TWI620816B - 植物衍生蛋白回收方法 - Google Patents

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    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation

Abstract

提供回收植物衍生蛋白質或表層結構蛋白質的方法。該方法可包含獲得包含含有位於質外體蛋白質或表層結構蛋白質的植物或植物物質、鬆動細胞壁以產生具有鬆動細胞壁之植物或植物物質，從而允許質外體內容物經由細胞壁釋放以產生來自植物或植物物質之質外體內容物部分，以及回收質外體內容物部分。該質外體內容物部分包含植物衍生蛋白質或表層結構蛋白質。

Description

植物衍生蛋白回收方法
本發明相關於植物衍生蛋白質回收方法。更具體地，本發明係提供從植物與植物組織獲得包括蛋白質表層結構(suprastructure)之蛋白質的方法。
現今在宿主細胞(例如E.coli、昆蟲細胞培養物以及哺乳動物細胞培養物)的重組表現策略在培養基中表現並分泌極高量的蛋白質。使用這些系統，大量表現、適當的蛋白質折疊以及蛋白質的轉譯後修飾被實現。此外，由於細胞內蛋白質可容易地由其他組成物(DNA、囊泡、膜、色素等等)中分離，簡化了所表現的蛋白質的純化。對於植物或酵母菌表現系統而言，細胞壁阻止所表現的蛋白質分泌至培養基中。
不同的方法在科學上被廣泛地使用來生成細胞萃取物。破壞細胞壁與釋放其內容物的機械性方法對某些類別的蛋白質或細胞組成物通常是不具選擇性的。導引感興趣之蛋白質的表現至細胞培養基、使細胞內汙染物經由離心或過濾來移除，則容許感興趣之蛋白質的簡單且快速的增濃。在將感興趣之蛋白質或蛋白質表層結構用於疫苗配方之前，從存在於植物或植物物質中的蛋白質、DNA、膜片段、囊泡、色素、碳水化合物等等的一些或全部中分離出感興趣之蛋白質或蛋白質表層結構(包括蛋白質叢生物(protein rosette)、奈米顆粒、大型蛋白質複合物、抗體或類病毒顆粒(VLP)以及諸如此類)亦可能是想要的。
免疫球蛋白(IgGs)為對各種性質之特定致原性配對物具有特徵親和性的複合雜多聚體蛋白質。今日，生產IgG細胞株的例行分離以及IgG導向的演化與分子工程技術的來臨已經以生物療法與在一般生物科學市場深刻地影響了它們的演化。治療性的單株IgG(單株抗體，mAb)主宰了目前新抗發炎與抗癌藥物的市場，並且數百個新的候選物目前處於改良或新應用之研究與臨床發展中。對mAb的每年市場需求從數公克(診斷)、數公斤(抗毒素)而至一或數百公斤(生物性防禦、抗癌、抗感染、抗發炎)的範圍。從植物中生產經修飾的醣蛋白之方法描述於WO 2008/151440(其以引用的方式併入本文)。
從植物的細胞間隙萃取蛋白質的方法係描述於PCT公開案WO 00/09725(予Turpen et al.)，其包含真空與離心步驟，以提供包含感興趣之蛋白質的間隙流體萃取物。此方法適合用於經真空與離心下通過微纖維(microfiber)之網狀結構的小型蛋白質(50kDa或更小的)，但不適合用於較大型蛋白質、超結構蛋白質、蛋白質叢生物、奈米顆粒、大型蛋白質複合物，例如抗體或VLP。
McCormick et al 1999(Proc Natl Acad Sci USA 96：703-708)揭露了融合至單鏈Fv(scFv)抗原決定區的稻米澱粉酶信號胜肽，以將所表現之蛋白質靶向至細胞外間隔，接著由葉與莖組織之真空滲透來供scFv多肽回收之用途。Moehnke et al.,2008(Biotechnol Lett 30：1259-1264)描述McCormick的真空滲透方法之用途，其使用質外體萃取(apoplastic extraction)以從煙草獲得重組植物過敏原。PCT公開號WO 2003/025124(予Zhang et al.)揭露了植物中scFv免疫球蛋白的表現、使用鼠信號序列來靶向至質外體間隙。
可採用類病毒顆粒(VLP)以製備疫苗，例如像是流感疫苗。表層結構(例如VLP)仿效了病毒殼體結構但缺乏基因組，因而無法複製或提供二次感染的工具。VLP對用於刺激一強烈免疫反應之分離(可溶的)重 組抗原提供了改良的替代方案。VLP於特定病毒蛋白質表現時被組裝並且呈現相似於其同源病毒的外表面，但不像真實的病毒顆粒，VLP沒有併入遺傳物質。在與原生病毒相似的微粒與多價結構中之抗原的呈現實現了具有平衡的體液與細胞組成物之免疫反應的增強刺激。當被膜VLP於其天然膜結合狀態下呈現表面抗原時，對由分離抗原之刺激的此類改良對外膜病毒而言被認為是特別真實的(Grgacic and Anderson,2006,Methods 40,60-65)。此外，具有其奈米顆粒組織的流感VLP已顯示為相較於重組血球凝集素HA(即，單體HA或組織至叢生物的HA；HA的3-8個三聚體的組裝)更好的疫苗候選物，並且它們可活化體液性免疫與細胞性免疫反應兩者(Bright,R.A.,et.al.,.2007,Vaccine 25,3871-3878)。
含有脂質被膜的流感HA VLP的生產先前已被WO 2009/009876與WO 2009/076778中的發明人描述(予D’Aoust et al.；將其兩者以引用的方式併入本文)。對於被膜病毒而言，脂質層或膜被病毒保留下來可能是有利的。脂質的組成分可隨著系統而改變(例如植物生產的被膜病毒在被膜中將包括植物脂質或植物固醇)，並且可對改善的免疫反應有貢獻。
在表現HBV表面抗原(HBsAg)之基因轉殖煙草中的被膜VLP之組裝係由Mason et al.描述(1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,11745-11749)。當非口服給藥時，植物生產的HBV VLP在小鼠中被顯示出來誘導強而有力的B-與T-細胞免疫反應(Huang et al.,2005,Vaccine 23,1851-1858)，但經由餵食研究的口服免疫僅誘發適度的免疫反應(Smith et al.,2003,Vaccine 21,4011-4021)。Greco(2007,Vaccine 25,8228-8240)顯示出，當在基因轉殖煙草與阿拉伯芥(Arabidopsis)中表現時，與HBsAg融合之人類免疫缺乏病毒(human immunodeficiency virus,HIV)抗原決定區以VLP累積，而創造出二價的VLP疫苗。
在基因轉殖煙草以及馬鈴薯植株中病毒殼體蛋白質 (NVCP)的表現導致了非被膜VLP的組裝(Mason et al.,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93,5335-5340)。NVCP VLP已於農桿菌滲透之菸草(N.benthamiana)葉片中生產(Huang et al.2009,Biotechnol.Bioeng.103,706-714)並且於小鼠中證實於口服給藥時其致原性(Santi et al.,2008,Vaccine 26,1846-1854)。以2或3劑包含215-751μg的NVCP的生馬鈴薯以VLP的形式給藥予健康成人志願者造成95%使免疫的志願者免疫反應的發展(Tacket et al.2000,J.Infect.Dis.182,302-305)。非被膜的VLP亦已由HBV核心抗原(HBV core antigen,HBcAg；Huang et al.,2009,Biotechnol.Bioeng.103,706-714)以及人類乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus,HPV)主要殼體蛋白質L1(Varsani et al.,2003,Arch.Virol.148,1771-1786)的表現而獲得。
一個較簡單的蛋白質或蛋白質表層結構生產系統，舉例來說，依賴僅一或數個蛋白質的表現是想要的。在植物系統中，蛋白質或蛋白質表層結構(例如但不限於蛋白質叢生物、奈米顆粒、大型蛋白質複合物，例如抗體或VLP)的生產是有利的，其在於可將植物種植於溫室或田野中，並且不需要無菌組織培養方法及處理。
大體上免除或輕易地自植物蛋白質分離而仍保持蛋白質或蛋白質表層結構之結構與特徵的回收蛋白質或蛋白質表層結構方法是渴望的。
本發明關於回收植物衍生蛋白質的方法。更具體地，本發明提供從植物與植物組織中回收蛋白質(包括蛋白質表層結構)的方法。
本發明的目的係提供一種回收植物衍生蛋白質的改良方法。
本發明提供一種製備植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質的方法(A)，包含獲得位於質外體內含有植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質的植物或植物物質；處理植物或植物物質以鬆動細胞壁以 產生質外體內容物部分以及植物細胞部分，質外體內容物部分包含植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質；以及回收質外體內容物部分。該方法可進一步包含從質外體內容物部分純化植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質的步驟。該植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質可為嵌合植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質。該植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質與該植物可為異源性的。植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質可包括蛋白質叢生物、蛋白質複合物、蛋白酶體、蛻變中間物質(metabolon)、轉錄複合物、重組複合物、光合成複合物、膜運輸複合物、核孔複合物、蛋白質奈米顆粒、醣蛋白、抗體、多株抗體、單株抗體、單鏈單株抗體、類病毒顆粒(VLP)、病毒被膜蛋白質、病毒結構蛋白質、病毒殼體蛋白質以及病毒外殼蛋白質、嵌合蛋白質、嵌合蛋白質複合物、嵌合蛋白質奈米顆粒、嵌合醣蛋白、嵌合抗體、嵌合單株抗體、嵌合單鏈單株抗體、嵌合血球凝集素、病毒被膜蛋白質、病毒結構蛋白質、病毒殼體蛋白質以及病毒外殼蛋白質。植物衍生單株抗體可包含嵌合小鼠人類單株抗體，舉例來說但不限於C2B8。植物衍生VLP可包含流感血球凝集素。
質外體內容物部分與細胞部分可經由化學地、酵素地、物理地或其組合來處理植物或植物物質而產生。舉例來說植物或植物物質可以細胞壁鬆動組成物來處理。細胞壁鬆動組成物可包含一或多於一個選自螫合劑、羥基自由基、吲哚-3-乙酸、擴張蛋白、果膠酶、纖維素酶、脂肪酶、蛋白酶以及其組合的化合物。如同技術人員將了解的，纖維素酶為酵素的混合物並可包括一或更多內-1,4-β-聚葡萄糖酶、外切纖維水解酶(外纖維素酶，exocellualse)、β-葡萄糖苷酶、纖維雙醣去氫酶(氧化纖維素酶)、纖維素磷酸解酶以及半纖維素酶。
此外，質外體內容物部分以及細胞部分可經由以壓力或真空滲透作用而將細胞壁鬆動組成物滲透至植物或植物物質中而產生。更具體 地，細胞壁鬆動組成物可包含一或更多酵素，例如一或多於一個果膠酶、一或多於一個纖維素酶，或一或多於一個果膠酶以及一或多於一個纖維素酶。因此，質外體內容物部分與細胞部分可經由例如酵素滲透作用(enzymatic infiltration)而產生。
質外體內容物部分以及細胞部分亦可經由以音波振動處理(sonication)或以與音波振動處理結合之細胞壁鬆動組成物來處理植物或植物物質而產生。
植物或植物物質可經由種植、收成、或種植與收成植物而獲得。植物物質可包含植物的一些或全部、一或多於一個植物細胞、葉片、莖、根或培養的植物細胞。
本發明提供一種製備植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質的方法，如上所述，其中將編碼植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質的核酸以暫時的方式引入至植物中。替代地，核酸為穩定地合併至植物的基因組中。
本發明亦提供一種製備植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質的方法，如上所述，進一步包含從質外體內容物部分純化植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質的步驟。純化步驟可包含使用深度過濾(depth filtration)來過濾質外體內容物部分，以產生澄清的萃取物，接著使用陽離子交換樹脂(cation exchange resin)、親和層析法(affinity chromatography)、尺寸排除層析法(size exclusion chromatography)或其組合來層析澄清萃取物。
不希望被理論所約束，由質外體內容物部分所獲得的蛋白質為更均質的，如同轉譯後修飾之蛋白質或包含發生於各種細胞內隔間(例如粒線體、葉綠體以及未共同萃取出的其他胞器)中其他處理類型之蛋白質的中間產物形式。重組蛋白質更高的均質程度典型地造成包含該蛋白質之製備物的更佳品質，並且可造成具有有利特性的產物，有利特性包括更 高效力、更長半衰期或更好的致原能力。舉例來說，含有高甘露糖(mannose)醣化作用的血蛋白在血液循環中較含有複雜的醣化作用之蛋白質更快速地被消除。在質外體內容物部分產生的醣化蛋白質顯示出更複雜形式的醣化作用。因此，使用描述於本文，涉及細胞壁鬆動的方法所製備的蛋白質，其顯示出例如在循環中更佳的半衰期。
植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質可包括蛋白質叢生物、蛋白質複合物、蛋白質奈米顆粒、抗體、單株抗體、VLP。VLP可包含一或更多流感HA多胜肽。表層結構蛋白質可以是嵌合表層結構蛋白質，舉例來說，單株抗體可以是嵌合單株抗體，或流感HA多胜肽可以是嵌合HA多胜肽。若表層結構蛋白質為VLP，那麼植物衍生的VLP可進一步含有血球凝集活性。植物或植物物質可由種植、收成或種植與收成植物而獲得。植物物質可包含植物的一些或全部，或一或多於一種植物細胞、葉片、莖、根或培養的細胞。
本發明亦提供一種製備植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質的方法(B)，其包含獲得含有植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質之植物或植物物質、使用細胞壁鬆動組成物、音波振動處理或其組合來處理植物物質，以產生植物細胞部分與質外體內容物部分，並且過濾該質外體內容物部分以產生過濾部分並從過濾部分回收植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質。
不希望被理論所約束，包含植物衍生脂質之植物產出的VLP較於其他製造系統中產出的VLP可誘發更強烈的免疫反應，並且當與由活的或減毒的全病毒疫苗所誘發的免疫反應相較，比由這些植物產出之VLP所誘發的免疫反應更為強烈。
從宿主細胞獲得的蛋白質萃取物之組成物是複雜的並且典型地包含具有要被分離的感興趣之蛋白質或表層結構的細胞間與細胞內組成物。質外體內容物部分的製備，接著將細胞壁組成物與細胞內蛋白質與 組成物一起分離的步驟是有利的，因為感興趣之蛋白質或表層結構可被增濃並且在製造過程中增加效率。具有較簡單的程序、含有較少的有效率步驟可造成顯著的產量增加以及費用降低。亦已發現當與涉及消化細胞壁的方法(例如，如同在PCT/CA2010/001489或PCT/CA2010/001488中所描述的)相較時，鬆動細胞壁的步驟獲得相似的或增加的表層結構蛋白質產量。不希望被理論所約束，鬆動細胞壁的步驟可鬆動細胞壁的聚合組成物並協助同樣地結合於細胞壁內的蛋白質或表層結構蛋白質的釋出。此方案亦可最小化在細胞內組成物內的蛋白質或表層結構蛋白質的汙染。
當相較於涉及均質化、混合與研磨之製備植物衍生表層結構蛋白質的方法時，本文所描述的方法造成較少的植物衍生表層結構蛋白質萃取物的分解及汙染。本文描述的方法提供植物組織的質外體內容物部分，同時保持原生質體與其組成物的完整性。即使原生質體，或原生質體的一部分喪失其完整性並且不再完好，如同本文所描述之方法在純化蛋白質或表層結構蛋白質方面是有效率的。
當與涉及標準組織分解技術(舉例來說，均質化、混合或攪拌)的表層結構蛋白質萃取方法比較時，這些方法提供了較高的蛋白質或表層結構蛋白質的產量。較高的產量可能部分地由於破壞蛋白質或表層結構蛋白質的結構完整性破裂之剪力的降低，以及在VLP的例子中為脂質被膜。從質外體內容物部分的蛋白質或表層結構蛋白質之製備可能是有利的，因為質外體內容物部分顯著地降低或無細胞質蛋白質。因此，在質外體內容物部分中從其他蛋白質與物質(包括單體、二聚體、三聚體或表層結構蛋白質的片段)中的表層結構蛋白質之分離是容易地被進行。然而，蛋白質或表層結構蛋白質所增加的產量亦可使用本文描述的方法而獲得，即使原生質體製備或一部分的原生質體製備不是完整的。
醣蛋白，包括表層結構醣蛋白，例如被分泌至質外體的單株抗體，相較於未鬆動細胞壁的萃取方法(例如攪拌均質器萃取的植物)，前 者包含較高百分比的已完成其成熟與包含末端N-乙醯葡萄糖胺或半乳糖殘基(複合N-聚醣)的N-聚醣。包含複合N聚糖的表層結構醣蛋白(舉例來說單株抗體)與包含末端甘露糖殘基(未成熟的N聚醣)的單株抗體相較，前者已被發現在血流中表現增加的半衰期之有利特性。
經由鬆動細胞壁，釋放一群含有完成其成熟的N-聚醣的質外體抗體可能是有可能的。此萃取方法可容許增濃族群或帶有複合N-聚醣之醣化抗體的同源族群之回收，分離在原生質體部分中醣化抗體的不成熟形式。若需要這群帶有不成熟N-聚醣的抗體，可保留原生質體部分並且將抗體從原生質體部分中純化。
本發明之VLP亦以比使用標準組織破裂技術所獲得者表現更大的血球凝集活性為特徵。此改良的血球凝集活性可歸因於更大產量的完整VLP(在溶液中較少游離的HA單體或沒有三聚體)、更大產量的帶有完整脂質被膜的完整VLP或其組合。
當相較於以全病毒製造的疫苗時，使用VLP製造的疫苗提供了它們為非感染性的優點。因此，生物性汙染不是問題並且對生產而言並不需要。植物製造的VLP提供了進一步的優點，其容許要被種植於溫室或田野的表現系統，因此顯著地更為經濟並且適於擴大產量。
此外，植物不包含涉及將合成與增加唾液酸殘基至蛋白質的酵素。VLP可在缺乏神經胺糖酸苷酶(NA)下產生，並且不需要共同表現NA或以唾液酸酶(神經胺糖酸苷酶)處理生產細胞或萃取物，以確保VLP在植物中的生產。
此發明摘要不必描述本發明的所有特徵。
本發明的這些與其他特徵將由下列描述而變得更明顯，其中以所附圖式作為參考，其中： 第1圖顯示用於H5 A/印尼/5/05血球凝集素之表現的以CPMVHT為基礎之表現卡匣(構築體685)示意圖。
第2圖顯示A)用於表現H5/Indo(構築體編號685)的由PacI(35S啟動子的上游)至AscI(緊接著NOS終止子的下游)之部分構築體的核酸序列(SEQ ID NO.1)。來自A/印尼/5/2005的H5編碼序列加底線。第2B圖顯示由構築體標號685所編碼的H5 A/印尼/5/05血球凝集素之胺基酸序列(SEQ ID NO.2)。
第3圖顯示經由尺寸排除層析(SEC)之含有血球凝集素(HA)之結構的特徵。在消化的植物萃取物離心之後，將團粒重新懸浮並經由SEC分餾。第3A圖顯示每分餾物中總可溶蛋白質含量(實心三角形；最大%，左側Y軸；使用Bradford方法測定)。亦顯示所收集的分離物之血球凝集活性(實心柱狀；右側Y軸)。第3B圖顯示SEC溶析餾分的SDS-PAGE分析。將餾分經由丙酮沉澱並在分析之前重新懸浮於1/40體積之還原樣品裝載緩衝液。以0.1%考馬斯R-250(Coomassie R-250)溶液染色膠體。操作純化的VLP作為對照組。對應於HA0單體的條帶以箭頭表示。MW-分子量標準品(kDa)；C-純化的VLP(對照組)；第7道到第10道與第14道到第16道對應於顯示於第3A圖來自SEC分析的餾分編號。
第4圖顯示在酵素消化作用以及經由使用ComitrolTM均質機的機械性均質作用後所獲得的蛋白質概況。於變性樣本裝載緩衝液中處理樣本並將蛋白質以SDS-PAGE分析的溶析餾分而分離。以0.1%考馬斯R-250溶液染色膠體。MW-分子量標準品(kDa)；第1道-25μl酵素混合物；第2道-25μl植物組織的酵素消化作用以及第3道-5μl以Comitrol均質機獲得之萃取物。
第5圖顯示包含苜蓿草質體藍素(alfalfa plastocyanin)啟動子與5’UTR、來自A/印尼/5/2005(構築體#660)之H5血球凝集素編碼序列、苜蓿草質體藍素3’UTR與終止子序列的HA表現卡匣之核酸序列(SEQ ID NO：9)。
