KR20080106433A - 인플루엔자 항원, 백신 조성물 및 관련 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 면역학, 단백질 조작, 특히 인플루엔자 바이러스에 의한 감염 예방에 유용한 항원 및 백신에 관계한다. 재조합 단백질 항원 및 이와 같은 항원 및 백신 조성물의 생산 및 이용 방법에 관계한다.

Description

인플루엔자 항원, 백신 조성물 및 관련 방법{Influenza antigens, Vaccine Compositions, and Related Methods}
본 출원은 USC 119(e) 35조하에 미국 출원 U.S.S.N. 60/773,378,(February 13, 2006 출원됨)(이하 '378 출원이라 칭함), 미국 출원 U.S.S.N. 60/813,955, June 15, 2006 출원됨)(이하 '955 출원이라 칭함)에 관계하며 이를 우선권으로 주장하고; '139 출원 및 '955 출원의 전문을 참고문헌으로 제출한다.
인플루엔자는 전세계적으로 유행처럼 번지며, 재발되며 급증하는 등의 특징을 가진 오랜 유래를 가진다. 인플루엔자 개발국가 및 선진국 모두에 동등하게 충격적일 수 있는 심각한 접촉성 질환이다. 인플루엔자 바이러스는 인간들에 위협을 주는 주요 요인중에 하나를 제공한다. 매년 백신 접종의 노력에도 불구하고, 인플루엔자 감염으로 인하여 실질적으로 질병 및 사망에 이르게 된다. 인플루엔자 전염은 거의 매년 발생되지만, 다행스러운 것은 광역적인 전염은 그렇게 흔히 일어나지는 않는다. 그러나, 최근에는 인플루엔자의 전염 가능성에 다시 직면하게 되는 인플루엔자 균주들이 출현하였다. 아시아 및 동유렵 일부 지역의 가금류에서 전염되는 H5NI3 타입의 조류 인플루엔자 바이러스는 전세계적으로 지속적으로 전파되고 있 다. 빠른 감염 및 조류에서 인간 개체로의 종을 교차한 감염은 인간군에서 발병 가능성 및 전염 위험을 증가시킨다. 바이러스는 매우 병원성이 크기 때문에 조류 및 일부 인간에서 확인된 경우 15%이상의 치사률을 가진다. 바이러스가 인간에서 인간으로 전염되는 경우에 신속하게, 광범위하게 질병이 전염되고 사망하게 될 가능성이 있다.
인플루엔자에 대한 주요 방어 기작은 백신접종이다. 인플루엔자 바이러스들은 오르소믹소비리데(Orthomyxoviridae)에 속하는 분절된 네가티드-가닥 RNA 바이러스이다. 바이러스성 항원은 매우 효과적인 이뮤노겐으로써 전신 및 점막 항체 반응을 유도시킬 수 있다. 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 당단백질 (HA)은 일반적으로 항체 중화 자극 및 백신 작제에 있어서 가장 중요한 바이러스성 항원이다. 바이러스성 뉴라미니다제(NA)의 존재가 바이러스에 대항하여 멀티-암(multi-arm) 보호성 면역 반응을 생성시키는데 중요한 것으로 확인되었다. 뉴라미니다제 활성을 저해시키는 항-바이러스가 개발되어 감염시에 추가적인 항-바이러스 치료가 될 수 있다. 인플루엔자 항바이러스 및 백신 개발에 유용한 것으로 간주되는 세 번째 성분은 이온 채널 단백질 M2이다.
인플루엔자 바이러스의 서브타입은 항원 쉬프트(shift)로 인한 상이한 HA 및 NA에 의해 지정된다. 또한 동일한 서브타입의 새로운 균주는 항원 드리프트(drift)로 인한 것이거나 또는 신규하고 상이한 에피토프를 생성시키는 HA 또는 NA 분자에 돌연변이로 인한 것이다. HA의 15가지 항원 서브타입이 설명되기는 하지만 이들 서브타입들중 세 가지 Hl, H2, H3만이 인간에서 광범위하게 순환된다. 선진국 및 개발도상국가에서 개선된 삶의 질을 추구함에 있어서 백신 접종이 최선의 방법이 되었다. 현재까지 이용가능한 백신의 주요성질은 관련 감염에 대해 보호할 수 있는 면역 반응을 유도하기 위해 감염 특징을 모방하는 기본 원리를 따르는 것이다. 그러나, 다양한 서브타입 및 복합물의 감소된 바이러스 생성은 시간이 많이 소요되고 비용도 상당히 든다. 신기술 개발 및 병원성의 분자 생물학의 심도있는 이해, 병원성 및 개인 면역계와 이들의 상호작용에 대한 이해로 백신 개발 및 운반에 새로운 접근 방법이 개발되었다. 따라서, 기술 발선으로 개선된 인플루엔자 항원 백신 조성물을 생산하는 능력이 개선되었으나, 최근의 새로운 서브타입 및 균주들을 해결하기 위한 백신 생산에 신규한 항원 및 백신의 추가 소스를 제공할 필요성은 여전히 존재한다. 비싸지 않은 그리고 접근성이 좋은 치료 조성물을 제공하기 위해 인플루엔자 바이러스 서브타입에 대한 개선된 백신 고안 및 개발 및 이와 같은 조성물을 이용하고 만드는 방법이 필요하다.
발명의 요약
본 발명은 식물에서 생산되는 인플루엔자 항원 및 백신 성분들을 제공하는 것이다. 본 발명은 열안정성(열안정성) 단백질과 융합된 형태로 생산되는 하나 또는 그 이상의 인플루엔자 항원을 제공한다. 또한 본 발명은 인플루엔자 항원을 포함하는 백신 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 적어도 2가지 상이한 인플루엔자 항원을 포함하는 인플루엔자 백신을 제공한다. 일부 구체예에서 발명의 조성물에는 하나 또는 그이상의 식물 성분들이 포함된다. 또한, 본 발명의 항원 및 백신 조성물의 생산 및 이용하는 방법도 제시한다.
본 발명은 인플루엔자 감염에 대한 백신 조제에 유용한 인플루엔자 항원, 열안정성 단백질에 작용가능하도록 연결된 이와 같은 인플루엔자 항원을 포함하는 융합 단백질에 관계한다. 본 발명은 식물계에서 제공된 항원의 생산을 포함하나 이에 국한시키지 않은 생산 방법에 관계한다. 또한, 본 발명은 벡터, 융합 단백질, 식물 세포 및 본 발명의 항원 및 융합 단백질을 포함하는 백신 조성물에 관계한다. 또한, 본 발명의 백신 조성물을 개체로 투여하는 것으로 구성된 개체에서 인플루엔자 감염에 대항하는 면역 반응을 유도하는 방법에 관계한다.
인플루엔자 항원
본 발명의 인플루엔자 항원 단백질에는 인플루엔자 바이러스에 대항하는 면역 반응을 유도시킬 수 있는 임의 면역원성 단백질 또는 펩티드를 포함한다. 일반적으로, 관심이 가는 면역원성 단백질에는 인플루엔자 항원(가령, 인플루엔자 단백질, 융합 단백질, 등), 이의 면역원 부분 또는 이의 면역원 변이체 및 이들의 일부 복합이 포함된다.
본 발명에 따라 이용할 수 있는 인플루엔자 항원에는 전장 인플루엔자 단백질 또는 인플루엔자 단백질의 단편들, 또는 전장 인플루엔자 단백질 또는 인플루엔자 단백질의 일부분을 포함하는 융합 단백질이 포함된다. 인플루엔자 단백질의 단편들을 이용하는 경우에, 단독 또는 융합 단백질로 이용하던 간에 이와 같은 단편들은 면역학적 활성(가령, 항-인플루엔자 항체들과 교차 반응성이 있는)을 보유한다. 바이러스 감염에 대항한 면역보호 반응을 유도하는 이들의 능력에 근거하여, 헤마글루티닌 및 뉴라미니다제는 백신을 생성시키는데 있어서 바람직한 1차 항원이다. 추가 항원 예를 들면 막 이온 채널 M2도 면역 보호 효과를 개선시키기 위한 백신 생산(가령, 복합 백신)에 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명은 식물 세포 및 이형성 단백질 인플루엔자 항원 (가령, 인플루엔자 단백질 또는 이의 단편, 인플루엔자 단백질 또는 이의 단편을 포함하는 융합 단백질)을 발현시키는 식물을 제공한다. 본 발명의 이형성 단백질은 소요의 임의 인플루엔자 항원으로 구성되는데, 여기에는 헤마글루티닌 (HA), 뉴라미니다제 (NA), 막 이온 채널 M2 (M2), 헤마글루티닌 (HA)의 일부분, 뉴라미니다제 (NA)의 일부분 및 막 이온 채널(M2)의 일부분 또는 융합 단백질, 단편 또는 헤마글루티닌 (HA) 복합물, 뉴라미니다제 (NA), 막 이온 채널 M2 (M2), 헤마글루티닌 (HA)의 일부분, 뉴라미니다제 (NA)의 일부분 또는 막 이온 채널 M2의 일부분을 포함하나 이에 국한되지는 않는다.
상이한 인플루엔자 HA, NA, M2 단백질(가령, 상이한 서브타입 또는 상이한 균주 또는 상이한 분리체)의 다양한 아미노산 서열이 당분야에 공지되어 있고, GenBank와 같은 데이터베이스에서 이용할 수 있다. 현재 특히 관심을 받은 두 가지 인플루엔자 서브타입의 HA 및 NA의 전장 단백질 서열 및 M2의 서열을 하기에 제공한다:
V: Vietnam H5N1
HA (HAV) SEQ ID NO.: 1
AKAGVQSVKMEKIVLLFAIVSLVKSDQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTH
NGKLCDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFND
YEELKHLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIK
RSYNNTNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQ
SGRMEFFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNCNTKCQTPMGA
INSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAIAGFIEGGWQG
MVDGWYGYHHSNEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLER
RIENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELG
NGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQILSIYSTVASSL
ALALMVAGLSL WMCSNGSLQCRICI
NA (NAV) SEQ ID NO.: 2:
MNPNQJGITIGSICMVTGIVSLMLQIGNMISJWYSUSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKL
AGNSSLCPINGWA VYSKDNSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGT
VKDRSPHRTLMSCPVGEAPSPYNSRFESVAWSASACHDGTS WLTIGISGPDNGA VA VLKYN
GIITDTIKS WRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDA
PNYHYEECSCYPDAGEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGT
GSCGPVSSNGAGGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDI
VAITDWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWS
WPDGAELPFTIDK
W: Wyoming H3N2
HA (HAW) SEQ ID NO.: 3:
MKTIIALS YILCL VFSQKLPGNDNSTATLCLGHHA VPNGTIVKTITNDQIEVTNATEL VQSSST
GG1CDSPHQ1LDGENCTLID ALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKA YSNCYPYDVPDYASLRS
LVASSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSmSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPN
NEKFDKLYIWGVHHPVTDSDQISLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRlSIYW
TIVKPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKCNSECITPNGSIPNDKPFQNVNRI
TYGACPRRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWYGFRHQNSEGT
GQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSY
NAELL VALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKCDNACIESIRNG
TYDHD VYRDEALNNRFQTKGVELKSGYKDWIL WISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIR
CNICI
NA (NAW) SEQ ID NO. : 4:
MNPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHFKQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVY
LTNTTIEKEICPKL AE YRNWSKPQCNITGFAPFSKDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCY
QFALGQGTTLNN VHSNDTVHDRTPYRTLLMNELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKA WL
HVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKILRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKAD
TKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYPGVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSS
YVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGHGVKGWAFDDGND VWMGRTISEKLRSGYE
TFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYSGIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLW
TSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
인플루엔자 Hong Kong M2 단백질 SEQ ID NO.: 5 :
LTEVETPIRNEWGCRCNDSSDP
인플루엔자 단백질
헤마글루티닌
특정 구체예에서, 전장 헤마글루티닌 (HA)을 본 발명의 백신 조성물에 이용한다. 일부 구체예에서, 하나 또는 그이상의 HA 도메인을 이용한다. 특정 구체예에서, 두 개 또는 그이상의 도메인을 이용하는데, 그 이유는 하나 또는 그이상의 융합 폴리펩티드에서 하나 또는 그 이상의 별개 폴리펩티드 또는 서로 연결되어 있기 때문이다. 특정 예시적인 구체예에서는 전장의 인플루엔자 항원, HA의 도메인 1-2 및 도메인 2-1 (HA1_2라고 칭함), 또는 HA의 도메인 3으로 구성된 인플루엔자 항원을 제공한다.
HA Vietnam. [H5N I]: [0035] H5N 1 HA 시그날 펩티드 SEQ ID NO.: 6:
AKAGVQSVKMEKIVLLFAIVSLVKS
H5N1 HA 도메인 1 -2 SEQ ID NO.: 7:
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKL'
H5N1 HA 도메인 3 SEQ ID NO.: 33:
CDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELK
HLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNN
TNQEDLLVL WGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRME
FFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNC
H5N1 HA 도메인 2-1 SEQ ID NO.: 8:
NTKCQTPMGAINSSMPFHNIHPLTIGECPKYVKSNRLVLATGLRNSPQRERRRKKRGLFGAI
AGFIE GGWQGMVDG WYGYHHShJEQGSGYAADKESTQKAIDGVTNKVNSIIDKMNTQFEA
VGREFNNLERRJENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRL
QLRDNAKELGNGCFEFYHKCDNECMESVRNGTYD YPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQI
H5N1 HA 막통과 도메인 SEQ ID NO.: 9:
LSIYSTVASSLALALMVAGLSLWMCSNGSLQCRICI
HA A/Wyoming (H3N2)
H3N2 HA 시그날 펩티드 SEQ ID NO.: 10: MKTIIALSYILCLVFS
H3N2 HA 도메인 1-2 SEQ ID NO.: 11 :
QKLPGNDNSTATLCLGHHAVPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGI
H3N2 HA 도메인 3 SEQ ID NO.: 12:
CDSPHQILDGENCTLID ALLGDPQCDGFQNKK WDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVA
SSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPNNEK
FDKL YIWGVHHP VTDSDQISLY AQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYWTIV
KPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKC
H3N2 HA 도메인 2-1 SEQ ID NO.: 13:
NSECITPNGSIPNDKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAlAGFIEN
GWEGMVDGWYGFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSE
VEGRIQDLEKYVEDTKIDLWSYN AELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDM
GNGCFKIYHKCDNACIESIRNGTYDHD VYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKD WIL
H3N2 HA 막통과 도메인 SEQ ID NO.: 14:
WISFAISCFLLCVALLGFIMWACQKGNIRCNICI
특정 구체예에서, 전장(full length) 뉴라미니다제 (NA) 항원을 본 발명의 백신 항원으로 이용하였다. 일부 구체예에서 NA의 도메인을 이용한다. 특정 구체예에서 두 개 또는 드 이상의 도메인을 본 발명의 항원에 제공한다. 특정 예시적인 구체예에서는 엥커(anchor) 펩트드 서열이 결여된 전장 NA로 구성된 인플루엔자 항원을 제공한다.
뉴라미니다제
NA Vietnam
H5N 1 NA 엥커 펩티드 SEQ ID NO.: 15:
MNPNQKIITIGSIC MVTGIVS
H5N1 NA SEQ ID NO.: 16:
LMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKD
NSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEA
PSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQES
ECACWGSCFTVMTDGPSNGQASHKJFKMEKGKVVKSVELDAPNYHYEECSCYPDAGEIT
CVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAGGVKGF
SFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHP
ELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK
H3N2 NA 엥커 펩티드 SEQ ID NO.: 17 :
MNPNQKIITIGSVSLTISTICFFMQIAILITTVTLHF
H3N2 NA SEQ ED NO.: 18:
KQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCNITGFAPFS
KDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNDTVHDRTPYRTLLMNELG
VPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKI
LRTQESECVCINGTCTVVMTDGSASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYP
GVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGH
GVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYS
GIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPI
예시적인 인플루엔자 항원의 서열을 여기에서 제공하고, HA, NA, M2에 대한 각 도메인도 예시적인 균주들로 제공하나, HA, NA 또는 M2 도메인의 면역원성 특징을 보유하는 임의 서열을 대안으로 이용할 수도 있다. 당업자는 제공된 항원에 최소 75%, 80%, 85%, 또는 90% 또는 그이상의 상동성을 가지는 서열을 생성할 수 있을 것이다. 특정 구체예에서, 인플루엔자 항원은 HA, NA 또는 M2 도메인 또는 이들 도메인의 일부에 최소 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 그 이상 상동성을 가지는 것을 포함하는 단백질로 구성되며, 이때 항원 단백질은 면역원성 활성을 보유한다. 예를 들면, 면역원성 특징으로 보유하는 인플루엔자 항원에 충분한 상동성을 가지는 서열은 여기에서 제공되는 도메인 (항원(들))과 반응하는 항체에 결합할 수 있다. 면역원성 특징에는 종종 관련 아미노산 또는 측쇄의 3차원 모양이 포함된다. 당업자는 서열에서 약간의 차이(가령, 경계에 차이 또는 일부 서열의 대체-그럼에도 불구하고 면역원성을 보존함)를 가지는 서열을 바로 확인할 수 있을 것이다. 예를 들면, 지정된 아미노산 서열의 어느쪽이건 단부에 있는 도메인 경계에 있는 서열들(가령, 약 15개 아미노산, 약 14개 아미노산, 약 13개 아미노산, 약 12개 아미노산, 약 11개 아미노산, 약 10개 아미노산, 약 9개 아미노산, 약 8개 아미노산, 약 7개 아미노산, 약 6개 아미노산, 약 5개 아미노산, 약 4개 아미노산, 약 3개 아미노산, 약 2개 아미노산, 또는 약 1개 아미노산내에)에 있는 것은 본 발명에 따른 관련 도메인으로 구성되는 것으로 간주한다. 따라서, 본 발명은 도메인 지정에 근접한 잔기들로 구성되는 인플루엔자 항원 서열을 이용하는 것도 고려한다. 예를 들면, HA의 도메인(들)을 작제하여 본 발명의 항원으로써 인-프레임(in-frame) 융합 단백질로 발현시킨다(실시예 참고). 또한, 여기에서 제공하는 구조체 및 방법이 이용하여 면역원성인 인플루엔자 항원(가령 HA5 NA, M2)의 아미노산 서열의 부분 도메인 또는 일부분을 만들 수 있다는 것도 인지할 것이다. 또한, 인플루엔자 항원을 생산하기 위해 도메인 또는 서브도메인을 별도로 또는 구성적으로 복합시킬 수도 있다.
예시적인 항원으로써, 여기에서 설명하는 것과 같이 헤마글루티닌, 뉴라미니다제의 서열 또는 특정 서브타입의 M2를 이용한다. 인플루엔자 바이러스의 다양한 서브타입이 존재하고, 새로운 서브타입 출연에 대해 지속적으로 확인하고 있다. 당업자는 여기에서 제공하는 방법 및 조성물을 적절히 이용하여 추가 서브타입의 서열을 이용할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이와 같은 변이도 여기에서 제공하는 방법 및 조성물내에 속한다.
열안정성 단백질과 인플루엔자 폴리펩티드 융합체
본 발명의 특정 측면에서, 열안정한 단백질에 작용가능하도록 연결된 인플루엔자 단백질(또는 이의 단편 또는 이의 변이체)을 포함하는 융합 폴리펩티드로 구성된 인플루엔자 항원을 제공한다. 발명의 융합 폴리펩티드들은 당분야에 공지된 임의 이용 가능한 발현 시스템에서 생산될 수 있다. 특정 구체예에서, 발명의 융합 단백질들은 식물 또는 이의 일부분 (가령, 식물, 식물 세포, 뿌리, 싹 등)에서 생산된다.
사람 또는 동물 세포에서 자연적으로는 발견되지 않는 효소 또는 다른 단백질이 본 발명의 융합 폴리펩티드에 이용에 있어서 특별히 적합하다. 융합되었을 때 융합 산물에 열안정성을 부여하는 열안정성 단백질이 유용하다. 열안정성은 생성된 단백질이 실온에서 모양을 유지하고 생성된 단백질을 유지할 수 있도록 한다. 이와 같은 특징은 융합 폴리펩티드의 용이하고, 효과적이고 비용에서 적절한 회수를 할 수 있도록 한다. 본 발명에서 이용할 수 있는 유용한 열안정성 효소로는 글루카노하이드롤라제(glucanohydrolase) 패밀리이다. 이들 효소들은 특히 혼합 연결된 폴리사카라이드에 1,3-β 연결에 인접한 1,4-β 글루코시드 결합만을 특이적으로 절단시킨다. (Hahn et al., 1994 Proc. Natl. Acad. Sd., USA, 91:10417). 이와 같은 효소들은 귀리 및 보리와 같은 곡물에서 발견되며 C. thermocellum와 같은 다수의 곰팡이 및 세균 종에서도 발견된다. (Goldenkova et al., 2002, Mol. Biol. 36:698). 따라서, 본 발명의 융합 폴리펩티드에 이용할 수 있는 바람직한 열안정성 단백질에는 글리코시다제 효소가 포함된다. 예시적인 열안정성 글리코시다제 단백질에는 표 1에서 제시하는 것들에서 선택된 GenBank 수탁 번호로 알수 있는 것들이 포함되며, 이들 각각의 내용은 각 번호에 GenBank accession 정보를 결합시켜 여기에 첨부한다. 본 발명의 융합 단백질에 이용할 수 있는 예시적인 열안정성 효소에는 클로스트리디움 터모셀룸(Clostridium thermocellum) P29716, 브레비바실러스 브레비스(Brevibacillus brevis) P37073, 및 로드테르무스 마리누스(Rhodthermus marinus) P45798가 포함되며 이들 각각에는 GenBank 수탁 번호가 포함된다. 실시예에서 설명하는 대표적인 융합 단백질들을 클로스트리디움 터모셀룸에서 분리된 변형된 열안정성 효소로 이용하나, 임의 열안정성 단백질을 본 발명에 따라 유사하게 이용할 수도 있다.
Figure 112008065043549-PCT00001
Figure 112008065043549-PCT00002
본 발명에 따라 융합 단백질 및 폴리펩티드를 디자인할 때, 물론 항원의 면역원성을 보존시키는 것이 바람직하다. 또한, 융합 단백질의 열안정성을 제공하는 구조체를 만드는 것이 바람직하다. 이와 같은 특징은 표적 항원의 용이하고, 신속한 그리고 비용 효과적인 회수를 가능하게 한다. 특정 측면에서, 면역원성의 강화, 멀티플 백시 결정체에 결합 가능성이 있으나 백신 접종 개체에 면역원 노출전에는 부족한 것등을 포함하는 추가적인 장점을 제공하는 항원 융합 파트너를 선별할 수 있을 것이다. 소요의 융합 펩티드의 추가적인 요건에는 하나 또는 그이상의 항원의 결합을 용이하게 조절할 수 있으며 백신 조제를 위한 생산, 정제 및 조제에 용이성을 부여하는 단백질을 제공하는 것들이 포함된다. 당업자는 3차원 프리젠티에션이 이들 유익한 특징 각각에 영향을 줄 것이라는 것을 인지할 것이다. 따라서 면역원성의 보존 또는 선호적인 성질의 보존이 융합 위치 선택(가령, N-말단, C-말단, 내부, 이들의 복합) 및 융합 파트너의 선택에 영향을 줄 것이다. 대안으로 또는 추가적으로 선호도가 융합을 위해 선택되는 단편의 길이, 항원의 길이 또는 선택된 융합 파트너의 길이에도 영향을 줄 것이다.
본 발명은 열 안정성 단백질과 다양한 항원의 성공적인 융합을 설명한다. 예를 들면, 우리는 리체나제로 언급한 열안정한 캐리어 분자 LicB를 융합 단백질 생산에 이용한다. LicB는 클로스트리디움 터모셀룸(Clostridium thermocellum)에서 얻은 1,3-1,4-β 글루카나제(LicB)이다(GenBank accession: X63355 [gi:40697]). LicB 는 구형(globular) 단백질 패밀리에 속한다. LicB의 3차원 구조에 근거하여, 이의 N- 및 C-말단이 활성 도메인에 근접한 표면상에서 서로 인접하게 위치하고 있다. LicB 는 또한 활성 도메인으로부터 떨어져 있는 표면상에 노출된 루프 구조를 가진다. 단백질의 N- 및 C- 말단과 루프 구조가 인플루엔자 항원 폴리펩티드의 삽입 부위로 이용될 수 있도록 만들었다. 인플루엔자 항원 폴리펩티드는 N- 또는 C- 말단 융합으로 발현되거나 표면 루프로 삽입될 수도 있다. 중요한 것은 LicB는 낮은 pH 및 고온(최고 75℃)에서 효소 활성을 유지한다. 따라서, 캐리어 분자로써 LicB를 이용하는 것은 표적 특이적 면역원성의 강화, 다중 백신 결정부위에 결합될 가능성, 비강, 경구 또는 장관외로 운반될 수 있는 백신의 직접적인 조제 등을 포함하는 장점을 제공하는데 기여한다. 또한, 식물에서 LicB 융합물의 생산으로 동물 또는 사람의 병인균 오염 위험을 감소시켜야 한다. 실시예를 제공한다.
인플루엔자 항원으로 구성된 융합 단백질는 in vitro 및 in vivo를 포함하는 다양한 발현계를 이용하여 생산할 수 있다. 당업자는 특정 발현계를 위한 핵산 서열의 최적화가 바람직하다는 것을 인지할 것이다. 예를 들면, 여기에서 제공하는 예시에서, 인플루엔자 항원-LicB 융합체의 발현을 위한 최적화된 서열을 제공한다. 실시예 1 참고. 따라서, 본 발명에 따른 인플루엔자 항원(s) 융합 단백질(s)을 인코드하는 임의 관련 핵산 및 이의 단편들은 본 발명의 핵산 구조체에 포함된다.
식물계에서 생산하기 위해, 인플루엔자 항원(s) (가령, 인플루엔자 단백질(s) 또는 이의 단편 또는 이들의 융합체)를 발현시키는 유전자전이 식물을 이용할 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로, 유전자전이 식물은 안정산 생산 작물을 만드는 분야에 공지된 방법을 이용하여 생산할 수 있을 것이다. 추가적으로, 일과성 발현계를 이용하는 식물을 이용하여 인플루엔자 항원(s)을 생산할 수 있다. 식물에서 유전자전이 또는 일과성 발현에 상관없이 식물 발현계를 이용하는 경우에, 원하는 항원에 대해 발현계의 이용성에 따라 핵 발현, 클로로플라스트 발현, 미토콘드리아 발현 또는 바이러스 발현을 이용하여 잇점을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항원 및 융합 단백질 생산에 추가 발현 시스템을 이용할 수도 있다.
예를 들면, 포유류 발현 (가령, 포유류 세포주 (가령, CHO5 등)), 세균 발현 시스템s (가령, E. coil), 곤충 발현 시스템s (가령, 베큘로바이러스), 이스트 발현 시스템, in vitro 발현 시스템 (가령, 레티큘레이트 라이세이트(reticulate lysates)) 등을 본 발명의 항원 및 융합 단백질 발현이 이용할 수도 있다.
인플루엔자 항원의 생산
본 발명에 따르면, 인플루엔자 항원(인플루엔자 단백질(s), 이의 단편, 변이체 및/또는 융합체)을 임의 바람직한 시스템에서 생산할 수도 있다; 생산은 식물 시스템에 한정시키지 않는다. 벡터 구조체와 발현 시스템들은 당분야에 잘 공지되어 있으며, 적절히 이용하면 여기에서 제공하는 인플루엔자 항원의 이용에 결합시킬 수 있을 것이다. 예를 들면, 인플루엔자 항원 (이의 단편들, 변이체 및/또는 융합체)들은 공지의 발현 시스템을 통하여 생산할 수 있는데, 포유류 세포 시스템, 유전자 전이 동물, 미생물 발현 시스템, 곤충 세포 시스템, 유전자 전이 및 일과성 식물 시스템 포함 식물 시스템을 통하여 생산할 수 있다. 인플루엔자 항원이 융합 단백질로 생산되는 경우에, 비-식물 시스템에서 이와 같은 융합 단백질을 생산하는 것이 바람직할 수도 있다.
본 발명의 일부 구체예에서, 인플루엔자 항원이 식물 시스템에서 생산된다. 식물은 유전적인 조작이 상대적으로 용이하고, 사람 유체, 동물 세포주, 재조합 미생물 및 유전자전이 동물과 같은 다른 대체 재료에 비해 몇가지 장점들이 있다. 식물은 동물의 것과 유사한 단백질에 대해 전사후 수정 기전이 매우 정교하다(식물과 포유류 사이에 글리코실화 반응 패턴에 일부 차이가 있다는 것은 알아야 한다). 이것이 식물 조직에서 생활성 물질을 생산하게끔 한다. 또한, 식물들은 정교한 설비없이도 매우 많은 양의 바이오매스를 경제적으로 생산할 수 있다. 또한, 식물은 동물 병인균으로 오염될 대상이 아니다. 리포좀 및 마이크로캡슐과 같이, 식물 세포는 위장관으로 항원이 통과하는 것에 대해 보호해줄 수 있는 것으로 기대된다.
식물을 이용하여 다양한 생산 시스템을 통하여 이형성(heterologous) 단백질을 생산할 수 있다. 이와 같은 시스템중 하나는 유전자전이/유전적으로 변형된 식물을 이용하는 것인데, 표적 산물을 인코드하는 유전자를 식물의 게놈으로 영구히 결합시킨 것이다. 유전자전이 시스템은 식물 생산 시스템을 생성시킬 수도 있다. 포유류 기원 및 많은 백신 후보물질 항원을 포함하는 다양한 외부 단백질이 유전자전이 식물에서 발현되었고, 기능적으로 활성을 가진다는 것을 보여주었다.(Tacket et al., 2000, J. Infect. Dis., 182:302; and Thanavala et al., 2005, Proc. Natl. Acad Sci., USA, 102:3378). 추가적으로 간염 B 주요 표면 항원을 발현시키는 프로세스안된 유전자전이 식물을 면역 주사를 받지 않은 사람 지원자에 투여하면 면역 반응이 생성된다(Kapusta et al., 1999, FASEB J., 13:1796).
식물에서 폴리펩티드를 발현시키는 또 다른 시스템은 외부 서열(가령, 일과성 발현)을 발현하도록 조작된 식물 바이러스 벡터를 이용하는 것이다. 이와 같은 방법으로 신속한 생산 시스템으로 건강한 비-유전자 전이 식물을 이용하게 한다. 따라서, 유전적으로 조작된 식물 및 재조합 식물 바이러스에 감염된 식물들을 원하는 특정 단백질을 신속하게 발생시키고 생산시키는 "그린 팩토리"로써 사용할 수 있을 것이다. 식물 바이러스들은 외부 단백질 생산을 위한 발현 벡터로써 매력을 가질 만한 특정 장점들이 있다. 식물 RNA 바이러스의 몇 가지 멤버들은 잘 특징화되어 있고, 감염성 cDNA를 유전자 조작을 위해 이용할 수 있다. 일단 감염성 바이러스 유전자 물질이 민감성 숙주 세포에 유입되면, 상당 수준으로 복제되어 전체 식물을 통하여 급속히 확산된다. 식물성 바이러스 발현 벡터를 이용한 표적 폴리펩티드를 생산하는 몇 가지 접근법이 있는데 표적 폴리펩티드를 바이러스 게놈에 결합시키는 방법이 포함된다. 한 가지 방법은 항원 펩티드에 대해 캐리어 분자로 기능을 하는 세균, 동물 또는 식물에 감염되는 바이러스의 피복 단백질을 조작하는 것이다. 이와 같은 캐리어 단백질은 이들 표면상에 원하는 항원 에피토프를 도시하는 재조합 바이러스 유사 입자를 어셈블리하고 형성시키는 능력을 가진다. 이와 같은 방법으로 백신 후보물질의 시간대비 효과적인 생산이 가능한데, 그 이유는 백신 후보물질의 특정 성질이 식물 조직으로부터 용이하고 비용 측면에서 효과적인 회수가 가능하기 때문이다. 추가 장점으로는 표적-특이적 면역원성의 강화, 다중 백신 결정부위에 결합 가능성 및 구강, 비강 또는 장관외로 운반되는 백신으로의 조제 용이성 등이 포함된다. 예를 들면, 피복 단백질에 융합되는 바이러스의 에피토프를 운반하는 재조합 식물 바이러스 입자를 포함하는 시금치 잎은 투여시에 면역 반응을 일으킨다. (Modelska et al, 1998, Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 95:2481 ; and Yusibov et al, 2002, 백신, 19/20:3155).
식물 발현 시스템
본 발명에 따라 이형성 핵산에 결합 및 유지에 민감한 그리고 이형성 단백질을 생산할 수 있는 임의 식물을 이용할 수 있다. 일반적으로, 비닐하우스 및 수경 시스템과 같은 특정 조건하에 생장을 잘 하는 식물을 이용하는 것이 종종 바람직할 수도 있다. 인류 또는 가축이 일반적으로 소비하지 않은 식물을 선택하거나 인간의 먹이 사슬에 전형적인 일부가 되지 않은 식물을 선택하여 발현된 폴리뉴클레오티드가 원치 않게 섭취되더라도 큰 걱정을 유발하지 않는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서, 그러나, 식용 식물을 이용하는 것이 바람직하다고 하기도 한다. 특정 구체예에서, 식물의 식용 부분에 발현된 폴리펩티드를 축적시키는 식물을 이용하는 것이 바람직할 것이라는 것이다.
