CN112111503A - 同时预防禽流感h5和h9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法 - Google Patents

同时预防禽流感h5和h9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法。本发明采用禽流感H5亚型和H9亚型的血凝素抗原为核心抗原，合成融合基因H5H9HA，并采用腺病毒作为载体，把融合基因H5H9HA克隆到腺病毒穿梭载体pDC315上，然后与骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染入293细胞中，完成重组腺病毒的生产，再经过扩增和纯化，得到高纯度的携带血凝素抗原的重组腺病毒rAd‑H5H9HA，经过冻干和包装后处理，得到同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗。该疫苗能够诱导高水平的H5亚型特异性抗体和H9亚型特异性抗体，抗体的水平与目前商业用的全病毒灭活疫苗相一致，超出了国家规定的免疫标准，在禽流感免疫预防领域具备巨大的应用前景和推广价值。

Description

同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备 方法
技术领域
本发明涉及生物制品技术领域，尤其涉及一种同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法。
背景技术
禽流感是由A型流感病毒引起的一种禽类的急性、烈性、接触性呼吸道传染病，禽流感可分为高致病性禽流感和低致病性禽流感。高致病性禽流感已在亚洲一些国家成为地方流行性疾病，被世界动物卫生组织(OIE)列为“通报性动物疫病”，在我国也被列为一类动物传染病。禽流感不仅可以感染禽类，也可以感染人类及其他的哺乳动物，因此对禽流感的防制具有公共卫生学意义。
禽流感根据AIV血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的不同可分为16个HA亚型，9个NA亚型，目前我国主要流行H5和H9亚型。H5亚型高致病性禽流感的威胁仍然很大，近10余年来H5亚型毒株仍是在全国流行的优势毒株，而H5N6亚型发病的比例成上升趋势，是造成的损失比较严重的一个亚型之一；与此同时，近年来H9N2亚型禽流感在我国养禽业中呈地方性流行，呈现感染日龄早、发病率和死亡率增高、传播速度加快等特点，对养鸡业持续造成威胁。因此，有效预防H5N6亚型和H9N2亚型的流行仍是当前防控禽流感疫情的重点，而迄今为止疫苗仍然是预防和控制禽流感最有效的武器。
现有技术中，由鸡胚培养制作的油乳剂灭活疫苗是多年来我国用于禽流感预防最主要的疫苗种类，在防控禽流感的实践中发挥着重要作用。但该类疫苗存在鸡胚质量控制难度大、工艺复杂、产生废物较多、总体生产成本高等缺陷，制约着我国禽流感疫苗质量的提高。为提升禽流感疫苗的质量和防疫效果，近年来国内外学者在新型禽流感疫苗的研发方面开展了大量探索和创新，在基因工程疫苗方面做了大量的工作，特别是在类颗粒病毒(VLP)和病毒载体疫苗禽流感疫苗的研发取得了许多可喜的进展。国外多位学者用腺病毒载体携带H5N1完整HA基因的重组腺病毒免疫小鼠和SPF鸡都获得良好的保护。综合国内外研究的结果显示，以禽流感血凝素抗原HA为主要保护性抗原基因构建重组的腺病毒禽流感疫苗具有良好的免疫效果和应用前景。
申请号为CN201610640234.1的发明专利公开了一种H7亚型重组禽流感病毒活载体疫苗毒种的制备方法。该制备方法的具体步骤如下：携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒载体的构建；携带H7N9/H7N7亚型禽流感病毒HA重组腺病毒毒种的拯救；病毒扩增；收集病毒颗粒；病毒纯化；半成品配制。但是该疫苗的不足之处在于：只能对一种禽流感H7亚型病毒进行特异性免疫，功能单一，且不会对H5和H9等亚型的禽流感感染产生免疫保护；根据权威的流行病学调查，在当前国内鸡群中流行最广而且造成危害最大的两个亚型禽流感就是H5亚型和H9亚型，而相对而言H7亚型在鸡群中造成的危害比H5亚型和H9亚型要轻微很多。
有鉴于此，有必要提供一种能够同时免疫两种或两种以上禽流感亚型病毒的禽流感腺病毒载体疫苗，用以满足实际应用的需要。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法。
为了实现上述发明目的，本发明提供了一种融合基因H5H9HA。所述融合基因H5H9HA由禽流感H5亚型血凝素抗原HA基因和禽流感H9亚型血凝素抗原HA基因融合而成；所述融合基因H5H9HA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种重组腺病毒rAd-H5H9HA。所述重组腺病毒rAd-H5H9HA包含上述融合基因H5H9HA。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗。所述同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗包含上述重组腺病毒rAd-H5H9HA。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了上述同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗的制备方法，包括如下步骤：
S1，质粒pUC57-H5H9HA的制备：首先，制备所述融合基因H5H9HA，然后，在所述融合基因H5H9HA序列的一端加上kozak序列后再增加EcoRI酶切位点，在另一端加上NheI酶切位点；其中，H5H9HA可以为全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得编码H5亚型HA抗原和H9亚型HA抗原的DNA序列，然后将其拼接起来，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列；或者可采用例如重叠PCR的方式合成而得；然后将预处理后的融合基因H5H9HA克隆到载体pUC57中，得到带有目的融合基因H5H9HA的所述质粒pUC57-H5H9HA；
S2，腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA的构建：采用限制性内切酶EcoRI和NheI对腺病毒穿梭载体pDC315和所述质粒pUC57-H5H9HA进行双酶切处理，得到双酶切后的腺病毒穿梭载体pDC315片段和双酶切后的融合基因H5H9HA片段，然后进行连接反应，得到所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA；
S3，重组腺病毒载体的包装和扩繁：运用AdMax腺病毒包装体系，将步骤S2制备的所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA进行包装和扩繁，得到四代重组腺病毒rAd-H5H9HA；
S4，重组腺病毒rAd-H5H9HA的PCR鉴定及扩增纯化：设计所述融合基因H5H9HA的上游引物和下游引物，进行PCR鉴定、扩增和纯化处理，得到大量纯化后的所述重组腺病毒rAd-H5H9HA，然后进行冻干、分装处理，制备得到所述同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗。
优选的，在步骤S1中，所述融合基因H5H9HA的合成工艺包括如下步骤：
