CN114891074B - 一种季节性甲型流感通用病毒样颗粒及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药技术领域，公开了一种季节性甲型流感通用病毒样颗粒及其制备方法与应用，具体公开了一种重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3或SEQ ID NO:4所示。本发明提供的重组蛋白是通过对人源H1N1和H3N2亚型流感病毒HA、NA蛋白的氨基酸序列进行筛选和分析，利用mosaic疫苗设计工具并通过遗传算法设计一种多价疫苗抗原集，具有较好的免疫原性，其CTL抗原表位较丰富，能够在昆虫细胞中高效表达。

Description

一种季节性甲型流感通用病毒样颗粒及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种季节性甲型流感通用病毒样颗粒及其制备方法与应用。
背景技术
流感是严重危害人民生命健康的重要传染病，每年流感季节性流行在全球可导致300万～500万重症病例，29万～65万例呼吸道疾病相关死亡。接种疫苗是预防流感最经济有效的手段。近年来，国外已有一些新型流感疫苗陆续上市，多项临床研究证实其能进一步提高保护效果。目前国内上市的流感疫苗均为传统鸡胚流感疫苗，其针对特殊人群和特定病毒株等的有效性尚待改善，开发新一代多价疫苗设计平台或者对流感病毒有广谱作用且提供持续免疫力的新型疫苗成为了迫切需求。
Mosaic蛋白疫苗是利用一个同源蛋白质库经过多轮重组比对获得的重组蛋白，其与天然蛋白非常相似，但对9～12个氨基酸的短肽有最大的覆盖率，因此排除了非天然和稀有“k-mers”，是目的蛋白最有代表性的变异体，以其制备的疫苗对异源毒株具有更好的交叉保护效果。该方法首先应用于HIV，但也可以应用于其他可变病原体，例如流感病毒。
病毒样颗粒(VLPs)是通过将编码病毒结构蛋白的基因插入到表达载体中，再转入原核或真核细胞中进行表达和自行组装而获得的高度结构化的空心蛋白颗粒，在形态上类似于病毒的蛋白颗粒，属于基因工程疫苗中的一种。VLPs不存在任何病毒遗传物质，不能复制，也不具备感染能力。
目前，我国上市的疫苗均以鸡胚为生产基质，由于依赖于鸡胚供应，因此在流感大流行或缺乏培育流感病毒所需的鸡胚的情况下，流感疫苗产能受到极大限制，同时部分疫苗病毒并不适合在鸡胚中生长或在鸡胚培养过程中可能会发生适应性突变引起疫苗病毒和循环病毒之间的不匹配，从而影响成品疫苗的效果,具有广谱性小、有效性低、持久性差等问题。而当前的一些流感病毒样颗粒中包含的流感结构蛋白成份均为完整的天然蛋白结构，例如天然HA蛋白和M1蛋白等共表达或共感染形成病毒样颗粒，这样的病毒样颗粒免疫原性高，但产生的免疫谱狭窄，对不同的同源毒株甚至异源毒株不能起到交叉保护作用。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种重组蛋白。
本发明第二方面的目的，在于提供一种编码本发明第一方面的重组蛋白的核酸分子。
本发明第三方面的目的，在于提供与本发明第二方面的核酸分子相关的生物材料。
本发明第四方面的目的，在于提供本发明第一方面的的重组蛋白在制备病毒样颗粒中的应用。
本发明第五方面的目的，在于提供一种病毒样颗粒。
本发明第六方面的目的，在于提供本发明第五方面的病毒样颗粒的制备方法。
本发明第七方面的目的，在于提供本发明第五方面的病毒样颗粒或第六方面的制备方法在制备甲型流感病毒疫苗中的疫苗。
本发明第八方面的目的，在于提供一种甲型流感病毒样颗粒疫苗。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
本发明第二个方面，在于提供一种编码本发明第一方面的重组蛋白的核酸分子。
优选地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。
本发明第三个方面，在于提供与本发明第二方面的核酸分子相关的生物材料，所述生物材料为(1)～(3)中任一种；
(1)表达盒，含有本发明第二方面的核酸分子；
(2)重组载体，含有本发明第二方面的核酸分子或(1)中的表达盒；
(3)重组细胞，含有本发明第二方面的核酸分子、(1)中的表达盒或(2)中的重组载体。
优选地，所述重组载体为质粒载体、病毒载体或细胞载体。
优选地，所述质粒载体可以是任选的质粒，所述病毒载体可以任选的病毒，所述细胞载体不包括繁殖材料。
优选地，所述细胞为昆虫细胞。
进一步优选地，所述昆虫细胞为Sf9昆虫细胞。
本发明第四个方面，在于提供本发明第一方面的重组蛋白在制备病毒样颗粒中的应用。
提供本发明第二方面的核酸分子在制备病毒样颗粒中的应用。
提供本发明第三方面的生物材料在制备病毒样颗粒中的应用。
提供本发明第五个方面，在于提供一种病毒样颗粒，所述病毒样颗粒包括：
(a1)H1亚型流感病毒H1N1血凝素蛋白HA、H1亚型流感病毒H1N1神经氨酸酶蛋白NA和甲型流感病毒基质蛋白M1；和/或
(b1)H3亚型流感病毒H3N2血凝素蛋白HA、H3亚型流感病毒H3N2神经氨酸酶蛋白NA和甲型流感病毒基质蛋白M1。
优选地，(a1)的病毒样颗粒命名为H1N1病毒样颗粒。
优选地，(b1)的病毒样颗粒命名为H3N2病毒样颗粒。
优选地，所述H1亚型流感病毒H1N1血凝素蛋白HA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
优选地，所述H1亚型流感病毒H1N1神经氨酸酶蛋白NA的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
优选地，所述H3亚型流感病毒H3N2血凝素蛋白HA的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
优选地，所述H3亚型流感病毒H3N2神经氨酸酶蛋白NA的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
优选地，所述甲型流感病毒基质蛋白M1为甲型流感病毒亚型株的基质蛋白M1中的一种。
进一步优选地，所述甲型流感病毒基质蛋白M1的核苷酸序列为SEQ ID NO:9所示。
本发明第六个方面，在于提供本发明第五方面的病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1、分别合成H1亚型流感病毒H1N1血凝素蛋白HA、H1亚型流感病毒H1N1神经氨酸酶蛋白NA、H3亚型流感病毒H3N2血凝素蛋白HA、H3亚型流感病毒H3N2神经氨酸酶蛋白NA和甲型流感病毒基质蛋白M1的基因；
S2、将步骤S1合成的基因分别插入到昆虫表达载体中，转化含有重组杆状病毒基因组的大肠杆菌10Bac感受态细胞，提取阳性质粒，得到整合了步骤S1所述基因的重组杆状病毒Bacmid质粒；
S3、将步骤S2制得的重组杆状病毒Bacmid质粒分别转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒；
S4、将步骤S3制得的整合了H1亚型流感病毒H1N1血凝素蛋白HA基因的重组杆状病毒、整合了H1亚型流感病毒H1N1神经氨酸酶蛋白NA基因的重组杆状病毒和整合了甲型流感病毒基质蛋白M1基因的重组杆状病毒按照一定比例转染至昆虫细胞，培养得到病毒样颗粒，命名为H1N1病毒样颗粒；和/或
将步骤S3制得的整合了H3亚型流感病毒H3N2血凝素蛋白HA基因的重组杆状病毒、整合了H3亚型流感病毒H3N2神经氨酸酶蛋白NA基因的重组杆状病毒和整合了甲型流感病毒基质蛋白M1基因的重组杆状病毒按照一定比例转染至昆虫细胞，培养得到病毒样颗粒，命名为H3N2病毒样颗粒。
优选地，所述步骤S2中所述昆虫表达载体选自AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、BacPAK6、Bac to Pac、Bacmid、p2Bac、p2Blue、BlucBacII、p89B310、pAc360、pAc373、pAcAB3、pAcAB 4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEl、pAcJPl、pAcMLF2、pAcMLF7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVP10、pJVrsMAG、pMBac、pP10、pPAKl、pPBac、pSHONEX 1.1、pSYN XIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIV VI-、pVL1391、pVL 1392、pVL 1393、pVL941、pVL 945、pVL 985、pVTBac、pBM030、pUAC-5、pFastBacDual、pFastBac1、pFastBacHT、pFastBacDual一种或两种以上的混合。
进一步优选地，所述昆虫表达载体为pFastBac-Dual。
优选地，所述步骤S3中所述昆虫细胞为Sf9昆虫细胞。
优选地，所述步骤S4中所述昆虫细胞为Sf9昆虫细胞。
优选地，所述步骤S4中，整合了H1亚型流感病毒H1N1血凝素蛋白HA基因的重组杆状病毒、整合了H1亚型流感病毒H1N1神经氨酸酶蛋白NA基因的重组杆状病毒和整合了甲型流感病毒基质蛋白M1基因的重组杆状病毒按照(4～5):(1～3):(2～3)的MOI比例转染至昆虫细胞。
优选地，所述培养的条件为25～30℃。
优选地，所述制备方法还包括纯化步骤。
优选地，所述纯化选用蔗糖密度梯度离心法。
优选地，所述蔗糖密度梯度离心法具体步骤为：将接种重组杆状病毒的昆虫细胞培养4～6天后，收集悬浮细胞培养液在4～5℃、5000～6000rpm转速下离心15～20min，收集上清；利用vivaflow2000膜包将上清进行浓缩，4～5℃、25000～35000rpm离心50～90min，收集上清；4～5℃、25000～35000rpm离心1.5～2h，弃去上清，使用PBS重悬沉淀，并置于4℃下过夜；将重悬后的溶液经过20％-30％-60％的蔗糖中以转速26000～30000rpm离心1.5～2h；分离得到30％-60％梯度间的溶液，用PBS稀释，4～5℃、26000～30000rpm离心1.5～2h，沉淀重悬后为纯化的病毒样颗粒。
本发明第七个方面，在于提供本发明第五方面的病毒样颗粒或本发明第六方面的制备方法在制备甲型流感病毒疫苗中的应用。
提供本发明第五方面的病毒样颗粒或本发明第六方面的制备方法在制备预防和/或治疗甲型流感的药物中的应用。
提供本发明第五方面的病毒样颗粒或本发明第六方面的制备方法在制备甲型流感病毒抗体检测制剂中的应用。
提供本发明第五方面的病毒样颗粒或本发明第六方面的制备方法在制备甲型流感病毒疫病监测制剂中的应用。
本发明第八个方面，在于提供一种甲型流感病毒样颗粒疫苗，包括本发明第五方面的病毒样颗粒。
优选地，所述甲型流感病毒样颗粒疫苗包括H1N1病毒样颗粒和H3N2病毒样颗粒。
优选地，所述H1N1病毒样颗粒和所述H3N2病毒样颗粒的蛋白浓度比为1:(1～2)。
优选地，所述甲型流感病毒样颗粒疫苗还包括佐剂。
本发明的有益效果是：
本发明提供的重组蛋白是通过对人源H1N1和H3N2亚型流感病毒HA、NA蛋白的氨基酸序列进行筛选和分析，利用mosaic疫苗设计工具并通过遗传算法设计一种多价疫苗抗原集，具有较好的免疫原性，其CTL抗原表位较丰富，能够在昆虫细胞中高效表达。
本发明通过对HA、NA和M1蛋白进行物种密码子优化后，利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备的病毒样颗粒，病毒蛋白产量显著高于SPF胚培养的病毒，具有生产成本低，产量高，安全性高的优点，其生产过程不依赖于鸡胚供应，因此在流感大流行或缺乏培育流感病毒所需的鸡胚的情况下，它的生产过程比鸡胚流感疫苗要快，而且不受选择适合鸡胚生长的疫苗病毒的限制。另外这一过表达程避免了病毒在鸡胚培养过程中发生适应性突变引起疫苗病毒和循环病毒之间的不匹配，从而影响成品疫苗的效果。
