DE60130987T2

DE60130987T2 - Assemblierung von wildtyp und chimären influenzavirus-ähnlichen partikeln (vlps)

Info

Publication number: DE60130987T2
Application number: DE60130987T
Authority: DE
Inventors: Jose M. Hartsdale GALARZA; Theresa E. Mamaroneck LATHAM
Original assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Priority date: 2000-06-23
Filing date: 2001-06-21
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2021-06-22
Also published as: BRPI0111830B8; WO2002000885A3; MXPA02012254A; AU2007201727A1; WO2002000885A9; US20090239261A1; KR100877019B1; KR20030013463A; US8859231B2; WO2002000885A2; BR0111830A; CA2410297C; CN1437655A; US20050186621A1; ES2295175T3; CA2410297A1; US7556940B2; BR0111830B1; JP2004501647A; CY1107835T1

Description

Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft influenzavirusähnliche Partikel, die aus dem Matrixprotein allein bestehen, und kann weiterhin ein beliebiges der Strukturproteine (strukturellen Proteine) von Influenza beinhalten.
Allgemeiner Stand der Technik
Die Influenzaviren bestehen aus mit A, B und C bezeichneten Unterarten. Influenzaviren verfügen über ein segmentiertes, negatives Einzelstrang-RNA-Genom, das 10 Polypeptide kodiert, die für den Lebenszyklus des Virus erforderlich sind. Jedes der acht RNA-Segmente eines vollständigen Genoms ist mit mehreren Untereinheiten des Nukleokapsidproteins (NP) enkapsidiert und mit einigen wenigen Molekülen der trimeren Polymerase (PB1-, PB2- und PA-Untereinheiten) verbunden, wodurch der Ribonukleoproteinkomplex (RNP-Komplex) gebildet wird (Literaturverzeichnis, Eintrag 1). Eine Schicht des Matrixproteins (M1) umgibt diese Strukturen, die als ein Nexus zwischen dem Kern und der Virushülle zu fungieren scheint. Diese von einer Wirtszelle abgeleitete Hülle ist mit den zwei viral kodierten Hauptoberflächenglykoproteine Hämagglutinin (HA) und Neuraminidase (NA) und einer viel geringeren Menge eines unglykosylierten kleinen Proteins M2 (1, 2) besetzt. Das HA-Glykoprotein wird von einer Protease gespalten, um HA1 und HA2 zu bilden.
Eine Infektion mit Influenzaviren wird von der Anlagerung des Oberflächenhämagglutinins an einen Sialsäure enthaltenden Zellrezeptor initiiert. Diese erste Interaktion von Virus und Zelle induziert die Aufnahme des Viruspartikels in die Zelle mittels rezeptorvermittelter Endozytose. Unter den Bedingungen mit niedrigem pH-Wert des Endosoms erfährt das HA eine Konformationsänderung, die die Interaktion der hydrophoben terminalen NH₂-Domäne von HA2 und der endosomalen Membran erleichtert, was in einer Membranfusion und einer anschließenden Freisetzung der Kern-RNP und des Matrixproteins (M1) in das Cytosol resultiert. Eine Dissoziation der RNP und der Matrixproteine findet in dem Cytosol statt, bevor die RNP zu dem Nukleus transloziert werden, in dem eine Transkription und Replikation des vollständigen Genoms stattfindet (3, 4).
Nach der primären Transkription initiieren neu synthetisierte Proteine die Replikation des viralen Genoms, das wiederum die Transkription und Proteinsynthese steigert. An diesem Punkt des Lebenszyklus des Virus fangen die Oberflächenglykoproteine HA und NA an, sich an diskreten Bereichen der Plasmamembran anzusammeln, von wo aus neu assembliertes (zusammengefügtes) Virus freigesetzt werden wird. Von der Virusassemblierung wird angenommen, dass sie über eine Art Interaktion zwischen den zytoplasmatischen und/oder Transmembrandomänen (transmembranen Domänen) der membranverankerten Proteine und dem darunter liegenden Matrixprotein (M1) beginnt, das wiederum eine enge Verbindung mit den RNP aufrechterhält (5, 6). Zusammengefasst bilden HA, NA, M1 und M2 die vier viral kodierten Strukturproteine. Die Kontakte zwischen dem Matrixprotein M1 und den RNP-Komplexen sowie der Mechanismus, mittels dessen ein vollständiger Satz von acht RNP in das reife Virion integriert wird, sind nicht gut definiert worden. Von spezifischen molekularen Kontakten unter den Strukturkomponenten wird angenommen, dass sie bestimmen, wie der Morphogenesevorgang beginnt und bis zum Punkt der Assemblierung und Ausschleusung des reifen Partikels von der Oberfläche der Wirtszelle fortschreitet.
Die Komplexität des Vorgangs hat Probleme verursacht, wie: 1) Die Identifizierung, welche Virusproteine zur Assemblierung und Ausschleusung erforderlich sind. 2) Die Art der Protein-Protein- und Lipid-Protein-Interaktionen zwischen der Oberfläche und darunter liegenden Komponenten, die den Assemblierungs- und Ausschleusungsvorgang antreiben. 3) Die Mechanismen, mittels derer die RNP in die Assemblierungsstelle gebracht, in das Partikel integriert und aus analogen Segmenten aussortiert werden. 4) Die Beschaffenheit und Stöchiometrie der Interaktionen und der Regulation der Assemblierung und Ausschleusung. All diese Ereignisse finden in einer komplexen Zellumgebung statt, in der einige Wirtsmoleküle das Fortschreiten des Assemblierungs- und Ausschleusungsvorgangs fördern oder stören können oder auch nicht. Dies wiederum führt zu den Problemen, ob zelluläre Proteine in der Tat an der Virusassemblierung beteiligt sind und wie nichtvirale Proteine im Allgemeinen von der Oberfläche der ausgeschleusten Partikel ausgeschlossen werden.
Eine große Anzahl an Studien wurde durchgeführt, um einige dieser Probleme mit umhüllten RNA-Viren verschiedener Familien anzugehen (5); die meisten dieser Probleme bleiben jedoch im Hinblick auf das Influenzavirus ungelöst. Studien mit nichtsegmentierten RNA-Virus-Familien (wie die Rhabdoviridae und Paramyxoviridae), die mit Influenza morphologisch und evolutionär ein wenig verwandt sind, haben gezeigt, dass das Matrixprotein (M) des Rhabdovirus-Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV, Bläschenstomatitisvirus) sich selbst als Membranpartikel aus der Zelloberfläche abschnüren (ausschleusen) kann (7, 8). Darüber hinaus wird die Bedeutung von M-Proteinen beim Ausschleusen außerdem von der Tatsache reflektiert, dass Kopien von Tollwutviren (ein weiteres Rhabdovirus) mit einer Deletion des Gens, das das G-Oberflächenprotein kodiert, immer noch gebildet und aus den infizierten Zellen freigesetzt werden (9). Neuere Arbeiten mit PIV-3 (ein Paramyxovirus) haben ebenfalls gezeigt, dass die Matrixproteine zusammen mit Nukleokapsidprotein (NP) sich zu einer virusähnlichen Struktur verbinden und aus der Zelloberfläche ausschleusen können (10). In Bezug auf das Influenzavirus zeigte die Expression dieser zwei Proteine unter Verwendung von Semliki-Forest-Virus-Replikons jedoch weder eine Verbindung zwischen diesen Proteinen oder eine Ausschleusung von Membranvesikeln (11).
Das Durchführen von umgekehrter Genetik an Influenzavirus war ein nützlicher Ansatz zum Untersuchen von Protein-Protein-Interaktionen zwischen Strukturkomponenten. Die Bedeutung der zytoplasmatischen Domäne der Glykoproteine in der Assemblierung von Influenza wurde vor kurzem studiert (12, 13, 14) und es wurde gezeigt, dass die Deletion des HA-Schwanzes dessen Integration in das Partikel als auch die Effizienz der Ausschleusung reduziert, sich jedoch nicht auf die Virionmorphologie auswirkte. Andererseits zeigte ein Virus mit einem deletierten NA-Schwanz eine filamentöse Morphologie und die Integration von NA in die Hülle war beeinträchtigt. Darüber hinaus schienen Doppeldeletionen die Effizienz der Ausschleusung sowie die Infektiosität zu reduzieren und änderten die Virionmorphologie, die von denen mit Schwanzdeletionen und vom Wildtyp-Virus zu unterscheiden waren. Obwohl doppelte Schwanzdeletionen sich auf die Effizienz der Ausschleusung und die Morphologie der Viruspartikel auszuwirken schienen, hoben sie die Assemblierung und den Austritt von Virions nicht vollständig auf. Dies legte nahe, dass das M1-Protein die Virusassemblierung und -ausschleusung steuern kann (13).
In ähnlicher Weise schienen die Interaktionen, die zwischen dem Matrixprotein und der Plasmamembran aufgebaut wurden, für die Virusassemblierung und -freisetzung von Entscheidung zu sein. Die physikalische Beschaffenheit dieser Verbindung, ob das Matrixprotein nun vollständig in die Plasmamembran eingebettet oder lediglich durch elektrostatische Interaktion angelagert ist, ist jedoch eine ungelöste Frage. Eine neuere Arbeit, die sich mit dieser Frage befasst, legte nachhaltig nahe, dass Matrix und Membran über elektrostatische Interaktionen verbunden waren, sie konnte jedoch nicht ausschließen, dass eine gewisse Menge M1 in die Membran eingebettet sein kann (15). Die Schlüsselrolle von M1- und M2-Proteinen in der Struktur des reifen Virions wird in der kugelförmigen oder filamentösen Morphologie der Partikel reflektiert, wenn Aminosäuresubstitutionen in einem dieser Moleküle vorliegen (16).
Virusähnliche Partikel (VLP) sind in den letzten Jahren als potentielle Kandidaten zur Einbindung in immunogenen Zusammensetzungen Gegenstand einer Menge Interesse gewesen. Der Grund dafür ist, dass VLP ein oder mehrere Oberflächenproteine enthalten, die in einer Konformation angezeigt sind, die ihrer nativen Konformation ähnlich genug ist, so dass sie eine gewünschte Immunantwort auslösen können. Gleichzeitig fehlt VLP das Komplement des genetischen Materials, das zum Produzieren von Virusnachkommenschaft in einem Wirt erforderlich ist. Folglich können VLP im Gegensatz zu einem Wildtyp-Virus keine Infektion mit Krankheitssymptomen oder einer Pathologie verursachen. Zum Beispiel wurden zwei oder drei Proteine des Rotavirus (ein Doppelstrang-RNA-Virus) zu VLP assembliert, die eine Immunantwort auslösten (17).
Baculovirus-Expressionssysteme wurden weitgehend verwendet, um die Morphogenese und Assemblierung von VLP nicht umhüllter Viren zu untersuchen, die sich selbst zu einer ikosaederförmigen Struktur assemblieren (18, 19, 20, 21). In analoger Weise wurde die Expression in Insektzellen der Proteine gag und/oder env verschiedener Mitglieder der Retrovirus-Familie ebenfalls zum Studieren der Assemblierung und Ausschleusung der Kernstruktur umhüllter Viren verwendet (22, 23, 24, 25).
Es besteht Bedarf daran, die Fähigkeit des Baculovirus-Expressionssystems, Influenza-VLP zu produzieren, zu beurteilen. Insbesondere besteht Bedarf daran, die Mindestzahl von Influenzavirusproteinen zu identifizieren, die sich zu VLP assemblieren werden, und die Morphologie und Immunogenität dieser VLP zu evaluieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Dementsprechend ist es eine Aufgabe dieser Erfindung, die Mindestzahl von Influenzavirusproteinen zu identifizieren, die sich zu einem VLP assemblieren werden. Es ist eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, VLP zu erzeugen, die Proteine aus mehr als einer Unterart von Influenzavirus enthalten. Es ist noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, chimäre VLP zu erzeugen, die ein Protein aus einer heterologen influenzafreien Quelle enthalten. Es ist noch eine weitere Aufgabe dieser Erfindung, immunogene und pharmazeutische Zusammensetzungen zu formulieren, die ein oder mehrere der oben erwähnten VLP enthalten.
Diese und andere Aufgaben der Erfindung, wie im Folgenden erörtert, werden mittels der Assemblierung von Influenza-VLP, die mindestens ein Influenzavirusstrukturprotein umfassen, erzielt, wobei die VLP immer M1 enthalten. In einer Ausführungsform der Erfindung enthalten die VLP nur M1 (das das Nukleokapsidprotein (NP) integrieren kann). Solche VLP werden hergestellt, indem ein rekombinantes (rekombiniertes) DNA-Molekül konstruiert wird, das M1 kodiert, eine geeignete Wirtszelle mit dem rekombinanten DNA-Molekül transfiziert, infiziert oder anderweitig transformiert wird, die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert (gezüchtet) wird, die die Expression (Exprimierung) von M1 gestatten, so dass VLP nach der Expression von M1 innerhalb der Zellen assembliert (zusammengefügt) werden, und die VLP von dem Nährmedium-Flüssigkeitsüberstand gereinigt werden.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfassen die VLP weiterhin mindestens eines der Influenzastrukturproteine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HA, NA und M2. Solche VLP werden hergestellt, indem ein oder mehrere rekombinante DNA-Moleküle konstruiert werden, die M1 plus mindestens eines von HA, NA und M2 kodieren, eine geeignete Wirtszelle mit dem einen oder den mehreren rekombinanten DNA-Molekülen transfiziert, infiziert oder anderweitig transformiert wird, die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert wird, die die Expression der Influenzavirusstrukturproteine gestatten, so dass VLP nach der Expression der Strukturproteine innerhalb der Zellen assembliert werden, und die VLP von dem Nährmedium-Flüssigkeitsüberstand gereinigt werden. Die VLP, die nur M1 oder M1 plus mindestens eines von HA, NA und M2 enthalten, werden mit einem Verdünnungsmittel oder Träger als eine immunogene Zusammensetzung zum Immunisieren von Vertebraten gegen eine Infektion, die von diesen zwei Unterarten von Influenzavirus verursacht wird, formuliert.
In noch einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann es wünschenswert sein, VLP herzustellen, die Oberflächenglykoproteine von unterschiedlichen Unterarten von Influenzavirus enthalten. Solche VLP, die HA von einer Unterart und NA von einer anderen Unterart enthalten, werden mit einem Verdünnungsmittel oder Träger als eine bivalente immunogene Zusammensetzung zum Immunisieren von Vertebraten gegen eine Infektion, die von diesen zwei Unterarten von Influenzavirus verursacht wird, formuliert.
In noch einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung kann es wünschenswert sein, VLP herzustellen, in denen ein Teil oder alle des HA oder der NA durch eine heterologe Einheit ersetzt ist, die nicht vom Influenzavirus produziert wird, um chimäre VLP zu umfassen. Solche Einheiten beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, ein Peptid, Polypeptid oder Protein. Wenn nur ein Teil des HA oder der NA ersetzt werden soll, wird ein Teil der DNA-Sequenz in dem rekombinanten DNA-Molekül, die das HA oder die NA kodiert, durch eine DNA-Sequenz ersetzt, die das influenzafreie Peptid, Polypeptid oder Protein kodiert. Wenn das gesamte HA oder die gesamte NA ersetzt werden soll, wird die gesamte DNA-Sequenz in dem rekombinanten DNA-Molekül, die das HA oder die NA kodiert, durch eine DNA-Sequenz ersetzt, die das influenzafreie Peptid, Polypeptid oder Protein kodiert.
In einem Gesichtspunkt stammt ein solches influenzafreies Peptid, Polypeptid oder Protein von einem krankheitserregenden (pathogenen) Mikroorganismus. Diese chimären VLP werden mit einem Verdünnungsmittel oder Träger als eine immunogene Zusammensetzung zum Immunisieren von Vertebraten gegen eine Infektion, die von diesem pathogenen Mikroorganismus verursacht wird, formuliert.