A1，筛选禽流感H5N6亚型和H9N2亚型的优势毒株，并确定前述毒株的HA基因序列；
A2，将所述H5N6亚型HA基因序列中的终止密码子及后续序列去除，然后紧接所述H9N2亚型的HA基因序列中的起始密码子，直至所述H9N2亚型的HA基因序列的终止密码子，基因融合处理，得到融合基因H5H9HA；融合基因H5H9HA可以为全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得编码H5亚型HA抗原和H9亚型HA抗原的DNA序列，然后将其拼接起来，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列；或者可采用例如重叠PCR的方式合成而得。
优选的，在步骤S2中，还包括对所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA的鉴定处理，具体过程为：
将连接反应得到的所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA转化入大肠杆菌DH5α，挑选单菌落小提质粒，用NheI/XmaI一次双酶切鉴定出阳性克隆，然后进行测序，确认目的融合基因H5H9HA成功克隆入所述腺病毒穿梭载体pDC315中。
优选的，在步骤S3中，重组腺病毒载体的包装和扩繁的具体步骤如下：
P1，运用AdMax腺病毒包装体系，将所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA与辅助包装质pBHGlox(delta)E1,3Cre通过LipofectamineTM 2000共转染至293细胞中；
P2，利用Cre/loxP重组酶系统实现重组，产生重组腺病毒的细胞中出现典型的细胞病变效应，待预定比例的细胞出现典型的细胞病变后，收集毒液，进行后处理，制备得到Ad-H5H9HA病毒原液；
P3，将步骤P2制备的所述Ad-H5H9HA病毒原液，用细胞维持液按照1:10的比例感染新的293细胞，重复步骤P1和步骤P2的过程重复三次，制备出所述四代重组腺病毒rAd-H5H9HA。
优选的，在步骤S4中，所述融合基因H5H9HA的上游引物为5’-gaattcctggatccgccaccatgga-3’；下游引物为5’-ttatatacaaatgttgcatctgca-3’。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了一种融合抗原。所述融合抗原由上述融合基因H5H9HA进行表达，又或者由上述重组腺病毒rAd-H5H9HA进行表达，或者由上述同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗进行表达；
所述融合抗原的氨基酸序列表如序列表SEQ ID NO：2所示；所述融合抗原具有：禽流感H5亚型HA蛋白和禽流感H9亚型HA蛋白；
所述融合抗原对禽流感H5亚型病毒和禽流感H9亚型病毒同时具有特异性免疫作用。
为了实现上述发明目的，本发明还提供了上述同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗在禽流感免疫预防领域中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
1、本发明提供的重组腺病毒rAd-H5H9HA和同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗，能够诱导高水平的H5亚型特异性抗体和H9亚型特异性抗体，抗体的水平与目前商业用的全病毒灭活疫苗相一致，超出了国家规定的免疫标准，首次实现了禽流感疫苗的生产只通过一次细胞培养就可以得到两种禽流感抗原、一个疫苗同时预防两种亚型禽流感的理想效果。
2、本发明提供的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗，相比于目前广泛应用的鸡胚培养禽流感病毒灭活疫苗采用鸡胚培养工艺来生产中存在的生产周期长、安全性差、原材料受限、占用厂区、生产废弃物处理环保压力大等缺陷。本发明制备的腺病毒载体禽流感疫苗(同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗)完全避免了上述现有技术的缺陷，在疫苗的产业化上具有明显的优势；其次，腺病毒载体疫苗是一个技术平台，由于腺病毒的包装容量较大，可以同时容纳2个以上的多基因表达(本发明已经证实了2个基因的共表达)，以后根据禽流感的流行情况，能够更换、增加新的血清型的抗原基因，以及和其他如新城疫等禽类传染病的保护性抗原共同组成融合基因，组成可以预防多种传染病的多价疫苗，大大方便养殖业户的实际应用。因此腺病毒载体疫苗在禽流感及相关病毒疫苗的应用前景广阔。
3、本发明提供的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗，其生产工艺为细胞培养—病毒接种—病毒收获—病毒纯化—冻干及成品分装，生产周期仅为7天。而且本发明重组腺病毒rAd-H5H9HA的培养使用传代细胞。相比的，现在国内最常用的商品化禽流感油乳剂灭活疫苗使用鸡胚为原料生产；其生产工艺为鸡胚前孵化—病毒接种—鸡胚后孵化—冻胚及收获病毒—病毒灭活—佐剂与病毒乳化—分装成品，由于鸡胚孵化时间较长，一个生产周期至少15天。因此，本发明提供的制备方法很大程度上缩短了生产周期，简化了生产工艺，具备巨大的商业推广价值。
4、本发明提供的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗，以腺病毒作为载体，表达融合基因H5H9HA的融合蛋白(融合抗原)，而诱导机体产生特异的针对H5亚型和H9亚型禽流感的预防作用。该腺病毒载体禽流感疫苗对H5和H9禽流感有足够的预防保护作用。而且使用腺病毒作为保护性抗原的载体，可以使禽流感抗原基因在动物体内表达而无毒副作用，具有广阔的应用前景。
5、本发明提供的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗，能够广泛适用于任何品种的鸡，由于该疫苗具有安全性高、保护性好的优点，可以完全取代目前用鸡胚生产的全病毒灭活疫苗。同时该疫苗产品在鸭、鹅等水禽中也可使用；由于腺病毒的宿主广泛，对哺乳动物有较好地感染性，所以该疫苗产品在猪等动物上同样有好的应用效果；最为重要的是，如果禽流感病毒突破宿主屏障而在人群大流行，该疫苗产品将是预防人感染禽流感的主要选择之一。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的重组腺病毒rAd-H5H9HA中HA基因的鉴定图。
图2为本发明实施例1及对比例1-3的免疫鸡的H5亚型抗体的检测结果图。
图3为本发明实施例1及对比例1-3的免疫鸡的H9亚型抗体的检测结果图。
具体实施方式
以下将结合附图对本发明各实施例的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施例，都属于本发明所保护的范围。
本发明提供了一种同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗的制备方法，包括如下步骤：
S1，质粒pUC57-H5H9HA的制备：首先，制备所述融合基因H5H9HA，然后，在所述融合基因H5H9HA序列的一端加上kozak序列后再增加EcoRI酶切位点，在另一端加上NheI酶切位点；H5H9HA可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得编码H5 HA抗原和H9 HA抗原的DNA序列，然后将其拼接起来，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列；或者可采用例如重叠PCR的方式合成而得；然后将预处理后的融合基因H5H9HA克隆到载体pUC57中，得到带有目的融合基因H5H9HA的所述质粒pUC57-H5H9HA；