第6圖顯示於質外體餾分直接由HA-VLP分離，在陽離子交換樹脂上獲得HA-VLP。將樣本於非還原的、變性樣本裝載緩衝液中處理，並且將蛋白質經由SDS-PAGE分離。將膠體以0.1%考馬斯R-250溶液染色。第1道：在離心後的質外體餾分，第2-3道：在連續的微過濾後之質外體餾分；第4道：陽離子交換之裝載；第5道：陽離子交換的流過餾分。第6道：來自陽離子交換、濃縮10倍的溶析物；第7道：分子量標準品(kDa)。
第7圖顯示H5/Indo VLP(第7A圖)與未加入NaCl至消化緩衝液之澄清後的H1/Cal VLP(第7B圖)以及以NaCl加入的澄清後之H1/Cal VLP(第7C圖)的奈米顆粒跟蹤分析(Nanoparticle Tracking analysis,NTA)概況。NTA實驗係以NanoSight LM20(NanoSight,Amesbury,UK)進行。該儀器配備有藍色雷射(405nm)、樣本腔室與Viton氟橡膠O形環。於室溫下錄製影像並使用NTA 2.0軟體分析。錄製樣本60秒。手動選擇快門與增益值使得獲得最佳顆粒解析度。
第8圖顯示以使用不同緩衝液之酵素消化作用所生成的H3/布里斯班VLP萃取物之西方墨點法。第1道)純化的重組HA標準品(5μg，來自Immune Technology Corp.IT-003-0042p，第2至5道包含在下列緩衝液中操作的7μl離心酵素萃取物：第2道)600mM甘露糖醇+125mM檸檬酸鹽+75mM NaPO4+25mM EDTA+0.04%亞硫酸氫鹽pH 6.2、第3道)600mM甘露糖醇+125mM檸檬酸鹽+75mM NaPO4+50mM EDTA+0.04%亞硫酸氫鹽pH 6.2、第4道)200mM甘露糖醇+125mM檸檬酸鹽+75mM NaPO4+25mM EDTA+0.03%亞硫酸氫鹽pH 6.2、第5道)200mM甘露糖醇+125mM檸檬酸鹽+75mM NaPO4+50mM EDTA+0.03%亞硫酸氫鹽pH 6.2。箭頭代表HA0的免疫偵測訊號。
第9圖顯示為構築體#590(LC片段)的組裝所合成之DNA片段的序列(SEQ ID NO.15)。
第10圖顯示為構築體#592(HC片段)的組裝所合成之DNA片段的序列(SEQ ID NO.16)。
第11A圖與第11B圖分別顯示構築體#595(第11A圖)與#R472(第11B圖)之示意圖。
第12圖由以機械性破裂(攪拌均質器萃取)與細胞壁酵素消化作用所產生的萃取物純化之抗體SDS-PAGE的比較。對於每個萃取方法，兩批次被獨立地處理並純化。
第13A圖顯示由以機械性破裂(攪拌均質器萃取)與細胞壁酵素消化作用所純化之C2B8的寡聚甘露醣苷N-聚醣比例之比較。第13B圖顯示由以機械性破裂(攪拌均質器萃取)與細胞壁酵素消化作用所純化之C2B8的複合N-聚醣比例之比較。
第14A圖顯示植物細胞壁的模式(共價交聯模式)。在此模式中，細胞壁基質聚合物(木葡聚糖、果膠以及醣蛋白)係共價地聯結至另一者。木葡聚糖結合至纖維素微原纖維造成提供壁面張力強度的非共價交聯纖維素-半纖維素網狀結構。第14B圖顯示植物細胞壁的替代模式(繫鍊模式)。在此模式中，木葡聚糖分子以氫鍵鍵結至並且交聯纖維素微原纖維。纖維素-木葡聚糖網狀結構被嚙合於非共價交聯的果膠網狀結構中。第14C圖顯示植物細胞壁的另一替代模式(擴散層模式)。在此模式中，木葡聚糖分子以氫鍵鍵結至纖維素微原纖維的表面但不直接與它們交聯。緊密鍵結的木葡聚糖係以一層較不緊密鍵結的多醣環繞。纖維素與木葡聚糖係嵌於果膠基質中。第14D圖顯示植物細胞壁的替代模式(分層模式)。在此模式中，木葡聚糖分子以氫鍵鍵結至並且交聯纖維素微原纖維。纖維素-木葡聚糖層狀組織係以果膠多糖組織層分離。
第15圖顯示於使用或不使用細胞壁解聚合作用酵素下，以含有EDTA的緩衝液之植物處理時釋放的蛋白質。第15A圖使用Bradford分析來測量蛋白質濃度。第15B圖以可對凝集紅血球細胞萃取的蛋白質最低量之 反向來表示HA活性。
第16A圖顯示從已被酵素溶液/消化溶液(見範例16)滲透之葉片4小時(時間0.25t)後，相較於已於相同酵素溶液/消化溶液中浸泡且搖動16小時的葉片(時間t)之所釋出的蛋白質。第16B圖顯示從以酵素溶液/消化溶液滲透的整個植物/葉片，相較於以相同的酵素溶液/消化溶液滲透的切葉之所釋出的蛋白質。第16C圖顯示於使用或不使用Multifect CXCG與Multifect CX B(Genencor)的使用下，以一或多於一種果膠酶(舉例來說，生物催化劑162L及/或444L)處理整個葉片時所釋出的蛋白質。此外，顯示出以生物催化劑PDN33處理整個葉片時所釋出的蛋白質。第16D圖顯示出以pH 5.8、pH 6.0或pH 6.2緩衝液處理整個葉片5天後或以農桿菌滲透法並以各種pH 6.2或pH 6.5緩衝液處理整個葉片7天後所釋出的蛋白質。
本發明相關於回收植物衍生蛋白質的方法。更具體地，本發明提供從植物與植物組織回收蛋白質或蛋白質表層結構的方法。
下列描述為優選具體實施例。
本發明提供一種用於回收感興趣之植物衍生蛋白質或蛋白質表層結構的方法。感興趣之蛋白質可能存在於質外體或細胞外間隔，與除了原生質體/原生質球狀體間隔之外的植物細胞部分相對應。該方法涉及鬆動細胞壁，舉例來說在細胞壁內以降解、部分地降解、切割、部分地切割或以其他結構上地改變細胞壁聚合組成物以及其相關連結而破壞細胞壁聚合物內或之間的分子間非共價或共價的鍵結。該方法可能，或可能不涉及原生質體或原生質球狀體從植物細胞的釋出。
「原生質體」一詞係意指其細胞壁已完全地或顯著地移除，例如細胞壁從約50%至約100%或介於其間的任何量可能被移除之植物細胞。舉例來說，細胞壁從約50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、 100%或介於其間的任何量。原生質球狀體可具有部分移除的細胞壁，舉例來說細胞壁從約10%至約49%，或介於其間的任何量可能被移除。舉例來說，細胞壁從約10、15、20、25、30、35、40、45、49%或介於其間的任何量可能被移除。
「質外體」為包含介於細胞膜與細胞壁之間的植物細胞部分，並且包括植物的細胞壁與細胞間隙。雖然在消化作用與進一步的處理期間維持原生質體(及/或原生質球狀體)的完整性是優選的，原生質體保持完好以增濃如同本文所述的蛋白質或表層結構蛋白質是不需要的。優選地，原生質體或原生質球狀體的細胞膜尚未被降解、部分地降解、切割、部分地切割或以其他結構上改變、鬆動或改變其完整性，但，舉例來說，細胞膜的大約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95%，或介於其間的任何量可能被降解、切割、結構上改變、鬆動或移除。
「細胞壁」一詞意指生成植物細胞的外層細胞隔間之結構，並且位於細胞膜外側，與質外體交界。不被理論所約束地，細胞壁被認為以聚合物基質(例如經由半纖維素繫帶連結的纖維素微原纖維)所製造，以形成嵌於果膠基質的纖維素-半纖維素網狀結構(見第14A-14D圖之植物細胞壁的數個非限制性模式)。細胞壁組成物可包括，作為非限制性範例，多醣、纖維素、半纖維素(例如聚木糖、木葡聚糖、葡萄糖醛酸木聚糖，阿拉伯木聚糖、葡萄糖醛酸阿拉伯木聚糖、甘露聚糖、葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖、半乳葡甘露聚糖)、果膠(例如同型半乳糖醛酸聚糖、鼠李半乳醛酸聚糖I、鼠李半乳醛酸聚糖II、寡聚半乳糖醛酸苷、取代的半乳糖醛酸聚糖、木半乳糖醛酸聚糖、洋芹半乳糖醛酸聚糖)、聚合體、木質素、角質、木栓質、醣蛋白、富含羥脯胺酸醣蛋白、阿拉伯半乳聚糖蛋白質、富含甘胺酸蛋白質、富含脯胺酸蛋白質、伸展蛋白、擴張蛋白、礦物質、鈣、果膠酸鈣、鎂、果膠酸鎂、硼酸鹽、酚酯、阿魏酸、香豆酸。
結構上，細胞壁組成物，特別是嵌於果膠基質形式的纖維素-半纖維素網狀結構有助於細胞壁的半通透性。在生理環境下，細胞壁正常地容許小分子經由細胞壁組成物所形成之網眼通過。鬆動細胞壁涉及了細胞壁組成物與另一者交互作用的鬆動，並且直接或間接地造成網眼的擴大或拉伸，因而容許比正常會被容許通過細胞壁的那些分子還要大的分子通過。經由鬆動細胞壁的大分子的通過可以由作用於小分子正常通過無鬆動的細胞壁之力量促進，像是例如膨壓、滲透壓與流體靜壓(hydrostatic pressure)。本方法可包括化學製品或生物性試劑的使用，其將作用於一或更多的那些力量以進一步促進大分子的通過。
「細胞壁鬆動」是指造成細胞壁結構改變的細胞壁之修飾，其可造成壁張力的鬆弛、壁應力的鬆弛、不可逆的壁延伸(壁蠕變)或細胞壁的一或更多組成物部分或完全地降解。舉例來說，且不希望被理論所約束，細胞壁鬆動可因破壞細胞壁中各種組成物間的鍵結的結果而發生，例如細胞壁中的載荷鍵(load-bearing bond)。結構的改變可例如經由切割、部分切割、降解或部分降解細胞壁組成物、破壞細胞壁組成物內或其間的分子間非共價或共價鍵或弱化細胞壁的其他修飾、破壞細胞壁基質或其組合而發生。鬆動可發生於壁的局部區域，於細胞壁內之標的組成物，或者鬆動一般可分散於整個細胞壁。細胞壁鬆動，舉例來說，可發生於植物細胞的物理處理，例如音波振動處理、化學、酵素、以細胞壁鬆動組成物的化學與酵素兩者之處理，或音波振動處理與以細胞壁鬆動組成物的處理之組合，或滲透(使用真空或壓力)與以細胞壁鬆動組成物的處理之組合。細胞壁的鬆動可造成細胞壁的部分消化。經歷鬆動細胞壁的處理之植物細胞仍可能包含修飾形式的植物細胞壁或部分植物細胞壁。進一步地，細胞壁的鬆動可包括細胞壁的部分降解或移除，例如由0%至約60%或介於其間的任何量的細胞壁被部分降解或移除、由0%至約30%或介於其間的任何量的細胞壁被部分降解或移除，或由0、5、10、15、20、25、30、35、40、 45、50、55、60、65、70、75、80、85、90%或介於其間的任何量的細胞壁被部分降解或移除。然而，原生質體、原生質球狀體或原生質體與原生質球狀體兩者亦可被產生。在一或更多如同本文所述的處理以鬆動細胞壁之後之一群細胞內的一些植物細胞可包含原生質體，舉例來說由約0%至約50%或介於其間任何量的細胞族群可包含原生質體，舉例來說0%至約30%或介於其間任何量、由0%至約10%或介於其間任何量的細胞族群可包含原生質體，或由0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50%或介於其間任何量的細胞族群可包含原生質體。相似地，一些植物細胞可包含原生質球狀體，舉例來說，由約0%至約90%或介於其間任何量的細胞族群可包含原生質球狀體，舉例來說，0%至約60%或介於其間任何量、由0%至約30%或介於其間任何量的細胞族群可包含原生質球狀體，或由0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90%或介於其間的任何量的細胞族群可包含原生質球狀體。
「細胞壁鬆動組成物」一詞係意指造成細胞壁鬆動的任何組成物，舉例來說，修飾細胞壁使得細胞壁內的組成物被切割、部分切割、降解或部分降解，或破壞細胞壁組成物內或其間的分子間非共價或共價鍵結，或弱化細胞壁、使細胞壁基質破裂或其組合的其他修飾。細胞壁鬆動組成物的範例包括使細胞壁組成物破裂或水解的化學製品、使細胞壁組成物破裂或水解的酵素、使細胞壁組成物破裂或水解的生物製劑或使細胞壁組成物破裂或水解的化學製品、生物製劑與酵素中至少兩者之任何組合物。化學製品的非限制性範例包括螫合劑，舉例來說二價陽離子螫合劑，例如EDTA或EGTA、質子予體、羥基自由基、氫氧化鉀、吲哚-3-乙酸、咪唑，以及其組合物。生物製劑的非限制性範例包括生長激素、擴張蛋白，舉例來說一或更多α-擴張蛋白或β-擴張蛋白以及其組合物。酵素的非限制性範例包括聚醣酶、半乳糖醛酸苷酶、聚半乳糖醛酸苷酶、聚木糖酶、果膠酶(pectinase)、果膠分解酶(pectolyase)、果膠酶(pectozyme)、果膠酯酶 (pectinesterase)、甲基轉移酶(methyltransferase)、纖維素酶(cellulase)、聚葡萄糖酶、內-1,4-β-聚葡萄糖酶、木葡聚糖轉葡萄糖苷水解酶、木葡聚糖內聚葡萄糖酶、木葡聚糖內轉葡萄糖苷酶、纖維水合酶(外纖維素酶)、糖苷水解酶、β-葡萄糖苷酶、纖維二糖脫氫酶(氧化纖維素酶)、纖維素磷酸解酶、半纖維素酶、脂酶、蛋白酶以及其組合物。如同描述於以下範例(見範例1)可能使用的酵素混合物之非限制性範例為果膠酶MACEROZYME(Yakult Pharmaceuticals)以及纖維素酶組成物Onozuka R-10(Yakult Pharmaceuticals)。在另一非限制性範例中(範例17；第16圖)可使用的酵素混合物包含單獨或結合使用的果膠酶，舉例來說生物催化劑162L、生物催化劑444L、生物催化劑PDN33。果膠酶或果膠酶組成物亦可與纖維素酶(舉例來說Multifect CX CG、Multifect CX B(Genencor)或其組合物)一起使用。若細胞壁鬆動組成物包含可使用作原生質體製劑的酵素混合物(例如，如同描述於下列範例的：「經由細胞壁消化作用之VLP萃取」，範例1與範例16；亦參閱PCT/CA2010/001489或PCT/CA2010/001488；將其以引用的方式併入本文)，那麼所使用的酵素量及/或消化時間或任何其他消化參數為小於典型地用以製備原生質體的酵素量。舉例來說，所使用的酵素量可能從0.1至約75%或其間的任何量之將正常地用於製備原生質體之量。舉例來說，使用為細胞壁鬆動組成物之酵素量將產生含有由0至約50%或其間任何量之原生質體的植物細胞組成物。替代地，使用為細胞壁鬆動組成物之酵素量可類似於使用以製備原生質體之量(例如，如同描述於範例「經由細胞壁消化作用之VLP萃取」，以及範例1；以及PCT/CA2010/001489或PCT/CA2010/001488；將其以引用的方式併入本文)，但培養持續期間減少約30%至約80%或其間的任何量之將正常地用以製備原生質體的持續期間。
可將細胞壁鬆動組成物(例如酵素溶液或消化溶液)滲透於使用為範例真空滲透或壓力滲透的整個植物、植物器官或整個葉片(見範例17)。以整個植物而言，意指包含根、莖與葉的植物。以植物器官而言， 意指根系統、植物的氣生部分(具有葉片的莖部)、葉片移除的莖部、花或一或更多葉片(具有或不具有葉柄)。以整個葉片而言，意指從植物移除但保持未切成較小塊之完整的葉片或一或更多葉片(具有或不具有葉柄)。如同本文所描述的，在例如整個植物或一或更多整個葉片內細胞壁鬆動組成物的滲透容許蛋白質、表層結構蛋白質或VLP從整個植物或葉片的釋出。不希望被理論所約束，當未在整個葉片內滲透細胞壁鬆動組成物時，需要在葉片內增加組成物的進入點，以便酵素組成物可逐漸消化組織。舉例來說，當以葉片要被浸泡著的溶液來提供細胞壁鬆動組成物時，酵素消化作用由暴露的邊緣朝葉片組織的內部發生。使用機械性攪拌來強化此步驟，造成原生質體或原生質球狀體由果膠纖維基質釋出。細胞壁鬆動組成物的滲透可能需要於強度與持續期間兩者降低的機械性攪拌，並協助維持原生質體完整性，並且增加原生質體產量。當酵素於葉內(或器官或整個植物)滲透時，可進行葉片(器官或植物)的持續攪拌，但可不需要攪拌。
經由以細胞壁鬆動組成物處理細胞壁，可更輕易釋出感興趣之植物衍生蛋白質或蛋白質表層結構。經由使用包含細胞壁鬆動步驟的方法，由於包含大部分宿主細胞蛋白質的細胞壁與原生質隔間從感興趣之所釋出的植物衍生蛋白質或蛋白質表層結構分離，感興趣之植物衍生蛋白質或蛋白質表層結構可被增濃。
「植物衍生蛋白質」、「蛋白質」或「感興趣之蛋白質」一詞(這些用語可互相交換使用)係意指在植物或植物的部分內要被表現之核苷酸序列或編碼區所編碼的蛋白質或蛋白質次單元，其包括對植物或植物的部分為外生性的蛋白質與蛋白質次單元。蛋白質可具有從大約1至大約100kDa或介於其間的任何值的分子量，舉例來說，1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100kDa或介於其間的任何值。蛋白質可為單體、二聚體、三聚體或多聚體。
蛋白質表層結構，亦稱為表層結構蛋白質、蛋白質超結構或超結構蛋白質，為包含二或更多多胜肽之蛋白質結構。多胜肽可為相同的或不同的；若不同，它們可以約1：1至約10：1或更大的比率存在。表層結構蛋白質可包括但不限於蛋白質叢生物、蛋白質複合物、蛋白質奈米顆粒、醣蛋白、抗體、多株抗體、單株抗體、單鏈單株抗體或類病毒顆粒、蛋白酶體、蛻變中間物質(metabolon)、轉錄複合物、重組複合物、光合成複合物、膜運輸複合物、核孔複合物、嵌合蛋白質、嵌合蛋白質複合物、嵌合蛋白質奈米顆粒、嵌合醣蛋白、嵌合抗體、嵌合單株抗體、嵌合單鏈單株抗體或嵌合血球凝集素(HA)。若蛋白質表層結構為VLP，VLP可選自由病毒被膜蛋白質、病毒結構蛋白質、病毒殼體蛋白質以及病毒外殼蛋白質所組成之群組。植物衍生性VLP可包含流感(HA)。
典型地當蛋白質表層結構(蛋白質超結構)組裝時是大型的，舉例來說具有大於75kDa的分子量，舉例來說由大約75至大約1500kDa或介於其間的任何分子量。舉例來說，蛋白質表層結構可具有分子量從大約75、80、85、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、200、220、240、260、280、300、320、340、360、380、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、850、900、950、1000、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500kDa或介於其間的任何值。組合在一起以製成蛋白質表層結構的次單元可以是較小的分子量，舉例來說每一個次單元具有由大約1kDa至大約500kDa或介於其間的任何值的分子量。蛋白質表層結構可包含舉例來說在蛋白質螺旋中具有以氫鍵鍵結之殘基的一或更多胺基酸來表現二級結構的蛋白質、具有三維配置之三級結構的蛋白質或具有多重折疊蛋白質排列的四級結構的蛋白質或生成多次單元複合物的螺旋蛋白質分子。
多元蛋白質複合物(或蛋白質複合物)可包含一群二個或更多個相關多肽鏈。若不同的多胜肽鏈包含不同蛋白質區域，那麼生成的多 元蛋白質複合物可具有多重催化功能。蛋白質複合物亦可為多元酵素多胜肽，其於單一多胜肽鏈中包含多個催化區域。蛋白質複合物典型地為四級結構的形式。使用標準蛋白質分離步驟方案典型地可能無法完整的存留下來，但使用本文描述的方法可能被獲得的蛋白質複合物的範例包括蛋白酶體(用於胜肽與蛋白質的降解)、蛻變中間物質(用於氧化能量產生)、核醣體(用於蛋白質合成；例如，如同描述於Pereira-Leal,J.B.；et.al.,2006,Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci.,361(1467)：507-517中者)、轉錄複合物、重組複合物、光合成複合物、膜運輸複合物、核孔複合物。本方法可用以獲得以具有穩定或較弱的蛋白質區域-蛋白質區域交互作用之蛋白質複合物。
蛋白質或蛋白質表層構造的範例包括，舉例來說但不限於，工業酵素例如纖維素酶、聚木糖酶、蛋白酶、過氧化氫酶、枯草桿菌蛋白酶、蛋白質添加物、營養食品、加值產物或給料、食物或給料與食物用途兩者之其片段、藥學上具活性蛋白質，例如但不限於生長因子、生長調節劑、抗體、抗原以及其片段或其對免疫或疫苗接種有用的衍生物以及諸如此類。額外的感興趣之蛋白質可包括但不限於介白素，舉例來說一或更多的IL-1至IL-24、IL-26以及IL-27其中之一、細胞介素、紅血球生成素(EPO)、胰島素、G-CSF、GM-CSF、hPG-CSF、M-CSF或其組合物、干擾素(舉例來說干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ)、凝血因子(例如因子VIII、因子IX、或tPA hGH)、受體、受體促進劑、抗體、神經多胜肽、胰島素、疫苗、生長因子(例如但不限於上皮生長因子、角質細胞生長因子、轉化生長因子、生長調節劑)、抗原、自體抗原，其片段或其組合物。
蛋白質表層結構的非限制性範例為抗體。抗體為具有分子量由大約100至大約1000kDa或介於其間的任何值之醣蛋白。抗體包含四個多胜肽鏈，兩個輕鏈與兩個重鏈，其經由雙硫鍵鍵結。舉例來說，其不被視為限制性的，每個輕鏈可具有約25kDa，舉例來說由大約20至大約30kDa 或介於其間的任何值，或更高例如由大約20至大約300kDa或介於其間的任何值的分子量，並且其由兩區域構成，一個可變區域(VL)與一個恆定區域(CL)。每個重鏈可具有約50kDa，舉例來說由大約30至大約75kDa或介於其間的任何值，或更高舉例來說由大約30至大約500kDa或介於其間的任何值的分子量，並且由恆定區域與可變區域組成。重鏈與輕鏈包含一些由類似但不相同群組的胺基酸序列所組成之同源區段。這些同源單位由大約110胺基酸組成並且稱為免疫球蛋白區域。重鏈包含一可變區域(VH)以及三或四恆定區域(CH1、CH2、CH3與CH4，視抗體分類或同型(isotype)而定)。在CH1與CH2區域之間的區域稱為絞鏈區(hinge region)，並允許Y形抗體分子之兩Fab臂間的彈性，使它們開放以及關閉以適應鍵結至被一段固定距離分開之兩抗原決定區。