흔히, 특정 바람직한 식물 특징은 발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 결정될 것이다. 몇 가지 실시예를 제공하기 위해 다량으로 생산될 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드(항원 단백질이 발현되는 경우와 같이), 상대적으로 높은 바이오매스를 가지는 식물(가령, 담배, 바이러스 감염에 상당히 민감하여 추가 장점을 가지는 담배는 생장 기간이 짧고, 사람의 먹이쇄에 포함되지 않은)이 바람직할 수 있다. 온전한 활성을 가지는 항원 단백질을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 특정 전사후 변형을 요구하는 경우에, 관련 변형(예를 들면 특징 글리코실화반응)을 이루지기 위해 특정 식물 종의 능력(또는 무능력)이 선별 기준이 될 수도 있다. 예를 들면, 식물이 특정 전사후 변형(가령, 글리코실화반응)을 수행할 수 있는 능력이 있을 때 식물은 포유류 전사후 변형에서 볼 수 있는 시알화 패턴(sialation patterns)을 생성시키지 않을 것이다. 따라서, 항원의 식물 생산은 대안 시스템에서 생산되는 동일한 단백질 서열과는 다른 존재(entity)의 생산으로 이어질 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 농작물 식물 또는 농작물 관련 식물을 이용한다. 특정 구체예에서 식용 식물을 이용한다.
본 발명에 따라 이용할 수 있는 식물에는 피자식물(Angiosperms), 선태류식물(Bryophytes (가령, 설앵초[Hepaticae], Musci, 등), 양치류[Pteridophytes] (가령, ferns, horsetails, 석송속[lycopods]), 겉씨식물[Gymnosperms] (가령, 침엽수[conifers], cycase, 은행[Ginko], Gnetales), 녹조 (가령, Chlorophyceae, Phaeophyceae, Rhodophyceae, Myxophyceae, Xanthophyceae, Euglenophyceae)등이 포함된다. 예시적인 식물은 Leguminosae(콩과[Fabaceae]; 가령, 완두, 알파파, 소이빈); 벼과[Gramineae] (Poaceae; 가령, 옥수수, 밀, 쌀); 가지과[Solanaceae], 특히, Lycopersicon 종(가령, 토마토), Solarium (가령, 감자, 가지), Capsium (가령, 고추), 또는 Nicotiana (가령, 담배); 미나리과[Umbelliferae] 특히 , Daucus 종 (가령, 당근), 솔잎미나리속[Apium](가령, 셀러리), 또는 운향과[Rutaceae](가령, 오렌지); 국화과[Compositae], 특히 Lactuca 종 (가령, 양상추); 십자화과[Brassicaceae] (Cruciferae), 특히, Brassica 또는 Sinapis 종을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명의 식물들은 Brassica 또는 Arab idopsis 종의 식물이 된다. 일부 예시적인 Brassicaceae 과에는 Brassica campestris, B. carinata, B. juncea, B. napus, B. nigra, B. oleraceae.B. tournifortii, Sinapis alba, Raphanus sativus을 포함한다. 변형이 용이하고, 발아 묘목으로써 식용으로 적절한 식물에는 알파파, 녹구, 무, 밀, 머스타드, 시금치, 당근, 비트, 양파, 마늘, 셀러리, 대황, 양배추 또는 양상추, 물냉이 또는 냉이와 같은 초목(잎이 무성한), 파아슬리, 민트와 같은 허브, 클로버, 콜리플라워, 브로콜리, 소이빈, 렌즈콩, 및 해바라기와 같은 식용 꽃을 포함한다.
식물내로 벡터의 도입
일반적으로 공지의 기술을 이용하여 벡터를 식물내로 도입시킬 수 있다. 예를 들면, 벡터 자체를 바로 식물에 도입시킬 수 있다(가령, 연마성 접종[abrasive inoculations], 기계적 분무 접종[mechanized spray inoculations], 진공 침윤[vacuum infiltration], 입자 투하[particle bombardment], 또는 전기천공[ electroporation]). 대안으로 또는 추가적으로, 비리온을 준비할 수 있고(예를 들면 이미 감염된 식물로부터), 그리고 공지의 기술을 이용하여 다른 식물에 응용할 수도 있다.
다양한 식물종에 감염되는 것으로 알려진 다양한 종류의 식물들이 있으며, 본 발명에 따라 폴리뉴클레오티드 발현이 이용할 수 있다.(see, for example, in The Classification and Nomenclature of viruses, "Sixth Report of the International Committee on Taxonomy of viruses" (Ed. Murphy et al), Springer Verlag: New York, 1995, the entire contents of which are incorporated herein by reference; Grierson et al., plant Molecular Biology, Blackie, London, pp. 126-146, 1984; Gluzman et al., Communications in Molecular Biology: viral vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, pp. 172-189, 1988; and Mathew, plant viruses Online (http://image.fs.uidaho.edu/vide/). 식물 세포로 단일 바이러스 벡터를 운반하는 것보다는 본 발명의 특정 구체예에서 다중 상이한 벡터들을 바이러스 벡터의 복제를 위해 함께 운반될 수 있도록 한다(그리고 추가적으로 세포에서 세포로 또는 장거리 이동을 위해). 일부 또는 모든 단백질이 유전자 전이 식물의 게놈에 인코드될 수 있다. 특정 측면에서, 하기에서 더욱 상세하게 설명하겠지만, 이들 시스템에는 하나 또는 그 이상의 바이러스 벡터 성분들이 포함된다.
광범위한 식물에 바로 감염시키고, 감염 전염의 위험이 거의 또는 전혀 없는 시스템을 얻기 위해 두 가지 이형성 식물 바이러스 성분들을 포함하는 벡터 시스템을 이용한다. 예시적인 시스템은 이미 설명된 바 있다(가령, PCT Publication WO 00/25574 및 U.S. Patent Publication 2005/0026291, 여기에서 언급한 바와 같이, 본 발명의 특정 측면에서, 바이러스성 벡터를 주입, 기계적인 접종, 분무 등을 통하여 식물에 응용한다(가령, 식물, 식물의 일부, 싹 등). 감염이 바이러스 게놈을 식물에 바로 제공하여 얻어지는 경우에 임의 기술을 이용하여 게놈을 준비할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따라 유용하게 이용할 수 있는 많은 바이러스는 ssRNA 게놈을 가진다. ssRNA는 in vivo 또는 in vitro에서 게놈의 DNA 카피의 전사를 통하여 만들거나 RNA 카피를 복제하여 만들 수 있다. 용이하게 이용할 수 있는 in vitro 전사 시스템이 제공된다면 (가령, SP6, T7, 레티큘로사이트 라이세이트, 등.), 그리고 RNA 벡터의 DNA 카피를 용이하게 유지한다면 발명의 ssRNA 벡터는 in vitro 전자 특히 T7 또는 SP6 폴리메라제를 통하여 만들 수 있다.
단일 바이러스 벡터 타입을 식물로 도입시키는 것보다는 본 발명의 특정 구체예에서, 다중 상이한 바이러스 벡터를 도입시킨다. 이와 같은 벡터들은 복제, 세포간 이동 또는 장거리 이동과 같은 기능에 대해 교차-보완적이다(trans- complement). 벡터들에는 본원 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 상이한 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 하나 또는 그이상의 인플루엔자 항원들을 인코드하는 다중 폴리펩티드를 발현시크는 식물 또는 식물의 일부를 선별하는 것은 상기 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대해 실행한 것과 동일한 방식으로 실행할 수 있다.
식물 조직 발현 시스템
상기에서 논의한 바와 같이, 본 발명에 따라 인플루엔자 항원을 임의 원하는 시스템에서 만들 수 있다. 벡터 구조체 및 발현 시스템들은 당분야에 잘 공지되어 있고, 이를 채용하여 여기에서 제공하는 인플루엔자 항원의 이용에 결합시킨다. 예를 들면, 유전자 전이 식물 생산은 공지된 것이고, 구조체 생성 및 식물 생산을 당분야에 공지된 기술을 이용하여 조작할 수 있다. 일부 구체예에서, 식물에서 일과성 발현 시스템이 바람직할 수 있다. 이들 시스템들중 두 가지에는 클론성 뿌리 및 클론성 식물 시스템 및 이의 유도체 뿐만 아니아 발아된 묘목 시스템의 생산이 포함된다.
클론성 식물
클론 뿌리는 RNA 바이러스성 발현 벡터들을 유지시키고 상당 시간동안 그리고 다중 서브컬쳐 동안에 전체 뿌리에서 균질하고 안정적으로 표적 단백질을 생산한다. 세포간 또는 장거리 이동시에 재조합에 의해 표적 유전자가 제거된 식물과는 대조적으로, 뿌리 배양물에서는 바이러스 벡터의 일체성이 유지되며, 시간에 걸쳐 생산되는 표적 단백질의 수준이 초기 스크리닝 동안 관찰된 것과 유사하다. 클론 뿌리는 항원 및 백신 조성물의 경구 조성물용 이형성 단백질 물질의 생산을 용이하게 한다. 항원 생산에 유용한 식물에서 유도된 다양한 클론 대상을 생성하는 방법 및 시약은 이미 설명된 바 있으며 당분야에 공지되어 있다(예를 들면, PCT Publication WO 05/81905, 참고문헌으로 첨부됨). 클론 대상에는 항원(본 발명의 항원 단백질)을 생산할 수 있는 클론 뿌리 라인, 클론 식물 라인 및 클론 식물이 포함된다. 본 발명에서는 다양한 식물 조직(가령, 뿌리, 잎) 및 단일 세포(클론 식물)에서 유도된 온전한 식물에서 유도된 클론 세포 라인에서 항원 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 생성물의 발현을 위한 시약 및 방법을 제공한다. 이와 같은 방법은 일반적으로 다양한 타입의 식물 바이러스 벡터 사용을 근거한다.
예를 들면, 한 측면에서 본 발명은 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 뿌리 라인을 수득하는 방법을 제공하는데, 그 방법은 (i) 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 바이러스 벡터를 식물 또는 식물이 일부에 도입시키고; (ii) 식물로부터 하나 또는 그 이상의 클론 뿌리를 생성하는 단계로 구성된다. 예를 들면, 클론 뿌리 라인은 우둘투둘한 뿌리가 형성되는 원인이 되는 아그로박테리움(가령, A. rhizogenes)으로 식물 또는 식물의 일부분(가령, 수확된 잎 조각)에 감염시켜 만들 수 있다. 바이러스를 유지시키는 라인, 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 높은 수준으로 발현시키는 라인 등을 동정하기 위해 다양한 방법으로 클론 뿌리 라인을 스크린할 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산된 클론 뿌리 라인을 제공하고, 또한 이와 같은 클론 뿌리 라인을 이용하여 폴리뉴클레오티드를 발현시키고, 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리펩티드를 생산하는 방법도 포함한다.
본 발명은 본 발명에 따른 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 뿌리 세포주를 생성시키는 방법을 제공하는데; 그 방법은
(i) 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 게놈을 가지고, 바이러스 벡터를 포함하는 클론 뿌리 세포주를 만들고;
(ii) 클론 뿌리 세포주로부터 개별 세포를 방출시키고;
(iii) 뿌리 세포 증식에 적절한 조건하에 세포를 유지시키는 단계로 구성된다. 본 발명은 클론 뿌리 세포주 및 클론 뿌리 세포주를 이용하여 폴리뉴클레오티드를 발현시키고, 폴리펩티드를 생산하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 식물 세포주를 생성하는 방법을 제공하는데; 그 방법은
(i) 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 게놈을 가지고, 바이러스 벡터를 포함하는 클론 뿌리 세포주를 만들고;
(ii) 클론 뿌리 세포주로부터 개별 세포를 방출시키고;
(iii) 뿌리 세포 증식에 적절한 조건하에 세포를 유지시키는 단계로 구성된다. 본 발명은 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 식물 세포주를 생성하는 방법을 제공하는데; 그 방법은
(i) 배양물에서 유지된 식물 세포주의 세포내로 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 바이러스 벡터를 도입시키고;
(ii) 바이러스 벡터를 함유하는 세포를 인리치(enrich)시키는 단계로 구성된다. 인리치(enrichment)는 i)배양물로부터 세포의 일부를 제거하고; ii) 세포 농도를 감소시키기 위해 제거된 세포를 희석시키고 (iii) 희석된 세포가 증식되도록 하고; iv) 바이러스 벡터를 포함하는 세포를 스크리닝하는 것으로 실행된다. 클론 식물 세포주를 본 발명에 따른 인플루엔자 항원 생산에 이용할 수 있다.
본 발명에는 클론 식물을 생성시키는 방법이 포함되는데, 이 식물의 세포에는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 바이러스 벡터를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 방법에는 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 식물을 생성시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은
(i) 클론 뿌리 라인을 만들고, 이 뿌리 라인의 세포에는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 게놈이 포함되며;
(ii) 클론 뿌리 라인으로부터 개별 세포를 방출시키고; 그리고
(iii) 식물 형성에 최적의 조건하에 방출된 세포를 유지시키는 단계로 구성된다. 본 발명은 또한 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 식물을 생성시키는 방법을 제공하는데, 이 방법은
(i) 클론 식물 세포주를 생성시키고, 이 식물의 세포에는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드로 구성된 게놈을 가지는 바이러스 벡터를 포함하며; 그리고
(ii) 식물이 형성되는데 최적의 조건하에 세포를 유지하는 단계로 구성된다. 일반적으로 본 발명의 클론 식물은 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 임의 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있다. 이와 같은 클론 식물을 항원성 폴리펩티드 생산에 이용할 수 있다.
상기에서 설명한 것과 같이, 본 발명은 클론 뿌리 라인, 클론 뿌리 세포 라인, 클론 식물 세포 라인(가령, 잎, 줄기 등으로부터 유도된 세포 라인), 클론 식물에서 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 시스템을 제공한다. 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드는 프로모터에 작용가능하도록 연결된 바이러스 벡터를 이용하여 조상전래(ancestral)의 식물 세포로 도입되는데, 이때 벡터의 게놈에는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 클론 뿌리 라인 또는 클론 식물 세포 라인은 하기에서 논의하는 몇 가지 기술 중 하나에 따라 바이러스를 포함하는 세포에서 확립한다. 식물 바이러스 벡터 또는 이의 일부분을 감염, 바이러스 전사체의 접종 또는 감염성 cDNA 클론에 의한 감염, 전기 천공 또는 T-DNA 매개 유전자 전달에 의한 감염으로 식물 세포로 도입시킬 수 있다.
다음에서는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 뿌리 라인, 클론 뿌리 세포 라인, 클론 식물 세포 라인, 클론 식물을 생성시키는 방법을 설명한다. "뿌리 라인("root line")은 뿌리 세포 라인( "root cell line")과 구별되어야 하는데, 뿌리 라인은 실질적인 뿌리형태의 구조 또는 뿌리를 생산하지만, 뿌리 세포 라인은 뿌리형 구조를 형성하지 않은 뿌리 세포로 구성된다. 라인("line")은 세포주(또는 세포 라인)이 증식하고 유전자 정보를 후손 세포에 전달하는 것을 말하는 의도로 이용된다. 세포주의 세포는 일반적으로 고유(intact) 식물에서 볼 수 있는 것과 같은 조직화된 구조의 일부가 없는 배양물에서 증식한다. 뿌리 라인("root line")은 완전한 식물의 일부분 없이 뿌리 구조에 세포가 증식할 수 있다는 것을 말한다. "식물 세포"에는 뿌리 세포가 포함된다는 것을 알아야 한다. 그러나, 비-뿌리 조직으로부터 직접적으로 식물 세포 라인을 생성하기 위해 이용된 것으로부터 뿌리 라인 및 뿌리 세포 라인을 생성시키기 위한 발명의 방법을 구별하기 위해(클론 뿌리 라인 또는 클론 뿌리 라인에서 유도된 클른 식물로부터 클론 식물 세포 라인을 생성하는 것에 반대되는 것으로), 여기에서 사용된 "식물 세포" 및 "식물 세포 라인"은 일반적으로 비-뿌리 식물 조직으로 구성된 세포 및 세포 라인을 말하는 것이다. 예를 들면, 식물 세포는 잎, 줄기, 묘조(shoot), 꽃 부분이 될 수 있다. 여기에서 유도된 것과 같이 생성된 클론 식물로부터 씨를 유도할 수도 있다. 이와 같은 씨에는 바이러스 벡터 및 이들 씨들에서 수득한 식물을 포함할 수 있다. 씨 스톡(stocks)을 수득하는 방법은 공지되어 있다(예를 들면, U.S Patent Publication 2004/093643).
클론 뿌리 라인
본 발명은 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 직접 발현에 이용되는 식물 바이러스 벡터가 있는 클론 뿌리 라인을 생성하는 시스템을 제공한다. 프로모터에 작용가능하도록 연결된 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 또는 그이상의 바이러스 발현 벡터를 다양한 공지의 방법 중 하나에 따라 식물 또는 식물의 일부로 도입한다. 예를 들면, 식물 잎에 바이러스 전사체를 접종시킬 수 있다. 벡터 자체를 식물에 직접 제공할 수도 있다(가령, 마찰성 접종, 기계적 분무 접종, 진공 침윤, 입자 투하 또는 전기 천공을 통하여). 대안으로 또는 추가로, 비리온(가령, 이미 감염된 식물로부터)을 만들거나 공지 기술에 따라 다른 식물에 사용할 수 있다.
바이러스 게놈을 식물에 직접 사용하여 감염을 시킬 수 있는데, 임의 이용가능한 기술을 이용하여 바이러스 게놈을 준비한다. 예를 들면, 본 발명에 따라 유용하게 이용되는 많은 바이러스들은 ssRNA 게놈을 가진다. ssRNA는 in vivo 또는 in vitro에서 게놈의 DNA 복사체의 전사, RNA 복사체의 복제에 의해 만들 수 있다. 바로 이용할 수 있는 경우에 사용이 용이한 in vitro 전사 시스템(가령, SP6, T7, 레티큘로사이트 라이세이트, 등) 및 RNA 벡터의 DNA 복사체 유지의 편의성이 있다면, 본 발명의 ssRNA 벡터들은 in vitro 전사, 특히 T7 또는 SP6 폴리메라제를 이용한 전사에 의해 만들 수 있다. 감염성 cDNA 클론을 이용할 수도 있다. 아그로박테리아 중개된 유전자 전이를 이용하여 바이러스 벡터와 같은 바이러스 핵산을 당분야에 공지된 방법에 따라 진공침윤(agroinfiltration)을 이용하여 식물 세포로 전달시킨다.
그 다음 식물 또는 식물 일부를 바이러스 전사체의 복제에 최적의 조건하에 유지시킨다(배양 또는 생장). 본 발명의 특정 구체예에서, 바이러스는 세포간에 국소적으로 또는 처음 접종된 잎에서 추가 잎으로의 시스템적으로 초기 접종된 세포를 벗어나 전파된다. 그러나, 본 발명의 일부 구체예에서 바이러스는 전파되지 않는다. 따라서, 바이러스 벡터에는 기능을 하는 MP 및/또는 CP를 인코드하는 유전자를 포함하거나 또는 이들 유전자 중 하나 또는 둘다 부족한 것도 있다. 일반적으로, 바이러스 벡터를 식물 또는 식물의 일부분에 있는 (곤충) 다중 세포로 도입한다.
식물로 바이러스 벡터를 도입시킨 후에, 잎을 수확한다. 일반적으로 잎은 바이러스 벡터를 도입시킨 후 임의 시간에 수확할 수 있다. 그러나, 바이러스 벡터를 식물로 도입시킨 후 일정 시간 동안 식물을 유지시키는 것이 바람직한데, 예를 들면 바이러스 복제를 할 충분한 시간 동안 그리고 선택적으로 바이러스가 초기 접종된 세포로부터 전파될 수 있는 시간 동안 유지시키는 것이 바람직하다. 하기에서 설명하는 공지의 방법을 이용하여 클론 뿌리 배양물(또는 다중 배양물)을 준비한다.
일반적으로, 임의 이용가능한 방법을 이용하여 바이러스 벡터가 도입된 식물 또는 식물 조직으로부터 클론 뿌리 배양물을 준비할 수 있다. 이와 같은 방법중에 하나는 특정 세균 플라스미드에 존재하는 유전자를 이용하는 것이다. 이들 플라스미드들은 DNA를 감염시키고 다양한 많은 유기체로 전달시키는 다양한 종류의 아그로박테리움에서 발견된다. 속(genus)으로써, 아그로박테리움은 쌍떡잎 식물 및 외떡잎 식물, 피자 식물 및 속씨 식물종을 포함하는 크고 다양한 식물 타입으로 DNA을 전달 할 수 있다(예를 들면, Gelvin, 2003, Microbiol. MoI. Biol. Rev., 67:16, 참고문헌으로 첨부함). 식물 세포의 유전적 변경의 분자 근간은 다양한 아그로박테리아(Agrobacterial) 종에 내재하는 거대 종양 유도성(Ti) 또는 뿌리를 내는(rhizogenic)(Ri) 플라스미드의 식물 핵 게놈으로 세균의 전달 및 융합이다. 이 부분은 플라스미드에 존재하는 경우에 T- 부분이라고 하고, 플라스미드로부터 잘라낸 경우에 T-DNA라고 한다. 일반적으로 단일 가닥 T-DNA 분자를 자연 발생적 아그로박테리아(Agrobacterial) 감염으로 식물 세포로 전달되며 최종적으로 게놈으로 융합(이중 가닥 형으로)된다. Ti 플라스미드에 기초한 시스템은 식물로 외부 유전자 물질을 도입시키고 유전자 전이 식물을 생산하는데 널리 이용된다.
다양한 아그로박테리아(Agrobacterial) 종으로 식물을 감염시키고 T-DNA 전달하는 것은 많은 효과를 가진다. 예를 들면, A. tumefaciens는 근두암종병(crown gall disease )의 원인이 되며, A. rhizogenes는 감염 부위에 모근병(hairy root disease)으로 알려진 가는 뿌리가 자라도록 하는 원인이 된다. 각 뿌리는 하나의 유전학적으로 변형된 세포에서 생성된다. 따라서 뿌리에 있는 뿌리 세포는 클론이며, 각 뿌리는 세포의 클론 집단이 된다. A. rhizogenes 감염에 의해 생성된 뿌리는 높은 생장률과 유전적 안정성을 특징으로 한다(Giri et al, 2000, Biotech. Adv., 18:1, 참고문헌을 첨부한다). 또한, 이와 같은 뿌리는 유전적으로 안정한 식물을 재생할 수 있다. (Giri 2000, supra).
일반적으로, 본 발명은 아그로박테리아(Agrobacteria)의 임의 균주 특히 식물 세포로부터 뿌리 형성을 유도할 수 있는 A. rhizogenes 균주를 이용하는 것이 포함된다. 상기에서 언급한 것과 같이, Ri 플라스미드 (Ri T-DNA)의 일부는 모근병을 유발하는데 책임이 있다. Ri 플라스미드의 일부를 식물 세포로 전달하는 것은 Ri 플라스미드를 가지는 아그로박테리움으로 감염시켜 편리하게 실시할 수 있는데, 발명에는 식물 세포로 관련 부분을 도입시키는 대안 방법을 이용하는 것도 포함된다. 이와 같은 방법에는 식물 세포로 유전자 물질을 도입시키는 임의 방법이 포함되는데, 유전자총(biolistics), 전기천공(electroporation), PEG-매개된 DNA 취입, Ti-계 벡터등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. Ri T-DNA의 관련 부분을 바이러스 벡터를 이용하여 식물 세포로 도입시킬 수 있다. 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 동일한 벡터에 Ri 유전자가 포함되거나 상이한 바이러스 벡터에 포함될 수 있는데, 이때 이 벡터는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터와 동일한 또는 상이한 타입이 될 수 있다. 모근을 만드는데 전체 Ri T-DNA가 필요하지 않을 수 있으며, Ri-T-DNA의 일부에 당분야에 공지된 것과 같이 뿌리 형성을 유도하는 충분한 유전 물질이 포함되는 경우에 본 발명은 Ri-T-DNA의 이용을 포함한다. 추가 유전 물질, 가령, Ri 플라스미드내에 있으나, T-DNA에는 존재하지 않는 유전자가 본 발명에 따른 식물 세포로 전달될 수 있으며, 특히 유전자의 발현 산물로 T-DNA가 식물 세포 DNA로 통합되도록 한다.
본 발명의 특정 구체예에 따라 클론 뿌리 라인을 준비하기 위해, 수확한 잎 부분을 감염 및 형질변환에 적절한 조건하에 A. rhizogenes와 접촉시킨다. 잎 부분은 배양물에 유지시켜 모근 발생을 유도한가. 각 뿌리는 클론, 가령 뿌리에 있는 세포는 Ri T-DNA가 전달된 단일 조상 세포에서 유도된 것이다. 본 발명에 따르면, 이와 같은 조상 세포의 일부에는 바이러스 벡터를 포함할 것이다. 따라서, 이와 같은 조상 세포로부터 유도된 뿌리에 세포에는 복제하여 세포 분할 동안에 전이되기 때문에 바이러스 벡터를 포함할 것이다. 따라서, 세포의 높은 비율(가령 최소 50%, 최소 75%, 최소 80%, 최소 90%, 최소 95%)의 세포 또는 모든 세포(100%), 또는 실질적으로 모든(최소 98%) 세포에는 바이러스 벡터가 포함될 것이다. 바이러스성 벡터는 클론 뿌리내에 자녀 세포에 의해 유전되어, 뿌리내 바이러스 벡터의 이동이 뿌리를 통하여 바이러스 벡터를 유지시키는데 필수적인 것은 아니다. 개별 클론 모근을 잎 부분으로부터 떼어내어 추가 배양할 수 있다. 이와 같은 뿌리를 뿌리 라인이라고 한다. 분리된 클론 뿌리는 분리 후에 생장을 계속한다.
다양한 상이한 클론 뿌리 라인을 본 발명의 방법을 이용하여 만들었다. 이들 뿌리 라인은 본 발명의 인플루엔자 항원(가령, 인플루엔자 폴리펩티드 또는 이의 단편 또는 이의 융합 단백질을 인코드하는)을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 이용하여 만들었다. 뿌리 라인을 웨스턴 블랏으로 테스트하였다. 뿌리 라인은 다양한 폴리펩티드의 상이한 발현 수준을 나타낸다. 높은 발현을 보여주는 뿌리 라인을 선택하여 추가 배양한다. 이들 뿌리 라인을 다시 연속 테스트하여, 상당 시간동안 높은 발현 수준을 유지한다는 것을 보여주었다. 발현 수준은 클론 뿌리 라인을 만드는데 이용된 동일한 바이러스 벡터로 감염된 고유 식물에서의 발현과 필적하거나 그 이상이었다. 또한, 뿌리 라인의 발현 안정성은 동일한 바이러스 벡터로 감염된 식물에서 수득한 것 이상이었다. 이와 같은 바이러스 감염된 식물의 최고 80%는 2-3 계대후에 야생형으로 복귀된다. (이와 같은 계대는 전사체를 식물에 접종하여, 감염(국소 또는 전신)이 일어나게 하고, 잎 샘플을 취하고, 발현에 대해 연속적으로 테스트하기 위해 새로운 식물에 접종하는 것과 연관된다).
하기에서 설명하는 것과 같이 본 발명의 펩티드의 항원을 생산하기 위해 대규모로 뿌리 라인을 배양할 수 있다. 클론 뿌리 라인( 및 클론 뿌리 라인에서 유도된 세포 라인)은 뿌리 및 식물 세포의 배양에 일반적으로 이용되는 다양한 화합물, 가령 옥신, 사이코키닌과 같은 식물 생장 호르몬을 포함하지 않은 배지에 유지시킨다. 이와 같은 특징은 조직 배양과 연관된 비용을 상당히 줄여주고, 발명자는 이것이 식물을 이용하는 단백질 생산의 경제적 실익에 상당히 기여할 것으로 기대한다.
다양한 임의 방법을 이용하여 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 뿌리를 선별할 수 있을 것이다. 웨스턴 블랏, ELISA 검사 등을 이용하여 인코드된 폴리펩티드를 감지할 수 있다.
GFP와 같은 감지가능한 마커의 경우에, 비쥬얼 스크린과 같은 대안법을 실시할 수 있을 것이다. 선택가능한 마커를 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 이용한다면, 적절한 선택을 부여해야한다(가령, 잎 물질 또는 이로부터 유도된 뿌리를 적절한 항생제 또는 영양 조건하에서 배양하여 생존하는 뿌리를 확인하고 분리하는). 특정 바이러스 벡터에는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 두 개 또는 그이상의 폴리뉴클레오티드, 가령 상이한 폴리펩티드를 인코드하는 두 개 또는 그이상의 폴리뉴클레오티드, 포함한다. 이들중 하나가 선택성 또는 감지가능한 마커인 경우에, 마커의 발현을 선택 또는 감지에 의해 선택된 또는 감지된 클론 뿌리는 제2 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 가능성이 높다. 특정 폴리뉴클레오티드를 포함하는 뿌리 라인의 스크리닝도 PCR 및 다른 핵산 감지 방법을 이용하여 실행할 수 있을 것이다.
대안으로 또는 추가적으로, 클론 뿌리 라인은 바이러스 감염 결과로 국소 병소를 형성하게 되는 숙주 식물(가령, 과민성 숙주 식물)의 접종에 의해 바이러스 존재에 대해 스크리닝할 수 있을 것이다. 예를 들면, 뿌리 조직 5mg을 50㎕ 인산염 완충액에서 균질화시키고, 이를 이용하여 담배 식물의 단일 잎에 접종한다. 바이러스가 뿌리 배양물에 존재하는 경우에, 2 내지 3일 이내에 특징적인 병소가 감염된 잎에 나타날 것이다. 이는 뿌리 라인에 본 발명의 인플루엔자 항원(표적 유전자)을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 운반하는 재조합 바이러스를 포함한다는 것을 의미한다. 국소 병소들이 형성되지 않으면, 바이러스는 없는 것이고, 뿌리 라인은 네가티브로 거절된다. 이 방법은 시간 및 비용 측면에서 효과적이다. 바이러스 존재에 대해 초기 스크리닝 후에, 바이러스를 포함하는 뿌리는 2차 스크리닝 가령, 웨스턴 블랏 또는 ELISA을 받게되어 높은 발현체를 선별한다. 추가 스크리닝, 예를 들면 신속한 생장, 특정 매체에서 생장 또는 특정 환경 조건하에서의 생장에 대한 스크리닝을 할 수 있을 것이다. 이와 같은 스크리닝 방법은 일반적으로 클론 뿌리 라인, 클론 뿌리 세포 라인, 클론 식물 세포 라인 및/또는 클론 식물 임의 발생에 이용할 수 있을 것이다.
당업자에게 명백한 것과 같이, 바이러스 벡터를 포함하는 클론 뿌리 라인을 만드는 발명의 설명에 다양한 변형이 가능할 수 있다. 이와 같은 변형도 본 발명의 범주내에 있다. 예를 들면, Ri T-DNA 유전자의 도입전에 고유 식물 또는 이의 일부분으로 바이러스 벡터를 도입시키는 것이 일반적으로 바람직할 수 있으나, 일부 특정 구체예에서, Ri-DNA를 바이러스 벡터 도입전에 도입시킨다. 또한, 잎 부분을 수확하여 세균에 노출시키기 전에 고유 식물을 A. rhizogenes에 접촉시키는 것도 가능하다.
바이러스 벡터를 보유하는 식물 또는 식물의 일부분의 단일 세포로부터 클론 뿌리 라인을 만드는 다른 방법을 이용할 수 있다(가령, Ri 플라스미드로부터 유전 물질 또는 A. rhizogenes을 이용하지 않는 방법). 예를 들면, 식물 호르몬 또는 특정 식물 호르몬 복합물로 처리하여 식물 조직으로부터 뿌리를 생성시키는 것은 공지의 것이다.
클론 뿌리 라인으로부터 유도된 클론 세포 라인
상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 클론 뿌리 라인을 생성하는 방법을 제공하는데, 이때 뿌리 라인의 세포에는 바이러스 벡터가 포함되어 있다. 당분야에 공지된 바와 같이, 다양한 상이한 세포가 뿌리로부터 생성된다. 예를 들면, 뿌리 세포 라인은 다양한 공지의 방법을 이용하여 뿌리로부터 수득된 개별 뿌리 세포로부터 생성된다. 이와 같은 뿌리 세포 라인은 뿌리내에 다양한 상이한 뿌리 세포 타입으로부터 수득될 수도 있다. 일반적으로 뿌리 물질을 수확하여 분해시켜(예를 들면, 물리적으로 또는 효소적으로 분해), 개별 뿌리 세포를 방출시키고 추가 배양한다. 완전한 프로토플라스트(protoplast)을 형성할 필요는 없다. 원하는 경우, 단일 뿌리 세포로부터 뿌리 세포 라인을 얻기 위해, 뿌리 세포를 매우 희석된 세포 농도에서 플레이트할 수 있다. 이와 같은 방식으로 유도된 뿌리 세포 라인은 바이러스 벡터를 포함하는 클론 뿌리 세포 라인이다. 이와 같은 뿌리 세포 라인은 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 나타낸다. 적절한 식물 호르몬 존재하에 분해된 뿌리 세포를 배양함으로써 클론 뿌리로부터 유사한 방식으로 클론 식물 세포 라인을 수득할 수 있다. 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 높은 수준으로 발현시키는 세포 라인을 확인하기 위해 인리치의 스크리닝 및 연속적인 라운드(successive rounds)를 이용할 수 있다. 그러나, 세포 라인이 유도된 클론 뿌리 라인이 높은 수준으로 발현시키면 추가 스크리닝은 불필요하다.
클론 뿌리 라인의 경우에서와 같이 클론 뿌리 세포 라인의 세포는 바이러스 벡터를 포함하는 단일 조상 세포로부터 유도되고, 따라서 바이러스 벡터를 포함하는데, 이는 복제되어 세포 분할 동안에 전이된다. 따라서, 높은 비율(가령, 최소 50%, 최소 75%, 최소 80%, 최소 90%, 최소 95%), 세포의 전부(100%), 또는 실질적으로 전체(최소 98%) 세포에는 바이러스 벡터를 포함할 것이다. 바이러스 벡터는 클론 뿌리 세포 라인내에 자녀 세포에 의해 유전되기 때문에, 세포중에서 바이러스 벡터의 이동이 바이러스 벡터를 유지하는데 필수사항이 아니라는 것이다. 하기에서 설명하는 것과 같이 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 생산하는데 클론 뿌리 세포 라인을 이용할 수 있다.