S2，腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA的构建：采用限制性内切酶EcoRI和NheI对腺病毒穿梭载体pDC315和所述质粒pUC57-H5H9HA进行双酶切处理，得到双酶切后的腺病毒穿梭载体pDC315片段和双酶切后的融合基因H5H9HA片段，然后进行连接反应，得到所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA；
S3，重组腺病毒载体的包装和扩繁：运用AdMax腺病毒包装体系，将步骤S2制备的所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA进行包装和扩繁，得到四代重组腺病毒rAd-H5H9HA；
S4，重组腺病毒rAd-H5H9HA的PCR鉴定及扩增纯化：设计所述融合基因H5H9HA的上游引物和下游引物，进行PCR鉴定、扩增和纯化处理，得到大量纯化后的所述重组腺病毒rAd-H5H9HA，然后进行冻干、分装处理，制备得到所述同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗。
进一步地，在步骤S1中，所述融合基因H5H9HA的合成工艺包括如下步骤：
A1，筛选禽流感H5N6亚型和H9N2亚型的优势毒株，并确定前述毒株的HA基因序列；
A2，将所述H5N6亚型HA基因序列中的终止密码子及后续序列去除，然后紧接所述H9N2亚型的HA基因序列中的起始密码子，直至所述H9N2亚型的HA基因序列的终止密码子，基因融合处理，得到融合基因H5H9HA；融合基因H5H9HA可以全序列人工合成，也可用PCR扩增的方法分别获得编码H5 HA抗原和H9 HA抗原的DNA序列，然后将其拼接起来，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列；或者可采用例如重叠PCR的方式合成而得。；
进一步地，在步骤S2中，还包括对所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA的鉴定处理，具体过程为：
将连接反应得到的所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA转化入大肠杆菌DH5α，挑选单菌落小提质粒，用NheI/XmaI一次双酶切鉴定出阳性克隆，然后进行测序，确认目的融合基因H5H9HA成功克隆入所述腺病毒穿梭载体pDC315中。
进一步地，在步骤S3中，重组腺病毒载体的包装和扩繁的具体步骤如下：
P1，运用AdMax腺病毒包装体系，将所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA与辅助包装质pBHGlox(delta)E1,3Cre通过LipofectamineTM 2000共转染至293细胞中；
P2，利用Cre/loxP重组酶系统实现重组，产生重组腺病毒的细胞中出现典型的细胞病变效应，待预定比例的细胞出现典型的细胞病变后，收集毒液，进行后处理，制备得到Ad-H5H9HA病毒原液；
P3，将步骤P2制备的所述Ad-H5H9HA病毒原液，应细胞维持液按照1:10的比例感染新的293细胞，重复步骤P1和步骤P2的过程重复三次，制备出所述四代重组腺病毒rAd-H5H9HA。
进一步地，在步骤S4中，所述融合基因H5H9HA的上游引物为5’-gaattcctggatccgccaccatgga-3’；下游引物为5’-ttatatacaaatgttgcatctgca-3’。
下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
本发明实施例1提供了一种同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗的制备方法，包括如下步骤：
S1，质粒pUC57-H5H9HA的制备：(H5N6HA和H9N2HA融合基因质粒的克隆)
筛选禽流感H5N6亚型和H9N2亚型的优势毒株，并确定前述毒株的HA基因序列，据此合成H5N6和H9N2的保护性抗原HA的融合基因H5N6HAH9N2HA(简写为H5H9HA)，然后将融合基因H5H9HA克隆到pUC57载体中，上述过程如下：
1、将H5N6的HA基因序列中的终止密码子及后续序列去除后，紧接H9N2中HA基因序列的起始密码子，直至H9N2中HA基因序列的终止密码子，使H5N6的HA基因和H9N2的HA基因融合成为一个融合基因H5H9HA，所述融合基因H5H9HA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示；
2、在H5N6 HA基因序列的启动子之前加上kozak序列GCCACC，并在该kozak序列之前增加EcoRI酶切位点；在H9N2HA基因序列的终止子后边增加了NheI酶切位点；
3、用GeneArt无缝克隆和组装试剂盒将融合基因H5H9HA克隆到载体pUC57中，形成带有目的融合基因H5H9HA的质粒pUC57-H5H9HA。
S2，带有目的融合基因的腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA的构建
1、首先用EcoRI酶切载体质粒pDC315和带有目的融合基因的质粒pUC57-H5H9HA，分别得到大小3.9kb和6.1kb的线性化质粒；用乙醇沉淀经EcoRI酶切处理的pDC315和pUC57-H5H9HA片段，去除酶切反应的Buffer后，再用第二个酶NheI做酶切。将经过双酶切后的载体片段pDC315(EcoRI/NheI)和从pUC57-H5H9HA中得到的H5H9HA融合基因(EcoRI/NheI)片段(3415bp)胶回收，而后进行连接反应，得到连接产物；
2、将连接产物转化入大肠杆菌DH5ɑ后，从过夜培养的平板上挑取单菌落小提质粒，用NheI/XmaI一次双酶切鉴定出阳性克隆，经过测序进一步确认目的融合基因H5H9HA是否成功克隆入腺病毒穿梭载体pDC315中，即是否成功的构建了腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA。
S3，重组腺病毒载体的包装和扩繁
运用AdMax腺病毒包装体系，将步骤S2制备的腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA与辅助包装质pBHGlox(delta)E1,3Cre通过LipofectamineTM 2000共转染至293细胞中，具体过程为：
1、用于转染的细胞密度为50％～60％，转染前2h将细胞培养基更换为无血清OMEM培养基，向一无菌离心管中加入所制备的DNA溶液(穿梭质粒5ug和辅助质粒5ug)与OMEM混合均匀，调整总体积为50uL,在室温下温育5min，取10uL Lipofectamine 2000试剂在另一管中与50uL OMEM混合，在室温下温育5min并将其与DNA稀释液进行混合，混合后，在室温下温育20min，以便形成DNA与Lipofectamine 2000稀释液的转染复合物。