蛋白質表層結構的另一非限制性範例為VLP。VLP可包含HA0先驅物形式或由二硫化橋狀形式保持在一起的HA1或HA2區域。VLP何具有大約20nm至1μm或介於其間的任何值的平均尺寸，舉例來說60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、120、130、140、150、160、170、180、190或200nm或介於其間的任何值(舉例來說100nm)，並且可包括脂質膜。
蛋白質或表層結構蛋白質可進一步包含一或更多脂質、磷脂質、核酸、膜以及諸如此類。二或更多的多肽可經由共價鍵、二硫橋、電荷相互作用、疏水性吸引力、凡得瓦力、氫鍵以及諸如此類而連結。蛋白質表層結構之範例為可由被膜上或未被被膜上舉例來說，病毒被膜蛋白質、病毒結構蛋白質、病毒殼體蛋白質或病毒外殼蛋白質之單株抗體、嵌合單株抗體、單鏈單株抗體或類病毒顆粒(VLP)。
蛋白質或表層結構蛋白質可在包括植物宿主細胞之合適宿主細胞內生產，並且若需要則進一步純化。嵌合單株抗體、流感VLP以及嵌合流感VLP在本文例舉時，描述於本文的方法可使用於任何細胞質植物衍生 蛋白質或表層結構蛋白質或位於或被分泌至質外體之任何植物衍生蛋白質或表層結構蛋白質。
本發明亦提供一種從植物或植物物質回收植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質的方法，其涉及獲得包含位於質外體內容物中的植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質的植物或植物物質；以細胞壁鬆動組成物、音波振動處理或細胞壁鬆動組成物與音波振動處理兩者來處理植物或植物物質，以產生具有鬆動細胞壁之植物或植物物質，從而容許、刺激、增加或強化質外體內容物經由細胞壁的釋出，藉此產生質外體內容物部分；過濾質外體內容物部分以產生過濾餾分以及從過濾餾分中回收植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質。如有需要，可由過濾餾分來純化植物衍生蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質。可使用本領域所知的用於由質外體內容物部分回收蛋白質或表層結構蛋白質的替代方法，其包括，舉例來說，離心與傾析。
本發明亦提供一種回收蛋白質或表層結構蛋白質的方法，其中蛋白質或表層結構蛋白質包含植物衍生脂質被膜，舉例來說包含植物衍生脂質被膜的VLP。該方法包括獲得包含感興趣之表層結構蛋白質(例如VLP)的植物或植物物質，以細胞壁鬆動組成物、音波振動處理或細胞壁鬆動組成物與音波振動處理兩者來處理植物或植物物質，以產生具有鬆動的細胞壁之植物或植物物質，因此容許、刺激、增加或強化質外體內容物經由細胞壁的釋放，從而產生質外體內容物部分，並且從質外體內容物部分分離包含植物衍生脂質被膜的感興趣之表層結構蛋白質。
提出植物組織培養、培養植物細胞以及原生質體、原生質球狀體以及諸如此類的生產之一般性原則的標準引用著作包括：Introduction to Plant Tissue Culture,by MK Razdan 2nd Ed(Science Publishers，2003；將其以引用的方式併入本文)，或參見例如下列URL：molecular-plant-biotechnology.info/plant-tissue-culture/protoplast-isolation.htm 。相關於原生質體(原生質球狀體)生產與操作的方法與技術係回顧於，舉例來說，Davey MR et al.,2005(Biotechnology Advances 23：131-171；將其以引用的方式併入本文)。提出蛋白質生物化學、分子生物學以及諸如此類的一般性方法與原則之標準引用著作包括舉例來說Ausubel et al,Current Protocols In Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York(1998以及2001之補充資料；將其以引用的方式併入本文)；Sambrook et al,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,2d Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,New York,1989(將其以引用的方式併入本文)；Kaufman et al,Eds.,Handbook Of Molecular And Cellular Methods In Biology And Medicine,CRC Press,Boca Raton,1995(將其以引用的方式併入本文)；McPherson,Ed.,Directed Mutagenesis：A Practical Approach,IRL Press,Oxford,1991(將其以引用的方式併入本文)。
用於修飾並從而鬆動細胞壁之有用的酵素係為本領域之技術人員所知並且可包括纖維素酶(EC 3.2.1.4)、果膠酶(EC 3.2.1.15)、聚木糖酶(EC 3.2.1.8)、幾丁質酶(EC 3.2.1.14)、半纖維素酶、木葡聚糖內轉醣苷酶聚葡萄糖酶、木葡聚糖內轉醣苷酶、內葡聚糖酶(例如β-1,3-聚葡萄糖酶以及β-1,4-甘露聚醣酶)、木葡聚糖內轉葡萄糖苷酶/水解酶或其組合物。纖維素酶為酵素混合物並且可包括一或更多種內-1,4-β-聚葡萄糖酶、纖維二糖水解酶(外切纖維素酶)、β-葡萄糖苷酶、纖維二糖脫氫酶(氧化纖維素酶)、纖維素磷酸解酶以及半纖維素酶。可用作細胞壁鬆動組成物的合適酵素之非限制性範例包括包含纖維素酶、半纖維素酶與果膠酶的多組成物酵素混合物，舉例來說MACEROZYMETM(大約包含：纖維素酶：0.1U/mg、半纖維素酶：0.25U/mg以及果膠酶：0.5U/mg)。商業酵素、酵素混合物與供應商的其他範例列舉於表1(參見：Introduction to Plant Tissue Culture,by MK Razdan 2nd Ed.,Science Publishers,2003)。
纖維素酶的別名以及類型包括內-1,4-β-D-聚葡萄糖酶； β-1,4-聚葡萄糖酶；β-1,4-內葡聚糖水解酶；纖維素酶A；cellulosin AP；內聚葡萄糖酶D；鹼性纖維素酶；纖維素酶A 3；纖維素糊精酶(celludextrinase)；9.5纖維素酶；微晶纖維素酶(avicelase)；pancellase SS以及1,4-(1,3；1,4)-β-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶。果膠酶(聚半乳糖全酸苷酶)的別名以及類型包括果膠解聚合酶；果膠酶(pectinase)；內聚半乳糖醛酸苷酶；果膠酶(pectolase)；果膠水解酶；果膠聚半乳糖醛酸苷酶；內-聚半乳糖醛酸苷酶；聚-α-1,4-半乳糖醛啶葡聚糖水解酶；內半乳糖醛酸苷酶；內-D-半乳糖荃酸苷酶以及聚(1,4-α-D-半乳糖醛啶)葡聚糖水解酶。聚木糖酶的別名以及類型包括半纖維素酶、內-(1→4)-β-聚木糖4-聚木糖水解酶；內-1,4-聚木糖酶；聚木糖酶；β-1,4-聚木糖酶；內-1,4-聚木糖酶；內-β-1,4-聚木糖酶；內-1,4-β-D-聚木糖酶；1,4-β-聚木糖聚木糖水解酶；β-聚木糖酶；β-1,4-聚木糖聚木糖水解酶；內-1,4-β-聚木糖酶；β-D-聚木糖酶。幾丁質酶的別名以及類型包括幾丁聚葡萄糖酶(chitodextrinase)；1,4-β-聚-N-乙醯葡萄糖苷酶；聚-β-葡萄糖苷酶；β-1,4-聚-N-乙醯葡萄糖苷酶；聚[1,4-(N-乙醯基-β-D-葡萄胺糖苷)]葡聚糖水解酶。
特定酵素的選擇或酵素的組合以及濃度與反應條件可視使用植物組織的類型來自何細胞以及所獲得含有VLP的鬆動部分而定。纖維素酶、半纖維素酶以及果膠酶的混合物(舉例來說，果膠酶MACEROZYMETM 或Multifect)可被用於由0.01%至2.5%(v/v)的濃度範圍，例如0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4或2.5%(v/v)或介於其間的任何值。MACEROZYMETM或Multifect可單獨或與其他酵素組合使用，例如纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶或其組合物。纖維素酶可被用於由0.1%至5%的濃度範圍，例如0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0%(w/v)或介於其間的任何值。此外，果膠酶(舉例來說但不限於Biocatalysts 162L以及144L(包含聚半乳糖醛酸苷酶以及果膠裂解酶活性))可單獨或與其他酵素組合使用，例如纖維素酶、果膠酶、半纖維素酶或其組合物。果膠酶(包含聚半乳糖醛酸苷酶以及果膠裂解酶活性)可用於由0.1%至5%的濃度範圍，例如0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0%(w/v)或介於其間的任何值。
酵素溶液(替代性地稱為細胞壁鬆動組成物)一般會包含緩衝液或緩衝液系統、滲透調節物質(osmoticum)以及一或多於一種鹽類、二價陽離子或其他添加劑。緩衝液或緩衝液系統係被選取以維持酸鹼值在適合酵素活性與蛋白質或VLP穩定性之範圍內，以在舉例來說大約pH 5.0至大約8.0或任何介於其間之值的範圍內純化。所使用之選取的酸鹼值可視要被回收的VLP而不同，舉例來說pH可為5.0、5.2、5.4、5.6、5.8、6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0或任何介於其間之pH。緩衝液或緩衝液系統的範例包括但不限於MES、磷酸鹽、檸檬酸鹽以及諸如此類。一或更多種緩衝液或緩衝液系統可在一酵素溶液(細胞壁鬆動溶液)中組合；該一或更多種緩衝液可以從0mM至大約200mM或介於其間的任何值的濃度存在，舉例來說10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180或190mM或介於其間的任何值。視 適合度而定，如有需要可加入滲透調節物質組成物。滲透調節物質與其濃度被選取以提高酵素溶液的滲透強度。滲透調節物質的範例包括甘露醇、山梨醇或其他糖醇、不同聚合物長度的聚乙二醇(PEG)以及諸如此類。滲透調節物質的濃度範圍可視植物種類、所使用之滲透調節物質類型以及選取的植物組織類型(物種或來源器官，例如葉或莖)而定-一般介於0M至約0.8M，舉例來說0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.5、0.6、0.7或0.75M或介於其間的任何值，舉例來說0、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600nM或介於其間的任何值之甘露醇。滲透調節物質的濃度亦可以百分比(w/v)表示。對一些植物或組織類型而言，採用可促使植物細胞質膜從細胞壁分離的稍高滲壓製劑可能是有利的。滲透調節物質亦可在細胞壁鬆動步驟期間被省略。
對修飾有益從而鬆動細胞壁的化學組成物與化合物包含例如但不限於螫合物、二價螫合物、羥基自由基、吲哚-3-乙酸與擴張蛋白(expansin)。螫合物的範例包括，例如但不限於乙二胺四乙酸(EDTA)以及乙二醇四乙酸(EGTA)。螫合物可以由0mM至約500mM或介於其間之任何值的濃度存在，舉例來說10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500mM或介於其間的任何值。可將一種或多於一種螫合物與額外的化學化合物、酵素溶液或化學化合物、酵素溶液的結合物加以組合，以提供細胞壁鬆動組成物。擴張蛋白的範例包括，例如但不限於擴張蛋白A、擴張蛋白B、類擴張蛋白A、類擴張蛋白B以及類擴張蛋白X。可以從0.1%至5%的範圍之濃度使用擴張蛋白，舉例來說0.1、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0%(w/v)。可將一種或多於一種擴張蛋白與酵素溶液加以組合，以提供細胞壁鬆動組成物。
細胞壁可能經由壁聚合物的非酵素切割而鬆動。此類非酵素 切割的範例包括經由羥基自由基的切割。羥基自由基可經由以例如在Cu或Fe離子(Fenton’s試劑)的催化量存在下的抗壞血酸鹽之H2O2還原而產生。相關於羥基自由基誘發的細胞壁鬆動方法與技術係回顧於，舉例來說，Schopf,Peter(The Plant Journal,2001,28(6),679-688，將其以引用的方式併入本文)。
替代地，細胞壁可經由加入從約0至約200μM或介於其間的任何值，舉例來說5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200μM或介於其間的任何值的吲哚-3-乙酸(生長激素)而鬆動。吲哚-3-乙酸可與酵素溶液組合，以提供細胞壁鬆動組成物。
可將細胞壁經由植物細胞的物理處理(例如音波振動處理)而進一步鬆動。多種超音波浴為市面上可得的並且可用於本發明。用語超音波意指恰高於人類聽力範圍的頻率，因此大約為20kHz。替代地，超音波能量可經由例如轉換器(transducer)直接地傳遞至溶液或細胞懸浮液。可將溶液或細胞懸浮液置於例如包含能夠傳遞超音波能量之媒介的容器或孔洞中或連續的容器或孔洞中。媒介的一個非限制性範例為細胞壁鬆動組成物。孔洞被連接到或為接近適合的轉換器或能夠將輸入能量轉換為超音波能量的其他裝置。可將細胞直接置於作為樣本容器之孔洞中或連續之孔洞中，或替代地可將細胞置於容器中並且淹沒於孔洞中所含的液體。可將孔洞以合適的封閉物加蓋，以避免滲露或噴霧化作用。音波處理頻率的範圍是適合植物樣本的音波振動處理，可使用由大約5kHz至大約60kHz或介於其間的任何值的超音波能量，舉例來說10、15、20、25、30、35、40、45、50、55kHz。音波振動處理可進行約5秒至約10分鐘或介於其間的任何時間。
另一個可被調整以協助細胞壁鬆動的參數為溫度。可在細胞壁鬆動步驟期間控制溫度。有用的溫度範圍為介於4℃與40℃之間或其間的任何溫度，舉例來說由大約4℃至大約15℃或介於其間的任何值，或是由大 約4℃至大約22℃或介於其間的任何溫度。視所選擇的溫度，可調整其他細胞壁鬆動的實驗參數以維持優化的萃取條件。
陽離子、鹽類或兩者可被添加以改善細胞膜穩定性，舉例來說，於0.5-50mM或介於其間的任何值的二價陽離子(例如Ca2+或Mg2+)、由約0至約750mM或介於其間之任何值(例如10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700或750mM)的鹽類(舉例來說CaCl2、NaCl、CuSO4、KNO3以及諸如此類)。其他添加物亦可被加入，包括螯合物，例如但不限於由約0至約200mM或介於其間的任何值(例如5、10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200mM或介於其間的任何值)的EDTA、EGTA；防止氧化的還原劑，例如但不限於0.005-0.4%或介於其間的任何值(例如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.15、0.2、0,25、0.3、0.35、0.4%或介於其間的任何值)之亞硫酸氫鈉或抗壞血酸；特定酵素抑制劑(參見以下)，以及如有需要，葉片衰老抑制劑(舉例來說，環己醯亞胺、激動素(kinetin)或一或更多的多胺。
細胞壁鬆動組成物亦可包含一或更多滲透調節物質，舉例來說由約0至約600mM的甘露醇、由約0至約500mM的NaCl、由約0至約50mM的EDTA、由約1%至約2%(v/v)的纖維素酶、由約0至約1%(v/v)的果膠酶、由約0.03至約0.04%的偏亞硫酸氫鈉、由約0至約125mM的檸檬酸鹽或由0至約75mM的NaPO4。然而，如同本文所描述的方法鬆動細胞壁，而非完全地消化細胞壁，細胞壁鬆動組成物中的滲透調節物質的使用是隨選的。
植物物質可被處理以強化酵素或酵素組成物的進入植物細胞壁。舉例來說，在以酵素組成物處理之前可移除或「去皮」葉的表皮。植物物質可被切成小塊(手動地，或以切碎或切割裝置(例如Urschel切片機))；可將切除的植物物質於部分真空下進一步以化學品、酵素組成物或化學品與酵素混合物兩者滲透(Nishimura and Beevers 1978,Plant Physiol 62：40-43；Newell et al.,1998,J.Exp Botany 49：817-827)。在以酵素組成物 處理之前或期間，亦可將植物物質的機械性擾動應用到植物組織(Giridhar et al.,1989.Protoplasma 151：151-157)。此外，培養的植物細胞，無論是液體或固體培養物，可被用以製備含有鬆動細胞壁的植物製劑。
使用缺乏或已去活化的脂酶或蛋白酶的酵素組成物可能是想要的。舉例來說，在酵素組成物中可包括一或更多蛋白酶或脂酶抑制劑。脂酶抑制劑的範例包括RHC80267(Sigma Aldrich)；蛋白酶抑制劑的範例包括E-64、Na2EDTA、Pepstatin、抑肽酶(aprotinin)、PMSF、Pefabloc、亮抑肽酶(Leupeptin)、抑氨肽素(bestatin)以及諸如此類。
可使用任何合適的在酵素組成物中混合或攪拌植物物質之方法。舉例來說，可將植物物質在碟或盤中或經由旋轉震盪器溫和打旋或震盪、在旋轉或振盪滾筒中翻滾。
作為非限制性的範例，在500mM甘露醇、10m CaCl2與5mM MES(pH 5.6)中含有1.5%纖維素酶(Onozuka R-10)以及0.375% MACEROZYMETM的酵素組成物可被使用作為用於植物組織的細胞壁鬆動組成物，舉例來說，菸草(Nicotiana)組織。如同本文中所描述地，甘露醇的濃度亦可由約0至約500mM或介於其間的任何值變化。本領域的技術人員被提供揭露於本文的資訊而將能夠針對煙草屬的年齡與種株或對另外用作VLP生產的植物品種來決定適合的酵素組成物。作為另一個非限制性的範例，含有每種由1至4%(v/v)之一或更多果膠酶的酵素組成物(舉例來說在600mM甘露醇、75mM檸檬酸鹽、0.04%亞硫酸氫鈉pH 6.0緩衝液中之Biocatalysts 162L、Biocatalysts 444L或其組合物)可作為用於植物組織(例如菸草組織)的細胞壁鬆動組成物。此外，在600mM甘露醇、75mM檸檬酸鹽、0.04%亞硫酸氫鈉(pH 6.0)緩衝液中包含一或更多果膠酶的組成物(舉例來說每個在1至4%(v/v)之Biocatalysts 162L、Biocatalysts 444L或其組合物)以及每個在1至4%(v/v)之一或更多纖維素酶(舉例來說Multifect CX CG、Multifect CX B(Genencor)或其組合物)可作為用於植物組織(例 如菸草組織)的細胞壁鬆動組成物。
「質外體內容物部分」係意指在細胞壁的鬆動或部分鬆動後所獲得的部分，其係使用細胞壁鬆動組成物或以其他方式修飾細胞壁以鬆動細胞壁，舉例來說音波振動處理、或是細胞壁鬆動組成物與音波振動處理的組合。質外體內容物部分可於植物或植物物質以細胞壁鬆動組成物、音波振動處理或其組合的培養以獲得植物培養混合物，以及將植物培養混合物過濾、離心或其組合以產生質外體內容物部分之後而獲得。質外體內容物部分典型地包含存在於質外體之可溶組成物。質外體內容物部分亦可包含一些由細胞壁破裂引起的組成物。
不希望被理論所約束，細胞壁鬆動的步驟可鬆動細胞壁的聚合組成物並且協助同時陷於細胞壁內的植物蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質之釋出。此方案亦最小化帶有細胞內組成物之植物蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質的汙染。可在細胞壁鬆動後將感興趣之植物蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質從細胞碎片分離，其使用低速離心其次藉由過濾、深度過濾、沉積、沉澱(舉例來說但不限於硫酸銨沈澱或其組合)，以獲得含有感興趣之植物蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質的質外體內容物部分。
由於本文所描述的方法鬆動了細胞壁，而非完全消化細胞壁，可不需要滲透調節物質。若使用滲透調節物質，包含胞器、原生質體與細胞壁的細胞部分可使用任何合適的技術由質外體內容物部分分離，該技術例如但不限於離心、過濾、深度過濾、沉積、沉澱或其組合，以獲得含有感興趣之植物蛋白質或表層結構蛋白質及/或包含含有感興趣之蛋白質或表層結構蛋白質之含有原生質體/原生質球狀體的鬆動的原生質體部分。