클론 식물 세포 라인
본 발명은 클론 식물 세포 라인을 생성하는 방법을 제공하는데, 이때 식물 바이러스 벡터를 이용하여 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 직접 발현시킨다. 본 발명의 방법에 다르면 프로모터에 작용가능하도록 연결된 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 또는 그이상의 바이러스 발현 벡터를 세포 배양물내에 유지된 식물 세포 라인의 세포내로 도입한다. 다양한 타입의 식물로부터 다수의 식물 세포 라인이 공지되어 있는데, 이들중 임의의 것을 이용할 수 있을 것이다. 새로이 유도된 세포 라인은 본 발명을 실행하는데 이용되는 공지 방법에 따라 만들 수 있을 것이다. 다수의 방법중 임의 방법에 따라 식물 세포 라인의 세포내로 바이러스 벡터를 도입시킨다. 예를 들면, 프로토플라스트를 준비하고 바이러스 전사체를 세포내로 전기천공시킨다. 식물 세포 라인의 세포로 식물 바이러스 벡터를 도입시키는 다른 방법들도 이용할 수 있다.
본 발명에 따른 클론 식물 세포 라인을 생성시키는 방법 및 식물 세포(가령 프로토플라스트)내로 도입에 적절한 바이러스 벡터를 생성시키는 방법은 다음과 같이 이용할 수 있다: 바이러스 벡터를 도입시킨 후에, 식물 세포 라인을 조직 배양물에 유지시킨다. 이 기간 동안 바이러스 벡터가 복제되고, 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드가 발현될 것이다. 클론 식물 세포 라인은 연속 인리치먼트 과정에 의해 배양물로부터 유도된다. 예를 들면 샘플을 배양물에서 빼내고 선택적으로 세포의 농도를 낮추기 위해 희석할 수 있으며, 개별 드롭(droplet)으로 배양접시상에 도말한다. 드롭을 유지시켜 세포 분할을 허용한다.
드롭에는 배양물의 초기 밀도, 희석 양에 따라 다양한 세포 수를 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 1회의 인리치먼트후에 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시키는 클론 세포 라인을 수득하고자 한다면, 세포를 희석하여 대부분의 드롭에 0 또는 1 세포가 포함될 수 있도록 한다. 그러나, 멀티 세포가 각 드롭에 존재하도록 농도를 선별하고, 발현 세포를 포함하는 지를 확인하기 위해 드롭을 스크리닝하는 것이 좀더 효과적일 것이다. 일반적으로, 임의 적절한 스크리닝 과정을 이용할 수도 있을 것이다. 예를 들면, GFP와 같은 감지가능한 마커를 이용할 수 있을 것이다. 웨스턴 블랏 또는 ELISA 검사를 이용할 수도 있다. 각 드롭(100㎕)에는 이들 검사를 실행하는데 충분한 양이상의 세포를 포함한다. 다수의 인리치먼트 라운드를 실행하여 연속덕으로 더 높은 발현 세포 주를 분리한다. 단일 클론 식물 세포 라인(예를 들면, 단일 조상 세포로부터 유도된 집단)은 단일 세포 클로닝을 위한 표준 방법을 이용하여 추가 희석을 제한시켜 생성시킬 수 있다. 그러나, 개별 클론 라인을 반드시 분리시킬 필요는 없다. 다중 클론 세포 라인을 포함하는 집단을 이용하여 본 발명의 하나 또는 그이상의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리뉴클레오티드를 발현시킬 수 있다.
일반적으로, 클론 뿌리 라인을 생성시키기 위해 상기에서 설명한 특정 방식을 클론 식물 세포 라인 생성에 응용한다. 예를 들면, 다중 상이한 벡터 조합을 이용할 수 있는 것과 같이 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 하나 또는 그이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터의 다양성을 이용할 수 있다. 유사한 스크리닝 방법을 이용할 수도 있다. 클론 뿌리 라인 및 클론 뿌리 세포 라인의 경우와 같이, 클론 식물 세포 라인의 세포들은 바이러스 벡터를 포함하는 단일 조상 세포로부터 유도되어, 따라서 이들이 복제될 것이고, 세포 분할 동안 전달되기 때문에 바이러스 벡터를 포함하게 될 것이다. 따라서, 세포의 많은 부분(가령 최소 50%, 최소 75%, 최소 80%, 최소 90%, 최소 95%), 모든 세포(100%), 똔느 실질적으로 모든 세포(최소 98%)에 바이러스 벡터가 포함될 것이다. 클론 식물 세포 라인내에 자녀 세포에 의해 바이러스 벡터가 유전될 것이므로, 세포간에 바이러스 벡터의 이동이 바이러스 벡터를 유지시키는데 반드시 필요한 것은 아니다. 하기에서 설명하는 것과 같이 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 폴리펩티드를 생산하는데 클론 식물 세포 라인을 이용할 수도 있다.
클론 식물
클론 식물은 상기에서 설명하는 다양한 방법에 따라 만들어진 클론 뿌리, 클론 뿌리 세포 라인 및/또는 클론 식물 세포 라인으로부터 생성될 수 있다. 여기에서 설명하는 것과 같이, 뿌리, 뿌리 세포 라인, 클론 뿌리 라인과 같은 식물 세포 라인 및 클론 뿌리 세포 라인 및 클론 식물 세포 라인으로부터 식물을 생성시키는 방법은 당분야에 공지되어 있다(가령, Peres et ai, 2001, Plant Cell, Tissue, Organ Culture, 65:37; and standard reference works on Plant molecular biology and biotechnology cited elsewhere herein). 따라서, 본 발명은 다음의 단계로 구성된 클론 식물을 생성시키는 방법을 제공한다; (i) 상기에서 설명하는 방법중 임의 방법에 따라 클론 뿌리 라인, 클론 뿌리 세포 라인 또는 클론 식물 세포를 생성시키고; 그리고 (ii) 클론 뿌리 라인, 클론 뿌리 세포 라인 또는 클론 식물로부터 온전한 식물을 생성한다. 클론 식물이 증식되고, 표준 방법에 따라 생장한다.
클론 뿌리 라인의 경우에서와 같이, 클론 뿌리 세포 라인, 클론 식물 세포 라인, 클론 식물의 세포들은 바이러스 벡터를 포함하는 단일 조상 세포로부터 유도되어, 이것들이 복제하고 분할 동안에 전이되기 때문에 바이러스 벡터를 포함하게 될 것이다. 따라서, 세포의 많은 부분(가령 최소 50%, 최소 75%, 최소 80%, 최소 90%, 최소 95%), 모든 세포(100%), 똔느 실질적으로 모든 세포(최소 98%)에 바이러스 벡터가 포함될 것이다. 클론 식물내에 자녀 세포에 의해 바이러스 벡터가 유전될 것이므로, 세포간에 바이러스 벡터의 이동이 바이러스 벡터를 유지시키는데 반드시 필요한 것은 아니다.
발아(Sprouts) 및 출아묘(Sprouted Seedling) 식물 발현 시스템
본 발명에 따른 인플루엔자 항원을 생산하는데 유용한 다양한 발아 및 출아묘를 생성하기 위한 시스템 및 시약들은 이미 설명된 바 있으며 당분야에 공지되어 있다(예를 들면, PCT Publication WO 04/43886, 참고문헌으로 첨부한다). 본 발명은 또한 출아묘를 제공하는데, 이는 인플루엔자 항원을 포함하는 바이오매스로 식용가능하다. 특정 측면에서, 바이오매스는 조성물을 포함하는 항원 소비를 위해 직접적으로 제공된다. 일부 측면에서 바이오매스를 소비전에 프로세싱 예를 들면 균질화(homogenizing), 크러슁(crushing), 건조 또는 추출할 수 있다. 특정 측면에서 바이오매스로부터 인플루엔자 항원을 정제하여, 약학 조성물로 조제할 수 있다. 생(live)으로 소비되거나 수확될 수 있는 출아묘(가령, Brassica 속의 발아, 출아묘) 내에서 인플루엔자 항원을 생산하는 방법을 추가로 제공한다. 특정 측면에서, 본 발명은 일정한 내부 조절가능한 환경(방, 용기 등)에서 씨앗을 식용 출아묘로 생장시키는 것과 관련된다. 씨앗은 발현이 외인성 유도가능한 프로모터에 의해 구동될 수 있고, 인플루엔자 항원을 인코드하는 발현 카세트를 포함하는 유전공학적으로 조작된 씨앗이 될 수 있다. 빛, 열, 식물성 호르몬에 의해 유도될 수 있는 다양한 외인성 유도성 프로모터를 이용할 수 있을 것이다.
관련 구체예에서, 본 발명은 아그로박테리움 형질전환 시스템을 이용하여 인플루엔자 항원을 인코드하는 박현 카세트로 식물을 형질변환시켜 출아묘용 씨앗 스톡을 우선 만들어 출아묘에서 인플루엔자 항원을 생산하는 방법을 제공하는데, 이때 인플루엔자 항원의 발현은 유도성 프로모터에 의해 구동된다. 유전자 전이 씨앗은 한정된, 조절가능한 환경에서 생장된 형질변환된 식물에서 수득하여 인플루엔자 항원을 발현하도록 유도할 수 있다.
일부 구체예에서, 인플루엔자 항원을 인코드하는 바이러스 발현 카세트로 발아묘를 감염시키는 방법을 제공하는데 이때 발현은 바이러스 프로모터 또는 유도성 프로모터중 임의의 것에 의해 구동된다. 출아묘는 한정된, 조절가능한 환경에서 2 내지 14일간 생장시키거나 또는 소비 또는 수확을 위해 충분한 양의 인플루엔자 항원이 수득될 때까지 생장시킨다.
본 발명은 출아묘에서 인플루엔자 항원을 생산하기 위한 시스템을 추가로 제공하는데, 시스템에는 온도 조절이 가능한 하우징 유닛과 하나 또는 그이상의 인플루엔자 항원을 인코드하는 발현 카세트를 포함하는 출아묘가 포함되는데, 이때 발현은 구성 또는 유도성 프로모터에 의해 구동된다. 시스템은 조절이 불가능한 외부 환경에 대해 또는 온실에 대해 독특한 장점을 제공한다. 따라서, 본 발명은 재배업자가 인플루엔자 항원의 발현을 유도하기 위해 정확하게 시간을 조절할 수 있게 한다. 이는 인플루엔자 항원을 생산하기 위한 시간 및 비용을 상당히 감소시켜 줄 수 있다.
특정 측면에서, 일과성 형질감염된 발아에는 본 발명의 인플루엔자 항원을 인코드하는 바이러스 벡터를 포함한다. 묘목은 일정시간 생장되어 발아에서 바이러스 핵산을 생산할 수 있도록 하고, 생장 후에 다중 복사체 바이러스가 생산되어 인플루엔자 항원이 생산된다.
특정 측면에서, 인플루엔자 항원을 인코드하는 핵산을 포함하는 유전공학적으로 조작된 씨앗 또는 배를 한정된, 제어가능한 환경에서 출아묘로 생장하게 한다. 한정된 제어가능한 환경은 씨앗이 실내에서 생장할 수 있도록 하우징 유닛 또는 룸이 될 수 있다. 한정된, 조절가능한 환경의 모든 환경 요인은 조절가능하다. 싹은 생장을 위해 빛을 요구하지 않기 때문에, 조명은 고가이며, 유전공학적으로 조작된 씨앗 또는 배아를 빛이 없는 실내에서 출아묘 단계로 생장시킬 수 있을 것이다.
본 발명의 한정된 조절가능한 환경에서 조절될 수 있는 다른 외부 환경 요인에는 온도, 습도, 수분, 영양소, 가스(가령, O2 또는 CO2 함량 또는 대기 순환), 화학물질(당 및 당 유도체와 같은 소분자 또는 식물성 호르몬 지베릴렌산 또는 아브시식산과 같은 호르몬) 및 이와 유사한 것들이 포함된다.
본 발명의 특정 방법에 따르면, 인플루엔자 항원을 인코드하는 핵산의 발현은 외인성 유도성 프로모터에 의해 조절될 수 있다. 외인성 유도성 프로모터는 내부 자극보다는 외부 자극에 반응하여 핵산의 발현을 증가 또는 감소시키게 된다. 다수의 환경 인자들이 유전공학적으로 조작된 싹의 발현 카세트에 의해 운반되는 핵산의 발현 유도물질로 기능할 수 있다. 프로모터는 열-쇼크 프로모터와 같은 역-유도성 프로모터가 될 수 있다. 예를 들면, 열-쇼크 프로모터를 이용하여 한정된 공간의 환경의 온도를 핵산 발현을 유도하기 위해 상승시킬 수도 있다. 다른 프로모터에는 빛 유도성 프로모터가 포함된다. 한정된 조절가능한 환경에 항상 빛이 제공되는 경우에, 빛 유도성 프로모터들은 구성 프로모터로 유지시킬 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로 빛을 단순하게 밝혀서 발생 동안 특정 시기에 핵산 발현을 개시시킬 수도 있다. 프로모터는 핵산 발현을 유도할 때 사용되는 화학물질에 의한 유도성 프로모터가 될 수도 있다. 이와 같은 구체예에 따르면 화학물질을 씨, 배아 또는 출아묘에 단순히 안개처럼 뿌리거나 분무하여 핵산 발현을 유도할 수 있다. 살포나 분무를 정확하게 조절가능하며, 표적 씨, 배아 또는 묘목에 의도하는 바에 따라 직접 가할 수 있다. 한정된 환경은 바람 또는 기류가 없기 때문에 원하는 표적으로부터 화학물질을 소산시킬 수 있어 원하는 바에 따라 표적에 화학물질을 유지시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 수확시기에 출아묘에 인플루엔자 항원의 발현을 최대화시키기 위해 발현 유도 시간을 선택할 수 있다. 특정 생장 단계에서 배아에서 발현 유도 예를 들면, 발아(germination) 후 특정 일정에 배아에서 발현 유도로 인하여 수확시기에 인플루엔자 항원의 최대 합성을 이끈다. 예를 들면 발아후 4일째에 프로모터로부터 발현을 유도하여 3일 또는 5일째에 프로모터 발현을 유도한 것보다 더 많은 단백질을 합성하게 된다. 당업자는 일상적인 실험을 통하여 최대 발현을 얻을 수 있을 것이다. 특정 방법에서 출아묘는 발아후 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일 또는 12일에 수확할 수 있다.
발현 벡터가 유도성 프로모터 대신에 구성(constitutive) 프로모터를 보유하는 경우, 출아묘는 출아묘의 형질변환후에 특정 시간에 수확할 수 있을 것이다. 예를 들면, 출아묘는 발생 초기 단계에서 바이러스에 의해 형질변환되면 출아묘는 발현이 형질변환후 최대시점에 되는 시기에 수확할 수 있다. 에를 들면 형질변환후 약 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일이 될 수 있다. 씨앗의 발아에 따라 싹은 형질변환후 1개월, 2개월, 3개월 또는 더 긴 시간에 발생될 수 있을 것이다.
일반적으로 인플루엔자 항원의 발현이 시작되면, 씨, 배아 또는 출아묘는 인플루엔자 항원 수준이 충분히 발현될 때까지 생장하도록 한다. 특정 측면에서, 충분한 수준은 수확된 바이오매스를 날 것으로 복용했을 때 환자에 치료요법적으로 잇점을 제공할 수 있는 수준이 된다. 대안으로 또는 추가로, 충분한 수준은 인플루엔자 항원이 바이로매스로부터 농축되거나 정제되어 투여시 환자에 치료요법적으로 유익한 점을 제공하는 약학 조성물로 조제될 수 있는 수준이 된다. 일반적으로, 인플루엔자 항원은 자연상태에서 출아묘에 발현되는 단백질이 아니다. 어쨌든, 인플루엔자 항원은 자연상태에서 출아묘에 존재하는 농도이상의 농도에서 발현된다.
인플루엔자 항원의 발현이 일단 유도되면, 출아묘를 수확하게 되는 출아묘 단계까지 생장을 계속하도록 한다. 출아묘는 생으로 수확할 수 있다. 생 출아묘 수확은 최소한의 노력과 파손 등을 포함하는 몇 가지 장점을 가진다. 본 발명의 출아묘는 수경재배에 의해 생장되어, 수확은 수경재배 액으로부터 출아묘를 단순히 집어 올리는 것이 된다. 본 발명의 출아묘 생장에 토양이 필요하지 않지만 당업자에 의해 필요하다고 생각되거나 바람직하다고 생각되는 경우에 제공될 수 있다. 싹이 토양없이 생장할 수 있기 때문에 수확 시기에 출아묘 물질을 세척할 필요는 없다. 세척없이 또는 문지름없이(수확된 물질의 파손을 최소화시키게 되는) 수경재배 환경으로부터 출아묘를 직접적으로 수확하게 된다. 식물의 파손 또는 시듬은 아포프톱시스를 유도한다. 아포프톱시스 동안에 특정 단백질 분해성 효소가 활성화되어 출아묘에서 발현된 약학 단백질을 분해시키고, 이는 단백질의 치료 활성이 감소 결과를 초래한다. 아포프톱시스 유도성 단백질 분해는 성숙한 식물로부터 단백질의 수득률을 상당히 감소시킬 수 있다. 본 발명의 방법을 이용하여 식물로부터 단백질을 추출하는 순간까지 수확이 일어나지 않아 아포프톱시스를 피할 수 있을 것이다.
예를 들면, 살아있는 싹을 연마, 분쇄 또는 혼합하여 프로테아제 저해물질을 포함하는 완충액에 출아묘 바이오매스 슬러리를 만든다. 완충액은 약 4℃로 유지한다. 일부 측면에서, 출아묘 바이오매스는 대기 건조, 분무 건조, 냉동 또는 동결 건조된다. 성술한 식물에서 이들 방법 중 일부 예를 들면 대기-건조에 의해 약학 단백질의 활성이 상실될 수 있다. 그러나, 출아묘는 매우 작고, 용적 비율에 대해 큰 표면적을 가지기 때문이 이와 같은 것은 발생하지 않을 수도 있다. 당업자는 발현된 단백질의 단백질 분해를 최소화시키는 바이오매스 수확 기술이 상당히 많으며, 본 발명에 이용할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일부 구체예에서, 출아묘는 식용이 가능하다. 특정 구체예에서, 수확시(가령, 수확 직후, 수확후 최소한의 시간내에)에 인플루엔자 항원을 충분한 수준으로 발현시키는 출아묘를 소비한다. 이와 같은 방식으로, 치료를 요하는 환자에 인플루엔자 항원을 투여하기 전에 인플루엔자 항원의 수확에 의해 유도되는 단백질 분해에 의한 분해를 최소화시킨다. 예를 들면, 바로 소비할 수 있는 출아묘를 환자에 직접 제공할 수 있을 것이다. 대안으로 또는 추가로 유전공학적으로 조작된 씨 또는 배아를 치료를 요하는 환자에 제공하고, 환자가 출아묘 키울 수 있다. 한 측면에서, 유전공학적으로 조작된 출아묘를 환자에 공급하거나 또는 환자를 치료하는 의사에 공급하여 특정 바람직한 인플루엔자 항원을 발현시키는 출아묘 스톡을 배양할 수도 있다. 이는 고가의 약품을 구입할 여력이 안되거나 운반할 여력이 안되는개발도상국가에서 특히 가치가 있다. 본 발명의 출아묘는 이와 같은 개발도상국 집단에 특히 바람직한 출아묘를 만드는데 용이하다.
한정된 환경에서의 조절가능한 성질은 외부 환경에서 자라는 식물에 비교하여 본 발명에 잇점을 부여한다. 일반적으로, 식물에서 약학 단백질을 발현시키는 유전공학적으로 조작된 출아묘를 생장시키면, 유전공학적으로 조작된 식물을 생장시키는 것보다 더 신속하게(식물을 더 어릴 때 수확하기 때문에) 그리고 힘을 덜 들이고, 위험이 감소된 약학 산물을 제공한다. 본 발명에 이용되는 한정된 조절가능한 환경은 자연계에서 식물의 교차 오염을 감소 또는 제거시킨다.
예를 들면, 열 유도성 프로모터는 외부 온도를 조절할 수 없기 때문에 실외에서는 이용되지 않을 것이다. 프로모터는 특정 수준이상으로 실외 온도가 상승되면 언제든지 개시될 수 있다. 유사하게, 프로모터는 실외 온도가 떨어질 때마다 작동을 멈추게 될 것이다. 이와 같은 온도 변이는 하루에, 예를 들면 낮에는 개시되고 밤에는 중단될 수 있다.
여기에서 설명하는 것과 같이 열 유도성 프로모터는 실외와 같이 거의 동일한 정도로 기온 변화에 민감한 온실에 실질적으로 이용할 수 없을 것이다. 온실에서 유전공학적으로 조작된 식물의 생장은 상당히 비용이 든다. 대조적으로, 본 시스템에서, 모든 변수를 조절하여 매번 수확시마다 최대의 발현을 얻을 수 있도록 한다.
특정 구체예에서, 본 발명의 출아묘를 트레이에 생장시켜, 출아묘 발생동안에 물을 주고, 분무하거나 연무시킬 수 있다. 예를 들면, 트레이에 하나 또는 그 이상의 수분 제공, 분무, 연무 및 배수 장비를 고정시켜 물, 영양소 및 화학물질 등을 출아묘 발생 동안에 특정 시기에 정확한 양으로 공급 및 배수를 시킬 수 있다. 예를 들면, 씨는 축축하게 젖도록 충분한 양의 수분을 요한다. 트레이에 있는 구멍을 통하여 과량의 수분은 바닥으로 배수된다. 일반적으로 배수된 물은 환경으로 방출하기 전에 유해한 화학물질을 제거하기 위해 적절히 조치한다.
트레이의 또 다른 장점은 매우 작은 공간내에 유지될 수 있다는 것이다. 출아묘의 생장을 위해 빛이 필요하지 않기 때문에 씨, 배아를 함유하는 트레이 또는 출아묘는 하우징 설비의 단위 바닥 공간당 많은 양의 바이오매스를 제공하기 위해 이와 같은 목적으로 제작된 설비에서 상단에 단단하게 수직으로 적재할 수 있다. 또한, 트레이 적재는 하우징 단위내에 수평으로 열을 맞추어 배열할 수도 있다. 싹이 생장하여 수확할 수 있는 시기가 되면(약 2일 내지 14일), 개별 묘목 트레이를 프로세싱 설비로 수작업으로 또는 콘베이어 벨트와 같은 자동화 장비를 이용하여 이동시킬 수 있다.
본 발명의 시스템은 인플루엔자 항원의 재료가 되는 출아묘 바이오매스를 제공하는 독특한 성질이 있다. 직접적으로 소비되건 또는 약학 조성물 형태로 처리되건, 출아묘는 한정된 조절가능한 환경에서 생장하기 때문에 출아묘 바이오매스 및/또는 이로부터 유도된 약학 조성물을 소비자에게 저렴한 가격으로 제공될 수 있다. 또한, 출아묘의 생장 조건을 조절할 수 있다는 사실은 생성물의 품질 및 순도를 일정하게 유지시킬 수 있다. 본 발명의 한정된 조절가능한 환경은 과학자들에 의해 실외에서 유전공학적으로 조작된 농산물의 재배를 금지하는 EPA의 많은 안전 규제를 피할 수 있다.
형질변환된 싹
다양한 방법을 이용하여 식물을 형질변환시키고, 유전공학적으로 조작된 출아묘를 만든다. 유전자 전이 식물 세포 라인을 in vitro에서 생성시키고, 세포 라인이 온전한 식물로 재생되는데 요구되는 식물의 형질변환에 이용가능한 두 가지 방법에는 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens) 매개된 유전자 전이와 마이크로프로젝타일 투하(microprojectile bombardment) 또는 전기천공이 포함된다. 바이러스 형질변환이 원하는 산물을 수득하기 전에 실험적인 또는 제너레이션 래그(generational lag) 없이 수확될 수 있는 배아와 출아묘를 좀더 신속하게 그리고 비용을 적게 들이는 방법이다. 임의 기술의 경우에, 당업자는 식물, 씨앗, 배아 또는 출아묘에 통상적으로 이용될 수 있는 형질변환 프로토콜을 어떻게 조절하여 최적화시킬 수 있는지를 인지할 수 있을 것이다.
아그로박테리움 형질변환 발현 카세트
아그로박테리움은 그램 음성 족 리조바아세(Rhizobiaceae)의 대표속이다. 이 종은 크라운 골(crown gall) 및 모근병과 같은 식물 종양의 원인이 된다. 종양의 특징인, (dedifferentiated) 식물 조직에서 오파인(opines)으로 알려진 아미노산 유도체가 아그로박테리움에 의해 생산되고, 식물에 의해 동화(catabolize)된다. 오파인 발현을 맡고 있는 세균 유전자는 키메라 발현 카세트의 조절 요소의 통상의 자원이 된다. 본 발명에 따르면, 아그로박테리움 형질변환 시스템을 이용하여 식용 출아묘를 생성시키고, 이는 성숙한 식물보다 다소 조기에 수확된다. 아그로박테리움 형질변환 방법을 인플루엔자 항원을 발현시키는 출아묘를 생성시키는데 응용할 수 있다.
일반적으로, 식물의 형질변환은 식물/세균 벡터를 운반하는 아그로박테리움 튜머페션스와 공동 배양하여 조직 배양물에서 생장한 식물의 형질변환시키는 것에 관계한다. 벡터에는 인플루엔자 항원을 인코드하는 유전자를 포함한다. 아그로박테리움은 식물 숙주 세포로 벡터를 전달하고, 항생제 처리에 의해 아그로박테리움은 제거된다. 인플루엔자 항원을 발현시키는 형질변환된 식물 세포들을 선별하고, 분화시켜 최종적으로 온전한 식물로 재생시킨다(Hellens et al, 2000, 식물 MoI. Biol, 42:819; Pilon-Smits et al., 1999, Plant Physiolog., 119:123; Barfield et al, 199], Plant Cell Reports, 10:308; and Riva et al, 1998, J. Biotech, 1(3); 각 참고문헌으로 첨부한다).
본 발명에서 이용할 수 있는 발현 벡터에는 식물에서 작용하도록 고안된 인플루엔자 항원과 발현 카세트의 하류 및 상류 컴패니언 서열(companion sequences)을 가진 유전자(또는 발현 카세트)가 포함된다. 컴패니언 서열은 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 오리진이며, 세균으로부터 원하는 식물 숙주로 DNA을 전달하기 위해 벡터에 존재하는 필수 특징들을 제공한다.
기본적인 세균/식물 벡터 구조체는 바람직하게는 광역의 숙주 범주의 원핵 복제 오리진, 원핵세포 선택성 표식을 제공할 수 있다. 적절한 원핵세포 선택성 표식에는 암피실린 또는 테트라사이클린과 같은 항생제에 대한 저항성이 포함된다. 당분야에 공지된 추가 기능을 인코드하는 다른 DNA서열이 벡터에 존재할 수도 있다.
아그로박테리움 T-DNA 서열은 식물 염색체로 DNA의 아그로박테리움 매개된 전달에 필요하다. T-DNA의 종양-유도성 유전자를 일반적으로 제거하고 인플루엔자 항원을 인코드하는하는 서열로 대체한다. T-DNA 보더(border) 서열은 식물 게놈으로 T-DNA 부분으로 통합개시하기 때문에 보유된다. 인플루엔자 항원의 발현이 바로 감지되지 않는 경우에, 세균/식물 벡터 구조체에 식물 세포의 형질변환이 있는지를 결정하는데 적절한 선택성 표식 유전자, 예를 들면, nptll 카나마이신 저항성 유전자가 포함될 수 있다. 동일한 또는 상이한 세균/식물 벡터 (Ti 플라스미드)가 Ti 서열이다. Ti 서열에는 비루런스(virulence) 유전자, 이 유전자는 T-DNA의 절단, 식물 게놈으로 전달 및 통합을 인코드한다(Schell, 1987, Science, 237:1176). 식물 게놈으로 이형성 서열의 통합을 허용하는데 적절한 다른 서열들에는 트랜스포존(transposon) 서열 및 상동성 재조합을 위한 유사한 것들이 포함된다.
특정 구조체에는 항원 단백질을 인코드하는 발현 카세트를 포함한다. 주어진 형질변환에 하나, 두 개 또는 그 이상의 발현 카세트가 이용될 수도 있다. 재조합 발현 카세트에는 인플루엔자 항원 인코드 서열에 추가하여 다음의 요소들이 포함될 수 있다: 프로모터 부분, 식물 5' 비해독(untranslated) 서열, 개시 코돈 (발현된 유전자가 이를 보유하느냐에 따라), 전사 및 해독 종료 서열. 추가적으로, 전사 및 해독 종료물질이 본 발명의 발현 카세트 도는 키메라 유전자에 포함될 수 있다. 단백질이 적절하게 프로세싱되고 전좌(translocation)를 허용하는 시그날 방출 서열이 발현 카세트에 포함될 수 있다. 다양한 프로모터, 시그날 서열 및 전사 및 해독 종료물질에 대해서는 예를 들면 Lawton et al. (1987, Plant Mol. Biol, 9:315) 및 U.S. Patent 5,888,789 (이둘 다 참고문헌으로 첨부한다)에서 설명하고 있다. 또한, 항생제 저항성에 대한 구조적 유전자를 선택성 인자로 통상적으로 이용한다 (Fraley et al. 1983, Proc. Natl. Acad. Sd., USA, 80:4803, 참고문헌으로 첨부한다). 카세트의 5'와 3' 에 유일한 제한 효소 부위가 기존의 벡터로 용이하게 삽입되도록 한다. 적어도 한 가지 T-DNA 보더 서열을 운반하며, 아그로박테리움 매게된 형질변환(binary) 벡터 시스템에 대해 설명되어 있다(PCT/EP99/07414, 참고문헌으로 첨부됨).
재생
형질변환된 식물의 씨앗을 수확하고, 건조하고, 세척하여 원하는 유전자 산물의 생존, 존재 및 발현을 테스트할 수 있다. 이것이 일단 결정되면 씨앗 스톡은 필요할 경우 사용하기에 적절한 일반적으로 온도, 습도, 위생 및 안전성에 적절한 조건하에 보관한다. 그 다음, 배양된 프로토플라스트로부터 전체 식물을 재생할 수 있는데 이는 Evans et al. (Handbook of Plant Cell Cultures, Vol. 1, MacMillan Publishing Co., New York, NY, 1983, incorporated herein by reference); 및 Vasil (ed., Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Acad. Press, Orlando, FL, Vol. I, 1984, and Vol. Ill, 1986, incorporated herein by reference)에서 설명하고 있다. 특정 측면에서, 출아묘 단계에서만 식물들이 재생된다. 일부 측면에서는 전체 식물들을 재생하여 씨앗 산물 스톡을 만들고, 출아묘는 씨앗 스톡의 씨로부터 생성된다.
프로토플라스트를 분리하고, 온전한 재생된 식물을 제공하는 모든 식물은 본 발명에 의해 형질변환되어, 전이된 유전자를 포함하는 전체 식물을 회수한다. 실제 모든 식물은 배양된 세포 또는 조직으로부터 재생되는데, 식용 싹을 생산하는 모든 주요 종의 식물을 포함하나 이에 국한시키지는 않는다. 일부 적절한 식물에는 알파파, 녹두, 무, 밀, 머스타드, 시금치, 당근, 비트, 양파, 마늘, 셀러리, 대황, 양배추 또는 양상추와 같은 잎 식물, 물냉이 또는 큰 바닥 냉이, 파슬리, 민트 또는 클로버와 같은 허브, 콜리플라워, 브로콜리, 소이빈, 렌즈콩, 해바라기와 같은 식용 꽃이 포함된다.
재생 수단은 식물의 한 종으로부터 다른 종으로 다양하다. 그러나, 당업자는 이형 유전자 복사체를 포함하는 형질변환된 프로토플라스트 현탁액을 먼저 제공해야한다는 것을 인지할 것이다. 유합(Callus) 조직이 형성되고, 유합조직으로부터 어린가지(shoot)가 유도되고 연속하여 뿌리를 내린다. 대안으로 또는 추가적으로 배아 형성은 프로토플라스트 현탁액으로부터 유도될 수 있다. 이들 배아가 자연 배아로 발아하여 식물을 형성한다. 씨를 물에 담구거나 또는 씨앗에 물을 분무하여 씨의 수분 함량을 35-45%로 증가시켜 발아가 시작된다. 발아의 진행을 위해, 일반적으로 씨앗은 조절된 온도 및 대기 조건하에 물로 포화된 대기에서 유지한다. 배양 배지에는 일반적으로 옥신 및 사이토키닌과 같은 다양한 아미노산 및 호르몬을 포함한다. 알파파와 같은 종에는 배지에는 글루타민산 및 프롤린을 첨가하는 것이 유리하다. 어린 가지와 뿌리는 일반적으로 동시에 발생한다. 효과적인 재생은 배지, 유전자 타입, 배양물의 역학에 따라 달라진다. 이들 세가지 변수가 조절된다면 재생은 반복적으로 재생할 수 있다.
형질변환된 식물 세포에서 생장된 성숙한 식물은 같은 종류이며, 비-분리형동종접합체 유전자 전이 식물이 확인된다. 동종의 식물은 항원-인코드 서열을 포함하는 씨앗을 만든다. 이와 같은 씨앗이 발아되어 출아묘 단계로 생장하고 본 발명의 인플루엔자 항원을 만든다.
관련 구체예에서, 본 발명의 씨앗이 씨앗 산물로 형성되어 어떻게 묘목을 약학 조성물로 투여 또는 수확하기 위한 출아묘 단계로 생장시키는지에 대한 지시사항과 함께 판매된다. 관련 구체예에서, 원하는 형질을 포함하는 하이브리드 도는 변이체를 본 발명의 동종 번식 식물로부터 발생시킬 수도 있다.
