EA034733B1 - Нуклеиновая кислота для увеличенной экспрессии гемагглютинина вируса гриппа в растении и ее применение - Google Patents

Нуклеиновая кислота для увеличенной экспрессии гемагглютинина вируса гриппа в растении и ее применение Download PDF

Info

Publication number
EA034733B1
EA034733B1 EA201001198A EA201001198A EA034733B1 EA 034733 B1 EA034733 B1 EA 034733B1 EA 201001198 A EA201001198 A EA 201001198A EA 201001198 A EA201001198 A EA 201001198A EA 034733 B1 EA034733 B1 EA 034733B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seq
plant
influenza virus
virus
nucleic acid
Prior art date
Application number
EA201001198A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201001198A1 (ru
Inventor
Марк-Андре Д'Ау
Манон КУТЮР
Фредерик Орс
Сонья Трепанье
Пьер-Оливье Лавуа
Мишель Даргис
Луи-Филипп ВЕЗИНА
Натали ЛАНДРИ
Original Assignee
Медикаго Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from CA002615372A external-priority patent/CA2615372A1/en
Application filed by Медикаго Инк. filed Critical Медикаго Инк.
Priority claimed from PCT/CA2009/000032 external-priority patent/WO2009076778A1/en
Publication of EA201001198A1 publication Critical patent/EA201001198A1/ru
Publication of EA034733B1 publication Critical patent/EA034733B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H5/00—Angiosperms, i.e. flowering plants, characterised by their plant parts; Angiosperms characterised otherwise than by their botanic taxonomy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/145—Orthomyxoviridae, e.g. influenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y503/00—Intramolecular oxidoreductases (5.3)
    • C12Y503/04—Intramolecular oxidoreductases (5.3) transposing S-S bonds (5.3.4)
    • C12Y503/04001—Protein disulfide-isomerase (5.3.4.1), i.e. disufide bond-forming enzyme
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F9/00—Arrangements for program control, e.g. control units
    • G06F9/06—Arrangements for program control, e.g. control units using stored programs, i.e. using an internal store of processing equipment to receive or retain programs
    • G06F9/46—Multiprogramming arrangements
    • G06F9/50—Allocation of resources, e.g. of the central processing unit [CPU]
    • G06F9/5005—Allocation of resources, e.g. of the central processing unit [CPU] to service a request
    • G06F9/5027—Allocation of resources, e.g. of the central processing unit [CPU] to service a request the resource being a machine, e.g. CPUs, Servers, Terminals
    • G06F9/505—Allocation of resources, e.g. of the central processing unit [CPU] to service a request the resource being a machine, e.g. CPUs, Servers, Terminals considering the load
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55583—Polysaccharides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55588—Adjuvants of undefined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/58—Medicinal preparations containing antigens or antibodies raising an immune response against a target which is not the antigen used for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16123—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16133—Use of viral protein as therapeutic agent other than vaccine, e.g. apoptosis inducing or anti-inflammatory
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16151—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16171—Demonstrated in vivo effect
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16222—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16223—Virus like particles [VLP]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16211—Influenzavirus B, i.e. influenza B virus
    • C12N2760/16234—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/65—Vector systems having a special element relevant for transcription from plants
    • G—PHYSICS
    • G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
    • G06F—ELECTRIC DIGITAL DATA PROCESSING
    • G06F2209/00—Indexing scheme relating to G06F9/00
    • G06F2209/50—Indexing scheme relating to G06F9/50
    • G06F2209/508—Monitor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)

Abstract

Изобретение относится к нуклеиновой кислоте для увеличенной экспрессии в растении гемагглютинина (HA) вируса гриппа типа A или B, которая включает полинуклеотид, кодирующий HA, регуляторный элемент, активный в растении и содержащий соответствующий промотор и энхансер CPMV. Изобретение также относится к растению, содержащему заявленную нуклеиновую кислоту, которое может быть использовано в способе получения вирусоподобных частиц. Также изобретение относится к полученным вирусоподобным частицам и содержащим их иммуногенным композициям, которые могут быть использованы в способах индуцирования иммунитета против вируса гриппа. Изобретение также относится к растению, растительному экстракту и пищевой добавке, содержащим вирусоподобные частицы, и их применениям.