所分離的部分可為例如上清液(若經離心、沉積或沉澱)或過濾物(若經過濾)，並且將對蛋白質或表層結構蛋白質進行增濃。所分離的部分可進一步被處理以分離、純化、濃縮或其組合蛋白質或表層結構蛋白質，其經由例如額外的離心步驟、沉澱、層析步驟(例如尺寸排除、離 子交換、親和層析)、切向流過濾(tangential flow filtration)或其組合。經純化的蛋白質或表層結構蛋白質之存在可由例如原生的或SDS-PAGE、使用適合偵測抗體的西方墨點分析、毛細管電泳或對於本領域之技術人員將為顯而易見的任何其他方法來確認。
在合成期間，感興趣之植物蛋白質、蛋白質或表層結構蛋白質可被分泌至細胞膜外。若表層結構蛋白質為VLP，它們的平均尺寸為大約20nm至1μm或介於其間的任何值。若表層結構蛋白質為抗體，它們的分子量為從大約100kDa至大約1000kDa或介於其間的任何值。一旦合成了，由於它們的尺寸，蛋白質或表層結構蛋白質可能仍然陷於細胞膜與細胞壁之間並且使用用以獲得植物蛋白質的標準機械性方法可能難以得到分離或進一步的純化。為了最大化產量、最小化帶有細胞蛋白質的表層結構蛋白質部分的汙染、維持蛋白質或表層結構蛋白質以及當需要時相關的脂質被膜或膜的完整性，最小化對原生質體及/或原生質球狀體的機械性傷害的鬆脫細胞壁以釋出蛋白質或表層結構蛋白質的方法可能是有用的，例如描述於本文的化學方法、酵素方法或其組合。然而，在過程中不需要保持所有原生質體的完整性。
表層結構蛋白質(舉例來說，在植物中產生的VLP)可與植物衍生脂質複合。植物衍生脂質可是以脂雙層的形式，並且可進一步包含環繞VLP的被膜。植物衍生脂質可包含生產VLP的植物細胞膜的脂質組成物，其包括但不限於卵磷脂(PC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、醣原神經脂質、植物固醇或其組合物。植物衍生脂質可交替地稱為「植物脂質」。植物固醇的範例為本領域所知的，並且包括舉例來說豆固醇、植固醇、24-甲基膽固醇與膽固醇(Mongrand et al.,2004,J.Biol Chem 279：36277-86)。
多肽表現可如需要地被靶定於植物的任何細胞內或細胞外間隙、胞器或組織。為了定位所表現的多胜肽至特定位置，編碼多胜肽的核酸可被連結至編碼信號胜肽或導引序列的核酸序列。信號胜肽可被交替 地稱為導引訊息胜肽、信號序列或導引序列。用於導引所表現的多胜肽之位置至質外體的信號胜肽或胜肽序列包括但不限於原生的(與蛋白質相關)訊號或導引序列，或異源的信號序列，舉例來說但不限於米澱粉酶信號胜肽(McCormick 1999,Proc Natl Acad Sci USA 96：703-708)、具有胺基酸序列：MAKNVAIFGLLFSLLLLVPSQIFAEE；SEQ ID NO.10之蛋白質雙硫異構酶信號胜肽(PDI)、植物病原性相關蛋白質(PRP；Szyperski et al.PNAS 95：2262-2262)，舉例來說，菸草植物病原性相關蛋白質2(PRP)、人類單株抗體信號胜肽(SP，或導引序列)或相關於蛋白質之原生的任何信號胜肽。
在一些範例中，所表現的多胜肽可累積於特定細胞內間隙或細胞外間隙(例如質外體)、胞器或組織，舉例來說當在缺乏信號胜肽或導引訊息胜肽下表現並分泌多胜肽時。
「類病毒顆粒(virus like particle)」(VLP)或「類病毒顆粒(virus-like particles)」或「VLPs」一詞意指自我組裝並且包含病毒表面蛋白質(舉例來說流感HA蛋白質或嵌合流感HA蛋白質)的結構。VLP與嵌合VLP一般地形態上與致原性上與感染中產生的病毒顆粒相似，但缺乏足以複製的遺傳資訊因而為非感染性的。
「嵌合蛋白質」或「嵌合多胜肽」意指包含來自二或多於二個來源的胺基酸序列之蛋白質或多胜肽，舉例來說但不限於，二或更多融合為單一多胜肽的流感類型或亞型。嵌合蛋白質或多胜肽可包括與多胜肽或蛋白質的其餘部分相同(即原生的)或異源的信號胜肽。嵌合蛋白質或嵌合多胜肽可由嵌合核苷酸序列產生為轉錄物並且保持完整，或如有需要，嵌合蛋白質或嵌合多胜肽在合成後可被切割。完整的嵌合蛋白質或嵌合蛋白質的切割部分可關聯至生成多聚蛋白質。嵌合蛋白質或嵌合多胜肽亦可包括含有經由二硫橋關聯的次單元之蛋白質或多胜肽(即多聚蛋白質)。舉例來說，含有來自二或多於二個來源的胺基酸序列的嵌合多胜肽可 被處理為次單元，並且該次單元經由二硫橋相關聯，以產生嵌合蛋白質或嵌合多胜肽。嵌合蛋白質的非限制性範例為嵌合單株抗體，舉例來說C2B8，或嵌合VLP，舉例來說但不限於如同描述於美國臨時申請案US 61/220,161與PCT/CA2010/000983(將其以引用的方式併入本文)中的蛋白質與VLP產生之編號690、691、696、734、737、745或747的構築體(表格2)。
蛋白質或表層結構蛋白質可為醣蛋白，並且可將涉及經由細胞壁鬆動的萃取之描述於本文的方法如同描述於WO 2008/151440(Modifying glycoprotein production in plants；將其以引用的方式併入本文)中應用至共同表現醣蛋白以及用於修飾N-醣化作用概況的一或更多酵素的植物，而有利於帶有經修飾的成熟之N-聚醣之醣蛋白的回收。舉例來說，成熟之N-聚醣可被免除木糖與海藻糖殘基，或表現降低的海藻糖化、木糖化或海藻糖化與木糖化兩者的N-聚醣。替代地，可獲得包含經修飾的醣化作用模式之感興趣之蛋白質，其中該蛋白質缺乏海藻糖化、木糖化或兩者，並且包含增加的半乳糖化作用。
經修飾的N-醣化作用概況可經由在植物、植物的部分或植物細胞中共同表現編碼第一核苷酸序列之核苷酸序列以及用於編碼感興趣之表層結構蛋白質的第二核苷酸序列而獲得，第一核苷酸序列編碼含有融合至β-1,4-半乳糖苷基轉移酶(GalT)的催化區域之N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶(GTN1)的CTS區域(即胞質尾區(cytoplasmic tail)、穿膜區、莖區域(stem region))的混合蛋白質(GNT1-GalT)而獲得，將該第一核苷酸序列以在植物中具活性之第一調節區域操作性地連結，將第二核苷酸序列以在植物中具活性之第二調節區域操作性地連結，並且共同表現第一與第二核苷酸序列以合成如同描述於WO 2008/151440中的含有帶有經修飾N-醣化作用概況的聚醣之感興趣之表層結構蛋白質。
表層結構蛋白質可為流感血球凝集素(HA)，並且組成多胜肽的二或多於二的胺基酸序列的每一個可由不同HA的胺基酸序列獲得，以 產生嵌合HA或嵌合流感HA。嵌合HA亦可包括含有在合成後被切割的異源信號胜肽(嵌合HA前蛋白質)之胺基酸序列。可用於描述於本文的發明之HA蛋白質之範例可發現於WO 2009/009876；WO 2009/076778；WO 2010/003225(將其以引用的方式併入本文)。編碼嵌合多胜肽的核酸可以「嵌合核酸」或「嵌合核苷酸序列」描述。由嵌合HA組成的類病毒顆粒可以「嵌合VLP」描述。嵌合VLP係進一步地描述於2010年6月25日申請之PCT申請案號PCT/CA2010/000983以及美國臨時申請案號61/220,161(於2009年6月24日申請；將其以引用的方式併入本文)。VLP可由原生或嵌合HA的表現獲得。
根據由本發明提供的方法所製備之VLP的HA，其包括已知序列與可被發展或鑑定的變異HA序列。此外，如同本文描述而產生的VLP不包含神經胺糖酸苷酶(NA)或其他組成物(例如M1(M蛋白質)、M2、NS以及諸如此類)。然而，萬一想要包含HA與NA的VLP，則NA與M1可與HA共同表現。
一般地，用語「脂質」意指脂溶性的(親脂性)、自然發生的分子。根據本發明的一些方面，在植物中生產的嵌合VLP可與植物衍生脂質複合。植物衍生脂質可為脂雙層的形式，並且可進一步包含環繞VLP的被膜。植物衍生脂質可包含產生VLP的植物的細胞膜的脂質組成物，其包括磷脂質、三-、二-以及單甘油酯，以及脂溶性固醇或包含固醇的代謝產物。範例包括卵磷脂(PC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、磷脂醯肌醇、磷脂醯絲胺酸、醣原神經脂質、植物固醇或其組合物。植物衍生脂質可交替地稱為「植物脂質」。植物固醇的範例包括油菜籽固醇、豆固醇、麥角固醇、菜子固醇、δ-7-豆固醇、δ-7-燕麥固醇、胡蘿蔔苷(daunosterol)、植固醇、24-甲基膽固醇、膽固醇或β-植固醇(Mongrand et al.,2004,J.Biol Chem 279：36277-86)。如同本領域之技術人員會輕易了解的，細胞的細胞質膜的脂質組成物可隨著細胞或生物體或獲得細胞的物種的培養或生長條件而變化。
細胞膜一般包含脂雙層，以及各種功能的蛋白質。特定脂質 的局部濃度可發現於脂雙層，稱為「脂筏」(lipid raft)。這些脂筏的微區域可在神經脂質(sphingolipid)與固醇中增濃。不希望被理論所約束，脂筏在胞飲與胞吐作用、病毒或其他感染性試劑的進入與外出、細胞間訊息傳遞、與細胞或生物體的其他結構組成物(例如細胞內與細胞外基質)的交互作用中可能具有重要角色。
含有脂質被膜的VLP先前已描述於WO 2009/009876；WO 2009/076778以及WO 2010/003225(將其以引用的方式併入本文)。參考流感病毒，如同本文所使用之用語「血球凝集素」或「HA」意指流感病毒顆粒的結構醣蛋白。本發明之HA可由任何亞型獲得。舉例來說，HA可以是亞型H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、H10、H11、H12、H13、H14、H15或H16或流感B型或C型。本發明的重組HA亦可包含基於任何血球凝集素序列的胺基酸序列。流感血球凝集素的結構被充分研究的並且證實在二級、三級與四級結構中高度的保留。此結構的保留性被觀察到，即使胺基酸序列可能不同(參見例如Skehel and Wiley,2000 Ann Rev Biochem 69：531-69；Vaccaro et al 2005；將其以引用的方式併入本文)。編碼HA的核苷酸序列是為人熟知的，並且是可得的，舉例來說由生物防禦(BioDefense)與公共衛生資料庫(Public Health Database)(現為流感研究資料庫；Squires et al.,2008Nucleic Acids Research 36：D497-D503)舉例來說於URL：biohealthbase.org/GSearch/home.do？decorator=Influenza或由美國國家生技資訊中心(National Center for Biotechnology Information)(NCBI；舉例來說於URL：ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez？db=nuccore&cmd=search&term=influenza)維護的資料庫，將兩者以引用的方式併入本文。
本發明亦相關於製備、回收、分離或製備、回收與分離VLP兩者的方法，其包括感染人類或宿主動物(例如靈長類動物、馬、豬、鳥類、羊、禽水鳥、候鳥、鵪鶉、鴨、鵝、家禽、雞、駱駝、犬科動物、狗、貓科動物、貓、虎、豹、麝貓、水貂、石貂、雪貂、家庭寵物、家畜、小 鼠、大鼠、海豹、鯨魚以及諸如此類)的病毒之流感VLP。一些流感病毒可感染超過一種宿主動物。在流感病毒的血球凝集素的胺基酸變異被容許。此變異提供持續地被鑑定的新種株。新種株之間的感染力可能有所不同。然而，隨後形成的VLP的血球凝集素三聚體的生成被維持著。本發明亦包括回收不論HA亞型或序列或包含VLP的嵌合HA或物種的來源之任何植物衍生VLP的方法。
表層結構蛋白質的正確折疊對蛋白質的穩定性、多聚體的生成、蛋白質的生成與功能可能是重要的。蛋白質的折疊可受一或更多因素影響，其包括但不限於蛋白質的序列、蛋白質的相對量、細胞內擁擠程度、可結合或暫時關聯於折疊的、部分折疊的或未折疊的蛋白質之輔助因子的可得性、一或更多帶位子(chaperone)蛋白質的存在或諸如此類。
熱休克蛋白(Hsp)或逆境蛋白為帶位子蛋白質的範例，其可參與各種細胞過程，包括蛋白質合成、細胞內運輸、折疊錯誤的避免、蛋白質聚集作用的避免、蛋白質複合物的組裝與拆解、蛋白質折疊與蛋白質解聚作用。此類帶位子蛋白質的範例包括但不限於Hsp60、Hsp65、Hsp70、Hsp90、Hsp100、Hsp20-30、Hsp10、Hsp100-200、Hsp100、Hsp90、Lon、TF55、FKBPs、環菲林(cyclophilin)、ClpP、GrpE、泛蛋白(ubiquitin)、鈣聯蛋白(calnexin)以及蛋白質雙硫鍵異構酶(參見例如Macario,A.J.L.,Cold Spring Harbor Laboratory Res.25：59-70.1995；Parsell,D.A.& Lindquist,S.Ann.Rev.Genet.27：437-496(1993)；美國專利號5,232,833)。帶位子蛋白質(舉例來說但不限於Hsp40與Hsp70)可被使用以確保嵌合HA的折疊(於2010年6月25日申請之PCT申請案號PCT/CA2010/000983以及於2009年6月24日申請之美國臨時申請案號61/220,161；WO 2009/009876以及WO 2009/076778，將其全部以引用的方式併入本文)。亦可使用蛋白質雙硫鍵異構酶(PDI；登錄號Z11499)。
一旦被回收，可經由例如但不限於電子顯微鏡、光散射、尺 寸排除層析法、HPLC、西方墨點分析、電泳法、ELISA、以活性為基礎的試驗(例如血球凝集分析)或任何其他適合的分析以評估蛋白質或表層結構蛋白質的結構、尺寸效力或活性。這些以及其他用於評估VLP的尺寸、濃度、活性以及組成物的方法為本領域所知。
對於製備型尺寸排除層析法，可經由本文所描述的方法獲得包含蛋白質或表層結構蛋白質的製劑，並且將不溶的物質以離心移除。以PEG或硫酸銨的沉澱亦可是有利的。可將回收的蛋白質使用傳統方法定量(舉例來說，Bradford Assay,BCA)，並且萃取物通過尺寸排除管柱，其使用例如SEPHACRYLTM、SEPHADEXTM或類似媒介，使用離子交換管柱的層析法或使用親和管柱的層析法，並且收集具活性的餾分。亦可使用親和力為基礎的磁性分離，例如以DynabeadsTM(Invitrogen)獲得蛋白質複合物，並且將蛋白質複合物由DynabeadsTM沖提。亦可使用層析與分離方案之組合。在層析法或分離之後，可如同需要地以蛋白質電泳、免疫墨點法、ELISA、以活性為基礎的試驗進一步地分析餾分，以確認表層結構蛋白質的存在。
若表層結構蛋白質為VLP，那麼使用本領域熟知的方法，可使用血球凝集試驗以得到包含VLP餾分的血球凝集活性。不希望被理論所約束，HA結合來自不同動物之RBC的能力係經由HA對唾液酸α2,3或α2,3的親和性以及這些唾液酸於RBC表面的存在而驅動。來自流感病毒的馬科動物與鳥類HA凝集了來自所有數個物種的紅血球，其包括火雞、雞、鴨、天竺鼠、人類、綿羊、馬與牛；而人類HA會結合至火雞、雞、鴨、天竺鼠、人類與綿羊的紅血球(Ito T.et al,1997,Virology,227：493-499；Medeiros R et al,2001.Virology 289：74-85)。
血球凝集素抑制作用(HI或HAI)試驗亦可用以證實由疫苗誘發的抗體之效力，或是含有嵌合HA或嵌合VLP的疫苗組成物可經由重組HA抑制紅血球細胞(RBC)的凝集作用。可藉由微滴定HAI(Aymard et al 1973)來評估血清樣本的血球凝集作用抑制抗體滴定量。可使用來自數個物種的任何者之紅血球-例如馬、火雞、雞或諸如此類。此試驗提供了在VLP表面上的HA三聚體組裝之間接資訊，確認了HA上致原性位置的適當呈現。
交叉反應HAI滴定量亦可被使用以證實對相關於疫苗亞型的其他病毒種株的免疫反應效力。舉例來說，在HAI試驗中可使用來自以含有流感第一型或亞型之HDC的嵌合血球凝集素之疫苗組成物接種的個體之血清，以及全病毒或病毒顆粒的第二種株，並且測定HAI滴定量。
藉由本發明的方法所製備的流感VLP可被使用以與現存的流感疫苗結合，以補充疫苗，使其更有效力，或降低必要的給藥劑量。如同本領域的技術人員會知道的，疫苗可針對一或多於一個流感病毒。適合的疫苗之範例包括但不限於，來自Sanofi-Pasteur、ID Biomedical、Merial、Sinovac、Chiron、Roche、MedImmune、GlaxoSmithKline、Novartis、Sanofi-Aventis、Serono、Shire Pharmaceuticals以及諸如此類商業上可得的那些。如有需要，可將本發明之VLP與本領域的技術人員所知的適合佐劑混合。此外，根據本發明所生產的VLP可與其他蛋白質組成物共同表現，或與其他VLP或流感蛋白質組成物(例如神經胺糖酸苷酶(NA)、M1以及M2)進行重組。亦可與由疫苗蛋白質(例如瘧疾抗原、HIV抗原、呼吸道融合性病毒(RSV)抗原以及諸如此類)製成的其他VLP共同表現或重組。
含有蛋白質或表層結構蛋白質的基因轉殖植物、植物細胞、植物物質或種子的轉形及再生的方法係於本領域建立並且為本領域的技術人員所知。獲得轉形與再生的植物之方法對本發明不是關鍵的。
「轉形」意指基因型上、表現型上或兩者表現的遺傳訊息(核苷酸序列)在物種間的轉移。從嵌合構築體至宿主的遺傳訊息之物種間轉移可為可遺傳的(即，嵌入至宿主基因組中)並且此遺傳訊息的轉移被認為是穩定的，或是轉移可以是短暫的且此遺傳訊息的轉移為不可遺傳的。
「植物物質」意指任何衍生自植物的材料。植物物質可包含 整個植物、組織、細胞或其任何部分。進一步地，植物物質可包含細胞內植物組成物、細胞外植物組成物、脂質或植物的固體萃取物或其組合物。進一步地，植物物質可包含來自植物葉片、莖、果實、根或其組合物的植物、植物細胞、組織、液體萃取物或其組合物。植物物質可包含沒有接受任何處理步驟的植物或其部分。植物的一部分可包含植物物質。植物或植物物質可以任何方法收成或獲得，舉例來說，可使用特定地移除供用於所述方法的整個植物或葉片或其他組織。亦可使用表現並分泌VLP的基因轉殖植物作為用於如本文所述的處理之起始材料。
本發明之構築體可被引入到使用Ti質體、Ri質體、植物病毒載體、直接的DNA轉形、顯微注射、電穿孔、滲透以及諸如此類的植物細胞中。對於此類技術的回顧參見例如Weissbach and Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academy Press,New York VIII,pp.421-463(1988)；Geierson and Corey,Plant Molecular Biology,2d Ed.(1988)；以及Miki and Iyer,Fundamentals of Gene Transfer in Plants.In Plant Metabolism,2d Ed.DT.Dennis,DH Turpin,DD Lefebrve,DB Layzell(eds),Addison-Wesley,Langmans Ltd.London,pp.561-579(1997)。其他方法包括直接的DNA攝取、脂質體的使用、電穿孔，例如使用原生質體、顯微注射、微量拋射或晶鬚(whisker)以及真空滲透。參見，例如Bilang,et al.(Gene 100：247-250(1991)，Scheid et al.(Mol.Gen.Genet.228：104-112,1991)、Guerche et al.(Plant Science 52：111-116,1987)、Neuhause et al.(Theor.Appl Genet.75：30-36,1987)、Klein et al.,Nature 327：70-73(1987)；Howell et al.(Science 208：1265,1980)、Horsch et al.(Science 227：1229-1231,1985)、DeBlock et al.,Plant Physiology 91：694-701,1989)、Methods for Plant Molecular Biology(Weissbach and Weissbach,eds.,Academic Press Inc.,1988)、Methods in Plant Molecular Biology(Schuler and Zielinski,eds.,Academic Press Inc.,1989)、Liu and Lomonossoff(J.Virol Meth,105：343-348,2002)、美國專利 號4,945,050；5,036,006；5,100,792；6,403,865；5,625,136(其全部以引用的方式併入本文)。
可使用短暫表現的方法來表現本發明之構築體(參見Liu and Lomonossoff,2002,Journal of Virological Methods,105：343-348；將其以引用的方式併入本文)。替代地，可使用以真空為基礎的短暫表現方法，如同於PCT公開案WO 00/063400、WO 00/037663中所描述的(以引用的方式併入本文)。這些方法可包括例如但不限於農桿菌接種或農桿菌滲透法的方法，然而，亦可使用如同上面所提的其他短暫的方法。以農桿菌接種或農桿菌滲透法，包含想要的核酸的農桿菌混合物進入組織的細胞間隙(例如葉)、植物的空中部分(包括莖、葉與花)、植物的其他部分(莖、根、花)或整株植物。在越過表皮之後，農桿菌感染並將t-DNA副本轉移至細胞中。將t-DNA游離地轉錄並轉譯mRNA，導致感興趣之蛋白質在受感染細胞中產生，然而，t-DNA在細胞核內的通行為短暫的。