직접적인 통합
본 발명에서 미세입자투사(microprojectile bombardment) 또는 전기천공에 의해 식물 세포의 게놈으로 DNA 단편의 직접 통합을 이용할 수도 있다(가령, Kikkert, et al, 1999, Plant: J. Tiss. Cult. Assoc, 35:43; Bates, 1994, MoI. Biotech., 2:135). 좀더 구체적으로, 본 발명의 인플루엔자 항원을 발현시키는 벡터를 다양한 기술을 이용하여 식물 세포에 도입시킬 수 있다. 상기에서 설명한 것과 같이, 벡터에는 식물 세포에서 이용할 수 있는 선택성 마커를 포함할 수도 있다. 벡터에는 제2 숙주에서 선별 및 증식을 허용하는 서열 예를 들면, 복제 기원 및 선택성 마커를 포함하는 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로, 제2숙주에는 세균 및 이스트를 포함한다. 한 구체예에서, 제2 숙주는 세균(가령, 대장균, 복제 원점은 복제의 colEl-타입 오리진이다)이 되며, 선택성 마커는 암피실린 저항성을 인코드하는 유전자가 된다. 이와 같은 서열은 당분야에 공지되어 있고 상업적으로 이용할 수 있다(가령, Clontech, Palo Alto, CA 또는 Stratagene, La Jolla, CA).
본 발명의 벡터를 변형하여, 아그로박테리움 튜머페션스 벡터, 아그로박테리움 튜머페션스의 T-DNA 보더 부분, 핵산 또는 발현 카세트를 인코드하는 항원에 상동성 부분을 포함하는 식물 형질변환 플라스미드를 조절할 수 있다. 추가로, 벡터에는 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens)의 플라스미드를 유도하는 무해한 식물 종양을 포함할 수도 있다.
이와 같은 구체예에 따르면, 벡터 발명의 직접적인 형질변환은 기계적인 재조합 DNA 전달에 마이크로피펫을 이용하여 식물 세포에 직접적으로 벡터를 미세주입하는 것과 관련있을 수 있다(가령, Crossway, 1985, MoI. Gen. Genet., 2Q2-Λ19, 참고문헌을 첨부한다). 유전 물질을 폴리에틸렌 글리콜을 이용하여 식물 세포로 전달할 수도 있다(가령, Krens et al., 1982, Nature 296:72). 식물로 핵산을 도입시키는 또 다른 방법은 작은 비드 또는 압자의 매트릭스내에 또는 표면상에 핵산의 소립자에 의해 고속 탄도 침투시키는 것이다(가령, Klein et al., 1987, Nature 321:10; Knudsen et al., Planta, 185:330). 또 다른 도입 방법은 미니셀, 세포, 라이소좀 또는 다른 융합성 지질 표면의 바디와 같은 다른 대상과 프로토플라스트를 융합시키는 것이다(가령, Fraley et al., 1982, Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 79:1859). 본 발명의 벡터를 전기천공에 의해 식물로 도입시킬 수 있다(가령, Fromm et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Set, USA, 82:5824). 이와 같은 기술에 따라 식물 프로토플라스트는 유전자 구조체를 포함하는 플라스미드 존재하에 전기천공된다. 고장력(high field strength)의 전기 펄스는 가역적으로 바이오막을 침투하게 하여 플라스미드의 도입이 허용된다. 전기천공된 식물 프로토플라스트는 세포 벽 분할을 재형성하고, 식물 유합조직을 형성하고, 이는 재생되어 본 발명의 출아묘를 형성한다. 당업자는 식용 출아묘를 만들기 위해, 어떻게 이와 같은 식물 세포의 형질변환 방법을 이용하는지를 인지할 것이다.
바이러스 형질변환
통상의 발현 시스템과 유사하게, 식물 바이러스 벡터를 이용하여 전장의 항원을 포함하는 전장 단백질을 만들 수 있다. 본 발명에 따라, 식물 바이러스 벡터를 이용하여 씨, 배아, 출아묘에서 항원을 감염 생산할 수 있다. 바이러스성 시스템을 이용하여 짧은 펩티드로부터 큰 복합 단백질을 발현시킨다. 특히, 토마토 바이러스 벡터를 이용하는 방법이 McCormick et al(1999, Proc. Natl. Acad. ScL, USA, 96:703; Kumagai et al. 2000, Gene, 245:169; and Verch et al, 1998, J. Immunol. Methods, 220:69; 참고문헌으로 첨부한다). 따라서, 식물 바이러스성 벡터는 짧은 펩티드 뿐만 아니라 큰 복합 단백질을 모두 발현시키는 능력을 가진다.
특정 구체예에서, 인플루엔자 항원을 발현하는 유전자 전이 싹은 숙주/바이러스 시스템을 이용하여 만들어진다. 바이러스 감염에 의해 생성된 유전자 전이 싹은 안전한 것으로 이미 설명된 유전자 전이 단백질의 재료를 제공한다. 예를 들면, 싹은 동물 병인균의 오염이 없다. 있음직 하지는 않지만, 예를 들면 담배의 식용 싹에서 단백질은 이론상으로는 정제없이 경구 투여할 수 있어 상당한 비용을 줄일 수 있다. 또한, 바이러스/발아 시스템은 스케일-업 및 제조에 훨씬 간단한 비용 절감적인 경로를 제공하는데, 그 이유는 트란스진(trangenes)이 바이러스내로 도입되어 수일내에 상업규모로 생장할 수 있기 때문이다. 대조적으로, 대규모 시도 또는 상업화에는 충분한 양의 씨 또는 식물 재료가 이용되기 때문에 유전자 전이 식물은 5-7년을 필요로 할 수 있다.
본 발명에 따르면, 식물 RNA 바이러스는 특정 장점을 가지는데, 이는 외부 단백질 발현을 위한 벡터로써의 매력을 가지도록 한다. 다수의 식물 RNA 바이러스의 분자생물학 및 병리학이 파악되어 있고, 바이러스 생물학, 유전학 및 조절 서열에 대해서도 상당히 공지되어 있다. 대부분 식물 RNA 바이러스는 작은 게놈을 가지며 감염성 cDNA 클론을 이용하여 유전자 조작을 실행할 수 있다. 감염성 바이러스 물질이 일단 민감성 숙주 세포로 유입되면 높은 수준으로 복제하여 전체적인 출아묘를 통하여 신속하게 퍼진다(접종후 1일 내지 10일 후). 바이러스 입자들은 감염된 출아묘 조직으로부터 용이하고 경제적으로 회수된다. 바이러스는 광역의 숙주 범위를 가지고 있어 몇 가지 민감 종의 감염에 단일 구조체를 이용할 수게 된다. 이와 같은 특징들은 싹으로 바로 전달될 수 있다.
외부 서열은 식물 RNA 바이러스로부터 발현되는데, 이는 일반적으로, 원하는 서열로 바이러스 유전자들중 하나를 대체하고, 적절한 위치의 바이러스 게놈으로 외부 서열을 삽입하거나 또는 바이러스의 구조 단백질에 외부 펩티드를 융합시켜 실행될 수 있다. 또한 이들 방법중 임의 방법을 복합하여 바이러스의 치명적 기능을 교차 실행(trans-complementation)하여 외부 서열을 발현시킬 수 있다. 담배 모자이크 바이러스(TMV), 알파파 모자이크 바이러스(AIMV), 이의 키메라를 이용하여 바이러스-감염된 식물에서 외부 서열을 발현시키는 도구로 사용할 수 있는 다양한 전략들이 존재한다.
AlMV 게놈은 브로모비리데(Bromoviridae)족 바이러스의 대표이며, 세가지 게놈 RNAs (RNAsl-3)와 서브게놈 RNA (RNA4)로 구성된다. 게놈 RNAs1 및 2는 바이러스 복제효소(replicase) 단백질 Pl 및 2를 각각 인코드한다. 게놈 RNA3는 세포간 이동 단백질 P3 및 피복 단백질(CP)을 인코드한다. CP는 서브게놈 RNA4로부터 해독되는데, 게놈 RNA3으로부터 합성되고, 감염 시작에 요구된다. 연구에 따르면, 게놈 활성화, 복제, RNA 안정성, 증후 형성 및 RNA 캡슐화를 포함하는 다중 기능에 CP가 관련된다는 것이다(가령, BoI et al, 1971, Virology, 46:73; Van Der Vossen et al, 1994, Virology 202:891; Yusibov et al, Virology, 208:405; Yusibov et al, 1998, Virology, 242:1 ; BoI et al, (Review, 100 refs.), 1999, J. Gen. Virol, 80:1089; De Graaff, 1995, Virology, 208:583; Jaspars et al, 1974,Adv. 바이러스 Res., 19:37; Loesch-Fries, 1985, Virology, 146:177; Neeleman et al, 1991, Virology, 181 :687; Neeleman et al, 1993, Virology, 196: 883; Van Der Kuyl et α/., 1991, Virology, 183:731; and Van Der Kuyl et al, 1991, Virology, 185:496).
바이러스 입자들의 겹합포개기(Encapsidation)는 씨, 배아 또는 출아묘의 접종된 부분으로부터 접종안된 부분으로 바이러스의 장거리 이동 및 시스템적 감염에 일반적으로 요구된다. 본 발명에 따르면, 접종은 식물 발생의 임의 단계에서 일어날 수 있다. 배아 및 싹에서 접종된 바이러스 전파는 매우 신속하다. AlMV 비리온은 독특한 CP (24kD)에 의해 결합포개기되어 한 가지 이상의 입자 타입을 형성한다. 입자들의 크기(30- 내지 60-nm의 길이, 18nm 직경) 및 모양(구형, 타원형 또는 간상[bacilliform])은 결합포개기된 RNA의 크기에 따라 달라진다. 어셈블리시에, AlMV CP의 N-말단은 바이러스 입자의 표면상에 위치하고 바이러스 어셈블리를 간섭하지 않은 것으로 보인다 (BoI et al., 1971 , Virology, 6:73). 또한, 38개 아미노산 펩티드와 ALMV CP는 N-말단에서 in vitro상에서 입자들을 형성하고 생물학적 활성은 유지한다 (Yusibov et al, 1995, J. Gen. Virol., 77:567).
AlMV는 식물 씨앗, 배아 및 싹을 포함하는 다수의 농업적으로 가치가 있는 곡물 식물을 포함하는 광범위한 숙주 범위를 가진다. 이와 함께, 이들 특징으로 ALMV CP를 캐리어 분자로써 우수한 후보물질을 만들고, AlMV는 발생의 발아 단계에 있는 식물에 외부 서열의 발현을 위한 매력적인 후보 벡터가 되다. 또한, TMV와 같은 이형성 벡터로부터 발현시에 바이러스 활성의 간섭없이 TMV 게놈을 결합포개기시킨다(Yusibov et al, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:5784, incorporated herein by reference). 이로써 외부 서열에 융합된 AlMV CP용 캐리어 바이러스로 TMV를 이용하게 된다.
토바모바이러스(tobamviruses)의 프로토타입인 TMV는 17.0kD CP로 결합포개기된 단일 펄스-센스 RNA로 구성된 게놈을 보유하는데, 이는 막대형 입자로 된다(300nm 길이). CP는 TMV의 유일한 구조 단백질이며, 결합포개기에 요구되며, 감염된 숙주에서 바이러스의 장거리 이동에도 필요하다(Saito et al, 1990, Virology 176:329). 게놈 RNA로부터 183 및 126 kD 단백질이 해독되고, 이들은 바이러스 복제에 요구된다 (Ishikawa et al, 1986, Nucleic Acids Res., 14:8291). 30 kD 단백질은 바이러스의 세포간 이동 단백질이다(Meshi et al, 1987, EMBO J., 6:2557). 이동 및 피복 단백질은 서브게놈 mRNA로부터 해독된다(Hunter et al., 1976, Nature, 260:759; Bruening ef or/., 1976, Virology, 71:498; and Beachy et al, 1976, Virology, 73:498, 각각은 참고문헌으로 첨부된다).
식물 조직을 형질변환시키는 다른 방법에는 식물의 꽃을 형질변환시키는 것이 포함된다. 아라비도프시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)의 형질변환은 식물의 꽃을 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens) 용액에 담구어 실행한다(Curtis et al, 2001, 유전자 전이 Res., 10:363; and Qing et al, 2000, Molecular Breeding: New Strategies in Plant Improvement 1 :67). "담궈진(dipped)" 식물에 의해 생성된 씨앗집단에서 형질변환된 식물은 형성된다. 꽃 발생 동안 특정 시기에 알에는 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens)가 알의 내부에 근접하는 알의 벽에 구멍이 있다. 알의 내부에 들어가면 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens)는 개별 난세포(ovules)를 침투하여 형질변환시킨다(Desfeux et al, 2000, Plant Physiology, 123:895). 형질변환된 난세포는 난내에 씨앗 형성의 전형적인 과정을 따른다.
항원의 생산 및 분리
일반적으로 당분야에 공지된 표준 방법을 이용하여 항원 생산을 위한 본 발명의 식물, 식물 세포 및/또는 식물 조직(예를 들면, 클론 식물, 클론 식물 세포, 클론 뿌리, 클론 뿌리 라인, 싹, 출아묘, 식물 등)을 배양하고 생장시킨다. 광범위하게 다양한 배양 배지 및 바이오리엑터를 이용하여 모근 세포, 뿌리 세포 라인 및 식물 세포를 배양한다(Giri et al, 2000, Biotechnol Adv., 18:1 ; Rao et al, 2002, Biotechnol. Adv., 20:101 ;참고문헌으로 첨부한다). 클론 식물은 임의 적절한 방법으로 생장시킬 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명의 인플루엔자 항원은 임의 공지의 방법에 의해 생산할 수 있다. 일부 구체예에서, 식물 또는 식물의 일부에서 인플루엔자 항원이 발현된다. 당분야에 공지된 통상의 조건 및 기술에 따라 단백질을 분리하고 정제한다. 여기에는 추출, 침전, 크로마토그래피, 친화력 크로마토그래피, 전기영동 및 이와 유사한 방법이 포함된다. 본 발명은 당분야에 공지된 임의 다양한 식물 발현 시스템 및 여기에서 제공하는 바이러스 발현 시스템을 이용하여 인플루엔자 항원 생산의 적절한 스케일 업 및 정제와 관계한다.
본 발명의 많은 구체예에서, 백신 산물을 위한 인플루엔자 항원을 분리하는 것이 바람직할 것이다. 본 발명의 단백질은 이를 발현시키는 식물 조직 또는 이의 일부, 예를 들면, 뿌리, 뿌리 세포, 식물, 식물 세포로부터 생산되고, 식물 재료의 부분적 또는 온전한 분리를 위해 여기에서 설명하는 방법 또는 당분야에 공지된 이용가능한 방법을 이용한다. 식물 세포 또는 조직의 일부 또는 전부로부터 발현 산물을 분리하는 것이 바람직한 경우에 임의 이용가능한 기술을 이용할 수도 있다. 당업자는 광범위한 분별 및 분리 과정에 대해 잘 숙지하고 있을 것이다(예를 들면, Scopes et al, Protein Purification: Principles and Practice, 3rd Ed., Janson et al, 1993; Protein Purification: Principles, High Resolution Methods, and Applications, Wiley- VCH, 1998; Springer- Verlag, NY, 1993; and Rot, protein Purification Techniques, Oxford University Press, 2001; 각각을 참고문헌으로 첨부한다). 흔히, 산물은 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 순도를 가지는 것이 바람직하다. 식물 조직 또는 유체로부터 물질을 정제하는데 유용한 방법에 대해서는 U.S. Pat. Nos. 6,740,740 ; 6,841,659을 참고한다.
당업자는 원하는 인플루엔자 항원 산물을 수득하는 방법이 추출에 의한 것이라는 것을 인지할 것이다. 식물 재료(가령, 뿌리, 잎 등)를 추출하여 잔류 바이오매스로부터 원하는 산물을 제거하여 산물의 농도 및 순도를 증가시킨다. 식물을 완충액에서 추출한다. 예를 들면, 식물 재료는 완충액 예를 들면 인산염 완충액과 1대1 중량비의 물로 이동한다. 필요한 경우에 단백질분해효소 저해물질을 첨가할 수도 있다. 식물 재료는 활발한 블렌딩 또는 그라인딩을 이용하여 파쇄시키고, 여과 또는 원심분리에 의해 제거된 바이오매스는 완충액에 현탁되고 추출된다. 용액에 포함된 산물을 추가 단계를 이용하여 추가 정제하거나 동결 건조 또는 침전을 통하여 건조 분말로 전환시킬 수 있다. 프레싱으로 추출을 할 수도 있다. 식물 또는 뿌리는 프레스에서 가압하거나 또는 서로 접해있는 롤러를 통과시켜 뭉개어 추출할 수 있다. 으깨진 식물 또는 뿌리로부터 나타나는 유체를 수거하고, 당분야에 공지된 방법에 따라 처리한다. 프레스를 통한 추출은 좀더 농축된 형태의 산물 방출을가능하게 한다. 그러나, 산물의 전반적인 수률은 산물이 용액에서 추출되는 경우에 낮아질 수도 있다.
백신
본 발명은 인플루엔자 감염의 치료 및 예방을 위한 백신으로 활성이 있는 인플루엔자 항원(가령 인플루엔자 단백질 또는 이의 면역원 부분 또는 인플루엔자 단백질 또는 이의 면역원 부분을 포함하는 융합 단백질과 같이 치료요법적 용도의 약리학적 항원 단백질을 제공한다. 또한, 본 발명은 수의학 분야에 활성이 있는 인플루엔자 항원으로 수의학 분야에 용도를 제공한다. 특정 구체예에서, 인플루엔자 항원은 식물 또는 이의 일부분(가령, 뿌리, 세포, 싹, 세포 라인, 식물 등)으로부터 만들 수 있다. 특정 구체예에서, 제공된 인플루엔자 항원이 식물, 식물 세포 또는 식물 조직(가령, 싹, 출아묘, 뿌리, 뿌리 배양물, 클론 세포, 클론 세포 라인, 클론 식물 등)에서 발현된다면 식물을 직접 사용하거나 또는 부분적으로 정제된 또는 정제된 형태의 개체에 약리학적 투여를 위해 조제물로 이용할 수 있다.
본 발명은 투여가 필요한 개체에 투여하였을 때 약리학적 활성을 유지하는 인플루엔자 항원을 발현시키는 식물, 식물 세포, 식물 조직을 제공한다. 예시적인 개체에는 척추동물(사람과 같은 포유류)을 포함한다. 본 발명에 따르면, 개체에는 소, 양, 개, 고양이 등과 같은 수의학적 개체가 포함된다. 특정 구체예에서 식용 식물 또는 이의 일부분(가령, 싹, 뿌리)를 치료요법적 효과량으로 개체의 구강으로 투여한다. 일부 측면에서, 하나 또는 그이상의 인플루엔자 항원은 여기에서 설명하는 약리학적 조제물로 제공된다. 본 발명의 백신 조성물에는 하나 또는 그이상의 인플루엔자 항원을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 최소 두 가지 인플루엔자 항원이 투여되는 백신 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명에 따르면, 인플루엔자 항원 백신으로 개체를 치료하면 생리학적 효과를 유도할 수 있다. 백신 단백질은 질환 또는 질병에 대해 치료 또는 경감 성질을 가질 수 있어, 이를 투여하여 질환 또는 질병의 증상 또는 심각성을 완화, 경감 또는 개시의 지역 또는 역전시킬 수 있다. 인플루엔자 항원을 포함하는 백신은 예방학적 성질을 가질 수 있기 때문에 이를 이용하여 이와 같은 질병 또는 질환 또는 발병할 것 같은 병리학적 상태에서 심각성을 감소시키거나 질병의 개시를 방지 또는 지연시킬 수 있다. 본 발명에 따른 항원으로 개체를 치료하여 유도할 수 있는 생리학적 효과에는 유기체에 의한 감염을 방해하기 위해 효과적인 면역 반응을 유도하는 것이 포함된다.
일부 구체예에서, 발명의 백신은 경구 또는 점막 경로를 통하여 운반될 수 있다. 경구 및/또는 점막 운반은 많은 병인균의 주요 감염 경로가 되는 점막 조직 감염을 예방할 가능성이 있다. 경구 및/점막 운반은 전신 면역 반응을 준비시킬 수 있다. 점막 면역 시스템을 자극하고 전신 면역원성을 준비시킬 수 있는 항원의 경구 투여용 이형 발현 시스템 개발에 상당한 진전이 있어왔다. 그러나, 경구 백신의 운반에 기존 효과는 효과를 달성하기 위해 상당량의 항원이 요구된다는 것을 설명한다. 따라서, 표적 항원의 다량을 경제적으로 생산하는 것이 효과적인 경구 백신을 만드는 선행 조건이다. 열안정성 항원을 포함한 항원을 발현시키는 식물 개발이 이와 같은 난제를 해결하는 좀 더 실질적인 방법이 된다.
본 발명의 약학 조성물은 개체에 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있는데 예를 들면, 경구, 비강, 장관(enterally), 장관외(parenterally), 근육 또는 정맥, 직장, 질, 국소, 안구, 폐를 통하여 또는 접촉에 의해 투여될 수 있다. 특정 구체예에서, 식물 또는 이의 일부에서 발현되는 인플루엔자 항원은 식물을 개체로 직접 경구로 직접 투여할 수 있다. 일부 측면에서 식물 또는 식물의 일부에서 발현되는 백신 단백질을 추출하고 정제하여 약학 조성물 조제에 이용할 수 있다. 이들의 사용처에 따라 분리된 산물을 적절히 조제하는 것이 바람직하다(약리학적 물질, 백신 조성물 등). 일부 구체예에서, 이를 발현시키는 일부 또는 전부의 식물 조직과 함께 산물을 조제하는 것이 바람직할 것이다.
식물 재료와 함께 산물을 조제하는 것이 바람직할 경우에, 관련 수용체(예를 들면, 사람 또는 다른 동물)에 독성이 없는 식물을 이용하는 것이 바람직할 것이다. 관련t 식물 조직 (가령, 세포, 뿌리, 잎)을 단순하게 수확하여 공지의 기술을 이용하여 처리할 수 있는데 발현된 산물의 활성을 유지하는 것이 고려되어야 한다. 특정 구체예에서, 식용 식물( 및 식물의 식용 부분)에 발현된 인플루엔자 항원을 보유하여 물질을 바로 섭취하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 경구 투여(적절히 조제된)후에 백신 항원이 활성화되면 식용 식물 부분에서 항원 단백질을 생산하여 단백질이 발현된 식물의 일부 또는 전부와 함께 경구 투여용으로 발현된 인플루엔자 항원을 조제하는 것이 바람직할 것이다.
제공되는 백신 항원 (가령, 본 발명의 인플루엔자 항원)은 공지 기술에 따라 조제될 수 있다. 예를 들면, 백신 산물의 효과량을 하나 또는 그이상의 유기 또는 무기, 액상 또는 고체의 약리학적으로 적절한 캐리어 물질과 함께 조제할 수 있을 것이다. 본 발명에 따라 생산된 백신 항원은 정제, 캡슐, 트로치, 분산액, 현탁액, 용액, 겔캡, 알약, 캐플릿, 크림, 연고, 에어로졸, 분말 패킷형태가 되며, 약형에서 단백질의 활성을 파괴하지 않는한 액체, 용매, 희석액, 표면활성물질, 등장액, 농후제, 또는 에멸젼화제, 보존제 및 고체 결합제등이 포함될 수 있다.
일반적으로, 조성물은 상이한 약리학적 수용가능한 캐리어, 어쥬번트, 비이클 또는 이들중 하나 또는 그 이상의 복합체를 포함할 수 있다. 여기에서 사용된 바와 같이 "약리학적으로 수용가능한 캐리어, 어쥬번트 또는 비이클"에는 투여에 사용할 수 있는 용매, 분산 매체, 코팅, 항균 및 항곰팡이제, 등장액, 흡수 지연 물질이 포함된다. 약리학적으로 수용가능한 캐리어로 사용될 수 있는 물질에는 락토즈, 글루코즈, 슈크로즈와 같은 당; 옥수수 전분, 감자 전분과 같은 전분; 셀룰로오즈 및 카르복시메틸 셀룰로오즈, 에틸 셀룰로오즈, 셀룰로오즈 아세테이트와 같은 유도물질; 분말형 트라가탄; 맥아; 젤라틴; 활석; 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; 땅콩 오일, 목화씨 오일, 참깨 오일, 올리브 오일, 옥수수 오일, 소이빈 오일과 같은 오일; 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; 에틸 올레이트, 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; 한천; 수산화 마그네슘, 수산화 알루미늄과 같은 완충액; 알긴산; 발열물질없는 물; 등장 염; 링거액; 에틸 알코올 및 인산염 완충 용액 및 라우릴 설페이트 나트륨 및 스테아레이트 마그네슘과 같은 비-독성 윤활제, 발색제, 방출제, 피복제, 감미제, 향료, 방향, 보존제, 항산화제 등이 제조업자의 판단에 따라 조성물에 포함될 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, Fifteenth Edition, E.W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 1975). 예를 들면, 백신 항원 산물은 통상의 당의정을 만드는 혼합 과립화, 용해, 동결건조 또는 유사한 과정을 통하여 약학 조성물로 제공될 수 있다.
추가 백신 성분
발명의 백신에는 개체에 투여하였을 때 백신의 면역원성을 강화시키기 위해 임의 적절한 어쥬번트를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, 이와 같은 어쥬번트에는 Quillaja saponaria (QS) 추출물, 식품 등급의 QS, 예를 들면, Quil A 및 QS-21의 정제된 서브분류물, 명반, 수산화알루미늄, 인산알루미늄, MF59, Malp2, 인컴플리트 Freund's 어쥬번트; 컴플리트 freund's 어쥬번트; 3 De-O-아실화된 모노포스포릴 리피드 A (3D-MPL)등이 포함되나 이에 국한되지는 않는다. 추가 어쥬번트에는 면역 조절 올리고뉴클레오티드 예를 들면, WO 96/02555에서 설명하는 메틸화안된 CpG 서열을 포함한다. 여기에서 언급한 것과 같이, TH1 세포 반응의 선호 자극물질인 어쥬번트를 제공하는 경우에 상이한 어쥬번트의 복합도 고려할 수 있다. 예를 들면, QS21는 3D-MPL와 함께 조제할 수 있다. QS21:3D-MPL 비율은 일반적으로 1: 10 내지 10:1; 1:5 내지 5:1이 되며; 실질적으로는 1:1이다. 적절한 시너지 효과를 내는 범위는 3D-MPL:QS21이 2.5:1 내지 1:1이 된다. 사람 백신 조제물에 이용하기에 적절한 정제된 QS 추출물의 양은 체중 kg당 0.01 mg 내지 10 mg이다.
특정 열안정성 단백질(가령, 리체나제)은 자체적으로 면역 반응 강화 활성을 설명하는데, 이와 같은 단백질은 인플루엔자 항원과 융합되거나 별도로 사용되건 간에 어쥬번트 이용으로 간주한다. 따라서, 발명의 백신 조성물에는 하나 또는 그이상의 어쥬번트를 포함한다. 특정 백신 조성물에는 두 개 또는 그이상의 어쥬번트를 포함한다. 또한, 조성물 및 투여 경로에 따라, 특정 어쥬번트가 특정 조성물 또는 복합물에 바람직하다.
특정 상황에서, 피하로 또는 근육으로 투여되는 백신 산물(가령, 단백질)의 하나 또는 그 이상의 성분의 흡수를 느리게 함으로써 발명의 백신 효과를 연장시키는 것도 바람직할 수도 있다. 이는 물에 용해도가 나쁜 결정 또는 무정형 물질의 액채 현탁액을 이용하면 된다. 산물의 흡수 속도는 분해율에 따라 달라지고, 분해율은 크기 및 형태에 따라 달라진다. 대안으로 또는 추가로, 장관외로 투여된 산물의 흡수 지연은 오일 비이클에 산물을 용해 또는 현탁시켜 얻을 수 있다. 주사용 데포는 단백질의 마이크로 캡슐 매트릭스를 폴리락티드-폴리글리콜리드와 같은 생분해가능한 폴리머에 형성시켜 만들 수 있다. 산물과 폴리머의 비율 및 이용되는 특정 폴리머의 성질에 따라 방출 속도를 조절할 수 있다. 생분해가능한 폴리머에는 포릴(오르소에스테르) 및 폴리(안하이드리드)등이 포함된다. 주사용 데포우 조성물은 신체 조직에 적응할 수 있는 리포좀 또는 마이크로에멸전에 산물을 포집시켜 만들 수 있다. 대안적인 폴리머 운반 비이클을 경구 조제물에 이용할 수 있다. 예를 들면, 생분해가능한, 인체에 사용가능한 폴리머 예를 들면, 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리안하이드리드, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르소에스테르 및 폴리락트산 등이 이용될 수 있다. 항원 또는 이의 면역원성 부분을 미소 입자 가령 폴리머 운반 비이클과 복합시켜 미소입자로 조제할 수도 있다.
백신 항원의 장관 투여용 조제물을 고체, 반고체, 현탁액 또는 에멸젼 형태로 조입시킬 수 있도 물, 현탁액, 에멸젼 물질과 같은 임의 약리학적으로 수용가능한 캐리어와 함께 합성될 수 있다. 항원은 특히 예방 수잔으로 투여되는 경우에 펌프 또는 지연 방출형으로 투여될 수 있다. 보조 활성 화합물 예를 들면, 치료될 질병 또는 임상 상태에 대해 독립적으로 활성을 가지는 화합물 또는 본 발명 화합물의 활성을 강화시키는 화합물을 조성물에 또는 조성물과 함께 투여할 수 있다. 향료 및 발색제를 이용할 수도 있다.
본 발명의 백신 산물, 선택적으로 식물 조직과 함께 백신 산물은 약학 조성물로 경구 투여하는데 특히 적합하다. 경구 액체 조성물을 이용하고, 소아 집단에 특히 용도가 있을 것이다. 수확된 식물 재료는 원하는 치료요법적 산물, 원하는 형태에 따라 다양한 방법(가령, 대기 건조, 동결 건조, 추출 등)에 의해 프로세스된다. 상기에서 설명하는 이와 같은 조성물은 경구로만 복용하거나 음식 또는 사료 또는 음료와 함께 복용할 수 있다. 경구 투여용 조성물에는 식물, 식물의 추출물, 감염된 식물에서 정제된 단백질이 건조 분말, 음식, 수용성 또는 비-수용성 용매, 현탁액 또는 에멸젼 형으로 제공된다. 비-수용성 용매의 예로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 식물성 오일, 생선 오일, 주사용 유기 에스테르가 된다. 수용성 캐리어에는 물, 물-알코올 용액, 에멸젼 또는 현탁액을 포함하는데, 염화나트륨 염, 링거 덱스트로즈 용액, 덱스트로즈+염화나트륨 용액, 락토즈 또는 고정 오일을 포함하는 링거액을 포함한 염 및 완충 의료용 비경구 비이클이 포함된다. 건조 분말에는 동결 건조, 대기 건조 또는 분무 건조된 임의 식물 바이오매스를 포함한다. 예를 들면, 식물은 이들을 시판되는 대기 건조기에 약 120℉에서 바이오매스내 수분 함량이 중량대비 5% 미만이 될 때까지 대기 건조시킬 수도 있다. 건조된 식물은 벌크 고체로 프로세싱하기 위해 보관하거나 그라인딩하여 원하는 메쉬 크기의 분말로 만들기 위해 프로세스한다. 대안으로 또는 추가로, 동결-건조는 대기 건조에 민감한 산물에 이용할 수 있다. 산물은 바이오매스내 수분 함량이 중량대비 5% 미만이 될 때까지 진공 건조기에서 동결 건조시킬 수도 있다. 건조된 물질은 여기에서 설명하는 것과 같이 추가 처리할 수 있다.
식물에서 유도된 물질을 하나 또는 그이상의 허브 조제물과 함께 또는 이와 같은 형태로 투여할 수도 있다. 유용한 허브 조제물에는 액체 및 고체 허브 조제물이 포함된다. 허브 조제물의 일부 실시예에는 팅크제, 추출물(예를 들면, 수용성 추출물, 알코올 추출물), 달임(decoctions), 건조 조제물(예를 들면 대기-건조, 분무 건조, 냉동 또는 냉동-건조), 분말(동결건조된 분말) 및 액체가 포함된다. 허브 조제물은 임의 표준 운반 비이클 예를 들면, 캡슐, 정제, 좌약, 액상 약형 등의 형태로 제공될 수 있다. 당업자는 본 발명에 이용할 수 있는 허브 조제물의 운반 양식 및 다양한 조제물의 형태를 인지할 수 있을 것이다.
발명의 뿌리 라인, 세포 라인, 식물, 추출물, 분말, 건조된 조제물, 정제된 단백질 또는 핵산 산물 등은 상기에서 설명하는 하나 또는 그이상의 부형제 유무하게 포집된 형(encapsulated form)가 될 수 있을 것이다. 고형 약형은 정제, 당의, 캡슐, 알약, 과립 등과 같은 형태는 피복이나 장용피, 방출 제어 피복 및 당분야에 공지된 다른 코팅으로 준비될 수도 있다. 고형 약형에서 활성 물질은 슈크로즈, 락토즈 또는 전분과 같은 하나이상의 비활성 희석제와 혼합될 수 있다. 이와 같은 약령은 정상적인 경우에, 비활성 희석제이외에 비활성 윤활제 및 스테아레이트 마그네슘 및 미소결정 셀룰로오즈와 같은 다른 태블릿 보조제를 추가 포함할 수 있다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우에, 약형에는 완충물질이 포함될 수 있다. 이들은 선택적으로 불투명제를 포함하거나 활성 성분만을 방출하거나 또는 지연된 방식으로 장관의 특정 부분에 선호적으로 방출하는 조성물이 될 수 있다. 이용되는 삽입조성물에는 폴리머 물질 및 왁스를 포함할 수 있다.