2、将DNA与Lipofectamine 2000混合液转移至293细胞的培养液中，混匀，于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养。培养6～8h后倒去含有转染混和物的培养基，每瓶细胞加入2mL的PBS液，轻轻左右晃动一下培养瓶以洗涤残余的转染混和物，然后倒去并补入含1％血清的培养基继续培养。
3、利用Cre/loxP重组酶系统的作用实现重组，产生重组腺病毒的细胞中会出现典型的细胞病变效应，待大部分细胞出现典型的细胞病变，且有50％细胞脱壁时收集毒液。离心收集细胞，细胞沉淀用PBS重悬，冻融4次，上清即为Ad-H5H9HA病毒原液。
4、用细胞维持液按1:10的比例稀释Ad-H5H9HA病毒原液后感染新的293细胞，如此反复制备出四代重组腺病毒rAd-H5H9HA。
S4，重组腺病毒rAd-H5H9HA的PCR鉴定及扩增纯化
1、对步骤S3收集到的重组腺病毒rAd-H5H9HA病毒液进行PCR鉴定。将100ug/ml的蛋白酶K加入到重组腺病毒rAd-H5H9HA病毒液中，煮沸5分钟，以此为模板。
2、设计融合基因H5H9HA的上游引物5’-gaattcctggatccgccaccatgga-3’，下游引物：5’-ttatatacaaatgttgcatctgca-3’；做PCR扩增，扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测。挑取PCR鉴定正确的病毒株进行扩增，即可得到大量的重组腺病毒rAd-H5H9HA。将上述重组腺病毒rAd-H5H9HA经过冻干及成品分装后处理，即得到同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗。
所述重组腺病毒rAd-H5H9HA和同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗均能够表达所述融合抗原，其氨基酸序列表如序列表SEQ ID NO：2所示。所述融合抗原对禽流感H5亚型病毒和禽流感H9亚型病毒同时具有特异性免疫作用。
对比例1
采用目前商业禽流感二价灭活苗(H5N1Re-6+H9N2Re-2)作为对比例1，与实施例1进行性能比较。
对比例2
采用携带报告基因GFP的腺病毒rAd-GFP作为对比例2，与实施例1进行性能比较。
对比例3
以293细胞裂解物作为空白对比例3，与实施例1进行性能比较。
性能结果分析：
一、重组腺病毒rAd-H5H9HA中特异性目的HA基因的鉴定
选用重组腺病毒rAd-H5H9HA感染生长好的293细胞，待细胞出现典型、均一的病变后，收集该细胞经处理后提取DNA，用特异性引物作扩增，得到相应的片断，结果如图1所示。具体过程为：用融合基因H5H9HA的引物对重组腺病毒rAd-H5H9HA做PCR鉴定。设计融合基因H5H9HA引物，如下：
上游引物：5’-gaattcctggatccgccaccatgga-3’
下游引物：5’-ttatatacaaatgttgcatctgca-3’
图1中，泳道M：DNA Marker
泳道1：rAd-H5H9HA PCR扩增出融合基因H5H9HA产物(3384bp)(实施例1提供的重组腺病毒rAd-H5H9HA)
泳道2：rAd-GFP PCR未扩增出产物(对比例1提供的携带报告基因GFP的腺病毒rAd-GFP)
二、以编码H5H9HA融合抗原的重组腺病毒rAd-H5H9HA(即同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗)免疫动物的抗体表达
将实施例1制备的重组腺病毒rAd-H5H9HA二价疫苗、对比例1提供的现有商业用的禽流感二价灭活苗(H5N1Re-6+H9N2Re-2)、对比例2提供的腺病毒rAd-GFP进行分组免疫，以对比例3提供的293细胞裂解物免疫作为空白对照。
免疫当天采血检测抗体，分别在免疫后第7、14、21、28天采血和收集血清，采用常规的血凝抑制方法检测抗体效价。结果表明，实施例1提供的携带融合基因H5H9HA的腺病毒rAd-H5H9HA和对比例1提供的禽流感二价灭活苗(H5N1Re-6+H9N2Re-2)免疫组鸡都产生特异性抗体。
用H5亚型抗原检测血凝抑制(HI)抗体，实施例1提供的重组腺病毒rAd-H5H9HA二价疫苗、对比例1提供的禽流感二价灭活苗(H5N1Re-6+H9N2Re-2)免疫后都能够产生H5亚型特异抗体；且在第21天，重组病毒免疫组鸡抗体水平达到峰值，抗体水平均超过免疫标准(6.0)，与此对应的是对比例2提供的携带报告基因GFP的腺病毒rAd-GFP和对比例3提供的293胞空白对照组均不产生特异性抗体。
实施例1提供的重组腺病毒rAd-H5H9HA二价疫苗和对比例1提供的禽流感二价灭活苗(H5N1Re-6+H9N2Re-2)产生的抗体水平基本相当(见图2所示)。
同样，用H9N2亚型抗原检测免疫效果，得出的结果是：实施例1提供的重组腺病毒rAd-H5H9HA二价疫苗免疫组在21天就产生了高水平特异抗体，与阳性对照组对比例1提供的禽流感二价灭活苗(H5N1Re-6+H9N2Re-2)免疫产生的抗体(在相同时间点)水平相当(见图3所示)，抗体水平超过免疫标准，与此对应的是对比例2提供的携带GFP的腺病毒rAd-GFP和对比例3提供的293胞空白对照组，均不产生特异性抗体。
作为本方案的优选，该二价疫苗为一次注射疫苗，可以稳定表达重组禽流感H5亚型和H9亚型的血凝素蛋白，由此而诱导针对H5亚型和H9亚型特异而坚强的免疫反应，其可以进行肌肉注射、皮内或皮下注射，也可进行胚内注射。该二价疫苗也可用于所有禽类禽流感的免疫预防，尤其对水禽有很好的免疫效果，同时也可以用于猪源和人源禽流感的免疫预防。
由此，本发明提供的重组腺病毒rAd-H5H9HA的构建路线为：克隆H5N6的HA编码基因全序列和H9N2的HA编码基因全序列的融合基因全序列到穿梭质粒pDC315中位于启动子下游的正确方向，然后与腺病毒骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre进行包装和扩繁，接着在293细胞中经Cre/loxP酶切重组获得携带融合基因H5H9HA的重组腺病毒rAd-H5H9HA，最后经过PCR鉴定得到阳性蚀斑，得到的重组腺病毒rAd-H5H9HA可以表达特异H5、H9亚型的血凝素抗原的融合体(融合抗原)。
需要注意的是，本领域技术人员应当理解，本发明制备的腺病毒载体禽流感疫苗，可以根据禽流感的流行情况，能够更换、增加新的血清型的抗原基因，以及和其他如新城疫等禽类传染病的保护性抗原共同组成融合基因，组成可以预防多种传染病的多价疫苗，大大方便养殖业户的实际应用。
综上所述，本发明提供了一种同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法。采用禽流感H5亚型和H9亚型的血凝素抗原为核心抗原，合成融合基因H5H9HA，并采用腺病毒作为载体，把融合基因H5H9HA克隆到腺病毒穿梭载体pDC315上，然后与骨架质粒pBHGlox(delta)E1,3Cre共转染入293细胞中，完成重组腺病毒的生产后，再经过纯化得到高纯度的携带血凝素抗原的重组腺病毒rAd-H5H9HA，即得到同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗。该疫苗能够诱导高水平的H5亚型特异性抗体和H9亚型特异性抗体，抗体的水平与目前商业用的全病毒灭活疫苗相一致，超出了国家规定的免疫标准，在禽流感免疫预防领域具备巨大的应用前景和推广价值。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案。
序列表
<110> 河北省动物疫病预防控制中心
天津保信立德生物科技有限公司