本文所描述的序列總結如下。
本發明將進一步地於下列範例中說明。然而要了解這些範例僅作為說明性的目的，並且不應該以任何方式被用來限制本發明的範圍。
範例
表現卡匣的組裝
可被使用於VLP生產的構築體係描述於美國臨時申請案第US 61/220,161號以及PCT/CA2010/000983(將其以引用的方式併入本文)、WO 2009/009876、WO 2009/076778以及WO2010/003225(將其全部以引用的方式併入本文)。亦可包括那些列舉於表格2的構築體。這些構築體的組裝係描述於WO 2009/009876、WO 2009/076778、WO2010/003225以及US 61/220,161。然而包含已知HA的其他構築體，其包括但不限於那些於表格2所提供的，以及與相似或不同調節因子與啟動子結合者，亦可用於如同本文描述之VLP生產。
CPMV-HT表現卡匣包括35S啟動子，以控制含感興趣之編碼序列的mRNA之表現，其5’端為具有在位置115與161的突變ATG之豇豆嵌紋病毒(CPMV)RNA2的核苷酸1-512，以及3’端為CPMV RNA2的核苷酸3330-3481(與3’UTR相對應)，其後為NOS終止子。質體pBD-C5-1LC(Sainsbury et al.2008；Plant Biotechnology Journal 6：82-92以及PCT公開號WO 2007/135480)被用於以CPMV-HT為基礎的血球凝集素表現卡匣之組裝。CPMV RNA2的位置115與161的ATG突變係使用於Darveau et al.(Methods in Neuroscience 26：77-85(1995))中出現的以PCR為基礎之接合方法完成。使用pBD-C5-1LC作為模板以執行兩個獨立的PCR。第一次擴增的引子為pBinPlus.2613c(SEQ ID NO：3)以及Mut-ATG115.r(SEQ ID NO：4)。第二次擴增的引子為Mut-ATG161.c(SEQ ID NO：5)以及LC-C5-1.110r(SEQ ID NO：6)。混合兩個片段並使用為第三次擴增的模板，其使用pBinPlus.2613c(SEQ ID NO：3)與LC-C5-1.110r(SEQ ID NO：6)為引子。將產生的片段以PacI以及ApaI消化並且轉殖至以相同酵素消化的pBD-C5-1LC。生成的表現卡匣稱為828。
在CPMV-HT表現卡匣中之H5 A/印尼/5/2005之組裝(構築體編號685)。
此卡匣的組裝係描述於WO 2009/009876、WO 2009/076778以及WO2010/003325，將其以引用的方式併入本文。
簡言之，將來自A/印尼/5/2005的H5編碼序列如下所述地轉殖至CPMV-HT：將限制切位ApaI(起始ATG的緊接上游)以及StuI(終止碼的緊接下游)經由執行PCR擴增而加至血球凝集素編碼序列，PCR擴增以引子ApaI-H5(A-Indo).1c(SEQ ID NO：7)以及H5(A-Indo)-StuI.1707r(SEQ ID NO：8)，使用構築體編號660(D’Aoust et al.,Plant Biotechnology Journal 6：930-940(2008))作為模板。構築體660包含苜蓿草質體藍素啟動子以及5’UTR、來自A/印尼/5/2005的H5血球凝集素編碼序列(構築體#660)、苜蓿草 質體藍素3’UTR以及終止子序列(SEQ ID NO：9；第5圖)。生成片段以ApaI與StuI限制酵素消化並轉殖至先前以相同酵素消化的構築體編號828。生成的卡匣稱為構築體編號685(第1、2圖)。
靜默抑制子
轉錄後基因靜默(PTGS)可涉及限制植物中轉殖基因的表現，而且來自馬鈴薯病毒Y(HcPro)的靜默抑制子的共同表現可被使用來抵消轉殖基因mRNAs的特定降解(Brigneti et al.,1998)。替代的靜默抑制子為本領域熟知的並且可如同本文所描述地使用(Chiba et al.,2006,Virology 346：7-14；將其以引用的方式併入本文)，舉例來說但不限於TEV-p1/HC-Pro(菸草蝕刻病毒-p1/HC-Pro)、BYV-p21、番茄叢生矮化病毒的p19(TBSV p19)、番茄皺縮病毒的殼體蛋白質(TCV-CP)、小黃瓜嵌紋病毒的2b(CMV-2b)、馬鈴薯病毒X的p25(PVX-p25)、馬鈴薯病毒M的p11(PVM-p11)、馬鈴薯病毒S的p11(PVS-p11)、藍莓枯黃病毒的p16(BScV-p16)、柑橘萎縮病毒的p23(CTV-p23)、葡萄藤捲葉關聯病毒-2的p24(GLRaV-2 p24)、葡萄藤病毒A的p10(GVA-p10)、葡萄藤病毒B的p14(GVB-p14)、獨活潛隱病毒(Heracleum latent virus)的p10(HLV-p10)或大蒜普通潛隱病毒的p16(GCLV-p16)。因此，靜默抑制子(舉例來說但不限於HcPro、TEV-p1/HC-Pro、BYV-p21、TBSV p19、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-p11、PVS-p11、BScV-p16、CTV-p23、GLRaV-2 p24、GBV-p14、HLV-p10、GCLV-p16或GVA-p10)可隨著編碼感興趣之蛋白質的核酸序列共同表現，以進一步確保植物中高量的蛋白質生產。
p19的建構係描述於WO 2010/0003225(將其以引用的方式併入本文)。簡言之，將番茄叢生矮化病毒(TBSV)之p19蛋白質的編碼序列經由在Darveau et al.(Methods in Neuroscience 26：77-85(1995))中出現之以PCR為基礎的接合方法連結至苜蓿草質體藍素表現卡匣。在第一回合的PCR，將質體藍素啟動子的區段使用引子Plasto-443c： GTATTAGTAATTAGAATTTGGTGTC(SEQ ID NO：11)以及supP19-plasto.r CCTTGTATAGCTCGTTCCATTTTCTCTCAAGATG(SEQ ID NO：12)並以構築體660(描述於WO 2010/0003225，將其以引用的方式併入本文)作為模板而擴增。與此同時地，包含p19編碼序列的另一片段以引子supP19-1c：ATGGAACGAGCTATACAAGG(SEQ ID NO：13)以及SupP19-SacI.r來擴增AGTCGAGCTCTTACTCGCTTTCTTTTTCGAAG(SEQ ID NO：14)使用如同於Voinnet et al.(The Plant Journal 33：949-956(2003))中所描述的構築體35S：p19作為模板。再將擴增產物混合並用作以引子Plasto-443c與SupP19-SacI.r進行的第二回合擴增(組裝反應)的模板。將生成片段以BamHI(在質體藍素啟動子)以及SacI(於p19編碼序列的末端)消化並轉殖至先前以相同限制酵素消化的構築體編號660，以提供構築體編號R472。質體被用以經由電穿孔(Mattanovich et al.,1989)來轉形農桿腫瘤菌(Agrobacteium tumefaciens)。所有A.tumefaciens種株的完整性係經由限制酵素圖譜確認。含有R472的A.tumefaciens種株(第11B圖)稱為「AGL1/R472」。
以如同Hamilton et al.(2002)中所描述的製備HcPro構築體(35HcPro)。將所有轉殖體定序以確認構築體的完整性。質體被用以經由電穿孔(Mattanovich et al.,1989)來轉形農桿腫瘤菌(Agrobacteium tumefaciens，AGL1；ATCC,Manassas,VA 20108,USA)。所有A.tumefaciens種株的完整性係經由限制酵素圖譜確認。
植物生物質的製備、接種、農桿菌滲透以及收成
圓葉菸草(Nicotiana benthamiana)植物係在以營業用的泥炭蘚基質填滿之平地中從種子開始生長。植物被允許於16/8光照期以及日間25℃/夜間20℃之溫度規律的溫室中生長。在播種後三星期，將個別的植株挑選出來，移植於盆中並使其在相同環境條件下於溫室生長額外的三星期。在六個星期後，植株具有80g的平均重量以及30cm之高度。
將農桿菌種株AGL1以如下鑑定的構築體並使用由D’Aoust et al.,2008描述的方法(Plant Biotechnology Journal 6：930-940)進行轉染(電穿孔)。將轉染的農桿菌培養於以10mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸(MES)、20μM乙醯丁香酮、50μg/ml康黴素與25μg/ml卡本西林(pH5.6)補充之YEB培養基至OD600介於0.6與1.6之間。使用前將農桿菌懸浮液離心並且重新懸浮於滲透媒介(10mM MgCl2以及10mM MES(pH 5.6))中。
將植物如同在D’Aoust et al.(同上)中描述以農桿菌滲透。簡言之，對真空滲透而言，將農桿菌懸浮液離心、重新懸浮於滲透媒介並於4℃下儲存隔夜。在滲透作用當天，將培養批次稀釋於2.5倍的培養體積並且在使用前使其升溫。將圓葉菸草的整個植株於20-40Torr的真空下倒置於空氣密封不銹鋼罐的細菌懸浮液中2分鐘。除非另外指明，所有滲透作用係以1：1的比率與以R472(種株AGL1/R472)轉形的細菌共同滲透。在真空滲透之後，將植物移回溫室4-6天的培養期間直至收成。
葉片取樣以及總蛋白質萃取(機械性均質化作用)
在4、5、6、7以及8天的培養後，將植物的氣生部分收成並立即使用。經由在3倍體積之冷50mM Tris(pH 8.0)、含有1% Trition X-100的0.15M NaCl以及0.004%偏二亞硫酸鈉中將植物組織均質化而萃取總可溶性蛋白質。使用POLYTRONTM來機械性地均質化植物組織，以杵臼或以在1倍體積的冷50mM Tris(pH 8)、0.15M NaCl中的COMITROLTM研磨。與COMITROLTM一起使用的緩衝液亦包含0.04%偏二亞硫酸鈉。在均質化之後，將研磨的植物材料泥漿於4℃下以5,000g離心5分鐘並且保留粗製萃取物(上清液)供分析。以Bradford試驗法(Bio-Rad,Hercules,CA)並使用牛血清白蛋白作為參考標準品而測定澄清的粗製萃取物之總蛋白質內容物。
經由細胞壁消化作用之VLP萃取
由圓葉菸草植株收集葉片組織並切成~1cm2小塊。將葉片小 塊在室溫(RT)下浸泡於500mM甘露醇中30分鐘。再將甘露醇溶液移除並以酵素混合物(在原生質溶液(500mM甘露醇、10mM CaCl2以及5mM MES/KOH(pH 5.6))中之來自木黴菌(Onozuka R-10；3% v/v)的纖維素酶混合物以及來自根黴屬(MACEROZYMETM；0.75% v/v；兩者皆來自Yakult Pharmaceuticals)的果膠酶混合物)更換。使用比率為每100mL溶液20g葉片小塊。此製劑均勻塗抹至淺型容器(~11x18cm)並且以40rpm與26℃下於旋轉震盪器培養16小時。
替代地，VLP萃取可如下操作：將植物以如同描述於範例1的AGL1/#685農桿菌滲透。在滲透後第6天從N.benthamiana植物收集葉片組織並切至~1cm2小塊。在600mM甘露醇、75mM檸檬酸鹽、0.04%二硫化鈉(pH 6.0)緩衝液中使用1：2.5(w/v)新鮮生物質：消化緩衝液的比率加入Multifect Pectinase FE、Multifect CX CG以及Multifect CX B(Genencor)至每個1.0%(v/v)。將生物質在室溫下於迴轉式震盪器中消化15小時。
在培養後，以過濾(250或400μm網眼的尼龍過濾器)移除葉片碎片。以200×g的離心(15分鐘)收集懸浮液中的原生質體，接著於5000×g(15分鐘)之上清液離心以進一步澄清上清液。替代地，可採用於5000×g、15分鐘的單一離心步驟。再將70mL上清液於70,000×g離心30分鐘。將生成的團塊重新懸浮於1.7mL PBS並立即分析或冷凍。
蛋白質分析
H5的血球凝集素試驗係根據由Nayak and Reichl(2004)描述的方法。簡言之，測試樣本(100μL)的連續二次稀釋在含有100μL PBS的V形底96孔微量盤中進行，每個孔洞留下100μL稀釋樣本。將100μL的0.25%火雞紅血球細胞懸浮液(Bio Link Inc.,Syracuse,NY)加至每個孔洞，並且將盤於室溫下培養2小時。將顯示完全的血球凝集作用的最高稀釋之倒數記錄為血球凝集活性。與此同時地，將重組HA5標準品(A/越南/1203/2004 H5N1)(Protein Science Corporation,Meriden,CT)於PBS中稀釋並於每一盤 以對照組進行。
ELISA
以純化類病毒顆粒來製備HA5標準品，將其以1% Triton X-100處理接著於Tissue LyserTM(Qiagen)機械性攪拌1分鐘而加以破壞。將U形底96孔微量盤以在50mM碳酸鹽-碳酸氫鹽塗布緩衝液(pH 9.6)中之10μg/mL補捉抗體(Immune Technology Corporation,#IT-003-005I)於4℃塗布16-18小時。所有清洗以包含0.1% Tween-20的0.01M PBS(磷酸鹽緩衝液)(pH 7.4)操作。在培養之後，清洗盤三次並且以在PBS中之1%酪蛋白於37℃阻斷1小時。在阻斷步驟之後，清洗盤三次。將HA5標準品於對照組萃取物(由單獨以AGL1/R472滲透的葉片組織製備)中稀釋以產生從500至50ng/mL的標準曲線。在裝載進微量盤之前將要定量的樣本於1% Triton X-100中處理。將盤進一步地於37℃培養1小時。在清洗之後，加入以1：1000稀釋之抗HA5的綿羊多株抗體(CBER/FDA)並且將盤於37℃下培養1小時。在清洗後，將1：1000稀釋之辣根過氧化氫酶共軛兔抗綿羊抗體加入並將盤於37℃下培養1小時。在最後清洗後，將盤以SureBlue TMB過氧化氫酶受質(KPL)於室溫下培養20分鐘。以1N HCl的加入終止反應並且使用Multiskan Ascent盤讀取儀(Thermo Scientific)測量A450數值。
範例1：具有相對活性升高的高量HA之植物組織酵素萃取
將由本酵素萃取方法獲得的HA之量與相對活性與由一般的機械性萃取方法獲得的HA之量與相對活性進行比較。以AGL1/685滲透圓葉菸草植物並且在五至六天的培養期間後收成葉片。葉片均質物製備如下：將2g葉片以Polytron均質機均質化；將4g葉片以杵與臼研磨；以及將25kg葉片在萃取緩衝液(50mM Tris、150mM NaCl(pH 8.0)、1：1(w/v)之比率)中以COMITROLTM處理機(Urschel Laboratories)均質化。酵素萃取如下進行：將20g收成的葉片如同上述以Macerozyme果膠酶與Onozuka R-10纖維素酶消化。在消化作用後，經由過濾來移除葉片碎片(尼龍過濾器， 250μm網孔)。將在懸浮液中之原生質體經由200×g(15分鐘)的離心移除，並且將上清液經由5000×g(15分鐘)的離心進一步澄清。
在每一個這些植物萃取物之HA的相對活性與數量係顯示於表格3。當與其他使用的方法相比，由細胞壁的酵素消化所釋出的HA量顯著較優。
範例2：植物組織酵素消化作用釋出所組織的HA至VLP。
不同的離心與尺寸排除層析(SEC)的組合被使用以證實由本文描述之酵素萃取方法所獲得的HA被組織為VLP。將圓葉菸草植物以如同描述於範例1的AGL1/685進行農桿菌滲透。在滲透6天後從植物收集葉片並且如同範例1中描述將葉片切至~1cm2小塊再消化、粗過濾並離心。
再將澄清的樣本於70,000×g離心以使VLP分離。在被裝載於SEC管柱之前，將包含VLP的離心團塊溫和地重新懸浮於1/50倍體積的磷酸鹽緩衝液(PBS；0.1M磷酸鈉、0.15M NaCl(pH 7.2))中。
以平衡/沖提緩衝液(50mM Tris、150mM NaCl、pH 8)製備32ml的SEPHACRYLTM S-500高解析珠SEC管柱(S-500 HR：GE Healthcare,Uppsala,Sweden,Cat.No.17-0613-10)。以1.5mL VLP樣本裝載於經平衡管柱而執行SEC層析法，以及其以45mL平衡/沖提緩衝液進行沖提。將沖提物收集於1.7mL餾分，並且經由以200μL稀釋的Bio-Rad蛋白質染料試劑(Bio-Rad,Hercules,CA)混合10μL沖提餾分以評估每個餾分的蛋白質含量。每次分離係藉由Blue Dextran 2000(GE Healthcare Bio-Science Corp.,Piscataway,NJ,USA)的校正而進行。對每次分離，進行Blue Dextran 2000與宿主蛋白質的沖提概況之比較，以確保分離的一致性。
SEC沖提餾分之蛋白質分析
使用牛血清白蛋白作為參考標準品，以Bradford試驗(Bio-Rad,Hercules,CA)測定澄清的粗製萃取物之總蛋白質含量。將存在於SEC沖提餾分的蛋白質以丙酮沉澱(Bollag et al.,1996)，重新懸浮於0.25倍體積或0.05倍體積之變性樣本裝載緩衝液(0.1M Tris(pH 6.8)、0.05%溴酚藍、12.5%甘油、4% SDS與5% β-巰基乙醇)，分別供SDS-PAGE分析或免疫墨點分析。於還原的情況下執行經由SDS-PAGE的分離，並將Coomassie Brillant Blue R-250用於蛋白質染色。
H5的血球凝集試驗係根據由Nayak and Reichl(2004)描述的方法而執行。簡言之，測試樣本(100μL)的連續二次稀釋在包含100μL PBS的V形底96孔洞微量盤中進行，每一孔洞留下100μL稀釋樣本。將100μL的0.25%火雞紅血球細胞懸浮液(Bio Link Inc.,Syracuse,NY)加至每一孔洞，並且將盤於室溫下培養2小時。將顯示完全的血球凝集作用的最高稀釋之倒數記錄為血球凝集活性。與此同時地，將重組HA5標準品(A/越南/1203/2004 H5N1)(Protein Science Corporation,Meriden,CT)稀釋於PBS中並於每一盤以對照組進行。
第3A圖顯示血球凝集活性係濃縮於對應於管柱的空隙體積(void volume)之餾分，確認血球凝集活性源自高分子量結構組織。SDS-PAGE分析(第3B圖)顯示那些相同的空隙體積餾分(餾分7至10)亦 存在最高的HA含量，而於大約75kDa處與HA0單體相對應之可偵測到條帶。
範例3：植物組織的酵素消化作用釋出了具有較少汙染物的HA-VLP
將圓葉菸草如同描述於範例1以AGL1/685進行農桿菌滲透。於滲透後第6天收集葉片，如同描述於範例1將葉片切成~1cm2小塊、消化、粗過濾並濃縮。
受控制的葉片酵素消化作用(至少部分地)移除了細胞壁，因此容許存在於細胞壁與細胞質的間隙的蛋白質以及組成物釋出至萃取媒介中。由於大部分細胞內蛋白質與組成物仍未被破壞並且包含於最完整的原生質體內，起始的離心步驟容許它們的移除，從而除了如同第4圖中所顯示的細胞外植物蛋白質以及組成物(質外體內容物部分)之外，還提供了包含細胞壁降解酵素的生成溶液。
第4圖顯示在如同先前描述在受控制的葉片組織酵素消化作用後所獲得的生成溶液之SDS-PAGE分析，以第1道顯示使用的酵素混合物以及第2道顯示酵素消化作用後的生成溶液。來自ComitrolTM之粗製萃取物的蛋白質含量提供於第3道作為比較。於第2道展示的萃取物之生物質：緩衝液比率為1：5(w/v)而在第3道為1：1(w/v)。第2與第3道每一個因此包含衍生自同等數量的起始材料。對於大約相同的緩衝液：植物比率而言，機械性植物萃取物包含大約3.5-4mg/ml的蛋白質濃度，而根據本方法所獲得的酵素植物萃取物表現大約1mg/ml的蛋白質濃度。
發現存在於第3道的主要汙染為RubisCo(核酮糖-1,5-二磷酸羧酶加氧酶)，其係以兩種蛋白質次單元組成：大鏈(L，大約55kDa)以及小鏈(S，大約13kDa)。總共八個大鏈二聚體以及八個小鏈通常彼此組裝成更大的複合物RubisCo 540kDa。然而此植物蛋白質汙染係在源於機械性萃取方法的植物萃取物中被大量發現(參見第4圖中的箭號)，這在由本文所描述的酵素消化方法所獲得的植物萃取物中幾乎是不存在的。因此，本方法容許此主要的植物蛋白質汙染在過程的早期階段中從其他成分中消 除。
範例4：在可於陽離子交換樹脂直接捕捉的條件下，植物組織的酵素消化作用釋出HA-VLP。