일부 방법에서 본 발명에 따른 인플루엔자 항원 또는 이의 바이오매스 을 발현시키는 식물 또는 이의 일부를 의료용 식품으로 경구 투여할 수 있다. 이와 같은 식용 조성물은 일반적으로 고형일 경우에는 날로 먹고, 액상형일 경우에는 마신다. 식물 재료를 사전 프로세싱 단계없이 또는 최소한의 조리후에 바로 섭취할 수 있다. 예를 들면, 직접적으로 먹을 수 있는 싹에 백신 단백질이 발현될 수 있다. 예를 들면, 알파파 싹, 녹두 싹 또는 시금치 또는 양상추 잎에 백신 항원이 발현된다. 한 구체예에서, 식물 바이오매스를 프로세스하여 프로세싱 단계후에 회수된 물질을 섭취한다.
본 발명에 따른 유용한 프로세싱 방법은 식품 또는 사료 산업에 흔히 이용되는 방법이다. 이와 같은 방법에 의한 최종 산물에는 일반적으로 발현된 항원의 실질적인 양이 포함되고, 먹거나 또는 마시기에 편리하다. 최종 산물은 다른 음식 또는 사료형 예를 들면, 염, 캐리어, 향 보강제, 항생제 등과 함께 혼합될 수 있으며, 고형, 반-고형, 현탁액, 에멸젼 또는 액상형으로 소비될 수 있다. 이와 같은 방법에는 보존 단계 예를 들면, 파스퇴르화 반응, 조리 또는 보전 및 방부 물질 첨가등이 포함된다. 임의 식물을 이용할 수 있고, 본 발명에 따라 프로세싱되어 식용 또는 마실 수 있는 식물성 물질을 만든다. 식물에서 유도된 조제물에 있는 인플루엔자 항원의 양은 당분야에 표준 방법에 의해 테스트될 수 있는데, 예를 들면, 겔 전기영동, 산물에 특이적인 프로브 또는 항체를 이용하는 ELISA 또는 웨스턴 블랏 분석이 있다. 이와 같은 측정 방법을 이용하여 소비되는 백신 항원 단백질 양을 표준화시킨다. 예를 들면 백신 항원의 양을 측정 및 조절하여, 산물의 상이한 수준을 가지는 산물 배취(batches)를 혼합하여 단일 약량으로 소비되는 또는 마시게 되는 물질의 양을 표준화시킬 수 있다. 본 발명의 한정된 조절가능한 환경은 이와 같은 표준화 과정을 실행할 필요를 최소화시킬 수 있다.
개체가 복용하는 식물 세포 도는 조직에서 생산된 백신 단백질은 소화계에 적절하게 흡수될 수 있다. 최소화로 프로세스된 식물 조직를 섭취할 경우 한 가지 장점은 식물의 세포에 단백질을 포집 또는 격리(sequestration)시킬 수 있다는 것이다. 따라서, 산물은 장에 도달하기 전에 상부 소화기관으로부터 어느 정도 보호를 받게되며, 활성 산물의 더 많은 비율이 흡수되는데 이용될 수 있을 것이다.
본 발명의 약학 조성물은 치료목적으로 또는 예방목적으로 투여될 수 있다. 조성물을 질병의 치료 또는 예방에 이용될 수 있을 것이다. 예를 들면, 질병의 발생 위험이 있는 또는 질병으로 고통을 받고 있는 임의 개체를 치료할 수 있을 것이다. 개인은 질병의 임의 증상을 가진다고 진단을 받지 않고도 질병의 발생 위험이 있다고 판단될 수도 있을 것이다. 예를 들면 개인이 인플루엔자 감염에 대해 상대적으로 높은 위험 환경에 있거나 있었던 것으로 보이면 개인은 질병 발생 위험이 높은 것으로 간주한다. 유사하게, 개인의 가족 또는 친구 구성원이 인플루엔자 감염으로 진단을 받은 경우에 개인은 질병 발생 위험이 높은 것으로 간주한다.
액상 약형은 경우 투여형을 형성하는데, 예를 들면, 약학적으로 수용가능한 에멸젼, 마이크로에멸젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘륵시르등이 포함되나 이에 국한시키지는 않는다. 활성 성분에 추가하여, 액체 약형에는 당분야에 통상으로 이용되는 비활성 희석제를 포함할 수 있는데, 예를 들면, 물 또는 다른 용매, 용해물질, 유화제 예를 들면, 에틸 알오콜, 이소프로필 알코올, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 디메틸포름아미드, 오일(특히, 목화시, 땅콩, 옥수수, 배, 올리브, 캐스터, 참깨 오일), 글리세롤, 테트라하이드로퓨르퓨릴 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 소르비탄 지방산 에스테르 및 이의 혼합물이 된다. 비활성 희석제 이외에도, 경구 조성물에는 습윤제, 유화제, 현탁제, 감미제, 방향제 및 풍미제와 같은 어쥬번트가 포함될 수 있다.
직장 또는 질 투여용 조성물에는 좌약 또는 체류 관장제가 될 수 있는데, 이는 적절한 비-자극 부형제 또는 캐리어 예를 들면, 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜 또는 실온에서는 고체이나 체온에서는 액체가 되어 직장 또는 질에서 용해되어 활성 단백질을 방출하는 좌약 왁스 등의 부형제 또는 캐리어를 본 발명의 조성물과 혼합하여 만들 수 있다.
본 발명의 백신 조성물의 국소, 점막 또는 경피 투여용 약형에는 연고, 고약, 크림, 로션, 겔, 분말, 용액, 스프레이, 흡입제 또는 패치 등이 포함된다. 활성 물질 또는 이의 조제물을 멸균 조건하에서 약학적으로 수용가능한 캐리어와 혼합하고, 임의 필요한 보존제 또는 완충액도 필요에 따라 혼합할 수 있다. 점막 또는 경피 투여의 경우에 장벽을 침투하기에 적절한 침투제를 조성물에 이용한다. 이와 같은 침투제는
당분야에 공지되어 있고, 경점막 투여의 경우에, 계면활성제, 담즙염, 푸시딘산 유도체 등이 포함된다. 경점막 투여는 비강 스프레이 또는 좌약을 이용하여 실시할 수 있다. 경피 투여의 경우에, 항원 또는 이의 면역원 부분을 연고, 살브스(salves), 겔 또는 크림이 된다. 안구 조성물, 귀점안제 및 안약등으로 조제하는 것도 본 발명의 범주에 속한다. 추라고 본 발명은 경피 패취를 이용하는 것도 고려하는데, 이는 신체로 백신 단백질의 조절된 운반을 제공하는데 추가적인 장점을 가진다. 이와 같은 약형은 적절한 매체에 백신 산물을 현탁 또는 분산시켜 만들 수 있다. 흡수 강화물질을 이용하여 피부를 통과하는 백신 단백질의 흐름을 증가시킬 수 있다. 속도 조절 막을 제공하거나 폴리머 매트릭스 또는 겔에 백신 단백질을 분산시켜 속도를 조절할 수 있다.
본 발명의 조성물은 원하는 결과를 얻는데 필수적인 양 및 시간으로 투여할 수 있다. 본 발명의 특정 구체예에서, 약학 조성물의 "치료요법적 효과량"은 개체에서 질병을 치료, 경감 또는 예방하는데 효과적인 양을 말한다. 따라서, 여기에서 언급하는 "질병의 치료, 경감 또는 예방에 효과적인 양"은 임의 개체에서 질병을 치료, 경감 또는 예방하기 위해 약학 조성물의 독성을 일으키지 않는 범위의 충분한 양이 된다. 예를 들면, "치료요법적 효과량"은 감염 치료(예를 들면 바이러스 감염, 인플루엔자 감염) 등의 치료, 경감 또는 예방을 하기 위한 양이 된다.
요구되는 정확한 양은 개체의 종, 나이, 일반적인 상태, 질병의 단계, 특정 약학 혼합물, 투여 방식 등에 따라 개체마다 다양하다. 항원을 발현시키는 식물 및 이의 준비물을 포함하는 본 발명의 인플루엔자 항원은 투여의 용이성 및 약형의 단일성을 위해 단위 투약형으로 조제될 수 있다. 여기에서 언급하는 발현 "투약 단위형"은 치료될 환자에 적절한 백신 조성물 단위를 말한다. 그러나, 본 발명의 조성물의 전체 매일 용도는 일반적으로 의학적 판단 범위내에서 의사가 결정한다. 임의 특정 환자 또는 유기체에 특별히 치료요법적으로 효과적인 약량 수준은 감염의 심각성 또는 위험도; 이용되는 특정 화합물의 활성; 환자의 나이, 체중, 전반적인 건강, 성별, 환자의 식이요법, 약리역학적 상태, 투여 시간, 투여 경로 및 이용되는 특정 항원 방출 속도; 치료 기간; 이용되는 백신 조성물에 복합되는 또는 동시 투여되는 약물 및 의학 분야에 공지된 요인을 포함하는 다양한 요인에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 복합 요법에 이용될 수 있는데(예를 들면 복합 백신 요법), 즉 약학 조성물을 하나 또는 그이상의 다른 원하는 약학 및 백신 과정과 동시에, 이전에, 또는 연차적으로 이용할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 복합 섭생에 이용되는 특정 복합 치료(가령, 인플루엔자 감염의 백신 치료법)는 일반적으로 얻고자 하는 치료효과 및 원하는 치료요법 또는 과정의 공존성을 고려한다. 이용되는 치료법 및/또는 백신은 동일한 질환에 대해 원하는 효과를 얻거나(예를 들면 항원을 다른 인플루엔자 백신과 동시에 투여할 수 있고) 이들은 상이한 효과를 가질 수 있다는 것을 인지할 것이다.
특정 구체예에서, 백신 조성물은 최소 두 가지 인플루엔자 항원을 포함한다. 예를 들면, 특정 백신 조성물은 본 발명의 최소 두 가지 인플루엔자 항원으로 구성된다(본 발명의 항원을 포함하는 HA 도메인 및 NA 도메인). 일부 측면에서, 이와 같은 복합 백신에는 인플루엔자 항원을 포함하는 한 가지 열안정성 융합 단백질을 포함할 수 있고, 일부 다른 측면에서 인플루엔자 항원을 포함하는 두 가지 또는 그이상의 열안정성 융합 단백질이 제공될 수 있다.
복합 백신을 이용하는 경우에, 인플루엔자 항원의 임의 복합을 이용할 수 있다. 조성물에는 여기에서 제공되는 다중 항원을 포함하는 다중 인플루엔자 항원을 포함할 수도 있다. 또한 조성물에는 여기에서 제공하는 한가지 또는 그이상의 항원과 한가지 또는 그 이상의 추가 항원을 포함할 수도 있다. 인플루엔자 항원 복합물에는 한가지 이상의 감염 타입에 대항하여 면역 반응을 부여하기 위해 한가지 또는 그이상의 다양한 서브 타입 또는 균주에서 유도된 인플루엔자 항원을 포함한다. 인플루엔자 항원 복합물에는 상이한 서브타입 또는 균주에서 유도된 최소 한 개, 최소 두 개, 최소 세 개, 최소 네 개 또는 그이상의 항원을 포함할 수 있다. 일부 복합의 경우에, 상이한 서브타입으로부터 최소 두 개 또는 최소 세 개 항원이 하나의 백신 조성물에 복합된다. 또한, 복합 백신은 인플루엔자 항원 및 하나 또는 그이상의 독특한 감염성 물질을 이용할 수 있다.
키트
한 측면에서 본 발명은 본 발명에 따른 인플루엔자 항원을 포함하는 약학 팩 또는 키트를 제공한다. 특정 구체예에서, 약학 팩 또는 키트에는 본 발명에 따른 인플루엔자 항원을 생산하는 생 출아묘, 클론 물질 또는 조제물, 추출물 또는 본 발명의 약학 조성물의 하나 또는 그 이상의 추가 성분들을 선택적으로 포함하는 하나 또는 그 이상의 용기에 백신을 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서, 약학 팩 또는 키트에는 약학 조성물의 하나 또는 그 이상의 추가 성분들을 선택적으로 포함하는 하나 또는 그 이상의 용기에 본 발명에 따른 정제된 인플루엔자 항원을 포함한다. 특정 구체예에서, 약학 팩 또는 키트에는 복합 요법으로 사용하기 위한 추가의 승인된 치료제(가령, 인플루엔자 항원, 인플루엔자 백신)을 포함한다.
이와 같은 용기에는 약학 산물의 조제, 이용 또는 판매에 관한 정부 기관의 주의 경고형태의 안내문이 부착될 수 있으며, 이는 인체 투여를 위한 조제, 이용 및 시판을 기관이 승인한다는 의미도 반영된다.
키트에는 치료시약을 포함한다. 비-제한적인 예로, 인플루엔자 백신은 경구 투여형으로 치료를 위해 제공될 수 있다. 대안으로 또는 추가적으로 인플루엔자 백신은 투여용 주사용 조제물로 제공될 수 있다. 일부 구체예에서, 인플루엔자 백신은 투여용 흡입가능한 조제물로 제공될 수 있다. 따라서 약학적인 투여량 또는 지시는 인플루엔자 감염으로 고통을 받는 또는 감염 위험에 처한 개체에 투여하기 위해 키트에 제공될 수 있다.
다음의 대표적인 실시예는 본 발명을 설명하기 위함이며, 본 발명의 범주를 이에 국한시키고자 함은 아니다. 또한, 본 발명의 다양한 변형 및 여기에 제공된 것에 추가하여 다양한 실시예들은 내용으로부터 발생될 수 있다는 것을 당업자가 충분히 인지할 수 있을 것이다. 다음의 실시예는 다양한 구체예 및 이의 등가의 형태로 본 발명을 실행할 수 있도록 정보, 예시, 가이드 등이 포함된다.
도 1 헤마글루티닌 (HA) 단백질 및 단백질 도메인의 도시도. 상부 좌측에 있는 I52 및 3은 여기에서 설명하는 도메인 1, 2, 3에 상응한다. 도메인 1, 2, 및 2, 1은 함께 폴드되어 스템 도메인(SD)을 만든다. 도메인 3은 구체(globular) 도메인(GD)이다. 아이템 1-6에 제시된 범위는 HA의 아미노산 위치에 상응한다.
도 2. pET32 플라스미드의 지도. 상부 좌측은 표적 항원을 클로닝하는데 이용되는 변형 플라스미드에 부족한 T7 프로모터 및 T7 터미네이트 사이의 부분을 나타낸다.
도 3. 변형된 pET32a 벡터내로 삽입된 pET-PR-LicKM-KDEL 및 pET-PR-LicKM-VAC 구조체의 도시.
도 4. pBI121 벡터 조직의 도시.
도 5. GUS 유전자 절단 및 TMV-유도된 플라스미드 추가후에 pBI 벡터로부터 pBID4 플라스미드 유도를 위한 도시.
도 6. 벡터내로 삽입된 표적 서열 유무하에 리체나제(richenase) 서열에서 HA, HA의 도메인 및 NA의 융합 도시.
도 7A, B. LicKM 및 융합 단백질을 발현시키는 식물 추출물의 리체나제 검사.
(7A)는 니코티아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)에서 리체나제의 일과성 발현.
(7B)는 식물에서 리체나제 HA 융합 단백질의 자이모그램(Zymogram)(화살표).
도 8. 항-HA 및 항-LiB 항체를 이용하여 Lic-HA 융합 단백질을 발현시키는 식물 추출물의 웨스턴 분석.
도 9. Lic-NA 융합 단백질을 발현시키는 식물 추출물의 리체나제 검사.
도 10. Lic-HA 융합 단백질을 발현시키는 식물 추출물의 웨스턴 분석.
도 11. HA 리체나제 융합 단백질을 발현시킨 식물에서 적혈구 세포 헤마토글 루티닌 검사.
도 12. 어쥬번트 유무하에 테스트용 H5N1 인플루엔자 백신으로 면역화시킨 생쥐에서 항체 반응.
도 13. 어쥬번트 유무하에 테스트용 H5N1 인플루엔자 백신으로 면역화시킨 생쥐로부터 수득한 혈청 희석물에 의한 헤마토글루티닌 활성 저해.
도 14A-D. H3N2 인플루엔자 테스트 백신 및 대조군 처리 집단에서 H3N2 바이러스 도전에 대한 증후. (14A)는 임상적인 증후 전반에 대한 평균 최대 결과. (14B) 바이러스 도전후에 비강 세척물에서 세포 카운트의 평균 최대 결과. (14C) 동물에서 체중 감소의 평균 최대 결과. (14D) 동물의 체온 변화의 평균 최대 결과.
도 15. H3N2 인플루엔자 테스트 백신 및 대조군 처리군에서 H3N2 바이러스 도전후에 바이러스 쉐딩(shedding); Group 1은 네가티브 대조군의 결과를 나타낸다; Group 2는 테스트 물질 1 (CMB Fl)으로 처리된 동물에서의 결과를 나타낸다; Group 3 은 테스트 물질 2 (CMB F2)로 처리된 동물에서의 결과를 나타낸다; Group 4는 테스트 물질 3 (CMB F3)로 처리된 동물에서의 결과를 나타낸다; 그리고 Group D는 포지티브 대조군 처리된 동물에서의 결과를 나타낸다. N은 각 Group에서의 평가된 동물의 수를 말한다(그룹당 8마리).
도 16. 식물에서 생산된 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스 항원의 특징. (16A) 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스의 정제된 HA에 대해 생성된 양 혈청을 이용한 LicKM-(SD) 및 LicKM-(GD)의 ELISA 분석. 상동성 바이러스 (AJ W/3/03) 및 식물에서 생산된 NA를 각각 포지티브 및 네가티브 대조군으로 이용한다. (16B) LicKM (anti-LicKM)에 대해 생성된 토끼 혈청 및 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스 (anti- HA)의 정제된 HA에 대해 생성된 양 혈청을 이용하여 LicKM-HA(SD)의 이뮤노블랏 분석(lane 4) 및 LicKM-HA(GD)의 이뮤노블랏 분석 (lane 3). LicKM (lane 2) 및 상동성 바이러스 (lane 1)를 대조군으로 이용한다. (16C) NIBRG-18 재조합 바이러스에 대해 생성된 양 혈청(anti-H7N2) 및 NIBRG-17 재조합 바이러스에 대해 생성된 양 혈청 (anti-H7Nl)을 이용한 NA의 ELISA 분석. NIBRG-18 (anti-H7N2)에 대한 양 혈청을 이용하여 평가된 상동성 바이러스 (A/W/3/03)를 포지티브 대조군으로 이용한다. (16D) NIBRG-18 (anti- H7N2) 또는 NIBRG- 17 (anti-H7Nl)에 대하여 생성된 양 혈청으로 선 배양후에 뉴라미니다제 활성의 균주 특이적인 저해. 세가지 반복체로부터 평균 효소 활성을 표준 편차로 나타내었다.
도 17. VCl+ 어쥬번트, VC2 (어쥬번트 없이) 또는 VC2 + 어쥬번트로 면역화시킨 흰 족제비로부터 헤마토글루티닌 저해 역가. 혈청 샘플은 제1투여전에(Pre-imm), 제1투여후 14일에(Dl), 제2투여후 14일에(D2), 제3투여후 10일에(D3), 그리고 도전후 4일(Post-Ch)에 수득하였다. 표준 편차와 기하학적 평균 역가를 나타내었다.
도 18. VCl+ 어쥬번트, VC2 (어쥬번트 없이) 또는 VC2 + 어쥬번트로 면역화시킨 흰 족제비의 도전후 모니터링이다. 표준 편차와 평균치를 나타내었고, 멀티플 테스트용으로 Bonferroni 보정한 ANOVA를 이용하여 데이터의 통계학적 분석을 실시하였다. 통계학적 유의성은 p < 0.05으로 정의함. (18A) 감염후 바이러스 발산(shed) 피크. (18B) 감염후 체중 최대 체중 감소. (18C) 감염후 체온 상승 피크. (18D) 감염후 증후 수치 피크 (18E) 감염후 비강 세척 샘플의 ml당 전체 백혈구세포 카운트 피크.
실시예 1. 백신 후보물질 구조체 생성
인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌으로부터 항원 서열 생성
인플루엔자 바이러스 타입 Vietnam H5N1 및 Wyoming H3N2의 HA 스템(stem) 도메인 (SD) 1-2 및 HA 구형(globular) 도메인 (GD)3을 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 합성하고, 이것이 정확하다는 것을 확인하였다. 생산된 핵산을 도메인을 인코드하는 서열의 양단부상에 조작하기 위한 부위인 제한효소 BglII/HindIII로 절단한다.
생성된 DNA 단편은 조작된 열안정성 캐리어 분자를 인코드하는 서열에 in frame으로 융합시킨다.
HA Vietnam TH5N 11
(SD 도메인 1-2): HA1_2V: (SEQ TD NO.: 19):
AGATCTGATCAAATCTGCATTGGATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATAC
AATTATGGAGAAGAACGTGACTGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACA
ACGGAAAGTTGGGAGGAGGAAACACTAAGTGCCAGACTCCAATGGGAGCTATTAACTC
TTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTATTGGAGAGTGCCCAAAGTACGTGA
AGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGACTTAGGAATTCTCCACAAAGAGAGAGGAGA
AGGAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGGGAGGATGGCAAG
GAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCACTCTAATGAGCAGGGATCTGGATATGCT
GCTGATAAGGAGTCTACTCAGAAGGCTATTGATGGAGTGACTAACAAGGTGAACTCTAT
TATTGATAAGATGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGGGAGTTCAACAATCTTGAGA
GGAGGATTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGAGGATGGATTCCTTGATGTGTGGACTTA
CAACGCTGAGCTTCTTGTGCTTATGGAGAACGAGAGGACTCTTGATTTCCACGATTCTA
ACGTGAAGAACCTTTACGACAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGATAACGCTAAGGAGCT
TGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAATGAGTGCATGGAGTCTGTTA
GGAACGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAGGAAGCTAGACTTAAGAGGGAGGA
GATTTCTGGAGTGAAGTTGGAGTCTATTGGTATCTACCAGATTAAGCTT
(SD 도메인 1-2): HA1_2V: (SEQ ID NO.: 20):
DQICIGYHANNSTEQVDTIMEKNVTVTHAQDILEKTHNGKLNTKCQTPMGAINSSMPFHNIH
PLTIGECPKYVKSINRLVLATGLRNSPQRERRRKKJLGLFGAIAGFIEGGWQGMVDGWYGYH
HSNEQGSGYAADKESTQKA1DGVTNKVNSIIDKMNTQFEAVGREFNNLERRIENLNKKMED
GFLDVWTYNAELLVLMENERTLDFHDSNVKNLYDKVRLQLRDNAKELGNGCFEFYHKCD
NECMESVRNGTYDYPQYSEEARLKREEISGVKLESIGIYQI
(GD 도메인 3): HA3V: (SEQ ID NO.: 21):
AGATCTTGCGATCTTGATGGAGTGAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGA
TGGCTTCTTGGAAACCCAATGTGCGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATATT
GTGGAGAAGGCTAACCCAGTGAACGATCTTTGTTACCCAGGAGATTTCAACGATTACGA
GGAGCTTAAGCACCTTCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTCCAA
AGTCATCTTGGTCATCTCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCTTGCCCATACCAGG
GAAAGTCATCTTTCTTCAGGAACGTTGTGTGGCTTATTAAGAAGAACTCTACTTACCCA
ACTATTAAGAGGTCTTACAACAACACTAACCAGGAGGATCTTCTTGTGCTTTGGGGAAT
TCACCATCCAAATGATGCTGCTGAGCAGACTAAGTTGTACCAGAACCCAACTACTTACA
TTTCTGTGGGAACTTCTACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTA
AGGTGAACGGACAATCTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGAT
GCTATTAACTTCGAGTCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGATTGT
GAAGAAGGGAGATTCTACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAAGCTT
(GD 도메인 3): HA V3: (SEQ ID NO.: 8):
CDLDGVKPLILRDCSVAGWLLGNPMCDEFINVPEWSYIVEKANPVNDLCYPGDFNDYEELK
HLLSRINHFEKIQIIPKSSWSSHEASLGVSSACPYQGKSSFFRNVVWLIKKNSTYPTIKRSYNN
TNQEDLLVLWGIHHPNDAAEQTKLYQNPTTYISVGTSTLNQRLVPRIATRSKVNGQSGRME
FFWTILKPNDAINFESNGNFIAPEYAYKIVKKGDSTIMKSELEYGNC
(전장): HASJV: (SEQ BD NO.: 22):
GGATCCATTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTTCCTTCTTGTG
TCTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTGATCAAATCTGCATTG
GATACCACGCTAACAACTCTACTGAGCAAGTGGATACAATTATGGAGAAGAACGTGAC
TGTTACTCACGCTCAGGATATTCTTGAAAAGACTCACAACGGAAAGTTGTGCGATCTTG
ATGGAGTGAAGCCACTTATTCTTAGGGATTGCTCTGTTGCTGGATGGCTTCTTGGAAACC
CAATGTGCGATGAGTTCATTAACGTGCCAGAGTGGTCTTATATTGTGGAGAAGGCTAAC
CCAGTTAATGATCTTTGCTACCCAGGAGATTTCAACGATTACGAGGAGCTTAAGCACCT
TCTTTCTAGGATTAACCACTTCGAGAAGATTCAGATTATTCCAAAGTCATCTTGGTCATC
TCACGAGGCTTCTCTTGGAGTTTCTTCTGCTTGCCCATACCAGGGAAAGTCATCTTTCTT
CAGGAACGTTGTGTGGCTTATTAAGAAGAACTCTACTTACCCAACTATTAAGAGGTCTT
ACAACAACACTAACCAGGAGGATCTTCTTGTGCTTTGGGGAATTCACCATCCAAATGAT
GCTGCTGAGCAGACTAAGTTGTACCAGAACCCAACTACTTACATTTCTGTGGGAACTTC
TACTCTTAACCAGAGGCTTGTGCCAAGAATTGCTACTAGGTCTAAGGTGAACGGACAAT
CTGGAAGGATGGAGTTCTTCTGGACTATTCTTAAGCCAAACGATGCTATTAACTTCGAG
TCTAACGGAAACTTCATTGCTCCAGAGTACGCTTACAAGATTGTGAAGAAGGGAGATTC
TACTATTATGAAGTCTGAGCTTGAGTACGGAAACTGCAACACTAAGTGCCAAACTCCAA
TGGGAGCTATTAACTCTTCTATGCCATTCCACAACATTCACCCACTTACTATTGGAGAGT
GCCCAAAGTACGTGAAGTCTAACAGGCTTGTGCTTGCTACTGGACTTAGGAATTCTCCA
CAAAGAGAGAGGAGAAGGAAGAAGAGGGGACTTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTG
AGGGAGGATGGCAAGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATACCATCACTCTAATGAGCA
GGGATCTGGATATGCTGCTGATAAGGAGTCTACTCAGAAGGCTATTGATGGAGTGACTA
ACAAGGTGAACTCTATTATTGATAAGATGAACACTCAGTTCGAAGCTGTTGGAAGGGAG
TTCAACAATCTTGAGAGGAGGATTGAGAACCTTAACAAGAAAATGGAGGATGGATTCC
TTGATGTGTGGACTTACAACGCTGAGCTTCTTGTGTTGATGGAGAACGAGAGGACTCTT
GATTTCCACGATTCTAACGTGAAGAACCTTTACGACAAAGTGAGGCTTCAGCTTAGGGA
TAACGCTAAGGAGCTTGGAAACGGTTGCTTCGAGTTCTACCACAAGTGCGATAATGAGT
GCATGGAGTCTGTTAGGAACGGAACTTACGATTACCCACAGTACTCTGAGGAAGCTAGA
CTTAAGAGGGAGGAGATTTCTGGAGTGAAGTTGGAGTCTATTGGTATCTACCAGATTCA
CCATCACCATCACCACAAGGATGAGCTTTGATGACTCGAGCTC
HA A/Wvoming (Η3N2)
(SD 도메인 1-2): HA1_2W: (SEQ ID NO.: 23):
AGATCTCAAAAGTTGCCAGGAAACGATAACTCTACTGCTACTCTTTGCCTTGGACATCA
CGCTGTTCCAAACGGAACTATTGTGAAAACTATTACTAACGATCAGATTGAGGTGACAA
ACGCTACTGAGCTTGTTCAGTCATCTTCTACTGGAGGAATTGGAGGAGGAAACTCTGAG
TGCATTACACCTAATGGATCTATTCCAAACGATAAGCCATTCCAGAACGTGAACAGGAT
TACTTATGGAGCTTGCCCAAGATACGTGAAGCAGAACACTCTTAAGTTGGCTACTGGAA
TGAGGAATGTGCCAGAGAAGCAGACTAGGGGAATTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATT
GAGAATGGATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATTCAGGCATCAGAATTCTG
AGGGAACTGGACAAGCTGCTGATCTTAAGTCTACTCAGGCTGCTATTAACCAGATTAAC
GGAAAGTTGAACAGGCTTATTGGAAAGACTAACGAGAAGTTCCACCAGATTGAGAAGG
AGTTCTCTGAGGTTGAGGGAAGGATTCAGGATCTTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAA
GATTGATCTTTGGTCTTACAACGCTGAGCTTCTTGTTGCTCTTGAGAACCAGCACACTAT
TGATCTTACTGATTCTGAGATGAACAAGTTGTTCGAGAGGACTAAGAAGCAGCTTAGGG
AGAACGCTGAGGATATGGGAAATGGATGCTTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGC
TTGCATTGAGTCTATTAGGAACGGAACTTACGATCACGATGTGTACCGTGATGAGGCTC
TTAACAACAGGTTCCAGATTAAGGGAGTGGAGCTTAAGTCTGGATACAAGGATTGGATT
CTTAAGCTT
(SD 도메인 1-2): HA1_2: (SEQ ID NO.: 24):
QKLPGNDNSTATLCLGHHA VPNGTIVKTITNDQIEVTNATELVQSSSTGGINSECITPNGSIPN
DKPFQNVNRITYGACPRYVKQNTLKLATGMRNVPEKQTRGIFGAIAGFIENGWEGMVDGWY
GFRHQNSEGTGQAADLKSTQAAINQINGKLNRLIGKTNEKFHQIEKEFSEVEGRIQDLEKYV
EDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLFERTKKQLRENAEDMGNGCFKIYHKC
DNACIESIRNGTYDHDVYRDEALNNRFQIKGVELKSGYKDWIL
(GD 도메인 3): HA3W: (SEQ ID NO.: 25):
AGATCTTGCGATTCTCCACACCAGATTCTTGATGGAGAGAACTGCACTCTTATTGATGCT
CTTCTTGGAGATCCACAGTGCGATGGATTCCAGAACAAGAAGTGGGATCTTTTCGTGGA
AAGGTCTAAGGCTTACTCTAACTGCTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCTCTTAG
GAGTCTTGTGGCTTCTTCTGGAACTCTTGAGTTCAACAACGAGTCTTTCAACTGGGCTGG
AGTTACTCAGAACGGAACTTCTTCTGCTTGTAAGAGGAGGTCTAACAAGTCTTTCTTCTC
TAGGCTTAACTGGCTTACTCACCTTAAGTACAAGTACCCAGCTCTTAACGTGACTATGCC
AAACAACGAGAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCACCACCCAGTTACTGATT
CTGATCAGATTTCTCTTTACGCTCAGGCTTCTGGAAGGATTACTGTGTCTACTAAGAGGT
CTCAGCAGACTGTGATTCCAAACATTGGATACCGTCCAAGAGTGAGGGATATTTCTTCT
AGGATTTCTATCTACTGGACTATTGTGAAGCCAGGAGATATTCTTCTTATTAACTCTACT
GGAAACCTTATTGCTCCAAGGGGATACTTCAAGATTAGGAGTGGAAAGTCATCTATTAT
GAGGAGTGATGCTCCAATTGGAAAGTGCAAGCTT
(GD도메인 3): HA3W: (SEQ ID NO.: 12):
CDSPHQILDGENCTLIDALLGDPQCDGFQNKKWDLFVERSKAYSNCYPYDVPDYASLRSLVA
SSGTLEFNNESFNWAGVTQNGTSSACKRRSNKSFFSRLNWLTHLKYKYPALNVTMPNNEK
FDKLYIWGVHHPVTDSDQISLYAQASGRITVSTKRSQQTVIPNIGYRPRVRDISSRISIYWTIV
KPGDILLINSTGNLIAPRGYFKIRSGKSSIMRSDAPIGKC
(전장): HASW: (SEQ ID NO.: 26):
GGATCCATTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTTCCTTCTTGTG
TCTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTCAAAAGTTGCCAGGAA
ACGATAACTCTACTGCTACTCTTTGCCTTGGACATCACGCTGTTCCAAACGGAACTATTG
TGAAAACTATTACTAACGATCAGATTGAGGTGACAAACGCTACTGAGCTTGTTCAGTCA
TCTTCTACTGGAGGAATTTGCGATTCTCCACACCAGATTCTTGATGGAGAGAACTGCAC
TCTTATTGATGCTCTTCTTGGAGATCCACAGTGCGATGGATTCCAGAACAAGAAGTGGG
ATCTTTTCGTGGAAAGGTCTAAGGCTTACTCTAACTGCTACCCATACGATGTTCCAGATT
ACGCTTCTCTTAGGAGTCTTGTGGCTTCTTCTGGAACTCTTGAGTTCAACAACGAGTCTT
TCAACTGGGCTGGAGTTACTCAGAACGGAACTTCTTCTGCTTGTAAGAGGAGGTCTAAC
AAGTCTTTCTTCTCTAGGCTTAACTGGCTTACTCACCTTAAGTACAAGTACCCAGCTCTT
AACGTGACTATGCCAAACAACGAGAAGTTCGATAAGTTGTACATTTGGGGAGTTCACCA
CCCAGTTACTGATTCTGATCAGATTTCTCTTTACGCTCAGGCTTCTGGAAGGATTACTGT
GTCTACTAAGAGGTCTCAGCAGACTGTGATTCCAAACATTGGATACCGTCCAAGAGTGA
GGGATATTTCTTCTAGGATTTCTATCTACTGGACTATTGTGAAGCCAGGAGATATTCTTC
TTATTAACTCTACTGGAAACCTTATTGCTCCAAGGGGATACTTCAAGATTAGGAGTGGA
AAGTCATCTATTATGAGGAGTGATGCTCCAATTGGAAAGTGCAACTCTGAGTGCATTAC
TCCAAACGGATCTATTCCAAACGATAAGCCATTCCAGAACGTGAACAGGATTACTTATG
GAGCTTGCCCAAGATACGTGAAGCAGAACACTCTTAAGTTGGCTACTGGAATGAGGAA
TGTGCCAGAGAAGCAGACTAGGGGAATTTTCGGAGCTATTGCTGGATTCATTGAGAATG
GATGGGAGGGAATGGTTGATGGATGGTACGGATTCAGGCACCAGAATTCAGAGGGAAC
TGGACAAGCTGCTGATCTTAAGTCTACTCAGGCTGCTATTAACCAGATTAACGGAAAGT
TGAACAGGCTTATTGGAAAGACTAACGAGAAGTTCCACCAGATTGAGAAGGAGTTCTCT
GAGGTTGAGGGAAGGATTCAGGATCTTGAGAAGTACGTGGAGGATACAAAGATTGATC
TTTGGTCTTACAACGCTGAGCTTCTTGTTGCTCTTGAGAACCAGCACACTATTGATTTGA
CTGATTCTGAGATGAACAAGTTGTTCGAGAGGACTAAGAAGCAGCTTAGGGAGAACGC
TGAGGATATGGGAAATGGATGCTTCAAAATCTACCACAAGTGCGATAACGCTTGCATTG
AGTCTATTAGGAACGGAACTTACGATCACGATGTGTACCGTGATGAGGCTCTTAACAAC
AGGTTCCAGATTAAGGGAGTGGAGCTTAAGTCTGGATACAAGGATTGGATTCTTCATCA
TCACCACCACCACAAGGATGAGCTTTGATGACTCGAGCTC
인플루엔자 바이러스 뉴라미니다제로부터 항원 서열의 생성
인플루엔자 바이러스 type Vietnam H5N1 (NAV) 및 Wyoming H3N2(NAW)의 각 인플루엔자 바이러스 타입의 뉴라미니다제를 인코드하는 뉴클레오티드 서열을 합성하고 이것들이 정확하다는 것을 확인하였다. 생산된 핵산은 도메인을 인코드하는 서열의 양단 상에 조직된 부위가 되는 제한효소 SalI으로 절단하였다. 생성된 DNA 단편들은 조작된 열안정성 캐리어 분자를 인코드하는 서열에 C 말단에 in frame 융합되었다.