Description

Область техники
Настоящее изобретение относится к производству вирусоподобных частиц. Более конкретно, настоящее изобретение относится к производству вирусоподобных частиц, содержащих антигены вируса гриппа.
Предпосылки создания изобретения
Грипп является главной причиной смерти людей из-за воздействия респираторного вируса. Типичными симптомами заболевания являются лихорадка, боль в горле, одышка и, наряду с прочим, боль в мышцах. Во время вспышки заболевания вирусами гриппа инфицируются 10-20% населения всего мира, что обусловливает ежегодно смерть 250-500 тыс. человек.
Вирусы гриппа относятся к оболочечным вирусам, которые отпочковываются от плазматической мембраны инфицированных клеток млекопитающих и птиц. Их классифицируют на типы А, В или С по присутствующим на них нуклеопротеидам и антигенам белков матрикса. Вирусы гриппа типа A можно дополнительно подразделить на подтипы по комбинации представленных поверхностных гликопротеинов, т.е. гемагглютинина (HA) нейраминидазы (NA). HA управляет способностью вируса связываться с клеткой хозяина и проникать в нее. NA отщепляет концевые остатки сиаловых кислот от полисахаридных цепочек на клетке хозяина и поверхностных вирусных белках, которые предотвращают агрегацию вирусов и обеспечивают подвижность вируса. В настоящее время известны 16 подтипов HA (H1-H16) и 9 подтипов NA (N1-N9). Каждый вирус гриппа типа A представляет один тип HA и один тип NA-гликопротеида. Как правило, каждый подтип проявляет видоспецифичность; например, известно, что все подтипы HA и NA заражают птиц, а человека инфицируют только подтипы H1, H2, H3, H5, H7, H9, H10, N1, N2, N3 и N7 (Horimoto, 2006; Suzuki 2005). Вирусы гриппа, содержащие H5, H7 и H9, считаются самыми патогенными формами вирусов гриппа типа A и с большой вероятностью будут причиной будущих пандемий.
Пандемии гриппа обычно вызывают высокозаразные и вирулентные вирусы гриппа; пандемии могут приводить к росту заболеваемости и смертности по всему миру. Появление новых подтипов вируса гриппа типа A привело в XX веке к 4 большим пандемиям. Грипп испанка, вызванный вирусом H1N1 в 1918-1919 гг., вызвал смерть более 50 млн человек по всему миру в период между 1917 и 1920 гг. В настоящее время постоянно существует риск появления нового подтипа или заражения человека подтипами, эндемичными для животных. Особую тревогу вызывает высоковирулентная форма вируса птичьего гриппа, вспышки которого отмечены в нескольких странах. Во многих случаях птичий грипп ведет к смертности, приближающейся к 100%, в течение 48 ч. Распространение вируса птичьего гриппа (H5N1), впервые обнаруженного в Гонконге в 1997 г., на другие страны Азии и Европы связали с путями миграции диких птиц.
Современный метод борьбы с гриппом у человека заключается в ежегодной вакцинации. Вакцина, как правило, представляет собой комбинацию нескольких штаммов, которые по прогнозам должны доминировать в будущей сезонной вспышке гриппа. Прогноз координируется Всемирной организацией здравоохранения. Как правило, количество доз вакцины, изготавливаемых каждый год, недостаточно для вакцинирования населения во всем мире. Например, Канада и США получают количество доз вакцины, достаточное для иммунизации примерно одной трети своего населения, в то время когда может быть вакцинировано только 17% населения Евросоюза. Очевидно, что текущее производство противогриппозной вакцины окажется недостаточным в преддверии будущей пандемии гриппа. Даже если каким-то образом в определенном году удастся произвести нужное количество вакцины, доминирующие штаммы год от года меняются, что делает нецелесообразным запас, создаваемый в периоды низкой потребности. С экономической точки зрения крупномасштабное производство эффективной противогриппозной вакцины вызывает большую заинтересованность у правительства и у частного бизнеса.
Вирусы для вакцин производят в оплодотворенных куриных яйцах. Вирусные частицы извлекают и для производства инактивированной вакцины разрушают с помощью детергентов, тем самым инактивируя вирус. Живые аттенуированные вакцины производят из вирусов гриппа, приспособленных для роста при низких температурах - это означает, что при нормальной температуре тела вакцина будет аттенуированной. Такая вакцина лицензирована в США для лиц в возрасте от 5 до 49 лет. Вакцины из инактивированного целого вируса становятся безвредными при инактивации химическими реагентами, и их получают в куриных эмбрионах или культурах клеток млекопитающих. Все эти типы вакцины имеют определенные преимущества и недостатки. Одно преимущество вакцин из целых вирусов - это тип иммунного ответа, вызываемого такими вакцинами. Как правило, сплит-вакцины стимулируют выраженную выработку антител, а вакцины из целого вируса вызывают и выработку антител (гуморальный ответ), и клеточный ответ. Даже если ответ в виде выработки функциональных антител является критерием для лицензирования, коррелирующим с защитой, которую обеспечивает вакцина, появляется все больше данных о том, что в иммунитете против гриппа также важен T-клеточный ответ - это может обеспечивать лучшую защиту у пожилых людей.
Для индукции клеточного иммунного ответа разработаны вакцины из целого вируса. Из-за высокой патогенности штаммов вируса гриппа (например, H5N1) такие вакцины производят на заводах с уровнем биологической безопасности 3+. В случаях высокопатогенных штаммов вируса гриппа, таких как H5N1,
- 1 034733 некоторые производители изменили последовательность в гене гемагглютинина, чтобы снизить патогенность штамма вируса гриппа и сделать его менее вирулентным и легче воспроизводящимся в куриных яйцах или культуре клеток млекопитающих. Другие также используют химерные вирусы гриппа, в которых последовательность гемагглютинина и белков нейраминидазы клонируют в низкопатогенном донорском штамме вируса гриппа, дающего высокий выход (A/PR/8/34; Quan F-S et al., 2007). Если таким методами можно получать полезные вакцины, то они не являются оптимальным решением при потребности в широкомасштабном, малозатратном и быстром производстве вакцины в количествах, необходимых для удовлетворения глобальных потребностей в обычном году и практически наверняка будет недостаточными в преддверии пандемии.
При использовании генетической технологии с обратной транскрипцией может возникнуть необходимость изменения генетической последовательности белка HA, чтобы сделать его авирулентным. В случаях высокопатогенных штаммов вируса гриппа производство вакцин из целого вируса требует либо процедур, выполняющихся в изолированных помещениях, либо получающаяся вакцина не будет точно совпадать с генетической последовательностью циркулирующего вируса. В случае живых аттенуированных вакцин сохраняется риск того, что введенная вакцина будет рекомбинироваться с вирусом гриппа у хозяина, что приведет к появлению нового вируса гриппа.
В то время как этот метод позволяет сохранить эпитоп антигена и посттрансляционные модификации, ему присущ ряд недостатков, включая риск загрязнения из-за использования целого вируса и различного выхода в зависимости от штамма вируса. Г енетическая гетерогенность вируса может приводить к субоптимальному уровню защиты, что происходит при заражении яиц. Другие недостатки включают долгосрочное планирование в отношении получения яиц, риск загрязнения, поскольку в процессе очистки используются химические вещества, и длительное время производства.
Также лица с повышенной чувствительностью к яичному белку могут быть не пригодны в качестве кандидатов для применения этой вакцины.
В случае пандемии производство сплит-вакцины ограничено необходимостью приспособить определенный штамм к росту в куриных яйцах, и выход продукта различен. Хотя такая технология применялась в течение многих лет для производства сезонных вакцин, она вряд ли окажется применимой в приемлемых временных рамках во время пандемии, и мировые производственные мощности не беспредельны.
Чтобы уйти от необходимости использовать куриные яйца, вирусы гриппа также культивировали в культурах клеток млекопитающих, например в клетках MDCK или PERC.6 или им подобных. Другой подход - обратная генетика, когда вирусы выращивают путем трансформации клетки с использованием вирусных генов. Однако для этих методик тоже требуется целый вирус, а также трудоемкие процедуры и определенные условия культивирования.
В качестве кандидатов на рекомбинантную противогриппозную вакцину разработано несколько рекомбинантных продуктов. Такие подходы сфокусированы на выработке, получении и очистке белков HA и NA вируса гриппа типа A, включая выработку этих белков с помощью клеток насекомых, инфицированных бакуловирусом (Crawford et al., 1999; Johansson, 1999), вирусных векторов и вакцинных ДНКконструкций (Olsen et al., 1997).
Специфика вируса гриппа хорошо известна. Вкратце, инфекционный цикл запускается прикреплением белка HA на поверхности вириона к клеточному рецептору, содержащему сиаловую кислоту (гликопротеины и гликолипиды). Белок NA способствует обработке рецептора, содержащего сиаловую кислоту, и проникновение вируса в клетку зависит от НА-зависимого эндоцитоза, опосредованного рецептором. В отделах, интернализованных эндосом с кислой средой, содержащих вирион гриппа, белок HA подвергается конформационным изменениям, которые ведут к слиянию мембран вируса и клетки и раскрытию оболочки вируса и высвобождению M1-белков, опосредованному M2, из рибонуклеопротеидов, связанных с нуклеокапсидом (PCH), которые мигрируют в клеточное ядро для синтеза вирусной РНК. Антитела к белкам HA противодействуют инфекции, нейтрализуя инфицирующую способность вируса, а антитела к белкам NA опосредуют этот эффект на ранних стадиях репликации вируса.
Crawford et al. (1999) описали выработку HA вируса гриппа в клетках насекомых, инфицированных бакуловирусом. Согласно описанию вырабатывающиеся белки способны предупреждать смертельное заболевание, вызванное подтипами вируса птичьего гриппа H5 и H7. Johansson et al. (1999) считают, что белки HA и NA вируса гриппа, вырабатывающиеся в клетках, инфицированных бакуловирусом, вызывают у животных иммунный ответ, превосходящий таковой на традиционную вакцину. Иммуногенность и эффективность гемагглютинина вируса лошадиного гриппа, вырабатывающегося в клетках, инфицированных бакуловирусом, сравнили с кандидатом для использования в вакцине - гомологичной ДНК (Olsen et al., 1997). В совокупности эти данные демонстрируют, что высокая степень защиты против вируса гриппа может быть достигнута с помощью рекомбинантных белков HA или NA с использованием различных экспериментальных методик и на разных моделях у животных.
Поскольку в предыдущих исследованиях показано, что поверхностные гликопротеины вируса гриппа, HA и NA, являются главными мишенями при создании защитного иммунитета против вируса гриппа и что M1 представляет собой консервативную мишень для клеточного иммунитета к гриппу, по
- 2 034733 тенциальная новая вакцина может включать эти вирусные антигены как макромолекулярные белковые частицы, такие как вирусоподобные частицы (ВЧ). В качестве продуктов для создания вакцин ВЧ имеют преимущество, являясь более иммуногенными, чем субъединичные или рекомбинантные антигены, и могут стимулировать как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ (Grgacic, Anderson, 2006). Кроме того, частица с такими антигенами гриппа может иметь конформационные эпитопы, которые стимулируют выработку нейтрализующих антител к множеству штаммов вируса гриппа.
Производство неинфекционного штамма вируса гриппа для использования в вакцине - один из путей предупреждения нежелательной инфекции. Также вирусоподобные частицы исследованы как заменители культивируемого вируса. ВЧ имитируют структуру вирусного капсида, но не содержат геном и поэтому не могут реплицироваться или быть источником вторичной инфекции.
В нескольких исследованиях установлено, что рекомбинантные белки вируса гриппа самопроизвольно образуют ВЧ в клеточной культуре при использовании плазмид экспрессии млекопитающих или бакуловирусных векторов (Gomez-Puertas et al., 1999; Neumann et al., 2000; Latham, Galarza, 2001). Gomez-Puertas et al. (1999) указывают, что эффективное образование ВЧ гриппа зависит от уровня экспрессии нескольких вирусных белков. Neumann et al. (2000) создали систему, основанную на плазмиде экспрессии млекопитающих, для производства инфекционных вирусоподобных частиц гриппа полностью из клонированных к ДНК. Latham и Galarza (2001 г.) описали образование ВЧ гриппа в клетках насекомых, инфицированных рекомбинантным бакуловирусом, одновременно экспрессирующим гены HA, NA, M1 и M2. Эти исследования продемонстрировали, что белки вириона вируса гриппа могут самопроизвольно собираться при коэкспрессии в клетках эукариотов.
Gomez-Puertas et al. (2000) излагают идею, что, помимо гемагглютинина (HA), для отпочковывания ВЧ от клеток насекомых требуется матриксный белок (M1) вируса гриппа. Однако Chen et al. (2007) указывают, что M1, возможно, для образования ВЧ не требуется, и считают, что для эффективного высвобождения M1 и ВЧ необходимо присутствие HA и сиалидазная активность, обеспечивающаяся NA. NA расщепляет сиаловые кислоты гликопротеинов на поверхности клеток, образующих ВЧ и высвобождающих ВЧ в питательную среду.
Quan et al. (2007) указывают, что ВЧ-вакцина, получающаяся в бакуловирусной системе экспрессии (клетки насекомых), вызывает защитный иммунитет против некоторых штаммов вируса гриппа (A/PR8/34 (H1N1)). ВЧ, исследованные Quan, отпочковывались от плазматической мембраны и считались имеющими соответствующий размер и морфологию, схожие с теми, которые наблюдали в системе клеток млекопитающих (клетки MDCK).
В описании публикаций PCT WO 2004/098530 и WO 2004/098533 приведена экспрессия вируса HN, вызывающего ньюкаслскую болезнь, или птичьего гриппа А/индейка/Висконсин/68 (H5N9) в трансформированных клетках NT-I (табак) в культуре. Композиции, включающие культуры клеток растений, экспрессирующие полипептиды, вызывают различные иммунные ответы у кроликов и кур.
Вирусы, покрытые оболочкой, могут получать свою липидную оболочку при отпочковывании от инфицированной клетки и получать мембрану из плазматической мембраны или внутриклеточных органелл. Частицы вируса гриппа и ВЧ отпочковываются от плазматической мембраны клетки хозяина. В системах клеток млекопитающих или инфицированных бакуловирусом, например, вирус гриппа отпочковывается от плазматической мембраны (Quan et al., 2007). Известно лишь несколько вирусов, способных инфицировать растения (например, члены семейства топовирусов и рабдовирусов). В отношении известных вирусов растений, покрытых оболочкой, считается, что они отпочковываются от внутренних мембран клетки хозяина, но не от плазматической мембраны. Хотя в растениях-хозяевах получено небольшое число рекомбинантных ВЧ, ни одна из них не являлась производным плазматической мембраны, что заставляет задать вопрос о том, можно ли получать в растениях ВЧ, использующие плазматическую мембрану, включая ВЧ вируса гриппа.
В текущих технологиях производства ВЧ вируса гриппа используется коэкспрессия множества вирусных белков, и такая зависимость является недостатком таких технологий, поскольку в случае пандемии и ежегодных эпидемий ключевым фактором является время реакции на эпидемию. Для ускорения разработки вакцин желательна более простая система производства ВЧ, например, та, в которой используется экспрессия только одного или нескольких вирусных белков без необходимости в экспрессии вирусных белков, не несущих структурную функцию.
Чтобы защитить население от гриппа и предотвратить будущие эпидемии, производители вакцин должны будут разработать эффективные быстрые методики производства фармацевтических форм вакцин. Текущее применение оплодотворенных яиц для производства вакцин недостаточно и включает слишком длительный процесс.
- 3 034733
Краткое описание изобретения
Целью настоящего изобретения является усовершенствование производства вирусоподобных частиц (ВЧ) вируса гриппа.
Согласно настоящему изобретению предлагается нуклеиновая кислота для экспрессии гемагглютинина (HA) вируса гриппа типа A в растении, включающая последовательность нуклеотидов, кодирующую HA вируса гриппа типа A, оперативно связанную с регуляторным элементом, который активен в растении, причем указанный регуляторный элемент содержит промотор, который активен в растении, и энхансер вируса мозаики коровьего гороха (CPMV), при этом экспрессия нуклеиновой кислоты приводит к увеличению образования HA вируса гриппа типа A по сравнению с образованием HA вируса гриппа типа A, кодируемым контрольной нуклеиновой кислотой, не содержащей энхансер CPMV.
В настоящем изобретении также предлагается нуклеиновая кислота для экспрессии гемагглютинина (HA) вируса гриппа типа B в растении, включающая последовательность нуклеотидов, кодирующую HA вируса гриппа типа B, оперативно связанную с регуляторным элементом, который активен в растении, причем указанный регуляторный элемент содержит промотор, который активен в растении, и энхансер вируса мозаики коровьего гороха (CPMV), при этом экспрессия нуклеиновой кислоты приводит к увеличению образования HA вируса гриппа типа B по сравнению с образованием HA вируса гриппа типа B, кодируемым контрольной нуклеиновой кислотой, не содержащей энхансер CPMV.
НА может включать нативный или отличный от нативного сигнальный пептид; отличный от нативного сигнальный пептид может быть сигнальным пептидом протеиндисульфидизомераз.
НА, кодируемый этой нуклеиновой кислотой, может относиться к вирусу гриппа типа A, вирусу гриппа типа B или подтипу вируса типа A, выбранному из группы, состоящей из H1, H2, H3, Н4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 и H16. В некоторых аспектах настоящего изобретения HA, кодируемый этой нуклеиновой кислотой, может происходить из вируса гриппа типа A и быть выбранным из группы, состоящей из H1, H2, H3, H5, H6, H7 и H9.
Согласно настоящему изобретению последовательность нуклеотидов, кодирующая HA вируса гриппа, идентична на 70-100% последовательности нуклеотидов, выбранной из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17,
SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23,
SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO:36,
SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO:42,
SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47.
Настоящее изобретение также предлагает способ получения вирусоподобных частиц (ВЧ) вируса гриппа в растении, включающий:
a) введение нуклеиновой кислоты в растение или его часть путем трансформации с получением трансгенного растения или обеспечение трансгенного растения или его части, содержащей указанную нуклеиновую кислоту; и
b) инкубирование растения или его части в условиях, подходящих для экспрессии нуклеиновой кислоты с получением ВЧ; и
c) сбор растения или его части и очистку ВЧ, причем ВЧ содержат HA вируса гриппа и по меньшей мере один липид растительного происхождения.
Настоящее изобретение включает вышеуказанный способ, где на этапе введения (этап (а)) нуклеиновая кислота может либо временно экспрессироваться в растении, либо стабильно экспрессироваться в растении. Кроме того, в данном способе на стадии (а) в растение может быть дополнительно введена вторая нуклеиновая кислота, включающая последовательность нуклеотидов, кодирующую по меньшей мере один белок-шаперон. Белки-шапероны могут быть выбраны из Hsp40 и Hsp70.
В одном из вариантов изобретения размер ВЧ находится в диапазоне 80-300 нм.
Согласно другому аспекту настоящего изобретения предложено растение, содержащее вышеописанную нуклеиновую кислоту. В одном из вариантов настоящего изобретения указанное растение дополнительно содержит нуклеиновую кислоту, включающую последовательность нуклеотидов, кодирующую по меньшей мере один белок-шаперон, оперативно связанную с регуляторным элементом. Белки-шапероны могут быть выбраны из Hsp40 и Hsp70.
Настоящее изобретение также относится к ВЧ, полученной вышеописанным способом, содержащей HA вируса гриппа типа A или HA вируса гриппа типа B и по меньшей мере один липид растительного происхождения. В одном из вариантов HA вируса гриппа типа A выбран из H1, H2, H3, Н4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 и H16, в частности HA вируса гриппа типа A выбран из H1, H2, H3, H5, H6, H7 и H9. В одном из вариантов HA вируса гриппа типа A или HA вируса гриппа типа B содержит N-гликаны или модифицированные N-гликаны, специфичные для растений.
В настоящем изобретении также предлагается композиция для индуцирования иммунитета против вируса гриппа типа A или вируса гриппа типа B у субъекта, содержащая эффективную дозу вирусоподобных частиц согласно настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель.
В настоящем изобретении также предлагается способ индуцирования иммунитета против вируса гриппа типа A или вируса гриппа типа B у субъекта, включающий введение вышеуказанной композиции.
- 4 034733
Настоящее изобретение включает вышеуказанный способ, где указанную композицию вводят субъекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена нуклеиновая кислота для экспрессии HA вируса гриппа в растении, включающая последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 97, 100, 101, 104, 105, 108, 109, 112 или 113, кодирующую HA вируса гриппа, и регуляторный элемент, который активен в растении, содержащий промотор, который активен в растении, и энхансер вируса мозаики коровьего гороха (CPMV).
Настоящее изобретение относится также к способу получения ВЧ вируса гриппа в трансгенном растении, включающий:
a) введение вышеуказанной нуклеиновой кислоты в растение или его часть путем трансформации с получением трансгенного растения;
b) инкубирование трансгенного растения или его части в условиях, подходящих для экспрессии нуклеиновой кислоты с получением ВЧ; и
c) сбор трансгенного растения или его части и очистку ВЧ, причем ВЧ содержат HA вируса гриппа и по меньшей мере один липид растительного происхождения.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение ВЧ для получения сыворотки, содержащей антитела, специфичные против HA вируса гриппа.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено поликлональное антитело, полученное с использованием ВЧ.
В другом аспекте настоящего изобретения предложен растительный экстракт, содержащий ВЧ, полученные способом согласно настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено растение или растительная клетка, содержащая ВЧ, полученные способом согласно настоящему изобретению.
В другом аспекте настоящего изобретения предложено применение растительного экстракта для индукции иммунитета к вирусу гриппа типа A или вирусу гриппа типа B у субъекта. В одном из вариантов растительный экстракт подходит для перорального введения.
В другом аспекте настоящего изобретения предложена пищевая добавка, содержащая собранные ткани растения согласно настоящему изобретению.
Производство ВЧ в растениях имеет несколько преимуществ по сравнению с производством этих частиц в культуре клеток насекомого. Растительные липиды могут стимулировать специфические иммунные клетки и усиливать вызванный иммунный ответ. Мембраны растений состоят из липидов, фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ), а также содержат гликосфинголипиды, которые уникальны для растений и некоторых бактерий и простейших. Сфинголипиды необычны тем, что они не являются эфирами глицерина, как ФХ или ФЭ, но состоят из длинноцепочечного аминоспирта, который образует амидную связь с цепью жирной кислоты, содержащей более 18 атомов углерода. ФХ и ФЭ так же как сфинголипиды могут связываться с молекулами CD1, экспрессирующимися иммунными клетками млекопитающих, такими как антигенпредставляющие клетки (АПК), подобные дендритным клеткам или макрофагам, и другие клетки, включая B- и T-лимфоциты в тимусе и печени (Tsuji M., 2006). Кроме того, помимо потенциального адъювантного эффекта, обусловленного присутствием растительных липидов, способность растительных N-гликанов облегчать захват гликопротеиновых антигенов антигенпредставляющими клетками (Saint- Jore-Dupas, 2007), может быть преимуществом производства ВЧ в растениях.
Без намерения ограничиваться существующей теорией, прогнозируется, что ВЧ, произведенные в растениях, будут вызывать более выраженный иммунный ответ, чем ВЧ, произведенные в других производственных системах, и что иммунный ответ, вызванный ВЧ, произведенными в растениях, будет более выраженным по сравнению с иммунным ответом, вызванным живыми или аттенуированными вакцинами из целого вируса.
В отличие от вакцин, произведенных из целых вирусов, ВЧ имеют преимущество, поскольку они неинфекционны, поэтому биологическая изоляция не является важной проблемой, как это было бы при работе с целым инфекционным вирусом, и при производстве не требуется. ВЧ, произведенные в растениях, создают дополнительное преимущество, поскольку система экспрессии может быть выращена в оранжерее или в открытом грунте, что делает ее значительно более экономичной и пригодной для массового производства.
Кроме того, растения не содержат ферменты, участвующие в синтезе и добавлении остатков сиаловых кислот к белкам. ВЧ можно получить в отсутствие нейраминидазы (NA), и поэтому нет необходимости в коэкспрессии NA или обработке клеток или экстрактов-продуцентов сиалидазой (нейраминидазой) для обеспечения производства ВЧ в растениях.
ВЧ, производимые согласно настоящему изобретению, не включают белок M1, который, как известно, связывает РНК. РНК является контаминантом ВЧ и нежелательна при получении регуляторной регистрации на ВЧ-продукт.
- 5 034733
Данное краткое описание изобретения не дает обязательное раскрытие всех признаков настоящего изобретения.
Краткое описание чертежей
Указанные и другие признаки настоящего изобретения будут более очевидными из последующего описания, в которое включены ссылки на приложенные чертежи.
На фиг. 1A показана последовательность кассеты экспрессии на основе пластоцианина люцерны, использующейся для экспрессии H1 из штамма А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) согласно одному из вариантов осуществления настоящего изобретения (SEQ ID NO: 8). Подчеркнут сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы (ПДИ). Жирным шрифтом представлены сайты рестрикции BglII (AGATCT) и SacI (GAGCTC), использующиеся для клонирования.
На фиг. 1B дано схематическое представление функциональных доменов гемагглютинина вируса гриппа. После отщепления фрагменты HA0, HA1 и HA2 остаются связанными вместе дисульфидным мостиком.
На фиг. 2A отображена плазмида 540, собранная для экспрессии HA подтипа H1 штамма А/Новая Каледония/20/99 (H1N1).
Фиг. 2B отображает плазмиду 660, собранную для экспрессии HA подтипа H1 штамма А/Индонезия/5/2005 (H5N1).
На фиг. 3 показана эксклюзионная хроматография белковых экстрактов из листьев, вырабатывающих гемагглютинин H1 или H5.
Фиг. 3A отображает профиль элюции синего декстрана 2000 (треугольники) и белков (ромбы).
Фиг. 3B отображает иммунодетекцию (вестерн-блот; антитела к H1) H1 (А/Новая Каледония/20/99 (H1N1)) во фракциях элюции после эксклюзионной хроматографии (шарики S500HR).
Фиг. 3C отображает профиль элюции H5; синего декстрана 2000 (треугольники) и белков (ромбы).
Фиг. 3D отображает иммунодетекцию (вестерн-блот; антитела к H5) H1 (А/Индонезия/5/2005 (H5N1)) во фракциях элюции после эксклюзионной хроматографии (шарики S500HR).
Фиг. 4A отображает последовательность, кодирующую N-концевой фрагмент H1 (А/Новая Каледония/20/99 (H1N1)) (SEQ ID NO: 1).
Фиг. 4B отображает последовательность, кодирующую C-концевой фрагмент H1 (А/Новая Каледония/20/99 (H1N1)) (SEQ ID NO: 2).
Фиг. 5 отображает полную последовательность, кодирующую HA0 H1 (А/Новая Каледония/20/99 (H1N1)) (SEQ ID NO: 28).
Фиг. 6 отображает последовательность, кодирующую H5 А/Индонезия/5/2005 (H5N1), фланкированную сайтом HindIII до начального ATG (АТГ) и сайтом SacI после стоп-кодона (TAA) (SEQ ID NO: 3).
Фиг. 7A отображает последовательность праймера Plasto-443c (SEQ ID NO: 4).
Фиг. 7B отображает последовательность праймера SpHA(Ind)-Plasto.r (SEQ ID NO: 5).
Фиг. 7C отображает последовательность праймера Plasto-SpHA(Ind).c (SEQ ID NO: 6).
Фиг. 7D отображает последовательность праймера HA(Ind)-Sac.r (SEQ ID NO: 7).
Фиг. 8A отображает аминокислотную последовательность пептида H1 (А/Новая Каледония/20/99 (H1N1)) (SEQ ID NO: 9).
Фиг. 8BA отображает аминокислотную последовательность пептида H5 (А/Индонезия/5/2005 (H5N1)) (SEQ ID NO: 10). Нативный сигнальный пептид выделен жирным шрифтом.
Фиг. 9 отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа H7 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 11).
Фиг. 10A отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа H2 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 12).
Фиг. 10В отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа H3 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 13).
Фиг. 10C отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа Н4 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 14).
Фиг. 10D отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа H5 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 15).
Фиг. 10E отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа H6 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 16).
Фиг. 10F отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа H8 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 17).
Фиг. 10G отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа H9 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 18).
Фиг. 10H отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа H10 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 19).
Фиг. 10I отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа H11 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 20).
- 6 034733
Фиг. 10J отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа H12 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 21).
Фиг. 10K отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа H13 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 22).
Фиг. 10L отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа H14 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 23).
Фиг. 10M отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа H15 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 24).
Фиг 10N отображает нуклеотидную последовательность HA подтипа H16 вируса гриппа типа A (SEQ ID NO: 25).
Фиг 10O отображает нуклеотидную последовательность HA вируса гриппа типа B (SEQ ID NO: 26).
Фиг 10P отображает нуклеотидную последовательность HA вируса гриппа типа С (SEQ ID NO: 27).
Фиг 10Q отображает нуклеотидную последовательность праймера XmaI-pPlas.c (SEQ ID NO: 29).
Фиг 10R отображает нуклеотидную последовательность праймера SacI-ATG-pPlas.r (SEQ ID NO: 30).
Фиг 10S отображает нуклеотидную последовательность праймера SacI-PlasTer.c (SEQ ID NO: 31).
Фиг 10T отображает нуклеотидную последовательность праймера EcoRI-PlasTer.r (SEQ ID NO: 32).
Фиг. 11 отображает схематическое представление нескольких конструкций, использующихся согласно данному описанию. Конструкция 660 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую HA подтипа H5 (А/Индонезия/5/2005 (H5N1)), функционально связанную с промотором пластоцианина (plasto) и терминатором (Pter); конструкция 540 содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую HA подтипа H1 (А/Новая Каледония/20/99 (H1N1)) в комбинации с сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы (СП ПДИ) люцерны, функционально связанную с промотором пластоцианина (Plasto) и терминатором (Pter); конструкция 544, собранная для экспрессии HA подтипа H1 (А/Новая Каледония/20/99 (H1N1)), нуклеотидная последовательность, кодирующая H1, объединена с сигнальным пептидом протеиндисульфидизомеразы (СП ПДИ) люцерны и лейциновой молнией GCN4pII (вместо трансмембранного домена и цитоплазматического хвоста H1) и функционально связана с промотором пластоцианина (Plasto) и терминатором (Pter); и конструкция 750 для экспрессии кодирующего участка M1 из вируса гриппа A/PR/8/34 объединена с вирусом гравировки табака (TEV) 5'UTR и функционально связана с двойным промотором 35S и терминатором Nos.
Фиг. 12 отображает иммунодетекцию H5 (А/Индонезия/5/2005 (H5N1)) с использованием антител к H5 (Вьетнам) в белковых экстрактах из листьев N. benthamiana, трансформированных с помощью конструкции 660 (дорожка 3). Коммерческий H5 из штамма вируса гриппа А/Вьетнам/1203/2004 использован как положительный контроль детекции (дорожка 1), белковый экстракт из листьев, трансформированных пустым вектором, использован как отрицательный контроль (дорожка 2).
Фиг. 13 отображает характеристики структур гемагглютинина с помощью эксклюзионной хроматографии. Белковый экстракт из отдельной биомассы, вырабатывающей H5 (А/Индонезия/5/2005 (H5N1)), H1 (А/Новая Каледония/20/99 (H1N1)), растворимый H1, или H1 и M1 разделены с помощью гельфильтрации на S-500 HR. Коммерческий H1 А/Новая Каледония/20/99 (H1N1)) в форме розеток также был подвергнут фракционированию (Ш-розетка).
Фиг. 13A отображает фракции элюции, проанализированные на относительное содержание белка (относительный уровень белка - показан стандартный профиль элюции белка в результате фракционирования биомассы). Указан пик элюции синего декстрана 2000 (эталонный стандарт 2 MDa).
Фиг. 13B отображает фракции элюции, проанализированные на присутствие гемагглютинина с помощью иммуноблоттинга с антителами к H5 (Вьетнам).
Фиг 13C отображает фракции элюции, проанализированные на антитела к H1 вируса гриппа типа A.
Фиг 13D отображает фракции элюции, проанализированные на антитела к растворимому H1 вируса гриппа типа A.
Фиг 13E отображает фракции элюции, проанализированные на антитела к Ш-розетке вируса гриппа типа A.
Фиг 13F отображает фракции элюции, проанализированные на антитела к H1 + M1 вируса гриппа типа A.
Фиг. 14 отображает концентрацию структур H5 вируса гриппа (А/Индонезия/5/2005 (H5N1)), определенную с помощью центрифугирования в градиенте сахарозы и электронной микроскопии фракций, содержащих концентрированный гемагглютинин.
Фиг 14A отображает характеристики фракций, полученных при центрифугировании в градиенте плотности сахарозы. Каждая фракция проанализирована на присутствие H5 с помощью иммуноблоттинга с использованием антитела к H5 (Вьетнам) (верхняя панель) и на относительное содержание белка и способности к гемагглютинации (кривая).
Фиг 14B отображает трансмиссионную электронную микроскопию с негативным окрашиванием объединенных фракций 17, 18 и 19 после центрифугирования в градиенте сахарозы. Столбик отображает 100 нм.
- 7 034733
Фиг. 15 отображает очистку ВЧ H5 вируса гриппа.
Фиг 15A отображает электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия для определения содержания белка, окрашенного Кумасси синим, на этапах очистки - дорожка 1, неочищенный экстракт; дорожка 2, экстракт с pH 6; дорожка 3, термически обработанный экстракт; дорожка 4, профильтрованный через диатомовую землю экстракт; этап очистки по аффинности к фетуину; дорожка 5, загрузка; дорожка 6, элюат; дорожка 7, элюция (10-кратно концентрированная).
Фиг 15B отображает трансмиссионную электронную микроскопию с негативным окрашиванием очищенного образца ВЧ H5. Столбик отображает 100 нм.
Фиг 15C отображает выделенные ВЧ H5 в увеличенном виде, чтобы продемонстрировать детали структуры.
Фиг 15D отображает продукт ВЧ H5 при электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (дорожка А) и вестерн-блот (дорожка В) с использованием кроличьего поликлонального антитела, полученного против UF из штамма А/Вьетнам/1203/2004 (H5N1).
Фиг. 16 отображает нуклеотидную последовательность гена гемагглютинина (HA) вируса гриппа типа A (А/Новая Каледония/20/99(H1N1)), полную кодирующую последовательность (cds), учетный номер в GenBank: AY289929 (SEQ ID NO: 33).
Фиг. 17 отображает нуклеотидную последовательность мРНК протеиндисульфидизомеразы люцерны, учетный номер в GenBank: Z1 1499 (SEQ ID NO: 34).
Фиг. 18 отображает нуклеотидную последовательность сегмента 7 вируса гриппа типа A (A/Puerto Rico/8/34(H1N1)), полная последовательность, учетный номер в GenBank: NC 002016.1 (SEQ ID NO: 35).
Фиг. 19 отображает локализацию накопления ВЧ с помощью трансмиссионной электронной микроскопии с позитивным окрашиванием в ткани, вырабатывающей H5. CW: клеточная стенка; ch: хлоропласт; pm: плазматическая мембрана; VLP: вирусоподобная частица. Столбик отображает 100 нм.
Фиг. 20 отображает индукцию выработки сывороточного антитела через 14 суток после введения бустера мышей Balb/c, вакцинированных ВЧ H5 А/Индонезия/5/2005 (H5N1)), полученных в растении, или рекомбинантным растворимым H5 (А/Индонезия/5/2005 (H5N1)).
Фиг 20A показывает антительный ответ у мышей, иммунизированных путем внутримышечной инъекции.
Фиг 20B показывает антительный ответ у мышей, иммунизированных путем интраназального введения. Антительные ответы измеряли против инактивированного целого вируса H5N1 (А/Индонезия/5/05). GMT: среднее геометрическое титра. Значения приведены в виде среднего геометрического, соответствующего контрольным титрам у пяти мышей на группу. Столбики отражают среднее отклонение. * р<0,05 при сравнении с рекомбинантным растворимым H5.
Фиг. 21 отображает антительный ответ в виде торможения гемагглютинации через 14 суток после введения бустера мышей Balb/c, вакцинированных ВЧ H5 А/Индонезия/5/2005 (H5N1)), полученных в растении, или рекомбинантным растворимым H5 (А/Индонезия/5/2005 (H5N1)).
Фиг 21A показывает антительный ответ у мышей, иммунизированных путем внутримышечной инъекции.
Фиг 21B показывает антительный ответ у мышей, иммунизированных путем интраназального введения. Антительные ответы на HA1 измеряли с использованием инактивированного целого вируса H5N1 (А/Индонезия/5/05). GMT: среднее геометрическое титра. Значения приведены в виде среднего геометрического, соответствующего контрольным титрам у пяти мышей на группу. Столбики отражают среднее отклонение. * р<0,05 и ** р<0,01 при сравнении с рекомбинантным растворимым H5.
Фиг. 22 отображает эффект адъюванта в отношении иммуногенности ВЧ у мышей Balb/c.
Фиг 22A показывает эффект квасцов у мышей, иммунизированных путем внутримышечной инъекции.
Фиг 22B показывает эффект хитозана у мышей, иммунизированных путем интраназального введения. Антительные ответы на HA1 измеряли с использованием инактивированного целого вируса H5N1 (А/Индонезия/5/05). GMT: среднее геометрическое титра. Значения приведены в виде среднего геометрического, соответствующего контрольным титрам у пяти мышей на группу. Столбики отражают среднее отклонение. * р<0,05 при сравнении с соответствующим рекомбинантным растворимым H5.
Фиг. 23 отображает антительный ответ на введение ВЧ H5 (А/Индонезия/5/2005 (H5N1)).
Фиг 23A показывает изотип иммуноглобулина против Анти-Индонезия/5/05 у мышей, иммунизированных путем внутримышечного введения, 30 суток после введения бустера. Значения приведены в виде среднего геометрического (log2), соответствующего контрольным титрам у пяти мышей на группу. Тест ELISA проведен с использованием целого инактивированного H5N1 (А/Индонезия/5/2005) в виде агента, покрытого оболочкой. Столбики отражают среднее отклонение. * р<0,05, ** р<0,001 при сравнении с соответствующим рекомбинантным растворимым H5 (А/Индонезия/5/2005 (H5N1)).
Фиг 23B показывает титры антител к целым инактивированным вирусам (А/Индонезия/5/2005 (H5N1) и (А/Вьетнам/1194/04 (H5N1))). Все группы статистически значимо отличаются от отрицательного контроля.
Фиг. 24 отображает титры антител против гомологичных целых инактивированных вирусов
- 8 034733 (А/Индонезия/5/05), 14 суток после первой дозы (2-я неделя), 14 суток после бустера (5-я неделя) или 30 суток после бустера (7-я неделя) у мышей Balb/c, иммунизированных ВЧ H5 (А/Индонезия/5/2005 (H5N1)). GMT: среднее геометрическое титра. Значения приведены в виде среднего геометрического, соответствующего контрольным титрам у пяти мышей на группу. * р<0,05 при сравнении с рекомбинантным растворимым H5.
Фиг. 25 отображает перекрестную реактивность in vitro сывороточных антител у мышей Balb/c, иммунизированных ВЧ H5 (А/Индонезия/5/2005 (H5N1)), через 30 суток после введения бустера.
Фиг. 25A показывает титры антител к целым инактивированным вирусам.
Фиг. 25B показывает титры антител против различных целых инактивированных вирусов, тормозящие гемагглютинацию. Значения приведены в виде среднего геометрического, соответствующего контрольным титрам у пяти мышей на группу. Столбики отражают среднее отклонение. Все группы статистически значимо отличаются от отрицательного контроля. * р<0,05 при сравнении с соответствующим рекомбинантным растворимым H5. Все значения меньше 10 представлены как условное значение 5 (1,6 для In) и считаются отрицательными.
Фиг. 26 отображает эффективность ВЧ H5 (А/Индонезия/5/2005 (H5N1)), полученных из растения.
Фиг. 26A отображает выживаемость мышей после заражения 1000 LD50 (4,09х106 CCID50 штамма А/Индейки/582/06 (H5N1) вируса гриппа.
Фиг. 26B показывает массу тела иммунизированных мышей после заражения. Значения представлены как средняя масса тела выживающих мышей.
Фиг. 27 отображает происхождение ВЧ вируса гриппа, полученных в растении.
Фиг. 27A показывает состав полярных липидов очищенных ВЧ вируса гриппа. Липиды, содержащиеся в эквиваленте 40 мкг белков, экстрагированы из ВЧ согласно описанию, отделены с помощью высокоэффективной тонкослойной хроматографии, и проведено сравнение профиля миграции липидов, выделенных из высокоочищенных плазматических мембран табака (PM). Липиды сокращены следующим образом: DGDG - дигалактозилдиацилглицерин, gluCER - глюкозилцерамид, PA - фосфорная кислота; PC - фосфатидилхолин; PE - фосфатидилэтаноламин; PG - фосфатидилглицерин, PI - фосфатидилинозитол; PS - фосфатидилсерин; SG - стерилгликозид.
Фиг. 27B показывает состав нейтральных липидов очищенных ВЧ вируса гриппа. Липиды, содержащиеся в эквиваленте 20 мкг белков, экстрагированы из ВЧ согласно описанию, отделены с помощью высокоэффективной тонкослойной хроматографии, и проведено сравнение с миграцией ситостерола.
Фиг. 27C показывает иммунодетекцию маркерного протонного насоса АТФазы (PMA) плазматической мембраны в очищенных ВЧ и высокоочищенного PMA из листьев табака (PML) и клеток табака BY2 (PMBY2). На каждую дорожку загружено 18 мкг белка.
Фиг. 28 отображает последовательность, проходящую от DraIII до сайтов SacI клона 774 - нуклеотидной последовательности А/Брисбан/59/2007 (H1N1) (SEQ ID NO: 36). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная от сайта рестрикции DraIII в направлении 5'-конца и до стоп-кодона и сайта SacI на 3'-конце. Подчеркнуты сайты рестрикции; ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
Фиг. 29 отображает последовательность, проходящую от DraIII до сайтов SacI клона 775 - нуклеотидной последовательности А/Соломоновы острова 3/2006 (H1N1) ((SEQ ID NO: 37). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная от сайта рестрикции DraIII в направлении 5'-конца и до стоп-кодона и сайта SacI на 3'-конце. Подчеркнуты сайты рестрикции; ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
Фиг. 30 отображает последовательность, проходящую от DraIII до сайтов SacI клона 776 - нуклеотидной последовательности А/Брисбан/10/2007 (H3N2) (SEQ ID NO: 38). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная от сайта рестрикции DraIII в направлении 5'-конца и до стоп-кодона и сайта SacI на 3'-конце. Подчеркнуты сайты рестрикции; ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
Фиг. 31 отображает последовательность, проходящую от DraIII до сайтов SacI клона 777 - нуклеотидной последовательности А/Висконсин/67/2005 (H3N2) (SEQ ID NO: 39). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная от сайта рестрикции DraIII в направлении 5'-конца и до стоп-кодона и сайта SacI на 3'-конце. Подчеркнуты сайты рестрикции; ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
Фиг. 32 отображает последовательность, проходящую от DraIII до сайтов SacI клона 778 - нуклеотидной последовательности В/Малайзия/2506/2004 (SEQ ID NO: 40). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная от сайта рестрикции DraIII в направлении 5'-конца и до стоп-кодона и сайта SacI на 3'-конце. Подчеркнуты сайты рестрикции; ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
Фиг. 33 отображает последовательность, проходящую от DraIII до сайтов SacI клона 779 - нуклеотидной последовательности В/Флорида/4/2006 (SEQ ID NO: 41). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная от сайта рестрикции DraIII в направлении 5'конца и до стоп-кодона и сайта SacI на 3'-конце. Подчеркнуты сайты рестрикции; ATG выделен жирным
- 9 034733 шрифтом и подчеркнут.
Фиг. 34 отображает последовательность, проходящую от DraIII до сайтов SacI клона 780 - нуклеотидной последовательности А/Сингапур/1/57 (H2N2) (SEQ ID NO: 42). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная от сайта рестрикции DraIII в направлении 5'-конца и до стоп-кодона и сайта SacI на 3'-конце. Подчеркнуты сайты рестрикции; АТС выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
Фиг. 35 отображает последовательность, проходящую от DraIII до сайтов SacI клона 781 - нуклеотидной последовательности А/Аньхой/1/2005 (H5N1) (SEQ ID NO: 43). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная от сайта рестрикции DraIII в направлении 5'-конца и до стоп-кодона и сайта SacI на 3'-конце. Подчеркнуты сайты рестрикции; ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
Фиг. 36 отображает последовательность, проходящую от DraIII до сайтов SacI клона 782 - нуклеотидной последовательности А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) (SEQ ID NO: 44). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная от сайта рестрикции DraIII в направлении 5'-конца и до стоп-кодона и сайта SacI на 3'-конце. Подчеркнуты сайты рестрикции; ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
Фиг. 37 отображает последовательность, проходящую от DraIII до сайтов SacI клона 783 - нуклеотидной последовательности А/дикие утки/Гонконг/\У312/97 (H6N1) (SEQ ID NO: 45). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная от сайта рестрикции DraIII в направлении 5'-конца и до стоп-кодона и сайта SacI на 3'-конце. Подчеркнуты сайты рестрикции; ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
Фиг. 38 отображает последовательность, проходящую от DraIII до сайтов SacI клона 784 - нуклеотидной последовательности А/лошади/Прага/56 (H7N7) (SEQ ID NO: 46). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная от сайта рестрикции DraIII в направлении 5'-конца и до стоп-кодона и сайта SacI на 3'-конце. Подчеркнуты сайты рестрикции; ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
Фиг. 39 отображает последовательность, проходящую от DraIII до сайтов SacI клона 785 - нуклеотидной последовательности А/Гонконг/1073/99 (H9N2) (SEQ ID NO: 47). Кодирующая последовательность фланкирована регуляторным участком пластоцианина, начиная от сайта рестрикции DraIII в направлении 5'-конца и до стоп-кодона и сайта SacI на 3'-конце. Подчеркнуты сайты рестрикции; ATG выделен жирным шрифтом и подчеркнут.
Фиг. 40A отображает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 48) полипептида, транслированного из клона 774 (А/Брисбан/59/2007 (H1N1)). Открытая рамка считывания клона 774 начинается с ATG, указанного на фиг. 28.
Фиг 40B отображает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 49) полипептида, транслированного из клона 775 (А/Соломоновы острова 3/2006 (H1N1)). Открытая рамка считывания клона 775 начинается с ATG, указанного на фиг. 29.
Фиг. 41A отображает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 50) полипептида, транслированного из клона 776 (А/Брисбан/10/2007 (H3N2)). Открытая рамка считывания клона 776 начинается с ATG, указанного на фиг. 30.
Фиг 41B отображает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 51) полипептида, транслированного из клона 777 (А/Висконсин/67/2005 (H3N2)). Открытая рамка считывания клона 777 начинается с ATG, указанного на фиг. 31.
Фиг. 42A отображает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 52) полипептида, транслированного из клона 778 (В/Малайзия/2506/2004). Открытая рамка считывания клона 778 начинается с ATG, указанного на фиг. 32.
Фиг 42B отображает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 53) полипептида, транслированного из клона 779 (В/Флорида/4/2006). Открытая рамка считывания клона 779 начинается с ATG, указанного на фиг. 33.
Фиг. 43A отображает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 54) полипептида, транслированного из клона 780 (А/Сингапур/1/57 (H2N2)). Открытая рамка считывания клона 780 начинается с ATG, указанного на фиг. 34.
Фиг 43B отображает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 55) полипептида, транслированного из клона 781 (А/Аньхой/1/2005 (H5N1)). Открытая рамка считывания клона 781 начинается с ATG, указанного на фиг. 35.
Фиг. 44A отображает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 56) полипептида, транслированного из клона 782 (А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1)). Открытая рамка считывания клона 782 начинается с ATG, указанного на фиг. 36.
Фиг 44B отображает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 57) полипептида, транслированного из клона 783 А/дикие утки/Гонконг/\У312/97 (H6N1). Открытая рамка считывания клона 783 начинается с ATG, указанного на фиг. 37.
- 10 034733
Фиг. 45A отображает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 58) полипептида, транслированного из клона 784 (А/лошади/Прага/56 (H7N7)). Открытая рамка считывания клона 784 начинается с ATG, указанного на фиг. 38.
Фиг 45B отображает аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 59) полипептида, транслированного из клона 785 (А/Гонконг/1073/99 (H9N2)). Открытая рамка считывания клона 785 начинается с ATG, указанного на фиг. 39.
Фиг. 46 отображает иммунодетекцию (вестерн-блот) фракций элюции 7-17 ВЧ, полученных в растении, после эксклюзионной хроматографии. Пик элюции (фракция 10) синего декстрана указан стрелкой. Показаны подтипы гемагглютинина H1, H2, H3, H5, H6 и H9. Гемагглютинин выявлен во фракциях 7-14, соответствующих элюции ВЧ.
Фиг. 47 отображает иммуноблот-анализ экспрессии серии гемагглютининов различных штаммов, вызывающих ежегодные эпидемии. 10 и 20 мкг белковых экстрактов листьев загрузили на дорожки 1 и 2 соответственно для растений, экспрессирующих HA различных штаммов вируса гриппа (указаны в верхней части иммуноблота).
Фиг. 48A отображает иммуноблот-анализ экспрессии серии гемагглютининов H5 различных штаммов, потенциально вызывающих пандемии. 10 и 20 мкг белковых экстрактов из листьев загрузили на дорожки 1 и 2 соответственно.
Фиг 48B отображает иммуноблот-анализ экспрессии серии гемагглютининов H2, H7 и H9 отдельных штаммов вируса гриппа. 10 и 20 мкг белковых экстрактов из листьев загрузили на дорожки 1 и 2 соответственно.
Фиг. 49 отображает иммуноблот-анализ H5 из штамма А/Индонезия/5/2005 в белковых экстрактах листьев табака, инфильтрированных агробактерией с AGL 1/660. Два растения (растение 1 и растение 2) инфильтрировали и 10 и 20 мкг растворимого белка, экстрагированного из каждого растения, загружали на дорожки 1 и 2 соответственно.
Фиг. 50 отображает перекрестную реактивность сывороточных антител in vitro. Титры торможения гемагглютинации (ГАТ) в сыворотке хорька, 14 суток (A) после 1-й иммунизации и (B) после 2-й бустерной иммунизации ВЧ вируса гриппа H5 (А/Индонезия/5/2005 (H5N1)), полученных в растении. Антительный ответ на HA1 измерен с использованием следующих инактивированных целых вирусов H5N1: А/индейки/Индейки/1/05, А/Вьетнам/1194/04, А/Аньхой/5/05 и гомологичного штамма А/Индонезия/5/05. Значения приведены как среднее геометрическое (log2) соответствующих контрольных титров пяти хорьков на группу. Диагональная полоса -А/Индонезия/6/06 (клад 2.1.3); помеченная А/индейки/Индейки/1/05 (клад 2.2); белый столбик - А/Вьетнам/1194/04 (клад 1); черный столбик А/Аньхой/5/05. Указаны животные, у которых выявлен ответ. Столбики отражают среднее отклонение.
Фиг. 51 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 60) кассеты экспрессии HA, содержащей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR (HTO)-кодирующую HA последовательность из H5 А/Индонезия/5/2005 (конструкция #660), последовательности 3'UTR пластоцианина люцерны и терминатора.
Фиг. 52 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 61) кассеты экспрессии HA, содержащей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR-кодирующую HA последовательность из H1 А//Новая Каледония/20/1999 (конструкция #540), последовательности 3'UTR пластоцианина люцерны и терминатора.
Фиг. 53 отображает аминокислотную последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 62) кассеты экспрессии HA, содержащей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR-кодирующую HA последовательность из H1 А/Брисбан/59/2007 (конструкция #774), последовательности 3'UTR пластоцианина люцерны и терминатора.
Фиг. 54 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 63) кассеты экспрессии HA, содержащей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR-кодирующую HA последовательность из H1 А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1) (конструкция #775), последовательности 3'UTR пластоцианина люцерны и терминатора.
Фиг. 55 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 64) кассеты экспрессии HA, содержащей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR-кодирующую HA последовательность из H2 А/Сингапур/1/57 (H2N2) (конструкция #780), последовательности 3'UTR пластоцианина люцерны и терминатора.
Фиг. 56 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 65) кассеты экспрессии HA, содержащей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR-кодирующую HA последовательность из H5 А/Аньхой/1/2005 (H5N1) (конструкция #781), последовательности 3'UTR пластоцианина люцерны и терминатора.
Фиг. 57 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 66) кассеты экспрессии HA, содержащей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR-кодирующую HA последовательность из H5 А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) (конструкция #782), последовательности 3'UTR пластоцианина люцерны и терминатора.
- 11 034733
Фиг. 58 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 67) кассеты экспрессии
HA, содержащей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR-кодирующую HA последовательность из
H6 А/Дикие утки/ГонконгЖ312/97 (H6N1) (конструкция #783), последовательности 3'UTR пластоцианина люцерны и терминатора.
Фиг. 59 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 68) кассеты экспрессии HA, содержащей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTRкодирующую HA последовательность из H9 А/Гонконг/1073/99 (H9N2) (конструкция #785), последовательности 3'UTR пластоцианина люцерны и терминатора.
Фиг. 60 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 69) кассеты экспрессии HA, содержащей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR-кодирующую HA последовательность из H3 А/Брисбан/10/2007 (H3N2), (конструкция #774), последовательности 3'UTR пластоцианина люцерны и терминатора.
Фиг. 61 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 70) кассеты экспрессии HA, содержащей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR-кодирующую HA последовательность из H3 А/Висконсин/67/2005 (H3N2), (конструкция #774), последовательности 3'UTR пластоцианина люцерны и терминатора.
Фиг. 62 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 71) кассеты экспрессии HA, содержащей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR-кодирующую HA последовательность из H7 А/лошади/Прага/56 (H7N7), (конструкция #774), последовательности 3'UTR пластоцианина люцерны и терминатора.
Фиг. 63 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 72) кассеты экспрессии HA, содержащей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR-кодирующую HA последовательность из В/Малайзия/2506/2004, последовательности 3'UTR пластоцианина люцерны и терминатора.
Фиг. 64 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 73) кассеты экспрессии HA, содержащей промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR-кодирующую HA последовательность из В/Флорида/4/2006, последовательности 3'UTR пластоцианина люцерны и терминатора.
Фиг. 65 отображает консенсусную аминокислотную последовательность (SEQ ID NO: 74) HA из А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) (кодируемого SEQ ID NO: 33), А/Брисбан/59/2007 (H1N1) (кодируемого SEQ ID NO: 48), А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1) (кодируемого SEQ ID NO: 49) и SEQ ID NO: 9. X1 (положение 3) - A или V; X2 (положение 52) - D или N; X3 (положение 90) - K или R; X4 (положение 99) - K или T; X5 (положение 111) - Y или H; X6 (положение 145) - V или T; X7 (положение 154) - E или K; X8 (положение 161) - R или K; X9 (положение 181) - V или A; X10 (положение 203) - D или N; X11 (положение 205) - R или K; X12 (положение 210) - T или K; X13 (положение 225) - R или K; X14 (положение 268) - W или R; X15 (положение 283) - T или N; X16 (положение 290) - E или K; X17 (положение 432) - I или L; X18 (положение 489) - N или D.
Фиг. 66 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 75) H1 Новая Каледония (AAP34324.1), кодируемого SEQ ID NO: 33.
Фиг. 67 отображает последовательность нуклеиновой кислоты (SEQ ID NO: 76) H1 Puerto Rico (NC 0409878.1), кодируемого SEQ ID NO: 35
Фиг. 68 отображает последовательность нуклеиновой кислоты в части кассеты экспрессии номер 828, от PacI (перед промотором) до AscI (непосредственно после терминатора NOS). CPMV HT 5'UTRпоследовательность подчеркнута с мутировавшим ATG. Сайт рестрикции ApaI (непосредственно перед ATG последовательностью, кодирующей белок, предназначенный для экспрессии, в данном случае легкая цепь каппа C5-1).
Фиг. 69 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер 663, HindIII (при множественном сайте клонирования, перед промотором пластоцианина) до EcoRI (непосредственно после терминатора пластоцианина). Последовательность, кодирующая H5 (из А/Индонезия/5/2005), в слиянии с СП ПДИ подчеркнута.
Фиг. 70 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер 787, от HindIII (при множественном сайте клонирования, перед промотором пластоцианина) до EcoRI (непосредственно после терминатора пластоцианина). Последовательность, кодирующая H5 (из А/Брисбан/59/2007), в слиянии с СП ПДИ подчеркнута.
Фиг. 71 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер 790, от HindIII (при множественном сайте клонирования, перед промотором пластоцианина) до EcoRI (непосредственно после терминатора пластоцианина). Последовательность, кодирующая H3 (из А/Брисбан/10/2007), в слиянии с СП ПДИ подчеркнута.
Фиг. 72 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер 798, от HindIII (при множественном сайте клонирования, перед промотором пластоцианина) до EcoRI (непосредственно после терминатора пластоцианина). Последовательность, кодирующая HA из В/Флорида/4/2006, в слиянии с СП ПДИ, подчеркнута.
Фиг. 73 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер 580, от PacI (перед промотором 35S) до AscI (непосредственно после терминатора NOS). Последовательность,
- 12 034733 кодирующая H1 (из А/Новая Каледония/20/1999), в слиянии с СП ПДИ, подчеркнута.
Фиг. 74 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер 685, от
PacI (перед промотором 35S) до AscI (непосредственно после терминатора NOS). Последовательность, кодирующая H5 из А/Индонезия/5/2005, подчеркнута.
Фиг. 75 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер 686, от PacI (перед промотором 35S) до AscI (непосредственно после терминатора NOS). Последовательность, кодирующая H5 из А/Индонезия/5/2005, в слиянии с СП ПДИ подчеркнута.
Фиг. 76 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер 732, от PacI (перед промотором 35S) до AscI (непосредственно после терминатора NOS). Последовательность, кодирующая H1 из А/Брисбан/59/2007, подчеркнута.
Фиг. 77 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер 733, от PacI (перед промотором 35S) до AscI (непосредственно после терминатора NOS). Последовательность, кодирующая H1 из А/Брисбан/59/2007, в слиянии с СП ПДИ, подчеркнута.
Фиг. 78 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер 735, от PacI (перед промотором 35S) до AscI (непосредственно после терминатора NOS). Последовательность, кодирующая H3 из А/Брисбан/10/2007, подчеркнута.
Фиг. 79 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер 736, от PacI (перед промотором 35S) до AscI (непосредственно после терминатора NOS). Последовательность, кодирующая H3 из А/Брисбан/10/2007, в слиянии с СП ПДИ, подчеркнута.
Фиг. 80 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер 738, от PacI (перед промотором 35S) до AscI (непосредственно после терминатора NOS). Последовательность, кодирующая HA из В/Флорида/4/2006, подчеркнута.
Фиг. 81 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер 739, от PacI (перед промотором 35S) до AscI (непосредственно после терминатора NOS). Последовательность, кодирующая HA из В/Флорида/4/2006, в слиянии с СП ПДИ, подчеркнута.
Фиг. 82 отображает последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую Msj 1 (SEQ ID NO: 114).
Фиг. 83 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер R850, от HindIII (при множественном сайте клонирования, перед промотором) до EcoRI (непосредственно после терминатора NOS). Последовательность, кодирующая HSP40, подчеркнута.
Фиг. 84 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер R860, от HindIII (при множественном сайте клонирования, перед промотором) до EcoRI (непосредственно после терминатора NOS). Последовательность, кодирующая HSP70, подчеркнута.
Фиг. 85 отображает последовательность нуклеиновой кислоты части конструкции номер R870, от HindIII (при множественном сайте клонирования, перед промотором) до EcoRI (непосредственно после терминатора NOS). Последовательность, кодирующая HSp40, выделена курсивом; последовательность, кодирующая HSP70, подчеркнута. А) нуклеотиды 1-5003; В) нуклеотиды 5004-9493.
Фиг. 86 отображает схематическое представление конструкции R472.
Фиг. 87 отображает иммуноблот-анализ экспрессии серии гемагглютинина с использованием сигнального пептида протеиндисульфидизомеразы люцерны. 20 мкг белкового экстракта из листьев, полученных от 3 отдельных растений, загружали для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия, кроме H1 (А/Новая Каледония/20/99 (H1N1)), когда использовали 5 мкг. Указанные контроли (целый инактивированный вирус (WIV) гомологичного штамма) смешаны с 5 или 2 мкг растений, инфильтрированных пустышками, а) экспрессия H1 из А/Новая Каледония/20/99, b) экспрессия H1 из А/Брисбан/59/2007, c) экспрессия H3 из А/Брисбан/10/2007, d) экспрессия H5 из А/Индонезия/5/2005, e) экспрессия HA из В/Флорида/4/2006. Стрелки указывают иммунополосу, соответствующую HA0. SP WT: нативный сигнальный пептид; PS PDI: сигнальный пептид ПДИ люцерны.
Фиг. 88 отображает сравнение стратегий экспрессии HA с помощью иммуноблот-анализа белковых экстрактов из листьев. HA производился с использованием кассет на основе пластоцианина или CPMV-HT. В случае CPMV-HT также сравнивали сигнальный пептид HA дикого типа и сигнальный пептид ПДИ люцерны. 20 мкг белкового экстракта загружали для электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия для определения подтипа HA, кроме H1 А/Новая Каледония, когда использовали 5 мкг, а) экспрессия H1 из А/Новая Каледония/20/1999, b) экспрессия H1 из А/Брисбан/59/2007, c) экспрессия H3 из А/Брисбан/10/2007, d) экспрессия H5 из А/Индонезия/5/2005 и e) экспрессия В из В/Флорида/4/2006. Стрелки указывают иммунополосу, соответствующую HA0; специфические штаммы агробактерии, содержащие специфические векторы, использующиеся для экспрессии HA, указаны в верхней части дорожек.
Фиг. 89 отображает иммуноблоттинг накопления HA при коэкспрессии с Hsp40 и Hsp70. H1 Новая Каледония (AGL1/540) и H3 Брисбан (AGL1/790) были экспрессированы поодиночке и коэкспрессированы с AGL1/R870. Уровень накопления HA оценивали с помощью иммуноблот-анализа белковых экстрактов из инфильтрированных листьев. В качестве контроля использованы целые инактивированные вирусы (WIV) штамма А/Новая Каледония/20/99 или Брисбан/10/2007/
- 13 034733
Подробное описание
Настоящее изобретение относится к производству вирусоподобных частиц. А именно, настоящее изобретение относится к производству вирусоподобных частиц, содержащих антигены вируса гриппа.
Нижеследующее описание представляет собой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения.
Настоящее изобретение предлагает нуклеиновую кислоту, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую антиген вируса, покрытого оболочкой, например гемагглютинин (HA) вируса гриппа, функционально связанную с регуляторным участком, активным у растения.
Кроме того, настоящее изобретение также предлагает способ производства вирусоподобных частиц (ВЧ) в растении. Указанный способ включает введение нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген вируса, функционально связанной с регуляторным участком, активным у растения, в растение или его часть и инкубацию растения или части растения в условиях, обеспечивающих экспрессию этой нуклеиновой кислоты, с получением таким образом ВЧ.
ВЧ могут быть получены из вируса гриппа, однако ВЧ могут также быть получены из других вирусов - производных плазматической мембраны, включая, но не ограничиваясь этим, вирусы кори, Эбола, Марбург и ВИЧ.
Настоящее изобретение включает ВЧ всех типов вируса гриппа, которые могут инфицировать человека, включая, например, но не ограничиваясь этим, самый частый подтип вируса типа A (H1N1), например А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), подтип А/Индонезия/5/05 (H5N1) (SEQ ID NO: 60) и менее частый тип B (например, SEQ ID NO: 26, фиг. 10O) и типа С (SEQ ID NO: 27, фиг. 10В) и HA, полученные из других подтипов вируса гриппа. ВЧ других подтипов также включены в объем данного изобретения, например А/Брисбан/59/2007 (H1N1; SEQ ID NO:48), А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1; SEQ ID NO:49), А/Сингапур/1/57 (H2N2; SEQ ID NO:54), А/Аньхой/1/2005 (H5N1; SEQ ID NO:55), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1; SEQ ID NO:56), А/дикие утки/ГонконгЖ312/97 (H6N1; SEQ ID NO:57), А/Гонконг/1073/99 (H9N2; SEQ ID NO:59), А/Брисбан/10/2007 (H3N2; SEQ ID NO:50), А/Висконсин/67/2005 (H3N2; SEQ ID NO:51), А/лошади/Прага/56 (H7N7; SEQ ID NO:58), В/Малайзия/2506/2004 (SEQ ID NO:52) или В/Флорида/4/2006 (SEQ ID NO:53).
Настоящее изобретение также относится к вирусам гриппа, которые могут инфицировать других млекопитающих или животных, например человека, приматов, лошадей, свиней, птиц, водоплавающих птиц, перелетных птиц, перепелов, уток, гусей, домашнюю птицу, кур, верблюдов, представителей семейства псовых, собак, представителей семейства кошачьих, кошек, тигра, леопарда, циветту, норку, куницу каменную, хорьков, домашних животных, домашний скот, мышей, крыс, тюленей, китов и им подобных.
Не налагающие ограничений примеры других антигенов, которые могут экспрессироваться в вирусах - производных плазматической мембраны, включают капсидный белок ВИЧ p24, белки оболочки gp120, gp41, структурные белки VP30 и VP35; Gp/SGP (гликозилированный интегральный мембранный белок) филовирусов, например Эбола или Марбург, или белок H и белок F парамиксовирусов, например вируса кори.
Настоящее изобретение также включает, но не ограничивается этим, ВЧ - производные вируса гриппа, которые получают липидную оболочку из плазматической мембраны клетки, в которой экспрессируются белки ВЧ. Например, если ВЧ экспрессируется в системе, основанной на растении, ВЧ может получать липидную оболочку от плазматической мембраны клетки.
В общем случае термин липид означает жирорастворимые (липофильные) молекулы естественного происхождения. Этот термин также используется в более конкретном смысле в отношении жирных кислот и их производных (включая три-, ди- и моноглицериды и фосфолипиды), а также другие жирорастворимые метаболиты, содержащие стерол, или стеролы. Фосфолипиды - главный компонент всех биологических мембран вместе с гликолипидами, стеролами и белками. Примеры фосфолипидов включают фосфатидилэтаноламин, фосфатидилхолин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин и им подобные. Примеры стеролов включают зоостеролы (например, холестерин) и фитостеролы (например, ситостерол) и стерилгликозид. В различных видах растений идентифицировано более 200 фитостеролов, самыми распространенными из которых являются кампестерол, стигмастерол, эргостерол, брассикастерол, дельта-7-стигмастерол, дельта-7-авенастерол, дауностерол, ситостерол, 24-метилхолестерин, холестерин или бета-ситостерол. Как будет понятно специалисту в данной области техники, состав липидов плазматической мембраны может меняться в зависимости от особенностей культуры или условий культивирования клетки или выращивания организмов, из которых эта клетка получена.
Обычно клеточные мембраны состоят из двойного слоя липидов, а также белков, обладающих различными функциями. В двойном липидном слое могут быть обнаружены специфические местные концентрации определенных липидов, что называют липидным рафтом. Без намерения ограничиваться существующей теорией предполагается, что липидные рафты могут играть важную роль в эндо- и экзоцитозе, проникновении или выходе вирусов и других инфекционных агентов, передаче сигнала внутри клетки, взаимодействии с другими структурными компонентами клетки или организма, такими как внут- 14 034733 риклеточный и внеклеточный матрикс.
В отношении вируса гриппа термин гемагглютинин или HA согласно использованию в данном документе означает гликопротеин, обнаруженный на наружной поверхности частиц вируса гриппа. HA представляет собой гомотримерный мембранный гликопротеин I типа, как правило, содержащий сигнальный пептид, домен HA1 и домен HA2, включающий якорный сайт, перекрывающий мембрану, на Cконце и небольшой цитоплазматический хвост (фиг. 1B). Нуклеотидные последовательности, кодирующие HA, хорошо известны и доступны для общего пользования - см. например, базу данных BioDefence Public Health (вирус гриппа, см. URL:biohealthbase.org) или Национальный центр биотехнологической информации (см. URL:ncbi.nlm.nih.gov), оба из которых включены в данный документ путем ссылки.
Термин гомотример или гомотримерный указывает, что олигомер образован тремя белковыми молекулами HA. Без намерения ограничиваться существующей теорией предполагается, что белок HA синтезируется как мономерный белок-предшественник (НА0) массой 75 кДа, который подвергается сборке на поверхности в длинный тримерный белок. До тримеризации белок-предшественник расщепляется в консервативном сайте активации-расщепления (также называемом химерным белком) на две полипептидные цепи, HA1 и HA2 (содержащие трансмембранный участок), связанные дисульфидным мостиком. Участок HA1 может состоять в длину из 328 аминокислот, участок HA2 может состоять в длину из 221 аминокислоты. Хотя это расщепление может быть важным для инфекционности вируса, возможно, оно необязательно для тримеризации белка. Встраивание HA в эндоплазматический ретикулум (ЭР) мембраны клетки хозяина, расщепление сигнального пептида и гликозилирование белка - это котрансляционные события. Для правильного свертывания HA требуется гликозилирование белка и образование шести внутрицепочечных дисульфидных связей. НА-тример подвергается сборке в цис- и трансположениях в комплексе Гольджи, при этом в процессе тримеризации играет роль трансмембранный домен. Кристаллические структуры белков HA, обработанных бромелином, где отсутствует трансмембранный домен, выявили высококонсервативную структуру среди штаммов вируса гриппа. Также установлено, что HA подвергается существенным конформационным изменениям в ходе инфекционного процесса, для чего требуется расщепление предшественника HA0 на две полипептидные цепи HA1 и HA2. Белок HA может подвергаться дополнительной обработке (т.е. включать домены HA1 и HA2) или может оставаться необработанным (т.е. включать домен НА0).
Настоящее изобретение также относится к использованию белка HA, содержащего трансмембранный домен, и включает домены HA1 и HA2, например, белок HA может представлять собой HA0 или обработанный HA, содержащий HA1 и HA2. Белок HA может быть использован в производстве или образовании ВЧ в системе экспрессии, основанной на растении или растительной клетке.
НА настоящего изобретения можно получить из любого подтипа. Например, HA может быть от подтипа H1, H2, H3, Н4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16 или вируса гриппа типа B. Рекомбинантный HA настоящего изобретения может также состоять из аминокислотной последовательности, основанной на последовательности какого-либо гемагглютинина, известного в данной области техники - см. например, базу данных BioDefence Public Health (вирус гриппа; см. информации (см.
URL:ncbi.nlm.nih.gov). Кроме того, HA может быть основан на последовательности гемагглютинина, выделенного из одного или нескольких появляющихся или вновь идентифицированных вирусов гриппа.
Настоящее изобретение также включает ВЧ, которые содержат HA, полученный из одного или нескольких подтипов вируса гриппа. Например, ВЧ могут содержать один или несколько HA из подтипа H1 (кодируемого последовательностью SEQ ID NO: 28), H2 (кодируемого SEQ ID NO: 12), H3 (кодируемого SEQ ID NO: 13), Н4 (кодируемого последовательностью SEQ ID NO: 14), H5 (кодируемого последовательностью SEQ ID NO: 15), H6 (кодируемого последовательностью SEQ H8 (кодируемого SEQ H11 SEQ H14
SEQ ID NO: 24), H16 (кодируемого последовательностью SEQ ID NO: 25) или вируса гриппа типа B (кодируемого последовательностью SEQ ID NO: 26) или их комбинации.
Один или несколько HA из одного или нескольких подтипов вируса гриппа могут коэкспрессироваться в клетке растения или насекомого, чтобы гарантировать, что синтез одного или нескольких HA приведет к образованию ВЧ, содержащих комбинацию HA, полученных из одного или нескольких подтипов вируса гриппа. Выбор комбинации HA может определяться целью применения вакцины, изготовленной из этих ВЧ. Например, вакцина для использования у инокулированных птиц может содержать какую-либо комбинацию подтипов HA, в то время как ВЧ, применяемые для вакцинации человека, могут содержать подтипы одного или нескольких из подтипов H1, H2, H3, H5, H7, H9, H10, N1, N2, N3 и N7. Однако другие комбинации подтипов HA можно получить в зависимости от цели применения инокулюма.
URL:biohealthbase.org) или Национальный центр биотехнологической
ID NO:
(кодируемого
ID NO: (кодируемого
ID NO: 16), H7 (кодируемого последовательностью SEQ ID NO: 11), последовательностью SEQ ID
18), H10 (кодируемого последовательностью SEQ ID
21), H13 (кодируемого последовательностью SEQ ID
NO: 17), H9 (кодируемого последовательностью последовательностью SEQ ID NO: 19),
NO: 20), H12 (кодируемого последовательностью последовательностью SEQ ID NO: 27),
NO: 23), H15 (кодируемого последовательностью
- 15 034733
Таким образом, настоящее изобретение относится к ВЧ, содержащих один или несколько подтипов
HA, например два, три, четыре, пять, шесть или более подтипов HA.
Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим гемагглютинины, которые образуются в ВЧ при экспрессии в растениях.
Типичные нуклеиновые кислоты могут содержать нуклеотидные последовательности гемагглютинина из выбранных штаммов подтипов вируса гриппа, например подтип A (H1N1), такой как А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) (SEQ ID NO: 33), подтип А/Индонезия/5/05 (H5N1) (включающий конструкцию #660; SEQ ID NO: 60) и менее частые тип В (например, SEQ ID NO: 26, фиг. 10O) и тип C (SEQ ID NO: 27, фиг. 10B) и HA, полученные из других подтипов вируса гриппа. ВЧ других подтипов вируса гриппа также включены в настоящее изобретение, например А/Брисбан/59/2007 (H1N1; SEQ ID NO: 36), А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1; SEQ ID NO: 37), А/Сингапур/1/57 (H2N2; SEQ ID NO: 42), А/Аньхой/1/2005 (H5N1; SEQ ID NO:43), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1;
SEQ ID NO: 44), А/Дикие утки/ГонкошЖ312/97 (H6N1; SEQ ID NO: 45), А/Гонконг/1073/99 (H9N2; SEQ ID NO: 47), А/Брисбан/10/2007 (H3N2; SEQ ID NO: 38), А/Висконсин/67/2005 (H3N2;
SEQ ID NO: 39), А/лошади/Прага/56 (H7N7; SEQ ID NO: 46), В/Малайзия/2506/2004 (SEQ ID NO: 40) или В/Флорида/4/2006 (SEQ ID NO: 41).
Правильное свертывание гемагглютининов может быть важным для стабильности этого белка, образования мультимеров, образования ВЧ и функции HA (способности к гемагглютинации) среди прочих характеристик гемагглютининов вируса гриппа. На свертывание белка могут влиять один или несколько факторов, включая, но не ограничиваясь этим, последовательность белка, относительное присутствие белка, степень внутриклеточного уплотнения, наличие кофакторов, которые могут связываться или временно соединяться со свернутым, частично свернутым или несвернутым белком, наличия одного или нескольких белков-шаперонов или подобных факторов.
Белки теплового шока (Hsp) или белки стресса являются примерами белков-шаперонов, которые могут участвовать в различных клеточных процессах, включая синтез белка, внутриклеточный транспорт, предупреждение неправильного свертывания, предупреждении агрегации белка, сборки или разборки белковых комплексов, свертывания белка и разрушения белка. Примеры таких белков-шаперонов включают, но не ограничиваются этим, Hsp60, Hsp65, Hsp70, Hsp90, Hsp100, Hsp20-30, Hsp10, Hsp100200, Hsp100, Hsp90, Lon, TF55, FKBP, циклофилины, CIpP, GrpE, убиквитин, кальнексин и протеиндисульфидизомеразы. См., например, Macario, A.J.L., Cold Spring Harbor Laboratory Res. 25:59-70. 1995; Parsell, D.A. & Lindquist, S. Ann. Rev. Genet. 27:437-496 (1993); патент США 5232833. В некоторых примерах определенная группа белков-шаперонов включает Hsp40 и Hsp70.
Примеры Hsp70 включают Hsp72 и Hsc73 из клеток млекопитающих, DnaK из бактерий, особенно микобактерий, таких как Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis u Mycobacterium bovis (таких как микобактерия для БЦЖ: обозначено в данном документе как Hsp71). DnaK из Escherichia coli, дрожжей и других прокариот и BiP и Grp78 из эукариот, таких как A. thaliana (Lin et al. 2001 (Cell Stress and Chaperones, 6:201-208). Конкретный пример Hsp70 - Hsp70 A. thaliana (кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 122 или SEQ ID NO: 123). Hsp70 способен специфически связываться с АТФ, а также несвернутыми белками и пептидами, таким образом участвуя в свертывании и развертывании, а также сборке и разборке белковых комплексов.
Примеры Hsp40 включают DnaJ из прокариот, таких как Е. coli и микобактерии, HSJ1, HDJ1 и Hsp40 из эукариот, таких как люцерна (Frugis et al., 1999. Plant Molecular Biology 40:397-408). Конкретный пример Hsp40 - MsJ1 M. sativa (кодируемый SEQ ID NO: 121, 123 или 114). Hsp40 играет роль молекулярного шаперона при свертывании белка, термической толерантности и репликации ДНК среди прочих клеточных процессов.
Среди белков теплового шока Hsp70 и его ко-шаперона, Hsp40 играют роль в стабилизации трансляции и вновь синтезированных полипептидов до того, как синтез завершается. Без намерения ограничиваться существующей теорией считается, что Hsp40 связывается с гидрофобными участками неразвернутых (формирующихся или вновь перенесенных) полипептидов, создавая условия для взаимодействия комплекса Hsp70-ATP с пептидами. Гидролиз АТФ ведет к образованию стабильного комплекса между полипептидом, Hsp70 и АДФ и высвобождению Hsp40. Связь комплекса Hsp70-АДФ с гидрофобными участками этого полипептида предупреждает взаимодействие с другими гидрофобными участками, предупреждая неправильное свертывание и образование агрегатов с другими белками (обзор Hartl, FU. 1996. Nature, 381:571-579).
И вновь, без намерений ограничиваться существующей теорией считается, что по мере увеличения выработки рекомбинантного белка в системе экспрессии белка эффекты нагрузки на экспрессию рекомбинантного белка могут приводить к агрегации и/или снижению накопления рекомбинантного белка вследствие разрушения неправильно свернутого белка. Нативные белки-шапероны могут быть способны облегчать правильное свертывание белка при низких уровнях рекомбинантного белка, но по мере возрастания уровня экспрессии нативные шапероны могут оказаться лимитирующим фактором. Высокие уровни экспрессии гемагглютинина в листьях, инфильтрированных агробактерией, могут вести к накоплению полипептидов гемагглютинина в цитозоле и ко-экспрессии одного или нескольких белков-шаперонов,
- 16 034733 таких как Hsp70, Hsp40 или оба Hsp70 и Hsp40 могут повышать стабильность в цитозоле клеток, экспрессирующих полипептиды, таким образом снижая уровень неправильно свернутых или агрегированных полипептидов гемагглютинина и увеличивая число полипептидов, накапливающихся в виде стабильного гемагглютинина, обладающего характеристиками третичной и четвертичной структуры, что способствуют образованию гемагглютинина и/или вирусоподобных частиц.
Таким образом, настоящее изобретение также предлагает способ производства ВЧ в растении, где первая нуклеиновая кислота, кодирующая HA вируса гриппа, коэкспрессируется со второй нуклеиновой кислотой, кодирующей шаперон. Первая и вторая нуклеиновые кислоты могут быть встроены в растение на одном и том же этапе или могут быть встроены в растение последовательно. Настоящее изобретение также относится к способу производства ВЧ вируса гриппа в растении, где растение содержит первую нуклеиновую кислоту, а вторую нуклеиновую кислоту вводят позже.
Настоящее изобретение также предусматривает растение, содержащее нуклеиновую кислоту, которая кодирует один или несколько гемагглютининов вируса гриппа, и нуклеиновую кислоту, которая кодирует один или несколько шаперонов.
Предполагается, что процессинг N-концевой последовательности сигнального пептида (СП) в ходе экспрессии и/или секреции гемагглютининов вируса гриппа играет роль в процессе свертывания. Термин сигнальный пептид в общем смысле означает короткую (примерно 5-30 аминокислот) последовательность аминокислот, как правило, обнаруживающихся на N-конце полипептида гемагглютинина, которая может направлять транслокацию вновь транслированного полипептида в определенную органеллу или участвовать в позиционировании определенных доменов этого полипептида. Сигнальный пептид гемагглютининов участвует в транслокации этого белка в эндоплазматический ретикулум и, как предполагается, способствует позиционированию N-концевого проксимального домена относительно якорного мембранного домена образующегося полипептида гемагглютинина при расщеплении и свертывании зрелого гемагглютинина. Для удаления сигнального пептида (например, с участием сигнальной пептидазы) может требоваться прецизионное отщепление и удаление сигнального пептида с образованием зрелого гемагглютинина - такое прецизионное отщепление может зависеть от любого из нескольких факторов, включая часть или весь сигнальный пептид, аминокислотную последовательность, фланкирующую сайт отщепления, длину сигнального пептида или их комбинацию, и не все факторы могут относиться к какой-либо определенной последовательности.
Сигнальный пептид может быть нативным для экспрессирующегося гемагглютинина или рекомбинантного гемагглютинина, содержащего сигнальный пептид из вируса гриппа первого типа, подтипа или штамма с равновесным содержанием гемагглютинина второго типа вируса гриппа, подтипа или штамма. Например, нативный сигнальный пептид HA подтипов H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9 или вируса гриппа типа B может быть использован для экспрессии HA в растительной системе.
Сигнальный пептид также может отличаться от нативного, например, от структурного белка или гемагглютинина вируса, не относящегося к вирусу гриппа, или от растительного, животного или бактериального полипептида. Типичный сигнальный пептид - это протеин-дисульфидизомераза люцерны (ПДИЛ) (нуклеотиды 32-103 под входящим номером Zl1499; SEQ ID NO: 34; фиг. 17; аминокислотная последовательность MAKNVAIF GLLFSLLLLVP SQIFAEE).
Настоящее изобретение также предлагает гемагглютинин вируса гриппа, содержащий нативный или отличающийся от нативного сигнальный пептид и нуклеиновые кислоты, кодирующие такие гемагглютинины.
Белки HA вируса гриппа проявляют ряд схожих свойств и различий в отношении молекулярной массы, изоэлектрической точки, размера, содержания гликанов и им подобным характеристикам. Физико-химические свойства различных гемагглютининов могут быть полезными в дифференциации HA, экспрессирующихся в растении, клетке насекомого или дрожжевой системе, и могут быть особенно полезны, когда в одной системе коэкспрессируется несколько HA. Примеры таких физико-химических свойств приведены в табл. 1.
- 17 034733
Таблица 1
Физико-химические свойства гемагглютининов вируса гриппа
Клон Штаммы гриппа АА Гликаны НА0 Молекулярная масса (кДа) Изоэлектрическая точка
№ Тип
НА0 НА1 НА2 НА0 НА1 НА2 НА0 1 НА1 НА1 1 НА2 НА2 1 НА0 НА1 НА2
774 Hl А/Брисбен/59/2007 548 326 222 9 7 2 61 75 36 47 25 28 6,4 7,5 5,3
775 Hl A/Соломоновы острова/3/2006 548 326 222 9 7 2 61 75 36 47 25 28 6,1 6,7 5,3
776 H3 А/Брисбен/10/2007 550 329 221 12 11 1 62 80 37 54 25 27 8,5 9,6 5,2
777 H3 А/Висконсин/67/2005 550 329 221 11 10 1 62 79 37 52 25 27 8,8 9,6 5,3
778 В В/Малайзия/2506/2004 570 347 223 12 8 4 62 80 38 50 24 30 8,0 9,7 4,5
779 В В/Флорида/4/2006 569 346 223 10 7 3 62 77 38 48 24 29 8,0 9,7 4,5
780 H2 А/Сингапур/1/57 547 325 222 6 4 2 62 71 36 42 25 28 6,0 7,5 4,9
781 H5 А/Аньхой/1/2005 551 329 222 7 5 2 62 73 37 45 25 28 6,2 8,9 4,7
782 Н5 А/Вьетнам/1194/2004 552 330 222 7 5 2 63 74 38 45 25 28 6,4 9,1 4,8
783 Н6 А/дикие утки/ГонконгАУЗ 12/97 550 328 222 8 5 3 62 75 37 45 25 30 5,7 5,9 5,6
784 Н7 А/лошади/Прага/56 552 331 221 6 4 2 62 71 37 43 25 28 8,9 9,7 4,9
785 Н9 А/Гонконг/1073/99 542 320 199 9 7 2 61 75 36 46 23 26 8,4 9,5 5,3
Настоящее изобретение также включает нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 28; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 11, кодирующие HA из H1, H5 или H7 соответственно. Настоящее изобретение также включает нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации с последовательностью SEQ ID NO: 28; последовательностью SEQ ID NO: 3; последовательностью SEQ ID NO: 11. Настоящее изобретение также включает нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации с комплементарной последовательностью последовательности SEQ ID NO: 28; последовательности SEQ ID NO: 3; последовательности SEQ ID NO: 1. Нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются с последовательностями под определенными номерами или последовательностями, комплементарными последовательностями под номерами, кодируют белок гемагглютинина, который после экспрессии образует ВЧ, и ВЧ индуцирует выработку антитела после введения субъекту. Например, экспрессия нуклеотидной последовательности в растительной клетке ведет к образованию ВЧ, и эту ВЧ можно использовать для выработки антитела, способного связывать HA, включая зрелый HA, НА0, HA1 или HA2 одного или нескольких типов или подтипов вируса гриппа. Эта ВЧ после введения субъекту вызывает иммунный ответ. Настоящее изобретение
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
13; SEQ
19; SEQ 25; SEQ 37; SEQ
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
также включает
14; SEQ
20; SEQ
26; SEQ
38; SEQ
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 15; SEQ 21; SEQ 27; SEQ 39; SEQ
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
16; SEQ 22; SEQ 33; SEQ 40; SEQ
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
17; SEQ 23; SEQ 35; SEQ 41; SEQ
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
12; 18; 24; 36; 42;
SEQ SEQ SEQ SEQ
SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47.
Настоящее изобретение также включает нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации с SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ SEQ SEQ SEQ
SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47.
Настоящее изобретение также включает нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется жестких
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
16; SEQ 22; SEQ 33; SEQ 40; SEQ
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
17; SEQ 23; SEQ 35; SEQ 41; SEQ
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
18; SEQ 24; SEQ 36; SEQ 42; SEQ
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
19; SEQ 25; SEQ 37; SEQ 43; SEQ
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
20; SEQ
26; SEQ
38; SEQ
44; SEQ
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
21;
27;
39;
45;
условиях
13; SEQ
19; SEQ
25; SEQ
37; SEQ гибридизации с последовательностью,
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
14; SEQ 20; SEQ 26; SEQ 38; SEQ
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
15; SEQ 21; SEQ 27; SEQ 39; SEQ
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
комплементарной SEQ ID NO: 16; SEQ 22; SEQ 33; SEQ 40; SEQ
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
17; SEQ 23; SEQ 35; SEQ 41; SEQ
ID NO:
ID NO:
ID NO:
ID NO:
12; 18; 24; 36; 42;
в
SEQ SEQ SEQ SEQ
SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47.
Настоящее изобретение также включает нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется с SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO
SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO:
SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47 последовательностью, комплементарной SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO:15;
SEQ ID NO: 16; SEQ ID NO: 17; SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO:21;
SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO:27;
SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO:39;
17;
23;
35;
41; или
- 18 034733
SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47, кодирующей белок гемагглютинина, которая при экспрессии образует ВЧ, и эта ВЧ вызывает выработку антитела после введения субъекту. Например, экспрессия нуклеотидной последовательности в растительной клетке ведет к образованию ВЧ, и эту ВЧ можно использовать для выработки антитела, способного связывать HA, включая зрелый HA, HA0, HA1 или HA2 одного или нескольких типов или подтипов вируса гриппа. Эта ВЧ после введения субъекту вызывает иммунный ответ.
В некоторых вариантах настоящее изобретение также включает нуклеотидные последовательности SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47, кодирующие HA из подтипов H1, H2, H3, H5, H7 или H9 вируса гриппа типа A или HA вируса гриппа типа B.
Настоящее изобретение также включает нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации с SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47.
Настоящее изобретение также включает нуклеотидную последовательность, которая гибридизуется в жестких условиях гибридизации с последовательностью, комплементарной SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47. Эти нуклеотидные последовательности, которые гибридизуются с SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47 или последовательностью, комплементарной SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47, кодируют белок гемагглютинина и при экспрессии образуют ВЧ, и эта ВЧ вызывает выработку антитела при введении субъекту. Например, экспрессия нуклеотидной последовательности в растительной клетке ведет к образованию ВЧ, и эту ВЧ можно использовать для выработки антитела, способного связывать HA, включая зрелый HA, НА0, HA1 или HA2 одного или нескольких типов или подтипов вируса гриппа. Эта ВЧ после введения субъекту вызывает иммунный ответ.
Гибридизация в жестких условиях гибридизации известна в данной области техники (см., например, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., eds. 1995 and supplements; Maniatis et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory, 1982; Sambrook and Russell, in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition 2001; каждая их которых включена в данный документ путем ссылки). Примером таких жестких условий гибридизации может быть 16-20 ч гибридизации в 4х SSC при 65°C с последующим отмыванием в 0,1 х SSC при 65°C в течение 1 ч или двукратным отмыванием в 0,1 х SSC при 65°C, каждое в течение 20-30 мин, или типичные жесткие условия гибридизации могут представлять собой гибридизацию в течение ночи (16-20 ч) в 50% формамиде, 4х SSC при 42°C с последующим отмыванием в 0,1х SSC при 65°C в течение 1 ч или двукратным отмыванием в 0,1х SSC при 65°C, каждое в течение 20-30 мин, или гибридизация в течение ночи (16-20 ч), или гибридизация в водном фосфатном буфере Черча (7% додецилсульфат натрия, 0,5 моль NaPO4-буфер с pH 7,2, 10 ммоль ЭДТК) при 65°C либо с двукратным отмыванием при 50°C в 0,1 х SSC, 0,1% додецилсульфате натрия, каждое в течение 20-30 мин, либо двукратным отмыванием при 65°C в 2х SSC, 0,1% додецилсульфате натрия, каждое в течение 20-30 мин.
Кроме того, настоящее изобретение включает нуклеотидные последовательности, которые характеризуются тем, что имеют 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое промежуточное значение идентичности или сходства последовательностей с нуклеотидной последовательностью, кодирующей HA из H1 (SEQ ID NO: 28), H5 (SEQ ID NO: 3) или H7 (SEQ ID NO: 11), где эта нуклеотидная последовательность кодирует белок гемагглютинина и при экспрессии образует ВЧ, и эта ВЧ вызывает выработку антитела. Например, экспрессия этой нуклеотидной последовательности в растительной клетке ведет к образованию ВЧ, и эту ВЧ можно использовать для выработки антитела, способного связывать HA, включая зрелый HA, НА0, HA1 или HA2. Эта ВЧ после введения субъекту вызывает иммунный ответ.
Кроме того, настоящее изобретение включает нуклеотидные последовательности, которые характеризуются тем, что имеют 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое промежуточное значение идентичности или сходства последовательностей с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 12; SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14; SEQ ID NO: 15; SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17;
SEQ ID NO: 18; SEQ ID NO: 19; SEQ ID NO: 20; SEQ ID NO: 21; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO:23;
SEQ ID NO: 24; SEQ ID NO: 25; SEQ ID NO: 26; SEQ ID NO: 27; SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO:35;
SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO:41;
- 19 034733
SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47, где эта нуклеотидная последовательность кодирует белок гемагглютинина и при экспрессии образует ВЧ, и эта ВЧ вызывает выработку антитела. Например, экспрессия этой нуклеотидной последовательности в растительной клетке ведет к образованию ВЧ, и эту ВЧ можно использовать для выработки антитела, способного связывать HA, включая зрелый HA, НА0, HA1 или HA2. Эта ВЧ после введения субъекту вызывает иммунный ответ.
Кроме того, настоящее изобретение включает нуклеотидные последовательности, которые характеризуются тем, что имеют 70, 75, 80, 85, 87, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100% или любое промежуточное значение идентичности или сходства последовательностей с нуклеотидной SEQ ID NO: 33; SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 38; SEQ ID NO: 39; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 41; SEQ ID NO: 42; SEQ ID NO: 43; SEQ ID NO: 44; SEQ ID NO: 45; SEQ ID NO: 46 или SEQ ID NO: 47, где эта нуклеотидная последовательность кодирует белок гемагглютинина и при экспрессии образует ВЧ, и эта ВЧ вызывает выработку антитела. Например, экспрессия этой нуклеотидной последовательности в растительной клетке ведет к образованию ВЧ, и эту ВЧ можно использовать для выработки антитела, способного связывать HA, включая зрелый HA, НА0, HA1 или HA2. Эта ВЧ после введения субъекту вызывает иммунный ответ.
Также настоящее изобретение включает HA, связанные со следующими подтипами H1 (кодируемого SEQ ID NO: 28), H2 (кодируемого SEQ ID NO: 12), H3 (кодируемого SEQ ID NO: 13), Н4 (кодируемого SEQ ID NO: 14), H5 (кодируемого SEQ ID NO: 15), H6 (кодируемого SEQ ID NO: 16), H7 (кодируемого SEQ ID NO: 11), H8 (кодируемого SEQ ID NO: 17), H9 (кодируемого SEQ ID NO: 18), H10 (кодируемого SEQ ID NO: 19), H11 (кодируемого SEQ ID NO: 20), H12 (кодируемого SEQ ID NO: 21), H13 (кодируемого SEQ ID NO: 27), H14 (кодируемого SEQ ID NO: 23), H15 (кодируемого SEQ ID NO: 24), H16 (кодируемого SEQ ID NO: 25) или вируса гриппа типа B (кодируемого SEQ ID NO: 26); см. фиг. 10A-10O), и нуклеотидные последовательности, которые характеризуются тем, что имеют 70-100% или любое промежуточное значение, 80-100% или любое промежуточное значение, 90-100% или любое промежуточное значение или 95-100% или любое промежуточное значение идентичности последовательности с H1 (SEQ ID NO: 28), H2 (SEQ ID NO: 12), H3 (SEQ ID NO: 13), H4 (SEQ ID NO: 14), H5 (SEQ ID NO: 15), H6 (SEQ ID NO: 16), H7 (SEQ ID NO: 11), H8 (SEQ ID NO: 17), H9 (SEQ ID NO: 18), H10 (SEQ ID NO: 19), H11 (SEQ ID NO: 20), H12 (SEQ ID NO: 21), H13 (SEQ ID NO: 27), H14 (SEQ ID NO: 23), H15 (SEQ ID NO: 24), H16 (SEQ ID NO: 25), где эта нуклеотидная последовательность кодирует белок гемагглютинина и при экспрессии образует ВЧ, и эта ВЧ вызывает выработку антитела. Например, экспрессия этой нуклеотидной последовательности в растительной клетке ведет к образованию ВЧ, и эту ВЧ можно использовать для выработки антитела, способного связывать HA, включая зрелый HA, HA0, HA1 или HA2. Эта ВЧ после введения субъекту вызывает иммунный ответ.
Иммунный ответ в общем случае означает реакцию адаптивной иммунной системы. Адаптивная иммунная система, как правило, включает гуморальный ответ и клеточный ответ. Гуморальный ответ это компонент иммунной системы, который опосредован высвобожденными антителами, которые вырабатываются в клетках линии B-лимфоцитов (В-клеток). Высвобожденные антитела связывают с антигенами на поверхности проникающих микроорганизмов (таких как вирусы или бактерии), таким образом помечая их как мишень, предназначенную для разрушения. Гуморальный иммунитет в общем смысле означает выработку антитела и процесс, который ее сопровождает, а также эффекторные функции антител, включая активацию Th2-лимфоцитов и выработку цитокинов, образование клеток памяти, обеспечение фагоцитоза с участием опсонинов, разрушение патогенных микроорганизмов и им подобные.
Термин модулировать или модуляция или аналогичные термины означают увеличение или уменьшение определенной реакции или показателя, что определяют с помощью какого-либо из нескольких анализов, общеизвестных или используемых, некоторые из которых приведены в данном документе в качестве примера.
Клеточный ответ - это иммунный ответ, который включает не участие антител, а активацию макрофагов, естественных киллеров (NK-клеток), антигенспецифичных цитотоксических T-лимфоцитов и высвобождение различных цитокинов в ответ на антиген. Клеточный иммунитет в общем смысле означает активацию Th-клеток, активацию Tc-клеток и опосредованные T-клетками ответы. Клеточный иммунитет особенно важен при ответе на вирусные инфекции.
Например, индукцию антигенспецифичных T-лимфоцитов CD8 можно измерить с помощью теста ELISPOT; стимуляцию T-лимфоцитов CD4 можно измерить с помощью теста с пролиферацией. Титры антител к вирусу гриппа можно оценить количественно с помощью теста ELISA; изотипы антигенспецифических или перекрестно реагирующих антител можно измерить с помощью антиизотипических антител (например, анти-IgG, IgA, IgE или IgM). Методики проведения таких тестов хорошо известны в данной области техники.
Тест с торможением гемагглютинации (ТГ или ТГА) также можно использовать для демонстрации эффективности антител, индуцированных вакциной, или вакцинная композиция может тормозить агглютинацию эритроцитов с участием рекомбинантного HA. Титры антител, тормозящих гемагглютинацию, в образцах сыворотки можно измерить с помощью ТГА с микротитрованием (Aymard et al., 1973). Можно
- 20 034733 использовать эритроциты любого из нескольких видов, например лошади, индейки, куры или им подобные. Этот тест дает непрямые данные о сборке триммера HA на поверхности ВЧ, подтверждая соответствующее представление антигенных сайтов на HA.
Титры перекрестно реагирующих антител с помощью ТГА также можно использовать для демонстрации эффективности иммунного ответа на другие штаммы вируса, схожего с вакцинным подтипом. Например, сыворотку субъекта, иммунизированного вакцинной композицией с первым штаммов (например, ВЧ А/Индонезия 5/05), можно использовать в тесте с ТГА со вторым штаммом целого вируса или вирусных частиц (например, А/Вьетнам/1194/2004) и определить титр в ходе ТГА.
Наличие или уровни цитокинов тоже можно определить количественно. Например, T-клеточный ответ (Th1/Th2) будет характеризоваться измерением клеток, секретирующих ИФН γ или ИЛ-4, с помощью теста ELISA (например, наборы BD Biosciences OptEIA). Мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) или спленоциты, полученные от субъекта, можно культивировать и провести анализ надосадочной жидкости. T-лимфоциты тоже можно определить количественно с помощью флуоресцентной сортировки клеток с использованием маркер-специфичных флуоресцентных меток и методик, известных в данной области техники.
Также можно провести тест с микронейтрализацией для определения характеристик иммунного ответа у субъекта, см., например, методики Rowe et al., 1973. Титры нейтрализации вируса можно измерить несколькими путями, включая 1) подсчет бляшек лизиса (анализ бляшкообразования) после фиксации кристаллическим фиолетовым и окраски клеток; 2) выявление лизиса клеток в культуре под микроскопом; 3) тест ELISA и спектрофотометрическую детекцию вирусного белка NP (что коррелирует с вирусной инфекцией клеток хозяина).
Идентичность последовательности или сходство последовательности можно определить с помощью программы сравнения нуклеотидных последовательностей, таких как имеющиеся в DNASIS (например, с помощью, но не ограничиваясь этим, следующих параметров: штраф за продолжение гэпа 5, число верхних диагоналей 5, фиксированный штраф за продолжение гэпа 10, k-кортеж 2, блуждающий гэп 10 и размер окна 5). Однако другие методики выравнивания последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области техники, например алгоритмы Smith и Waterman (1981, Adv. Appl. Math. 2:482), Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443, 1970), Pearson и Lipman (1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 85:2444) и компьютеризованные методики внедрения этих алгоритмов (например, GAP, BESTFIT, FASTA или BLAST) или выравнивание вручную и визуальная оценка.
Термин домен гемагглютинина означает пептид, содержащий либо домен НА0, либо домены HA1 и HA2 (иначе обозначаемые как фрагменты HA1 и HA2). HA0 - предшественник фрагментов HA1 и HA2. Мономер HA можно обычно подразделить на два функциональных домена - стеблевой домен и глобулярная головка, или головной домен. Стеблевой домен участвует в инфекционности и патогенности вируса через конформационное изменение, которому он может подвергаться под воздействием кислой среды. Стеблевой домен можно подразделить дополнительно на четыре субдомена или фрагмента - субдомен слияния или пептид слияния (гидрофобный участок аминокислот, участвующих в слиянии с мембраной хозяина в конформационном состоянии в кислой среде); стеблевой субдомен (может иметь две или больше конформации); трансмембранный домен или субдомен (TmD) (участвует в аффинности HA к липидным рафтам) и цитоплазматический хвост (субдомен цитоплазматического хвоста) (Ctail) (участвует в секреции НА). Глобулярная головка подразделяется на два субдомена, субдомен RB и домен остаточной эстеразы (E). Субдомен Е может быть частично или полностью утоплен и не достигать поверхности глобулярной головки, поэтому некоторые антитела, выработанные против HA, связываются с субдоменом RB.
Термины вирусоподобная частица (ВЧ) или вирусподобные частицы означают структуры, которые подвергаются самосборке и содержат структурные белки, такие как белок HA вируса гриппа. ВЧ, как правило, по морфологическим и антигенным свойствам схожи с вирионами, образующимися при инфекции, но в них отсутствует генетическая информация, достаточная для репликации, и по этой причине они неинфекционны. В некоторых примерах ВЧ могут содержать только один вид белков или несколько видов белка. В ВЧ, содержащих несколько видов белков, виды белка могут происходить из одного и того же вида вируса или могут содержать белок от другого вида, рода, подсемейства или семейства вирусом (согласно номенклатуре Международного комитета по таксономии вирусов). В других примерах один или несколько видов белков, содержащихся в ВЧ, могут быть модифицированы относительно последовательности естественного происхождения. ВЧ можно производить в соответствующих клетках хозяина, включая клетки растений и насекомых. После экстракции из клетки хозяина и после выделения и дальнейшей очистки в соответствующих условиях ВЧ можно очистить в виде целых структур.
ВЧ, получающиеся из белков вируса гриппа, согласно настоящему изобретению не содержат белок M1. Белок M1, как известно, связывает РНК (Wakefield и Brownlee, 1989), которая является контаминантом ВЧ. Присутствие РНК нежелательно при получении регуляторной регистрации для ВЧ-продукта, поэтому препарат ВЧ, не содержащий РНК, может быть более выигрышным.
ВЧ настоящего изобретения можно производить в клетке хозяина, которая характеризуется отсутствием способности к сиалилированию белков, например клетке растения, клетке насекомого, грибов и
- 21 034733 других организмов, включая губки, кишечнополостных, кольчатых червей, членистоногих, моллюсков, круглых червей, trochelmintes, plathelminthes, щетинкочелюстные, щупальцевые гребневики, хламидии, спирохеты, грамположительные бактерии, цианобактерии, архебактерии или им подобные. См., например, Glycoforum (URL:glycofomm.gr.jp/science/word/evolution/ES-A03E.html) или Gupta et al., 1999. Nucleic Acids Research, 27:370-372; или Toukach et al., 2007. Nucleic Acids Research 35:D280-D286; или URL:glycostructures.jp (Nakahara et al., 2008. Nucleic Acids Research 36:D368-D371; опубликовано онлайн 11 октября 2007 г. doi:10.1093/NAR/gkm833). ВЧ, произведенные, как описано в данном документе, обычно не содержат нейраминидазу (NA). Однако NA может коэкспрессироваться с HA, если желательно, чтобы ВЧ содержали HA и NA.
ВЧ, произведенные в растении согласно некоторым аспектам настоящего изобретения, могут образовывать комплексы с липидами растительного происхождения. ВЧ могут содержать пептид НА0, HA1 или HA2. Липиды растительного происхождения могут находиться в виде двойного липидного слоя и могут дополнительно содержать оболочку, окружающую ВЧ. Липиды растительного происхождения могут содержать липидные компоненты плазматической мембраны растения, в котором производятся ВЧ, включая, но не ограничиваясь этим, фосфатидилхолин (ФХ), фосфатидилэтаноламин (ФЭ), гликосфинголипиды, фитостеролы или их комбинацию. Липид растительного происхождения может иначе именоваться растительным липидом. Примеры фитостеролов известны в данной области техники и включают, например, стигмастерол, ситостерол, 24-метилхолестерин и ходестерин - см. например, Mongrand et al., 2004.
ВЧ можно исследовать в отношении структуры и размера, например, с помощью теста на гемагглютинацию, электронной микроскопии или эксклюзионной хроматографии.
При эксклюзионной хроматографии все растворимые белки можно экстрагировать из растительной ткани путем гомогенизации образца (Polytron) замороженного и измельченного растительного материала в экстрагирующем буфере и удаления нерастворимого материала с помощью центрифугирования. Также может быть полезной преципитация с использованием полиоксиэтиленгликоля. Растворимый белок измеряют и этот экстракт пропускают через колонку Sephacryl™. В качестве калибровочного стандарта можно использовать синий декстран 2000. После хроматографии фракции можно дополнительно исследовать с помощью иммуноблоттинга, чтобы определить белковый комплемент в этой фракции.
Без намерения ограничиваться существующей теорией предполагается, что способность HA связываться с эритроцитами у различных животных зависит от аффинности HA к сиаловым кислотам α2,3 или α2,3 и присутствия этих сиаловых кислот на поверхности эритроцитов. HA вируса лошадиного и птичьего гриппа склеивают эритроциты всех из нескольких видов, включая индейку, кур, уток, морских свинок, человека, овец, лошадей и коров; в то время как человеческие HA будут связываться с эритроцитами индейки, кур, уток, морских свинок, человека и овец (см. также Ito Т. et al., 1997, Virology, vol. 227, p. 493499 и Medeiros R. et al., 2001, Virology, vol. 289, p. 74-85). Примеры видовой реактивности HA различных штаммов вируса гриппа представлены в табл. 2 A и 2B.
- 22 034733
Таблица 2A
Виды эритроцитов, с которыми связываются HA некоторых сезонных штаммов гриппа
Сезонный Штамм № происхождение лошади индейки
Hl А/Брисбен/59/2007 (H1N1) 774 человек + ++
A/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1) 775 человек + ++
НЗ А/Брисбен/10/2007 (H3N2) 776 человек + -н-
А/Висконсин/67/2005 (H3N2) 777 человек + ++
В В/Малайзия/2506/2004 778 человек + ++
В/Флорида/4/2006 779 человек + ++
Таблица 2B
Виды эритроцитов, с которыми связываются HA некоторых пандемических штаммов гриппа
Пандемия Штамм № происхождение лошади индейки
Н2 А/Сингапур/1/57 (H2N2) 780 человек + ++
Н5 А/Аньхой/1/2005 (H5N1) 781 чел.-птицы ++ +
А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) 782 чел.-птицы ++ +
Н6 А/дикие утки/ГонконгДУЗ 12/97 (H6N1) 783 птицы 4-+ +
Н7 А/лошади/Прага/56 (H7N7) 784 лошади ++ ++
Н9 А/Гонконг/1073/99 (H9N2) 785 человек ++ +
Фрагмент или часть белка, гибридный белок или полипептид включают пептид или полипептид, содержащий набор аминокислот, комплементарных определенному белку или полипептиду при условии, что этот фрагмент при экспрессии может образовать ВЧ. Этот фрагмент может, например, содержать антигенный участок, участок, индуцирующий ответ на стресс, или участок, содержащий функциональный домен белка или полипептида. Этот фрагмент может также содержать участок или домен, общий для белков одного и того же общего семейства, или этот фрагмент может включать достаточную аминокислотную последовательность, которая специфически идентифицирует полноразмерный белок, от которого она происходит.
Например, фрагмент или часть могут содержать от примерно 60 до примерно 100% длины полноразмерного белк, или любое промежуточное значение при условии, что этот фрагмент при экспрессии может образовывать ВЧ, например, от примерно 60 до примерно 100%, от примерно 70 до примерно 100%, от примерно 80 до примерно 100%, от примерно 90 до примерно 100%, от примерно 95 до примерно 100% длины полноразмерного белка или любое промежуточное значение. Или же фрагмент или часть могут содержать от примерно 150 до примерно 500 аминокислот или любого промежуточного числа в зависимости от HA и при условии, что этот фрагмент при экспрессии может образовывать ВЧ, например фрагмент может содержать от примерно 150 до примерно 500 аминокислот или любого промежуточного числа, от примерно 200 до примерно 500 аминокислот или любого промежуточного числа, от примерно 250 до примерно 500 аминокислот или любого промежуточного числа, от примерно 300 до примерно 500 аминокислот или любого промежуточного числа, от примерно 350 до примерно 500 аминокислот или любого промежуточного числа, от примерно 400 до примерно 500 аминокислот или любого промежуточного числа, от примерно 450 до примерно 500 аминокислот или любого промежуточного числа, в зависимости от HA и при условии, что этот фрагмент при экспрессии может образовывать ВЧ. Например, примерно 5, 10, 20, 30, 40 или 50 аминокислот или любое промежуточное число могут быть удалены из C-конца, N-конца или обоих C- и N-концов белка HA при условии, что этот фрагмент при экспрессии может образовывать ВЧ.
Нумерация аминокислот в любой данной последовательности происходит относительно определенной последовательности, однако специалист в данной области техники может без труда определить эквивалентность определенной аминокислотной последовательности по структуре и/или последовательности. Например, если шесть аминокислот на N-конце удалены при конструировании клона для кристаллографии, это изменит специфическую числовую идентификацию аминокислоты (например, относительно полноразмерного белка), но не изменит относительное положение аминокислоты в структуре.
Сравнения последовательности или последовательностей можно провести с помощью алгоритма BLAST (Altschul et al., 1990. J. Mol. Biol. 215:403-410). Поиск BLAST позволяет сравнить данную после
- 23 034733 довательность с определенной последовательностью или группой последовательностей или с большой библиотекой или базой (например, GenBank и GenPept) последовательностей и идентифицировать не только последовательности, которые проявляют 100% сходство, но и те, что имеют меньшее сходство. Последовательности нуклеиновых кислот или аминокислотные последовательности можно сравнить с помощью алгоритма BLAST. Кроме того, сходство двух или более последовательностей можно определить путем выравнивания последовательностей и вычисления % сходства между последовательностями. Выравнивание можно провести с помощью алгоритма BLAST (например, согласно доступному GenBank; URL:ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/ с помощью стандартных параметров. Program: blastn; Database: nr; Expect 10; filter: default; Alignment: pairwise; Query genetic Codes: Standard (1)), или BLAST2 через EMBL URL:embl-heidelberg.de/Services/index.html с помощью стандартных параметров: Matrix BLOSUM62; Filter: default, echofilter: on, Expect: 10, cutoff: default; Strand: both; Descriptions: 50, Alignments: 50; или FASTA с использованием стандартных параметров), или вручную путем сравнения последовательностей и расчета % сходства.