<120> 同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗及其制备方法
<141> 2020-08-21
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3384
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
atggagaaaa tagtgcttct tcttgcagtg gttagccttg ttaaaagtga tcagatttgc 60
attggttacc atgcaaacaa ctcgacagag caggttgaca cgataatgga aaaaaacgtc 120
actgttacac atgcccaaga catactggaa aagacacaca acgggaggct ctgcgatctg 180
aatggagtga aacctctgat tttaaaggat tgtagtgtag ctggatggct tcttggaaac 240
ccaatgtgcg acgagttcat cagagtgccg gaatggtctt acatagtgga gagggctaac 300
ccagccaatg acctctgtta cccagggaac ctcaatgact atgaagaact gaaacaccta 360
ttgagcagaa taaatcattt tgagaagact ctgatcatcc ccaagagttc ctggcccaat 420
catgaaacat cattaggggt gagcgcagca tgtccatacc agggaatgcc ctcctttttc 480
agaaatgtgg tatggcttac caagaagaac gatgcgtacc caacaataaa gatgagctac 540
aataatacca atagggaaga tcttttgata ctgtggggga ttcatcattc caacaatgca 600
gcagagcaga caaatctcta taaaaaccca accacctatg tttccgttgg gacatcaaca 660
ttaaaccaga gattggtgcc aaaaatagct actagatccc aagtaaacgg gcaacgtgga 720
agaatggatt tcttctggac aattttaaaa ccgaatgatg caatccactt cgagagtaat 780
ggaaatttta ttgctccaga atatgcatac aaaattgtca agaaagggga ctcaacaatt 840
atgaaaagtg aaatggaata tgggcactgc aacaccaaat gtcaaactcc aataggggcg 900
ataaactcta gtatgccatt ccacaatata caccctctca ctatcgggga gtgccctaaa 960
tacgtgaaat caaacaaatt agtccttgcg actgggctca gaaatagtcc tctaagagaa 1020
agaagaagaa aaagaggact atttggagct atagcagggt ttatagaggg aggatggcaa 1080
ggaatggtag atggttggta tgggtaccat catagcaatg aacaggggag tgggtacgct 1140
gcagacagag aatccaccca aaaggcaata gatggagtta ccaataaggt caactcgatc 1200
attgacaaaa tgaacactca atttgaggcc gttggaaggg aatttaataa cttagaacgg 1260
agaatagaga atttaaataa gaaaatggaa gacggattcc tagatgtctg gacttataat 1320
gctgaacttc tagttctcat ggaaaatgag agaactctag attttcatga ctcaaatgtc 1380
aagaaccttt atgacaaagt ccgactacag cttagggata atgcaaagga gctgggtaat 1440
ggttgtttcg agttctatca caaatgtgat aatgaatgta tggaaagtgt aagaaatggg 1500
acgtatgact acccccagta ttcagaagaa gcaagattaa aaagggaaga aataagcgga 1560
gtgaaattgg aatcaatagg aacttaccaa atactgtcaa tttattcaac agtggcgagt 1620
tccctagcac tggcaatcat tgtggctggt ctatctttat ggatgtgctc caatgggtcg 1680
ttacaatgca gaatttgcat tatggagaca gtatcactaa taactatact actagtagca 1740
acagtaagca atgcagataa aatctgcatc ggctaccaat caacaaactc cacagaaact 1800
gtggacacac taacagaaaa caatgtccct gtgacacatg ccaaagaact gctccacaca 1860
gagcataatg ggatgctgtg tgcaacaagc ttgggacaac ctcttatttt agacacctgc 1920
accattgaag ggctaatcta tggcaatcct tcttgtgatc tatcgctgga aggaagagaa 1980
tggtcctata tcgtcgagag accatcagct gttaacggat tgtgttaccc cgggaatgta 2040
gaaaatctag aagagctaag gtcacttttt agttctgcta ggtcttatca aagaatccag 2100
attttcccag acacaatctg gaatgtgtct tacgatggaa caagcacagc atgctcaggt 2160
tcattctaca gaagcatgag atggttgact cgaaagaacg gcgattaccc tacccaagac 2220
gcccaataca caaataatca agggaagaac attcttttca tgtggggcat aaatcaccca 2280
cccaccgatg atacgcagag aaatctgtac acgagaaccg acacaacaac gagtgtggca 2340
acagaagaaa caaataggat cttcaaacca ttgataggac caaggcctct tgtcaacggt 2400
ttgatgggaa gaattgatta ttattggtct gtattgaaac cgggtcaaac actgcgaata 2460
aaatctgatg ggaatctaat agctccatgg tatggacaca ttctttcagg agagagccat 2520
ggaagaattc tgaagactga tttaaaaagg ggtagctgca cagtgcaatg tcagacagag 2580
aaaggtggct taaacacaac actgccattc caaaatgtaa gtaagtatgc atttggaaac 2640