將圓葉菸草如同描述於範例1以AGL1/685進行農桿菌滲透。於滲透後第6天收集葉片，切成~1cm2小塊並且在迴轉式震盪器中於室溫下消化15小時。消化作用緩衝液包含1.0%(v/v)Multifect Pectinase FE、1.0%(v/v)Multifect CX CG及/或1.0%(v/v)Multifect CX B(全部來自Genencor)，每一個在使用生物質：消化作用緩衝液比率1：2.5(w/v)的600mM甘露醇、75mM檸檬酸、0.04%亞硫酸氫鈉(pH 6.0)緩衝液的溶液中。
在消化後，藉由400μm尼龍過濾器來過濾質外體內容物部分，以移除粗糙未消化的植物組織(<5%的起始生物質)。再將過濾的萃取物於室溫下以5000×g離心15分鐘，以移除原生質體與細胞內汙染物(蛋白質、DNA、膜、囊泡、色素等等)。接著，在被受到層析之前，將上清液使用0.65μm玻璃纖維過濾器(Sartopore GF plus/Sartorius Stedim)以及0.45/0.2μm過濾器(Sartopore 2/Sartorius Stedim)進行深度過濾(用於澄清)。
將澄清的質外體內容物部分裝載於以平衡/沖提緩衝液(50mM NaPO4、100mM NaCl、0.005% Tween 80(pH 6.0))平衡的陽離子交換管柱(Poros HS Applied Biosystems)上。一旦UV回到零，將萃取物以包含增加濃度的NaCl(500mM)之平衡/沖提緩衝液進行沖提步驟。如有必要，將層析餾分使用以裝設有10kDa MWCO的AmiconTM裝置濃縮10倍。如同先前範例所述執行蛋白質分析。
於上述條件下，大部分酵素與植物蛋白質不會結合至陽離子交換樹脂，而HA-VLP確實會結合，因此提供在沖提餾分中HA-VLP相當大的增濃(第6圖)。此外，如同在第6圖第4與第5道所顯示的，纖維素酶與果膠酶在低於7的pH下不會結合至陽離子交換樹脂。在陽離子交換樹脂之後，根據HA血液凝集活性之HA-VLP回收為92%。於來自陽離子交換樹脂的沖 提餾分測得純化因子194。
範例5：將NaCl加入至消化緩衝液
將圓葉菸草植物如同範例1中所描述地以帶有表現感興趣之血球凝集素(H1/Cal WT、B/Flo、H5/Indo或H1/Cal X179A)的構築體之農桿菌AGL1種株進行農桿菌滲透。於滲透後第6天收集葉片，切成~1cm2小塊並且除非以下提及，根據範例4進行消化。過濾、離心與澄清以如同範例4中所述執行。
將NaCl加至消化緩衝液，以評估其在HA-VLP回收率的潛在效果。猜想的好處為，在澄清時，潛在的防止被移除的懸浮液中HA與植物細胞或與顆粒之非專一性關聯，以及於HA-VLP膠體穩定度的實現及/或維持及/或改善的潛在效果。
將500mM NaCl加入至消化緩衝液造成在原生質體與細胞碎片經由離心移除後HA-VLP每克生物質的回收產量增加。然而，此增加僅於H1/Cal WT以及B/Flo種株被注意到，而經由此方法H5回收產量無顯著地增加(表格4)。
在消化期間加入500mM NaCl進一步造成於消化期間HA-VLP釋出的增加，其反過來造成在澄清之後對種株H1/Cal WT與H1/Cal X-179A兩者增加的回收速率(表格5)，但對種株H5/Indo並無。
使用對H5/Indo與H1/Cal WT的奈米顆粒追蹤分析(NTA)來研究於NaCl在酵素消化期間加入或不加入之HA-VLP的結合狀態(分別為第7A與7B圖)。當消化作用在NaCl缺乏下執行時，對H5觀察到單分散製劑的顆粒，而H1/Cal製劑顯示出更大量的顆粒種類。加入NaCl至消化緩衝液降低了對H1/Cal的HA-VLP自行結合，如同以在第7C圖中發現之相當地單分散顆粒分布所顯示的。藉由加入500mM NaCl至消化緩衝液以增強(約5倍)H1/Cal WT-VLPs在150nm的顆粒數量。
範例6：控制色素的釋出
如同範例1中所描述地，將圓葉菸草植物以帶有表現感興趣之血球凝集素(H5/Indo)之構築體的農桿菌AGL1種株進行農桿菌滲透。於滲透後第6天收集葉片，切至~1cm2小塊，並如同範例4中所描述地以加入500mM NaCl或者加入500mM NaCl以及25mM EDTA至消化緩衝液中來消化。如同範例4中所描述地執行過濾、離心與澄清。
於酵素消化步驟期間帶有綠色組成分的釋出導致了帶有呈現綠色的VLP之純化製劑。因此細胞壁消化溶液的組成物被探討並且調整，以獲得帶有減少的綠色VLP之純化製劑從而增加的純度。不希望被理論所約 束，由於Ca2+在保持細胞壁中間層狀結構成分一起扮演關鍵角色，並提供植物細胞壁中通常是高濃度Ca2+的事實，加入Ca2+-螫合劑EDTA可促進細胞壁的酵素解聚作用，從而保留完整的細胞內胞器(例如葉綠體)，並且避免綠色色素組成物的釋出。
如同於表格6所顯示的，加入25mM EDTA至消化緩衝液使純化的H5-VLP製劑的綠色減少，如同經由測量製劑吸光度的差異(OD672nm-OD650nm)以評估的。當綠色成分以高量釋出或未被合適地移除時，VLP製劑表現△OD>0.040。
範例7：替代的消化緩衝液組成物
如同範例1中所描述地，將圓葉菸草植物以帶有表現感興趣之血球凝集素(H5/Indo)之構築體的農桿菌AGL1種株進行農桿菌滲透。於滲透後第6天收集葉片，切至~1cm2小塊，並如同範例4中所描述地消化，而消化緩衝液的改良包括如同在表格7至9所提的0%、0.25%、0.5%、0.75%或1%(v/v)Multifect Pectinase FE、Multifect CX-CG纖維素酶以及Multifect CX B纖維素酶。如同範例4中所描述地執行過濾、離心與澄清。
如同顯示於下列表格7與表格8，已證實果膠酶在消化緩衝液為非必需的。可以本方法在果膠酶的存在或缺乏下萃取相似量的H5/Indo或H1/Cal WT VLP。再者，已發現當與先前範例比較時降低纖維素酶的濃度對萃取品質沒有顯著影響(表格9)。
表格7：經由圓葉菸草葉片的消化之H5/Indo VLP的釋出。所有條件以重覆
範例8：接近中性pH的條件下之酵素消化
於消化期間控制pH對一些VLP的萃取可為關鍵性的。考慮到：於消化步驟期間發生細胞壁解聚作用可於合適緩衝液的存在下釋出可酸化溶液的酸糖(即由pH 6至5)，以及已經證實一些VLP(例如包含H3/Bris 與B/Flo HA的那些)對弱酸性條件強烈的敏感性，調查此類潛在酸化作用對所生產的VLP產量的影響。
如同範例1中所描述的，將圓葉菸草植物以帶有表現感興趣之血球凝集素(B/Flo、H5/Indo、H3/Bris)之構築體的農桿菌AGL1種株進行農桿菌滲透。於滲透後第6天收集葉片，切至~1cm2小塊，並如同範例4中所描述地消化，而消化條件的改良包括500mM NaCl；25或50mM EDTA；0.03或0.04%亞硫酸氫鈉；0、100、200或600mM甘露醇、75、125或150mM檸檬酸鹽；及/或75mM NaPO4；而如同在表格10至14設定而調整的消化緩衝液之pH。如同範例4中所描述地執行過濾、離心與澄清。
各種消化緩衝液組成物在酵素消化結束前被測試達到pH大約5.5，包括檸檬酸鹽濃度的增加(介於pH 3.0與5.4的緩衝液效應)以及磷酸鈉的加入(於pH高於6.0的緩衝液效應)。表格10顯示當消化後pH接近pH 6.0時，來自B種株之VLP被更有效地萃取。
接著，測試以較高pH起始消化作用以達到最終pH值接近6.0之影響。如同在表格11中所顯示地，植物細胞壁以此類接近中性條件的消化作用是可能的，並且不損害H5/Indo VLP的萃取產量。
消化溶液的其他組成物亦顯示為可改良而不負面影響VLP的萃取產量。表12說明了為了增高B/Flo VLP萃取產量而可被應用於消化溶液的改良，而獲得消化後pH 5.4-5.7。此類改良包括增加檸檬酸鹽的濃度並添加PO4緩衝液。已發現增加EDTA的濃度通常導致更酸化的萃取物以及較低的VLP萃取產量。
緩衝液組成物被進一步改良以改善H3/布里斯班VLP的萃取產量(表格13)。
如同在表格12與13中顯示的，甘露醇濃度可被降低至200mM而不顯著地影響VLP萃取產量。甘露醇濃度進一步降低至100mM，以及甚至甘露醇從消化溶液全部省略並未顯著地影響所獲得的HA-VLP之量(表格14)。
範例9：對於各種HA-VLP之酵素消化之適應性
描述於本文的植物生物質之酵素消化方法具有要被應用於各種HA-VLP萃取的潛力。除了顯示於先前範例的包含H5/Indo、H1/Cal WT VLP、H3/Bris以及B/Flo的HA-VLP之萃取，描述於本文的方法亦顯示出適合於HA-VLP從季節性的H1/Bris與H1/NC中萃取，如同在表格15中所顯示的。
表格15：季節性的H1/Bris與H1/NC VLP從農桿菌滲透之圓葉菸草葉片之消
範例10：抗體製備、表現與分析
C2B8表現卡匣(構築體#595)的組裝
C2B8為針對於表現在非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)的B細胞專一性抗原CD20之嵌合(鼠/人類)單株抗體。C2B8調節補體作用以及抗體依賴性細胞調節之細胞毒殺作用並且於活體外對惡性B細胞株具有直接的抗增生效果(N Selenko et.al.,Leukemia,October 2001,15(10)；1619-1626)。
合成包含84bp的苜蓿草質體藍素啟動子、完整的C2B8輕鏈編碼序列以及完整的苜蓿草質體藍素終止子的DNA片段(LC片段)。LC片段被DraIII限制切位(於質體藍素啟動子發現)以及質體藍素終止子下游的EcoRI切位夾在兩側。LC片段的序列呈現於第9圖(SEQ ID NO：15)。將包含LC片段的質體以DraIII與EcoRI消化並且轉殖至先前以相同酵素消化的構築體#660(D’Aoust et al.,Plant Biotechnol.J.2008,6：930-940)。將生成的質體稱為構築體編號590。合成包含84bp的苜蓿草質體藍素啟動子、完整的C2B8重鏈編碼序列以及完整的苜蓿草質體藍素終止子的第二DNA片段(HC片段)。HC片段被DraIII限制切位(於質體藍素啟動子發現)以及質體藍素終止子下游的EcoRI切位夾在兩側。HC片段的序列呈現於第16圖(SEQ ID NO：16)。將包含HC片段的質體以DraIII與EcoRI消化並且轉殖至先前以相同酵素消化的構築體#660(D’Aoust et al.,Plant Biotechnol.J.2008,6：930-940)。將生成的質體稱為構築體編號592。將包含592的農桿腫瘤菌(A.tumefacians)種株稱為「AGL1/592」。
將包含用於C2B8表現之雙表現卡匣的質體(構築體#595)被組裝如下。將構築體編號592以EcoRI消化，以Klenow片段處理以生成鈍端並且以SbfI消化。將生成的片段(包含被SbfI切位與鈍端夾於兩側的用於表現C2B8重鏈之完整卡匣)插至先前以SbfI與SmaI消化的構築體#590。第11A圖呈現用於在植物中表現C2B8的構築體#590之示意圖。
P19表現卡匣之組裝(構築體#R472)
編碼p19蛋白質的構築體R472係描述於上(「靜默抑制子」，參見第11B圖)
植物生物質之製備、細菌接種、農桿菌滲透以及收成
將圓葉菸草植物如上所述(「植物生物質之製備、細菌接種、農桿菌滲透以及收成」)於16/8的光照期以及日間25℃/夜間20℃的溫度規律之溫室中生長。在播種三週後，將個別的植株挑選出來，移植至盆中並使其在相同環境條件下於溫室生長額外的三週。
將帶有構築體#595或#R472的農桿菌培養於以10mM 2-[N-嗎啉基]乙磺酸(MES)、50μg/ml康黴素以及25μg/ml卡本西林(pH5.6)補充之BBL Select APS LB broth培養基，直到它們到達OD600>2.0。將農桿菌懸浮液於使用前離心並且重新懸浮於滲透媒介(10mM MgCl2以及10mM MES(pH 5.6))並且於4℃儲存隔夜。在滲透當天，將培養批次以6.7倍培養體積稀釋並且在使用前使其加溫。將圓葉菸草的整株植物於20-40Torr的真空下倒置於氣體密封不銹鋼罐的細菌懸浮液1分鐘。在滲透後，將植物移回溫室5天的培養期直到收成。以1：1比率之種株AGL1/595與AGL1/R472之共同滲透而執行滲透。
葉片取樣以及總蛋白萃取(機械性萃取)
在培養之後，將植物的氣生部分收成並且立即使用。經由以1.5倍體積之冷20mM NaPO4(pH 6.0)、0.15M NaCl以及2mM偏二亞硫酸鈉，將植物組織在家用攪拌均質器中均質化3分鐘，以萃取總可溶性蛋白 質。在均質化後，將研磨的植物材料泥漿於Miracloth過濾，以移除大型不可溶碎片。藉由加入1M HCl將萃取物的pH調整至4.8，並且經由離心18000g、15分鐘(4℃)來移除非可溶材料。收集上清液並且以Tris base(2M)調整pH至8.0。於4℃下以18000g離心15分鐘而移除不可溶材料並且收集粗製萃取物(上清液)。以Bradford試驗(Bio-Rad,Hercules,CA)並使用牛血清白蛋白作為參考標準品而測定澄清的粗製萃取物之總蛋白質內容物。
經由細胞壁消化作用之蛋白質萃取
從圓葉菸草植物收集葉片組織並且切成~1cm2小塊。將葉片小塊置於2.425倍體積之消化溶液(75mM檸檬酸鹽(pH 6.9)、600mM甘露醇、1% Multifect Pectinase FE、1% Multifect CXG、1% Multifect B)。將此製劑均勻塗布至淺型容器並且於迴轉式震盪器以120rpm、18℃下培養16小時。在培養後，將葉片碎片經由尼龍過濾器(250μm網孔)過濾而移除。將萃取物於5000g離心15分鐘(22℃)並且收集上清液且於0.65μm玻璃纖維過濾。將萃取物以0.5M Tris base調整至pH 6.0並於PES膜0.45/0.22μm過濾。
硫酸銨沉澱以及抗體純化
將硫酸銨緩慢加至蛋白質萃取物以達成45%飽和度。將萃取物保持於冰上60分鐘並且於18000g離心20分鐘(4℃)。將上清液丟棄並且將團塊保持冷凍(-80℃)直到使用時。
將冷凍蛋白質團塊解凍並重新懸浮於1/10倍體積(相較於沉澱前體積)的蛋白質再懸浮溶液(50mM Tris pH 7.4、150mM NaCl)。將蛋白質溶液於12000g離心20分鐘(4℃)以移除非可溶材料。將蛋白質溶液裝載至MabSelect Sure樹脂(GE Healthcare,Baie d’Urfé,Canada)。以10CV的50mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl沖洗管柱並以6CV的100mM檸檬酸鈉(pH 3.0)沖提抗體。收集沖提體積於1CV餾分於包含1/10倍CV的2M Tris(pH 7.4)、NaCl 150mM的管中。根據其蛋白質含量(經由Bradford法測量) 選擇沖提餾分以及將所選定的餾分合併並且在分析前保持冷凍(-80℃)。
蛋白質定量以及SDS-PAGE分析
以Bradford試驗法(Bio-Rad,Hercules,CA)並使用牛血清白蛋白(針對粗製蛋白質萃取物)或市面上的美羅華(rituximab,Rituxan®,Hoffmann-La Roche,Mississauga,Canada)(針對純化的抗體)作為參考標準品而測定總蛋白質含量。如同由Laemmli(Nature 1970,227：680-685)所描述地執行Coomassie染色之SDS-PAGE。
經由ELISA之C2B8定量
將多孔盤(Immulon 2HB,ThermoLab System,Franklin,MA)以在50mM碳酸緩衝液(pH 9.6)中之2.0μg/ml單株鼠抗人類IgG(Abcam,Ab9243)於4℃下塗布16-18小時。再將多孔盤在37℃下於磷酸鹽緩衝液(PBS)(Pierce Biotechnology,Rockford,Il)中的1%酪蛋白經由1小時培養以阻斷。以美羅華(Rituxan®,Hoffmann-La Roche,Mississauga,Canada)的稀釋產生標準曲線。當執行免疫試驗時，將所有稀釋(對照組與樣本)於從滲透之植物組織獲得的植物萃取物中執行並且以對照組(mock)接種(僅AGL1/R472)培養以消除基質效應。將植物與蛋白質樣本以及標準曲線稀釋物於37℃培養1小時。在以在PBS中之0.1% Tween-20(PBS-T)清洗三次後，將盤與過氧化酶共軛之驢抗人類IgG抗體(在阻斷溶液中1/4000倍稀釋)(Jackson ImmunoResearch 709-035-149)於37℃下培養1小時。重覆以PBS-T清洗並且將盤以3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(TMB)Sure Blue過氧化酶受質(KPL,Gaithersburg,MD)培養。藉由加入1N HCl來終止反應並且在450nm讀取吸光值。以三重覆分析每個樣本並且將濃度插入標準曲線的線性部分。
N-聚醣分析
將包含C2B8的樣本(RituxanTM；50μg)於15% SDS/PAGE分離。以Coomassie blue顯現出重鏈與輕鏈並且將對應於重鏈的蛋白質條帶切下並且切成小片段。將片段以600μL的0.1M NH4HCO3/CH3CN(1/1)溶 液清洗3次，每次15分鐘並且乾燥。
二硫橋的減少經由膠體片段於56℃下在600μL之0.1M NH4HCO3中之0.1M DTT溶液培養45分鐘而發生。經由室溫下加入600μL之55mM碘乙醯胺溶液至0.1M NH4HCO3中30分鐘而進行烷基化作用。丟棄上清液並且於NH4HCO3 0.1M/CH3CN(1/1)中再清洗聚丙醯胺片段一次。
再將蛋白質以在600μL的0.05M NH4HCO3中之7.5μg胰蛋白酶(Promega)於37℃消化16小時。加入200μL CH3CN並且收集上清液。再將膠體片段以200μL的0.1M NH4HCO3清洗，接著再次以200μL CH3CN清洗並且最後以200μL 5%甲酸清洗。匯集並凍乾所有上清液。
藉由層析法在Sep-Pack C18卡匣上將醣肽從胜肽中分離出來。將醣肽以在水中之10% CH3CN專一性地沖提出來然後在配備有337-nm氮氣雷射之Voyager DE-Pro MALDI-TOF儀器(Applied Biosystems,USA)上藉由MALDI-TOF-MS分析。使用二氫苯甲酸(Sigma-Aldrich)作為基質在反射型延遲萃取模式操作質譜。
範例11：C2B8抗體萃取產量之比較
將酵素消化與C2B8抗體的萃取之機械性萃取進行比較。將圓葉菸草植物以AGL1/595與AGL1/R472進行農桿菌滲透。在6天的培養後，收成葉片並且經由酵素消化或機械性萃取來萃取蛋白質。執行兩次萃取並且將生成的萃取物比較體積、蛋白質濃度以及抗體(C2B8)含量。結果顯示於表格16。
由700g生物質，機械性萃取產生平均1440ml蛋白質萃取物，而消化作用產生2285ml蛋白質萃取物。C2B8抗體百分比在來自消化作用的萃取物(萃取蛋白質的平均值479%)高於在攪拌均質器中產生的萃取物(萃取蛋白質的平均值3.49%)。總之，萃取物體積越高以及在萃取物發現的抗體濃度越高，造成消化作用的萃取產量(240.75mg C2B8/kg鮮重)比機械性萃取(175.95mg C2B8/kg鮮重)高37%。
範例13：純化之C2B8抗體之比較(蛋白質含量)
如同範例10所述，藉由在蛋白質A的親和層析法將C2B8抗體由萃取物中純化。將由機械性萃取或消化作用所獲得之萃取物來純化的產物於其蛋白質含量的基礎上相比。由每個萃取批次所純化之抗體電泳概況係顯示於第12圖。結果顯示，從攪拌均質器萃取或者細胞壁消化作用所純化的產物概況為類似的。
範例14：純化之C2B8抗體之比較(N-醣化作用)
蛋白質的N-醣化作用包括在帶有N-X-S/T序列的分泌蛋白質之天門冬醯胺酸上添加複合聚醣結構，其中N為天門冬醯胺酸、X為除了脯胺酸之外的任何胺基酸以及S/T為絲胺酸或蘇胺酸。先質聚醣係於蛋白質轉譯期間在內質網提早添加，並且在其運輸通過分泌路徑期間，N-聚醣受到成熟作用。從在內質網(ER)中的高甘露糖類型之N-聚醣，植物中的N-聚醣成熟作用包括葡萄糖殘基的添加或移除、末端位置之甘露糖的移除以及N-乙醯胺基葡萄糖、木糖、海藻糖以及半乳糖殘基的添加。植物中N-聚醣的成熟作用係由Gomord et al.在植物中治療性蛋白質的轉譯後修飾(Curr.Opin.Plant Biol.2004,7：171-181)裡描述。N-醣化作用路徑的酵素係位於分泌路徑的每個隔間中精確的位置，即內質網、順式-高基氏體、中間高基氏體以及反式-高基氏體。因此，蛋白質的N-醣化作用模式將取決於萃取那一刻其位置而異。我們先前已觀察到，使用圓葉菸草的農桿菌滲透所產生之抗體的某些部分帶有高甘露糖類型的不成熟N-聚醣(儘管被靶定標耙於 質外體)(Vezina et al.,Plant Biotechnol.J.2009 7：442-455)。其他地方報導了類似的觀察(Sriraman et al.,Plant Biotechnol.J.2004,2,279-287)。在兩個案例中，不成熟N-聚醣於抗體的某些部分之存在被解釋為萃取那一刻分泌路徑的早期隔間中抗體存在的結果。