In einem anderen Gesichtspunkt ist eine solche influenzafreie Einheit eine pharmazeutisch wirksame Einheit. Diese chimären VLP werden mit einem Verdünnungsmittel oder Träger als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert und in einer Menge verabreicht, die zum Behandeln von Vertebraten mit der derartigen influenzafreien Einheit wirksam ist.
In noch einem anderen Gesichtspunkt assemblieren und verpacken die VLP RNP und können weiterhin eine heterologe Nukleotidsequenz integrieren und exprimieren.
Eine beliebige der vorstehenden immunogenen und pharmazeutischen Zusammensetzungen kann weiterhin ein Adjuvans umfassen.
Kurzbeschreibung der Figuren
1 zeigt einen Quadrupel-Baculovirus-Transfervektor (Struktur-Quad), der vier Gene des Influenza-A/Udorn/72-(H3N2)-Stamms trägt. Die Transkription der Influenzagene HA und M1 wird von dem Polyhedrin-Promotor (als „pH" abgekürzt) angetrieben, wohingegen M2 und NA von dem p10-Promotor angetrieben werden. Dieser Vektor wurde zusammen mit linearisierter Baculovirus-DNA in Sf9-Insektenzellen transfiziert, um die Quadrupel-Rekombinante (HA/Q) zu erzeugen.
2 zeigt die Struktur einer VSV-G/HA-Chimäre. Die 14 Aminosäuren des zytoplasmatischen Schwanzes und die 29 Aminosäuren der Transmembrandomäne des Influenza-HA wurden im Raster („in frame") mit der Ectodomäne des VSV-G-Oberflächenglykoproteins fusioniert (SEQ ID NO: 11).
3 zeigt Western-Blot-Analysen der Influenza- und VSV-G-Proteine, die in Sf9-Zellen exprimiert wurden, die mit Baculovirus-Quadrupel-Rekombinanten (HA/Q28 oder VSV-G/Q) infiziert wurden. in 3A wurden die Influenzaproteine HA, M1 und M2 in dem Flüssigkeitsüberstand von Sf9-Zellen, die mit der Quadrupel-Rekombinante HA/Q28 infiziert wurden, (72 Stunden nach der Infektion) unter Verwendung eines Gemischs monoklonaler Anti-HA-, Anti-M1- und -M2-Antikörpern nachgewiesen (Bahn 1); das HA und das M1 wurden ebenfalls in dem Zellpellet nachgewiesen (Bahn 2). Mit Influenza A/Udorn/72 (H3N2) infizierte MDCK-Zellen wurden als Kontrolle verwendet (Bahn 3).
3B zeigt die Expression des VSV-G sowie der Influenza-M1- und -M2-Proteine in Sf9-Zellen, die mit VSV-G/Q (vollständiges G) infiziert wurden. Die Expression wurde in Zellpellets (Bahn 2) und Nährmedium-Flüssigkeitsüberstand (Bahn 3) nachgewiesen, wenn sie mit einem Gemisch monoklonaler Anti-G-, Anti-M1- und -M2-Antikörpern sondiert wurden. Nicht infizierte Sf9-Zellen (Bahn 1), mit VSV infizierte BHK-Zellen (Bahn 4) und mit Influenza A/Udorn/72 (H3N2) infizierte MDCK-Zellen (Bahn 5) wurden als Negativ- bzw. Positivkontrollen verwendet.
4 zeigt die Immunfluoreszenzanalyse von Sf9-Zellen, die mit einer Baculovirus-Quadrupel-Rekombinante (HA/Q28) infiziert wurden. Kästchenkulturen von Sf9-Zellen wurden mit HA/Q28 mit einer MOI von 1 infiziert und 72 Stunden inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden einzelne Kästchen mit Methanol/Aceton fixiert und sequentiell mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Die Expression von HA (4A), M1 (4B) oder HA/M1 (4C) wurde unter Verwendung der entsprechenden Filter nachgewiesen.
5 zeigt die Immunfluoreszenzanalyse von Sf9-Zellen, die mit HA/Q28 infiziert wurden. Kästchenkulturen wurden mit HA/Q28 mit einer MOI von 1 infiziert und 72 Stunden inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden einzelne Kästchen mit Paraformaldehyd fixiert und sequentiell mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Die Expression von HA (5A), NA (5B) oder HA/NA (5C) wurde unter Verwendung der entsprechenden Filter nachgewiesen.
6 zeigt die Immunfluoreszenzanalyse von Sf9-Zellen, die mit HA/Q28 infiziert wurden. Kästchenkulturen von Sf9-Zellen wurden mit HA/Q28 mit einer MOI von 1 infiziert und 72 Stunden inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden einzelne Kästchen mit Paraformaldehyd fixiert und sequentiell mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Die Expression von M2 wurde unter Verwendung der entsprechenden Filter nachgewiesen.
7 zeigt die Immunfluoreszenzanalyse von Sf9-Zellen, die mit VSV-G/Q (ein vollständiges Influenza-HA-Gen in HA/Q28, das durch ein vollständiges VSV-G-Gen ersetzt wurde) infiziert wurden. Kästchenkulturen wurden mit VSV-G/Q mit einer MOI von 1 infiziert und 72 Stunden inkubiert. Zu diesem Zeitpunkt wurden individuelle Kästchen mit Methanol/Aceton fixiert und sequentiell mit primären und sekundären Antikörpern inkubiert. Die Expression von VSV-G wurde unter Verwendung der entsprechenden Filter nachgewiesen.
8 zeigt die Analysen von VLP-Bildung mittels Iodixanol-Gradientenzentrifugation. 8A zeigt die Ergebnisse, wenn Fraktionen von HA/Q28 mittels Western-Blot mit einem Gemisch monoklonaler Anti-HA- und -M1-Antikörper sondiert werden. Bahnen 1–8 stellen Fraktionen dar, die von oben nach unten aus dem Röhrchen gesammelt wurden; Bahn 9 ist eine mit MDCK-Influenza-A/Udorn/72-(H3N2) infizierte Kontrolle. 8B zeigt die Ergebnisse, wenn Fraktionen von VSV-G/Q mittels Western-Blot mit einem Gemisch monoklonaler Anti-VSV-G- und Anti-M1- und Anti-M2-Antikörper sondiert werden. Bahnen 1–8 stellen Fraktionen dar, die von oben nach unten aus dem Röhrchen gesammelt wurden; Bahn 9 ist ein Gemisch von mit VSV infizierten BHK-Zellen und mit Influenza infizierten MDCK-Zellen, die als Kontrolle vereint wurden. 8C zeigt die Ergebnisse, wenn konzentrierte Flüssigkeitsüberstände zweifach infizierter (mit Einzel-M1- und NP-Rekombinante) Sf9-Zellen gereinigt und mit einem Gemisch von Anti-M1- und Anti-NP-Antikörpern sondiert werden. Bahnen 1–8 stellen Gradientenfraktionen dar, die von oben nach unten aus dem Röhrchen gesammelt wurden; Bahn 9 ist mit Influenza infizierte MDCK-Zellen als Kontrolle.
9 zeigt Western-Blot-Analysen von Nährmedium-Flüssigkeitsüberständen von Sf9-Zellen, die mit M1 allein und/oder HA/Q28 plus Einzel-NP-Baculovirus-Rekombinanten infiziert wurden. 9A zeigt die Analyse von Fraktionen, die von dem Flüssigkeitsüberstand einer M1-Einfachinfektion abgeleitet und mit Anti-M1-Antikörper sondiert wurden. Bahnen 1–8 stellen Fraktionen dar, die von oben nach unten aus dem Röhrchen gesammelt wurden; Bahn 9 ist mit Influenza infizierte MDCK-Zellen als Kontrolle. 9B zeigt die Ergebnisse, wenn Flüssigkeitsüberstand zweifach infizierter Sf9-Zellen (HA/Q28 plus Einzel-NP-Baculovirus-Rekombinanten) gereinigt und mit einem Gemisch von Anti-HA-, Anti-M1- und Anti-NP-Antikörpern sondiert wird. Bahnen 1–8 stellen Fraktionen dar, die von oben nach unten aus dem Röhrchen gesammelt wurden; Bahn 9 ist dieselbe Kontrolle wie in 9A.
10 zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme negativ gefärbter Influenza-VLP, die aus Nährmedien von sf9-Zellen gereinigt wurden, die mit einer Quadrupel-Rekombinante HA/Q28 infiziert wurden.
11 zeigt elektronenmikroskopische Aufnahmen von mit Immungold markierten Influenza-VLP. In 11A (drei Ansichten) wurden VLP mit einem monoklonalen Anti-HA-Antikörper sondiert und mit Goldkugeln, die mit Anti-Maus-IgG verbunden waren, gegengefärbt. In 11B wurden VLP mit einem monoklonalen Anti-NA-Antikörper sondiert und wie in 11A gegengefärbt.
12 zeigt Western-Blots von mit Influenzavirus infizierten Zellen, die mit Pools von Sera von Mäusen, die mit HA/Q28-VLP immunisiert wurden, sondiert wurden. In 12A sind Ergebnisse von gepoolten Sera von einem ersten Paar aus zwei Mäusen gezeigt. In 12B sind Ergebnisse von gepoolten Sera von einem zweiten Paar aus zwei Mäusen gezeigt. In sowohl 12A als auch B: Bahn 1: nicht infizierte MDCK-Zellen als Kontrolle; Bahn 2: mit Influenza-A-Virus infizierte MDCK-Zellen. Ein Sondieren nicht infizierter MDCK-Zellen zeigte eine unspezifische Bande, die geringfügig über der von M1 lag, die in mit Influenza infizierten Zellen ebenfalls vorlag.
13 zeigt Blots von mit VSV infizierten Zellen, die mit Pools von Sera von Mäusen, die mit chimären VSV-G/Q-VLP immunisiert wurden, sondiert wurden. In 13A sind Ergebnisse von gepoolten Sera von einem ersten Paar aus zwei Mäusen gezeigt. In 13B sind Ergebnisse von gepoolten Sera von einem zweiten Paar aus zwei Mäusen gezeigt. In sowohl 13A als auch B: Bahn 1: nicht infizierte BHK-Zellen als Kontrolle; Bahn 2: mit VSV infizierte BHK-Zellen; Bahn 3: nicht infizierte MDCK-Zellen als Kontrolle; Bahn 4: mit Influenza infizierte MDCK-Zellen.
14 zeigt einen Quadrupel-Baculovirus-Transfervektor, der vier Gene des Influenza-A/Udorn/72-(H3N2)-Stamms trägt, einschließlich der drei Gene, die die Polymeraseuntereinheiten und das Nukleoprotein kodieren. Die Transkription der Influenzagene PB1 und PA, die in entgegengesetzten Ausrichtungen angeordnet sind, wird von dem Polyhedrin-Promotor (als „pH-Promotor" abgekürzt) angetrieben, wohingegen die Transkription der Gene PB2 und NP, ebenfalls in entgegengesetzten Ausrichtungen, von dem p10-Promotor angetrieben wird. Die vier Gene wurden in den Baculovirus-Transfervektor PAcAB4 subkloniert, dann mit linearisierter Baculovirus-DNA in Sf9-Insektenzellen transfiziert, um die Quadrupel-Rekombinante zu erzeugen.
15 zeigt die Messung der Luciferase-Aktivität in relativen Lichteinheiten (relative light units, RLU) in nicht infizierten (Kontrolle) und mit VLP infizierten BHK-Zellen (baby hamster kidney cells, Babyhamster-Nierenzellen).
16 zeigt die Expression von grün fluoreszierendem Protein (GFP) in BHK-Zellen nach Infektion mit VLP, die das GFP-Gen tragen. Pfeile zeigen BHK-Zellen an, die GFP exprimieren.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Assemblierung und Freisetzung von umhüllten Viruspartikeln von der Oberfläche von mit Virus infizierten Zellen ist ein komplexer und in Stufen ablaufender Vorgang. Er erfordert die abgestimmten Interaktionen von viruskodierten glykosylierten und unglykosylierten Proteinen mit diskreten Bereichen der Plasmamembran, um die Assemblierung des Virions zu initiieren. Neben diesen Komponenten werden auch von Protein enkapsidierte Nukleinsäuren, die das genetische Material des Virus darstellen, in die Struktur integriert, um den Morphogenesevorgang abzuschließen, der von dem Abschnüren oder Ausschleusen des reifen Virions aus der Zelloberfläche abgeschlossen wird. Die exakten molekularen Interaktionen und die Beiträge der verschiedenen Strukturkomponenten zu der Assemblierung und der endgültigen Freisetzung eines kompletten Virions sind nicht gut charakterisiert.
Die vorliegende Erfindung beschreibt die Assemblierung und Freisetzung von influenzavirusähnlichen Partikeln (influenza vrus-like particles, Influenza-VLP) von der Oberfläche von Zellen, die mit rekombinanten Vektoren infiziert wurden, die Influenzavirusstrukturproteine exprimierten. Eine Vielfalt von Expressionssystemen ist zur Erzeugung von VLP geeignet. Die Erfindung wird mit Insektenzellen beispielhaft dargestellt, die mit Baculovirus-Rekombinanten infiziert wurden, die Influenzavirusstrukturproteine exprimierten.
Um die Moleküle zu definieren, die zur Influenzavirusassemblierung und -ausschleusung erforderlich sind, wurde eine Reihe von Einzel- und Quadrupel- Gen-Baculovirus-Rekombinanten konstruiert. Die Rekombinanten exprimierten vier Influenzastrukturproteine (HA, NA, M1 und M2) in Spodoptera-frugiperda-9-Zellen (Sf9-Zellen). Sf9-Zellen sind eine Insektenzelllinie (ATCC-Zugangsnummer CRL 1711), bei der es sich um einen Abkömmling der SF21-Zelllinie handelt. um Quadrupel-Rekombinanten zu erhalten, wurde ein Einzel-Baculovirus-Transfervektor, der vier Strukturproteine des Influenza-A/Udorn/72-(H3N2)-Stamms kodierte, unter Anwendung des Shuttle-Vektor-Ansatzes konstruiert, der das Klonieren durch Reduzieren der Größe des Arbeitsplasmids und Erhöhen der Anzahl von Restriktionsstellen erleichtert. Im letzten Transfervektor wurden die Influenzagene stromabwärts der Baculovirus-Promotoren p10 (NA und M2) und Polyhedrin (HA und M1) lokalisiert, die angeordnet wurden, um die Transkription der Gene in entgegengesetzten Richtungen anzutreiben (1).
Quadrupel-Baculovirus-Rekombinanten (HA, NA, M1 und M2) wurden durch simultane Transfektion von Sf9-Zellen mit linearisierter Virus-DNA und Transfervektor-DNA erhalten. Einige wenige rekombinante Virusplaques wurden ausgewählt und durch zwei zusätzliche Runden Plaque-zu-Plaque-Isolierung gereinigt. Auf Basis des Niveaus der Proteinexpression, das mittels Immunoblot beurteilt wurde, wurde dieser Quadrupel-Rekombinanten-Transfervektor, als HA/Q28 bezeichnet, zur Verwendung in anschließenden Versuchen ausgewählt.
Ein markantes Merkmal dieses Konstrukts bestand darin, dass die Donor- und Akzeptor-Spleißstellen an dem M1-Gen mutiert waren, um ein Spleißen der M1-mRNA zu verhindern. Andernfalls wäre die M1-mRNA in M2-mRNA gespleißt worden, was in einem verringerten Niveau der Expression des M1-Proteins resultiert. Die M2-DNA wurde als ein unabhängiges Gen in den Transfervektor eingeführt.