NAV(Nl): (SEQ ID NO.: 27):
GGATCCTTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTTCCTTCTTGTGT
CTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTCAAAATGTCGACCTTAT
GCTTCAGATTGGAAACATGATTTCTATTTGGGTGTCACACTCTATTCACACTGGAAACCA
GCATCAGTCTGAGCCAATTTCTAACACTAACCTTTTGACTGAGAAGGCTGTGGCTTCTGT
TAAGTTGGCTGGAAACTCTTCTCTTTGCCCTATTAACGGATGGGCTGTGTACTCTAAGGA
TAACTCTATTAGGATTGGATCTAAGGGAGATGTGTTCGTGATTAGGGAGCCATTCATTT
CTTGCTCTCACCTTGAGTGCCGTACTTTCTTCCTTACTCAGGGTGCTCTTCTTAACGATAA
GCACTCTAACGGAACTGTGAAGGATAGGTCTCCACACAGGACTCTTATGTCTTGTCCAG
TTGGAGAAGCTCCATCTCCATACAACTCTAGATTCGAGTCTGTTGCTTGGAGTGCTTCTG
CTTGCCATGATGGAACTTCATGGCTTACTATTGGAATTTCTGGACCAGATAACGGAGCT
GTTGCTGTGCTTAAGTACAACGGAATTATTACTGATACCATCAAGTCTTGGAGGAACAA
CATTCTTAGGACTCAGGAGTCTGAGTGTGCTTGCGTTAACGGATCTTGCTTCACTGTGAT
GACTGATGGACCATCTAATGGACAGGCTTCTCACAAGATTTTCAAGATGGAGAAGGGA
AAGGTTGTGAAGTCTGTGGAACTTGATGCTCCAAACTACCATTACGAGGAGTGTTCTTG
CTATCCAGATGCTGGAGAGATTACTTGTGTGTGCCGTGATAATTGGCATGGATCTAACA
GGCCATGGGTGTCATTCAATCAGAACCTTGAGTACCAGATTGGTTACATTTGCTCTGGA
GTGTTCGGAGATAATCCAAGGCCAAACGATGGAACTGGATCTTGTGGACCAGTGTCATC
TAATGGAGCTGGAGGAGTGAAGGGATTCTCTTTCAAGTACGGAAACGGAGTTTGGATTG
GAAGGACTAAGTCTACTAACTCTAGGAGTGGATTCGAGATGATTTGGGACCCAAACGG
ATGGACTGAGACTGATTCTTCTTTCTCTGTGAAGCAGGATATTGTGGCTATTACTGATTG
GAGTGGATACTCTGGATCTTTCGTTCAGCACCCAGAGCTTACTGGACTTGATTGCATTAG
GCCATGCTTCTGGGTTGAACTTATTAGGGGAAGGCCAAAGGAGTCTACTATTTGGACTT
CTGGATCTTCTATTTCTTTCTGCGGAGTGAATTCTGATACTGTGGGATGGTCTTGGCCAG
ATGGAGCTGAGCTTCCATTCACTATTGATAAGGTCGACCATCATCATCATCACCACAAG
GATGAGCTTTGACTCGAG
NAV: (SEQ ID NO.: 16):
LMLQIGNMISIWVSHSIHTGNQHQSEPISNTNLLTEKAVASVKLAGNSSLCPINGWAVYSKD
NSIRIGSKGDVFVIREPFISCSHLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTVKDRSPHRTLMSCPVGEA
PSPYNSRFESVAWSASACHDGTSWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQES
ECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASHKIFKMEKGKVVKSVELDAPNYHYEECSCYPDAGEIT
CVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGVFGDNPRPNDGTGSCGPVSSNGAGGVKGF
SFKYGNGVWIGRTKSTNSRSGFEMIWDPNGWTETDSSFSVKQDIVAITDWSGYSGSFVQHP
ELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKESTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK
NAW(N2): (SEQ ID NO.: 28):
GGATCCTTAATTAAAATGGGATTCGTGCTTTTCTCTCAGCTTCCTTCTTTCCTTCTTGTGT
CTACTCTTCTTCTTTTCCTTGTGATTTCTCACTCTTGCCGTGCTCAAAATGTCGACAAGCA
GTACGAGTTCAACTCTCCACCAAACAACCAGGTTATGCTTTGCGAGCCAACTATTATTG
AGAGGAACATTACTGAGATTGTGTACCTTACTAACACTACTATTGAGAAGGAGATTTGC
CCAAAGTTGGCTGAGTACCGTAATTGGTCTAAGCCACAGTGCAACATTACTGGATTCGC
TCCATTCTCTAAGGATAACTCAATTAGGCTTTCTGCTGGAGGAGATATTTGGGTTACAA
GGGAGCCATACGTTTCTTGCGATCCAGATAAGTGCTACCAGTTCGCTCTTGGACAAGGA
ACTACTCTTAACAACGTGCACTCTAACGATACTGTGCACGATAGGACTCCATACCGTAC
TCTTTTGATGAACGAGCTTGGAGTTCCATTCCACCTTGGAACTAAGCAAGTGTGCATTGC
TTGGTCATCTTCATCTTGCCACGATGGAAAGGCTTGGCTTCATGTTTGCGTGACTGGAGA
TGATGAGAACGCTACTGCTTCTTTCATCTACAACGGAAGGCTTGTGGATTCTATTGTTTC
TTGGTCTAAGAAGATTCTTAGGACTCAGGAGTCTGAGTGTGTGTGCATTAACGGAACTT
GCACTGTGGTTATGACTGATGGATCTGCTTCTGGAAAGGCTGATACAAAGATTCTTTTC
ATTGAGGAGGGAAAGATTGTGCACACTTCTACTCTTTCTGGATCTGCTCAGCATGTTGA
GGAGTGTTCTTGCTACCCAAGGTATCCAGGAGTTAGATGTGTGTGCCGTGATAACTGGA
AGGGATCTAACAGGCCAATTGTGGATATTAACATTAAGGATTACTCTATTGTGTCATCTT
ATGTGTGCTCTGGACTTGTTGGAGATACTCCAAGGAAGAACGATTCTTCTTCATCTTCAC
ACTGCCTTGATCCAAATAACGAGGAGGGAGGACATGGAGTTAAGGGATGGGCTTTCGA
TGATGGAAACGATGTTTGGATGGGAAGGACTATTTCTGAGAAGTTGAGGAGCGGATAC
GAGACTTTCAAAGTGATTGAGGGATGGTCTAACCCAAATTCTAAGCTGCAGATTAACAG
GCAAGTGATTGTGGATAGGGGAAACAGGAGTGGATACTCTGGAATTTTCTCTGTGGAGG
GAAAGTCTTGCATTAACAGATGCTTCTACGTGGAGCTTATTAGGGGAAGGAAGCAGGA
GACTGAGGTTTTGTGGACTTCTAACTCTATTGTGGTGTTCTGCGGAACTTCTGGAACTTA
CGGAACTGGATCTTGGCCAGATGGAGCTGATATTAACCTTATGCCAATTGTCGACCATC
ATCACCATCACCACAAGGATGAGCTTTGACTCGAG
NAW: (SEQ ID NO.: 18):
KQYEFNSPPNNQVMLCEPTIIERNITEIVYLTNTTIEKEICPKLAEYRNWSKPQCNITGFAPFS
KDNSIRLSAGGDIWVTREPYVSCDPDKCYQFALGQGTTLNNVHSNDTVHDRTPYRTLLMN
ELGVPFHLGTKQVCIAWSSSSCHDGKAWLHVCVTGDDENATASFIYNGRLVDSIVSWSKKI
LRTQESECVCINGTCTWMTDGSASGKADTKILFIEEGKIVHTSTLSGSAQHVEECSCYPRYP
GVRCVCRDNWKGSNRPIVDINIKDYSIVSSYVCSGLVGDTPRKNDSSSSSHCLDPNNEEGGH
GVKGWAFDDGNDVWMGRTISEKLRSGYETFKVIEGWSNPNSKLQINRQVIVDRGNRSGYS
GIFSVEGKSCINRCFYVELIRGRKQETEVLWTSNSIVVFCGTSGTYGTGSWPDGADINLMPl
열안정성 캐리어 구조체 생성
전장의 고유 C. thermocellum 리체나제, LicB는 리더 펩티드 펩티드 (Lp)5 N-말단 부분(A), 표면 루프(l), C-말단 부분(C), Pro-Thr 박스 및 셀룰로좀-결합 도메인 (C-BD)으로 구성된다. 우리는 LicB 인코딩 유전자로부터 Lp, Pro-Thr 박스 및 C-BD을 제거하고 분자를 고리모양으로 순서를 교환하여, N- 과 C- 말단을 바꾸고(Musiychuk et ai, 2007, influenza and Other Respiratory viruses, 1 :1), N- 및 C-말단에 뿐만 아니라 표면 루프(l)내에 표적 서열을 클로닝하기 위한 독특한 제한효소 부위를 삽입하였다. 생성된 조작된 캐리어 분자 서열을 확인하고, 이를 LicKM으로 명명하였다.
SEQ ID NO.: 29:
GGATCCTTAATTAAAATGGGAGGTTCTTATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTA
AGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAGTTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGA
ATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGACCATCTGATAACAACCCATGGGATGAGATT
GATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACTAAGGTTCAATTCAACTGGTATAAGAATGG
TGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCTTGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATAC
TTATGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATATTGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTA
TAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTCCTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAG
GAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGATATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAG
TATGAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGGTAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATAC
TCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGATTCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGC
TAACGGTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAGCCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACGGAAA
GATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTCGACCATCATCATCATCATCATTGA CTCGA
GCTC
SEQ ID NO.:30:
MGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAAKNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGK
DTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQDFHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNI
PVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQAEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFS
NFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSNGKMILTLDREYVDHHHHHH
특정 구조체의 경우, LicKM의 N- 및 C- 말단에 PRla 시그날 펩티드 및 KDEL 서열을 만들었다. 이들 구조체의 핵산 및 아미노산 서열은 SEQ ID NO.: 31 및 SEQ ID NO.: 32에 나타내었다.
SEQ ID NO.: 31 :
GGATCCTTAATTAAAATGGGATTTGTTCTCTTTTCACAATTGCCTTCATTTCTTCTTGTCT
CTACACTTCTCTTATTCCTAGTAATATCCCACTCTTGCCGTGCCCAAAATGGAGGTTCTT
ATCCATATAAGTCTGGTGAGTATAGAACTAAGTCTTTCTTTGGATATGGTTATTATGAAG
TTAGGATGAAGGCTGCAAAGAACGTTGGAATTGTTTCTTCTTTCTTTACTTATACTGGAC
CATCTGATAACAACCCATGGGATGAGATTGATATTGAGTTTCTTGGAAAGGATACTACT
AAGGTTCAATTCAACTGGTATAAGAATGGTGTTGGTGGAAACGAGTATCTTCATAACCT
TGGATTTGATGCTTCTCAAGATTTTCATACTTATGGTTTTGAGTGGAGACCAGATTATAT
TGATTTTTATGTTGATGGAAAGAAGGTTTATAGAGGTACTAGAAACATTCCAGTTACTC
CTGGAAAGATTATGATGAATCTTTGGCCAGGAATTGGTGTTGATGAATGGCTTGGTAGA
TATGATGGAAGAACTCCACTTCAAGCTGAGTATGAGTATGTTAAGTATTATCCAAACGG
TAGATCTGAATTCAAGCTTGTTGTTAATACTCCATTTGTTGCTGTTTTCTCTAACTTTGAT
TCTTCTCAATGGGAAAAGGCTGATTGGGCTAACGGTTCTGTTTTTAACTGTGTTTGGAAG
CCATCTCAAGTTACTTTTTCTAACGGAAAGATGATTCTTACTTTGGATAGAGAGTATGTC
GACCATCATCATCATCATCATAAGGATGAACTTTGACTCGAGCTC
SEQ ID NO.: 32:
MGFVLFSQLPSFLLVSTLLLFLVISHSCRAQNGGSYPYKSGEYRTKSFFGYGYYEVRMKAA
KNVGIVSSFFTYTGPSDNNPWDEIDIEFLGKDTTKVQFNWYKNGVGGNEYLHNLGFDASQD
FHTYGFEWRPDYIDFYVDGKKVYRGTRNIPVTPGKIMMNLWPGIGVDEWLGRYDGRTPLQ
AEYEYVKYYPNGRSEFKLVVNTPFVAVFSNFDSSQWEKADWANGSVFNCVWKPSQVTFSN
GKMILTLDREYVDHHHHHHKDEL
재조합 항원 구조체의 생성
pBR322 플라스미드로부터 유도된 pET 발현 벡터를 이용하는데 이는 높은 수준의 전사 및 해독을 촉진시키는 T7 박테리오파아지 유전자 10의 특징을 가지도록 조작한 것이다. RNA 폴리메라제를 인코드하는 박테리오파아지는 T7 프로모터 서열에 매우 특이성을 가지며 이는 T7 파아지 게놈이외의 게놈에서는 거의 볼 수 없다(도 2). pET-32를 이용하여 이 벡터에 클론된 변형된 리체나제 서열의 루프 부분으로 HA 및 NA 구조체를 융합시킨다. 리체나제 유전자의 촉매 도메인, 상류 서열 PR-IA ("병인균-관련 단백질 1 A"), 엔도플라스믹 레티큘럼(KDEL) 또는 액포 보유 서열(vacuolar retaining sequence)(VAC), 하류 His6 태그를 변형된 pET-32 벡터의 PacI 및 XhoI 부위(T7 프로모터 및 T7 종료물질이 잘려나간 위치)로 클론하였다. 이와 같은 방식으로, pET-PR-LicKM-KDEL 및 pET-PR-LicKM-VAC을 수득하였다(도 3).
HA 도메인 또는 NA의 DNA 단편을 LicKM의 루프(l) 부분에 서브클론시켜 해동을 위한 정확한 리딩 프레임내에 융합한다. LicKM-NA 융합체가 작제된다. NAW 또는 NAV의 DNA 단편은 해독을 위한 정확한 frame에 융합체를 제공하기 위해 SalI 부위를 이용하여 LicKM의 C-말단으로 서브클론시킨다.
실시예 2. 백신 후보물질 항원 벡터의 생성
표적 항원 구조체 LicKM-HA(SD), LicKM-HA(GD), 또는 LicKM-NA는 개별적으로 선택된 바이러스성 벡터 (pBI-D4)에 서브클론시켰다. pBl-D4는 pBl121-유도된 이 중(binary) 벡터인데 이 벡터는 대장균(Escherichia coli) β-D-글루쿠로니다제(GUS)를 코딩하는 리포터 유전자가 폴리링커("polylinker")로 대체되었는데, 여기에 XbaI과 SacI 부위사이에 TMV-유도된 벡터가 클론되었다(도 4). pBI-D4는 TMV -기초한 구조체로, 발현되는 외부 유전자(가령, LicKM-HA(SD), LicKM-HA(GD), LicKM-NA와 같은 표적 항원)를 TMV의 피복 단백질 (CP) 유전자로 대체한다. 바이러스는 TMV 126/183kDa 유전자, 이동 단백질 (MP) 유전자, CP 오픈 리딩 프레임(ORF)로 뻗어있는 CP 서브게놈 mRNA 프로모터(sgp)를 보유한다. CP의 개시 코돈을 변형켰다. 바이러스는 CP가 결핍되어 체관부(phloem)를 통하여 숙주 식물로 이동할 수 없다. 그러나, 바이러스 감염의 세포가 이동은 기능을 유지하며, 바이러스는 이와 같은 방법으로 상측 잎으로 서서히 이동할 수 있다. 다중 클로닝 부위(Pacl-Pmel-Agel-Xhol)를 외부 유전자 발현을 위해 sgp의 말단에 만들고, 그 다음에 이어서 TMV 3' 비-해독 부위(NTR)가 이어진다. 35S 프로모터를 바이러스 서열의 5'말단에서 융합한다. 벡터 서열은 pBI121의 BamHI과 SacI 부위에 위치한다. 바이러스 서열의 3'에는 망치머리 리보자임이 위치한다(Chen et al, 2003, MoI. Breed., 11 :287). 이와 같은 구조체에는 LicKM-HA-SD, LicKM-HA(GD), 또는 NA를 인코드하는 서열과 시그날 펩티드 from 담배 PR-la 단백질, a 6x His tag, ER-체류 고정 서열 KDEL의 시그날 펩티드를 인코드하는 서열 또는 공포(vacuolar) 서열 융합된 서열을 포함한다(도 5). PR-LicKM-HA(SD)-KDEL, PR-LicKM-HA(GD)-KDEL, PR-LicKM-NA-KDEL를 인코드하는 구조체를 위해, 코딩 DNA를 PacI-XhoI 단편으로 pBI-D4안으로 도입시킨다. 또한, HAW (HA Wyoming), HAV (HA Vietnam), NAW (NA Wyoming), NAV (NA Vietnam)를 PacI-XhoI 단편으로써 pBI-D4안으로 도입시킨다. 뉴클레오티드 서열이 최종 발현 구조체의 서브클로닝 졍션으로 연결되어 있다는 것을 확인하였다(도 6).
실시예 3: 식물 생성 및 항원 생산
식물에 아그로박테리움의 침투
아그로박테리움 침투에 의해 아그로박테리움(Agrobacterium)-매개된 일과성 발현 시스템을 얻었다(Turpen et aL, 1993, J. Virol. Methods, 42:227). N. benthamiana의 건강한 잎에 LicKM-HA 또는 LicKM-NA를 발현시키도록 조작된 바이러스 벡터를 포함하는 A. rhizogenes 또는 A. tumefaciens(GV3101)를 침투시켰다.
A. rhizogenes 균주 A4 (ATCC 43057)를 구조체 pBI-D4- PR-LicKM-HA(SD)-KDEL, PR-LicKM-HA(GD)-KJDEL, pBI-D4-PR-LicKM-NA-KDEL를 이용하여 형질변환시켰다. 아그로박테리움 배양물을 Kapila et al.(1997, Plant Sci., 122:101)에서 설명하는 것에 따라 생장시키고 유도시켰다. 2㎖ 스타터-배양물(새로운 콜로니로부터 취함)을 YEB (5g/ℓ 소고기 추출물, 1g/ℓ 이스트 추출물, 5g/ℓ 펩톤, 5g/ℓ 슈크로즈, 2mM MgSO4, 25㎍/㎖ 카나마이신)에서 280℃ 하룻밤동안 생장시켰다. 스타터 배양물은 1:500으로 500㎖ YEB+ 25㎍/㎖ 카나마이신, 10mM 2-4(-몰포리노)에탄설폰산(MES) pH 5.6, 2mM 추가 MgSO4, 20μM 아세토시리곤에 희석하여 넣는다. 희석된 배양물을 280℃에서 O.D.600 값이 ~1.7이 되도록 하룻밤동안 생장시켰다. 세포는 15 분간 3,000 x g에서 원심분리시키고, (MS염, 10 mM MES pH 5.6, 20 g/ℓ 슈크로즈, 200μM 아세토시리곤)에 재현탁시켜, O.D.600 값이 ~2.4가 되도록 한 후에 실혼에서 1-3시간 동안 유지시키고, 이를 아그로박테리움 침투에 이용하였다. N. benthamiana 잎들에 바늘없는 일회용 주사기를 이용하여 아그로박테리움 현탁액을 주사하였다. 침투된 잎들은 침투후 4-7일(예를 들면 6일)에 수확한다.
식물은 리체나제 활성 검사 및 면역블랏 분석 평가를 통하여 표적 항원 발현이 되었는지를 스크리닝하였다(도 7, 8, 9, 10). 효소도(Zymogram) 분석에서 테스트된 니코디아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 침투 잎에 HA 및 NA 키메라 단백질이 모두 발현된 것으로 나타났다. 발현은 리체나제 활성과 연관된다(도 7 및 9). 융합 단백질과 연관된 활성 밴드에서 리체나제 대조군보다 조금 더 무거운 밴드와 아그로박테리움 감염 후에 식물에서 발현되는 산물과 동일한 무게를 가지는 밴드가 나타났는데, 이는 전체 융합 산물의 존재를 확인시켜주는 것이다.
클론 뿌리 및 클론 뿌리 라인 생성
니코디아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 외식편 1㎝X1㎝를 0.1% NH4Cl에 살균 및 dH2O에 6회 세척후에 얻었다. 외식편에 abacsial 측면에 나이프를 이용하여 약간의 상처를 낸 후, 아그로박테리움 리조겐(Agrobacterium rhizogenes), 균주 A4,-pBlD4-Lic-HA-KDEL 또는 pBID4-Lic-NA-KDEL을 포함하고 있음-와 공동 배양시켰다.외식편을 2'동안 아그로박테리움 하룻밤 배양물(O.D.600nm?? 0.8-1)으로 배양하고, 3000 rpm, 4℃에서 원심분리시키고, MMA 배지로 재현탁시켜, 20mM 아세토시리곤 존재하에 최종 O.D.600nm이 ~0.5가 되도록 한다. 배양 종료시에, 외식물은 멸균 종이 상에서 건조시키고, 1% 글루코즈 및 20mM 아세토시리곤 존재하에 0.8% 한천 MS 플레이트로 이동시켰다. 플레이트를 파라필름으로 마감하고, 실온에서 2일간 유지시켰다. 외식편을 500㎎/ℓ 세포탁심(Cif), 100mg/ℓ 티멘틴(Timentin)(Tim), 25mg/ℓ 카나마이신 존재하에 MS 플레이트로 옮겼다. 약 5주후에, 유전자 전이 뿌리가 pBID4-Lic-HA-KDEL 및 pBID4-Lic-NA-KDEL 구조체를 포함하는 아그로박테리움 리조겐(Agrobacterium rhizogenes)으로 형질변환된 니코디아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 잎 외식편으로부터 생성된다.
형질변환후에, 모근을 잘라내고, 고형의 호르몬없는 K3 배지에 일렬로 둔다. 4 내지 6일 후에, 가장 활발하게 생장된 뿌리를 분리해내고, 액상 K3 배지로 옮긴다. 선택된 뿌리는 24℃ 암상태에서 회전 쉐이크 상에서 배양시키고, 클론 라인은 분리하여 주단위로 서브배양시킨다. 뿌리 및/클론 라인을 리체나제 활성 검사 및 면역 블랏 분석을 통하여 표적 항원 발현이 있었는지에 대해 스크리닝할 수 있다.
실시예 4: 백신 후보물질의 생산
100mg 니코디아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 침투된 잎 샘플을 감염후 4, 5, 6, 7일에 회수하였다. 단백질 발현에 대해 수확 후 바로 새로운 조직을 분석하였고, 연속하여 정제되지 않은 식물 추출물 준비 또는 융합 단백질 정제를 위해 -80℃에서 수집하였다.
새로운 샘플을 냉각 PBS 1x + 프로테아제 저해물질(Roche) 1/3 w/v 용적비(1㎖/ 0.3 g 조직)에 재현탁시키고, 페스텔(pestel)로 빻는다. 균질물은 SDS 겔 로딩 완충액으로 5분간 가열하고, 12,000rpm, 4℃에서 5분간 웜심분리하여 맑게 한다. 상청액을 새로운 튜브에 옮기고, 20㎕, 1㎕ 또는 이들의 희석액을 12% SDS-PAGE상에서 분리하고, 항-His6-HA 생쥐 또는 토끼 항-리체나제 다클론 항체를 이용하여 웨스턴 분석을 통하여 분석하거나 또는 효소도 분석에 의해 기능을 가진 리체나제 활성을 나타내는 효소 활성을 평가한다. 효소도는 효소 활성을 측정하여 전기영동(electrophoretic) 방법이다. 이 방법은 배양 기간 동안에 용해된 효소에 의해 분해되는 기질로 충만된 도데실 설페이트 나트륨 겔에 기초한다. 겔의 착색으로 어두운 적색 배경에 효소 활성은 흰색 밴드로 나타난다. 특정 범위 내에, 밴드 강도는 적하된 효소 양과 1차원적인 관계에 있을 것이다.
플라스미드 pBID4-LicKM-HA(SD)-KDEL 또는 pBID4-LicKM-HA(GD)-KDELHA를 포함하는 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens) 또는 아그로박테리움 리조겐(rhizogenes)으로 침투된 니코디아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 식물에서 발현은 융합 단백질에서 HA 단백질의 전기영동성 이동이 이론상 MW에 상응하는 경우에 키메라 단백질 LicKM-HA(SD)-KDEL 또는 LicKM-HA(GD)-KDEL의 분자량에 특정 결합이 상응하게 된다. (리체나제 효소 MW는 약 28kD이다).
정제안된 추출물에서 발현되는 키메라 단백질 Lic-HA-KDEL 및 Lic-NA-KDEL의 정량화는 수작업으로 침투된 조직 및 진공-침투된 조직상에 면역 블랏팅으로 할 수 있다.
항원의 정제
pBID4-LicKM-HA(SD)-KDEL, pBID4-LicKM-HA(GD)-KDEL, pBID4-full-length-NA-KDEL 구조체를 포함하는 재조합 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens)로 침투된 식물의 잎은 균질화과정을 통하여 빻는다. "EDTA-없는" 프로테아제 저해물질(Roche)을 포함하는 추출 완충액과 X-100 1%를 3용적비 w/v로 이용하여 30분간 4℃에서 흔든다. 추출물은 10분간 4℃에서 9000 x g에서 원심분리시켰다. 상청액을 연속하여 miracloth로 여과시키고, 20.000 x g에서 30분간 원심분리시키고, 0.45-μm 필터를 통하여 여과시킨 후에 크로마토그래피를 이용하여 정제시킨다.
생성된 추출물은 암모니움 설페이트 침전을 이용하여 절단한다. 간단하게 설명하면, (NH4)2SO4를 추출물에 첨가하여 20% 포화되도록 하고, 얼음위에서 1시간 동안 두고, 15분간 18,000 x g에서 회전시킨다. 펠렛은 버리고, (NH4)2SO4를 첨가하여 60% 포화되도록 하고, 얼음위에서 1시간 동안 두고, 15분간 18,000 x g에서 회전시킨다. 상청액을 버리고, 생성된 펠렛은 완충액에 재현탁시키고, 얼음위에서 20분간 유지시키고, 30분간 18,000 x g에서 원심분리시키고, 상청액은 10000 용적의 세척 완충액에 대해 하룻밤동안 투석시켰다:
중력하에 실온에서 IMAC ("Immobilized Metal Affinity Chromatography," GE Healthcare)를 이용하여, His-tagged LicKM-HA(SD)-KDEL, LicKM-HA(GD)-KDEL, 전장 -NA-KDEL 키메라 단백질을 정제하였다. 정제는 변성 조건하에서 실시하였다. 단백질을 0.5㎖ 분획물로 회수하고, 단일화시키고, PBS 1X에 대해 하룻밤동안 4℃에서 투석된 20mM EDTA5를 첨가하고, SDS-PAGE로 분석하였다.
대안으로, 분획물을 첨가된 20mM EDTA와 함께 수거하고, 하룻밤동안 4℃에서 NaH2PO4 10 mM에 대해 투석시키고, 음이온 교환 크로마토그래피를 통하여 정제시킨다. LicKM-HA(SD)-KDEL, LicKM-HA(GD)-KDEL, 전장-NA-KDEL 정제의 경우, 음이온 교환 컬럼 Q Sepharose Fast Flow(Amersham Pharmacia Biosciences)를 이용한다. LicKM-HA(SD)-KDEL, LicKM-HA(GD)-KDEL, 전장-NA-KDEL 친화력 또는 이온-교환 정제된 키메라 단백질은 12% 폴리아크릴아미드 겔상에서 분리하고, 코마시 블루 착색시켰다. 분리된 단백질은 다클론 항-리체나제 항체와 연속하여 항-토끼 IgG 양고추냉이 과산화효소-컨쥬게이트된 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 위해, PDVF 막으로 전기영동에 의해 이동시킨다.
투석후에 수집된 분획물은 pAb α-리체나제 및 pAb α-His6.을 이용한 이뮤노블랏을 이용하여 분석하였다. His-tag는 발현된 키메라 단백질에 의해 유지되었고, 정제된 단백질의 최종 농도는 소프트웨어를 이용하여 평가하였다.
헤마토글루티닌화 반응 검사
두 가지 상이한 원료로부터 적혈구세포(RBC)의 세종을 이용하여 식물에서 만들어진 인플루엔자 벡산에 헤마토글루티닌 활성을 설명한다. 검사된 백신 재료를 인플루엔자 A/Wyoming/03/03 (H3N2 바이러스) 또는 인플루엔자 A/Vietnam/ 1194/2004(H5N1 바이러스)의 "도메인 3" (구형 도메인)으로 명명한다.
닭, 칠면조 및 말에서 얻은 RBC는 개별적으로 인산염 완충염(PBS)로 3회 세척하고, PBS로 0.5% v/v로 조정한다. 밑둥근 96 웰 미량적정 플레이트에 Falcon 플레이트가 포지티브와 네가티브 결과사이에 분명한 설명을 제공한다는 것을 보장하는 품질 보증용으로 PBS만으로 테스트하였다. 백신 재료는 중복으로 0.5mg/㎖로 시작하여, 재료 25㎕를 25㎕ PBS에 단계적으로 피펫팅하여 플레이트를 최고 2배까지 희석하였다. RBC/플레이트 한 종의 0.5% 현탁액 25㎕를 플레이트의 모든 웰에 분배하였다. 플레이트를 흔들어서 RBC를 분포시키고 4℃에서 4시간 동안 배양한 후 네가티브 결과로부터 포지티브를 결정한다.
인플루엔자 A/Vietnam/I 194/2004 (H5N 1 바이러스)의 도메인 3은 일관되고 반복적으로 조류 RBC에는 포지티브한 결과를 제공하지만 말 RBC에서는 아니다. 희석종말점(endpoint dilution)은 중복재료(replicates)에서 모두 8로 일치하며, 반복 실험으로 H5 도메인 3은 62.5㎍ 농도에서 조류 RBCs를 헤마토글루티네이트 시킬 수 있다(도 11).
실시예 5: 면역원성 연구
초기 면역원성 연구
초기 면역원 연구를 실시하여 식물에서 생산된 LicKM-항원 융합체가 복막을 통하여 면역주사를 맞은 생쥐에서 특정 혈청 IgG를 유도할 수 있는지, 그리고 유도된 항체가 in vitro에서 인플루엔자 바이러스를 중화시킬 수 있는지를 확ㅇ니한다. 이 견구는 LicKM, LicKM-HA(SD), LicKM-HA(SD)를 이용하고 아그로박테리움으로부터 인리치한 재조합 NA를 상기에서 설명하는 것과 같이 75% 순도로 니코디아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana)의 잎에 침투시켰다.
8주령의 암컷 BALB/c 생쥐를 재조합 LicKM-HA(SD), LicKMHA(GD) 100㎍/투여량 및 재조합 NA 50㎍/투여량으로 면역주사하였다. 이뮤노겐의 면역주사는 1일에 복막으로 주사후, 제1 부스터는 14일 후에, 제2 부스터는 10일 후에 실시한다. 첫 투여량에는 1:1 용적 비율의 컴플리트 Freund's 어쥬번트가 포함되고, 제2투여량에는 임의 어쥬번트가 포함되지 않는다. 네가티브 대조군은 재조합 LicKM 투여량 250㎍을 제공받는다. 각 군에는 세 마리 생쥐가 있다. 제1 투여전 1일에 프레-이뮨 혈청을 수집하고, 혈청은 제2부스터 후 28일에 연속하여 수거한다. 인플루엔자 특이적 IgG 항체 역가는 ELISA 검사를 이용하여 결정한다(도 12).
인플루엔자 백신에 대해 발생된 면역 혈청에 의한 바이러스의 헤마토글루티닌 활성 저해.