下列研究測驗經由細胞壁消化之分泌的醣蛋白之萃取是否偏好萃取帶有複合N-聚醣的重組蛋白質。分泌至質外體的抗體以及其他醣蛋白被期待帶有具完成其成熟作用的N聚醣。成熟的N聚醣最常帶有末端N-乙醯麩胺酸鹽或半乳糖殘基並且亦稱為複合N-聚醣。相反地，不成熟的N-聚醣，最常被發現於分泌路徑中途的蛋白質，其包含末端甘露糖殘基。在C2B8(RituxanTM)上之N-聚醣的高甘露糖含量已與血流中降低的半衰期相關聯(Kanda et al.,Glycobiology 2006,17：104-118)。在此背景下，能夠有助於帶有複合N-聚醣的質外體醣蛋白從植物萃取出來的萃取方法是想要的。
如同描述於範例10，進行純化的C2B8抗體之N-醣化作用之比較分析。結果證實由消化的生物質所純化的抗體帶有顯著較低比例的寡聚甘露醣苷N-聚醣(第13A圖)以及作為推論，帶有顯著較高比例的複雜N-聚醣(第13B圖)。
經由細胞壁消化的萃取亦可應用於如同描述於WO 2008/151440(Modifying glycoprotein production in plants；將其以引用的方式併入本文)的共同表現醣蛋白與用於修飾N-醣化作用概況之一或更多酵素的植物，以有利於回收帶有經修飾之成熟N-聚醣的醣蛋白。舉例來說，成熟的N-聚醣可被減少，或免除木糖與海藻糖殘基。
修飾N-醣化作用的方法可涉及共同表現與編碼β-1,4-半乳糖苷基轉移酶(GalT；以WO 2008/151440的SEQ ID NO：14提供)之核苷酸序列一起的感興趣之蛋白質，舉例來說但不限於哺乳動物GalT或人類GalT，然而亦可使用來自另一來源的GalT。亦可將GalT的催化區域(舉例來說如同描述於WO 2008/151440的SEQ ID NO：14的核苷酸370-1194)融合 至N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶(GNT1；舉例來說，含有如同WO 2008/151440中提供之SEQ ID NO：17的核苷酸34-87)的CTS區域，以產生GNT1-GalT混合酵素。混合酵素可與編碼感興趣之表層結構蛋白質的序列共同表現。此外，編碼感興趣之表層結構的序列可與編碼N-乙醯葡萄糖胺基轉移酶III(GnT-III；如同描述於WO 2008/151440中的SEQ ID NO：16)的核苷酸序列共同表現共同表現。亦可使用哺乳動物GnT-III或人類GnT-III、來自其他來源的GnT-III。此外，亦可使用包含融合至GnT-III的GNT1之CTS的GNT1-GnT-III混合酵素(SEQ ID NO：26；如同描述於WO 2008/151440)。
範例15：鬆動植物細胞壁之植物生物質的處理
如同描述於範例1，將圓葉菸草植物以帶有表現感興趣之血球凝集素(H1/CA07)的構築體之農桿菌AGL1種株進行農桿菌滲透。於滲透後第5日收集葉片，切成~1cm2小塊，並根據範例4以及使用包括0、25、100或250mM EDTA而改良的75mM檸檬酸鹽、500mM NaCl(pH 6.1)緩衝液，以進行消化作用。細胞碎片的粗過濾與離心係如同描述於範例4。測試來自此離心作用的上清液之蛋白質濃度與血球凝集活性。將植物以或不以描述於範例4的消化酵素進行處理，以說明EDTA對於蛋白質釋出的影響。值得注意的是，加至消化緩衝液的酵素約佔0.8mg/ml。第15圖顯示EDTA加至植物(而無酵素)可從質外體萃取蛋白質，其中包含H1 VLP。
第15圖亦顯示EDTA具有伴隨最大效果介於20-100mM之間的H1 VLP釋放增強效果。EDTA被認為扮演Ca++清道夫，其為植物細胞壁的重要成分，協助植物細胞壁的解聚作用。
範例16：鬆動植物細胞壁的植物生物質處理
如同描述於範例1，將圓葉菸草植物以帶有表現感興趣之血球凝集素(H1/CA07)的農桿菌AGL1種株進行農桿菌滲透。於滲透後第5日收集葉片，切成~1cm2小塊，並根據範例4進行消化，控制消化緩衝液包含1.0%(v/v)Multifect Pectinase FE、1.0%(v/v)Multifect CX CG或/及1.0% (v/v)Multifect CX B(全部來自Genencor)，其每一個在600mM甘露醇、75mM檸檬酸鹽、25mM EDTA、0.04%亞硫酸氫鈉(pH 6.0)緩衝液的溶液中，使用生物質：消化緩衝液比率1：2.5(w/v)。在相同消化緩衝液中執行包含3% Multifect Pectinase FE(v/v)的比較性消化作用。細胞碎片的粗過濾以及離心係如同描述於範例4。測試來自此離心作用的上清液之蛋白質濃度與血球凝集活性。表格17顯示果膠酶組成物容許蛋白質與HA VLP的釋出。
表格17顯示，以3%果膠酶、有或沒有使用纖維素專一性酵素與半纖維素專一性酵素處理之植物時蛋白質以及VLP的釋出。使用Bradford試驗法測量蛋白質濃度。HA活性係以可萃取至血球凝集紅血球細胞之蛋白質最低量的倒數表示。
範例17：經由酵素滲透之葉片與植物處理
酵素滲透可容許VLP自整個葉片增加的釋出。為了測驗此方法，將VLP由在真空或壓力下以細胞壁鬆動組成物滲透之葉片來進行萃取。
VLP萃取
如同描述於範例1，以AGL1/#685來農桿菌滲透植物。於滲透後第5或7日從圓葉菸草植物收集葉片組織。將整個植物及/或整個葉片浸泡於酵素溶液，其包含：一或更多果膠酶(由1%至4%(v/v)的Biocatalyst 162L、由1.0%至4.0%(v/v)的Biocatalysts 444L或每個由1%至4%(v/v)之其組合物、由1%至4%(v/v)的Biocatalysts PDN33)。亦將整個植物或整個葉片浸泡於包含果膠酶(由1%至4%(v/v)的Biocatalyst 162L以及由1.0%至4.0%(v/v)的Biocatalyst 444L)以及纖維素酶(每個由1.0%至4.0%(v/v)的Multifect CX CG及/或Multifect CX B(Genencor))之酵素溶液，其使用 比率1：2.5(w/v)新鮮生物質：消化緩衝液、在600mM甘露醇、75mM檸檬酸鹽、0.04%亞硫酸氫鈉(pH 6.0)的緩衝液中。在一範例中，將Biocatalyst 162L加至1%以及將Biocatalyst 444L加至4%，然而本領域之技術人員會了解這些百分比可取決於消化期間而變化。果膠酶活性越高，消化期間越短。本領域之技術人員進一步理解，只要此過程中果膠分解需求被滿足，則可使用本領域所知的廣泛酵素。可將緩衝液調整至從5.0至6.5之pH或介於其間的任何值，以及在消化期間處於此狀態，或可將pH經由添加緩衝液溶液而調整至保持起始數值(即5.0至6.5之間或介於其間的任何值之範圍)。此外，緩衝液可隨選地以各種抗氧化劑(像是例如偏亞硫酸鹽)來補充。來自酵素溶液的酵素藉由真空或壓力滲透法而滲透至整個植物或整個葉片。
在酵素滲透之後，可將整個葉片及/或植物在過程結束時留在消化緩衝液中並震盪，或者在整個消化期間緩慢震盪(視容器種類而介於40-80rpm之間)。不同的攪拌將導致不同程度的消化作用，特別是對於維管束組織(葉脈)。未以酵素滲透的葉片將需要更長的時間(即如同範例4中概述的15小時的過程)以及需要更強的攪拌。
第16A圖顯示，於4小時(時間0.25t)從已利用酵素溶液來滲透的葉片比當葉片僅在相同酵素溶液中浸泡並且震盪16小時(時間t)後釋出同樣多的VLP(釋出至溶液的HA)。亦觀察到(結果未顯示)重覆的滲透為比延長的單一滲透步驟更為有利。當相較於浸泡並且震盪但未以相同酵素溶液滲透的葉片時，酵素滲透容許於消化時間的四分之一釋出相同量的HA/VLP。
亦觀察到當測定HA釋出時，以整個葉片比切片葉片的酵素滲透法更為有效(見第16B圖)。由於可使用整個葉片或植物並且因此可省略切割植物或植物材料的步驟，酵素滲透法容許更簡易的萃取步驟。
葉片組織的液化作用可藉由僅使用果膠酶而獲得，以有效的釋出HA/VLP。果膠酶的酵素滲透亦比僅有果膠酶可行，特別是具有高相對 聚半乳糖醛酸苷酶含量的酵素(舉例來說Biocatalyst 162L/144L)相較於僅有Biocatalyst 444L(第16C圖)。只要它們各別或皆具有聚半乳糖醛酸苷酶活性以及果膠裂解酶活性，可單獨或與另一者組合而使用任何果膠酶。合適的果膠酶為例如「Biocatalyst 162L」及/或「Biocatalyst 144L」。酵素滲透容許使用較簡易的消化溶液，例如僅包含果膠酶的溶液。不希望被理論所約束，此溶液可能對原生質體損害較少。
如同第16D圖所見的，以適合的緩衝液與酵素混合，HA/VLP之酵素協助的萃取可於pH接近中性時發生。因此酵素滲透法的使用容許用於pH敏感性蛋白質的純化。
雖然本文已完全闡明，所有引用資料係以引用的方式併入本文，猶如每個各別出版品為具體與各別地表示為以引用的方式併入本文。本文引用之引用資料不被理解或被視為此類引用為本發明之先前技藝的承認。
本發明之一或更多目前優選的具體實施例已以範例的方式描述。本發明包括大體上如同前文描述的所有具體實施例、改良以及變化以及範例與圖式的參考。對本領域的技術人員來說，在不悖離如同申請專利範圍定義的本發明範圍之下可進行一些變化與改良將是明顯的。此類改良的範例包括為了以大體上相同的方式實現相同結果下對本發明的任何方面之已知等效物的替換。
<110> MEDICAGO INC. Couture,Manon Paquet,Dany VEZINA,Louis-Philippe
<120> 植物衍生蛋白質回收方法
<130> V83963WO
<150> US 61/466,889
<151> 2011-03-23
<160> 16
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 3067
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 用於表現H5/Indo的構築體685
<400> 1
<210> 2
<211> 568
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 由用於表現H5/Indo的構築體685編碼之胺基酸序列
<400> 2
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子pBinPlus.2613.c
<400> 3
<210> 4
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子Mut-ATG115.r
<400> 4
<210> 5
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子Mut-ATG161.c
<400> 5
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子LC-C5-1.110r
<400> 6
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子LC-C5-1.110r
<400> 7
<210> 8
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子H5(A-Indo)-StuI.1707r
<400> 8
<210> 9
<211> 3111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 核酸序列(構築體660)
<400> 9
<210> 10
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PDI信號胜肽
<400> 10
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子Plasto-443c
<400> 11
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子supP19-plasto.r
<400> 12
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引子supP19-1c
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<210> 14
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
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<400> 14
<210> 15
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<212> DNA
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<220>
<223> 構築體590
<400> 15
<210> 16
<211> 1919
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 構築體編號592
<400> 16

Claims (20)

  1. 一種由植物或植物物質回收蛋白質、表層結構蛋白質或類病毒顆粒(VLP)的方法，包含：a.獲得包含位於質外體的蛋白質、位於質外體的表層結構蛋白質或位於質外體的VLP的該植物或植物物質，該位於質外體的表層結構蛋白質具有從75至1500kDa的一分子量；b.以包含從20至250mM的乙二胺四乙酸(EDTA)或乙二醇四乙酸(EGTA)的一組成物處理該植物或植物物質，以鬆動細胞壁來產生具有一鬆動細胞壁的該植物或植物物質，從而釋放該位於質外體的蛋白質、位於質外體的表層結構蛋白質或位於質外體的VLP，以產生一植物培養混合物，將該植物培養混合物分離以產生一植物細胞部分及一質外體部分；以及c.從該質外體部分回收該蛋白質、該表層結構蛋白質或該VLP。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中在該處理步驟(步驟b)更包含生物性處理、物理性處理或其組合。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的方法，其中該物理性處理包含音波振動處理。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該組成物更包含一酵素混合物，該酵素混合物藉由酵素滲透被導入到該植物或植物物質。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的方法，其中該酵素混合物包含一或多於一個果膠酶、一或多於一個纖維素酶或是一或多於一個果膠酶與一或多於一個纖維素酶。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該組成物包含乙二胺四乙酸(EDTA)。
  7. 如申請專利範圍第2項所述的方法，其中該生物性處理包含以一或更多擴張蛋白、生長激素或其組合的處理。
  8. 如申請專利範圍第4項所述的方法，其中該組成物不包括一或更多的一脂 酶、一蛋白酶或一果膠酶。
  9. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中在該獲得步驟(步驟a)中，該植物或植物物質係以一編碼該蛋白質或該表層結構蛋白質的一核酸序列轉化，該蛋白質或該表層結構蛋白質係選自由一蛋白質、一蛋白質叢生物、一蛋白質複合物、一蛋白酶體、一蛻變中間產物(metabolon)、一轉錄複合物、一重組複合物、一光合成複合物、一膜運輸複合物、一核孔複合物、一蛋白質奈米顆粒、一醣蛋白、一抗體、一多株抗體、一單株抗體、一單鏈單株抗體、一類病毒顆粒(VLP)、一病毒被膜蛋白質、一病毒結構蛋白質、一病毒殼體蛋白質以及一病毒外殼蛋白質、一嵌合蛋白質、一嵌合蛋白質複合物、一嵌合蛋白質奈米顆粒、一嵌合醣蛋白、一嵌合抗體、一嵌合單株抗體、一嵌合單鏈單株抗體以及一嵌合血球凝集素所組成之群組，並且收成該植物或植物物質。
  10. 如申請專利範圍第9項所述的方法，其中將該核酸以一短暫的方式引入該植物或植物物質。
  11. 如申請專利範圍第9項所述的方法，其中將該核酸穩定地合併至該植物的一基因組內。
  12. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中在該獲得步驟(步驟a)中，該植物或植物物質被種植並且該植物或植物物質被收成。
  13. 如申請專利範圍第9項所述的方法，其中該核酸編碼一單株抗體或一流感血球凝集素。
  14. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該蛋白質或該表層結構蛋白質不包括神經胺糖酸苷酶或M蛋白質。
  15. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該植物物質係選自由葉片以及培養的植物細胞所組成之群組。
  16. 如申請專利範圍第1項所述的方法，還包含一步驟d)：從該質外體部分純化該蛋白質、該表層結構蛋白質或該VLP。
  17. 如申請專利範圍第16項所述的方法，其中該d)純化步驟包含使用深度過濾以過濾該質外體部分，以產生一澄清萃取物，接著使用尺寸排除層析法、陽離子交換樹脂或親和層析法或其組合來層析該澄清萃取物。
  18. 如申請專利範圍第1項所述的方法，其中該處理步驟(步驟b)係經由離心、深度過濾或其組合而進行分離。
  19. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中該一或多於一個果膠酶的一濃度是介於0.01%體積/體積(v/v)至2.5% v/v之間。
  20. 如申請專利範圍第5項所述的方法，其中該一或多於一個纖維素酶的一濃度是介於0.1%至5%重量/體積(w/v)之間。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HRP20220478T1 (hr) 2009-09-22 2022-05-27 Medicago Inc. Način pripreme proteina od biljaka
TWI620816B (zh) 2011-03-23 2018-04-11 苜蓿股份有限公司 植物衍生蛋白回收方法
US11390878B2 (en) 2011-09-30 2022-07-19 Medicago Inc. Increasing protein yield in plants
BR112015024790A2 (pt) * 2013-03-28 2017-10-10 Medicago Inc produção de partícula semelhante a vírus influenza em plantas
ES2864081T3 (es) 2014-01-10 2021-10-13 Medicago Inc Elementos potenciadores de CPMV
WO2015143567A1 (en) 2014-03-27 2015-10-01 Medicago Inc. Modified cpmv enhancer elements
FR3054547B1 (fr) * 2016-07-29 2020-06-05 Angany Inc. Particules pseudo-virales et leurs utilisations
CN110483616B (zh) * 2019-07-31 2021-06-04 中国农业科学院农产品加工研究所 从感染病原菌的植物组织中分离病原菌分泌的质外体效应蛋白的方法
EP3808854A1 (de) * 2019-10-17 2021-04-21 eleva GmbH Verfahren zur gewinnung von material von pflanzenzelloberflächen

Family Cites Families (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
EP0203177A4 (en) 1984-11-29 1987-04-28 Scripps Clinic Res POLYPEPTIDES AND ANTIBODIES AGAINST DEGGLYCOSILIZED VIRAL GLYCOPROTEINS.
US6846968B1 (en) * 1988-02-26 2005-01-25 Large Scale Biology Corporation Production of lysosomal enzymes in plants by transient expression
US5232833A (en) 1988-09-14 1993-08-03 Stressgen Biotechnologies Corporation Accumulation of heat shock proteins for evaluating biological damage due to chronic exposure of an organism to sublethal levels of pollutants
