn/72 (H3N2) de la influenza fue construido utilizando un método de vector de transferencia que facilita la clonación por la reducción del tamaño del plásmido de trabajo e incrementando el número de sitios de restricción. En el vector de transferencia final, los genes de la influenza estuvieron localizados en la dirección 3' desde los promotores plO (NA y M2) y polihedrina (HA y MI) del baculovirus, los cuales fueron colocados para activar la transcripción de los genes en direcciones opuestas (Figura 1) . Los recombinantes cuádruples del baculovirus (HA, NA, MI y M2) fueron obtenidos por la transfección simultánea de las células Sf9 con el ADN viral linearizado y el ADN del vector de transferencia. Pocas placas virales recombinantes fueron seleccionadas y purificadas adicionalmente por dos rondas adicionales de aislamiento de placa a placa. Basado en el nivel de expresión de la proteína evaluado por inmunotransferencia, este vector de transferencia recombinante cuádruple, designado HA/Q28, fue seleccionado para su uso en los experimentos subsiguientes. Una característica prominente de esta construcción fue que los sitios de empalme del donador y aceptor sobre el gen de MI fueron mutados para prevenir el empalme del ARNm de MI. De otra manera, el ARNm de MI podría haber sido empalmado en el ARNm de M2, conduciendo a un nivel reducido de expresión de la proteína MI. El ADN de M2 fue introducido en el vector de transferencia como un gen independiente. Para investigar si la expresión de estas cuatro proteínas estructurales de la influenza fue suficiente para activar el montaje y brote de las VLPs de influenza desde la superficie de las células de insectos de Sf9 infectadas con el HA/Q28 recombinante del baculovirus cuádruple, los sobrenadantes del cultivo fueron analizados por transferencia de Western para averiguar la presencia de las proteínas de MI y HA. El medio de cultivo fue colectado 72 horas después de la infección, aclarado a 4000xg durante 30 minutos y el material suspendido restante fue concentrado entonces por centrifugación a 200000xg durante dos horas. El análisis de transferencia de Western del sobrenadante concentrado de las células infectadas sondeadas con la combinación de los anticuerpos monoclonales de anti-HA, MI y M2 demostraron la expresión significativa de las proteínas HA, MI, y M2 de la influenza (Figura 3A) . La proteína de HA pareció que migra en diferentes configuraciones que la HA desde las células de riñon de canino de Medin-Darby (MDCK) infectadas con A/Udorn/72 (H3N2) de la influenza, lo cual puede ser un reflejo de varias formas de glicosilación de esta proteína. Por otra parte, las configuraciones de migración de las proteínas de MI y M2 fueron semejantes a aquellas expresadas en las células infectadas de la influenza de MDCK (Figura 3A, bandas 1-3) . La expresión de las proteínas de NA fue detectada por la transferencia de Western con un anticuerpo policlonal de ratón que también reconoció HA, MI y M2 (datos no mostrados) . Los resultados descritos posteriormente demuestran que la expresión de cuatro proteínas estructurales de la influenza es suficiente para el montaje y el brote de VLPs de la superficie de las células de insectos de Sf9. La expresión de la proteína de la nucleocápside (NP) , además de estas cuatro proteínas, condujo a la formación de VLPs que incorporaron la proteína de NP en la partícula. Además, la expresión de la proteína MI sola indujo la liberación de VLPs, las cuales pueden incorporar la NP de nucleocápside cuando son co-expresadas con MI. Además, el reemplazo del gen HA ya sea por una proteína g de longitud total del virus de estomatitis Vesicular o un HA/G híbrido en el recombinante cuádruple, indujo el montaje y liberación de las VLPs quiméricas. La totalidad de estas VLPs sen obtenidas por los medios convencionales de purificación después de la secreción de las VLPs en el medio. Para evaluar si las glicoproteínas diferentes de la influenza, heterólogas, pueden ser incorporadas en la superficie de las VLPs de influenza, dos diferentes recombinantes de baculovirus cuádruples, quiméricos, fueron construidos. El primero, designado VSV-G/Q, reemplazó la secuencia de ADM que codifica la proteína de HA de la influenza con una secuencia de ADN que codifica la glicoproteína G de longitud completa del virus de estomatitis Vesicular (VSV) . El segundo, designado VSV-G/HA-Q, llevó una secuencia de ADN híbrido que codifica el ectodominio de la proteína G de VSV y el dominio de transmembrana y el extremo posterior citoplásmico de la proteína HA de influenza (véase la Figura 2) . Ambos recombinantes contuvieron los genes para las tres proteínas MI, NA y M2 del virus de la influenza estructural . Estas construcciones fueron sometidas a los mismos estudios de caracterización que las VLPs de influenza del tipo silvestre y los resultados indicaron que la infección de las células de insectos de Sf9 con cualquier construcción, dirigió el montaje y liberación de las partículas semejantes a la influenza que llevan las proteínas G de VSV sobre su superficie. Ambos de estos virus recombinantes fueron capaces de activar la expresión de las cuatro proteínas (MI, M2, NA y VSV-G) , las cuales también fueron secretadas en el medio. El análisis de transferencia de Western de las células Sf9 infectadas con VSV-G/Q mostró que la proteína G de VSV, asi como las proteínas MI y M2 de la influenza, fueron expresadas 72 horas después de la infección (Figura 3B) . Además, el sobrenadante concentrado de las células infectadas mostró una transferencia de Western positiva cuando se sondeó con anticuerpos para G de VSV, y MI y M2 de la influenza (Figura 3B, banda 3) . Los métodos descritos hasta ahora para la proteina G de VSV son fácilmente aplicables a la incorporación de otras glicoproteinas diferentes de la influenza de interés biológico en la superficie de las VLPs, asi como la incorporación de una porción no producida por el virus de la influenza. Tales porciones incluyen, pero no están limitadas a, un péptido, polipéptido o proteina. Como se describe posteriormente, tales VLPs son utilizadas como composiciones inmunogénicas , en los estudios de interacción del ligando-receptor, y/o como un sistema para el suministro de la porción diferente de la influenza como parte de una composición farmacéutica. Para evaluar adicionalmente la expresión y localización celular de las proteínas de influenza en las células Sf9, el análisis inmunofluorescente de las células infectadas con el recombinante HA/Q28 del baculovirus purificado de la placa fue llevado a cabo. Estos experimentos mostraron que las cuatro proteínas estructurales de la influenza fueron expresadas como se muestra por inmunofluorescencia indirecta (Figuras 4-6). Los experimentos de teñido doble con anticuerpos anti-HA y anti-NA demostraron que estas glicoproteínas superficiales están localizadas en la periferia de las células infectadas con un cierto grado de superposición (Figura 5) . Estos resultados sugirieron que estas glicoproteínas mayores co-localizadas en áreas discretas sobre la superficie de las células de insecto infectadas, parece que son las que se esperan en una infección de influenza natural de las células de mamífero. De manera semejante, el teñido inmunofluorescente doble de las células de Sf9 infectadas con HA/Q28 con una mezcla de anticuerpos monoclonales para cualquiera de HA y MI mostró que las proteínas superficiales y MI de la matriz parece que se co-localizan en áreas distintas de la membrana celular (Figura 4C) . Por otra parte, la inmunofluorescencia de las células de Sf9 infectadas recombinantemente del baculovirus de MI mostró que la proteína MI se acumuló predominantemente en los núcleos de las células infectadas y solamente cantidades menores fueron visualizadas en la superficie celular (datos no mostrados) . La configuración de la distribución de la proteína MI en las células infectadas parece que no va a ser alterada si MI fue expresado como un gen único o como un recombinante cuádruple junto con HA, NA y M2 (Figura 4) . Además, la infección simultánea de las células Sf9 con los recombinantes únicos de MI y NP no mostró la redistribución de estas proteínas en las células cuando se compara con las células Sf9 infectadas individualmente con los recombinantes ya sea de MI o NP (datos no mostrados) . Asi, la transferencia de Western y el análisis inmunofluorescente de las células infectadas mostró claramente que estas cuatro proteínas no solamente estuvieron presentes en las células y los sobrenadantes de las células, sino también estuvieron co-localizadas en áreas discretas sobre la membrana del plasma. Esto sugirió una asociación potencial entre estas proteínas estructurales. Los estudios de inmunofluorescencia de las células Sf9 infectadas con un VSV-G/Q recombinante mostraron que la proteína G de VSV no solamente es expresada, sino que también parece que se acumula en la periferia de las células infectadas . A causa de que los estudios de inmunofluorescencia revelaron que estas proteínas estuvieron co-localizadas en la superficie de la célula, esto condujo a una evaluación de que si estas cuatro proteínas virales fueron suficientes para activar la formación y liberación de VLPs desde la superficie de la célula infectada. Específicamente, para investigar si estas proteínas fueron liberadas de la célula como una consecuencia del daño y la muerte celular, o a causa de que las mismas se montaron como VLPs que brotaron desde la superficie celular, los sobrenadantes concentrados de las células Sf9 infectadas con HA/Q28 fueron sometidas a centrifugación con un gradiente de velocidad de Iodixanol (26) (200000 x g durante 3.5 horas) . Como se especificó individualmente, las fracciones que contienen las proteínas de interés fueron sometidas a purificación adicional sobre un gradiente de sucrosa al 20-60%. El análisis de transferencia de las fracciones colectadas mostró que HA y MI co-migraron a través del gradiente, alcanzando una concentración máxima en la fracción 2 (Figura 8A, banda 2) . Estas proteínas también se encontraron en las fracciones adyacentes 3 y 4, así como en las fracciones 7 y 8 (Figura 8A) . La detección de HA y MI en estas fracciones inferiores (hacia el fondo del gradiente) fue probablemente debido a la asociación de estas proteínas con el baculovirus, el cual bajo estas condiciones muestra franjas en las fracciones 7 y 8 (datos no mostrados) . Un experimento semejante fue llevado a cabo con las construcciones tanto de VSV-G/HA-Q (quimera) como VSV-G/Q (longitud completa) . Como se observó con HA/Q28, la fracción 2 de un gradiente de Iodixanol contuvo el VSV G y las proteínas MI y M2 de la influ.enza como se muestra por el análisis de transferencia de Western (Figura 8B, banda 2) . Cuando las células Sf9 fueron infectadas con un recombinante cuádruple que lleva un VSV-G de longitud completa en lugar de HA, todas las proteínas sondeadas (VSV-G, MI y M2) también estuvieron presentes tanto en el sobrenadante del concentrado como las fracciones 2 y 3 del gradiente de Iodixanol (Figura 3B, banda 3 y Figura 8B) . Estos resultados sugirieron que la infección de las células Sf9 con ya sea VSV-G/HA-Q cuádruple (quimera) o VSV-G/Q (longitud completa) dirigieron el montaje y liberación de VLPs de la influenza que llevan la. proteína G de VSV sobre su superficie. En vista del hecho de que algunas de las partículas de HA/Q28 examinadas bajo el microscopio electrónico no mostraron puntas superficiales detectables (véase posteriormente) , surge la cuestión de que si la proteína de la matriz de influenza por sí misma es suficiente para activar el montaje y liberación de las partículas vesiculares. Para resolver esta cuestión, las células de insecto Sf9 fueron infectadas con un recombinante de vaculovirus MI durante 72 horas, y los sobrenadantes del cultivo concentrados fueron sometidos al mismo análisis que se describió anteriormente. El análisis por inmunotransferencia de las fracciones del sobrenadante del gradiente de Iodixanol demostró que la proteína de la matriz fue concentrada en las fracciones 2 y 3, de manera semejante a la configuración de migración de las VLPs liberadas de las células Sf9 infectadas con HA/Q28 (Figura 9A) . Existe una fuerte evidencia (3) de que la proteína de la matriz (MI) desempeña un papel importante en el transporte del complejo de ribonucleoproteína (RNPs) desde el núcleo hasta la superficie de la célula, en donde el montaje viral se lleva a cabo. La asociación entre la matriz y los RNPs podría ser mediada a través de los contactos con el NP, el ARN del virión o ambos. Por lo tanto, fue de interés evaluar si la proteína de la nucleocápside (NP) fue incorporada en la VLP cuando las células Sf9 fueron coinfectadas con el HA/Q28 recombinante cuádruple y un recombinante de baculovirus único de NP. El análisis de transferencia de Western de la fracción 2 del gradiente demostró que la proteína NP de la nucleocápside fue incorporada realmente en las VLPs resultantes (Figura 9B) . Este resultado realzó la cuestión acerca de cuales proteínas establecen contacto con el NP para permitir la incorporación del NP en la partícula. Para resolver esta cuestión, se utilizaron recombinantes de baculovirus únicos de MI y NP. La expresión simultánea de MI y NP en las células Sf9 produjo partículas de membranas compuestas de ambas proteínas. Esto permitió la evaluación de interacciones potenciales entre estas dos proteínas en la ausencia del ARN de la influenza definido con las terminales precisas. El análisis de transferencia de Western de las partículas purificadas con el gradiente derivadas de las células Sf9 infectadas doblemente con los recombinantes MI y NP mostraron que MI y NP estuvieron colocalizados en las mismas fracciones (Figura 8C) . Por otra parte, la infección con un recombinante de NP solo no indujo la liberación de la partícula y no demostró la presencia de la NP reactiva en cualquiera de las fracciones (datos no mostrados) . Estos resultados sugirieron una interacción entre MI y NP la cual fue lo suficientemente fuerte para llevar la NP dentro de la partícula que contiene MI aún en la ausencia del ARN. Basado en la localización de la proteína NP en el virus de influenza, y otros estudios del conjunto de partículas de la proteína (10) , es razonable inferir que la proteína de NP establece contacto con la proteina de la matriz MI y, como resultado de esta interacción, la misma es incorporada en el VLP. En las células infectadas con influenza, el transporte de los RNPs desde el núcleo hasta el sitio del montaje del virus en la membrana del plasma ocurre después de la asociación con la proteína de la matriz por un mecanismo el cual no está bien caracterizado. Se ha mostrado (27) que la proteína, de NP se aglutina no solamente al ARN de influenza, sino que también se puede aglutinar con afinidad inferior al ARN no específico. Por lo tanto, este resultado no excluye la posibilidad de que el ARN sea requerido para una interacción productiva entre MI y NP. Por lo tanto, se concluye que la proteína de la matriz no solamente inicia las interacciones moleculares que conducen al montaje y liberación de las partículas, sino que también es capaz de aglutinar e incorporar la NP de la nucleocápside en la partícula. En las células infectadas con influenza, la proteína MI se asocia con los RNPs en el proceso de transporte y montaje viral. En el caso de recombinantes de MI únicos, estas otras estructuras de la influenza no están presentes, pero todavía ocurre el brote. El NP puede asociarse con MI como monómeros u oligómeros, o después de la aglutinación del ARN celular. Cualquiera que sea la naturaleza de la asociación, es claro que MI y NP expresadas en las células de insectos se aglutinan con suficiente afinidad para unirse en una vesícula, la cual es capaz de salir de la célula. Para caracterizar adicionalmente la naturaleza de la asociación entre las proteínas de la influenza que co-migraron en las fracciones 2 y 3, se llevó a cabo la evaluación por microscopía electrónica del material presente en estas fracciones. El examen por microscopía electrónica de la fracción 2 reveló la presencia de una concentración elevada de las partículas tanto vesiculares como no vesiculares fijadas con proyecciones superficiales que se asemejaron ampliamente con el virus de la influenza y las partículas subvirales (Figura 10) . La forma y características estructurales de las VLPs varió dependiendo de sus posiciones en el gradiente. Las puntas que sobresalen de la superficie de algunas vesículas parecieron semejantes a HA y NA de la influenza, porque las mismas sobresalen hacia fuera desde la superficie de las partículas como las mismas lo hacen desde la superficie del virus de la influenza. Las proyecciones en algunas VLPs desde la fracción 2 fueron significativamente semejantes a las puntas de HA presentes en el virus de influenza (Figura 10) . La morfología de NA es menos distintiva en las muestras que contienen tal gama amplia de entidades fijadas con las puntas. La fracción 3 contuvo una gama semejante de partículas en concentración elevada, sin embargo pareció que contienen una concentración más elevada de las membranas agregadas que la fracción 2 (datos no mostrados) . Las fracciones que mostraron el número más grande de VLPs de la influenza bajo el microscopio electrónico también contuvieron las concentraciones más elevadas de proteínas MI y NA como se demostró por el análisis de transferencia de Western. Las VLPs, las cuales fueron cubiertas con proyecciones superficiales y variaron en su longitud desde aproximadamente 75 nm hasta 150 nm, se asemejaron claramente al virus de influenza en tamaño y morfología . Para caracterizar adicionalmente la estructura de las partículas de MI, estas dos fracciones del gradiente fueron examinadas por microscopía electrónica. El examen por microscopía electrónica teñida negativamente mostró un gran número de vesículas de formas variables que no llevan puntas sobre sus superficies (datos no mostrados). Para determinar si las células infectadas con el baculovirus liberaron espontáneamente las vesícula o si la asociación de la proteína MI en la superficie celular fue suficiente para activar la salida de las partículas, se examinaron por microscopía electrónica las fracciones de gradiente semejante de los sobrenadantes concentrados de las células Sf9 infectadas ya sea con el baculovirus recombinante de NP o del tipo silvestre. Ninguna de las otras proteínas (NP, HA) fue detectada en estas fracciones, cuando el sobrenadante de las células de Sf9 infectadas con los recombinantes únicos correspondientes fu utilizado en el análisis. Estos resultados indicaron que la proteína de la matriz por sí misma fue suficiente para activar el montaje y liberación de las VLPs desde la superficie de las células de insectos . La composición de la proteína de las puntas que sobresalen desde la superficie de las VLPs fue investigada por microscopía electrónica de los antígenos superficiales etiquetados con immunogold, que fueron sondeados con anticuerpos monoclonales específicos con respecto a HA y NA (los cuales fueron los mismos que aquellos utilizados en los experimentos de inmunofluorescencia) . Este examen mostró que el HA del antlgeno superficial mayor de la influenza estuvo realmente presente sobre la superficie de las VLPs, como se indicó por la presencia de perlas de oro (Figura 11A) . Esto confirmó lo que se supuso de la evaluación estructural de las puntas visualizadas por el teñido negativo y la microscopía electrónica (Figura 10). De manera semejante, la etiquetación de immunogold con el anticuerpo anti-NA y la microscopía electrónica también revelaron la presencia de glicoproteína de NA sobre la superficie de las VLPs, aunque con abundancia inferior que HA (Figura 11B) . Se han hecho intentos para detectar la presencia las proteínas M2 sobre la superficie de la VLP por etiquetación con immunogold utilizando un anticuerpo policlonal de conejo realzado contra los péptidos que- abarcan 18 aminoácidos del amino terminal de la proteina M2. La proteína M2 no fue detectada sobre la superficie de la partícula, aún cuando la misma estuvo presente en las fracciones del gradiente sometidas a microscopía electrónica-etiquetación con immunogold (IEM). Sin embargo, esto no fue sorprendente, a causa del IEM no es un sistema suficientemente sensible para detectar proteínas menores y, aún con el virus de influenza natural, muy poco M2 es producido y es difícil de detectar. Cuando las VLPs de VSV-influenza quiméricas fueron purificadas y examinadas por microscopía electrónica, las mismas se encontró que tienen una morfología semejante a las VLPs de la influenza. Además, el análisis de etiquetación con immunogold reveló que las mismas llevan glicoproteínas superficiales que fueron reactivas con el anticuerpo anti-G (datos no mostrados) . Las partículas generadas con cualquier construcción no parece que muestren alguna diferencia significativa en la morfología. El contenido de las proteínas sobre la superficie de ambas partículas fue aparentemente semejante. Esto sugirió que la interacción potencialmente favorable entre la porción de HA de la quimera de G/HA y MI subyacente de la membrana no mejoraron significativamente el nivel de incorporación de G en la partícula. Para evaluar la inmunogenicidad de las VLPs de influenza del tipo silvestre y las VLPs quiméricas (que contienen G de VSV) , dos grupos de ratones Balb/c fueron inmunizados por medio de la ruta intramuscular con ya sea HA/Q28 o VSV-G/Q, en donde cada conjunto de VLPs fue formulado con fosfato de aluminio. Todos los ratones en cada grupo recibieron una inyección principal y dos inyecciones de refuerzo en intervalos de dos semanas. Dos semanas después de la última inmunización, las muestras de sangre fueron obtenidas y la presencia de los anticuerpos contra el antígeno correspondiente fue evaluada por transferencia de Western (para ambos tipos de VLPs), la inhibición de hemaglutinación (para el HA/Q28) y una prueba de neutralización del suero (para VSV-G/Q) . El análisis de inmunotransferencia demostró que los sueros de los ratones inmunizados con HA/Q 28 de la influenza reconocieron el virus de influenza utilizado como el inmunógeno de prueba (predominantemente HA y MI; Figuras 12A y B, banda 2) . De manera semejante, los sueros de los ratones inmunizados con el VSV-G/Q de las VLPs quiméricas reconocieron la proteína G de VSV (Figura 13A y B, banda 2) . El funcionamiento de una inhibición de la prueba de hemaglutinación del virus de influenza (IHA) mostró que los sueros de los ratones inmunizados con HA/Q28 tuvieron una concentración de IHA de 96 IHAU, la