Настоящее изобретение описывает, но не ограничивается этим, клонирование нуклеиновой кислоты, кодирующей HA, в растительном векторе экспрессии и производство ВЧ вируса гриппа в растении, пригодном для производства вакцин. Примеры таких нуклеиновых кислот включают, например, но не ограничиваются этим, HA вируса гриппа A/Новая Каледония/20/99 (H1N1) (например, SEQ ID NO: 61), подтип А/Индонезия/5/05 (H5N1) (например, SEQ ID NO: 60), А/Брисбан/59/2007 (H1N1) (например, SEQ ID NO: 36, 48,62), А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1) (например, SEQ ID NO: 37, 49, 63), А/Сингапур/1/57 (H2N2) (например, SEQ ID NO: 42, 54, 64), А/Аньхой/1/2005 (H5N1) (например, SEQ ID NO: 43, 55, 65), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) (например, SEQ ID NO: 44, 56, 66), А/Дикие утки/Гонконг/\У312/97 (H6N1) (например, SEQ ID NO: 45, 57, 67), А/Гонконг/1073/99 (H9N2) (например, SEQ ID NO: 47, 59, 68), А/Брисбан/10/2007 (H3N2) (например, SEQ ID NO: 38, 50, 69), А/Висконсин/67/2005 (H3N2) (например, SEQ ID NO: 39, 51, 70), А/лошади/Прага/56 (H7N7) (например, SEQ ID NO: 46, 58, 71), В/Малайзия/2506/2004 (например, SEQ ID NO: 40, 52, 72)), В/Флорида/4/2006 (например, SEQ ID NO: 41, 53, 73). Соответствующие номера клонов или конструкций для этих штаммов приведены в табл. 1. Последовательности нуклеиновых кислот, соответствующие последовательностям под номерами: 36-47, содержат пластоцианин в 3'-5'-направлении и функционально связаны с кодирующей последовательностью HA для каждого из этих типов или подтипов, как проиллюстрировано на фиг. 28-39. Последовательности нуклеиновых кислот, соответствующие SEQ ID NO: 60-73, содержат кассету экспрессии HA, включающую промотор пластоцианина люцерны и 5'UTR-последовательность, кодирующую гемагглютинин, последовательности 3'UTR и терминатор пластоцианина люцерны, как проиллюстрировано на фиг. 51-64.
ВЧ также можно использовать для производства реагентов, содержащих рекомбинантные структурные белки вируса гриппа, которые подвергаются самосборке в функциональные и иммуногенные гомотипические макромолекулярные белковые структуры, включая субвирусные частицы вируса гриппа и ВЧ вируса гриппа, в трансформированных клетках хозяина, например клетках растений или клетках насекомых.
Таким образом, настоящее изобретение относится к ВЧ и способу производства вирусных ВЧ в растительной системе экспрессии по экспрессии единственного белка оболочки. ВЧ могут представлять собой ВЧ вируса гриппа или ВЧ, полученные из других вирусов - производных плазматической мембраны, включают, но не ограничиваются этим, вирусы кори, Эбола, Марбург и ВИЧ.
Белки других вирусов, покрытых оболочкой, например, помимо прочего, филовирусов (например, вирус Эбола, вирус Марбург или им подобные), парамисковирусов (например, вирус кори, вирус эпидемического паротита, респираторный синцитиальный вирус, пневмовирус или им подобные), ретровирусов (например, вирус иммунодефицита человека-1, вирус иммунодефицита человека-2, вирус T-клеточного лейкоза человека-1 или им подобные), флавовирусов (например, вирус энцефалита Западного Нила, вирус лихорадки Денге, вирус гепатита С, вирус желтой лихорадки или им подобные), буньявирусов (например, хантавирус или ему подобные), коронавирусов (например, коронавирус, вирус атипичной пневмонии или им подобные), как известно специалисту в данной области техники, также могут быть использованы. Не налагающие ограничений примеры антигенов, которые могут экспрессироваться в вирусах - производных плазматической мембраны, включают капсидный белок ВИЧ p24, гликопротеин ВИЧ gp120 или gp41, белки филовируса, включая VP30 или VP35 вируса Эбола, или gp/SGP вируса Марбург, или белок H, или белок F парамиксовируса кори. Например, P24 ВИЧ (например, идентификатор Geninfo в GenBank: 19172948) - белок, получающийся при трансляции и расщеплении последовательности gag вирусного генома ВИЧ (например, идентификатор Geninfo в GenBank: 9629357); gp 120 и gp41 ВИЧ - гликопротеины, получающиеся при трансляции и расщеплении белка gp160 (например, идентификатор Geninfo в GenBank: 9629363), кодируемого env вирусного генома ВИЧ. VP30 вируса Эбола (идентификатор Geninfo в GenPept: 55770813) - белок, получающийся при трансляции последовательности VP30 генома вируса Эбола (например, идентификатор Geninfo в GenBank: 55770807); VP35 вируса Эбола (идентификатор Geninfo в GenPept:55770809) - белок, получающийся при трансляции последовательности VP35 генома вируса Эбола. Gp/SGP вируса Марбург (идентификатор Geninfo в GenPept: 296965) - 24 034733 белок, получающийся при трансляции (последовательности) генома вируса Марбург (идентификатор
Geninfo в GenBank: 158539108). Белок H (идентификатор Geninfo в GenPept: 9626951) - белок из последовательности H генома вируса кори (идентификатор Geninfo в GenBank: 9626945); белок F (идентификатор Geninfo в GenPept: 9626950) - белок из последовательности F генома вируса кори.
Однако, как будет понятно специалисту в данной области техники, для осуществления способов настоящего изобретения могут быть использованы другие оболочечные белки.
Таким образом, настоящее изобретение предлагает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащей последовательность, кодирующую р24 ВИЧ, gp120 ВИЧ, gp41 ВИЧ, VP340 вируса Эбола, VP35 вируса Эбола, gp/SGP вируса Марбург, белок H или белок F вируса кори. Данная молекула нуклеиновой кислоты может быть функционально связана с регуляторным участком, активным в клетке насекомого, дрожжей или растения, или в определенной растительной ткани.
Кроме того, настоящее изобретение предлагает клонирование нуклеиновой кислоты, кодирующей HA, например, но не ограничиваясь этим, HA вируса гриппа человека А/Индонезия/5/05 (H5N1), в вектор экспрессии растения или насекомого (например, бакуловирусный вектор экспрессии) и производство кандидатов на вакцину от гриппа или реагентов, содержащих рекомбинантные структурные белки, которые подвергаются самосборке в функциональные и иммуногенные гомотипические макромолекулярные белковые структуры, включая субвирусные частицы вируса гриппа и ВЧ вируса гриппа, в трансформированных клетках растения или трансформированных клетках насекомого.
Нуклеиновая кислота, кодирующая HA подтипов вируса гриппа, включая, но не ограничиваясь этим, А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), подтипа A/Индонезия/5/05 (H5N1), А/Брисбан/59/2007 (H1N1), А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1), А/Сингапур/1/57 (H2N2), А/Аньхой/1/2005 (H5N1),
А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), А/Дикие утки/ГонконгЖ312/97 (H6N1), А/Гонконг/1073/99 (H9N2), А/Брисбан/10/2007 (H3N2), А/Висконсин/67/2005 (H3N2), А/лошади/Прага/56 (H7N7),
В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006, может быть экспрессирована, например, с помощью бакуловирусной системы экспрессии в соответствующей клеточной линии, например клетках Spodoptera frugiperda (например, клеточной линии Sf-9; ATCC PTA-4047). Также можно использовать клеточные линии других насекомых.
С другой стороны, нуклеиновая кислота, кодирующая HA, может быть экспрессирована в клетке растения или в растении. Нуклеиновая кислота, кодирующая HA, может быть синтезирована с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием РНК HA. Как пример, РНК может быть выделена из вируса гриппа человека А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), или из вируса гриппа человека А/Индонезия/5/05 (H5N1), или других вирусов гриппа, например А/Брисбан/59/2007 (H1N1), А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1), А/Сингапур/1/57 (H2N2), А/Аньхой/1/2005 (H5N1), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), А/Дикие утки/ГонконгЖ312/97 (H6N1), А/Гонконг/1073/99 (H9N2), А/Брисбан/10/2007 (H3N2), А/Висконсин/67/2005 (H3N2), А/лошади/Прага/56 (H7N7),
В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006, или из клеток, инфицированных каким-либо вирусом гриппа. Для обратной транскрипции и ПЦР могут быть использованы олигонуклеотидные праймеры, специфичные для РНК HA, например, но не ограничиваясь этим, последовательностей вирусного HA вируса гриппа человека А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) последовательностей HA0 вируса гриппа человека А/Индонезия/5/05 (H5N1), или последовательностей HA подтипов вируса гриппа А/Брисбан/59/2007 (H1N1), А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1), А/Сингапур/1/57 (H2N2), А/Аньхой/1/2005 (H5N1), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), А/Дикие утки/ГонконгЖ312/97 (H6N1), А/Гонконг/1073/99 (H9N2), А/Брисбан/10/2007 (H3N2), А/Висконсин/67/2005 (H3N2), А/лошади/Прага/56 (H7N7),
В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006. Кроме того, нуклеиновая кислота, кодирующая HA, может быть химически синтезирована с помощью методик, известных специалисту в данной области техники.
Полученные копии кДНК этих генов могут быть клонированы в соответствующий вектор экспрессии согласно тому, что требуется для системы экспрессии хозяина. Примеры соответствующих векторов экспрессии описаны ниже или же может быть использован бакуловирусный вектор экспрессии, например pFastBacl (InVitrogen), ведущий к образованию плазмид, основанных на pFastBacl, с использованием известных методик и информации, содержащейся в инструкциях производителя.
Настоящее изобретение также предлагает генную конструкцию, содержащую нуклеиновую кислоту, кодирующую HA, как описано выше, функционально связанную с регуляторным элементом, активным в растении. Примеры регуляторных элементов, активных в клетке растения и пригодных для использования для осуществления настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются этим, регуляторный участок пластоцианина (патент США 7125978; который включен в данный документ путем ссылки) или регуляторный участок рибулозы-1,5-бифосфаткарбоксилазы/оксигеназы (RuBisCO; патент США 4962028; который включен в данный документ путем ссылки), белок, связывающий хлорофилл a/b (CAB; Leutwiler et al.; 1986; который включен в данный документ путем ссылки), ST-LS1 (связанный с выпускающим кислород комплексом фотосистемы II и описанный Stockhaus et al. 1987, 1989; который включен в данный документ путем ссылки). Пример регуляторного района пластоцианина - последовательность, содержащая нуклеотиды 10-85 из SEQ ID NO: 36; или схожий участок любой из последовательностей SEQ ID NO: 37-47. Регуляторный элемент или регуляторный участок может ускорять транс- 25 034733 ляцию нуклеотидной последовательности, с которой он функционально связан, при этом нуклеотидная последовательность может кодировать белок или полипептид. Другой пример регуляторного участка производное нетранслируемых участков вируса мозаики коровьего гороха (CPMV), которое можно использовать для предпочтительной трансляции нуклеотидной последовательности, с которой оно функционально связано, регуляторный участок CPMV содержит систему CMPV-HT - см., например, Sainsbury et al., 2008, Plant Physiology, 148: 1212-1218.
Если эта конструкция экспрессируется в клетке насекомого, примеры регуляторных элементов, активных в клетке насекомого, включают, но не ограничиваются этим, промотор полиэдрина (Possee and Howard 1987. Nucleic Acids Research 15:10233-10248), промотор gp64 (Kogan et al., 1995. J. Virology, 69:1452-1461) и им подобные.
Таким образом, один из аспектов настоящего изобретения предлагает нуклеиновую кислоту, содержащую регуляторный участок и последовательность, кодирующую HA вируса гриппа. Регуляторный участок может быть регуляторным элементом пластоцианина, и HA вируса гриппа может быть выбран из группы штаммов или подтипов вируса гриппа, включающей А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), подтип А/Индонезия/5/05 (H5N1), А/Брисбан/59/2007 (H1N1), А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1), А/Сингапур/1/57 (H2N2), А/Аньхой/1/2005 (H5N1), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), А/Дикие утки/ГонкошЖ312/97 (H6N1), А/Гонконг/1073/99 (H9N2), А/Брисбан/10/2007 (H3N2), А/Висконсин/67/2005 (H3N2), А/лошади/Прага/56 (H7N7), В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006. Последовательности нуклеиновой кислоты, содержащие регуляторный элемент пластоцианина и HA вируса гриппа, приведены в данном документе в качестве примера в последовательностях SEQ ID NO: 36-47.
Известно, что бывают различия в аминокислотных последовательностях гемагглютинина вируса гриппа или кодирующих их нуклеиновых кислот, когда вирус гриппа культивируют в яйцах, или клетках млекопитающих (например, клетках MDCK), или при выделении от инфицированного субъекта. Не налагающие ограничений примеры таких различий проиллюстрированы в данном документе, включая пример 18. Кроме того, как поймет специалист в данной области техники, дополнительные различия могут наблюдаться в гемагглютининах вируса гриппа, полученных из новых штаммов, поскольку продолжают происходить дополнительные мутации. Из-за известной вариабельности последовательностей различных гемагглютининов вируса гриппа настоящее изобретение включает ВЧ, которые могут быть получены с использованием любого гемагглютинина вируса гриппа при условии, что при экспрессии в клетке хозяина, как описано в данном документе, гемагглютинин вируса гриппа образует ВЧ.
Выравнивание последовательностей и консенсусные последовательности можно определить с использованием какой-либо из нескольких компьютерных программ, известных в данной области техники, например MULTALIN (F. CORPET, 1988, Nucl. Acids Res., 16(22), 10881-10890), или последовательности могут быть выровнены вручную, и между ними определены сходство и различия.
Структура гемагглютининов хорошо изучена, и известно, что эти структуры высоко консервативны. При наложении структур гемагглютининов наблюдается высокая степень структурного консерватизма (rmsd <2A). Такой структурный консерватизм наблюдается, даже когда аминокислотная последовательность меняется в некоторых положениях (см., например, Skehel and Wiley, 2000, Ann. Rev. Biochem. 69:531-69; Vaccaro et al., 2005). Участки гемагглютининов тоже высококонсервативны, например:
структурные домены: полипротеин HA0 расщепляется с образованием зрелого HA. HA является гомотримером, в котором каждый мономер содержит домен, связывающий рецептор (HA1) и якорный плазматический домен (HA2), связанные дисульфидной связью; N-концевые 20 остатков субъединицы HA2 также могут именоваться как домен или последовательность слияния HA. Также присутствует хвостовой участок (внутренний по отношению к мембранной оболочке). Каждый гемагглютинин содержит эти участки или домены. Отдельные участки или домены, как правило, консервативны по длине;
все гемагглютинины имеют одинаковое число и положение внутри- и межмолекулярных дисульфидных мостиков. Количество и положение цистеинов в аминокислотной последовательности, участвующих в сети дисульфидных мостиков, среди HA сохраняется. Примеры структур, иллюстрирующих характеристики внутри- и межмолекулярных дисульфидных мостиков и другие консервативные аминокислоты и их относительное положение, описаны, например, Gamblin et al., 2004 (Science, 303:18381842). Типичные структуры и последовательности включают IRVZ, IRVX, IRVT, IRVO, IRUY, 1RU7, имеющиеся в базе данных белков (Berman et al. 2003. Nature Structural Biology, 10:980; URL: rcsb.org); цитоплазматический хвост - большинство гемагглютининов - содержит 3 цистеина в консервативных положениях. Один или несколько из этих цистеинов могут быть пальмитоилированы в посттрансляционной модификации.
Различия аминокислот в гемагглютининах вирусов гриппа допустимы. Эти различия объясняют новые штаммы, которые постоянно выявляются. Инфекционность новых штаммов может различаться. Однако сохраняется образование тримеров гемагглютининов, которые впоследствии образуют ВЧ. Таким образом, настоящее изобретение относится к аминокислотной последовательности гемагглютинина или нуклеиновой кислоте, кодирующей аминокислотную последовательность гемагглютинина, которая образует ВЧ в растении и включает известные последовательности и варианты последовательностей, которые
- 26 034733 могут образоваться.
На фиг. 65 показан пример таких известных различий. На этом рисунке отображена консенсусная аминокислотная последовательность (SEQ ID NO: 74) для HA следующих штаммов H1N1:
А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) (кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 33);
А/Брисбан/59/2007 (H1N1) (кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 48);
А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1) (кодируемый последовательностью SEQ ID NO: 49) и
SEQ ID NO: 9. X1 (положение 3) - A или V; X2 (положение 52) - D или N; X3 (положение 90) - K или R; X4 (положение 99) - K или T; X5 (положение 111) - Y или H; X6 (положение 145) - V или T; X7 (положение 154) - E или K; X8 (положение 161) -R или K;
X9 (положение 181) - V или A; X10 (положение 203) - D или N; X11 (положение 25) - R или K;
X12 (положение 210) - T или K; X13 (положение 225) - R или K; X14 (положение 268) - W или R;
X15 (положение 283) - T или N; X16 (положение 290) - E или K; X17 (положение 432) - I или L;
X18 (position 489) - N или D.
В качестве другого примера таких различий в табл. 3 показаны выравнивание последовательностей и консенсусная последовательность HA А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) (кодируемого последовательностью SEQ ID NO: 33), А/Брисбан/59/2007 (H1N1) (кодируемого последовательностью SEQ ID NO: 48), А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1) (кодируемого последовательностью SEQ ID NO: 49), А/ПуэртоРико/8/34 (H1N1) и последовательность SEQ ID NO: 9.
Таблица 3 Выравнивание последовательностей и консенсусная последовательность HA отдельных штаммов H1N1
SEQ ID NO Последовательность
75 9 48 49 76 1 MKAKLLVLLC TFTATYADTI MKAKLLVLLC TFTATYADTI MKVKLLVLLC TFTATYADTI MKVKLLVLLC TFTATYADTI 50 CIGYHANNST DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL
CIGYHANNST CIGYHANNST CIGYHANNST DTVDTVLEKN DTVDTVLEKN DTVDTVLEKN VTVTHSVNLL VTVTHSVNLL VTVTHSVNLL
консенсусная последовательность mkxkllvllc tftatyadti cigyhannst dtvdtvlekn vtvthsvnll
51 100
75 EDSHNGKLCL LKGIAPLQLG NCSVAGWILG NPECELLISK ESWSYIVETP
9 EDSHNGKLCL LKGIAPLQLG NCSVAGWILG NPECELLISK ESWSYIVETP
48 ENSHNGKLCL LKGIAPLQLG NCSVAGWILG NPECELLISK ESWSYIVEKP
49 EDSHNGKLCL LKGIAPLQLG NCSVAGWILG NPECELLISR ESWSYIVEKP
76
консенсусная последовательность exshngklcl Ikgiaplqlg ncsvagwilg npecellis. eswsyive.p
101 150
75 NPENGTCYPG YFADYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTVTGVSA
9 NPENGTCYPG YFADYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTVTGVSA
48 NPENGTCYPG HFADYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTVTGVSA
49 NPENGTCYPG HFADYEELRE QLSSVSSFER FEIFPKESSW PNHTTTGVSA
76
консенсусная последовательность5 npengtcypg xfadyeelre qlssvssfer feifpkessw pnhtxtgvsa
151 200
75 SCSHNGKSSF YRNLLWLTGK NGLYPNLSKS YVNNKEKEVL VLWGVHHPPN
9 SCSHNGKSSF YRNLLWLTGK NGLYPNLSKS YVNNKEKEVL VLWGVHHPPN
48 SCSHNGESSF YRNLLWLTGK NGLYPNLSKS YANNKEKEVL VLWGVHHPPN
49 SCSHNGESSF YRNLLWLTGK NGLYPNLSKS YANNREKEVL VLWGVHHPPN
76
консенсусная последовательность scshngxssf yxnllwltgk nglypnlsks yxnnkekevl vlwgvhhppn
201 250
75 IGNQRALYHT ENAYVSWSS HYSRRFTPEI AKRPKVRDQE GRINYYWTLL
9 IGNQRALYHT ENAYVSWSS HYSRRFTPEI AKRPKVRDQE GRINYYWTLL
48 IGDQKALYHT ENAYVSWSS HYSRRFTPEI AKRPKVRDQE GRINYYWTLL
49 IGDQRALYHK ENAYVSWSS HYSRRFTPEI AKRPKVRDQE GRINYYWTLL
76 ······.··· .....MSLLT EVETYVLSII PSGPLKAEIA QRLEDVFAGK
консенсусная последовательность igxqxalyhx enayvsvvss hysrxftpel akrPkvrfqe gRi#yyWtll
251 300
75 EPGDTIIFEA NGNLIAPWYA FALSRGFGSG IITSNAPMDE CDAKCQTPQG
9 EPGDTIIFEA NGNLIAPWYA FALSRGFGSG IITSNAPMDE CDAKCQTPQG
48 EPGDTIIFEA NGNLIAPRYA FALSRGFGSG IINSNAPMDK CDAKCQTPQG
49 EPGDTIIFEA NGNLIAPRYA FALSRGFGSG IINSNAPMDE CDAKCQTPQG
76 NTDLEVLMEW ...LKTRPIL SPLTKGILGF VFTLTVPSER GLQRRRFVQN
консенсусная последовательность #pgdt iifEa ngnLiapxya faLsrGfgsg litsnaPmlx cdakcqtpQg
- 27 034733
301 350
75 AINSSLPFQN VHPVTIGECP KYVRSAKLRM VT.GLRNIPS IQSRGLFGAI
9 AINSSLPFQN VHPVTIGECP KYVRSAKLRM VT.GLRNIPS IQSRGLFGAI
48 AINSSLPFQN VHPVTIGECP KYVRSAKLRM VT.GLRNIPS IQSRGLFGAI
49 AINSSLPFQN VHPVTIGECP KYVRSAKLRM VT.GLRNIPS IQSRGLFGAI
76 ALNG.....N GDPNNMDKAV KLYRKLKREI TFHGAKEISL SYSAGALASC
консенсусная последовательность AiNsslpfqN vhPvtigecp KyvRsaKlrm vtxGlrtlps iqSrGlfgai
351 400
75 AGFIEGGWTG MVDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI
9 AGFIEGGWTG MVDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI
48 AGFIEGGWTG MVDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI
49 AGFIEGGWTG MVDGWYGYHH QNEQGSGYAA DQKSTQNAIN GITNKVNSVI
76 MGLIYNRM.G AVTTEVAFGL VCATCEQIAD SQHRSHRQMV TTTNPLIRHE
консенсусная последовательность aGfleggwtG mVdgwyg%hh qneqgsgyAa dQkstqnain giTNkvnsvi
401 450
75 EKMNTQFTAV GKEFNKLERR MENLNKKVDD GFLDIWTYNA ELLVLLENER
9 EKMNTQFTAV GKEFNKLERR MENLNKKVDD GFLDIWTYNA ELLVLLENER
48 EKMNTQFTAV GKEFNKLERR MENLNKKVDD GFIDIWTYNA ELLVLLENER
49 EKMNTQFTAV GKEFNKLERR MENLNKKVDD GFIDIWTYNA ELLVLLENER
76 NRMVLASTTA .KAMEQMAGS SEQAAEAMEV A........S QARQMVQAMR
консенсусная последовательность #kMntqfTav gKef#k$err mE#lnkkv#d gfxdiwtyna #llv$l#neR
451 500
75 TLDFHDSNVK NLYEKVKSQL KNNAKEIGNG CFEFYHKCNN ECMESVKNGT
9 TLDFHDSNVK NLYEKVKSQL KNNAKEIGNG CFEFYHKCNN ECMESVKNGT
48 TLDFHDSNVK NLYEKVKSQL KNNAKEIGNG CFEFYHKCND ECMESVKNGT
49 TLDFHDSNVK NLYEKVKSQL KNNAKEIGNG CFEFYHKCND ECMESVKNGT
76 TIGTHPSSSA GLKNDLLENL QAYQKRMGVQ MQRFK.....
консенсусная последовательность TldfHdSnvk nLy#kvks#L knnaKeiGng cfeFyhkcnx eernesvkngt
501 550
75 YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS LVLLVSLGAI
9 YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS LVLLVSLGAI
48 YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS LVLLVSLGAI
49 YDYPKYSEES KLNREKIDGV KLESMGVYQI LAIYSTVASS LVLLVSLGAI
76
консенсусная последовательность ydypkysees klnrekidgv klesmgvyqi laiystvass Ivllvslgai
551 566
75 SFWMCSNGSL QCRICI
9 SFWMCSNGSL QCRICI
48 SFWMCSNGSL QCRICI
49 SFWMCSNGSL QCRICI
76
консенсусная последовательность sfwmcsngsl qcrici
Консенсусная последовательность указывает буквами в верхнем регистре аминокислоты, общие для всех последовательностей в данном положении; буквы в нижнем регистре указывают аминокислоты, общие по крайней мере для половины или большинства последовательностей; символ ! - любая одна из I или V; символ $ - любая одна из L или M; символ % - любая одна из F или Y; символ # - любая одна из N, D, Q, E, B или Z; символ - отсутствие аминокислоты (например, делеция); X в положении 3 - любая одна из A или V; X в положении 52 - любая одна из E или N; X в положении 90 - K или R; X в положении 99 - T или K; X в положении 111 - любая одна из Y или H; X в положении 145 - любая одна из V или T; X в положении 157 - K или E; X в положении 162 - R или K; X в положении 182 - V или A; X в положении 203 - N или D; X в положении 205 - R или K; X в положении 210 - T или K; X в положении 225 - K или Y; X в положении 333 - H или деления; X в положении 433 - I или L; X в положении 49) - N или D.
В качестве другого примера таких различий в табл. 4 показаны выравнивание последовательностей и консенсусная последовательность HA А/Аньхой/1/2005 (H5N1) (SEQ ID NO: 55), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) и А/Индонезия/5/2006 (H5N1) (SEQ ID NO: 10).
- 28 034733
Таблица 4 Выравнивание последовательностей и консенсусная последовательность HA отдельных штаммов H1N1
SEQ ID NO. Последовательность консенсусная последовательность
MEKIVLLLAI MEKIVLLFAI MEKIVLLLAI MEKIVLLLAI
VSLVKSDQIC VSLVKSDQIC VSLVKSDQIC VSLVKSDQIC
IGYHANNSTE IGYHANNSTE IGYHANNSTE IGYHANNSTE
QVDTIMEKNV QVDTIMEKNV QVDTIMEKNV QVDTIMEKNV
TVTHAQDILE TVTHAQDILE TVTHAQDILE TVTHAQDILE консенсусная последовательность
KTHNGKLCDL KTHNGKLCDL KTHNGKLCDL KTHNGKLCDL
DGVKPLILRD DGVKPLILRD DGVKPLILRD DGVKPLILRD
CSVAGWLLGN CSVAGWLLGN CSVAGWLLGN CSVAGWLLGN
PMCDEFINVP PMCDEFINVP PMCDEFINVP PMCDEFINVP
100
EWSYIVEKAN EWSYIVEKAN EWSYIVEKAN EWSYIVEKAN консенсусная последовательность
101
PTNDLCYPGS PVNDLCYPGD PANDLCYPGN PxNDLCYPGx
FNDYEELKHL FNDYEELKHL FNDYEELKHL FNDYEELKHL
LSRINHFEKI LSRINHFEKI LSRINHFEKI LSRINHFEKI
QIIPKSSWSD QIIPKSSWSS QIIPKSSWSD QIIPKSSWSd
150
HEASSGVSSA HEASLGVSSA HEASSGVSSA HEASsGVSSA консенсусная последовательность
151
CPYLGSPSFF CPYQGKSSFF CPYQGTPSFF CPYqGxpSFF
RNWWLIKKN RNWWLIKKN RNWWLIKKN RNWWLIKKN
STYPTIKRSY STYPTIKRSY NTYPTIKRSY sTYPTIKrSY
NNTNQEDLLV NNTNQEDLLV NNTNQEDLLI NNTNQEDLL!
200
LWGIHHPNDA LWGIHHPNDA LWGIHHSNDA LWGIHHpNDA консенсусная последовательность
201
AEQTRLYQNP AEQTKLYQNP AEQTKLYQNP AEQTkLYQNP
TTYISIGTST TTYISVGTST TTYISVGTST TTYIS!GTST
LNQRLVPKIA LNQRLVPRIA LNQRLVPKIA LNQRLVPkIA
TRSKVNGQSG TRSKVNGQSG TRSKVNGQSG TRSKVNGQSG
250
RMEFFWTILK RMEFFWTILK RMDFFWTILK RMtFFWTILK консенсусная последовательность
251
PNDAINFESN PNDAINFESN PNDAINFESN PNDAINFESN
GNFIAPEYAY GNFIAPEYAY GNFIAPEYAY GNFIAPEYAY
KIVKKGDSAI KIVKKGDSTI KIVKKGDSAI KIVKKGDSal
MKSELEYGNC MKSELEYGNC VKSEVEYGNC mKSElEYGNC
300
NTKCQTPMGA NTKCQTPMGA NTKCQTPIGA NTKCQTPmGA консенсусная последовательность консенсусная последовательность консенсусная последовательность консенсусная последовательность консенсусная последовательность
301
INSSMPFHNI INSSMPFHNI INSSMPFHNI
351
AIAGFIEGGW AIAGFIEGGW AIAGFIEGGW AIAGFIEGGW
401
IIDKMNTQFE IIDKMNTQFE IIDKMNTQFE IIDKMNTQFE
451
ERTLDFHDSN ERTLDFHDSN ERTLDFHDSN ERTLDFHDSN
501
GTYNYPQYSE GTYDYPQYSE GTYDYPQYSE GTYlYPQYSE
551
GLSLWMCSNG GLSLWMCSNG GLSLWMCSNG GLSLWMCSNG
HPLTIGECPK HPLTIGECPK HPLTIGECPK
YVKSNRLVLA YVKSNRLVLA YVKSNRLVLA
TGLRNSPQRE TGLRNSPQRE TGLRNSPLRE
QGMVDGWYGY QGMVDGWYGY QGMVDGWYGY QGMVDGWYGY
AVGREFNNLE AVGREFNNLE AVGREFNNLE AVGREFNNLE
VKNLYDKVRL VKNLYDKVRL VKNLYDKVRL VKNLYDKVRL
EARLKREEIS EARLKREEIS EARLKREEIS EARLKREEIS
568 SLQCRICI SLQCRICI SLQCRICI SLQCRICI
HHSNEQGSGY HHSNEQGSGY HHSNEQGSGY HHSNEQGSGY
RRIENLNKKM RRIENLNKKM RRIENLNKKM RRIENLNKKM
QLRDNAKELG QLRDNAKELG QLRDNAKELG QLRDNAKELG
GVKLESIGTY GVKLESIGIY GVKLESIGTY GVKLESIGtY
AADKESTQKA AADKESTQKA AADKESTQKA AADKESTQKA
EDGFLDVWTY EDGFLDVWTY EDGFLDVWTY EDGFLDVWTY
NGCFEFYHKC NGCFEFYHKC NGCFEFYHKC NGCFEFYHKC
QILSIYSTVA QILSIYSTVA QILSIYSTVA QILSIYSTVA
350
SRRKKRGLFG RRRKKRGLFG RRRK.RGLFG
400 IDGVTNKVNS IDGVTNKVNS IDGVTNKVNS IDGVTNKVNS
450
NAELLVLMEN NAELLVLMEN NAELLVLMEN NAELLVLMEN
500
DNECMESIRN DNECMESVRN DNECMESVRN DNECMES!RN
550
SSLALAIMMA SSLALAIMVA SSLALAIMVA SSLALAIMvA
Консенсусная последовательность указывает буквами в верхнем регистре аминокислоты, общие для всех последовательностей в данном положении; буквы в нижнем регистре указывают аминокислоты, общие по крайней мере для половины или большинства последовательностей; символ ! - любая одна из I или V; символ $ - любая одна из L или M; символ % - любая одна из F или Y; символ # - любая одна из N,
- 29 034733
D, Q, E, B или Z; X в положении 102 - любая одна из T, V или A; X в положении 110 - любая одна из S, D или N; X в положении 156 - любая из S, K или T.
Проиллюстрированные и описанные выше выравнивания и консенсусные последовательности являются не налагающими ограничений примерами вариантов аминокислотных последовательностей HA, которые можно использовать в различных вариантах настоящего изобретения для производства ВЧ в растении.
Нуклеиновую кислоту, кодирующую аминокислотную последовательность, можно легко определить, так как кодоны для каждой аминокислоты известны в данной области техники. Таким образом, описание аминокислотной последовательности несет идею вырожденности последовательностей нуклеиновых кислот, которые ее кодируют. Таким образом, настоящее изобретение предлагает последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей гемагглютинин штаммов и подтипов вируса гриппа, описанных в данном документе (например, А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) А/Индонезия/5/2006 (H5N1), А/куры/Нью-Йорк/1995, А/серебристые чайки/Делавэр/677/88 (H2N8), А/Техас/32/2003, А/кряквы/Миннесота/33/00, А/утки/Шанхай/1/2000, А/шилохвосты/Техас/828189/02, А/Индейки/Онтарио/6118/68(H8N4), А/утки-широконоски/Иран/654/03, А/куры/Германия/№1949 (H10N7), А/утки/Англия/56 (Н1Ш6), А/утки/Альберта/60/76 (H12K5), А/чайки/Мэриленд/704/77 (H13K6), А/кряквы/Гурьев/263/82, А/утки/Австралия/341/83 (H15N8), А/чайки обыкновенные/Швеция/5/99 (H16N3), В/Ли/40, С/Йоханнесбург/66, А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1), А/Брисбан/59/2007 (H1N1), А/Соломоновы острова 3/2006 (H1N1), А/Брисбан 10/2007 (H3N2), А/Висконсин/67/2005 (H3N2), В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006, А/Сингапур/1/57 (H2N2), А/Аньхой/1/2005 (H5N1), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), А/дикие утки/ГонконгЖ312/97 (H6N1), А/лошади/Прага/56 (H7N7), А/Гонконг/1073/99 (H9N2)), а также вырожденные последовательности, которые кодируют вышеуказанные гемагглютинина.
Кроме того, аминокислотную последовательность, кодируемую нуклеиновой кислотой, можно легко определить, так как кодон или кодоны для каждой аминокислоты известны. Таким образом, описание нуклеиновой кислоты отражает аминокислотную последовательность, которую она кодирует. Таким образом, настоящее изобретение предлагает аминокислотные последовательности гемагглютинина штаммов и подтипов вируса гриппа, описанные в данном документе (например, А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) А/Индонезия/5/2006 (H5N1), А/куры/Нью-Йорк/1995, А/серебристые чайки/Делавэр/677/88 (H2N8), А/Техас/32/2003, А/кряквы/Миннесота/33/00, А/утки/Шанхай/1/2000, А/шилохвосты/Техас/828189/02, А/Индейки/Онтарио/6118/68 (H8N4), А/утки-широконоски/Иран/О54/03, А/куры/Германия/№1949(Ш0Ю), А/утки/Англия756 (Н1Ш6), А/утки/Альберта/60/76 (H12K5), А/чайки/Мэриленд/704/77(Ш3^), А/кряквы/Гурьев/263/82, А/утки/Австралия/341/83 (H15N8), А/чайки обыкновенные/Швеция/5/99(Ш6№), В/Ли/40, С/Йоханнесбург/66, А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1),
А/Брисбан/59/2007 (H1N1), А/Соломоновы острова 3/2006 (H1N1), А/Брисбан 10/2007 (H3N2), А/Висконсин/67/2005 (H3N2), В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006, А/Сингапур/1/57 (H2N2), А/Аньхой/1/2005 (H5N1), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), А/дикие утки/ГонконгЖ312/97 (H6N1), А/лошади/Прага/56 (H7N7), А/Гонконг/1073/99 (H9N2)).
В растениях ВЧ вируса гриппа отпочковываются от плазматической мембраны (см. пример 5 и фиг. 19), поэтому липидный состав ВЧ отражает их происхождение. ВЧ, производящиеся согласно настоящему изобретению, включают HA одного или нескольких типов или подтипов вируса гриппа, образующие комплексы с липидами растительного происхождения. Растительные липиды могут стимулировать специфические иммунные клетки и усиливать вызванный иммунный ответ. Растительные липиды состоят из липидов, фосфатидилхолина (ФХ) и фосфатидилэтаноламина (ФЭ), а также содержат гликосфинголипиды, сапонины и фитостеролы. Кроме того, в плазматических мембранах растений также обнаружены липидные рафты - эти микродомены обогащены сфинголипидами и стеролами. У растений известны различные фитостеролы, включая стигмастерол, ситостерол, 24-метилхолестерин и холестерин (Mongrand et al., 2004).
ФХ и ФЭ так же, как гликосфинголипиды, могут связываться с молекулами CD1, экспрессируемыми иммунными клетками млекопитающих, такими как антигенпредставляющие клетки (АПК), подобные дендритным клеткам или макрофагам, и другие клетки, включая B- и T-лимфоциты в тимусе и печени (Tsuji M., 2006). Молекулы CD1 структурно схожи с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГС) класса I, и их роль заключается в представлении гликолипидных антигенов NKT-клеткам (естественным киллерным T-клеткам). После активации NKT-клетки активируют клетки неспецифической иммунной системы, такие как NK-клетки и дендритные клетки, а также клетки адаптивной иммунной системы, такие как B-клетки, вырабатывающие антитела, и T-клетки.
В плазматической мембране можно обнаружить различные фитостеролы - специфический комплемент может различаться в зависимости от вида, условий роста, источников питания или состояния патогенного микроорганизма среди прочих факторов. Как правило, бета-ситостерол - встречающийся в наибольших количествах фитостерол.
Фитостеролы, содержащиеся в ВЧ вируса гриппа в виде комплекса с двойным липидным слоем, таким как оболочка - производное плазматической мембраны, могут обеспечивать преимущества вакцин- 30 034733 ной композиции. Без ограничений существующей теорией считается, что ВЧ, формирующиеся в растениях и образующие комплекс с двойным липидным слоем, таким как оболочка - производное плазматической мембраны, могут вызывать более выраженный иммунный ответ, чем ВЧ, полученные в других системах экспрессии, и могут вызывать иммунный ответ, схожий с таковым после иммунизации живой или аттенуированной вакциной из целого вируса.
Таким образом, в нескольких вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает ВЧ, образующие комплексы с двойным липидным слоем растительного происхождения. В некоторых вариантах двойной липидный слой растительного происхождения может содержать оболочку ВЧ.
ВЧ, продуцируемые в растении, могут включать HA, содержащий специфичные для растения N-гликаны. Таким образом, настоящее изобретение также относится к ВЧ, содержащей HA, включающий N-гликаны, специфичные для растения.
Кроме того, известны модификации N-гликана в растениях (см., например, патент США 60/944344; который включен в данный документ путем ссылки), и можно получить HA, содержащий модифицированные N-гликаны. Можно получить HA, характеризующийся модифицированным типом гликозилирования, например, со сниженным содержанием фукозилированных, ксилозилированных или тех или других N-гликанов, или HA, характеризующийся модифицированным типом гликозилирования, где в белке отсутствует фукозилирование, ксилозилирование или то или другое повышенное галактозилирование. Кроме того, воздействие на посттрансляционные модификации, например добавление концевой галактозы, может вести к снижению фукозилирования и ксилозилирования экспрессированного HA при сравнении с растением дикого типа, экспрессирующим HA.
Например, без наложения ограничений, синтез HA, имеющего измененный тип гликозилирования, можно осуществить путем коэкспрессии нужного белка вместе с нуклеотидной последовательностью, кодирующей бета-1,4-галактозихтрансферазу (GaIT), например, но не ограничиваясь этим, GaIT млекопитающих, или GaIT человека, хотя можно использовать и GaIT из другого источника. Каталитический домен GaIT также можно слить с доменом CTS (т.е. цитоплазматическим хвостом, трансмембранным доменом, стеблевым участком) N-ацетилглюкозаминилтрансферазы (GNT1) с получением гибридного фермента GNT1-GaIT, и этот гибридный фермент можно коэкспрессировать с HA. Также HA можно коэкспрессировать вместе с нуклеотидной последовательностью, кодирующей N-ацетилглюкозаминилтрансферазу IH (GnT-III), например, но не ограничиваясь этим, GnT-III млекопитающих или GnT-III человека, также можно использовать GnT-III из других источников. Кроме того, можно использовать гибридный фермент GNT1-GnT-III, содержащий CTS GNT1, слитый с GnT-III.
Таким образом, настоящее изобретении также включает ВЧ, содержащие HA, в котором имеются модифицированные N-гликаны.
Без намерения привязки к существующей теории считается, что присутствие растительных N-гликанов на HA может стимулировать иммунный ответ, способствуя связыванию HA антигенпредставляющими клетками. Стимуляция иммунного ответа с использованием растительного N-гликана предложена Saint-Jore-Dupas et al. (2007). Кроме того, конформация ВЧ может оказаться преимущественной для представления антигена и усиливать адъювантный эффект ВЧ при объединении в комплекс с липидным слоем растительного происхождения.
Термины регуляторный участок, регуляторный элемент или промотор обычно, но не всегда, означают часть молекулы нуклеиновой кислоты, которая расположена перед участком гена, кодирующего белок, и которая может содержать ДНК или РНК или одновременно ДНК и РНК. Когда регуляторный участок активен и функционально связан с нужным геном, это может приводить к экспрессии этого нужного гена. Регуляторный элемент может быть способен к опосредованной роли в специфичности органа или регуляции развития или временной активации гена. Регуляторный участок включает элементы промотора, при этом основные элементы промотора обладают базальной промоторной активностью, элементы, которые индуцируются в ответ на внешний стимул, элементы, которые опосредуют промоторную активность, такую как негативные регуляторные элементы или энхансеры транскрипции. Регуляторный участок согласно употреблению в данном документе также включает элементы, которые активны после транскрипции, например регуляторные элементы, которые модулируют экспрессию генов, такие как энхансеры трансляции и транскрипции, репрессоры трансляции и транскрипции, активирующие последовательности в 3'-5'-направлении и детерминанты нестабильности мРНК. Несколько из этих последних элементов могут локализоваться проксимально от кодирующего участка.
В рамках данного описания термин регуляторный элемент или регуляторный участок, как правило, относится к последовательности ДНК, обычно, но не всегда, расположенной перед (5') кодирующей последовательностью структурного гена, которая регулирует экспрессию кодирующей области за счет распознавания РНК-полимеразы и/или других факторов, необходимых для начала транскрипции на определенном участке. Однако следует учитывать, что другие последовательности нуклеотидов, расположенные в интронах или в направлении 3' от данного участка, могут также участвовать в регулировании экспрессии целевой кодирующей области. Примером регуляторного элемента, осуществляющего распознавание РНК-полимеразы или других факторов транскрипции, что обеспечивает ее начало на конкретном участке, является элемент промотора. Многие, но не все регуляторные элементы эукариотов содер- 31 034733 жат TATA-бокс - консервативную последовательность нуклеиновой кислоты, состоящую из пар азотистых оснований аденозин и тимидин, обычно расположенных приблизительно за 25 пар оснований до сайта начала транскрипции. Элемент промотора представляет собой основной элемент промотора, ответственный за инициирование транскрипции, а также другие регуляторные элементы (перечисленные выше), модифицирующие экспрессию генов.
Существует несколько типов регуляторных участков, в том числе активные в ходе развития, индуцируемые или конститутивные. Регуляторный участок, активный в ходе развития или управляющий дифференциальной экспрессией гена, активируется в определенных органах или тканях органа в определенные моменты времени в процессе развития данного органа или ткани. Тем не менее, некоторые регуляторные участки, которые активны в ходе развития, могут быть лишь предпочтительно активны в определенных органах или тканях на определенных стадиях развития, при этом проявляя активность либо в ходе развития, либо на базовом уровне в других органах или тканях растения. Примерами тканеспецифических регуляторных участков, например see-специфических регуляторных участков, являются промотор напина и промотор круциферина (Rask et al., 1998, J. Plant. Physiol. 152:595-599; Bilodeau et al., 1994, Plant Cell, 14:125-130). Примером промотора, специфического для листьев, является промотор пластоцианина (фиг. 1b или SEQ ID NO: 23), (US 7125978, включен в данный документ посредством ссылки).
Индуцируемым является регуляторный участок, который способен прямо или косвенно активировать транскрипцию одной или более последовательности ДНК или гена под действием индуктора. В отсутствие индуктора транскрипция последовательности ДНК или гена не происходит. Как правило, белковый фактор, который специфически связывается с индуцируемым регуляторным участком для активации транскрипции, может присутствовать в неактивной форме, которая затем прямо или косвенно превращается в активную под воздействием индуктора. Однако белковый фактор может и отсутствовать. В качестве индуктора может служить химический агент, такой как белок, метаболит, регулятор роста, гербицид или производное фенола, а также физиологический стресс, оказываемый прямо при воздействии тепла, холода, соли или токсичных элементов или косвенно при воздействии патогенного микроорганизма или болезнетворного агента, например, вируса. Воздействие индуктора на клетку растения, содержащую индуцируемый регуляторный участок, осуществляется при внешнем воздействии на растение или клетку, например обрызгивание, полив, нагревание и т.п. Индуцируемые регуляторные элементы могут быть получены из растительных или нерастительных генов (например, Gatz, C. and Lenk, I.R.P., 1998, Trends Plant Sci. 3, 352-358; включен посредством ссылки). Примеры возможных индуцируемых промоторов (без ограничения) - индуцируемый тетрациклином промотор (Gatz, C., 1997, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48, 89-108; включен посредством ссылки), индуцируемый стероидами промотор (Aoyama, T. and Chua, N.H., 1997, Plant J. 2, 397-404; включен посредством ссылки) и индуцируемый этанолом промотор (Salter, M.G., et al., 1998, Plant. Journal, 16, 127-132; Caddick, M.X., et al., 1998, Nature Biotech. 16, 177-180, включены посредством ссылки), гены IB6 и CKI1, индуцируемые цитокинином (Brandstatter, I. and Kieber, J.J., 1998, Plant Cell. 10, 1009-1019; Kakimoto, T., 1996, Science, 274, 982-985; включены посредством ссылки) и индуцируемый ауксином элемент DR5 (Ulmasov, T., et al., 1997, Plant Cell. 9,1963-1971; включен посредством ссылки).
Конститутивный регуляторный участок управляет экспрессией гена по всему растению и в течение всего периода развития. Примерами известных конститутивных регуляторных элементов являются промоторы, связанные с транскриптом CaMV 35S (Odell et al., 1985, Nature, 313:810-812), гены актина 1 риса (Zhang et al., 1991, Plant Cell, 3:1155-1165), актина 2 риса (An et al., 1996, Plant J., 10:107-121), тропомиозина 2 (U.S. 5428147, включен в данный документ посредством ссылки) и триозофосфатизомеразы 1 (Xu et. al., 1994, Plant Physiol. 106:459-467), ген убиквитина кукурузы 1 (Cornejo et al., 1993, Plant Mol. Biol. 29:637-646), гены убиквитина Arabidopsis 1 и 6 (Holtorf et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29:637-646) и ген фактора инициации трансляции табака 4A (Mandel et al., 1995, Plant Mol. Biol. 29:995-1004). В данном документе термин конститутивный не означает, что экспрессия гена под управлением конститутивного регуляторного участка непременно осуществляется на одном и том же уровне во всех типах клеток, но экспрессия осуществляется в широком интервале типов клеток, хотя часто на разных уровнях. Конститутивные регуляторные элементы могут быть связаны с другими последовательностями для дальнейшего усиления транскрипции и/или трансляции нуклеотидной последовательности, с которой они оперативно связаны. Например, система CPMV-HT (Sainsbury et al., 2008, Plant Physiology, 148:1212-1218) получается из нетранслируемых областей вируса мозаики коровьего гороха (CPMV) и характеризуется усиленной трансляцией связанной кодирующей последовательности.
Под словом нативный подразумевается, что аминокислотная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты существуют в природе или соответствуют дикому типу.
Термин оперативно связанный подразумевает, что определенные последовательности, например регуляторный элемент и целевая кодирующая область, прямо или косвенно взаимодействуют для осуществления заданной функции, такой как опосредование или модуляция экспрессии генов. Взаимодействие оперативно связанных последовательностей может, например, быть опосредовано белками, которые взаимодействуют с оперативно связанными последовательностями.
- 32 034733
Экспрессия одной или более одной последовательности нуклеотидов согласно настоящему изобретению может происходить в любом приемлемом растении-хозяине, трансформированном последовательностью нуклеотидов, конструкцией или вектором в соответствии с настоящим изобретением. К таким хозяевам относятся (без ограничения) сельскохозяйственные культуры, в том числе люцерна, рапс канола, Brassica spp., кукуруза, Nicotiana spp., люцерна, картофель, женьшень, горох, овес, рис, соя, пшеница, ячмень, подсолнечник, хлопчатник и т.п.
Одна или более химерная генетическая конструкция согласно настоящему изобретению может также содержать 3'-нетранслируемую область (3'HTO); 3'-нетранслируемая область - часть гена, включающая сегмент ДНК, который содержит сигнал полиаденилирования и другие регуляторные сигналы, способные влиять на процессинг мРНК или экспрессию генов. Сигнал полиаденилирования обычно способствует присоединению треков полиадениловой кислоты к 3'-концу прекурсора мРНК. Сигналы полиаденилирования распознаются по наличию гомологии с канонической формой 5'-AATAAA-3', хотя нередки вариации. Одна или несколько химерных генетических конструкций в соответствии с настоящим изобретением могут также содержать дополнительные энхансеры - энхансеры трансляции или транскрипции, по необходимости. Такие энхансерные участки хорошо известны специалистам в данной области, они могут содержать АТГ-кодон инициации и ближайшие последовательности. Кодон инициации должен находится в фазе с рамкой считывания кодирующей последовательности для осуществления трансляции всей последовательности.
Неограничивающими примерами подходящих 3'-областей являются нетранслируемые 3'-области транскрипции, содержащие сигнал полиаденилирования опухолеиндуцирующих (Ti) плазмидных генов Agrobacterium, например нопалинсинтазы (Nos-ген), и гены растений, такие как гены белков хранения сои и ген малой субъединицы рибулозо-1,5-бисфосфат-карбоксилазы (ssRUBISCO; патент США 4962028; включен в данный документ посредством ссылки), промотор, используемый при регулировании экспрессии пластоцианина (Pwee и Gray 1993; включен в данный документ посредством ссылки). Пример промотора пластоцианина описан в патенте США 7125978 (включен в данный документ посредством ссылки).
В настоящем документе промоторы, содержащие энхансерные последовательности с доказанной эффективностью при экспрессии в листьях, показали также свою эффективность и при временной (транзиентной) экспрессии. Не желая ограничиваться конкретной теорией, полагают, что присоединение предыдущих регуляторных элементов гена фотосинтеза к ядерной матрице может служить медиатором интенсивной экспрессии. Например, участок до -784 от сайта начала трансляции гена пластоцианина гороха может служить медиатором интенсивной экспрессии гена-репортера.
Для улучшения идентификации трансформированных клеток растения конструкции согласно настоящему изобретению можно далее модифицировать, включая селектируемые маркеры растений. К полезным селектируемым маркерам относятся ферменты, обеспечивающие устойчивость к химическим агентам, таким как антибиотики, например гентамицин, гигромицин, канамицин, или гербициды, например фосфинотрицин, глифосат, хлорсульфурон и т.п. Аналогичную роль могут играть ферменты, образующие соединение, которое обнаруживается по изменению цвета, например GUS (бета-глюкуронидаза), или по люминесценции, например люцифераза или GFP (зеленый фосфоресцирующий белок).
Еще одним компонентом настоящего изобретения являются трансгенные растения, клетки или семена растений, содержащие конструкцию химерного гена в соответствии с настоящим изобретением. Способы регенерации целого растения из его клеток также известны в данной области. В общем случае трансформированные клетки растения культивируют в соответствующей среде, возможно содержащей селективные агенты, такие как антибиотики, при этом селектируемые маркеры способствуют идентификации трансформированных растительных клеток. После образования каллюса формирование ростков стимулируют действием соответствующих растительных гормонов известными способами, затем ростки переносят в субстрат для регенерации растения. Далее растения могут служить для производства последующих генераций либо из семян, либо методами вегетативного размножения. Трансгенные растения также могут быть получены без использования культур тканей.
Еще одним компонентом настоящего изобретения являются трансгенные растения, деревья, дрожжи, бактерии, грибы, клетки насекомых и животных, содержащие конструкцию химерного гена, представляющую собой нуклеиновую кислоту, кодирующую рекомбинантные HA0 для получения ВЧ в соответствии с настоящим изобретением.
Регуляторные элементы настоящего изобретения можно комбинировать с целевой кодирующей областью для экспрессии в ряде организмов-хозяев, пригодных для трансформации или временной экспрессии. К таким организмам относятся, без ограничения, растения, как однодольные, так и двудольные, например, без ограничения, кукуруза, зерновые растения, пшеница, ячмень, овес, Nicotiana spp, Brassica spp, соя, бобы, горох, люцерна, картофель, томат, женьшень и Arabidopsis.
Способы стабильной трансформации и регенерации указанных организмов хорошо разработаны в данной области и известны специалистам. Способ получения трансформированного и регенерированного растения не является принципиальным в отношении настоящего изобретения.
- 33 034733
Под трансформацией понимается стабильный межвидовой перенос генетической информации (последовательности нуклеотидов), который проявляется в генотипе и/или в фенотипе. Межвидовой перенос генетической информации от химерной конструкции к хозяину может быть наследуемым, тогда перенос генетической информации считается стабильным, либо перенос может быть транзиентным (временным), тогда перенос генетической информации не наследуется.
Понятие растительное вещество означает любой материал, полученный из растения. Растительным веществом может быть растение полностью, ткань, клетки или любая их часть. Далее, растительное вещество может включать внутриклеточные компоненты растения, внеклеточные компоненты растения, жидкие или твердые экстракты растения либо их комбинацию. Далее, растительное вещество может представлять собой растение, клетки или ткани растения, жидкий экстракт (или их комбинацию) из листьев, стеблей, плодов, корней растения или их комбинацию. Растительное вещество может быть растением или его частью, которые не подвергались ни одной стадии переработки. Часть растения может играть роль растительного вещества. Однако возможно также, что растительное вещество прошло стадии минимальной переработки, которые раскрыты ниже, либо более жесткой переработки, к которой может относиться частичная или значительная очистка белка обычными методами, известными в данной области, к которым относятся (без ограничения) хроматография, электрофорез и т.п.
Понятие минимальная переработка относится к растительному веществу, например к растению или части растения, содержащему целевой белок, которое было частично очищено с получением экстракта, гомогената, фракции гомогената растения и т.п. (т.е. минимально переработано). Частичная очистка может представлять собой (без ограничения) нарушение клеточной структуры растения, приводящее к образованию композиции, содержащей растворимые компоненты растения, и нерастворимых компонентов растения, которые можно разделить, например (без ограничения), центрифугированием, фильтрованием или их сочетанием. При этом белки, секретированные в межклеточном пространстве листа или другой ткани, можно легко выделить вакуумной или центробежной экстракцией, либо провести экстракцию тканей под давлением, пропуская их через валки, измельчая и т.п., чтобы выжать или выделить белок из межклеточного пространства. Минимальная переработка может также подразумевать приготовление первичного экстракта растворимых белков, так как указанные препараты будут содержать пренебрежимо малое количество примесей из вторичных растительных продуктов. Далее, минимальная переработка может подразумевать экстракцию растворимого белка из листьев в водную фазу с последующим осаждением любой приемлемой солью. К другим методам относятся мацерация и жидкостная экстракция в крупных масштабах, что позволяет непосредственное использование экстракта.
Растительное вещество в виде растительного материала или ткани может быть пригодно для перорального применения у субъекта. Растительное вещество можно принимать в составе добавки к рациону - вместе с пищей или в капсулах. Можно провести концентрирование растительного вещества или ткани для улучшения или повышения его съедобности либо объединить с другими материалами, ингредиентами или фармацевтическими наполнителями, по необходимости.
Примерами субъектов или целевых организмов, куда предполагается введение ВЧ настоящего изобретения, являются, без ограничения, человек, приматы, птицы, водоплавающие птицы, перелётные птицы, перепелки, утки, гуси, домашние птицы, куры, свиньи, овцы, лошади, кони, верблюды, псовые, собаки, кошачьи, кошки, тигры, леопарды, циветты, норки, каменные куницы, хорьки, комнатные животные, домашний скот, кролики, мыши, крысы, морские свинки или другие грызуны, тюлени, киты и т.д. Такие целевые организмы приведены как примеры и не ограничивают область применения настоящего изобретения.
Предусматривается, что растение, содержащее целевой белок либо экспрессирующее ВЧ, содержащие целевой белок, можно вводить в организм субъекта или целевой организм разными способами, в зависимости от надобности и ситуации. Например, целевой белок, полученный из растения, можно экстрагировать перед использованием в неочищенном, частично очищенном или очищенном виде. Если предполагается очистка белка, то его получение может осуществляться в съедобном либо несъедобном растении. Далее, при пероральном введении белка растительная ткань может быть собрана для непосредственного употребления субъектом, либо собранную растительную ткань можно предварительно высушить и только затем употреблять, либо животные могут поедать растения на корню без предварительного сбора урожая. В рамках данного изобретения собранные ткани растений могут также применяться в составе пищевой добавки к корму животных. Если животные поедают растительную ткань после незначительной переработки или вообще без нее, то предпочтительно, чтобы данная растительная ткань была съедобной.
В ограничении экспрессии трансгенов в растениях может принимать участие посттранскрипционный сайленсинг генов (PTGS), а коэкспрессия супрессора сайленсинга из вируса картофеля Y (HcPro) может быть использована для противодействия специфической деградации трансгенных мРНК (Brigneti et al., 1998). Другие супрессоры сайленсинга хорошо известны в данной области и могут применяться, как описано в данном документе (Chiba et al., 2006, Virology 346:7-14; включен в данный документ посредством ссылки), например, это (без ограничения) - TEV-p1/HC-Pro (вирус гравировки табакаp1/Hc-Pro), BYV-p21, p19 вируса кустистой карликовости томата (TBSV p19), капсидный белок вируса
- 34 034733 скрученности томата (TCV -CP), 2b вируса огуречной мозаики (CMV-2b), p25 вируса картофеля X (PVX-p25), p11 вируса картофеля M (PVM-p11), p11 вируса картофеля S (PVS-p11), p16 вируса ожога черники (BScV-p16), р23 вируса тристецы цитрусовых (CTV-p23), p24 вируса скручивания листьев винограда-2 (GLRaV-2-p24), p10 вируса винограда A (GVA-p10), p14 вируса винограда B (GVB-p14), p10 латентного вируса борщевика (HLV-p10) или р16 обыкновенного латентного вируса чеснока (GCLV-p16). Таким образом, дополнительное увеличение образования белка в растении достигается при коэкспрессии супрессора сайленсинга, например (без ограничения), HcPro, TEV-p1/HC-Pro, BYV-p21, TBSV p19, TCVCP, CMV-2b, PVX-p25, PVM-p11, PVS-p11, BScV-p16, CTV-p23, GLRaV-2 p24, GBV-p14, HLV-p10, GCLV-p16 или GVA-p10, одновременно с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей целевой белок.
Далее, возможно получение ВЧ, представляющих собой комбинацию подтипов HA. Например, ВЧ могут содержать один или более одного HA подтипов H1, H2, H3, Н4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15, H16, тип B или их комбинацию. Выбор комбинации HA определяется предполагаемой областью применения вакцины на основе ВЧ. Например, вакцина, предназначенная для вакцинации птиц, может содержать любую комбинацию подтипов HA, в то время как ВЧ, предназначенные для вакцинации людей, могут содержать один или более одного из подтипов H1, H2, H3, H5, H6, H7, H9 или B. Тем не менее, возможно приготовление и других комбинаций подтипов HA, в зависимости от области применения ВЧ. Для получения ВЧ, содержащих комбинации подтипов HA, желаемые подтипы HA могут быть получены при коэкспрессии в одной и той же клетке, например в клетке растения.
Далее, ВЧ, полученные, как описано в настоящем документе, не содержат нейраминидазу (NA). Тем не менее, если требуются ВЧ, содержащие HA и NA, возможна коэкспрессия NA с HA.
В связи с этим в настоящем изобретении также предлагается соответствующий вектор, включающий химерную конструкцию, пригодную для использования в системах стабильной либо временной экспрессии. Генетическая информация может быть заключена в одной или нескольких конструкциях. Например, последовательность нуклеотидов, кодирующая целевой белок, может быть введена в виде одной конструкции, а вторая нуклеотидная последовательность, кодирующая белок, который модифицирует тип гликозилирования целевого белка, может быть введена как отдельная конструкция. Указанные нуклеотидные последовательности могут быть получены при коэкспрессии в растении. Можно использовать также конструкцию, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую как целевой белок, так и белок, который модифицирует тип гликозилирования целевого белка. В этом случае последовательность нуклеотидов будет содержать первый участок, соответствующий первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей целевой белок, оперативно связанный с промотором или регуляторным участком, и второй участок, соответствующий второй последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который модифицирует тип гликозилирования целевого белка, при этом второй участок оперативно связан с промотором или регуляторным участком.
Под коэкспрессией понимается экспрессия двух или нескольких последовательностей нуклеотидов, происходящая в растении примерно в одно и то же время, причем в одной и той же ткани растения. Однако экспрессия нуклеотидных последовательностей необязательно осуществляется строго одновременно. Более точно, экспрессия двух или нескольких нуклеотидных последовательностей должна осуществляться таким образом, чтобы кодированные продукты имели возможность взаимодействовать. Например, экспрессия белка, который модифицирует тип гликозилирования целевого белка, может проходить ранее, чем экспрессия целевого белка либо одновременно с ней, чтобы было возможно модифицирование типа гликозилирования целевого белка. Коэкспрессия двух или нескольких нуклеотидных последовательностей может иметь место в системе временной экспрессии, при этом две или несколько последовательностей вводят в растение приблизительно одновременно в условиях, при которых происходит экспрессия обеих последовательностей. Альтернативой является временная или стабильная трансформация растения-платформы, содержащего одну из нуклеотидных последовательностей, например участок, кодирующий белок, который модифицирует тип гликозилирования целевого белка, добавлением дополнительного участка, кодирующего целевой белок. В этом случае экспрессия участка, кодирующего белок, который модифицирует тип гликозилирования целевого белка, может осуществляться в желаемой ткани, на желаемой стадии развития либо указанную экспрессию можно вызвать с помощью индуцируемого промотора, при этом экспрессия дополнительного участка, кодирующего целевой белок, осуществляется в аналогичных условиях в той же ткани, что обеспечивает коэкспрессию указанных участков.
Конструкции в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в клетки растения с помощью Ti плазмид, Ri плазмид, вирусов-векторов растений, прямой трансформации ДНК, микроинъекции, электропорации, инфильтрации и т.д. Обзор таких методов можно найти, например, в работах Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, Academy Press, Нью-Йорк VIII, p. 421-463 (1988); Geierson and Corey, Plant Molecular Biology, 2nd ed. (1988); Miki and Iyer, Fundamentals of Gene Transfer in Plants. In Plant Metabolism, 2nd ed. D.T. Dennis, D.H. Turpin, D.D. Lefebrve, D.B. Layzell (Ed.), Addison-Wesley, Langmans Ltd. London, p. 561-579 (1997). К другим методам относятся прямая абсорбция ДНК, применение липосом, электропорация, например, с помощью протопластов, микроинъекций, мик
- 35 034733 роснарядов или вискеров, а также вакуумная инфильтрация. См., например, работы Bilang, et al. (Gene, 100:247-250 (1991), Scheid, et al. (Mol. Gen. Genet. 228:104-112, 1991), Guerche, et al. (Plant Science, 52:111-116, 1987), Neuhause, et al. (Theor. Appl Genet. 75:30-36, 1987), Klein, et al., Nature, 327:70-73 (1987); Howell, et al. (Science, 208:1265, 1980), Horsch, et al. (Science, 227:1229-1231, 1985), DeBlock, et al., Plant Physiology, 91:694-701, 1989), Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, ред., Academic Press Inc., 1988), Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, ред., Academic Press Inc., 1989), Liu and Lomonossoff (J. Virol Meth, 105:343-348, 2002), патенты США № 4945050; 5036006; 5100792; 6403865; 5625136 (все документы включены в данный документ посредством ссылки)/
Для экспрессии конструкций в соответствии с настоящим изобретением пригодны методы временной экспрессии (см. Liu and Lomonossoff, 2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348; включен в данный документ посредством ссылки). Кроме того, применим метод временной экспрессии на основе вакуума, описанный в работе Kapila et al. 1997 (включен посредством ссылки). Указанные методы могут включать, например (без ограничения), методы агроинокуляции или агроинфильтрации; применимы также и другие транзиентные методы, как указано выше. Согласно способам агроинокуляции или агроинфильтрации смесь агробактерий (Agrobacteria), содержащих заданную нуклеиновую кислоту, вводится в межклеточное пространство ткани, например в листья, надземную часть растения (стебель, листья, цветок), другую часть растения (стебель, корень, цветок) или все растение. После перехода через эпидермис агробактерий инфицируют копии т-ДНК и переносят их в клетки. Эписомная транскрипция т-ДНК и трансляция м-РНК приводят к продукции целевого белка в инфицированных клетках, тем не менее, проникновение т-ДНК внутрь ядра является временным.
Если целевая нуклеотидная последовательность кодирует продукт, который прямо или косвенно токсичен для растения, то при использовании способа настоящего изобретения такая токсичность может быть снижена проведением селективной экспрессии целевой нуклеотидной последовательности в выбранной ткани или на выбранной стадии развития растения. Кроме того, ограниченное время экспрессии, связанное с ее временным характером, может снизить ее влияние при образовании токсичного продукта в растении. Для селективного управления экспрессией целевой последовательности можно использовать индуцируемый промотор, тканеспецифический промотор или клеточно-специфический промотор.
Рекомбинантные ВЧ HA согласно настоящему изобретению можно применять в сочетании с существующими вакцинами против гриппа для дополнения вакцин, придания им более высокой эффективности, а также для снижения необходимой дозы. Специалисту в данной области известно, что вакцина может быть направлена против одного или более одного вируса гриппа. Примеры пригодных вакцин включают, без ограничения, имеющиеся на рынке вакцины компаний Sanofi-Pasteur, ID Biomedical, Merial, Sinovac, Chiron, Roche, Medlmmune, GlaxoSmithKline, Novartis, Sanofi-Aventis, Serono, Shire Pharmaceuticals и т.п.
При желании, ВЧ в соответствии с настоящим изобретением можно смешивать с приемлемым адъювантом, известным специалисту в данной области. Кроме того, ВЧ могут применяться в составе композиции вакцины, содержащей эффективную дозу ВЧ для воздействия на целевой организм, в соответствии с данным выше определением. Далее ВЧ, полученные в соответствии с настоящим изобретением, можно комбинировать с ВЧ, полученными с использованием различных белков вируса гриппа, например нейраминидазы (NA).
Таким образом, в настоящем изобретении предложен способ формирования иммунитета к инфицированию вирусом гриппа у животного или целевого организма, заключающийся во введении эффективной дозы вакцины, содержащей один или более одного ВЧ. Вакцину можно вводить перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
Введение ВЧ, полученных в соответствии с настоящим изобретением, описано в примере 6. Введение ВЧ H5, полученного в растении, приводило к заметно более сильному ответу по сравнению с введением растворимого HA (см. фиг. 21A и 21B).
Как показано на фиг. 26A и 26B, при введении ВЧ H5 штамма А/Индонезия/5/05 субъект получает перекрестный иммунитет против гриппа А/Турция/582/06 (H5N1; Турция H5N1). Введение ВЧ H5 штамма Индонезия перед контрольным заражением не привело к потере массы тела. Субъекты, не получившие ВЧ H5, но подвергшиеся контрольному заражению штаммом Турция H5N1, показали значительную потерю массы тела, и некоторые из них погибли.
Таким образом, приведенные данные показывают, что полученные в растении ВЧ вируса гриппа, содержащие вирусный белок гемагглютинин H5, вызывают иммунный ответ, специфичный для патогенных штаммов гриппа, и что вирусоподобные частицы могут почковаться из плазматической мембраны растения.
Так, в настоящем изобретении предлагается композиция, содержащая эффективную дозу ВЧ, включающих белок HA вируса гриппа, один или более одного растительный липид и фармацевтически приемлемый носитель. Белок HA вируса гриппа может представлять собой H5 штамма Индонезия/5/2006, А/Брисбен /50/2007, А/Соломоновы острова 3/2006, А/Брисбен/10/2007, А/Висконсин/67/2005, В/Малайзия/2506/2005, В/Флорида/4/2006, А/Сингапур/1/57, А/Аньхой/1/2005, А/Вьетнам/1194/2004, А/дикие утки/Гонконг/\У312/97. А/лошади/Прага/56 или А/Гонконг/1073/99. Предлагается также способ
- 36 034733 формирования иммунитета против вируса гриппа у субъекта. Способ заключается во введении вирусоподобных частиц, включающих белок HA вируса гриппа, один или более одного растительный липид и фармацевтически приемлемый носитель. Введение вирусоподобных частиц осуществляется перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
Композиции согласно различным осуществлениям настоящего изобретения могут содержать ВЧ двух или более штаммов или подтипов вируса гриппа. Два или более означает два, три, четыре, пять, шесть, семь, восемь, девять, десять или более штаммов или подтипов. Штаммы или подтипы могут относиться к одному подтипу (например, все H1N1 или все H5N1) или представлять собой комбинацию подтипов. Примерами подтипов и штаммов являются, без ограничения, перечисленные здесь (например, А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) А/Индонезия/5/2006 (H5N1), А/куры /Нью-Йорк/1995, А/серебристые чайки/Делавэр/677/88 (H2N8), А/Техас/32/2003, А/кряквы /Миннесота /33/00, А/утки/Шанхай/1/2000, 30, А/шилохвости/Техас/828189/02, А/индейки/Онтарио/6118/68(H8N4), А/утки-широконоски/Иран/054/03, А/куры/Германия/Ы/1949(Ш0Ю), А/утки/Англия/56(Н1Ш6), А/утки/Альберта/60/76(Ш2№),
А/чайки/Мэриленд/704/77(Ш3^), А/кряквы/Гурьев/263/82, А/утки/Австралия/341/83 (H15N8), А/чайки обыкновенные/Швеция/5/99(Ш6№), В/Ли/40, C/Йоханнесбург/66, А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1),
А/Брисбен/59/2007 (H1N1), А/Соломоновы острова 3/2006 (H1N1), А/Брисбен 10/2007 (H3N2), А/Висконсин/67/2005 (H3N2), В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006, А/Сингапур/1/57 (H2N2), А/Аньхой/1/2005 (H5N1), А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1), А/дикие утки/ГонконгЖ312/97 (H6N1), А/лошади/Прага/56 (H7N7), А/Гонконг/1073/99 (H9N2)).
Выбор сочетания штаммов и подтипов зависит от географической области, в которой субъекты могут войти в контакт с вирусом гриппа, наличия животных определенных видов вблизи места проживания людей подлежащих иммунизации (например, водоплавающие птицы, сельскохозяйственные животные, такие как свиньи и т.п.), а также штаммов, которые несут эти животные, воздействию которых они подвергаются или могут подвергнуться, прогнозов антигенной изменчивости по подтипам или штаммам, либо сочетания указанных факторов. Примеры сочетаний, применявшихся в последние годы, имеются в доступе (см. URL: who.int/csr/dieease/influenza/vaccine recommendations1/en). При разработке состава вакцины можно использовать некоторые или все эти штаммы в приведенных сочетаниях или в других сочетаниях.
Более конкретно, примеры сочетаний включают ВЧ из двух или более штаммов или подтипов, выбранных из группы, в которую входят А/Брисбен/59/2007 (H1N1), А/Брисбен/59/2007 (ШШ)-подобный вирус, А/Брисбен/10/2007 (H3N2), А/Брисбен/10/2007 (П3№)-подобный вирус, В/Флорида/4/2006 или В/Флорида/4/2006-подобный вирус.
Другое сочетание, взятое в качестве примера, может включать ВЧ из двух или более штаммов или подтипов, выбранных из группы, содержащей штаммы А/Индонезия/5/2005, А/Индонезия/5/2005подобный вирус, А/Вьетнам/1194/2004, А/Вьетнам/1194/2004-подобный вирус, А/Аньхой/1/05, А/Аньхой/1/05-подобный вирус, А/гуси/Гуйян/337/2006, А/гуси/Гуйян/337/2006-подобный вирус, А/куры/Шаньси/2/2006 или А/куры/Шаньси/2/2006-подобный вирус.
Другое сочетание, взятое в качестве примера, может включать ВЧ штаммов гриппа А/куры/Италия/13474/99 (тип H7) или А/куры/Британская Колумбия/04 (H7N3).
Еще один пример может включать ВЧ штаммов А/куры/Гонконг/О9/97 или А/Гонконг/1073/99. Другой пример - ВЧ штаммов А/Соломоновы острова/3/2006. Еще один пример сочетания - ВЧ штаммов А/Брисбен/10/2007. Еще один вариант сочетания может включать ВЧ штаммов А/Висконсин/67/2005. Еще один пример может состоять из ВЧ штаммов или подтипов В/Малайзия/2506/2004, В/Флорида/4/2006 или В/Брисбен/3/2007.
Получение двух или более ВЧ можно осуществлять путем раздельной экспрессии с последующим объединением очищенных или частично очищенных ВЧ. В качестве альтернативы возможна коэкспрессия ВЧ в одном и том же хозяине, например в растении. ВЧ можно комбинировать или получать в заданном отношении, например примерно в эквивалентных количествах, также их можно комбинировать таким образом, что один подтип или штамм будет составлять превалирующие ВЧ в композиции.
Таким образом, изобретение предлагает композиции, содержащие ВЧ двух или более штаммов или подтипов.
Обычно ВЧ оболочечных вирусов получают свою оболочку из мембраны, через которую они почкуются. Плазматические мембраны растений содержат фитостериновый комплемент, который может оказывать иммуностимулирующее действие. Для исследования указанной возможности полученные в растениях ВЧ H5 вводили животным в присутствии или в отсутствие адъюванта и определяли HAI (гуморальный ответ по ингибированию гемагглютинации) (фиг. 22A, 22B). В отсутствие добавки адъюванта полученные в растениях ВЧ H5 показали высокую величину HAI, что указывает на системный иммунный ответ на введение антигена. Более того, профили изотипов антител для ВЧ, введенных в присутствии или в отсутствие адъюванта, аналогичны (фиг. 23A).
В табл. 5 приведены последовательности, предлагаемые согласно различным осуществлениям настоящего изобретения.
- 37 034733
Таблица 5
Описание последовательностей для идентификатора последовательностей
SEQ ID No Описание последовательности Раскрыто
1 N-терминальный фрагмент Н1 Фигура 4 а
2 С-терминальный фрагмент Н1 Фигура 4Ь
3 Последовательность, кодирующая Н5 Фигура 6
4 праймер Plato-443c Фигура 7а
5 праймер SpHA(Ind)-Plasto.r Фигура 7Ь
6 праймер Plasto-SpHA(Ind).c Фигура 7 с
7 праймер HA(Ind)-Sac.r Фигура 7d
8 Последовательность кассеты на основе пластоцианина люцерны для экспрессии Н1 Фигура 1
9 Последовательность пептида НА1 (А/Новая Каледония/20/99) Фигура 8а
10 Последовательность пептида НА5 (А/Индонезия/5/2006) Фигура 8Ь
- 38 034733
И Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н7 (А/куры/Нью-Йорк/1995) Фигура 9
12 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н2 (А/ серебристые чайки/ Делавэр 677/88 (H2N8)) Фигура 10а
13 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа НЗ (А/Техас/32/2003) Фигура 10Ь
14 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н4 (А/кряквы/Миннесота/33/00) Фигура Юс
15 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н5 (А/утки/Шанхай/1/2000) Фигура 10d
16 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н6 (А/ шилохвости/Техас/828189/02) Фигура Юе
17 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н8 (А/индейки/Онтарио/6118/68(H8N4)) Фигура 10f
18 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н9 (А/утки-широконоски/Иран/О54/03) Фигура 10g
19 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа НЮ (А/куры/Германия/К/1949(Н10Н 7)) Фигура 10h
20 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н11 (А/утки/Англия/56(Н1Ш6)) Фигура 10i
21 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н12 (А/утки/Альберта/60/76(Н12К5)) Фигура 10j
22 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипаН13 (А/чайки/Мэриленд/704/77(Н 13N6)) Фигура Юк
23 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Ш 4 (А/кряквы/Г урьев/263/82) Фигура 101
24 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н15 (А/утки/Австралия/341/83 (H15N8)) Фигура Ют
25 Последовательность, кодирующая вирус гриппа А подтипа Н16 (А/чайки обыкновенные/Швеция /5/99(H16N3)) Фигура Юп
26 Последовательность, кодирующая НА вируса гриппа В (В/Ли/40) Фигура Юо
27 Последовательность, кодирующая НА вируса гриппа С (С/Йоханнесбург/66) Фигура Юр
28 Полная последовательность Hl НА0 Фигура 5
29 Праймер Xmal-pPlas.c Фигура 10q
30 Праймер SacI-ATG-pPlas.r Фигура Юг
31 Праймер SacI-PlasTer.c Фигура 10s
32 Праймер EcoRI-PlasTer.r Фигура 10t
33 А/Новая Каледония/20/99 (H1N1), per. № в GenBank AY289929 Фигура 16
34 Протеиндисульфидизомераза М. Sativa per. № Z11499 в GenBank Фигура 17
- 39 034733
35 А/Пуэрто-Рико/8/34 (H1N1) per. № NC 002016.1 в GenBank Фигура 18
36 Клон 774: ДНК от Dralll до SacI, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей НА штамма А/Брисбен/59/2007 (H1N1) Фигура 28
37 Клон 775: ДНК от Dralll до SacI, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей НА штамма A/Соломоновы острова 3/2006 (H1N1) Фигура 29
38 Клон 776: ДНК от Dralll до SacI, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей НА штамма А/Брисбен 10/2007 (H3N2) Фигура 30
39 Клон 777: ДНК от Dralll до SacI, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей НА штамма А/Висконсин/67/2005 (H3N2) Фигура 31
40 Клон 778: ДНК от Dralll до SacI, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей НА штамма В/Малайзия/2506/2004 Фигура 32
41 Клон 779: ДНК от Dralll до SacI, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей НА штамма В/Флорида/4/2006 Фигура 33
42 Клон 780: ДНК от Dralll до SacI, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей НА штамма А/Сингапур/1/57 (H2N2) Фигура 34
43 Клон 781: ДНК от Dralll до SacI, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей НА штамма А/Аньхой/1/2005 (H5N1) Фигура 35
44 Клон 782: ДНК от Dralll до SacI, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей НА штамма А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) Фигура 36
45 Клон 783: ДНК от Dralll до SacI, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей НА штамма А/дикие утки/ГOHKOHr/W312/97 (H6N1) Фигура 37
- 40 034733
46 Клон 784: ДНК от Dralll до SacI, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей НА штамма А/лошади/Прага/56 (H7N7) Фигура 38
47 Клон 785: ДНК от Dralll до SacI, включая регуляторный участок пластоцианина, оперативно связанный с последовательностью, кодирующей НА штамма А/Гонконг/1073/99 (H9N2) Фигура 39
48 Клон 774: аминокислотная последовательность НА штамма А/Брисбен/59/2007 (H1N1) Фигура 40 А
49 Клон 775: аминокислотная последовательность НА штамма A/Соломоновы острова 3/2006 (H1N1) Фигура 40В
50 Клон 776: аминокислотная последовательность НА штамма А/Брисбен 10/2007 (H3N2) Фигура 41А
51 Клон 777: аминокислотная последовательность НА штамма А/Висконсин/67/2005 (H3N2) Фигура 41В
52 Клон 778 аминокислотная последовательность НА штамма В/Малайзия/2506/2004 Фигура 42А
53 Клон 779 аминокислотная последовательность НА штамма В/Флорида/4/2006 Фигура 42В
54 Клон 780 аминокислотная последовательность НА штамма А/Сингапур/1/57 (H2N2) Фигура 43 А
55 Клон 781 аминокислотная последовательность НА штамма А/Аньхой/1/2005 (H5N1) Фигура 43В
56 Клон 782 аминокислотная последовательность НА штамма А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) Фигура 44А
57 Клон 783 аминокислотная последовательность НА штамма А/ дикие утки /ToHKOHr/W312/97 (H6N1) Фигура 44В
58 Клон 784, аминокислотная последовательность НА А/лошади/Прага/56 (H7N7) Фигура 45А
59 Клон 785, аминокислотная последовательность НА штамма А/Гонконг/1073/99 (H9N2) Фигура 45 В
60 Кассета экспрессии НА, содержащая терминатор и 5’-НТО пластоцианина люцерны, гемагглютининкодирующую последовательность Н5 штамма А/Индонезия/5/2005 (конструкция # 660), и участки З’-НТО и терминатора пластоцианина люцерны. Фигура 51
61 Кассета экспрессии НА, содержащая терминатор и 5’-НТО пластоцианина люцерны, гемагглютининкодирующую последовательность Н1 штамма A/Новая Каледония/20/1999 (Конструкция # 540), и участки 3 ’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны Фигура 52
- 41 034733
62 Кассета экспрессии НА, содержащая терминатор и 5’-НТО пластоцианина люцерны, гемагглютининкодирующую последовательность Н1 штамма А/Брисбен/59/2007 (Конструкция #774), участки 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны Фигура 53
63 Кассета экспрессии НА, содержащая терминатор и 5’-НТО пластоцианина люцерны, гемагглютининкодирующую последовательность Н1 штамма А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1) (Конструкция #775), участки 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны Фигура 54
64 Кассета экспрессии НА, содержащая терминатор и 5’-НТО пластоцианина люцерны, гемагглютининкодирующую последовательность Н2 штамма А/Сингапур/1/57 (H2N2) (Конструкция # 780), участки 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны Фигура 55
65 Кассета экспрессии НА, содержащая терминатор и 5’-НТО пластоцианина люцерны, гемагглютининкодирующую последовательность Н5 штамма А/Аньхой/1/2005 (H5N1) (Конструкция # 781), и участки 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны Фигура 56
66 Кассета экспрессии НА, содержащая терминатор и 5’-НТО пластоцианина люцерны, гемагглютининкодирующую последовательность Н5 штамма А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) (Конструкция # 782), участки 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны Фигура 57
67 Кассета эксессии НА, содержащая терминатор и 5’-НТО пластоцианина люцерны, гемагглютининкодирующую последовательность Н6 штамма А/дикие утки/Гонконг/\¥312/97 (H6N1) (Конструкция # 783), участки 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны Фигура 58
68 Кассета экспрессии НА, содержащая терминатор и 5’-НТО пластоцианина люцерны, гемагглютининкодирующую последовательность Н9 штамма А/Гонконг/1073/99 (H9N2) (Конструкция # 785), участки 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны Фигура 59
69 Кассета экспрессии НА, содержащая терминатор и 5’-НТО пластоцианина люцерны, гемагглютининкодирующую последовательность НЗ штамма А/Брисбен/10/2007 (H3N2), участки 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны Фигура 60
- 42 034733
70 Кассета экспрессии НА, содержащая терминатор и 5’-НТО пластоцианина люцерны, гемагглютининкодирующую последовательность НЗ штамма А/Висконсин/67/2005 (H3N2), участки 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны Фигура 61
71 Кассета экспрессии НА, содержащая терминатор и 5’-НТО пластоцианина люцерны, гемагглютининкодирующую последовательность Н7 штамма А/лошади/Прага/56 (H7N7), участки 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны Фигура 62
72 Кассета экспрессии НА, содержащая терминатор и 5’-НТО пластоцианина люцерны, гемагглютининкодирующую последовательность НА штамма В/Малайзия/2506/2004, участки 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны Фигура 63
73 Кассета экспрессии НА, содержащая терминатор и 5’-НТО пластоцианина люцерны, гемагглютининкодирующую последовательность НА штамма В/Флорида/4/2006, участки 3’ НТО и терминатора пластоцианина люцерны Фигура 64
74 Консенсусная аминокислотная последовательность SEQ ID NO: 49,48, 33 и 9 Фигура 65
75 Аминокислотная последовательность Н1 штамма Новая Каледония (ААР34324.1), которую кодирует SEQ ID NO: 33 Фигура 66
76 Аминокислотная последовательность Н1 штамма Пуэрто-Рико (NC 0409878.1), которую кодирует SEQ ID NO: 35 Фигура 67
77 pBinPlus.2613c AGGAAGGGAAGAAA GCGAAAGGAG
78 Mut-ATG115.r GTGCCGAAGCACGAT CTGACAACGTTGAAG ATCGCTCACGCAAGA AAGACAAGAGA
79 Mut-ATG161.c GTTGTCAGATCGTGC TTCGGCACCAGTACA ACGTTTTCTTTCACTG AAGCGA
80 LC-C5-l.il Or TCTCCTGGAGTCACA GACAGGGTGG
- 43 034733
81 Экспрессирующая кассета № 828, от Рас! (перед промотором) до Asci (непосредственно после терминатора NOS). Фигура 68
82 SpPDI-HA(Ind).c GTTCCTTCTCAGATCT TCGCTGATCAGATTT GCATTGGTTACCATG CA
83 Конструкция № 663, от Hindi!! (в сайте множественного клонирования перед промотором пластоцианина) до EcoRI (непосредственно после терминатора пластоцианина). Фигура 69
84 SpPDI-HlB.c TTCTCAGATCTTCG CTGACACAATATGT ATAGGCTACCATGC TAACAAC
85 SacI-HlB.r CTTAGAGCTCTTAGA TGCATATTCTACA CTGTAAAGACCCAT TGGAA
86 Конструкция № 787, от Hind!!! (в сайте множественного клонирования, перед промотором пластоцианина) до EcoRI (непосредственно после терминатора пластоцианина) Фигура 70
87 НЗВ-SpPDI.r TGTCATTTCCGGGA AGTTTTTGAGCGAAG ATCTGAGAAGGA ACCA
88 SpPDI-НЗВ.с TCTCAGATCTTCGCT CAAAAACTTCCCGGA AATGACAACAGCACG
89 НЗ(А-Вп).982г TTGCTTAACATATC TGGGACAGG
90 Конструкция № 790, от Hind!!! (в сайте множественного клонирования, перед промотором пластоцианина) до EcoRI (непосредственно после терминатора пластоцианина). Фигура 7
91 HBF-SpPDI.r GTTATTCCAGTGCA GATTCGATCAGCGAA GATCTGAGAAGG AACCAACAC
92 SpPDI-HBF.c CAGATCTTCGCTGA TCGAATCTGCACTG GAATAACATCTTCA AACTCACC
93 Plaster80r CAAATAGTATTTCA TAACAACAACGATT
- 44 034733
94 Конструкция №798, от Hindlll (в сайте множественного клонирования, перед промотором пластоцианина) до EcoRI (непосредственно после терминатора пластоцианина). Фигура 72
95 Apal-SpPDLc TTGTCGGGCCCATGG CGAAAAACGTT GCGATTTTCGGCTT ATTGT
96 StuI-Hl(A-NC).r AAAATAGGCCTTTAG ATGCATATTCTA CACTGCAAAGACCCA
97 Конструкция № 580, от Рас! (перед промотором 35S) до Asci (непосредственно после терминатора NOS). Фигура 73
98 Apal-H5 (A-Indo).lc TGTCGGGCCCATGGA GAAAATAGTGCT TCTTCTTGCAAT
99 Н5 (A-Indo)-Stul. 1707г AAATAGGCCTTTAAA TGCAAATTCTGC ATTGTAACGA
100 Конструкция № 685, от Рас! (перед промотором 35S) до Asci (непосредственно после терминатора NOS). Фигура 74
101 Конструкция № 686, от PacI (перед промотором 35S) до Asci (непосредственно после терминатора NOS) Фигура 75
102 Ара1-Н1В.с TGTCGGGCCCATGAA AGTAAAACTACTGGT CCTGTTATGCACATT
103 StuI-H2B.r AAATAGGCCTTTAGA TGCATATTCTACACTG TAAAGACCCATTGGA
104 Конструкция № 732, от PacI (перед промотором 35S) до Asci (непосредственно после терминатора NOS). Фигура 76
105 Конструкция № 733, от PacI (перед промотором 35S) до Asci (непосредственно после терминатора NOS). Фигура 77
106 ApaI-НЗВ.с TTGTCGGGCCCATGA AGACTATCATTGCTTT GAGCTACATTCTATG ТС
- 45 034733
107 StuI-НЗВ.г AAAATAGGCCTTCAA ATGCAAATGTTG CACCTAATGTTGCC TTT
108 Конструкция № 735, от PacI (перед промотором 35S) до Asci (непосредственно после терминатора NOS). Фигура 78
109 Конструкция № 736, от Рас! (перед промотором 35S) до Asci (непосредственно после терминатора NOS). Фигура 79
ПО ApI-HBF.c TTGTCGGGCCCATGA AGGCAATAATTGTAC TACTCATGGTAGTAA C
111 StuI-HBF.r AAAATAGGCCTTTAT AGACAGATGGAGCAT GAAACGTTGTCTCTG G
112 Конструкция № 738, от Рас! (перед промотором 35S) до Asci (непосредственно после терминатора NOS). Фигура 80
113 Конструкция № 739, от Рас! (перед промотором 35S) до Asci (непосредственно после терминатора NOS). Фигура 81
114 Кодирующая последовательность М. sativa Msj 1 Фигура 82
115 Hsp-40Luz.lc ATGTTTGGGCGCGG ACCAAC
116 Hsp40Luz-SacI. 1272г AGCTG4GCTCCTACT GTTGAGCGCANTTGC AC
117 Hsp40Luz-Plasto .r GTTGGTCCGCGCCC AAACATTTTCTCTCAA GATGAT
118 Hsp70Ara.lc ATGTCGGGTAAAGG AGAAGGA
119 Hsp70Ara-SacI.1956r AGCTG4GCTCTTAGT CGACCTCCTCCTCGAT CTTAG
120 Hsp70Ara-Plasto.r TCCTTCTCCTTTACCC GACATTTTCTCTCAAG ATGAT
121 Конструкция № R850, от Hindlll (в сайте множественного клонирования, перед промотором) до EcoRI (непосредственно после терминатора NOS). Фигура 83
122 Конструкция № R860, от Hindlll (в сайте множественного клонирования, перед промотором) до EcoRI (непосредственно после терминатора NOS) Фигура 84
123 Конструкция № R870, от Hindlll (в сайте множественного клонирования, перед промотором) до EcoRI (непосредственно после терминатора NOS). Фигура 85
124 supP19-plasto.r CCTTGTATAGCTCGT TCCATTTTCTCTCAA GATG
125 supP19-lc ATGGAACGAGCTAT ACAAGG
126 SupP19-SacI.r AGTCGAGCTCTTAC TCGCTTTCTTTTTCG AAG
Далее изобретение описано подробно путем ссыпки только на приведенные ниже неограничивающие примеры.
- 46 034733
Методы и материалы.
1. Сборка экспрессирующих кассет на основе пластоцианина для нативного НА.
Все операции проводили по стандартным методикам молекулярной биологии из книги Sambrook and Russell (2001; включена в данный документ посредством ссылки). Первая стадия клонирования представляла собой сборку плазмиды, кодирующей рецептор, с апстрим и даунстрим регуляторными элементами гена пластоцианина люцерны. Участок промотора и 5'HTO пластоцианина амплифицировали из геномной ДНК люцерны с помощью олигонуклеотидных праймеров XmaI-pPlas.c (SEQ ID NO: 29; фиг. 10Q) и SacI-ATG-pPlas.r (SEQ ID NO: 30; фиг. 10R). Продукт амплификации гидролизовали действием XmaI и SacI и лигировали в pCAMBIA2300 (Cambia, Канберра, Австралия), предварительно гидролизованный теми же ферментами, для формирования pCAMBIApromo Plasto. Аналогично последовательности 3'HTO и терминатор гена пластоцианина амплифицировали из геномной ДНК люцерны посредством следующих праймеров: SacI-PlasTer.c (SEQ ID NO: 31; фиг. 10S) и EcoRI-PlasTer.r (SEQ ID NO: 32; фиг. 10T) и продукты гидролизовали действием SacI и EcoRI, после чего вставляли в те же сайты pCAMBIApromoPlasto для создания pCAMBLAPlasto.
Фрагмент, кодирующий гемагглютинин штамма вируса гриппа А/Индонезия/5/05 (H5N1; рег. № LANL ISDN125873), синтезировали в лаборатории Epoch Biolabs (Шугар-Лэнд, Техас, США). Полученный фрагмент, содержащий полный кодирующий участок H5, в том числе нативный сигнальный пептид, фланкированный сайтом HindIII, непосредственно перед начальным ATG, и сайтом SacI, непосредственно после стоп-кодона (TAA), представлен как SEQ ID NO: 3 (фиг. 6). Кодирующую область H5 клонировали в экспрессирующую кассету на основе пластоцианина методом лигирования на основе ПЦР, представленным в работе Darveau, et al. (1995). Кратко: первую ПЦР амплификацию получали с праймерами Plato-443c (SEQ ID NO: 4; фиг. 7A) и SpHA(Ind)-Plasto.r (SEQ ID NO:5; фиг. 7B) на матрице pCAMBIA promoPlasto. Параллельно проводили вторую амплификацию с праймерами Plasto-SpHA(Ind).c (SEQ ID NO: 6; фиг. 7C) и HA(Ind)-Sac.r (SEQ ID NO:7; фиг. 7D) на матрице - кодирующем фрагменте H5. Продукты амплификации смешивали, и смесь служила матрицей для третьей реакции (сборки) с праймерами Plato-443c (SEQ ID NO: 4; фиг. 7A) и HA(Ind)-Sac.r (SEQ ID NO: 7; фиг. 7D). Полученный фрагмент гидролизовали действием BamHI (в промоторе пластоцианина) и SacI (на 3'-конце фрагмента) и клонировали в pCAMBIAPlasto, предварительно гидролизованный теми же ферментами. Полученная плазмида 660 представлена на фиг. 2B (см. также фиг. 11).
Экспрессирующие кассеты гемагглютинина № 774-785 собирали следующим образом. Синтезировали фрагмент, содержащий полную кодирующую последовательность гемагглютинина (от ATG до стоп-кодона), фланкированный на 3'-конце последовательностями гена пластоцианина люцерны, соответствующими первым 84 нуклеотидам, предшествующим ATG, и оканчивающийся сайтом рестрикции DraIII. В состав синтетических фрагментов входил сайт SacI, непосредственно после стоп-кодона.
Синтетические фрагменты гемагглютинина синтезировали в компании Top Gene Technologies (Монреаль, Квебек, Канада) и Epoch Biolabs (Шугар-Лэнд, Техас, США). Полученные фрагменты представлены на фиг. 28-39 и соответствуют SEQ ID NO: 36 - SEQ ID NO: 47. Для сборки полных экспрессирующих кассет синтетические фрагменты гидролизовали DraIII и SacI и клонировали pCAMBIAPlasto, предварительно гидролизованный теми же ферментами. В табл. 6 представлены кассеты, полученные с соответствующими HA, и другие ссылки на текст.
- 47 034733
Таблица 6
Экспрессирующие кассеты гемагглютинина, собранные из синтетических фрагментов DraIII-SacI
Кассета № Соответствующий НА Синтетический фрагмент Комплектная кассета
Фиг. Синтетически й фрагмент SEQ ID NO Фиг. Готовая кассета SEQ ID NO
774 НА штамма А/Брисбен/59/2007 (H1N1) 28 36 53 62
775 НА штамма A/Соломоновы острова 3/2006 (H1N1) 29 37 54 63
776 НА штамма А/Брисбен 10/2007 (H3N2) 30 38 60 69
777 НА штамма А/Висконсин/67/2005 (H3N2) 31 39 61 70
778 НА штамма В/Малайзия/2506/2004 32 40 63 72
779 НА штамма В/Флорида/4/2006 33 41 64 73
780 НА штамма А/Сингапур/1/57 (H2N2) 34 42 55 64
781 НА штамма А/Аньхой/1/2005 (H5N1) 35 43 56 65
782 НА штамма А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) 36 44 57 66
783 НА штамма А/дикие утки/Гонконг/ХУЗ 12/97 (H6N1) 37 45 58 67
784 НА штамма А/Лошади/Прага/56 (H7N7) 38 46 62 71
785 НА штамма А/Гонконг/1073/99 (H9N2) 39 47 59 68
2. Сборка экспрессирующих кассет на основе пластоцианина для слитых СП PDI/HA.
H1 А/Новая Каледония/20/99 (конструкция № 540).
Открытую рамку считывания из гена H1 штамма А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) синтезировали в виде двух фрагментов (Plant Biotechnology Institute, National Research Council, Саскатун, Канада). Первый синтезированный фрагмент соответствовал кодирующей последовательности H1 дикого типа (GenBank рег. № AY289929; SEQ ID NO: 33; фиг. 16), где отсутствовала кодирующая последовательность сигнального пептида на 5'-конце и кодирующая последовательность трансмембранного домена на 3'-конце. К 5'-концу кодирующей последовательности присоединяли сайт рестрикции BglII, а непосредственно за стоп-кодоном в 3'-концевой области фрагмента присоединяли двойной сайт SacI/StuI, что давало SEQ ID NO: 1 (фиг. 5А). Синтезировали второй фрагмент, кодирующий C-терминальную область белка H1 (содержащий трансмембранный домен и цитоплазматический хвост) от сайта KpnI до стоп-кодона, фланкированный у 3' сайтами рестрикции SacI и StuI (SEQ ID NO. 2; фиг. 5B).
Первый фрагмент H1 гидролизовали BglII и SacI и клонировали в те же сайты бинарного вектора (pCAMBIAPlasto), содержащего участок промотора и 5'-HTO пластоцианина, слитые с сигнальным пептидом гена протеиндисульфидизомеразы (PDI) люцерны (нуклеотиды 32-103; рег. № Z11499; SEQ ID NO: 34; фиг. 17), что приводило к образованию химерного гена PDI-H1, расположенного после регуляторных элементов пластоцианина. Последовательность кассеты на основе пластоцианина, содержащей сигнальный пептид PDI, представлена на фиг. 1 (SEQ ID NO: 8). Полученная плазмида включает кодирующую область H1, слитую с сигнальным пептидом PDI и фланкированную регуляторными элементами пластоцианина. Добавление C-концевого кодирующего участка (кодирующего трансмембранный домен и цитоплазматический хвост) осуществляли внедрением в плазмиду экспрессии H1 синтезированного фрагмента (SEQ ID NO: 2; фиг. 5В), предварительно гидролизованного действием KpnI и SacI. Полученная плазмида под номером 540 представлена на фиг. 11 (см. также фиг. 2A).
H5 А/Индонезия/5/2005 (конструкция № 663).
Сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы (СП PDI) люцерны (нуклеотиды 32-103; рег. № Z11499; SEQ ID NO: 34; фиг. 17) присоединяли к кодирующей последовательности HA0 H5 штамма А/Индонезия/5/2005 следующим образом. Кодирующую последовательность H5 амплифицировали праймерами SpPDI-HA(Ind).c (SEQ ID NO:82) и NA(Ind)-SacI.r (SEQ ID NO: 7; фиг. 7D) с матрицей - конструкцией № 660 (SEQ ID NO: 60; фиг. 51). Полученный фрагмент представлял собой кодирующую последовательность H5, фланкированную у 5' последними нуклеотидами, кодирующими СП PDI (включая сайт рестрикции BglII) и у 3' - сайтом рестрикции SacI. Фрагмент гидролизовали BglII и SacI и клониро- 48 034733 вали в конструкцию № 540 (SEQ ID NO: 61; фиг. 52), предварительно гидролизованную теми же ферментами рестрикции. Полученная кассета - конструкция № 663 (SEQ ID NO: 83) - приведена на фиг. 69.
H1 А/Брисбен/59/2007 (конструкция № 787).
Сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы (СП PDI) люцерны (нуклеотиды 32-103; рег. №. Z11499; SEQ ID NO: 34; фиг. 17) присоединяли к кодирующей последовательности HA0 H1 штамма А/Брисбен/59/2007 следующим образом. Кодирующую последовательность H1 амплифицировали праймерами SpPDI-H1B.c (SEQ ID NO: 84) и SacI-H1B.r (SEQ ID NO: 85) с матрицей - конструкцией № 774 (SEQ ID NO: 62; фиг. 53). Полученный фрагмент представлял собой кодирующую последовательность H1, фланкированную у 5' последними нуклеотидами, кодирующими СП PDI (включая сайт рестрикции BglII) и у 3'- сайтом рестрикции SacI. Фрагмент гидролизовали BglII и SacI и клонировали в конструкцию № 540 (SEQ ID NO: 61; фиг. 52), предварительно гидролизованную теми же ферментами рестрикции. Полученная кассета - конструкция № 787 (SEQ ID NO: 86) - представлена на фиг. 70.
H3 А/Брисбен/10/2007 (конструкция № 790).
Сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы (СП PDI) люцерны (нуклеотиды 32-103; рег. № Z11499; SEQ ID NO: 34; фиг. 17) присоединяли к кодирующей последовательности HA0 H3 штамма А/Брисбен/10/2007 следующим образом. СП PDI присоединяли к кодирующей последовательности H3 методом лигирования на основе ПЦР, описанным в работе Darveau, et al. (Methods in Neuroscience, 26:7785(1995)). В первом раунде ПЦР сегмент промотора пластоцианина, слитый с СП PDI, амплифицировали с праймерами Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; фиг. 7A) и H3В-SpPDI.r (SEQ ID NO:87) с матрицей - конструкцией 540 (SEQ ID NO: 61; фиг. 52). Одновременно другой фрагмент, содержащий часть кодирующей последовательности H3 А/Брисбен/10/2007 (от кодона 17 до сайта рестрикции SpeI), амплифицировали с праймерами SpPDI-FDB.c (SEQ ID NO: 88) и H3(A-Bri).982r (SEQ ID NO: 89) с матрицей - конструкцией 776 (SEQ ID NO: 69; фиг. 60). Затем продукты амплификации смешивали и использовали в качестве матрицы во втором раунде амплификации (реакция сборки) с праймерами Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; фиг. 7A) и H3(A-Bri).982r (SEQ ID NO: 89). Полученный фрагмент гидролизовали BamHI (в промоторе пластоцианина) и SpeI (в кодирующей последовательности H3) и клонировали в конструкцию № 776 (SEQ ID NO: 69; фиг. 60), предварительно гидролизованную теми же ферментами рестрикции, получив конструкцию № 790 (SEQ ID NO: 90), которая показана на фиг. 71.
НА В/Флорида/4/2006 (конструкция № 798).
Сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы (СП PDI) люцерны (нуклеотиды 32-103; рег. № Z11499; SEQ ID NO: 34; фиг. 17) присоединяли к кодирующей последовательности HA0 из HA штамма В/Флорида/4/2006 методом лигирования на основе ПЦР, описанным в работе Darveau, et al. (Methods in Neuroscience, 26:77-85(1995)). В первом раунде амплификации участок промотора пластоцианина, слитый с СП PDI, амплифицировали с праймерами Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; фиг. 7A) и HBF-SpPDI.r (SEQ ID NO:91) с матрицей - конструкцией № 540 (SEQ ID NO: 61; фиг. 52). Одновременно другой фрагмент, содержащий часть кодирующей последовательности HB B/Flo, слитого с терминатором пластоцианина, амплифицировали с праймерами SpPDI-HBF.c (SEQ ID NO: 92) и Plaster80r (SEQ ID NO: 93) с матрицей - конструкцией № 779 (SEQ ID NO: 73; фиг. 64). Затем продукты ПЦР смешивали и использовали в качестве матрицы во втором раунде амплификации (реакция сборки) с праймерами Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; фиг. 7A) и Plaster80r (SEQ ID NO: 93). Полученный фрагмент гидролизовали BamHI (в промоторе пластоцианина) и ЛИН (в кодирующей последовательности HA штамма В/Флорида/4/2006) и клонировали в конструкцию № 779 (SEQ ID NO:73; фиг. 64), предварительно гидролизованную теми же ферментами рестрикции, получив конструкцию № 798 (SEQ ID NO:94). Полученная экспрессирующая кассета показана на фиг. 72.
Сборка экспрессирующих кассет на основе CPMV-HT.
В кассетах экспрессии на основе CPMV-HT промотор 35S служит для регулирования экспрессии мРНК и включает целевую кодирующую последовательность, фланкированную у 5' нуклеотидами 1-512 РНК2 вируса мозаики коровьего гороха (CPMV) с мутированным ATG в положениях 115 и 161 и у 3' нуклеотидами 3330-3481 РНК2 CPMV (соответствует 3' HTO) с последующим терминатором NOS. Сборку кассет экспрессии гемагглютинина на основе CPMV-HT проводили с плазмидой pBD-C5-1LC (Sainsbury, et al. 2008; Plant Biotechnology Journal, 6:82-92, публикация PCT WO 2007/135480). Мутацию ATG в положениях 115 и 161 РНК2 CPMV осуществляли методом лигирования на основе ПЦР, изложенным в публикации Darveau, et al. (Methods in Neuroscience, 26:77-85 (1995)). Проводили две отдельные ПЦР, используя матрицу pBD-C5-1LC. Праймерами при первой амплификации служили pBinPlus.2613c (SEQ ID NO: 77) и Mut-ATG115r (SEQ ID NO: 78). Праймерами для второй амплификации были Mut-ATG161c (SEQ ID NO: 79) и LC-C5-1.110r (SEQ ID NO: 80). Два полученных фрагмента смешивали и использовали в качестве матрицы в третьей амплификации с праймерами pBinPlus.2613c (SEQ ID NO: 77) и LC-C5-1.110r (SEQ ID NO: 80). Полученный фрагмент гидролизовали PacI и ApaI и клонировали в pBD-C5-1LC, гидролизованный тем же ферментом. Последовательность экспрессирующей кассеты номер 828 представлена на фиг. 68 (SEQ ID NO: 81).
Сборка SpPDI-H1 А/Новая Каледония/20/99 в экспрессирующей кассете на основе CPMV-HT (конструкция № 580).
- 49 034733
Участок, кодирующий сигнальный пептид PDI люцерны, слитый с HA0 из H1 штамма А/Новая Каледония/20/99, клонировали в CPMV-HT следующим образом. Сайты рестрикции ApaI (непосредственно перед начальным ATG) и StuI (непосредственно после стоп-кодона) присоединяли к кодирующей последовательности гемагглютинина за счет ПЦР-амплификации с праймерами ApaI-SpPDI.c (SEQ ID NO: 95) и StuI-H1(A-NC).r (SEQ ID NO: 96) и с матрицей - конструкцией № 540 (SEQ ID NO: 61; фиг. 52). Полученный фрагмент гидролизовали ферментами рестрикции ApaI и StuI и клонировали в конструкцию № 828 (SEQ ID NO: 81), гидролизованную теми же ферментами. Полученная кассета носит название конструкция № 580 (SEQ ID NO: 97).
Сборка H5 А/Индонезия/5/2005 в экспрессирующей кассете CPMV-HT (конструкция № 685).
Кодирующую последовательность H5 штамма А/Индонезия/5/2005 клонировали в CPMV-HT следующим образом. Сайты рестрикции ApaI (непосредственно перед ATG) и StuI (непосредственно после стоп-кодона) присоединяли к кодирующей последовательности гемагглютинина за счет ПЦРамплификации с праймерами ApaI-H5 (A-Indo).1c (SEQ ID NO: 98) и H5 (A-Indo)-StuI.1707r (SEQ ID NO: 99) и с матрицей - конструкцией № 660 (SEQ ID NO: 60; фиг. 51). Полученный фрагмент гидролизовали ферментами рестрикции ApaI и StuI и клонировали в конструкцию № 828 (SEQ ID NO: 81), гидролизованную теми же ферментами. Полученная кассета носит название конструкция № 685 (SEQ ID NO: 100).
Сборка SpPDI-H5 А/Индонезия/5/2005 в экспрессирующей кассете на основе CPMV-HT (конструкция № 686).
Участок, кодирующий сигнальный пептид PDI люцерны, слитый с HA0 из H5 штамма А/Индонезия/5/2005, клонировали в CPMV-HT следующим образом. Сайты рестрикции ApaI (непосредственно перед ATG) и StuI (непосредственно после стоп-кодона) присоединяли к кодирующей последовательности гемагглютинина за счет ПЦР-амплификации с праймерами ApaI-SpPDI.c (SEQ ID NO: 95) и H5 (A-Indo)-StuI.1707r (SEQ ID NO: 99) и с матрицей - конструкцией № 663 (SEQ ID NO: 83). Полученный фрагмент гидролизовали ферментами рестрикции ApaI и StuI и клонировали в конструкцию 828 (SEQ ID NO: 81), гидролизованную теми же ферментами. Полученная кассета носит название конструкция № 686 (SEQ ID NO: 101).
Сборка H1 А/Брисбен/59/2007 в экспрессирующей кассете на основе CPMY-HT (конструкция № 732).
Кодирующую последовательность HA из H1 штамма А/Брисбен/59/2007 клонировали в CPMV-HT следующим образом. Сайты рестрикции ApaI (непосредственно перед ATG) и StuI (непосредственно после стоп-кодона) присоединяли к кодирующей последовательности гемагглютинина за счет ПЦРамплификации с праймерами ApaI-H1B.c (SEQ ID NO: 102) и StuI-H1B.r (SEQ ID NO: 103) и с матрицей конструкцией № 774 (SEQ ID NO: 62; фиг. 53). Полученный фрагмент гидролизовали ферментами рестрикции ApaI и StuI и клонировали в конструкцию 828 (SEQ ID NO: 81), гидролизованную теми же ферментами. Полученная кассета носит название конструкция № 732 (SEQ ID NO: 104).
Сборка SpPDI-H1 А/Брисбен/59/2007 в экспрессирующей кассете на основе CPMV-HT (конструкция № 733).
Участок, кодирующий сигнальный пептид PDI люцерны, слитый с HA0 из H1 штамма А/Брисбен/59/2007, клонировали в CPMV-HT следующим образом. Сайты рестрикции ApaI (непосредственно перед ATG) и StuI (непосредственно после стоп-кодона) присоединяли к кодирующей последовательности гемагглютинина за счет ПЦР-амплификации с праймерами ApaI-SpPDI.c (SEQ ID NO: 95) и StuI-H1B.r (SEQ ID NO: 103) и с матрицей - конструкцией № 787 (SEQ ID NO: 86). Полученный фрагмент гидролизовали ферментами рестрикции ApaI и StuI и клонировали в конструкцию № 828 (SEQ ID NO: 81), гидролизованную теми же ферментами. Полученная кассета носит название конструкция № 733 (SEQ ID NO: 105).
Сборка H3 А/Брисбен/10/2007 в экспрессирующей кассете на основе CPMV-HT (конструкция № 735).
Кодирующую последовательность HA из H3 штамма А/Брисбен/10/2007 клонировали в CPMV-HT следующим образом. Сайты рестрикции ApaI (непосредственно перед ATG) и StuI (непосредственно после стоп-кодона) присоединяли к кодирующей последовательности гемагглютинина за счет ПЦРамплификации с праймерами ApaI-H3В.c (SEQ ID NO: 106) и StuI-H3B.r (SEQ ID NO: 107) и с матрицей конструкцией № 776 (SEQ ID NO:69). Полученный фрагмент гидролизовали ферментами рестрикции ApaI и StuI и клонировали в конструкцию № 828 (SEQ ID NO: 81), гидролизованную теми же ферментами. Полученная кассета носит название конструкция № 735 (SEQ ID NO: 108).
Сборка SpPDI-H3 А/Брисбен/10/2007 в экспрессирующей кассете на основе CPMV-HT (конструкция № 736).
Участок, кодирующий сигнальный пептид PDI люцерны, слитый с HA0 из H3 штамма А/Брисбен/10/2007, клонировали в CPMV-HT следующим образом. Сайты рестрикции ApaI (непосредственно перед ATG) и StuI (непосредственно после стоп-кодона) присоединяли к кодирующей последовательности гемагглютинина за счет ПЦР-амплификации с праймерами ApaI-SpPDI.c (SEQ ID NO: 95) и StuI-H3B.r (SEQ ID NO: 107) и с матрицей - конструкцией № 790 (SEQ ID NO: 90). Полученный фрагмент гидролизовали ферментами рестрикции ApaI и StuI и клонировали в конструкцию № 828
- 50 034733 (SEQ ID NO: 81), гидролизованную теми же ферментами. Полученная кассета носит название конструкция № 736 (SEQ ID NO: 109).
Сборка HA В/Флорида/4/2006 в экспрессирующей кассете на основе CPMV-HT (конструкция № 738).
Кодирующую последовательность HA из штамма В/Флорида/4/2006 клонировали в CPMV-HT следующим образом. Сайты рестрикции ApaI (непосредственно перед ATG) и StuI (непосредственно после стоп-кодона) присоединяли к кодирующей последовательности гемагглютинина за счет ПЦРамплификации с праймерами ApaI-HBF.c (SEQ ID NO: 110) и StuI-HBF.r (SEQ ID NO: 111) и с матрицей конструкцией № 779 (SEQ ID NO: 73; фиг. 64). Полученный фрагмент гидролизовали ферментами рестрикции ApaI и StuI и клонировали в конструкцию № 828 (SEQ ID NO: 81), гидролизованную теми же ферментами. Полученная кассета носит название конструкция №738 (SEQ ID NO: 112).
Сборка SpPDI-HA В/Флорида/4/2006 в экспрессирующей кассете CPMV-HT (конструкция № 739).
Участок, кодирующий сигнальный пептид PDI люцерны, слитый с HA0 из штамма В/Флорида/4/2006, клонировали в CPMV-HT следующим образом. Сайты рестрикции ApaI (непосредственно перед ATG) и StuI (непосредственно после стоп-кодона) присоединяли к кодирующей последовательности гемагглютинина за счет ПЦР-амплификации с праймерами ApaI-SpPDI.c (SEQ ID NO: 95) и StuI-HBF.r (SEQ ID NO: 111) и с матрицей - конструкцией № 798 (SEQ ID NO: 94). Полученный фрагмент гидролизовали ферментами рестрикции ApaI и StuI и клонировали в конструкцию № 828 (SEQ ID NO: 81), гидролизованную теми же ферментами. Полученная кассета носит название конструкция № 739 (SEQ ID NO: 113).
Сборка экспрессирующих кассет белков-шаперонов.
Собирали две экспрессирующие кассеты белков теплового шока (Hsp). В первой кассете экспрессия цитозольного HSP70 Arabidopsis thaliana (экотип Колумбия) (Athsp70-l в Lin, et al. (2001) Cell Stress and Chaperones, 6:201-208) регулируется химерным промотором, сочетающим элементы нитритредуктазы (Nir) люцерны и промотора пластоцианина люцерны (Nir/Plasto). Вторая кассета состояла из кодирующего участка цитозольного HSP40 люцерны (MsJ1; Frugis, et al. (1999), Plant Molecular Biology, 40:397-408) под контролем химерного промотора Nir/Plasto.
Первой собирали плазмиду акцептора, содержащую промотор нитротредуктазы (Nir) люцерны, репортерный ген GUS и терминатор NOS в бинарном векторе на основе растения. Плазмиду pNir3K51 (описана ранее в патенте США № 6420548) гидролизовали действием HindIII и EcoRI. Полученный фрагмент клонировали в pCAMBIA2300 (Камбиа, Канберра, Австралия), гидролизованный теми же ферментами рестрикции, получая pCAMBIA-Nir3K51.
Участки, кодирующие Hsp70 и Hsp40, раздельно клонировали в плазмиде акцептора pCAMBIANir3K51 способом лигирования на основе ПЦР, описанным Darveau, et al. (Methods in Neuroscience, 26:77-85 (1995)).
Для Hsp40 кодирующую последовательность Msj1 (SEQ ID NO: 114) амплифицировали с помощью RT-ПЦР из полной РНК листа люцерны (экотип Rangelander) с помощью праймеров Hsp40Luz.1c (SEQ ID NO: 115) и Hsp40Luz-SacI.1272r (SEQ ID NO: 116). Вторую амплификацию проводили с праймерами Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; фиг. 7A) и Hsp40Luz-Plasto.r (SEQ ID NO: 117) и с конструкцией № 660 (SEQ ID NO: 60; фиг. 51) в качестве матрицы. Затем продукты ПЦР смешивали и использовали в качестве матрицы для третьей амплификации (реакция сборки) с праймерами Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; фиг. 7A) и Hsp40Luz-SacI. 1272r (SEQ ID NO: 116). Полученный фрагмент гидролизовали HpaI (в промоторе пластоцианина) и клонировали в pCAMBIANir3K51, предварительно гидролизованный HpaI (в промоторе Nir) и SacI, затем формировали тупые концы с помощью ДНК полимеразы фага Т4. Полученные клоны тестировали на правильную ориентацию и секвенировали для подтверждения целостности последовательности. Полученная плазмида под названием R850 приведена на фиг. 83 (SEQ ID NO: 121). Кодирующий участок Athsp70-l амплифицировали с помощью RT-PCR из РНК листа Arabidopsis с помощью праймеров Hsp70Ara.1c (SEQ ID NO: 118) и Hsp70Ara-SacI.1956r (SEQ ID NO: 119). Вторую амплификацию проводили с праймерами Plato-443c (SEQ ID NO: 4; фиг. 7A) и Hsp70Ara-Plasto.r (SeQ ID NO: 120) и с матрицей - конструкцией 660 (SEQ ID NO: 60; фиг. 51). Продукты ПЦР смешивали и использовали в качестве матрицы для третьей амплификации (реакция сборки) с праймерами Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; фиг. 7A) и Hsp70ARA-SacI.1956r (SEQ ID NO: 119). Полученный фрагмент гидролизовали HpaI (в промоторе пластоцианина) и клонировали в pCAMBIANir3K51, гидролизованный HpaI (в промоторе Nir) и SacI, после чего формировали тупые концы с помощью ДНК полимеразы фага Т4. Полученные клоны тестировали на правильную ориентацию и секвенировали для подтверждения целостности последовательности. Полученная плазмида под названием R860 приведена на фиг. 84 (SEQ ID NO: 122).
Плазмиду двойной экспрессии Hsp собирали следующим образом. R860 гидролизовали действием BsrBI (после терминатора NOS), обрабатывали ДНК полимеразой фага Т4 для получения тупого конца, затем гидролизовали Sbfl (перед химерным промотором Nir/Plasto). Полученный фрагмент (химерный промотор Nir/Plasto-кодирующая последовательность H8Р70-терминатор Nos) клонировали в R850, предварительно гидролизованный Sbfl и SmaI (оба расположены в сайте множественного клонирования перед химерным промотором Nir/Plasto). Полученная плазмида под названием R870 приведена на фиг. 85
- 51 034733 (SEQ ID NO: 123).
Сборка других экспрессирующих кассет.
Кассета для экспрессии растворимого H1.
Кассету, кодирующую растворимую форму H1, получали заменой участка, кодирующего трансмембранный домен и цитоплазматический хвост в 540, фрагментом, кодирующим лейциновую застежку GCN4, вариант pII (Harbury et al., 1993, Science 1993; 262:1401-1407). Указанный фрагмент синтезировали с фланкирующими сайтами KpnI и SacI, что способствует клонированию. Плазмида, полученная при такой замене, имеет номер 544, соответствующая экспрессирующая кассета приведена на фиг. 11.
Кассета экспрессии M1 А/Пуэрто-Рико/8/34.
Синтезировали слитую 5' HTO вируса гравировки табака (TEV) с открытой рамкой считывания гена вируса гриппа A/PR/8/34 M1 (рег. № NC002016) с фланкирующим сайтом SacI, присоединенным после стоп-кодона. Фрагмент гидролизовали SwaI (в 5'HTO TEV) и SacI и клонировали в экспрессирующую кассету на основе 2X35S/TEV в бинарной плазмиде pCAMBIA. Полученная плазмида несла участок, кодирующий M1, под контролем промотора 2X35S/TEV и 5'HTO и терминатора NOS (конструкция № 750; фиг. 11).
Кассета экспрессии HcPro.
Конструкцию HcPro (35HcPro) готовили, как описано в работе Hamilton et al. (2002). Все клоны секвенировали для подтверждения целостности конструкций. Плазмиды использовали для трансформации Agrobacteium tumefaciens (AGL1; АТСС, Manassas, VA 20108, USA) методом электропорации (Mattanovich et al., 1989). Целостность всех штаммов A. tumefaciens подтверждали рестрикционным картированием.
Кассета экспрессии p19.
Участок, кодирующий белок p19 вируса кустистой карликовости томата (TBSV), присоединяли к кассете экспрессии пластоцианина люцерны методом лигирования на основе ПЦР, приведенным в работе Darveau et al. (Methods in Neuroscience, 26:77-85(1995)). В первом раунде ПЦР сегмент промотора пластоцианина амплифицировали с помощью праймеров Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; фиг. 7A) и supP19-plasto.r (SEQ ID NO: 124) и с матрицей - конструкцией№ 660 (SEQ ID NO: 60; фиг. 51). Одновременно еще один фрагмент, содержащий кодирующую последовательность p19, амплифицировали праймерами supP19-1c (SEQ ID NO: 125) и SupP19-SacI.r (SEQ ID NO: 126) с матрицей - конструкцией 35S:p19, описанной в работе Voinnet et al. (The Plant Journal, 33:949-956 (2003)). Продукты амплификации затем смешивали и использовали в качестве матрицы во втором раунде амплификации (реакция сборки) с праймерами Plasto-443c (SEQ ID NO: 4; фиг. 7A) и SupP19-SacI.r (SEQ ID NO: 126). Полученный фрагмент гидролизовали BamHI (в промоторе пластоцианина) и SacI (на конце участка, кодирующего p19) и клонировали в конструкцию № 660 (SEQ ID NO: 60; фиг. 51), предварительно гидролизованную теми же ферментами рестрикции с образованием конструкции № R472. Плазмида R472 показана на фиг. 86.
3. Приготовление растительной биомассы, инокулята, агроинфильтрация и сбор растений.
Растения Nicotiana benthamiana или Nicotiana tabacum были выращены из семян в ящиках, заполненных товарным субстратом - болотным мхом. Растения находились в оранжерее в условиях светового дня/ночи 16/8 и при температурном режиме: день -25°С/ночь - 20°C. Через три недели после посева ростки вынимали, пересаживали в горшки и выращивали в оранжерее еще три недели при тех же условиях внешней среды. Перед трансформацией в различные моменты времени удаляли апикальные и пазушные почки, как указано ниже, либо отщипывая почки с растения, либо обрабатывая растение химическим реагентом.
После трансфекции каждой из конструкций Agrobacteria выращивали на среде YEB (бульон с дрожжевым экстрактом) с добавлением 10 мМ 2-|Л-морфолино]этансулъфоновой кислоты (MES), 20 мкм ацетосирингона, 50 мкг/мл канамицина и 25 мкг/мл карбенициллина при pH 5,6 до достижения OD600 в интервале 0,6-1,6. Суспензии Agrobacterium центрифугировали перед использованием, затем продукт повторно суспендировали в среде для инфильтрации (10 мМ MgCl2 и 10 мМ MES, pH 5,6). Шприцевую инфильтрацию проводили, как описано в работе Liu and Lomonossoff (2002, Journal of Virological Methods, 105:343-348). Для вакуумной инфильтрации суспензии A. tumefaciens центрифугировали, продукт повторно суспендировали в среде для инфильтрации и оставляли на ночь при температуре 4°C. В день проведения инфильтрации партии культуры разбавляли в 2,5 объемах культуры и перед использованием оставляли для повышения температуры. Цельные растения N. benthamiana или
N. tabacum помещали верхушкой вниз в бактериальную суспензию в герметичной емкости из нержавеющей стали и выдерживали в течение 2 мин в вакууме 20-40 торр. После шприцевой или вакуумной инфильтрации растения возвращали в оранжерею, где инкубировали в течение 4-5 суток перед сбором. Если не указано иное, осуществляли совместную инфильтрацию AGL1/35S-HcPro в отношении 1:1, за исключением штаммов с кассетами CPMV-HT, для которых проводили совместную инфильтрацию штаммами AGL1/R472 в отношении 1:1.