Um zu untersuchen, ob die Expression dieser vier Influenzastrukturproteine dazu ausreicht, die Assemblierung und Ausschleusung von Influenza-VLP von der Oberfläche von Sf9-Insektenzellen, die mit der Baculovirus-Quadrupel-Rekombinante HA/Q28 infiziert wurden, anzutreiben, wurden Nährmedium-Flüssigkeitsüberstände mittels Western-Blot analysiert, um das Vorliegen von M1- und HA-Proteinen festzustellen. Das Nährmedium wurde 72 Stunden nach der Infektion geerntet, 30 Minuten bei 4000 × g geklärt und das verbleibende suspendierte Material dann mittels Zentrifugation bei 200.000 × g für zwei Stunden eingeengt.
Eine Western-Blot-Analyse des eingeengten Flüssigkeitsüberstands von den infizierten Zellen, die mit einer Kombination monoklonaler Anti-HA-, -M1- und -M2-Antikörper sondiert wurden, zeigte eine signifikante Expression der Influenza-HA-, -M1- und -M2-Proteine (3A). Das HA-Protein schien in anderen Mustern zu migrieren als das HA von mit Influenza A/Udorn/72 (H3N2) infizierten Madin-Darby-Hundenierenzellen (Madin-Darby canine kidney cells, MDCK-Zellen), wobei es sich um eine Widerspiegelung der verschiedenen Glykosylierungsformen dieses Proteins handeln kann. Andererseits waren die Migrationsmuster der M1- und M2-Proteine denen, die in mit Influenza infizierten MDCK-Zellen exprimiert wurden, ähnlich (3A, Bahnen 1–3). Die Expression der NA-Proteine wurde mittels Western-Blot mit einem polyklonalen Maus-Antikörper nachgewiesen, der auch HA, M1 und M2 erkannte (Daten nicht gezeigt).
Die im Folgenden erörterten Ergebnisse zeigen, dass die Expression der vier Influenzastrukturproteine für die Assemblierung und Ausschleusung von VLP von der Oberfläche von Sf9-Insektenzellen ausreicht. Die Expression von Nukleokapsidprotein (NP), zusätzlich zu diesen vier Proteinen, führte zu der Bildung von VLP, die das NP-Protein in das Partikel integrierten. Des Weiteren induzierte die Expression von M1-Protein allein die Freisetzung von VLP, die ebenfalls bei Coexpression mit M1 das Nukleokapsid, NP, integrieren kann. Darüber hinaus induzierte das Ersetzen des HA-Gens durch entweder ein vollständiges G-Protein von Vesicular-Stomatitis-Virus oder ein Hybrid-HA/G in der Quadrupel-Rekombinante die Assemblierung und Freisetzung chimärer VLP. All diese VLP werden durch herkömmliche Mittel der Reinigung nach der Sekretion der VLP in das Medium erhalten.
Um zu beurteilen, ob heterologe, influenzafreie Glykoproteine in die Oberfläche der Influenza-VLP integriert werden können, wurden zwei unterschiedliche chimäre Quadrupel-Baculovirus-Rekombinanten konstruiert. Die erste, als VSV-G/Q bezeichnet, ersetzte die DNA-Sequenz, die das Influenza-HA-Protein kodiert, durch eine DNA-Sequenz, die das vollständige G-Protein von Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV) kodiert. Die zweite, als VSV-G/HA-Q bezeichnet, trug eine Hybrid-DNA-Sequenz, die die Ectodomäne des VSV-G-Proteins und die Transmembrandomäne und den zytoplasmatischen Schwanz des Influenza-HA-Proteins kodiert (siehe 2). Beide Rekombinanten enthielten die Gene für die drei Influenzavirusstrukturproteine M1, NA und M2.
Diese Konstrukte wurden denselben Charakterisierungsstudien wie die Wildtyp-Influenza-VLP unterzogen und die Ergebnisse zeigten, dass die Infektion von Sf9-Insektenzellen mit jedem Konstrukt die Assemblierung und Freisetzung von influenzaähnlichen Partikeln, die die VSV-G-Proteine auf ihrer Oberfläche trugen, steuerte. Beide diese rekombinanten Viren konnten die Expression der vier Proteine (M1, M2, NA und VSV-G) antreiben, die ebenfalls in das Medium sekretiert wurden.
Eine Western-Blot-Analyse von Sf9-Zellen, die mit VSV-G/Q infiziert waren, zeigte, dass das VSV-G-Protein sowie die Influenzaproteine M1 und M2 72 Stunden nach der Infektion exprimiert wurden (3B). Darüber hinaus zeigte eingeengter Flüssigkeitsüberstand von infizierten Zellen bei Sondierung mit Antikörpern zu VSV-G und Influenza-M1 und -M2 ein positives Western-Blot (3B, Bahn 3).
Die gerade für das VSV-G-Protein beschriebenen Verfahren sind leicht auf die Integration anderer influenzafreier Glykoproteine von biologischem Interesse in die Oberfläche der VLP sowie die Integration einer Einheit, die nicht vom Influenzavirus produziert wird, anwendbar. Solche Einheiten beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, ein Peptid, Polypeptid oder Protein. Wie im Folgenden erörtert, werden solche VLP als immunogene Zusammensetzungen, in Rezeptor-Ligand-Interaktionsstudien und/oder als ein System zur Abgabe der influenzafreien Einheit als Teil einer pharmazeutischen Zusammensetzung verwendet.
Um weiter die Expression und zelluläre Lokalisierung der Influenzaproteine in Sf9-Zellen zu beurteilen, wurde eine Immunfluoreszenzanalyse von Zellen, die mit der plaquegereinigten Baculovirus-Rekombinante HA/Q28 infiziert waren, durchgeführt. Diese Versuche zeigten, dass die vier Influenzastrukturproteine wie gezeigt mittels indirekter Immunfluoreszenz exprimiert wurden (4–6). Doppelfärbeversuche mit Anti-HA- und Anti-NA-Antikörpern zeigten, dass diese Oberflächenglykoproteine sich an der Peripherie der infizierten Zellen mit einem gewissen Ausmaß an Überlappung lokalisierten (5C). Diese Ergebnisse legten nahe, dass diese Hauptglykoproteine sich gemeinsam an diskreten Bereichen auf der Oberfläche der infizierten Insektenzellen lokalisierten, was dem ähnelt, was in einer natürlichen Influenzainfektion von Säugetierzellen erwartet wird.
In ähnlicher Weise zeigte Doppelimmunfluoreszenzfärbung von mit HA/Q28 infizierten Sf9-Zellen mit einem Gemisch monoklonaler Antikörper zu entweder HA und M1, dass die Oberflächenproteine und die Matrix M1 sich gemeinsam in unterschiedlichen Bereichen der Zellmembran lokalisierten (4C).
Andererseits zeigte Immunfluoreszenz von mit M1-Maculovirus-Rekombinante infizierten Sf9-Zellen, dass M1-Protein sich vorwiegend in den Nuklei der infizierten Zellen ansammelte und nur geringe Mengen wurden an der Zelloberfläche sichtbar gemacht (Daten nicht gezeigt). Das Verteilungsmuster von M1-Protein in infizierten Zellen schien nicht verändert zu sein, ob nun M1 als ein Einzelgen oder als eine Quadrupel-Rekombinante zusammen mit HA, NA und M2 exprimiert wurde (4). Darüber hinaus zeigte eine gleichzeitige Infektion von Sf9-Zellen mit Einzel-M1- und NP-Rekombinanten im Vergleich zu Sf9-Zellen, die individuell mit entweder M1- oder NP-Rekombinanten infiziert wurden, keine Neuverteilung dieser Proteine in den Zellen (Daten nicht gezeigt).
Folglich zeigten eine Western-Blot- und eine Immunfluoreszenzanalyse infizierter Zellen deutlich, dass diese vier Proteine nicht nur in den Zellen und den Zellüberständen vorlagen, sondern sich auch gemeinsam an diskreten Bereichen auf der Plasmamembran lokalisierten. Dies legte eine potentielle Verbindung zwischen diesen Strukturproteinen nahe.
Immunfluoreszenzstudien von Sf9-Zellen, die mit einer VSV-G/Q-Rekombinante infiziert waren, zeigten, dass VSV-G-Protein nicht nur exprimiert wird, sondern sich auch in der Peripherie der infizierten Zellen anzusammeln scheint.
Da Immunfluoreszenzstudien offenbarten, dass diese Proteine sich gemeinsam an der Zelloberfläche lokalisierten, führte dies zu einer Beurteilung, ob diese vier Virusproteine dazu ausreichten, die Bildung und Freisetzung von VLP von der Oberfläche der infizierten Zelle anzutreiben. Insbesondere, um zu untersuchen, ob diese Proteine von der Zelle infolge von Zellschädigung und -tod freigesetzt wurde, oder weil sie als VLP assemblierten, die von der Zelloberfläche ausgeschleust wurden, wurden eingeengte Flüssigkeitsüberstände von mit HA/Q28 infizierten Sf9-Zellen Iodixanol-Geschwindigkeitsgradientenzentrifugation (26) (200.000 × g für 3,5 Stunden) unterzogen. Wie einzeln aufgeführt, wurden Fraktionen, die die Proteine von Interesse enthielten, einer zusätzlichen Reinigung auf einem Saccharosegradienten von 20–60% unterzogen.
Eine Western-Blot-Analyse gesammelter Fraktionen zeigte, dass HA und M1 gemeinsam durch den Gradienten migrierten, wobei in Fraktion 2 eine Spitzenkonzentration erreicht wurde (8A, Bahn 2). Diese Proteine wurden auch in den benachbarten Fraktionen 3 und 4 sowie in den Fraktionen 7 und 8 gefunden (8A). Der Nachweis von HA und M1 in diesen unteren Fraktionen (zum unteren Teil des Gradienten hin) lag wahrscheinlich in der Verbindung dieser Proteine mit dem Baculovirus begründet, die unter diesen Bedingungen in den Fraktionen 7 und 8 Banden aufzeigten (Daten nicht gezeigt).
Ein ähnlicher Versuch wurde mit den VSV-G/HA-Q-(Chimäre) und VSV-G/Q-Konstrukten (vollständig) durchgeführt. Wie mit dem HA/Q28 beobachtet wurde, enthielt die Fraktion 2 eines Iodixanol-Gradienten das VSV-G und die Influenza-M1- und -M2-Proteine, wie mittels Western-Blot-Analyse gezeigt (8B, Bahn 2). Wenn Sf9-Zellen mit einer Quad-Rekombinante, die anstelle von HA ein vollständiges VSV-G trug, infiziert wurden, lagen auch alle sondierten Proteine (VSV-G, M1 und M2) in sowohl dem eingeengten Flüssigkeitsüberstand als auch den Fraktionen 2 und 3 des Iodixanol-Gradienten vor (3B, Bahn 3, und 8B). Diese Ergebnisse legten nahe, dass die Infektion von Sf9-Zellen mit entweder Quad-VSV-G/HA-Q (Chimäre) oder VSV-G/Q (vollständig) die Assemblierung und Freisetzung von Influenzavirus-VLP steuerte, die das VSV-G-Proten auf ihrer Oberfläche trugen.
Angesichts der Tatsache, dass einige der HA/Q28-Partikel, die unter dem Elektronenmikroskop untersucht wurden, keine erkennbaren Oberflächen-Spikes zeigten (siehe unten), kommt die Frage auf, ob das Influenzamatrixprotein von sich aus ausreicht, die Assemblierung und Freisetzung vesikulärer Partikel anzutreiben. Um sich mit dieser Frage zu befassen, wurden Sf9-Insektenzellen 72 Stunden mit einer M1-Baculovirus-Rekombinante infiziert und eingeengte Nährmedium-Flüssigkeitsüberstände wurden derselben Analyse wie oben beschrieben unterzogen. Eine Immunoblotanalyse von Iodixanol-Gradienten-Überstandsfraktionen zeigte, dass Matrixprotein in den Fraktionen 2 und 3 eingeengt wurde, ähnlich dem Migrationsmuster der VLP, die von Sf9-Zellen freigesetzt wurden, die mit HA/Q28 infiziert waren (9A).
Es gibt schlagende Beweise dafür (3), dass das Matrixprotein (M1) eine wichtige Rolle beim Transport des Ribonukleoproteinkomplexes (RNP) vom Nukleus zur Zelloberfläche spielt, an der die Virusassemblierung stattfindet. Die Verbindung zwischen der Matrix und den RNP könnte durch Kontakte mit NP, Virion-RNA oder beiden vermittelt sein. Folglich war es interessant, zu beurteilen, ob das Nukleokapsidprotein (NP) in das VLP integriert wurde, wenn Sf9-Zellen mit der Quadrupel-Rekombinante HA/Q28 und einer Einzel-NP-Baculovirus-Rekombinante coinfiziert wurden. Eine Western-Blot-Analyse der Gradientenfraktion 2 zeigte, dass das Nukleokapsidprotein, NP, in der Tat in die resultierenden VLP integriert wurde (9B). Dieses Ergebnis brachte die Frage auf, welche Proteine einen Kontakt mit NP herstellen, um die Integration von NP in das Partikel zu ermöglichen.
Um sich mit dieser Frage zu befassen, wurden Einzel-M1- und NP-Baculovirus-Rekombinanten verwendet. Eine gleichzeitige Expression von M1 und NP in Sf9-Zellen produzierte Membranpartikel, die sich aus beiden Proteinen zusammensetzten. Dies ermöglichte die Beurteilung potentieller Interaktionen zwischen diesen zwei Proteinen in Abwesenheit von definierter Influenza-RNA mit präzisen Termini. Eine Western-Blot-Analyse von gradientengereinigten Partikeln, die von Sf9-Zellen stammten, die doppelt mit M1- und NP-Rekombinanten infiziert worden waren, zeigte, dass M1 und NP sich gemeinsam in denselben Fraktionen lokalisierten (8C). Andererseits induzierte eine Infektion mit einer NP-Rekombinante allein keine Partikelfreisetzung und zeigte kein Vorliegen von reaktionsfähigem NP in einer beliebigen der Fraktionen (Daten nicht gezeigt). Diese Ergebnisse legten eine Interaktion zwischen M1 und NP nahe, die stark genug war, um NP selbst in Abwesenheit von RNA in das M1 enthaltende Partikel zu bringen.
Auf Grundlage der Lokalisierung von NP-Protein in dem Influenzavirus und anderen Studien der Proteinpartikelassemblierung (10) ist es angemessen zu folgern, dass das NP-Protein einen Kontakt mit dem Matrixprotein M1 herstellt und infolge dieser Interaktion in das VLP integriert wird. In mit Influenza infizierten Zellen findet der Transport von RNP vom Nukleus zu der Stelle der Virusassemblierung an der Plasmamembran nach Verbindung mit dem Matrixprotein mittels eines nicht gut charakterisierten Mechanismus statt.
Es wurde gezeigt (27), dass NP-Protein nicht nur an Influenza-RNA bindet, sondern auch mit geringerer Affinität an unspezifische RNA binden kann. Folglich schließt dieses Ergebnis die Möglichkeit nicht aus, dass RNA für eine produktive Interaktion zwischen M1 und NP erforderlich ist.
Folglich kommt man zum Schluss, dass das Matrixprotein nicht nur molekulare Interaktionen initiiert, die zur Assemblierung und Freisetzung von Partikeln führen, sondern auch das Nukleokapsid, NP, binden und in das Partikel integrieren kann. In mit Influenza infizierten Zellen verbindet sich das M1-Protein im Vorgang des Transports und der Virusassemblierung mit den RNP. Im Fall von Einzel-M1-Rekombinanten liegen diese anderen Influenzastrukturen nicht vor, die Ausschleusung findet jedoch nach wie vor statt. NP kann sich als Monomere oder Oligomere oder nach dem Binden zellulärer RNA mit M1 binden. Wie auch immer die Verbindung beschaffen ist, es ist offensichtlich, dass M1 und NP, die in Insektenzellen exprimiert wurden, mit ausreichender Affinität binden, um in ein Vesikel zu assemblieren, das die Zelle verlassen kann.
Um die Beschaffenheit der Verbindung unter den Influenzaproteinen, die gemeinsam in die Fraktionen 2 und 3 migrierten, weiter zu charakterisieren, wurde eine Elektronenmikroskopauswertung des in diesen Fraktionen vorliegenden Materials durchgeführt.