tgctcaaaat acattggcat aaagagtctc aaacttgcag ttggtctgag gaatgtgcct 2700
tctagatcta gtagaggact attcggggcc atagcagggt ttatagaggg aggttggtca 2760
ggactagttg ctggttggta tgggttccag cattcaaatg accaaggggt aggtatggca 2820
gcagatagag actcaaccca aaagtcaatt gataaaataa catccaaagt gaataatata 2880
gtcgacaaaa tgaacaagca gtatgaaatc attgatcatg aattcagtga ggtagaaact 2940
agacttaaca tgatcaataa taagattgat gatcaaatcc aggatatatg ggcatataat 3000
gcagaattgc tagttctgct tgaaaaccag aaaacactcg atgagcatga cgcaaatgtg 3060
aacaatctat ataataaagt aaagagggcg ttgggttcca atgcggtgga agatgggaaa 3120
ggatgtttcg agctatacca caaatgtaat gaccaatgca tggagacaat tcggaacggg 3180
acctacaaca gaaggaagta tcaagaggag tcaaaattag aaagacagaa aatagagggg 3240
gtcaagctgg aatctgaagg aacttacaaa atcctcacca tttattcgac tgttgcctca 3300
tctcttgtga ttgcaatggg gtttgctgcc tttttgttct gggccatgtc caatgggtct 3360
tgcagatgca acatttgtat ataa 3384
<210> 2
<211> 1127
<212> PRT
<213> 融合抗原(2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum)
<400> 2
Met Glu Lys Ile Val Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Val Lys Ser
1 5 10 15
Asp Gln Ile Cys Ile Gly Tyr His Ala Asn Asn Ser Thr Glu Gln Val
20 25 30
Asp Thr Ile Met Glu Lys Asn Val Thr Val Thr His Ala Gln Asp Ile
35 40 45
Leu Glu Lys Thr His Asn Gly Arg Leu Cys Asp Leu Asn Gly Val Lys
50 55 60
Pro Leu Ile Leu Lys Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn
65 70 75 80
Pro Met Cys Asp Glu Phe Ile Arg Val Pro Glu Trp Ser Tyr Ile Val
85 90 95
Glu Arg Ala Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Leu Asn
100 105 110
Asp Tyr Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Ile Asn His Phe Glu
115 120 125
Lys Thr Leu Ile Ile Pro Lys Ser Ser Trp Pro Asn His Glu Thr Ser
130 135 140
Leu Gly Val Ser Ala Ala Cys Pro Tyr Gln Gly Met Pro Ser Phe Phe
145 150 155 160
Arg Asn Val Val Trp Leu Thr Lys Lys Asn Asp Ala Tyr Pro Thr Ile
165 170 175
Lys Met Ser Tyr Asn Asn Thr Asn Arg Glu Asp Leu Leu Ile Leu Trp
180 185 190
Gly Ile His His Ser Asn Asn Ala Ala Glu Gln Thr Asn Leu Tyr Lys
195 200 205
Asn Pro Thr Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg
210 215 220
Leu Val Pro Lys Ile Ala Thr Arg Ser Gln Val Asn Gly Gln Arg Gly
225 230 235 240
Arg Met Asp Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Ala Ile His
245 250 255
Phe Glu Ser Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Glu Tyr Ala Tyr Lys Ile
260 265 270
Val Lys Lys Gly Asp Ser Thr Ile Met Lys Ser Glu Met Glu Tyr Gly
275 280 285
His Cys Asn Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Asn Ser Ser
290 295 300
Met Pro Phe His Asn Ile His Pro Leu Thr Ile Gly Glu Cys Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Val Lys Ser Asn Lys Leu Val Leu Ala Thr Gly Leu Arg Asn Ser
325 330 335
Pro Leu Arg Glu Arg Arg Arg Lys Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala
340 345 350
Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Gln Gly Met Val Asp Gly Trp Tyr Gly
355 360 365
Tyr His His Ser Asn Glu Gln Gly Ser Gly Tyr Ala Ala Asp Arg Glu
370 375 380
Ser Thr Gln Lys Ala Ile Asp Gly Val Thr Asn Lys Val Asn Ser Ile
385 390 395 400
Ile Asp Lys Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn
405 410 415
Asn Leu Glu Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Gly
420 425 430
Phe Leu Asp Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu
435 440 445