本发明生产流感病毒样颗粒是采用HA、NA、M1重组杆状病毒共感染昆虫细胞的方法，相较于HA、NA、M1基因串联到同一载体生产流感病毒样颗粒的方法，共感染的方式有更大的优化空间，可控的增加流感病毒样颗粒中主要靶抗原的含量以及调控各抗原含量的比例，其中，HA、NA、M1重组杆状病毒以MOI＝5:1:2共同感染昆虫细胞，所获流感病毒样颗粒血凝效价最好。
本发明提供的病毒样颗粒免疫原性好、交叉保护性好，且无生物安全风险等问题，能够应用于预防特异性流感、同型异源流感病毒及异型流感病毒方面，适应性强。
本发明提供的甲型流感病毒样颗粒疫苗能够激发机体对多种流感病毒的免疫，其免疫原性与保护效力相当甚至略高于商品疫苗。
附图说明
图1为重组质粒的构建示意图。
图2为重组质粒的电泳鉴定图；其中，A为重组质粒pFastBac-Dual-H1m的电泳鉴定图，B为重组质粒pFastBac-Dual-H3m的电泳鉴定图。
图3为重组质粒的电泳鉴定图；其中，A为重组质粒pFastBac-Dual-N1m的电泳鉴定图，B为重组质粒pFastBac-Dual-N2m的电泳鉴定图，C为重组质粒pFastBac-Dual-M1m的电泳鉴定图，图中1代表质粒，2代表经EcoRⅠ与HindⅢ酶切后的质粒，M代表KB ladder。
图4为杆状病毒重组蛋白表达的Western Blot结果图；其中，A为H1m蛋白的Western Blot结果图，B为H3m蛋白的Western Blot结果图，图中1代表P1代重组杆状病毒的细胞上清液，2代表P2代重组杆状病毒的细胞上清液，3代表P2代重组杆状病毒的细胞裂解液，4代表空白对照，M为蛋白ladder。
图5为杆状病毒重组蛋白表达的Western Blot结果图，其中，A为N1m蛋白的Western Blot结果图，B为N2m蛋白的Western Blot结果图，C为M1蛋白的Western Blot结果图，图中1代表P1代重组杆状病毒的细胞上清液，2代表P2代重组杆状病毒的细胞上清液，3代表P2代重组杆状病毒的细胞裂解液，4代表空白对照，M为蛋白ladder。
图6为H1N1 VLP的透射电镜结果图。
图7为H3N2 VLP的透射电镜结果图。
图8为VLPs中各蛋白的Western Blot结果图，其中，A为H1N1 VLP中各蛋白的Western Blot结果图，B为H3N2 VLP中各蛋白的Western Blot结果图。
图9为血凝实验的结果图。
图10为免疫第0周和第4周的各组小鼠体内的血凝抑制抗体产生情况。
图11为免疫4周后的各组小鼠体内特异性抗体产生情况，其中，A为免疫4周后小鼠针对同源A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019(H1N1)毒株IgG特异性抗体产生情况，B为免疫4周后小鼠针对同源A/HongKong/2671/2019(H3N2)毒株IgG特异性抗体产生情况，C为免疫4周后小鼠针对异源A/Guangdong/avian/0724/2017(H3N8)毒株IgG特异性抗体产生情况，D为免疫4周后小鼠针对异源A/Guangdong/avian/2751/2017(H6N2)毒株IgG特异性抗体产生情况，图中*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。
图12为免疫4周后各组小鼠的淋巴细胞分群情况。
图13为免疫4周后各组小鼠体内的中和抗体产生情况。
具体实施方式
现结合具体实施例对本发明进行详细说明，但不限制本发明的范围。
本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的材料和试剂。
实施例1 mosaic VLPs的制备
1.mosaic序列设计、优化及筛选
在GISAID数据库与NCBI数据库下载2009～2021年全部人源H1N1与H3N2的HA、NA的氨基酸序列，分别得到14816条H1氨基酸序列，18569条N1氨基酸序列，24807条H3氨基酸序列，21063条N2氨基酸序列；利用计算机算法与软件剔除重复序列与测序质量较差的序列，得到4691条H1氨基酸序列，4553条N1氨基酸序列，6581条氨基酸H3序列，5033条N2氨基酸序列；将筛选得到的氨基酸序列以FAS格式上传至Mosaic Vaccine Designer程序，设置以下参数：Cocktail Size设置为“1”，以获得1条mosaic序列供下一步使用；表位长度设置为“9”以获得涵盖较多CD8+CTL细胞表位的mosaic序列；阈值设置为“3”，以减少罕见的、在天然表位中出现次数低的稀有表位的数目；经遗传算法运算后，最终获得了一系列由9个氨基酸组成的短肽组装而成的mosaic序列；使用遗传算法依次对每个群体进行优化，其中生成新的重组体并计算测试它们的抗原表位覆盖率，通过抗原表位预测、遗传进化分析及空间构象分析后，最终获得4条最优的mosaic氨基酸序列，其氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1～4所示。
2.mosaic重组蛋白的制备
(1)依据昆虫细胞偏爱密码子优化后，通过基因合成技术获得H1m、H3m、N1m、N2m蛋白以及流感病毒M1蛋白的的编码基因，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO:5～9所示；
(2)对步骤(1)所述H1m、H3m、N1m、N2m、M1蛋白的编码基因分别与pFastBac-Dual载体的基因进行多克隆位点分析，选择pFastBac-Dual载体上提供而目的片段上没有的两个限制性内切酶位点(EcoRI、HindIII)，经过目的片段扩增酶切回收后，将目的片段分别插入pFastBac-Dual载体的pH启动子后的多克隆位点中，经大肠杆菌DH5α感受态细胞转化，分别获得含有所述H1m、H3m、N1m、N2m、M1抗原的重组质粒，即pFastBac-Dual-H1m、pFastBac-Dual-H3m、pFastBac-Dual-N1m、pFastBac-Dual-N2m和pFastBac-Dual-M1，其重组质粒的构建示意图见图1，重组质粒的电泳图2和图3所示；
(3)将步骤(2)所述获得的重组质粒(pFastBac-Dual-H1m、pFastBac-Dual-H3m、pFastBac-Dual-N1m、pFastBac-Dual-N2m和pFastBac-Dual-M1)分别经大肠杆菌DH10Bac感受态细胞转化，分别获得含有所述H1m、H3m、N1m、N2m、M1抗原的重组杆状病毒穿梭质粒，即Bacmid-H1m、Bacmid-H2m、Bacmid-N1m、Bacmid-N2m和Bacmid-M1；
(4)将步骤(3)所述的Bacmid-H1m、Bacmid-H2m、Bacmid-N1m、Bacmid-N2m、Bacmid-M1和空杆粒(作为空白对照)分别转染至生长状态良好的Sf9昆虫细胞，当细胞出现感染迹象后，收集细胞清液，即获得P0代重组杆状病毒；按照MOI(感染时病毒与细胞数量的比值，指平均每个细胞感染病毒的活性单位)＝3经过连续两次接种至生长状态良好的Sf9昆虫细胞，获得P2代重组杆状病毒，收取细胞上清液，并对细胞进行裂解后进行Western Blot检测重组蛋白的表达。
通过对P1代重组杆状病毒的细胞上清液和P2代重组杆状病毒的细胞上清液以及对其细胞进行裂解后进行Western Blot检测重组蛋白的表达，结果如图4和图5所示，P1代重组杆状病毒的蛋白表达量较少，而P2代重组杆状病毒可有效的表达出相应的重组蛋白。
3.mosaic VLPs的制备
在重组蛋白表达鉴定成功后，将5种P2代重组杆状病毒分别继续接种至生长状态良好的Sf9昆虫细胞(MOI＝3)，收集细胞上清液，获得P3代重组杆状病毒；然后按照HA:NA:M1＝5:1:2的MOI比例将P3代重组杆状病毒进行混合接种至生长状态良好的Sf9昆虫细胞，27℃条件下进行4～6天的培养；将培养后的Sf9昆虫细胞在4℃中以5000rpm离心30min，收集上清；将所获得上清经过vivaflow2000膜包进行浓缩，在4℃中以10000rpm离心10min，收集上清，在4℃中以30000rpm超速离心2h，弃去上清，加入1～2mLPBS，重悬沉淀，置于4℃过夜；次日将重悬后的沉淀溶液经20％-30％-60％的蔗糖溶液密度梯度离心纯化，在4℃中以26000rpm超速离心2h；将30％-60％蔗糖溶液之间的乳白色液体慢慢吸出，使用PBS稀释，在4℃中以30000rpm超速离心2h；弃去含有蔗糖的上清，使用PBS重悬沉淀，重悬液即为纯化的mosaic VLPs(即H1N1 VLP和H3N2 VLP)，-80℃保存，备用。
3.1透射电镜观察
将纯化的H1N1 VLP和H3N2 VLP进行10倍稀释，然后滴加到制备好的铜网上，室温下孵育5分钟后使用吸水纸吸走铜网上的多余液体，滴加2％的磷钨酸染液染色3分钟，使用吸水纸吸走铜网上多余的磷钨酸并在室温下干燥，最后利用透射电镜JEM-1400观察VLPs的形态。结果如图6和图7所示，观察到大小约100nm的类球形粒子，且球形周围有茎突结构，说明H1N1 VLP和H3N2 VLP正确组装。
3.2 Western Blot检测
进一步利用Western Blot检测H1N1 VLP和H3N2 VLP中各蛋白的表达情况，具体步骤如下：
(1)SDS-PAGE电泳样品的制备：取30μL纯化后的VLPs和不含靶蛋白的杆状病毒液(空白对照)与5×蛋白上样缓冲液按4:1体积预混后，沸水浴10min后备用；
(2)SDS-PAGE电泳：根据目的蛋白的大小，配制10％SDS-PAGE分离胶与5％SDS-PAGE积层胶，将制好的样品加入样品孔中，以180KD蛋白质标准分子质量作为参考，进行电泳至结束，取出凝胶；
(3)将凝胶按照Marker指示切割目的条带，裁剪PVDF膜在甲醇溶液中浸泡10min；
(4)在转膜仪上依次放厚滤纸，PVDF膜，凝胶，厚滤纸，尽可能避免气泡，400mA恒流，依据蛋白分子量大小判断具体转印时间；
(5)转印结束后，取下PVDF膜，将其置于含5w/v％BSA的PBST中，37℃封闭1h，弃封闭液，PBST洗膜3次，每次10min；
(6)用含5w/v％BSA的PBST分别将抗Influenza A virus H1N1的HA、NA抗体(分别购自GeneTex和R&D，货号分别为GTX127357和40017-T60)和抗Influenza A virus H3N2的HA、NA抗体(分别购自GeneTex和Sino Biological，货号为127363和AF4858)以及抗Influenza A virus的M1抗体(购自Abcam，货号为ab22396)按照1:4000进行稀释，并将PVDF膜置于其中，4℃孵育过夜，取出PVDF膜，PBST洗膜3次，每次10min；
(7)将PVDF膜分别转入1:10000倍稀释的HRP标记的羊抗鼠与羊抗兔IgG抗体(均购自弗德生物，货号分别为FDM007和FDR007)中，37℃孵育1h，取出PVDF膜，PBST洗膜3次，每次10min；
(8)在PVDF膜上滴加新配制的ECL化学发光工作液，室温避光显色。
Western Blot结果表明，H1N1 VLP在70～100bp、55bp左右以及25～35bp有条带，H3N2 VLP在100bp左右、40～55bp以及25～35bp左右有条带(图8)，表明两种mosaic VLP中HA蛋白、NA蛋白、M1蛋白均已成功表达。
3.3红细胞凝集试验检测
对纯化后的H1N1 VLP与空白对照(见本专利第2点中提到的空白对照)的细胞培养上清的血凝滴度进行1％鸡红细胞的血凝检测，对纯化后的H3N2 VLP与空白对照的细胞培养上清的血凝滴度进行1％豚鼠红细胞的血凝检测，具体步骤如下：
(1)在96孔血凝板的2～12列中每孔加入50ul PBS；
(2)吸取50μL纯化后的VLPs与对照样品分别加入96孔血凝板中的第1列中，吹打混匀后吸取50μL加入第2列中，再次吹打混匀后吸取50μL加入第3列中，依次进行倍比稀释直至第11列弃去50μL(每次吹打混匀后需要换新枪头)；
(3)在各孔中加入1％鸡红细胞或1％豚鼠红细胞，震荡混匀后室温静置25min后读数。
(4)读数时，以完全出现凝集的孔作为样品的血凝滴度；
如图9所示，可以观察到VLPs能够产生210的血凝效价，而在空白对照组(Mock)则没有看到有血凝现象的产生，进一步证明纯化过的病毒样颗粒可进行免疫原性研究。