Eine Elektronenmikroskopuntersuchung der Fraktion 2 offenbarte das Vorliegen einer hohen Konzentration sowohl vesikulärer als auch nichtvesikulärer Partikel, die mit Oberflächenprojektionen besetzt sind, die Influenzavirus- und subviralen Partikeln stark ähnelten (10). Die Form und die Strukturmerkmale der VLP variierten in Abhängigkeit von ihren Positionen im Gradienten. Die Spikes, die von der Oberfläche mancher Vesikel hervorragten, schienen insofern Influenza-HA und -NA zu ähneln, dass sie von der Oberfläche der Partikel sich nach außen erstrecken, wie sie dies von der Oberfläche von Influenzavirus tun.
Die Projektionen in manchen VLP von Fraktion 2 waren den HA-Spikes, die in Influenzavirus vorliegen, sehr ähnlich (10). Die Morphologie von NA ist in Proben, die eine solch große Auswahl von mit Spikes besetzten Entitäten enthalten, weniger ausgeprägt. Fraktion 3 enthielt eine ähnliche Auswahl von Partikeln in hoher Konzentration, sie schien jedoch eine höhere Konzentration aggregierter Membrane zu enthalten als Fraktion 2 (Daten nicht gezeigt).
Fraktionen, die unter dem Elektronenmikroskop die größte Anzahl von Influenza-VLP zeigten, enthielten auch die höchsten Konzentrationen von M1- und HA-Proteinen, wie mittels Western-Blot-Analyse gezeigt. Die VLP, die mit Oberflächenprojektionen bedeckt waren und in Bezug auf die Länge von etwa 75 nm bis 150 nm reichten, ähnelten hinsichtlich Größe und Morphologie deutlich Influenzavirus.
Um die Struktur der M1-Partikel weiter zu charakterisieren, wurden diese zwei Fraktionen des Gradienten mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Eine Elektronenmikroskopieuntersuchung mit Negativfärbung zeigte eine große Anzahl von Vesikeln variabler Formen, die keine Spikes auf ihren Oberflächen trugen (Daten nicht gezeigt).
Um zu ermitteln, ob mit Baculovirus infizierte Zellen spontan Vesikel freigaben oder ob die Verbindung von M1-Protein an der Zelloberfläche dazu ausreichte, den Partikelaustritt anzutreiben, wurden ähnliche Gradientenfraktionen eingeengter Flüssigkeitsüberstände von Sf9-Zellen, die mit entweder Wildtyp- oder rekombinantem NP-Baculovirus infiziert worden waren, mittels Elektronenmikroskopie untersucht. Keines der anderen Proteine (NP, HA) wurde in diesen Fraktionen nachgewiesen, wenn der Flüssigkeitsüberstand von Sf9-Zellen, die mit den entsprechenden Einzel-Rekombinanten infiziert worden waren, in der Analyse verwendet wurde. Diese Ergebnisse zeigten, dass das Matrixprotein von sich aus dazu ausreichte, die Assemblierung und Freisetzung von VLP von der Oberfläche von Insektenzellen anzutreiben.
Die Proteinzusammensetzung der Spikes, die von der Oberfläche der VLP hervorragen, wurde mittels Elektronenmikroskopie von mit Immungold markierten Oberflächenantigenen untersucht, die mit spezifischen monoklonalen Antikörpern zu dem HA und der NA sondiert waren (die mit den in den Immunfluoreszenzversuchen verwendeten identisch waren). Diese Untersuchung zeigte, dass das Hauptinfluenzaoberflächenantigen HA in der Tat auf der Oberfläche der VLP vorlag, wie durch das Vorliegen von Goldkügelchen angezeigt (11A). Dies bestätigte, was von der Strukturbeurteilung der Spikes angenommen wurde, die mittels Negativfärbung und Elektronenmikroskopie sichtbar gemacht wurde (10). In ähnlicher Weise offenbarten Immungoldmarkierung mit Anti-NA-Antikörper und Elektronenmikroskopie außerdem das Vorliegen von NA-Glykoprotein auf der Oberfläche der VLP, wenn auch mit geringerer Abundanz als HA (11B).
Es wurden Versuche unternommen, das Vorliegen der M2-Proteine auf der Oberfläche der VLP mittels Immungoldmarkierung unter Verwendung eines polyklonalen Kaninchen-Antikörpers, der gegen Peptide gezüchtet wurde, die 18 Aminosäuren des Aminoterminus von M2-Protein umfassen, nachzuweisen. M2-Protein wurde auf der Oberfläche des Partikels nicht nachgewiesen, auch wenn es in den Gradientenfraktionen vorlag, die Immungoldmarkierungselektronenmikroskopie (IEM) unterzogen wurden. Dies war jedoch nicht überraschend, da IEM ein System ist, das nicht empfindlich genug ist, um Nebenproteine nachzuweisen und selbst mit nativem Influenzavirus wird sehr wenig M2 produziert und es ist schwer nachzuweisen.
Wenn die chimären Influenza-VSV-VLP gereinigt und mittels Elektronenmikroskopie untersucht wurden, wurde von ihnen festgestellt, dass sie eine zu den Influenza-VLP ähnliche Morphologie aufwiesen. Darüber hinaus offenbarte eine Immungoldmarkierungsanalyse, dass sie Oberflächenglykoproteine trugen, die mit Anti-G-Antikörper reagierten (Daten nicht gezeigt).
Partikel, die mit einem der beiden Konstrukte erzeugt wurden, schienen keinen signifikanten Unterschied bezüglich der Morphologie zu zeigen. Die Gehalte von G-Proteinen auf der Oberfläche beider Partikel waren anscheinend ähnlich. Dies legte nahe, dass die potentiell günstige Interaktion zwischen dem HA-Abschnitt der G/HA-Chimäre und dem M1, das unter der Membran liegt, das Ausmaß der Integration von G in das Partikel nicht signifikant steigerte.
Um die Immunogenität der Wildtyp-Influenza-VLP und chimären VLP (die VSV-G enthalten) zu beurteilen, wurden zwei Gruppen Balb/c-Mäuse über den intramuskulären Weg mit entweder HA/Q28 oder VSV-G/Q immunisiert, wobei jeder Satz VLP mit Aluminiumphosphat formuliert wurde. Alle Mäuse in jeder Gruppe erhielten eine Primer- und zwei Booster-Injektionen in Intervallen von zwei Wochen. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden Blutproben gezogen und das Vorliegen von Antikörpern gegen das entsprechende Antigen wurde mittels Western-Blot (für beide Arten von VLP), Inhibition von Hämagglutination (für das HA/Q28) und eines Serumneutralisationstests (für VSV-G/Q) bewertet.
Eine Immunoblotanalyse zeigte, dass die Sera von Mäusen, die mit dem Influenza HA/Q28 immunisiert worden waren, das als das Testimmunogen verwendete Influenzavirus erkannten (vorwiegend HA und M1; 12A und B, Bahn 2). In ähnlicher Weise erkannten Sera von Mäusen, die mit den chimären VLP VSV-G/Q immunisiert worden waren, das G-Protein von VSV (13A und B, Bahn 2).
Die Performanz eines Tests der Inhibition von Influenzavirushämagglutination (IHA) zeigte, dass Sera von mit HA/Q28 immunisierten Mäusen einen IHA-Titer von 96 IHAU aufwiesen, der mehr als doppelt so hoch war wie der von naiven Kontrollmäusen erhaltene (32 IHAU). Diese Reaktion war mit dem IHA-Titer von 128 IHAU nahezu gleich, der von zwei intranasalen Immunisierungen (im Abstand von zwei Wochen) mit lebendigem Influenza A/Hong Kong (H3N2) (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. Mbawuike, Baylor College of Medicine) hervorgerufen wurde, der als eine Positivkontrolle diente.
Eine Neutralisation von VSV mittels Sera von Mäusen, die mit VSV-G/Q immunisiert worden waren, zeigte, dass eine Verdünnung von bis zu 1/64 einen Standardtiter von VSV komplett neutralisierte, wodurch die Bildung etwaiger Plaques in der Zellmonolayer verhindert wurde.
Diese Ergebnisse zeigten, dass die Influenza-VLP eine Antikörperreaktion hervorrief, die nicht nur Wildtyp-Influenzavirus in Western-Blot erkannte, sondern auch eine Influenzavirushämagglutination inhibierte. Darüber hinaus induzierte die Immunisierung von Mäusen mit chimären VLP, die die das VSV-G-Protein trugen, eine humorale Antikörperreaktion, die das VSV-G-Protein von Wildtypvirus in einem Western-Blot erkannte und außerdem eine VSV-Infektion in einem Serumneutralisationstest verhinderte.
Andere Typen von Wirtszellen neben Insektenzellen können ebenfalls mit einem oder mehreren rekombinanten Vektoren verwendet werden, die Influenzavirusstrukturproteine (und, falls gewünscht, ein influenzafreies Protein) kodieren, um VLP zu produzieren. Studien mit dem M-Protein von VSV zeigten, dass diese Eigenschaft in sowohl Insekten-(8) und Säugetierzelltypen (7) gezeigt wurde. Darüber hinaus führte eine Expression von Matrix-M- und -NP-Proteinen von Parainfluenzavirus (ein weiteres nicht segmentiertes Negativstrang-RNA-Virus) in Säugetierzellen zur Bildung und Freisetzung virusähnlicher Partikel (10).
Zu anderen Zelltypen, die zur Verwendung als Wirtszellen geeignet sind, zählen Säugetier-(wie Ovarialzellen des chinesischen Hamsters, BHK-Zellen, SW13-Zellen des Menschen) und Hefewirtszellen (wie Pichia, Saccharomyces). Die Verwendung von Säugetier- oder Hefezellen kann in der Expression von Proteinen mit einer Glykosylierung resultieren, die mehr der von Wildtypproteinen ähnelt, als sie mit Insektenzellen erzielt werden kann.
Geeignete rekombinante Vektoren zur Abgabe von Genen neben Baculovirus beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Viren, wie Vakzinia- und andere Pockenviren, Sindbis-, Adenoviren, venezuelanisches equines Enzephalitisvirus und andere Alphaviren, sowie Plasmid-DNA.
Die rekombinanten Vektoren sollten Promotoren und andere regulatorische Elemente (wie ein Polyadenylierungssignal) beinhalten, die dahingehend wirksam sind, die Expression von Influenzaproteinen (und beliebigen influenzafreien Proteinen) zu steuern, um VLP in dem entsprechenden Wirtszelltyp zu produzieren. Wirtszellen werden mittels herkömmlicher, im Fachbereich bekannter Techniken transfiziert, infiziert oder anderweitig transformiert. Solche Techniken beinhalten außerdem, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Transduktion, Elektroporation und Lipofektion.
Wie hierin beschrieben, reichte die Expression über eine Quadrupel-Baculovirus-Rekombinante der vier Strukturproteine von Influenza (HA, NA, M1, M2) dazu aus, die Assemblierung und Freisetzung von VLP von der Oberfläche von Sf9-Insektenzellen anzutreiben. Dies ist der erste Bericht zur Bildung von Influenza-VLP, die mit nur vier Strukturproteinen produziert wurden. In der Tat können VLP sogar nur ein Strukturprotein, M1, umfassen. Folglich umfasst diese Erfindung VLP, die sich aus M1 allein, M1 plus einem oder zwei von HA, NA und M2 sowie allen vier dieser Strukturproteine zusammensetzen.
Die assemblierten VLP ähneln dem Wildtyp-Influenzavirus in Bezug auf ihre Größe, Partikelmorphologie und feine Struktur der Oberflächenspikes sehr. Des Weiteren deutet die Bildung von VLP in Abwesenheit von Influenza-RNP darauf hin, dass RNP für die Assemblierung und Freisetzung von Partikeln nicht erforderlich sind.
Dieser neuartige Ansatz zum Assemblieren von Influenza-VLP ist von großer Bedeutung für das Design immunogener Zusammensetzungen gegen neue Influenzavarianten. Ein wichtiges Merkmal dieses Systems ist die Fähigkeit, die Oberflächenglykoproteine durch andere Unterarten von HA und/oder NA zu ersetzen; dies wird das Aktualisieren von Formulierungen mit neuen antigenen Varianten dieser Proteine ermöglichen. Da antigene Varianten dieser Glykoproteine identifiziert werden, können die VLP aktualisiert werden, um diese neuen Varianten einzubinden. Folglich könnten sogar äußerst gefährliche Oberflächenglykoproteine wie H1N1 (von der spanischen Gruppe von 1918) oder eine HA/NA-Kombination mit Pandemiepotential in VLP integriert werden, ohne Bedenken in Bezug auf die Auswirkungen der Freisetzung von Genen, die in mehreren Jahrzehnten nicht in Menschen umhergegangen sind. Dies liegt darin begründet, dass die VLP nicht infektiös sind, sich nicht replizieren und keine Erkrankung verursachen können.
Darüber hinaus macht die Durchführbarkeit des Integrierens heterologer Glykoproteine auf der Oberfläche der VLP diesen Ansatz nicht nur als ein Abgabesystem reizvoll, sondern kann auch die Targetierung spezifischer Zelltypen (Tropismus) auf Basis der Oberflächenglykoproteine, die auf ihren Oberflächen integriert sind, ermöglichen. In einer Ausführungsform enthalten die VLP den zytoplasmatischen Schwanz und die Transmembrandomäne von HA und die externe Domäne eines influenzafreien Glykoproteins, was die Erzeugung chimärer Partikel erleichtert, die für multivalente Immunisierungen von Nutzen sind.
Zusammengefasst wurde gezeigt, dass Wildtyp- und chimäre influenzavirusähnliche Partikel nach Expression von nur einem bis vier Virusstrukturproteinen assembliert und von der Oberfläche von Sf9-Zellen freigesetzt werden können, solange das Matrixprotein M1 immer exprimiert wird. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass M1 die Freisetzung vesikulärer Partikel, die NP enthalten, antreiben kann, wenn die zwei zusammen vorliegen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wurde die Bildung und anschließende Enkapsidierung von Ribonukleoproteinkomplexen (RNP) (die die drei Polymeraseuntereinheiten, PA, PB1 und PB2, sowie das Nukleoprotein, NP, enthalten) in die VLP erreicht. Eine zweite Quadrupel-Baculovirus-Rekombinante wurde erzeugt (14), die in Sf9-Insektenzellen gleichzeitig die drei Polymeraseuntereinheiten und NP exprimiert.
Um die RNP-Bildung und -Enkapsidierung zu beurteilen, wurde eine In-vitro-Minus-Sense-RNA-Matrize, die Luciferase in Antisense-Ausrichtung kodiert, synthetisiert, die von den konservierten und nichtkodierenden 3'- und 5'-Regionen der Influenzavirus-NP-Termini flankiert wurde. Die Transfektion von Sf9-Insektenzellen mit der in vitro erzeugten RNA und die anschließende Coinfektion mit Q28 und der zweiten Quadrupel-Rekombinante führte zu der Assemblierung und Freisetzung von VLP, die das Reportergen als auch die Polymerase und NP trugen. Eingeengte Flüssigkeitsüberstände transfizierter/infizierter Sf9-Zellen wurden auf eine Monolayer einer Babyhamsternierenzelle (baby hamster kidney cell, BHK) überführt, inkubiert und die Zellen wurden mit einem Luciferase-Testlysepuffer gespalten. Lysate infizierter Zellen verzeichneten eine Luciferase-Aktivität, die 70- bis 700-mal höher als die nicht infizierter Kontrollzellen war (15).
In ähnlicher Weise wurde, um die RNP-Bildung und -Enkapsidierung zu beurteilen, eine In-vitro-Minus-Sense-RNA-Matrize, die grün fluoreszierendes Protein (GFP) in Antisense-Ausrichtung kodiert, synthetisiert, die von den konservierten und nichtkodierenden 3'- und 5'-Regionen der Influenzavirus-NP- Termini flankiert wurde. Die Transfektion von Sf9-Insektenzellen mit der in vitro erzeugten RNA und die anschließende Coinfektion mit Q28 und der zweiten Quadrupel-Rekombinante führte zu der Assemblierung und Freisetzung von VLP, die das Reportergen als auch die Polymerase und NP trugen. Wenn eingeengte Flüssigkeitsüberstände transfizierter/infizierter Sf9-Zellen auf eine Monolayer einer MDCK-Zelle überführt wurden, wurde die Expression von GFP nachgewiesen (16).
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die von Baculovirus abgeleiteten Partikel RNP enkapsidieren konnten, die in der primären Transkription funktionell waren, wie durch die Expression von Luciferase und GFP gezeigt. Folglich können die VLP RNP assemblieren und verpacken sowie weiterhin eine heterologe Nukleotidsequenz zu integrieren und zu exprimieren. Eine solche exprimierte heterologe Sequenz beinhaltet, ist jedoch nicht darauf beschränkt, eine heterologe Einheit, die nicht vom Influenzavirus produziert wird, einschließlich eines Peptids, Polypeptids oder Proteins von einem influenzafreien pathogenen Mikroorganismus, wie im Folgenden beschrieben. Eine solche exprimierte heterologe Sequenz beinhaltet weiterhin einen Immunmodulator zum Steigern und/oder Verlagern der Immunantwort. Solche Immunmodulatoren beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA, USA) und GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, WA, USA). Noch weitere exprimierte heterologe Sequenzen beinhalten monoklonale Antikörper, die als Targetierungs- und/oder Behandlungseinheiten dienen.
Die VLP dieser Erfindung werden zum Formulieren immunogener oder pharmazeutischer Zusammensetzungen verwendet. Hierzu werden die VLP auf eine adäquate Konzentration eingestellt und mit einem beliebigen geeigneten Adjuvans, Verdünnungsmittel oder Träger formuliert. Physiologisch unbedenkliche Medien können als Träger und/oder Verdünnungsmittel verwendet werden. Diese beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt: Wasser, ein adäquates isotonisches Medium, Glycerin, Ethanol und andere herkömmliche Lösemittel, phosphatgepufferte Kochsalzlösung und dergleichen. Geeignete Adjuvantien beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Aluminiumphosphat, Aluminiumhydroxid, MPL^TM (3-O-deacyliertes Monophosphoryllipid A; RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT, USA, jetzt Corixa), synthetische Lipidanaloga wie 529 (Corixa), Stimulon^TM QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, MA, USA), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA, USA), synthetische Polynukleotide, wie Oligonukleotide, die ein CpG-Motiv enthalten ( US-Patentschrift Nummer 6,207,646 (28)), das hitzelabile Toxin von E. coli und Choleraenterotoxin (beispielsweise entweder in einer Wildtyp- oder Mutantenform, in der die Glutaminsäure an der Aminosäurenposition 29 durch eine andere Aminosäure, vorzugsweise ein Histidin, ersetzt wurde, gemäß der veröffentlichten internationalen Patentanmeldung Nummer WO 00/18434 (29)).
In einer Ausführungsform dieser Erfindung ist die Formulierung, die die VLP enthält, zur Verwendung als eine immunogene Zusammensetzung konzipiert. Das Virus kann mit vor Kälte schützenden Additiven oder Stabilisatoren gemischt werden, wie Proteinen (z. B. Albumin, Gelatine), Zuckern (z. B. Saccharose, Laktose, Sorbit), Aminosäuren (z. B. Natriumglutamat), Kochsalzlösung oder anderen schützenden Mitteln. Dieses Gemisch wird in einem flüssigen Zustand gehalten oder wird dann zum Transport und zur Lagerung entwässert oder lyophilisiert und direkt vor der Verabreichung mit Wasser gemischt.
Formulierungen, die VLP enthalten, die nur Influenzavirusstrukturproteine enthalten, sind zum Immunisieren eines Menschen oder eines anderen Vertebratprobanden von Nutzen, um einen Schutz gegen eine Infektion mit Influenzavirus zu induzieren. Folglich stellt diese Erfindung weiterhin Zusammensetzungen zum Immunisieren eines Probanden, um einen Schutz gegen eine Infektion mit Influenzavirus zu induzieren, bereit, die eine wirksame immunisierende Menge einer Formulierung der immunogenen Zusammensetzung umfassen, die VLP integriert, die nur Influenzavirusstrukturproteine enthält, die wie hierin oben beschrieben erzeugt wurden.
Formulierungen, die VLP umfassen, die Oberflächenglykoproteine von unterschiedlichen Unterarten von Influenzavirus enthalten, wie HA von einer Unterart und NA von einer anderen Unterart, werden mit einem Verdünnungsmittel oder Träger als eine bivalente immunogene Zusammensetzung zum Immunisieren von Vertebraten gegen eine Infektion, die von diesen zwei Unterarten von Influenzavirus verursacht wird, formuliert. Wie oben erörtert, kann jedes von HA und NA ersetzt werden, da antigene Varianten identifiziert werden. Folglich werden aktualisierte chimäre VLP gemäß den hierin beschriebenen Verfahren einfach konstruiert.
Alternativ werden multivalente immunogene Zusammensetzungen durch Erzeugen eines Satzes von VLP von jedem Influenzastamm von Interesse, Mischen der Sätze von VLP in adäquaten Verhältnissen und Verabreichen der resultierenden immunogenen Zusammensetzung hergestellt.
Formulierungen dieser Erfindung umfassen auch VLP, in denen ein Teil oder alle des HA oder der NA durch eine heterologe Einheit ersetzt ist, die nicht vom Influenzavirus produziert wird, um chimäre VLP zu umfassen. Solche Einheiten beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, ein Peptid, Polypeptid oder Protein. Wenn nur ein Teil des HA oder der NA ersetzt werden soll, wird ein Teil der DNA-Sequenz in dem rekombinanten DNA-Molekül, die das HA oder die NA kodiert, durch eine DNA-Sequenz ersetzt, die das influenzafreie Peptid, Polypeptid oder Protein kodiert. Wenn das gesamte HA oder die gesamte NA ersetzt werden soll, wird die gesamte DNA-Sequenz in dem rekombinanten DNA-Molekül, die das HA oder die NA kodiert, durch eine DNA-Sequenz ersetzt, die das influenzafreie Peptid, Polypeptid oder Protein kodiert.
Alternativ wird eine wie oben beschriebene heterologe Einheit, die nicht vom Influenzavirus (oder einem Influenzavirussegment wie dem, das NP kodiert) produziert wird, in die VLP integriert. Dies wird durch Coinfizieren, Cotransfizieren oder anderweitiges Cotransformieren einer geeigneten Wirtszelle mit: (a) einem oder mehreren rekombinanten DNA-Molekülen, die jeweils mindestens ein Influenzavirusstrukturprotein kodieren, wobei immer ein rekombinantes DNA-Molekül, das M1 kodiert, konstruiert wird, und (b) einem rekombinanten DNA-Molekül, das die heterologe Einheit (oder das Influenzavirussegment) kodiert, Kultivieren der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des mindestens einen Influenzavirusstrukturproteins gestatten, so dass VLP nach der Expression des mindestens einen Influenzavirusstrukturproteins innerhalb der Zellen assembliert werden, und Reinigen der VLP von dem Nährmedium-Flüssigkeitsüberstand erzielt. Die heterologe Einheit (oder das Influenzaprotein) wird in die VLP integriert.
Wenn ein solches influenzafreies Peptid, Polypeptid oder Protein von einem pathogenen Mikroorganismus stammt, werden die resultierenden chimären VLP mit einem Verdünnungsmittel oder Träger als eine immunogene Zusammensetzung zum Immunisieren von Vertebraten gegen eine Infektion, die von diesem pathogenen Mikroorganismus (sowie Influenzavirus) verursacht wurde, formuliert. Am typischsten enthält das chimäre VLP ein Oberflächenantigen von einem influenzafreien pathogenen Mikroorganismus.
Solche influenzafreien pathogenen Mikroorganismen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, jene von Viren, Bakterien, Pilzen oder parasitischen Mikroorganismen, die Menschen und nichtmenschliche Vertebrate infizieren. Andere Arten von influenzafreien Einheiten beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, jene von Krebszellen oder Tumorzellen, monoklonalen Antikörpern (beispielsweise als Targetierungs- und/oder Behandlungseinheiten verwendet), Allergenen, Amyloidpeptidprotein oder anderen makromolekularen Komponenten.
Beispiele solcher Viren beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, humanes Immundefizienzvirus, Affen-Immundefizienzvirus, Respiratory-Syncytial-Virus, Parainfluenzavirus Typen 1–3, Herpes-Simplex-Virus, humanes Zytomegalievirus, Hepatitis-A-Virus, Hepatitis-B-Virus, Hepatitis-C-Virus, humanes Papillomavirus, Poliovirus, Rotavirus, Calicivirus, Masernvirus, Mumpsvirus, Rubellavirus, Adenovirus, Tollwutvirus, Hundestaupevirus, Rinderpestvirus, Coronavirus, Parvovirus, infektiöse Rhinotracheitisviren, Katzenleukämievirus, Virus der infektiösen Peritonitis der Katze, Virus der infektiösen Schleimbeutelerkrankung des Vogels, Newcastle-Disease-Virus, Marek-Virus, Virus des respiratorischen und reproduktiven Syndroms des Schweins, Arteritisvirus des Pferds und verschiedene Enzephalitisviren.
Beispiele solcher Bakterien beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Haemophilus influenzae (sowohl typisierbar als auch nicht typisierbar), Haemophilus somnus, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis, Helicobacter pylori, Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis, Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci, Bordetella pertussis, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Salmonella choleraesuis, Escherichia coli, Shigella, Vibrio cholerae, Corynebacterium diphtheriae, Mycobacterium tuberculosis, Komplex aus Mycobacterium avium und Mycobacterium intracellulare, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Staphylococcus aureus, Clostridium tetani, Leptospira interrogans, Borrelia burgdorferi, Pasteurella haemolytica, Pasteurella multocida, Actinobacillus pleuropneumoniae und Mycoplasma gallisepticum.
Beispiele solcher Pilze beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Aspergillis, Blastomyces, Candida, Coccidiodes, Cryptococcus und Histoplasma.
Beispiele solcher Parasiten beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, Leishmania major, Ascaris, Trichuris, Giardia, Schistosoma, Cryptosporidium, Trichomonas, Toxoplasma gondii und Pneumocystis carinii.
Beispiele solcher Krebszellen oder Tumorzellen beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, prostataspezifisches Antigen, carcinoembryonales Antigen, MUC-1, Her2, CA-125 und MAGE-3.
Beispiele solcher Allergene beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, die in der US-Patentschrift Nummer 5,830,877 (30) und der veröffentlichten Patentanmeldung Nummer WO 99/51259 (31) beschriebenen, und beinhalten Pollen, Insektengifte, Tierhautschuppen, Pilzsporen und Arzneimittel (wie Penicillin). Solche Komponenten stören die Produktion von IgE-Antikörpern, eine bekannte Ursache allergischer Reaktionen.
Amyloidpeptidprotein (APP) wurde mit Erkrankungen in Verbindung gebracht, die wechselnd als Alzheimer-Krankheit, Amyloidose oder amyloide Degeneration bezeichnet werden. Das β-Amyloidpeptid (auch als Aβ-Peptid bezeichnet) ist ein APP-Fragment mit 42 Aminosäuren, das durch Verarbeiten von APP mit den β- und γ-Sekretaseenzymen erzeugt wird und die folgende Sequenz aufweist: Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala (SEQ ID NO: 2).
In einigen Patienten nimmt die Amyloidablagerung die Form eines aggregierten Aβ-Peptids an. Überraschenderweise wurde nun festgestellt, dass eine Verabreichung von isoliertem AβP-Peptid eine Immunantwort gegen die Aβ-Peptid-Komponente einer Amyloidablagerung in einem Vertebratwirt induziert (32). Solche Aβ-Peptide wurden ebenfalls mit nicht damit verwandten Einheiten in Verbindung gebracht. Folglich beinhalten die VLP dieser Erfindung die Expression dieses Aβ-Peptids anstelle eines Teils oder von allem des HA oder der NA von Influenzavirus sowie Fragmente von Aβ-Peptid und Antikörper zu Aβ-Peptid oder Fragmenten davon. Ein solches Fragment von Aβ-Peptid ist das Peptid mit 28 Aminosäuren mit der folgenden Sequenz (33): Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys (SEQ ID NO: 3).
Dem Probanden wird eine ausreichende Menge einer oben beschriebenen immunogenen Zusammensetzung in einer adäquaten Anzahl von Dosen verabreicht, um eine Immunantwort hervorzurufen. Fachmänner werden leicht dazu im Stande sein, solche Mengen und Dosierungen zu ermitteln. Die Verabreichung kann mittels einer beliebigen herkömmlichen wirksamen Form erfolgen, wie intranasal, parenteral, oral oder topisch auf eine beliebige Schleimhautoberfläche, wie eine intranasale, orale, Augen-, Lungen-, vaginalen oder rektalen Oberfläche, aufgebracht, wie mittels eines Aerosolsprays. Das bevorzugte Verabreichungsmittel ist mittels intranasaler Verabreichung.
Ein solches influenzafreies Peptid, Polypeptid oder Protein kann auch eine pharmazeutisch wirksame Einheit sein. Solche Einheiten beinhalten, sind jedoch nicht darauf beschränkt, therapeutische Proteine, Wachstumsfaktoren, Immunmodulatoren, monoklonale Antikörper sowie die oben im Hinblick auf die immunogenen Zusammensetzungen aufgeführten Einheiten. Diese chimären VLP werden mit einem Verdünnungsmittel oder Träger, wie oben erörtert, als eine pharmazeutische Zusammensetzung formuliert und in einer Menge verabreicht, die zum Behandeln von Vertebraten mit solch einem derartigen influenzafreien Peptid, Polypeptid oder Protein wirksam ist. Eine wirksame Menge wird von Fachmännern einfach ermittelt.
Die vorstehenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können weiterhin ein Adjuvans umfassen, die oben erörtert.
Ein solches influenzafreies Peptid, Polypeptid oder Protein kann auch ein Rezeptor oder Ligand sein, der in Rezeptor-Ligand-Studien von Nutzen ist. Zum Beispiel ist ein influenzafreies Glykoprotein in VLP enthalten, das zu einem spezifischen Rezeptor targetiert wird.
In all diesen immunogenen oder pharmazeutischen Zusammensetzungen können die VLP bei Verabreichung an einen Vertebratwirt eine Immunantwort induzieren, können jedoch keine Krankheitssymptome verursachen, da VLP kein genetisches Material enthalten und sich nicht in dem Vertebratprobanden replizieren können.
Damit diese Erfindung besser verstanden wird, werden die folgenden Beispiele zum Zwecke der Veranschaulichung ausgeführt.
Beispiele
Beispiel 1
Klonierung von Influenza-M2-Gen in den Baculovirus-Transfervektor pAcAB4
Das Influenza-M2-Gen, bei dem es sich um ein gespleißtes Produkt der M1-mRNA handelt, wurde mittels RT-PCR aus polyadenylierter mRNA isoliert, die aus MDCK-Zellen extrahiert wurde, die mit dem Influenza-A/Udorn/72-(H3N2)-Stamm infiziert worden waren. Das M2-Gen wurde als ein DNA-Insert in einen pGemT-Vektor (Promega) kloniert und unter Verwendung einer Farbstoffterminationssequenzierungsreaktion und einem DNA-Sequenzautomat ABI 377 (Applied Biosystems) mit spezifischen Primern sequenziert.