상기에서 설명한 것과 같이 생쥐로부터 프레이뮨(Preimmune) 혈청 및 제2부스트 후 혈청을 비활성화된 인플루엔자 바이러스의 헤마토글루티닌 활성 저해에 대한 항체 역가 능력을 평가하였다. 비활성화된 인플루엔자 A/Vietnam/I 194/2004 바이러스(H5N1 바이러스)의 4 HA 단위를 프레이뮨 혈청과 백신의 제2부스터후에 수득한 혈청 25㎕ 희석액과 복합하였다. 실시예 4에서 설명하는 것과 같이 조류 RBC에서 헤마토글루티닌 활성 저해를 평가하였다. 생성된 항체 역가는 바이러스의 헤마토글루티닌 저해에 효과가 있었다. 예시적인 결과는 도 13에 나타내었고 표 1에 정리하였는데, 생성된 항체는 바이러스의 헤마토글루티닌 활성에 대해 보호할 수 있다는 것을 설명한다.
실험적인 인플루엔자 백신에 대해 생성된 면역 혈청에 의한 헤마토글루티닌 저해
백신화 그룹 헤마토글루티닌 저해 역가(혈청 희석 -1)
PBS 대조군 <10
프레이뮨 혈청 160
백신 w/o 어쥬번트 2560
백신+어쥬번트 2560
실시예 6: 인플루엔자 백신화반응의 모델 시스템
A. 근육내 백신주사
인플루엔자 감염 연구를 위해 확립된 동물 모델인 흰 족제비를 이용하여 인플루엔자 백신의 효과를 측정하였다(가령 Boyd et al, 1975; Chen et al., 1995; Scheiblauer et al., 1995; Sweet et al, 1980, Microbiol. Rev., 44:303; Maassab et al, 1982, J. Infect. Dis., 146:780; Toms et al, 1977; Webster et al, 1994; Fenton et.al, 1981 ; and Webster et al, 1994). 흰족제비 동물 모델을 이용한 유전(Transmission) 연구에서 인플루엔자 바이러스의 수용체 전파 뿐만 아니라 바이러스의 비루런스에 돌연변이의 효과를 설명한다(Herlocher et al., 2001 ; and Herlocher et al., 2002). 여기에서 설명하는 연구에 사용된 이형성 프라임-백신-도전으로 비활성화된 어쥬번트연결된 인플루엔자 백신으로 성공적으로 테스트하였다.
테스트 물질 생산
우리는 흰족재비에서 식물에서 생산된 항원의 면역원성 및 보호 효과를 평가하였다. 테스트 물질은 식물에서 생산된 정제된 표적 항원으로 구성된다. 인플루엔자 type A (A/Wyoming/3/03 [H3N2])의 균주의 HA 도메인은 열안정성 캐리어 분자와 융합되도록 만들어 상기에서 설명하는 식물계 발현 시스템에서 만들어진다. 동일한 균주에서 구한 NA는 상기에서 설명하는 식물계 발현 시스템에서 만들어진다. 테스트 물질에는 임의 핵산, 독성 물질 또는 감염성 물질을 포함하지 않는다.
특히, HA의 아미노산 17 내지 67 + 아미노산 294 내지 532(스템 도메인을 함께 구성)를 인코드하는 뉴클레오티드 서열(Wilson et al, 1981, Nature 289:366)을 LicKM (GenBank accession number DQ776900)에 삽입하여 LicKM-HA(SD)을 얻는다. HA의 아미노산 68 내지 293(구형 도메인을 구성)을 인코드하는 뉴클레오티드도 유사하여 삽입하여 LicKM-HA(GD)을 얻는다. 니코티나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 병인성 관련 단백질 PR1a의 시그날 펩티드를 인코드하는 서열(Pfitzner et al., 1987, Nucleic Acids Res. , 15 :4449)을 융합체가 N-말단에 포함되어 있다. 폴리-히스티딘 친화력 정제 tag(6XHis) 및 엔도플라스믹 레티큘럼 유지 시그날(KDEL)을 인코드하는 서열은 C-말단에 포함된다. LicKM 융합체를 하이브리드 벡터 pBID4 (Wilson et al, supra)에 도입시켜, 바이러스 게놈이 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터로부터 전사되고, 바이러스 복제 및 담배 모자이크 바이러스 (TMV) 피복 단백질 서브 게놈 mRNA로부터 표적 서열이 발현되도록 하는데(Shivprasad et al, 1999, Virology, 255:312), 이 하이브리드 벡터는 잎에서 표적의 일과성 발현을 위해 아그로박테리움 바이너리 플라스미드 pBI121(Chen et al, 2003, MoI, Breed., 11 :287)로부터 유도된다. 또한, 동일한 인플루엔자 균주의 NA의 아미노산 38 내지 469를 인코드하는 서열을 LicKM에 사전 융합없이 pBID4로 도입시킨다. 상기에서와 같이, PRIa의 시그날 펩티드는 N-말단에 포함되며, 6xHis + KDEL는 C-말단에 포함된다.
인플루엔자 항원을 포함하는 조작된 벡터는 전기천공에 의해 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens) 균주 GV3101로 도입된다. 재조합 아그로박테리움 튜머페션스(Agrobacterium tumefaciens) 현탁액을 씨를 뿌린 후 약 6주되는 잎에 접종하여 니코디아나 벤타미아나(Nicotiana benthamiana) 식물에 도입시켜 표적 서열을 잎 조직으로 도입시킨다. 식물은 약 21℃에서 12시간 낮밤 주기 조건하에 화분에서 생장시켰다. 잎들을 발현 구조체에 따라 접종후 4일 내지 7일에 수확한다. 단백질 추출물은 완충액(50mM 인산나트륨염, pH 7.0; 100mM 염화나트륨; 10mM 디에틸디티오카르바메이트; 10mM β-멀캅토에탄올)에서 잎을 빻아서 준비한다 재조합 항원은 황화암모니움 침전 및 고정된 금속 친화력 크로마토그래피(6xHis tag이용) 및 음이온 교환 크로마토그래피, 각 단계후에는 투석하여 최소 순도를 80%로 하는 과정에 의해 준비한다.
기준 항혈청으로 식물에서 생산된 항원의 반응을 ELISA 분석으로 평가하고(도 16A), 면역 블랏팅에 의해 변성 조건하에서 평가하였다(도 16B). ELISA의 경우에, 96 웰 플레이트를 LicKM-HA(SD), LicKM-HA(GD), 또는 식물에서 정제된 NA로 또는 비활서오하된 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스로 피복한다. 피복된 플레이트를 정제된 A/Wyoming/3/03 바이러스에 대해 생성된 양 항혈청, NEBRG-18 (H7N2) 재조합된 바이러스에 대해 생성된 양 항혈청 또는 NIBRG-17 (H7N1) 재조합된 바이러스에 대해 생성된 양 항혈청과 배양시켰다. 면역블랏 분석을 위해, 100ng LicKM-HA(SD), 100ng LicKM-HA(GD), 100ng HA에 상응하는 양의 비활성화된 인플루엔자 A/Wyoming/3/03를 SDS-PAGE를 이용하여 분리하고, 폴리비닐리덴 플로라이드 막으로 옮기고, LicKM 또는 A/Wyoming/3/03 바이러스의 정제된 HA에 대해 생성된 양 항혈청으로 배양시켰다. NA 활성은 표준 WHO 프로토콜 WHO/CDS/CSR/NCS 2002.5.Rev.l에 따라 검사하였다. NA 활성 저해는 뉴라미니다제 검사 실행전에 상동성 (NIBRG-18 [H7N2J) 또는 이형성(NIBRG-17 [H7N1]) 재조합 바이러스에 대해 생성된 양 항혈청과 식물에서 생산된 NA를 사전-배양하여 평가하였다.
ELISA 및 면역블랏 검사에서, LicKM에 대해 생성된 다클론 토끼 혈청이 비슷하게 각 융합체를 인지하기는 하지만, LicKM-HA(SD)는 LicKM-HA(GD) 보다 기준 혈청에 의해 더 강하게 인지되었다(도 16B). 또한, 식물에서 생산된 NA는 재조합 H7N2 바이러스에 대해 생성된 다클론 양 혈청에 의해 인지되었고(도 16C), 이는 균주 특이적인 방법으로 기준 혈청에 의해 저해되는 효소 활성을 보여준다. (도 16C).
백신 접종
흰족제비 연구는 UK동물법, 1986에서 요구되는 UK Home Office 라이센스하에 실행되었다(Scientific Procedures). 고밀도 흰족제비 LabDiet 5Ll 5 (IPS Product Supplies, London, UK)에서 유지된 수컷 긴털족제비 또는 알비노 흰족제비(High gate Farm, Highgate, England), 4.5월령, 441 내지 629 g의 체중(연구개시일 당시)를 표 2에서 나타낸 것과 같이 처리군으로 나누었다.
처리군
처리군 투여 경로 각군에 동물수 투여량 용적 처리
1 SC 8 - 300㎕ 네가티브 기준, 테스트 물질 1
2 SC 8 100㎍ 300㎕ VC1 + 어쥬번트, 테스트 물질 2
3 SC 8 100㎍ 300㎕ VC2,어쥬번트없음,테스트 물질3
4 SC 8 100㎍ 300㎕ VC2+어쥬번트
5 SC 8 TCID50 기록 300㎕ 포지티브 기준
* TCID50 ("조직 배양 감염 약량") = 실험 웰의 절단에 활성, 생장하는 바이러스를 포함하는 바이러스 희석 수준
8마리 흰족제비 세그룹에 후보 백신 조제물(식물에서 생산되는 인플루엔자 항원 복합물을 포함; VC1+어쥬번트, VC2, VC2+어쥬번트)로 프라이밍 및 부스트 2회(0, 14, 28일)에 피하 면역주사하였다(표 1). VCl 동물은 100㎍ LicKM-HA(SD) 및 100㎍ LicKM-GD + 1.3mg alum을 투여받았다. VC2 동물은 100㎍ LicKM-(SD), 100㎍ LicKM-(GD), 50㎍ NA, 1.3mg alum ("+어쥬번트") 또는 alum 없음 ("어쥬번트 없음")을 투여받았다. 100㎍ LicKM-(SD) 및 100㎍ LicKM-(GD)은 HA 100㎍에 상응하도록 함께 제공된다. 네가티브 대조군 동물은 alum 어쥬번트 만을 제공받고, 포지티브 대조군 동물은 단일 비강 투여량의 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스 (0일에 ㎖당 105.5 TCID50 농도에서 0.5㎖)를 제공받았다. 면역주사후에, 병소, 자극, 운동성, 홍반, 일반적 활성에 대해 동물을 매일 주시한다.
동물의 비강으로 바이러스 도전을 받게 되는데, 최종 투여후 10일 ㎖당 105.5 TCID50 농도에서 마취하에 0.5㎖ 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스로 도전을 받게된다. 혈액 샘플은 백신주사일, 도전(challenge)일, 도전후 4일째에 수거하였고, 비강 세척액은 도전후 4일째 수거하였다. 혈청 HI 역가를 상동성 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스 및 이형성 인플루엔자 A/Sydney/5/97 (H3N2), A/California/7/04 (H3N2), A/New Caledonia/20/99 (HlNl) 바이러스에 대해 결정하였다.
표 3에 나타낸 과정에 따라 인플루엔자 백신접종, 과정, 바이러스 도전을 실행하였다. 식물에서 만들어진 백신 후보물질을 제공받은 동물에서 부작용이 나타나지는 않았다. 동물에 개별 확인 및 체온 감시를 위해 트랜스폰더를 삽입하였다. 투약은 연구 과정에 나타낸 시간대에 세 번의 별도 과정으로 실시하였다(표 3). 미리 준비된 테스트 물질을 각 투약에 분배하였다. 테스트 물질은 투여직전에 어쥬번트와 혼합하였다.
연구 과정
연구일 -38 -24 -10 0 1 2 3 4
트랜스폰더 삽입 X
백신 주사 X X X
도전 X
마취 X X X X X X X X
체중 X X X X X X X X
매일 체온 X X X X X X X X
건강 수치 X X X X X X X X
비강 세척액 X X X X
항체 혈청 X X X X X
죽임 X
분석
임상적 징후(건강 수치), 체중 및 체온 변화를 기록하였다. 매일, 감염후에 각 동물에서 병소, 자극, 운동성, 홍반 및 일반적인 활동에 대해 검사를 하고, 건강 지수를 결정하기 위해 기록하였다. 각 동물은 다음과 같이 기록한다: 재채기 또는 코가 꾸륵거름(1점); 외부 콧코구멍으로부터 화농 방출(1점); 자발적인 활성 또는 움직임 감소(1점); 자발적인 활동 없음 또는 민첩함 감소(2점). "자발적 활동 또는 움직임 감소" 및 "자발적 활동 없음 또는 민첩함 감소"는 상호 배타적인 수치이다. 감염후 체중의 최대 감소를 각 동물마다 기록한다. 감염후 최대 최온 증가도 각 동물마다 기록한다. 임의 날에 각 동물에서 최대 건강 지수, 체중 감소 및 체온 변화의 평균 및 표준 편차를 처리군으로 계산하고, ANOVA으로 비교한다. 각 동물에서 매일 종합 건강, 체중 감소, 체온 변화로 구성된 AUC-유사 측정을 계산한다: 처리군 평균, 중간 및 표준 편차를 계산하고, ANOVA 또는 Kruskal-Wallis 테스트와 비교한다. 살아있는 바이러스로 도전후, 각 처리군은 임상 징후, 체온 및 체중 변화로 나타나는 도전으로부터 회복을 설명한다. 테스트 백신을 제공받은 동물 집단은 보호되며, 상동성 인플루엔자 바이러스로 도전을 받은 후에 질병의 징후는 없거나 거의 없는 것으로 나타났다. 테스트 백신 후보물질 모두 동물에 완전한 보호를 제공한다(도 14).
바이러스 도전후에 비강 세척액을 수거하였다. 각 비강 세척액 용적으로 측정하고, 비강 세척액 중량을 모니터하였다. 도전후 비강 세척액에서 트립판 블루(총 세포 카운트를 결정하는데 이용됨)을 이용하여 백혈구 세포를 카운트하여 염증 세포 반응을 측정하였다. 비강 세척액에 감염후 세포 카운터를 각 샘플링 날에 log 변환된 데이터의 평균, 중간 및 표준 편차를 통하여 종합한다; 처리군은 ANOVA 또는 Kruskal-Wallis 테스트로 비교하였다. 상기에서 설명된 임상 징후에 유사하게, 테스트 처리 백신을 제공받은 처리 군에서 비강 세척액의 모니터링으로 감염에 대해 포지티브 대조군에 동등한 또는 그 이상의 보호를 받는다는 것을 설명한다(도 14).
비강 세척 샘플상에 Madin-Darby canine kidney (MDCK) 세포 적정을 이용하여 바이러스 발산(shedding)을 결정하였다. MDCK 세포 적정 검사의 종결점은 칠면조 적혈구세포를 이용한 헤마토글루티닌 검사로 결정한다. Karber 계산을 이용하여 각 샘플에서 log10 TCID50/㎖을 결정하였다. 비강 세척 샘플에서의 바이러스 발산은 감염후 비강 세척 샘플 상에서 결정하였다. 각 동물에서 발산되는 최대 역가는 로그 변환되었다; 처리군, 평균, 표준 편차를 계산하고, Kruskal-Wallis 테스트로 비교하였다. 임의 시간에서 임의 바이러스 발산을 가는 처리군에 동물 비율을 표로 만들고, 각 군은 독립적으로 χ2 테스트를 이용하여 대조하였다. 바이러스 발산으로부터 결과를 도 15에 나타내었다. 네가티브 대조군 처리 군만 유의성있는 바이러스 발산이 있었다(도 15).
헤마글루티닌 저해 검사(HAI)는 상동성 바이러스(인플루엔자 A/Wyoming/3/2003 (H3N2) 바이러스)에 대해 백신주사전 및 주사후 혈청 샘플을 이용하여 실시예 5에서 설명하는 것과 같이 실행하여, 기저수준에서 혈청-네가티브와 면역주사 및 감염후에 동물의 혈청 변환이 있는지에 대해 확인하였다. HAI 역가를 표로 만들고, 기준일(0일째)와 종료일에 4배이상 상승된 동물들을 확인하였다.
면역주사를 맞은 동물의 혈청의 헤마토글루티닌-저해(HI) 활성은 보호와 관련있는 것으로 간주된다(Brown et al. , 2004, Dev. Biol. (Basel), 115:1; and Hobson et al. , 1972, J. Hyg., 70:767). 각 실험 결과를 표 4에 나타내었다. H3N2 또는 포지티브 대조군에 대해 테스트 백신으로 면역주하를 받은 군의 모든 동물은 고혈청 헤마토글루티닌 저해 활성을 가지는 강력한 표적-특이적인 면역 반응을 가졌다. 백신의 제1투여후에, VC2+어쥬번트는 높은 HAI 역가를 생성하였다. 어쥬번트 없이 VC2는 보호 반응을 생성하였으나 제1투여후에 어쥬번트를 포함하는 것만큼 역가가 높지는 않았다. 그러나 제2투여후에, 역가는 어쥬번트를 가지는 CMB1 수준과 유사한 수준에 도달하였다. VCl +어쥬번트는 항체의 보호 수준을 생성하였는데, 이는 백신의 제2투여후에 상당히 더 높았다(표 4).
흰족제비 HAI 데이터 종합
백신주사군 헤마토글루티닌 저해역가(혈청 희석 -1)
프레이뮨 Dose 1 Dose 2
N/대조군 5 5 5
VC2+A 5 1280 1280
VC1+A 5 50 1826
VC2, no A 5 322 1440
P/대조군 5 3000 1367
도 17에서는 제2 HA 검사 실엄 결과를 나타내었다. 임의 동물의 프레-이뮨 혈청에서 또는 NC 동물의 혈청에서 HI 활성이 관찰되지 않았다(도 17). 그러나, VC2+어쥬번트로 백신주사를 맞은 모든 흰족제비의 혈청은 1:320 내지 1:2560(평균 역가 1273)의 높은 HI 역가를 나타내었다. VC1+어쥬번트를 제공받은 동물 가운데 제1투여후에 HI 역가가 낮거나 반응이 없는 것(Fewer responders)들이 관찰되었고(도 17), 이는 NA가 면역 반응을 조절할 것이라는 것을 말한다. VC2를 제공받은 8마리 동물중 다섯 마리는 1:160 내지 1:1280 범위의 HI 역가를 가지며, 어쥬번트 없이 상업적인 비활성화된 인플루엔자 백신은 일반적으로 HI 역가가 매우 낮았다(Potter et al, 1972, Br. J. Exp. Pathol, 53: 168; Potter et al, 1973, J. Hyg. (Lond.), 71 :97; and Potter et al, 1973, Arch. Gesamte virusforsch., 42:285). FVC1+어쥬번트, VC2 또는 VC2+어쥬번트의 제2투여후에, 모든 흰족제비의 혈청은 1:640 내지 1:2560 범위의 HI 역가를 가지고, 이들은 제3투여후에도 유사한 높은 역가를 유지한다(도 17). 이들 동물 모두의 혈청에는 1:40의 과량의 역가를 가지는데, 이는 최저 HI 역가가 사람에서 보호와 일치하는 것으로 간주된다(Brown et al, 2004, Dev. Biol. (Basel), 115:1; and Hobson et al, 1972, J. Hyg., 70:767).
식물에서 생산된 백신 후보물질의 2 내지 3회 투여후 흰족제비의 혈청에 HI 역가는 비강으로 감염된 포지티브 대조군 동물에서의 것과 상응하거나 이보다 컸고(도 17), 다른 흰족제비 연구에서 관찰된 것보다는 초과되었다. 예를 들면, 시판되는 비활성화된 H3N2 인플루엔자 백신을 근육으로 면역주사를 맞은 흰족제비는 2회 투여후에 1:20의 HI 역가가 발생되는 것으로 보고되었다(Lambkin et al, 2004, 백신, 22:4390). VC1+어쥬번트, VC2 또는 VC2+어쥬번트로 면역주사를 맞은 흰족제비의 혈청에는 A/Wyoming/3/03에 대항하는 것보다 이형성 H3N2 바이러스 균주A/Sydney/5/97 및 A/California/7/04 Sera에 대해 약 4 내지 12배 더 낮은 역가를 가졌으나, 이들 역가는 보호에 상응하는 1 :40 분계점을 모두 초과하여, 이는 이들 백신 후보물질이 이형성 H3N2 균주에 대한 보호 능역이 있다는 것을 설명한다. HI titers below 1 :10 were observed against 인플루엔자 A/New Caledonia/20/99 (HlNl)에 대해 1:10이하의 HI 역가가 관찰되었는데 이는 HI 항체 반응의 H3 서브타입 특이성을 나타내는 것이다.
면역원성 및 보호 효과 연구가 실행되어 살아있는 난에서 생장된 인플루엔자 A/Wyoming/3/03 바이러스로 비강 도전을 받은 흰족제비의 식물에서 생산되는 HA 및 NA 항원으로 면역주사 후 보호 효과를 평가하였다.
도전후에 바이러스 감염은 도전후 4일에 비강 세척물에서 바이러스 발산을 모니터하여 각 동물에서 결정한다. 세 가지 후보물질 백신 조성물중 임의의 것을 제공받은 한 마리 동물에서만 감지가능한 정도의 바이러스 발산이 나타났고, 이는 102 TCID50보다 적었으며, NC 군의 동물에서는 106 TCID50 내지 107 TCID50 범위의 발산을 보여주었다(도 18A). PC 군에서 바이러스 발산 수준은 102 TCID50 내지 103 TCID50 범위에 있고 이는 후보 백신군에 임의 동물에서보다 높았다(도 18A).
후보 백신 조제물을 제공받은 동물에서 보호 증가가 관찰되었다. 감염후 체중 감소는 NC 군에 있는 것들과 비교하였을 때 VC1+어쥬번트, VC2+어쥬번트 또는 상동성 바이러스를 제공받은 흰족제비에서 상당히 감소되었다.(도 18B). VC2를 제공받은 동물에서 체중 감소가 줄어든 것은 그다지 놀라운 것은 아니다(도 18B). 또한, 임의 백신 후보 물질 조성물로 면역주사를 맞은 흰족제비에서 체온 상승은 NC 또는 PC 군의 동물과 비교하였을 때 감소되었다(도 18C). 또한, 증후 수치 평균 피크, 도전후에 몇 가지 인플루엔자 관련된 증후 빈도는 NC군의 동물과 비교하였을 때 후보 백신 조성물을 제공받은 동물에서 감소되었다(도 18D). 유사하게, 상부 호흡기관 감염의 지시물질로써 취한 흰족제비의 비강 세척액에 백혈구세포 카운터는 NC 군에 있는 동물과 비교하였을 때 후보물질 백신 수용체에서 감소되었다(도 18E).
도전 연구에서 식물에서 생산된 HA 및 NA 항원은 흰족제비에서 고도의 높은 보호 면역성을 부여하고, 이는 백신 개발에 전망을 보여주는 것이다. 앞으로 연구에서 LicKM-SD 및 LicKM-GD를 개별적으로 투여하였을 때 보호 역할 및 면역 반응을 실행함에 있어서 NA의 역할을 밝혀야 할 것이다.
B. 비강 백신 주사
Balb/c 생쥐 또는 흰족제비 동물 모델에서 비강 면역주사후에 후보 백신의 면역원성을 평가하였다. 연구안은 상기 실시예에서 논의된 근육내 면역주사의 경우와 유사하다. 간략하게 설명하면 어쥬번트(가령, 수산화알루미늄, MALP-2, 등) 존재 하에 또는 부재 하에 0, 14, 28일에 표적 항원 세 가지 약량(100㎍/투여)으로 생쥐 또는 흰족제비 집단(집단에 약 8-10마리)의 비강으로 면역주사한다. 혈청 샘플과 비강 세척액을 항원 투여전 각 백신투여일 및 제3투여후 10일에 수거하였다. 면역주사를 맞은 동물에 최종 투여일후에, 동물을 감염시키고, 열을 수반하는 호흡기 감염 증후를 만들기 위해 비강 경로를 통하여 공지된 인플루엔자 바이러스 상동성 균주로 도전시켰다. 면역 반응의 성질은 바이러스 도전후에 바이러스 발산, 감염후 체중 감소, 체온 상승, 증후 수치의 평균 피크, 비강 세척액에 백혈구세포 카운트 수준을 결정하여 검사한다. NA 및/또는 HA에 대한 항체 존재 및 HI 및 바이러스 중화 활성도 검사하였다.
C. 투여량 상승 연구
항원 및 어쥬번트의 최적 조성 및 투여량, 투여경로 및 면역주사 섭생은 약량 상응 연구(dose escalation studies)를 통하여 추가 평가할 수 있다. 이 연구는 근육 경로(표 3) 및 비강 경로를 모두 이용하여 실시한다. 실시예에서 논의된 근육 및 비강 면역주사와 유사하게, 동물군(집단에 약 8-10마리)를 다양한 약량의 테스트 백신(어쥬번트 유무하에-가령, 수산화알루미늄, MALP-2, 등) 비강으로 면역주사한다. 예시적인 약량은 하기 표 5에 나타내었다.
다른 연구에서, 혈청 샘플 및 비강 세척액은 항원 투여전 각 백신주사일 및 제3 투약후 10일에 계산하엿다. 면역주사를 맞은 동물은 동물을 감염시키고, 열을 수반하는 호흡기 감염 증후를 만드는 것으로 공지된 인플루엔자 바이러스의 상동성 균주로 비강 경로를 통하여 최종 투여후에 도전을 받게 한다. 면역 반응의 성질은 바이러스 도전후에 바이러스 발산, 감염후 체중 감소, 체온 상승, 증후 수치의 평균 피크, 비강 세척액에 백혈구세포 카운트; NA, HA 및/또는 M2에 대한 항체 존재; 헤마토글루티닌 저해 및 바이러스 중화 활성도 검사하여 결정하였다.
동물에서 약량 증가 연구에 대한 실험안
집단 백신 후보물질 조성물# 백신 주사 경로 동물의 수 투여 빈도 투여당 VC㎍
1 표준 i.m.* 8
2 1 i.m. 8 3 10
3 1 i.m. 8 2 50
4 1 i.m. 8 1 100
5 LicKM i.m. 8 2 100
6 2 i.m. 8 3 10
7 2 i.m. 8 2 50
8 2 i.m. 8 1 100
9 3 i.m. 8 3 10
10 3 i.m. 8 2 50
11 3 i.m. 8 1 100
*i.m.은 근육투여를 말한다.