实施例4 mosaic VLPs的免疫效果评价
利用实施例3表达纯化得到的两种mosaic VLP为免疫原，对BALB/c小鼠进行免疫，考察mosaic VLPs的免疫效果。
1.免疫小鼠
使用BCA检测试剂盒(购买自碧云天公司，货号为P0012)分别检测两种mosaic VLP的蛋白浓度，以1:1浓度配比均匀混合，将混合后的VLPs与7万单位/mL的IL-2和0.1％壳聚糖均匀混合，得到mosaic VLPs疫苗。
选取20只6～8周龄的BALB/c雌性小鼠随机分为4组，分别为空白对照组：肌肉注射100μL PBS；免疫对照组：肌肉注射100μL含有2μg HA(四种组分HA总含量，约为人体注射剂量的1/30)的2020～2021年商品化四价灭活流感疫苗(IIV4)(购买自北京科兴生物制品有限公司)；VLP免疫组：肌肉注射100μL含有15μg mosaic VLPs的疫苗，在第0周与第2周时按分组情况对BALB/c雌性小鼠进行免疫，在免疫后第0周和第4周(第28天)对各组小鼠进行眼眶采血，4℃静置过夜后经3000rpm离心10min获得血清，分装后置于-80℃冰箱备用。
2.血凝抑制(hemagglutination inhibiion，HAI)实验
制备RDE处理后的小鼠血清：将受体破坏酶(RDE，购买自日本生研，货号为340122)分别与各组小鼠的血清按体积比3:1混合于试管中，置于37℃水浴16h；取出试管，置于56℃水浴30min灭活RDE；向试管中加入PBS，使血清稀释度达到1:10；冷却至室温后加入原始血清1/2体积的鸡红血球并充分混匀，置于4℃保存1h，期间每隔15min重新混匀一次；1200rpm离心1min，吸取上清，得到RDE处理的小鼠血清，4℃静置备用。
四单位标准抗原的制备：分别检测A/Victoria/2570/2019、A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019、A/California/7/2009(3种H1N1亚型毒株，由中国疾病预防控制中心馈赠)、A/Kansas/14/2017、A/HongKong/2671/2019、A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016(3种H3N2亚型毒株，由中国疾病预防控制中心馈赠)的HA效价，用PBS将各抗原稀释为8个血凝单位，再次进行HA效价确认，进一步稀释为4个血凝单位，即得到四单位标准抗原。
血凝抑制实验：在96孔板的第2～10列与第12列各孔中加入25μLPBS，在第11列的各孔中加入50μLPBS；在第1列和第2列各孔中加入25μL经RDE处理后的小鼠血清，混匀；吸取25μL第2列混合后的溶液，加入到第3列中，混匀；重复上述操作，直到第10列，并将第10列中混匀后的溶液弃去25μL；向第1～10列和第12列中加入25μL四单位标准抗原，其中，第12列作为病毒对照列，同时向第11列加入阳性血清(实验室前期得到的小鼠血清，经过验证对相应毒株有血凝效价)做标准阳性对照；充分混匀后将96孔板置于室温静置45min；每孔加入50μL1％鸡红细胞悬液，室温静置25min，将96孔板作45℃倾斜，观察红细胞是否呈泪滴状流淌。
结果如图10所示，流感病毒特异性血凝抑制抗体显示在首次免疫后第4周(D28)，VLP免疫组的小鼠血清针对于近年来的季节性流感病毒疫苗株均呈现出一定的交叉保护效果，并显著性高于空白对照组和免疫对照组(P＜0.05)，特别是A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019与A/HongKong/2671/2019病毒血凝抑制抗体效价达到了128～256。与免疫IIV4疫苗相比，对免疫mosaic VLPs的小鼠机体产生了更高水平可针对多种疫苗株的血凝抑制抗体。
3.特异性IgG抗体检测
使用纯化后的灭活A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019(H1N1亚型毒株)、A/HongKong/2671/2019(H3N2亚型毒株)、A/Guangdong/avian/0724/2017(H3N8亚型毒株，由中国疾病预防控制中心馈赠)和A/Guangdong/avian/2751/2017(H6N2亚型毒株，由中国疾病预防控制中心馈赠)病毒，使用ELISA包被液(购买自索莱宝，货号为C1050)稀释为5μg/mL，每孔加入100ul于96孔板中，置于4℃孵育过夜；次日取出96孔板，弃去各孔中的溶液，用PBST洗涤6次，每次3min；向96孔板中加入含由0.05v/v％的Tween 20和1w/v％BSA的PBST，每孔200μL，室温封闭2h；弃去各孔中的溶液，用PBST洗涤6次，每次3min；在96孔板中加入100μL稀释好的血清样品(首次免疫后第4周得到的血清，血清稀释倍数分别为1000倍、4000倍、16000倍、64000倍、256000倍和1024000倍，用PBS作为稀释液)，每个血清样品做3个复孔，室温孵育2h；弃去96孔板中的溶液，用PBST洗涤6次，每次3min；加入100μL用含2w/v％BSA的PBST按1:8000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG(购买自SouthernBiotech，货号为1036-05)，室温孵育1h；用PBST洗涤6次，每次3min，每孔中加入100μLTMB染色液，置于室温反应30min；每孔加入50μL的2M的H2SO4溶液终止反应，立即使用酶标仪测定450nm处吸的吸光度值(OD450nm)。
结果如图11所示，在首次免疫4周后，免疫mosaic VLPs与免疫IIV4疫苗均可产生针对同源的H1N1与H3N2亚型病毒的可检测水平的血清IgG，相对于IIV4诱导的抗体水平来说，免疫mosaic VLPs表现出了更强的H1N1与H3N2特异性血清IgG抗体效价(图11中A和B)。而对于异源的H3N8与H6N2亚型病毒，免疫mosaic VLPs诱导产生的血清IgG特异性抗体水平明显高于免疫IIV4疫苗的小鼠，免疫IIV4疫苗的小鼠体内几乎不产生针对异源的H3N8与H6N2亚型病毒的血清IgG特异性抗体(图11中C和D)。
4.T淋巴细胞分群检测
在首次免疫后第4周对各组小鼠进行安乐死，将小鼠浸泡于75％酒精中转移至无菌环境；剖取小鼠脾脏，置于2mL RPMI 1640培养基中，在200目滤网上研磨脾脏，多次冲洗转移至15mL离心管中；加入2mL红细胞裂解液混匀，静置5min；2000rpm离心10min，再次加入RPMI 1640培养基重悬细胞后进行细胞计数；分别取0.25μg PE-CD19、APC-CD3、FITC-CD4、AF700-CD8a(均购买自Biolegend，货号分别为115508、100236、100406、100725)加入至50μL细胞悬液(含有1×106个细胞)中，充分混匀后置于室温染色30min；加入5μL7-AAD(购买自Biolegend，货号为420404)，室温染色10min，立即采用流式细胞仪检测T淋巴细胞分群情况。
通过对各组小鼠的脾脏的淋巴细胞进行分析，结果如图12所示，在首次免疫后第4周，与空白对照组相比，VLP免疫组和对照组免疫组的小鼠中CD19+B淋巴细胞与CD8+T淋巴细胞占比均存在不同程度的提高，其中，VLP免疫组小鼠的淋巴细胞提高程度最明显，呈现极显著性差异(P＜0.01)，表明免疫mosaic VLPs后，小鼠体内重点激活体液免疫与CTL途径细胞免疫。同时与免疫IIV4疫苗相比，免疫mosaic VLPs能够刺激小鼠产生更强的免疫反应。
5.中和抗体检测
(1)测定病毒的半数组织培养感染剂量(median tissue culture infectivedose，TCID50)
取冻存的待测毒株的病毒液(A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019与A/HongKong/2671/2019)，用病毒稀释液(DMEM+1w/v％BSA+100U/mL青霉素+100μg/mL链霉素+20mMHEPES+2μg/mL TPCK-胰酶)进行1:100稀释，在96孔板第一列各孔加入146μL稀释后的病毒液，其它各列每孔加入100μL病毒稀释液。然后用从第一孔吸46μL至第二孔，依次做系列半对数稀释，至第11列混匀后弃46μL，第12列作为细胞对照(加入100μL稀释后的病毒液)。将培养板放置在37℃，5％CO2培养箱内孵育1h。向孵育1h的96孔板中加入100μL/孔的细胞悬液(选择细胞密度在70％～90％的MDCK细胞，加适量含有0.25％EDTA-胰酶消化20min后1000g离心5min，用病毒稀释液重悬细胞，配制浓度为1.5×105个细胞/mL的细胞悬液)，37℃，5％CO2培养箱内孵育18～20h。
吸弃微孔板中的液体，用200μL/孔PBS洗涤细胞一次，吸弃PBS，每孔加200μL预冷的固定液(含有80v/v％丙酮的PBS)，室温固定细胞10min后弃固定液，室温条件下晾干。使用PBST洗板6次，每次3min。每孔加100μL含1w/v％BSA的PBST 1:10000稀释的Influenza Avirus Nucleoprotein antibody(购买自Genetex，货号为GTX125989)，室温孵育1h。使用PBST洗板6次，每次3min，每孔加100μL含1w/v％BSA的PBST 1:10000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG(购买自弗德生物，货号为FDR007)，室温孵育1h。使用PBST洗板6次，每次3min。每孔中加入100μLTMB染色液，置于室温反应30min；每孔加入50μL的2M的H2SO4溶液终止反应，立即使用酶标仪测定450nm处吸的吸光度值(OD450nm)。
(2)中和抗体检测
向96孔板第一排A1～A10每孔加60μL病毒稀释液，其余各孔加50μL病毒稀释液，向第一排A1～A10各孔加40μL待检血清(RDE处理后的小鼠血清，制备过程见本专利文件“2.血凝抑制实验”)。从96孔板的第一排A1～A10吸取50μL液体到第二排，吹打混匀后再吸50μL液体至第三排，如此重复操作直至第八排弃50μL液体。A12～D12加50uL病毒稀释液作为病毒对照孔，E12～H12加100μL病毒稀释液作为细胞对照孔。使用病毒稀释液将病毒原液稀释至100TCID50/50μL，除病毒对照孔和细胞对照孔外，其余各孔均添加50μL稀释后的病毒液。向A11孔加入50μL稀释后的病毒液，使病毒起始浓度为50TCID50，吹打混匀后移取50μL到B11孔，以此类推，作2倍稀释，至H11孔吹打混匀后弃50μL病毒液。补加50uL病毒稀释液至第11列各孔，使第11列各孔终体积为100μL。轻拍混匀后置37℃，5％CO2培养箱内孵育1h。向孵育1h的96孔板中加入100μL/孔的细胞悬液(选择细胞密度在70％～90％的MDCK细胞，加适量含有0.25％EDTA-胰酶消化20min后1000g离心5min，用病毒稀释液重悬细胞，配制浓度为1.5×105个细胞/mL的细胞悬液)，37℃，5％CO2培养箱内孵育18～20h。吸弃微孔板中的液体，用200μL/孔PBS洗涤细胞一次，吸弃PBS每孔加200μL预冷的固定液(含有80v/v％丙酮的PBS)，室温固定细胞10min后弃固定液，室温条件下晾干。使用PBST洗板6次，每次3min。每孔加100μL含1w/v％BSA的PBST 1:10000稀释的Influenza A virus Nucleoproteinantibody(购买自Genetex，货号为GTX125989)，室温孵育1h。使用PBST洗板6次，每次3min，每孔加100μL含1w/v％BSA的PBST 1:10000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG(购买自弗德生物，货号为FDR007)，室温孵育1h。使用PBST洗板6次，每次3min。每孔中加入100μLTMB染色液，置于室温反应30min；每孔加入50μL的2M的H2SO4溶液终止反应，立即使用酶标仪测定450nm处吸的吸光度值(OD450nm)。
结果如图13所示，在首次免疫后第4周(第28天)，VLP免疫组的小鼠血清针对于A/Guangdong-Maonan/SWL1536/2019与A/HongKong/2671/2019两种疫苗株产生了特异性中和抗体，并显著高于空白对照组(P＜0.05或P＜0.01)，提示mosaic VLPs免疫对小鼠产生了一定的保护效果。与免疫IIV4疫苗相比，对免疫mosaic VLPs的小鼠机体产生了相当甚至更高水平可针对多种疫苗株的中和抗体。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
SEQUENCE LISTING
<110> 中山大学·深圳
中山大学
<120> 一种季节性甲型流感通用病毒样颗粒及其制备方法与应用
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 565
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Lys Val Lys Leu Leu Val Leu Leu Cys Thr Phe Thr Ala Thr Tyr
1               5                   10                  15
Ala Asp Thr Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Asp Thr
            20                  25                  30
Val Asp Thr Val Leu Glu Arg Asn Val Thr Val Thr His Ser Val Asn
        35                  40                  45
Leu Leu Glu Asn Ser His Asn Gly Lys Leu Cys Leu Leu Lys Gly Ile
    50                  55                  60
Ala Pro Leu Gln Leu Gly Asn Cys Ser Val Ala Gly Trp Ile Leu Gly
65                  70                  75                  80
Asn Pro Glu Cys Glu Leu Leu Ile Ser Lys Glu Ser Trp Ser Tyr Ile
                85                  90                  95
Val Glu Lys Pro Asn Pro Glu Asn Gly Thr Cys Tyr Pro Gly His Phe
            100                 105                 110
Ala Asp Tyr Glu Glu Leu Arg Glu Gln Leu Ser Ser Val Ser Ser Phe
        115                 120                 125
Lys Arg Phe Glu Ile Phe Pro Lys Glu Ser Ser Trp Pro Asn His Thr
    130                 135                 140
Val Thr Gly Val Ser Ala Ser Cys Ser His Asn Gly Glu Ser Ser Phe
145                 150                 155                 160
Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Gly Lys Asn Gly Leu Tyr Pro Asn
                165                 170                 175
Leu Ser Lys Ser Tyr Ala Asn Asn Lys Glu Lys Glu Val Leu Val Leu
            180                 185                 190
Trp Gly Val His His Pro Pro Asn Ile Val Asp Gln Lys Thr Leu Tyr
        195                 200                 205
His Thr Glu Asn Ala Tyr Val Ser Val Val Ser Ser His Tyr Ser Arg
    210                 215                 220
Lys Phe Thr Pro Glu Ile Ala Lys Arg Pro Lys Val Arg Asp Gln Glu
225                 230                 235                 240
Gly Arg Ile Asn Tyr Tyr Trp Thr Leu Leu Glu Pro Gly Asp Thr Ile
                245                 250                 255
Ile Phe Glu Ala Asn Gly Asn Leu Ile Ala Pro Arg Tyr Ala Phe Ala
            260                 265                 270
Leu Ser Arg Gly Phe Gly Ser Gly Ile Ile Asn Ser Asn Ala Pro Met
        275                 280                 285
Asp Lys Cys Asp Ala Lys Cys Gln Thr Pro Gln Gly Ala Ile Asn Ser
    290                 295                 300
Ser Leu Pro Phe Gln Asn Val His Pro Val Thr Ile Gly Glu Cys Pro
305                 310                 315                 320
Lys Tyr Val Arg Ser Ala Lys Leu Arg Met Val Thr Gly Leu Arg Asn
                325                 330                 335
Ile Pro Ser Val Gln Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe
            340                 345                 350
Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly Met Val Glu Gly Trp Tyr Gly Tyr His
        355                 360                 365
His Gln Asn Gly Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Gln Lys Ser Thr
    370                 375                 380
Gln Asn Ala Ile Asn Gly Ile Thr Asn Lys Val Asn Ser Val Ile Asp
385                 390                 395                 400
Lys Met Asn Thr Gln Phe Thr Ala Val Gly Lys Glu Phe Asn Lys Leu
                405                 410                 415
Glu Arg Arg Met Glu Asn Leu Asn Lys Lys Val Asp Asp Gly Phe Ile
            420                 425                 430
Asp Ile Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Ile Leu Leu Glu Asn Glu
        435                 440                 445
Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Glu Lys
    450                 455                 460
Val Lys Ser Gln Leu Lys Asn Asn Ala Lys Glu Ile Gly Asn Gly Cys
465                 470                 475                 480
Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asn Asp Glu Cys Met Glu Ser Val Lys
                485                 490                 495
Asn Gly Ile Tyr Asp Tyr Pro Lys Tyr Ser Glu Glu Ser Lys Leu Asn
            500                 505                 510
Arg Glu Lys Ile Asp Gly Val Lys Leu Glu Ser Met Gly Val Tyr Gln
        515                 520                 525
Ile Leu Ala Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Leu Leu Val
    530                 535                 540
Ser Leu Gly Ala Ile Ser Phe Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser Leu Gln
545                 550                 555                 560
Cys Arg Ile Cys Ile
                565
<210> 2
<211> 566
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Lys Thr Val Ile Ala Leu Ser Tyr Ile Leu Cys Leu Val Phe Ala
1               5                   10                  15
Gln Lys Ile Pro Gly Asn Asp Asn Ser Met Ala Thr Leu Cys Leu Gly
            20                  25                  30
His His Ala Val Ser Asn Gly Thr Ile Val Lys Thr Ile Thr Asn Asp
        35                  40                  45
Arg Ile Glu Val Thr Asn Ala Thr Glu Leu Val Gln Ser Ser Ser Thr
    50                  55                  60
Gly Glu Ile Cys Asn Ser Pro His Gln Ile Leu Asp Gly Gly Asn Cys
65                  70                  75                  80
Thr Leu Ile Asp Ala Leu Leu Gly Asp Pro His Cys Asp Gly Phe Gln
                85                  90                  95
Asn Lys Glu Trp Asp Leu Phe Val Glu Arg Ser Arg Ala Tyr Ser Asn
            100                 105                 110
Cys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Ser Leu Arg Ser Leu Val
        115                 120                 125
Ala Ser Ser Gly Thr Leu Glu Phe Lys Asn Glu Ser Phe Asn Trp Thr
    130                 135                 140
Gly Val Lys Gln Asn Gly Thr Ser Ser Ala Cys Ile Arg Arg Ser Ser
145                 150                 155                 160
Ser Ser Phe Phe Ser Arg Leu Asn Trp Leu Thr His Leu Asn Tyr Thr
                165                 170                 175
Tyr Pro Ala Leu Asn Val Thr Met Pro Asn Lys Glu Gln Phe Asp Lys
            180                 185                 190
Leu Tyr Ile Trp Gly Val His His Pro Gly Thr Asp Lys Asp Gln Ile
        195                 200                 205
Ser Leu Tyr Ala Gln Ser Ser Gly Arg Ile Thr Val Ser Thr Lys Arg
    210                 215                 220
Ser Gln Gln Ala Val Thr Pro Asn Ile Gly Ser Arg Pro Arg Ile Arg
225                 230                 235                 240
Asp Ile Pro Ser Arg Ile Ser Ile Tyr Trp Thr Ile Val Lys Pro Gly
                245                 250                 255
Asp Val Leu Leu Ile Asn Ser Thr Gly Asn Leu Val Ala Pro Arg Gly
            260                 265                 270
Tyr Phe Lys Ile Arg Asn Gly Lys Ser Ser Ile Met Arg Ser Asp Ala
        275                 280                 285
Pro Ile Gly Lys Cys Lys Ser Glu Cys Ile Thr Pro Asn Gly Ser Ile
    290                 295                 300
Pro Asn Glu Lys Pro Phe Gln Asn Val Asn Arg Val Thr Tyr Gly Ala
305                 310                 315                 320
Cys Pro Arg Tyr Val Lys His Ser Thr Leu Lys Leu Ala Thr Gly Met
                325                 330                 335
Arg Asn Ile Pro Glu Lys Gln Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala Ile Ala
            340                 345                 350
Val Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
        355                 360                 365
Phe Arg His Gln Asn Ser Glu Gly Arg Gly Gln Ala Ala Asp Leu Lys
    370                 375                 380
Ser Thr Gln Ser Ala Ile Asp Gln Ile Asn Gly Lys Leu Asn Arg Leu
385                 390                 395                 400
Val Gly Lys Thr Asn Glu Lys Phe His Gln Ile Glu Arg Glu Phe Ser
                405                 410                 415
Glu Val Glu Gly Arg Val Gln Asp Leu Glu Lys Tyr Val Glu Asp Thr
            420                 425                 430
Lys Val Asp Leu Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ser Leu Glu
        435                 440                 445
Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Thr Asp Ser Glu Met Asn Lys Leu Phe
    450                 455                 460
Glu Lys Thr Lys Lys Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Asp Ile Gly Asn
465                 470                 475                 480
Gly Cys Phe Lys Ile Tyr His Lys Cys Asn Asn Ala Cys Ile Gly Ser
                485                 490                 495
Ile Arg Asn Glu Thr Tyr Asp His Asn Val Tyr Arg Asn Glu Ala Leu
            500                 505                 510
Asn Asn Arg Phe Gln Ile Lys Gly Val Glu Leu Lys Ser Gly Tyr Lys
        515                 520                 525
Asp Trp Ile Leu Trp Ile Ser Phe Ala Met Ser Cys Phe Leu Leu Cys
    530                 535                 540
Ile Ala Leu Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Asn Gly Asn Ile
545                 550                 555                 560
Arg Cys Asn Ile Cys Ile
                565
<210> 3
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Cys Met Thr
1               5                   10                  15
Ile Gly Met Ala Asn Leu Ile Leu Gln Ile Gly Asn Ile Ile Ser Ile
            20                  25                  30
Trp Val Ser His Ser Ile Gln Ile Gly Asn Gln Ser Gln Ile Glu Thr
        35                  40                  45
Cys Asn Gln Ser Val Ile Thr Tyr Glu Asn Asn Thr Trp Val Asn Gln
    50                  55                  60
Thr Tyr Val Asn Ile Ser Asn Thr Asn Phe Ala Ala Gly Gln Ser Val
65                  70                  75                  80
Val Ser Val Lys Leu Ala Gly Asn Ser Ser Leu Cys Pro Val Ser Gly
                85                  90                  95
Trp Ala Ile Tyr Ser Lys Asp Asn Ser Val Arg Ile Gly Ser Lys Gly
            100                 105                 110
Asp Val Phe Val Ile Arg Glu Pro Phe Ile Ser Cys Ser Pro Leu Glu
        115                 120                 125
Cys Arg Thr Phe Phe Leu Thr Gln Gly Ala Leu Leu Asn Asp Lys His
    130                 135                 140
Ser Asn Gly Thr Ile Lys Asp Arg Ser Pro Tyr Arg Thr Leu Met Ser
145                 150                 155                 160
Cys Pro Ile Gly Glu Val Pro Ser Pro Tyr Asn Ser Arg Phe Glu Ser
                165                 170                 175
Val Ala Trp Ser Ala Ser Ala Cys His Asp Gly Ile Asn Trp Leu Thr
            180                 185                 190
Ile Gly Ile Ser Gly Pro Asp Ser Gly Ala Val Ala Val Leu Lys Tyr
        195                 200                 205
Asn Gly Ile Ile Thr Asp Thr Ile Lys Ser Trp Arg Asn Asn Ile Leu
    210                 215                 220
Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Ala Cys Val Asn Gly Ser Cys Phe Thr
225                 230                 235                 240
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                245                 250                 255
Arg Ile Glu Lys Gly Lys Ile Val Lys Ser Val Glu Met Asn Ala Pro
            260                 265                 270
Asn Tyr His Tyr Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Asp Ser Ser Glu Ile
        275                 280                 285
Thr Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp His Gly Ser Asn Arg Pro Trp Val
    290                 295                 300
Ser Phe Asn Gln Asn Leu Glu Tyr Gln Ile Gly Tyr Ile Cys Ser Gly
305                 310                 315                 320
Val Phe Gly Asp Asn Pro Arg Pro Asn Asp Lys Thr Gly Ser Cys Gly
                325                 330                 335
Pro Val Ser Ser Asn Gly Ala Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Phe Lys
            340                 345                 350
Tyr Gly Asn Gly Val Trp Ile Gly Arg Thr Lys Ser Ile Ser Ser Arg
        355                 360                 365
Lys Gly Phe Glu Met Ile Trp Asp Pro Asn Gly Trp Thr Gly Thr Asp
    370                 375                 380
Asn Asn Phe Ser Ile Lys Gln Asp Ile Val Gly Ile Asn Glu Trp Ser
385                 390                 395                 400
Gly Tyr Ser Gly Ser Phe Val Gln His Pro Glu Leu Thr Gly Leu Asp
                405                 410                 415
Cys Ile Arg Pro Cys Phe Trp Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Pro Glu
            420                 425                 430
Glu Asn Thr Ile Trp Thr Ser Gly Ser Ser Ile Ser Phe Cys Gly Val
        435                 440                 445
Asn Ser Asp Thr Val Gly Trp Ser Trp Pro Asp Gly Ala Glu Leu Pro
    450                 455                 460
Phe Thr Ile Asp Lys
465
<210> 4
<211> 469
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 4
Met Asn Pro Asn Gln Lys Ile Ile Thr Ile Gly Ser Val Ser Leu Thr
1               5                   10                  15
Ile Ser Thr Ile Cys Phe Phe Met Gln Ile Ala Ile Leu Ile Thr Thr
            20                  25                  30
Val Thr Leu His Phe Lys Gln Tyr Glu Phe Asn Ser Pro Pro Asn Asn
        35                  40                  45
Gln Val Met Leu Cys Glu Pro Thr Ile Ile Glu Arg Asn Ile Thr Glu
    50                  55                  60
Ile Val Tyr Leu Thr Asn Thr Thr Ile Glu Lys Glu Ile Cys Pro Lys
65                  70                  75                  80
Pro Ala Glu Tyr Arg Asn Trp Ser Lys Pro Gln Cys Gly Ile Thr Gly
                85                  90                  95
Phe Ala Pro Phe Ser Lys Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ser Ala Gly Gly
            100                 105                 110
Asp Ile Trp Val Thr Arg Glu Pro Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Lys
        115                 120                 125
Cys Tyr Gln Phe Ala Leu Gly Gln Gly Thr Thr Leu Asn Asn Val His
    130                 135                 140
Ser Asn Asn Thr Val Arg Asp Arg Thr Pro Tyr Arg Thr Leu Leu Met
145                 150                 155                 160
Asn Glu Leu Gly Val Pro Phe His Leu Gly Thr Lys Gln Val Cys Ile
                165                 170                 175
Ala Trp Ser Ser Ser Ser Cys His Asp Gly Lys Ala Trp Leu His Val
            180                 185                 190
Cys Ile Thr Gly Asp Asp Lys Asn Ala Thr Ala Ser Phe Ile Tyr Asn
        195                 200                 205
Gly Arg Leu Val Asp Ser Val Val Ser Trp Ser Lys Asp Ile Leu Arg
    210                 215                 220
Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val Cys Ile Asn Gly Thr Cys Thr Val Val
225                 230                 235                 240
Met Thr Asp Gly Asn Ala Thr Gly Lys Ala Asp Thr Lys Ile Leu Phe
                245                 250                 255
Ile Glu Glu Gly Lys Ile Val His Thr Ser Lys Leu Ser Gly Ser Ala
            260                 265                 270
Gln His Val Glu Glu Cys Ser Cys Tyr Pro Arg Tyr Pro Gly Val Arg
        275                 280                 285
Cys Val Cys Arg Asp Asn Trp Lys Gly Ser Asn Arg Pro Ile Val Asp
    290                 295                 300
Ile Asn Ile Lys Asp His Ser Ile Val Ser Ser Tyr Val Cys Ser Gly
305                 310                 315                 320
Leu Val Gly Asp Thr Pro Arg Lys Asn Asp Ser Ser Ser Ser Ser His
                325                 330                 335
Cys Leu Asp Pro Asn Asn Glu Glu Gly Gly His Gly Val Lys Gly Trp
            340                 345                 350
Ala Phe Asp Asp Gly Asn Asp Val Trp Met Gly Arg Thr Ile Asn Glu
        355                 360                 365