Das M2-Gen wurde mittels Verdau mit dem EagI-Restriktionsenzym aus dem pGemT-M2-Plasmid freigesetzt und zur Klonierung in den Baculovirus-Transfervektor pAcAB4 (Pharmingen) vorbereitet. Die M2-DNA-Fragmente wurden mit DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) aufgefüllt und BglII-Linker wurden mittels Ligation mit T4-DNA-Ligase in die Termini integriert. Alle Enzyme und Linker wurden von New England Biolabs (NEB) bezogen. Der Transfervektor pAcAB4 wurde dann mit BglII verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (calf intestinal alkaline phosphatase, CIP) behandelt. Das M2-Insert wurde dann auf Gel gereinigt (Qiagen) und in den Transfervektor in einem Verhältnis von 3:1 ligiert. Ein positiver Klon wurde mittels Restriktionsanalyse ausgewählt und Plasmid-DNA wurde unter Verwendung eines Qiagen-Plasmidreinigungskits aus einer 100-ml-E.-coli-Kultur hergestellt. Dieses Konstrukt wird nun als pAcAB4/M2 bezeichnet.
Beispiel 2
Konstruktion eines intermediären Vektors („Shuttle"-Vektors)
Aufgrund von Beschränkungen der Anzahl zweckmäßiger Restriktionsstellen zum Klonieren von Influenzagenen in den Transfervektor pAcAB4 wurde ein Shuttle-Klonierungsvektor erzeugt, der drei Baculovirus-Promotoren (zwei Polyhedrin und ein p10) trug, die von neuen Restriktionsstellen flankiert wurden, die mittels PCR hinzugefügt wurden. Dieser Shuttle-Vektor wurde wie folgt konstruiert: pAcAB4/M2 (aus Beispiel 1) wurde mit SmaI verdaut und in zwei Proben aufgeteilt. Eine pAcAB4/M2-SmaI-Probe wurde mit XbaI verdaut, was ein 400 Nukleotide langes DNA-Fragment freisetzte. Diese DNA wurde auf Gel gereinigt und mittels PCR mit zwei Primern amplifiziert, von denen einer in ein Ende des Endprodukts der PmeI-(kursiv) und NofI-Stellen (unterstrichen) integriert wurde:
Die andere pAcAB4/M2-SmaI-Probe wurde mit BamHI verdaut und das freigesetzte SmaI/BamHI-DNA-Fragment wurde auf Gel gereinigt und ebenfalls mittels PCR mit zwei Primern amplifiziert, von denen einer in das PCR-Endprodukt der SacI-(kursiv) und NheI-Stellen (unterstrichen) integriert wurde:
Diese zwei PCR-Produkte, die sich an den unmodifizierten Termini überlappen, wurden in einer anderen PCR-Reaktion mit zwei externen Primern, die für die neu integrierten Restriktionsenzymstellen spezifisch sind, verwendet:
Diese PCR-DNA wurde dann mit SacI/PmeI verdaut. Das Plasmid pNEB193 (Promega) wurde auch mit SacI/PmeI verdaut und mit der verdauten PCR-DNA mit T4-Ligase ligiert. Schließlich trägt dieser resultierende pNEB193-Shuttle-Vektor ein DNA-Fragment, das zwei Polyhedrin-Promotoren und einen p10-Promotor enthält, die von neuen Restriktionsstellen flankiert werden, die in der folgenden Klonierung der Influenzagene HA, NA und M1 verwendet werden.
Beispiel 3
Klonierung von Influenza-HA-, -NA- und -M1-Genen in den Shuttle-Vektor
Die Influenzagene HA, NA und Matrix (M1) wurden mittels RT-PCR aus gereinigter genomischer RNA von Influenzavirus A/Udorn/72 (H3N2) gewonnen. Alle drei Gene wurden als DNA-Inserts in pGemT- oder pGemTeasy-Vektoren (Promega) kloniert und unter Verwendung einer Farbstoffterminationssequenzierungsreaktion und einem DNA-Sequenzautomat ABI 377 mit spezifischen Primern sequenziert. Die zwei Donor-Spleißstellen am 5'-Ende des M1-Gens wurden unter Verwendung eines QuikChange-Kits von Stratagene (pGT-M1-Spleiß) mutiert, um das potentielle Spleißen der m1-mRNA in Wirtszellen zu verhindern.
Diese drei Gene wurden in drei Schritten in den Shuttle-Vektor kloniert:
1) Klonierung von M1-Gen:
Das pGemT/M1-(Spleiß)-Plasmid (pGemT, das das M1-Gen trägt) wurde als die Matrize in einer PCR-Reaktion mit 5'- und 3'-Primern verwendet, die eine NheI- bzw. eine SacI-Stelle in die amplifizierte DNA einführten. Diese PCR-DNA wurde dann mit NheI/SacI verdaut und auf Gel gereinigt. In ähnlicher Weise wurde der pNEB193-Shuttle-Vektor mit NheI/SacI verdaut und gereinigt. Der Shuttle-Vektor und das Insert (M1-PCR) wurden ligiert und nach der Transfektion in E. coli amplifiziert. Das M1-Gen wurde unter Verwendung von BigDye (Perkin Elmer) sequenziert. Das M1-Gen war stromabwärts von dem Polyhedrin-Promotor positioniert. Das resultierende Plasmid wurde pNEB193M1 genannt.
2) Klonierung von HA-Gen:
Das pGemT/HA-Plasmid (pGemT, das das HA-Gen trägt) wurde mit SacII verdaut und zu den Enden aufgefüllt. NotI-Linker wurden auf die verdaute DNA ligiert. Die DNA wurde dann mit NotI verdaut, so dass das HA-Insert freigesetzt werden und NotI-Stellen an jedem Ende aufweisen würde. Das Plasmid pNEB193M1 wurde mit NotI verdaut, mit Phosphatase aus Kälberdarm (calf intestinal phosphatase, CIP) behandelt und das HA-Insert wurde mit T4-DNA-Ligase (nicht direktional) in es ligiert. PCR wurde zum Ermitteln der Ausrichtung des HA-Gens angewendet, das sich unter der Transkriptionskontrolle des Polyhedrin-Promotors befindet. Das resultierende Plasmid wurde pNEB193M1/HA genannt.
3) Klonierung von NA-Gen:
Das Plasmid pGemT/NA3B (pGemT, das das NA-Gen trägt) wurde zunächst mit SacII verdaut und mit T4-DNA-Polymerase zu den Enden aufgefüllt. Anschließend wurde das NA-Gen mittels Verdau mit SpeI freigesetzt und mit Klenow aufgefüllt und das NA-Insert wurde an die stumpfen Enden ligiert. Als Nächstes wurde pNEB193M1/HA mit SmaI verdaut und das NA-Insert wurde an die stumpfen Enden ligiert. PCR wurde zum Identifizieren des Klons angewendet, der das NA-Gen in der korrekten Ausrichtung trug. Das NA-Gen war stromabwärts von dem p10-Promotor positioniert. Das resultierende Plasmid wurde pNEB193M1/HA/NA genannt.
Beispiel 4
Konstruktion eines Transfervektors, der die Influenzagenen M2, M1, HA und NA enthält
Nach Abschluss des in Beispiel 3 beschriebenen Vorgangs enthielt der Shuttle-Vektor pNEB193M1/HA/NA die M1-, HA- und NA-Gene, die unter Transkriptionsregulationskontrolle von Baculovirus-Promotoren stehen. Um diese drei Gene als ein einziges DNA-Stück freizusetzen, wurde der Shuttle-Vektor mit PmeI/SacI verdaut. Dieses DNA-Fragment wurde in pAcAB4/M2 aus Beispiel 1 (das bereits das M2-Gen enthielt) ligiert, das wie folgt modifiziert worden war: Neue Restriktionsstellen wurden in das pAcAB4/M2 eingeführt, um die Klonierung des DNA-Fragments zu erleichtern, das diese drei Gene von dem Shuttle-Vektor enthielt. Dieses pAcAB4/M2-Plasmid wurde dann mit XbaI verdaut, die Termini mit DNA-Polymerase (Klenow-Fragment) aufgefüllt und PmeI-Linker mit T4-DNA-Ligase hinzugefügt. Diese DNA wurde dann mit PmeI verdaut und religiert, um die PmeI-Stelle wiederherzustellen. In ähnlicher Weise wurde das religierte Plasmid mit BamHI verdaut, mit DNA-Polymerase (Klenow) aufgefüllt und SacI-Linker wurden mit T4-Ligase angelagert. Ein anschließender Verdau mit SacI und eine Ligation stellte die SacI-Stelle wieder her. Der resultierende pAcAB4/M2-Vektor weist zwei neue Stellen auf, PmeI und SacI. Der Vektor wurde zur Insertion der zusätzlichen Influenzagene durch Verdau mit PmeI/SacI und Gelreinigung vorbereitet. Alle Junktionen wurden sequenziert, um sicherzustellen, dass während der pNEB193-Klonierung keine Mutationen eingeführt wurden. Das resultierende Konstrukt wurde als HA/Q bezeichnet (siehe 1), bei dem es sich um einen Transfervektor handelt, der vier Influenzagene (pAcAB4/M2/M1/HA/NA) trägt.
Beispiel 5
Erzeugung chimärer Transfervektoren
Die kodierende Sequenz für das VSV-G-Protein wurde von dem VSV mittels RT-PCR viraler RNA mit spezifischen Primern zu den 3'- und 5'-Enden des G-Gens (5'-AACAGAGATCGATCTGT-3' (SEQ ID NO: 10) und 5'-CATAAAAATTAAAAATTAAAATATAATTAAGG-3' (SEQ ID NO: 11)) wiederhergestellt und in pGemT-Plasmid (Promega) kloniert. Der resultierende pGemT-VSV-Klon wurde mit SacII verdaut und mit T4-DNA-Polymerase an den Enden abgestumpft. Er wurde dann mit SpeI verdaut und mit Klenow zu den Enden aufgefüllt. NotI-Linker wurden mit T4-Ligase hinzugefügt und dann erneut mit NotI verdaut. Anschließend wurde die VSV-G kodierende Sequenz in den Q28-Vektor ligiert, der mit NotI verdaut worden war, um das HA-Gen zu entfernen. Die Ausrichtung des Gens wurde mittels PCR und Sequenzierung bestätigt. Dieses Konstrukt wurde als Transfervektor VSV-G bezeichnet.
In einer alternativen Ausführungsform wurde nur ein Teil des VSV-G-Gens inseriert. Ein chimäres Gen (siehe 2), das die Ectodomäne von G-Protein enthielt, die im Raster („in frame") mit der Transmembrandomäne (29 Aminosäuren) und zytoplasmatischen Domäne (14 Aminosäuren) von HA fusioniert war, wurde wie folgt mittels PCR erzeugt: Die Transmembrandomäne und der zytoplasmatische Schwanz des Influenza-HA-Gens wurden von dem pGemT-HA-Klon mittels PCR amplifiziert und auf Gel gereinigt. Die Ectodomäne des VSV-G-Gens wurde ebenfalls mittels PCR amplifiziert und auf Gel gereinigt. Beide diese DNA-Fragmente wurden als Matrizen in einer PCR-Reaktion mit Pfu-DNA-Polymerase (Stratagene, LaJolla, CA, USA) unter Verwendung eines Primers verwendet, die dem 5'-Ende des VSV-G-Gens und dem 3'-Ende des HA-Gens entsprechen. Ein DNA-Fragment von 1620 bp wurde auf Gel gereinigt und NotI-Linker wurden mit T4-Ligase hinzugefügt, worauf ein Verdau mit NotI folgte. Dieses Insert wurde in den HA/Q-Vektor ligiert, der mit NotI verdaut worden war, um das HA-Gen zu entfernen. Das resultierende Konstrukt erzeugte den Transfervektor VSV-G/HA (Chimäre).
Beispiel 6
Transfektion von Quadrupel-Baculovirus-Rekombinanten in Insektenzellen
Sf9-Zellen (ATCC CRL 1711) wurden auf 60-mm-Schalen in einer Dichte von 2 × 10⁶ Zellen pro Schale gesät. Ungefähr 2 μg HA/Q-Transfervektor wurden mit 0,5 μg linearisierter BaculoGold-DNA (Pharmingen) gemischt und die Sf9-Zellen wurden unter Verwendung des BaculoGold-Transfektionskits (Pharmingen) mit der DNA transfiziert. Rekombinante Baculoviren wurden ausgewählt und durch drei Plaquereinigungsrunden gereinigt. Eine solche plaquegereinigte Rekombinante wurde als HA/Q28 bezeichnet und wurde für weitere Studien ausgewählt.
Darüber hinaus wurde die Quadrupel-Transfervektor-DNA, die ein vollständiges VSV-G oder ein VSV-G/HA (Chimäre) trug, mit linearisierter BaculoGold-DNA in Sf9-Zellen transfiziert, wie oben beschrieben, um die Rekombinanten VSV-G/Q und VSV-G/HA/Q zu erzeugen. Rekombinante Viren wurden wie oben für HA/Q28 beschrieben ausgewählt. Alle Rekombinanten wurden in Sf9-Zellen auf einen Titer von 7 × 10⁷ PBE/ml amplifiziert.
Beispiel 7
Wachstum von Sf9-Insektenzellen und Infektion mit Baculovirus-Rekombinanten
Alle Sf9-Zellkulturen wurden in Suspension in serumfreien Medien gezüchtet. Infektionen mit Baculovirus-Rekombinanten wurden mit einer Infektionsmultiplizität (multiplicity of infection, MOI) von 5 durchgeführt. Rekombinante Viren wurden in einem kleinen Volumen in die Zellmonolayers inokuliert, 30 Minuten bei Raumtemperatur adsorbieren gelassen und dann nach Zugabe serumfreier frischer Medien bei 28°C inkubiert. Die Zellen und Kulturmedien wurden 72 Stunden nach der Infektion gesammelt, sofern nicht anders angegeben, und zur anschließenden Analyse der Expression von Proteinen und der Bildung von VLP verwendet.
Beispiel 8
Klonierung einzelner Influenzagene in den Transfervektor pBlueBac4.5 und Erzeugung von Einzel-Baculovirus-Rekombinanten
Das M1-Gen von Influenza A/Udorn wurde zuvor in pGemT (pGT-M1-Spleiß, siehe Beispiel 1 oben) kloniert. Um das M1-Gen zu subklonieren, wurde pGT-M1 mit SacII verdaut, mit T4-DNA-Polymerase an den Enden abgestumpft und SacI-Linker wurden an den Enden mit T4-Ligase hinzugefügt. Das Plasmid wird dann mit SacI/SalII verdaut und das freigesetzte M1 wurde auf Gel gereinigt. Das Insert wurde in pBlueBac4.5 (Invitrogen) ligiert, das mit SacI/SalII verdaut worden war, und DH5α-Zellen wurden mit dem Ligationsmix transformiert.
Um das HA-Gen in pBlueBac4.5 zu subklonieren, wurde pGemT/HA (siehe Beispiel 3 oben) mit SacII verdaut und mit T4-DNA-Polymerase an den Enden abgestumpft. Die DNA wurde dann erneut mit SalI verdaut, um das Insert zu entfernen, und wurde auf Gel gereinigt. Das HA-Insert wurde in mit NheI (stumpf)/SalI verdautem pBlueBac4.5 ligiert und STBL-kompetente E.-coli-Zellen wurden mit dem Ligationsmix transformiert.
Das pGemT-NA (siehe Beispiel 3 oben) wurde mit SacII verdaut und mit T4-DNA-Polymerase an den Enden abgestumpft. Die DNA wurde dann mit SpeI verdaut und auf Gel gereinigt. Das Insert wurde in einen pBlueBac4.5-Vektor ligiert, der mit NheI/SmaI verdaut worden war, und STBL-kompetente E.-coli-Zellen wurden transformiert.