4. Отбор образцов листьев и экстракция суммарного белка.
После инкубации надземную часть растений собирали, замораживали при -80°C и разделяли на куски. Суммарные растворимые белки экстрагировали, гомогенизируя (Polytron) каждую пробу расти
- 52 034733 тельного материала, измельченного в замороженном виде, в 3 объемах холодной среды, состоящей из 50 мМ Трис pH 7,4, 0,15 М NaCl и 1 мМ фенилметансульфонилфторида. После гомогенизации полученные образцы жидкой массы центрифугировали при 20000xg в течение 20 мин при 4°C и полученные прозрачные сырые экстракты (супернатанты) оставляли для анализа. Суммарное содержание белка в прозрачных сырых экстрактах определяли методом Бредфорда (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния), стандарт бычий сывороточный альбумин.
5. Эксклюзионная хроматография экстрактов белка.
Колонки для эксклюзионной хроматографии (ЭХ) с 32 мл насадки Sephacryl™ S-500 HR (S-500 HR: GE Healthcare, Упсала, Швеция, кат. № 17-0613-10) приводили в равновесие с буфером/подвижной фазой (50 мМ Трис, pH 8, 150 мМ NaCl). 1,5 мл сырого экстракта белка наносили на колонку, после чего элюировали 45 мл буфера/подвижной фазы. Элюат собирали в виде фракций объемом по 1,5 мл. Относительное содержание белка в элюированных фракциях контролировали, смешивая 10 мкл фракции с 200 мкл разбавленного реагента-красителя Bio-Rad для белков (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния). Колонку промывали двукратным объемом 0,2н. NaOH (по отношению к объему колонки), а затем десятикратным объемом смеси 50 мМ Трис, pH 8, 150 мМ NaCl, 20% этанол. После каждого разделения проводили градуировку колонки красителем декстран голубой 2000 (GE Healthcare Bio-Science Corp., Пискатавэй, НьюДжерси, США). При каждом разделении сопоставляли профили элюирования декстрана голубого 2000 и растворимых белков растения-хозяина для обеспечения неизменности профиля элюирования от колонки к колонке.
6. Анализ белка и иммуноблоттинг.
Концентрацию белков определяли методом анализа с БСА (Pierce Biochemicals, Рокпорт, Иллинойс). Белки разделяли электрофорезом на ДДС-Na-ПААГ в восстанавливающих условиях и окрашивали кумасси синим. Окрашенные гели исследовали и проводили денситометрический анализ с применением программного обеспечения ImageJ Software (NIH).
Белки из элюированных хроматографических фракций осаждали ацетоном (Bollag et al., 1996), повторно суспендировали в 1/5 объема буфера/подвижной фазы, разделяли электрофорезом на ДДС-Na-ПААГ в восстанавливающих условиях и переносили методом электроблоттинга на поливинилендифторидные (ПВДФ) мембраны (Roche Diagnostics Corporation, Индианаполис, Индиана) для иммунологического анализа. Перед иммуноблоттингом мембраны выдерживали в 5%-ном молоке и 0,1% Твин-20 в солевом растворе Трис буфера (TBS-T) в течение 16-18 ч при 4°C.
Иммуноблоттинг проводили инкубированием с подходящим антителом (табл. 7), в 2 мкг/мл 2% снятого молока в буфере TBS-Твин 20 0,1%. Вторичные антитела, использованные для хемилюминесцентного обнаружения (перечислены в табл. 4), были разведены, как указано, в 2% снятого молока в TBS-Твин 20 0,1%. Иммунореактивные комплексы обнаруживали на основе хемилюминесценции в присутствии субстрата-люминола (Roche Diagnostics Corporation). Конъюгацию пероксидазы хрена с антителом IgG человека проводили с помощью набора EZ-Link Plus® Activated Peroxidase (Pierce, Рокфорд, Иллинойс). Цельный инактивированный вирус (ЦИВ), который использовали в качестве контроля для обнаружения подтипов H1, H3 и В, приобретали в Национальном институте биологических стандартов и контроля (NIBSC).
- 53 034733
Таблица 7
Условия электрофореза, антитела и разведение для иммуноблоттинга белков, полученных экспрессией
Подтип НА Штамм вируса гриппа Условия электрофореза Первичное антитело Разведени e Вторичное антитело Разведение
Hl А/Брисбен/59 /2007 (H1N1) Восстанавливающие FII10-150 4 мкг/мл Козы к мышиным антигенам (JIR 115-035-146) 1:10 000
Hl А/ Соломоновы острова /3/2006 (H1N1) Восстанавливающие NIBSC07/104 1:2000 Кролика к антигенам овцы (JIR 313-035-045) 1:10 000
Hl А/Новая Каледония/20/ 99 (H1N1) Восстанавливающие FII10-150 4 мкг/мл Козы к мышиным антигенам (JIR 115-035-146) 1:10 000
H2 А/Сингапур/1 /57 (H2N2) Невосстанавливающие NIBSC 00/440 1:1000 Кролика к антигенам овцы (ЛК 313-035-045) 1:10 000
НЗ А/Брисбен/10 /2007 (H3N2) Невосстанавливающие TGAAS393 1:4000 Кролика к антигенам овцы (JIR 313-035-045) 1:10 000
НЗ А/Брисбен/10 /2007 (H3N2) Невосстанавливающие NIBSC 08/136 1:1000 Кролика к антигенам овцы (JIR 313-035-045) 1:10 000
НЗ А/Висконсин/67/ 2005 (H3N2) Невосстанавливающие NIBSC 05/236 1:1000 Кролика к антигенам овцы (ЛЯ 313-035-045) 1:10 000
Н5 А/Индонезия/5/2 005 (H5N1) Восстанавливающие ITC IT-003- 005V 1:4000 Козы к антигенам кролика (JIR 111035-144) 1:10 000
Н5 А/Аньхой/1/ 2005 (H5N1) Восстанавливающие NIBSC 07/338 1:750 Кролика к антигенам овцы (ЛЯ 313-035-045) 1:10 000
Н5 А/Вьетнам/1194/ 2004 (H5N1) Невосстанавливающие ITC IT-003- 005 1:2000 Козы к антигенам кролика (ЛЯ 111- 035-144) 1:10 000
Н6 А/ дикие утки /Гонконг/\У312/9 7 (H6N1) Невосстанавливающие BEI NR 663 1:500 Кролика к антигенам овцы (ЛЯ 313-035-045) 1:10 000
Н7 А/Лошади/Прага/ 56 (H7N7) Невосстанавливающие NIBSC 02/294 1:1000 Кролика к антигенам овцы (ЛЯ 313-035-045) 1:10 000
Н9 А/Гонконг/1073/ 99 (H9N2) Восстанавливающие NIBSC 07/146 1:1000 Кролика к антигенам овцы (ЛЯ 313-035-045) 1:10 000
В В/Малайзия/25 06/2004 Невосстанавливающие NIBSC 07/184 1:2000 Кролика к антигенам овцы (ЛЯ 313-035-045) 1:10 000
В В/Флорида/4/ 2006 Невосстанавливающие NIBSC 07/356 1:2000 Кролика к антигенам овцы (ЛЯ 313-035-045) 1:10 000
FII: Fitzgerald Industries International, Конкорд, Миннесота, США;
NIBSC: Национальный институт биологических стандартов и контроля (National Institute for Biological Standards and Control);
JIR: Jackson ImmunoResearch, Вест-Грув, Пенсильвания, США;
BEI NR: Репозиторий исследовательских ресурсов по биозащите и новым инфекциям (Biodefense and emerging infections research resources repository);
ITC: Immune Technology Corporation, Вудсайд, Нью-Йорк, США;
TGA: Управление лечебной продукции (Therapeutic Goods Administration), Австралия.
- 54 034733
Определение гемагглютинации H5 основано на способе, описанном в публикации Nayak and Reichl (2004). Кратко, готовили серию двукратных разведений испытуемых проб (100 мкл) в V-образных 96луночных планшетах для микротитрования, содержащих 100 мкл солевого фосфатного буфера (PBS), помещая 100 мкл разведенного образца в каждую лунку. В каждую лунку добавляли 100 мкл 0,25%-ной суспензии эритроцитов индейки (Bio Link Inc., Сиракузы, Нью-Йорк) и инкубировали 2 ч при комнатной температуре. Обратную величину максимального разведения, при котором еще происходила полная гемагглютинация, записывали как активность HA. Параллельно разводили в PBS стандартный образец рекомбинантного HA (А/Вьетнам/1203/2004 H5N1) (Protein Science Corporation, Мериден, Коннектикут) и помещали на каждый планшет в качестве контроля.
7. Ультрацентрифугирование в градиенте сахарозы.
По 1 мл фракций 9, 10 и 11, полученных при гель-хроматографии Ш-содержащей биомассы, объединяли, помещали в ступенчатый градиент плотности сахарозы (20-60% мас./об.) и центрифугировали в течение 17,5 ч при 125000xg (4°C). Градиент фракционировали на 19 фракций объемом 3 мл, начиная с верхней фракции, и диализом удаляли сахарозу перед проведением иммунологического анализа и анализа гемагглютинации.
8. Электронная микроскопия.
Для исследования по 100 мкл образцов помещали в пробирки ультрацентрифуги Airfuge (Beckman Instruments, Пало Альто, Калифорния, США). На дно пробирок ставили сетки и центрифугировали в течение 5 мин при 120000 g. Сетку вынимали, осторожно сушили и помещали на каплю 3%-ной фосфовольфрамовой кислоты при pH 6 для окрашивания. Сетки исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) Hitachi 7100 (микрофотографии приведены на фиг. 14B, 15B и 15C).
Для получения микрофотографий (фиг. 19) фрагменты листа размером около 1 мм3 фиксировали в буфере PBS, содержащем 2,5% глутарового альдегида, и промывали PBS, содержащим 3% сахарозы, а затем дофиксировали 1,33%-ным тетраоксидом осмия. Фиксированные образцы заключали в смолу Spurr, и ультратонкие пленки помещали на сетку. Перед исследованием образцы окрашивали 5%-ным раствором уранилацетата и 0,2%-ным раствором цитрата свинца. Сетки исследовали под просвечивающим электронным микроскопом Hitachi 7100.
9. Анализ липидов плазматической мембраны.
Плазматические мембраны (ПМ) получали из листьев табака и культивированных клеток BY2 после фракционирования, как описано Mongrand et al., распределяя их в водно-полимерной двухфазной системе, содержащей полиэтиленгликоль 3350/декстран T-500 (по 6,6%). Все стадии проводили при 4°C.
Липиды экстрагировали из разных фракций и очищали по методу Блая и Дайера. Полярные и нейтральные липиды разделяли одномерной высокоэффективной ТСХ с системами растворителей, описанными Lefebvre et al. Липиды фракций ПМ обнаруживали после окрашивания ацетатом меди, как описано в работе Macala et al. Липиды идентифицировали сравнением их времени миграции со стандартом (все стандарты были получены от фирмы Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США, кроме SG, который был получен от Matreya, Плезант Гэп, Пенсильвания, США).
10. Очистка ВЧ H5 (А/Индонезия/5/2005).
Замороженные листья растения N. benthamiana, инфильтрованные конструкцией 660, гомогенизировали в 1,5 объемах 50 мМ Трис, pH 8, 150 мМ NaCl и 0,04% метабисульфита натрия с помощью в коммерческого блендера. К полученному экстракту добавляли 1 мМ фенилметансульфонилфторида (ФМСФ). Величину pH приводили к 6 добавлением 1 М уксусной кислоты, после чего нагревали при 42°C в течение 5 мин. К термообработанному экстракту прибавляли диатомовую землю (ДЗ) для адсорбции примесей, осажденных при сдвиге pH и термообработке, и полученную массу фильтровали через фильтр из ватмана. Полученный прозрачный экстракт центрифугировали при 10000xg в течение 10 мин при комнатной температуре для удаления остатков ДЗ, пропускали через фильтры Acropack 20, 0,8/0,2 мкм, и наносили на колонку для аффинной хроматографии с фетуин-агарозой (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). После стадии промывки в 400 мМ NaCl, 25 мМ Трис, pH 6, связанные белки элюировали 1,5 М NaCl, 50 мМ MES, pH 6. К элюированным ВЧ добавляли Твин-80 до концентрации 0,0005 об.%. Полученные ВЧ концентрировали на мембране MWCO Amicon, 100 кДа, центрифугировали при 10000xg в течение 30 мин при 4°C и повторно суспендировали в буфере PBS, pH 7,4, содержащем
0.01% Твин-80 и 0,01% тимерозала. Суспендированные ВЧ стерилизовали фильтрацией перед использованием.
11. Испытание на животных.
Мыши.
Для исследования иммунного ответа на введение ВЧ брали самок мышей линии BALB/c (Charles River Laboratories) возрастом 6-8 недель. Семьдесят мышей случайным образом делили на 14 групп по пять животных в каждой. В восьми группах проводили внутримышечную иммунизацию, а в шести группах - интраназальную. Во всех группах иммунизацию проводили по двухдозовой схеме, причем добавочную дозу вводили через три недели после первой.
- 55 034733
При внутримышечной иммунизации в заднюю лапу мыши вводили без анестезии либо полученную в растении вакцину ВЧ H5 (А/Индонезия/5/2005 (H5N1) (0,1, 1, 5 или 12 мкг), либо контроль - антиген гемагглютинин (H5). Контрольный H5 представлял собой рекомбинантный растворимый гемагглютинин, полученный на основе штамма А/Индонезия/5/05 H5N1 и выделенный из культуры клеток 293 (Immune Technology Corp., Нью-Йорк, США) (применяли 5 мкг на 1 инъекцию, если не указано иное). В качестве контроля служил буфер PBS. Данный антиген состоит из аминокислот 18-530 белка HA и имеет His-tag и модифицированный сайт расщепления. Данными электронной микроскопии подтверждено, что данный товарный продукт не находится в форме ВЧ.
Для выявления влияния адъюванта двум группам животных вводили 5 мкг полученной в растении вакцины ВЧ H5 плюс один объем 2% Al-гидрогеля (квасцы, Accurate Chemical & Scientific Corporation, Вестбери, Нью-Йорк, США) либо 5 мкг рекомбинантного гемагглютинина, выделенного из культуры клеток 293 плюс 1 объем квасцов. 70 мышей случайным образом делили на 14 групп по пять животных в каждой. В восьми группах проводили внутримышечную иммунизацию, а в шести группах - интраназальную. Во всех группах иммунизацию проводили по двухдозовой схеме, причем добавочную дозу вводили через три недели после первой.
При внутримышечной иммунизации в заднюю лапу мыши вводили без анестезии либо полученную в растении вакцину ВЧ H5 (0.1, 1, 5 или 12 мкг), либо контроль - антиген гемагглютинин (5 мкг), либо PBS. Перед иммунизацией все препараты антигена смешивали в отношении 1:1 с 1% Al-гидроогеля (квасцы, 20 Accurate Chemical & Scientific Corporation, Вестбери, Нью-Йорк, США). Для оценки влияния адъюванта двум группам животных вводили либо 5 мкг полученной в растении вакцины ВЧ H5, либо 5 мкг контроля - антигена HA без адъюванта.
При интраназальном введении мыши получали кратковременную анестезию вдыханием изофлурана в автоматической индукционной камере, после чего проводили иммунизацию введением в каждую ноздрю по капле (4 мкл) полученной в растении ВЧ-вакцины (0,1 или 1 мкг), контроля - антигена HA (1 мкг) или PBS. Перед иммунизацией все препараты антигена были смешаны с 1% хитозан глутамата (Protosan, Novamatrix/FMC BioPolymer, Норвегия). Затем мыши вдыхали растворы. Для оценки влияния адъюванта при интраназальном пути введения двум группам животных проводили иммунизацию 1 мкг полученной в растении вакцины ВЧ H5 или 1 мкг контроля - антигена HA.
Хорьки.
Для испытания брали 10 групп по 5 хорьков (самцы, возраста 18-24 недели, массой около 1 кг). Схема иммунизации для каждой группы приведена в табл. 8. В качестве адъюванта применяли Alгидроогель (квасцы) (Superfos Biosector, Дания), 2% (окончательно:=1%). В состав вакцины входили мембраноассоциированные ВЧ штамма А/Индонезия/5/05 (H5N1), полученные как описано в настоящем документе. Контрольная вакцина (положительный контроль) представляла собой полностью гликозилированный, связанный с мембраной рекомбинантный H5 из штамма Индонезия, полученный с помощью аденовируса в культуре клеток 293 компанией Immune Technology Corporation (ITC).
Таблица 8
Схемы иммунизации по группам
Группа η Продукт, введенный животным Адъювант
1 5 буфер PBS (отрицательный контроль) Β.Μ.* -
2 5 испытуемая вакцина, 1 мкг в.м. -
3 5 испытуемая вакцина, 1 мкг в.м. квасцы
4 5 испытуемая вакцина, 5 мкг в.м. -
5 5 испытуемая вакцина, 5 мкг в.м. квасцы
6 5 испытуемая вакцина, 7.5 мкг в.м. -
7 5 испытуемая вакцина, 15 мкг в.м. -
8 5 испытуемая вакцина, 15 мкг в.м. квасцы
9 5 испытуемая вакцина, 30 мкг в.м. -
10 5 вакцина-контроль, 5 мкг в.м. -
*в.м.: внутримышечно.
В ходе испытаний регулярно оценивали общее состояние и внешний вид хорьков (массу тела, ректальную температуру, положение тела, мех, траектории перемещения, дыхание, помет). Животные получали внутримышечные инъекции (общий объем 0,5-1,0) в четырехглавую мышцу на 0-, 14- и 28-е сутки (для схем, включающих адъювант, вакцину смешивали с Al-гидроогелем в отношении 1:1 по объему непосредственно перед иммунизацией). Образцы сыворотки отбирали на 0-е сутки (перед иммунизацией) и на 21- и 35-е сутки. Животных забивали (обескровливание/сердечная пункция) на 40-45-е сутки, селезен- 56 034733 ку забирали для исследования и проводили вскрытие.
Титры антител против вируса гриппа можно определить твердофазным ИФА (ELISA) с помощью гомо- или гетерологичных инактивированных вирусов H5N1.
Титры антител ингибирования гемагглютинации образцов сыворотки (до вакцинации, 21-е сутки, 35-е сутки) оценивали методом микротитрования HAI, как описано в работе (Aymard et al., 1973). Кратко, сыворотки предварительно обрабатывали рецептор-разрушающим ферментом, термически инактивировали и смешивали с суспензией эритроцитов (отмытые красные кровяные клетки). Рекомендуются отмытые эритроциты лошади (10%) производства компании Lampire, и, учитывая, что результаты анализа могут различаться в зависимости от источника эритроцитов (в зависимости от лошади), испытывали отмытые эритроциты от 10 лошадей и выбирали наиболее чувствительную партию. В качестве альтернативы возможно применение эритроцитов индейки. Титры антител выражали как обратную величину максимального разведения, при котором гемагглютинация еще полностью ингибируется.
Титры перекрестного ответа HAI: титры HAI хорьков, привитых вакциной против штамма А/Индонезия/5/05 (клада 2.1), определяли с помощью инактивированных штаммов гриппа H5N1 из другой субклады или клады, например штаммов клады 1 Вьетнам-А/Вьетнам/1203/2004 и А/Вьетнам/1194/2004, или А/Аньхой/01/2005 (субклада 2.3), или А/индейки/Турция/1/05 (субклада 2.2). Все анализы проводили на индивидуальных образцах.
Анализ полученных данных: статистический дисперсионный анализ (ANOVA) проводили для всех полученных данных с целью выяснения, являются ли обнаруженные различия статистически значимыми.
Методика эксперимента по летальному инфицированию (мыши).
128 мышей случайным образом делили на 16 групп по восемь животных в каждой, при этом одна группа не получала ни прививки, ни инфицирования (отрицательный контроль). Все группы прививали внутримышечно по двухдозовой схеме, причем добавочную дозу вводили через две недели после первой.
При внутримышечной иммунизации в задние лапы мышей вводили без анестезии либо полученную в растении вакцину ВЧ H5 (1, 5 или 15 мкг), либо антиген HA в качестве контроля (15 мг), либо PBS. Перед иммунизацией все препараты антигена смешивали с одним объемом 1%-ного Al-гидроогеля (квасцы, Accurate Chemical & Scientific Corporation, Вестбери, Нью-Йорк, США).
В период иммунизации мышей взвешивали один раз в неделю и осматривали место укола для обнаружения местной реакции.
Через 22 суток после второй иммунизации проводили контрольное заражение мышей после анестезии в лаборатории системной защиты BL4 (P4-Jean Merieux-INSERM, Лион, Франция) интраназально (и.н.) действием дозы 4,09x106 50%-ной клеточной культуры (CCID50), инфицированной вирусом гриппа А/Турция /582/06 (любезно предоставлена Др. Бруно Лина, Лионский Университет, Лион, Франция). После заражения вели наблюдение за мышами для обнаружения клинических симптомов и мышей ежедневно взвешивали в течение 14 суток. Мышей с тяжелыми симптомами инфекции и с потерей массы более >25% усыпляли под анестезией.
Сбор крови, смывы из легких и из носа и сбор селезенок.
Сбор крови из боковой подкожной вены проводили без анестезии через 14 суток после первой иммунизации и через 14 суток после повторной иммунизации. Сыворотку собирали центрифугированием при 8000xg в течение 10 мин.
Через четыре недели после второй иммунизации мышам давали наркоз в виде газообразного CO2 и сразу после окончания проводили сердечную пункцию для забора крови.
После забора крови вводили в трахею катетер в направлении легких и в шприц малой емкости, присоединенный к катетеру, помещали 1 мл холодного раствора коктейля ингибиторов протеаз в PBS, затем впрыскивали раствор в легкие и отбирали на анализ. Указанную процедуру промывки повторяли дважды. Смывы из легких центрифугировали для удаления продуктов распада клеток. Для получения смывов из носа катетер вводили в носовую область, через катетер в носовой ход впрыскивали 0,5 мл раствора коктейля ингибиторов протеаз в PBS и собирали жидкость. Смывы из носа центрифугировали для удаления продуктов распада клеток. Селезенки собирали у мышей, получивших внутримышечную иммунизацию полученной в растении вакциной (5 мкг) с адъювантом или рекомбинантным антигеном H5 (5 мкг) с адъювантом, а также у мышей, получивших интраназальную иммунизацию полученной в растении вакциной (1 мкг) с адъювантом или рекомбинантным антигеном H5 (1 мкг) с адъювантом. Собранные селезенки помещали в среду RPMI с добавлением гентамицина и измельчали в конической пробирке объемом 50 мл поршнем шприца на 10 мл. Измельченные селезенки дважды промывали и центрифугировали при 2000 об/мин в течение 5 мин, а затем повторно суспендировали в буфере для лизиса ACK в течение 5 мин при комнатной температуре. Спленоциты промывали смесью PBS - гентамицин, повторно суспендировали в 5%-ной среде RPMI и считывали. Спленоциты служили для анализа пролиферации.
Титы антител.
Титры антител к вирусу гриппа в сыворотках определяли через 14 суток после первой иммунизации, а также через 14 и 28 суток после второй иммунизации. Титры определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (тИФА) с использованием инактивированного вируса А/Индонезия/5/05 в
- 57 034733 качестве антигена покрытия. Конечные титры выражали в виде обратной величины максимального разведения, при котором величина оптической плотности была хотя бы на 0,1 выше, чем в образцах отрицательного контроля.
Для определения класса антител (IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM) оценивали титры методом тИФА, как описано ранее.
Титры ингибирования гемагглютинации (HI).
Титры ингибирования гемагглютинации (HI) сывороток определяли через 14 и 28 суток после второй иммунизации, как описано ранее (WHO 2002; Kendal 1982). Для тестирования образцов мышиной сыворотки на активность HI использовали инактивированные вирусы штаммов А/Индонезия/5/05 и А/Вьетнам/1203/2004. Предварительно сыворотки обрабатывали рецептор-разрушающим ферментом II (RDE II) (Denka Seiken Co., Токио, Япония), полученным из Vibrio cholerae (Kendal 1982). Измерение HI проводили с 0,5% эритроцитов индейки. Титры антител HI выражали в виде обратной величины максимального разведения, при котором еще наблюдалось полное ингибирование агглютинации.
Примеры
Пример 1. Временная экспрессия гемагглютинина вируса гриппа А/Индонезия/5/05 (H5N1) при агроинфильтрации в растения N. Benthamiana.
Способность систем временной экспрессии продуцировать гемагглютинин вируса гриппа определяли при экспрессии подтипа H5 из штамма А/Индонезия/5/05 (H5N1). Как показано на фиг. 11, кодирующую последовательность гена гемагглютинина (GenBank рег. № EF541394) с нативным сигнальным пептидом и трансмембранным доменом собирали сначала в виде кассеты экспрессии на основе пластоцианина, включающей участки промотора, 5HTO, 3'HTO и участок терминации транскрипции из гена пластоцианина люцерны, затем собранную кассету (660) вставляли в бинарную плазмиду pCAMBIA. Указанную плазмиду трансфицировали в Agrobacterium (AGL1), создавая рекомбинантный штамм AGL1/660, который и использовали для временной экспрессии.
Проводили инфильтрацию растения N. benthamiana штаммом AGL1/660 и после инкубации в течение шести суток собирали листья. Для подтверждения накопления H5 в агроинфильтрованных листьях сначала экстрагировали белок из ткани листьев, а затем проводили вестерн-блоттинг с поликлональными антителами против H5 (Вьетнам). В экстрактах обнаруживалась единственная полоса при 72 кДа (фиг. 12), что соответствует по размеру нерасщепленной форме HA0 гемагглютинина вируса гриппа. Товарный H5, служивший положительным контролем (А/Вьетнам/1203/2004; Protein Science Corp., Мериден, Коннектикут, США), давал две полосы около 48 и 28 кДа, что соответствует молярной массе фрагментов HA1 и HA2. Таким образом, экспрессия H5 в инфильтрованных листьях приводит к накоплению нерасщепленного продукта трансляции.
Образование активных тримеров HA было подтверждено по способности сырых экстрактов белка из листьев, трансформированных AGL1/660, агглютинировать эритроциты индейки (данные не показаны).
Пример 2. Исследование гемагглютинин-содержащих структур в экстрактах растений методом эксклюзионной хроматографии.
Организацию полученного в растении гемагглютинина вируса гриппа в высокомолекулярные структуры оценивали методом гель-хроматографии. Сырые экстракты белка растений, инфильтрованных AGL1/660 (1,5 мл), фракционировали методом эксклюзионной хроматографии (ЭХ) на колонках Sephacryl™ S-500 HR (GE Healthcare Bio-Science Corp., Пискатавэй, Нью-Джерси, США). В элюированных фракциях определяли общее содержание белка и содержание HA методом иммунологического анализа с антителами против HA (фиг. 13A). Как видно на фиг. 13A, основное количество голубого декстрана (2 МДа) при элюировании находилось во фракции 10, а основная масса белков-хозяев оставалась в колонке и выходила между фракциями 14 и 22. После (пятикратного) концентрирования белков из 200 мкл каждой фракции ЭХ осаждением ацетоном с последующим анализом методом вестернблоттинга (фиг. 15A, H5) гемагглютинин (H5) был обнаружен в основном во фракциях 9-14 (фиг. 13В). Не желая ограничиваться конкретной теорией, можно предположить, что белок HA либо организован в крупную сверхструктуру, либо присоединен к высокомолекулярной структуре.
Вторую экспрессирующую кассету собирали с последовательностью нуклеиновой кислоты H1 из штамма А/Новая Каледония/20/99 (H1N1) (SEQ ID NO: 33; фиг. 16; GenBank рег. № AY289929), что давало конструкцию 540 (фиг. 11). Конструкцию химерного гена создавали таким образом, что получалась растворимая тримерная форма H1, где сигнальный пептид происходил из гена протеиндисульфидизомеразы растительного происхождения, а трансмембранный домен H1 был заменен вариантом pII лейциновой застежки GCN4 - пептидом, который известен самоорганизацией в тримеры (Harbury et al., 1993) (кассета 544, фиг. 11). Несмотря на отсутствие трансмембранного домена, данная растворимая тримерная форма оказалась способна к гемагглютинации (данные не показаны).
Экстракты белка из растений, инфильтрованных AGL1/540 или AGL1/544, фракционировали методом ЭХ, и наличие H1 в элюированных фракциях определяли методом вестерн-блоттинга с антителами против вируса гриппа A (Fitzgerald, Конкорд, Миннесота, США). В листьях, инфильтрованных AGL1/540, H1 преимущественно накапливался в виде высокомолекулярной структуры, при этом пик был
- 58 034733 скошен к структурам меньшего размера (H1; фиг. 13C). В листьях, инфильтрованных AGL1/544, накапливалась растворимая форма H1 в виде изолированных тримеров, как показывает совпадение профиля элюирования при гель-хроматографии с профилями элюирования белка-хозяина (растворимый H1; фиг. 13D). При этом розеточный H1 (Protein Science Corp., Мериден, Коннектикут, США), состоящий из мицелл, включающих 5-6 тримеров гемагглютинина, выходил во фракциях 12-16 (фиг. 13E), т.е. ранее, чем растворимая форма H1 (фиг. 13D), но позже, чем нативный H1 (фиг. 13C).
Для оценки влияния коэкспрессии M1 на организацию гемагглютинина в структуры собирали кассету экспрессии M1 с нуклеиновой кислотой, соответствующей кодирующей последовательности A/PR/8/34 (H1N1) M1 (SEQ ID NO: 35; фиг. 18; GenBank рег. № NC-002016). Конструкция получила название 750, она представлена на фиг. 11. Для коэкспрессии M1 и H1 равные объемы суспензий AGL1/540 и AGL1/750 смешивали перед инфильтрацией. Совместная инфильтрация множественными суспензиями Agrobacteriums позволяет проводить коэкспрессию множественных трансгенов. Вестерн-блоттинг фракций ЭХ показывает, что коэкспрессия M1 не меняет профиль элюирования структур H1, но снижает уровень накопления H1 в листьях после агроинфильтрации (см. фиг. 13F).
Пример 3. Выделение структур H5 центрифугированием в градиенте сахарозы и исследование под электронным микроскопом.
Для исследования структуры гемагглютинина под электронным микроскопом (ЭМ) требуются более высокая концентрация и уровень очистки, чем можно получить в результате ЭХ сырых экстрактов белка из листьев. Чтобы провести исследование структуры H5 с помощью ЭМ, сырой экстракт белка из листьев концентрировали осаждением ПЭГ (20% ПЭГ), затем повторно суспендировали в 1/10 объема буфера для экстракции. Концентрированный экстракт белка фракционировали с помощью гельхроматографии на S-500 HR и фракции 9, 10 и 11 (в соответствии со свободным объёмом колонки) объединяли и далее отделяли от белков хозяина ультрацентрифугированием на 20-60%-ном градиенте плотности сахарозы. Градиент плотности сахарозы фракционировали, начиная с верхней фракции, и перед проведением анализа фракции диализовали и концентрировали на центробежном фильтре 100 NMWL (номинальный предел молекулярной массы). Как показывают результаты вестерн-блоттинга и исследования гемагглютинации (фиг. 14A), H5 в основном накапливался во фракциях 16-19, где содержалось около 60% сахарозы, а основное количество белков хозяина оказалось во фракции 13. Фракции 17, 18 и 19 объединяли, негативно окрашивали и исследовали под ЭМ. В образце отчетливо наблюдались структуры сферической формы с зазубренными краями размером от 80 до 300 нм, которые по морфологическим характеристикам соответствовали ВЧ вируса гриппа (фиг. 14B).
Пример 4. Очистка ВЧ вируса гриппа H5 из растительной биомассы.
Помимо значительного содержания растворимого белка, экстракты из листьев растений содержат сложную смесь растворимых сахаров, нуклеиновые кислоты и липиды. Сырой экстракт осветляли изменением pH и термической обработкой с последующей фильтрацией через диатомовую землю. (Более подробное описания метода осветления приведено в разделе Материалы и методы). На фиг. 15А (дорожки 1-4) представлен окрашенный кумасси синим гель, показывающий содержание белка на различных стадиях процесса осветления. Сравнение содержания белка в сыром экстракте (дорожка 1) и в осветленном экстракте (дорожка 4) показывает снижение суммарного содержания белка и удаление большей части основной примеси, которая наблюдается в сыром экстракте из листьев при 50 кДа, на различных стадиях процесса осветления. Полоса при 50 кДа относится к большой субъединице RuBisCO, к которой относится до 30% суммарного белка листьев.
Из осветленных экстрактов выделяли ВЧ H5 вируса гриппа методом аффинной хроматографии на колонке с фетуином. Сравнение фракции, помещенной на колонку (фиг. 15A, дорожка 5), с проходящими (фиг. 15A, дорожка 6) и элюированными ВЧ (фиг. 15A, дорожка 7) показывает специфичность колонки с фетуином в отношении ВЧ
H5 вируса гриппа в осветленном растительном экстракте.
В результате процесса очистки достигается чистота H5 более 75% по данным денситометрии на ДДС-Na/ПААГ геле, окрашенном кумасси синим (фиг. 15A, дорожка 7). Для оценки структурного качества очищенного продукта очищенный H5 концентрировали на центробежном фильтре 100 NMWL (номинальный предел молекулярной массы), а затем исследовали под ЭМ после негативного окрашивания. На фиг. 15B приведен репрезентативный участок, на котором видно присутствие большого количества ВЧ. Более тщательное исследование показывает наличие выступов на ВЧ (фиг. 15C).
Как показано на фиг. 15D, после аффинной хроматографии на колонке с фетуином ВЧ H5, выделенные из осветленного экстракта листьев, имели степень чистоты около 89% на основе плотности окрашенного кумасси синим гемагглютинина H5 и на основе определения суммарного содержания белка методом с бицинхониновой кислотой (ВСА).
Биологическую активность ВЧ HA подтверждали по их способности агглютинировать эритроциты индейки (данные не приведены).
Данные фиг. 15D подтверждают идентичность очищенных ВЧ, визуализованных методом вестерн-блоттинга и иммунологического анализа с поликлональной сывороткой против H5 (А/Вьетнам/1203/2004). Обнаруживается единственная полоса при 72 кДа, что соответствует нерасщеп- 59 034733 ленной форме HA0 гемагглютинина вируса гриппа. На фиг. 15C приведено строение вакцины, представляющей собой ВЧ с покрывающими ее гемагглютининновыми выступами.
Для иммунизации мышей ВЧ вводили в состав рецептуры путем фильтрации через фильтр с размером отверстий 0.22 мкм; содержание эндотоксина определяли с помощью набора для LAL-теста (лизат амебоцитов Лимулюс) на эндотоксины (Lonza, Уолкервиль, Миссури, США). Фильтрованная вакцина содержала 105.8 ±11.6% ЭдЕ/мл (эндотоксиновых единиц/мл).
Пример 5. Локализация ВЧ вируса гриппа в растениях.
Для локализации ВЧ и подтверждения их образования из плазматической мембраны готовили тонкие срезы листьев Ш-продуцирующих растений и исследовали их методом ПЭМ после положительного окрашивания. Исследование клеток листьев указывает на наличие ВЧ во внеклеточных кавернах, образованных при втягивании плазматической мембраны (фиг. 19). Форма и расположение наблюдаемых ВЧ показывают, что, несмотря на аппозицию их плазматических мембран на стенке клетки, клетки растения обладают достаточной пластичностью для продуцирования ВЧ вируса гриппа из своей плазматической мембраны и накопления их в апопластическом пространстве.
Пример 6. Анализ липидов плазматической мембраны.
Дальнейшее подтверждение состава и происхождения ВЧ вируса гриппа в растениях было получено при анализе содержания липидов. Липиды экстрагировали из очищенных ВЧ и их состав сравнивали с составом липидов высоко очищенной плазматической мембраны табака методом высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭ-ТСХ). Траектории миграции полярных и нейтральных липидов из ВЧ и плазматических мембран, использованных в качестве контроля, были аналогичны. Очищенные ВЧ содержали основные фосфолипиды (фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин) и сфинголипиды (гликозил-церамид), присутствующие в плазматической мембране (фиг. 27A), а также в обоих случаях обнаружены свободные стерины как единственный вид нейтральных липидов (фиг. 27B). Однако иммунологический анализ белка-маркера плазматической мембраны (АТФаза) в экстрактах очищенных ВЧ показал, что липидный бислой ВЧ не содержит одного из основных белков, ассоциированного с плазматическими мембранами растений, что позволяет предположить, что белки-хозяева могли уйти из мембран в ходе почкования ВЧ из клеток растения (фиг. 27C).
Пример 7. Иммуногенность ВЧ H5 и роль способа введения.
Мышам вводили полученные в растении ВЧ H5 путем внутримышечной инъекции или интраназальной ингаляции. Внутримышечно вводили от 0,1 до 12 мкг ВЧ с квасцами в качестве адъюванта в соответствии с описанными способами. Максимальные титры антител наблюдали при минимальном количестве антигена, соответствующем 5 мкг рекомбинантного растворимого гемагглютинина (H5) (фиг. 20A).
От 0,1 до 1 мкг полученных в растении ВЧ H5 вводили интраназально с хитозаном в качестве адъюванта а, получая более значительный гуморальный иммунный ответ, чем для рекомбинантного растворимого H5 с квасцами в роли адъюванта (фиг. 20B).
При обоих способах введения и во всем интервале количества антигена сероконверсию наблюдали для всех испытуемых мышей. Рекомбинантный растворимый антиген H5 вызывал низкий (<1/40) или пренебрежимо малый (1<1/10 в случае рекомбинантных H5 без адъюванта) титр HI.
Пример 8. Титр антител по ингибированию гемагглютинации (HAI) для ВЧ H5.
Фиг. 21A, B показывает гуморальный ответ по ингибированию гемагглютинации (HAI) через 14 суток после добавочной иммунизации полученными в растении ВЧ H5 или рекомбинантным растворимым H5. Наименьшая доза антигена (0,1 мкг) при внутримышечном введении приводила к более высокому ответу чем десятикратная доза (5 мкг) рекомбинантного растворимого H5. Более высокие дозы ВЧ H5 приводили к незначительному повышению HAI по сравнению с минимальной дозой.
Ответ HAI после интраназального введения мышам полученных в растении ВЧ H5 (1,0 или 0,1 мкг) был значительно выше, чем в случае введения 1 мкг рекомбинантного растворимого H5, где результат был близок к отрицательному контролю. Все мыши, получившие внутримышечную инъекцию ВЧ H5 (от 0,1 до 12 мкг), имели более высокие титры, чем мыши, получившие прививку контрольным антигеном H5 (фиг. 21A). Для одной и той же дозы, равной 5 мкг, ВЧ приводили к образованию в 20 раз более высоких титров HAI, чем контрольный антиген H5. Также ВЧ давали значительно более высокие титры HAI по сравнению с контрольным антигеном HA при интраназальном введении (фиг. 21b). При одной и той же дозе ВЧ H5 уровень титров HAI был ниже для мышей, получивших прививку интраназально по сравнению с внутримышечной иммунизацией; 1 мкг ВЧ приводил к среднему титру HAI, равному 210, при в.м. введении, а та же доза при и.н. введении вызывала ответ титра HAI, равный 34.
При внутримышечном введении все дозы ВЧ вызывали появление высокого уровня антител, способных связывать гомологичные цельные инактивированные вирусы (фиг. 20A и 24). Между вакциной на основе полученных в растении ВЧ и контрольным антигеном H5 не обнаружено значимых различий (не считая группы, получившей 12 мкг ВЧ, через 14 суток после дополнительной прививки), так как оба препарата антигенов приводят к появлению высоких титров связывающих антител против гомологичных штаммов. Однако при интраназальном введении ВЧ вызывали образование более высоких титров связывающих антител, чем контрольный антиген H5 (фиг. 20B). После иммунизации 1 мкг ВЧ в смеси с хито- 60 034733 заном средняя обратная величина титра антител составляла 5500, что в 8,6 раз выше, чем уровень, обнаруженный для мышей после иммунизации 1 мкг контрольного антигена HA (средняя обратная величина тира - 920).
Далее иммуногенность ВЧ вируса гриппа растительного происхождения исследовали на мышах при варьировании дозы. Группы из пяти мышей линии BALB/c получали внутримышечную прививку (двукратно с интервалом в три недели) 0,1-12 мкг ВЧ, содержащих HA из штамма А/Индонезия/5/05 (H5N1) в смеси с квасцами (в отношении 1:1). Титры ингибирования агглютинации (H1 или HAI) измеряли с помощью цельного инактивированного антигена вируса (А/Индонезия/5/05 (H5N1)) на сыворотках, собранных через 14 суток после повторной иммунизации. Иммунизация ВЧ в дозах лишь 0,1 мкг индуцировала продукцию антител, которые ингибировали агглютинацию эритроцитов вирусами при большом разведении (фиг. 21A). Параллельная иммунизация мышей 5 мкг контрольного антигена H5 (также из штамма А/Индонезия/5/05), не являющегося ВЧ, но содержащего адъювант - квасцы, вызывает ответ HI, уступающий ответу, достигнутому с наиболее низкой дозой ВЧ, на 2-3 логарифмических единицы.
При обоих способах введения и во всем интервале количеств антигена более высокий ответ HAI был получен у мышей, получавших ВЧ.
Пример 9. Влияние адъюванта на иммуногенность ВЧ H5.
Полученные в растении ВЧ H5 образованы из плазматической мембраны (фиг. 19, пример 5). Не желая ограничиваться конкретной теорией, считают, что оболочечные вирусы или ВЧ оболочечных вирусов обычно приобретают свою оболочку из мембраны, через которую они почкуются. Плазматические мембраны растений содержат фитостериновый комплемент, который редко (если вообще когда-либо) обнаруживается в клетках животных, причем для некоторых из этих стеринов была показана способность проявлять иммуностимулирующие действия.
Полученные в растении ВЧ H5 вводили мышам внутримышечно (фиг. 22A) или интраназально (фиг. 22B) в присутствии или в отсутствие адъюванта и определяли показатель HAI (гуморальный ответ по подавлению гемагглютинации). ВЧ, введенные с добавлением или без добавления адъюванта (квасцы или хитозан, как в приведенных примерах), при обоих путях введения дали существенно более высокие значения ингибирования гемагглютинина HAI, чем рекомбинантный растворимый H5. Даже в отсутствие добавки адъюванта (т.е. квасцов или хитозана) полученный в растении ВЧ H5 показал достаточно высокую величину HAI, указывающую на системный иммунный ответ на введение антигена.
Квасцы повышали средний уровень титра HAI в 5 раз при внутримышечном введении ВЧ (фиг. 22A) и в 3,7 раз при введении контроля - антигена H5. После в.м. введения 5 мкг ВЧ средний титр HAI был в 12 раз выше, чем при введении соответствующей дозы контрольного антигена H5. Хитозан не изменял средний уровень HAI для контрольного антигена H5 (фиг. 22B), но повышал в пять раз среднюю величину HAI для мышей, получивших 1 мкг ВЧ интраназально.
Пример 10. Изотипы антител.
У мышей, привитых полученным в растении ВЧ H5 или рекомбинантным растворимым H5 в присутствии или в отсутствие добавки адъюванта - квасцов, наблюдали различные изотипы иммуноглобулина (фиг. 23A).
В присутствии добавки адъюванта профили изотипов антител для ВЧ и рекомбинантного H5 аналогичны, доминирующим изотипом является IgG1. При введении ВЧ или рекомбинантного H5 без добавки адъюванта ответ IgG1 снижается, но остается доминирующим ответом изотипа на ВЧ, при этом IgM, IgG2a, IgG2B и IgG3 имеют титры, близкие к случаю присутствия адъюванта. Титры IgG1, IgG2a и IgG2b заметно снижаются при введении рекомбинантного H5 без добавки адъюванта (фиг. 23A).
Таким образом, результаты показывают, что полученные в растении ВЧ не требуют добавки адъюванта для появления гуморального ответа в организме хозяина.
Титры антител против штаммов цельного инактивированного вируса гриппа (А/Индонезия/5/05; А/Вьетнам/1203/04), найденные для мышей, привитых внутримышечно полученными в растении ВЧ или растворимым рекомбинантным HA в присутствии добавки антигена, показаны на фиг. 23B. Значительных различий в титрах антител против этих штаммов гриппа у мышей, получивших 1 мкг или 5 мкг ВЧ или 5 мкг растворимого HA, не обнаружено.
Пример 11. Перекрестный ответ сывороточных антител, индуцированный вакциной на основе ВЧ H5.
Перекрестный ответ сывороточных антител, индуцированный ВЧ H5, определяли по отношению к цельным инактивированным вирусам гриппа различных штаммов. Все дозы ВЧ (от 0,1 до 12 мкг), а также доза 5 мкг контроля - антигена HA индуцировали высокие титры связывающих антител против штамма клады 1 (А/Вьетнам/1194/04), гомологичного штамма клады 2.1 А/Индонезия/5/05 и штамма клады 2.2 А/индейки/Турция/1/05 (фиг. 25A).
Однако только полученные в растении ВЧ индуцировали титр HAI против штамма А/индейки/Турция/1/05 (фиг. 25b). Титры HAI против А/Индонезия/5/05 для ВЧ были высокими.
- 61 034733
Пример 12. Перекрестный иммунитет, вызванный иммунизацией полученными в растении ВЧ H5.
Мышей, которым ранее вводили ВЧ H5 штамма А/Индонезия/5/05 по двухдозовой схеме, как описано выше, подвергали интраназальному контрольному заражению инфективным вирусом гриппа
А/Турция /582/06 (H5N1) (Турция H5N1) и наблюдали. Введенная доза на 1 животное составляла 10 LD50 (4,09х105 CCID50).
На седьмые сутки после заражения только 37.5% мышей, вакцинированных контролем - PBS, остались живыми после воздействия штамма Турция H5N1 (фиг. 26A). После введения контрольного антигена (HA) или 1, 5, или 15 мкг ВЧ H5 Индонезия 100% животных оставались живыми на 17-е сутки после заражения, после чего эксперимент прекращали.
В ходе эксперимента следили также за массой тела мышей и строили график средней массы живых мышей (фиг. 26B). Мыши, которым вводили 1, 5 или 15 мкг ВЧ H5 Индонезия до заражения, не показывали значительной потери массы в ходе эксперимента, в частности мыши, получившие 5 мкг ВЧ, набрали массу. Для мышей группы отрицательного контроля (без заражения штаммом Турция H5N1) не обнаружено ни значительного повышения, ни значительной потери массы тела. Для группы мышей положительного контроля (не получивших ВЧ, но зараженных штаммом Турция H5N1) наблюдали значительную потерю массы тела в ходе эксперимента, и три мыши из этой группы погибли. Так как масса тела считается как средняя величина для всех мышей данной категории, удаление самых больных мышей (три умершие особи) может привести к кажущемуся общему повышению массы. Однако обращает на себя внимание тот факт, что средняя масса тела в группе положительного контроля все же остается значительно ниже, чем в группе отрицательного контроля или в группе, привитой ВЧ.
Таким образом, эти данные демонстрируют, что полученные в растении ВЧ вируса гриппа, включающие вирусный белок гемагглютинин H5, индуцируют иммунный ответ, специфичный для патогенных штаммов гриппа, и что вирусоподобные частицы могут почковаться из плазматической мембраны растения.
Эти данные также показывают, что растения способны продуцировать вирусоподобные частицы вируса гриппа и также впервые показано, что вирусоподобные частицы могут почковаться из плазматической мембраны растения.
С помощью данной технологии временной экспрессии первая партия антигена была изготовлена уже через 16 суток после появления последовательности целевого HA. При существующих выходах ВЧ H5 и при примерной дозе, равной 5 мкг на 1 субъект, каждый килограмм инфильтрованного листа может продуцировать ~20000 доз вакцины. Уникальное сочетание простоты платформы, буферной емкости и высокой иммуногенности обеспечивает, помимо прочих осуществлений, новый вариант ответа в условиях пандемии.
Пример 13. Исследование гемагглютинин-содержащих (H1, H2, H3, H5, H6 и H9) структур в экстрактах растений методом эксклюзионной хроматографии.
Организацию гемагглютинина вирусов гриппа различных подтипов, полученных в растении, в высокомолекулярные структуры оценивали методом гель хроматографии. Сырые или концентрированные экстракты белков из растений, инфильтрованных AGL1/660, AGL1/540-, AGL1/783-, AGL1/780-, AGL1/785- и AGL1/790- (1,5 мл) разделяли на фракции методом эксклюзионной хроматографии (ЭХ) на колонках с Sephacryl™ S-500 HR (GE Healthcare Bio-Science Corp., Пискатвэй, Нью-Йорк, США). Как показано на фиг. 46, голубой декстран (2 МДа) выходил из колонки в основном во фракции 10. Пятикратное концентрирование белков из 200 мкг каждой ЭХ-фракции осаждением ацетоном с последующим вестерн-блоттингом показало (фиг. 46), что гемагглютинины концентрируются во фракциях 7-14, что указывает на внедрение HA в ВЧ. Не желая ограничиваться конкретной теорией, можно полагать, что белок HA либо организован в крупную сверхструктуру, либо присоединен к высокомолекулярной структуре, независимо от продуцированного подтипа. На фиг. 46 показан H1 из штамма А/Новая Каледония/20/1999 и H3 из штамма А/Брисбен/10/2007, полученные из кассет, содержащих сигнальный пептид PDI. Согласно полученным результатам замена нативного сигнального пептида сигнальным пептидом PDI люцерны не влияет на способность HA к организации в частицы.
Пример 14. Временная экспрессия гемагглютинина сезонного вируса гриппа при агроинфильтрации в растения N. benthamiana нуклеотидной последовательности дикого типа.
Способность систем временной экспрессии продуцировать гемагглютинин сезонного вируса гриппа определяли по экспрессии подтипа H1 из штаммов А/Брисбен/59/2007 (H1N1) (плазмида #774), А/Новая Каледония/20/1999 (H1N1) (плазмида #540) и А/Соломоновы острова/3/2006 (H1N1) (плазмида #775), подтипа H3 из штаммов А/Брисбен/10/2007 (плазмида #776) и А/Висконсин/67/2005 (плазмида #777), а также типа B из штаммов В/Малайзия/2506/2004 (линия Виктория) (плазмида #778) и В/Флорида/4/2006 (линия Ямагата) (плазмида #779). Кодирующие последовательности гена гемагглютинина сначала собирали в экспрессирующую кассету на основе пластоцианина, содержащую участки промотора, 5'HTO, 3'HTO и терминации транскрипции из гена пластоцианина люцерны. Собранные кассеты вставляли в бинарную плазмиду pCAMBIA. Плазмиды трансфицировали в Agrobacterium (AGL1), продуцирующие соответственно штаммы Agrobacterium AGL1/774, AGL1/540, AGL1/775, AGL1/776, AGL1/777,
- 62 034733
AGL1/778 и AGL1/779.
Проводили инфильтрацию растения N. benthamiana штаммами AGL1/774, AGL1/540, AGL1/775, AGL1/776, AGL1/777, AGL1/778 и AGL1/779 и после инкубации в течение шести суток собирали листья. Для подтверждения накопления H1 в агроинфильтрованных листьях белки сначала экстрагировали из ткани листьев и анализировали методом вестерн-блоттинга с антителами против HA (антитела и условия детектирования каждого из подтипов НА приведены в табл. 7). В случае HA из штаммов H1 в экстрактах обнаруживалась единственная полоса приблизительно при 72 кДа (фиг. 47), что соответствует по размеру нерасщепленной форме гемагглютинина вируса гриппа НА0. Таким образом, экспрессия гемагглютинина различных ежегодных эпидемических штаммов в инфильтрованных листьях приводит к накоплению нерасщепленного продукта трансляции. При указанных способах экспрессии по данным иммунологического анализа сырых экстрактов белка не обнаружено экспрессии HA вируса гриппа подтипа H3 или типа B (фиг. 47).
Пример 15. Временная экспрессия гемагглютинина потенциально пандемического вируса гриппа агроинфильтрацией в растения N. benthamiana нуклеотидной последовательности дикого типа.
Способность систем временной экспрессии продуцировать гемагглютинины потенциально пандемического штамма вируса гриппа определяли по экспрессии подтипа H5 из штаммов А/Аньхой/1/2005 (H5N1) (плазмида #781), А/Индонезия/5/2005 (H5N1) (плазмида #660) и А/Вьетнам/1194/2004 (H5N1) (плазмида #782), подтипа H2 из штамма А/Сингапур/1/1957 (H2N2) (плазмида #780), H6 из штамма А/дикие утки/Гонконг/\У312/1997 (H6N1) (плазмида # 783), подтипа H7 из штамма А/лошади/Прага/1956 (H7N7) (плазмида #784), а также H9 из штамма А/Гонконг/1073/1999 (H9N2) (плазмида # 785). Кодирующие последовательности гена гемагглютинина сначала собирали в пластоцианин-экспрессирующую кассету, содержащую участки промотора, 5'HTO, 3'HTO и участок терминатора транскрипции из гена пластоцианина люцерны. Собранные кассеты вставляли в бинарную плазмиду pCAMBIA. Плазмиды трансфицировали в Agrobacterium (AGL1), продуцирующий штаммы Agrobacterium AGL1/781, AGL1/660, AGL1/782, AGL1/780, AGL1/783, AGL1/784 и AGL1/785.
Проводили инфильтрацию растения N. benthamiana штаммом AGL1/781, AGL1/660, AGL1/782, AGL1/780, AGL1/784 и AGL1/785 и после инкубации в течение шести суток собирали листья. Для подтверждения накопления H5 в агроинфильтрованных листьях белки экстрагировали из ткани листьев и анализировали методом вестерн-блоттинга с подходящими антителами против HA (антитела и условия обнаружения каждого подтипа HA приведены в табл. 7). В экстрактах из растений, трансформированных конструкциями экспрессии H5 и H2, обнаруживалась единственная полоса около 72 кДа (фиг. 48А и 48D), что соответствует по размеру нерасщепленной форме гемагглютинина вируса гриппа НА0. Таким образом, экспрессия гемагглютинина различных потенциально пандемических штаммов в инфильтрованных листьях приводит к накоплению нерасщепленного продукта трансляции. При указанных способах экспрессии по данным иммунологического анализа сырых экстрактов белка не обнаружено экспрессии HA вируса гриппа подтипов H7 и H9 (фиг. 48B).
Пример 16. Временная экспрессия H5 агроинфильтрацией в растения N. Tabacum.
Способность систем временной экспрессии продуцировать гемагглютинин вируса гриппа в листьях растения Nicotiana tabacum определяли по экспрессии подтипа H5 из штамма А/Индонезия/5/2005 (H5N1) (плазмида #660). Кодирующие последовательности гена гемагглютинина сначала собирали в экспрессирующую кассету на основе пластоцианина, содержащую участки промотора, 5'HTO, 3'HTO и терминатора транскрипции из гена пластоцианина люцерны. Собранные кассеты вносили в бинарную плазмиду pCAMBIA. Плазмиды трансфицировали в Agrobacterium (AGL1), продуцирующие штамм AGL 1/660.
Проводили инфильтрацию растения N. tabacum штаммом AGL 1/660 и после инкубации в течение шести суток собирали листья. Для подтверждения накопления H5 в агроинфильтрованных листьях белки экстрагировали из ткани листьев и анализировали методом вестерн-блоттинга с антителами против H5. В экстрактах обнаруживалась единственная полоса около 72 кДа (фиг. 49), что соответствует по размеру нерасщепленной форме гемагглютинина вируса гриппа НА0. Таким образом, экспрессия гемагглютинина в инфильтрованных листьях N. tabacum приводит к накоплению нерасщепленного предшественника НА0.
Пример 17. Иммуногенность полученной в растении вакцины на основе ВЧ H5N1 из штамма А/Индонезия/5/05 (H5N1) для хорьков.
Для оценки иммуногенности ВЧ растительного происхождения проводили исследование эскалации дозы на хорьках. Перекрестный ответ сывороточных антител in vitro, индуцированный вакциной на основе ВЧ H5 при трех дозах (1, 5 и 15 мкг), оценивали по ингибированию гемагглютинации трех других штаммов H5N1 - А/индейки/Турция/1/05 (клада 2.2), А/Вьетнам/1194/04 (клада 1) и А/Аньхой/5/05 (цельный инактивированный вирус), используя сыворотку, взятую через 14 суток после введения первой дозы вакцины (фиг. 50A) и через 14 суток после введения второй дозы (фиг. 50B). Для трех использованных дозировок наблюдали перекрестный ответ.
- 63 034733
Пример 18. Анализ данных по иммуногенности в соответствии с критериями CHMP (Комитета по медицинским продуктам для человека).
Комитет по медицинским продуктам для человека (CHMP) Европейских медицинских агентств (http://www.emea.europa.eu/htms/general/contacts/CHMP/CHMP.html установил три критерия (применяются после введения второй дозы) для оценки эффективности вакцин: 1) уровень сероконверсии или доля субъектов, показавших значительное (четырехкратное) повышение титра HI >40%; 2) среднее геометрическое повышение - не менее 2,5; 3) доля субъектов, у которых достигается титр HI, равный 1/40, - не менее 70%. Анализ выполнения указанных критериев на модели хорьков приведен в табл. 9-12. (*) означает, что критерий CHMP выполнен или превзойден. Выводы по данным анализа перекрестной иммуногенности в отношении критериев CHMP для лицензирования приведены в табл. 13.
Ежедневно измеряли массу тела животных, температуру и общее состояние.
Признаков болезни или недомогания в ходе исследования не обнаружено.
Масса тела и температура оставались в интервалах нормальных значений. Вакцина была безопасна и хорошо переносилась животными.
Данные по гомологичному штамму (А/Индонезия/5/05)
Таблица 9
Сутки Критерий Исследованная группа
1 мкг 1 мкг + адъювант 5 мкг 5 мкг + адъювант 7,5 мкг 15 мкг 15 мкг + адъювант 30 мкг 5 мкг ITC
14 (после 1й инъекции) % субъектов с 4-х-кратным повышением титра Ш 0% 100% 0% 100%* 20% 20% 80% * 0% 0%
Среднее геометрическое повышение 0% 7.6 0% 15.6* 1,3 1,2 11,2* 0% 0%
% титров Ш равных 1/40 0% 60% 0% 100%* 20% 0% 80%* 0% 0%
Средний титр Ш 38 78 56
35 (14 сут. после добавочн. инъекции) % субъектов с 4-х-кратным повышением титра HI 0% 100% * 0% 60%* 0% 0% 40%* 0% 0%
Среднее геометрическое повышение 0% 10,8* 0% 5,9* 0.7 0% 4* 0% 0%
% титров Ш равных 1/40 0% 100% * 0% 100% * 0% 0% 100* 0% 0%
Средний титр HI 411 465 217
Данные по гетерологичному штамму (А/Вьетнам/1194/04)
Таблица 10
Сутки (после 1-й инъекции) (после дополн. инъекции)
Критерий Исследованная группа
1 мкг 1 мкг + адъювант 5 мкг 5 мкг + адъювант 7,5 мкг 15 мкг 15 мкг + адъювант 30 мкг 5 мкг ITC
% субъектов с 4-х-кратным повышением титра Ш 0% 0% °%
Среднее геометрическое повышение Ь2 1,2 1,3
% титров HI равных 1/40 0% 0% 0%
% субъектов с 4-х-кратным повышением титра HI 60% 80%* 60%
Среднее геометрическое повышение 2.3 5.1* 1.78
% титров Ш равных 1/40 0% 80%* 20%
Данные по гетерологичному штамму (А/Индейки/Турция/1/05)
Таблица 11
Сутки Критерий Исследованная группа
1 мкг 1 мкг + адъювант 5 мкг 5 мкг + адъювант 7.5 мкг 15 мкг 15 мкг + адъювант 30 мкг 5 мкг ITC
14 (после 1-й инъекции) % субъектов с 4-х-кратным повышением титра Ш 40% 20% 60%
Среднее геометрическое повышение 1,9 1,7 2,8
% титров Ш равных 1/40 40% 20% 40%
35 (после дополн. инъекции) % субъектов с 4-х-кратным повышением титра Ш 80% * 100% * 80% *
Среднее геометрическое повышение 10,6* 20,8* 7,7*
% титров Ш равных 1/40 100% * 100% * 100% *
- 64 034733
Таблица 12
Данные по гетерологичному штамму (А/Аньхой/5/05)
Исследованная группа мкг +
адъювант % титров Ш равных 1/40
35(после
11,8* % титров HI равных 1/40
100% * дополн.
инъекции) (после 1-и инъекции) % субъектов с 4-х-кратным повышением титра Ш
Среднее геометрическое повышение
Таблица 13 % субъектов с 4-х-кратным повышением титра Ш Среднее геометрическое повышение
Выводы о перекрестной иммуногенности согласно критериям CHMP для лицензирования
Штамм Критерий Исследованная группа
1 мкг + адъювант 5мкг + адъювант 15 мкг + адъювант
А/индейки/Турция/1 / % субъектов с 4-х-кратным повышением титра HI 80%* 100% * 80%*
05 (клада 2.2) Среднее геометрическое повышение 10,6* 20,8* 7,7*
% титров HI равных 1/40 100% * 100% * 100% *
А/Аньхой/1/05 % субъектов с 4-х-кратным повышением титра HI 100% * 100% * 60% *
(клада 2.3) Среднее геометрическое повышение 11,8* 14,4* 3*
% титров HI равных 1/40 100% * 80% * 80%*
А/Вьетнам/1194/04 % субъектов с 4-х-кратным повышением титра HI 60% 80%* 60%
(клада 1) Среднее геометрическое повышение 2,3 7,1* 1,78
% титров HI равных 1/40 0% 80%* 20%
Пример 19. Выбор нуклеотидных последовательностей гемагглютинина.
Последовательности нуклеотидов HA были взяты из базы данных последовательностей вирусов гриппа (см. URL:flu.lanl.gov) или ресурса Национального центра биотехнологической информации по вирусам гриппа (NCBI) (Bao et al., 2008. J. Virology 82(2): 596-601; см.
URL:ncbi.nlm.nih.gov/genomes/FLU/FLU.html). Для нескольких нуклеиновых кислот HA в базах данных имеется несколько вариантов (табл. 14). Некоторые вариации связаны в основном с системой культивирования (происхождение - MDCK (клетки почки собаки), яйцо, неизвестно, РНК вируса/клинический штамм); например, отсутствует гликозилирование в положении 194 (нумерация зрелого белка) HA, если вирус гриппа типа B экспрессирован в аллантоисной жидкости яиц (см. также Chen et al., 2008). Для некоторых последовательностей могут отсутствовать домены (например, неполные клоны, артефакты секвенирования и т.д.). Домены и субдомены гемагглютинина вируса гриппа в общем обсуждаются в описании. Домены и субдомены первого участка могут сочетаться с доменом из второго существующего участка, например сигнальный пептид последовательности первого штамма может сочетаться с балансом кодирующей последовательности гемагглютинина из второго штамма для образования полной кодирующей последовательности.
- 65 034733
Таблица 14
Вариация подтипов вируса гриппа для выбранных кодирующих последовательностей НА
Штамм Рет. № последовательности в базе данных Происхожде ние СП НА1 НА2 DTm Расхождения
Н1 А/Соломоновы острова/3/ 2006 ISDN2315 58 (рек. Вакцина) клетки MDCK Y Y Y Y 189: R или G, 220: К (MDCK) Т(яйцо), 249: Q (MDCK) К(яйцо), 550: L (MDCK) R (яйцо)
А/Соломоновы острова/3/ 2006 ISDN2381 90 яйцо Y Y Y Y 189: R или G, 220: К (MDCK) Т(яйцо), 249: Q (MDCK) R/яйцо), 550: L (MDCK) R (яйцо)
А/Соломоновы острова/3/ 2006 EU100724 ? Y Y Y Y 189: R или G, 220: К (MDCK) Т(яйцо), 249: Q (MDCK) R/яйцо), 550: L (MDCK) R (яйцо)
А/Соломоновы острова/3/ 2006 ISDN2209 51 Клетки MDCK Y Y N N 189: R или G, 220: К (MDCK) Т(яйцо), 249: Q (MDCK) R/яйцо), 550: L (MDCK) R (яйцо)
А/Соломоновы острова/3/ 2006 ISDN2209 53 Яйцо Y Y N N 189: R или G, 220: К (MDCK) Т(яйцо), 249: Q (MDCK) К(яйцо), 550: L
(MDCK) R (яйцо)
А/Соломоновы острова/3/ 2006 EU124137 Яйцо Y Y N N 189: R или G, 220: К (MDCK) Т(яйцо), 249: Q (MDCK) R/яйцо), 550: L (MDCK) R (яйцо)
А/Соломоновы острова/3/ 2006 EU124135 Клетки MDCK Y Y N N 189: R или G, 220: К (MDCK) Т(яйцо), 249: Q (MDCK) R/яйцо), 550: L (MDCK) R (яйцо)
А/Соломоновы острова/3/ 2006 EU124177 Клетки MDCK Y Y Y Y 189: R или G, 220: К (MDCK) Т(яйцо), 249: Q (MDCK) R/яйцо), 550: L (MDCK) R (яйцо)
Н1 А/Брисбен/5 9/2007 ISDN2826 76 клетки MDCK Y Y Y 203: D/I/N D наиболее часто встречается в Н1
А/Брисбен/ 59/2007 ISDN2851 01 яйцо Y Y N N 203: D/I/N D наиболее часто встречается в Н1
А/Брисбен/ 59/2007 ISDN2857 77 яйцо Y Y Y Y 203: D/I/N D наиболее часто встречается в Ш
А/Брисбен/ 59/2007 ISDN2826 77 яйцо Y Y Y Y 203: D/I/N D наиболее часто встречается в HI
НЗ А/Брисбен/1 0/2007 ISDN2748 93 яйцо Y Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: делеция Ala, 242: S/I
А/Брисбен/ 10/2007 ISDN2576 48 клетки MDCK N Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: делеция Ala, 242: S/I
А/Брисбен/10/2007 ISDN2567 51 яйцо Y Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: Ala, 242: S/I
А/Брисбен/10/2007 ISDN2737 57 яйцо Y Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: делеция Ala, 242: S/I
- 66 034733
А/Брисбен/ 10/2007 ISDN2737 59 яйцо Y Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: делеция Ala, 242: S/I
А/Брисбен/ 10/2007 EU199248 яйцо N Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: делеция Ala, 242: S/I
А/Брисбен/ 10/2007 EU199366 яйцо Y Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: делеция Ala, 242: S/I
А/Брисбен/ 10/2007 ISDN2570 43 яйцо N Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: делеция Ala, 242: S/I
А/Брисбен/ 10/2007 EU199250 Клетки MDCK N Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: делеция Ala, 242: S/I
А/Брисбен/ 10/2007 ISDN2753 57 ЯЙЦО N Y N N 202: V/G, 210:L/P, 215: делеция Ala, 242: S/I
А/Брисбен/ 10/2007 ISDN2604 30 яйцо N Y Y Y 202: V/G, 210:L/P, 215: делеция Ala, 242: S/I
H3 А/Висконсин /67/2005 ISDN1314 64 (рек. Вакцина) 7 N Y Y N 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y
А/Висконсин /67/2005 DQ865947 7 N Y Частич N 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y
А/ Висконсин /67/2005 EF473424 7 N Y Y N 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y
А/ Висконсин /67/2005 ISDN1387 23 яйцо N Y Y Y 138: A/S 156: H/Q 186: G/V196:H/Y
А/ Висконсин /67/2005 EF473455 яйцо N Y Y Y 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y
А/ Висконсин /67/2005 ISDN 1387 24 ? N Y Y Y 138: A/S 156: H/Q 186: G/V 196: H/Y
В В/Малайзия/ 2506/2004 ISDN 1266 72 (рек. Вакцина) Яйцо Y Y N N 120K/N210T/A
В/Малайзия/ 2506/2004 EF566433 Яйцо Y Y N N 120K/N210T/A
- 67 034733
В/Малайзия/ 2506/2004 ISDN231265 Яйцо Y Y Y Y 120K/N210T/A
В/Малайзия/ 2506/2004 ISDN2315 57 Клетки MDCK Y Y Y Y 120 K/N 210 Т/А
В/Малайзия/ 2506/2004 EF566394 Клетки MDCK Y Y N N 120 K/N 210 Т/А
В/Малайзия/ 2506/2004 EU124274 яйцо Y Y Y Y 120 K/N 210 Т/А
В/Малайзия/ 2506/2004 EU124275 Клетки MDCK Y Y Y Y 120 K/N 210 Т/А
В/Малайзия/ 2506/2004 ISDN 1247 76 Клетки MDCK Y Y N N 120 K/N 210 Т/А
В В/Флорида/4/ 2006 ISDN2616 49 яйцо Y Y Y N отс. сайта гликозилирования в положении 211; 10 аминокислот DTm/ цитоплазматическ.хвост
В/Флорида/4/ 2006 EU 100604 клеткиМОСК N Y N N
В/Флорида/4/ 2006 ISDN218061 клеткиМОСК N Y N N
В/Флорида/4/ 2006 ISDN285778 яйцо Y Y Y Y Включает цитоплазматическ. Хвост
В В/Брисбен/3 /2007 ISDN256628 яйцо N Y N N отс. сайта гликозилирования в положении 211
В/Брисбен/ 3/2007 ISDN263782 яйцо Y Y Y Y отс. сайта гликозилирования в положении 211
В/Брисбен/ 3/2007 ISDN263783 клеткиМОСК Y Y Y Y
Н5 А/Вьетнам/ ISDN38686 (рек. П? I Y I Y I Ϋ I Y
- 68 034733
1194/2004 вакцина)
А/Вьетнам /1194/2004 AY651333 9 Y Y Y Y
А/Вьетнам/ 1194/2004 EF541402 7 Y Y Y Y
Н5 А/Аньхой/1/2005 DQ37928 (рек. вакцина) ? Y Y Y Y
А/Аньхой/1/2005 ISDN1314 65 яйцо Y Y Y Y
Н7 А/куры/ Италия/13474/1999 AJ91720 ген ARN Y Y Y Y
Н7 А/Лошади/Прага/56 АВ298277 (лаб. реассор-тант) ? Y Y Y Y 169 (ТЛ) 208 (Ν/D) (ото. позиции гликозилирования)
А/Л ошади/Прага/ 5 6 Х62552 ? Y Y Y Y
Н9 А/Гонконг/1073/1 999 AJ404626 9 Y Y Y Y
А/Гонконг/1073/1 999 АВ080226 7 N Y N N
Н2 А/Сингапур/ 1/1957 АВ296074 ? Y Y Y Y
А/Сингапур /1/1957 L20410 РНК Y Y Y Y
А/Сингапур /1/1957 LI1142 ? Y Y Y Y
Н2 А/Япония/305/1957 L20406 7 Y Y Y Y
А/Япония /305/1957 L20407 ? Y Y Y Y
А/Япония/305/1957 CY014976 7 Y Y Y Y
А/Япония/305/1957 AY209953 ? Y Y N N
А/Япония/305 /1957 J02127 ? Y Y Y Y
А/Япония/305 /1957 DQ508841 ? Y Y Y Y
А/Япония/305/1957 AY643086 ? Y Y Y N
А/Япония/305/1957 АВ289337 ? Y Y Y Y
А/Япония/305/1957 AY643085 ? Y Y Y Y
Лекарственн
А/Япония/305/1957 AY643087 устойчивый Y Y Y N
Н6 А/дикие утки/Г онконг/ХУЗ 12/ 1997 (H6N1) AF250479 Яйцо Y Y Y Y
Y, N - Да и Нет соответственно.
СП - наличие участка сигнального пептида Y/N (Да/Нет).
HA1 - полный домен HA1 Y/N (Да/Нет).
HA2 - полный домен HA2 Y/N (Да/Нет).
DTm - полный трансмембранный домен Y/N (Да/Нет). Штамм: H1 из А/Соломоновы Острова/3/2006.
- 69 034733
Сравнивали восемь аминокислотных последовательностей и идентифицировали вариации (табл. 15).
В некоторых последовательностях в положении 171 обнаружена вариация глицин (G) или аргинин (R).
Таблица 15
Вариация аминокислот штамма
А/Соломоновы острова/3/2006
Штамм: H1 из А/Брисбен/59/2007.
В положении 203 обнаружена вариация - аспарагиновая кислота (D), изолейцин (I) или аспарагин (N).
Штамм: H3 из А/Брисбен/10/2007
Вариации последовательностей обнаружены в пяти положениях (табл. 16). В положении 215 в двух образцовых последовательностях присутствовала делеция.
Таблица 16
Вариация аминокислот для H3 из А/Брисбен/10/200
Происхождение 202, 210, 215, 235, 242 *
ISDN274893 яйцо V L - Y I
ISDN273759 яйцо G Р А S I
EU199248 яйцо G Р А S I
EU199366 яйцо G Р А S I
ISDN273757 яйцо V L - S S
ISDN257043 яйцо G Р А S I
EU199250 клетки MDCK G L А S I
ISDN375357 яйцо G Р А S I
ISDN260430 яйцо G Р А S I
ISDN256751 яйцо G Р А S I
ISDN257648 MDCK G L А S I
* Нумерация с начального М.
Штамм: H3 из А/Висконсин/67/2005.
Вариации последовательностей для этого штамма обнаружены в четырех положениях (табл. 17).
Таблица 17
Вариации аминокислот H3 из А/Висконсин/67/2005
Происхождение 138, 156, 186, 196
ISDN138724 Неизвестно А Н G Н
DQ865947 Неизвестно S Н V Y
EF473424 Неизвестно А Н G Н
ISDN138723 Яйцо S Q V Y
ISDN131464 Неизвестно А Н G н
EF473455 Яйцо А н G н
* Нумерация зрелого белка.
- 70 034733
Штамм: В из В/Малайзия/2506/2004.
Вариации наблюдались в двух положениях (табл. 18). Положение 120 не является сайтом гликозилирования; положение 210 участвует в гликозилировании; данное гликозилирование устраняется после культивирования в яйцах.
Таблица 18
Вариации аминокислот гемагглютинина
Штамм: гемагглютинин из В/Флорида/4/2006; ISDN261649.
Наблюдаемые вариации - варьирование аминокислотной последовательности в положении 211, в зависимости от системы культивирования. В последовательностях, выделенных из клеток MDCK, обнаруживается аспарагин (N), а в последовательности, выделенной из яиц, - глутаминовая кислота (D). Положение 211 является сайтом гликозилирования, который устраняется после культивирования в яйцах.
Штамм: H2 из А/Сингапур/1/1957.
Вариации последовательностей наблюдались в шести положениях (табл. 19).
Таблица 19
Вариации аминокислот в последовательности H2 из штамма А/Сингапур/1/1957
Происхождение Аминокислота № 238 358
166 168 199\ 236
L20410 вирусная РНК К Е Т L S V
LI 1142 неизвестен Е G К L S I
АВ296074 неизвестен К G т Q G V
консенсусная последовательность А/Япония/305/1957 К G т Q/L G V
1 Нумерация зрелого белка.
Штаммы: H5 из А/Вьетнам/1194/2004 и H5 из А/Аньхой/1/2005.
При выравнивании первичных последовательностей H5 любого из указанных штаммов вариаций в аминокислотных последовательностях не обнаружено.
Штамм: H6 из А/дикие утки/Гонконг^312/1997.
Для данного штамма имеется только один вариант (AF250179).
Штамм: H7 из А/лошади/Прага/56.
В базах данных обнаружено всего два варианта последовательностей. Вариант АВ298877 не рассматривался, так как является лабораторным реассортантом.
Штамм: H9 из А/Гонконг/1073/1999; AJ404626.
В базах данных обнаружено всего два варианта последовательностей. Только одна из них была полной.
Пример 20. Временная экспрессия гемагглютинина вируса гриппа, слитого с сигнальным пептидом из белка, секретированного в растении.
Влияние модификации сигнального пептида на уровень накопления HA было исследовано и для других гемагглютининов по экспрессии HA подтипа A из штаммов А/Брисбен/59/2007 (H1N1) (плазмида #787), А/Новая Каледония/20/1999 (H1N1) (плазмида #540); штаммов А/Брисбен/10/2007 (H3N2) (плазмида 790) и А/Индонезия/5/2005 (H5N1) (плазмида #663), а также типа B из штаммов В/Флорида/4/2006 (плазмида #798), слитых с сигнальным пептидом (СП; нуклеотиды 32-103) протеиндисульфидизомеразы люцерны (PDI; рег. № Z11499; SEQ ID NO: 34; фиг. 17). Слитые системы СП PDI-ген гемагглютинина собирали в виде кассеты экспрессии пластоцианина, включающей участок промотора, 5'HTO, 3'HTO и
- 71 034733 участок терминации транскрипции из гена пластоцианина люцерны. Собранные кассеты вставляли в бинарную плазмиду pCAMBIA. Плазмиды трансфицировали в Agrobacterium (AGL1), продуцирующие соответственно штаммы Agrobacterium AGL1/787, AGL1/540, AGL1/790, AGL1/663 и AGL1/798.
Проводили инфильтрацию растения N. benthamiana штаммами AGL1/787, AGL1/540, AGL1/790, AGL1/663 и AGL1/798. Одновременно для сравнения проводили инфильтрацию ряда растений штаммами AGL1/774, AGL776, AGL1/660 и AGL1/779. После инкубации в течение шести суток листья собирали, из листьев экстрагировали белки и анализировали методом вестерн-блоттинга с соответствующими антителами против HA. Установлено, что экспрессия HA Ш/Брисбен и И3/Брисбен при использовании СП из PDI была значительно эффективнее, чем экспрессия, наблюдавшаяся для тех же HA с нативным сигнальным пептидом (соответственно фиг. 87b) и 87c). Экспрессию третьего HA подтипа H1 (штамм А/Новая Каледония/20/1999) подтверждали тем же способом замены СП (фиг. 87a). Модификация сигнального пептида приводила к значительному повышению накопления HA в случае H5 (А/Индонезия/5/2005) (фиг. 87d), но для HA из штамма В/Флорида/4/2006 сигнала не обнаружено, независимо от того, какой именно сигнальный пептид применялся при экспрессии (фиг. 87e). Для всех условий, при которых обнаружена экспрессия HA, наблюдали единственную иммунологически активную полосу, соответствующую молекулярной массе приблизительно 72 кДа (фиг. 87a-87d), т.е. принадлежащую нерасщепленному НА0.
Пример 21. Экспрессия HA под управлением кассеты экспрессии кассетах экспрессии CPMV-HT.
Кассета экспрессии CPMV-HT (Sainsbury et al. 2008 Plant Physiology, 148:1212-1218; см. также WO 2007/135480), включающая нетранслируемые области РНК2 вируса мозаики коровьего гороха (CPMV), служила для экспрессии некоторых гемагглютининов в трансгенных растениях. Под управлением CPMV-HT в растениях N. benthamiana, агроинфильтрованных как описано выше, проводили экспрессию HA из штаммов А/Новая Каледония/20/1999 (H1), А/Брисбен/59/2007 (H1), А/Брисбен/10/2007 (H3), А/Индонезия/5/2005 (H5) и В/Флорида/4/2006 (B). После инкубации собирали листья, экстрагировали и методом вестерн-блоттинга сравнивали содержание HA в экстрактах белков. Как показано на фиг. 88, кассета экспрессии на основе CPMV-HT обеспечивала более высокий уровень экспрессии HA, чем кассета на основе пластоцианина, независимо от используемого сигнального пептида. Более того, в случае штамма B из В/Флорида/4/2006 применение кассеты CPMV-HT позволило обнаружить накопление HA, который не мог быть обнаружен в данных условиях иммунологического анализа при экспрессии с кассетой на основе пластоцианина.
Таблица 19
Экспрессирующая кассета для экспрессии гемагглютининов вируса гриппа с нативным сигнальным пептидом или сигнальным пептидом PDI
Штамм растения Вид НА Сигнальный пептид Экспрессирующая кассета
AGL1/540 Н1 (А/Новая Каледония/20/99) PDI Пластоцианин
AGL1/580 Н1 (А/Новая Каледония/20/99) PDI CPMV-HT
AGL1/774 Н1 (А/Брисбен/59/2007) нативный Пластоцианин
AGL1/787 Н1 (А/Брисбен/59/2007) PDI Пластоцианин
AGL1/732 HI (А/Брисбен/59/2007) нативный CPMV-HT
AGL1/776 НЗ (А/Брисбен/10/2007) нативный Пластоцианин
AGL1/790 НЗ (А/Брисбен/10/2007) PDI Пластоцианин
AGL1/735 НЗ (А/Брисбен/10/2007) нативный CPMV-HT
AGL1/736 НЗ (А/Брисбен/10/2007) PDI CPMV-HT
AGL1/660 Н5 (А/Индонезия/5/2005) нативный Пластоцианин
AGL1/685 Н5 (А/Индонезия/5/2005) нативный CPMV-HT
AGL1/779 В (В/Флорида/4/2006) нативный Пластоцианин
AGL1/798 В (В/Флорида/4/2006) PDI Пластоцианин
AGL1/738 В (В/Флорида/4/2006) нативный CPMV-HT
AGL1/739 В (В/Флорида/4/2006) PDI CPMV-HT
- 72 034733
Пример 22. Коэкспрессия с Hsp70 и Hsp40 в сочетании с модификацией сигнального пептида.
Проводили коэкспрессию цитозольных Hsp70 и Hsp40 (конструкция № R870) растительного происхождения с H1 Новая Каледония (конструкция № 540) или H3 Брисбен (конструкция № 790), в обоих случаях с сигнальным пептидом растительного происхождения (сигнальный пептид PDI люцерны). Коэкспрессию проводили при агроинфильтрации растения N. benthamiana бактериальной суспензией, содержащей смесь (в отношении 1:1:1) штаммов AGL1/540, AGL1/R870, AGL1/35SHcPro (для H1) или AGL1/790, AGL1/R870 и AGL1/35SHcPro (для H3). Агроинфильтрацию растений, взятых для контроля, проводили смесью (отношение 1:2) AGL1/540, AGL1/35SHcPro (для H1) или AGL1/790, AGL1/35SHcPro (для H3). После инкубации листья собирали, экстрагировали и сравнивали содержание HA в экстрактах белков по данным вестерн-блоттинга (фиг. 89). В условиях опытов показано, что коэкспрессия Hsp70 и Hsp40 не повышает уровень накопления гемагглютинина в случае H1 Новая Каледония. Тем не менее для подтипа H3 Брисбен данные вестерн-блоттинга отчетливо указывают, что коэкспрессия цитозольных Hsp70 и Hsp40 приводит к значительному повышению уровня накопления гемагглютинина.
Все цитируемые материалы включены в данный документ посредством ссылки.
Настоящее изобретение описано в отношении одного или более осуществлений. Однако для специалиста в данной области очевидно, что возможны варианты и модификации, не выходящие за рамки объема изобретения, который представлен в формуле изобретения.
Библиография.
Aymard, Η. Μ., Μ. Т. Coleman, W. R. Dowdle, W. G. Laver, G. C. Schild, and R. G. Webster.
1973. Influenza virus neuraminidase-inhibition test procedures. Bull. W.H.O. 48: 199-202
Bollag, D.M., Rozycki, M.D., and Edelstein, S.J. (1996) Protein methods (2nd edition). Wiley-Liss,
New York, USA.
Bligh, E.G., & Dyer, W.J. Can. J. Med. Sci. 37,911-917 (1959).
Chen, B.J., Leser, G.P., Morita, E., and Lamb R.A. (2007) Influenza virus hemagglutinin and neuraminidase, but not the matrix protein, are required for assembly and budding of plasmid-derived virus-like particles. J. Virol. 81,7111-7123.
Chen Z, Aspelund A, Jin H. 2008 Stabilizing the glycosylation pattern of influenza В 15 hemagglutinin following adaptation to growth in eggs.Vaccine vol 26 p 361-371 Crawford, J., Wilkinson, B., Vosnesensky, A., Smith, G., Garcia, M., Stone, H., and Perdue, M. L. (1999). Baculovirus-derived hemagglutinin vaccines protect against lethal influenza infections by avian H5 and H7 subtypes. Vaccine 17,2265-2274.
Darveau, A., Pelletier, A. & Perreault, J. PCR-mediated synthesis of chimeric molecules. 20
Methods Neurosc. 26,77-85 (1995).
Grgacic EVL, Anderson DA. Virus-like particles: passport to immune recognition. Methods 2006;
40: 60-65.
Gillim-Ross, L., and Subbarao, K. (2006) Emerging respiratory viruses: chanllenges and vaccine strategies. Clin. Microbiol. Rev. 19, 614-636.
Gomez-Puertas, P., Mena, I., Castillo, M., Vivo, A., Perez-Pastrana, E. and Portela, A. (1999) Efficient formation of influenza virus-like particles: dependence on the expression level of viral proteins. J. Gen. ViroL 80, 1635-1645.
Gomez-Puertas, P., Albo, C, Perez-Pastrana, E., Vivo, A., and Portela, A. (2000) Influenza Virus protein is the major driving force in virus budding. J Virol. 74, 11538-11547.
Hamilton, A., Voinnet, O., Chappell, L. & Baulcombe, D. Two classes of short interfering RNA in
RNA silencing. EMBOJ 21,4671-4679 (2002).
Hofgen, R. & Willmitzer, L. Storage of competent cells for Agrobacterium transformation. Nucleic
Acid Res. 16,9877(1988).
- 73 034733
Harbury PB, Zhang T, Kim PS, Alber T. (1993) A switch between two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants. Science; 262: 1401-1407)
Horimoto T., Kawaoka Y. Strategies for developing vaccines against h5Nl influenza a viruses. 10
Trends in Mol. Med. 2006; 12(11):506-514.
Huang Z, Elkin G, Maloney BJ, Beuhner N, Amtzen CJ, Thanavala Y, Mason HS. Virus-like particle expression and assembly in plants: hepatitis В and Norwalk viruses. Vaccine. 2005 Mar 7;23(15):1851-8.
Johansson, В. E. (1999). Immunization with influenza A virus hemagglutinin and neuraminidase 15 produced in recombinant baculovirus results in a balanced and broadened immune response superior to conventional vaccine. Vaccine 17,2073-2080.
Latham, T., and Galarza, J. M. (2001). Formation of wild-type and chimeric influenza virus-like particles following simultaneous expression of only four structural proteins. J. Virol. 75,6154-6165. Lefebvre, B. et al. Plant Physiol. 144,402-418 (2007).
Leutwiler LS et al 1986. Nucleic Acid Sresearch 14910):4051-64
Liu, L & Lomonossoff, G.P. Agroinfection as a rapid method for propagating Cowpea mosaic 25 virus-based constructs. J. Virol. Methods 105,343-348 (2002).
Macala, L.J., Yo, R.K. & Ando, S. J Lipid Res. 24,1243-1250 (1983)
Mattanovich, D., Riiker, F., da Camara Machado, A., Laimer, M., Regner, F., Steinkellner, H., Himmler, G., and Katinger, H. (1989) Efficient transformation of Agrobacterium spp. By 30 electroporation. Nucl. Ac. Res. 17, 6747.
Mena, I., Vivo, A., Perez, E., and Portela, A. (1996) Rescue of synthetic chloramphenicol acetyltransferase RNA into influenza virus-like particles obtained from recombinant plasmids. J. Virol. 70, 5016-5024.
Mongrand S, Morel J, Laroche J, Claverol S, Carde JP, Hartmann MA et aL. Lipid rafts in higher 5 plant cells. The Journal of Biological Chemistry 2004; 279(35): 36277-36286.
Neumann, G., Watanabe, T., and Kawaoka, Y. (2000) Plasmid-driven formation of virus-like particles. J. Virol. 74,547-551.
Nayak DP, Reichl U. (2004) Neuraminidase activity assays for monitoring MDCK cell culture derived influenza virus. J Virol Methods 122(1):9-15.
Olsen, C. W., McGregor, M. W., Dybdahl-Sissoko, N., Schram, B. R., Nelson, К. M., Lunn, D.,
- 74 034733
Macklin, M. D., and Swain, W. F. (1997). Immunogenicity and efficacy of baculovirus-expressed and DNA-based equine influenza virus hemagglutinin vaccines in mice. Vaccine 15, 1149-1156.
Quan FS, Huang C, Compans RW, Kang SM. Virus-like particle vaccine induces protective 15 immunity against homologous and heterologous strains of influenza virus. Journal of Virology 2007;
81(7): 3514-3524.
Rowe, T. et al. 1999. Detection of antibody to avian influenza a (h5Nl) virus in human serum by using a cmbiation of serologic assays. J. Clin Microbiol 37(4):937-43
Saint-Jore-Dupas C et al. 2007. From planta to pharma with glycosylation in the toolbox. 20 Trends in Biotechnology 25(7) :317-23
Sambrook J, and Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
Stockhaus J et al 1987. Analysis of cis-active sequences involved in the leaf-specific expression of a potato gene in transgenic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.S. 25 84(22):7943-7947.
Stockhaus J et al 1989. Identification of enhancer elements in the upstream region of the nuclear photosynthetic gene ST-LS1. Plant Cell. 1(8):805-13.
Suzuki, Y. (2005) Sialobiology of influenza. Molecular mechanism of host range variation of influenza viruses. Biol. Pharm. Bull 28, 399-408.
Tsuji M., Cell. Mol. Life Sci., 63 (2006); 1889-1898
Wakefield L., G.G. BrownLee Nuc Acid Res. 17 (1989); 8569-8580.
Kendal, AP, Pereira MS, Skehel J. Concepts and procedures for laboratory-based influenza surveillance. Atlanta:CDC; 1982. p.B17-B35
WHO. Manual on animal influenza diagnosis and surveillance. Department of communicable disease surveillance and response. World Health Organisation Global Influenza Program. 2002. Skehel JJ and Wildy DC Ann Rev Biochem 2000 69:531-69
Vaccaro L et al 2005. Biophysical J. 88:25-36.
Gamblin, S.J., Haire, L.F., Russell, R.J., Stevens, D.J., Xiao, В., Ha, Y., Vasisht,
N., Steinhauer, D.A., Daniels, R.S., Elliot, A., Wiley, D.C., Skehel, J.J. (2004) The structure and receptor binding properties of the 1918 influenza hemagglutinin. Science 303: 1838-1842
- 75 034733
Список последовательностей <110> МЕДИКАГО ИНК.
Д'АУ, Марк-Андре
КУТЮР, Манон
ОРС, Фредерик
ТРЕПАНЬЕ, Сонья
ЛАВУА, Пьер-Оливье
ДАРГИС, Мишель
ВЕЗИНА, Луи-Филипп
ЛАНДРИ, Натали <120> Нуклеиновая кислота для увеличенной экспрессии гемагглютинина вируса гриппа в растении и ее применение <130> V81270WO1 <140> РСТ/СА2009/000032 <141> 2009-01-12 <150> СА 2,615,372 <151> 2008-01-21 <150> US 61/022,775 <151> 2008-01-22 <150> РСТ/СА2008/001281 <151> 2008-07-11 <160>126 <170> Patentin version 3.4 <210>1 <211>1556 <212> ДНК <213> Вирус гриппа А <400> 1
agatcttcgc tgacacaata tgtataggct accatgccaa caactcaacc gacactgttg 60
acacagtact tgagaagaat gtgacagtga cacactctgt caacctactt gaggacagtc 120
acaatggaaa actatgtcta ctaaaaggaa tagccccact acaattgggt aattgcagcg 180
ttgccggatg gatcttagga aacccagaat gcgaattact gatttccaag gaatcatggt 240
cctacattgt agaaacacca aatcctgaga atggaacatg ttacccaggg tatttcgccg 300
actatgagga actgagggag caattgagtt cagtatcttc atttgagaga ttcgaaatat 360
tccccaaaga aagctcatgg cccaaccaca ccgtaaccgg agtatcagca tcatgctccc 420
ataatgggaa aagcagtttt tacagaaatt tgctatggct gacggggaag aatggtttgt 480
acccaaacct gagcaagtcc tatgtaaaca acaaagagaa agaagtcctt gtactatggg 540
gtgttcatca cccgcctaac atagggaacc aaagggcact ctatcataca gaaaatgctt 600
atgtctctgt agtgtcttca cattatagca gaagattcac cccagaaata gccaaaagac 660
- 76 034733
ccaaagtaag agatcaggaa ggaagaatca actactactg gactctgctg gaacctgggg 720
atacaataat atttgaggca aatggaaatc taatagcgcc atggtatgct tttgcactga 780
gtagaggctt tggatcagga atcatcacct caaatgcacc aatggatgaa tgtgatgcga 840
agtgtcaaac acctcaggga gctataaaca gcagtcttcc tttccagaat gtacacccag 900
tcacaatagg agagtgtcca aagtatgtca ggagtgcaaa attaaggatg gttacaggac 960
taaggaacat cccatccatt caatccagag gtttgtttgg agccattgcc ggtttcattg 1020
aaggggggtg gactggaatg gtagatgggt ggtatggtta tcatcatcag aatgagcaag 1080
gatctggcta tgctgcagat caaaaaagta cacaaaatgc cattaacggg attacaaaca 1140
aggtcaattc tgtaattgag aaaatgaaca ctcaattcac agctgtgggc aaagagttca 1200
acaaattgga aagaaggatg gaaaacttaa ataaaaaagt tgatgatggg tttctagaca 1260
tttggacata taatgcagaa ttgttggttc tactggaaaa tgaaaggact ttggatttcc 1320
atgactccaa tgtgaagaat ctgtatgaga aagtaaaaag ccaattaaag aataatgcca 1380
aagaaatagg aaacgggtgt tttgagttct atcacaagtg taacaatgaa tgcatggaga 1440
gtgtgaaaaa tggtacctat gactatccaa aatattccga agaatcaaag ttaaacaggg 1500
agaaaattga tggagtgaaa ttggaatcaa tgggagtata ctaagagctc aggcct 1556
<210> 2
<211> 219
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа A
<400> 2
ggtacctatg actatccaaa atattccgaa gaatcaaagt taaacaggga gaaaattgat 60
ggagtgaaat tggaatcaat gggagtatac cagattctgg cgatctactc aactgtcgcc 120
agttccctgg ttcttttggt ctccctgggg gcaatcagct tctggatgtg ttccaatggg 180
tctttgcagt gtagaatatg catctaagag ctcaggcct 219
<210> 3 <211> 1719 <212> ДНК <213> Вирус гриппа A <400> 3
aagcttatgg agaaaatagt gcttcttctt gcaatagtca gtcttgttaa aagtgatcag 60
atttgcattg gttaccatgc aaacaattca acagagcagg ttgacacaat catggaaaag 120
aacgttactg ttacacatgc ccaagacata ctggaaaaga cacacaacgg gaagctctgc 180
gatctagatg gagtgaagcc tctaatttta agagattgta gtgtagctgg atggctcctc 240
gggaacccaa tgtgtgacga attcatcaat gtaccggaat ggtcttacat agtggagaag 300
gccaatccaa ccaatgacct ctgttaccca gggagtttca acgactatga agaactgaaa 360
- 77 034733
cacctattga gcagaataaa ccattttgag aaaattcaaa tcatccccaa aagttcttgg 420
tccgatcatg aagcctcatc aggagttagc tcagcatgtc catacctggg aagtccctcc 480
ttttttagaa atgtggtatg gcttatcaaa aagaacagta catacccaac aataaagaaa 540
agctacaata ataccaacca agaggatctt ttggtactgt ggggaattca ccatcctaat 600
gatgcggcag agcagacaag gctatatcaa aacccaacca cctatatttc cattgggaca 660
tcaacactaa accagagatt ggtaccaaaa atagctacta gatccaaagt aaacgggcaa 720
agtggaagga tggagttctt ctggacaatt ttaaaaccta atgatgcaat caacttcgag 780
agtaatggaa atttcattgc tccagaatat gcatacaaaa ttgtcaagaa aggggactca 840
gcaattatga aaagtgaatt ggaatatggt aactgcaaca ccaagtgtca aactccaatg 900
ggggcgataa actctagtat gccattccac aacatacacc ctctcaccat cggggaatgc 960
cccaaatatg tgaaatcaaa cagattagtc cttgcaacag ggctcagaaa tagccctcaa 1020
agagagagca gaagaaaaaa gagaggacta tttggagcta tagcaggttt tatagaggga 1080
ggatggcagg gaatggtaga tggttggtat gggtaccacc atagcaatga gcaggggagt 1140
gggtacgctg cagacaaaga atccactcaa aaggcaatag atggagtcac caataaggtc 1200
aactcaatca ttgacaaaat gaacactcag tttgaggccg ttggaaggga atttaataac 1260
ttagaaagga gaatagagaa tttaaacaag aagatggaag acgggtttct agatgtctgg 1320
acttataatg ccgaacttct ggttctcatg gaaaatgaga gaactctaga ctttcatgac 1380
tcaaatgtta agaacctcta cgacaaggtc cgactacagc ttagggataa tgcaaaggag 1440
ctgggtaacg gttgtttcga gttctatcac aaatgtgata atgaatgtat ggaaagtata 1500
agaaacggaa cgtacaacta tccgcagtat tcagaagaag caagattaaa aagagaggaa 1560
ataagtgggg taaaattgga atcaatagga acttaccaaa tactgtcaat ttattcaaca 1620
gtggcgagtt ccctagcact ggcaatcatg atggctggtc tatctttatg gatgtgctcc 1680
aatggatcgt tacaatgcag aatttgcatt taagagctc 1719
<210> 4 <211> 25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220>
<223>
Plasto-443c праймер <400> gtattagtaa ttagaatttg gtgtc <210> 5 <211> 44 <212> ДНК
- 78 034733 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> SpHA(Ind)-Plasto.г праймер <400> 5 gcaagaagaa gcactatttt ctccattttc tctcaagatg atta 44 <210> 6 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Plasto-SpHA(Ind).с праймер <400>6 ttaatcatct tgagagaaaa tggagaaaat agtgcttctt cttgc45 <210>7 <211>38 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> HA(Ind)-Sac . г праймер <400>7 actttgagct cttaaatgca aattctgcat tgtaacga38 <210>8 <211> 1471 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Кассета на основе пластоцианина люцерны <400> 8
agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60
taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120
atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180
tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240
aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300
gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360
aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420
taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480
aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540
aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600
atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660
- 79 034733
ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720
cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780
aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840
atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900
ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960
agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tggcgaaaaa cgttgcgatt 1020
ttcggcttat tgttttctct tcttgtgttg gttccttctc agatctgagc tctaagttaa 1080
aatgcttctt cgtctcctat ttataatatg gtttgttatt gttaattttg ttcttgtaga 1140
agagcttaat taatcgttgt tgttatgaaa tactatttgt atgagatgaa ctggtgtaat 1200
gtaattcatt tacataagtg gagtcagaat cagaatgttt cctccataac taactagaca 1260
tgaagacctg ccgcgtacaa ttgtcttata tttgaacaac taaaattgaa catcttttgc 1320
cacaacttta taagtggtta atatagctca aatatatggt caagttcaat agattaataa 1380
tggaaatatc agttatcgaa attcattaac aatcaactta acgttattaa ctactaattt 1440
tatatcatcc cctttgataa atgatagtac a 1471
<210>9 <211>565 <212> БЕЛОК <213> Вирус гриппа А <400>9
Met 1 Lys Ala Lys Leu 5 Leu Vai Leu Leu Cys 10 Thr Phe Thr Ala Thr 15 Tyr
Ala Asp Thr lie 20 Cys He Gly Tyr His 25 Ala Asn Asn Ser Thr 30 Asp Thr
Vai Asp Thr 35 Vai Leu Glu Lys Asn 40 Vai Thr Vai Thr His 45 Ser Vai Asn
Leu Leu 50 Glu Asp Ser His Asn 55 Gly Lys Leu Cys Leu 60 Leu Lys Gly He
Ala 65 Pro Leu Gin Leu Gly 70 Asn Cys Ser Vai Ala 75 Gly Trp He Leu Gly 80
Asn Pro Glu Cys Glu 85 Leu Leu He Ser Lys 90 Glu Ser Trp Ser Tyr 95 He
Vai Glu Thr Pro 100 Asn Pro Glu Asn Gly 105 Thr Cys Tyr Pro Gly 110 Tyr Phe
Ala Asp Tyr 115 Glu Glu Leu Arg Glu 120 Gin Leu Ser Ser Vai 125 Ser Ser Phe
Glu Arg 130 Phe Glu He Phe Pro 135 Lys Glu Ser Ser Trp 140 Pro Asn His Thr
- 80 034733
Val 145 Thr Gly Val Ser Ala 150 Ser Cys Ser His Asn 155 Gly Lys Ser Ser Phe 160
Туг Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn
165 170 175
Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu
180 185 190
Trp Gly Val His His Pro Pro Asn He Gly Asn Gin Arg Ala Leu Tyr
195 200 205
His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg
210 215 220
Arg Phe Thr Pro Glu He Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gin Glu
225 230 235 240
Gly Arg He Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr He
245 250 255
He Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu He Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala
260 265 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly He He Thr Ser Asn Ala Pro Met
275 280 285
Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gin Thr Pro Gin Gly Ala lie Asn Ser
290 295 300
Ser Leu Pro Phe Gin Asn Val His Pro Val Thr lie Gly Glu Cys Pro
305 310 315 320
Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn
325 330 335
He Pro Ser He Gin Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala He Ala Gly Phe
340 345 350
He Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His
355 360 365
His Gin Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gin Lys Ser Thr
370 375 380
Gin Asn Ala He Asn Gly He Thr Asn Lys Val Asn Ser Val He Glu
385 390 395 400
Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu
405 410 415
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu
420 425 430
Asp He Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu
435 440 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys
450 455 460
- 81 034733
Val 465 Lys Ser Gin Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu He Gly Asn Gly Cys 480
470 475
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys
485 490 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
500 505 510
Arg Glu Lys lie Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gin
515 520 525
He Leu Ala He Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val
530 535 540
Ser Leu Gly Ala He Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gin
545 550 555 560
Cys Arg He Cys He
565
210> 10
211> 568
212> БЕЛОК
213> Вирус гриппа
400> 10
Met Glu Lys He Val Leu Leu Leu Ala He Val Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp Gin He Cys He Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gin Val
20 25 30
Asp Thr He Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gin Asp He
35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
55 60
Pro Leu lie Leu Arg Asp Cys Ser Vai Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe He Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr lie Val
85 90 95
Glu Lys Ala Asn Pro Thr Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg He Asn His Phe Glu
115 120 125
Lys He Gin lie He Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
130 135 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Leu Gly Ser Pro Ser Phe Phe
145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu He Lys Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr He
165 170 175
- 82 034733
Lys Lys Ser Tyr Asn Asn Thr 180
Gly lie His His Pro Asn Asp 195
Asn Pro Thr Thr Tyr lie Ser
210 215
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr
225 230
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr
245
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe
260
Val Lys Lys Gly Asp Ser Ala 275
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gln
290 295
Met Pro Phe His Asn lie His
305 310
Tyr Val Lys Ser Asn Arg Leu
325
Pro Gln Arg Glu Ser Arg Arg 340
Ala Gly Phe lie Glu Gly Gly 355
Gly Tyr His His Ser Asn Glu
370 375
Glu Ser Thr Gln Lys Ala lie
385 390 lie lie Asp Lys Met Asn Thr
405
Asn Asn Leu Glu Arg Arg lie 420
Gly Phe Leu Asp Val Trp Thr 435
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp
450 455
Tyr Asp Lys Val Arg Leu Gln
465 470
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr
485
Asn Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 185190
Ala Ala Glu Gln Thr Arg Leu Tyr Gln 200205 lie Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 220
Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
235240 lie Leu Lys Pro Asn Asp Ala lie Asn 250255 lie Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys lie 265270 lie Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly 280285
Thr Pro Met Gly Ala lie Asn Ser Ser 300
Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
315320
Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser 330335
Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie 345350
Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr 360365
Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys 380
Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser 395400
Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe 410415
Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp 425430
Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met 440445
Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu
460
Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly 475480
His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu
490495
- 83 034733
Ser He Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu 510 Glu Ala
500 505
Arg Leu Lys Arg Glu Glu lie Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser He Gly
515 520 525
Thr Tyr Gln He Leu Ser He Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala
530 535 540
Leu Ala He Met Met Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly
545 550 555 560
Ser Leu Gln Cys Arg lie Cys lie
565 <210> 11 <211> 1629 <212> ДНК <213> Вирус гриппа A <400> 11
gacaaaatat gtcttgggca ccatgctgtg gcaaatggaa caaaagtgaa cacattaaca 60
gagaggggga ttgaagtagt gaacgccaca gagacggtgg aaactgcgaa tatcaagaaa 120
atatgtattc aagggaaaag gccaacagat ctgggacaat gtggacttct aggaacccta 180
ataggacctc cccaatgtga tcaattcctg gagttttact ctgatttgat aattgagcga 240
agagaaggaa ccgatgtgtg ctatcccggt aaattcacaa atgaagaatc actgaggcag 300
atccttcgag ggtcaggagg aattgataag gagtcaatgg gtttcaccta tagtggaata 360
agaaccaatg gagcgacaag tgcctgcaaa agatcaggtt cttctttcta tgcagagatg 420
aagtggttgc tgtcgaattc agacaatgcg gcattccctc aaatgacaaa gtcgtataga 480
aatcccagaa acaaaccagc tctgataatt tggggagttc atcactctgg atcggttagc 540
gagcagacca aactctatgg aagtggaaac aagttgataa cagtaggaag ctcaaaatac 600
cagcaatcat tcaccccaag tccgggagca cggccacaag tgaatggaca atcagggaga 660
atcgattttc actggctact ccttgatccc aatgacacag tgaccttcac tttcaatggg 720
gcattcatag cccctgacag ggcaagtttc tttagaggag aatcactagg agtccagagt 780
gatgttcctc tggattctag ttgtggaggg gattgctttc acagtggggg tacgatagtc 840
agttccctgc cattccaaaa catcaaccct agaactgtgg ggagatgccc tcggtatgtc 900
aaacagacaa gcctcctttt ggctacagga atgagaaatg ttccagagaa tccaaagccc 960
agaggccttt ttggagcaat tgctggattc atagagaatg gatgggaggg tctcatcgat 1020
ggatggtatg gtttcagaca tcaaaatgca caaggggaag gaactgcagc tgactacaaa 1080
agcacccaat ctgcaataga tcagatcaca ggcaaattga atcgtctgat tgacaaaaca 1140
aatcagcagt ttgagctgat agacaatgag ttcaatgaga tagaacaaca aataggaaat 1200
- 84 034733 gtcattaatt ggacacgaga cgcaatgact gaggtatggt cgtataatgc tgagctgttg 1260 gtggcaatgg aaaatcagca tacaatagat cttgcggact cagaaatgaa caaactttat 1320 gagcgtgtca gaaaacaact aagggagaat gctgaagaag atggaactgg atgttttgag 1380 atattccata agtgtgatga tcagtgcatg gagagcataa ggaacaacac ttatgaccat 1440 actcaataca gaacagagtc attgcagaat agaatacaga tagacccagt gaaattgagt 1500 agtggataca aagacataat cttatggttt agcttcgggg catcatgttt tcttcttcta 1560 gccgttgtaa tgggattggt tttcatttgc ataaagaatg gaaacatgcg gtgcaccatt 1620 tgtatataa 1629
<210> 12
<211> 1773
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа A
<400> 12
agcaaaagca ggggttatac catagacaac caaaggcaag acaatggcca tcatttatct 60
aattcttctg ttcacagcag tgagagggga ccaaatatgc attggatacc attccaacaa 120
ttccacagaa aaggttgaca caatcctaga gagaaatgtc actgtgactc acgctgagga 180
cattcttgag aagactcaca atgggaagtt atgcaaacta aatggaatcc ctccacttga 240
attaagggat tgcagcattg ccggatggct ccttgggaat ccagaatgtg atatacttct 300
aactgtgcca gaatggtcat acataataga aaaagaaaat ccaaggaacg gcttgtgcta 360
cccaggcagt ttcaatgatt atgaagaatt gaagcatctt atcagcagcg tgacacattt 420
tgagaaagta aagattctgc ccagaaatga atggacacag catacaacaa ctggaggttc 480
acaggcttgc gcagactatg gtggtccgtc attcttccgg aacatggtct ggttgacaaa 540
gaaagggtcg aattatccaa ttgccaaaag atcttacaac aatacaagtg gggaacaaat 600
gctgatcatt tgggggatac atcaccccaa tgatgaaagt gaacaaagag cattgtatca 660
gaatgtgggg acctatgtgt cagtaggaac atcaacactg aacaaaagat catccccaga 720
aatagcaaca agacctaaag tgaatggaca aggaggcaga atggaattct cgtggactat 780
cttagatata tgggacacaa taaattttga gagtactggc aatctaattg caccagaata 840
tggtttcaaa atatccaaac gaggtagttc agggatcatg aaaacagaag gaaaacttga 900
aaactgcgag accaagtgcc aaactccttt gggagcaata aatacaacat taccctttca 960
caatatccac ccactgacca ttggtgagtg ccccaaatat gtaaaatcgg aaagattagt 1020
cttagcaaca ggactaagaa acgtccctca gattgagtca aggggattgt ttggggcaat 1080
agctggtttt atagagggtg gatggcaagg aatggttgat ggttggtatg ggtatcatca 1140
cagcaatgac cagggatctg ggtatgcagc agacaaagaa tccactcaaa aggcaattga 1200
- 85 034733
tggaatcacc aacaaggtaa attctgtgat cgaaaagatg aacacccaat tcggagctgt 1260
tggaaaagaa ttcagtaact tggagagaag actggagaac ttgaataaaa agatggagga 1320
cggatttcta gatgtgtgga catacaatgc cgagctccta gttctaatgg aaaatgagag 1380
gacacttgac tttcatgatt ctaatgtcaa gaatctatat gataaagtca gaatgcaact 1440
gagagacaat gcaaaagaac tagggaatgg atgttttgaa ttttatcaca aatgtgatga 1500
tgaatgcatg aacagtgtga agaatgggac atatgattat tccaagtatg aagaggagtc 1560
taaactaaac aggactgaaa tcaaaggggt taaattgagc aatatggggg tttatcaaat 1620
ccttgccatc tatgctacag tagcaggttc cctgtcactg gcaatcatga tagctgggat 1680
ttctatatgg atgtgctcca acgggtctct gcaatgcaga atctgcatat gatcatcagt 1740
cattttgtaa ttaaaaacac ccttgtttct act 1773
<210> 13 <211> 1086
<212> ДНК <213> Вирус гриппа A <400> 13
caaaaacttc ccggaaatga caacagcacg gcaacgctgt gccttgggca ccatgcagta 60
ccaaacggaa cgatagtgaa aacaatcacg aatgaccaaa ttgaagttac taatgctact 120
gagctggtac agagttcctc aacaggtgga atatgcgaca gtcctcatca gatccttgat 180
ggagaaaact gcacactaat agatgctcta ttgggagacc ctcagtgtga tggcttccaa 240
aataagaaat gggacctttt tgttgaacgc agcaaagcct acagcaactg ttacccttat 300
gatgtgccgg attatgcctc ccttaggtca ctagttgcct catccggcac actggagttt 360
aacaatgaaa gcttcgattg gactggagtc actcagaatg gaacaagctc tgcttgcaaa 420
aggagatcta ataaaagttt ctttagtaga ttgaattggt tgacccactt aaaatacaaa 480
tacccagcat tgaacgtgac tatgccaaac aatgaaaaat ttgacaaatt gtacatttgg 540
ggggttcacc acccgggtac ggacagtgac caaatcagcc tatatgctca agcatcagga 600
agaatcacag tctctaccaa aagaagccaa caaactgtaa tcccgaatat cggatctaga 660
cccagggtaa gggatgtctc cagccgaata agcatctatt ggacaatagt aaaaccggga 720
gacatacttt tgattaacag cacagggaat ctaattgctc ctcggggtta cttcaaaata 780
cgaagtggga aaagctcaat aatgagatca gatgcaccca ttggcaaatg caattccgaa 840
tgcatcactc caaatggaag cattcccaat gacaaaccat ttcaaaatgt aaacaggatc 900
acatatgggg cctgtcccag atatgttaag caaaacactc tgaaattggc aacagggatg 960
cgaaatgtac cagagaaaca aactagaggc atatttggcg caatcgcggg tttcatagaa 1020
- 86 034733 aatggttggg agggaatggt ggacggttgg tacggtttca ggcatcaaaa ttctgagggc 1080 acagga 1086 <210> 14 <211> 1048 <212> ДНК <213> Вирус гриппа A <400> 14
atgctatcaa tcacgattct gtttctgctc atagcagagg gttcctctca gaattacaca 60
gggaatcccg tgatatgcct gggacatcat gccgtatcca atgggacaat ggtgaaaacc 120
ctgactgatg accaagtaga agttgtcact gcccaagaat tagtggaatc gcaacatcta 180
ccggagttgt gtcctagccc tttaagatta gtagatggac aaacttgtga catcgtcaat 240
ggtgccttgg ggagtccagg ctgtgatcac ttgaatggtg cagaatggga tgtcttcata 300
gaacgaccca ctgctgtgga cacttgttat ccatttgatg tgccggatta ccagagccta 360
cggagtatcc tagcaaacaa tgggaaattt gagttcattg ctgaggaatt ccaatggaac 420
acagtcaaac aaaatgggaa atccggagca tgcaaaagag caaatgtgaa tgactttttc 480
aacagattga actggctgac caaatctgat gggaatgcat acccacttca aaacctgaca 540
aaggttaaca acggggacta tgcaagactt tacatatggg gagttcatca tccttcaact 600
gacacagaac aaaccaactt gtataagaac aaccctggga gagtaactgt ttccaccaaa 660
accagtcaaa caagtgtggt accaaacatt ggcagtagac catgggtaag aggccaaagc 720
ggcaggatta gcttctattg gacaattgtg gagccaggag acctcatagt cttcaacacc 780
atagggaatt taattgctcc gagaggtcat tacaagctta acagtcaaaa gaagagcaca 840
attctgaata ctgcaattcc cataggatct tgtgttagta aatgtcacac agataggggt 900
tcaatctcta caaccaaacc ctttcagaac atctcaagaa tatcaattgg ggactgtccc 960
aagtatgtca aacagggatc cttgaaacta gctacaggaa tgaggaatat ccctgagaaa 1020
gcaaccagag gcctgtttgg tgcaattg 1048
<210> 15
<211> 1707
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа A
<400> 15
atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaata gtcagtcttg ttaaaagtga tcagatttgc 60 attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca caataatgga aaagaacgtt 120 actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaaact ctgcgatcta 180 gatggagtga agcctctaat tttgagagat tgtagtgtag ctggatggct cctcggaaac 240 cctatgtgtg acgaattcat caatgtgccg gaatggtctt acatagtgga gaaggccagt 300
- 87 034733
ccagccaatg acctctgtta cccaggggat ttcaacgact atgaagaact gaaacaccta 360
ttgagcagaa taaaccactt tgagaaaatt cagatcatcc ccaaaagttc ttggtccaat 420
catgaagcct catcaggggt gagcgcagca tgtccatacc atgggaagcc ctcctttttc 480
agaaatgtgg tatggcttat caaaaagaac agtgcatacc caacaataaa gaggagctac 540
aataatacca accaagaaga tcttttggta ctgtggggga ttcaccatcc taatgatgcg 600
gcagagcaga caaagctcta tcaaaaccca accacctata tttccgttgg aacatcaaca 660
ctaaaccaga gattggtccc aaaaatagct actagatcca aagtaaacgg gcaaagtgga 720
agaatggagt tcttctggac aattttaaag ccgaatgatg ccataaattt cgagagtaat 780
ggaaatttca ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcagcaatt 840
atgaaaagtg aattggaata tggtaactgc aacaccaagt gtcaaactcc aatgggggcg 900
ataaactcta gtatgccatt ccacaacata caccctctca caatcgggga atgccccaaa 960
tatgtgaaat caaacagatt agtccttgcg actggactca gaaatacccc tcaaagagat 1020
agaagaagaa aaaagagagg actatttgga gctatagcag gttttataga gggaggatgg 1080
caaggaatgg tagatggttg gtatgggtac caccatagca atgagcaggg gagtggatac 1140
gctgcagaca aagaatccac tcaaaaggca atagatggag tcaccaataa ggtcaactcg 1200
atcattgaca aaatgaacac tcagtttgag gccgttggaa gggaatttaa taacttagaa 1260
aggaggatag aaaatttaaa caagaagatg gaagacggat tcctagatgt ctggacttat 1320
aatgctgaac ttctggttct catggaaaat gagagaactc tagactttca tgattcaaat 1380
gtcaagaacc tttacaacaa ggtccgacta cagcttaggg ataatgcaaa ggagctgggt 1440
aatggttgtt tcgagttcta tcacaaatgt gataatgaat gtatggaaag tgtaaaaaac 1500
gggacgtatg actacccgca gtattcagaa gaagcaagac taaacagaga ggaaataagt 1560
ggagtaaaat tggaatcaat gggaacttac caaatactgt caatttattc aacagtggcg 1620
agttccctag cactggcaat catggtagct ggtctatctt tatggatgtg ctccaatggg 1680
tcgttacaat gcagaatttg catttaa 1707
<210> 16 <211> 1050
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа A
<400> 16
atgattgcaa tcattgtaat agcgatactg gcagcagccg gaaagtcaga caagatctgc 60
attgggtatc atgccaacaa ttcaacaaca caggtggata cgatacttga gaagaatgta 120
accgtcacac actcagttga attgctggag aatcagaagg aagaaagatt ctgcaagatc 180
- 88 034733
ttgaacaagg cccctctcga cctaaaggga tgcaccatag agggttggat cttggggaat 240
ccccaatgcg atctgttgct tggtgaccaa agctggtcat atatagtgga aagacctact 300
gcccaaaatg ggatatgcta cccaggagct ttgaatgagg tagaagaact gaaagcattt 360
atcggatcag gagaaagggt agagagattt gagatgtttc ccaaaagcac atgggcaggg 420
gtagacacca gcagtggggt aacaaaagct tgtccttata atagtggttc atctttctac 480
agaaacctcc tatggataat aaagaccaag tcagcagcgt atccagtaat taagggaact 540
tacagcaaca ctggaaacca gccaatcctc tatttctggg gtgtgcacca tcctcctgac 600
accaatgagc aaaatactct gtatggctct ggcgatcggt atgttaggat gggaactgag 660
agcatgaatt ttgccaagag cccagaaatt gcggcaagac ccgctgtgaa tggccaaaga 720
ggtcgaattg attattactg gtctgtttta aaaccaggag aaaccttgaa tgtggaatct 780
aatggaaatc taatcgctcc ttggtatgca tacaaatttg tcaacacaaa taataaggga 840
gccgtcttca agtcaaattt accaatcgag aattgcgatg ccacatgcca gactattgca 900
ggagtcctaa ggaccaataa aacatttcag aatgtgagcc ctctgtggat aggagaatgc 960
cccaagtatg tgaaaagtga aagtctaagg cttgctactg gactaagaaa tgttccacag 1020
attgaaacca gagggctttt cggagctatc 1050
<210> 17
<211> 1698
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа A
<400> 17
atggaaaaat tcatcgcaat agcaaccttg gcgagcacaa atgcatacga taggatatgc 60
attgggtacc aatcaaacaa ctccacagac acagtgaaca ctctcataga acagaatgta 120
ccagtcaccc aaacaatgga gctcgtggaa acagagaaac atcccgctta ttgtaacact 180
gatttaggtg ccccattgga actgcgagac tgcaagattg aggcagtaat ctatgggaac 240
cccaagtgtg acatccatct gaaggatcaa ggttggtcat acatagtgga gaggcccagc 300
gcaccagaag ggatgtgtta ccctggatct gtggaaaatc tagaagaact gaggtttgtc 360
ttctccagtg ctgcatctta caagagaata agactatttg actattccag gtggaatgtg 420
actagatctg gaacgagtaa agcatgcaat gcatcaacag gtggccaatc cttctatagg 480
agcatcaatt ggttgaccaa aaaggaacca gacacttatg acttcaatga aggagcttat 540
gttaataatg aagatggaga catcattttc ttatggggga tccatcatcc gccggacaca 600
aaagagcaga caacactata taaaaatgca aacactttga gtagtgttac tactaacact 660
ataaacagaa gctttcaacc aaatattggt cccagaccat tagtaagagg acagcaaggg 720
aggatggatt actattgggg cattctgaaa agaggggaga ctctgaagat caggaccaac 780
- 89 034733
ggaaatttaa tcgcacctga atttggctat ctgctcaaag gtgaaagcta cggcagaata 840
attcaaaatg aggatatacc catcgggaac tgtaacacaa aatgtcaaac atatgcggga 900
gcaatcaata gcagcaaacc ctttcagaat gcaagtaggc attacatggg agaatgtccc 960
aaatatgtga agaaggcaag cttgcgactt gcagttgggc ttaggaatac gccttctgtt 1020
gaacccagag gactgtttgg agccattgct ggtttcattg aaggaggatg gtctggaatg 1080
attgatgggt ggtatggatt tcatcacagc aattcagagg gaacaggaat ggcagctgac 1140
cagaaatcaa cacaagaagc catcgataag atcaccaata aagtcaacaa tatagttgac 1200
aagatgaaca gggagtttga agttgtgaat catgagttct ctgaagttga aaaaagaata 1260
aacatgataa acgataaaat agatgaccaa attgaagatc tttgggctta caatgcagag 1320
ctccttgtgc tcttagagaa ccagaaaacg ctagacgaac atgattccaa tgtcaaaaac 1380
ctttttgatg aagtgaaaag gagactgtca gccaatgcaa tagatgctgg gaacggttgc 1440
tttgacatac ttcacaaatg cgacaatgag tgtatggaaa ctataaagaa cggaacttac 1500
gatcataagg aatatgaaga ggaggctaaa ctagaaagga gcaagataaa tggagtaaaa 1560
ctagaagaga acaccactta caaaattctt agcatttaca gtacagtggc ggccagtctt 1620
tgcttggcaa tcctgattgc tggaggttta atcctgggca tgcaaaatgg atcttgtaga 1680
tgcatgttct gtatttga 1698
<210> 18
<211> 1363
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа A
<400> 18
atggaaacag tatcactaat gactatacta ctagtagcaa cagcaagcaa tgcagacaaa 60
atctgcatcg gccaccagtc aacaaactcc acagaaactg tggacacgct aacagaaacc 120
aatgttcctg tgacacatgc caaagaattg ctccacacag agcacaatgg aatgctgtgt 180
gcaacaaatc tgggacatcc cctaatctta gacacgtgca ctattgaagg actgatctat 240
ggtaaccctt cttgtgactt gctgttggga ggaagagaat ggtcctacat cgtcgaaagg 300
tcatcagctg taaatggaac gtgttaccct gggaatgtag agaacctaga ggaactcagg 360
acacttttta gttccgctag ttcctaccga agaatccaaa tcttcccaga cacaatctgg 420
aatgtgactt acactggaac aagcaaagca tgttcagatt cattctacag gagtatgaga 480
tggctgactc aaaaaagcgg gtcttaccct gttcaagacg ctcaatacac aaataatatg 540
ggaaagagca ttcttttcgt gtggggcata catcacccac ccactgaagc tgcacagaca 600
aatttgtaca caagaaccga cacaacaaca agcgtgacaa cagaagactt aaataggatc 660
- 90 034733
ttcaaaccga tggtagggcc aaggcccctt gtcaatggtc tgcagggaag aattaattat 720
tattggtcgg tactaaaacc aggccagaca ctgcgagtaa gatccaatgg gaatctaatt 780
gctccatggt atggacacat tctttcggga gggagccatg gaagaatcct gaagactgat 840
ttaaaaagta gtaattgcgt agtgcaatgt cagactgaaa aaggcggctt aaacagtaca 900
ttgccgttcc acaatatcag taaatatgca tttggaaact gtcccaaata tgttagagtt 960
aaaagtctca aactggcagt agggttgagg aacgtgcctg ctagatcaag tagaggacta 1020
ttcggagcca tagctggatt catagaagga ggttggccag gactagtcgc tggttggtat 1080
ggtttccagc attcaaatga tcaaggggtt ggtattgcgg cagataggga ttcaactcaa 1140
aaggcaattg atagaataac aaccaaggtg aataatatag tcgacaaaat gaacaaacaa 1200
tatgaaataa ttgatcatga attcagtgag gttgaaacta ggctcaacat gatcaataat 1260
aagattgatg accaaataca agacatatgg gcatataatg cagagttgct agtactactt 1320
gaaaaccaga aaacactcga tgagcatgac gcaaatgtga aga 1363
<210> 19
<211> 1727
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа A
<400> 19
agcaaaagca ggggtcacaa tgtacaaagt agtagtaata attgcgctcc ttggagcagt 60
gaaaggtctt gacagaatct gcctaggaca ccatgcggtt gccaatggaa ccattgtgaa 120
gacccttaca aatgaacaag aggaagtgac caatgctact gagacggtag agagcacaaa 180
tttgaataaa ttgtgtatga aaggaagaag ctacaaggac ttgggcaatt gtcacccggt 240
aggaatgttg ataggaacac ctgtttgtga tccgcacttg accgggacct gggacactct 300
cattgagcga gagaatgcca ttgcccactg ttatccaggg gcaaccataa atgaagaagc 360
attgaggcag aaaataatgg aaagtggagg aatcagcaag atgagcactg gcttcactta 420
tgggtcttcc atcacctcag ctgggaccac taaggcatgc atgagaaatg gaggagatag 480
tttctatgca gagctcaaat ggctagtgtc aaagacaaag ggacaaaatt tccctcagac 540
aacaaacacc tatcggaata cggacacagc agaacatctc ataatatggg gaattcatca 600
cccttccagc acacaggaaa agaatgactt atacggaact cagtcactat ctatatcagt 660
tgagagttct acatatcaga acaactttgt tccagttgtt ggggcaagac ctcaggtcaa 720
tggacaaagt gggcgaattg actttcactg gacactagta cagccgggtg acaacataac 780
cttctcagac aatggaggtc taatagcacc aagtcgagtt agcaaattaa ctggaaggga 840
tttgggaatc caatcagaag cgttgataga caacagttgt gaatccaaat gcttttggag 900
agggggttct ataaatacaa agctcccttt tcaaaatctg tcacccagaa cagtaggtca 960
- 91 034733
atgccccaaa tacgtaaatc agaggagttt actgcttgca acagggatga ggaatgtgcc 1020
agaagtggtg cagggaaggg gtctgtttgg tgcaatagca gggttcatag aaaacggatg 1080
ggaaggaatg gtagacggct ggtatggttt cagacaccaa aatgcccagg gcacaggcca 1140
agctgctgat tacaagagta ctcaagcagc tattgaccaa atcacaggga aactgaacag 1200
gttgattgag aagaccaaca ctgagtttga gtcaatagaa tctgaattca gtgagactga 1260
gcatcaaatt ggtaacgtca ttaattggac caaagattca ataaccgaca tttggactta 1320
caacgcagag ctattagtgg caatggagaa tcagcacaca attgacatgg ctgattcaga 1380
gatgctaaat ctgtatgaaa gggtaagaaa gcaactcaga cagaatgcag aagaagacgg 1440
aaagggatgt tttgagatat atcatacttg tgatgattcg tgcatggaga gtataaggaa 1500
caatacttat gaccattcac aatacagaga ggaggctctt ctgaatagac tgaacatcaa 1560
cccagtgaaa ctttcttcgg ggtacaaaga catcatactt tggtttagct tcggggaatc 1620
atgctttgtt cttctagccg ttgttatggg tcttgttttc ttctgcctga aaaatggaaa 1680
catgcgatgc acaatctgta tttagttaaa aacaccttgt ttctact 1727
<210> 20
<211> 1698
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа A
<400> 20
atggagaaaa cactgctatt tgcagctatt ttcctttgtg tgaaagcaga tgagatctgt 60
atcgggtatt taagcaacaa ctcgacagac aaagttgaca caataattga gaacaatgtc 120
acggtcacta gctcagtgga actggttgag acagaacaca ctggatcatt ctgttcaatc 180
aatggaaaac aaccaataag ccttggagat tgttcatttg ctggatggat attaggaaac 240
cctatgtgtg atgaactaat tggaaagact tcatggtctt acattgtgga aaaacccaat 300
ccaacaaatg gaatctgtta cccaggaact ttagagagtg aagaagaact aagactgaaa 360
ttcagtggag ttttagaatt taacaaattc gaagtattca catcaaatgg atggggtgct 420
gtaaattcag gagtaggagt aaccgctgca tgcaaattcg ggggttctaa ttctttcttt 480
cgaaacatgg tatggctgat acaccaatca ggaacatatc ctgtaataaa gagaaccttt 540
aacaacacca aagggagaga tgtactgatt gtttggggaa ttcatcatcc tgctacactg 600
acagaacatc aagatctgta taaaaaggac agctcctatg tagcagtggg ttcagagacc 660
tacaacagaa gattcactcc agaaatcaac actaggccca gagtcaatgg acaggccgga 720
cggatgacat tctactggaa gatagtcaaa ccaggagaat caataacatt cgaatctaat 780
ggggcgttcc tagctcctag atatgctttt gagattgtct ctgttggaaa tgggaaactg 840
- 92 034733
ttcaggagcg aactgaacat tgaatcatgc tctaccaaat gtcaaacaga aataggagga 900
attaatacga acaaaagctt ccacaatgtt cacagaaaca ctatcgggga ttgccccaag 960
tatgtgaatg tcaaatcctt aaagcttgca acaggaccta gaaatgtccc agcaatagca 1020
tcgagaggct tgtttggagc aatagctgga ttcatagaag ggggatggcc tggactgatc 1080
aatggatggt atgggttcca acacagggac gaagaaggaa caggcattgc agcagacaag 1140
gagtcaactc aaaaggcaat agaccagata acatccaagg taaataacat cgttgacagg 1200
atgaatacaa actttgagtc tgtgcaacac gaattcagtg aaatagagga aagaataaat 1260
caattatcaa aacacgtaga tgattctgtg gttgacatct ggtcatataa tgcacagctt 1320
ctcgttttac ttgaaaatga gaagacactg gacctccatg actcaaatgt caggaacctc 1380
catgagaaag tcagaagaat gctaaaggac aatgccaaag atgaggggaa cggatgcttc 1440
accttttacc ataagtgtga caataaatgc attgaacgag ttagaaacgg aacatatgat 1500
cataaagaat tcgaggagga atcaaaaatc aatcgccagg agattgaagg ggtgaaacta 1560
gattctagtg ggaatgtgta taaaatactg tcaatttaca gctgcattgc aagcagtctt 1620
gtattggcag cactcatcat ggggttcatg ttttgggcat gcagtaatgg atcatgtaga 1680
tgtaccattt gcatttag 1698
<210> 21
<211> 1695
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа A
<400> 21
atggaaaaat tcatcatttt gagtactgtc ttggcagcaa gctttgcata tgacaaaatt 60
tgcattggat accaaacaaa caactcgact gaaacggtaa acacactaag tgaacaaaac 120
gttccggtga cgcaggtgga agaacttgta catcgtggga ttgatccgat cctgtgtgga 180
acggaactag gatcaccact agtgcttgat gactgttcat tagagggtct aatcctaggc 240
aatcccaaat gtgatcttta tttgaatggc agggaatggt catacatagt agagaggccc 300
aaagagatgg aaggagtttg ctatccaggg tcaattgaaa accaggaaga gctaagatct 360
ctgttttctt ccatcaaaaa atatgaaaga gtgaagatgt ttgatttcac caaatggaat 420
gtcacataca ctgggaccag caaggcctgc aataatacat caaaccaagg ctcattctat 480
aggagcatga gatggttgac cttaaaatca ggacaatttc cagtccaaac agatgagtac 540
aagaacacca gagattcaga cattgtattc acctgggcca ttcaccaccc accaacatct 600
gatgaacaag taaaattata caaaaatcct gatactctct cttcagtcac caccgtagaa 660
atcaatagga gcttcaagcc taatataggg ccaagaccac tcgtgagagg acaacaaggg 720
agaatggatt actactgggc tgttcttaaa cctggacaaa cagtcaaaat acaaaccaat 780
- 93 034733
ggtaatctta ttgcacctga atatggtcac ttaatcacag ggaaatcaca tggcaggata 840
ctcaagaata atttgcccat gggacagtgt gtgactgaat gtcaattgaa cgagggtgta 900
atgaacacaa gcaaaccttt ccagaacact agtaagcact atattgggaa atgccccaaa 960
tacataccat cagggagttt aaaattggca atagggctca ggaatgtccc acaagttcaa 1020
gatcgggggc tctttggagc aattgcaggt ttcatagaag gcggatggcc agggctagtg 1080
gctggttggt acggatttca gcatcaaaat gcggagggga caggcatagc tgcagacaga 1140
gacagcaccc aaagggcaat agacaatatg caaaacaaac tcaacaatgt catcgacaaa 1200
atgaataaac aatttgaagt ggtgaatcat gagttttcag aagtggaaag cagaataaac 1260
atgattaatt ccaaaattga tgatcagata actgacatat gggcatacaa tgctgaattg 1320
cttgtcctat tggaaaatca gaagacatta gatgagcatg acgctaatgt aaggaatcta 1380
catgatcggg tcagaagagt cctgagggaa aatgcaattg acacaggaga cggctgcttt 1440
gagattttac ataaatgtga caacaattgt atggacacga ttagaaacgg gacatacaat 1500
cacaaagagt atgaggaaga aagcaaaatc gaacgacaga aagtcaatgg tgtgaaactt 1560
gaggagaatt ctacatataa aattctgagc atctacagca gtgttgcctc aagcttagtt 1620
ctactgctca tgattattgg gggtttcatt ttcgggtgtc aaaatggaaa tgttcgttgt 1680
actttctgta tttaa 1695
<210> 22
<211> 1701
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа A
<400> 22
atggctctaa atgtcattgc aactttgaca cttataagtg tatgtgtaca tgcagacaga 60
atatgcgtgg ggtatctgag caccaattca tcagaaaggg tcgacacgct ccttgaaaat 120
ggggtcccag tcaccagctc cattgatctg attgagacaa accacacagg aacatactgt 180
tctctaaatg gagtcagtcc agtgcatttg ggagattgca gctttgaagg atggattgta 240
ggaaacccag cctgcaccag caactttggg atcagagagt ggtcatacct gattgaggac 300
cccgcggccc ctcatgggct ttgctaccct ggagaattaa acaacaatgg tgaactcaga 360
cacttgttca gtggaatcag gtcattcagt agaacggaat tgatcccacc tacctcctgg 420
ggggaagtac ttgacggtac aacatctgct tgcagagata acacgggaac caacagcttc 480
tatcgaaatt tagtttggtt tataaagaag aatactagat atccagttat cagtaagacc 540
tacaacaata caacgggaag ggatgtttta gttttatggg gaatacatca cccagtgtct 600
gtggatgaga caaagactct gtatgtcaat agtgatccat acacactggt ttccaccaag 660
- 94 034733
tcttggagcg agaaatataa actagaaacg ggagtccgac ctggctataa tggacagagg 720
agctggatga aaatttattg gtctttgata catccagggg agatgattac tttcgagagt 780
