CN114395052B

CN114395052B - 一种重组禽流感三价疫苗及其制备方法与应用

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Publication number: CN114395052B
Application number: CN202210299473.0A
Authority: CN
Inventors: 伏显华
Original assignee: Beijing Zhonghai Biotech Co Ltd
Current assignee: Beijing Zhonghai Biotech Co Ltd
Priority date: 2022-03-25
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2022-07-22
Anticipated expiration: 2042-03-25
Also published as: CN114395052A

Abstract

本发明公开了一种重组禽流感三价疫苗及其制备方法与应用。本发明构建得到可以分泌表达H5N1亚型、H7N9亚型、H9N2亚型中的HA1颈环部分蛋白抗原以及H7N9骨架重组融合蛋白的克隆细胞株，并通过发酵培养获得本发明的重组禽流感三价疫苗。实验表明：该重组禽流感三价疫苗免疫SPF鸡产生中和抗体持平目前市面产品，可用于预防禽H5N1亚型、H7N9亚型、H9N2亚型流感，具有生产成本低，不需要鸡胚培养病毒，对环境安全，不会有散毒风险且一次发酵生产能预防3种流感的优点。

Description

一种重组禽流感三价疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种重组禽流感三价疫苗及其制备方法与应用，属于兽用制品领域。

背景技术

流感病毒（Influenza virus）属于正粘病毒科，是单股负链分节段的RNA病毒。根据核蛋白（NP）和基质蛋白（M1）上抗原决定簇的不同，流感病毒可分为A、B、C、D 四型，其中A型和B型可给人类的健康带来威胁，尤其是A型，每年因全球季节性流感和散发性流感而导致大约30万–50万人死亡，死亡率高达60%。除了感染人类外，A型流感病毒还可以引起禽类、猪及其他哺乳动物流感的发生。在鸡群中流行的A型流感病毒包括H5N1、H7N9及H9N2等亚型，其中，H5N1亚型和H7N9亚型已引起了全世界的关注，因为这些亚型不但可以引起人类感染发病并造成较高的死亡率，且有潜力发生变异，更容易出现跨物种传播。

根据流感病毒对禽类的致病力不同，可将其分为高致病性禽流感病毒（HPAI）和低致病性禽流感病毒（LPAI）。1997年中国香港发生的直接由鸡群传染给人的高致病性禽流感，造成了18人感染6人死亡，其病原即为高致病性禽流感病毒（H5N1亚型）。最近，由HPAI导致的禽流感在韩国和日本也有发生，HPAI作为一种人畜共患病病原，不但给养殖业带来了巨大的经济损失，而且对人类的公共卫生安全也造成了严重的威胁，因此，对HPAI的防控显得尤为重要。禽流感的防控一直是全世界关注的焦点，也是世界性难题。

目前防治禽流感发生的主要手段为疫苗接种，常用的H5亚型流感疫苗为全病毒灭活疫苗，如我国市售的Re-1、Re-4、Re-5、Re-6、Re-7、Re-8和Re-10株等疫苗，但该类型的疫苗在生产过程中涉及活病毒的操作，所以存在生物安全风险。除此之外，还有重组活载体疫苗、DNA疫苗等，由于重组载体疫苗存在影响二次免疫，DNA疫苗需多次免疫，不适用于紧急预防，所以市场上未见大量应用，因此研发出新型高效的通用的流感亚单位疫苗已是迫在眉睫。亚单位疫苗是利用微生物或病毒的某种表面结构成分（抗原）制成的无核酸且能诱发机体产生抗体的疫苗，与常规疫苗相比生产简单、快速且安全。

HA蛋白是流感病毒表面的主要保护性抗原，也是研究亚单位疫苗的主要靶标抗原。HA抗体滴度的高低从某种程度上能够反映机体对于禽流感病毒的抵抗力。目前研究的流感病毒样颗粒主要由HA（HA1、HA2）、NA、M2蛋白组成。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高流感病毒蛋白质在大肠杆菌表达系统中的免疫效果。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种稳定、廉价、高效表达禽流感病毒H5N1亚型、H9N2亚型、H7N9亚型的融合HA片段和辅助病毒样颗粒骨架蛋白H7N9亚型的M2和NA融合蛋白的CHO细胞株的构建方法及其应用。