Asn Glu Arg Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr
450 455 460
Asp Lys Val Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala Lys Glu Leu Gly Asn
465 470 475 480
Gly Cys Phe Glu Phe Tyr His Lys Cys Asp Asn Glu Cys Met Glu Ser
485 490 495
Val Arg Asn Gly Thr Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Ser Glu Glu Ala Arg
500 505 510
Leu Lys Arg Glu Glu Ile Ser Gly Val Lys Leu Glu Ser Ile Gly Thr
515 520 525
Tyr Gln Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu
530 535 540
Ala Ile Ile Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp Met Cys Ser Asn Gly Ser
545 550 555 560
Leu Gln Cys Arg Ile Cys Ile Met Glu Thr Val Ser Leu Ile Thr Ile
565 570 575
Leu Leu Val Ala Thr Val Ser Asn Ala Asp Lys Ile Cys Ile Gly Tyr
580 585 590
Gln Ser Thr Asn Ser Thr Glu Thr Val Asp Thr Leu Thr Glu Asn Asn
595 600 605
Val Pro Val Thr His Ala Lys Glu Leu Leu His Thr Glu His Asn Gly
610 615 620
Met Leu Cys Ala Thr Ser Leu Gly Gln Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys
625 630 635 640
Thr Ile Glu Gly Leu Ile Tyr Gly Asn Pro Ser Cys Asp Leu Ser Leu
645 650 655
Glu Gly Arg Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Arg Pro Ser Ala Val Asn
660 665 670
Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Val Glu Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser
675 680 685
Leu Phe Ser Ser Ala Arg Ser Tyr Gln Arg Ile Gln Ile Phe Pro Asp
690 695 700
Thr Ile Trp Asn Val Ser Tyr Asp Gly Thr Ser Thr Ala Cys Ser Gly
705 710 715 720
Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg Trp Leu Thr Arg Lys Asn Gly Asp Tyr
725 730 735
Pro Thr Gln Asp Ala Gln Tyr Thr Asn Asn Gln Gly Lys Asn Ile Leu
740 745 750
Phe Met Trp Gly Ile Asn His Pro Pro Thr Asp Asp Thr Gln Arg Asn
755 760 765
Leu Tyr Thr Arg Thr Asp Thr Thr Thr Ser Val Ala Thr Glu Glu Thr
770 775 780
Asn Arg Ile Phe Lys Pro Leu Ile Gly Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly
785 790 795 800
Leu Met Gly Arg Ile Asp Tyr Tyr Trp Ser Val Leu Lys Pro Gly Gln
805 810 815
Thr Leu Arg Ile Lys Ser Asp Gly Asn Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly
820 825 830
His Ile Leu Ser Gly Glu Ser His Gly Arg Ile Leu Lys Thr Asp Leu
835 840 845
Lys Arg Gly Ser Cys Thr Val Gln Cys Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu
850 855 860
Asn Thr Thr Leu Pro Phe Gln Asn Val Ser Lys Tyr Ala Phe Gly Asn
865 870 875 880
Cys Ser Lys Tyr Ile Gly Ile Lys Ser Leu Lys Leu Ala Val Gly Leu
885 890 895
Arg Asn Val Pro Ser Arg Ser Ser Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala
900 905 910
Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Ser Gly Leu Val Ala Gly Trp Tyr Gly
915 920 925
Phe Gln His Ser Asn Asp Gln Gly Val Gly Met Ala Ala Asp Arg Asp
930 935 940
Ser Thr Gln Lys Ser Ile Asp Lys Ile Thr Ser Lys Val Asn Asn Ile
945 950 955 960
Val Asp Lys Met Asn Lys Gln Tyr Glu Ile Ile Asp His Glu Phe Ser
965 970 975
Glu Val Glu Thr Arg Leu Asn Met Ile Asn Asn Lys Ile Asp Asp Gln
980 985 990
Ile Gln Asp Ile Trp Ala Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Leu Glu
995 1000 1005
Asn Gln Lys Thr Leu Asp Glu His Asp Ala Asn Val Asn Asn Leu Tyr
1010 1015 1020
Asn Lys Val Lys Arg Ala Leu Gly Ser Asn Ala Val Glu Asp Gly Lys
1025 1030 1035 1040
Gly Cys Phe Glu Leu Tyr His Lys Cys Asn Asp Gln Cys Met Glu Thr
1045 1050 1055
Ile Arg Asn Gly Thr Tyr Asn Arg Arg Lys Tyr Gln Glu Glu Ser Lys