aatggtggat ttttagcccc aagatatggg tacataattg aagaatatgg aaaaggaagg 840
attttccaga gtcgcatcag aatgtctagg tgcaacacca agtgccagac ttcggttgga 900
gggataaaca caaacagaac gttccaaaac atcgataaga atgctcttgg tgactgtccc 960
aaatacataa agtctggcca actcaagcta gccactggac tcagaaatgt gccagctata 1020
tcgaatagag gattgttcgg agcaattgca gggttcatag aaggaggctg gccaggttta 1080
atcaatggtt ggtacggttt tcagcatcaa aatgaacagg gaacaggaat agctgcagac 1140
aaagaatcaa cacagaaagc tatagaccag ataacaacca aaataaataa cattattgat 1200
aaaatgaatg ggaactatga ttcaattagg ggtgaattca atcaagttga gaagcgtata 1260
aacatgcttg cagacagaat agatgatgcc gtgacggaca tttggtcata caatgccaaa 1320
cttcttgtat tgctggaaaa tgataaaact ttagatatgc atgatgctaa tgtaaagaat 1380
ttacatgagc aagtacgaag agaattgaag gacaatgcaa ttgacgaagg aaatggctgt 1440
tttgaactcc ttcataaatg caatgactcc tgcatggaaa ctataagaaa tggaacgtat 1500
gaccacactg agtatgcaga ggagtcaaag ttaaagaggc aagaaatcga tgggatcaaa 1560
ctcaaatcag aagacaacgt ttacaaagca ttatcaatat acagttgcat tgcaagtagt 1620
gttgtactag taggactcat actctctttc atcatgtggg cctgtagtag tgggaattgc 1680
cgattcaatg tttgtatata a 1701
<210> 23
<211> 1749
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа A
<400> 23
agcaaaagca ggggaaaatg attgcactca tattggttgc actggctctg agccacactg 60
cttattctca gatcacaaat gggacaacag gaaaccccat tatatgcttg gggcatcatg 120
cagtggaaaa cggcacatct gttaaaacac taacagacaa tcacgtagaa gttgtgtcag 180
ctaaagaatt agttgagacg aaccacactg atgaactgtg cccaagcccc ttgaagcttg 240
tcgacgggca agactgccac ctcatcaatg gtgcattggg gagtccaggc tgtgaccgtt 300
tgcaggacac cacttgggat gtcttcattg aaaggcccac tgcagtagac acatgttatc 360
cattcgacgt cccagattac cagagtctca gaagcatcct agcaagcagt gggagtttgg 420
agttcatcgc cgaacaattc acctggaatg gtgtcaaagt tgacggatca agcagtgctt 480
gtttgagggg cggtcgcaac agcttcttct cccgactaaa ctggctaacc aaagcaacaa 540
atggaaacta tggacctatt aacgtcacta aagaaaatac gggctcttat gtcaggctct 600
- 95 034733
atctctgggg agtgcatcac ccatcaagcg ataatgagca aacggatctc tacaaggtgg 660
caacagggag agtaacagta tctacccgct cggaccaaat cagtattgtt cccaatatag 720
gaagtagacc gagggtaagg aatcagagcg gcaggataag catctactgg accctagtaa 780
acccagggga ctccatcatt ttcaacagta ttgggaattt gattgcacca agaggccact 840
acaaaataag caaatctact aagagcacag tgcttaaaag tgacaaaagg attgggtcat 900
gcacaagccc ttgcttaact gataaaggtt cgatccaaag tgacaaacct tttcagaatg 960
tatcaaggat tgctatagga aactgcccga aatatgtaaa gcaagggtcc ctgatgttag 1020
caactggaat gcgcaacatc cctggcaaac aggcaaaggg cttatttggg gcaattgctg 1080
gattcattga aaatggttgg caaggcctga ttgatgggtg gtatggattc aggcaccaaa 1140
atgctgaagg aacaggaact gctgcaga.cc tgaagtcaac tcaggcagcc attgatcaga 1200
taaatggcaa gctgaacaga ttgatagaga agacaaatga aaaatatcac caaatagaaa 1260
aggaattcga acaggtggaa ggaagaatac aagaccttga gaagtacgtt gaggacacta 1320
agattgattt gtggtcatac aatgctgaat tgctagtagc actagagaat cagcacacaa 1380
tagatgtcac agactccgaa atgaacaagc tttttgaaag agtaagaagg caattaagag 1440
agaatgcaga agatcaaggc aacggttgtt tcgagatatt ccatcagtgt gacaacaatt 1500
gtatagaaag cattagaaac ggaacttatg accacaacat ctacagggat gaagccatca 1560
acaatcgaat caaaataaat cctgtcactt tgacgatggg gtacaaggac ataatcctgt 1620
ggatttcttt ctccatgtca tgctttgtct tcgtggcact gattctggga tttgttctat 1680
gggcttgtca aaacgggaat atccgatgcc aaatctgtat ataaagaaaa aacacccttg 1740
tttctactc 1749
<210> 24
<211> 1762
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа A
<400> 24
agcaaaagca ggggatacaa aatgaacact caaatcatcg tcattctagt cctcggactg 60 tcgatggtga gatctgacaa gatttgtctc gggcaccatg ccgtagcaaa tgggacaaaa 120 gtcaacacac taactgagaa aggagtggaa gtggtcaatg ccacggagac agtggagatt 180 acaggaataa ataaagtgtg cacaaaaggg aagaaagcgg tggacttggg atcttgtgga 240 atactgggaa ctatcattgg gcctccacaa tgtgactctc atcttaaatt caaagctgat 300 ctgataatag aaagaagaaa ttcaagtgac atctgttacc cagggaaatt cactaatgag 360 gaagcactga gacaaataat cagagaatct ggtggaattg acaaagagcc aatgggattt 420
- 96 034733
agatattcag gaataaaaac agacggggca accagtgcgt gtaagagaac agtgtcctct 480
ttctactcag aaatgaaatg gcttttatcc agcaaggcta accaggtgtt cccacaactg 540
aatcagacat acaggaacaa cagaaaagaa ccagccctaa ttgtttgggg agtacatcat 600
tcaagttcct tggatgagca aaataagcta tatggagctg ggaacaagct gataacagta 660
ggaagctcaa aataccaaca atcgttttca ccaagtccag gggacaggcc caaagtgaat 720
ggtcaggccg ggaggatcga ctttcattgg atgctattgg acccagggga tacagtcact 780
tttaccttca atggtgcatt catagcccca gatagagcca cctttctccg ctctaatgcc 840
ccatcgggag ttgagtacaa tgggaagtca ctgggaatac agagtgatgc acaaattgat 900
gaatcatgtg aaggggaatg cttctacagt ggagggacaa taaacagccc tttgccattt 960
caaaacatcg atagttgggc tgtcggaagg tgccccagat atgtaaagca atcaagcctg 1020
ccgctggcct taggaatgaa aaatgtacca gagaaaatac atactagggg actgttcggt 1080
gcaattgcag gattcatcga gaatggatgg gaaggactca ttgatggatg gtatggattt 1140
aggcatcaaa atgcacaggg gcagggaaca gctgctgact acaagagtac tcaggctgca 1200
attgaccaga taacagggaa acttaataga ttaattgaaa aaaccaacac acagtttgaa 1260
ctcatagaca atgagttcac tgaagtggag cagcagatag gcaatgtaat aaactggaca 1320
agggactcct tgactgagat ctggtcatac aatgctgaac ttctagtagc aatggaaaat 1380
cagcatacaa ttgaccttgc agattctgaa atgaacaaac tctatgagag agtgagaaga 1440
cagctaaggg agaatgccga ggaggatgga actggatgtt ttgagatttt ccaccgatgt 1500
gacgatcaat gtatggagag catacgaaat aatacttaca atcacactga atatcgacag 1560
gaagccttac agaataggat aatgatcaat ccggtaaagc ttagtggtgg gtacaaagat 1620
gtgatactat ggtttagctt cggggcatca tgtgtaatgc ttctagccat tgctatgggt 1680
cttattttca tgtgtgtgaa aaacgggaat ctgcggtgca ctatctgtat ataattattt 1740
gaaaaacacc cttgtttcta Ct 1762
<210> 25 <211> 1760 <212> ДНК <213> Вирус гриппа A
<400> 25
agcaaaagca ggggatattg tcaaaacaac agaatggtga tcaaagtgct ctactttctc 60
atcgtattgt taagtaggta ttcgaaagca gacaaaatat gcataggata tctaagcaac 120
aacgccacag acacagtaga cacactgaca gagaacggag ttccagtgac cagctcagtt 180
gatctcgttg aaacaaacca cacaggaaca tactgctcac tgaatggaat cagcccaatt 240
catcttggtg actgcagctt tgagggatgg atcgtaggaa acccttcctg tgccaccaac 300
- 97 034733
atcaacatca gagagtggtc gtatctaatt gaggacccca atgcccccaa caaactctgc 360
ttcccaggag agttagataa taatggagaa ttacgacatc tcttcagcgg agtgaactct 420
tttagcagaa cagaattaat aagtcccaac aaatggggag acattctgga tggagtcacc 480
gcttcttgcc gcgataatgg ggcaagcagt ttttacagaa atttggtctg gatagtgaag 540
aataaaaatg gaaaataccc tgtcataaag ggggattaca ataacacaac aggcagagat 600
gttctagtac tctggggcat tcaccatccg gatacagaaa caacagccat aaacttgtac 660
gcaagcaaaa acccctacac attagtatca acaaaggaat ggagcaaaag atatgaacta 720
gaaattggca ccagaatagg tgatggacag agaagttgga tgaaactata ttggcacctc 780
atgcgccctg gagagaggat aatgtttgaa agcaacgggg gccttatagc gcccagatac 840
ggatacatca ttgagaagta cggtacagga cgaattttcc aaagtggagt gagaatggcc 900
aaatgcaaca caaagtgtca aacatcatta ggtgggataa acaccaacaa aactttccaa 960
aacatagaga gaaatgctct tggagattgc ccaaagtaca taaagtctgg acagctgaag 1020
cttgcaactg ggctgagaaa tgtcccatcc gttggtgaaa gaggtttgtt tggtgcaatt 1080
gcaggcttca tagaaggagg gtggcctggg ctaattaatg gatggtatgg tttccagcat 1140
cagaatgaac aggggactgg cattgctgca gacaaagcct ccactcagaa agcgatagat 1200
gaaataacaa caaaaattaa caatataata gagaagatga acggaaacta tgattcaata 1260
agaggggaat tcaatcaagt agaaaagagg atcaacatgc tcgctgatcg agttgatgat 1320
gcagtaactg acatatggtc gtacaatgct aaacttcttg tactgcttga aaatgggaga 1380
acattggact tacacgacgc aaatgtcagg aacttacacg atcaggtcaa gagaatattg 1440
aaaagtaatg ctattgatga aggagatggt tgcttcaatc ttcttcacaa atgtaatgac 1500
tcatgcatgg aaactattag aaatgggacc tacaatcatg aagattacag ggaagaatca 1560
caactgaaaa ggcaggaaat tgagggaata aaattgaagt ctgaagacaa tgtgtataaa 1620
gtactgtcga tttatagctg cattgcaagc agtattgtgc tggtaggtct catacttgcg 1680
ttcataatgt gggcatgcag caatggaaat tgccggttta atgtttgtat atagtcggaa 1740
aaaataccct tgtttctact 1760
<210> 26 <211> 1882
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа В
<400> 26
agcagaagcg ttgcattttc taatatccac aaaatgaagg caataattgt actactcatg 60
gtagtaacat ccaatgcaga tcgaatctgc actgggataa catcgtcaaa ctcacctcat 120
- 98 034733
gtggttaaaa ctgccactca aggggaagtc aatgtgactg gtgtgatacc actaacaaca 180
acacctacca aatctcattt tgcaaatctc aaaggaacac agaccagagg aaaactatgc 240
ccaaactgtt ttaactgcac agatctggac gtggccctag gcagaccaaa atgcatgggg 300
aacacaccct ccgcaaaagt ctcaatactc catgaagtca aacctgctac atctggatgc 360
tttcctataa tgcacgacag aacaaaaatc agacaactac ctaatcttct cagaggatat 420
gaaaacatca ggttatcaac cagtaatgtt atcaatacag agacggcacc aggaggaccc 480
tacaaggtgg ggacctcagg atcttgccct aacgttgcta atgggaacgg cttcttcaac 540
acaatggctt gggttatccc aaaagacaac aacaagacag caataaatcc agtaacagta 600
gaagtaccat acatttgttc agaaggggaa gaccaaatta ctgtttgggg gttccactct 660
gatgacaaaa cccaaatgga aagactctat ggagactcaa atcctcaaaa gttcacctca 720
tctgccaatg gagtaaccac acattatgtt tctcagattg gtggcttccc aaatcaaaca 780
gaagacgaag ggctaaaaca aagcggcaga attgttgttg attacatggt acaaaaacct 840
ggaaaaacag gaacaattgt ttatcaaaga ggcattttat tgcctcaaaa agtgtggtgc 900
gcaagtggca ggagcaaggt aataaaaggg tccttgcctt taattggtga agcagattgc 960
ctccacgaaa agtacggtgg attaaataaa agcaagcctt actacacagg agagcatgca 1020
aaggccatag gaaattgccc aatatgggtg aaaacaccct tgaagctggc caatggaacc 1080
aaatatagac cgcctgcaaa actattaaag gaaagaggtt tcttcggagc tattgctggt 1140
ttcttggaag gaggatggga aggaatgatt gcaggttggc acggatacac atctcatgga 1200
gcacatggag tggcagtggc agcagacctt aagagtacac aagaagctat aaacaagata 1260
acaaaaaatc tcaactattt aagtgagcta gaagtaaaaa accttcaaag actaagcgga 1320
gcaatgaatg agcttcacga cgaaatactc gagctagacg aaaaagtgga tgatctaaga 1380
gctgatacaa taagctcaca aatagagctt gcagtcttgc tttccaacga agggataata 1440
aacagtgaag atgagcatct cttggcactt gaaagaaaac tgaagaaaat gcttggcccc 1500
tctgctgtag aaatagggaa tgggtgcttt gaaaccaaac acaaatgcaa ccagacttgc 1560
ctagacagga tagctgctgg cacctttaat gcaggagatt tttctcttcc cacttttgat 1620
tcattaaaca ttactgctgc atctttaaat gatgatggct tggataatca tactatactg 1680
ctctactact caactgctgc ttctagcttg gctgtaacat taatgatagc tatcttcatt 1740
gtctacatgg tctccagaga caatgtttct tgttccatct gtctgtgagg gagattaagc 1800
cctgtgtttt cctttactgt agtgctcatt tgcttgtcac cattacaaag aaacgttatt 1860
gaaaaatgct cttgttacta Ct 1882
<210> 27
- 99 034733
<211> 2073
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа С
<400> 27
agcagaagca gggggttaat aatgtttttc tcattactct tggtgttggg cctcacagag 60
gctgaaaaaa taaagatatg ccttcaaaag caagtgaaca gtagcttcag cctacacaat 120
ggcttcggag gaaatttgta tgccacagaa gaaaaaagaa tgtttgagct tgttaagccc 180
aaagctggag cctctgtctt gaatcaaagt acatggattg gctttggaga ttcaaggact 240
gacaaaagca attcagcttt tcctaggtct gctgatgttt cagcaaaaac tgctgataag 300
tttcgttttt tgtctggtgg atccttaatg ttgagtatgt ttggcccacc tgggaaggta 360
gactaccttt accaaggatg tggaaaacat aaagtttttt atgaaggagt taactggagt 420
ccacatgctg ctataaattg ttacagaaaa aattggactg atatcaaact gaatttccag 480
aaaaacattt atgaattggc ttcacaatca cattgcatga gcttggtgaa tgccttggac 540
aaaactattc ctttacaagt gactgctggg actgcaggaa attgcaacaa cagcttctta 600
aaaaatccag cattgtacac acaagaagtc aagccttcag aaaacaaatg tgggaaagaa 660
aatcttgctt tcttcacact tccaacccaa tttggaacct atgagtgcaa actgcatctt 720
gtggcttctt gctatttcat ctatgatagt aaagaagtgt acaataaaag aggatgtgac 780
aactactttc aagtgatcta tgattcattt ggaaaagtcg ttggaggact agataacagg 840
gtatcacctt acacagggaa ttctggagac accccaacaa tgcaatgtga catgctccag 900
ctgaaacctg gaagatattc agtaagaagc tctccaagat tccttttaat gcctgaaaga 960
agttattgct ttgacatgaa agaaaaagga ccagtcactg ctgtccaatc catttgggga 1020
aaaggcagag aatctgacta tgcagtggat caagcttgct tgagcactcc agggtgcatg 1080
ttgatccaaa agcaaaagcc atacattgga gaagctgatg atcaccatgg agatcaagaa 1140
atgagggagt tgctgtcagg actggactat gaagctagat gcatatcaca atcagggtgg 1200
gtgaatgaaa ccagtccttt tacggagaaa tacctccttc ctcccaaatt tggaagatgc 1260
cctttggctg caaaggaaga atccattcca aaaatcccag atggccttct aattcccacc 1320
agtggaaccg ataccactgt aaccaaacct aagagcagaa tttttggaat cgatgacctc 1380
attattggtg tgctctttgt tgcaatcgtt gaaacaggaa ttggaggcta tctgcttgga 1440
agtagaaaag aatcaggagg aggtgtgaca aaagaatcag ctgaaaaagg gtttgagaaa 1500
attggaaatg acatacaaat tttaaaatct tctataaata tcgcaataga aaaactaaat 1560
gacagaattt ctcatgatga gcaagccatc agagatctaa ctttagaaat tgaaaatgca 1620
agatctgaag ctttattggg agaattggga ataataagag ccttattggt aggaaatata 1680
- 100 034733
agcataggat tacaggaatc tttatgggaa ctagcttcag aaataacaaa tagagcagga 1740
gatctagcag ttgaagtctc cccaggttgc tggataattg acaataacat ttgtgatcaa 1800
agctgtcaaa attttatttt caagttcaac gaaactgcac ctgttccaac cattccccct I860
cttgacacaa aaattgatct gcaatcagat cctttttact ggggaagcag cttgggctta 1920
gcaataactg ctactatttc attggcagct ttggtgatct ctgggatcgc catctgcaga 1980
actaaatgat tgagacaatt ttgaaaaatg gataatgtgt tggteaatat tttgtacagt 2040
tttataaaaa acaaaaatcc ccttgctact get 2073
<210> 28
<211> 1670
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа A
<400> 28
agatettege tgacacaata tgtatagget accatgccaa caactcaacc gacactgttg 60
acacagtact tgagaagaat gtgacagtga cacactctgt caacctactt gaggacagtc 120
acaatggaaa actatgtcta ctaaaaggaa tagccccact acaattgggt aattgcagcg 180
ttgccggatg gatettagga aacccagaat gcgaattact gatttccaag gaatcatggt 240
cctacattgt agaaacacca aatcctgaga atggaacatg ttacccaggg tatttegeeg 300
actatgagga aetgagggag caattgagtt cagtatcttc atttgagaga ttegaaatat 360
tccccaaaga aagctcatgg cccaaccaca ccgtaaccgg agtatcagca tcatgctccc 420
ataatgggaa aagcagtttt tacagaaatt tgctatggct gacggggaag aatggtttgt 480
acccaaacct gagcaagtcc tatgtaaaca acaaagagaa agaagteett gtactatggg 540
gtgttcatca cccgcctaac atagggaacc aaagggcact ctatcataca gaaaatgett 600
atgtctctgt agtgtcttca cattatagca gaagattcac cccagaaata gccaaaagac 660
ccaaagtaag agatcaggaa ggaagaatca actactactg gactctgctg gaacctgggg 720
atacaataat atttgaggca aatggaaatc taatagegee atggtatget tttgcactga 780
gtagaggett tggatcagga atcatcacct caaatgcacc aatggatgaa tgtgatgega 840
agtgtcaaac acctcaggga gctataaaca gcagtcttcc tttccagaat gtacacccag 900
tcacaatagg agagtgtcca aagtatgtca ggagtgcaaa attaaggatg gttacaggac 960
taaggaacat cccatccatt caatccagag gtttgtttgg agccattgcc ggtttcattg 1020
aaggggggtg gactggaatg gtagatgggt ggtatggtta tcatcatcag aatgagcaag 1080
gatetggeta tgetgeagat caaaaaagta cacaaaatgc cattaacggg attacaaaca 1140
aggteaatte tgtaattgag aaaatgaaca ctcaattcac agctgtgggc aaagagttca 1200
acaaattgga aagaaggatg gaaaaettaa ataaaaaagt tgatgatggg tttctagaca 1260
- 101 034733
tttggacata taatgcagaa ttgttggttc tactggaaaa tgaaaggact ttggatttcc 1320
atgactccaa tgtgaagaat ctgtatgaga aagtaaaaag ccaattaaag aataatgcca 1380
aagaaatagg aaacgggtgt tttgagttct atcacaagtg taacaatgaa tgcatggaga 1440
gtgtgaaaaa tggtacctat gactatccaa aatattccga agaatcaaag ttaaacaggg 1500
agaaaattga tggagtgaaa ttggaatcaa tgggagtata ccagattctg gcgatctact 1560
caactgtcgc cagttccctg gttcttttgg tctccctggg ggcaatcagc ttctggatgt 1620
gttccaatgg gtctttgcag tgtagaatat gcatctaaga gctcaggcct 1670
<210> 29 <211> 32 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Xmal-pPlas.c праймер <400>29 agttccccgg gctggtatat ttatatgttg tc32 <210>30 <211>46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> SacI-ATG-pPlas.r <400>30 aatagagctc cattttctct caagatgatt aattaattaa ttagtc46
<210> 31
<211> 46
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SacI-PlasTer. с
<400> 31
aatagagctc gttaaaatgc ttcttcgtct cctatttata atatgg46
<210> 32
<211> 48
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> EcoRI-PlasTer.r
<400> 32
ttacgaattc tccttcctaa ttggtgtact atcatttatc aaagggga48 <210>33 <211>1711
- 102 034733 <212> ДНК <213> Вирус гриппа А <400> 33
atgaaagcaa aactactggt cctgttatgt acatttacag ctacatatgc agacacaata 60
tgtataggct accatgccaa caactcaacc gacactgttg acacagtact tgagaagaat 120
gtgacagtga cacactctgt caacctactt gaggacagtc acaatggaaa actatgtcta 180
ctaaaaggaa tagccccact acaattgggt aattgcagcg ttgccggatg gatcttagga 240
aacccagaat gcgaattact gatttccaag gaatcatggt cctacattgt agaaacacca 300
aatcctgaga atggaacatg ttacccaggg tatttcgccg actatgagga actgagggag 360
caattgagtt cagtatcttc atttgagaga ttcgaaatat tccccaaaga aagctcatgg 420
cccaaccaca ccgtaaccgg agtatcagca tcatgctccc ataatgggaa aagcagtttt 480
tacagaaatt tgctatggct gacggggaag aatggtttgt acccaaacct gagcaagtcc 540
tatgtaaaca acaaagagaa agaagtcctt gtactatggg gtgttcatca cccgcctaac 600
atagggaacc aaagggccct ctatcataca gaaaatgctt atgtctctgt agtgtcttca 660
cattatagca gaagattcac cccagaaata gccaaaagac ccaaagtaag agatcaggaa 720
ggaagaatca actactactg gactctgctg gaacctgggg atacaataat atttgaggca 780
aatggaaatc taatagcgcc atggtatgct tttgcactga gtagaggctt tggatcagga 840
atcatcacct caaatgcacc aatggatgaa tgtgatgcga agtgtcaaac acctcaggga 900
gctataaaca gcagtcttcc tttccagaat gtacacccag tcacaatagg agagtgtcca 960
aagtatgtca ggagtgcaaa attaaggatg gttacaggac taaggaacat cccatccatt 1020
caatccagag gtttgtttgg agccattgcc ggtttcattg aaggggggtg gactggaatg 1080
gtagatgggt ggtatggtta tcatcatcag aatgagcaag gatctggcta tgctgcagat 1140
caaaaaagta cacaaaatgc cattaacggg attacaaaca aggtgaattc tgtaattgag 1200
aaaatgaaca ctcaattcac agctgtgggc aaagaattca acaaattgga aagaaggatg 1260
gaaaacttaa ataaaaaagt tgatgatggg tttctagaca tttggacata taatgcagaa 1320
ttgttggttc tactggaaaa tgaaaggact ttggatttcc atgactccaa tgtgaagaat 1380
ctgtatgaga aagtaaaaag ccaattaaag aataatgcca aagaaatagg aaacgggtgt 1440
tttgaattct atcacaagtg taacaatgaa tgcatggaga gtgtgaaaaa tggaacttat 1500
gactatccaa aatattccga agaatcaaag ttaaacaggg agaaaattga tggagtgaaa 1560
ttggaatcaa tgggagtcta tcagattctg gcgatctact caactgtcgc cagttccctg 1620
gttcttttgg tctccctggg ggcaatcagc ttctggatgt gttccaatgg gtctttgcag 1680
tgtagaatat gcatctgaga ccagaatttc a 1711
- 103 034733
<210> 34
<211> 1781
<212> ДНК
<213> Medicago sativa
<400> 34
ccaaatcctt aacattcttt caacaccaac aatggcgaaa aacgttgcga ttttcggttt 60
attgttttct cttcttctgt tggttccttc tcagatcttc gctgaggaat catcaactga 120
cgctaaggaa tttgttctta cattggataa cactaatttc catgacactg ttaagaagca 180
cgatttcatc gtcgttgaat tctacgcacc ttggtgtgga cactgtaaga agctagcccc 240
agagtatgag aaggctgctt ctatcttgag cactcacgag ccaccagttg ttttggctaa 300
agttgatgcc aatgaggagc acaacaaaga cctcgcatcg gaaaatgatg ttaagggatt 360
cccaaccatt aagattttta ggaatggtgg aaagaacatt caagaataca aaggtccccg 420
tgaagctgaa ggtattgttg agtatttgaa aaaacaaagt ggccctgcat ccacagaaat 480
taaatctgct gatgatgcga ccgcttttgt tggtgacaac aaagttgtta ttgtcggagt 540
tttccctaaa ttttctggtg aggagtacga taacttcatt gcattagcag agaagttgcg 600
ttctgactat gactttgctc acactttgaa tgccaaacac cttccaaagg gagactcatc 660
agtgtctggg cctgtggtta ggttatttaa gccatttgac gagctctttg ttgactcaaa 720
ggatttcaat gtagaagctc tagagaaatt cattgaagaa tccagtaccc caattgtgac 780
tgtcttcaac aatgagccta gcaatcaccc ttttgttgtc aaattcttta actctcccaa 840
cgcaaaggct atgttgttca tcaactttac taccgaaggt gctgaatctt tcaaaacaaa 900
ataccatgaa gtggctgagc aatacaaaca acagggagtt agctttcttg ttggagatgt 960
tgagtctagt caaggtgcct tccagtattt tggactgaag gaagaacaag tacctctaat 1020
tattattcag cataatgatg gcaagaagtt tttcaaaccc aatttggaac ttgatcaact 1080
cccaacttgg ttgaaggcat acaaggatgg caaggttgaa ccatttgtca agtctgaacc 1140
tattcctgaa actaacaacg agcctgttaa agtggtggtt gggcaaactc ttgaggacgt 1200
tgttttcaag tctgggaaga atgttttgat agagttttat gctccttggt gtggtcactg 1260
caagcagttg gctccaatct tggatgaagt tgctgtctca ttccaaagcg atgctgatgt 1320
tgttattgca aaactggatg caactgccaa cgatatccca accgacacct ttgatgtcca 1380
aggctatcca accttgtact tcaggtcagc aagtggaaaa ctatcacaat acgacggtgg 1440
taggacaaag gaagacatca tagaattcat tgaaaagaac aaggataaaa ctggtgctgc 1500
tcatcaagaa gtagaacaac caaaagctgc tgctcagcca gaagcagaac aaccaaaaga 1560
tgagctttga aaagttccgc ttggaggata tcggcacaca gtcatctgcg ggctttacaa 1620
- 104 034733
ctcttttgta tctcagaatc agaagttagg aaatcttagt gccaatctat ctatttttgc 1680
gtttcatttt atctttttgg tttactctaa tgtattactg aataatgtga gttttggcgg 1740
agtttagtac tggaactttt gtttctgtaa aaaaaaaaaa a 1781
<210> 35
<211> 1027
<212> ДНК
<213> Вирус гриппа A
<400> 35
agcgaaagca ggtagatatt gaaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct 60
ctctatcatc ccgtcaggcc ccctcaaagc cgagatcgca cagagacttg aagatgtctt 120
tgcagggaag aacaccgatc ttgaggttct catggaatgg ctaaagacaa gaccaatcct 180
gtcacctctg actaagggga ttttaggatt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240
aggactgcag cgtagacgct ttgtccaaaa tgcccttaat gggaacgggg atccaaataa 300
catggacaaa gcagttaaac tgtataggaa gctcaagagg gagataacat tccatggggc 360
caaagaaatc tcactcagtt attctgctgg tgcacttgcc agttgtatgg gcctcatata 420
caacaggatg ggggctgtga ccactgaagt ggcatttggc ctggtatgtg caacctgtga 480
acagattgct gactcccagc atcggtctca taggcaaatg gtgacaacaa ccaacccact 540
aatcagacat gagaacagaa tggttttagc cagcactaca gctaaggcta tggagcaaat 600
ggctggatcg agtgagcaag cagcagaggc catggaggtt gctagtcagg ctaggcaaat 660
ggtgcaagcg atgagaacca ttgggactca tcctagctcc agtgctggtc tgaaaaatga 720
tcttcttgaa aatttgcagg cctatcagaa acgaatgggg gtgcagatgc aacggttcaa 780
gtgatcctct cgctattgcc gcaaatatca ttgggatctt gcacttgata ttgtggattc 840
ttgatcgtct ttttttcaaa tgcatttacc gtcgctttaa atacggactg aaaggagggc 900
cttctacgga aggagtgcca aagtctatga gggaagaata tcgaaaggaa cagcagagtg 960
ctgtggatgc tgacgatggt cattttgtca gcatagagct ggagtaaaaa actaccttgt 1020
ttctact 1027
<210> 36
<211> 1788
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> клон 774 A/Brisbane/59/2007
<400> 36
cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60 attaattaat catcttgaga gaaaatgaaa gtaaaactac tggtcctgtt atgcacattt 120
- 105 034733
acagctacat atgcagacac aatatgtata ggctaccatg ctaacaactc gaccgacact 180
gttgacacag tacttgaaaa gaatgtgaca gtgacacact ctgtcaacct gcttgagaac 240
agtcacaatg gaaaactatg tctattaaaa ggaatagccc cactacaatt gggtaattgc 300
agcgttgccg ggtggatctt aggaaaccca gaatgcgaat tactgatttc caaggagtca 360
tggtcctaca ttgtagaaaa accaaatcct gagaatggaa catgttaccc agggcatttc 420
gctgactatg aggaactgag ggagcaattg agttcagtat cttcatttga gaggttcgaa 480
atattcccca aagaaagctc atggcccaac cacaccgtaa ccggagtgtc agcatcatgc 540
tcccataatg gggaaagcag tttttacaga aatttgctat ggctgacggg gaagaatggt 600
ttgtacccaa acctgagcaa gtcctatgca aacaacaaag aaaaagaagt ccttgtacta 660
tggggtgttc atcacccgcc aaacataggt gaccaaaagg ccctctatca tacagaaaat 720
gcttatgtct ctgtagtgtc ttcacattat agcagaaaat tcaccccaga aatagccaaa 780
agacccaaag taagagatca agaaggaaga atcaattact actggactct gcttgaaccc 840
ggggatacaa taatatttga ggcaaatgga aatctaatag cgccaagata tgctttcgca 900
ctgagtagag gctttggatc aggaatcatc aactcaaatg caccaatgga taaatgtgat 960
gcgaagtgcc aaacacctca gggagctata aacagcagtc ttcctttcca gaacgtacac 1020
ccagtcacaa taggagagtg tccaaagtat gtcaggagtg caaaattaag gatggttaca 1080
ggactaagga acatcccatc cattcaatcc agaggtttgt ttggagccat tgccggtttc 1140
attgaagggg ggtggactgg aatggtagat ggttggtatg gttatcatca tcagaatgag 1200
caaggatctg gctatgctgc agatcaaaaa agcacacaaa atgccattaa tgggattaca 1260
aacaaggtca attctgtaat tgagaaaatg aacactcaat tcacagcagt gggcaaagag 1320
ttcaacaaat tggaaagaag gatggaaaac ttgaataaaa aagttgatga tgggtttata 1380
gacatttgga catataatgc agaactgttg gttctactgg aaaatgaaag gactttggat 1440
ttccatgact ccaatgtgaa gaatctgtat gagaaagtaa aaagccagtt aaagaataat 1500
gctaaagaaa taggaaatgg gtgttttgag ttctatcaca agtgtaacga tgaatgcatg 1560
gagagtgtaa agaatggaac ttatgactat ccaaaatatt ccgaagaatc aaagttaaac 1620
agggagaaaa ttgatggagt gaaattggaa tcaatgggag tctatcagat tctggcgatc 1680
tactcaacag tcgccagttc tctggttctt ttggtctccc tgggggcaat cagcttctgg 1740
atgtgttcca atgggtcttt acagtgtaga atatgcatct aagagctc 1788
<210> 37 <211> 1788 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
- 106 034733 <220>
<223> клон 775 A/Solomon Islands 3/2006 <400> 37
cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60
attaattaat catcttgaga gaaaatgaaa gtaaaactac tggtcctgtt atgcacattt 120
acagctacat atgcagacac aatatgtata ggctaccatg ccaacaactc aaccgacact 180
gttgacacag tacttgagaa gaatgtgaca gtgacacact ctgtcaacct gcttgaggac 240
agtcacaatg gaaaattatg tctattaaaa ggaatagccc cactacaatt gggtaattgc 300
agcgttgccg gatggatctt aggaaaccca gaatgcgaat tactgatttc cagggaatca 360
tggtcctaca ttgtagaaaa accaaatcct gagaatggaa catgttaccc agggcatttc 420
gccgactatg aggaactgag ggagcaattg agttcagtat cttcatttga gagattcgaa 480
atattcccca aagaaagctc atggcccaac cacaccacaa ccggagtatc agcatcatgc 540
tcccataatg gggaaagcag tttttacaaa aatttgctat ggctgacggg gaagaatggt 600
ttgtacccaa acctgagcaa gtcctatgca aacaacaaag agaaagaagt ccttgtacta 660
tggggtgttc atcacccgcc taacataggt gaccaaaggg ctctctatca taaagaaaat 720
gcttatgtct ctgtagtgtc ttcacattat agcagaaaat tcaccccaga aatagccaaa 780
agacccaaag taagagatca agaaggaaga atcaactact actggactct acttgaaccc 840
ggggatacaa taatatttga ggcaaatgga aatctaatag cgccaagata tgctttcgca 900
ctgagtagag gctttggatc aggaatcatc aactcaaatg caccaatgga tgaatgtgat 960
gcgaagtgcc aaacacctca gggagctata aacagcagtc ttcctttcca gaatgtacac 1020
cctgtcacaa taggagagtg tccaaagtat gtcaggagtg caaaattaag gatggttaca 1080
ggactaagga acatcccatc cattcaatcc agaggtttgt ttggagccat tgccggtttc 1140
attgaagggg ggtggactgg aatggtagat ggttggtatg gttatcatca tcagaatgag 1200
caaggatctg gctatgctgc agatcaaaaa agcacacaaa atgccattaa tgggattaca 1260
aacaaggtca attctgtaat tgagaaaatg aacactcaat tcacagctgt gggcaaagag 1320
ttcaacaaat tggaaagaag gatggaaaac ttaaataaaa aagttgatga tgggtttata 1380
gacatttgga catataatgc agaattgttg gttctactgg aaaatgaaag gactttggat 1440
ttccatgact ccaatgtgaa gaatctgtat gagaaagtaa aaagccaatt aaagaataat 1500
gccaaagaaa taggaaatgg gtgttttgag ttctatcata agtgtaacga tgaatgcatg 1560
gagagtgtaa aaaatggaac ttatgactat ccaaaatatt ccgaagaatc aaagttaaac 1620
agggagaaaa ttgatggagt gaaattggaa tcaatgggag tctatcagat tctggcgatc 1680
tactcaacag tcgccagttc tctggttctt ttggtctccc tgggggcaat cagcttctgg 1740
- 107 034733 atgtgttcca atgggtcttt gcagtgtaga atatgcatct gagagctc
1788 <210> 38 <211> 1791 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> клон 776 of A/Brisbane 10/2007 <400> 38
cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60
attaattaat catcttgaga gaaaatgaag actatcattg ctttgagcta cattctatgt 120
ctggttttca ctcaaaaact tcccggaaat gacaacagca cggcaacgct gtgccttggg 180
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgacca aattgaagtt 240
actaatgcta ctgagctggt tcagagttcc tcaacaggtg aaatatgcga cagtcctcat 300
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 360
gatggcttcc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gcagcaaagc ctacagcaac 420
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 480
acactggagt ttaacaatga aagtttcaat tggactggag tcactcaaaa cggaacaagc 540
tctgcttgca taaggagatc taataacagt ttctttagta gattgaattg gttgacccac 600
ttaaaattca aatacccagc attgaacgtg actatgccaa acaatgaaaa atttgacaaa 660
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaatg accaaatctt cctgtatgct 720
caagcatcag gaagaatcac agtctctacc aaaagaagcc aacaaactgt aatcccgaat 780
atcggatcta gacccagagt aaggaatatc cccagcagaa taagcatcta ttggacaata 840
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 900
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 960
tgcaattctg aatgcatcac tccaaacgga agcattccca atgacaaacc attccaaaat 1020
gtaaacagga tcacatacgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaaacac tctgaaattg 1080
gcaacaggga tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatcgcg 1140
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtatggttt caggcatcaa 1200
aattctgagg gaataggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcgatcaa 1260
atcaatggga agctgaatag gttgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1320
aaagagttct cagaagtcga agggagaatc caggaccttg agaaatatgt tgaggacacc 1380
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1440
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa aaacaaagaa gcaactgagg 1500
- 108 034733 gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1560 tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccacgatg tatacagaga tgaagcatta 1620 aacaaccggt tccagatcaa gggcgttgag ctgaagtcag gatacaaaga ttggatacta 1680 tggatttcct ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg 1740 tgggcctgcc aaaaaggcaa cattaggtgc aacatttgca tttgagagct c 1791
<210> 39
<211> 1791
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> клон 777 A/Wisconsin/67/2005
<400> 39
cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60
attaattaat catcttgaga gaaaatgaag actatcattg ctttgagcta cattctatgt 120
ctggttttca ctcaaaaact tcccggaaat gacaacagca cggcaacgct gtgccttggg 180
caccatgcag taccaaacgg aacgatagtg aaaacaatca cgaatgacca aattgaagtt 240
actaatgcta ctgagctggt tcagagttcc tcaacaggtg gaatatgcga cagtcctcat 300
cagatccttg atggagaaaa ctgcacacta atagatgctc tattgggaga ccctcagtgt 360
gatggcttcc aaaataagaa atgggacctt tttgttgaac gcagcaaagc ctacagcaac 420
tgttaccctt atgatgtgcc ggattatgcc tcccttaggt cactagttgc ctcatccggc 480
acactggagt ttaacgatga aagtttcaat tggactggag tcactcaaaa tggaacaagc 540
tctgcttgca aaaggagatc taataacagt ttctttagta gattgaattg gttgacccac 600
ttaaaattca aatacccagc attgaacgtg actatgccaa acaatgaaaa atttgacaaa 660
ttgtacattt ggggggttca ccacccgggt acggacaatg accaaatctt cctgcatgct 720
caagcatcag gaagaatcac agtctctacc aaaagaagcc aacaaactgt aatcccgaat 780
atcggatcta gacccagaat aaggaatatc cccagcagaa taagcatcta ttggacaata 840
gtaaaaccgg gagacatact tttgattaac agcacaggga atctaattgc tcctaggggt 900
tacttcaaaa tacgaagtgg gaaaagctca ataatgagat cagatgcacc cattggcaaa 960
tgcaattctg aatgcatcac tccaaatgga agcattccca atgacaaacc atttcaaaat 1020
gtaaacagga tcacatatgg ggcctgtccc agatatgtta agcaaaacac tctgaaattg 1080
gcaacaggga tgcgaaatgt accagagaaa caaactagag gcatatttgg cgcaatcgcg 1140
ggtttcatag aaaatggttg ggagggaatg gtggatggtt ggtacggttt caggcatcaa 1200
aattctgagg gaataggaca agcagcagat ctcaaaagca ctcaagcagc aatcaatcaa 1260
- 109 034733
atcaatggga agctgaatag gttgatcggg aaaaccaacg agaaattcca tcagattgaa 1320
aaagagttct cagaagtaga agggagaatc caggacctcg agaaatatgt tgaggacact 1380
aaaatagatc tctggtcata caacgcggag cttcttgttg ccctggagaa ccaacataca 1440
attgatctaa ctgactcaga aatgaacaaa ctgtttgaaa gaacaaagaa gcaactgagg 1500
gaaaatgctg aggatatggg caatggttgt ttcaaaatat accacaaatg tgacaatgcc 1560
tgcataggat caatcagaaa tggaacttat gaccatgatg tatacagaga tgaagcatta 1620
aacaaccggt tccagatcaa aggcgttgag ctgaagtcag gatacaaaga ttggatacta 1680
tggatttcct ttgccatatc atgttttttg ctttgtgttg ctttgttggg gttcatcatg 1740
tgggcctgcc aaaaaggcaa cattaggtgc aacatttgca tttgagagct c 1791
<210> 40
<211> 1848
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> клон 778 B/Malaysia/2506/2004
<400> 40
cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60
attaattaat catcttgaga gaaaatgaag gcaataattg tactactcat ggtagtaaca 120
tccaatgcag atcgaatctg cactgggata acatcgtcaa actcaccaca tgttgtcaaa 180
actgctactc aaggggaggt caatgtgact ggtgtaatac cactgacaac aacacccacc 240
aaatctcatt ttgcaaatct caaaggaaca gaaaccagag ggaaactatg cccaaaatgc 300
ctcaactgca cagatctgga cgtggccttg ggcagaccaa aatgcacggg gaacataccc 360
tcggcaagag tttcaatact ccatgaagtc agacctgtta catctgggtg ctttcctata 420
atgcacgaca gaacaaaaat tagacagctg cctaaacttc tcagaggata cgaacatatc 480
aggttatcaa ctcataacgt tatcaatgca gaaaatgcac caggaggacc ctacaaaatt 540
ggaacctcag ggtcttgccc taacgttacc aatggaaacg gatttttcgc aacaatggct 600
tgggccgtcc caaaaaacga caacaacaaa acagcaacaa attcattaac aatagaagta 660
ccatacattt gtacagaagg agaagaccaa attaccgttt gggggttcca ctctgataac 720
gaaacccaaa tggcaaagct ctatggggac tcaaagcccc agaagttcac ctcatctgcc 780
aacggagtga ccacacatta cgtttcacag attggtggct tcccaaatca aacagaagac 840
ggaggactac cacaaagcgg tagaattgtt gttgattaca tggtgcaaaa atctgggaaa 900
acaggaacaa ttacctatca aagaggtatt ttattgcctc aaaaagtgtg gtgcgcaagt 960
ggcaggagca aggtaataaa aggatcgttg cctttaattg gagaagcaga ttgcctccac 1020
- 110 034733
gaaaaatacg gtggattaaa caaaagcaag ccttactaca caggggaaca tgcaaaggcc 1080
ataggaaatt gcccaatatg ggtgaaaaca cccttgaagc tggccaatgg aaccaaatat 1140
agacctcctg caaaactatt aaaggaaagg ggtttcttcg gagctattgc tggtttctta 1200
gaaggaggat gggaaggaat gattgcaggt tggcacggat acacatccca tggggcacat 1260
ggagtagcgg tggcagcaga ccttaagagc actcaagagg ccataaacaa gataacaaaa 1320
aatctcaact ctttgagtga gctggaagta aagaatcttc aaagactaag cggtgccatg 1380
gatgaactcc acaacgaaat actagaacta gacgagaaag tggatgatct cagagctgat 1440
acaataagct cacaaataga actcgcagtc ctgctttcca atgaaggaat aataaacagt 1500
gaagatgagc atctcttggc gcttgaaaga aagctgaaga aaatgctggg cccctctgct 1560
gtagagatag ggaatggatg ctttgaaacc aaacacaagt gcaaccagac ctgtctcgac 1620
agaatagctg ctggtacctt tgatgcagga gaattttctc tccccacttt tgattcactg 1680
aatattactg ctgcatcttt aaatgacgat ggattggata atcatactat actgctttac 1740
tactcaactg ctgcctccag tttggctgta acattgatga tagctatctt tgttgtttat 1800
atggtctcca gagacaatgt ttcttgctcc atctgtctat aagagctc 1848
<210> 41 <211> 1845 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> клон 779 B/Florida/4/2006
<400> 41 cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60
attaattaat catcttgaga gaaaatgaag gcaataattg tactactcat ggtagtaaca 120
tccaatgcag atcgaatctg cactggaata acatcttcaa actcacctca tgtggtcaaa 180
acagccactc aaggggaggt caatgtgact ggtgtgatac cactaacaac aacaccaaca 240
aaatcttatt ttgcaaatct caaaggaaca aggaccagag ggaaactatg cccagactgt 300
ctcaactgca cagatctgga tgtggctttg ggcagaccaa tgtgtgtggg gaccacacct 360
tcggcgaagg cttcaatact ccacgaagtc aaacctgtta catccgggtg ctttcctata 420
atgcacgaca gaacaaaaat caggcaacta cccaatcttc tcagaggata tgaaaatatc 480
aggctatcaa cccaaaacgt catcgatgcg gaaaaggcac caggaggacc ctacagactt 540
ggaacctcag gatcttgccc taacgctacc agtaagagcg gatttttcgc aacaatggct 600
tgggctgtcc caaaggacaa caacaaaaat gcaacgaacc cactaacagt agaagtacca 660
tacatttgta cagaagggga agaccaaatc actgtttggg ggttccattc agataacaaa 720
- 111 034733
acccaaatga agaacctcta tggagactca aatcctcaaa agttcacctc atctgctaat 780
ggagtaacca cacactatgt ttctcagatt ggcagcttcc cagatcaaac agaagacgga 840
ggactaccac aaagcggcag gattgttgtt gattacatga tgcaaaaacc tgggaaaaca 900
ggaacaattg tctaccaaag aggtgttttg ttgcctcaaa aggtgtggtg cgcgagtggc 960
aggagcaaag taataaaagg gtccttgcct ttaattggtg aagcagattg ccttcatgaa 1020
aaatacggtg gattaaacaa aagcaagcct tactacacag gagaacatgc aaaagccata 1080
ggaaattgcc caatatgggt gaaaacacct ttgaagctcg ccaatggaac caaatataga 1140
cctcctgcaa aactattaaa ggaaaggggt ttcttcggag ctattgctgg tttcctagaa 1200
ggaggatggg aaggaatgat tgcaggctgg cacggataca catctcacgg agcacatgga 1260
gtggcagtgg cggcggacct taagagtacg caagaagcta taaacaagat aacaaaaaat 1320
ctcaattctt tgagtgagct agaagtaaag aatcttcaaa gactaagtgg tgccatggat 1380
gaactccaca acgaaatact cgagctggat gagaaagtgg atgatctcag agctgacact 1440
ataagctcgc aaatagaact tgcagtcttg ctttccaacg aaggaataat aaacagtgaa 1500
gatgagcatc tattggcact tgagagaaaa ctaaagaaaa tgctgggtcc ctctgctgta 1560
gagataggaa atggatgctt cgaaaccaaa cacaagtgca accagacctg cttagacagg 1620
atagctgctg gcacctttaa tgcaggagaa ttttctctcc ccacttttga ttcactgaac 1680
attactgctg catctttaaa tgatgatgga ttggataacc atactatact gctctattac 1740
tcaactgctg cttctagttt ggctgtaaca ttgatgctag ctatttttat tgtttatatg 1800
gtctccagag acaacgtttc atgctccatc tgtctataag agctc 1845
<210> 42 <211> 1779 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> клон 780 A/Singapore/1/57
<400> 42 cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60
attaattaat catcttgaga gaaaatggcc atcatttatc taattctcct gttcacagca 120
gtgagagggg accaaatatg cattggatac catgccaata attccacaga gaaggtcgac 180
acaattctag agcggaacgt cactgtgact catgccaagg acattcttga gaagacccat 240
aacggaaagt tatgcaaact aaacggaatc cctccacttg aactagggga ctgtagcatt 300
gccggatggc tccttggaaa tccagaatgt gataggcttc taagtgtgcc agaatggtcc 360
tatataatgg agaaagaaaa cccgagagac ggtttgtgtt atccaggcag cttcaatgat 420
- 112 034733
tatgaagaat tgaaacatct cctcagcagc gtgaaacatt tcgagaaagt aaagattctg 480
cccaaagata gatggacaca gcatacaaca actggaggtt cacgggcctg cgcggtgtct 540
ggtaatccat cattcttcag gaacatggtc tggctgacaa agaaagaatc aaattatccg 600
gttgccaaag gatcgtacaa caatacaagc ggagaacaaa tgctaataat ttggggggtg 660
caccatccca atgatgagac agaacaaaga acattgtacc agaatgtggg aacctatgtt 720
tccgtaggca catcaacatt gaacaaaagg tcaaccccag acatagcaac aaggcctaaa 780
gtgaatggac taggaagtag aatggagttc tcttggaccc tattggatat gtgggacacc 840
ataaattttg agagtactgg taatctaatt gcaccagagt atggattcaa aatatcgaaa 900
agaggtagtt cagggatcat gaaaacagaa ggaacacttg agaactgtga gaccaaatgc 960
caaactcctt tgggagcaat aaatacaaca ttgccttttc acaatgtcca cccactgaca 1020
ataggtgagt gccccaaata tgtaaaatcg gagaagttgg tcttagcaac aggactaagg 1080
aatgttcccc agattgaatc aagaggattg tttggggcaa tagctggttt tatagaagga 1140
ggatggcaag gaatggttga tggttggtat ggataccatc acagcaatga ccagggatca 1200
gggtatgcag cagacaaaga atccactcaa aaggcatttg atggaatcac caacaaggta 1260
aattctgtga ttgaaaagat gaacacccaa tttgaagctg ttgggaaaga gttcagtaac 1320
ttagagagaa gactggagaa cttgaacaaa aagatggaag acgggtttct agatgtgtgg 1380
acatacaatg ctgagcttct agttctgatg gaaaatgaga ggacacttga ctttcatgat 1440
tctaatgtca agaatctgta tgataaagtc agaatgcagc tgagagacaa cgtcaaagaa 1500
ctaggaaatg gatgttttga attttatcac aaatgtgatg atgaatgcat gaatagtgtg 1560
aaaaacggga cgtatgatta tcccaagtat gaagaagagt ctaaactaaa tagaaatgaa 1620
atcaaagggg taaaattgag cagcatgggg gtttatcaaa tccttgccat ttatgctaca 1680
gtagcaggtt ctctgtcact ggcaatcatg atggctggga tctctttctg gatgtgctcc 1740
aacgggtctc tgcagtgcag gatctgcata tgagagctc 1779
<210> 43 <211> 1794 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> клон 781 A/Anhui/1/2005 <400> cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta attaattaat catcttgaga gaaaatggag aaaatagtgc ttcttcttgc aatagtcagc
120 cttgttaaaa gtgatcagat ttgcattggt taccatgcaa acaactcgac agagcaggtt
180
- 113 034733
gacacaataa tggaaaagaa cgttactgtt acacatgccc aagacatact ggaaaagaca 240
cacaacggga agctctgcga tctagatgga gtgaagcctc tgattttaag agattgtagt 300
gtagctggat ggctcctcgg aaacccaatg tgtgacgagt tcatcaatgt gccggaatgg 360
tcttacatag tggagaaggc caacccagcc aatgacctct gttacccagg gaatttcaac 420
gactatgaag aactgaaaca cctattgagc agaataaacc attttgagaa aattcagatc 480
atccccaaaa gttcttggtc cgatcatgaa gcctcatcag gggtcagctc agcatgtcca 540
taccagggaa cgccctcctt tttcagaaat gtggtatggc ttatcaaaaa gaacaataca 600
tacccaacaa taaagagaag ctacaataat accaaccagg aagatctttt gatactgtgg 660
gggattcatc attctaatga tgcggcagag cagacaaagc tctatcaaaa cccaaccacc 720
tatatttccg ttgggacatc aacactaaac cagagattgg taccaaaaat agctactaga 780
tccaaagtaa acgggcaaag tggaaggatg gatttcttct ggacaatttt aaaaccgaat 840
gatgcaatca acttcgagag taatggaaat ttcattgctc cagaatatgc atacaaaatt 900
gtcaagaaag gggactcagc aattgttaaa agtgaagtgg aatatggtaa ctgcaataca 960
aagtgtcaaa ctccaatagg ggcgataaac tctagtatgc cattccacaa catacaccct 1020
ctcaccatcg gggaatgccc caaatatgtg aaatcaaaca aattagtcct tgcgactggg 1080
ctcagaaata gtcctctaag agaaagaaga agaaaaagag gactatttgg agctatagca 1140
gggtttatag agggaggatg gcagggaatg gtagatggtt ggtatgggta ccaccatagc 1200
aatgagcagg ggagtgggta cgctgcagac aaagaatcca ctcaaaaggc aatagatgga 1260
gtcaccaata aggtcaactc gatcattgac aaaatgaaca ctcagtttga ggccgttgga 1320
agggaattta ataacttaga aaggagaata gagaatttaa acaagaaaat ggaagacgga 1380
ttcctagatg tctggactta taatgctgaa cttctggttc tcatggaaaa tgagagaact 1440
ctagacttcc atgattcaaa tgtcaagaac ctttacgaca aggtccgact acagcttagg 1500
gataatgcaa aggagctggg taacggttgt ttcgagttct atcacaaatg tgataatgaa 1560
tgtatggaaa gtgtaagaaa cggaacgtat gactacccgc agtattcaga agaagcaaga 1620
ttaaaaagag aggaaataag tggagtaaaa ttggaatcaa taggaactta ccaaatactg 1680
tcaatttatt caacagttgc gagttctcta gcactggcaa tcatggtggc tggtctatct 1740
ttgtggatgt gctccaatgg gtcgttacaa tgcagaattt gcatttaaga gctc 1794
<210> 44 <211> 1797 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
- 114 034733 <223> клон 782 A/Vietnam/1194/2004 <400> 44
cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60
attaattaat catcttgaga gaaaatggag aaaatagtgc ttctttttgc aatagtcagt 120
cttgttaaaa gtgatcagat ttgcattggt taccatgcaa acaactcgac agagcaggtt 180
gacacaataa tggaaaagaa cgttactgtt acacatgccc aagacatact ggaaaagaca 240
cacaatggga agctctgcga tctagatgga gtgaagcctc taattttgag agattgtagt 300
gtagctggat ggctcctcgg aaacccaatg tgtgacgagt tcatcaatgt gccggaatgg 360
tcttacatag tggagaaggc caatccagtc aatgacctct gttacccagg ggatttcaat 420
gactatgaag aattgaaaca cctattgagc agaataaacc attttgagaa aattcagatc 480
atccccaaaa gttcttggtc cagtcatgaa gcctcattgg gggtcagctc agcatgtcca 540
taccagggaa agtcctcctt tttcagaaat gtggtatggc ttatcaaaaa gaacagtaca 600
tacccaacaa taaagaggag ctacaataat accaaccaag aagatctttt ggtactgtgg 660
gggattcacc atcctaatga tgcggcagag cagacaaagc tctatcaaaa cccaaccacc 720
tatatttccg ttgggacatc tacactaaac cagagattgg taccaagaat agctactaga 780
tccaaagtaa acgggcaaag tggaaggatg gagttcttct ggacaatttt aaaaccgaat 840
gatgcaatca acttcgagag taatggaaat ttcattgctc cagaatatgc atacaaaatt 900
gtcaagaaag gggactcaac aattatgaaa agtgaattgg aatatggtaa ctgcaatacc 960
aagtgtcaaa ctccaatggg ggcgataaac tctagcatgc cattccacaa tatacaccct 1020
ctcaccatcg gggaatgccc caaatatgtg aaatcaaaca gattagtcct tgcgactggg 1080
ctcagaaata gccctcaaag agagagaaga agaaaaaaga gaggattatt tggagctata 1140
gcaggtttta tagagggagg atggcaggga atggtagatg gttggtatgg gtaccaccat 1200
agcaacgagc aggggagtgg gtacgctgca gacaaagaat ccactcaaaa ggcaatagat 1260
ggagtcacca ataaggtcaa ctcgattatt gacaaaatga acactcagtt tgaggccgtt 1320
ggaagggaat ttaacaactt agaaaggaga atagagaatt taaacaagaa gatggaagac 1380
gggttcctag atgtctggac ttataatgct gaacttctag ttctcatgga aaacgagaga 1440
actctagact ttcatgactc aaatgtcaag aacctttacg acaaggtccg actacagctt 1500
agggataatg caaaggagct gggtaacggt tgtttcgagt tctatcataa atgtgataat 1560
gaatgtatgg aaagtgtaag aaacggaacg tatgactacc cgcagtattc agaagaagca 1620
agactaaaaa gagaggaaat aagtggagta aaattggaat caataggaat ttaccaaata 1680
ttgtcaattt attctacagt ggccagctcc ctagcactgg caatcatggt agctggtcta 1740
- 115 034733 tccttatgga tgtgctccaa tgggtcgtta caatgcagaa tttgcattta agagctc 1797 <210> 45 <211> 1791 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> клон 783 A/Teal/HongKong/W312/97
<400> 45 cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60
attaattaat catcttgaga gaaaatgatt gcaatcattg taatagcaat actggcagca 120
gccggaaagt cagacaagat ctgcattggg tatcatgcca acaattcaac aacacaggta 180
gatacgatac ttgagaagaa tgtgactgtc acacactcaa ttgaattgct ggaaaatcag 240
aaggaagaaa gattctgcaa gatattgaac aaggcccctc tcgacttaag ggaatgtacc 300
atagagggtt ggatcttggg gaatccccaa tgcgacctat tgcttggtga tcaaagctgg 360
tcatacattg tggaaagacc tactgctcaa aacgggatct gctacccagg aaccttaaat 420
gaggtagaag aactgagggc acttattgga tcaggagaaa gggtagagag atttgagatg 480
tttccccaaa gcacctggca aggagttgac accaacagtg gaacaacaag atcctgccct 540
tattctactg gtgcgtcttt ctacagaaac ctcctatgga taataaaaac caagacagca 600
gaatatccag taattaaggg aatttacaac aacactggaa cccagccaat cctctatttc 660
tggggtgtgc atcatcctcc taacaccgac gagcaagata ctctgtatgg ctctggtgat 720
cgatacgtta gaatgggaac tgaaagcatg aattttgcca agagtccgga aattgcggca 780
aggcctgctg tgaatggaca aagaggcaga attgattatt attggtcggt tttaaaacca 840
ggggaaacct tgaatgtgga atctaatgga aatctaatcg ccccttggta tgcatacaaa 900
tttgtcaaca caaatagtaa aggagccgtc ttcaggtcag atttaccaat cgagaactgc 960
gatgccacat gccagactat tgcaggggtt ctaaggacca ataaaacatt tcagaatgtg 1020
agtcccctgt ggataggaga atgtcccaaa tacgtgaaaa gtgaaagtct gaggcttgca 1080
actggactaa gaaatgttcc acagattgaa actagaggac tcttcggagc tattgcaggg 1140
tttattgaag gaggatggac tgggatgata gatgggtggt atggctatca ccatgaaaat 1200
tctcaagggt caggatatgc agcagacaga gaaagcactc aaaaggctgt aaacagaatt 1260
acaaataagg tcaattccat catcaacaaa atgaacacac aatttgaagc tgtcgatcac 1320
gaattttcaa atctggagag gagaattgac aatctgaaca aaagaatgca agatggattt 1380
ctggatgttt ggacatacaa tgctgaactg ttggttcttc ttgaaaacga aagaacacta 1440
gacatgcatg acgcaaatgt gaagaaccta catgaaaagg tcaaatcaca actaagggac 1500
- 116 034733 aatgctacga tcttagggaa tggttgcttt gaattttggc ataagtgtga caatgaatgc 1560 atagagtctg tcaaaaatgg tacatatgac tatcccaaat accagactga aagcaaatta 1620 aacaggctaa aaatagaatc agtaaagcta gagaaccttg gtgtgtatca aattcttgcc 1680 atttatagta cggtatcgag cagcctagtg ttggtagggc tgatcatggc aatgggtctt 1740 tggatgtgtt caaatggttc aatgcagtgc aggatatgta tataagagct c 1791
<210> 46
<211> 1803
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> клон 784 A/Equine/Prague/56
<400> 46
cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60
attaattaat catcttgaga gaaaatgaac actcaaattc taatattagc cacttcggca 120
ttcttctatg tacgtgcaga taaaatctgc ctaggacatc atgctgtgtc taatggaacc 180
aaagtagaca cccttactga aaaaggaata gaagttgtca atgcaacaga aacagttgaa 240
caaacaaaca tccctaagat ctgctcaaaa ggaaaacaga ctgttgacct tggtcaatgt 300
ggattactag ggaccgttat tggtcctccc caatgtgacc aatttcttga gttctctgct 360
aatttaatag ttgaaagaag ggaaggtaat gacatttgtt atccaggcaa atttgacaat 420
gaagaaacat tgagaaaaat actcagaaaa tccggaggaa ttaaaaagga gaatatggga 480
ttcacatata ccggagtgag aaccaatgga gagactagcg catgtagaag gtcaagatct 540
tccttttatg cagagatgaa atggcttcta tccagcacag acaatgggac atttccacaa 600
atgacaaagt cctacaagaa cactaagaag gtaccagctc tgataatctg gggaatccac 660
cactcaggat caactactga acagactaga ttatatggaa gtgggaataa attgataaca 720
gtttggagtt ccaaatacca acaatctttt gtcccaaatc ctggaccaag accgcaaatg 780
aatggtcaat caggaagaat tgactttcac tggctgatgc tagatcccaa tgatactgtc 840
actttcagtt ttaatggggc ctttatagca cctgaccgcg ccagttttct aagaggtaaa 900
tctctaggaa tccaaagtga tgcacaactt gacaataatt gtgaaggtga atgctatcat 960
attggaggta ctataattag caacttgccc tttcaaaaca ttaatagtag ggcaatcgga 1020
aaatgcccca gatacgtgaa gcagaagagc ttaatgctag caacaggaat gaaaaatgtt 1080
cctgaagctc ctgcacataa acaactaact catcacatgc gcaaaaaaag aggtttattt 1140
ggtgcaatag caggattcat tgaaaatggg tgggaaggat taatagacgg atggtatgga 1200
tataagcatc agaatgcaca aggagaaggg actgctgcag actacaaaag tacacaatct 1260
- 117 034733
gctatcaacc aaataaccgg aaaattgaac agactaatag aaaaaaccaa ccagcaattc 1320
gaactaatag ataatgagtt caatgaaata gaaaaacaaa ttggcaatgt tattaaetgg 1380
actagagatt ctatcatcga agtatggtca tataatgeag agttcctcgt agcagtggag 1440
aatcaacaca ctattgattt aactgactca gaaatgaaca aactatatga aaaggtaaga 1500
agacaactga gagaaaatgc tgaggaagat ggtaatggct gttttgaaat attccaccaa 1560
tgtgacaatg attgeatgge cagcattaga aacaacacat atgaccataa aaaatacaga 1620
aaagaggcaa tacaaaacag aatccagatt gacgcagtaa agttgagcag tggttacaaa 1680
gatataatac tttggtttag cttcggggca tcatgtttct tatttcttgc cattgcaatg 1740
ggtcttgttt tcatatgtat aaaaaatgga aacatgcggt gcactatttg tatataagag 1800
etc 1803
<210> 47
1773
ДНК
Искусственная последовательность <220>
клон 785 A/HongKong/1073/99
<400> 47 cactttgtga gtctacactt tgattccctt caaacacata caaagagaag agactaatta 60
attaattaat catcttgaga gaaaatggaa acaatatcac taataactat actactagta 120
gtaacagcaa gcaatgcaga taaaatetge atcggccacc agtcaacaaa ctccacagaa 180
actgtggaca cgctaacaga aaccaatgtt cctgtgacac atgccaaaga attgctccac 240
acagagcata atggaatget gtgtgcaaca agcctgggac atcccctcat tctagacaca 300
tgcactattg aaggactagt ctatggcaac ccttcttgtg acctgctgtt gggaggaaga 360
gaatggtcct acatcgtcga aagatcatca gctgtaaatg gaacgtgtta ccctgggaat 420
gtagaaaacc tagaggaact caggacactt tttagttccg ctagttccta ccaaagaatc 480
caaatcttcc cagacacaac ctggaatgtg acttacactg gaacaagcag agcatgttca 540
ggttcattct acaggagtat gagatggctg actcaaaaga gcggttttta ccctgttcaa 600
gacgcccaat acacaaataa ageattettt tcgtgtgggg catacatcac 660
ccacccacct ataccgagca aacaaatttg tacataagaa acgacacaac aacaagcgtg 720
acaacagaag atttgaatag gaccttcaaa ccagtgatag ggccaaggcc ccttgtcaat 780
ggtetgeagg gaagaattga ttattattgg tcggtactaa aaccaggcca aacattgcga 840
gtacgatcca atgggaatct aattgctcca tggtatggac acgttctttc aggagggagc 900
catggaagaa tcctgaagac tgatttaaaa ggtggtaatt gtgtagtgca atgtcagact 960
- 118 034733
gaaaaaggtg gcttaaacag tacattgcca ttccacaata tcagtaaata tgcatttgga 1020
acctgcccca aatatgtaag agttaatagt ctcaaactgg cagtcggtct gaggaaegtg 1080
cctgctagat caagtagagg actatttgga gccatagctg gattcataga aggaggttgg 1140
ccaggactag tcgctggctg gtatggtttc cagcattcaa atgatcaagg ggttggtatg 1200
gctgcagata gggattcaac tcaaaaggca attgataaaa taacatccaa ggtgaataat 1260
atagtcgaca agatgaacaa gcaatatgaa ataattgatc atgaatttag tgaggttgaa 1320
actagactca atatgatcaa taataagatt gatgaccaaa tacaagacgt atgggcatat 1380
aatgcagaat tgctagtact acttgaaaat caaaaaacac tegatgagea tgatgcgaac 1440
gtgaacaatc tatataacaa ggtgaagagg gcactgggct ccaatgctat ggaagatggg 1500
aaaggctgtt tcgagctata ccataaatgt gatgatcagt gcatggaaac aattcggaac 1560
gggacctata ataggagaaa gtatagagag gaatcaagac tagaaaggca gaaaatagag 1620
ggggttaagc tggaatctga gggaacttac aaaatcctca ccatttattc gactgtcgcc 1680
tcatctcttg tgcttgcaat ggggtttgct gccttcctgt tctgggccat gtccaatgga 1740
tcttgcagat gcaacatttg tatataagag etc 1773
<210> 48
<211> 565
<212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> клонГ 774 A/Brisbane/59/2007
<400> 48
Met 1 Lys Vai Lys Leu 5 Leu Vai Leu Leu Cys 10 Thr Phe Thr Ala Thr 15 Tyr
Ala Asp Thr He 20 Cys He Gly Tyr His 25 Ala Asn Asn Ser Thr 30 Asp Thr
Vai Asp Thr 35 Vai Leu Glu Lys Asn 40 Vai Thr Vai Thr His 45 Ser Vai Asn
Leu Leu 50 Glu Asn Ser His Asn 55 Gly Lys Leu Cys Leu 60 Leu Lys Gly He
Ala 65 Pro Leu Gin Leu Gly 70 Asn Cys Ser Vai Ala 75 Gly Trp He Leu Gly 80
Asn Pro Glu Cys Glu 85 Leu Leu He Ser Lys 90 Glu Ser Trp Ser Tyr 95 He
Vai Glu Lys Pro 100 Asn Pro Glu Asn Gly 105 Thr Cys Tyr Pro Gly 110 His Phe
Ala Asp Tyr 115 Glu Glu Leu Arg Glu 120 Gin Leu Ser Ser Vai 125 Ser Ser Phe
- 119 034733
Glu Arg Phe Glu He Phe Pro 130 135
Val Thr Gly Val Ser Ala Ser
145 150
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu 165
Leu Ser Lys Ser Tyr Ala Asn 180
Trp Gly Val His His Pro Pro 195
His Thr Glu Asn Ala Tyr Val
210 215
Lys Phe Thr Pro Glu lie Ala
225 230
Gly Arg lie Asn Tyr Tyr Trp 245 lie Phe Glu Ala Asn Gly Asn 260
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser
275
Asp Lys Cys Asp Ala Lys Cys
290 295
Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val
305 310
Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys 325 lie Pro Ser lie Gln Ser Arg
340
He Glu Gly Gly Trp Thr Gly
355
His Gln Asn Glu Gln Gly Ser
370 375
Gln Asn Ala He Asn Gly He
385 390
Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr 405
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu 420
Asp He Trp Thr Tyr Asn Ala
435
Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr 140
Cys Ser His Asn Gly Glu Ser Ser Phe 155160
Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn 170175
Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu 185190
Asn lie Gly Asp Gln Lys Ala Leu Tyr 200205
Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg 220
Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu 235240
Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr lie 250255
Leu lie Ala Pro Arg Tyr Ala Phe Ala 265270
Gly lie lie Asn Ser Asn Ala Pro Met 280285
Gln Thr Pro Gln Gly Ala lie Asn Ser 300
His Pro Val Thr lie Gly Glu Cys Pro 315320
Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn 330335
Gly Leu Phe Gly Ala He Ala Gly Phe 345350
Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His 360365
Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr 380
Thr Asn Lys Val Asn Ser Val lie Glu 395400
Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu 410415
Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe He 425430
Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu
440445
- 120 034733
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp 455 Ser Asn Vai Lys Asn 460 Leu Tyr Glu Lys
450
Vai Lys Ser Gin Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu He Gly Asn Gly Cys
465 470 475 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Vai Lys
485 490 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
500 505 510
Arg Glu Lys He Asp Gly Vai Lys Leu Glu Ser Met Gly Vai Tyr Gin
515 520 525
lie Leu Ala He Tyr Ser Thr Vai Ala Ser Ser Leu Vai Leu Leu Vai
530 535 540
Ser Leu Gly Ala He Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gin
545 550 555 560
Cys Arg He Cys He
565
<21C )> < 19
<211> 565 <212> БЕЛОК
<213 ;> Искусственная последовательность
<220>
<223> 1 клон 775 А/Solomon Islands 3/2006
<40C >> 49
Met Lys Vai Lys Leu Leu Vai Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1 5 10 15
Ala Asp Thr lie Cys He Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Vai Asp Thr Vai Leu Glu Lys Asn Vai Thr Vai Thr His Ser Vai Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly He
50 55 60
Ala Pro Leu Gin Leu Gly Asn Cys Ser Vai Ala Gly Trp lie Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu He Ser Arg Glu Ser Trp Ser Tyr He
85 90 95
Vai Glu Lys Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly His Phe
100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gin Leu Ser Ser Vai Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu lie Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr
130 135 140
- 121 034733
Thr 145 Thr Gly Val Ser Ala 150 Ser Cys Ser His Asn 155 Gly Glu Ser Ser Phe 160
Туг Lys Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn
165 170 175
Leu Ser Lys Ser Tyr Ala Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu
180 185 190
Trp Gly Val His His Pro Pro Asn He Gly Asp Gin Arg Ala Leu Tyr
195 200 205
His Lys Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg
210 215 220
Lys Phe Thr Pro Glu He Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gin Glu
225 230 235 240
Gly Arg He Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr He
245 250 255
He Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu He Ala Pro Arg Tyr Ala Phe Ala
260 265 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly He He Asn Ser Asn Ala Pro Met
275 280 285
Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gin Thr Pro Gin Gly Ala He Asn Ser
290 295 300
Ser Leu Pro Phe Gin Asn Val His Pro Val Thr He Gly Glu Cys Pro
305 310 315 320
Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn
325 330 335
He Pro Ser He Gin Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Xie Ala Gly Phe
340 345 350
Xie Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His
355 360 365
His Gin Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gin Lys Ser Thr
370 375 380
Gin Asn Ala He Asn Gly He Thr Asn Lys Val Asn Ser Val He Glu
385 390 395 400
Lys Met Asn Thr Gin Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu
405 410 415
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe He
420 425 430
Asp He Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu
435 440 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys
450 455 460
Val Lys Ser Gin Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu He Gly Asn Gly Cys
- 122
465 470 475 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys
485 490 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
500 505 510
Arg Glu Lys He Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln
515 520 525
Не Leu Ala He Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val
530 535 540
Ser Leu Gly Ala He Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln
545 550 555 560
Cys Arg He Cys He
565
<210> ! 50
<211 .> ! 566
<212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223 : > клон 776 A/Brisbane/10/2007
<400> ! 50
Met Lys Thr He He Ala Leu Ser Tyr He Leu Cys Leu Val Phe Thr
1 5 10 15
Gln Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr He Val Lys Thr He Thr Asn Asp
35 40 45
Gln He Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr
50 55 60
Gly Glu He Cys Asp Ser Pro His Gln He Leu Asp Gly Glu Asn Cys
65 70 75 80
Thr Leu He Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gln Cys Asp Gly Phe Gln
85 90 95
Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn
100 105 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
115 120 125
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr
130 135 140
Gly Val Thr Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys He Arg Arg Ser Asn
145 150 155 160
Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Lys Phe Lys
- 123
165 170 175
Туг Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe Asp Lys
180 185 190
Leu Tyr He Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Asn Asp Gln He
195 200 205
Phe Leu Tyr Ala Gln Ala Ser Gly Arg He Thr Val Ser Thr Lys Arg
210 215 220
Ser Gln Gln Thr Val He Pro Asn He Gly Ser Arg Pro Arg Val Arg
225 230 235 240
Asn He Pro Ser Arg He Ser He Tyr Trp Thr He Val Lys Pro Gly
245 250 255
Asp He Leu Leu He Asn Ser Thr Gly Asn Leu He Ala Pro Arg Gly
260 265 270
Tyr Phe Lys He Arg Ser Gly Lys Ser Ser He Met Arg Ser Asp Ala
275 280 285
Pro He Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys He Thr Pro Asn Gly Ser He
290 295 300
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg He Thr Tyr Gly Ala
305 310 315 320
Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
325 330 335
Arg Asn Val Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly He Phe Gly Ala He Ala
340 345 350
Gly Phe He Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly He Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
370 375 380
Ser Thr Gln Ala Ala He Asp Gln He Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu
385 390 395 400
lie Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln He Glu Lys Glu Phe Ser
405 410 415
Glu Val Glu Gly Arg He Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr
420 425 430
Lys He Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
435 440 445
Asn Gln His Thr He Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
450 455 460
Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
465 470 475 480
Gly Cys Phe Lys He Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys He Gly Ser
485 490 495
- 124
He Arg Asn Gly 500 Thr Tyr Asp His Asp 505 Val Tyr Arg Asp Glu 510 Ala Leu
Asn Asn Arg 515 Phe Gin He Lys Gly 520 Val Glu Leu Lys Ser 525 Gly Tyr Lys
Asp Trp 530 He Leu Trp He Ser 535 Phe Ala He Ser Cys 540 Phe Leu Leu Cys
Val 545 Ala Leu Leu Gly Phe 550 He Met Trp Ala Cys 555 Gin Lys Gly Asn He 560
Arg Cys Asn He Cys 565 He
<21C )> ! 51
<211> 566 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ] клон 777 A/Wisconsin/67/2005
<400> ! 51
Met Lys Thr lie He Ala Leu Ser Tyr He Leu Cys Leu Val Phe Thr
1 5 10 15
Gin Lys Leu Pro Gly Asn Asp Asn Ser Thr Ala Thr Leu Cys Leu Gly
20 25 30
His His Ala Val Pro Asn Gly Thr He Val Lys Thr He Thr Asn Asp
35 40 45
Gin He Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gin Ser Ser Ser Thr
50 55 60
Gly Gly He Cys Asp Ser Pro His Gin lie Leu Asp Gly Glu Asn Cys
65 70 75 80
Thr Leu He Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro Gin Cys Asp Gly Phe Gin
85 90 95
Asn Lys Lys Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Lys Ala Tyr Ser Asn
100 105 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
115 120 125
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Asn Asp Glu Ser Phe Asn Trp Thr
130 135 140
Gly Val Thr Gin Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Lys Arg Arg Ser Asn
145 150 155 160
Asn Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Lys Phe Lys
165 170 175
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Asn Glu Lys Phe Asp Lys
180 185 190
- 125
Leu Tyr He 195 Trp Gly Val His His 200 Pro Gly Thr Asp Asn 205 Asp Gin He
Phe Leu His Ala Gin Ala Ser Gly Arg lie Thr Val Ser Thr Lys Arg
210 215 220
Ser Gin Gin Thr Val He Pro Asn He Gly Ser Arg Pro Arg He Arg
225 230 235 240
Asn He Pro Ser Arg He Ser He Tyr Trp Thr He Val Lys Pro Gly
245 250 255
Asp He Leu Leu He Asn Ser Thr Gly Asn Leu He Ala Pro Arg Gly
260 265 270
Tyr Phe Lys He Arg Ser Gly Lys Ser Ser He Met Arg Ser Asp Ala
275 280 285
Pro He Gly Lys Cys Asn Ser Glu Cys He Thr Pro Asn Gly Ser He
290 295 300
Pro Asn Asp Lys Pro Phe Gin Asn Val Asn Arg He Thr Tyr Gly Ala
305 310 315 320
Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
325 330 335
Arg Asn Val Pro Glu Lys Gin Thr Arg Gly He Phe Gly Ala He Ala
340 345 350
Gly Phe He Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Phe Arg His Gin Asn Ser Glu Gly He Gly Gin Ala Ala Asp Leu Lys
370 375 380
Ser Thr Gin Ala Ala He Asn Gin He Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu
385 390 395 400
He Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gin He Glu Lys Glu Phe Ser
405 410 415
Glu Val Glu Gly Arg He Gin Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr
420 425 430
Lys He Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Leu Glu
435 440 445
Asn Gin His Thr He Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
450 455 460
Glu Arg Thr Lys Lys Gin Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Met Gly Asn
465 470 475 480
Gly Cys Phe Lys He Tyr His Lys Cys Asp Asn Ala Cys He Gly Ser
485 490 495
He Arg Asn Gly Thr Tyr Asp His Asp Val Tyr Arg Asp Glu Ala Leu
500 505 510
- 126 034733
Asn Asn Arg Phe Gln lie Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys 515 520525
Asp Trp lie Leu Trp lie Ser Phe Ala lie Ser Cys Phe Leu Leu Cys 530 535540
Val Ala Leu Leu Gly Phe lie Met Trp Ala Cys Gln Lys Gly Asn lie 545 550 555560
Arg Cys Asn lie Cys lie
565 <210> 52 <211>585 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> клон 778 B/Malaysia/2506/2004 <400> 52
Met Lys Ala lie lie Val Leu Leu 15
Arg lie Cys Thr Gly lie Thr Ser 20
Thr Ala Thr Gln Gly Glu Val Asn 3540
Thr Thr Pro Thr Lys Ser His Phe
5055
Arg Gly Lys Leu Cys Pro Lys Cys 6570
Ala Leu Gly Arg Pro Lys Cys Thr 85
Ser lie Leu His Glu Val Arg Pro 100
Met His Asp Arg Thr Lys lie Arg
115120
Tyr Glu His lie Arg Leu Ser Thr 130135
Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Lys lie 145150
Val Thr Asn Gly Asn Gly Phe Phe
165
Lys Asn Asp Asn Asn Lys Thr Ala
180
Pro Tyr lie Cys Thr Glu Gly Glu
195200
Met Val Val Thr Ser Asn Ala Asp
1015
Ser Asn Ser Pro His Val Val Lys 2530
Val Thr Gly Val lie Pro Leu Thr 45
Ala Asn Leu Lys Gly Thr Glu Thr 60
Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Val 7580
Gly Asn lie Pro Ser Ala Arg Val
9095
Val Thr Ser Gly Cys Phe Pro lie 105110
Gln Leu Pro Lys Leu Leu Arg Gly 125
His Asn Val lie Asn Ala Glu Asn 140
Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn 155160
Ala Thr Met Ala Trp Ala Val Pro 170175
Thr Asn Ser Leu Thr lie Glu Val
185190
Asp Gln lie Thr Val Trp Gly Phe
205
- 127 034733
His Ser 210 Asp Asn Glu Thr Gin Met Ala Lys Leu Tyr Gly Asp Ser Lys
215 220
Pro Gin Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly Vai Thr Thr His Tyr Vai
225 230 235 240
Ser Gin He Gly Gly Phe Pro Asn Gin Thr Glu Asp Gly Gly Leu Pro
245 250 255
Gin Ser Gly Arg He Vai Vai Asp Tyr Met Vai Gin Lys Ser Gly Lys
260 265 270
Thr Gly Thr He Thr Tyr Gin Arg Gly He Leu Leu Pro Gin Lys Vai
275 280 285
Trp Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Vai He Lys Gly Ser Leu Pro Leu
290 295 300
He Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys Tyr Gly Gly Leu Asn Lys
305 310 315 320
Ser Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala Lys Ala He Gly Asn Cys
325 330 335
Pro He Trp Vai Lys Thr Pro Leu Lys Leu Ala Asn Gly Thr Lys Tyr
340 345 350
Arg Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg Gly Phe Phe Gly Ala He
355 360 365
Ala Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly Met He Ala Gly Trp His
370 375 380
Gly Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Vai Ala Vai Ala Ala Asp Leu
385 390 395 400
Lys Ser Thr Gin Glu Ala He Asn Lys He Thr Lys Asn Leu Asn Ser
405 410 415
Leu Ser Glu Leu Glu Vai Lys Asn Leu Gin Arg Leu Ser Gly Ala Met
420 425 430
Asp Glu Leu His Asn Glu He Leu Glu Leu Asp Glu Lys Vai Asp Asp
435 440 445
Leu Arg Ala Asp Thr He Ser Ser Gin He Glu Leu Ala Vai Leu Leu
450 455 460
Ser Asn Glu Gly He He Asn Ser Glu Asp Glu His Leu Leu Ala Leu
465 470 475 480
Glu Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro Ser Ala Vai Glu He Gly
485 490 495
Asn Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys Asn Gin Thr Cys Leu Asp
500 505 510
Arg He Ala Ala Gly Thr Phe Asp Ala Gly Glu Phe Ser Leu Pro Thr
515 520 525
Phe Asp Ser Leu Asn He Thr Ala Ala Ser Leu Asn Asp Asp Gly Leu
- 128 034733
530 535 540
Asp Asn His Thr He Leu Leu Tyr Tyr Ser Thr Ala Ala Ser Ser Leu
545 550 555 560
Ala Vai Thr Leu Met He Ala He Phe Vai Vai Tyr Met Vai Ser Arg
565 570 575
Asp Asn Vai Ser Cys Ser He Cys Leu
580 585
<210> 53 <211> 584 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> клон 779 B/Florida/4/2006 <400> 53
Met 1 Lys Ala He lie Vai 5 Leu Leu Met Vai 10 Vai Thr Ser Asn Ala 15 Asp
Arg He Cys Thr Gly He Thr Ser Ser Asn Ser Pro His Vai Vai Lys
20 25 30
Thr Ala Thr Gin Gly Glu Vai Asn Vai Thr Gly Vai He Pro Leu Thr
35 40 45
Thr Thr Pro Thr Lys Ser Tyr Phe Ala Asn Leu Lys Gly Thr Arg Thr
50 55 60
Arg Gly Lys Leu Cys Pro Asp Cys Leu Asn Cys Thr Asp Leu Asp Vai
65 70 75 80
Ala Leu Gly Arg Pro Met Cys Vai Gly Thr Thr Pro Ser Ala Lys Ala
85 90 95
Ser He Leu His Glu Vai Lys Pro Vai Thr Ser Gly Cys Phe Pro He
100 105 110
Met His Asp Arg Thr Lys He Arg Gin Leu Pro Asn Leu Leu Arg Gly
115 120 125
Tyr Glu Asn He Arg Leu Ser Thr Gin Asn Vai lie Asp Ala Glu Lys
130 135 140
Ala Pro Gly Gly Pro Tyr Arg Leu Gly Thr Ser Gly Ser Cys Pro Asn
145 150 155 160
Ala Thr Ser Lys Ser Gly Phe Phe Ala Thr Met Ala Trp Ala Vai Pro
165 170 175
Lys Asp Asn Asn Lys Asn Ala Thr Asn Pro Leu Thr Vai Glu Vai Pro
180 185 190
Tyr He Cys Thr Glu Gly Glu Asp Gin He Thr Vai Trp Gly Phe His
195 200 205
Ser Asp Asn Lys Thr Gin Met Lys Asn Leu Tyr Gly Asp Ser Asn Pro
- 129
210
215
220
Gln Lys Phe Thr Ser Ser Ala Asn Gly 225230
Gln lie Gly Ser Phe Pro Asp Gln Thr 245
Ser Gly Arg Ile Val Val Asp Tyr Met 260265
Gly Thr lie Val Tyr Gln Arg Gly Val 275280
Cys Ala Ser Gly Arg Ser Lys Val lie 290295
Gly Glu Ala Asp Cys Leu His Glu Lys 305310
Lys Pro Tyr Tyr Thr Gly Glu His Ala 325 lie Trp Val Lys Thr Pro Leu Lys Leu 340345
Pro Pro Ala Lys Leu Leu Lys Glu Arg
355360
Gly Phe Leu Glu Gly Gly Trp Glu Gly
370375
Tyr Thr Ser His Gly Ala His Gly Val 385390
Ser Thr Gln Glu Ala lie Asn Lys lie 405
Ser Glu Leu Glu Val Lys Asn Leu Gln 420425
Glu Leu His Asn Glu lie Leu Glu Leu
435440
Arg Ala Asp Thr lie Ser Ser Gln lie 450455
Asn Glu Gly lie lie Asn Ser Glu Asp 465470
Arg Lys Leu Lys Lys Met Leu Gly Pro 485
Gly Cys Phe Glu Thr Lys His Lys Cys
500505 lie Ala Ala Gly Thr Phe Asn Ala Gly
515520
Asp Ser Leu Asn lie Thr Ala Ala Ser
530535
Val Thr Thr His Tyr Val Ser 235 240
Glu Asp Gly Gly Leu Pro Gln
250 255
Met Gln Lys Pro Gly Lys Thr 270
Leu Leu Pro Gln Lys Val Trp 285
Lys Gly Ser Leu Pro Leu lie 300
Tyr Gly Gly Leu Asn Lys Ser
315 320
Lys Ala lie Gly Asn Cys Pro
330 335
Ala Asn Gly Thr Lys Tyr Arg
350
Gly Phe Phe Gly Ala lie Ala 365
Met lie Ala Gly Trp His Gly 380
Ala Val Ala Ala Asp Leu Lys
395 400
Thr Lys Asn Leu Asn Ser Leu
410 415
Arg Leu Ser Gly Ala Met Asp 430
Asp Glu Lys Val Asp Asp Leu
445
Glu Leu Ala Val Leu Leu Ser
460
Glu His Leu Leu Ala Leu Glu
475 480
Ser Ala Val Glu lie Gly Asn
490 495
Asn Gln Thr Cys Leu Asp Arg 510
Glu Phe Ser Leu Pro Thr Phe 525
Leu Asn Asp Asp Gly Leu Asp
540
- 130 034733
Asn 545 His Thr lie Leu Leu Tyr 550 Tyr Ser Thr Ala 555 Ala Ser Ser Leu Ala 560
Val Thr Leu Met Leu Ala lie Phe Ile Val Tyr Met Val Ser Arg Asp
565 570 575
Asn Val Ser Cys Ser lie Cys Leu
580 <210> 54 <211> 562 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> клон 780 A/Singapore/1/57 <400> 54
Met Ala 1 lie lie Tyr 5 Leu lie Leu Leu Phe Thr 10 Ala Val Arg Gly 15 Asp
Gln lie Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Lys Val Asp
20 25 30
Thr lie Leu Glu Arg Asn Val Thr Val Thr His Ala Lys Asp lie Leu
35 40 45
Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Lys Leu Asn Gly lie Pro Pro
50 55 60
Leu Glu Leu Gly Asp Cys Ser Ile Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro
65 70 75 80
Glu Cys Asp Arg Leu Leu Ser Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Met Glu
85 90 95
Lys Glu Asn Pro Arg Asp Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Ser Phe Asn Asp
100 105 110
Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Ser Val Lys His Phe Glu Lys
115 120 125
Val Lys lie Leu Pro Lys Asp Arg Trp Thr Gln His Thr Thr Thr Gly
130 135 140
Gly Ser Arg Ala Cys Ala Val Ser Gly Asn Pro Ser Phe Phe Arg Asn
145 150 155 160
Met Val Trp Leu Thr Lys Lys Glu Ser Asn Tyr Pro Val Ala Lys Gly
165 170 175
Ser Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Glu Gln Met Leu Ile lie Trp Gly Val
180 185 190
His His Pro Asn Asp Glu Thr Glu Gln Arg Thr Leu Tyr Gln Asn Val
195 200 205
Gly Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Lys Arg Ser Thr
210 215 220
- 131
Pro Asp He Ala Thr Arg Pro Lys Vai 225230
Glu Phe Ser Trp Thr Leu Leu Asp Met 245
Ser Thr Gly Asn Leu lie Ala Pro Glu 260265
Arg Gly Ser Ser Gly lie Met Lys Thr 275280
Glu Thr Lys Cys Gin Thr Pro Leu Gly
290295
Phe His Asn Vai His Pro Leu Thr lie 305310
Lys Ser Glu Lys Leu Vai Leu Ala Thr 325
He Glu Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala 340345
Gly Trp Gin Gly Met Vai Asp Gly Trp 355360
Asp Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp
370375
Phe Asp Gly He Thr Asn Lys Vai Asn 385390
Thr Gin Phe Glu Ala Vai Gly Lys Glu 405
Leu Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu 420425
Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Vai Leu 435440
Asp Phe His Asp Ser Asn Vai Lys Asn
450455
Gin Leu Arg Asp Asn Vai Lys Glu Leu 465470
Tyr His Lys Cys Asp Asp Glu Cys Met 485
Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Glu Glu Glu 500505 lie Lys Gly Vai Lys Leu Ser Ser Met
515520
He Tyr Ala Thr Vai Ala Gly Ser Leu
530535
Asn Gly Leu Gly Ser Arg Met 235 240
Trp Asp Thr He Asn Phe Glu
250 255
Tyr Gly Phe Lys lie Ser Lys 270
Glu Gly Thr Leu Glu Asn Cys 285
Ala lie Asn Thr Thr Leu Pro
300
Gly Glu Cys Pro Lys Tyr Vai 315 320
Gly Leu Arg Asn Vai Pro Gin
330 335 lie Ala Gly Phe lie Glu Gly 350
Tyr Gly Tyr His His Ser Asn 365
Lys Glu Ser Thr Gin Lys Ala 380
Ser Vai lie Glu Lys Met Asn
395 400
Phe Ser Asn Leu Glu Arg Arg
410 415
Asp Gly Phe Leu Asp Vai Trp 430
Met Glu Asn Glu Arg Thr Leu 445
Leu Tyr Asp Lys Vai Arg Met 460
Gly Asn Gly Cys Phe Glu Phe
475 480
Asn Ser Vai Lys Asn Gly Thr
490 495
Ser Lys Leu Asn Arg Asn Glu 510
Gly Vai Tyr Gin lie Leu Ala 525
Ser Leu Ala lie Met Met Ala
540
- 132 034733
Gly lie Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln Cys Arg lie 545 550 555560
Cys lie <210>55 <211>567 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> клон 781 A/Anhui/1/2005 <400> 55
Met Glu Lys 1 lie Val 5 Leu Leu Leu Ala Ile Val 10 Ser Leu Val Lys 15 Ser
Asp Gln lie Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp lie
35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys
50 55 60
Pro Leu lie Leu Arg Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Asn Val Pro Glu Trp Ser Tyr lie Val
85 90 95
Glu Lys Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Phe Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg lie Asn His Phe Glu
115 120 125
Lys lie Gln lie lie Pro Lys Ser Ser Trp Ser Asp His Glu Ala Ser
130 135 140
Ser Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Thr Pro Ser Phe Phe
145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Ile Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Thr lie
165 170 175
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Gln Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp
180 185 190
Gly lie His His Ser Asn Asp Ala Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr lie Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
210 215 220
Leu Val Pro Lys lie Ala Thr Arg Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
225 230 235 240
- 133 034733
Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr lie Leu Lys Pro Asn Asp Ala He 255 Asn
245 250
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe He Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys He
260 265 270
Vai Lys Lys Gly Asp Ser Ala He Vai Lys Ser Glu Vai Glu Tyr Gly
275 280 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gin Thr Pro He Gly Ala He Asn Ser Ser
290 295 300
Met Pro Phe His Asn He His Pro Leu Thr He Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Vai Lys Ser Asn Lys Leu Vai Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
325 330 335
Pro Leu Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala He Ala
340 345 350
Gly Phe He Glu Gly Gly Trp Gin Gly Met Vai Asp Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Tyr His His Ser Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys Glu
370 375 380
Ser Thr Gin Lys Ala He Asp Gly Vai Thr Asn Lys Vai Asn Ser He
385 390 395 400
lie Asp Lys Met Asn Thr Gin Phe Glu Ala Vai Gly Arg Glu Phe Asn
405 410 415
Asn Leu Glu Arg Arg He Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly
420 425 430
Phe Leu Asp Vai Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Vai Leu Met Glu
435 440 445
Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Vai Lys Asn Leu Tyr
450 455 460
Asp Lys Vai Arg Leu Gin Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn
465 470 475 480
Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser
485 490 495
Vai Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gin Tyr Ser Glu Glu Ala Arg
500 505 510
Leu Lys Arg Glu Glu He Ser Gly Vai Lys Leu Glu Ser He Gly Thr
515 520 525
Tyr Gin He Leu Ser He Tyr Ser Thr Vai Ala Ser Ser Leu Ala Leu
530 535 540
Ala He Met Vai Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser
545 550 555 560
Leu Gin Cys Arg He Cys He
- 134 034733
565 <210> 56 <211> 568 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> клон 782 A/Vietnam/1194/2004 <400> 56
Met Glu Lys Не Val Leu Leu Phe 15
Asp Gln He Cys He Gly Tyr His 20
Asp Thr lie Met Glu Lys Asn Val 3540
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Lys
5055
Pro Leu lie Leu Arg Asp Cys Ser 6570
Pro Met Cys Asp Glu Phe lie Asn 85
Glu Lys Ala Asn Pro Val Asn Asp
100
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu
115120
Lys lie Gln lie He Pro Lys Ser 130135
Leu Gly Val Ser Ser Ala Cys Pro 145150
Arg Asn Val Val Trp Leu lie Lys
165
Lys Arg Ser Tyr Asn Asn Thr Asn
180
Gly lie His His Pro Asn Asp Ala
195200
Asn Pro Thr Thr Tyr lie Ser Val
210215
Leu Val Pro Arg lie Ala Thr Arg 225230
Arg Met Glu Phe Phe Trp Thr lie
245
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe lie
Ala lie Val Ser Leu Val Lys Ser 1015
Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val 2530
Thr Val Thr His Ala Gln Asp He 45
Leu Cys Asp Leu Asp Gly Val Lys 60
Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn 7580
Val Pro Glu Trp Ser Tyr lie Val 9095
Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn 105110
Leu Ser Arg lie Asn His Phe Glu
125
Ser Trp Ser Ser His Glu Ala Ser 140
Tyr Gln Gly Lys Ser Ser Phe Phe
155160
Lys Asn Ser Thr Tyr Pro Thr lie 170175
Gln Glu Asp Leu Leu Val Leu Trp 185190
Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gln
205
Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg 220
Ser Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly
235 240
Leu Lys Pro Asn Asp Ala lie Asn 250 255
Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys lie
- 135
260 265 270
Vai Lys Lys Gly Asp Ser Thr He Met Lys Ser Glu Leu Glu Tyr Gly
275 280 285
Asn Cys Asn Thr Lys Cys Gin Thr Pro Met Gly Ala He Asn Ser Ser
290 295 300
Met Pro Phe His Asn He His Pro Leu Thr He Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Vai Lys Ser Asn Arg Leu Vai Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
325 330 335
Pro Gin Arg Glu Arg Arg Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala He
340 345 350
Ala Gly Phe He Glu Gly Gly Trp Gin Gly Met Vai Asp Gly Trp Tyr
355 360 365
Gly Tyr His His Ser Asn Glu Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Lys
370 375 380
Glu Ser Thr Gin Lys Ala He Asp Gly Vai Thr Asn Lys Vai Asn Ser
385 390 395 400
He He Asp Lys Met Asn Thr Gin Phe Glu Ala Vai Gly Arg Glu Phe
405 410 415
Asn Asn Leu Glu Arg Arg He Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp
420 425 430
Gly Phe Leu Asp Vai Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Vai Leu Met
435 440 445
Glu Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Vai Lys Asn Leu
450 455 460
Tyr Asp Lys Vai Arg Leu Gin Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly
465 470 475 480
Asn Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu
485 490 495
Ser Vai Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gin Tyr Ser Glu Glu Ala
500 505 510
Arg Leu Lys Arg Glu Glu lie Ser Gly Vai Lys Leu Glu Ser lie Gly
515 520 525
He Tyr Gin He Leu Ser He Tyr Ser Thr Vai Ala Ser Ser Leu Ala
530 535 540
Leu Ala He Met Vai Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly
545 550 555 560
Ser Leu Gin Cys Arg He Cys He
565 <210> 57 <211> 566
- 136 034733 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> клон 783 A/Teal/HongKong/W312/97 <400> 57
Met 1 lie Ala He lie Val 5 He Ala lie Leu 10 Ala Ala Ala Gly Lys 15 Ser
Asp Lys lie Cys He Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Thr Gln Val
20 25 30
Asp Thr He Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser He Glu Leu
35 40 45
Leu Glu Asn Gln Lys Glu Glu Arg Phe Cys Lys He Leu Asn Lys Ala
50 55 60
Pro Leu Asp Leu Arg Glu Cys Thr He Glu Gly Trp He Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Gln Cys Asp Leu Leu Leu Gly Asp Gln Ser Trp Ser Tyr lie Val
85 90 95
Glu Arg Pro Thr Ala Gln Asn Gly He Cys Tyr Pro Gly Thr Leu Asn
100 105 110
Glu Val Glu Glu Leu Arg Ala Leu He Gly Ser Gly Glu Arg Val Glu
115 120 125
Arg Phe Glu Met Phe Pro Gln Ser Thr Trp Gln Gly Val Asp Thr Asn
130 135 140
Ser Gly Thr Thr Arg Ser Cys Pro Tyr Ser Thr Gly Ala Ser Phe Tyr
145 150 155 160
Arg Asn Leu Leu Trp He He Lys Thr Lys Thr Ala Glu Tyr Pro Val
165 170 175
He Lys Gly He Tyr Asn Asn Thr Gly Thr Gln Pro lie Leu Tyr Phe
180 185 190
Trp Gly Val His His Pro Pro Asn Thr Asp Glu Gln Asp Thr Leu Tyr
195 200 205
Gly Ser Gly Asp Arg Tyr Val Arg Met Gly Thr Glu Ser Met Asn Phe
210 215 220
Ala Lys Ser Pro Glu He Ala Ala Arg Pro Ala Val Asn Gly Gln Arg
225 230 235 240
Gly Arg He Asp Tyr Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Glu Thr Leu
245 250 255
Asn Val Glu Ser Asn Gly Asn Leu He Ala Pro Trp Tyr Ala Tyr Lys
260 265 270
Phe Val Asn Thr Asn Ser Lys Gly Ala Val Phe Arg Ser Asp Leu Pro
275 280 285
- 137 034733
lie Glu Asn Cys Asp Ala Thr Cys 295 Gin Thr lie Ala 300 Gly Val Leu Arg
290
Thr Asn Lys Thr Phe Gin Asn Val Ser Pro Leu Trp lie Gly Glu Cys
305 310 315 320
Pro Lys Tyr Val Lys Ser Glu Ser Leu Arg Leu Ala Thr Gly Leu Arg
325 330 335
Asn Val Pro Gin He Glu Thr Arg Gly Leu Phe Gly Ala lie Ala Gly
340 345 350
Phe He Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met lie Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr
355 360 365
His His Glu Asn Ser Gin Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Arg Glu Ser
370 375 380
Thr Gin Lys Ala Val Asn Arg He Thr Asn Lys Val Asn Ser He He
385 390 395 400
Asn Lys Met Asn Thr Gin Phe Glu Ala Val Asp His Glu Phe Ser Asn
405 410 415
Leu Glu Arg Arg He Asp Asn Leu Asn Lys Arg Met Gin Asp Gly Phe
420 425 430
Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn
435 440 445
Glu Arg Thr Leu Asp Met His Asp Ala Asn Val Lys Asn Leu His Glu
450 455 460
Lys Val Lys Ser Gin Leu Arg Asp Asn Ala Thr He Leu Gly Asn Gly
465 470 475 480
Cys Phe Glu Phe Trp His Lys Cys Asp Asn Glu Cys He Glu Ser Val
485 490 495
Lys Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Gin Thr Glu Ser Lys Leu
500 505 510
Asn Arg Leu Lys He Glu Ser Val Lys Leu Glu Asn Leu Gly Val Tyr
515 520 525
Gin He Leu Ala lie Tyr Ser Thr Val Ser Ser Ser Leu Val Leu Val
530 535 540
Gly Leu He Met Ala Met Gly Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Met
545 550 555 560
Gin Cys Arg He Cys lie
565 <210> 58 <211> 570 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
- 138 034733 <223> клон 784 A/Equine/Prague/56 <400> 58
Met Asn 1 Thr Gin He 5 Leu He Leu Ala Thr 10 Ser Ala Phe Phe Tyr 15 Val
Arg Ala Asp Lys He Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr
20 25 30
Lys Val Asp Thr Leu Thr Glu Lys Gly He Glu Val Val Asn Ala Thr
35 40 45
Glu Thr Val Glu Gin Thr Asn He Pro Lys He Cys Ser Lys Gly Lys
50 55 60
Gin Thr Val Asp Leu Gly Gin Cys Gly Leu Leu Gly Thr Val lie Gly
65 70 75 80
Pro Pro Gin Cys Asp Gin Phe Leu Glu Phe Ser Ala Asn Leu He Val
85 90 95
Glu Arg Arg Glu Gly Asn Asp He Cys Tyr Pro Gly Lys Phe Asp Asn
100 105 HO
Glu Glu Thr Leu Arg Lys He Leu Arg Lys Ser Gly Gly He Lys Lys
115 120 125
Glu Asn Met Gly Phe Thr Tyr Thr Gly Val Arg Thr Asn Gly Glu Thr
130 135 140
Ser Ala Cys Arg Arg Ser Arg Ser Ser Phe Tyr Ala Glu Met Lys Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Ser Thr Asp Asn Gly Thr Phe Pro Gin Met Thr Lys Ser
165 170 175
Tyr Lys Asn Thr Lys Lys Val Pro Ala Leu He He Trp Gly He His
180 185 190
His Ser Gly Ser Thr Thr Glu Gin Thr Arg Leu Tyr Gly Ser Gly Asn
195 200 205
Lys Leu He Thr Val Trp Ser Ser Lys Tyr Gin Gin Ser Phe Val Pro
210 215 220
Asn Pro Gly Pro Arg Pro Gin Met Asn Gly Gin Ser Gly Arg He Asp
225 230 235 240
Phe His Trp Leu Met Leu Asp Pro Asn Asp Thr Val Thr Phe Ser Phe
245 250 255
Asn Gly Ala Phe He Ala Pro Asp Arg Ala Ser Phe Leu Arg Gly Lys
260 265 270
Ser Leu Gly He Gin Ser Asp Ala Gin Leu Asp Asn Asn Cys Glu Gly
275 280 285
Glu Cys Tyr His He Gly Gly Thr He He Ser Asn Leu Pro Phe Gin
290 295 300
- 139 034733
Asn 305 He Asn Ser Arg Ala 310 lie Gly Lys Cys Pro Arg 315 Tyr Val Lys Gln 320
Lys Ser Leu Met Leu Ala Thr Gly Met Lys Asn Val Pro Glu Ala Pro
325 330 335
Ala His Lys Gln Leu Thr His His Met Arg Lys Lys Arg Gly Leu Phe
340 345 350
Gly Ala He Ala Gly Phe He Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu He Asp
355 360 365
Gly Trp Tyr Gly Tyr Lys His Gln Asn Ala Gln Gly Glu Gly Thr Ala
370 375 380
Ala Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser Ala He Asn Gln He Thr Gly Lys
385 390 395 400
Leu Asn Arg Leu He Glu Lys Thr Asn Gln Gln Phe Glu Leu lie Asp
405 410 415
Asn Glu Phe Asn Glu He Glu Lys Gln He Gly Asn Val He Asn Trp
420 425 430
Thr Arg Asp Ser He He Glu Val Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Phe Leu
435 440 445
Val Ala Val Glu Asn Gln His Thr He Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met
450 455 460
Asn Lys Leu Tyr Glu Lys Val Arg Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu
465 470 475 480
Glu Asp Gly Asn Gly Cys Phe Glu lie Phe His Gln Cys Asp Asn Asp
485 490 495
Cys Met Ala Ser He Arg Asn Asn Thr Tyr Asp His Lys Lys Tyr Arg
500 505 510
Lys Glu Ala He Gln Asn Arg He Gln lie Asp Ala Val Lys Leu Ser
515 520 525
Ser Gly Tyr Lys Asp He He Leu Trp Phe Ser Phe Gly Ala Ser Cys
530 535 540
Phe Leu Phe Leu Ala He Ala Met Gly Leu Val Phe He Cys He Lys
545 550 555 560
Asn Gly Asn Met Arg Cys Thr He Cys He
565 570
<210> 59 <211> 560 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> клон 785 A/HongKong/1073/99 <400> 59
- 140 034733
Met 1 Glu Thr He Ser Leu 5 He Thr He Leu Leu 10 Vai Vai Thr Ala 15 Ser
Asn Ala Asp Lys He Cys He Gly His Gin Ser Thr Asn Ser Thr Glu
20 25 30
Thr Vai Asp Thr Leu Thr Glu Thr Asn Vai Pro Vai Thr His Ala Lys
35 40 45
Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly Met Leu Cys Ala Thr Ser Leu
50 55 60
Gly His Pro Leu He Leu Asp Thr Cys Thr He Glu Gly Leu Vai Tyr
65 70 75 80
Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Leu Leu Gly Gly Arg Glu Trp Ser Tyr
85 90 95
He Vai Glu Arg Ser Ser Ala Vai Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Asn
100 105 110
Vai Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Thr Leu Phe Ser Ser Ala Ser Ser
115 120 125
Tyr Gin Arg He Gin lie Phe Pro Asp Thr Thr Trp Asn Vai Thr Tyr
130 135 140
Thr Gly Thr Ser Arg Ala Cys Ser Gly Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg
145 150 155 160
Trp Leu Thr Gin Lys Ser Gly Phe Tyr Pro Vai Gin Asp Ala Gin Tyr
165 170 175
Thr Asn Asn Arg Gly Lys Ser He Leu Phe Vai Trp Gly He His His
180 185 190
Pro Pro Thr Tyr Thr Glu Gin Thr Asn Leu Tyr He Arg Asn Asp Thr
195 200 205
Thr Thr Ser Vai Thr Thr Glu Asp Leu Asn Arg Thr Phe Lys Pro Vai
210 215 220
He Gly Pro Arg Pro Leu Vai Asn Gly Leu Gin Gly Arg He Asp Tyr
225 230 235 240
Tyr Trp Ser Vai Leu Lys Pro Gly Gin Thr Leu Arg Vai Arg Ser Asn
245 250 255
Gly Asn Leu He Ala Pro Trp Tyr Gly His Vai Leu Ser Gly Gly Ser
260 265 270
His Gly Arg He Leu Lys Thr Asp Leu Lys Gly Gly Asn Cys Vai Vai
275 280 285
Gin Cys Gin Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Ser Thr Leu Pro Phe His
290 295 300
Asn He Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Thr Cys Pro Lys Tyr Vai Arg Vai
305 310 315 320
Asn Ser Leu Lys Leu Ala Vai Gly Leu Arg Asn Vai Pro Ala Arg Ser
- 141
325 330 335
Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala He Ala Gly Phe He Glu Gly Gly Trp
340 345 350
Pro Gly Leu Vai Ala Gly Trp Tyr Gly Phe Gin His Ser Asn Asp Gin
355 360 365
Gly Vai Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp Ser Thr Gin Lys Ala He Asp
370 375 380
Lys He Thr Ser Lys Vai Asn Asn He Vai Asp Lys Met Asn Lys Gin
385 390 395 400
Tyr Glu He He Asp His Glu Phe Ser Glu Vai Glu Thr Arg Leu Asn
405 410 415
Met He Asn Asn Lys He Asp Asp Gin He Gin Asp Vai Trp Ala Tyr
420 425 430
Asn Ala Glu Leu Leu Vai Leu Leu Glu Asn Gin Lys Thr Leu Asp Glu
435 440 445
His Asp Ala Asn Vai Asn Asn Leu Tyr Asn Lys Vai Lys Arg Ala Leu
450 455 460
Gly Ser Asn Ala Met Glu Asp Gly Lys Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His
465 470 475 480
Lys Cys Asp Asp Gin Cys Met Glu Thr He Arg Asn Gly Thr Tyr Asn
485 490 495
Arg Arg Lys Tyr Arg Glu Glu Ser Arg Leu Glu Arg Gin Lys lie Glu
500 505 510
Gly Vai Lys Leu Glu Ser Glu Gly Thr Tyr Lys He Leu Thr He Tyr
515 520 525
Ser Thr Vai Ala Ser Ser Leu Vai Leu Ala Met Gly Phe Ala Ala Phe
530 535 540
Leu Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser Cys Arg Cys Asn lie Cys He
545 550 555 560
<210> 60 <211> 3111 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция 660 из A/Indonesia/5/2005 <400> 60
agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60
taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120
atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180
tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240
- 142 034733
aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300
gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360
aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420
taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480
aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540
aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600
atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660
ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720
cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780
aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840
atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900
ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960
agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tggagaaaat agtgcttctt 1020
cttgcaatag tcagtcttgt taaaagtgat cagatttgca ttggttacca tgcaaacaat 1080
tcaacagagc aggttgacac aatcatggaa aagaacgtta ctgttacaca tgcccaagac 1140
atactggaaa agacacacaa cgggaagctc tgcgatctag atggagtgaa gcctctaatt 1200
ttaagagatt gtagtgtagc tggatggctc ctcgggaacc caatgtgtga cgaattcatc 1260
aatgtaccgg aatggtctta catagtggag aaggccaatc caaccaatga cctctgttac 1320
ccagggagtt tcaacgacta tgaagaactg aaacacctat tgagcagaat aaaccatttt 1380
gagaaaattc aaatcatccc caaaagttct tggtccgatc atgaagcctc atcaggagtt 1440
agctcagcat gtccatacct gggaagtccc tcctttttta gaaatgtggt atggcttatc 1500
aaaaagaaca gtacataccc aacaataaag aaaagctaca ataataccaa ccaagaggat 1560
cttttggtac tgtggggaat tcaccatcct aatgatgcgg cagagcagac aaggctatat 1620
caaaacccaa ccacctatat ttccattggg acatcaacac taaaccagag attggtacca 1680
aaaatagcta ctagatccaa agtaaacggg caaagtggaa ggatggagtt cttctggaca 1740
attttaaaac ctaatgatgc aatcaacttc gagagtaatg gaaatttcat tgctccagaa 1800
tatgcataca aaattgtcaa gaaaggggac tcagcaatta tgaaaagtga attggaatat 1860
ggtaactgca acaccaagtg tcaaactcca atgggggcga taaactctag tatgccattc 1920
cacaacatac accctctcac catcggggaa tgccccaaat atgtgaaatc aaacagatta 1980
gtccttgcaa cagggctcag aaatagccct caaagagaga gcagaagaaa aaagagagga 2040
ctatttggag ctatagcagg ttttatagag ggaggatggc agggaatggt agatggttgg 2100
- 143 034733
tatgggtacc accatagcaa tgagcagggg agtgggtacg ctgcagacaa agaatccact 2160
caaaaggcaa tagatggagt caccaataag gtcaactcaa tcattgacaa aatgaacact 2220
cagtttgagg ccgttggaag ggaatttaat aacttagaaa ggagaataga gaatttaaac 2280
aagaagatgg aagacgggtt tctagatgtc tggacttata atgccgaact tctggttctc 2340
atggaaaatg agagaactct agactttcat gactcaaatg ttaagaacct ctacgacaag 2400
gtccgactac agcttaggga taatgcaaag gagctgggta acggttgttt cgagttctat 2460
cacaaatgtg ataatgaatg tatggaaagt ataagaaacg gaacgtacaa ctatccgcag 2520
tattcagaag aagcaagatt aaaaagagag gaaataagtg gggtaaaatt ggaatcaata 2580
ggaacttacc aaatactgtc aatttattca acagtggcga gttccctagc actggcaatc 2640
atgatggctg gtctatcttt atggatgtgc tccaatggat cgttacaatg cagaatttgc 2700
atttaagagc tctaagttaa aatgcttctt cgtctcctat ttataatatg gtttgttatt 2760
gttaattttg ttcttgtaga agagcttaat taatcgttgt tgttatgaaa tactatttgt 2820
atgagatgaa ctggtgtaat gtaattcatt tacataagtg gagtcagaat cagaatgttt 2880
cctccataac taactagaca tgaagacctg ccgcgtacaa ttgtcttata tttgaacaac 2940
taaaattgaa catcttttgc cacaacttta taagtggtta atatagctca aatatatggt 3000
caagttcaat agattaataa tggaaatatc agttatcgaa attcattaac aatcaactta 3060
acgttattaa ctactaattt tatatcatcc cctttgataa atgatagtac a 3111
<210> 61
<211> 3123
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конструкция 540 из А/New Caledonia/20/1999
<400> 61
agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60
taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120
atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180
tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240
aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300
gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360
aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420
taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480
aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540
- 144 034733
aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600
atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660
ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720
cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780
aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840
atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900
ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960
agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tggcgaaaaa cgttgcgatt 1020
ttcggcttat tgttttctct tcttgtgttg gttccttctc agatcttcgc tgacacaata 1080
tgtataggct accatgccaa caactcaacc gacactgttg acacagtact tgagaagaat 1140
gtgacagtga cacactctgt caacctactt gaggacagtc acaatggaaa actatgtcta 1200
ctaaaaggaa tagccccact acaattgggt aattgcagcg ttgccggatg gatcttagga 1260
aacccagaat gcgaattact gatttccaag gaatcatggt cctacattgt agaaacacca 1320
aatcctgaga atggaacatg ttacccaggg tatttcgccg actatgagga actgagggag 1380
caattgagtt cagtatcttc atttgagaga ttcgaaatat tccccaaaga aagctcatgg 1440
cccaaccaca ccgtaaccgg agtatcagca tcatgctccc ataatgggaa aagcagtttt 1500
tacagaaatt tgctatggct gacggggaag aatggtttgt acccaaacct gagcaagtcc 1560
tatgtaaaca acaaagagaa agaagtcctt gtactatggg gtgttcatca cccgcctaac 1620
atagggaacc aaagggcact ctatcataca gaaaatgctt atgtctctgt agtgtcttca 1680
cattatagca gaagattcac cccagaaata gccaaaagac ccaaagtaag agatcaggaa 1740
ggaagaatca actactactg gactctgctg gaacctgggg atacaataat atttgaggca 1800
aatggaaatc taatagcgcc atggtatgct tttgcactga gtagaggctt tggatcagga 1860
atcatcacct caaatgcacc aatggatgaa tgtgatgcga agtgtcaaac acctcaggga 1920
gctataaaca gcagtcttcc tttccagaat gtacacccag tcacaatagg agagtgtcca 1980
aagtatgtca ggagtgcaaa attaaggatg gttacaggac taaggaacat cccatccatt 2040
caatccagag gtttgtttgg agccattgcc ggtttcattg aaggggggtg gactggaatg 2100
gtagatgggt ggtatggtta tcatcatcag aatgagcaag gatctggcta tgctgcagat 2160
caaaaaagta cacaaaatgc cattaacggg attacaaaca aggtcaattc tgtaattgag 2220
aaaatgaaca ctcaattcac agctgtgggc aaagagttca acaaattgga aagaaggatg 2280
gaaaacttaa ataaaaaagt tgatgatggg tttctagaca tttggacata taatgcagaa 2340
- 145 034733
ttgttggttc tactggaaaa tgaaaggact ttggatttcc atgactccaa tgtgaagaat 2400
ctgtatgaga aagtaaaaag ccaattaaag aataatgcca aagaaatagg aaacgggtgt 2460
tttgagttct atcacaagtg taacaatgaa tgcatggaga gtgtgaaaaa tggtacctat 2520
gactatccaa aatattccga agaatcaaag ttaaacaggg agaaaattga tggagtgaaa 2580
ttggaatcaa tgggagtata ccagattctg gcgatctact caactgtcgc cagttccctg 2640
gttcttttgg tctccctggg ggcaatcagc ttctggatgt gttccaatgg gtctttgcag 2700
tgtagaatat gcatctaaga gctctaagtt aaaatgcttc ttcgtctcct atttataata 2760
tggtttgtta ttgttaattt tgttcttgta gaagagctta attaatcgtt gttgttatga 2820
aatactattt gtatgagatg aactggtgta atgtaattca tttacataag tggagtcaga 2880
atcagaatgt ttcctccata actaactaga catgaagacc tgccgcgtac aattgtctta 2940
tatttgaaca actaaaattg aacatctttt gccacaactt tataagtggt taatatagct 3000
caaatatatg gtcaagttca atagattaat aatggaaata tcagttatcg aaattcatta 3060
acaatcaact taacgttatt aactactaat tttatatcat cccctttgat aaatgatagt 3120
аса 3123
<210> 62
<211> 3088
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конструкция 774 из A/Brisbane/59/2007
<400> 62
ctggtatatt tatatgttgt caaataactc aaaaaccata aaagtttaag ttagcaagtg 60
tgtacatttt tacttgaaca aaaatattca cctactactg ttataaatca ttattaaaca 120
ttagagtaaa gaaatatgga tgataagaac aagagtagtg atattttgac aacaattttg 180
ttgcaacatt tgagaaaatt ttgttgttct ctcttttcat tggtcaaaaa caatagagag 240
agaaaaagga agagggagaa taaaaacata atgtgagtat gagagagaaa gttgtacaaa 300
agttgtacca aaatagttgt acaaatatca ttgaggaatt tgacaaaagc tacacaaata 360
agggttaatt gctgtaaata aataaggatg acgcattaga gagatgtacc attagagaat 420
ttttggcaag tcattaaaaa gaaagaataa attattttta aaattaaaag ttgagtcatt 480
tgattaaaca tgtgattatt taatgaattg atgaaagagt tggattaaag ttgtattagt 540
aattagaatt tggtgtcaaa tttaatttga catttgatct tttcctatat attgccccat 600
agagtcagtt aactcatttt tatatttcat agatcaaata agagaaataa cggtatatta 660
atccctccaa aaaaaaaaaa cggtatattt actaaaaaat ctaagccacg taggaggata 720
- 146 034733
acaggatccc cgtaggagga taacatccaa tccaaccaat cacaacaatc ctgatgagat 780
aacccacttt aagcccacgc atctgtggca catctacatt atctaaatca cacattcttc 840
cacacatctg agccacacaa aaaccaatcc acatctttat cacccattct ataaaaaatc 900
acactttgtg agtctacact ttgattccct tcaaacacat acaaagagaa gagactaatt 960
aattaattaa tcatcttgag agaaaatgaa agtaaaacta ctggtcctgt tatgcacatt 1020
tacagctaca tatgcagaca caatatgtat aggctaccat gctaacaact cgaccgacac 1080
tgttgacaca gtacttgaaa agaatgtgac agtgacacac tctgtcaacc tgcttgagaa 1140
cagtcacaat ggaaaactat gtctattaaa aggaatagcc ccactacaat tgggtaattg 1200
cagcgttgcc gggtggatct taggaaaccc agaatgcgaa ttactgattt ccaaggagtc 1260
atggtcctac attgtagaaa aaccaaatcc tgagaatgga acatgttacc cagggcattt 1320
cgctgactat gaggaactga gggagcaatt gagttcagta tcttcatttg agaggttcga 1380
aatattcccc aaagaaagct catggcccaa ccacaccgta accggagtgt cagcatcatg 1440
ctcccataat ggggaaagca gtttttacag aaatttgcta tggctgacgg ggaagaatgg 1500
tttgtaccca aacctgagca agtcctatgc aaacaacaaa gaaaaagaag tccttgtact 1560
atggggtgtt catcacccgc caaacatagg tgaccaaaag gccctctatc atacagaaaa 1620
tgcttatgtc tctgtagtgt cttcacatta tagcagaaaa ttcaccccag aaatagccaa 1680
aagacccaaa gtaagagatc aagaaggaag aatcaattac tactggactc tgcttgaacc 1740
cggggataca ataatatttg aggcaaatgg aaatctaata gcgccaagat atgctttcgc 1800
actgagtaga ggctttggat caggaatcat caactcaaat gcaccaatgg ataaatgtga 1860
tgcgaagtgc caaacacctc agggagctat aaacagcagt cttcctttcc agaacgtaca 1920
cccagtcaca ataggagagt gtccaaagta tgtcaggagt gcaaaattaa ggatggttac 1980
aggactaagg aacatcccat ccattcaatc cagaggtttg tttggagcca ttgccggttt 2040
cattgaaggg gggtggactg gaatggtaga tggttggtat ggttatcatc atcagaatga 2100
gcaaggatct ggctatgctg cagatcaaaa aagcacacaa aatgccatta atgggattac 2160
aaacaaggtc aattctgtaa ttgagaaaat gaacactcaa ttcacagcag tgggcaaaga 2220
gttcaacaaa ttggaaagaa ggatggaaaa cttgaataaa aaagttgatg atgggtttat 2280
agacatttgg acatataatg cagaactgtt ggttctactg gaaaatgaaa ggactttgga 2340
tttccatgac tccaatgtga agaatctgta tgagaaagta aaaagccagt taaagaataa 2400
tgctaaagaa ataggaaatg ggtgttttga gttctatcac aagtgtaacg atgaatgcat 2460
ggagagtgta aagaatggaa cttatgacta tccaaaatat tccgaagaat caaagttaaa 2520
cagggagaaa attgatggag tgaaattgga atcaatggga gtctatcaga ttctggcgat 2580
- 147 034733
ctactcaaca gtcgccagtt ctctggttct tttggtctcc ctgggggcaa tcagcttctg 2640
gatgtgttcc aatgggtctt tacagtgtag aatatgcatc taagagctct aagttaaaat 2700
gcttcttcgt ctcctattta taatatggtt tgttattgtt aattttgttc ttgtagaaga 2760
gcttaattaa tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg agatgaactg gtgtaatgta 2820
attcatttac ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct ccataactaa ctagacatga 2880
agacctgccg cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa aattgaacat cttttgccac 2940
aactttataa gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa gttcaataga ttaataatgg 3000
aaatatcagt tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg ttattaacta ctaattttat 3060
atcatcccct ttgataaatg atagtaca 3088
<210> 63
<211> 3102
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конструкция 775 из A/Solomon Islands/3/2006
<400> 63
agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60
taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120
atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180
tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240
aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300
gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360
aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420
taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480
aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540
aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600
atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660
ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720
cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780
aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840
atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900
ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960
agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tgaaagtaaa actactggtc 1020
- 148 034733
ctgttatgca catttacagc tacatatgca gacacaatat gtataggcta ccatgccaac 1080
aactcaaccg acactgttga cacagtactt gagaagaatg tgacagtgac acactctgtc 1140
aacctgcttg aggacagtca caatggaaaa ttatgtctat taaaaggaat agccccacta 1200
caattgggta attgcagcgt tgccggatgg atcttaggaa acccagaatg cgaattactg 1260
atttccaggg aatcatggtc ctacattgta gaaaaaccaa atcctgagaa tggaacatgt 1320
tacccagggc atttcgccga ctatgaggaa ctgagggagc aattgagttc agtatcttca 1380
tttgagagat tcgaaatatt ccccaaagaa agctcatggc ccaaccacac cacaaccgga 1440
gtatcagcat catgctccca taatggggaa agcagttttt acaaaaattt gctatggctg 1500
acggggaaga atggtttgta cccaaacctg agcaagtcct atgcaaacaa caaagagaaa 1560
gaagtccttg tactatgggg tgttcatcac ccgcctaaca taggtgacca aagggctctc 1620
tatcataaag aaaatgctta tgtctctgta gtgtcttcac attatagcag aaaattcacc 1680
ccagaaatag ccaaaagacc caaagtaaga gatcaagaag gaagaatcaa ctactactgg 1740
actctacttg aacccgggga tacaataata tttgaggcaa atggaaatct aatagcgcca 1800
agatatgctt tcgcactgag tagaggcttt ggatcaggaa tcatcaactc aaatgcacca 1860
atggatgaat gtgatgcgaa gtgccaaaca cctcagggag ctataaacag cagtcttcct 1920
ttccagaatg tacaccctgt cacaatagga gagtgtccaa agtatgtcag gagtgcaaaa 1980
ttaaggatgg ttacaggact aaggaacatc ccatccattc aatccagagg tttgtttgga 2040
gccattgccg gtttcattga aggggggtgg actggaatgg tagatggttg gtatggttat 2100
catcatcaga atgagcaagg atctggctat gctgcagatc aaaaaagcac acaaaatgcc 2160
attaatggga ttacaaacaa ggtcaattct gtaattgaga aaatgaacac tcaattcaca 2220
gctgtgggca aagagttcaa caaattggaa agaaggatgg aaaacttaaa taaaaaagtt 2280
gatgatgggt ttatagacat ttggacatat aatgcagaat tgttggttct actggaaaat 2340
gaaaggactt tggatttcca tgactccaat gtgaagaatc tgtatgagaa agtaaaaagc 2400
caattaaaga ataatgccaa agaaatagga aatgggtgtt ttgagttcta tcataagtgt 2460
aacgatgaat gcatggagag tgtaaaaaat ggaacttatg actatccaaa atattccgaa 2520
gaatcaaagt taaacaggga gaaaattgat ggagtgaaat tggaatcaat gggagtctat 2580
cagattctgg cgatctactc aacagtcgcc agttctctgg ttcttttggt ctccctgggg 2640
gcaatcagct tctggatgtg ttccaatggg tctttgcagt gtagaatatg catctgagag 2700
ctctaagtta aaatgcttct tcgtctccta tttataatat ggtttgttat tgttaatttt 2760
gttcttgtag aagagcttaa ttaatcgttg ttgttatgaa atactatttg tatgagatga 2820
- 149 034733
actggtgtaa tgtaattcat ttacataagt ggagtcagaa tcagaatgtt tcctccataa 2880
ctaactagac atgaagacct gccgcgtaca attgtcttat atttgaacaa ctaaaattga 2940
acatcttttg ccacaacttt ataagtggtt aatatagctc aaatatatgg tcaagttcaa 3000
tagattaata atggaaatat cagttatcga aattcattaa caatcaactt aacgttatta 3060
actactaatt ttatatcatc ccctttgata aatgatagta ca 3102
<210> 64
<211> 3093
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конструкция 780 из A/Singapore/1/57
<400> 64
agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60
taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120
atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180
tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240
aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300
gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360
aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420
taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480
aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540
aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600
atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660
ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720
cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780
aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840
atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900
ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960
agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tggccatcat ttatctaatt 1020
ctcctgttca cagcagtgag aggggaccaa atatgcattg gataccatgc caataattcc 1080
acagagaagg tcgacacaat tctagagcgg aacgtcactg tgactcatgc caaggacatt 1140
cttgagaaga cccataacgg aaagttatgc aaactaaacg gaatccctcc acttgaacta 1200
ggggactgta gcattgccgg atggctcctt ggaaatccag aatgtgatag gcttctaagt 1260
- 150 034733
gtgccagaat ggtcctatat aatggagaaa gaaaacccga gagacggttt gtgttatcca 1320
ggcagcttca atgattatga agaattgaaa catctcctca gcagcgtgaa acatttcgag 1380
aaagtaaaga ttctgcccaa agatagatgg acacagcata caacaactgg aggttcacgg 1440
gcctgcgcgg tgtctggtaa tccatcattc ttcaggaaca tggtctggct gacaaagaaa 1500
gaatcaaatt atccggttgc caaaggatcg tacaacaata caagcggaga acaaatgcta 1560
ataatttggg gggtgcacca tcccaatgat gagacagaac aaagaacatt gtaccagaat 1620
gtgggaacct atgtttccgt aggcacatca acattgaaca aaaggtcaac cccagacata 1680
gcaacaaggc ctaaagtgaa tggactagga agtagaatgg agttctcttg gaccctattg 1740
gatatgtggg acaccataaa ttttgagagt actggtaatc taattgcacc agagtatgga 1800
ttcaaaatat cgaaaagagg tagttcaggg atcatgaaaa cagaaggaac acttgagaac 1860
tgtgagacca aatgccaaac tcctttggga gcaataaata caacattgcc ttttcacaat 1920
gtccacccac tgacaatagg tgagtgcccc aaatatgtaa aatcggagaa gttggtctta 1980
gcaacaggac taaggaatgt tccccagatt gaatcaagag gattgtttgg ggcaatagct 2040
ggttttatag aaggaggatg gcaaggaatg gttgatggtt ggtatggata ccatcacagc 2100
aatgaccagg gatcagggta tgcagcagac aaagaatcca ctcaaaaggc atttgatgga 2160
atcaccaaca aggtaaattc tgtgattgaa aagatgaaca cccaatttga agctgttggg 2220
aaagagttca gtaacttaga gagaagactg gagaacttga acaaaaagat ggaagacggg 2280
tttctagatg tgtggacata caatgctgag cttctagttc tgatggaaaa tgagaggaca 2340
cttgactttc atgattctaa tgtcaagaat ctgtatgata aagtcagaat gcagctgaga 2400
gacaacgtca aagaactagg aaatggatgt tttgaatttt atcacaaatg tgatgatgaa 2460
tgcatgaata gtgtgaaaaa cgggacgtat gattatccca agtatgaaga agagtctaaa 2520
ctaaatagaa atgaaatcaa aggggtaaaa ttgagcagca tgggggttta tcaaatcctt 2580
gccatttatg ctacagtagc aggttctctg tcactggcaa tcatgatggc tgggatctct 2640
ttctggatgt gctccaacgg gtctctgcag tgcaggatct gcatatgaga gctctaagtt 2700
aaaatgcttc ttcgtctcct atttataata tggtttgtta ttgttaattt tgttcttgta 2760
gaagagctta attaatcgtt gttgttatga aatactattt gtatgagatg aactggtgta 2820
atgtaattca tttacataag tggagtcaga atcagaatgt ttcctccata actaactaga 2880
catgaagacc tgccgcgtac aattgtctta tatttgaaca actaaaattg aacatctttt 2940
gccacaactt tataagtggt taatatagct caaatatatg gtcaagttca atagattaat 3000
aatggaaata tcagttatcg aaattcatta acaatcaact taacgttatt aactactaat 3060
tttatatcat cccctttgat aaatgatagt аса 3093
- 151 034733 <210> 65 <211> 3108
<212> ДНК
<213> Искусственная i юследовательность
<220> <223> Конструкция 78] L из A/Anhui/1/2005
<400> 65 agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60
taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120
atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180
tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240
aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300
gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360
aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420
taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480
aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540
aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600
atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660
ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720
cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780
aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840
atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900
ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960
agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tggagaaaat agtgcttctt 1020
cttgcaatag tcagccttgt taaaagtgat cagatttgca ttggttacca tgcaaacaac 1080
tcgacagagc aggttgacac aataatggaa aagaacgtta ctgttacaca tgcccaagac 1140
atactggaaa agacacacaa cgggaagctc tgcgatctag atggagtgaa gcctctgatt 1200
ttaagagatt gtagtgtagc tggatggctc ctcggaaacc caatgtgtga cgagttcatc 1260
aatgtgccgg aatggtctta catagtggag aaggccaacc cagccaatga cctctgttac 1320
ccagggaatt tcaacgacta tgaagaactg aaacacctat tgagcagaat aaaccatttt 1380
gagaaaattc agatcatccc caaaagttct tggtccgatc atgaagcctc atcaggggtc 1440
agctcagcat gtccatacca gggaacgccc tcctttttca gaaatgtggt atggcttatc 1500
aaaaagaaca atacataccc aacaataaag agaagctaca ataataccaa ccaggaagat 1560
- 152 034733
cttttgatac tgtgggggat tcatcattct aatgatgcgg cagagcagac aaagctctat 1620
caaaacccaa ccacctatat ttccgttggg acatcaacac taaaccagag attggtacca 1680
aaaatagcta ctagatccaa agtaaacggg caaagtggaa ggatggattt cttctggaca 1740
attttaaaac cgaatgatgc aatcaacttc gagagtaatg gaaatttcat tgctccagaa 1800
tatgcataca aaattgtcaa gaaaggggac tcagcaattg ttaaaagtga agtggaatat 1860
ggtaactgca atacaaagtg tcaaactcca ataggggcga taaactctag tatgccattc 1920
cacaacatac accctctcac catcggggaa tgccccaaat atgtgaaatc aaacaaatta 1980
gtccttgcga ctgggctcag aaatagtcct ctaagagaaa gaagaagaaa aagaggacta 2040
tttggagcta tagcagggtt tatagaggga ggatggcagg gaatggtaga tggttggtat 2100
gggtaccacc atagcaatga gcaggggagt gggtacgctg cagacaaaga atccactcaa 2160
aaggcaatag atggagtcac caataaggtc aactcgatca ttgacaaaat gaacactcag 2220
tttgaggccg ttggaaggga atttaataac ttagaaagga gaatagagaa tttaaacaag 2280
aaaatggaag acggattcct agatgtctgg acttataatg ctgaacttct ggttctcatg 2340
gaaaatgaga gaactctaga cttccatgat tcaaatgtca agaaccttta cgacaaggtc 2400
cgactacagc ttagggataa tgcaaaggag ctgggtaacg gttgtttcga gttctatcac 2460
aaatgtgata atgaatgtat ggaaagtgta agaaacggaa cgtatgacta cccgcagtat 2520
tcagaagaag caagattaaa aagagaggaa ataagtggag taaaattgga atcaatagga 2580
acttaccaaa tactgtcaat ttattcaaca gttgcgagtt ctctagcact ggcaatcatg 2640
gtggctggtc tatctttgtg gatgtgctcc aatgggtcgt tacaatgcag aatttgcatt 2700
taagagctct aagttaaaat gcttcttcgt ctcctattta taatatggtt tgttattgtt 2760
aattttgttc ttgtagaaga gcttaattaa tcgttgttgt tatgaaatac tatttgtatg 2820
agatgaactg gtgtaatgta attcatttac ataagtggag tcagaatcag aatgtttcct 2880
ccataactaa ctagacatga agacctgccg cgtacaattg tcttatattt gaacaactaa 2940
aattgaacat cttttgccac aactttataa gtggttaata tagctcaaat atatggtcaa 3000
gttcaataga ttaataatgg aaatatcagt tatcgaaatt cattaacaat caacttaacg 3060
ttattaacta ctaattttat atcatcccct ttgataaatg atagtaca 3108
<210> 66 <211> 3111 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция 782 из A/Vietnam/1194/2004
- 153 034733 <400> 66
agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60
taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120
atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180
tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240
aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300
gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360
aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420
taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480
aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540
aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600
atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660
ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720
cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780
aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840
atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900
ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960
agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tggagaaaat agtgcttctt 1020
tttgcaatag tcagtcttgt taaaagtgat cagatttgca ttggttacca tgcaaacaac 1080
tcgacagagc aggttgacac aataatggaa aagaacgtta ctgttacaca tgcccaagac 1140
atactggaaa agacacacaa tgggaagctc tgcgatctag atggagtgaa gcctctaatt 1200
ttgagagatt gtagtgtagc tggatggctc ctcggaaacc caatgtgtga cgagttcatc 1260
aatgtgccgg aatggtctta catagtggag aaggccaatc cagtcaatga cctctgttac 1320
ccaggggatt tcaatgacta tgaagaattg aaacacctat tgagcagaat aaaccatttt 1380
gagaaaattc agatcatccc caaaagttct tggtccagtc atgaagcctc attgggggtc 1440
agctcagcat gtccatacca gggaaagtcc tcctttttca gaaatgtggt atggcttatc 1500
aaaaagaaca gtacataccc aacaataaag aggagctaca ataataccaa ccaagaagat 1560
cttttggtac tgtgggggat tcaccatcct aatgatgcgg cagagcagac aaagctctat 1620
caaaacccaa ccacctatat ttccgttggg acatctacac taaaccagag attggtacca 1680
agaatagcta ctagatccaa agtaaacggg caaagtggaa ggatggagtt cttctggaca 1740
attttaaaac cgaatgatgc aatcaacttc gagagtaatg gaaatttcat tgctccagaa 1800
- 154 034733
tatgcataca aaattgtcaa gaaaggggac tcaacaatta tgaaaagtga attggaatat 1860
ggtaactgca ataccaagtg tcaaactcca atgggggcga taaactctag catgccattc 1920
cacaatatac accctctcac catcggggaa tgccccaaat atgtgaaatc aaacagatta 1980
gtccttgcga ctgggctcag aaatagccct caaagagaga gaagaagaaa aaagagagga 2040
ttatttggag ctatagcagg ttttatagag ggaggatggc agggaatggt agatggttgg 2100
tatgggtacc accatagcaa cgagcagggg agtgggtacg ctgcagacaa agaatccact 2160
caaaaggcaa tagatggagt caccaataag gtcaactcga ttattgacaa aatgaacact 2220
cagtttgagg ccgttggaag ggaatttaac aacttagaaa ggagaataga gaatttaaac 2280
aagaagatgg aagacgggtt cctagatgtc tggacttata atgctgaact tctagttctc 2340
atggaaaacg agagaactct agactttcat gactcaaatg tcaagaacct ttacgacaag 2400
gtccgactac agcttaggga taatgcaaag gagctgggta acggttgttt cgagttctat 2460
cataaatgtg ataatgaatg tatggaaagt gtaagaaacg gaacgtatga ctacccgcag 2520
tattcagaag aagcaagact aaaaagagag gaaataagtg gagtaaaatt ggaatcaata 2580
ggaatttacc aaatattgtc aatttattct acagtggcca gctccctagc actggcaatc 2640
atggtagctg gtctatcctt atggatgtgc tccaatgggt cgttacaatg cagaatttgc 2700
atttaagagc tctaagttaa aatgcttctt cgtctcctat ttataatatg gtttgttatt 2760
gttaattttg ttcttgtaga agagcttaat taatcgttgt tgttatgaaa tactatttgt 2820
atgagatgaa ctggtgtaat gtaattcatt tacataagtg gagtcagaat cagaatgttt 2880
cctccataac taactagaca tgaagacctg ccgcgtacaa ttgtcttata tttgaacaac 2940
taaaattgaa catcttttgc cacaacttta taagtggtta atatagctca aatatatggt 3000
caagttcaat agattaataa tggaaatatc agttatcgaa attcattaac aatcaactta 3060
acgttattaa ctactaattt tatatcatcc cctttgataa atgatagtac a 3111
<210> 67 <211> 3105 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция 783 из A/Teal/Hong Kong/W312/97 <400>67 agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt60 taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa120 atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt180 tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca240
- 155 034733
aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300
gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360
aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420
taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480
aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540
aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600
atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660
ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720
cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780
aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840
atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900
ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960
agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tgattgcaat cattgtaata 1020
gcaatactgg cagcagccgg aaagtcagac aagatctgca ttgggtatca tgccaacaat 1080
tcaacaacac aggtagatac gatacttgag aagaatgtga ctgtcacaca ctcaattgaa 1140
ttgctggaaa atcagaagga agaaagattc tgcaagatat tgaacaaggc ccctctcgac 1200
ttaagggaat gtaccataga gggttggatc ttggggaatc cccaatgcga cctattgctt 1260
ggtgatcaaa gctggtcata cattgtggaa agacctactg ctcaaaacgg gatctgctac 1320
ccaggaacct taaatgaggt agaagaactg agggcactta ttggatcagg agaaagggta 1380
gagagatttg agatgtttcc ccaaagcacc tggcaaggag ttgacaccaa cagtggaaca 1440
acaagatcct gcccttattc tactggtgcg tctttctaca gaaacctcct atggataata 1500
aaaaccaaga cagcagaata tccagtaatt aagggaattt acaacaacac tggaacccag 1560
ccaatcctct atttctgggg tgtgcatcat cctcctaaca ccgacgagca agatactctg 1620
tatggctctg gtgatcgata cgttagaatg ggaactgaaa gcatgaattt tgccaagagt 1680
ccggaaattg cggcaaggcc tgctgtgaat ggacaaagag gcagaattga ttattattgg 1740
tcggttttaa aaccagggga aaccttgaat gtggaatcta atggaaatct aatcgcccct 1800
tggtatgcat acaaatttgt caacacaaat agtaaaggag ccgtcttcag gtcagattta 1860
ccaatcgaga actgcgatgc cacatgccag actattgcag gggttctaag gaccaataaa 1920
acatttcaga atgtgagtcc cctgtggata ggagaatgtc ccaaatacgt gaaaagtgaa 1980
agtctgaggc ttgcaactgg actaagaaat gttccacaga ttgaaactag aggactcttc 2040
ggagctattg cagggtttat tgaaggagga tggactggga tgatagatgg gtggtatggc 2100
- 156 034733
tatcaccatg aaaattctca agggtcagga tatgcagcag acagagaaag cactcaaaag 2160
gctgtaaaca gaattacaaa taaggtcaat tccatcatca acaaaatgaa cacacaattt 2220
gaagctgtcg atcacgaatt ttcaaatctg gagaggagaa ttgacaatct gaacaaaaga 2280
atgcaagatg gatttctgga tgtttggaca tacaatgctg aactgttggt tcttcttgaa 2340
aacgaaagaa cactagacat gcatgacgca aatgtgaaga acctacatga aaaggtcaaa 2400
tcacaactaa gggacaatgc tacgatctta gggaatggtt gctttgaatt ttggcataag 2460
tgtgacaatg aatgcataga gtctgtcaaa aatggtacat atgactatcc caaataccag 2520
actgaaagca aattaaacag gctaaaaata gaatcagtaa agctagagaa ccttggtgtg 2580
tatcaaattc ttgccattta tagtacggta tcgagcagcc tagtgttggt agggctgatc 2640
atggcaatgg gtctttggat gtgttcaaat ggttcaatgc agtgcaggat atgtatataa 2700
gagctctaag ttaaaatgct tcttcgtctc ctatttataa tatggtttgt tattgttaat 2760
tttgttcttg tagaagagct taattaatcg ttgttgttat gaaatactat ttgtatgaga 2820
tgaactggtg taatgtaatt catttacata agtggagtca gaatcagaat gtttcctcca 2880
taactaacta gacatgaaga cctgccgcgt acaattgtct tatatttgaa caactaaaat 2940