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
ATE142883T1 (de) 1991-03-28 1996-10-15 Rooperol Na Nv Zusammensetzungen von phytosterolen mit phytosterolinen als immunmodulatoren
UA48104C2 (uk) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, який містить послідовність,що кодує інсектицидний протеїн, оптимізовану для кукурудзи,фрагмент днк, який забезпечує направлену бажану для серцевини стебла експресію зв'язаного з нею структурного гена в рослині, фрагмент днк, який забезпечує специфічну для пилку експресію зв`язаного з нею структурного гена в рослині, рекомбінантна молекула днк, спосіб одержання оптимізованої для кукурудзи кодуючої послідовності інсектицидного протеїну, спосіб захисту рослин кукурудзи щонайменше від однієї комахи-шкідника
US6326470B1 (en) 1997-04-15 2001-12-04 The Penn State Research Foundation Enhancement of accessibility of cellulose by expansins
US5762939A (en) 1993-09-13 1998-06-09 Mg-Pmc, Llc Method for producing influenza hemagglutinin multivalent vaccines using baculovirus
US6020169A (en) 1995-07-20 2000-02-01 Washington State University Research Foundation Production of secreted foreign polypeptides in plant cell culture
DE69637875D1 (de) * 1995-09-14 2009-04-30 Virginia Tech Intell Prop Produktion von lysosomalen enzymen in pflanzlichen expressionssystemen
US20010006950A1 (en) 1998-02-11 2001-07-05 Juha Punnonen Genetic vaccine vector engineering
US6489537B1 (en) 1998-08-07 2002-12-03 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Phytochelatin synthases and uses therefor
KR20010072372A (ko) 1998-08-11 2001-07-31 맥기 데이비드 알 식물조직의 간질액으로부터 단백질을 추출하는 방법
AU2594300A (en) 1998-12-23 2000-07-12 Samuel Roberts Noble Foundation, Inc., The Plant transformation process
FR2791358B1 (fr) 1999-03-22 2003-05-16 Meristem Therapeutics Promoteurs chimeriques d'expression, cassettes d'expression, plasmides, vecteurs, plantes et semences transgeniques les contenant et leurs methodes d'obtention
AU4365200A (en) 1999-04-21 2000-11-02 Samuel Roberts Noble Foundation, Inc., The Plant transformation process
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
CA2435000C (en) 2001-01-18 2014-03-25 Vlaams Interuniversitair Instituut Voor Biotechnologie Vzw Oligomeric complexes of chimeric proteins with enhanced immunogenic potential
DE10143205A1 (de) * 2001-09-04 2003-03-20 Icon Genetics Ag Verfahren zur Proteinproduktion in Pflanzen
WO2003025124A2 (en) 2001-09-14 2003-03-27 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Immunoglobulin having particular framework scaffold and methods of making and using
EP3009507B1 (en) 2002-02-13 2020-06-24 Wisconsin Alumini Research Foundation Signal for packaging of influenza virus vectors
US20040063188A1 (en) 2002-02-14 2004-04-01 Novavax, Inc. Kit for treating gastrointestinal tract
US7897842B2 (en) 2002-03-19 2011-03-01 Plant Research International B.V. GnTIII expression in plants
DE602004028004D1 (de) 2003-05-05 2010-08-19 Thompson Boyce Plant Res Vektoren und zellen zur herstellung von aus transgenen pflanzen gewonnenen immunprotektiven zusammensetzungen
WO2004098530A2 (en) 2003-05-05 2004-11-18 Dow Agrosciences Llc Stable immunoprophylactic and therapeutic compositions derived from transgenic plant cells and methods for production
CA2816222A1 (en) 2003-06-16 2005-03-03 Medimmune Vaccines, Inc. Influenza hemagglutinin and neuraminidase variants
US8592197B2 (en) 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
US7901691B2 (en) 2004-08-13 2011-03-08 Council Of Scientific And Indistrial Research Chimeric G protein based rabies vaccine
EP1883701B1 (en) 2005-04-29 2012-01-18 University of Cape Town Expression of viral proteins in plants
US20090117144A1 (en) 2005-07-19 2009-05-07 Lada Rasochova Recombinant flu vaccines
US7871626B2 (en) 2005-08-04 2011-01-18 St. Jude Children's Research Hospital Modified influenza virus for monitoring and improving vaccine efficiency
SG2014012868A (en) 2005-10-18 2014-09-26 Novavax Inc Functional influenza virus like particles (vlps)
EP1969001A2 (en) 2005-11-22 2008-09-17 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Norovirus and sapovirus antigens
CA2642054C (en) 2006-02-13 2017-11-21 Fraunhofer Usa, Inc. Influenza antigens, vaccine compositions, and related methods
US20070250003A1 (en) 2006-04-03 2007-10-25 Bare Rex O Fluid activated retractable safety syringe
KR20080109094A (ko) 2006-04-21 2008-12-16 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨 조류 인플루엔자 백신 및 이용방법
US8778353B2 (en) 2006-05-01 2014-07-15 Technovax, Inc. Influenza virus-like particle (VLP) compositions
AU2007314550A1 (en) 2006-05-18 2008-05-08 Pharmexa Inc. Inducing immune responses to influenza virus using polypeptide and nucleic acid compositions
EP2029755A1 (en) 2006-05-22 2009-03-04 Plant Bioscience Limited Bipartite system, method and composition for the constitutive and inducible expression of high levels of foreign proteins in plants
US20070286873A1 (en) 2006-05-23 2007-12-13 Williams John V Recombinant Influenza H5 Hemagluttinin Protein And Nucleic Acid Coding Therefor
MX2008015770A (es) 2006-07-13 2009-01-07 Sca Hygiene Prod Ab Una costura que une al menos dos materiales de red o trama.
US8523925B2 (en) 2007-01-17 2013-09-03 Lerner Medical Devices, Inc. Fiber optic phototherapy device
US7730950B2 (en) 2007-01-19 2010-06-08 Halliburton Energy Services, Inc. Methods for treating intervals of a subterranean formation having variable permeability
CN104962579A (zh) 2007-06-15 2015-10-07 麦迪卡格公司 修饰植物中的糖蛋白产生
KR100964462B1 (ko) 2007-07-10 2010-06-16 성균관대학교산학협력단 형질전환 식물 유래의 조류독감 바이러스 백신 및 그 제조방법
CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
WO2009026397A2 (en) 2007-08-20 2009-02-26 Fraunhofer Usa, Inc. Prophylactic and therapeutic influenza vaccines, antigens, compositions, and methods
MX2010007962A (es) 2007-11-27 2010-11-10 Medicago Inc Particulas tipo virus de influenza recombinante (vlp) producidas en plantas transgenicas que expresan hemaglutinina.
EP2235165A1 (en) * 2007-12-21 2010-10-06 Cytos Biotechnology AG Process for clarifying cell homogenates
EA201001064A1 (ru) 2007-12-28 2011-02-28 Юнилевер Н.В. Способ извлечения аромата из чая
US8799801B2 (en) 2008-01-16 2014-08-05 Qualcomm Incorporated Interactive ticker
EA034733B1 (ru) 2008-01-21 2020-03-13 Медикаго Инк. Нуклеиновая кислота для увеличенной экспрессии гемагглютинина вируса гриппа в растении и ее применение
DK2294202T3 (en) 2008-07-08 2015-08-31 Medicago Inc SOLUBLE RECOMBINANT INFLUENZA ANTIGENES
CN101626276A (zh) 2008-07-10 2010-01-13 华为技术有限公司 广告替换方法、装置及系统
CN102165062B (zh) 2008-07-18 2017-09-08 麦迪卡格公司 新的流感病毒免疫表位
JP5785080B2 (ja) 2008-08-27 2015-09-24 アリゾナ・ボード・オブ・リージェンツ・フォー・アンド・オン・ビハーフ・オブ・アリゾナ・ステイト・ユニバーシティＡｒｉｚｏｎａ Ｂｏａｒｄ Ｏｆ Ｒｅｇｅｎｔｓ Ｆｏｒ Ａｎｄ Ｏｎ Ｂｅｈａｌｆ Ｏｆ Ａｒｉｚｏｎａ Ｓｔａｔｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ 植物におけるワクチン及びモノクローナル抗体治療薬の高レベル迅速生産のためのｄｎａレプリコン系
WO2010042551A2 (en) 2008-10-06 2010-04-15 Genvault Corporation Methods for providing cellular lysates from cell wall-containing samples
WO2010077712A1 (en) 2008-12-09 2010-07-08 Novavax, Inc. Bovine respiratory syncytial virus virus-like particle (vlps)
US20100233095A1 (en) 2009-01-30 2010-09-16 Adlyfe, Inc. Conformationally dynamic peptides
AU2010259986B2 (en) 2009-06-10 2015-04-02 Nono Inc. Co-administration of an agent linked to an internalization peptide with an anti-inflammatory
TR201811076T4 (tr) 2009-06-10 2018-08-27 Arbutus Biopharma Corp Geliştirilmiş lipit formulasyonu.
NO2445928T3 (zh) 2009-06-24 2018-08-25
HRP20220478T1 (hr) 2009-09-22 2022-05-27 Medicago Inc. Način pripreme proteina od biljaka
WO2012061815A2 (en) 2010-11-05 2012-05-10 Novavax Inc. RABIES GLYCOPROTEIN VIRUS-LIKE PARTICLES (VLPs)
TWI526539B (zh) 2010-12-22 2016-03-21 苜蓿股份有限公司 植物中生產類病毒顆粒(vlp)的方法及以該方法生產之vlp
TWI620816B (zh) 2011-03-23 2018-04-11 苜蓿股份有限公司 植物衍生蛋白回收方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cosgrove DJ, "Loosening of plant cell walls by expansins", Nature, vol.407, p.321-326, 2000/09/21
Fischer R et al., "Affinity-purification of a TMV-specific recombinant full-size antibody from a transgenic tobacco suspension culture", Journal of Immunological Methods, vol.226, p.1-10, 1999/06
Fischer R et al., "Affinity-purification of a TMV-specific recombinant full-size antibody from a transgenic tobacco suspension culture", Journal of Immunological Methods, vol.226, p.1-10, 1999/06 Hellwig S et al., "Plant cell cultures for the production of recombinant proteins", Nature Biotechnology, vol.22, no.11, p.1415-1422, 2004/11/04 Cosgrove DJ, "Loosening of plant cell walls by expansins", Nature, vol.407, p.321-326, 2000/09/21 Low D et al., "Future of antibody purification", Journal of Chromatography B, vol.848, p.48-63, 2006/11/28 *
Hellwig S et al., "Plant cell cultures for the production of recombinant proteins", Nature Biotechnology, vol.22, no.11, p.1415-1422, 2004/11/04
Low D et al., "Future of antibody purification", Journal of Chromatography B, vol.848, p.48-63, 2006/11/28

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