1060 1065 1070
Leu Glu Arg Gln Lys Ile Glu Gly Val Lys Leu Glu Ser Glu Gly Thr
1075 1080 1085
Tyr Lys Ile Leu Thr Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Val Ile
1090 1095 1100
Ala Met Gly Phe Ala Ala Phe Leu Phe Trp Ala Met Ser Asn Gly Ser
1105 1110 1115 1120
Cys Arg Cys Asn Ile Cys Ile
1125

Claims (10)

1.一种融合基因H5H9HA，其特征在于：所述融合基因H5H9HA由禽流感H5亚型血凝素抗原HA基因和禽流感H9亚型血凝素抗原HA基因融合而成；所述融合基因H5H9HA的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。
2.一种重组腺病毒rAd-H5H9HA，其特征在于：所述重组腺病毒rAd-H5H9HA包含权利要求1所述的融合基因H5H9HA。
3.一种同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗，其特征在于：所述同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗包含权利要求2所述的重组腺病毒rAd-H5H9HA。
4.一种权利要求3所述的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1，质粒pUC57-H5H9HA的制备：首先，制备所述融合基因H5H9HA，然后，在所述融合基因H5H9HA序列的一端加上kozak序列后再增加EcoRI酶切位点，在另一端加上NheI酶切位点；然后，将预处理后的融合基因H5H9HA克隆到载体pUC57中，得到带有目的融合基因H5H9HA的所述质粒pUC57-H5H9HA；
S2，腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA的构建：采用限制性内切酶EcoRI和NheI对腺病毒穿梭载体pDC315和所述质粒pUC57-H5H9HA进行双酶切处理，得到双酶切后的腺病毒穿梭载体pDC315片段和双酶切后的融合基因H5H9HA片段，然后进行连接反应，得到所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA；
S3，重组腺病毒载体的包装和扩繁：运用AdMax腺病毒包装体系，将步骤S2制备的所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA进行包装和扩繁，得到四代重组腺病毒rAd-H5H9HA；
S4，重组腺病毒rAd-H5H9HA的PCR鉴定及扩增纯化：设计所述融合基因H5H9HA的上游引物和下游引物，进行PCR鉴定、扩增和纯化处理，得到大量纯化后的所述重组腺病毒rAd-H5H9HA，然后进行冻干、分装处理，制备得到所述同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗。
5.根据权利要求4所述的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗的制备方法，其特征在于：在步骤S1中，所述融合基因H5H9HA的合成工艺包括如下步骤：
A1，筛选禽流感H5N6亚型和H9N2亚型的优势毒株，并确定前述毒株的HA基因序列；
A2，将所述H5N6亚型HA基因序列中的终止密码子及后续序列去除，然后紧接续所述H9N2亚型的HA基因序列中的起始密码子，直至所述H9N2亚型的HA基因序列的终止密码子，基因融合处理，得到融合基因H5H9HA；
其中，所述融合基因H5H9HA为采用全序列人工合成的方法合成得到，或者采用PCR扩增的方法分别获得编码H5N6亚型HA抗原和H9N2亚型HA抗原的DNA序列，然后拼接而成；又或者为采用重叠PCR的方式合成而得到。
6.根据权利要求4所述的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗的制备方法，其特征在于：在步骤S2中，还包括对所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA的鉴定处理，具体过程为：
将连接反应得到的所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA转化入大肠杆菌DH5α，挑选单菌落小提质粒，用NheI/XmaI一次双酶切鉴定出阳性克隆，然后进行测序，确认目的融合基因H5H9HA是否成功克隆入所述腺病毒穿梭载体pDC315中。
7.根据权利要求4所述的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗的制备方法，其特征在于：在步骤S3中，重组腺病毒载体的包装和扩繁的具体步骤如下：
P1，运用AdMax腺病毒包装体系，将所述腺病毒穿梭质粒pDC315-H5H9HA与辅助包装质pBHGlox(delta)E1,3Cre通过LipofectamineTM 2000共转染至293细胞中；
P2，利用Cre/loxP重组酶系统实现重组，产生重组腺病毒的细胞中出现典型的细胞病变效应，待预定比例的细胞出现典型的细胞病变后，收集毒液，进行后处理，制备得到Ad-H5H9HA病毒原液；
P3，将步骤P2制备的所述Ad-H5H9HA病毒原液，用细胞维持液按照1:10的比例稀释然后感染新的293细胞，重复步骤P1和步骤P2的过程重复三次，制备出所述四代重组腺病毒rAd-H5H9HA。
8.根据权利要求4所述的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗的制备方法，其特征在于：在步骤S4中，所述融合基因H5H9HA的上游引物为5’-gaattcctggatccgccaccatgga-3’；下游引物为5’-ttatatacaaatgttgcatctgca-3’。
9.一种融合抗原，其特征在于：所述融合抗原由权利要求1所述的融合基因H5H9HA进行表达，或者由所述融合抗原由权利要求2所述的重组腺病毒rAd-H5H9HA进行表达，又或者由所述融合抗原由权利要求3所述的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗或者权利要求4-8中任一项权利要求所述的制备方法制备的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗进行表达；
所述融合抗原的氨基酸序列表如序列表SEQ ID NO：2所示；所述融合抗原具有：禽流感H5亚型HA蛋白和禽流感H9亚型HA蛋白；
所述融合抗原对禽流感H5亚型病毒和禽流感H9亚型病毒同时具有特异性免疫作用。
10.一种权利要求3所述的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗或者权利要求4-8中任一项权利要求所述的制备方法制备的同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗的应用，其特征在于：所述同时预防禽流感H5和H9亚型的腺病毒载体二价苗在禽流感免疫预防领域中的应用。
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