tgaacatctt ttgccacaac tttataagtg gttaatatag ctcaaatata tggtcaagtt 3000
caatagatta ataatggaaa tatcagttat cgaaattcat taacaatcaa cttaacgtta 3060
ttaactacta attttatatc atcccctttg ataaatgata gtaca 3105
<210> 68 <211> 3087 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция 785 из А/Hong Kong/1073/99 <400> 68 agaggtaccc taagttagca atcattatta tgacaacaat aaaacaatag gaaagttgta aagctacaca taccattaga aaagttgagt cgggctggta agtgtgtaca aacattagag tttgttgcaa agagagaaaa caaaagttgt aataagggtt gaatttttgg catttgatta tatttatatg tttttacttg taaagaaata catttgagaa aggaagaggg accaaaatag aattgctgta caagtcatta aacatgtgat ttgtcaaata aacaaaaata tggatgataa aattttgttg agaataaaaa ttgtacaaat aataaataag aaaagaaaga tatttaatga actcaaaaac ttcacctact gaacaagagt ttctctcttt cataatgtga atcattgagg gatgacgcat ataaattatt attgatgaaa cataaaagtt actgttataa agtgatattt tcattggtca gtatgagaga aatttgacaa tagagagatg tttaaaatta gagttggatt
120
180
240
300
360
420
480
540
- 157 034733
aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600
atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660
ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720
cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780
aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840
atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900
ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960
agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tggaaacaat atcactaata 1020
actatactac tagtagtaac agcaagcaat gcagataaaa tctgcatcgg ccaccagtca 1080
acaaactcca cagaaactgt ggacacgcta acagaaacca atgttcctgt gacacatgcc 1140
aaagaattgc tccacacaga gcataatgga atgctgtgtg caacaagcct gggacatccc 1200
ctcattctag acacatgcac tattgaagga ctagtctatg gcaacccttc ttgtgacctg 1260
ctgttgggag gaagagaatg gtcctacatc gtcgaaagat catcagctgt aaatggaacg 1320
tgttaccctg ggaatgtaga aaacctagag gaactcagga cactttttag ttccgctagt 1380
tcctaccaaa gaatccaaat cttcccagac acaacctgga atgtgactta cactggaaca 1440
agcagagcat gttcaggttc attctacagg agtatgagat ggctgactca aaagagcggt 1500
ttttaccctg ttcaagacgc ccaatacaca aataacaggg gaaagagcat tcttttcgtg 1560
tggggcatac atcacccacc cacctatacc gagcaaacaa atttgtacat aagaaacgac 1620
acaacaacaa gcgtgacaac agaagatttg aataggacct tcaaaccagt gatagggcca 1680
aggccccttg tcaatggtct gcagggaaga attgattatt attggtcggt actaaaacca 1740
ggccaaacat tgcgagtacg atccaatggg aatctaattg ctccatggta tggacacgtt 1800
ctttcaggag ggagccatgg aagaatcctg aagactgatt taaaaggtgg taattgtgta 1860
gtgcaatgtc agactgaaaa aggtggctta aacagtacat tgccattcca caatatcagt 1920
aaatatgcat ttggaacctg ccccaaatat gtaagagtta atagtctcaa actggcagtc 1980
ggtctgagga acgtgcctgc tagatcaagt agaggactat ttggagccat agctggattc 2040
atagaaggag gttggccagg actagtcgct ggctggtatg gtttccagca ttcaaatgat 2100
caaggggttg gtatggctgc agatagggat tcaactcaaa aggcaattga taaaataaca 2160
tccaaggtga ataatatagt cgacaagatg aacaagcaat atgaaataat tgatcatgaa 2220
tttagtgagg ttgaaactag actcaatatg atcaataata agattgatga ccaaatacaa 2280
gacgtatggg catataatgc agaattgcta gtactacttg aaaatcaaaa aacactcgat 2340
- 158 034733
gagcatgatg cgaacgtgaa caatctatat aacaaggtga agagggcact gggctccaat 2400
gctatggaag atgggaaagg ctgtttcgag ctataccata aatgtgatga tcagtgcatg 2460
gaaacaattc ggaacgggac ctataatagg agaaagtata gagaggaatc aagactagaa 2520
aggcagaaaa tagagggggt taagctggaa tctgagggaa cttacaaaat cctcaccatt 2580
tattcgactg tcgcctcatc tcttgtgctt gcaatggggt ttgctgcctt cctgttctgg 2640
gccatgtcca atggatcttg cagatgcaac atttgtatat aagagctcta agttaaaatg 2700
cttcttcgtc tcctatttat aatatggttt gttattgtta attttgttct tgtagaagag 2760
cttaattaat cgttgttgtt atgaaatact atttgtatga gatgaactgg tgtaatgtaa 2820
ttcatttaca taagtggagt cagaatcaga atgtttcctc cataactaac tagacatgaa 2880
gacctgccgc gtacaattgt cttatatttg aacaactaaa attgaacatc ttttgccaca 2940
actttataag tggttaatat agctcaaata tatggtcaag ttcaatagat taataatgga 3000
aatatcagtt atcgaaattc attaacaatc aacttaacgt tattaactac taattttata 3060
tcatcccctt tgataaatga tagtaca 3087
<210> 69 <211> 3105 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> кассета на основе A/Brisbane/10/2007 <400> 69
agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60
taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120
atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180
tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240
aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300
gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360
aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420
taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480
aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540
aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600
atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660
ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720
cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780
- 159 034733
aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840
atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900
ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960
agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tgaagactat cattgctttg 1020
agctacattc tatgtctggt tttcactcaa aaacttcccg gaaatgacaa cagcacggca 1080
acgctgtgcc ttgggcacca tgcagtacca aacggaacga tagtgaaaac aatcacgaat 1140
gaccaaattg aagttactaa tgctactgag ctggttcaga gttcctcaac aggtgaaata 1200
tgcgacagtc ctcatcagat ccttgatgga gaaaactgca cactaataga tgctctattg 1260
ggagaccctc agtgtgatgg cttccaaaat aagaaatggg acctttttgt tgaacgcagc 1320
aaagcctaca gcaactgtta cccttatgat gtgccggatt atgcctccct taggtcacta 1380
gttgcctcat ccggcacact ggagtttaac aatgaaagtt tcaattggac tggagtcact 1440
caaaacggaa caagctctgc ttgcataagg agatctaata acagtttctt tagtagattg 1500
aattggttga cccacttaaa attcaaatac ccagcattga acgtgactat gccaaacaat 1560
gaaaaatttg acaaattgta catttggggg gttcaccacc cgggtacgga caatgaccaa 1620
atcttcctgt atgctcaagc atcaggaaga atcacagtct ctaccaaaag aagccaacaa 1680
actgtaatcc cgaatatcgg atctagaccc agagtaagga atatccccag cagaataagc 1740
atctattgga caatagtaaa accgggagac atacttttga ttaacagcac agggaatcta 1800
attgctccta ggggttactt caaaatacga agtgggaaaa gctcaataat gagatcagat 1860
gcacccattg gcaaatgcaa ttctgaatgc atcactccaa acggaagcat tcccaatgac 1920
aaaccattcc aaaatgtaaa caggatcaca tacggggcct gtcccagata tgttaagcaa 1980
aacactctga aattggcaac agggatgcga aatgtaccag agaaacaaac tagaggcata 2040
tttggcgcaa tcgcgggttt catagaaaat ggttgggagg gaatggtgga tggttggtat 2100
ggtttcaggc atcaaaattc tgagggaata ggacaagcag cagatctcaa aagcactcaa 2160
gcagcaatcg atcaaatcaa tgggaagctg aataggttga tcgggaaaac caacgagaaa 2220
ttccatcaga ttgaaaaaga gttctcagaa gtcgaaggga gaatccagga ccttgagaaa 2280
tatgttgagg acaccaaaat agatctctgg tcatacaacg cggagcttct tgttgccctg 2340
gagaaccaac atacaattga tctaactgac tcagaaatga acaaactgtt tgaaaaaaca 2400
aagaagcaac tgagggaaaa tgctgaggat atgggcaatg gttgtttcaa aatataccac 2460
aaatgtgaca atgcctgcat aggatcaatc agaaatggaa cttatgacca cgatgtatac 2520
agagatgaag cattaaacaa ccggttccag atcaagggcg ttgagctgaa gtcaggatac 2580
aaagattgga tactatggat ttcctttgcc atatcatgtt ttttgctttg tgttgctttg 2640
- 160 034733
ttggggttca tcatgtgggc ctgccaaaaa ggcaacatta ggtgcaacat ttgcatttga 2700
gagctctaag ttaaaatgct tcttcgtctc ctatttataa tatggtttgt tattgttaat 2760
tttgttcttg tagaagagct taattaatcg ttgttgttat gaaatactat ttgtatgaga 2820
tgaactggtg taatgtaatt catttacata agtggagtca gaatcagaat gtttcctcca 2880
taactaacta gacatgaaga cctgccgcgt acaattgtct tatatttgaa caactaaaat 2940
tgaacatctt ttgccacaac tttataagtg gttaatatag ctcaaatata tggtcaagtt 3000
caatagatta ataatggaaa tatcagttat cgaaattcat taacaatcaa cttaacgtta 3060
ttaactacta attttatatc atcccctttg ataaatgata gtaca 3105
<210> <211> <212> <213> 70 3105 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> кассета на основе A/Wisconsin/67/2005
<400> 70
agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60
taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120
atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180
tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240
aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300
gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360
aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420
taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480
aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540
aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600
atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660
ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720
cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780
aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840
atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900
ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960
agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tgaagactat cattgctttg 1020
agctacattc tatgtctggt tttcactcaa aaacttcccg gaaatgacaa cagcacggca 1080
- 161 034733
acgctgtgcc ttgggcacca tgcagtacca aacggaacga tagtgaaaac aatcacgaat 1140
gaccaaattg aagttactaa tgctactgag ctggttcaga gttcctcaac aggtggaata 1200
tgcgacagtc ctcatcagat ccttgatgga gaaaactgca cactaataga tgctctattg 1260
ggagaccctc agtgtgatgg cttccaaaat aagaaatggg acctttttgt tgaacgcagc 1320
aaagcctaca gcaactgtta cccttatgat gtgccggatt atgcctccct taggtcacta 1380
gttgcctcat ccggcacact ggagtttaac gatgaaagtt tcaattggac tggagtcact 1440
caaaatggaa caagctctgc ttgcaaaagg agatctaata acagtttctt tagtagattg 1500
aattggttga cccacttaaa attcaaatac ccagcattga acgtgactat gccaaacaat 1560
gaaaaatttg acaaattgta catttggggg gttcaccacc cgggtacgga caatgaccaa 1620
atcttcctgc atgctcaagc atcaggaaga atcacagtct ctaccaaaag aagccaacaa 1680
actgtaatcc cgaatatcgg atctagaccc agaataagga atatccccag cagaataagc 1740
atctattgga caatagtaaa accgggagac atacttttga ttaacagcac agggaatcta 1800
attgctccta ggggttactt caaaatacga agtgggaaaa gctcaataat gagatcagat 1860
gcacccattg gcaaatgcaa ttctgaatgc atcactccaa atggaagcat tcccaatgac 1920
aaaccatttc aaaatgtaaa caggatcaca tatggggcct gtcccagata tgttaagcaa 1980
aacactctga aattggcaac agggatgcga aatgtaccag agaaacaaac tagaggcata 2040
tttggcgcaa tcgcgggttt catagaaaat ggttgggagg gaatggtgga tggttggtac 2100
ggtttcaggc atcaaaattc tgagggaata ggacaagcag cagatctcaa aagcactcaa 2160
gcagcaatca atcaaatcaa tgggaagctg aataggttga tcgggaaaac caacgagaaa 2220
ttccatcaga ttgaaaaaga gttctcagaa gtagaaggga gaatccagga cctcgagaaa 2280
tatgttgagg acactaaaat agatctctgg tcatacaacg cggagcttct tgttgccctg 2340
gagaaccaac atacaattga tctaactgac tcagaaatga acaaactgtt tgaaagaaca 2400
aagaagcaac tgagggaaaa tgctgaggat atgggcaatg gttgtttcaa aatataccac 2460
aaatgtgaca atgcctgcat aggatcaatc agaaatggaa cttatgacca tgatgtatac 2520
agagatgaag cattaaacaa ccggttccag atcaaaggcg ttgagctgaa gtcaggatac 2580
aaagattgga tactatggat ttcctttgcc atatcatgtt ttttgctttg tgttgctttg 2640
ttggggttca tcatgtgggc ctgccaaaaa ggcaacatta ggtgcaacat ttgcatttga 2700
gagctctaag ttaaaatgct tcttcgtctc ctatttataa tatggtttgt tattgttaat 2760
tttgttcttg tagaagagct taattaatcg ttgttgttat gaaatactat ttgtatgaga 2820
tgaactggtg taatgtaatt catttacata agtggagtca gaatcagaat gtttcctcca 2880
- 162 034733
taactaacta gacatgaaga cctgccgcgt acaattgtct tatatttgaa caactaaaat 2940
tgaacatctt ttgccacaac tttataagtg gttaatatag ctcaaatata tggtcaagtt 3000
caatagatta ataatggaaa tatcagttat cgaaattcat taacaatcaa cttaacgtta 3060
ttaactacta attttatatc atcccctttg ataaatgata gtaca 3105
<210> 71 <211> 3117 <212> ДНК <213 > Искусственная последовательность <220>
<223> кассета на основе A/Equine/Prague/56
<400> 71 agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60
taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120
atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180
tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240
aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300
gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360
aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420
taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480
aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540
aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600
atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660
ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720
cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780
aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840
atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900
ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960
agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tgaacactca aattctaata 1020
ttagccactt cggcattctt ctatgtacgt gcagataaaa tctgcctagg acatcatgct 1080
gtgtctaatg gaaccaaagt agacaccctt actgaaaaag gaatagaagt tgtcaatgca 1140
acagaaacag ttgaacaaac aaacatccct aagatctgct caaaaggaaa acagactgtt 1200
gaccttggtc aatgtggatt actagggacc gttattggtc ctccccaatg tgaccaattt 1260
cttgagttct ctgctaattt aatagttgaa agaagggaag gtaatgacat ttgttatcca 1320
- 163 034733
ggcaaatttg acaatgaaga aacattgaga aaaatactca gaaaatccgg aggaattaaa 1380
aaggagaata tgggattcac atataccgga gtgagaacca atggagagac tagcgcatgt 1440
agaaggtcaa gatcttcctt ttatgcagag atgaaatggc ttctatccag cacagacaat 1500
gggacatttc cacaaatgac aaagtcctac aagaacacta agaaggtacc agctctgata 1560
atctggggaa tccaccactc aggatcaact actgaacaga ctagattata tggaagtggg 1620
aataaattga taacagtttg gagttccaaa taccaacaat cttttgtccc aaatcctgga 1680
ccaagaccgc aaatgaatgg tcaatcagga agaattgact ttcactggct gatgctagat 1740
cccaatgata ctgtcacttt cagttttaat ggggccttta tagcacctga ccgcgccagt 1800
tttctaagag gtaaatctct aggaatccaa agtgatgcac aacttgacaa taattgtgaa 1860
ggtgaatgct atcatattgg aggtactata attagcaact tgccctttca aaacattaat 1920
agtagggcaa tcggaaaatg ccccagatac gtgaagcaga agagcttaat gctagcaaca 1980
ggaatgaaaa atgttcctga agctcctgca cataaacaac taactcatca catgcgcaaa 2040
aaaagaggtt tatttggtgc aatagcagga ttcattgaaa atgggtggga aggattaata 2100
gacggatggt atggatataa gcatcagaat gcacaaggag aagggactgc tgcagactac 2160
aaaagtacac aatctgctat caaccaaata accggaaaat tgaacagact aatagaaaaa 2220
accaaccagc aattcgaact aatagataat gagttcaatg aaatagaaaa acaaattggc 2280
aatgttatta actggactag agattctatc atcgaagtat ggtcatataa tgcagagttc 2340
ctcgtagcag tggagaatca acacactatt gatttaactg actcagaaat gaacaaacta 2400
tatgaaaagg taagaagaca actgagagaa aatgctgagg aagatggtaa tggctgtttt 2460
gaaatattcc accaatgtga caatgattgc atggccagca ttagaaacaa cacatatgac 2520
cataaaaaat acagaaaaga ggcaatacaa aacagaatcc agattgacgc agtaaagttg 2580
agcagtggtt acaaagatat aatactttgg tttagcttcg gggcatcatg tttcttattt 2640
cttgccattg caatgggtct tgttttcata tgtataaaaa atggaaacat gcggtgcact 2700
atttgtatat aagagctcta agttaaaatg cttcttcgtc tcctatttat aatatggttt 2760
gttattgtta attttgttct tgtagaagag cttaattaat cgttgttgtt atgaaatact 2820
atttgtatga gatgaactgg tgtaatgtaa ttcatttaca taagtggagt cagaatcaga 2880
atgtttcctc cataactaac tagacatgaa gacctgccgc gtacaattgt cttatatttg 2940
aacaactaaa attgaacatc ttttgccaca actttataag tggttaatat agctcaaata 3000
tatggtcaag ttcaatagat taataatgga aatatcagtt atcgaaattc attaacaatc 3060
aacttaacgt tattaactac taattttata tcatcccctt tgataaatga tagtaca 3117
<210> 72
- 164 034733
<211> 3162
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> кассета на основе B/Malaysia/2506/2004
<400> 72
agaggtaccc cgggctggta tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt 60
taagttagca agtgtgtaca tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa 120
atcattatta aacattagag taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt 180
tgacaacaat tttgttgcaa catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca 240
aaaacaatag agagagaaaa aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga 300
gaaagttgta caaaagttgt accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa 360
aagctacaca aataagggtt aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg 420
taccattaga gaatttttgg caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta 480
aaagttgagt catttgatta aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt 540
aaagttgtat tagtaattag aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct 600
atatattgcc ccatagagtc agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa 660
ataacggtat attaatccct ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc 720
cacgtaggag gataacagga tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac 780
aatcctgatg agataaccca ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa 840
atcacacatt cttccacaca tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca 900
ttctataaaa aatcacactt tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag 960
agaagagact aattaattaa ttaatcatct tgagagaaaa tgaaggcaat aattgtacta 1020
ctcatggtag taacatccaa tgcagatcga atctgcactg ggataacatc gtcaaactca 1080
ccacatgttg tcaaaactgc tactcaaggg gaggtcaatg tgactggtgt aataccactg 1140
acaacaacac ccaccaaatc tcattttgca aatctcaaag gaacagaaac cagagggaaa 1200
ctatgcccaa aatgcctcaa ctgcacagat ctggacgtgg ccttgggcag accaaaatgc 1260
acggggaaca taccctcggc aagagtttca atactccatg aagtcagacc tgttacatct 1320
gggtgctttc ctataatgca cgacagaaca aaaattagac agctgcctaa acttctcaga 1380
ggatacgaac atatcaggtt atcaactcat aacgttatca atgcagaaaa tgcaccagga 1440
ggaccctaca aaattggaac ctcagggtct tgccctaacg ttaccaatgg aaacggattt 1500
ttcgcaacaa tggcttgggc cgtcccaaaa aacgacaaca acaaaacagc aacaaattca 1560
ttaacaatag aagtaccata catttgtaca gaaggagaag accaaattac cgtttggggg 1620
- 165 034733
ttccactctg ataacgaaac ccaaatggca aagctctatg gggactcaaa gccccagaag 1680
ttcacctcat ctgccaacgg agtgaccaca cattacgttt cacagattgg tggcttccca 1740
aatcaaacag aagacggagg actaccacaa agcggtagaa ttgttgttga ttacatggtg 1800
caaaaatctg ggaaaacagg aacaattacc tatcaaagag gtattttatt gcctcaaaaa 1860
gtgtggtgcg caagtggcag gagcaaggta ataaaaggat cgttgccttt aattggagaa 1920
gcagattgcc tccacgaaaa atacggtgga ttaaacaaaa gcaagcctta ctacacaggg 1980
gaacatgcaa aggccatagg aaattgccca atatgggtga aaacaccctt gaagctggcc 2040
aatggaacca aatatagacc tcctgcaaaa ctattaaagg aaaggggttt cttcggagct 2100
attgctggtt tcttagaagg aggatgggaa ggaatgattg caggttggca cggatacaca 2160
tcccatgggg cacatggagt agcggtggca gcagacctta agagcactca agaggccata 2220
aacaagataa caaaaaatct caactctttg agtgagctgg aagtaaagaa tcttcaaaga 2280
ctaagcggtg ccatggatga actccacaac gaaatactag aactagacga gaaagtggat 2340
gatctcagag ctgatacaat aagctcacaa atagaactcg cagtcctgct ttccaatgaa 2400
ggaataataa acagtgaaga tgagcatctc ttggcgcttg aaagaaagct gaagaaaatg 2460
ctgggcccct ctgctgtaga gatagggaat ggatgctttg aaaccaaaca caagtgcaac 2520
cagacctgtc tcgacagaat agctgctggt acctttgatg caggagaatt ttctctcccc 2580
acttttgatt cactgaatat tactgctgca tctttaaatg acgatggatt ggataatcat 2640
actatactgc tttactactc aactgctgcc tccagtttgg ctgtaacatt gatgatagct 2700
atctttgttg tttatatggt ctccagagac aatgtttctt gctccatctg tctataagag 2760
ctctaagtta aaatgcttct tcgtctccta tttataatat ggtttgttat tgttaatttt 2820
gttcttgtag aagagcttaa ttaatcgttg ttgttatgaa atactatttg tatgagatga 2880
actggtgtaa tgtaattcat ttacataagt ggagtcagaa tcagaatgtt tcctccataa 2940
ctaactagac atgaagacct gccgcgtaca attgtcttat atttgaacaa ctaaaattga 3000
acatcttttg ccacaacttt ataagtggtt aatatagctc aaatatatgg tcaagttcaa 3060
tagattaata atggaaatat cagttatcga aattcattaa caatcaactt aacgttatta 3120
actactaatt ttatatcatc ccctttgata aatgatagta ca 3162
<210> 73 <211> 3159 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> кассета на основе B/Florida/4/2006
- 166 034733 <400> 73 agaggtaccc taagttagca atcattatta tgacaacaat aaaacaatag gaaagttgta aagctacaca taccattaga aaagttgagt aaagttgtat atatattgcc ataacggtat cacgtaggag aatcctgatg atcacacatt ttctataaaa agaagagact ctcatggtag cctcatgtgg acaacaacac ctatgcccag gtggggacca gggtgctttc ggatatgaaa ggaccctaca ttcgcaacaa acagtagaag cattcagata acctcatctg caaacagaag cgggctggta agtgtgtaca aacattagag tttgttgcaa agagagaaaa caaaagttgt aataagggtt gaatttttgg catttgatta tagtaattag ccatagagtc attaatccct gataacagga agataaccca cttccacaca aatcacactt aattaattaa taacatccaa tcaaaacagc caacaaaatc actgtctcaa caccttcggc ctataatgca atatcaggct gacttggaac tggcttgggc taccatacat acaaaaccca ctaatggagt acggaggact tatttatatg tttttacttg taaagaaata catttgagaa aggaagaggg accaaaatag aattgctgta caagtcatta aacatgtgat aatttggtgt agttaactca ccaaaaaaaa tccccgtagg ctttaagccc tctgagccac tgtgagtcta ttaatcatct tgcagatcga cactcaaggg ttattttgca ctgcacagat gaaggcttca cgacagaaca atcaacccaa ctcaggatct tgtcccaaag ttgtacagaa aatgaagaac aaccacacac accacaaagc ttgtcaaata aacaaaaata tggatgataa aattttgttg agaataaaaa ttgtacaaat aataaataag aaaagaaaga tatttaatga caaatttaat tttttatatt aaaacggtat aggataacat acgcatctgt acaaaaacca cactttgatt tgagagaaaa atctgcactg gaggtcaatg aatctcaaag ctggatgtgg atactccacg aaaatcaggc aacgtcatcg tgccctaacg gacaacaaca ggggaagacc ctctatggag tatgtttctc ggcaggattg actcaaaaac ttcacctact gaacaagagt ttctctcttt cataatgtga atcattgagg gatgacgcat ataaattatt attgatgaaa ttgacatttg tcatagatca atttactaaa ccaatccaac ggcacatcta atccacatct cccttcaaac tgaaggcaat gaataacatc tgactggtgt gaacaaggac ctttgggcag aagtcaaacc aactacccaa atgcggaaaa ctaccagtaa aaaatgcaac aaatcactgt actcaaatcc agattggcag ttgttgatta cataaaagtt actgttataa agtgatattt tcattggtca gtatgagaga aatttgacaa tagagagatg tttaaaatta gagttggatt atcttttcct aataagagaa aaatctaagc caatcacaac cattatctaa ttatcaccca acatacaaag aattgtacta ttcaaactca gataccacta cagagggaaa accaatgtgt tgttacatcc tcttctcaga ggcaccagga gagcggattt gaacccacta ttgggggttc tcaaaagttc cttcccagat catgatgcaa
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800
- 167 034733
aaacctggga aaacaggaac aattgtctac caaagaggtg ttttgttgcc tcaaaaggtg 1860
tggtgcgcga gtggcaggag caaagtaata aaagggtcct tgcctttaat tggtgaagca 1920
gattgccttc atgaaaaata cggtggatta aacaaaagca agccttacta cacaggagaa 1980
catgcaaaag ccataggaaa ttgcccaata tgggtgaaaa cacctttgaa gctcgccaat 2040
ggaaccaaat atagacctcc tgcaaaacta ttaaaggaaa ggggtttctt cggagctatt 2100
gctggtttcc tagaaggagg atgggaagga atgattgcag gctggcacgg atacacatct 2160
cacggagcac atggagtggc agtggcggcg gaccttaaga gtacgcaaga agctataaac 2220
aagataacaa aaaatctcaa ttctttgagt gagctagaag taaagaatct tcaaagacta 2280
agtggtgcca tggatgaact ccacaacgaa atactcgagc tggatgagaa agtggatgat 2340
ctcagagctg acactataag ctcgcaaata gaacttgcag tcttgctttc caacgaagga 2400
ataataaaca gtgaagatga gcatctattg gcacttgaga gaaaactaaa gaaaatgctg 2460
ggtccctctg ctgtagagat aggaaatgga tgcttcgaaa ccaaacacaa gtgcaaccag 2520
acctgcttag acaggatagc tgctggcacc tttaatgcag gagaattttc tctccccact 2580
tttgattcac tgaacattac tgctgcatct ttaaatgatg atggattgga taaccatact 2640
atactgctct attactcaac tgctgcttct agtttggctg taacattgat gctagctatt 2700
tttattgttt atatggtctc cagagacaac gtttcatgct ccatctgtct ataagagctc 2760
taagttaaaa tgcttcttcg tctcctattt ataatatggt ttgttattgt taattttgtt 2820
cttgtagaag agcttaatta atcgttgttg ttatgaaata ctatttgtat gagatgaact 2880
ggtgtaatgt aattcattta cataagtgga gtcagaatca gaatgtttcc tccataacta 2940
actagacatg aagacctgcc gcgtacaatt gtcttatatt tgaacaacta aaattgaaca 3000
tcttttgcca caactttata agtggttaat atagctcaaa tatatggtca agttcaatag 3060
attaataatg gaaatatcag ttatcgaaat tcattaacaa tcaacttaac gttattaact 3120
actaatttta tatcatcccc tttgataaat gatagtaca 3159
<210> 74 <211> 565 <212> БЕЛОК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> консенсусная SEQ ID NO: : 33, 48, 49 и 9
<220>
<221> смет признак
<222> (3) .. (3)
<223> Хаа может быть Ala или Vai
<220>
<221> сме ш__при знак
- 168 034733
<222> (52)..(52)
<223> Хаа может быть Asp ИЛИ Asn
<220>
<221> смеш_признак
<222> (90)..(90)
<223> Хаа может быть Lys или Arg
<220>
<221> сме ш_при знак
<222> (99)..(99)
<223> Хаа может быть Lys или Thr
<220>
<221> сме ш_при знак
<222> (111)..(111)
<223> Хаа может быть Туг или His
<220>
<221> сме ш_при знак
<222> (145)..(145)
<223> Хаа может быть Val или Thr
<220>
<221> сме ш_при знак
<222> (157)..(157)
<223> Хаа может быть Glu или Lys
<220>
<221> смеш_признак
<222> (162)..(162)
<223> Хаа может быть Arg или Lys
<220>
<221> сме ш_при знак
<222> (182)..(182)
<223> Хаа может быть Arg или Lys
<220>
<221> сме ш_при знак
<222> (203) . . (203)
<223> Хаа может быть Asp или Asn
<220>
<221> смеш_признак
<222> (205)..(205)
<223> Хаа может быть Arg или Lys
<220>
<221> сме ш_при знак
<222> (210) . . (210)
<223> Хаа может быть Thr или Lys
<220>
<221> смеш_признак
<222> (225)..(225)
<223> Хаа может быть Arg или Lys
<220>
<221> смеш_признак
<222> (268)..(268)
- 169 034733
<223> Хаа может быть Тгр или Arg
<220>
<221> смеш_признак
<222> (283)..(283)
<223> Хаа может быть Thr или Asn
<220>
<221> смеш_признак
<222> (290)..(290)
<223> Хаа может быть Gly или Lys
<220>
<221> смет признак
<222> (432?..(432)
<223> Хаа может быть Не или Leu
<220>
<221> смеш_признак
<222> (489)..(489)
<223> Хаа может быть Asn или Asp
<400> 74
Met 1 Lys Xaa Lys Leu 5 Leu Vai Leu Leu Cys 10 Thr Phe Thr Ala Thr 15 Tyr
Ala Asp Thr He Cys He Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Vai Asp Thr Vai Leu Glu Lys Asn Vai Thr Vai Thr His Ser Vai Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Xaa Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly He
50 55 60
Ala Pro Leu Gin Leu Gly Asn Cys Ser Vai Ala Gly Trp He Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu He Ser Xaa Glu Ser Trp Ser Tyr He
85 90 95
Vai Glu Xaa Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Xaa Phe
100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gin Leu Ser Ser Vai Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu He Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr
130 135 140
Xaa Thr Gly Vai Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Xaa Ser Ser Phe
145 150 155 160
Tyr Xaa Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn
165 170 175
Leu Ser Lys Ser Tyr Xaa Asn Asn Lys Glu Lys Glu Vai Leu Vai Leu
180 185 190
Trp Gly Vai His His Pro Pro Asn He Gly Xaa Gin Xaa Ala Leu Tyr
- 170 034733
195 200 205
His Xaa Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg
210 215 220
Хаа Phe Thr Pro Glu He Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu
225 230 235 240
Gly Arg He Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr He
245 250 255
Не Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu He Ala Pro Xaa Tyr Ala Phe Ala
260 265 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly He He Xaa Ser Asn Ala Pro Met
275 280 285
Asp Xaa Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala He Asn Ser
290 295 300
Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr He Gly Glu Cys Pro
305 310 315 320
Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn
325 330 335
He Pro Ser He Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala He Ala Gly Phe
340 345 350
lie Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His
355 360 365
His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr
370 375 380
Gln Asn Ala He Asn Gly He Thr Asn Lys Val Asn Ser Val He Glu
385 390 395 400
Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu
405 410 415
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Xaa
420 425 430
Asp He Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu
435 440 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys
450 455 460
Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu He Gly Asn Gly Cys
465 470 475 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Xaa Glu Cys Met Glu Ser Val Lys
485 490 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
500 505 510
Arg Glu Lys He Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln
515 520 525
- 171
lie Leu 530 Ala lie Tyr Ser Thr 535 Val Ala Ser Ser Leu 540 Val Leu Leu Val
Ser 545 Leu Gly Ala lie Ser 550 Phe Trp Met Cys Ser 555 Asn Gly Ser Leu Gln 560
Cys Arg lie Cys lie 565
<210> 75
<211> 565
<212> БЕЛОК
<213> Вирус гриппа
<400> 75
Met 1 Lys Ala Lys Leu 5 Leu Val Leu Leu Cys Thr 10 Phe Thr Ala Thr 15 Tyr
Ala Asp Thr Ile Cys lie Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
20 25 30
Val Asp Thr Val Leu Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
35 40 45
Leu Leu Glu Asp Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile
50 55 60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp lie Leu Gly
65 70 75 80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu lie Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr lie
85 90 95
Val Glu Thr Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly Tyr Phe
100 105 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
115 120 125
Glu Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr
130 135 140
Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Lys Ser Ser Phe
145 150 155 160
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn
165 170 175
Leu Ser Lys Ser Tyr Val Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu
180 185 190
Trp Gly Val His His Pro Pro Asn Ile Gly Asn Gln Arg Ala Leu Tyr
195 200 205
His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg
210 215 220
Arg Phe Thr Pro Glu lie Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu
225 230 235 240
- 172
Gly Arg He Asn Tyr Tyr 245 Trp Thr Leu Leu 250 Glu Pro Gly Asp Thr 255 He
Не Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu He Ala Pro Trp Tyr Ala Phe Ala
260 265 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly He He Thr Ser Asn Ala Pro Met
275 280 285
Asp Glu Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala He Asn Ser
290 295 300
Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr He Gly Glu Cys Pro
305 310 315 320
Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn
325 330 335
He Pro Ser He Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala He Ala Gly Phe
340 345 350
lie Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly Tyr His
355 360 365
His Gln Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr
370 375 380
Gln Asn Ala He Asn Gly He Thr Asn Lys Val Asn Ser Val He Glu
385 390 395 400
Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu
405 410 415
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Leu
420 425 430
Asp He Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu Asn Glu
435 440 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys
450 455 460
Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu lie Gly Asn Gly Cys
465 470 475 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asn Glu Cys Met Glu Ser Val Lys
485 490 495
Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
500 505 510
Arg Glu Lys lie Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln
515 520 525
He Leu Ala He Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val
530 535 540
Ser Leu Gly Ala He Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln
545 550 555 560
- 173
Cys Arg He Cys lie
565 <210> 76 <211> 252 <212> БЕЛОК <213> Вирус гриппа A <400>76
Met 1 Ser Leu Leu Thr Glu 5 Val Glu Thr Tyr Val 10 Leu Ser lie He 15 Pro
Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu lie Ala Gin Arg Leu Glu Asp Val Phe
20 25 30
Ala Gly Lys Asn Thr Asp Leu Glu Val Leu Met Glu Trp Leu Lys Thr
35 40 45
Arg Pro He Leu Ser Pro Leu Thr Lys Gly He Leu Gly Phe Val Phe
50 55 60
Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg Gly Leu Gin Arg Arg Arg Phe Val
65 70 75 80
Gin Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly Asp Pro Asn Asn Met Asp Lys Ala
85 90 95
Val Lys Leu Tyr Arg Lys Leu Lys Arg Glu He Thr Phe His Gly Ala
100 105 110
Lys Glu He Ser Leu Ser Tyr Ser Ala Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met
115 120 125
Gly Leu He Tyr Asn Arg Met Gly Ala Val Thr Thr Glu Val Ala Phe
130 135 140
Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu Gin He Ala Asp Ser Gin His Arg
145 150 155 160
Ser His Arg Gin Met Val Thr Thr Thr Asn Pro Leu lie Arg His Glu
165 170 175
Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr Thr Ala Lys Ala Met Glu Gin Met
180 185 190
Ala Gly Ser Ser Glu Gin Ala Ala Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gin
195 200 205
Ala Arg Gin Met Val Gin Ala Met Arg Thr He Gly Thr His Pro Ser
210 215 220
Ser Ser Ala Gly Leu Lys Asn Asp Leu Leu Glu Asn Leu Gin Ala Tyr
225 230 235 240
Gin Lys Arg Met Gly Val Gin Met Gin Arg Phe Lys
245250 <210>77 <211>24 <212> ДНК
- 174 034733 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> pBinPlus.2613.с <400> 77 aggaagggaa gaaagcgaaa ggag24 <210>78 <211>56 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Mut-ATG115.r <400>78 gtgccgaagc acgatctgac aacgttgaag atcgctcacg caagaaagac aagaga56 <210>79 <211>52 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Mut-ATG161.C <400>79 gttgtcagat cgtgcttcgg caccagtaca acgttttctt tcactgaagc ga52 <210> 80 <211>25 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> LC-C5-1. HOr <400>80 tctcctggag tcacagacag ggtgg25 <210>81 <211>2065 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> кассета 828 от PacI до Asci <400> 81
ttaattaaga attcgagctc caccgcggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 60
gtcactttat tgagaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 120
ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 180
cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 240
attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 300
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gtattaaaat cttaataggt 360
- 175 034733
tttgataaaa gcgaacgtgg ggaaacccga accaaacctt cttctaaact ctctctcatc 420
tctcttaaag caaacttctc tcttgtcttt cttgcgtgag cgatcttcaa cgttgtcaga 480
tcgtgcttcg gcaccagtac aacgttttct ttcactgaag cgaaatcaaa gatctctttg 540
tggacacgta gtgcggcgcc attaaataac gtgtacttgt cctattcttg tcggtgtggt 600
cttgggaaaa gaaagcttgc tggaggctgc tgttcagccc catacattac ttgttacgat 660
tctgctgact ttcggcgggt gcaatatctc tacttctgct tgacgaggta ttgttgcctg 720
tacttctttc ttcttcttct tgctgattgg ttctataaga aatctagtat tttctttgaa 780
acagagtttt cccgtggttt tcgaacttgg agaaagattg ttaagcttct gtatattctg 840
cccaaatttg tcgggcccat ggttttcaca cctcagatac ttggacttat gcttttttgg 900
atttcagcct ccagaggtga tattgtgcta actcagtctc cagccaccct gtctgtgact 960
ccaggagata gtgtcagtct ttcctgcagg gccagccaaa gtattagcaa caacctacac 1020
tggtttcaac aaaaatcgca tgagtctcca aggcttctca tcaagtatgc ttcccagtcc 1080
atatctggga tcccctccag gttcagtggc agtggatctg ggacagattt cactctcagt 1140
atcaacagtg tgaagactga agattttgga atgtttttct gtcaacagag taacagctgg 1200
cctctcacgt tcggtgatgg gacaaagctg gagctgaaac gggctgatgc tgcaccaact 1260
gtatccatct tcccaccatc cagtgagcag ttaacatctg gaggtgcctc agtcgtgtgc 1320
ttcttgaaca acttctaccc caaagacatc aatgtcaagt ggaagattga tggcagtgaa 1380
cgacaaaatg gcgtcctgaa cagttggact gatcaggaca gcaaagacag cacctacagc 1440
atgagcagca ccctcacgtt gaccaaggac gagtatgaac gacataacag ctatacctgt 1500
gaggccactc acaagacatc aacttcaccc attgtcaaga gcttcaacag gaatgagtgt 1560
tagaggccta ttttctttag tttgaattta ctgttattcg gtgtgcattt ctatgtttgg 1620
tgagcggttt tctgtgctca gagtgtgttt attttatgta atttaatttc tttgtgagct 1680
cctgtttagc aggtcgtccc ttcagcaagg acacaaaaag attttaattt tattaaaaaa 1740
aaaaaaaaaa aagaccggga attcgatatc aagcttatcg acctgcagat cgttcaaaca 1800
tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat 1860
aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta 1920
tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca 1980
aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatt 2040
ctagagtctc aagcttcggc gcgcc 2065
<210> 82 <211> 48
- 176 034733
<212> <213> ДНК Искусственная последовательность
<220>
<223> SpPDI-HA(Ind).С <400> 82 gttccttctc agatcttcgc tgatcagatt tgcattggtt accatgca <210> 83 <211> 3218 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конструкция 66ί <400> 83 aagcttgcta gcggcctcaa 1 от HindiII до EcoRI tggccctgca ggtcgactct agaggtaccc cgggctggta
tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt taagttagca agtgtgtaca
tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa atcattatta aacattagag
taaagaaata tggatgafcaa gaacaagagt agtgatattt tgacaacaat tttgttgcaa
catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca aaaacaatag agagagaaaa
aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga gaaagttgta caaaagttgt
accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa aagctacaca aataagggtt
aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg taccattaga gaatttttgg
caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta aaagttgagt catttgatta
aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt aaagttgtat tagtaattag
aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct atatattgcc ccatagagtc
agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa ataacggtat attaatccct
ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc cacgtaggag gataacagga
tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac aatcctgatg agataaccca
ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa atcacacatt cttccacaca
tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca ttctataaaa aatcacactt
tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag agaagagact aattaattaa
ttaatcatct tgagagaaaa tggcgaaaaa cgttgcgatt ttcggcttat tgttttctct
tcttgtgttg gttccttctc agatcttcgc tgatcagatt tgcattggtt accatgcaaa
caattcaaca gagcaggttg acacaatcat ggaaaagaac gttactgtta cacatgccca
agacatactg gaaaagacac acaacgggaa gctctgcgat ctagatggag tgaagcctct
aattttaaga gattgtagtg tagctggatg gctcctcggg aacccaatgt gtgacgaatt
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
- 177 034733
catcaatgta ccggaatggt cttacatagt ggagaaggcc aatccaacca atgacctctg 1380
ttacccaggg agtttcaacg actatgaaga actgaaacac ctattgagca gaataaacca 1440
ttttgagaaa attcaaatca tccccaaaag ttcttggtcc gatcatgaag cctcatcagg 1500
agttagctca gcatgtccat acctgggaag tccctccttt tttagaaatg tggtatggct 1560
tatcaaaaag aacagtacat acccaacaat aaagaaaagc tacaataata ccaaccaaga 1620
ggatcttttg gtactgtggg gaattcacca tcctaatgat gcggcagagc agacaaggct 1680
atatcaaaac ccaaccacct atatttccat tgggacatca acactaaacc agagattggt 1740
accaaaaata gctactagat ccaaagtaaa cgggcaaagt ggaaggatgg agttcttctg 1800
gacaatttta aaacctaatg atgcaatcaa cttcgagagt aatggaaatt tcattgctcc 1860
agaatatgca tacaaaattg tcaagaaagg ggactcagca attatgaaaa gtgaattgga 1920
atatggtaac tgcaacacca agtgtcaaac tccaatgggg gcgataaact ctagtatgcc 1980
attccacaac atacaccctc tcaccatcgg ggaatgcccc aaatatgtga aatcaaacag 2040
attagtcctt gcaacagggc tcagaaatag ccctcaaaga gagagcagaa gaaaaaagag 2100
aggactattt ggagctatag caggttttat agagggagga tggcagggaa tggtagatgg 2160
ttggtatggg taccaccata gcaatgagca ggggagtggg tacgctgcag acaaagaatc 2220
cactcaaaag gcaatagatg gagtcaccaa taaggtcaac tcaatcattg acaaaatgaa 2280
cactcagttt gaggccgttg gaagggaatt taataactta gaaaggagaa tagagaattt 2340
aaacaagaag atggaagacg ggtttctaga tgtctggact tataatgccg aacttctggt 2400
tctcatggaa aatgagagaa ctctagactt tcatgactca aatgttaaga acctctacga 2460
caaggtccga ctacagctta gggataatgc aaaggagctg ggtaacggtt gtttcgagtt 2520
ctatcacaaa tgtgataatg aatgtatgga aagtataaga aacggaacgt acaactatcc 2580
gcagtattca gaagaagcaa gattaaaaag agaggaaata agtggggtaa aattggaatc 2640
aataggaact taccaaatac tgtcaattta ttcaacagtg gcgagttccc tagcactggc 2700
aatcatgatg gctggtctat ctttatggat gtgctccaat ggatcgttac aatgcagaat 2760
ttgcatttaa gagctctaag ttaaaatgct tcttcgtctc ctatttataa tatggtttgt 2820
tattgttaat tttgttcttg tagaagagct taattaatcg ttgttgttat gaaatactat 2880
ttgtatgaga tgaactggtg taatgtaatt catttacata agtggagtca gaatcagaat 2940
gtttcctcca taactaacta gacatgaaga cctgccgcgt acaattgtct tatatttgaa 3000
caactaaaat tgaacatctt ttgccacaac tttataagtg gttaatatag ctcaaatata 3060
tggtcaagtt caatagatta ataatggaaa tatcagttat cgaaattcat taacaatcaa 3120
- 178 034733 cttaacgtta ttaactacta attttatatc atcccctttg ataaatgata gtacaccaat 3180 taggaaggag catgctcgag gcctggctgg ccgaattc
3218 <210> 84 <211> 49 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> SpPDI-HlB.C <400>84 ttctcagatc ttcgctgaca caatatgtat aggctaccat gctaacaac49 <210>85 <211>47 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> SacI-HlB.r <400>85 cttagagctc ttagatgcat attctacact gtaaagaccc attggaa <210>86 <211>3206 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция 787 от Hindlll до EcoRl <400>86 aagcttgcta gcggcctcaa tggccctgca ggtcgactct agaggtaccc cgggctggta60 tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt taagttagca agtgtgtaca120 tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa atcattatta aacattagag180 taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt tgacaacaat tttgttgcaa240 catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca aaaacaatag agagagaaaa300 aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga gaaagttgta caaaagttgt360 accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa aagctacaca aataagggtt420 aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg taccattaga gaatttttgg480 caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta aaagttgagt catttgatta540 aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt aaagttgtat tagtaattag600 aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct atatattgcc ccatagagtc660 agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa ataacggtat attaatccct720 ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc cacgtaggag gataacagga780
- 179 034733
tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac aatcctgatg agataaccca 840
ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa atcacacatt cttccacaca 900
tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca ttctataaaa aatcacactt 960
tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag agaagagact aattaattaa 1020
ttaatcatct tgagagaaaa tggcgaaaaa cgttgcgatt ttcggcttat tgttttctct 1080
tcttgtgttg gttccttctc agatcttcgc tgacacaata tgtataggct accatgctaa 1140
caactcgacc gacactgttg acacagtact tgaaaagaat gtgacagtga cacactctgt 1200
caacctgctt gagaacagtc acaatggaaa actatgtcta ttaaaaggaa tagccccact 1260
acaattgggt aattgcagcg ttgccgggtg gatcttagga aacccagaat gcgaattact 1320
gatttccaag gagtcatggt cctacattgt agaaaaacca aatcctgaga atggaacatg 1380
ttacccaggg catttcgctg actatgagga actgagggag caattgagtt cagtatcttc 1440
atttgagagg ttcgaaatat tccccaaaga aagctcatgg cccaaccaca ccgtaaccgg 1500
agtgtcagca tcatgctccc ataatgggga aagcagtttt tacagaaatt tgctatggct 1560
gacggggaag aatggtttgt acccaaacct gagcaagtcc tatgcaaaca acaaagaaaa 1620
agaagtcctt gtactatggg gtgttcatca cccgccaaac ataggtgacc aaaaggccct 1680
ctatcataca gaaaatgctt atgtctctgt agtgtcttca cattatagca gaaaattcac 1740
cccagaaata gccaaaagac ccaaagtaag agatcaagaa ggaagaatca attactactg 1800
gactctgctt gaacccgggg atacaataat atttgaggca aatggaaatc taatagcgcc 1860
aagatatgct ttcgcactga gtagaggctt tggatcagga atcatcaact caaatgcacc 1920
aatggataaa tgtgatgcga agtgccaaac acctcaggga gctataaaca gcagtcttcc 1980
tttccagaac gtacacccag tcacaatagg agagtgtcca aagtatgtca ggagtgcaaa 2040
attaaggatg gttacaggac taaggaacat cccatccatt caatccagag gtttgtttgg 2100
agccattgcc ggtttcattg aaggggggtg gactggaatg gtagatggtt ggtatggtta 2160
tcatcatcag aatgagcaag gatctggcta tgctgcagat caaaaaagca cacaaaatgc 2220
cattaatggg attacaaaca aggtcaattc tgtaattgag aaaatgaaca ctcaattcac 2280
agcagtgggc aaagagttca acaaattgga aagaaggatg gaaaacttga ataaaaaagt 2340
tgatgatggg tttatagaca tttggacata taatgcagaa ctgttggttc tactggaaaa 2400
tgaaaggact ttggatttcc atgactccaa tgtgaagaat ctgtatgaga aagtaaaaag 2460
ccagttaaag aataatgcta aagaaatagg aaatgggtgt tttgagttct atcacaagtg 2520
taacgatgaa tgcatggaga gtgtaaagaa tggaacttat gactatccaa aatattccga 2580
agaatcaaag ttaaacaggg agaaaattga tggagtgaaa ttggaatcaa tgggagtcta 2640
- 180 034733
tcagattctg gcgatctact caacagtcgc cagttctctg gttcttttgg tctccctggg 2700
ggcaatcagc ttctggatgt gttccaatgg gtctttacag tgtagaatat gcatctaaga 2760
gctctaagtt aaaatgcttc ttcgtctcct atttataata tggtttgtta ttgttaattt 2820
tgttcttgta gaagagctta attaatcgtt gttgttatga aatactattt gtatgagatg 2880
aactggtgta atgtaattca tttacataag tggagtcaga atcagaatgt ttcctccata 2940
actaactaga catgaagacc tgccgcgtac aattgtctta tatttgaaca actaaaattg 3000
aacatctttt gccacaactt tataagtggt taatatagct caaatatatg gtcaagttca 3060
atagattaat aatggaaata tcagttatcg aaattcatta acaatcaact taacgttatt 3120
aactactaat tttatatcat cccctttgat aaatgatagt acaccaatta ggaaggagca 3180
tgctcgaggc ctggctggcc gaattc 3206
<210> 87 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> НЗВ-SpPDI.r <400> 87 tgtcatttcc gggaagtttt tgagcgaaga tctgagaagg aacca <210> 88 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> SpPDI-НЗВ.с <400>88 tctcagatct tcgctcaaaa acttcccgga aatgacaaca gcacg45 <210>89 <211>23 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> H3(A-Bri).982r <400>89 ttgcttaaca tatctgggac agg <210>90 <211>3212 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность' <220>
<223> Конструкция 790 от Hindlll до EcoRI
- 181 034733 <400> 90 aagcttgcta tatttatatg tttttacttg taaagaaata catttgagaa aggaagaggg accaaaatag aattgctgta caagtcatta aacatgtgat aatttggtgt agttaactca ccaaaaaaaa tccccgtagg ctttaagccc tctgagccac tgtgagtcta ttaatcatct tcttgtgttg ggcaacgctg gaatgaccaa aatatgcgac attgggagac cagcaaagcc actagttgcc cactcaaaac attgaattgg caatgaaaaa ccaaatcttc acaaactgta gcggcctcaa ttgtcaaata aacaaaaata tggatgataa aattttgttg agaataaaaa ttgtacaaat aataaataag aaaagaaaga tatttaatga caaatttaat tttttatatt aaaacggtat aggataacat acgcatctgt acaaaaacca cactttgatt tgagagaaaa gttccttctc tgccttgggc attgaagtta agtcctcatc cctcagtgtg tacagcaact tcatccggca ggaacaagct ttgacccact tttgacaaat ctgtatgctc atcccgaata tggccctgca actcaaaaac ttcacctact gaacaagagt ttctctcttt cataatgtga atcattgagg gatgacgcat ataaattatt attgatgaaa ttgacatttg tcatagatca atttactaaa ccaatccaac ggcacatcta atccacatct cccttcaaac tggcgaaaaa agatcttcgc accatgcagt ctaatgctac agatccttga atggcttcca gttaccctta cactggagtt ctgcttgcat taaaattcaa tgtacatttg aagcatcagg tcggatctag ggtcgactct cataaaagtt actgttataa agtgatattt tcattggtca gtatgagaga aatttgacaa tagagagatg tttaaaatta gagttggatt atcttttcct aataagagaa aaatctaagc caatcacaac cattatctaa ttatcaccca acatacaaag cgttgcgatt tcaaaaactt accaaacgga tgagctggtt tggagaaaac aaataagaaa tgatgtgccg taacaatgaa aaggagatct atacccagca gggggttcac aagaatcaca acccagagta agaggtaccc taagttagca atcattatta tgacaacaat aaaacaatag gaaagttgta aagctacaca taccattaga aaagttgagt aaagttgtat atatattgcc ataacggtat cacgtaggag aatcctgatg atcacacatt ttctataaaa agaagagact ttcggcttat cccggaaatg acgatagtga cagagttcct tgcacactaa tgggaccttt gattatgcct agtttcaatt aataacagtt ttgaacgtga cacccgggta gtctctacca aggaatatcc cgggctggta agtgtgtaca aacattagag tttgttgcaa agagagaaaa caaaagttgt aataagggtt gaatttttgg catttgatta tagtaattag ccatagagtc attaatccct gataacagga agataaccca cttccacaca aatcacactt aattaattaa tgttttctct acaacagcac aaacaatcac caacaggtga tagatgctct ttgttgaacg cccttaggtc ggactggagt tctttagtag ctatgccaaa cggacaatga aaagaagcca ccagcagaat
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800
- 182 034733 aagcatctat tggacaatag taaaaccggg agacatactt ttgattaaca gcacagggaa 1860 tctaattgct cctaggggtt acttcaaaat acgaagtggg aaaagctcaa taatgagatc 1920 agatgcaccc attggcaaat gcaattctga atgcatcact ccaaacggaa gcattcccaa 1980 tgacaaacca ttccaaaatg taaacaggat cacatacggg gcctgtccca gatatgttaa 2040 gcaaaacact ctgaaattgg caacagggat gcgaaatgta ccagagaaac aaactagagg 2100 catatttggc gcaatcgcgg gtttcataga aaatggttgg gagggaatgg tggatggttg 2160 gtatggtttc aggcatcaaa attctgaggg aataggacaa gcagcagatc tcaaaagcac 2220 tcaagcagca atcgatcaaa tcaatgggaa gctgaatagg ttgatcggga aaaccaacga 2280 gaaattccat cagattgaaa aagagttctc agaagtcgaa gggagaatcc aggaccttga 2340 gaaatatgtt gaggacacca aaatagatct ctggtcatac aacgcggagc ttcttgttgc 2400 cctggagaac caacatacaa ttgatctaac tgactcagaa atgaacaaac tgtttgaaaa 2460 aacaaagaag caactgaggg aaaatgctga ggatatgggc aatggttgtt tcaaaatata 2520 ccacaaatgt gacaatgcct gcataggatc aatcagaaat ggaacttatg accacgatgt 2580 atacagagat gaagcattaa acaaccggtt ccagatcaag ggcgttgagc tgaagtcagg 2640 atacaaagat tggatactat ggatttcctt tgccatatca tgttttttgc tttgtgttgc 2700 tttgttgggg ttcatcatgt gggcctgcca aaaaggcaac attaggtgca acatttgcat 2760 ttgagagctc taagttaaaa tgcttcttcg tctcctattt ataatatggt ttgttattgt 2820 taattttgtt cttgtagaag agcttaatta atcgttgttg ttatgaaata ctatttgtat 2880 gagatgaact ggtgtaatgt aattcattta cataagtgga gtcagaatca gaatgtttcc 2940 tccataacta actagacatg aagacctgcc gcgtacaatt gtcttatatt tgaacaacta 3000 aaattgaaca tcttttgcca caactttata agtggttaat atagctcaaa tatatggtca 3060 agttcaatag attaataatg gaaatatcag ttatcgaaat tcattaacaa tcaacttaac 3120 gttattaact actaatttta tatcatcccc tttgataaat gatagtacac caattaggaa 3180 ggagcatgct cgaggcctgg ctggccgaat tc 3212 <210> 91
<211> 50
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> HBF-SpPDI.r
<400> 91
gttattccag tgcagattcg atcagcgaag atctgagaag gaaccaacac 50 <210> 92
- 183 034733
<211> <212> <213> 50 ДНК Искусственная последовательность
<220>
<223> SpPDI-HBF.C
<400> 92
cagatcttcg ctgatcgaat ctgcactgga ataacatctt caaactcacc 50
<210> 93
<211> 28
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Plaster80r
<400> 93
caaatagtat ttcataacaa caacgatt 28
<210> 94 <211> 3269 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция 798 от Hindlll до EcoRI
<400> 94 aagcttgcta gcggcctcaa tggccctgca ggtcgactct agaggtaccc cgggctggta 60
tatttatatg ttgtcaaata actcaaaaac cataaaagtt taagttagca agtgtgtaca 120
tttttacttg aacaaaaata ttcacctact actgttataa atcattatta aacattagag 180
taaagaaata tggatgataa gaacaagagt agtgatattt tgacaacaat tttgttgcaa 240
catttgagaa aattttgttg ttctctcttt tcattggtca aaaacaatag agagagaaaa 300
aggaagaggg agaataaaaa cataatgtga gtatgagaga gaaagttgta caaaagttgt 360
accaaaatag ttgtacaaat atcattgagg aatttgacaa aagctacaca aataagggtt 420
aattgctgta aataaataag gatgacgcat tagagagatg taccattaga gaatttttgg 480
caagtcatta aaaagaaaga ataaattatt tttaaaatta aaagttgagt catttgatta 540
aacatgtgat tatttaatga attgatgaaa gagttggatt aaagttgtat tagtaattag 600
aatttggtgt caaatttaat ttgacatttg atcttttcct atatattgcc ccatagagtc 660
agttaactca tttttatatt tcatagatca aataagagaa ataacggtat attaatccct 720
ccaaaaaaaa aaaacggtat atttactaaa aaatctaagc cacgtaggag gataacagga 780
tccccgtagg aggataacat ccaatccaac caatcacaac aatcctgatg agataaccca 840
ctttaagccc acgcatctgt ggcacatcta cattatctaa atcacacatt cttccacaca 900
tctgagccac acaaaaacca atccacatct ttatcaccca ttctataaaa aatcacactt 960
- 184 034733
tgtgagtcta cactttgatt cccttcaaac acatacaaag agaagagact aattaattaa 1020
ttaatcatct tgagagaaaa tggcgaaaaa cgttgcgatt ttcggcttat tgttttctct 1080
tcttgtgttg gttccttctc agatcttcgc tgatcgaatc tgcactggaa taacatcttc 1140
aaactcacct catgtggtca aaacagccac tcaaggggag gtcaatgtga ctggtgtgat 1200
accactaaca acaacaccaa caaaatctta ttttgcaaat ctcaaaggaa caaggaccag 1260
agggaaacta tgcccagact gtctcaactg cacagatctg gatgtggctt tgggcagacc 1320
aatgtgtgtg gggaccacac cttcggcgaa ggcttcaata ctccacgaag tcaaacctgt 1380
tacatccggg tgctttccta taatgcacga cagaacaaaa atcaggcaac tacccaatct 1440
tctcagagga tatgaaaata tcaggctatc aacccaaaac gtcatcgatg cggaaaaggc 1500
accaggagga ccctacagac ttggaacctc aggatcttgc cctaacgcta ccagtaagag 1560
cggatttttc gcaacaatgg cttgggctgt cccaaaggac aacaacaaaa atgcaacgaa 1620
cccactaaca gtagaagtac catacatttg tacagaaggg gaagaccaaa tcactgtttg 1680
ggggttccat tcagataaca aaacccaaat gaagaacctc tatggagact caaatcctca 1740
aaagttcacc tcatctgcta atggagtaac cacacactat gtttctcaga ttggcagctt 1800
cccagatcaa acagaagacg gaggactacc acaaagcggc aggattgttg ttgattacat 1860
gatgcaaaaa cctgggaaaa caggaacaat tgtctaccaa agaggtgttt tgttgcctca 1920
aaaggtgtgg tgcgcgagtg gcaggagcaa agtaataaaa gggtccttgc ctttaattgg 1980
tgaagcagat tgccttcatg aaaaatacgg tggattaaac aaaagcaagc cttactacac 2040
aggagaacat gcaaaagcca taggaaattg cccaatatgg gtgaaaacac ctttgaagct 2100
cgccaatgga accaaatata gacctcctgc aaaactatta aaggaaaggg gtttcttcgg 2160
agctattgct ggtttcctag aaggaggatg ggaaggaatg attgcaggct ggcacggata 2220
cacatctcac ggagcacatg gagtggcagt ggcggcggac cttaagagta cgcaagaagc 2280
tataaacaag ataacaaaaa atctcaattc tttgagtgag ctagaagtaa agaatcttca 2340
aagactaagt ggtgccatgg atgaactcca caacgaaata ctcgagctgg atgagaaagt 2400
ggatgatctc agagctgaca ctataagctc gcaaatagaa cttgcagtct tgctttccaa 2460
cgaaggaata ataaacagtg aagatgagca tctattggca cttgagagaa aactaaagaa 2520
aatgctgggt ccctctgctg tagagatagg aaatggatgc ttcgaaacca aacacaagtg 2580
caaccagacc tgcttagaca ggatagctgc tggcaccttt aatgcaggag aattttctct 2640
ccccactttt gattcactga acattactgc tgcatcttta aatgatgatg gattggataa 2700
ccatactata ctgctctatt actcaactgc tgcttctagt ttggctgtaa cattgatgct 2760
- 185 034733
agctattttt attgtttata tggtctccag agacaacgtt tcatgctcca tctgtctata 2820
agagctctaa gttaaaatgc ttcttcgtct cctatttata atatggtttg ttattgttaa 2880
ttttgttctt gtagaagagc ttaattaatc gttgttgtta tgaaatacta tttgtatgag 2940
atgaactggt gtaatgtaat tcatttacat aagtggagtc agaatcagaa tgtttcctcc 3000
ataactaact agacatgaag acctgccgcg tacaattgtc ttatatttga acaactaaaa 3060
ttgaacatct tttgccacaa ctttataagt ggttaatata gctcaaatat atggtcaagt 3120
tcaatagatt aataatggaa atatcagtta tcgaaattca ttaacaatca acttaacgtt 3180
attaactact aattttatat catccccttt gataaatgat agtacaccaa ttaggaagga 3240
gcatgctcga ggcctggctg gccgaattc 3269
<210> 95 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Apal-SpPDI.C
<400> 95
ttgtcgggcc catggcgaaa aacgttgcga ttttcggctt attgt 45
<210> 96
<211> 42
<212> ДНК
<213> Искусственная ι юследовательность
<220>
<223> Stu3 :-Н1 (A-NC) .1
<400> 96
aaaataggcc tttagatgca tattctacac tgcaaagacc ca 42
<210> 97
<211> 307$ )
<212> ДНК
<213> Искусственная г юследовательность
<220>
<223> Конструкция 580 от PacI д< э Asci
<400> 97
ttaattaaga attcgagctc caccgcggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 60
gtcactttat tgagaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 120
ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 180
cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 240
attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 300
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gtattaaaat cttaataggt 360
- 186 034733
tttgataaaa gcgaacgtgg ggaaacccga accaaacctt cttctaaact ctctctcatc 420
tctcttaaag caaacttctc tcttgtcttt cttgcgtgag cgatcttcaa cgttgtcaga 480
tcgtgcttcg gcaccagtac aacgttttct ttcactgaag cgaaatcaaa gatctctttg 540
tggacacgta gtgcggcgcc attaaataac gtgtacttgt cctattcttg tcggtgtggt 600
cttgggaaaa gaaagcttgc tggaggctgc tgttcagccc catacattac ttgttacgat 660
tctgctgact ttcggcgggt gcaatatctc tacttctgct tgacgaggta ttgttgcctg 720
tacttctttc ttcttcttct tgctgattgg ttctataaga aatctagtat tttctttgaa 780
acagagtttt cccgtggttt tcgaacttgg agaaagattg ttaagcttct gtatattctg 840
cccaaatttg tcgggcccat ggcgaaaaac gttgcgattt tcggcttatt gttttctctt 900
cttgtgttgg ttccttctca gatcttcgct gacacaatat gtataggcta ccatgccaac 960
aactcaaccg acactgttga cacagtactt gagaagaatg tgacagtgac acactctgtc 1020
aacctacttg aggacagtca caatggaaaa ctatgtctac taaaaggaat agccccacta 1080
caattgggta attgcagcgt tgccggatgg atcttaggaa acccagaatg cgaattactg 1140
atttccaagg aatcatggtc ctacattgta gaaacaccaa atcctgagaa tggaacatgt 1200
tacccagggt atttcgccga ctatgaggaa ctgagggagc aattgagttc agtatcttca 1260
tttgagagat tcgaaatatt ccccaaagaa agctcatggc ccaaccacac cgtaaccgga 1320
gtatcagcat catgctccca taatgggaaa agcagttttt acagaaattt gctatggctg 1380
acggggaaga atggtttgta cccaaacctg agcaagtcct atgtaaacaa caaagagaaa 1440
gaagtccttg tactatgggg tgttcatcac ccgcctaaca tagggaacca aagggcactc 1500
tatcatacag aaaatgctta tgtctctgta gtgtcttcac attatagcag aagattcacc 1560
ccagaaatag ccaaaagacc caaagtaaga gatcaggaag gaagaatcaa ctactactgg 1620
actctgctgg aacctgggga tacaataata tttgaggcaa atggaaatct aatagcgcca 1680
tggtatgctt ttgcactgag tagaggcttt ggatcaggaa tcatcacctc aaatgcacca 1740
atggatgaat gtgatgcgaa gtgtcaaaca cctcagggag ctataaacag cagtcttcct 1800
ttccagaatg tacacccagt cacaatagga gagtgtccaa agtatgtcag gagtgcaaaa 1860
ttaaggatgg ttacaggact aaggaacatc ccatccattc aatccagagg tttgtttgga 1920
gccattgccg gtttcattga aggggggtgg actggaatgg tagatgggtg gtatggttat 1980
catcatcaga atgagcaagg atctggctat gctgcagatc aaaaaagtac acaaaatgcc 2040
attaacggga ttacaaacaa ggtcaattct gtaattgaga aaatgaacac tcaattcaca 2100
gctgtgggca aagagttcaa caaattggaa agaaggatgg aaaacttaaa taaaaaagtt 2160
gatgatgggt ttctagacat ttggacatat aatgcagaat tgttggttct actggaaaat 2220
- 187 034733
gaaaggactt tggatttcca tgactccaat gtgaagaatc tgtatgagaa agtaaaaagc 2280
caattaaaga ataatgccaa agaaatagga aacgggtgtt ttgagttcta tcacaagtgt 2340
aacaatgaat gcatggagag tgtgaaaaat ggtacctatg actatccaaa atattccgaa 2400
gaatcaaagt taaacaggga gaaaattgat ggagtgaaat tggaatcaat gggagtatac 2460
cagattctgg cgatctactc aactgtcgcc agttccctgg ttcttttggt ctccctgggg 2520
gcaatcagct tctggatgtg ttccaatggg tctttgcagt gtagaatatg catctaaagg 2580
cctattttct ttagtttgaa tttactgtta ttcggtgtgc atttctatgt ttggtgagcg 2640
gttttctgtg ctcagagtgt gtttatttta tgtaatttaa tttctttgtg agctcctgtt 2700
tagcaggtcg tcccttcagc aaggacacaa aaagatttta attttattaa aaaaaaaaaa 2760
aaaaaagacc gggaattcga tatcaagctt atcgacctgc agatcgttca aacatttggc 2820
aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc 2880
tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat 2940
gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat 3000
agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gattctagag 3060
tctcaagctt cggcgcgcc 3079
<210> 98
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Apal-H5 (A-Indo).lc
<400> 98
tgtcgggccc atggagaaaa tagtgcttct tcttgcaat
<210> 99 <211> 37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Η5 (А-Indo)-Stul.1707г <400>99 aaataggcct ttaaatgcaa attctgcatt gtaacga <210>100 <211>3067 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция 685 от PacI до AscI
- 188 034733 <400> 100 ttaattaaga gtcactttat ataaaggaaa cacccacgag attgatgtga acccttcctc tttgataaaa tctcttaaag tcgtgcttcg tggacacgta cttgggaaaa tctgctgact tacttctttc acagagtttt cccaaatttg aaaagtgatc atcatggaaa gggaagctct ggatggctcc atagtggaga gaagaactga aaaagttctt ggaagtccct acaataaaga caccatccta tccattggga gtaaacgggc atcaacttcg aaaggggact caaactccaa attcgagctc tgagaagata ggccatcgtt gagcatcgtg tatctccact tatataagga gcgaacgtgg caaacttctc gcaccagtac gtgcggcgcc gaaagcttgc ttcggcgggt ttcttcttct cccgtggttt tcgggcccat agatttgcat agaacgttac gcgatctaga tcgggaaccc aggccaatcc aacacctatt ggtccgatca ccttttttag aaagctacaa atgatgcggc catcaacact aaagtggaag agagtaatgg cagcaattat tgggggcgat caccgcggaa gtggaaaagg gaagatgcct gaaaaagaag gacgtaaggg agttcatttc ggaaacccga tcttgtcttt aacgttttct attaaataac tggaggctgc gcaatatctc tgctgattgg tcgaacttgg ggagaaaata tggttaccat tgttacacat tggagtgaag aatgtgtgac aaccaatgac gagcagaata tgaagcctca aaatgtggta taataccaac agagcagaca aaaccagaga gatggagttc aaatttcatt gaaaagtgaa aaactctagt acctcctcgg aaggtggctc ctgccgacag acgttccaac atgacgcaca atttggagag accaaacctt cttgcgtgag ttcactgaag gtgtacttgt tgttcagccc tacttctgct ttctataaga agaaagattg gtgcttcttc gcaaacaatt gcccaagaca cctctaattt gaattcatca ctctgttacc aaccattttg tcaggagtta tggcttatca caagaggatc aggctatatc ttggtaccaa ttctggacaa gctccagaat ttggaatatg atgccattcc attccattgc ctacaaatgc tggtcccaaa cacgtcttca atcccactat gtattaaaat cttctaaact cgatcttcaa cgaaatcaaa cctattcttg catacattac tgacgaggta aatctagtat ttaagcttct ttgcaatagt caacagagca tactggaaaa taagagattg atgtaccgga cagggagttt agaaaattca gctcagcatg aaaagaacag ttttggtact aaaacccaac aaatagctac ttttaaaacc atgcatacaa gtaactgcaa acaacataca ccagctatct catcattgcg gatggacccc aagcaagtgg ccttcgcaag cttaataggt ctctctcatc cgttgtcaga gatctctttg tcggtgtggt ttgttacgat ttgttgcctg tttctttgaa gtatattctg cagtcttgtt ggttgacaca gacacacaac tagtgtagct atggtcttac caacgactat aatcatcccc tccatacctg tacataccca gtggggaatt cacctatatt tagatccaaa taatgatgca aattgtcaag caccaagtgt ccctctcacc
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1680 1740 1800
- 189 034733
atcggggaat gccccaaata tgtgaaatca aacagattag tccttgcaac agggctcaga 1860
aatagccctc aaagagagag cagaagaaaa aagagaggac tatttggagc tatagcaggt 1920
tttatagagg gaggatggca gggaatggta gatggttggt atgggtacca ccatagcaat 1980
gagcagggga gtgggtacgc tgcagacaaa gaatccactc aaaaggcaat agatggagtc 2040
accaataagg tcaactcaat cattgacaaa atgaacactc agtttgaggc cgttggaagg 2100
gaatttaata acttagaaag gagaatagag aatttaaaca agaagatgga agacgggttt 2160
ctagatgtct ggacttataa tgccgaactt ctggttctca tggaaaatga gagaactcta 2220
gactttcatg actcaaatgt taagaacctc tacgacaagg tccgactaca gcttagggat 2280
aatgcaaagg agctgggtaa cggttgtttc gagttctatc acaaatgtga taatgaatgt 2340
atggaaagta taagaaacgg aacgtacaac tatccgcagt attcagaaga agcaagatta 2400
aaaagagagg aaataagtgg ggtaaaattg gaatcaatag gaacttacca aatactgtca 2460
atttattcaa cagtggcgag ttccctagca ctggcaatca tgatggctgg tctatcttta 2520
tggatgtgct ccaatggatc gttacaatgc agaatttgca tttaaaggcc tattttcttt 2580
agtttgaatt tactgttatt cggtgtgcat ttctatgttt ggtgagcggt tttctgtgct 2640
cagagtgtgt ttattttatg taatttaatt tctttgtgag ctcctgttta gcaggtcgtc 2700
ccttcagcaa ggacacaaaa agattttaat tttattaaaa aaaaaaaaaa aaaagaccgg 2760
gaattcgata tcaagcttat cgacctgcag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct 2820
taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg 2880
ttaagcatgt aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga 2940
ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact 3000
aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga ttctagagtc tcaagcttcg 3060
gcgcgcc 3067 <210> 101 <211> 3091 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция 686 от Pad до Asci <400> 101 ttaattaaga gtcactttat ataaaggaaa cacccacgag attcgagctc tgagaagata ggccatcgtt gagcatcgtg caccgcggaa gtggaaaagg gaagatgcct gaaaaagaag acctcctcgg aaggtggctc ctgccgacag acgttccaac attccattgc ctacaaatgc tggtcccaaa cacgtcttca ccagctatct catcattgcg gatggacccc aagcaagtgg
120
180
240
- 190 034733
attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 300
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gtattaaaat cttaataggt 360
tttgataaaa gcgaacgtgg ggaaacccga accaaacctt cttctaaact ctctctcatc 420
tctcttaaag caaacttctc tcttgtcttt cttgcgtgag cgatcttcaa cgttgtcaga 480
tcgtgcttcg gcaccagtac aacgttttct ttcactgaag cgaaatcaaa gatctctttg 540
tggacacgta gtgcggcgcc attaaataac gtgtacttgt cctattcttg tcggtgtggt 600
cttgggaaaa gaaagcttgc tggaggctgc tgttcagccc catacattac ttgttacgat 660
tctgctgact ttcggcgggt gcaatatctc tacttctgct tgacgaggta ttgttgcctg 720
tacttctttc ttcttcttct tgctgattgg ttctataaga aatctagtat tttctttgaa 780
acagagtttt cccgtggttt tcgaacttgg agaaagattg ttaagcttct gtatattctg 840
cccaaatttg tcgggcccat ggcgaaaaac gttgcgattt tcggcttatt gttttctctt 900
cttgtgttgg ttccttctca gatcttcgct gatcagattt gcattggtta ccatgcaaac 960
aattcaacag agcaggttga cacaatcatg gaaaagaacg ttactgttac acatgcccaa 1020
gacatactgg aaaagacaca caacgggaag ctctgcgatc tagatggagt gaagcctcta 1080
attttaagag attgtagtgt agctggatgg ctcctcggga acccaatgtg tgacgaattc 1140
atcaatgtac cggaatggtc ttacatagtg gagaaggcca atccaaccaa tgacctctgt 1200
tacccaggga gtttcaacga ctatgaagaa ctgaaacacc tattgagcag aataaaccat 1260
tttgagaaaa ttcaaatcat ccccaaaagt tcttggtccg atcatgaagc ctcatcagga 1320
gttagctcag catgtccata cctgggaagt ccctcctttt ttagaaatgt ggtatggctt 1380
atcaaaaaga acagtacata cccaacaata aagaaaagct acaataatac caaccaagag 1440
gatcttttgg tactgtgggg aattcaccat cctaatgatg cggcagagca gacaaggcta 1500
tatcaaaacc caaccaccta tatttccatt gggacatcaa cactaaacca gagattggta 1560
ccaaaaatag ctactagatc caaagtaaac gggcaaagtg gaaggatgga gttcttctgg 1620
acaattttaa aacctaatga tgcaatcaac ttcgagagta atggaaattt cattgctcca 1680
gaatatgcat acaaaattgt caagaaaggg gactcagcaa ttatgaaaag tgaattggaa 1740
tatggtaact gcaacaccaa gtgtcaaact ccaatggggg cgataaactc tagtatgcca 1800
ttccacaaca tacaccctct caccatcggg gaatgcccca aatatgtgaa atcaaacaga 1860
ttagtccttg caacagggct cagaaatagc cctcaaagag agagcagaag aaaaaagaga 1920
ggactatttg gagctatagc aggttttata gagggaggat ggcagggaat ggtagatggt 1980
tggtatgggt accaccatag caatgagcag gggagtgggt acgctgcaga caaagaatcc 2040
actcaaaagg caatagatgg agtcaccaat aaggtcaact caatcattga caaaatgaac 2100
- 191 034733
actcagtttg aggccgttgg aagggaattt aataacttag aaaggagaat agagaattta 2160
aacaagaaga tggaagacgg gtttctagat gtctggactt ataatgccga acttctggtt 2220
ctcatggaaa atgagagaac tctagacttt catgactcaa atgttaagaa cctctacgac 2280
aaggtccgac tacagcttag ggataatgca aaggagctgg gtaacggttg tttcgagttc 2340
tatcacaaat gtgataatga atgtatggaa agtataagaa acggaacgta caactatccg 2400
cagtattcag aagaagcaag attaaaaaga gaggaaataa gtggggtaaa attggaatca 2460
ataggaactt accaaatact gtcaatttat tcaacagtgg cgagttccct agcactggca 2520
atcatgatgg ctggtctatc tttatggatg tgctccaatg gatcgttaca atgcagaatt 2580
tgcatttaaa ggcctatttt ctttagtttg aatttactgt tattcggtgt gcatttctat 2640
gtttggtgag cggttttctg tgctcagagt gtgtttattt tatgtaattt aatttctttg 2700
tgagctcctg tttagcaggt cgtcccttca gcaaggacac aaaaagattt taattttatt 2760
aaaaaaaaaa aaaaaaaaga ccgggaattc gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt 2820
caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta 2880
tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt 2940
tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag 3000
aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac 3060
tagattctag agtctcaagc ttcggcgcgc c 3091
<210> 102 <211> 45 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Apal-HIB.C <400>102 tgtcgggccc atgaaagtaa aactactggt cctgttatgc acatt45 <210>103 <211>46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> StuI-H2B.r <400> 103
aaataggcct ttagatgcat attctacact gtaaagaccc attgga 46
<210> 104
<211> 3058
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
- 192 034733 <220>
<223> Конструкция 732 от PacI до Asci
<400> 104 ttaattaaga attcgagctc caccgcggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 60
gtcactttat tgagaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 120
ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 180
cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 240
attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 300
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gtattaaaat cttaataggt 360
tttgataaaa gcgaacgtgg ggaaacccga accaaacctt cttctaaact ctctctcatc 420
tctcttaaag caaacttctc tcttgtcttt cttgcgtgag cgatcttcaa cgttgtcaga 480
tcgtgcttcg gcaccagtac aacgttttct ttcactgaag cgaaatcaaa gatctctttg 540
tggacacgta gtgcggcgcc attaaataac gtgtacttgt cctattcttg tcggtgtggt 600
cttgggaaaa gaaagcttgc tggaggctgc tgttcagccc catacattac ttgttacgat 660
tctgctgact ttcggcgggt gcaatatctc tacttctgct tgacgaggta ttgttgcctg 720
tacttctttc ttcttcttct tgctgattgg ttctataaga aatctagtat tttctttgaa 780
acagagtttt cccgtggttt tcgaacttgg agaaagattg ttaagcttct gtatattctg 840
cccaaatttg tcgggcccat gaaagtaaaa ctactggtcc tgttatgcac atttacagct 900
acatatgcag acacaatatg tataggctac catgctaaca actcgaccga cactgttgac 960
acagtacttg aaaagaatgt gacagtgaca cactctgtca acctgcttga gaacagtcac 1020
aatggaaaac tatgtctatt aaaaggaata gccccactac aattgggtaa ttgcagcgtt 1080
gccgggtgga tcttaggaaa cccagaatgc gaattactga tttccaagga gtcatggtcc 1140
tacattgtag aaaaaccaaa tcctgagaat ggaacatgtt acccagggca tttcgctgac 1200
tatgaggaac tgagggagca attgagttca gtatcttcat ttgagaggtt cgaaatattc 1260
cccaaagaaa gctcatggcc caaccacacc gtaaccggag tgtcagcatc atgctcccat 1320
aatggggaaa gcagttttta cagaaatttg ctatggctga cggggaagaa tggtttgtac 1380
ccaaacctga gcaagtccta tgcaaacaac aaagaaaaag aagtccttgt actatggggt 1440
gttcatcacc cgccaaacat aggtgaccaa aaggccctct atcatacaga aaatgcttat 1500
gtctctgtag tgtcttcaca ttatagcaga aaattcaccc cagaaatagc caaaagaccc 1560
aaagtaagag atcaagaagg aagaatcaat tactactgga ctctgcttga acccggggat 1620
acaataatat ttgaggcaaa tggaaatcta atagcgccaa gatatgcttt cgcactgagt 1680
- 193 034733
agaggctttg gatcaggaat catcaactca aatgcaccaa tggataaatg tgatgcgaag 1740
tgccaaacac ctcagggagc tataaacagc agtcttcctt tccagaacgt acacccagtc 1800
acaataggag agtgtccaaa gtatgtcagg agtgcaaaat taaggatggt tacaggacta 1860
aggaacatcc catccattca atccagaggt ttgtttggag ccattgccgg tttcattgaa 1920
ggggggtgga ctggaatggt agatggttgg tatggttatc atcatcagaa tgagcaagga 1980
tctggctatg ctgcagatca aaaaagcaca caaaatgcca ttaatgggat tacaaacaag 2040
gtcaattctg taattgagaa aatgaacact caattcacag cagtgggcaa agagttcaac 2100
aaattggaaa gaaggatgga aaacttgaat aaaaaagttg atgatgggtt tatagacatt 2160
tggacatata atgcagaact gttggttcta ctggaaaatg aaaggacttt ggatttccat 2220
gactccaatg tgaagaatct gtatgagaaa gtaaaaagcc agttaaagaa taatgctaaa 2280
gaaataggaa atgggtgttt tgagttctat cacaagtgta acgatgaatg catggagagt 2340
gtaaagaatg gaacttatga ctatccaaaa tattccgaag aatcaaagtt aaacagggag 2400
aaaattgatg gagtgaaatt ggaatcaatg ggagtctatc agattctggc gatctactca 2460
acagtcgcca gttctctggt tcttttggtc tccctggggg caatcagctt ctggatgtgt 2520
tccaatgggt ctttacagtg tagaatatgc atctaaaggc ctattttctt tagtttgaat 2580
ttactgttat tcggtgtgca tttctatgtt tggtgagcgg ttttctgtgc tcagagtgtg 2640
tttattttat gtaatttaat ttctttgtga gctcctgttt agcaggtcgt cccttcagca 2700
aggacacaaa aagattttaa ttttattaaa aaaaaaaaaa aaaaagaccg ggaattcgat 2760
atcaagctta tcgacctgca gatcgttcaa acatttggca ataaagtttc ttaagattga 2820
atcctgttgc cggtcttgcg atgattatca tataatttct gttgaattac gttaagcatg 2880
taataattaa catgtaatgc atgacgttat ttatgagatg ggtttttatg attagagtcc 2940
cgcaattata catttaatac gcgatagaaa acaaaatata gcgcgcaaac taggataaat 3000
tatcgcgcgc ggtgtcatct atgttactag attctagagt ctcaagcttc ggcgcgcc 3058
<210> 105 <211> 3079
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конструкция 733 ; от PacI дс > Asci
<400> 105
ttaattaaga attcgagctc caccgcggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 60
gtcactttat tgagaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 120
ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 180
- 194 034733
cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 240
attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 300
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gtattaaaat cttaataggt 360
tttgataaaa gcgaacgtgg ggaaacccga accaaacctt cttctaaact ctctctcatc 420
tctcttaaag caaacttctc tcttgtcttt cttgcgtgag cgatcttcaa cgttgtcaga 480
tcgtgcttcg gcaccagtac aacgttttct ttcactgaag cgaaatcaaa gatctctttg 540
tggacacgta gtgcggcgcc attaaataac gtgtacttgt cctattcttg tcggtgtggt 600
cttgggaaaa gaaagcttgc tggaggctgc tgttcagccc catacattac ttgttacgat 660
tctgctgact ttcggcgggt gcaatatctc tacttctgct tgacgaggta ttgttgcctg 720
tacttctttc ttcttcttct tgctgattgg ttctataaga aatctagtat tttctttgaa 780
acagagtttt cccgtggttt tcgaacttgg agaaagattg ttaagcttct gtatattctg 840
cccaaatttg tcgggcccat ggcgaaaaac gttgcgattt tcggcttatt gttttctctt 900
cttgtgttgg ttccttctca gatcttcgct gacacaatat gtataggcta ccatgctaac 960
aactcgaccg acactgttga cacagtactt gaaaagaatg tgacagtgac acactctgtc 1020
aacctgcttg agaacagtca caatggaaaa ctatgtctat taaaaggaat agccccacta 1080
caattgggta attgcagcgt tgccgggtgg atcttaggaa acccagaatg cgaattactg 1140
atttccaagg agtcatggtc ctacattgta gaaaaaccaa atcctgagaa tggaacatgt 1200
tacccagggc atttcgctga ctatgaggaa ctgagggagc aattgagttc agtatcttca 1260
tttgagaggt tcgaaatatt ccccaaagaa agctcatggc ccaaccacac cgtaaccgga 1320
gtgtcagcat catgctccca taatggggaa agcagttttt acagaaattt gctatggctg 1380
acggggaaga atggtttgta cccaaacctg agcaagtcct atgcaaacaa caaagaaaaa 1440
gaagtccttg tactatgggg tgttcatcac ccgccaaaca taggtgacca aaaggccctc 1500
tatcatacag aaaatgctta tgtctctgta gtgtcttcac attatagcag aaaattcacc 1560
ccagaaatag ccaaaagacc caaagtaaga gatcaagaag gaagaatcaa ttactactgg 1620
actctgcttg aacccgggga tacaataata tttgaggcaa atggaaatct aatagcgcca 1680
agatatgctt tcgcactgag tagaggcttt ggatcaggaa tcatcaactc aaatgcacca 1740
atggataaat gtgatgcgaa gtgccaaaca cctcagggag ctataaacag cagtcttcct 1800
ttccagaacg tacacccagt cacaatagga gagtgtccaa agtatgtcag gagtgcaaaa 1860
ttaaggatgg ttacaggact aaggaacatc ccatccattc aatccagagg tttgtttgga 1920
gccattgccg gtttcattga aggggggtgg actggaatgg tagatggttg gtatggttat 1980
catcatcaga atgagcaagg atctggctat gctgcagatc aaaaaagcac acaaaatgcc 2040
- 195 034733
attaatggga ttacaaacaa ggtcaattct gtaattgaga aaatgaacac tcaattcaca 2100
gcagtgggca aagagttcaa caaattggaa agaaggatgg aaaacttgaa taaaaaagtt 2160
gatgatgggt ttatagacat ttggacatat aatgcagaac tgttggttct actggaaaat 2220
gaaaggactt tggatttcca tgactccaat gtgaagaatc tgtatgagaa agtaaaaagc 2280
cagttaaaga ataatgctaa agaaatagga aatgggtgtt ttgagttcta tcacaagtgt 2340
aacgatgaat gcatggagag tgtaaagaat ggaacttatg actatccaaa atattccgaa 2400
gaatcaaagt taaacaggga gaaaattgat ggagtgaaat tggaatcaat gggagtctat 2460
cagattctgg cgatctactc aacagtcgcc agttctctgg ttcttttggt ctccctgggg 2520
gcaatcagct tctggatgtg ttccaatggg tctttacagt gtagaatatg catctaaagg 2580
cctattttct ttagtttgaa tttactgtta ttcggtgtgc atttctatgt ttggtgagcg 2640
gttttctgtg ctcagagtgt gtttatttta tgtaatttaa tttctttgtg agctcctgtt 2700
tagcaggtcg tcccttcagc aaggacacaa aaagatttta attttattaa aaaaaaaaaa 2760
aaaaaagacc gggaattcga tatcaagctt atcgacctgc agatcgttca aacatttggc 2820
aataaagttt cttaagattg aatcctgttg ccggtcttgc gatgattatc atataatttc 2880
tgttgaatta cgttaagcat gtaataatta acatgtaatg catgacgtta tttatgagat 2940
gggtttttat gattagagtc ccgcaattat acatttaata cgcgatagaa aacaaaatat 3000
agcgcgcaaa ctaggataaa ttatcgcgcg cggtgtcatc tatgttacta gattctagag 3060
tctcaagctt cggcgcgcc 3079
<210> 106 <211> 48 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ApaI-НЗВ.с <400> 106 ttgtcgggcc catgaagact atcattgctt tgagctacat tctatgtc
<210> 107
<211> 44
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> StuI-НЗВ.г
<400> 107
aaaataggcc ttcaaatgca aatgttgcac ctaatgttgc cttt 44
<210> 108 <211> 3061
- 196 034733 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция 735 от PacI до AscI
<400> 108 ttaattaaga attcgagctc caccgcggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 60
gtcactttat tgagaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 120
ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 180
cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 240
attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 300
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gtattaaaat cttaataggt 360
tttgataaaa gcgaacgtgg ggaaacccga accaaacctt cttctaaact ctctctcatc 420
tctcttaaag caaacttctc tcttgtcttt cttgcgtgag cgatcttcaa cgttgtcaga 480
tcgtgcttcg gcaccagtac aacgttttct ttcactgaag cgaaatcaaa gatctctttg 540
tggacacgta gtgcggcgcc attaaataac gtgtacttgt cctattcttg tcggtgtggt 600
cttgggaaaa gaaagcttgc tggaggctgc tgttcagccc catacattac ttgttacgat 660
tctgctgact ttcggcgggt gcaatatctc tacttctgct tgacgaggta ttgttgcctg 720
tacttctttc ttcttcttct tgctgattgg ttctataaga aatctagtat tttctttgaa 780
acagagtttt cccgtggttt tcgaacttgg agaaagattg ttaagcttct gtatattctg 840
cccaaatttg tcgggcccat gaagactatc attgctttga gctacattct atgtctggtt 900
ttcactcaaa aacttcccgg aaatgacaac agcacggcaa cgctgtgcct tgggcaccat 960
gcagtaccaa acggaacgat agtgaaaaca atcacgaatg accaaattga agttactaat 1020
gctactgagc tggttcagag ttcctcaaca ggtgaaatat gcgacagtcc tcatcagatc 1080
cttgatggag aaaactgcac actaatagat gctctattgg gagaccctca gtgtgatggc 1140
ttccaaaata agaaatggga cctttttgtt gaacgcagca aagcctacag caactgttac 1200
ccttatgatg tgccggatta tgcctccctt aggtcactag ttgcctcatc cggcacactg 1260
gagtttaaca atgaaagttt caattggact ggagtcactc aaaacggaac aagctctgct 1320
tgcataagga gatctaataa cagtttcttt agtagattga attggttgac ccacttaaaa 1380
ttcaaatacc cagcattgaa cgtgactatg ccaaacaatg aaaaatttga caaattgtac 1440
atttgggggg ttcaccaccc gggtacggac aatgaccaaa tcttcctgta tgctcaagca 1500
tcaggaagaa tcacagtctc taccaaaaga agccaacaaa ctgtaatccc gaatatcgga 1560
tctagaccca gagtaaggaa tatccccagc agaataagca tctattggac aatagtaaaa 1620
- 197 034733
ccgggagaca tacttttgat taacagcaca gggaatctaa ttgctcctag gggttacttc 1680
aaaatacgaa gtgggaaaag ctcaataatg agatcagatg cacccattgg caaatgcaat 1740
tctgaatgca tcactccaaa cggaagcatt cccaatgaca aaccattcca aaatgtaaac 1800
aggatcacat acggggcctg tcccagatat gttaagcaaa acactctgaa attggcaaca 1860
gggatgcgaa atgtaccaga gaaacaaact agaggcatat ttggcgcaat cgcgggtttc 1920
atagaaaatg gttgggaggg aatggtggat ggttggtatg gtttcaggca tcaaaattct 1980
gagggaatag gacaagcagc agatctcaaa agcactcaag cagcaatcga tcaaatcaat 2040
gggaagctga ataggttgat cgggaaaacc aacgagaaat tccatcagat tgaaaaagag 2100
ttctcagaag tcgaagggag aatccaggac cttgagaaat atgttgagga caccaaaata 2160
gatctctggt catacaacgc ggagcttctt gttgccctgg agaaccaaca tacaattgat 2220
ctaactgact cagaaatgaa caaactgttt gaaaaaacaa agaagcaact gagggaaaat 2280
gctgaggata tgggcaatgg ttgtttcaaa atataccaca aatgtgacaa tgcctgcata 2340
ggatcaatca gaaatggaac ttatgaccac gatgtataca gagatgaagc attaaacaac 2400
cggttccaga tcaagggcgt tgagctgaag tcaggataca aagattggat actatggatt 2460
tcctttgcca tatcatgttt tttgctttgt gttgctttgt tggggttcat catgtgggcc 2520
tgccaaaaag gcaacattag gtgcaacatt tgcatttgaa ggcctatttt ctttagtttg 2580
aatttactgt tattcggtgt gcatttctat gtttggtgag cggttttctg tgctcagagt 2640
gtgtttattt tatgtaattt aatttctttg tgagctcctg tttagcaggt cgtcccttca 2700
gcaaggacac aaaaagattt taattttatt aaaaaaaaaa aaaaaaaaga ccgggaattc 2760
gatatcaagc ttatcgacct gcagatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat 2820
tgaatcctgt tgccggtctt gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc 2880
atgtaataat taacatgtaa tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag 2940
tcccgcaatt atacatttaa tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata 3000
aattatcgcg cgcggtgtca tctatgttac tagattctag agtctcaagc ttcggcgcgc 3060
с 3061 <210>
<220>
<223>
109
3085
ДНК
Искусственная последовательность
Конструкция 736, от Рас! до Asci
109 <400>
ttaattaaga attcgagctc caccgcggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct
- 198 034733
gtcactttat tgagaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 120
ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 180
cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 240
attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 300
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gtattaaaat cttaataggt 360
tttgataaaa gcgaacgtgg ggaaacccga accaaacctt cttctaaact ctctctcatc 420
tctcttaaag caaacttctc tcttgtcttt cttgcgtgag cgatcttcaa cgttgtcaga 480
tcgtgcttcg gcaccagtac aacgttttct ttcactgaag cgaaatcaaa gatctctttg 540
tggacacgta gtgcggcgcc attaaataac gtgtacttgt cctattcttg tcggtgtggt 600
cttgggaaaa gaaagcttgc tggaggctgc tgttcagccc catacattac ttgttacgat 660
tctgctgact ttcggcgggt gcaatatctc tacttctgct tgacgaggta ttgttgcctg 720
tacttctttc ttcttcttct tgctgattgg ttctataaga aatctagtat tttctttgaa 780
acagagtttt cccgtggttt tcgaacttgg agaaagattg ttaagcttct gtatattctg 840
cccaaatttg tcgggcccat ggcgaaaaac gttgcgattt tcggcttatt gttttctctt 900
cttgtgttgg ttccttctca gatcttcgct caaaaacttc ccggaaatga caacagcacg 960
gcaacgctgt gccttgggca ccatgcagta ccaaacggaa cgatagtgaa aacaatcacg 1020
aatgaccaaa ttgaagttac taatgctact gagctggttc agagttcctc aacaggtgaa 1080
atatgcgaca gtcctcatca gatccttgat ggagaaaact gcacactaat agatgctcta 1140
ttgggagacc ctcagtgtga tggcttccaa aataagaaat gggacctttt tgttgaacgc 1200
agcaaagcct acagcaactg ttacccttat gatgtgccgg attatgcctc ccttaggtca 1260
ctagttgcct catccggcac actggagttt aacaatgaaa gtttcaattg gactggagtc 1320
actcaaaacg gaacaagctc tgcttgcata aggagatcta ataacagttt ctttagtaga 1380
ttgaattggt tgacccactt aaaattcaaa tacccagcat tgaacgtgac tatgccaaac 1440
aatgaaaaat ttgacaaatt gtacatttgg ggggttcacc acccgggtac ggacaatgac 1500
caaatcttcc tgtatgctca agcatcagga agaatcacag tctctaccaa aagaagccaa 1560
caaactgtaa tcccgaatat cggatctaga cccagagtaa ggaatatccc cagcagaata 1620
agcatctatt ggacaatagt aaaaccggga gacatacttt tgattaacag cacagggaat 1680
ctaattgctc ctaggggtta cttcaaaata cgaagtggga aaagctcaat aatgagatca 1740
gatgcaccca ttggcaaatg caattctgaa tgcatcactc caaacggaag cattcccaat 1800
gacaaaccat tccaaaatgt aaacaggatc acatacgggg cctgtcccag atatgttaag 1860
caaaacactc tgaaattggc aacagggatg cgaaatgtac cagagaaaca aactagaggc 1920
- 199 034733
atatttggcg caatcgcggg tttcatagaa aatggttggg agggaatggt ggatggttgg 1980
tatggtttca ggcatcaaaa ttctgaggga ataggacaag cagcagatct caaaagcact 2040
caagcagcaa tcgatcaaat caatgggaag ctgaataggt tgatcgggaa aaccaacgag 2100
aaattccatc agattgaaaa agagttctca gaagtcgaag ggagaatcca ggaccttgag 2160
aaatatgttg aggacaccaa aatagatctc tggtcataca acgcggagct tcttgttgcc 2220
ctggagaacc aacatacaat tgatctaact gactcagaaa tgaacaaact gtttgaaaaa 2280
acaaagaagc aactgaggga aaatgctgag gatatgggca atggttgttt caaaatatac 2340
cacaaatgtg acaatgcctg cataggatca atcagaaatg gaacttatga ccacgatgta 2400
tacagagatg aagcattaaa caaccggttc cagatcaagg gcgttgagct gaagtcagga 2460
tacaaagatt ggatactatg gatttccttt gccatatcat gttttttgct ttgtgttgct 2520
ttgttggggt tcatcatgtg ggcctgccaa aaaggcaaca ttaggtgcaa catttgcatt 2580
tgaaggccta ttttctttag tttgaattta ctgttattcg gtgtgcattt ctatgtttgg 2640
tgagcggttt tctgtgctca gagtgtgttt attttatgta atttaatttc tttgtgagct 2700
cctgtttagc aggtcgtccc ttcagcaagg acacaaaaag attttaattt tattaaaaaa 2760
aaaaaaaaaa aagaccggga attcgatatc aagcttatcg acctgcagat cgttcaaaca 2820
tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat 2880
aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta 2940
tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca 3000
aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatt 3060
ctagagtctc aagcttcggc gcgcc 3085
<210> ПО <211> 46 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ApI-HBF.c <400> 110 ttgtcgggcc catgaaggca ataattgtac tactcatggt agtaac
<210> <211> <212> <213> 111 46 ДНК Искусственная последовательность
<220> <223> StuI-HBF.r
<400> 111
- 200 034733 aaaataggcc tttatagaca gatggagcat gaaacgttgt ctctgg 46 <210> 112 <211> 3115 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность' <220>
<223> Конструкция 738 от Pad до Asci <400> 112
ttaattaaga attcgagctc caccgcggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 60
gtcactttat tgagaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 120
ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 180
cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 240
attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 300
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gtattaaaat cttaataggt 360
tttgataaaa gcgaacgtgg ggaaacccga accaaacctt cttctaaact ctctctcatc 420
tctcttaaag caaacttctc tcttgtcttt cttgcgtgag cgatcttcaa cgttgtcaga 480
tcgtgcttcg gcaccagtac aacgttttct ttcactgaag cgaaatcaaa gatctctttg 540
tggacacgta gtgcggcgcc attaaataac gtgtacttgt cctattcttg tcggtgtggt 600
cttgggaaaa gaaagcttgc tggaggctgc tgttcagccc catacattac ttgttacgat 660
tctgctgact ttcggcgggt gcaatatctc tacttctgct tgacgaggta ttgttgcctg 720
tacttctttc ttcttcttct tgctgattgg ttctataaga aatctagtat tttctttgaa 780
acagagtttt cccgtggttt tcgaacttgg agaaagattg ttaagcttct gtatattctg 840
cccaaatttg tcgggcccat gaaggcaata attgtactac tcatggtagt aacatccaat 900
gcagatcgaa tctgcactgg aataacatct tcaaactcac ctcatgtggt caaaacagcc 960
actcaagggg aggtcaatgt gactggtgtg ataccactaa caacaacacc aacaaaatct 1020
tattttgcaa atctcaaagg aacaaggacc agagggaaac tatgcccaga ctgtctcaac 1080
tgcacagatc tggatgtggc tttgggcaga ccaatgtgtg tggggaccac accttcggcg 1140
aaggcttcaa tactccacga agtcaaacct gttacatccg ggtgctttcc tataatgcac 1200
gacagaacaa aaatcaggca actacccaat cttctcagag gatatgaaaa tatcaggcta 1260
tcaacccaaa acgtcatcga tgcggaaaag gcaccaggag gaccctacag acttggaacc 1320
tcaggatctt gccctaacgc taccagtaag agcggatttt tcgcaacaat ggcttgggct 1380
gtcccaaagg acaacaacaa aaatgcaacg aacccactaa cagtagaagt accatacatt 1440
tgtacagaag gggaagacca aatcactgtt tgggggttcc attcagataa caaaacccaa 1500
- 201 034733
atgaagaacc tctatggaga ctcaaatcct caaaagttca cctcatctgc taatggagta 1560
accacacact atgtttctca gattggcagc ttcccagatc aaacagaaga cggaggacta 1620
ccacaaagcg gcaggattgt tgttgattac atgatgcaaa aacctgggaa aacaggaaca 1680
attgtctacc aaagaggtgt tttgttgcct caaaaggtgt ggtgcgcgag tggcaggagc 1740
aaagtaataa aagggtcctt gcctttaatt ggtgaagcag attgccttca tgaaaaatac 1800
ggtggattaa acaaaagcaa gccttactac acaggagaac atgcaaaagc cataggaaat 1860
tgcccaatat gggtgaaaac acctttgaag ctcgccaatg gaaccaaata tagacctcct 1920
gcaaaactat taaaggaaag gggtttcttc ggagctattg ctggtttcct agaaggagga 1980
tgggaaggaa tgattgcagg ctggcacgga tacacatctc acggagcaca tggagtggca 2040
gtggcggcgg accttaagag tacgcaagaa gctataaaca agataacaaa aaatctcaat 2100
tctttgagtg agctagaagt aaagaatctt caaagactaa gtggtgccat ggatgaactc 2160
cacaacgaaa tactcgagct ggatgagaaa gtggatgatc tcagagctga cactataagc 2220
tcgcaaatag aacttgcagt cttgctttcc aacgaaggaa taataaacag tgaagatgag 2280
catctattgg cacttgagag aaaactaaag aaaatgctgg gtccctctgc tgtagagata 2340
ggaaatggat gcttcgaaac caaacacaag tgcaaccaga cctgcttaga caggatagct 2400
gctggcacct ttaatgcagg agaattttct ctccccactt ttgattcact gaacattact 2460
gctgcatctt taaatgatga tggattggat aaccatacta tactgctcta ttactcaact 2520
gctgcttcta gtttggctgt aacattgatg ctagctattt ttattgttta tatggtctcc 2580
agagacaacg tttcatgctc catctgtcta taaaggccta ttttctttag tttgaattta 2640
ctgttattcg gtgtgcattt ctatgtttgg tgagcggttt tctgtgctca gagtgtgttt 2700
attttatgta atttaatttc tttgtgagct cctgtttagc aggtcgtccc ttcagcaagg 2760
acacaaaaag attttaattt tattaaaaaa aaaaaaaaaa aagaccggga attcgatatc 2820
aagcttatcg acctgcagat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc 2880
ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa 2940
taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc 3000
aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat 3060
cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatt ctagagtctc aagcttcggc gcgcc 3115
<210> 113 <211> 3142 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция 739 от Pad до Asci
- 202 034733 <400> 113
ttaattaaga attcgagctc caccgcggaa acctcctcgg attccattgc ccagctatct 60
gtcactttat tgagaagata gtggaaaagg aaggtggctc ctacaaatgc catcattgcg 120
ataaaggaaa ggccatcgtt gaagatgcct ctgccgacag tggtcccaaa gatggacccc 180
cacccacgag gagcatcgtg gaaaaagaag acgttccaac cacgtcttca aagcaagtgg 240
attgatgtga tatctccact gacgtaaggg atgacgcaca atcccactat ccttcgcaag 300
acccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gtattaaaat cttaataggt 360
tttgataaaa gcgaacgtgg ggaaacccga accaaacctt cttctaaact ctctctcatc 420
tctcttaaag caaacttctc tcttgtcttt cttgcgtgag cgatcttcaa cgttgtcaga 480
tcgtgcttcg gcaccagtac aacgttttct ttcactgaag cgaaatcaaa gatctctttg 540
tggacacgta gtgcggcgcc attaaataac gtgtacttgt cctattcttg tcggtgtggt 600
cttgggaaaa gaaagcttgc tggaggctgc tgttcagccc catacattac ttgttacgat 660
tctgctgact ttcggcgggt gcaatatctc tacttctgct tgacgaggta ttgttgcctg 720
tacttctttc ttcttcttct tgctgattgg ttctataaga aatctagtat tttctttgaa 780
acagagtttt cccgtggttt tcgaacttgg agaaagattg ttaagcttct gtatattctg 840
cccaaatttg tcgggcccat ggcgaaaaac gttgcgattt tcggcttatt gttttctctt 900
cttgtgttgg ttccttctca gatcttcgct gatcgaatct gcactggaat aacatcttca 960
aactcacctc atgtggtcaa aacagccact caaggggagg tcaatgtgac tggtgtgata 1020
ccactaacaa caacaccaac aaaatcttat tttgcaaatc tcaaaggaac aaggaccaga 1080
gggaaactat gcccagactg tctcaactgc acagatctgg atgtggcttt gggcagacca 1140
atgtgtgtgg ggaccacacc ttcggcgaag gcttcaatac tccacgaagt caaacctgtt 1200
acatccgggt gctttcctat aatgcacgac agaacaaaaa tcaggcaact acccaatctt 1260
ctcagaggat atgaaaatat caggctatca acccaaaacg tcatcgatgc ggaaaaggca 1320
ccaggaggac cctacagact tggaacctca ggatcttgcc ctaacgctac cagtaagagc 1380
ggatttttcg caacaatggc ttgggctgtc ccaaaggaca acaacaaaaa tgcaacgaac 1440
ccactaacag tagaagtacc atacatttgt acagaagggg aagaccaaat cactgtttgg 1500
gggttccatt cagataacaa aacccaaatg aagaacctct atggagactc aaatcctcaa 1560
aagttcacct catctgctaa tggagtaacc acacactatg tttctcagat tggcagcttc 1620
ccagatcaaa cagaagacgg aggactacca caaagcggca ggattgttgt tgattacatg 1680
atgcaaaaac ctgggaaaac aggaacaatt gtctaccaaa gaggtgtttt gttgcctcaa 1740
aaggtgtggt gcgcgagtgg caggagcaaa gtaataaaag ggtccttgcc tttaattggt 1800
- 203 034733
gaagcagatt gccttcatga aaaatacggt ggattaaaca aaagcaagcc ttactacaca 1860
ggagaacatg caaaagccat aggaaattgc ccaatatggg tgaaaacacc tttgaagctc 1920
gccaatggaa ccaaatatag acctcctgca aaactattaa aggaaagggg tttcttcgga 1980
gctattgctg gtttcctaga aggaggatgg gaaggaatga ttgcaggctg gcacggatac 2040
acatctcacg gagcacatgg agtggcagtg gcggcggacc ttaagagtac gcaagaagct 2100
ataaacaaga taacaaaaaa tctcaattct ttgagtgagc tagaagtaaa gaatcttcaa 2160
agactaagtg gtgccatgga tgaactccac aacgaaatac tcgagctgga tgagaaagtg 2220
gatgatctca gagctgacac tataagctcg caaatagaac ttgcagtctt gctttccaac 2280
gaaggaataa taaacagtga agatgagcat ctattggcac ttgagagaaa actaaagaaa 2340
atgctgggtc cctctgctgt agagatagga aatggatgct tcgaaaccaa acacaagtgc 2400
aaccagacct gcttagacag gatagctgct ggcaccttta atgcaggaga attttctctc 2460
cccacttttg attcactgaa cattactgct gcatctttaa atgatgatgg attggataac 2520
catactatac tgctctatta ctcaactgct gcttctagtt tggctgtaac attgatgcta 2580
gctattttta ttgtttatat ggtctccaga gacaacgttt catgctccat ctgtctataa 2640
aggcctattt tctttagttt gaatttactg ttattcggtg tgcatttcta tgtttggtga 2700
gcggttttct gtgctcagag tgtgtttatt ttatgtaatt taatttcttt gtgagctcct 2760
gtttagcagg tcgtcccttc agcaaggaca caaaaagatt ttaattttat taaaaaaaaa 2820
aaaaaaaaag accgggaatt cgatatcaag cttatcgacc tgcagatcgt tcaaacattt 2880
ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt atcatataat 2940
ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg ttatttatga 3000
gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata gaaaacaaaa 3060
tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta ctagattcta 3120
gagtctcaag cttcggcgcg cc 3142
<210> 114
<211> 1272
<212> ДНК
<213> Medicago sativa
<400> 114
atgtttgggc gcggaccaac aaggaagagt gataacacca aatattacga tattcttggt gtttcaaaaa gtgctagtga agatgaaatc aagaaagcct atagaaaggc agcgatgaag
120 aaccatccag ataagggtgg ggatcctgag aagttcaagg agttgggcca agcatatgaa
180 gtgttgagcg atcctgaaaa gaaagaactg tatgatcaat atggtgaaga tgcccttaaa
240
- 204 034733
gaaggaatgg ggggaggcgc aggaagctca tttcataatc cgtttgatat tttcgaatca 300
ttttttggtg caggctttgg tggtggtggt ccttcacgcg caagaagaca gaagcaagga 360
gaagatgtgg tgcattctat aaaggtttcc ttggaggatg tgtataacgg cactacaaag 420
aagctatcac tttctaggaa tgcactgtgc tcaaaatgta aagggaaagg ttcaaaaagt 480
ggaactgctg gaaggtgttt tggatgccag ggcacaggta tgaagattac cagaaggcaa 540
attggactgg gcatgattca acaaatgcaa cacgtctgtc ctgactgcaa aggaacaggc 600
gaggtcatta gtgagagaga tagatgccct caatgcaagg gaaacaagat tactcaagaa 660
aagaaggtgc tggaggtgca tgtggaaaag gggatgcagc agggtcacaa gattgtattc 720
gaaggacaag ctgatgaagc tcctgataca atcacaggag acatagtttt tgtcttgcaa 780
gtaaagggac atccgaagtt tcggagggag cgtgatgacc tccacattga acacaatttg 840
agcttaactg aggctctctg tggcttccag tttaatgtca cacatcttga tggaaggcaa 900
ctattggtca aatcgaaccc cggcgaagtc atcaagccag gtcaacataa agctataaat 960
gatgagggaa tgccacaaca tggtaggccg ttcatgaagg gacgcctata catcaagttt 1020
agtgttgatt tcccggattc gggttttctt tccccaagcc aaagcctgga attagaaaag 1080
atattacctc aaaagacaag caagaacttg tcccaaaagg aggtagatga ttgtgaggag 1140
accaccctgc atgatgtcaa tattgcagag gagatgagtc gaaagaagca acaataccgt 1200
gaggcatatg atgacgatga tgatgaagat gatgagcact cgcagcctcg ggtgcaatgc 1260
gctcaacagt ag 1272
<210> 115
ДНК
Искусственная последовательность <213>
Hsp-40Luz.1С
115 <400> atgtttgggc gcggaccaac <210> 116 <211> 31 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Hsp40Luz-SacI.1272г <400>116 agctgagctc ctactgttga gcgcattgca с <210>117 <211>36 <212> ДНК
- 205 034733 <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Hsp40Luz-Plasto.г <400>117 gttggtccgc gcccaaacat tttctctcaa gatgat36 <210>118 <211>21 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Hsp70Ara.lc <400>118 atgtcgggta aaggagaagg a21 <210>119 <211>33 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Hsp70Ara-SacI.1956r <400>119 agctgagctc ttagtcgacc tcctcgatct tag33 <210>120 <211>37 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Hsp70Ara-Plasto.r <400> 120 tccttctcct ttacccgaca ttttctctca agatgat 37
<210> 121
<211> 4402
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конструкция R850 от Hindlll до EcoRI
<400> 121
aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccccgg gctggtctgt acattcatct 60
tgccgccttt gcattcactt ggccacaaag agtagagaga aggaagagaa gagcccagac 120
ttcaagaagc gaccttgcaa gtgcactcga gggtcagaaa ctgtatatca tatctatgtg 180
agagaaaggg gaacatttga gatggagtcc atttacttga ggtatactta ttattttgat 240
caataaattt gtatacttct tatttagatc aataaatttg tcattaagct ataatccaaa 300
ataaattacg atcaaatatg caaatgttag ccagtacttg tgttaaactt gatggcatct 360
- 206 034733
cttggtttct ttggcaatca catgcctaag aaataaatag tatcatatga ttgtgtttgg 420
tcagacttca gagtcagatg actctgtttg gataaacagc ttaattaagc gcttatagaa 480
tatcatatga ttgtgtttgg tcagacttca gagcatctct tggtttctct ggcaatcata 540
tgcctaagaa ataaatagta tcatatgatt gtgtttggtc agacttcaga gtcagatgac 600
cctgtttggg taaacagctt aattaagtgc ttatagaata agcgcttatc atataagtgc 660
ttttgtacag ttatttctat gaaagtagaa gaaatagtca tattgtttta atataagcta 720
tcctggagag cttgtggaaa taaccagaaa agaacttatg gacacgtcat gagctgttta 780
cataagatct ccctaacagt ctcaaaagtg tttatgccag tagataaatt caaataagtc 840
aatctaaaca gaccctaaat ccattatggt acctatcatt ttagcttatt ccatctttat 900
taagaatgtc atgagataac ataatgataa cacattattt tgacacaaat gggcagatct 960
agcaatttaa ctctggagtc cttcaagact gctgttctta cgaagttcac gtccctgaat 1020
catgttcctg tatggaagcc tgaaagacct caaattctaa aaggtggcga taaattgaag 1080
gtttacaaaa tataccctgc gggcttgaca cagaggcaag ctctttatac cttccagttc 1140
aacggggatg ttgatttcag aagtcacttg gagagcaatc cttgtgccaa gtttgaagta 1200
atttttgtgt agcatatgtt gagctaccta caatttacat gatcacctag cattagctct 1260
ttcacttaac tgagagaatg aagttttagg aatgagtatg accatggagt cggcatggct 1320
ttgtaatgcc taccctactt tggccaactc atcggggatt tacattcaga aaatatacat 1380
gacttcaacc atacttaaac ccctttttgt aagataactg aatgttcata tttaatgttg 1440
ggttgtagtg tttttacttg attatatcca gacagttaca agttggacaa caagattgtg 1500
ggtctgtact gttatttatt tatttttttt ttagcagaaa caccttatct tttgtttcgt 1560
ttgaatgtag aatgaaaata aaagaaagaa aatataacat catcggccgc gcttgtctaa 1620
tttcgggcag ttaggatcct ctccggtcac cggaaagttt cagtagaaga aacaaaacac 1680
cgtgactaaa atgatactat tattttattt attgtgtttt tcttttttct accggaactt 1740
tttagaacgg atcccaactc gttccggggc cgctacaact gaaacaaaag aagatatttt 1800
ctctctcttc agaaatgtaa gttttccttt acagataccc attcaccatt tgattcagat 1860
gtggtgacta gagataaagc atactaattt gactcttgga aacccataaa gtttatgtta 1920
tccgtgttct ggaccaatcc acttgggggc ataacctgtg tctatgtgtg gtttggtttc 1980
cattctgatt tatgcggcga cttgtaattt aaaatctagg aggggcagac attgaacaat 2040
cccaatattt taataactta tgcaagattt tttttattaa tgagatgatg tgtttgtgac 2100
tgagattgag tcatacattt cactaagaaa tggttccaag taccaaacta tcatgaccca 2160
- 207 034733
gttgcaaaca tgacgttcgg gagtggtcac tttgatagtt caatttcatc ttggcttctt 2220
attcctttta taattctaat tcttcttgtg taaactattt catgtattat ttttctttaa 2280
aatttacatg tcatttattt tgcctcacta actcaatttt gcatataaca atgataagtg 2340
atattttgac tcacaaaatt tacatcaaat ttcgacatcg tttattatgt tcattggatg 2400
attaacaaat ataacaaact ttgcaactaa ttaaccacca actgaatata attaactata 2460
actgtgaaag tagttaactc atttttatat ttcatagatc aaataagaga aataacggta 2520
tattaatccc tccaaaaaaa aaaaacggta tatttactaa aaaatctaag ccacgtagga 2580
ggataacagg atccccgtag gaggataaca tccaatccaa ccaatcacaa caatcctgat 2640
gagataaccc actttaagcc cacgcatctg tggcacatct acattatcta aatcacacat 2700
tcttccacac atctgagcca cacaaaaacc aatccacatc tttatcaccc attctataaa 2760
aaatcacact ttgtgagtct acactttgat tcccttcaaa cacatacaaa gagaagagac 2820
taattaatta attaatcatc ttgagagaaa atgtttgggc gcggaccaac aaggaagagt 2880
gataacacca aatattacga tattcttggt gtttcaaaaa gtgctagtga agatgaaatc 2940
aagaaagcct atagaaaggc agcgatgaag aaccatccag ataagggtgg ggatcctgag 3000
aagttcaagg agttgggcca agcatatgaa gtgttgagcg atcctgaaaa gaaagaactg 3060
tatgatcaat atggtgaaga tgcccttaaa gaaggaatgg ggggaggcgc aggaagctca 3120
tttcataatc cgtttgatat tttcgaatca ttttttggtg caggctttgg tggtggtggt 3180
ccttcacgcg caagaagaca gaagcaagga gaagatgtgg tgcattctat aaaggtttcc 3240
ttggaggatg tgtataacgg cactacaaag aagctatcac tttctaggaa tgcactgtgc 3300
tcaaaatgta aagggaaagg ttcaaaaagt ggaactgctg gaaggtgttt tggatgccag 3360
ggcacaggta tgaagattac cagaaggcaa attggactgg gcatgattca acaaatgcaa 3420
cacgtctgtc ctgactgcaa aggaacaggc gaggtcatta gtgagagaga tagatgccct 3480
caatgcaagg gaaacaagat tactcaagaa aagaaggtgc tggaggtgca tgtggaaaag 3540
gggatgcagc agggtcacaa gattgtattc gaaggacaag ctgatgaagc tcctgataca 3600
atcacaggag acatagtttt tgtcttgcaa gtaaagggac atccgaagtt tcggagggag 3660
cgtgatgacc tccacattga acacaatttg agcttaactg aggctctctg tggcttccag 3720
tttaatgtca cacatcttga tggaaggcaa ctattggtca aatcgaaccc cggcgaagtc 3780
atcaagccag gtcaacataa agctataaat gatgagggaa tgccacaaca tggtaggccg 3840
ttcatgaagg gacgcctata catcaagttt agtgttgatt tcccggattc gggttttctt 3900
tccccaagcc aaagcctgga attagaaaag atattacctc aaaagacaag caagaacttg 3960
tcccaaaagg aggtagatga ttgtgaggag accaccctgc atgatgtcaa tattgcagag 4020
- 208 034733
gagatgagtc gaaagaagca acaataccgt gaggcatatg atgacgatga tgatgaagat 4080
gatgagcact cgcagcctcg ggtgcaatgc gctcaacagt aggagctcag ctcgaatttc 4140
cccgatcgtt caaacatttg gcaataaagt ttcttaagat tgaatcctgt tgccggtctt 4200
gcgatgatta tcatataatt tctgttgaat tacgttaagc atgtaataat taacatgtaa 4260
tgcatgacgt tatttatgag atgggttttt atgattagag tcccgcaatt atacatttaa 4320
tacgcgatag aaaacaaaat atagcgcgca aactaggata aattatcgcg cgcggtgtca 4380
tctatgttac tagatcgaat tc 4402
<210> 122
<211> 5086
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Конструкция R860 от Hind III до EcoRI
<400> 122
aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccccgg gctggtctgt acattcatct 60
tgccgccttt gcattcactt ggccacaaag agtagagaga aggaagagaa gagcccagac 120
ttcaagaagc gaccttgcaa gtgcactcga gggtcagaaa ctgtatatca tatctatgtg 180
agagaaaggg gaacatttga gatggagtcc atttacttga ggtatactta ttattttgat 240
caataaattt gtatacttct tatttagatc aataaatttg tcattaagct ataatccaaa 300
ataaattacg atcaaatatg caaatgttag ccagtacttg tgttaaactt gatggcatct 360
cttggtttct ttggcaatca catgcctaag aaataaatag tatcatatga ttgtgtttgg 420
tcagacttca gagtcagatg actctgtttg gataaacagc ttaattaagc gcttatagaa 480
tatcatatga ttgtgtttgg tcagacttca gagcatctct tggtttctct ggcaatcata 540
tgcctaagaa ataaatagta tcatatgatt gtgtttggtc agacttcaga gtcagatgac 600
cctgtttggg taaacagctt aattaagtgc ttatagaata agcgcttatc atataagtgc 660
ttttgtacag ttatttctat gaaagtagaa gaaatagtca tattgtttta atataagcta 720
tcctggagag cttgtggaaa taaccagaaa agaacttatg gacacgtcat gagctgttta 780
cataagatct ccctaacagt ctcaaaagtg tttatgccag tagataaatt caaataagtc 840
aatctaaaca gaccctaaat ccattatggt acctatcatt ttagcttatt ccatctttat 900
taagaatgtc atgagataac ataatgataa cacattattt tgacacaaat gggcagatct 960
agcaatttaa ctctggagtc cttcaagact gctgttctta cgaagttcac gtccctgaat 1020
catgttcctg tatggaagcc tgaaagacct caaattctaa aaggtggcga taaattgaag 1080
gtttacaaaa tataccctgc gggcttgaca cagaggcaag ctctttatac cttccagttc 1140
- 209 034733
aacggggatg ttgatttcag aagtcacttg gagagcaatc cttgtgccaa gtttgaagta 1200
atttttgtgt agcatatgtt gagctaccta caatttacat gatcacctag cattagctct 1260
ttcacttaac tgagagaatg aagttttagg aatgagtatg accatggagt cggcatggct 1320
ttgtaatgcc taccctactt tggccaactc atcggggatt tacattcaga aaatatacat 1380
gacttcaacc atacttaaac ccctttttgt aagataactg aatgttcata tttaatgttg 1440
ggttgtagtg tttttacttg attatatcca gacagttaca agttggacaa caagattgtg 1500
ggtctgtact gttatttatt tatttttttt ttagcagaaa caccttatct tttgtttcgt 1560
ttgaatgtag aatgaaaata aaagaaagaa aatataacat catcggccgc gcttgtctaa 1620
tttcgggcag ttaggatcct ctccggtcac cggaaagttt cagtagaaga aacaaaacac 1680
cgtgactaaa atgatactat tattttattt attgtgtttt tcttttttct accggaactt 1740
tttagaacgg atcccaactc gttccggggc cgctacaact gaaacaaaag aagatatttt 1800
ctctctcttc agaaatgtaa gttttccttt acagataccc attcaccatt tgattcagat 1860
gtggtgacta gagataaagc atactaattt gactcttgga aacccataaa gtttatgtta 1920
tccgtgttct ggaccaatcc acttgggggc ataacctgtg tctatgtgtg gtttggtttc 1980
cattctgatt tatgcggcga cttgtaattt aaaatctagg aggggcagac attgaacaat 2040
cccaatattt taataactta tgcaagattt tttttattaa tgagatgatg tgtttgtgac 2100
tgagattgag tcatacattt cactaagaaa tggttccaag taccaaacta tcatgaccca 2160
gttgcaaaca tgacgttcgg gagtggtcac tttgatagtt caatttcatc ttggcttctt 2220
attcctttta taattctaat tcttcttgtg taaactattt catgtattat ttttctttaa 2280
aatttacatg tcatttattt tgcctcacta actcaatttt gcatataaca atgataagtg 2340
atattttgac tcacaaaatt tacatcaaat ttcgacatcg tttattatgt tcattggatg 2400
attaacaaat ataacaaact ttgcaactaa ttaaccacca actgaatata attaactata 2460
actgtgaaag tagttaactc atttttatat ttcatagatc aaataagaga aataacggta 2520
tattaatccc tccaaaaaaa aaaaacggta tatttactaa aaaatctaag ccacgtagga 2580
ggataacagg atccccgtag gaggataaca tccaatccaa ccaatcacaa caatcctgat 2640
gagataaccc actttaagcc cacgcatctg tggcacatct acattatcta aatcacacat 2700
tcttccacac atctgagcca cacaaaaacc aatccacatc tttatcaccc attctataaa 2760
aaatcacact ttgtgagtct acactttgat tcccttcaaa cacatacaaa gagaagagac 2820
taattaatta attaatcatc ttgagagaaa atgtcgggta aaggagaagg accagctatc 2880
ggtatcgatc ttggtaccac ttactcttgc gtcggagtat ggcaacacga ccgtgttgag 2940
- 210 034733
atcattgcta atgatcaagg aaacagaacc acgccatctt acgttgcttt caccgactcc 3000
gagaggttga tcggtgacgc agctaagaat caggtcgcca tgaaccccgt taacaccgtt 3060
ttcgacgcta agaggttgat cggtcgtcgt ttctctgaca gctctgttca gagtgacatg 3120
aaattgtggc cattcaagat tcaagccgga cctgccgata agccaatgat ctacgtcgaa 3180
tacaagggtg aagagaaaga gttcgcagct gaggagattt cttccatggt tcttattaag 3240
atgcgtgaga ttgctgaggc ttaccttggt gtcacaatca agaacgccgt tgttaccgtt 3300
ccagcttact tcaacgactc tcagcgtcag gctacaaagg atgctggtgt catcgctggt 3360
ttgaacgtta tgcgaatcat caacgagcct acagccgccg ctattgccta cggtcttgac 3420
aaaaaggcta ccagcgttgg agagaagaat gttcttatct tcgatcttgg tggtggcact 3480
tttgatgtct ctcttcttac cattgaagag ggtatctttg aggtgaaggc aactgctggt 3540
gacacccatc ttggtgggga agattttgac aacagaatgg ttaaccactt tgtccaagag 3600
ttcaagagga agagtaagaa ggatatcacc ggtaacccaa gagctcttag gaggttgaga 3660
acttcctgtg agagagcgaa gaggactctt tcttccactg ctcagaccac catcgagatt 3720
gactctctat acgagggtat cgacttctac tccaccatca cccgtgctag atttgaggag 3780
ctcaacatgg atctcttcag gaagtgtatg gagccagttg agaagtgtct tcgtgatgct 3840
aagatggaca agagcactgt tcatgatgtt gtccttgttg gtggttctac ccgtatccct 3900
aaggttcagc aattgctcca ggacttcttc aacggcaaag agctttgcaa gtctattaac 3960
cctgatgagg ctgttgccta cggtgctgct gtccagggag ctattctcag cggtgaagga 4020
aacgagaagg ttcaagatct tctattgctc gatgtcactc ctctctccct tggtttggaa 4080
actgccggtg gtgtcatgac cactttgatc ccaaggaaca caaccatccc aaccaagaag 4140
gaacaagtct tctccaccta ctcagacaac caacccggtg tgttgatcca ggtgtacgaa 4200
ggagagagag ccagaaccaa ggacaacaac cttcttggta aatttgagct ctccggaatt 4260
cctccagctc ctcgtggtgt cccccagatc acagtctgct ttgacattga tgccaatggt 4320
atcctcaatg tctctgctga ggacaagacc accggacaga agaacaagat caccatcacc 4380
aatgacaagg gtcgtctctc caaggatgag attgagaaga tggttcaaga ggctgagaag 4440
tacaagtccg aagacgagga gcacaagaag aaggttgaag ccaagaacgc tctcgagaac 4500
tacgcttaca acatgaggaa caccatccaa gacgagaaga ttggtgagaa gctcccggct 4560
gcagacaaga agaagatcga ggattctatt gagcaggcga ttcaatggct cgagggtaac 4620
cagttggctg aggctgatga gttcgaagac aagatgaagg aattggagag catctgcaac 4680
ccaatcattg ccaagatgta ccaaggagct ggtggtgaag ccggtggtcc aggtgcctct 4740
ggtatggacg atgatgctcc ccctgcttca ggcggtgctg gacctaagat cgaggaggtc 4800
- 211 034733
gactaagagc tcagctcgaa tttccccgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta 4860
agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt 4920
aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt 4980
agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag 5040
gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc gaattc 5086
<210> 123 <211> 9493 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> Конструкция R870 от Hind III до Eco RI <400> 123
aagcttgcat gcctgcaggt cgactctaga ggatccccgg gctggtctgt acattcatct 60
tgccgccttt gcattcactt ggccacaaag agtagagaga aggaagagaa gagcccagac 120
ttcaagaagc gaccttgcaa gtgcactcga gggtcagaaa ctgtatatca tatctatgtg 180
agagaaaggg gaacatttga gatggagtcc atttacttga ggtatactta ttattttgat 240
caataaattt gtatacttct tatttagatc aataaatttg tcattaagct ataatccaaa 300
ataaattacg atcaaatatg caaatgttag ccagtacttg tgttaaactt gatggcatct 360
cttggtttct ttggcaatca catgcctaag aaataaatag tatcatatga ttgtgtttgg 420
tcagacttca gagtcagatg actctgtttg gataaacagc ttaattaagc gcttatagaa 480
tatcatatga ttgtgtttgg tcagacttca gagcatctct tggtttctct ggcaatcata 540
tgcctaagaa ataaatagta tcatatgatt gtgtttggtc agacttcaga gtcagatgac 600
cctgtttggg taaacagctt aattaagtgc ttatagaata agcgcttatc atataagtgc 660
ttttgtacag ttatttctat gaaagtagaa gaaatagtca tattgtttta atataagcta 720
tcctggagag cttgtggaaa taaccagaaa agaacttatg gacacgtcat gagctgttta 780
cataagatct ccctaacagt ctcaaaagtg tttatgccag tagataaatt caaataagtc 840
aatctaaaca gaccctaaat ccattatggt acctatcatt ttagcttatt ccatctttat 900
taagaatgtc atgagataac ataatgataa cacattattt tgacacaaat gggcagatct 960
agcaatttaa ctctggagtc cttcaagact gctgttctta cgaagttcac gtccctgaat 1020
catgttcctg tatggaagcc tgaaagacct caaattctaa aaggtggcga taaattgaag 1080
gtttacaaaa tataccctgc gggcttgaca cagaggcaag ctctttatac cttccagttc 1140
aacggggatg ttgatttcag aagtcacttg gagagcaatc cttgtgccaa gtttgaagta 1200
atttttgtgt agcatatgtt gagctaccta caatttacat gatcacctag cattagctct 1260
- 212 034733
ttcacttaac tgagagaatg aagttttagg aatgagtatg accatggagt cggcatggct 1320
ttgtaatgcc taccctactt tggccaactc atcggggatt tacattcaga aaatatacat 1380
gacttcaacc atacttaaac ccctttttgt aagataactg aatgttcata tttaatgttg 1440
ggttgtagtg tttttacttg attatatcca gacagttaca agttggacaa caagattgtg 1500
ggtctgtact gttatttatt tatttttttt ttagcagaaa caccttatct tttgtttcgt 1560
ttgaatgtag aatgaaaata aaagaaagaa aatataacat catcggccgc gcttgtctaa 1620
tttcgggcag ttaggatcct ctccggtcac cggaaagttt cagtagaaga aacaaaacac 1680
cgtgactaaa atgatactat tattttattt attgtgtttt tcttttttct accggaactt 1740
tttagaacgg atcccaactc gttccggggc cgctacaact gaaacaaaag aagatatttt 1800
ctctctcttc agaaatgtaa gttttccttt acagataccc attcaccatt tgattcagat 1860
gtggtgacta gagataaagc atactaattt gactcttgga aacccataaa gtttatgtta 1920
tccgtgttct ggaccaatcc acttgggggc ataacctgtg tctatgtgtg gtttggtttc 1980
cattctgatt tatgcggcga cttgtaattt aaaatctagg aggggcagac attgaacaat 2040
cccaatattt taataactta tgcaagattt tttttattaa tgagatgatg tgtttgtgac 2100
tgagattgag tcatacattt cactaagaaa tggttccaag taccaaacta tcatgaccca 2160
gttgcaaaca tgacgttcgg gagtggtcac tttgatagtt caatttcatc ttggcttctt 2220
attcctttta taattctaat tcttcttgtg taaactattt catgtattat ttttctttaa 2280
aatttacatg tcatttattt tgcctcacta actcaatttt gcatataaca atgataagtg 2340
atattttgac tcacaaaatt tacatcaaat ttcgacatcg tttattatgt tcattggatg 2400
attaacaaat ataacaaact ttgcaactaa ttaaccacca actgaatata attaactata 2460
actgtgaaag tagttaactc atttttatat ttcatagatc aaataagaga aataacggta 2520
tattaatccc tccaaaaaaa aaaaacggta tatttactaa aaaatctaag ccacgtagga 2580
ggataacagg atccccgtag gaggataaca tccaatccaa ccaatcacaa caatcctgat 2640
gagataaccc actttaagcc cacgcatctg tggcacatct acattatcta aatcacacat 2700
tcttccacac atctgagcca cacaaaaacc aatccacatc tttatcaccc attctataaa 2760
aaatcacact ttgtgagtct acactttgat tcccttcaaa cacatacaaa gagaagagac 2820
taattaatta attaatcatc ttgagagaaa atgtcgggta aaggagaagg accagctatc 2880
ggtatcgatc ttggtaccac ttactcttgc gtcggagtat ggcaacacga ccgtgttgag 2940
atcattgcta atgatcaagg aaacagaacc acgccatctt acgttgcttt caccgactcc 3000
gagaggttga tcggtgacgc agctaagaat caggtcgcca tgaaccccgt taacaccgtt 3060
- 213 034733
ttcgacgcta agaggttgat cggtcgtcgt ttctctgaca gctctgttca gagtgacatg 3120
aaattgtggc cattcaagat tcaagccgga cctgccgata agccaatgat ctacgtcgaa 3180
tacaagggtg aagagaaaga gttcgcagct gaggagattt cttccatggt tcttattaag 3240
atgcgtgaga ttgctgaggc ttaccttggt gtcacaatca agaacgccgt tgttaccgtt 3300
ccagcttact tcaacgactc tcagcgtcag gctacaaagg atgctggtgt catcgctggt 3360
ttgaacgtta tgcgaatcat caacgagcct acagccgccg ctattgccta cggtcttgac 3420
aaaaaggcta ccagcgttgg agagaagaat gttcttatct tcgatcttgg tggtggcact 3480
tttgatgtct ctcttcttac cattgaagag ggtatctttg aggtgaaggc aactgctggt 3540
gacacccatc ttggtgggga agattttgac aacagaatgg ttaaccactt tgtccaagag 3600
ttcaagagga agagtaagaa ggatatcacc ggtaacccaa gagctcttag gaggttgaga 3660
acttcctgtg agagagcgaa gaggactctt tcttccactg ctcagaccac catcgagatt 3720
gactctctat acgagggtat cgacttctac tccaccatca cccgtgctag atttgaggag 3780
ctcaacatgg atctcttcag gaagtgtatg gagccagttg agaagtgtct tcgtgatgct 3840
aagatggaca agagcactgt tcatgatgtt gtccttgttg gtggttctac ccgtatccct 3900
aaggttcagc aattgctcca ggacttcttc aacggcaaag agctttgcaa gtctattaac 3960
cctgatgagg ctgttgccta cggtgctgct gtccagggag ctattctcag cggtgaagga 4020
aacgagaagg ttcaagatct tctattgctc gatgtcactc ctctctccct tggtttggaa 4080
actgccggtg gtgtcatgac cactttgatc ccaaggaaca caaccatccc aaccaagaag 4140
gaacaagtct tctccaccta ctcagacaac caacccggtg tgttgatcca ggtgtacgaa 4200
ggagagagag ccagaaccaa ggacaacaac cttcttggta aatttgagct ctccggaatt 4260
cctccagctc ctcgtggtgt cccccagatc acagtctgct ttgacattga tgccaatggt 4320
atcctcaatg tctctgctga ggacaagacc accggacaga agaacaagat caccatcacc 4380
aatgacaagg gtcgtctctc caaggatgag attgagaaga tggttcaaga ggctgagaag 4440
tacaagtccg aagacgagga gcacaagaag aaggttgaag ccaagaacgc tctcgagaac 4500
tacgcttaca acatgaggaa caccatccaa gacgagaaga ttggtgagaa gctcccggct 4560
gcagacaaga agaagatcga ggattctatt gagcaggcga ttcaatggct cgagggtaac 4620
cagttggctg aggctgatga gttcgaagac aagatgaagg aattggagag catctgcaac 4680
ccaatcattg ccaagatgta ccaaggagct ggtggtgaag ccggtggtcc aggtgcctct 4740
ggtatggacg atgatgctcc ccctgcttca ggcggtgctg gacctaagat cgaggaggtc 4800
gactaagagc tcagctcgaa tttccccgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta 4860
agattgaatc ctgttgccgg tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt 4920
- 214 034733
aagcatgtaa taattaacat gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt 4980
agagtcccgc aattatacat ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag 5040
gataaattat cgcgcgcggt gtcatctatg ttactagatc gaattcgtaa tcatggtcat 5100
agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgg ggctggtctg tacattcatc ttgccgcctt 5160
tgcattcact tggccacaaa gagtagagag aaggaagaga agagcccaga cttcaagaag 5220
cgaccttgca agtgcactcg agggtcagaa actgtatatc atatctatgt gagagaaagg 5280
ggaacatttg agatggagtc catttacttg aggtatactt attattttga tcaataaatt 5340
tgtatacttc ttatttagat caataaattt gtcattaagc tataatccaa aataaattac 5400
gatcaaatat gcaaatgtta gccagtactt gtgttaaact tgatggcatc tcttggtttc 5460
tttggcaatc acatgcctaa gaaataaata gtatcatatg attgtgtttg gtcagacttc 5520
agagtcagat gactctgttt ggataaacag cttaattaag cgcttataga atatcatatg 5580
attgtgtttg gtcagacttc agagcatctc ttggtttctc tggcaatcat atgcctaaga 5640
aataaatagt atcatatgat tgtgtttggt cagacttcag agtcagatga ccctgtttgg 5700
gtaaacagct taattaagtg cttatagaat aagcgcttat catataagtg cttttgtaca 5760
gttatttcta tgaaagtaga agaaatagtc atattgtttt aatataagct atcctggaga 5820
gcttgtggaa ataaccagaa aagaacttat ggacacgtca tgagctgttt acataagatc 5880
tccctaacag tctcaaaagt gtttatgcca gtagataaat tcaaataagt caatctaaac 5940
agaccctaaa tccattatgg tacctatcat tttagcttat tccatcttta ttaagaatgt 6000
catgagataa cataatgata acacattatt ttgacacaaa tgggcagatc tagcaattta 6060
actctggagt ccttcaagac tgctgttctt acgaagttca cgtccctgaa tcatgttcct 6120
gtatggaagc ctgaaagacc tcaaattcta aaaggtggcg ataaattgaa ggtttacaaa 6180
atataccctg cgggcttgac acagaggcaa gctctttata ccttccagtt caacggggat 6240
gttgatttca gaagtcactt ggagagcaat ccttgtgcca agtttgaagt aatttttgtg 6300
tagcatatgt tgagctacct acaatttaca tgatcaccta gcattagctc tttcacttaa 6360
ctgagagaat gaagttttag gaatgagtat gaccatggag tcggcatggc tttgtaatgc 6420
ctaccctact ttggccaact catcggggat ttacattcag aaaatataca tgacttcaac 6480
catacttaaa cccctttttg taagataact gaatgttcat atttaatgtt gggttgtagt 6540
gtttttactt gattatatcc agacagttac aagttggaca acaagattgt gggtctgtac 6600
tgttatttat ttattttttt tttagcagaa acaccttatc ttttgtttcg tttgaatgta 6660
gaatgaaaat aaaagaaaga aaatataaca tcatcggccg cgcttgtcta atttcgggca 6720
- 215 034733
gttaggatcc tctccggtca ccggaaagtt tcagtagaag aaacaaaaca ccgtgactaa 6780
aatgatacta ttattttatt tattgtgttt ttcttttttc taccggaact ttttagaacg 6840
gatcccaact cgttccgggg ccgctacaac tgaaacaaaa gaagatattt tctctctctt 6900
cagaaatgta agttttcctt tacagatacc cattcaccat ttgattcaga tgtggtgact 6960
agagataaag catactaatt tgactcttgg aaacccataa agtttatgtt atccgtgttc 7020
tggaccaatc cacttggggg cataacctgt gtctatgtgt ggtttggttt ccattctgat 7080
ttatgcggcg acttgtaatt taaaatctag gaggggcaga cattgaacaa tcccaatatt 7140
ttaataactt atgcaagatt ttttttatta atgagatgat gtgtttgtga ctgagattga 7200
gtcatacatt tcactaagaa atggttccaa gtaccaaact atcatgaccc agttgcaaac 7260
atgacgttcg ggagtggtca ctttgatagt tcaatttcat cttggcttct tattcctttt 7320
ataattctaa ttcttcttgt gtaaactatt tcatgtatta tttttcttta aaatttacat 7380
gtcatttatt ttgcctcact aactcaattt tgcatataac aatgataagt gatattttga 7440
ctcacaaaat ttacatcaaa tttcgacatc gtttattatg ttcattggat gattaacaaa 7500
tataacaaac tttgcaacta attaaccacc aactgaatat aattaactat aactgtgaaa 7560
gtagttaact catttttata tttcatagat caaataagag aaataacggt atattaatcc 7620
ctccaaaaaa aaaaaacggt atatttacta aaaaatctaa gccacgtagg aggataacag 7680
gatccccgta ggaggataac atccaatcca accaatcaca acaatcctga tgagataacc 7740
cactttaagc ccacgcatct gtggcacatc tacattatct aaatcacaca ttcttccaca 7800
catctgagcc acacaaaaac caatccacat ctttatcacc cattctataa aaaatcacac 7860
tttgtgagtc tacactttga ttcccttcaa acacatacaa agagaagaga ctaattaatt 7920
aattaatcat cttgagagaa aatgtttggg cgcggaccaa caaggaagag tgataacacc 7980
aaatattacg atattcttgg tgtttcaaaa agtgctagtg aagatgaaat caagaaagcc 8040
tatagaaagg cagcgatgaa gaaccatcca gataagggtg gggatcctga gaagttcaag 8100
gagttgggcc aagcatatga agtgttgagc gatcctgaaa agaaagaact gtatgatcaa 8160
tatggtgaag atgcccttaa agaaggaatg gggggaggcg caggaagctc atttcataat 8220
ccgtttgata ttttcgaatc attttttggt gcaggctttg gtggtggtgg tccttcacgc 8280
gcaagaagac agaagcaagg agaagatgtg gtgcattcta taaaggtttc cttggaggat 8340
gtgtataacg gcactacaaa gaagctatca ctttctagga atgcactgtg ctcaaaatgt 8400
aaagggaaag gttcaaaaag tggaactgct ggaaggtgtt ttggatgcca gggcacaggt 8460
atgaagatta ccagaaggca aattggactg ggcatgattc aacaaatgca acacgtctgt 8520
cctgactgca aaggaacagg cgaggtcatt agtgagagag atagatgccc tcaatgcaag 8580
- 216 034733
ggaaacaaga ttactcaaga aaagaaggtg ctggaggtgc atgtggaaaa ggggatgcag 8640
cagggtcaca agattgtatt cgaaggacaa gctgatgaag ctcctgatac aatcacagga 8700
gacatagttt ttgtcttgca agtaaaggga catccgaagt ttcggaggga gcgtgatgac 8760
ctccacattg aacacaattt gagcttaact gaggctctct gtggcttcca gtttaatgtc 8820
acacatcttg atggaaggca actattggtc aaatcgaacc ccggcgaagt catcaagcca 8880
ggtcaacata aagctataaa tgatgaggga atgccacaac atggtaggcc gttcatgaag 8940
ggacgcctat acatcaagtt tagtgttgat ttcccggatt cgggttttct ttccccaagc 9000
caaagcctgg aattagaaaa gatattacct caaaagacaa gcaagaactt gtcccaaaag 9060
gaggtagatg attgtgagga gaccaccctg catgatgtca atattgcaga ggagatgagt 9120
cgaaagaagc aacaataccg tgaggcatat gatgacgatg atgatgaaga tgatgagcac 9180
tcgcagcctc gggtgcaatg cgctcaacag taggagctca gctcgaattt ccccgatcgt 9240
tcaaacattt ggcaataaag tttcttaaga ttgaatcctg ttgccggtct tgcgatgatt 9300
atcatataat ttctgttgaa ttacgttaag catgtaataa ttaacatgta atgcatgacg 9360
ttatttatga gatgggtttt tatgattaga gtcccgcaat tatacattta atacgcgata 9420
gaaaacaaaa tatagcgcgc aaactaggat aaattatcgc gcgcggtgtc atctatgtta 9480
ctagatcgaa ttc 9493
<210> 124
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> supP19-plasto. г
<400> 124
ccttgtatag ctcgttccat tttctctcaa gatg 34
<210> 125
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> supP19-lc
<400> 125
atggaacgag ctatacaagg 20
<210> 126
<211> 32
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> SupP19-SacI.r
<400> 126
agtcgagctc ttactcgctt tctttttcga ag 32