Wenn mittels Sequenzierung festgestellt wurde, dass die Transfervektor-DNA korrekt war, wurden Sf9-Zellen mit 5 μg jedes pBlueBac-Klons und 10 μg Bac & Blue-DNA (Invitrogen) transformiert. Die Sf9-Zellen wurden mit diesen DNA mittels liposomvermittelter Transfektion cotransfiziert. Die Zellen wurden fünf Tage inkubiert und der Flüssigkeitsüberstand wurde plaquegereinigt. Einzelne blaue Plaques wurden gezüchtet und in Sf9-Zellen amplifiziert und die Proteinexpression wurde mittels Western-Blots beurteilt. Die NP-Baculovirus-Rekombinante (die das Influenza-NP-Gen enthielt), die in dieser Studie verwendet wurde, wurde wie von Galarza et al. (27) beschrieben konstruiert.
Beispiel 9
Immunoblotanalyse
Eine Western-Blot-Analyse wurde dazu angewendet, Proteine in infizierten Sf9-Zellen, eingeengten Flüssigkeitsüberständen und Gradientenfraktionen zu identifizieren. Proben wurden auf einem 10%-igen SDS-PAGE-Gel (sofern nicht anders angegeben) gelöst und auf eine Nitrocellulosemembran überführt. Die Blots wurden in einer Lösung von TBS (Tris-gepufferter Kochsalzlösung) blockiert, die 5% fettfreie Trockenmilch und 0,1% Tween-20 enthielt, und anschließend mit einem Gemisch monoklonaler Antikörper zu den Influenza-HA-, -M1-(Matrix) und -M2-Proteinen sondiert. Der monoklonale Maus-Anti-HA (Klon 12CA5) wurde von Roche Molecular Biochemicals (Indianapolis, IN, USA) bezogen. Monoklonaler Maus-Anti-M1 (Klon GA2B) stammte von Serotec (Raleigh, NC, USA). Monoklonaler Maus-Anti-M2 stammte vom Mt. Sinai Hybridoma Center (New York, NY, USA). Antigene wurden auf Western-Blots mit einem mit alkalischer Phosphatase konjugierten sekundären Anti-Maus-IgG-Antikörper (Promega) sichtbar gemacht. Analysen der VLP-Bildung in Sf9-Zellen, die mit einer Einfach-, Doppel- oder Dreifachkombination von Einzel-Gen-Baculovirus-Rekombinanten infiziert waren, wurden in einer ähnlichen Art und Weise durchgeführt. Eine Analyse von Proben, die VSV-G-Protein enthielten, wurden mit einem monoklonalen Maus-Anti-G-Antikörper (Klon P5D4; Roche Molecular Biochemicals) in Kombination mit den Antikörpern zu den Influenza-M1- und -M2-Proteinen sondiert. Die Ergebnisse sind in 3 gezeigt.
Beispiel 10
Immunfluoreszenz infizierter Sf9-Zellen
Sf9-Zellen wurden in Objektträgern mit acht Kammern (Kästchenkulturen) gezüchtet und mit Quadrupel- oder Einzel-Gen-Baculovirus-Rekombinanten mit einer MOI von 1 infiziert. Zu 72 Stunden nach der Infektion wurden einzelne Kästchen von Sf9-Zellen in entweder Methanol/Aceton (2:1) oder 3%-igem Paraformaldehyd fixiert. Als ein Blockierungsschritt wurden fixierte Zellen 30 Minuten bei Raumtemperatur in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (phosphate-buffered saline, PBS), die 3% Rinderserumalbumin (RSA) enthielt, inkubiert. Anschließend wurde jeder Objektträger sequentiell mit einer Lösung primärer und sekundärer Antikörper inkubiert. Eine Kombination von monoklonalen Ratte-Anti-HA-(Roche Molecular Biochemicals) und Maus-Anti-M1-Antikörpern (siehe Beispiel 9) (als primäre, 1:100-Verdünnung) und eine Kombination von mit Ziege-Anti-Ratte-Rhodamin konjugierten (Molecular Probes) und Schaf-Anti-Maus-FITC konjugierten (Sigma) Antikörpern (als sekundäre) zum Untersuchen der Expression von HA und M1 verwendet. Eine Kombination von monoklonalen Ratte-Anti-HA- und Kaninchen-Anti-NA-Peptiden (individuell von Research Genetics angefertigt) (als primäre, 1:100-Verdünnung) und mit Ziege-Anti-Ratte-Rhodamin konjugierten (Molecular Probes) und Schaf-Anti-Kaninchen-FITC konjugierten (Sigma) Antikörpern (als sekundäre) zum Untersuchen der Expression von NA und HA verwendet. Als eine Alternative zu Rhodamin kann ein mit Cy3 konjugierter Ziege-Anti-Ratte-Antikörper (Sigma) verwendet werden. Jede Antikörperreaktion wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und die Objektträger wurden zwischen Schritten dreimal mit PBS gespült. Die FITC- und Rhodamin-Moleküle gaben bei Exzitation bei Wellenlängen von 495 nm und 552 nm ein grünes bzw. rotes Licht ab, die mit adäquaten Filtern unterschieden wurden. Die Ergebnisse der Immunfluoreszenzanalysen sind in den 4–7 gezeigt.
Beispiel 11
Reinigung von Influenza-VLP
Sf9-Zellen wurden in einer Dichte von 7,5 × 10⁷ Zellen pro 150 cm² Gewebekulturkolben gesät und sich 30 Minuten bei Raumtemperatur setzen gelassen. Die Zellen wurden mit Baculovirus-Rekombinanten (HA/Q28-, VSV-G/Q-, VSV-G/HA/Q-Chimäre oder Einzel-Rekombinante) mit einer MOI von 5 infiziert und die Infektion wurde 72 Stunden bei 28°C fortfahren gelassen. Nach dem Abschluss wurde das Kulturmedium geerntet und einer Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit (30 Minuten bei 4°C und 2000 × g) unterzogen. Der Flüssigkeitsüberstand wurde dann durch Schleudern bei 200.000 × g für 90 Minuten pelletiert. Je nach der Anzahl der anfänglich infizierten Zellen wurden die resultierenden Pellets in 50 μl oder 500 μl 1X PBS resuspendiert, durch eine kurze Beschallung homogenisiert und dann auf einen Iodixanol-Gradienten (Optiprep, Nycomed/Sigma; Dichte von 1,08 g/ml bis 1,32 g/ml) geladen. Der Gradient wurde 3,5 Stunden bei 200.000 × g geschleudert und Fraktionen wurden unter Verwendung eines U-förmigen Mikrokapillarröhrchens durch Schwerkraft von dem Boden des Röhrchens gesammelt. Aliquots dieser Fraktionen wurden nach SDS-PAGE mittels Western-Blot analysiert. Die Western-Blots sind in den 8 und 9 gezeigt. Um die Partikel weiter zu reinigen, wurden Fraktionen, die die VLP enthalten, einer zweiten Saccharosegradient-Zentrifugation unterzogen. Zur Saccharoseäqulibriumsgradient-Zentrifugation wurde die zuvor gewählte Fraktion mit PBS dialysiert und auf einem Gradienten von 20–60 Gew.-% Saccharose (in NTE) geschichtet und 22 Stunden bei 4°C und 150.000 × g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden Fraktionen von 0,5 ml vom Boden des Röhrchens gesammelt, wie oben beschrieben, und nach SDS-PAGE mittels Western-Blot analysiert.
Die Fraktionen, die die VLP enthielten, wurden dann mittels Elektronenmikroskopie und Immungoldmarkierung untersucht (siehe Beispiel 12).
Beispiel 12
Elektronenmikroskopie: Negativfärbung und Immungoldmarkierung
Für eine Negativfärbung und Immungoldmarkierung wurden VLP von Nährmedium-Flüssigkeitsüberstand eingeengt und mittels zweier aufeinander folgender Dichtegradient-Zentrifugationen gereinigt (siehe Beispiel 11). Aliquots der Proben wurden auf frischen abgeglimmten, mit Kunststoff/Kohlenstoff beschichteten Gittern angeordnet, behutsam mit einigen wenigen Tropfen destillierten Wassers gewaschen, mit 2%-igem Natriumphosphotungstat, pH 6,5, negativ gefärbt und mit einem Elektronenmikroskop betrachtet. Ein Elektronenmikrogramm negativ gefärbter Influenza-VLP ist in 10 bildlich dargestellt.
Proben zur Immungoldmarkierung der Oberflächenantigene, die die VLP bedecken, wurden fünf Minuten in 0,5%-igem Glutaraldehyd vorfixiert, wie oben beschrieben auf den Gittern angeordnet und mit einigen wenigen Tropfen destillierten Wassers gewaschen. Anschließend wurden sie mit der Oberfläche nach unten auf 100-μl-Volumen der folgenden Lösungen sequentiell inkubiert: primäre Antikörper, die 30 Minuten in PBS/1% RSA verdünnt wurden; dreimal jeweils fünf Minuten mit PBS/1% RSA; Suspension von Goldkugeln, die mit Antikörper gegen Maus-IgG beschichtet waren – 30 Minuten in PBS/1% RSA (1:10) verdünnt; dreimal mit PBS/1% RSA, jeweils für fünf Minuten. Schließlich wurden sie mit einigen wenigen Tropfen destillierten Wassers gewaschen, mit 2%-igem Uranylacetat gefärbt, an der Luft getrocknet und im Elektronenmikroskop untersucht.
Elektronenmikrogramme immungoldmarkierter Influenza-VLP, die mit monoklonalen Anti-HA- oder Anti-NA-Antikörpern sondiert und mit Goldkugeln, die mit Anti-Maus-IgG verbunden waren, gegengefärbt wurden, sind in 11 bildlich dargestellt.
Beispiel 13
Integration von Influenzanukleoprotein (Influenza-NP) in VLP
Sf9-Zellen wurden mit entweder HA/Q28 und NP oder Einzel-NP- und M1-Baculovirus-Rekombinanten coinfiziert. Eingeengte Flüssigkeitsüberstände der coinfizierten Zellen wurden gemäß Beispiel 11 gereinigt. Ein Western-Blot der Fraktion, die sowohl HA und NP enthielt, wie von diesen coinfizierten Zellen exprimiert, ist in 9B bildlich dargestellt. Ein Western-Blot der Fraktion, die NP und M1 enthielt, wie von diesen coinfizierten Zellen exprimiert, ist in 8C bildlich dargestellt.
Beispiel 14
Immunogenität von VLP in Mäusen
Zwei Gruppen Balb/c-Mäuse (4–5 Wochen alt) wurden über den intramuskulären Weg mit entweder HA/Q28-VLP (ungefähr 1 μg HA) oder VSV-G/Q-VLP (ungefähr 1 μg G) immunisiert, wobei jeder Satz VLP mit Aluminiumphosphat (200 μg/Dosis) formuliert wurde. Alle Mäuse in jeder Gruppe erhielten eine Primer- und zwei Booster-Injektionen in Intervallen von zwei Wochen. Zwei Wochen nach der letzten Immunisierung wurden Blutproben gezogen und das Vorliegen von Antikörpern gegen das entsprechende Antigen wurde mittels Western-Blot (für beide Arten von VLP), eines Assays auf Inhibition von Hämagglutination (IHA) (für das HA/Q28) und eines Serumneutralisationstests (für VSV-G/Q) bewertet. Western-Blots sind in 12 (für HA/Q28) und 13 (für VSV-G/Q) bildlich dargestellt. Die IHA-Titer wurden in IHA-Einheiten (IHA units, IHAU) gemessen und waren wie folgt:

Naive Mäuse: 32 IHAU*

Positivkontrolle: [Influenza A/Hong Kong] 128 IHAU

Gepoolte HA/Q28-Sera: 96 IHAU

* Naive Mäuse zeigten einen Inhibitionstiter, der in unspezifischen Agglutininen begründet liegt darin. Alle Proben wurden mit Kaolin behandelt und in einem Versuch, unspezifische Inhibitoren und/oder unspezifische Agglutinine zu inaktivieren, 30 Minuten bei 56°C erhitzt.

Für den Serumneutralisationstest wurden ansteigende Verdünnungen von Sera von Mäusen, die mit VSV-G/Q immunisiert waren, auf einer Zellmonolayer, die VSV enthielt, angeordnet, inkubiert und auf die Fähigkeit, Virus zu inhibieren, analysiert, wie mittels der Verhinderung der Bildung etwaiger Plaques in der Zellmonolayer erkannt wurde. Es wurde festgestellt, dass eine Verdünnung von bis zu 1/64 der Sera einen Standardtiter von VSV (1 × 10⁶ PBE/ml) vollständig neutralisierte.
Beispiel 15
Verpacken von Ribonukleoproteinkomplexen (RNP) in Influenza-VLP und Expression von Reportergenen
Polymerase-(Untereinheiten PB1, PB2 und PA) und NP-Baculovirus-Konstrukt (Quadrupel-Transfervektor-Rekombinante)
Die drei Gene, die die Untereinheiten der Polymerase (PB1-, PB2- und PA-Proteine) kodieren, und das Nukleoprotein NP des Influenzavirus-A/Udorn/72-(H3N2)-Stamm wurden in einen Einzel-Baculovirus-Transfervektor, pAcAB4, subkloniert. Die PB1- und PA-Gene wurden in entgegengesetzten Ausrichtungen unter der Transkriptionskontrolle des Baculovirus-Polyhedrin-Promotors positioniert, wohingegen die PB2- und NP-Gene, ebenfalls in entgegengesetzten Ausrichtungen, unter der Transkriptionskontrolle des Baculovirus-p10-Promotors standen. Eine Cotransfektion von Sf9-Insektenzellen mit gereinigter Transfervektor-DNA, die die Polymerasegene und NP trägt, und linearisierter genomischer Baculovirus-DNA ermöglichte eine homologe Rekombination. Dies resultierte in dem Transfer der Polymerase- und NP-Gene in die Baculovirus-DNA. Dieses intrazelluläre Rekombinationsereignis erzeugte die Quadrupel-Baculovirus-Rekombinante (14), die in das Kulturmedium freigesetzt wurde. Drei aufeinander folgende Plaquereinigungs-/Amplifikationsschritte wurden ausgeführt, um Quadrupel-Baculovirus-Transfervektor-Rekombinanten auszuwählen. Eine PCR unter Verwendung genspezifischer Primer wurde durchgeführt, um das Vorliegen der vier Gene in den gereinigten Quadrupel-Rekombinanten zu bestätigen. Western-Blot-Assays mit Anti-PB1-, Anti-PB2-, Anti-PA- und Anti-NP-spezifischen polyklonalen Antikörpern wurden durchgeführt, um die Expression der drei Polymeraseunterheiten und NP zu beurteilen (Daten nicht gezeigt).
Reportergenkonstrukte
Es wurden DNA-Plasmide erzeugt, die die Luciferase- oder die GFP- Gene (GFP = grün fluoreszierendes Protein) enthielten, die von den konservierten 3'- und 5'-Termini von Influenzavirus flankiert wurden. Diese Sequenzen sind zur Transkription/Replikation und Verpackung des Influenzagenoms in einer Wildtypvirusinfektion erforderlich. Neben den konservierten Sequenzen sind präzise 3'- und 5'-Termini für ein funktionelles Genom entscheidend. Um diese präzisen Enden zu erzielen, wurde ein modifizierter T7-Promotor dem 5'-Terminus der Influenzasequenz hinzugefügt; danach erzeugte die Transkription mit T7-RNA-Polymerase präzise Influenza-5'-Termini in den RNA-Transkripten. Darüber hinaus wurde an dem 3'-Ende der Influenzasequenz eine BsaI-Restriktionsstelle konstruiert. Ein Verdau des Plasmids mit diesem Restriktionsenzym produzierte DNA-Matrizen mit 5'-Überhang, die in Run-Off-T7-RNA-Polymerase-Transkriptionsreaktionen RNA-Moleküle mit präzisen Influenza-3'-Termini erzeugten. Diese Modell-Influenzareportergene wurden dann dazu verwendet, die Polymerase-Aktivität, RNA-Enkapsidierung und Verpackung von RNA in influenzavirusähnliche Partikel zu studieren.