SEQUENCE LISTING <110> Yusibov, et al. <120> Influenza Antigens, Vaccine Compositions, and Related Methods <130> 2002645-0113 <140> 11/706573 <141> 2007-02-13 <160> 35 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 577 <212> PRT <213> HA (HAV) Protein <400> 1 Ala Lys Ala Gly Val Gln Ser Val Lys Met Glu Lys Ile Val Leu Leu 1 5 10 15 Phe Ala Ile Val Ser Leu Val Lys Ser Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr 20 25 30 His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn 35 40 45 Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile Leu Glu Lys Thr His Asn Gly 50 55 60 Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys 65 70 75 80 Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile 85 90 95 Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn 100 105 110 Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His 115 120 125 Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys 130 135 140 Ser Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys 145 150 155 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gttctctgag 540 gttgagggaa ggattcagga tcttgagaag tacgtggagg atacaaagat tgatctttgg 600 tcttacaacg ctgagcttct tgttgctctt gagaaccagc acactattga tcttactgat 660 tctgagatga acaagttgtt cgagaggact aagaagcagc ttagggagaa cgctgaggat 720 atgggaaatg gatgcttcaa aatctaccac aagtgcgata acgcttgcat tgagtctatt 780 aggaacggaa cttacgatca cgatgtgtac cgtgatgagg ctcttaacaa caggttccag 840 attaagggag tggagcttaa gtctggatac aaggattgga ttcttaagct t 891 <210> 24 <211> 290 <212> PRT <213> (SD domain 1-2) HA1-2 <400> 24 Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly 1 5 10 15 His His Ala Val Pro Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp 20 25 30 Gln Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr 35 40 45 Gly Gly Ile Asn Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile Pro Asn 50 55 60 Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Ile Thr Tyr Gly Ala Cys Pro 65 70 75 80 Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met Arg Asn 85 90 95 Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe 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cttcttggag atccacagtg cgatggattc cagaacaaga agtgggatct tttcgtggaa 120 aggtctaagg cttactctaa ctgctaccca tacgatgttc cagattacgc ttctcttagg 180 agtcttgtgg cttcttctgg aactcttgag ttcaacaacg agtctttcaa ctgggctgga 240 gttactcaga acggaacttc ttctgcttgt aagaggaggt ctaacaagtc tttcttctct 300 aggcttaact ggcttactca ccttaagtac aagtacccag ctcttaacgt gactatgcca 360 aacaacgaga agttcgataa gttgtacatt tggggagttc accacccagt tactgattct 420 gatcagattt ctctttacgc tcaggcttct ggaaggatta ctgtgtctac taagaggtct 480 cagcagactg tgattccaaa cattggatac cgtccaagag tgagggatat ttcttctagg 540 atttctatct actggactat tgtgaagcca ggagatattc ttcttattaa ctctactgga 600 aaccttattg ctccaagggg atacttcaag attaggagtg gaaagtcatc tattatgagg 660 agtgatgctc caattggaaa gtgcaagctt 690 <210> 26 <211> 1699 <212> DNA <213> (full length) HASW <400> 26 ggatccatta attaaaatgg gattcgtgct tttctctcag cttccttctt tccttcttgt 60 gtctactctt cttcttttcc ttgtgatttc tcactcttgc cgtgctcaaa agttgccagg 120 aaacgataac tctactgcta ctctttgcct tggacatcac gctgttccaa acggaactat 180 tgtgaaaact attactaacg atcagattga ggtgacaaac gctactgagc ttgttcagtc 240 atcttctact ggaggaattt gcgattctcc acaccagatt cttgatggag agaactgcac 300 tcttattgat gctcttcttg gagatccaca gtgcgatgga ttccagaaca agaagtggga 360 tcttttcgtg gaaaggtcta aggcttactc taactgctac ccatacgatg ttccagatta 420 cgcttctctt aggagtcttg tggcttcttc tggaactctt gagttcaaca acgagtcttt 480 caactgggct ggagttactc agaacggaac ttcttctgct tgtaagagga ggtctaacaa 540 gtctttcttc tctaggctta actggcttac tcaccttaag tacaagtacc cagctcttaa 600 cgtgactatg ccaaacaacg agaagttcga taagttgtac atttggggag ttcaccaccc 660 agttactgat tctgatcaga tttctcttta cgctcaggct tctggaagga ttactgtgtc 720 tactaagagg tctcagcaga ctgtgattcc aaacattgga taccgtccaa gagtgaggga 780 tatttcttct aggatttcta tctactggac tattgtgaag ccaggagata ttcttcttat 840 taactctact ggaaacctta ttgctccaag gggatacttc aagattagga gtggaaagtc 900 atctattatg aggagtgatg ctccaattgg aaagtgcaac tctgagtgca ttactccaaa 960 cggatctatt ccaaacgata agccattcca gaacgtgaac aggattactt atggagcttg 1020 cccaagatac gtgaagcaga acactcttaa gttggctact ggaatgagga atgtgccaga 1080 gaagcagact aggggaattt tcggagctat tgctggattc attgagaatg gatgggaggg 1140 aatggttgat ggatggtacg gattcaggca ccagaattca gagggaactg gacaagctgc 1200 tgatcttaag tctactcagg ctgctattaa ccagattaac ggaaagttga acaggcttat 1260 tggaaagact aacgagaagt tccaccagat tgagaaggag ttctctgagg ttgagggaag 1320 gattcaggat cttgagaagt acgtggagga tacaaagatt gatctttggt cttacaacgc 1380 tgagcttctt gttgctcttg agaaccagca cactattgat ttgactgatt ctgagatgaa 1440 caagttgttc gagaggacta agaagcagct tagggagaac gctgaggata tgggaaatgg 1500 atgcttcaaa atctaccaca agtgcgataa cgcttgcatt gagtctatta ggaacggaac 1560 ttacgatcac gatgtgtacc gtgatgaggc tcttaacaac aggttccaga ttaagggagt 1620 ggagcttaag tctggataca aggattggat tcttcatcat caccaccacc acaaggatga 1680 gctttgatga ctcgagctc 1699 <210> 27 <211> 1446 <212> DNA <213> NAV (N1) <400> 27 ggatccttaa ttaaaatggg attcgtgctt ttctctcagc ttccttcttt ccttcttgtg 60 tctactcttc ttcttttcct tgtgatttct cactcttgcc gtgctcaaaa tgtcgacctt 120 atgcttcaga ttggaaacat gatttctatt tgggtgtcac actctattca cactggaaac 180 cagcatcagt ctgagccaat ttctaacact aaccttttga ctgagaaggc tgtggcttct 240 gttaagttgg ctggaaactc ttctctttgc cctattaacg gatgggctgt gtactctaag 300 gataactcta ttaggattgg atctaaggga gatgtgttcg tgattaggga gccattcatt 360 tcttgctctc accttgagtg ccgtactttc ttccttactc agggtgctct tcttaacgat 420 aagcactcta acggaactgt gaaggatagg tctccacaca ggactcttat gtcttgtcca 480 gttggagaag ctccatctcc atacaactct agattcgagt ctgttgcttg gagtgcttct 540 gcttgccatg atggaacttc atggcttact attggaattt ctggaccaga taacggagct 600 gttgctgtgc ttaagtacaa cggaattatt actgatacca tcaagtcttg gaggaacaac 660 attcttagga ctcaggagtc tgagtgtgct tgcgttaacg gatcttgctt cactgtgatg 720 actgatggac catctaatgg acaggcttct cacaagattt tcaagatgga gaagggaaag 780 gttgtgaagt ctgtggaact tgatgctcca aactaccatt acgaggagtg ttcttgctat 840 ccagatgctg gagagattac ttgtgtgtgc cgtgataatt ggcatggatc taacaggcca 900 tgggtgtcat tcaatcagaa ccttgagtac cagattggtt acatttgctc tggagtgttc 960 ggagataatc caaggccaaa cgatggaact ggatcttgtg gaccagtgtc atctaatgga 1020 gctggaggag tgaagggatt ctctttcaag tacggaaacg gagtttggat tggaaggact 1080 aagtctacta actctaggag tggattcgag atgatttggg acccaaacgg atggactgag 1140 actgattctt ctttctctgt gaagcaggat attgtggcta ttactgattg gagtggatac 1200 tctggatctt tcgttcagca cccagagctt actggacttg attgcattag gccatgcttc 1260 tgggttgaac ttattagggg aaggccaaag gagtctacta tttggacttc tggatcttct 1320 atttctttct gcggagtgaa ttctgatact gtgggatggt cttggccaga tggagctgag 1380 cttccattca ctattgataa ggtcgaccat catcatcatc accacaagga tgagctttga 1440 ctcgag 1446 <210> 28 <211> 1458 <212> DNA <213> NAW (N2) <400> 28 ggatccttaa ttaaaatggg attcgtgctt ttctctcagc ttccttcttt ccttcttgtg 60 tctactcttc ttcttttcct tgtgatttct cactcttgcc gtgctcaaaa tgtcgacaag 120 cagtacgagt tcaactctcc accaaacaac caggttatgc tttgcgagcc aactattatt 180 gagaggaaca ttactgagat tgtgtacctt actaacacta ctattgagaa ggagatttgc 240 ccaaagttgg ctgagtaccg taattggtct aagccacagt gcaacattac tggattcgct 300 ccattctcta aggataactc aattaggctt tctgctggag gagatatttg ggttacaagg 360 gagccatacg tttcttgcga tccagataag tgctaccagt tcgctcttgg acaaggaact 420 actcttaaca acgtgcactc taacgatact gtgcacgata ggactccata ccgtactctt 480 ttgatgaacg agcttggagt tccattccac cttggaacta agcaagtgtg cattgcttgg 540 tcatcttcat cttgccacga tggaaaggct tggcttcatg tttgcgtgac tggagatgat 600 gagaacgcta ctgcttcttt catctacaac ggaaggcttg tggattctat tgtttcttgg 660 tctaagaaga ttcttaggac tcaggagtct gagtgtgtgt gcattaacgg aacttgcact 720 gtggttatga ctgatggatc tgcttctgga aaggctgata caaagattct tttcattgag 780 gagggaaaga ttgtgcacac ttctactctt tctggatctg ctcagcatgt tgaggagtgt 840 tcttgctacc caaggtatcc aggagttaga tgtgtgtgcc gtgataactg gaagggatct 900 aacaggccaa ttgtggatat taacattaag gattactcta ttgtgtcatc ttatgtgtgc 960 tctggacttg ttggagatac tccaaggaag aacgattctt cttcatcttc acactgcctt 1020 gatccaaata acgaggaggg aggacatgga gttaagggat gggctttcga tgatggaaac 1080 gatgtttgga tgggaaggac tatttctgag aagttgagga gcggatacga gactttcaaa 1140 gtgattgagg gatggtctaa cccaaattct aagctgcaga ttaacaggca agtgattgtg 1200 gataggggaa acaggagtgg atactctgga attttctctg tggagggaaa gtcttgcatt 1260 aacagatgct tctacgtgga gcttattagg ggaaggaagc aggagactga ggttttgtgg 1320 acttctaact ctattgtggt gttctgcgga acttctggaa cttacggaac tggatcttgg 1380 ccagatggag ctgatattaa ccttatgcca attgtcgacc atcatcacca tcaccacaag 1440 gatgagcttt gactcgag 1458 <210> 29 <211> 717 <212> DNA <213> LicKM <400> 29 ggatccttaa ttaaaatggg aggttcttat ccatataagt ctggtgagta tagaactaag 60 tctttctttg gatatggtta ttatgaagtt aggatgaagg ctgcaaagaa cgttggaatt 120 gtttcttctt tctttactta tactggacca tctgataaca acccatggga tgagattgat 180 attgagtttc ttggaaagga tactactaag gttcaattca actggtataa gaatggtgtt 240 ggtggaaacg agtatcttca taaccttgga tttgatgctt ctcaagattt tcatacttat 300 ggttttgagt ggagaccaga ttatattgat ttttatgttg atggaaagaa ggtttataga 360 ggtactagaa acattccagt tactcctgga aagattatga tgaatctttg gccaggaatt 420 ggtgttgatg aatggcttgg tagatatgat ggaagaactc cacttcaagc tgagtatgag 480 tatgttaagt attatccaaa cggtagatct gaattcaagc ttgttgttaa tactccattt 540 gttgctgttt tctctaactt tgattcttct caatgggaaa aggctgattg ggctaacggt 600 tctgttttta actgtgtttg gaagccatct caagttactt tttctaacgg aaagatgatt 660 cttactttgg atagagagta tgtcgaccat catcatcatc atcattgact cgagctc 717 <210> 30 <211> 230 <212> PRT <213> LicKM <400> 30 Met Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Lys Ser Gly Glu Tyr Arg Thr Lys Ser 1 5 10 15 Phe Phe Gly Tyr Gly Tyr Tyr Glu Val Arg Met Lys Ala Ala Lys Asn 20 25 30 Val Gly Ile Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly Pro Ser Asp Asn 35 40 45 Asn Pro Trp Asp Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly Lys Asp Thr Thr 50 55 60 Lys Val Gln Phe Asn Trp Tyr Lys Asn Gly Val Gly Gly Asn Glu Tyr 65 70 75 80 Leu His Asn Leu Gly Phe Asp Ala Ser Gln Asp Phe His Thr Tyr Gly 85 90 95 Phe Glu Trp Arg Pro Asp Tyr Ile Asp Phe Tyr Val Asp Gly Lys Lys 100 105 110 Val Tyr Arg Gly Thr Arg Asn Ile Pro Val Thr Pro Gly Lys Ile Met 115 120 125 Met Asn Leu Trp Pro Gly Ile Gly Val Asp Glu Trp Leu Gly Arg Tyr 130 135 140 Asp Gly Arg Thr Pro Leu Gln Ala Glu Tyr Glu Tyr Val Lys Tyr Tyr 145 150 155 160 Pro Asn Gly Arg Ser Glu Phe Lys Leu Val Val Asn Thr Pro Phe Val 165 170 175 Ala Val Phe Ser Asn Phe Asp Ser Ser Gln Trp Glu Lys Ala Asp Trp 180 185 190 Ala Asn Gly Ser Val Phe Asn Cys Val Trp Lys Pro Ser Gln Val Thr 195 200 205 Phe Ser Asn Gly Lys Met Ile Leu Thr Leu Asp Arg Glu Tyr Val Asp 210 215 220 His His His His His His 225 230 <210> 31 <211> 822 <212> DNA <213> Engineered LicKM <400> 31 ggatccttaa ttaaaatggg atttgttctc ttttcacaat tgccttcatt tcttcttgtc 60 tctacacttc tcttattcct agtaatatcc cactcttgcc gtgcccaaaa tggaggttct 120 tatccatata agtctggtga gtatagaact aagtctttct ttggatatgg ttattatgaa 180 gttaggatga aggctgcaaa gaacgttgga attgtttctt ctttctttac ttatactgga 240 ccatctgata acaacccatg ggatgagatt gatattgagt ttcttggaaa ggatactact 300 aaggttcaat tcaactggta taagaatggt gttggtggaa acgagtatct tcataacctt 360 ggatttgatg cttctcaaga ttttcatact tatggttttg agtggagacc agattatatt 420 gatttttatg ttgatggaaa gaaggtttat agaggtacta gaaacattcc agttactcct 480 ggaaagatta tgatgaatct ttggccagga attggtgttg atgaatggct tggtagatat 540 gatggaagaa ctccacttca agctgagtat gagtatgtta agtattatcc aaacggtaga 600 tctgaattca agcttgttgt taatactcca tttgttgctg ttttctctaa ctttgattct 660 tctcaatggg aaaaggctga ttgggctaac ggttctgttt ttaactgtgt ttggaagcca 720 tctcaagtta ctttttctaa cggaaagatg attcttactt tggatagaga gtatgtcgac 780 catcatcatc atcatcataa ggatgaactt tgactcgagc tc 822 <210> 32 <211> 265 <212> PRT <213> Engineered LicKM <400> 32 Met Gly Phe Val Leu Phe Ser Gln Leu Pro Ser Phe Leu Leu Val Ser 1 5 10 15 Thr Leu Leu Leu Phe Leu Val Ile Ser His Ser Cys Arg Ala Gln Asn 20 25 30 Gly Gly Ser Tyr Pro Tyr Lys Ser Gly Glu Tyr Arg Thr Lys Ser Phe 35 40 45 Phe Gly Tyr Gly Tyr Tyr Glu Val Arg Met Lys Ala Ala Lys Asn Val 50 55 60 Gly Ile Val Ser Ser Phe Phe Thr Tyr Thr Gly Pro Ser Asp Asn Asn 65 70 75 80 Pro Trp Asp Glu Ile Asp Ile Glu Phe Leu Gly Lys Asp Thr Thr Lys 85 90 95 Val Gln Phe Asn Trp Tyr Lys Asn Gly Val Gly Gly Asn Glu Tyr Leu 100 105 110 His Asn Leu Gly Phe Asp Ala Ser Gln Asp Phe His Thr Tyr Gly Phe 115 120 125 Glu Trp Arg Pro Asp Tyr Ile Asp Phe Tyr Val Asp Gly Lys Lys Val 130 135 140 Tyr Arg Gly Thr Arg Asn Ile Pro Val Thr Pro Gly Lys Ile Met Met 145 150 155 160 Asn Leu Trp Pro Gly Ile Gly Val Asp Glu Trp Leu Gly Arg Tyr Asp 165 170 175 Gly Arg Thr Pro Leu Gln Ala Glu Tyr Glu Tyr Val Lys Tyr Tyr Pro 180 185 190 Asn Gly Arg Ser Glu Phe Lys Leu Val Val Asn Thr Pro Phe Val Ala 195 200 205 Val Phe Ser Asn Phe Asp Ser Ser Gln Trp Glu Lys Ala Asp Trp Ala 210 215 220 Asn Gly Ser Val Phe Asn Cys Val Trp Lys Pro Ser Gln Val Thr Phe 225 230 235 240 Ser Asn Gly Lys Met Ile Leu Thr Leu Asp Arg Glu Tyr Val Asp His 245 250 255 His His His His His Lys Asp Glu Leu 260 265 <210> 33 <211> 233 <212> PRT <213> H5N1 HA domain 3 <400> 33 Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys Pro Leu Ile Leu Arg Asp Cys Ser Val 1 5 10 15 Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val 20 25 30 Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp Leu 35 40 45 Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu 50 55 60 Ser Arg Ile Asn His Phe Glu Lys Ile Gln Ile Ile Pro Lys Ser Ser 65 70 75 80 Trp Ser Ser His Glu Ala Ser Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr 85 90 95 Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys 100 105 110 Asn Ser Thr Tyr Pro Thr Ile Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln 115 120 125 Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp Gly Ile His His Pro Asn Asp Ala Ala 130 135 140 Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln Asn Pro Thr Thr Tyr Ile Ser Val Gly 145 150 155 160 Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro Arg Ile Ala Thr Arg Ser 165 170 175 Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr Ile Leu 180 185 190 Lys Pro Asn Asp Ala Ile Asn Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala 195 200 205 Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met 210 215 220 Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly Asn Cys 225 230 <210> 34 <211> 428 <212> PRT <213> NAV <400> 34 Leu Met Leu Gln Ile Gly Asn Met Ile Ser Ile Trp Val Ser His Ser 1 5 10 15 Ile His Thr Gly Asn Gln His Gln Ser Glu Pro Ile Ser Asn Thr Asn 20 25 30 Leu Leu Thr Glu Lys Ala Val Ala Ser Val Lys Leu Ala Gly Asn Ser 35 40 45 Ser Leu Cys Pro Ile Asn Gly Trp Ala Val Tyr Ser Lys Asp Asn Ser 50 55 60 Ile Arg Ile Gly Ser Lys Gly Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe 65 70 75 80 Ile Ser Cys Ser His Leu Glu Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly 85 90 95 Ala Leu Leu Asn Asp Lys His Ser Asn Gly Thr Val Lys Asp Arg Ser 100 105 110 Pro His Arg Thr Leu Met Ser Cys Pro Val Gly Glu Ala Pro Ser Pro 115 120 125 Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His 130 135 140 Asp Gly Thr Ser Trp Leu Thr Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp Asn Gly 145 150 155 160 Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr Asn Gly Ile Ile Thr Asp Thr Ile Lys 165 170 175 Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Ala Cys 180 185 190 Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr Val Met Thr Asp Gly Pro Ser Asn Gly 195 200 205 Gln Ala Ser His Lys Ile Phe Lys Met Glu Lys Gly Lys Val Val Lys 210 215 220 Ser Val Glu Leu Asp Ala Pro Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys 225 230 235 240 Tyr Pro Asp Ala Gly Glu Ile Thr Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His 245 250 255 Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val Ser Phe Asn Gln Asn Leu Glu Tyr Gln 260 265 270 Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly Val Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn 275 280 285 Asp Gly Thr Gly Ser Cys Gly Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Gly Gly 290 295 300 Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg 305 310 315 320 Thr Lys Ser Thr Asn Ser Arg Ser Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro 325 330 335 Asn Gly Trp Thr Glu Thr Asp Ser Ser Phe Ser Val Lys Gln Asp Ile 340 345 350 Val Ala Ile Thr Asp Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His 355 360 365 Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp Cys Ile Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu 370 375 380 Leu Ile Arg Gly Arg Pro Lys Glu Ser Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser 385 390 395 400 Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp 405 410 415 Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro Phe Thr Ile Asp Lys 420 425 <210> 35 <211> 432 <212> PRT <213> NAW <400> 35 Lys Gln Tyr Glu Phe Asn Ser Pro Pro Asn Asn Gln Val Met Leu Cys 1 5 10 15 Glu Pro Thr Ile Ile Glu Arg Asn Ile Thr Glu Ile Val Tyr Leu Thr 20 25 30 Asn Thr Thr Ile Glu Lys Glu Ile Cys Pro Lys Leu Ala Glu Tyr Arg 35 40 45 Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Asn Ile Thr Gly Phe Ala Pro Phe Ser 50 55 60 Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly Asp Ile Trp Val Thr 65 70 75 80 Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Lys Cys Tyr Gln Phe Ala 85 90 95 Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn Val His Ser Asn Asp Thr Val 100 105 110 His Asp Arg Thr Pro Tyr Arg Thr Leu Leu Met Asn Glu Leu Gly Val 115 120 125 Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile Ala Trp Ser Ser Ser 130 135 140 Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val Cys Val Thr Gly Asp 145 150 155 160 Asp Glu Asn Ala Thr Ala Ser Phe Ile Tyr Asn Gly Arg Leu Val Asp 165 170 175 Ser Ile Val Ser Trp Ser Lys Lys Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser Glu 180 185 190 Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val Met Thr Asp Gly Ser 195 200 205 Ala Ser Gly Lys Ala Asp Thr Lys Ile Leu Phe Ile Glu Glu Gly Lys 210 215 220 Ile Val His Thr Ser Thr Leu Ser Gly Ser Ala Gln His Val Glu Glu 225 230 235 240 Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Gly Val Arg Cys Val Cys Arg Asp 245 250 255 Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Ile Val Asp Ile Asn Ile Lys Asp 260 265 270 Tyr Ser Ile Val Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly Leu Val Gly Asp Thr 275 280 285 Pro Arg Lys Asn Asp Ser Ser Ser Ser Ser His Cys Leu Asp Pro Asn 290 295 300 Asn Glu Glu Gly Gly His Gly Val Lys Gly Trp Ala Phe Asp Asp Gly 305 310 315 320 Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Ser Glu Lys Leu Arg Ser Gly 325 330 335 Tyr Glu Thr Phe Lys Val Ile Glu Gly Trp Ser Asn Pro Asn Ser Lys 340 345 350 Leu Gln Ile Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Arg Gly Asn Arg Ser Gly 355 360 365 Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser Cys Ile Asn Arg Cys 370 375 380 Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Lys Gln Glu Thr Glu Val Leu 385 390 395 400 Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe Cys Gly Thr Ser Gly Thr Tyr 405 410 415 Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asp Ile Asn Leu Met Pro Ile 420 425 430

Claims (94)

  1. 열안정성 단백질에 융합된 인플루엔자 A 일체(integral)형 막 단백질의 성분을 포함하는 분리된 항원에 있어서,
    일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA) 및 M2 도메인에서 선택된 최소 한가지 도메인으로 구성되는 것을 특징으로 하는 분리된 항원.
  2. 제 1 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 최소 한가지 헤마토글루티닌(HA) 도메인을 포함하는데, 이때 도메인은 SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.:3, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 33, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 20 및 SEQ ID No.: 24에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 항원.
  3. 제 1 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 최소 한가지 뉴라미니다제(NA)도메인을 포함하는데, 이때 도메인은 SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.: 16 및 SEQ ID No.: 18에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리된 항원.
  4. 제 1 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 SEQ ID No.: 1 또는 SEQ ID No.:3에서 선택된 전장(full length) 헤마토글루티닌(HA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항원.
  5. 제 1 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 SEQ ID No.: 2 또는 SEQ ID No.:4에서 선택된 전장(full length) 뉴라미니다제(NA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항원.
  6. 제 1 항에 있어서, 열안정성 단백질은 변형된 리체나제 단백질 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항원.
  7. 제 6 항에 있어서, 리체나제 코딩 서열은 식물에서 단백질 발현을 위해 최적화된 것을 특징으로 하는 분리된 항원.
  8. 제 6 항에 있어서, 리체나제 단백질 서열은 리체나제 Lic B의 N-말단 도메인, C-말단 도메인, 표면 루프 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항원.
  9. 제 8 항에 있어서, 리체나제에 융합된 일체형 막 단백질 성분은 N0말단 융합체, C-말단 융합체 또는 표면 루프 삽입 융합 단백질중 임의의 하나 인 것을 특징으로 하는 분리된 항원.
  10. 제 1 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.:3, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 33, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 24, SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.:16 및 SEQ ID No.:18에서 선택되는 최소 두 개 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항원.
  11. 제 10 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA)의 도메인 및 뉴라미니다제(NA)의 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리된 항원.
  12. 열안정성 단백질에 융합된 인플루엔자 A 일체(integral)형 막 단백질의 성분으로 구성된 분리된 항원과 약학적으로 수용가능한 캐리어로 구성된 백신 조성물에 있어서,
    일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA), 뉴라미니다제(NA) 및 M2 도메인에서 선택된 최소 한가지 도메인을 포함하고; 그리고
    조성물은 개체에 주사하였을 때 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  13. 제 12 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 최소 한가지 헤마토글루티닌(HA) 도메인을 포함하는데, 이때 도메인은 SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.:3, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 33, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 20 및 SEQ ID No.: 24에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백 신 조성물.
  14. 제 12 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 최소 한가지 뉴라미니다제(NA)도메인을 포함하는데, 이때 도메인은 SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.: 16 및 SEQ ID No.: 18에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  15. 제 12 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 SEQ ID No.: 1 또는 SEQ ID No.:3에서 선택된 전장(full length) 헤마토글루티닌(HA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  16. 제 12 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 SEQ ID No.: 2 또는 SEQ ID No.:4에서 선택된 전장(full length) 뉴라미니다제(NA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  17. 제 12 항에 있어서, 열안정성 단백질은 변형된 리체나제 단백질 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  18. 제 12 항에 있어서, 열안정성 단백질은 클로스트리듐 터모셀륨(Clostridium thermocellum)의 변형된 리체나제 단백질 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  19. 제 17 항에 있어서, 리체나제 코딩 서열은 식물에서 단백질 발현을 위해 최적화된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  20. 제 17 항에 있어서, 리체나제 단백질 서열은 리체나제의 N-말단 도메인, C-말단 도메인, 표면 루프 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 리체나제에 융합된 일체형 막 단백질 성분은 N0말단 융합체, C-말단 융합체 또는 표면 루프 삽입 융합 단백질중 임의의 하나 인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  22. 제 12 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.:3, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 33, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 24, SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.:16 및 SEQ ID No.:18에서 선택된 최소 두가지 도메인을 포함하고, 이때 조성물은 개체에 주사하였을 때 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  23. 제 22 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA)의 도메인 및 뉴라미니다제(NA)의 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  24. 제 22 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 전장(full length)의 헤마토글루티닌(HA) 및 전장(full length)의 뉴라미니다제(NA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  25. 제 12 항에 있어서, 조성물에는 제 2 항원이 추가로 포함되며, 조성물은 개체에 주사하였을 때 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서, 제 2 항원은 열안정성 단백질에 융합된 인플루엔자 A 일체형 막 단백질 성분과 약학적으로 수용가능한 캐리어로 구성되고;
    이때, 제1항원의 일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA)의 도메인, 뉴라미니다제(NA)의 도메인, M2의 도메인에서 선택된 최소 한가지 도메인을 포함하고, 제2항원의 일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA)의 도메인, 뉴라미니다제(NA)의 도메인, M2의 도메인에서 선택된 제1 항원과 별개의 최소 한가지 도메인을 포함하고, 그리고
    조성물은 개체에 투여되었을 때 면역반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  27. 제 26 항에 있어서, 제 1 항원의 일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA) 도메인을 포함하고, 제2 항원의 일체형 막 단백질 성분은 뉴라미니다제(NA) 의 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  28. 제 12 항에 있어서, 항원은 유전자 전이된 식물 및 항원을 일과성으로 발현시키는 식물에서 선택된 식물로부터 생산되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  29. 제 12 항에 있어서, 조성물은 식물 세포, 식물, 씨, 과일 또는 이들의 추출물로부터 정제된, 부분적으로 정제된 또는 정제되지 않은 항원으로 구성된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  30. 제 12 항에 있어서, 최소 한 가지 백신 어쥬번트를 추가 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  31. 제 30 항에 있어서, 어쥬번트는 알룸(alum), MF59, 사포닌, MAPL2로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  32. 최소 두가지 항원과 약학적으로 수용가능한 캐리어를 포함하는 백신 조성물에 있어서, 항원 각각은 인플루엔자 A 일체형 막 단백질 성분을 포함하고; 일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA)의 도메인, 뉴라미니다제(NA)의 도메인, M2의 도메인에서 선택된 최소 한가지 도메인을 포함하고, 최소 한가지 항원은 열안정성 단백질에 융합되며, 그리고 조성물은 개체에 투여되었을 때 면역반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  33. 제 32 항에 있어서, 최소 한가지 일체형 막 단백질 성분은 최소 한가지 헤마토글루티닌(HA) 도메인을 포함하는데, 이때 도메인은 SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.:3, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 33, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 20 및 SEQ ID No.: 24에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  34. 제 32 항에 있어서, 최소 한가지 일체형 막 단백질 성분은 최소 한가지 뉴라미니다제(NA)도메인을 포함하는데, 이때 도메인은 SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.: 16 및 SEQ ID No.: 18에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  35. 제 32 항에 있어서, 최소 한가지 일체형 막 단백질 성분은 SEQ ID No.: 1 또는 SEQ ID No.:3에서 선택된 전장(full length) 헤마토글루티닌(HA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  36. 제 32 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 SEQ ID No.: 2 또는 SEQ ID No.:4에서 선택된 전장(full length) 뉴라미니다제(NA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  37. 제 32 항에 있어서, 열안정성 단백질은 변형된 리체나제 단백질 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  38. 제 32 항에 있어서, 열안정성 단백질은 클로스트리듐 터모셀륨(Clostridium thermocellum)의 변형된 리체나제 단백질 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  39. 제 37 항에 있어서, 리체나제 코딩 서열은 식물에서 단백질 발현을 위해 최적화된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  40. 제 37 항에 있어서, 리체나제 단백질 서열은 리체나제의 N-말단 도메인, C-말단 도메인, 표면 루프 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  41. 제 40 항에 있어서, 리체나제에 융합된 일체형 막 단백질 성분은 N0말단 융합체, C-말단 융합체 또는 표면 루프 삽입 융합 단백질중 임의의 하나 인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  42. 제 32 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.:3, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 33, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 20, SEQ ID No.: 24, SEQ ID No.:2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.:16 및 SEQ ID No.:18에서 선택되는 최소 두 개 도메인을 포함하고, 조성물을 개체에 투여하면 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  43. 제 42 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA)의 도메인 및 뉴라미니다제(NA)의 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  44. 제 42 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 전장(full length)의 헤마토글루티닌(HA) 및 전장(full length)의 뉴라미니다제(NA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  45. 제 32 항에 있어서, 조성물에는 제 3 항원이 추가로 포함되며, 조성물은 동물에 주사하였을 때 면역 반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  46. 제 45 항에 있어서, 제 3 항원은 열안정성 단백질에 융합된 인플루엔자 A 일체형 막 단백질 성분과 약학적으로 수용가능한 캐리어로 구성되고;
    이때, 제1항원의 일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA)의 도메인, 뉴라미니다제(NA)의 도메인, M2의 도메인에서 선택된 최소 한가지 도메인을 포함하고, 제2항원의 일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA)의 도메인, 뉴라미니다제(NA)의 도메인, M2의 도메인에서 선택된 제1 항원과 별개의 최소 한가지 도메인 을 포함하고, 그리고
    조성물은 개체에 투여되었을 때 면역반응을 유도할 수 있는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  47. 제 32 항에 있어서, 항원은 유전자 전이된 식물 및 항원을 일과성으로 발현시키는 식물에서 선택된 식물로부터 생산되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  48. 제 32 항에 있어서, 조성물은 식물 세포, 식물, 씨, 과일 또는 이들의 추출물로부터 정제된, 부분적으로 정제된 또는 정제되지 않은 항원으로 구성된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  49. 제 32 항에 있어서, 최소 한 가지 백신 어쥬번트를 추가 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  50. 제 49 항에 있어서, 어쥬번트는 알룸(alum), MF59, 사포닌, MAPL2로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
  51. 개체에서 인플루엔자 A 감염에 대한 보호성 면역 반응을 유도하는 방법에 있어서,
    항-인플루엔자 A 백신 조성물의 효과량을 개체에 투여하는 단계를 포함하며, 투여로 개체에의해 세포 면역 반응을 자극하거나 항원 특이적 항체 생산을 자극할 수 있어 보호성 면역 반응을 유도하며;
    이때 백신 조성물은 열안정성 단백질에 융합된 인플루엔자 A 일체형 막 단백질의 성분을 포함하며;
    일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA)의 도메인, 뉴라미니다제(NA)의 도메인 및 M2의 도메인으로 구성된 집단에서 선택된 최소 한가지 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  52. 제 51 항에 있어서 조성물은 경구, 비강, 복막, 정맥, 피하, 또는 근육을 통하여 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  53. 제 52 항에 있어서, 조성물은 개체에 식용 식물 세포를 통하여 경구 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  54. 제 51 항에 있어서 개체는 사람인 것을 특징으로 하는 방법.
  55. 제 51 항에 있어서, 개체는 새, 돼지 및 말에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  56. 열안정성에 융합된 인플루엔자 A 일체형 막 단백질을 포함하는 항원 단백질 을 생산하는 방법에 있어서,
    a. 열안정성 단백질에 융합된 인플루엔자 A 일체형 막 단백질의 성분으로 구성된 항원을 인코드하는 핵산 구조체를 준비하고
    b. 세포내로 핵산을 도입시키고
    c. 항원 단백질의 발현에 적절한 조건하에 세포를 배양하여 항원 단백질을 생산하는 단계로 구성되고,
    이때 일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA)의 도메인 및 뉴라미니다제(NA)의 도메인에서 선택된 최소 한가지 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제 56 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 최소 한가지 헤마토글루티닌(HA) 도메인을 포함하는데, 이때 도메인은 SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.:3, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 33, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 20 및 SEQ ID No.: 24에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제 56 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 최소 한가지 뉴라미니다제(NA)도메인을 포함하는데, 이때 도메인은 SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.: 16 및 SEQ ID No.: 18에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 제 56 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 SEQ ID No.: 1 또는 SEQ ID No.:3에서 선택된 전장(full length) 헤마토글루티닌(HA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제 56 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 SEQ ID No.: 2 또는 SEQ ID No.:4에서 선택된 전장(full length) 뉴라미니다제(NA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제 56 항에 있어서, 열안정성 단백질은 변형된 리체나제 단백질 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제 62 항에 있어서, 리체나제 코딩 서열은 식물에서 단백질 발현을 위해 최적화된 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제 61 항에 있어서, 리체나제 단백질 서열은 리체나제의 N-말단 도메인, C-말단 도메인, 표면 루프 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제 61 항에 있어서, 리체나제에 융합된 일체형 막 단백질 성분은 N0말단 융합체, C-말단 융합체 또는 표면 루프 삽입 융합 단백질중 임의의 하나 인 것을 특징으로 하는 방법.
  65. 제 56 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA)의 도메인 및 뉴라미니다제(NA)의 도메인으로 구성된 군에서 선택된 최소 두 개 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  66. 제 56 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA)의 도메인 및 뉴라미니다제(NA)의 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  67. 제 56 항에 있어서, 항원 단백질 발현은 바이러스 프로모터의 제어하에 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  68. 제 56 항에 있어서, 핵산 구조체는 벡터 핵산 서열을 추가 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  69. 제 68 항에 있어서, 벡터는 바이너리(binary) 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  70. 제 56 항에 있어서, 핵산 구조체는 바이러스 단백질을 인코드하는 서열을 추가 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  71. 제 56 항에 있어서, 세포는 식물 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  72. 제 71 항에 있어서, 식물 세포는 알파파, 무, 머스타드, 녹두, 브로콜리, 물냉이, 소이빈, 밀, 해바라기, 양배추, 클로버, 페튜니아, 감자, 토마토, 담배, 시금치, 렌즈콩 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  73. 제 56 항에 있어서, 항원 단백질은 클론 뿌리 세포에서 만들어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  74. 제 56 항에 있어서, 항원 단백질은 발아된 묘목(sprouted seedlings)에서 만들어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  75. 제 56 항에 있어서, 만들어진 부분적으로 정제된 또는 정제된 항원 단백질을 회수하는 단계가 추가 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
  76. 열안정성 단백질에 융합된 인플루엔자 A 일체형 막 단백질의 성분을 인코드하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 핵산 구조체에 있어서, 이때 일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌(HA) 의 도메인 및 뉴라미니다제(NA)의 도메인으로 구성된 군에서 선택된 최소 한가지 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  77. 제 76 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 최소 한가지 헤마토글루티닌(HA) 도메인을 포함하는데, 이때 도메인은 SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.:3, SEQ ID No.: 7, SEQ ID No.: 8, SEQ ID No.: 33, SEQ ID No.: 11, SEQ ID No.: 12, SEQ ID No.: 13, SEQ ID No.: 20 및 SEQ ID No.: 24에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  78. 제 76 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 최소 한가지 뉴라미니다제(NA)도메인을 포함하는데, 이때 도메인은 SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.:4, SEQ ID No.: 16 및 SEQ ID No.: 18에서 선택되는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  79. 제 76 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 헤마토글루티닌의 최소 한가지 도메인을 포함하는데, 이때 일체형 막 단백질은 SEQ ID No.: 1 또는 SEQ ID No.:3에서 선택된 전장(full length) 헤마토글루티닌(HA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  80. 제 76 항에 있어서, 일체형 막 단백질 성분은 뉴라미니다제의 최소 한가지 도메인을 포함하는데, 이때 SEQ ID No.: 2 또는 SEQ ID No.:4에서 선택된 전장(full length) 뉴라미니다제(NA)을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  81. 제 76 항에 있어서, 일체형 막 성분은 헤마토글루티닌의 최소 한가지 도메인 을 포함하고, 열안정성 단백질은 변형된 리체나제 단백질 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  82. 제 76 항에 있어서,일체형 막 성분은 헤마토글루티닌의 최소 한가지 도메인을 포함하고, 리체나제 코딩 서열은 식물에서 단백질 발현을 위해 최적화된 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  83. 제 76 항에 있어서, 일체형 막 성분은 헤마토글루티닌의 최소 한가지 도메인을 포함하고, 리체나제 단백질 서열은 리체나제의 N-말단 도메인, C-말단 도메인, 표면 루프 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  84. 제 76 항에 있어서, 일체형 막 성분은 헤마토글루티닌의 최소 한가지 도메인을 포함하고, 이때 리체나제에 융합된 일체형 막 단백질은 리체나제의 N-말단 도메인, C-말단 도메인, 표면 루프 삽입 융합 단백질을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  85. 제 76 항에 있어서, 일체형 막 성분은 헤마토글루티닌의 최소 한가지 도메인을 포함하고, 이때 일체형 막 단백질은 헤마토글루티닌(HA)의 도메인 및 뉴라미니다제(NA)의 도메인에서 선택된 최소 두 가지 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  86. 제 85 항에 있어서, 일체형 막 단백질은 최소 한가지 헤마토글루티닌(HA)의 도메인 및 최소 한가지 뉴라미니다제(NA)의 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  87. 제 76 항에 있어서, 벡터 핵산 서열을 추가 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  88. 제 85 항에 있어서, 바이러스 프로모터 핵산 서열을 추가 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  89. 제 87 항에 있어서, 벡터는 바이너리 벡터인 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  90. 제 76 항에 있어서, 바이러스 단백질을 인코드하는 핵산 서열을 추가 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 구조체.
  91. 제 76 항의 핵산 구조체를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  92. 제 91 항에 있어서, 식물 세포인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  93. 제 91 항에 있어서, 식물 세포는 알파파, 무, 머스타드, 녹두, 브로콜리, 물냉이, 소이빈, 밀, 해바라기, 양배추, 클로버, 페튜니아, 감자, 토마토, 담배, 시금치, 렌즈콩 세포로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식물.
  94. 제 91 항에 있어서, 식물은 브라시카 속(Brassica genus), 니코타나 속(Nicotana genus) 및 페투니아 속(Petunia genus)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 식물.
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