Claims (37)

1. Нуклеиновая кислота для экспрессии гемагглютинина (HA) вируса гриппа типа A в растении, включающая последовательность нуклеотидов, кодирующую HA вируса гриппа типа A, оперативно связанную с регуляторным элементом, который активен в растении, причем указанный регуляторный элемент содержит промотор, который активен в растении, и энхансер вируса мозаики коровьего гороха (CPMV), при этом экспрессия нуклеиновой кислоты приводит к увеличению образования HA вируса гриппа типа A по сравнению с образованием HA вируса гриппа типа A, кодируемым контрольной нуклеиновой кислотой, не содержащей энхансер CPMV.
2. Нуклеиновая кислота для экспрессии гемагглютинина (HA) вируса гриппа типа B в растении, включающая последовательность нуклеотидов, кодирующую HA вируса гриппа типа B, оперативно связанную с регуляторным элементом, который активен в растении, причем указанный регуляторный элемент содержит промотор, который активен в растении, и энхансер вируса мозаики коровьего гороха (CPMV), при этом экспрессия нуклеиновой кислоты приводит к увеличению образования HA вируса гриппа типа B по сравнению с образованием HA вируса гриппа типа B, кодируемым контрольной нуклеиновой кислотой, не содержащей энхансер CPMV.
3. Нуклеиновая кислота по п.1 или 2, где HA вируса гриппа типа A или типа B содержит нативный или ненативный сигнальный пептид.
4. Нуклеиновая кислота по п.3, где ненативный сигнальный пептид представляет собой сигнальный пептид протеиндисульфидизомеразы.
5. Нуклеиновая кислота по п.1, где HA вируса гриппа типа A выбран из H1, H2, H3, Н4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 и H16.
6. Нуклеиновая кислота по п.1, где HA вируса гриппа типа A выбран из H1, H2, H3, H5, H6, H7 и H9.
7. Нуклеиновая кислота по п.1, где последовательность нуклеотидов, кодирующая HA вируса гриппа, идентична на 70-100% последовательности нуклеотидов, выбранной из SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17,
SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:23,
SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO:36,
SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO:42,
SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47.
8. Способ получения вирусоподобных частиц (ВЧ) вируса гриппа в растении, включающий:
a) введение нуклеиновой кислоты по любому из пп.1-7 в растение или его часть путем трансформации с получением трансгенного растения или обеспечение трансгенного растения или его части, содержащей нуклеиновую кислоту по любому из пп. 1-7; и
b) инкубирование трансгенного растения или его части в условиях, подходящих для экспрессии нуклеиновой кислоты с получением ВЧ; и
c) сбор трансгенного растения или его части и очистку ВЧ, причем ВЧ содержат HA вируса гриппа и по меньшей мере один липид растительного происхождения.
9. Способ по п.8, где указанная на стадии (a) нуклеиновая кислота пригодна для временной экс прессии в растении.
10. Способ по п.8, где указанная на стадии (a) нуклеиновая кислота пригодна для стабильной экс прессии в растении.
11. Способ по любому из пп.8-10, где на стадии (a) в растение вводят вторую нуклеиновую кислоту, включающую последовательность нуклеотидов, кодирующую по меньшей мере один белок-шаперон.
12. Способ по п.11, где белки-шапероны выбирают из Hsp40 и Hsp70.
13. Способ по п.8, где размер ВЧ находится в диапазоне 80-300 нм.
14. Растение, содержащее нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-7.
15. Растение по п.14, дополнительно содержащее нуклеиновую кислоту, включающую последовательность нуклеотидов, кодирующую по меньшей мере один белок-шаперон, оперативно связанную с регуляторным элементом.
16. Растение по п.15, где белки-шапероны выбирают из Hsp40 и Hsp70.
17. Вирусоподобная частица (ВЧ), полученная способом по п.8, содержащая HA вируса гриппа типа A или HA вируса гриппа типа B и по меньшей мере один липид растительного происхождения.
18. Вирусоподобная частица по п.17, где HA вируса гриппа типа A выбран из H1, H2, H3, Н4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 и H16.
19. Вирусоподобная частица по п.18, где HA вируса гриппа типа A выбран из H1, H2, H3, H5, H6, H7 и H9.
20. Вирусоподобная частица по п.17, где HA вируса гриппа типа A или HA вируса гриппа типа B содержит N-гликаны или модифицированные N-гликаны, специфичные для растений.
21. Вирусоподобная частица по п.20, где HA вируса гриппа типа A выбран из H1, H2, H3, Н4, H5,
- 218 034733
H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 и H16.
22. Вирусоподобная частица по п.21, где HA вируса гриппа типа A выбран из H1, H2, H3, H5, H6, H7 и H9.
23. Композиция для индуцирования иммунитета против вируса гриппа типа A или вируса гриппа типа B у субъекта, содержащая эффективную дозу ВЧ по п.17 и фармацевтически приемлемый носитель.
24. Способ индуцирования иммунитета против вируса гриппа типа A или вируса гриппа типа B у субъекта, включающий введение композиции по п.23.
25. Способ по п.24, где указанную композицию вводят субъекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
26. Композиция для индуцирования иммунитета против вируса гриппа типа A или вируса гриппа типа B у субъекта, содержащая эффективную дозу ВЧ по п.20 и фармацевтически приемлемый носитель.
27. Способ индуцирования иммунитета против вируса гриппа типа A или вируса гриппа типа B у субъекта, включающий введение композиции по п.26.
28. Способ по п.27, где указанную композицию вводят субъекту перорально, внутрикожно, интраназально, внутримышечно, внутрибрюшинно, внутривенно или подкожно.
29. Нуклеиновая кислота для экспрессии гемагглютинина (HA) вируса гриппа в растении, включающая последовательность нуклеотидов SEQ ID NO: 97, 100, 101, 104, 105, 108, 109, 112 или 113, кодирующую HA вируса гриппа, и регуляторный элемент, который активен в растении, содержащий промотор, который активен в растении, и энхансер вируса мозаики коровьего гороха (CPMV).
30. Способ получения вирусоподобных частиц (ВЧ) вируса гриппа в трансгенном растении, включающий:
a) введение нуклеиновой кислоты по п.29 в растение или его часть путем трансформации с получением трансгенного растения;
b) инкубирование трансгенного растения или его части в условиях, подходящих для экспрессии нуклеиновой кислоты с получением ВЧ; и
c) сбор трансгенного растения или его части и очистку ВЧ, причем ВЧ содержат HA вируса гриппа и по меньшей мере один липид растительного происхождения.
31. Применение ВЧ по любому из пп.17-19 для получения сыворотки, содержащей антитела, специфичные против HA вируса гриппа.
32. Поликлональное антитело, полученное с использованием ВЧ по любому из пп.17-22.
33. Растительный экстракт, содержащий ВЧ, полученные способом по любому из пп.8-13 или 30.
34. Растение или растительная клетка, содержащая ВЧ, полученные способом по любому из пп.8-13 или 30.
35. Применение растительного экстракта по п.33 для индукции иммунитета к вирусу гриппа типа A или вирусу гриппа типа B у субъекта.
36. Применение по п.35, где растительный экстракт подходит для перорального введения.
37. Пищевая добавка, содержащая собранные ткани растения по п.34.
EA201001198A 2008-01-21 2009-01-12 Нуклеиновая кислота для увеличенной экспрессии гемагглютинина вируса гриппа в растении и ее применение EA034733B1 (ru)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CA002615372A CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2008-01-21 Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
US2277508P 2008-01-22 2008-01-22
PCT/CA2008/001281 WO2009009876A1 (en) 2007-07-13 2008-07-11 Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin produced within a plant
PCT/CA2009/000032 WO2009076778A1 (en) 2007-11-27 2009-01-12 Recombinant influenza virus-like particles (vlps) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin
CA2730185A CA2730185C (en) 2008-07-11 2009-07-02 Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201001198A1 EA201001198A1 (ru) 2011-06-30
EA034733B1 true EA034733B1 (ru) 2020-03-13