VLP-Verpackung von Luciferase-Reportergen
Sf9-Insektenzellen wurden gleichzeitig mit dem Q28 (HA, NA, M1, M2) und Quadrupel-Transfervektor-Baculovirus-Rekombinanten (PB1, PB2, PA, NP) infiziert (MOI: 5). Die Infektion wurde 48 Stunden fortfahren gelassen und 30 μg einer in vitro synthetisierten RNA, die das Luciferasegen in umgekehrter Ausrichtung enthielt, das von den 3'- und 5'-Terminussequenzen des Influenzagenoms flankiert wurde, wurden zu diesem Zeitpunkt unter Verwendung des LT1-Transfektionsreagens (Panvera, Madison, WI, USA) in Sf9-Zellen transfiziert. Infizierte/transfizierte Zellen wurden weitere 24 Stunden inkubiert. Der Nährmedium-Flüssigkeitsüberstand wurde dann geerntet, mittels Zentrifugation mit niedriger Geschwindigkeit geklärt und die VLP wurden mittels Zentrifugation bei 2000 × g für zwei Stunden eingeengt. Die VLP wurden in Kulturmedium resuspendiert und auf eine neue Monolayer von Babyhamsternierenzellen (baby hamster kidney cells, BHK-Zellen). Nach 48 Stunden Inkubation wurden die BHK-Zellen mit Luciferase-Testlysepuffer gespalten und die Luciferase-Aktivität wurde in dem Zellextrakt gemessen. Die Luciferase-Hintergrundaktivität wurde unter Verwendung eines Luminometers in nicht infizierten BHK-Zellen (Kontrolle) bestimmt und die Messwerte reichten von 50 bis 500 relativen Lichteinheiten (relative light units, RLU). Lysate von mit VLP infizierten BHK-Zellen verzeichneten einen Messwert der Luciferase-Aktivität von 36.000 RLU (15).
VLP-Verpackung von GFP-Reportergen (GFP = grün fluoreszierendes Protein)
Ähnliche Versuche zur Verpackung von RNP in VLP wurden unter Verwendung des GFP-Gens (GFP = grün fluoreszierendes Protein) als einem Reporter durchgeführt. Sf9-Insektenzellen wurden unter Befolgung der oben beschriebenen Parameter infiziert/transfiziert. Transfizierte RNA-Moleküle wurden konstruiert, die die kodierende Sequenz für das GFP in einer Antisense-Ausrichtung enthielt, die von den 3'- und 5'-Termini der Influenzavirus-RNA flankiert wurden. BHK-Zellen und MDCK-Zellen wurden 24 Stunden mit VLP infiziert und die Expression von GFP wurde dann unter Verwendung eines Zeiss-Mikroskops und FITC-Filtern (FITC = Fluoreszeinisothiocyanat) überwacht. Eine kleine Anzahl grüner Zellen lag vor, was nahe legte, dass die VLP das GFP-Gen übertragen konnten, was in der Expression von grün fluoreszierendem Protein resultierte (16).
Literaturverzeichnis

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33. US-Patentschrift Nummer 4,666,829 .

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zum Herstellen von influenzavirusähnlichen Partikeln (VLP), wobei das Verfahren aus den folgenden Schritten besteht: (i) Konstruieren eines rekombinierten DNA-Moleküls, das hinsichtlich von Influenzavirusproteinen nur das strukturelle Influenzavirusmatrixprotein (M1) kodiert; (ii) Transfizierung, Infizierung oder anderweitige Transformierung einer geeigneten Wirtszelle mit dem rekombinierten DNA-Molekül, wobei die Wirtszelle unter Bedingungen gezüchtet wird, die die Exprimierung des strukturellen Proteins M1 gestatten, so dass VLP nach der Exprimierung des strukturellen Proteins M1 innerhalb der Zellen zusammengefügt werden; und (iii) Reinigen der VLP von dem Nährmedium-Flüssigkeitsüberstand.
Verfahren zum Herstellen von influenzavirusähnlichen Partikeln (VLP), wobei das Verfahren aus den folgenden Schritten besteht: (i) Konstruieren eines rekombinierten DNA-Moleküls, das hinsichtlich von Influenzavirusproteinen nur das strukturelle Influenzavirusmatrixprotein (M1) kodiert; (ii) Transfizierung, Infizierung oder anderweitige Transformierung einer geeigneten Wirtszelle mit dem rekombinierten DNA-Molekül, wobei die Wirtszelle unter Bedingungen gezüchtet wird, die die Exprimierung des strukturellen Proteins M1 gestatten, so dass VLP nach der Exprimierung des strukturellen Proteins M1 innerhalb der Zellen zusammengefügt werden; und Cotransfizierung, Coinfizierung oder Cotransformierung der Wirtszelle mit dem rekombinierten DNA-Molekül, das hinsichtlich von Influenzavirusproteinen nur das Influenzanukleokapsidprotein (NP) kodiert, so dass NP innerhalb der VLP integriert ist, und (iii) Reinigen der VLP von dem Nährmedium-Flüssigkeitsüberstand.
Verfahren zum Herstellen von influenzavirusähnlichen Partikeln (VLP), wobei das Verfahren aus den folgenden Schritten besteht: (i) Konstruieren eines rekombinierten DNA-Moleküls, das hinsichtlich von Influenzavirusproteinen nur das strukturelle Influenzavirusmatrixprotein (M1) kodiert; (ii) Transfizierung, Infizierung oder anderweitige Transformierung einer geeigneten Wirtszelle mit dem rekombinierten DNA-Molekül, wobei die Wirtszelle unter Bedingungen gezüchtet wird, die die Exprimierung des strukturellen Proteins M1 gestatten, so dass VLP nach der Exprimierung des strukturellen Proteins M1 innerhalb der Zellen zusammengefügt werden; und Cotransfizierung, Coinfizierung oder Cotransformierung der Wirtszelle mit dem rekombinierten DNA-Molekül, das nur eine Einheit kodiert, die nicht vom Influenzavirus produziert wird, so dass die influenzafreie Einheit innerhalb der VLP integriert ist; und (iii) Reinigen der VLP von dem Nährmedium-Flüssigkeitsüberstand.
Verfahren zum Herstellen von influenzavirusähnlichen Partikeln (VLP), wobei das Verfahren aus den folgenden Schritten besteht: (i) Konstruieren eines rekombinierten DNA-Moleküls, das hinsichtlich von Influenzavirusproteinen nur das strukturelle Influenzavirusmatrixprotein (M1) kodiert; (ii) Konstruieren eines oder mehrerer rekombinierter DNA-Moleküle, die jeweils mindestens eine, aber nicht mehr als alle der strukturellen Influenzavirusproteine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und dem verbundenen Produkt von M1 mRNA (M2), kodieren; (iii) Transfizierung, Infizierung oder anderweitige Transformierung einer geeigneten Wirtszelle mit den rekombinierten DNA-Molekülen, auf die unter (i) Bezug genommen wird, und mit den rekombinierten DNA-Molekülen, auf die unter (ii) Bezug genommen wird, wobei die Wirtszelle unter Bedingungen gezüchtet wird, die die Exprimierung der strukturellen Influenzavirusproteine gestatten, so dass VLP nach der Exprimierung der strukturellen Influenzavirusproteine innerhalb der Zellen zusammengefügt werden; und (iv) Reinigen der VLP von dem Nährmedium-Flüssigkeitsüberstand.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei HA und NA von unterschiedlichen Unterarten von Influenzavirus sind.
Verfahren zum Herstellen von chimären influenzavirusähnlichen Partikeln (VLP), wobei das Verfahren aus den folgenden Schritten besteht: (i) Konstruieren eines rekombinierten DNA-Moleküls, das hinsichtlich von Influenzavirusproteinen nur das strukturelle Influenzavirusmatrixprotein (M1) kodiert; (ii) Konstruieren eines oder mehrerer rekombinierter DNA-Moleküle, die jeweils mindestens eine, aber nicht mehr als alle der strukturellen Influenzavirusproteine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und dem verbundenen Produkt von M1 mRNA (M2), kodieren, mit der Ausnahme, dass ein Teil oder alle der HA- oder NA-DNA-Sequenzen durch eine DNA-Sequenz ersetzt wurden, die eine influenzafreie Einheit kodiert; (iii) Transfizierung, Infizierung oder anderweitige Transformierung einer geeigneten Wirtszelle mit den rekombinierten DNA-Molekülen, auf die unter (i) Bezug genommen wird, und mit den rekombinierten DNA-Molekülen, auf die unter (ii) Bezug genommen wird, wobei die Wirtszelle unter Bedingungen gezüchtet wird, die die Exprimierung der strukturellen Influenzavirusproteine gestatten, so dass VLP nach der Exprimierung der strukturellen Influenzavirusproteine innerhalb der Zellen zusammengefügt werden; und (iv) Reinigen der VLP von dem Nährmedium-Flüssigkeitsüberstand.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die DNA-Sequenz in dem rekombinierten DNA-Molekül, das das HA kodiert, durch eine DNA-Sequenz ersetzt wird, die das G-Protein von Vesicular-Stomatitis-Virus (VSV) kodiert.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die DNA-Sequenz in einem rekombinierten DNA-Molekül die transmembranen und zytoplasmischen Domänen von HA kodiert, jedoch die verbleibende Kodierungsregion von HA durch eine DNA-Sequenz ersetzt wird, die die Ectodomäne des G-Proteins von VSV kodiert.
Verfahren zum Herstellen von influenzavirusähnlichen Partikeln (VLP), wobei das Verfahren aus den folgenden Schritten besteht: (i) Konstruieren eines rekombinierten DNA-Moleküls, das hinsichtlich des Influenzavirusproteins nur das strukturelle Influenzavirusmatrixprotein (M1) kodiert; (ii) Konstruieren eines oder mehrerer rekombinierter DNA-Moleküle, die jeweils mindestens eine, aber nicht mehr als alle der strukturellen Influenzavirusproteine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und dem verbundenen Produkt von M1 mRNA (M2), kodieren; (iii) Transfizierung, Infizierung oder anderweitige Transformierung einer geeigneten Wirtszelle mit den rekombinierten DNA-Molekülen, auf die unter (i) Bezug genommen wird, und mit den rekombinierten DNA-Molekülen, auf die unter (ii) Bezug genommen wird, wobei die Wirtszelle unter Bedingungen gezüchtet wird, die die Exprimierung der strukturellen Influenzavirusproteine gestatten, so dass VLP nach der Exprimierung der strukturellen Influenzavirusproteine innerhalb der Zellen zusammengefügt werden; und Cotransfizierung, Coinfizierung oder Cotransformierung einer geeigneten Wirtszelle mit dem rekombinierten DNA-Molekül, das hinsichtlich von Influenzavirusproteinen nur das Influenzanukleokapsidprotein (NP) kodiert, so dass NP innerhalb der VLP integriert ist, und (iv) Reinigen der VLP von dem Nährmedium-Flüssigkeitsüberstand.
Verfahren zum Herstellen von influenzavirusähnlichen Partikeln (VLP), wobei das Verfahren aus den folgenden Schritten besteht: (i) Konstruieren eines rekombinierten DNA-Moleküls, das hinsichtlich von Influenzavirusproteinen nur das strukturelle Influenzavirusmatrixprotein (M1) kodiert; (ii) Konstruieren eines oder mehrerer rekombinierter DNA-Moleküle, die jeweils mindestens eine, aber nicht mehr als alle der strukturellen Influenzavirusproteine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hämagglutinin (HA), Neuraminidase (NA) und dem verbundenen Produkt von M1 mRNA (M2), kodieren; (iii) Transfizierung, Infizierung oder anderweitige Transformierung einer geeigneten Wirtszelle mit den rekombinierten DNA-Molekülen, auf die unter (i) Bezug genommen wird, und mit den rekombinierten DNA-Molekülen, auf die unter (ii) Bezug genommen wird, wobei die Wirtszelle unter Bedingungen gezüchtet wird, die die Exprimierung der strukturellen Influenzavirusproteine gestatten, so dass VLP nach der Exprimierung der strukturellen Influenzavirusproteine innerhalb der Zellen zusammengefügt werden; und Cotransfizierung, Coinfizierung oder Cotransformierung einer geeigneten Wirtszelle mit dem rekombinierten DNA-Molekül, das nur eine Einheit kodiert, die nicht vom Influenzavirus produziert wird, so dass die influenzafreie Einheit innerhalb der VLP integriert ist, und (iv) Reinigen der VLP von dem Nährmedium-Flüssigkeitsüberstand.
Influenza-VLP, bestehend aus dem strukturellen Protein M1.
Influenza-VLP, bestehend aus den strukturellen Proteinen M1 und NP.
Influenza-VLP, bestehend aus dem strukturellen Protein M1 und einer Einheit, die nicht vom Influenzavirus produziert wird.
Influenza-VLP, bestehend aus dem strukturellen Protein M1 und mindestens einem und maximal allen der strukturellen Influenzaproteine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HA, NA und M2.
Influenza-VLP nach Anspruch 14, wobei HA und NA von unterschiedlichen Unterarten von Influenzavirus sind.
Chimäre Influenza-VLP, bestehend aus dem strukturellen Protein M1 und mindestens einem und maximal allen der strukturellen Influenzaproteine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HA, NA und M2, mit der Ausnahme, dass ein Teil oder alle der HA oder NA durch eine Einheit ersetzt wurden, die nicht vom Influenzavirus produziert wird, um chimäre VLP zu umfassen.
Chimäre Influenza-VLP nach Anspruch 16, wobei ein Teil oder alle der HA oder NA durch ein Peptid, Polypeptid oder Protein, das von einem krankheitserregenden Mikroorganismus produziert wird, ersetzt sind.
Chimäre VLP nach Anspruch 17, wobei HA durch ein G-Protein von VSV ersetzt ist.
Chimäre VLP nach Anspruch 17, wobei die transmembranen und zytoplasmischen Domänen von HA vorhanden sind, aber die verbleibende Region von HA durch die Ectodomäne des G-Proteins von VSV ersetzt ist.
Influenza-VLP, bestehend aus dem strukturellen Protein M1 und NP und mindestens einem und maximal allen der strukturellen Influenzaproteine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HA, NA und M2.
Influenza-VLP, bestehend aus dem strukturellen Protein M1 und einer Einheit, die nicht vom Influenzavirus produziert wird, und mindestens einem und maximal allen der strukturellen Influenzaproteine, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus HA, NA und M2.
Immunogene Zusammensetzung, die die VLP nach einem der Ansprüche 11, 12, 13, 14, 17, 20 oder 21 zusammen mit einem Verdünnungsmittel oder Träger umfasst.
Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 22, die ferner einen Hilfsstoff umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die die VLP nach Anspruch 13 oder 16 zusammen mit einem Verdünnungsmittel oder Träger umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 24, die ferner einen Hilfsstoff umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 25 zum Gebrauch in einem Vertebrat als ein Medikament.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 22 bis 26 bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Influenza in einem Vertebrat.
Wirtszelle, die mit einem rekombinierten DNA-Molekül transfiziert, infiziert oder transformiert ist, die hinsichtlich von Influenzavirusproteinen nur die Influenzavirusproteine M1, M2, HA und NA kodiert und wobei die Zelle hinsichtlich von Influenzavirus kodierenden DNA-Molekülen nur mit diesem DNA-Molekül transfiziert, infiziert oder transformiert ist.
Wirtszelle, transfiziert, infiziert oder transformiert mit: (i) einem rekombinierten DNA-Molekül, das hinsichtlich von Influenzavirusproteinen nur die Influenzavirusproteine M1, M2, HA und NA kodiert, und (ii) einem zweiten rekombinierten DNA-Molekül, das das Influenzavirusnukleoprotein kodiert, und wobei die Zelle hinsichtlich von Influenzavirusprotein kodierenden DNA-Molekülen nur mit diesen DNA-Molekülen transfiziert, infiziert oder transformiert ist.