第一方面，本发明保护一种重组融合蛋白。

本发明保护的重组融合蛋白包括HA融合蛋白和M2-NA融合蛋白；

所述HA融合蛋白包括禽流感H5N1亚型的HA1蛋白、禽流感H9N2亚型的HA1蛋白、禽流感H7N9亚型的HA1蛋白和禽流感H7N9亚型的HA2蛋白；

所述M2-NA融合蛋白包括禽流感H7N9亚型的M2蛋白和禽流感H7N9亚型的NA蛋白；

所述禽流感H5N1亚型的HA1蛋白的氨基酸序列如序列2第25-298位所示；

所述禽流感H9N2亚型的HA1蛋白的氨基酸序列如序列2第314-554位所示；

所述禽流感H7N9亚型的HA1蛋白的氨基酸序列如序列2第570-891位所示；

所述禽流感H7N9亚型的HA2蛋白的氨基酸序列如序列2第892-1113位所示；

所述禽流感H7N9亚型的M2蛋白的氨基酸序列如序列4第25-276位所示；

所述禽流感H7N9亚型的NA蛋白的氨基酸序列如序列4第293-781位所示。

进一步的，所述HA融合蛋白依次包括信号肽、禽流感H5N1亚型的HA1蛋白、连接肽、禽流感H9N2亚型的HA1蛋白、连接肽、禽流感H7N9亚型的HA1蛋白和禽流感H7N9亚型的HA2蛋白。

所述M2-NA融合蛋白依次包括信号肽、禽流感H7N9亚型的M2蛋白、HIS标签、连接肽和禽流感H7N9亚型的NA蛋白。

更进一步的，所述HA融合蛋白的氨基酸序列如序列2所示。

所述M2-NA融合蛋白的氨基酸序列如序列4所示。

第二方面，本发明保护与上述重组融合蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述B1）-B5）中至少一种：

B1）编码上述重组融合蛋白的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B2）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B3）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的重组细胞系、含有B2）所述表达盒的重组细胞系、或含有B3）所述重组载体的重组细胞系。

上述生物材料中，编码所述HA融合蛋白的核酸分子为如下X1）或X2）所示的基因：

X1）序列1第19-3360位所示的DNA分子；

X2）与X1）限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述HA融合蛋白的DNA分子；

编码所述M2-NA融合蛋白的核酸分子为如下Y1）或Y2）所示的基因：

Y1）序列3第13-2358位所示的DNA分子；

Y2）与Y1）限定的DNA分子具有75％以上的同一性且编码所述M2-NA融合蛋白的DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码HA融合蛋白或M2-NA融合蛋白的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码HA融合蛋白或M2-NA融合蛋白的核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要编码HA融合蛋白或M2-NA融合蛋白且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2或序列4所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75%或75%以上同一性，可为80%、85%、90%或95%以上的同一性。

上述生物材料中，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述融合蛋白的DNA，该DNA不但可包括启动上述融合蛋白转录的启动子，还可包括终止上述融合蛋白转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。

所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。所述重组载体具体为在载体pcH1.0的多克隆位点插入为序列1和序列3后得到的重组表达载体。

所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。

所述细胞可为真核生物细胞或原核生物细胞。所述重组细胞系具体为含有所述重组载体的CHO细胞。

第三方面，本发明保护上述重组融合蛋白的制备方法。

本发明保护的重组融合蛋白的制备方法包括如下步骤：使编码所述HA融合蛋白的核酸分子和编码所述M2-NA融合蛋白的核酸分子在生物或生物细胞中进行表达，得到所述重组融合蛋白。

进一步的，所述方法包括如下步骤：将编码所述HA融合蛋白的核酸分子和编码所述M2-NA融合蛋白的核酸分子导入CHO细胞，得到重组细胞；将所述重组细胞进行发酵培养，得到所述重组融合蛋白。