Family

ID=41507811

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201001198A EA034733B1 (ru) 2008-01-21 2009-01-12 Нуклеиновая кислота для увеличенной экспрессии гемагглютинина вируса гриппа в растении и ее применение

Country Status (15)

Country Link
EP (2) EP2570484B1 (ru)
JP (1) JP5921884B2 (ru)
KR (2) KR101956910B1 (ru)
CN (1) CN102272308A (ru)
AU (1) AU2009267759A1 (ru)
BR (1) BRPI0915896A2 (ru)
CA (1) CA2730185C (ru)
EA (1) EA034733B1 (ru)
ES (1) ES2525177T3 (ru)
IL (1) IL210215A (ru)
MX (1) MX2011000459A (ru)
NZ (1) NZ590144A (ru)
RU (1) RU2011105073A (ru)
SG (1) SG187500A1 (ru)
WO (1) WO2010003225A1 (ru)

Families Citing this family (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2615372A1 (en) 2007-07-13 2009-01-13 Marc-Andre D'aoust Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin
EP2610345B1 (en) 2007-11-27 2015-08-19 Medicago Inc. Recombinant influenza virus-like particles (VLPS) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin
US20110081367A1 (en) * 2008-06-14 2011-04-07 Veredus Laboratories Pte Ltd Influenza sequences
EP2294202B1 (en) 2008-07-08 2015-05-20 Medicago Inc. Soluble recombinant influenza antigens
PT2318530T (pt) 2008-07-18 2016-09-30 Medicago Inc Novo epítopo de imunização contra o vírus da gripe
US10272148B2 (en) 2009-06-24 2019-04-30 Medicago Inc. Chimeric influenza virus-like particles comprising hemagglutinin
RU2571223C2 (ru) * 2009-09-18 2015-12-20 Фронхофер Юэсэй Инк. Вирусоподобные частицы, содержащие белки-мишени, слитые с белками оболочки растительных вирусов
PT3354657T (pt) 2009-09-22 2022-05-06 Medicago Inc Método de preparação de proteínas derivadas de plantas
CN103282501A (zh) * 2010-11-04 2013-09-04 麦迪卡格公司 植物表达系统
TWI526539B (zh) 2010-12-22 2016-03-21 苜蓿股份有限公司 植物中生產類病毒顆粒(vlp)的方法及以該方法生產之vlp
TWI620816B (zh) 2011-03-23 2018-04-11 苜蓿股份有限公司 植物衍生蛋白回收方法
JP6113155B2 (ja) * 2011-06-20 2017-04-12 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ − オブ ザ コモンウェルス システム オブ ハイヤー エデュケイション 計算で最適化した広い反応性を示すｈ１ｎ１インフルエンザの抗原
DK3418300T3 (da) 2011-07-18 2020-12-07 Inst Res Biomedicine Neutralisering af anti-influenza-a-virusantistoffer og anvendelser deraf
US11390878B2 (en) 2011-09-30 2022-07-19 Medicago Inc. Increasing protein yield in plants
PT2760882T (pt) 2011-09-30 2023-08-07 Medicago Inc Aumento do rendimento de partícula semelhante a vírus em plantas
CA2855252C (en) * 2011-11-11 2023-03-07 Philip Morris Products S.A. Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin produced in nicotiana tabacum
WO2013119683A1 (en) * 2012-02-07 2013-08-15 University Of Pittsburgh - Of The Commonwealth System Of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for h3n2, h2n2, and b influenza viruses
RU2639551C2 (ru) 2012-03-30 2017-12-21 Юниверсити Оф Питтсбург - Оф Зе Коммонвэлс Систем Оф Хайе Эдьюкейшн Оптимизированные с помощью вычислительных средств антигены с широким спектром реактивности для вирусов гриппа h5n1 и h1n1
KR102134815B1 (ko) 2012-09-05 2020-07-17 메디카고 인코포레이티드 식물에서 피코르나바이러스-유사 입자 생산
US9309290B2 (en) 2012-11-27 2016-04-12 University of Pittsburgh—of the Commonwealth System of Higher Education Computationally optimized broadly reactive antigens for H1N1 influenza
CN112592389A (zh) 2013-03-28 2021-04-02 莫迪卡戈公司 植物中流感样病毒颗粒的产生
CN105980561B (zh) * 2014-01-10 2020-06-02 莫迪卡戈公司 Cpmv增强子元件
US10563213B2 (en) 2014-03-27 2020-02-18 Medicago Inc. Modified CPMV enhancer elements
EP3167057B1 (en) 2014-07-11 2020-03-25 Medicago Inc. Modifying protein production in plants
WO2016168187A1 (en) * 2015-04-13 2016-10-20 The Regents Of The University Of Michigan Virus-like particles
WO2016196846A2 (en) * 2015-06-02 2016-12-08 Sanofi Pasteur Inc. Engineered influenza antigenic polypeptides and immunogenic compositions thereof
KR20180088629A (ko) 2015-07-02 2018-08-06 메디카고 인코포레이티드 자스몬산 경로 활성화제
US10844097B2 (en) 2016-06-02 2020-11-24 Sanofi Pasteur Inc. Engineered influenza antigenic polypeptides and immunogenic compositions thereof
JP6622825B2 (ja) * 2018-01-25 2019-12-18 インスティテュート・フォー・リサーチ・イン・バイオメディシンＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａ型インフルエンザウイルス中和抗体及びその使用法
EP3814507A4 (en) * 2018-06-27 2022-07-06 Medicago Inc. INFLUENZA VIRUS HEMAGGLUTININ MUTANTS
WO2020092207A1 (en) * 2018-10-28 2020-05-07 University Of Georgia Research Foundation Broadly reactive immunogens of influenza virus, compositions, and methods of use thereof
EP3935180A4 (en) * 2019-03-06 2022-12-28 Plantform Corporation T-DNA VECTORS WITH ENGINEERED 5' SEQUENCES PRE-POST-TRANSLATIONAL MODIFICATION ENZYMES AND METHODS OF USE THEREOF
EP3938511A4 (en) 2019-03-14 2023-02-08 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation ENDOGENOUS PLANT EXPRESSION ACTIVATOR
JP2020048568A (ja) * 2019-11-22 2020-04-02 インスティテュート・フォー・リサーチ・イン・バイオメディシンＩｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ Ａ型インフルエンザウイルス中和抗体及びその使用法
US20230203101A1 (en) * 2020-04-22 2023-06-29 POSTECH Research and Business Development Foundation Coronavirus Disease 2019(COVID -19) Recombinant Spike Protein Forming Trimer, Method for Mass Producing Recombinant Spike Protein in Plants, and Method for Preparing Vaccine Composition on Basis Thereof
CN117479831A (zh) 2021-06-09 2024-01-30 南特知识产权控股有限责任公司 用于在植物中生产感兴趣的蛋白质的方法和系统
CN114891074B (zh) * 2022-05-10 2023-04-11 中山大学·深圳 一种季节性甲型流感通用病毒样颗粒及其制备方法与应用
CN115992101B (zh) * 2023-03-22 2023-07-28 深圳市卫光生物制品股份有限公司 一种流感病毒裂解疫苗原液的制备方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009008573A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Sungkyunkwan University Foundation For Corporate Collaboration An avian influenza virus vaccine and a method for preparing same

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5428147A (en) 1983-04-15 1995-06-27 Mycogen Plant Science, Inc. Octopine T-DNA promoters
US5036006A (en) 1984-11-13 1991-07-30 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US4945050A (en) 1984-11-13 1990-07-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues and apparatus therefor
US5100792A (en) 1984-11-13 1992-03-31 Cornell Research Foundation, Inc. Method for transporting substances into living cells and tissues
US4962028A (en) 1986-07-09 1990-10-09 Dna Plant Technology Corporation Plant promotors
US5232833A (en) 1988-09-14 1993-08-03 Stressgen Biotechnologies Corporation Accumulation of heat shock proteins for evaluating biological damage due to chronic exposure of an organism to sublethal levels of pollutants
US6403865B1 (en) 1990-08-24 2002-06-11 Syngenta Investment Corp. Method of producing transgenic maize using direct transformation of commercially important genotypes
UA48104C2 (ru) 1991-10-04 2002-08-15 Новартіс Аг Фрагмент днк, содержащий последовательность, которая кодирует инсектицидный протеин, оптимизированную для кукурузы, фрагмент днк, обеспечивающий направленную желательную для сердцевины стебля экспрессию связанного с ней структурного гена в растении, фрагмент днк, обеспечивающий специфическую для пыльцы экспрессию связанного с ней структурного гена в растении, рекомбинантная молекула днк, способ получения оптимизированной для кукурузы кодирующей последовательности инсектицидного протеина, способ защиты растений кукурузы по меньшей мере от одного насекомого-вредителя
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
WO2002000885A2 (en) * 2000-06-23 2002-01-03 American Cyanamid Company Assembly of wild-type and chimeric influenza virus-like particles (vlps)
BRPI0410340A (pt) * 2003-05-05 2006-05-30 Dow Agrosciences Llc vetores e células para preparar composições imunoprotetoras derivadas de plantas transgênicas
EP1635772A4 (en) 2003-05-05 2008-02-13 Dow Agrosciences Llc STERILE IMMUNOPROPHYLACTIC AND THERAPEUTIC COMPOSITIONS DERIVED FROM TRANSGENIC VEGETABLE CELLS AND METHODS OF PRODUCTION THEREOF
US8592197B2 (en) * 2003-07-11 2013-11-26 Novavax, Inc. Functional influenza virus-like particles (VLPs)
CN100410378C (zh) * 2005-05-09 2008-08-13 中国农业科学院生物技术研究所 编码禽流感血凝素的基因及其植物表达载体和应用
BRPI0613625A2 (pt) * 2005-07-19 2011-01-18 Dow Global Technologies Inc vacinas da gripe recombinantes
WO2008060669A2 (en) * 2006-04-21 2008-05-22 Dow Agrosciences Llc Vaccine for avian influenza and methods of use
US8778353B2 (en) * 2006-05-01 2014-07-15 Technovax, Inc. Influenza virus-like particle (VLP) compositions
WO2007135480A1 (en) 2006-05-22 2007-11-29 Plant Bioscience Limited Bipartite system, method and composition for the constitutive and inducible expression of high levels of foreign proteins in plants

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009008573A1 (en) * 2007-07-10 2009-01-15 Sungkyunkwan University Foundation For Corporate Collaboration An avian influenza virus vaccine and a method for preparing same

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHANDLER G.L. Influenza hemagglutinin expression in Nicotiana tabacum and Nicotiana benthamiana, M. Sc. THESIS, BAYLOR UNIVERSITY, WACO, TEXAS, August 2007 [retrieved on 22 September 2008 (22-09-2008)]. Retrieved from the Internet: https://beardocs.baylor.edu/bitstream/2104/5049/1/Lee Chandler Masters.pdf (see abstract) *
CHARLAND N. et. al. An innovative VLP-based technology to respond to global influenza vaccine needs, POSTER ABSTRACT, IDSA SEASONAL AND PANDEMIC INFLUENZA MEETING, ARLINGTON, VIRGINIA, USA, 18 May 2008 (18-05-2008) [retrieved on 22 September 2008 (22-09-2008)]. Retrieved from the Internet: www.idsociety.org/WorkArea/downloadasset.aspx?id=11384 (see abstract) *
MASON H.S. et al. Expression of Norwalk virus capsid protein in transgenic tobacco and potato and its oral immunogenicity in mice. PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, May 1996, 93:5335-5340 (see whole document) *
MUSIYCHUK K. et al. A launch vector for the production of vaccine antigens in plants, INFLUENZA, January 2007, 1:19-25 (see whole document) *
QUAN F.-S. et al. Virus-like particle vaccine induces protective immunity against homologous and heterologous strains of influenza virus, JOURNAL OF VIROLOGY, April 2007, 81:3514-3524 (see whole document) *
SHOJI Y. et al. Plant-expressed HA as a seasonal influenza vaccine candidate, VACCINE, June 2008, 26:2930-2934 (see whole document) *

Also Published As

Publication number Publication date
KR101956910B1 (ko) 2019-03-12
RU2011105073A (ru) 2012-08-20
EP2307549A4 (en) 2011-09-07
AU2009267759A1 (en) 2010-01-14
BRPI0915896A2 (pt) 2019-09-24
EP2570484A1 (en) 2013-03-20
WO2010003225A1 (en) 2010-01-14
CA2730185A1 (en) 2010-01-14
IL210215A (en) 2013-11-28
CN102272308A (zh) 2011-12-07
JP2011527180A (ja) 2011-10-27
IL210215A0 (en) 2011-03-31
SG187500A1 (en) 2013-02-28
EP2307549A1 (en) 2011-04-13
ES2525177T3 (es) 2014-12-18
KR20110034650A (ko) 2011-04-05
NZ590144A (en) 2012-11-30
MX2011000459A (es) 2011-02-23
EP2570484B1 (en) 2014-09-10
JP5921884B2 (ja) 2016-05-24
WO2010003225A8 (en) 2010-07-22
CA2730185C (en) 2016-02-09
EA201001198A1 (ru) 2011-06-30
KR20160049061A (ko) 2016-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230044454A1 (en) Recombinant influenza virus-like particles (vlps) produced in transgenic plants
KR101956910B1 (ko) 헤마글루티닌을 발현하는 트랜스제닉 식물에서 생산된 재조합 인플루엔자 바이러스-유사 입자(ＶＬＰｓ)
US11434497B2 (en) Recombinant influenza virus-like particles (VLPS) produced in transgenic plants
KR20120133371A (ko) 헤마글루티닌을 포함하는 키메라 인플루엔자 바이러스-유사 입자
KR101974017B1 (ko) 식물에서 바이러스-유사 입자 수득율을 증가시키는 방법
SG192503A1 (en) New influenza virus immunizing epitope
RU2569195C9 (ru) Химерные вирусоподобные частицы, содержащие гемагглютинин, сходные с частицами вируса гриппа
IL203018A (en) Influenza virus-like particles containing megalotinin produced in a plant
D'AOUST et al. Patent 2730185 Summary

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM