CN117534739A - 一种季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原及其疫苗和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物制药技术领域,尤其是涉及一种季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原及其疫苗和应用,本发明通过对现有已知的2009‑2021年全部人源H1N1与H3N2的HA、NA的氨基酸序列进行数据分析,利用Mosaic设计策略得到能覆盖天然序列的潜在T细胞表位的最大多样性的流感病毒HA与NA Mosaic重组抗原序列;本发明设计的流感病毒体HA与NA Mosaic重组抗原由天然序列的短肽组装形成,通过抗原表位覆盖率分析、遗传进化分析以及空间构象分析,其与抗原覆盖率高,与疫苗株亲缘关系相近并与天然蛋白具有很好的结构相似性,具有开发为疫苗抗原的潜力。

Description

一种季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原及其疫苗和应用
本申请是CN 115894636 A(申请日为2022年07月15日、申请号为2022108401508、发明创造名称为一种季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原及其疫苗和应用)的分案申请。
技术领域
本发明涉及生物制药技术领域,尤其是涉及一种季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原及其疫苗和应用。
背景技术
流行性感冒病毒(Influenza virus,IV),简称流感病毒,其亚型众多,不同来源的HA和NA基因能重配组合成上百种不同亚型的病毒,同一种亚型中还存在众多的不同毒株,可以在不同的宿主之间传播。而甲型流感病毒HA抗原的变异频率很高,在免疫压力下,其抗原性变异更频繁,极易发生抗原漂移和抗原转变,使流感病毒产生免疫逃逸,从而导致季节性流感流行与全球流感大流行。
接种流感疫苗是预防流感、降低流感危害以及减少各类并发症的最佳干预措施。由于流感病毒的易变异性,世界卫生组织(WHO)每年都会预测并推荐南、北半球的流行毒株,疫苗生产厂商会以此为疫苗株生产流感疫苗,而人群也需要每年接种流感疫苗以匹配当年预测将会流行的毒株。如果疫苗使用的毒株与流行的毒株不匹配,保护效力会大幅降低,并导致流感的发病率和死亡率增加。因此研发具有相对广谱性的通用型疫苗已成为大家关注的重点问题。
目前国际上研究了许多通用的流感疫苗策略。病毒表面糖蛋白、血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)是疫苗最常见的靶点,但它们的交叉保护作用有限。最近的研究主要针对HA茎部区,该区域比HA头部区域更保守。HA和NA靶点依赖于诱导抗体反应来提供对IAV的保护。然而,在以往的流感疫苗研制过程中,往往忽略了T细胞免疫应答的重要性。T细胞免疫应答是抵抗病毒感染的关键因素,对控制流感病毒、艾滋病毒具有重要作用。越来越多的证据表明,T细胞免疫可能是更好的疫苗交叉保护的关键,在预防流感中发挥着重要作用。
目前,国内上市的流感疫苗均为传统鸡胚培养的疫苗,包括灭活和减毒疫苗,通常为三价(甲型H1N1、甲型H3N2和一种乙型)或四价(甲型H1N1、甲型H3N2、乙型Yamagata及乙型Victoria)疫苗。这些疫苗一方面只能引起全身体液反应,另一方面对新出现的毒株的保护有限。基于流感病毒的多样性与抗原的频繁突变,研制一种可抵御多种亚型流感病毒的通用型疫苗是非常理想的选择。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原及其疫苗和应用。
为实现上述目的,本发明采取的技术方案为:
本发明提供了一种季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原,所述Mosaic重组抗原为:
(a)由SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的抗原;或者,
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸组成的抗原。
作为本发明所述季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原的优选实施方式,所述Mosaic重组抗原的Th细胞表位与流感病毒的天然HA蛋白上的Th细胞表位相比,Th细胞表位覆盖率大于81%;所述Mosaic重组抗原的Th细胞表位与流感病毒的天然NA蛋白上的Th细胞表位相比,Th细胞表位覆盖率大于84%。
本申请的Mosaic重组抗原是在天然HA蛋白或NA蛋白序列上产生少量“镶嵌”序列,使其包含来自天然蛋白序列的潜在T细胞表位的最大多样性。利用遗传算法(计算优化方法)从天然蛋白的片段组装,优化产生的“镶嵌”蛋白具有丰富的T细胞表位。经过模拟预测Mosaic重组抗原的三维结构模型,本发明筛选得到的Mosaic重组抗原与天然蛋白具有较高的结构相似性,具有开发为疫苗抗原的潜力。
作为本发明所述季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原的优选实施方式,所述HA蛋白包括H1蛋白或H3蛋白,所述NA蛋白包括N1蛋白或N2蛋白。
作为本发明所述季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原的优选实施方式,所述Mosaic重组抗原超过81%的Th细胞表位的12个氨基酸与流感病毒的天然H1蛋白或H3蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配。
作为本发明所述季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原的优选实施方式,所述Mosaic重组抗原超过96%的Th细胞表位的11个以上氨基酸与流感病毒的天然H1蛋白或H3蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配。
作为本发明所述季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原的优选实施方式,所述Mosaic重组抗原超过99%的Th细胞表位的10个氨基酸与流感病毒的天然H1蛋白或H3蛋白的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配。
作为本发明所述季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原的优选实施方式,所述Mosaic重组抗原超过84%的Th细胞表位的12个氨基酸与流感病毒的天然N1蛋白或N2蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配。
作为本发明所述季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原的优选实施方式,所述Mosaic重组抗原超过96%的Th细胞表位的11个以上氨基酸与流感病毒的天然N1蛋白或N2蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配。
作为本发明所述季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原的优选实施方式,所述Mosaic重组抗原超过98%的Th细胞表位的10个以上氨基酸与流感病毒的天然N1蛋白或N2蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配。
经过蛋白生物学功能的实验验证,氨基酸序列如SEQ ID No:1所示的Mosaic重组抗原能产生26的血凝效价,氨基酸序列如SEQ ID No:2所示的Mosaic重组抗原能产生27的血凝效价。
本发明的Mosaic重组抗原对于唾液酸a2,3-半乳糖受体与唾液酸a2,6-半乳糖受体均有结合能力且与PBS组对比有显著性差异(P≤0.01),其中对于a2,6-半乳糖受体结合能力更强。
作为本发明所述季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原的优选实施方式,所述Mosaic重组抗原还添加有gp67信号肽、凝血酶切割位点和8×His标签,去除HA或NA原有信号肽;针对HA蛋白添加GCN4pII序列,针对NA蛋白添加VASP序列;
所述gp67信号肽的氨基酸序列为:MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAAD;
所述GCN4pII序列为MKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEV;
所述VASP序列为SSSDYSDLQRVKQELLEEVKKELQKVKEEIIEAFVQELRKRG。
本发明还提供了编码上述季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原的基因。
本发明对处理后的Mosaic重组抗原的基因进行优化,根据昆虫细胞的密码子偏好性进行基因改造,得到优化后的基因。
作为本发明所述基因的优选实施方式,所述基因的序列如SEQ ID No:6所示。
本发明还提供了包含所述基因的载体。
作为本发明所述载体的优选实施方式,所述载体是将所述基因连接到质粒中得到。所述质粒优选为pFastBac-Dual。
本发明还提供了包含所述的基因或如所述的载体的细胞。
作为本发明所述细胞的优选实施方式,所述细胞为将基因或载体转入大肠杆菌宿主细胞中得到。
此外,本发明提供了一种所述的季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原在制备季节性甲型流感通用疫苗中的应用。
本发明提供了一种疫苗制剂,所述疫苗制剂包含所述的季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原、所述的基因、所述的载体。
作为本发明所述疫苗制剂的优选实施方式,疫苗制剂还包括免疫学和药学上可接受的载体或佐剂。所述佐剂包括铝佐剂、弗氏佐剂、磷酸铝、磷酸钙、石蜡油、羊毛脂、表面活性剂、藻酸钙、多聚核苷酸、胞壁肽、皂苷、RIBI佐剂系统、霍乱毒素、丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物、油包水乳剂、水包油乳剂中的一种或几种。
本发明还提供了上述疫苗制剂在制备预防和/或治疗季节性甲型流感药物中的应用。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
(1)本发明通过对现有已知的2009-2021年全部人源H1N1与H3N2的HA、NA的氨基酸序列进行数据分析,利用Mosaic设计策略得到能覆盖天然序列的潜在T细胞表位的最大多样性的流感病毒HA与NA Mosaic重组抗原序列;
(2)本发明设计的流感病毒体HA与NA Mosaic重组抗原由天然序列的短肽组装形成,通过抗原表位覆盖率分析、遗传进化分析以及空间构象分析,其与抗原覆盖率高,与疫苗株亲缘关系相近并与天然蛋白具有很好的结构相似性,具有开发为疫苗抗原的潜力。
(3)本发明的流感病毒体HA与构建的Mosaic重组蛋白在开发流感病毒通用型疫苗方面具有潜在的应用前景和价值,其抗原的T细胞免疫应答有望成为研发流感疫苗的重要考虑方向。
附图说明
图1为H1m重组序列对于2009-2021年全部人源H1N1的HA氨基酸序列抗原表位覆盖率平均值示意图;
图2为H3m重组序列对于2009-2021年全部人源H3N2的HA氨基酸序列抗原表位覆盖率平均值示意图;
图3为N1m重组序列对于2009-2021年全部人源H1N1的NA氨基酸序列抗原表位覆盖率平均值示意图;
图4为N2m重组序列对于2009-2021年全部人源H3N2的NA氨基酸序列抗原表位覆盖率平均值示意图;
图5为H1m重组序列每个氨基酸的抗原表位覆盖率示意图;
图6为H3m重组序列每个氨基酸的抗原表位覆盖率示意图;
图7为N1m重组序列每个氨基酸的抗原表位覆盖率示意图;
图8为N2m重组序列每个氨基酸的抗原表位覆盖率示意图;
图9为H1m重组序列的抗原表位缺失率示意图;
图10为H3m重组序列的抗原表位缺失率示意图;
图11为N1m重组序列的抗原表位缺失率示意图;
图12为N2m重组序列的抗原表位缺失率示意图;
图13为H1m重组序列的遗传进化分析示意图;
图14为H3m重组序列的遗传进化分析示意图;
图15为N1m重组序列的遗传进化分析示意图;
图16为N2m重组序列的遗传进化分析示意图;
图17为Mosaic重组抗原的三维结构模型模拟示意图;
图18为杆状病毒系统表达Mosaic重组蛋白的Western Blot结果图;
图19为Mosaic重组蛋白洗脱液的考马斯亮蓝染色结果图;
图20为Mosaic重组蛋白的血凝实验结果图;
图21为Mosaic重组蛋白的糖受体结合实验结果图;
图22为Mosaic重组蛋白的神经氨酸酶活性实验结果图;
图23为Mosaic重组蛋白的血凝抑制动物实验结果图;
图24为Mosaic重组蛋白的神经氨酸酶抑制动物实验结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点,下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
在以下实施例中,所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法,所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。
流感病毒HA与NA蛋白在病毒入侵与释放中起着重要作用,其免疫原性强,可以诱发强烈的特异性抗体和T细胞反应。Mosaic疫苗主要是针对抗原表位多变的病毒设计,其目标是使用天然序列产生少量“镶嵌”序列,使其包含来自天然序列的潜在T细胞表位的最大多样性。利用遗传算法(计算优化方法)从天然蛋白质的片段组装,优化产生的“镶嵌”蛋白类似于来自天然病毒蛋白并具有丰富的T细胞表位,因此可以作为抗原用于候选疫苗设计。
实施例1、一种季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原的构建
1、通用Mosaic重组抗原序列设计与优化:
1)利用GISAID与NCBI数据库下载2009-2021年全部人源H1N1与H3N2的HA、NA的氨基酸序列,剔除重复序列与质量较差的序列后得到7609条H1氨基酸序列,9262条氨基酸H3序列,8590条N1氨基酸序列,9942条氨基酸N2序列。
2)将处理后的氨基酸序列以FAS格式上传至Mosaic Vaccine Designer程序,设置以下参数:Cocktail Size设置为“1",以获得1条Mosaic序列供下一步使用;表位长度设置为“12”以获得涵盖较多CD4+Th细胞表位的Mosaic序列;阈值设置为“3”以减少罕见的、在天然表位中出现次数低的稀有表位的数目;经遗传算法运算后,最终获得了一系列由12个氨基酸组成的短肽组装而成的Mosaic序列。其后使用遗传算法依次对每个群体进行优化,其中生成新的重组体并计算测试它们的抗原表位覆盖率,最终获得4条Mosaic重组抗原序列(SEQ ID NO:1-4所示)。
2、通用Mosaic重组抗原序列筛选与鉴定
对上述获得的Mosaic重组抗原序列进行抗原表位覆盖率分析、遗传进化分析以及空间构象分析。
1)使用Epitope Coverage Assessment Tool(Epicover)来评估Mosaic蛋白的抗原表位覆盖率。首先将Mosaic重组抗原序列作为抗原蛋白添加到相应位置。同时将之前在GISAID与NCBI上下载分析比对好的完整毒株氨基酸序列设置为测试蛋白集也添加到相应位置。将表位长度设置为12,最大氨基酸错配数设置为2,最后的结果以计算出的Mosaic重组抗原序列对所有背景蛋白集表位覆盖率的平均值来表示。
根据表1所示,在Mosaic重组抗原序列(命名为H1m或H3m)上超过81%的Th细胞表位的12个氨基酸与甲型流感的天然H1蛋白或H3蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配(12/12匹配),在Mosaic重组抗原序列上超过96%的Th细胞表位的11个以上氨基酸与甲型流感的天然H1蛋白或H3蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配(11/12匹配),在Mosaic重组抗原序列上超过99%的Th细胞表位的10个以上氨基酸与甲型流感的天然H1蛋白或H3蛋白的Th表位的12个氨基酸完全匹配(10/12匹配)。
在Mosaic重组抗原序列(命名为N1m或N2m)所述Mosaic重组抗原超过84%的Th细胞表位的12个氨基酸与流感病毒的天然N1蛋白或N2蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配(12/12匹配),在Mosaic重组抗原超过96%的Th细胞表位的11个以上氨基酸与流感病毒的天然N1蛋白或N2蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配(11/12匹配),在Mosaic重组抗原超过98%的Th细胞表位的10个以上氨基酸与流感病毒的天然N1蛋白或N2蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配(10/12匹配)。
Mosaic重组抗原序列对于整体抗原表位覆盖率平均值如图1-4所示。Mosaic重组抗原序列为HAm和NAm。
表1
Mosaic重组抗原 天然序列条数 Off-by-0 Off-by-1 Off-by-2
H1m 7609 88.27% 98.27% 99.61%
H3m 9262 81.82% 96.81% 99.26%
N1m 8590 84.47% 96.16% 98.48%
N2m 9942 84.84% 97.69% 99.73%
2)使用Positional Epitope Coverage Assessment Tool(Posicover)来分析Mosaic重组抗原的在每一位氨基酸的表位覆盖率。首先将Mosaic重组抗原作为抗原蛋白添加到相应位置,同时设置之前在GISAID与NCBI上下载分析比对好的毒株氨基酸序列作为测试蛋白集,也添加到相应位置。将表位长度设置为12,最后的结果以平均表位覆盖率来表示。Mosaic重组抗原序列每个氨基酸的抗原表位覆盖率示意图如图5-8所示;Mosaic重组抗原序列的抗原表位缺失率示意图如图9-12所示,Mosaic重组抗原序列表位覆盖率较高且12mer缺失率整体较低。
3)选取2009-2022年季节性甲型流感病毒疫苗株的HA、NA基因与HAm、NAm进行遗传进化分析,使用最大似然法进行统计分析后绘制HA、NA基因的进化树。Mosaic重组抗原序列遗传进化分析示意图如图13-16所示,Mosaic重组抗原与多种疫苗株亲缘关系较近,说明设计的Mosaic重组抗原有作为疫苗抗原的潜力。
4)通过模拟预测Mosaic重组抗原的三维结构模型,评估Mosaic重组抗原的天然免疫功能。如图17所示(图17-A为H1m重组抗原的三维结构模型模拟示意图,图17-B为H3m重组抗原的三维结构模型模拟示意图,图17-C为A/Puerto Rico/8/1934毒株HA蛋白的三维结构模型模拟示意图,图17-D为N1m重组抗原的三维结构模型模拟示意图,图17-E为N2m重组抗原的三维结构模型模拟示意图,图17-F为A/Aichi/2/1968毒株NA蛋的三维结构模型模拟示意图),4种Mosaic重组抗原与其天然蛋白的Global Model Quality Estimate(QMQE)评分分别为:H1m蛋白:0.74、H3m蛋白:0.78、HA蛋白:0.80;N1m蛋白:0.81、N2m蛋白:0.78、NA蛋白:0.79,说明Mosaic重组抗原与天然蛋白具有较高的结构相似性。
3、通用Mosaic重组抗原序列的基因优化与合成
对于设计的得到的4种Mosaic重组抗原H1m、H3m、N1m及N2m的氨基酸序列,进一步去除HA、NA原有信号肽,添加gp67信号肽(MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAAD),针对HA蛋白序列添加GCN4pII序列(MKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEV);针对NA蛋白序列添加VASP序列(SSSDYSDLQRVKQELLEEVKKELQKVKEEIIEAFVQELRKRG),而后共同添加凝血酶切割位点(LVPRGS)与8×His tag(HHHHHHHH)。对处理后的Mosaic重组抗原序列的编码基因进行优化,根据昆虫细胞的密码子偏好性进行基因改造,得到优化后的基因序列(如SEQ IDNO.5-8所示)。
实施例2、Mosaic重组蛋白的表达
本实施例采用Invitrogen公司Bac-to-Bac杆状病毒表达系统表达所需蛋白。
1、杆状病毒重组质粒的构建:
对Mosaic重组抗原H1m、H3m、N1m及N2m的编码基因与pFastBac-Dual载体的基因进行多克隆位点分析,选择pFastBac-Dual载体上提供而目的片段上没有的两个限制性内切酶位点(EcoRI、HindIII),经过目的片段扩增酶切回收后,将目的片段插入pFastBac-Dual载体的pH启动子后的多克隆位点中,经大肠杆菌DH5α感受态细胞转化后获得含有所述H1m、H3m、N1m及N2m抗原的重组质粒。
2、杆状病毒重组穿梭质粒(bacmid)的提取:
将步骤1获得的重组质粒经大肠杆菌DH10Bac感受态细胞转化,经过蓝白斑筛选,在含有卡那霉素(50μg/mL)、四环素(10μg/mL)与庆大霉素(7μg/mL)的LB中培养过夜后提取bacmid(购买自碧云天,货号D0031),即获得含有所述H1m、H3m、N1m及N2m抗原的重组杆状病毒穿梭质粒。
3、Bacmid细胞转染及蛋白表达:
将步骤2所述的Bacmid与空杆粒(作为空白对照)分别转染至sf9昆虫细胞,27℃恒温摇床培养72h,获得P0代重组杆状病毒。按照MOI=3接种sf9昆虫细胞后,获得P1代重组杆状病毒,使用蛋白质免疫印迹法(Western Blot,WB)检测细胞上清液中目的蛋白表达情况,如图18所示(图18-A为H1m重组蛋白的Western Blot结果图,图18-B为H3m重组蛋白的Western Blot结果图,图18-C为N1m重组蛋白的Western Blot结果图,图18-D为N2m重组蛋白的Western Blot结果图,图18中1代表P1代重组杆状病毒的细胞上清液,2代表P2代重组杆状病毒的细胞上清液,3代表P2代重组杆状病毒的细胞裂解液,4代表空白对照,M为蛋白ladder)。
4、连续传达扩大培养:
重组蛋白表达鉴定成功后,每日观察细胞死亡率,当P1培养物细胞死亡率大于90%时,按照MOI=3连续两代接种sf9昆虫细胞,获得P3代重组杆状病毒,待P3代培养物细胞死亡率约为50%时,在4℃中以3000×g离心30min,弃去沉淀,收集上清。
5、蛋白浓缩及蛋白纯化:
将步骤4获得的上清经过vivaflow200膜包进行浓缩,使用PBS经过三次置换后得到浓缩液100mL,在4℃中以10000rpm离心10min,收集上清,经0.22μM滤膜过滤后得到的液体置于4℃,使用微量蠕动泵采用5mL/min的流速使液体流过镍亲和柱至液体全部过柱,此时蛋白结合在镍亲柱中。使用AKTA蛋白纯化系统进行亲和层析,首先将1号柱位原始的柱子拆除,将柱位阀门流入管道1A,流出管道为1B的两线接头处用连通器塞好后置换系统中的Buffer。Buffer置换完毕后,将镍亲和柱接入1号柱位,开始利用含有5mM咪唑的磷酸平衡缓冲液与含有500mM咪唑的磷酸洗脱缓冲液进行连续浓度梯度洗脱,并收集洗脱液。
根据洗脱后的紫外吸收峰图,挑选亲和层析后收获的含目的蛋白的洗脱液并进行SDS-PAGE电泳,后使用考马斯亮蓝染色,如图19(图19-A为H1m重组蛋白洗脱液的考马斯亮蓝染色结果图,图19-B为H3m重组蛋白洗脱液的考马斯亮蓝染色结果图,图19-C为N1m重组蛋白洗脱液的考马斯亮蓝染色结果图,图19-D为N2m重组蛋白洗脱液的考马斯亮蓝染色结果图(方框内为目的蛋白表达正确条带)。根据染色结果用超滤管进行离心浓缩至体积为0.5mL。将浓缩液13000×g离心10min后,取上清液分装,液氮速冻后存于-80℃备用。
实施例3、Mosaic重组蛋白生物学功能的验证实验
1、血凝活性验证:
对纯化后的Mosaic重组蛋白与空白对照的细胞培养上清的血凝滴度进行1%豚鼠红细胞的血凝检测:在96孔血凝板的2-12列中每孔加入50μL PBS,吸取50μL纯化后的Mosaic重组蛋白与对照样品分别加入96孔血凝板中的第1列中,吹打混匀后吸取50μL加入第2列中,再次吹打混匀后吸取50μL加入第3列中,依次进行倍比稀释直至第11列弃去50μL。每次吹打混匀后需要换新枪头,在各孔中加入1%豚鼠红细胞,震荡混匀后室温静置25min后读数,读数时,以完全出现凝集的孔作为样品的血凝滴度。
结果如图20所示,可以观察10μg的H1m重组蛋白能够产生26的血凝效价,10μg的H3m重组蛋白能够产生27的血凝效价,而在空白对照组(Mock)则没有看到有血凝现象的产生。
2、糖受体结合能力验证:
在96孔板第1列加入50μL PBS,在第2,3列加入50μL用PBS稀释至500ng/mL的3'SLN-PAA-biot,6'SLN-PAA-biot(购自GlycoNZ,货号为GNZ-0036-BP与GNZ-0997-BP),每个蛋白两个复孔,置于4℃孵育过夜。将板子放入紫外交联机,波长254nm,作用10min左右,弃去板内液体,PBS洗板1次,每次3分钟,加入100μL/孔1w/v%BSA in PBS封闭,置于4℃孵育过夜。弃去各孔中的溶液,用PBS洗涤3次,每次3min,每孔加入50μL 2μg HAm重组蛋白,置于4℃孵育过夜。使用PBST洗板6次,每次3min,每孔加50μL1:4000稀释的抗Influenza AvirusH1N1的HA抗体(购自GeneTex,货号为GTX127357);抗Influenza Avirus H3N2的HA抗体购自GeneTex,货号为GTX127363),室温孵育2h。使用PBST洗板6次,每次3min,每孔加100μL1:8000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG(购自弗德生物,货号为FDR007),室温孵育1h。使用PBST洗板6次,每次3min。每孔中加入100μLTMB染色液,置于室温反应30min;每孔加入50μL的2M的H2SO4溶液终止反应,立即使用酶标仪测定450nm与630nm处吸的吸光度值(OD450nm与OD630nm)。
结果如图21显示,H1m与H3m重组蛋白对于唾液酸a2,3-半乳糖受体与唾液酸a2,6-半乳糖受体均有结合能力且与PBS组对比有显著性差异(P≤0.01),其中对于a2,6-半乳糖受体结合能力更强。
3、神经氨酸酶活性实验
本实验采用神经氨酸酶检测试剂盒检测(购自碧云天,货号为P0306):
1)阳性和阴性对照检测的准备:a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70μL神经氨酸酶检测缓冲液。b.每孔再分别加入10或0μL神经氨酸酶。c.每孔再加入10μL溶解神经氨酸酶样品的溶液。d.每孔再加入0或10μLMilli-Q水使每孔总体积为90μL。
2)样品检测的准备:a.在96孔荧光酶标板内每孔加入70μL神经氨酸酶检测缓冲液。b.每孔再加入10μL神经氨酸酶样品。c.每孔再加入10μLMilli-Q水使每孔总体积为90μL。
3)检测:a.振动混匀约1分钟。b.每孔加入10μL神经氨酸酶荧光底物。c.再振动混匀约1分钟。d.37℃孵育30分钟后进行荧光测定。激发波长为322nm,发射波长为450nm。
结果如图22所示,N1m与N2m重组蛋白均具有相对较高的神经氨酸酶活性且二者对比PBS组有显著性差异((P≤0.05或P≤0.01)。
实施例4、Mosaic重组蛋白免疫效果评价
利用实施例2表达纯化得到的4种Mosaic重组蛋白(H1m、H3m、N1m及N2m重组蛋白)为免疫原,对BALB/c小鼠进行免疫,考察Mosaic重组蛋白的免疫效果。
1.免疫小鼠:
使用BCA检测试剂盒(购买自碧云天公司,货号为P0012)分别检测4种Mosaic重组蛋白的浓度,将蛋白与7万单位/mL的IL-2和0.1%壳聚糖均匀混合,得到Mosaic重组蛋白疫苗(HAm蛋白疫苗和NAm蛋白疫苗)。
选取15只6~8周龄的BALB/c雌性小鼠随机分为3组(空白对照组:肌肉注射100μLPBS;免疫HAm组:肌肉注射100μL含有60μg的2种HAm蛋白疫苗;免疫NAm组:肌肉注射100μL含有60μg的2种NAm蛋白疫苗),在第0周与第2周时按分组情况对BALB/c雌性小鼠进行免疫,在免疫后第0周和第4周(第28天)对各组小鼠进行眼眶采血,4℃静置过夜后经3000rpm离心10min获得血清,分装后置于-80℃冰箱备用。
2.血凝抑制(hemagglutination inhibiion,HAI)实验:
1)制备RDE处理后的小鼠血清:将受体破坏酶(RDE,购买自日本生研,货号为340122)分别与各组小鼠的血清按体积比3:1混合于试管中,置于37℃水浴16h;取出试管,置于56℃水浴30min灭活RDE;向试管中加入PBS,使血清稀释度达到1:10;冷却至室温后加入原始血清1/2体积的鸡红血球并充分混匀,置于4℃保存1h,期间每隔15min重新混匀一次;1200rpm离心1min,吸取上清,得到RDE处理的小鼠血清,4℃静置备用。
2)四单位标准抗原的制备:分别检测A/Victoria/2570/2019(H1N1亚型毒株,由中国疾病预防控制中心馈赠)、A/Cambodia/E0826360/2020(H3N2亚型毒株,由中国疾病预防控制中心馈赠)的HA效价,用PBS将各抗原稀释为8个血凝单位,再次进行HA效价确认,进一步稀释为4个血凝单位,即得到四单位标准抗原。
3)血凝抑制实验:在96孔板的第2~10列与第12列各孔中加入25μLPBS,在第11列的各孔中加入50μLPBS;在第1列和第2列各孔中加入25μL经RDE处理后的小鼠血清,混匀;吸取25μL第2列混合后的溶液,加入到第3列中,混匀;重复上述操作,直到第10列,并将第10列中混匀后的溶液弃去25μL;向第1~10列和第12列中加入25μL四单位标准抗原,其中,第12列作为病毒对照列,同时向第11列加入阳性血清(实验室前期得到的小鼠血清,经过验证对相应毒株有血凝效价)做标准阳性对照;充分混匀后将96孔板置于室温静置45min;每孔加入50μL1%鸡红细胞悬液,室温静置25min,将96孔板作45℃倾斜,观察红细胞是否呈泪滴状流淌。
结果如图23所示,流感病毒特异性血凝抑制抗体显示在首次免疫后第4周(D28),免疫HAm组的小鼠血清针对于2021-2022年季节性流感病毒两株疫苗株均呈现出一定的交叉保护效果,并显著性高于空白对照组(P≤0.05)
3.神经氨酸酶抑制(Neuraminidase Inhibition,NI)实验
1)PNA-HPRO用量的测定:在96孔板中加入1%BSAin PBST作为样品稀释剂,第1-11列每孔加入216μL。解冻病毒,混匀后第1-11列每孔加入24μL。取出胎蛋白包被的96孔板中使用PBST洗板6次,每次3min。将稀释后的病毒平行转移50μL至胎蛋白包被的96孔板中,每孔补加50μL样品稀释剂,第12列补加100μL样品稀释剂,轻摇混匀后放入37℃培养箱中孵育16小时。孵育结束后,吸弃板中液体,使用PBST洗板6次,每次3min。第1-10列每列依次加入100μL按照1:200、1:400、1:500、1:800、1:1000、1:1600、1:2000、1:3000、1:4000、1:5000稀释的PNA-HRPO(原浓度1mg/mL)后室温孵育2h。使用PBST洗板6次,每次3min。每孔中加入100μLTMB染色液,置于室温反应30min;每孔加入50μL的2M的H2SO4溶液终止反应,立即使用酶标仪测定450nm处吸的吸光度值(OD450nm)。根据结果确定PNA-HPRO用量。
2)NA用量的测定:在96孔板中加入1%BSAin PBST作为样品稀释剂,第2-12列每孔加入120μL,第1列每孔加入216μL。解冻病毒,混匀后加入24μL至第1列,连续进行2倍稀释至第11列。取出胎蛋白包被的96孔板中使用PBST洗板6次,每次3min。将稀释后的病毒平行转移50μL至胎蛋白包被的96孔板中,每孔补加50μL样品稀释剂,轻摇混匀后放入37℃培养箱中孵育16小时。孵育结束后,吸弃板中液体,使用PBST洗板6次,每次3min。在第1-11列每孔加入100μL上述步骤确定好用量的PNA-HPRO,室温孵育2h。使用PBST洗板6次,每次3min。每孔中加入100μLTMB染色液,置于室温反应30min;每孔加入50μL的2M的H2SO4溶液终止反应,立即使用酶标仪测定450nm处吸的吸光度值(OD450nm)。根据结果确定NA用量。
3)制备RDE处理后的小鼠血清:将受体破坏酶(RDE,购买自日本生研,货号为340122)分别与各组小鼠的血清按体积比3:1混合于试管中,置于37℃水浴16h;取出试管,置于56℃水浴30min灭活RDE;向试管中加入PBS,使血清稀释度达到1:10;冷却至室温后加入原始血清1/2体积的鸡红血球并充分混匀,置于4℃保存1h,期间每隔15min重新混匀一次;1200rpm离心1min,吸取上清,得到RDE处理的小鼠血清,4℃静置备用。
4)神经氨酸酶抑制实验:在96孔板中加入1%BSA in PBST作为样品稀释剂,第3-11列每孔加入120μL,第2列每孔加入216μL。取经过RDE处理后的小鼠血清加入24μL至第1列,连续进行2倍稀释至第11列。取出胎蛋白包被的96孔板中使用PBST洗板6次,每次3min。将稀释后的血清平行转移50μL至胎蛋白包被的96孔板中,第1-11列每孔加入50μL前述步骤确定好NA用量的病毒,轻摇混匀后放入37℃培养箱中孵育16小时。孵育结束后,吸弃板中液体,使用PBST洗板6次,每次3min。在第1-11列每孔加入100μL前述步骤确定好用量的PNA-HPRO,室温孵育2h。使用PBST洗板6次,每次3min。每孔中加入100μLTMB染色液,置于室温反应30min;每孔加入50μL的2M的H2SO4溶液终止反应,立即使用酶标仪测定450nm处吸的吸光度值(OD450nm)。
结果如图24所示,在首次免疫后第4周(第28天),NAm免疫组的小鼠血清针对于A/Victoria/2570/2019与A/Cambodia/E0826360/2020两种疫苗株产生了特异性神经氨酸酶抑制抗体,并显著高于空白对照组(P≤0.05或P≤0.01),提示本发明的Mosaic重组蛋白免疫对小鼠产生了一定的保护效果。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (20)

1.一种季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原,其特征在于,所述Mosaic重组抗原为:
(a)由SEQ ID No:2所示的氨基酸序列组成的抗原;或者,
(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸组成的抗原。
2.如权利要求1所述的季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原,其特征在于,所述Mosaic重组抗原的Th细胞表位与流感病毒的天然HA蛋白上的Th细胞表位相比,Th细胞表位覆盖率大于81%;所述Mosaic重组抗原的Th细胞表位与流感病毒的天然NA蛋白上的Th细胞表位相比,Th细胞表位覆盖率大于84%。
3.如权利要求2所述的季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原,其特征在于,所述HA蛋白包括H1蛋白或H3蛋白,所述NA蛋白包括N1蛋白或N2蛋白。
4.如权利要求3所述的季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原,其特征在于,所述Mosaic重组抗原超过81%的Th细胞表位的12个氨基酸与流感病毒的天然H1蛋白或H3蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配。
5.如权利要求3所述的季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原,其特征在于,所述Mosaic重组抗原超过96%的Th细胞表位的11个以上氨基酸与流感病毒的天然H1蛋白或H3蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配。
6.如权利要求3所述的季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原,其特征在于,所述Mosaic重组抗原超过99%的Th细胞表位的10个氨基酸与流感病毒的天然H1蛋白或H3蛋白的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配。
7.如权利要求3所述的季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原,其特征在于,所述Mosaic重组抗原超过84%的Th细胞表位的12个氨基酸与流感病毒的天然N1蛋白或N2蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配。
8.如权利要求3所述的季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原,其特征在于,所述Mosaic重组抗原超过96%的Th细胞表位的11个以上氨基酸与流感病毒的天然N1蛋白或N2蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配。
9.如权利要求3所述的季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原,其特征在于,所述Mosaic重组抗原超过98%的Th细胞表位的10个以上氨基酸与流感病毒的天然N1蛋白或N2蛋白上的Th细胞表位的12个氨基酸完全匹配。
10.如权利要求1所述的季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原,其特征在于,所述Mosaic重组抗原还添加有gp67信号肽、凝血酶切割位点和8×His标签,去除HA或NA原有信号肽;针对HA蛋白添加GCN4pII序列,针对NA蛋白添加VASP序列;
所述gp67信号肽的氨基酸序列为:MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAAD;
所述GCN4pII序列为MKQIEDKIEEILSKIYHIENEIARIKKLIGEV;
所述VASP序列为SSSDYSDLQRVKQELLEEVKKELQKVKEEIIEAFVQELRKRG。
11.编码如权利要求1~10任一项所述的季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原的基因。
12.如权利要求11所述的基因,其特征在于,所述基因的序列如SEQ ID No:6所示。
13.包含如权利要求11或12所述基因的载体。
14.如权利要求13所述的载体,其特征在于,所述载体是将如权利要求11或12所述基因连接到表达质粒中得到。
15.包含如权利要求11或12所述的基因或如权利要求13或14所述的载体的细胞。
16.如权利要求15所述的细胞,其特征在于,所述细胞为将基因或载体转入大肠杆菌宿主细胞中得到。
17.一种如权利要求1~10任一项所述的季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原在制备季节性甲型流感通用疫苗中的应用。
18.一种疫苗制剂,其特征在于,所述疫苗制剂包含如权利要求1~10任一项所述的季节性甲型流感通用Mosaic重组抗原、如权利要求11或12所述的基因、如权利要求13或14所述的载体。
19.如权利要求18所述的疫苗制剂,其特征在于,还包括免疫学和药学上可接受的载体或佐剂。
20.一种如权利要求18或19所述的疫苗制剂在制备预防和/或治疗季节性甲型流感药物中的应用。
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