Thr Ser Arg Leu Gly Tyr Glu Thr Phe Lys Val Val Glu Gly Trp Ser
    370                 375                 380
Asn Pro Lys Ser Lys Leu Gln Ile Asn Arg Gln Val Ile Val Asp Arg
385                 390                 395                 400
Gly Asp Arg Ser Gly Tyr Ser Gly Ile Phe Ser Val Glu Gly Lys Ser
                405                 410                 415
Cys Ile Asn Arg Cys Phe Tyr Val Glu Leu Ile Arg Gly Arg Lys Glu
            420                 425                 430
Glu Thr Glu Val Leu Trp Thr Ser Asn Ser Ile Val Val Phe Cys Gly
        435                 440                 445
Thr Ser Gly Thr Tyr Gly Thr Gly Ser Trp Pro Asp Gly Ala Asp Leu
    450                 455                 460
Asn Leu Met Pro Ile
465
<210> 5
<211> 1731
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
atgaagcaag gaaagactaa agctaccaaa atgaaggcca ttttagtagt tctgctgtac 60
acatttgcta cggctaacgc cgacactcta tgtataggct atcatgcgaa taattccact 120
gacacagtcg acactgtact ggaaaagaac gtaacagtta cgcactcggt caacctgtta 180
gaagataagc acaacgggaa actgtgcaaa ctaaggggag tggcgccact ccatctaggg 240
aaatgtaaca tcgctggatg gattctgggt aatcctgaat gcgaaagtct gtccactgca 300
tcgtcctgga gctacattgt cgagacttct tcgtccgata atggtacatg ctacccaggc 360
gattttatag actacgagga gctacgggaa cagttatcat ctgtatcttc ttttgaaaga 420
ttcgagattt tccctaagac aagtagttgg ccaaaccacg attcgaacaa aggtgtaaca 480
gcagcatgtc cccatgcggg ggccaaatca ttctataaga atttgatctg gctagtgaag 540
aaaggcaaca gctatccaaa actctctaag tcctacataa atgataaggg taaggaggta 600
ttagtgttgt ggggaatcca ccatccgagt accagtgcgg atcagcagag tctctatcaa 660
aatgcagatg cttacgtttt tgtgggaacg tcgcgctatt ctaaaaaatt caaacccgaa 720
atcgccatac gccccaaagt ccgtgaccaa gagggacgaa tgaattacta ctggaccctc 780
gttgaacccg gtgacaaaat aacgttcgaa gcaactggca atttagttgt tcctaggtat 840
gcatttgcga tggagcggaa tgctggcagt ggaataatca tatctgacac gccggtccac 900
gactgcaata ctacatgtca gacccctaaa ggtgcgatta atacatcatt gccgttccag 960
aacattcacc caataacgat cgggaagtgt cctaagtatg taaaatctac aaagttgcgg 1020
ttagcaaccg gcttgagaaa tgttccgagt attcagtccc gagggctctt cggagcaata 1080
gccggattca ttgaaggtgg ctggacgggg atggtggacg ggtggtatgg ctaccatcat 1140
caaaacgagc aaggcagcgg gtatgcggca gatttaaaga gcactcaaaa tgccatcgat 1200
aagatcacca acaaggtcaa cagcgtgata gaaaagatga acacgcaatt tactgctgtt 1260
ggtaaagagt ttaatcacct tgagaaaaga atcgaaaatc ttaacaaaaa ggtcgacgat 1320
ggttttcttg acatctggac gtacaatgcc gagttacttg tgttgctaga aaacgagcgc 1380
accttagatt atcatgactc aaacgtaaaa aacctttacg aaaaggtacg ttctcagctc 1440
aaaaataacg ctaaagagat tggaaatggg tgttttgaat tttaccacaa atgcgataac 1500
acgtgtatgg aatcagtcaa aaatggtact tatgattatc ccaagtattc ggaggaggcg 1560
aaattaaatc gagaagagat cgacggtgtg aagctagaaa gcacaaggat ttatcagatc 1620
ttggccattt attctaccgt cgcctcatca ctagttttag tggtatcgct tggggcgatt 1680
agcttttgga tgtgctcgaa cggctccttg caatgtcgta tatgcatatg a 1731
<210> 6
<211> 1701
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atgaaaacga ttatagctct tagttatata ttatgtcttg tgttcgcaca gaaaatcccg 60
ggcaatgata actcgaccgc tacactgtgc cttgggcacc atgctgttcc taacggcaca 120
atcgttaaga ccattaccaa cgacagaata gaagtaacta acgcgacaga gcttgttcaa 180
aattcctcta ttggagagat ttgcgacagt ccacaccaaa tcctagatgg cgagaattgt 240
actctaattg acgcactcct tggagatcct caatgcgatg gtttccaaaa taagaaatgg 300
gatctgttcg tcgaacgatc caaagcatac agtaactgct acccctatga cgtcccagac 360
tatgcctcgc tgcgtagtct agtggcttct agtgggactc tcgaatttaa caatgagtct 420
tttaactgga cgggagtgac acagaacggg acatcatctg cgtgtatccg tcggtcctct 480
tcttcttttt tttcccgact caattggtta acccacttaa actataccta ccctgcactc 540
aacgtgacga tgccaaacaa cgaacaattc gataaattgt acatatgggg cgttcatcac 600
cctggaacgg ataaagacca aatattcttg tacgcccaat catccggaag gatcaccgtg 660
tcaacgaaac gcagccagca agcggtcatc ccaaatatcg gtagccgccc cagaatcagg 720
gatataccct cacgaatttc gatttattgg acgatcgtta aacctgggga catactccta 780
attaattcca caggtaacct gatcgctcca aggggttatt tcaagataag aagcgggaag 840
tcgagtatca tgcggtccga cgcccccata ggcaaatgta agagtgaatg catcaccccc 900
aacggatcta tacctaacga caaaccgttt caaaacgtaa atagaattac gtatggggct 960
tgcccgcggt acgtaaaaca gtctactctc aaactggcaa caggtatgcg taatgtcccg 1020
gaaaagcaaa caagggggat ttttggcgct atagccggtt tcatcgagaa tggttgggag 1080
ggtatggtcg atggttggta cggatttcgc catcagaata gtgaaggtcg ggggcaagcc 1140
gcggacctaa agtcaacgca agccgcgatt gatcagatca atggaaagtt gaaccgtctg 1200
attggcaaaa ccaacgagaa atttcatcag attgaaaaag aattttctga agtggagggg 1260
aggatacagg acttggaaaa atacgtagag gacactaaga tcgacctctg gtcgtataat 1320
gctgaattgt tggtagctct tgagaaccag catactatcg acttaacaga ttcagaaatg 1380
aataaattat ttgagaagac taagaagcag ctacgcgaga atgccgaaga tatggggaat 1440
ggatgcttta aaatttacca caagtgcgac aatgcatgta ttggctctat acgaaatggc 1500
acttatgatc ataatgttta ccgagatgag gcgttaaata accgttttca gatcaaggga 1560
gttgagctga agtccgggta taaggattgg atactatgga tttcgtttgc aataagctgt 1620
ttccttttgt gtgtcgcgtt actaggcttc attatgtggg cttgtcaaaa gggtaacata 1680
cggtgtaata tatgtatctg a 1701
<210> 7
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atgaacccaa atcaaaaaat aattaccatc ggaagtgtct gtatgaccat cggaatggca 60
aatctgatat tacaaatagg aaacatcatt tcaatatggg tttctcactc tatacagata 120
gggaatcaat cgcagatcga gacttgcaac caatcggtta taacttacga gaataacacc 180
tgggttaatc agacgtatgt aaatatctcg aatacgaatt ttgcagccgg acagtccgta 240
gtaagcgtaa aactagctgg caacagcagt ctctgtccgg tatcgggttg ggctatctac 300