cual fue más de dos veces más elevada que aquella obtenida de los ratones naturales de control (32 IHAU) . Esta respuesta fue casi igual a la concentración de IHA de 128 IHAU producida por dos inmunizaciones intranasales (con dos semanas de separación) con A/Hong Kong (H3N2) vivos de influenza (cortesía del Dr. Mbawuike, Baylor College of Medicine) , los cuales sirvieron como un control positivo. La neutralización de VSV por los sueros de los ratones inmunizados con VSV-G/Q mostró que una dilución tan elevada como 1/64 neutralizó completamente una concentración estándar de VSV, por lo cual se previene la formación de cualesquiera placas en la monocapa de células. Estos resultados demostraron que las VLPs de la influenza produjeron una respuesta del anticuerpo que no solamente reconoció el virus de influenza del tipo silvestre en la transferencia de Western, sino que también exhibió la hemaglutinación del virus de influenza. Además, la inmunización de los ratones con las VLPs quiméricas que llevan la proteina G de VSV indujeron una respuesta de anticuerpo humoral que reconoció la proteina G de VSV del virus del tipo silvestre en una transferencia de Western, y también previno la infección en una prueba de neutralización del suero. Otros tipos de células huésped además de las células de insecto también pueden ser utilizadas con uno o más vectores recombinantes que codifican las proteínas estructurales del virus de influenza (y, si se desea, una proteína diferente de la influenza) para producir las VLPs. Los estudios con la proteína M de VSV demostraron que esta propiedad fue mostrada en los tipos de células tanto de insecto (8) como de mamífero (7). Además de la expresión de las proteínas M y NP de la matriz del virus de parainfluenza (otro virus de ARN de hebra negativa, no segmentado) en las células de mamífero condujo a la formación y liberación de partículas semejantes al virus (10). Otros tipos de células adecuadas para su uso como células huésped incluyen las células huésped de mamífero (tales como las células de los ovarios del hámster Chino, fibroblastos del embrión de pollo, células BHK, células SW13 humanas) y células huésped de levadura (tales como Pichia, Saccharomyces) . El uso de células de mamífero o de levadura puede conducir a la expresión de proteínas con una glicosilación más semejante que la de las proteínas del tipo silvestre que puede ser obtenida con células de insectos. Los vectores recombinantes adecuados para el suministro de los genes además de los baculovirus incluyen, pero no están limitados a, virus tales como de vaccinia y otros poxvirus, sindbis, adenovirus, virus de encefalitis equina de Venezuela y otros alfavirus, así como el ADN del plásmido. Los vectores recombinantes deben incluir promotores y otros elementos reguladores (tales como una señal de poliadenilación) efectiva para dirigir la expresión de proteínas de la influenza (y cualquiera diferente de la influenza) para producir VLPs en el tipo de célula huésped correspondiente. Las células huésped son transíectadas, infectadas y transformadas de otra manera por técnicas convencionales conocidas en el arte. Tales técnicas también incluyen, pero no están limitadas a, transducción, electroporacion y lipofeccion. Como se describió aquí, la expresión por medio de un recombinante del baculovirus cuádruple de las cuatro proteínas estructurales de la influenza (HA, NA, MI, M2) fue suficiente para activar el montaje y liberación de las VLPs desde la superficie de las células de insectos Sf9. Este es el primer reporte de la formación de VLPs de influenza producidos con solamente cuatro proteínas estructurales. Realmente, las VLPs pueden comprender tan pocos como una proteína estructural, MI. Por lo tanto, esta invención incluye las VLPs compuestas de MI solos, MI más uno o dos de HA, NA y M2, así como la totalidad de las cuatro de estas proteínas estructurales. Las VLPs montadas se asemejan estrechamente al virus de influenza del tipo silvestre en su tamaño, morfología de la partícula y estructura fina de las puntas superficiales. Además, la formación de VLPs en la ausencia de RNPs de influenza indica que los RNPs no son necesarios para el montaje y liberación de las partículas. Este método novedoso para montar las VLPs de influenza es de gran importancia para el diseño de composiciones inmunogénicas contra nuevas variantes de influenza. Una característica importante de este sistema es la capacidad para reemplazar las glicoproteínas superficiales con diferentes subtipos de HA y/o NA; esto permitirá la actualización de formulación con nuevas variantes antigénicas de estas proteínas. Cuando variantes antigénicas de estas glicoproteinas son identificadas, las VLPs pueden ser actualizadas para incluir estas nuevas variantes. Por consiguiente, aún las glicoproteinas superficiales extremadamente peligrosas tales como H1N1 (del 1918 Spanish flu) o una combinación de HA, NA con potencial pandémico podrían ser incorporados en las VLPs sin conocimiento acerca de las implicaciones de la liberación de genes que no han circulado en los seres humanos por varias décadas. Esto es a causa de que las VLPs no son infecciosas, no se replican y no provocan la enfermedad. Además, la factibilidad de incorporar glicoproteinas heterólogas sobre la superficie de las VLPs hace a este enfoque atractivo no solamente como un sistema de suministro, sino también permite la ubicación como objetivo de tipos de células específicas (tropismo) con base en las glicoproteinas superficiales incorporadas sobre sus superficies. En una modalidad, las VLPs contienen el extremo posterior citoplásmico y el dominio de la transmembrana de HA y el dominio externo de una glicoproteína diferente de la influenza, lo cual facilita la generación de partículas quiméricas útiles para inmunizaciones multivalentes . En resumen, se ha mostrado que las partículas semejantes al virus de la influenza quiméricas y del tipo silvestre pueden ser montadas y liberadas de la superficie de las células Sf9 a continuación de la expresión de solamente una a cuatro proteínas estructurales virales, siempre que la proteína MI de la matriz sea expresada siempre. También se ha demostrado que MI es capaz de activar la liberación de partículas vesiculares que contienen NP cuando las dos están presentes conjuntamente. En una modalidad adicional de la invención, la formación y encapsidación subsiguiente de los complejos de ribonucleoproteína (RNPs) (que contienen las tres subunidades PA, PB1 y PB2 de polimerasa, así como la nucleoproteína, NP) en las VLPs son logradas. Un segundo recombinante del baculovirus cuádruple fue generado (Figura 14) que expresó simultáneamente en las células de insecto Sf9 las tres subunidades de polimerasa y NP . Para evaluar la formación y encapsidación de RNP, se sintetizó un molde de ARN de sentido negativo in vitro que codifica la luciferasa en una orientación anti-sentido, flanqueado por las regiones conservadas y no codificantes 3' y 5' de las terminales de NP del virus de influenza. La transfección de las células de insecto Sf9 con el ARN generado in vitro y la co-infección subsiguiente con Q28 y el segundo recombinante cuádruple condujo . al montaje y liberación de las VLPs que llevaron el gen reportero así como la polimerasa y NP. Los sobrenadantes concentrados de las células Sf9 transfectadas/infectadas fueron transferidas a una monocopa de células de riñon del hámster bebé (BHK) , incubadas, y las células alteradas con un amortiguador de la lisis del ensayo de luciferasa. Los Usados de las células infectadas registraron una actividad de la luciferasa de 70-700 veces de aquella de las células de control no infectadas (Figura 15) . De manera semejante, para evaluar la formación y encapsidación de RNP, se sintetizó un molde de ARN de sentido negativo in vitro que codifica la proteina de fluorescencia verde (GFP) en la orientación anti-sentido, flanqueada por las regiones conservada y no codificante 3' y 5' de las terminales de NP del virus de la influenza. La transfección de las células de insecto de Sf9 con el ARN generado in vitro y la co-infección subsiguiente con Q28 y el segundo recombinante cuádruple condujo al montaje y liberación de las VLPs que llevan el gen reportero asi como la polimerasa y NP. Cuando los sobrenadantes concentrados de las células SF9 transfectadas/infectadas fueron transferidos a una monocapa de células MDCK, la expresión de GFP fue detectada (Figura 16) . Estos resultados indican que las partículas derivadas del baculovirus fueron capaces de encapsidar los RNPs, los cuales fueron funcionales en la transcripción primaria, como es demostrado por la expresión de la luciferasa y GFP. Así, las VLPs son capaces de montar y empacar los RNPs, así como incorporar y expresar adicionalmente una secuencia de nucleótido heterologa. Tal secuencia heterologa expresada incluye, pero no está limitada a una porción heterologa no producida por el virus de influenza, incluyendo un péptido, polipéptido o proteina de un microorganismo patógeno diferente de la influenza, como se describe posteriormente. Tal secuencia heterologa expresada incluye además un modulador inmune para incrementar y/o desplazar la respuesta inmune. Tales modulares inmune incluyen, pero no están limitados a, IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA) y GM-CSF ( Immunex Corp., Seattle, WA) . Las secuencias heterólogas expresadas todavía adicionalmente incluyen anticuerpos monoclonales los cuales sirven como porciones de tratamiento y/o de ubicación como ob etivo. Las VLPs de esta invención son utilizadas para formular composiciones inmunogénicas o farmacéuticas. Para hacerlo así, las VLPs son ajustadas a una concentración apropiada y formuladas con cualquier adyuvante, diluyente o portador, adecuado. Los medios aceptables fisiológicamente pueden ser utilizados como portadores y/o diluyentes. Estos incluyen, pero no están limitados a: agua, un medio isotónico apropiado, glicerol, etanol y otros solventes convencionales, solución salada amortiguada con fosfato y semejantes. Los adyuvantes adecuados incluyen, pero no están limitados a fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, MPL™ (lípido A de monofosforilo 3-0-desacetilado; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT, ahora Corixa) , análogos del lípido A sintético tales como 529 (Corixa) , Stimulon™ QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, MA) , IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA) , polinucleótidos sintéticos tales como los oligonucleótidos que contienen una porción CpG (Patente U.S. No. 6,207,646 (28)), la toxina lábil con calentamiento de E. coli, y la toxina del cólera (ya sea en una forma mutante o del tipo silvestre, por ejemplo, en donde el ácido glutámico en la posición 29 del aminoácido es reemplazada por otro aminoácido, preferentemente una histidina, de acuerdo con la solicitud de Patente Internacional publicada Número WO 00/18434 (29)). En una modalidad de esta invención, la formulación que incluye las VLPs está propuesta para su uso como una composición inmunogénica . El virus puede ser mezclado con aditivos o estabilizadores crioprotectores tales como proteínas (por ejemplo, albúmina, gelatina), azúcares (por ejemplo, sucrosa, lactosa, sorbitol) , aminoácidos (por ejemplo, glutamato de sodio), solución salada, u otros agentes protectores. Esta mezcla es mantenida en un estado líquido, o es desecada o liofilizada entonces para transporte y almacenamiento y mezclada con agua inmediatamente previo a su administración. Las formulaciones que comprenden las VLPs que contienen solamente proteínas estructurales del virus de influenza son útiles para inmunizar a un ser humano u otro sujeto vertebrado para inducir protección contra la infección provocada por el virus de influenza. Así, esta invención proporciona además un método de inmunización de un sujeto para inducir la protección contra la infección provocada por el virus de influenza por la administración al sujeto de una cantidad de inmunización efectiva de una formulación de la composición inmunogénica que incorpora las VLPs que contienen solamente las proteínas estructurales del virus de influenza, generadas como se describió aquí anteriormente. Las formulaciones que comprenden las VLPs que contienen glicoproteínas superficiales de diferentes subtipos del virus de influenza, tales como HA de un subtipo y NA de un subtipo diferente, son formuladas con un diluyente o portador como una composición inmunogénica bivalente para inmunizar a los vertebrados contra la infección provocada por aquellos dos subtipos del virus de la influenza. Como se describió anteriormente, cada una de HA y NA pueden ser reemplazadas cuando las variantes antigénicas sean identificadas. Así, las VLPs quiméricas actualizadas son construidas fácilmente de acuerdo con los métodos descritos aquí . Alternativamente, las composiciones inmunogénicas multivalentes son preparadas generando un conjunto de VLPs de cada cepa de influenza de interés, mezclando los conjuntos de VLPs en las relaciones apropiadas, y administrando la composición inmunogénica resultante. Las formulaciones de esta invención también comprenden VLPs en donde una porción o la totalidad de HA o NA es reemplazada por una porción heteróloga no producida por el virus de influenza, para que comprenda VLPs quiméricas. Tales porciones incluyen, pero no están limitadas a, un péptido, polipéptido o proteina. En donde solamente una porción de HA o NA va a ser reemplazada, una porción de la secuencia de ADN en la molécula de ADN recombinante la cual codifica HA o NA, es reemplazada por una secuencia de ADN la cual codifica el péptido, polipéptido o proteina diferente de la influenza. En donde HA o NA completa va a ser reemplazada, la secuencia de ADN completa en la molécula de ADN recombinante que codifica HA o NA está reemplazada por una secuencia de ADN que codifica el péptido, polipéptido o proteina diferente de la influenza. Alternativamente, una porción heteróloga como se describió anteriormente la cual no es producida por el virus de influenza (o un segmento del virus de influenza tal como aquel que codifica NP) es incorporada dentro de las VLPs. Esto es logrado por co-infección, co-transfección o co-transformación de otra manera de una célula huésped adecuada con: (a) una o más moléculas de ADN recombinante las cuales codifican cada una de al menos una proteína estructural del virus de influenza, en donde la molécula de ADN recombinante que codifica MI es construida siempre, y (b) una molécula de ADN recombinante la cual codifica la porción heterologa (o el segmento del virus de influenza) , cultivando la célula huésped bajo condiciones las cuales permitan la expresión de al menos una proteína estructural del virus de influenza, de modo que las VLPs sean montadas dentro de las células después de la expresión de al menos una proteina estructural del virus de influenza, y purificar las VLPs a partir del sobrenadante del cultivo. La porción heterologa (o proteína de influenza) es incorporada dentro de las VLPs. En donde tal péptido, polipéptido o proteína diferente de la influenza es de un microorganismos patógeno, las VLPs quiméricas resultantes son formuladas con un diluyente o portador como una composición inmunogénica para inmunizar a los vertebrados contra la infección provocada por este microorganismo patógeno (así como el virus de influenza) . Más típicamente, la VLP quimérica incluye un antígeno superficial de un microorganismo patógeno diferente de la influenza Tales microorganismos patógenos diferentes de la influenza incluyen, pero no están limitados a, aquellos de los virus, bacterias, hongos o microorganismos parásitos los cuales infectan a los vertebrados humanos y no humanos. Otros tipos de porciones diferentes de la influenza incluyen, pero no están limitadas a, aquellas de las células del cáncer o células del tumor, anticuerpos monoclonales (utilizados, por ejemplo, como porciones de tratamiento y/o de ubicación como objetivo) , alérgenos, proteina del péptido amiloide, u otros componentes macromoleculares. Los ejemplos de tales virus incluyen, pero no están limitados a, virus de inmunodeficiencia humana, virus de inmunodeficiencia del Simio, virus sincitial respiratorio, tipos 1-3 del virus de Parainfluenza, virus del Herpes simple, citomegalovirus humano, virus de la Hepatitis A, virus de la Hepatitis B, virus de la hepatitis C, papilomavirus humano, poliovirus, rotavirus, calicivirus, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de Rubéola, adenovirus, virus de la rabia, virus del moquillo canino, virus de rinderpest, coronavirus, parvovirus, virus de la rinotraqueitis infecciosa, virus de leucemia felina, virus de peritonitis infecciosa de los felinos, virus de la enfermedad bursal infecciosa de las aves, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la enfermedad de Marek, virus del síndrome reproductor y respiratorio de los porcinos, virus de la arteritis equina y varios virus de Encefalitis. Los ejemplos de tales bacterias incluyen, pero no están limitados a, Haemophilus influenzae (tanto de tipo conocido como desconocido) , Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis , Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyrogenes , Streptococcus agalactiaer Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrhoeae , Chlamydia trachomatisr Chlamydia penumoniae, Chlamydia psittaci , Bordetella pertussis, Salmonella typhi , Salmonella typhymurium, Salmonella choleraesuis , Escherichia colir Shigella , Vibrio cholerae , Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis , complejo de Mycobacterium avium-Mycobacterium intracellulare, Proteus mirabilis , Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani , Leptospira interrogans , Borrelia burgdorferi , Pasteurella haemolytica , Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae y Mycoplasma gallisepticum. Los ejemplos de tales hongos incluyen, pero no están limitados a, Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidiodes , Cryptococcus e Histoplasma . Los ejemplos de tales parásitos incluyen, pero no están limitados a, Leishmania major, Ascaris, Trichurisr Giardia r Schistcsoma r Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii y Penumocystis carinii. Los ejemplos de tales células del cáncer o células de tumor incluyen, pero no están limitados a, antigeno especifico de la próstata, antigeno carcmo-embriónico, MUC-1, Her2, CA-125 y MAGE-3. Los ejemplos de tales alérgenos incluyen, pero no están limitados a, aquellos descritos en la Patente de los Estados Unidos de América No. 5,830,877 (30) y Solicitud de Patente Internacional publicada Número WO 99/51259 (31) las cuales son incorporadas aquí para referencia, e incluyen polen, venenos de insecto, caspa de los animales, esporas fungosas y fármacos (tales como penicilina) . Tales componentes interfieren con la producción de anticuerpos de IgE, una causa conocida de reacciones alérgicas. La proteina del péptido amiloide (APP) ha sido implicada en enfermedades referidas de manera variable como la enfermedad de Alzheimer, amiloidosis y enfermedad amiloidogénica . El péptido ß-amiloide (también referido como el péptido ?ß) es un fragmento de 42 aminoácidos de APP, el cual es generado por el procesamiento de APP por las enzimas de ß y ? secretasa, y tiene la siguiente secuencia: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala (SEC ID NO : 2 ) . En algunos pacientes, el depósito amiloide toma la forma de un péptido ?ß agregado. Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que la administración del péptido ?ß aislado induce una respuesta inmune contra el componente del péptido ?ß de un depósito amiloide en un huésped vertebrado (32) . Tales péptidos ?ß también tienen una conexión con las porciones no relacionadas. Asi, las VLPs de esta invención incluyen la 'expresión de este péptido ?ß en lugar de una porción o la totalidad de HA o NA del virus de influenza, asi como fragmentos del péptido ?ß y anticuerpos para el péptido ?ß o fragmentos de los mismos. Uno de tales fragmentos del péptido ?ß es el péptido de 28 aminoácidos que tiene la siguiente secuencia (33) : Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (SEC ID NO : 3) . Una cantidad suficiente de una composición inmunogénica descrita anteriormente en un número apropiado de dosis es administrada al sujeto para producir una respuesta inmune. Las personas expertas en el arte serán capaces fácilmente de determinar tales cantidades y dosificaciones. La administración puede ser por cualquier forma efectiva convencional, tal como la aplicada intranasal, parenteral, oral, o tópicamente a cualquier superficie de la mucosa tal como una superficie intranasal, oral, de los ojos, pulmones, vaginal o rectal, tal como por una solución para rociado en aerosol. El medio preferido de administración es por administración intranasal. Tal péptido, polipéptido o proteina diferente de la influenza también puede ser una porción activa farmacéuticamente. Tales porciones incluyen, pero no están limitadas a, proteínas terapéuticas, factores de crecimiento, moduladores inmune, anticuerpos monoclonales , así como las porciones listadas anteriormente con respecto a las composiciones inmunogénicas . Estas VLPs quiméricas son formuladas con un portador o diluyente como se describió anteriormente como una composición farmacéutica y administradas en una cantidad efectiva para el tratamiento de vertebrados con tal péptido, polipéptido o proteína diferente de la influenza. Una cantidad efectiva es determinada fácilmente por las personas expertas en el arte. Las composiciones farmacéuticas anteriores pueden comprender además un adyuvante como se describió anteriormente. Tal péptido, polipéptido o proteína diferente de la influenza también puede ser un receptor o ligando útil en los estudios de receptor-ligando. Por ejemplo, una glicoproteína diferente- de la influenza está incluida en las VLPs las cuales son ubicadas como objetivo para un receptor específico. En la totalidad de estas composiciones inmunogénicas o farmacéuticas, las VLPs son capaces de inducir una respuesta inmune cuando son administradas a un huésped de vertebrado, pero no son capaces de provocar síntomas de enfermedad a causa de que las VLPs no contienen material genético y no se pueden replicar en el sujeto vertebrado. Todas las patentes y publicaciones citadas aquí son incorporadas por el presente para referencia. Para que esta invención pueda ser mejor entendida, se describen los siguientes ejemplos. Los ejemplos son con el propósito de ilustración solamente y no van a ser interpretados como limitativos del alcance de la invención.

E emplos Ejemplo 1 Clonación del Gen M2 de Influenza en al Vector de la Transferencia pAcAB4 del Baculovirus El gen M2 de influenza, el cual es un producto empalmado del ARNm de MI, fue aislado por RT-PCR del ARNm poliadenilado extraído de las células MDCK las cuales han sido infectadas con la cepa A/Udorn/72 (H3N2) de la influenza. El gen M2 fue clonado como un inserto de ADN en un vector pGemT (Promega) y secuenciado con los cebadores específicos utilizando una reacción de secuenciación de terminación con teñido y un Secuenciador ABI 377 DNA automático (Applied Biosystems) . El gen M2 fue liberado del plásmido pGemT-M2 por digestión con la enzima de restricción EagI y preparado para clonación en el vector de transferencia del baculovirus pAcAB4 (PharMingen) . Los fragmentos de M2-ADN fueron llenados con la ADN polimerasa (fragmento de Klenow) y los enlazadores BglII fueron incorporados en las terminales por ligación con la T4 ADN ligasa. Todas las enzimas y enlazadores fueron obtenidos de New England Biolabs (NEB) . El vector de transferencia pAcAB4 fue digerido entonces con BglII y tratado con fosfatasa alcalina intestinal de ternero (CIP) . El inserto de M2 fue purificado entonces con un gel (Qiagen) y ligado en el vector de transferencia a una proporción 3:1. Un clon positivo fue seleccionado por el análisis de restricción y el ADN del plásmido fue preparado a partir de 100 mi de un cultivo de E. coli utilizando kits de purificación Qiagen Plasmid. Esta construcción será referida ahora como pAcAB4/M2.

Ejemplo 2 Construcción de un Vector Intermedio ("de transferencia" ) Debido a las limitaciones en el número de sitios de restricción convenientes para clonar los genes de influenza en el vector de transferencia de pAcAB4, un vector de clonación de transferencia fue generado llevando tres promotores de baculovirus (dos de polihedrina y uno de plO) flanqueado por nuevos sitios de restricción que fueron agregados por PCR. Este vector de transferencia fue construido como sigue: pAcAB4M2 (del Ejemplo 1) fue digerido con Smal y dividido en dos muestras. Una muestra de pAcAB4/M2 fue digerida con Xbal, la cual liberó un fragmento de ADN de 400 nucleótidos de longitud. Este ADN fue purificado con un gel y amplificado por PCR con dos cebadores, uno de los cuales incorporó en un extremo del producto final los sitios Pmel (cursivas) y otl (subrayado) : 5' GTTTAAACGCGGCCGCCGTATTTATAGGTTTTTTTATTA 3' (SEC ID NO: 4) 5' TTTTATTACTAGTCCCGGGGATCTGTGATTGTAAAT 3' (SEC ID NO: 5) . La otra muestra de pAcAB /M2-5maI fue digerida con BamEI, y el fragmento de ADN de Smal/BamEI liberado fue purificado con un gel y también amplificado por PCR con dos cebadores, uno de los cuales incorporó en el producto de PCR final los sitios SacI (cursivas) y Miel (subrayado) : 5' AAGAGCTCGCTAGCGTATTTATAGGTTTTTTTATTA 3' (SEC ID NO: 6) 5' ACAATCACAGATCCCCGGGACTAGTAATAAAACC AGA 3' (SEC ID NO: 7) . Estos dos productos de PCR, los cuales se superponen en las terminales no modificadas, fueron utilizados en otra reacción de PCR con dos cebadores externos específicos para los sitios de la enzima de restricción incorporados recientemente: 5' GTTTAAACGCGGCCGCCG 3' (SEC ID NO: 8) 5' AAGAGCTCGCTAGCGTA 3' (SEC ID NO: 9) . Este ADN de PCR fue digerido entonces con SacI/Pmel . El plásmido pNEB193 (Promega) también fue digerido con SacI/ Pmel y ligado con el ADN digerido por PCR con la T4 ligasa.

Finalmente, este vector de transferencia de pNEB193 resultante lleva un fragmento de ADN que contiene dos promotores de polihedrina y un promotor de plO flanqueado por los nuevos sitios de restricción que son utilizados en la clonación subsiguiente de los genes HA, NA, y MI de la influenza .

Ejemplo 3 Clonación de los Genes HA, NA y MI de la Influenza en el Vector de Transferencia Los genes HA, NA, y de la matriz (MI) de la influenza fueron recuperados por RT-PCR del ARN genómico purificado de A/Udorn/72 (H3N2) del virus de influenza. La totalidad de los tres genes fueron clonados como insertos de ADN en los vectores pGemT o pGemTeasy (Promega) y secuenciados con los cebadores específicos utilizando una reacción de secuenciación de terminación con teñido y un secuenciador ABI 377 DNA automático. Los dos sitios de empalme del donador en el extremo 5' del gen MI fueron mutados utilizando un Kit QuikChange de Stratagene (empalme pGT-Ml) para prevenir el empalme potencial del ARNm de MI en las células huésped. Estos tres clones fueron clonados en el vector de transferencia en tres etapas: 1) Clonación del gen MI: El plásmido pGemT/ l (de empalme) (pGemT que lleva el gen MI) fue utilizado como el molde en una reacción de PCR con los cebadores 5' y 3' que introdujeron un sitio 'Miel y un sitio SacI, respectivamente, en el ADN amplificado. Este PCR ADN fue digerido entonces con Nhel/SacI y purificado con un gel. De manera semejante, el vector de transferencia pNEB193 fue digerido con Nhel/SacI y purificado. El vector de transferencia y el inserto (MI PCR) fueron ligados y amplificados en E. colí a continuación de la transíección . El gen MI fue secuenciado utilizando BigDye (Perkin Elmer) . El gen MI fue colocado en la dirección 3' desde el promotor de polihedrina. El plásmido resultante fue llamado pNEB193Ml. 2) Clonación del gen HA: El plásmido pGemT/HA (pGemT que lleva el gen HA) fue digerido con SacII y llenado en los extremos. Los enlazadores Notl fueron ligados sobre el ADN digerido. El ADN fue digerido entonces con otl de modo que el inserto de HA pudiera ser liberado y tiene sitios Notl sobre cada extremo. El plásmido ????193?1 fue digerido con Notl, tratado con fosfatasa intestinal de ternero (CIP) y el inserto HA fue ligado en el mismo con T4 ADN ligasa (no direccional) . La PCR fue utilizada para determinar la orientación del gen HA, la cual está bajo el control transcripcional del promotor de polihedrina. El plásmido resultante fue llamado pNEB193Ml/HA. 3) Clonación del gen NA: El plásmido pGemT/NA3B (pGemT que lleva el gen NA) fue digerido primero con SacII y llenado en los extremos con T4 ADN polimerasa. Subsiguientemente, el gen NA fue liberado por digestión con Spel y llenado con Klenow, y el inserto de NA fue ligado en los extremos romos. A continuación, el PNEB193M1/HA fue digerido con Smal, y el inserto de NA fue ligado en los extremos romos. Se utilizó la PCR para identificar el clon que llevó el gen de NA en la orientación correcta. El gen NA fue colocado en la dirección 3' desde el promotor plO. El plásmido resultante fue llamado PNEB193M1 /HA/NA.

Ejemplo 4 Construcción de un Vector de Transferencia que Contiene los Genes M2, MI, HA y NA de la Influenza Después que se complementa el proceso descrito en el Ejemplo 3, el vector de transferencia pNEBl 93M1 /HA/NA contuvo los genes MI, HA, y NA colocados bajo el control de la regulación de la transcripción de los promotores del baculovirus . Para liberar estos tres genes como una pieza única del ADN, el vector de transferencia fue digerido con Pmel/Sacl. Este fragmento de ADN fue ligado en pAcAB4M2 del' Ejemplo 1 (que ya contenia el gen M2), el cual ha sido modificado como sigue: Nuevas enzimas de restricción fueron introducidas en pAcAB4/M2 para facilitar la clonación del fragmento de ADN que contiene tres genes del vector de transferencia. Este plásmido pAcAB4/M2 fue digerido entonces con Xbal, terminales llenadas con la ADN polimerasa (fragmento de Kleno ) y los enlazadores de P el agregados con la T4 ADN ligasa. Este ADN fue digerido entonces con Pmel y religados para regenerar el sitio Pmel. De manera semejante, el plásmido religado fue digerido con BamEI, llenado con ADN Polimerasa (Klenow) y los enlazadore SacI fueron fijados con la T4 ligasa. La digestión subsiguiente con SacI y la ligación restablecieron el- sitio de SacI. El vector de pAcAB4/M2 resultante tiene dos nuevos sitios Pmel y SacI. El vector fue preparado para la inserción de genes de influenza adicionales por la digestión con Pmel/ SacI y purificación con un gel. Todas las uniones fueron secuenciadas para asegurarse que ninguna de las mutaciones fuera introducida durante la clonación de pNEB193. La construcción resultante fue designada HA/Q (véase la Figura 1), la cual es un vector de transferencia que lleva cuatro genes de influenza (pAcAB4/M2 /MI /HA/NA) .

Ejemplo 5 Generación de Vectores de Transferencia Quiméricos La secuencia de codificación para la proteína G de VSV fue recuperada del VSV por RT-PCR del ARN viral con los cebadores específicos para los extremos 3' y 5' del gen G (5' AACAGAGATCGATCTGT 3' (SEC ID NO: 10) y 5' CATAAAAATTAAAAATTAAAATATAATTAAGG 3' (SEC ID NO: 11)) y se clonó en el plásmido pGemT (Promega) . El clon de pGemT-VSV resultante fue digerido con SacII y los extremos con las partes romas se llenaron con T4 ADN polimerasa. El mismo se digerió entonces con Spel y se llenaron los extremos .con Klenow. Los enlazadores Notl fueron agregados con T4 ligasa y luego se volvieron a digerir con Notl . Subsiguientemente, la secuencia de codificación de VSV G se ligó en el ^vector Q28 el cual ha sido digerido con otl para remover el gen HA. La orientación del gen fue confirmada por PCR y secuenciamiento . Esta construcción fue designada el vector de transferencia VSV-G. En una modalidad alternativa, solamente una porción del gen VSV fue insertada. Un gen quimérico (véase la Figura 2) que contiene el ectodominio de la proteina G fusionada en el mismo marco que los dominios de la transmembrana (29 aminoácidos) y citoplásmico (14 aminoácidos) de HA fueron generados por PCR como sigue: El dominio de la transmembrana y el extremo posterior citoplásmico del gen HA de la influenza fueron amplificados a partir del clon pGemT-HA por PCR y se purificó con un gel. El ectodominio del gen G de VSV también fue amplificado por PCR y purificado con un gel. Ambos de estos fragmentos de ADN fueron utilizados como moldes en una reacción de PCR con la Pfu ADN polimerasa (Stratagene, LaJolla, CA) utilizando un cebador que corresponde al extremo 5' del gen G de VSV y el extremo 3' del gen HA. Un fragmento de ADN de 1620 pb fue purificado con un gel y los enlazadores Notl fueron agregados con la T4 ligasa, seguido por digestión con Notl . Este inserto fue ligado en el vector HA/Q que ha sido digerido con Notl para remover el gen HA. La construcción resultante generó el vector de transferencia VSV-G/HA (quimera) .

Ejemplo 6 Transfección de los Recombinantes del Baculovirus Cuádruples en las Células de Insectos Las células Sf9 (ATCC CRL 1711) fueron sembradas en discos de 60 nrai a una densidad de 2 x 106 células por disco. Aproximadamente 2 µg del vector de transferencia HA/Q fueron mezclados con 0.5 µg de ADN BaculoGold linearizado (Pharmingen) y las células Sf9 fueron transfectadas con el ADN utilizando el Kit de Transfección BaculoGold (Pharmingen) . Los baculovirus recombinantes fueron seleccionados y purificados por tres rondas de purificación de la placa. Uno de tales recombinantes purificados de la placa fue designado HA/Q28 y fue seleccionado para estudios adicionales.

Además, el ADN del vector de transferencia cuádruple que lleva un VSV-G de longitud completa o un VSV-G/HA (quimera) fue transfectado con el ADN de BaculoGold linearizado en las células Sf9 como se describió anteriormente para generar los recombinantes VSV-G/Q y VSV-G/HA/Q. Los virus recombinantes fueron seleccionados como se describió anteriormente para HA/Q28. Todos los recombinantes fueron amplificados en células Sf9 hasta una concentración de 7xl07 pfu/ml.

Ejemplo 7 Crecimiento de las Células de Insecto Sf9 e Infección con Recombinantes de Baculovirus Todos los cultivos de células Sf9 se hicieron crecer en suspensión en el medio libre de suero. Las infecciones con recombinantes de baculovirus fueron llevadas a cabo en una multiplicidad de sitios de infección ( OI) de 5. Los virus recombinantes fueron inoculados en las monocapas de las células en un volumen pequeño, se permitió que se adsorban durante durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego se incuban a 28 °C después de agregar el medio fresco libre del suero. Las células y el medio de cultivo fueron colectados 72 horas después de la infección, a menos que se especifique de otra manera, y utilizados para el análisis subsiguiente de la expresión de las proteínas y la formación de VLPs.

Ejemplo 8 Clonación de los Genes de Influenza Unicos en el Vector de Transferencia pBlueBac4.5 y Generación de Recombinantes de Baculovirus Unicos El gen MI de A/Udorn de influenza fue clonado previamente en pGemT (empalme pGT-Ml, véase el Ejemplo 1 anterior) . Para subclonar el gen MI, pGT-Ml fue digerido con SacII, los extremos se hicieron romos con T4 ADN polimerasa, y los enlazadores Sacl fueron agregados a los extremos con T4 ligasa. El plásmido fue digerido entonces con Sacl/ Salí y el MI liberado fue purificado con un gel. El inserto fue ligado en pBlueBac4.5 ( Invitrogen) , el cual ha sido digerido con Sacl/Salí, y las células DHoc5 fueron transformadas con la mezcla de ligación. Para subclonar el gen HA en el pBlueBac4.5, el pGemT/HA (véase el Ejemplo 3 anterior) fue digerido con SacII y los extremos se hicieron romos con T4 ADN Polimerasa. El ADN fue redigerido entonces con Salí para remover el inserto y se purificó con un gel. El inserto de HA fue ligado en pBlueBac4.5 digerido con Sal/Nhel (de extremos romos), y las células de E. coli competentes de STBL2 fueron transformadas con la mezcla de ligación.

El pGemT-NA (véase el Ejemplo 3 anterior) fue digerido con SacII y los extremos se hicieron romos con T4 ADN Polimersasa. Este ADN fue ligado entonces con Spel y se purificó con un gel. El inserto fue ligado en un vector pBlueBac4.5 que ha sido digerido con Nhel/Smal, y J.as células de E. coli competentes de STBL2 fueron transformadas. Cuando el ADN del vector de transferencia se encontró que va a ser correcto por secuenciación, las células Sf9 fueron transfectadas con 5 µg de cada clon de pBlueBac y 10 µg de ADN Bac & Blue (Invitrogen) . Las células Sf9 fueron cotransfectadas con estos ADNs por transfección mediada por liposomas. Las células fueron incubadas durante cinco días y el sobrenadante fue purificado en la placa. Las placas azules únicas se hicieron crecer y se amplificaron en las células Sf9 y la expresión de la proteina fue evaluada por Transferencias de Western. El recombinante de baculovirus de NP (que contiene el gen NP de la influenza) utilizado en este trabajo fue construido como se describió por Galarza et al. (27) .

Ejemplo 9 Análisis de Inmunotransferencia El análisis por transferencia de Western se utilizó para identificar las proteínas en las células Sf9 infectadas, los sobrenadantes concentrados y las fracciones del gradiente. Las muestras fueron resueltas sobre un gel de SDS-PAGE al 10% (a menos que se especifique de otra manera) y se transfirieron sobre una membrana de nitrocelulosa . Las transferencias fueron bloqueadas en una solución de TBS (solución salada amortiguada con tris) que contiene 5% de leche seca no grasosa al 5% y 0.1% de Tween 20, y subsiguientemente se sondeó con una mezcla de anticuerpos monoclonales para las proteínas HA, MI (matriz) y M2 de influenza. El anti-HA monoclonal del ratón (clon 12CA5) fue obtenido de Roche Molecular Biochemicals ( Indianapolis, IN) . El anti-Ml monoclonal de ratón (clon GA2B) fue de Serotec (Raleigh, NC) . El anti-M2 monoclonal del ratón fue de Mt. Sinai Hybridoma Center (New York, NY) . Los antígenos fueron visualizados sobre las transferencias de Western con un anticuerpo - secundario de IgG anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina (Promega) . El análisis de la formación de VLP en las células Sf9 infectadas con una combinación sencilla, doble o triple de los recombinantes del . baculovirus del gen único se llevó a cabo de un modo semejante. El análisis de las muestras que contienen la proteína G de VSV fueron sondeadas con un anticuerpo anti-G monoclonal de ratón (clon P5D4; Roche Molecular Biochemicals) en combinación con los anticuerpos para las proteínas MI y M2 de la influenza. Los resultados son mostrados en la Figura 3.

Ejemplo 10 Inmunofluorescencia de las Células de Sf9 Infectadas Las células Sf9 se hicieron crecer en ocho cámaras cuadradas (cultivos en cajas) y se infectaron con recombinantes de baculovirus del gen único o cuádruples en un MOI de 1. A las 72 horas después de la infección, las cajas individuales de las células Sf9 fueron fijadas ya sea en metanol/acetona (2:1) o 3% de paraformaldehido . Como una etapa de bloqueo, las células fijas fueron incubadas durante 30 minutos a temperatura ambiente en solución salada amortiguada con fosfato (PBS) que contiene 3% de albúmina del suero de bovino (BSA) . Subsiguientemente, cada portaobjetos se incubó subsiguientemente con una solución de anticuerpos primarios y secundarios. Una combinación de anticuerpos anti-HA de rata (Roche Molecular Biochemicals ) /anticuerpos monoclonales anti-Ml de ratón (véase el Ejemplo 9) (como una dilución 1:100, primaria) y una combinación de anticuerpos conjugados de rodamina anti-rata de cabra (Molecular Probes)/ conjugados de FITC anti-ratón de oveja (Sigma) (como dilución secundaria) , fue utilizada para examinar la expresión de HA y MI. Una combinación de péptidos anti-NA de conej o/anti-HA monoclonales de la rata (hecha de la manera acostumbrada por Research Genetics) (como una dilución 1:100, primaria) y anticuerpos conjugados de rodamina anti-rata de cabra (Molecular Probes ) /conj ugados de FITC anti-conejo de oveja (Sigma) (como solución secundaria) se utilizaron para examinar la expresión de NA y HA. Como una alternativa a la rodamina, se puede utilizar un anticuerpo anti-rata de cabra conjugado con Cy3 (Sigma) . Cada reacción del anticuerpo fue incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente y, entre las etapas, los portaobjetos fueron enjuagados tres veces con PBS. Las moléculas de FITC y rodamina emitieron luces verde y roja respectivamente cuando se excitaron a longitudes de onda de 495 nm y 552 nm, las cuales fueron discriminadas con los filtros apropiados. Los resultados de los análisis de inmunofluorescencia se muestran en las Figuras 4-7.

Ejemplo 11 Purificación de VLPs de Influenza Las células Sf9 fueron sembradas a una densidad de 7.5 x 107 células por 150 cm2 del recipiente de cultivo del tejido y se dejó sedimentar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Las células fueron infectadas con los recombinantes del baculovirus (quimera de HA/Q28, VSV-G/Q, VSV-G/HA/Q o el recombinante único) en un MOI de 5 y la infección se dejó proceder durante 72 horas a 28 °C. Cuando se complementa, el medio de cultivo fue colectado y se sometió a centrifugación de velocidad baja (30 minutos a 4 °C y 2000 x g) . El sobrenadante fue convertido entonces en pelotillas por centrifugación a 200000 x g durante 90 minutos. Dependiendo del número de células identificadas inicialmente, las pelotillas resultantes fueron resuspendidas en 50 µ? o 500 µ? de IX PBS, se homogeneizaron por una sonicación breve y luego se cargaron sobre la parte superior de un gradiente de Iodixanol (Optiprep, Nycomed/Sigma) (densidad de 1.08g/ml a 1.32 g/ml) . El gradiente fue centrifugado a 200000 x g durante 3.5 horas y las fracciones fueron colectadas por gravedad desde el fondo del tubo utilizando un tubo micro-capilar con forma de U. Las alícuotas de estas fracciones fueron analizadas por transferencia de Western después de SDS-PAGE. Las transferencias de Western son mostradas en las Figuras 8 y 9. Para purificar adicionalmente las partículas, las fracciones que contienen las VLPs fueron sometidas a una centrifugación con un segundo gradiente de sucrosa. Para la centrifugación del gradiente de equilibrio de sucrosa, la fracción seleccionada previamente fue dializada con PBS y se estratificó sobre un gradiente de sucrosa al 20-60% (peso/peso) (en NT) y se centrifugó durante 22 horas a 4 °C y 150000 X g. Después de la centrifugación, se colectaron fracciones de 0.5 mi desde el fondo del tubo, como se describió anteriormente, y se analizaron por transferencia de Western después de SDS-PAGE. Las fracciones que contienen las VLPs fueron examinadas por microscopía electrónica y etiquetación con immunogold (véase el ejemplo 12) .

Ejemplo 12 Microscopía Electrónica: Teñido Negativo y Etiquetación con Immunogold Para el teñido negativo y la etiquetación con immunogold, las VLPs fueron concentradas a partir del sobrenadante del cultivo y se purificaron por dos centrifugaciones de gradiente de densidad consecutiva (véase el 11). Las alícuotas de las muestras fueron colocadas sobre rejillas recubiertas con carbón/plástico de descarga luminiscente, recién hechas, lavadas suavemente con pocas gotas de agua destilada, teñidas negativamente con fosfotungstato de sodio al 2%, pH 6.5, y se observó con un microscopio electrónico. Una micrografía electrónica de las VLPs de influenza teñidas negativamente es mostrada en la Figura 10. Las muestras para la etiquetación con immunogold de los antígenos superficiales que decoran las VLPs fueron prefijadas en glutaraldehído al 0.5% durante cinco minutos, se colocaron sobre rejillas como se describió anteriormente y se lavaron con pocas gotas de agua destilada. Subsiguientemente, las mismas fueron incubadas secuencialmente con la cara para abajo sobre la parte superior de volúmenes de 100 µ? de las siguientes soluciones: los anticuerpos primarios se diluyeron en PBS-BSA al 1% durante 30 minutos; tres veces con PBS-BSA al 1% durante cinco minutos cada una; suspensión de esferas de oro recubiertas con anticuerpos contra IgG de ratón-diluidas en PBS/BSA al 1% (1:10) durante 30 minutos; tres veces con PBS-BSA al 1%, durante cinco minutos cada una. Finalmente, las mismas fueron lavadas con algunas gotas de agua destilada, teñidas con acetato de uranilo 2%, se secó con aire y se examinó en el microscopio electrónico. Las micrografias electrónicas de VLPs de influenza etiquetadas con immunogold con anticuerpos monoclonales anti-HA y anti-NA y contrateñidos con esferas de oro unidas al IgG antiratón son mostradas en la Figura 11.

E emplo 13 Incorporación de ucleoproteína de Influenza (NP) en VLPs Las células Sf9 fueron co-infectadas ya sea con HA/Q28 y NP o NP y recombinantes del baculovirus único de MI. Los sobrenadantes concentrados de las células coinfectadas fueron purificados de acuerdo con el Ejemplo 11. Una transferencia de Western de la fracción que contiene tanto HA como NP como se expresó por estas células co-infectadas es mostrada en la Figura 9B. Una transferencia de Western de la fracción que contiene NP y MI como se expresó por estas células co-infectadas es mostrada en la Figura 8C.

Ejemplo 14 Inmunogenicidad de VLPs en Ratones Dos grupos de ratones Balb/c (de 4-5 semanas de edad) fueron inmunizados por medio de la ruta intramuscular con ya sea las VLPs de HA/Q28 (aproximadamente 1 µg HA) o VLPs de VSV-G/Q (aproximadamente 1 µg G) , en donde cada conjunto de VLPs fue formulado con fosfato de aluminio (200 µg/dosis) . Todos los ratones en cada grupo recibieron una primera inyección y dos inyecciones de refuerzo en intervalos de dos semanas. Dos semanas después de la última inmunización, las muestras de sangre fueron obtenidas y se evaluó la presencia de anticuerpos contra el antigeno correspondiente por transferencia de Western (para ambos tipos de VLPs), la inhibición del ensayo de hemaglutinina (IHA) (para el HA/Q28) y una prueba de neutralización del suero (para VSV-G/Q) . Las transferencias de Western son mostradas en la Figura 12 (para HA/Q28) y la Figura 13 (para VSV-G/Q) . Las concentraciones de IHA fueron medidas en unidades IHA (IHAU) y fueron como sigue: ratones naturales: 32 IHAU* Control positivo: 128 IHAU [influenza A/Hong Kong] Sueros agrupados de HA/Q28 : 96 IHAU Los ratones naturales mostraron una concentración de inhibición, lo cual puede ser debido a aglutininas no especificas. Todas las muestras fueron tratadas con caolín y calentadas a 56 °C durante 30 minutos en un esfuerzo para inactivar los inhibidores no específicos y/o las aglutininas no específicas. Para la prueba de neutralización del suero, diluciones crecientes del suero de ratones inmunizados con VSV-G/Q fueron colocadas arriba de una monocapa de células que contiene VSV, incubadas y analizadas para verificar la capacidad para inhibir el virus, como se observa por la prevención de la formación de cualesquiera placas en la monocapa de las células. Se encontró que una dilución tan elevada como 1/64 de los sueros neutralizó completamente una concentración estándar de VSV (lxlO6 PFU/ml) .

Ejemplo 15 Empaque de Complejos de Ribonucleoproteína (RNPs) en VLPs de Influenza y Expresión de los Genes Reporteros Polimerasa ( Subur.idades PB1, PB2 y PA) y Construcción de Baculovirus NP (Recombinante del Vector de Transferencia Cuádruple Los tres genes que codifican las subunidades de la polimerasa (proteínas de PB1, PB2, y PA) y la nucleoproteína NP de la cepa A/Udorn/72 (H3N2) del virus A de la influenza fueron subclonados en un vector de transferencia del baculovirus único pAcAB4. Los genes de PB1 y PA fueron colocados sobre orientaciones opuestas bajo el control transcripcional del promotor de polihedrina del baculovirus, mientras que los genes PB2 y NP, también en orientaciones opuestas, estuvieron bajo el control transcripcional del promotor plO del baculovirus. La co-transfección de las células de insecto SF9 con el ADN del vector de transferencia purificado, el cual lleva los genes de polimerasa y NP, y el ADN del baculovirus genómico linearizado, permitió la recombinación homologa. Esto condujo a la transferencia de la polimerasa y los genes de NP en el ADN del baculovirus. Este caso de recombinación intracelular generó el recombinante del baculovirus cuádruple (Figura 14) que fue liberado hacia el medio de cultivo. Tres etapas consecutivas de amplificación/purificación de la placa fueron llevadas a cabo para seleccionar los recombinantes del vector de transferencia del baculovirus cuádruple. La PCR utilizando cebadores específicos del gen fue llevada a cabo para confirmar la presencia de los cuatro genes en los recombinantes cuádruples purificados. Los ensayos de transferencia de Western con anticuerpos policlonales específicos de anti-PBl, anti-PB2, anti-PA y anti-NP fueron efectuados para evaluar la expresión de las tres subunidades de polimerasa y NP (datos no mostrados) .

Construcciones del Gen Reportero Se generaron plásmidos de ADN los cuales contuvieron la luciferasa o los genes de la proteina de fluorescencia verde (GFP) flanqueados por las terminales 3' y 5' conservadas del virus de influenza. Estas secuencias son requeridas para la transcripción/replicación y el empaque del genoma de influenza en una infección del virus del tipo silvestre. Además de las secuencias conservadas, las terminales 3' y 5' precisas son esenciales para un genoma funcional. Para obtener estos fines precisos, un promotor T7 alterado fue agregado a la terminal 5' de la secuencia de influenza; después de esto, la transcripción con T7 ARN polimerasa generó terminales 5' de la influenza precisas en las transcripciones de ARN. Además, un sitio de restricción Bsal fue diseñado en el extremo 3' de la secuencia de influenza. La digestión del plásmido con esta enzima de restricción produjo los moldes del ADN con 5' colgante, el cual en las reacciones de transcripción de la T7 ARN polimerasa saliente, generaron moléculas de ARN con terminales 3' de influenza precisas. Estos genes reporteros de la influenza modelos fueron utilizados entonces para estudiar la actividad de polimerasa, la encapsidación de ARN, y el empaque del ARN en las partículas semejantes al virus de influenza .

Empaque de VLP del Gen Reportero de Luciferasa Las células de insecto Sf9 fueron infectadas simultáneamente (MOI : 5) con los recombinantes Q28 (HA, NA, MI, M2), y recombinantes del baculovirus del vector de transferencia cuádruple (PB1, PB2, PA, NP) . La infección se dejó que procediera durante 48 horas y en este instante, 30 ug de un ARN sintetizado in vitro que contiene el gen de luciferasa en orientación inversa flanqueado por las secuencias de las terminales 3' y 5' del genoma de influenza, fueron transfectados en las células Sf9 utilizando el reactivo de transfección de LT1 (Panvera, Madison, I) . Las células infectadas/transfectadas fueron incubadas durante unas 24 horas adicionales. El sobrenadante del cultivo fue colectado entonces, aclarado por centrifugación a velocidad baja, y las VLPs concentradas por centrifugación durante dos horas a 2000xg. Las VLPs fueron resuspendidas en el medio de cultivo y aplicadas sobre una nueva monocapa de células del riñon del hámster bebé (BHK) . Después de 48 horas de incubación, las células BHK fueron alteradas con el amortiguador de la lisis de ensayo de luciferasa, y la actividad de la luciferasa se midió en el extracto celular. La actividad basal de la luciferasa fue determinada en las células BHK no infectadas (control) utilizando un luminómetro y las lecturas variaron desde 50 hasta 500 unidade luminosas relativas (RLUs) . Los Usados de las células de BHK infectadas con VLP registraron una lectura de actividad de luciferasa de 36,000 RLUs (Figura 15).

Empaque de VLP del Gen Reportero de la Proteina Fluorescente Verde (GFP) Los experimentos de empaque semejantes de los RNPs en las VLPs, fueron efectuados utilizando el gen de proteina fluorescente verde (GFP) como un reportero. Las células de insecto de Sf9 fueron infectadas/transfectadas siguiendo los parámetros descritos anteriormente. Se construyeron moléculas de ARN transíectadas las cuales contuvieron la secuencia de codificación para el GFP en una orientación anti-sentido flanqueada por las terminales 3' y 5' del ARN viral de la influenza. Las células BHK y MDCK fueron infectadas durante 24 horas con VLPs y la expresión de GFP fue verificada entonces utilizando un microscopio Zeiss y filtros de isotiocianato de fluoresceina (FITC) . Un número pequeño de células verdes estuvo presente, sugiriendo que las VLPs fueron capaces de transferir el gen GFP, por lo cual conducen a la expresión de la proteina fluorescente verde (Figura 16) .

Bibliografía 1. Lamb, R.A., páginas 1-87 de The Influenza Viruses, R.M. Krug, ed. (Plenum Press, 1989) . 2. Lamb., R.A., et al, Cell, 40, 627-633 (1985) . 3. Martin, K., y Helenius, A., Cell, 67, 117-130 (1991) . 4. Shapiro, G.I., et al., J. Virology, 61, 764-773 (1987) . 5. Garoff, H., et al., Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62, 1171-1190 (1998) . 6. Nayak, D.P., ASM News, 62, 411-414 (1996) . 7. Justice, P.A., et al., J. Virol., 69, 3156-3160 (1995) . 8. Li, Y., et al., J. Virol., 67, 4415-4420 (1993) . 9. Mebatsion, T., et al., Cell, 84, 941-951 (1996) . 10. Coronel, E.C., et al., J. Virol., 73, 7035-7038 (1999) . 11. Zhao, H., et al., J. Gen. Virol., 79, 2435- 2446 (1998) . 12. Jin, H., EMBO J., 13, 5504-5515 (1994) . 13. Jin, H . , et al., EMBO J . , 16, 1236-1247 (1997) . 14. Zhang, J., et al., J. Virology, 74, 4634-4644 (2000) . 15. Ruigrok, R.W.H., et al., Virology, 267, 289-298 (2000) . 16. Roberts, P.C., et al . , Virology, 240, 127-137 (1998) . 17. Patente U.S. Número 5,298,244. 18. Kirnbauer, R., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA. , 89, 12180-12184 (1992) . 19. Loudon, P.T., y Roy, P., Virology, 180, 798-802 (1991) . 20. Rose, R.C., et al., J. Virology, 67, 1936-1944 (1993) . 21. Zeng, C.Q.-Y., et al., J. Virology, 70, 2736-2742 (1996) . 22. Gheysen, D., et al., Cell, 59, 103-112 (1989) . 23. Nermut, M.V., et al., Virology, 198, 288-296 (1994) . 24. Takahashi, H., et al., Virology, 256:371-380 (1999) . 25. Yamshchikov, G. V., et al., Virology, 214, 50- 58 (1995) . 26. Ford, T., et al., Analytical Biochem., 220, 360-366 (1994) . 27. Galarza, J.M., et al., Virus Res . , 24, 91-106 (1992) . 28. Patente U.S. Número 6,207,646. 29. Solicitud de Patente Internacional Publicada Número WO 00/18434. 30. Patente U.S. Número 5,830,877. 31. Solicitud de Patente Internacional Publicada Número WO 99/51259. 32. Solicitud de Patente Internacional Publicada Número WO 99/27944. 33. Patente U.S. Número 4,666,829.

Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS American Cyanamid Company <120> Conjunto de Partículas Quiméricas Semejantes al Virus de Influenza y del tipo silvestre <130> AM100288PCT <140> <141> <150> 60/213,656 <151> 23-06-2000 <150> 60/284,411 <151> 17-04-2001 <160> 11 <170> Patentln Ver. <210> 1 <211> 71 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : Quimera de las porciones de la proteina G del Virus Estomatitis Vesicular y proteina HA de influenza <400> 1 Gly Glu Thr Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro 1 5 10 15 lie Glu Phe Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Lys Ser 20 25 30 Gly Tyr Lys Asp Trp lie Leu Trp lie Ser Phe Ala lie Ser Cys 35 40 45 Phe Leu Leu Cys Val Val Leu Leu Gly Phe lie Met Trp Ala Cys 50 55 60 Gln Lys Gly Asn lie Arg Cys Asn lie Cys lie 65 70 <210> 2 <211> 42 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial .'Aminoácidos 1-42 de la proteina del péptido amiloide humano <400> 2 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln 1 5 10 15 Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala 20 25 30 lie lie Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val lie Ala 35 40 <210> 3 <211> 28 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial ¡Aminoácidos 1-28 de proteina del péptido amiloide humano <400> 3 Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln 1 5 10 15 Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Ser Asn Lys 20 25 <210> 4 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : Cebador <400> 4 gtttaaacgc ggccgccgta tttataggtt tttttatta 39 <210> 5 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : Cebador <400> 5 ttttattact agtcccgggg atctgtgatt gtaaat 36 <210> 6 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : Cebador <400> 6 aagagctcgc tagcgtattt ataggttttt ttatta 36 <210> 7 <211> 38 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : Cebador <400> 7 acaatcacag atccccggga ctagtaataa aacctaga 38 <210> <211> 18 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : Cebador <400> 8 gtttaaacgc ggccgccg 18 <210> 9 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : Cebador <400> 9 aagagctcgc tagcgta 17 <210> 10 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : Cebador <400> 10 aacagagatc gatctgt 17 <210> 11 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la Secuencia Artificial : Cebador <400> 11 cataaaaatt aaaaattaaa atataattaa gg 32

Claims

80
REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un método de producción de partículas semejantes al virus de influenza (VLPs), el método está caracterizado porque comprende las etapas de: (i) construir una o más moléculas de ADN recombinante las cuales codifican cada una al menos una proteína estructural del virus de influenza, en donde una molécula de ADN recombinante que codifica la proteína de la matriz (MI) es construida siempre; (ii) transfectar, infectar o transformar de otra manera una célula huésped adecuada con una ó más moléculas de ADN recombinante, cultivar la célula huésped bajo condiciones las cuales permitan la expresión de al menos una proteína estructural del virus de influenza, de modo que las VLPs sean montadas dentro de las células después de la expresión de al menos una proteína estructural del virus de influenza; y (iii) purificar las VLPs del sobrenadante del cultivo . 2. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque las VLPs comprenden el MI más al menos una de las proteínas estructurales de influenza seleccionadas 81 del grupo que consiste de hentaglutinina (HA) , neuraminidasa (NA) y M2.
3. El método de la Reivindicación 2, caracterizado porque HA y NA son de subtipos diferentes del virus de influenza.
4. El método de la Reivindicación 2, caracterizado porque una porción o la totalidad de la secuencia de ADN en la molécula de ADN recombinante que codifica el HA o NA es reemplazada por una secuencia de ADN la cual codifica una porción no producida por el virus de influenza, para producir VLPs quiméricas.
5. El método de la Reivindicación 4, caracterizado porque la secuencia de ADN en la molécula de ADN recombinante que codifica HA es reemplazada por una secuencia de ADN que codifica la proteína G del virus de estomatitis vesicular (VSV) .
6. El método de la Reivindicación 4, caracterizado porque la secuencia de ADN en una molécula de ADN recombinante codifica los dominios de la transmembrana y citoplásmico de HA, pero la región de codificación restante de HA es reemplazada por una secuencia de ADN que codifica el ectodominio de la proteína G de VSV.
7. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque además comprende co-transfecta , co-infectar o co-transformar la célula huésped con una molécula 82 de ADN recombinante la cual codifica una proteina de influenza, de modo que la proteina de influenza sea incorporada dentro de las VLPs.
8. El método de la Reivindicación 7, 5 caracterizado porque la molécula de ADN recombi ante es la que codifica la proteina de nucleocápside (NP) de la influenza .
9. El método de la Reivindicación 1, caracterizado porque además comprende co-transfectar, co- 10 infectar o co-transformar la célula huésped con una molécula de ADN recombinante la cual codifica una porción no producida por el virus de influenza, de modo que la porción diferente de la influenza sea incorporada dentro de las VLPs.
10. Las VLPs de influenza que comprenden al menos 15 una proteina estructural del virus de influenza, caracterizadas porque las VLPs siempre incluyen MI.
11. Las VLPs de influenza de la Reivindicación 10, caracterizadas porque las VLPs comprenden además al menos una de las proteínas estructurales de influenza seleccionadas del •20 grupo que consiste de Ha, NA y M2.
12. Las VLPs de influenza de la Reivindicación 11, caracterizadas porque HA y NA son de subtipos diferentes del virus de influenza.
13. Las VLPs de influenza de la Reivindicación 10, 25 caracterizadas porque una porción o la totalidad de HA o NA 83 es reemplazada por una porción no producida por el virus de influenza, para que comprenda VLPs quiméricas.
14. Las VLPs quiméricas de la Reivindicación 13, caracterizadas porque una porción o la totalidad de HA y NA es reemplazada por un péptido, polipéptido o proteina producida por un microorganismo patógeno.
15. Las , VLPs quiméricas de la Reivindicación 14, caracterizadas porque HA es reemplazado por la proteina G de VSV.
16. Las VLPs quiméricas de la Reivindicación 14, caracterizadas porque los dominios de la transmembrana y citoplásmico de HA están presentes, pero la región restante de HA está reemplazada por el ectodominio de la proteina G de VSV.
17. Las VLPs de influenza de la Reivindicación 10, caracterizadas porque una proteina de influenza es incorporada dentro de las VLPs.
18. Las proteínas de influenza de la Reivindicación 17, caracterizadas porque la proteína de influenza incorporada dentro de las VLPs es NP.
19. Las VLPs de influenza de la Reivindicación 10, caracterizadas porque una porción no producida por el virus de influenza está incorporada dentro de las VLPs.
20. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende las VLPs de la Reivindicación 10, junto con 84 un diluyente o portador.
21. La composición inmunogénica de la Reivindicación 20, caracterizada porque además comprende un adyuvante.
22. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende las VLPs de la Reivindicación 11, junto con un diluyente o portador.
23. La composición inmunogénica de la reivindicación 22, caracterizada porque además comprende un adyuvante.
24. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende las VLPs de la Reivindicación 13, junto con un diluyente o portador.
25. La composición farmacéutica de la Reivindicación 24, caracterizada porque además comprende un adyuvante .
26. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende las VLPs de la Reivindicación 14, junto con un diluyente o portador.
27. La composición inmunogénica de la Reivindicación 26, caracterizada porque además comprende un adyuvante .
28. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende las VLPs de la Reivindicación 17, junto con un diluyente o portador. 85
29. La composición inmunogénica de la Reivindicación 28, caracterizada porque además comprende un adyuvante .
30. Una composición inmunogénica, caracterizada porque comprende las VLPs de la Reivindicación 19, junto con un diluyente o portador.
31. La composición inmunogénica de la Reivindicación 30, caracterizada porque además comprende un adyuvante .
32. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende las VLPs de la Reivindicación 19, junto con un diluyente o portador.
33. La composición farmacéutica de la Reivindicación 32, caracterizada porque además comprende un adyuvante.
34. Un método de inmunización contra la infección provocada por el virus de influenza, caracterizado porque comprende administrar a un vertebrado la composición inmunogénica de la Reivindicación 20.
35. Un método de inmunización contra la infección provocada por el virus de influenza, caracterizado porque comprende administrar a un vertebrado la composición inmunogénica de la Reivindicación 22.
36. Un método de inmunización contra la infección provocada por un microorganismo patógeno diferente del virus 86 de influenza, caracterizado porque comprende administrar a un vertebrado la composición inmunogénica de la Reivindicación 26.
37. Un método de inmunización contra la infección provocada por un microorganismo patógeno diferente del virus de influenza, caracterizado porque comprende administrar a un vertebrado la composición inmunogénica de la Reivindicación 30.
38. Un método de tratamiento, caracterizado porque comprende administrar a un vertebrado una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la Reivindicación 24.
39. Un método de tratamiento, caracterizado porque comprende administrar a un vertebrado una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la Reivindicación 32.
40. Una célula huésped, caracterizada porque es transí ctada, infectada o transformada con una molécula de ADN recombinante que codifica las proteínas MI, M2, HA y NA del virus de influenza.
41. La célula huésped de la Reivindicación 40, caracterizada porque es transfectada, infectada o transformada adicionalmente con una segunda molécula de ADN recombinante que codifica las subunidades PA, PB1 y PB2 de la polimerasa del virus de influenza, y la nucleoproteina NP del virus de influenza. 87
42. La célula huésped de la reivindicación 41, caracterizada porque además es transíectada, infectada o transformada con una secuencia de nucleótido heterologa.
43. La célula huésped de la reivindicación 42, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos heterologa durante la expresión, es una porción no producida por el virus de influenza.
44. Las VLPs de influenza, caracterizadas porque se unen y empacan con los complejos de ribonucleoproteina.
45. Las VLPs de influenza de la reivindicación 44, caracterizadas porque expresan adicionalmente una secuencia de nucleótido heterologa.
46. Las VLPs de influenza de la reivindicación 45, caracterizadas porque la secuencia de nucleótidos heterologa durante la expresión, es una porción no producida por el virus de influenza.