tccaaggaca actcggtccg cattgggagc aagggtgacg tgtttgttat tcgggaaccc 360
tttataagtt gcagcccctt ggaatgtcgt accttcttcc taacacaagg ggcgctcctg 420
aacgataaac attcaaacgg tacaattaag gataggagtc cgtataggac cctgatgtcc 480
tgtcccatcg gagaggtgcc ctccccttat aattctcgat ttgagagtgt tgcctggtct 540
gcatctgcct gccacgatgg catcaattgg ttgacgatag ggatttcagg gcccgacagc 600
ggagcggtcg ctgttcttaa atacaacggc ataatcacag atactataaa gtcttggaga 660
aataacatcc ttcggaccca ggaatcagaa tgcgcatgtg tgaatgggtc gtgttttact 720
attatgacag atgggccctc agacggtcag gcttcttata aaattttcag aattgagaaa 780
ggaaagatag tgaaaagtgt tgagatgaac gccccgaatt atcattacga agagtgcagt 840
tgttatccag attcttccga gattacctgt gtatgccgtg acaactggca tggctcgaat 900
cggccttggg tctcatttaa ccagaacctt gagtaccaga tcggatatat ctgttccggt 960
gtgtttggcg ataatccgcg accaaacgac aagactggct catgcggacc tgtgtcttca 1020
aatggggcga atggcgtgaa gggtttcagc ttcaaatacg gcaacggcgt atggattggt 1080
cgcacgaaaa gcatttcatc ccgcaaggga tttgagatga tctgggaccc taacgggtgg 1140
actggcacgg ataacaattt ctcgataaaa caagacattg tgggcattaa tgaatggtca 1200
ggatactcgg gtagtttcgt ccaacacccg gaattgacag ggctagactg cattaggcca 1260
tgcttttggg tcgaattaat aagagggcgt ccagaagaaa acactatctg gacaagcggc 1320
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gcggagttac cgttcacgat cgataagtga 1410
<210> 8
<211> 1407
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
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tgtttcttca tgcaaatcgc tatactaatc acaaccgtga cgttacattt taagcaatat 120
gaatttaatt cgcctcctaa caaccaggta atgttatgtg aacctactat aattgagcga 180
aatatcacgg aaattgtata cctcactaat acgactatcg aaaaggaaat atgccccaaa 240
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tacgtctcgt gcgacccgga caagtgctat cagttcgcct taggccaagg tacaactctt 420
aataatgtcc atagtaacaa taccgtccgg gatagaaccc cgtaccgcac actgttaatg 480
aatgagttag gggtgccctt ccaccttggc accaagcagg tatgcatagc ttggagttcg 540
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aagattgttc atacgtcgaa attgtcgggc tcagcacaac acgtagaaga gtgcagctgt 840
tatcctcgat acccaggagt tcggtgtgtt tgtcgtgaca actggaaagg aagcaacagg 900
ccgatagtcg acataaacat taaggatcac tccatagtct cttcctatgt atgctcaggg 960
ctcgtggggg ataccccccg taaaaatgac tctagttcaa gcagccattg ccttgatcca 1020
aataacgaag agggaggtca cggtgtaaag ggctgggcct ttgatgatgg taacgatgta 1080
tggatgggaa gaactattaa cgagacatct cgactaggct atgaaacgtt caaggttgtc 1140
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ggagaccgca gcggatactc cggaatcttc agcgtggaag ggaaatcctg catcaacagg 1260
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<210> 9
<211> 759
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
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cagaatgctc tcaacggaaa tggtgatcct aataacatgg ataaggctgt aaagttatat 300
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gcaggagcac tggcatcatg catgggtttg atctataatc gcatgggtgc agttacgaca 420
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agccatagac agatggtgac tacgacaaac ccgttaatac gacacgaaaa ccgaatggta 540
ttggcctcca ccactgcgaa agcaatggaa caaatggcgg ggagctcgga gcaagctgcc 600
gaggctatgg aagtcgcgtc ccaggccagg cagatggtgc aggccatgag gacaatcggg 660
acgcatccca gttcttcagc gggcctaaaa aatgacctcc tcgaaaatct gcaggcttat 720
caaaagagaa tgggggtcca aatgcagcgg ttcaaatga 759

Claims (9)

1.一种甲型流感病毒重组蛋白，所述甲型流感病毒重组蛋白包括：H1N1血凝素蛋白HA、H1N1神经氨酸酶蛋白NA和/或H3N2血凝素蛋白HA、H3N2神经氨酸酶蛋白NA；
所述H1N1血凝素蛋白HA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述H1N1神经氨酸酶蛋白NA的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述H3N2血凝素蛋白HA的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述H3N2神经氨酸酶蛋白NA的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.编码权利要求1所述重组蛋白的核酸分子，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO:5~8所示。
3.与权利要求2所述的核酸分子相关的生物材料，所述生物材料为（1）~（3）中任一种；
（1）表达盒，含有权利要求2所述的核酸分子；
（2）重组载体，含有权利要求2所述的核酸分子或（1）中表达盒；
（3）重组细胞，含有权利要求2所述的核酸分子、（1）中表达盒或（2）中重组载体。
4.（4）~（6）中任一项在制备甲型流感病毒病毒样颗粒中的应用；
（4）权利要求1所述的甲型流感病毒重组蛋白；
（5）权利要求2所述的核酸分子；
（6）权利要求3所述的生物材料。
5.一种病毒样颗粒，其特征在于，所述病毒样颗粒包括：
（a1）H1亚型流感病毒H1N1血凝素蛋白HA、H1亚型流感病毒H1N1神经氨酸酶蛋白NA和甲型流感病毒基质蛋白M1；和/或
（b1）H3亚型流感病毒H3N2血凝素蛋白HA、H3亚型流感病毒H3N2神经氨酸酶蛋白NA和甲型流感病毒基质蛋白M1；
其中，所述H1亚型流感病毒H1N1血凝素蛋白HA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述H1亚型流感病毒H1N1神经氨酸酶蛋白NA的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；
所述H3亚型流感病毒H3N2血凝素蛋白HA的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
所述H3亚型流感病毒H3N2神经氨酸酶蛋白NA的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；
所述甲型流感病毒基质蛋白M1的氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示。
6.权利要求5所述的病毒样颗粒的制备方法，包括以下步骤：
S1、分别合成H1亚型流感病毒H1N1血凝素蛋白HA、H1亚型流感病毒H1N1神经氨酸酶蛋白NA、H3亚型流感病毒H3N2血凝素蛋白HA、H3亚型流感病毒H3N2神经氨酸酶蛋白NA和甲型流感病毒基质蛋白M1的基因；
S2、将步骤S1合成的基因分别插入到昆虫表达载体中，转化含有重组杆状病毒基因组的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，提取阳性质粒，得到整合了步骤S1所述基因的重组杆状病毒Bacmid质粒；
S3、将步骤S2制得的重组杆状病毒Bacmid质粒分别转染昆虫细胞，得到重组杆状病毒；
S4、将步骤S3制得的整合了H1亚型流感病毒H1N1血凝素蛋白HA基因的重组杆状病毒、整合了H1亚型流感病毒H1N1神经氨酸酶蛋白NA基因的重组杆状病毒和整合了甲型流感病毒基质蛋白M1基因的重组杆状病毒按照一定比例转染至昆虫细胞，培养得到病毒样颗粒，命名为H1N1病毒样颗粒；和/或
将步骤S3制得的整合了H3亚型流感病毒H3N2血凝素蛋白HA基因的重组杆状病毒、整合了H3亚型流感病毒H3N2神经氨酸酶蛋白NA基因的重组杆状病毒和整合了甲型流感病毒基质蛋白M1基因的重组杆状病毒按照一定比例转染至昆虫细胞，培养得到病毒样颗粒，命名为H3N2病毒样颗粒。
7.权利要求5所述的病毒样颗粒在（7）~（9）中任一种中的应用；
（7）制备甲型流感病毒疫苗；
（8）制备预防和/或治疗甲型流感的药物；
（9）制备甲型流感病毒抗体检测制剂。
8.一种甲型流感病毒样颗粒疫苗，包括权利要求5所述的病毒样颗粒。
9.根据权利要求8所述的甲型流感病毒样颗粒疫苗，其特征在于，所述甲型流感病毒样颗粒疫苗还包括佐剂。
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