更进一步的，所述方法包括如下步骤：

（1）将编码所述HA融合蛋白的核酸分子和编码所述M2-NA融合蛋白的核酸分子连入真核质粒载体，得到真核表达质粒；

（2）完成步骤（1）后，将所述真核表达质粒线性化后转染至CHO细胞株中；

（3）完成步骤（2）后，通过缺陷型的选择培养基筛选整合入所述融合蛋白编码基因的阳性单克隆细胞株；

（4）完成步骤（3）后，通过SDS-PAGE电泳筛选高效表达重组融合蛋白的阳性单克隆细胞株；

（5）完成步骤（4）后，将筛选得到的高效表达重组融合蛋白的阳性单克隆细胞株进行悬浮驯化，得到稳定高效表达重组融合蛋白的阳性单克隆悬浮细胞株；

（6）完成步骤（5）后，将所述阳性单克隆悬浮细胞株作为种子细胞进行发酵，得到发酵液，所述发酵液中含有所述重组融合蛋白。

其中，所述（1）中，所述真核质粒载体优选pCHO1.0质粒，但不局限于该载体，可以是任何哺乳细胞表达载体。

所述（2）中，所述CHO细胞株的用途在于制备含抗H5N1亚型、H9N2亚型和H7N9亚型流感HA1的VLPS抗原，该VLPS抗原与佐剂混合免疫动物后可以起到保护动物效果，且对动物安全。所述CHO细胞株优选CHO二氢叶缺陷型。

所述（3）中，所述缺陷型的选择培养基具体为含5%（体积分数）胎牛血清的CHO SSFM II培养基（不含次黄嘌呤或胸苷）。

所述（4）中，通过SDS-PAGE电泳筛选重组融合蛋白表达量最高的阳性单克隆细胞株。

所述（5）中，所述悬浮驯化的方法具体可包括如下步骤：将重组融合蛋白表达高的阳性单克隆细胞株转移至48孔板中培养（所用培养基具体可为CHO SSFM II培养基），细胞长满后传到6孔板，连续培养6代，直至细胞不结团，生长和加血清没有明显生长变换趋势即驯化成功。

所述（6）中，所述发酵的方法具体可包括如下步骤：将种子液在发酵培养基中进行发酵培养，当细胞密度达到3.5×10⁵时每天补加补料培养基，连续补加7天，当细胞活率低于80%时，停止补加补料培养基，1天后停止发酵。

其中，所述种子液的制备方法具体如下：将细胞悬液（阳性单克隆悬浮细胞株溶液）吸到离心管中，然后向离心管中加入10ml CHO SSFM II培养基，轻柔吹打均匀，离心（如1000rpm离心10分钟），弃上清液，收集沉淀；再向沉淀中加入15ml CHO SSFM II培养基后将细胞转移至细胞三角培养瓶中，37℃、5%CO₂中培养48～72h，得到种子液。

所述发酵培养基具体可为CHO S SFM II培养基。

所述发酵培养的条件具体可为转速80r/min，pH 7.2，培养温度37℃，30%溶氧水平。

所述补料培养基具体可为CHO CD EfficientFeed™ A 营养添加剂。

所述方法还包括纯化的步骤。所述纯化的方法具体如下：将发酵液离心（如8000r/min离心5min），得到上清液；将所述上清液用滤膜（如0.22μm滤膜）进行过滤，得到滤液；用buffer A（20mM PB，0.2M NaCl，20mM咪唑；pH7.2）平衡纯化柱子后用所述滤液上样，上样后用含2%曲拉通114的buffer A冲洗至吸光值走势不再降低平滑时再用不含曲拉通114的buffer A冲洗10倍柱体积；用buffer B（20mM PB，0.2M NaCl，250mM咪唑；pH7.2）洗脱后再用PBS透析，得到纯化后的重组融合蛋白溶液。

所述方法还包括安全性测定、免疫原中和抗体测定和免疫攻毒试验进行评价的步骤。

第四方面，本发明保护上述重组融合蛋白或生物材料或按照上述方法制备得到的重组融合蛋白的新用途。

本发明保护上述重组融合蛋白或生物材料或按照上述方法制备得到的重组融合蛋白在制备预防和/或治疗流感病毒的产品中的应用。

第五方面，本发明保护一种流感疫苗。

本发明保护的流感疫苗的活性成分为上述重组融合蛋白或生物材料或按照上述方法制备得到的重组融合蛋白。

进一步的，所述流感疫苗还可包括佐剂、防腐剂、蛋白保护液、稳定剂等一种或几种成分，也可选择加入鸡干扰素、鸡白细胞介素2、6、15等细胞因子。

更进一步的，所述佐剂可以选用铝胶、卡伯波971、皂角甙、脂质体、CpG-ODN、纳米佐剂、油乳佐剂、水性佐剂等。

在本发明的一个具体实施例中，所述佐剂为水性佐剂，优选桑米特SummitA004。

在实际应用中将上述重组融合蛋白与上述佐剂混合，即可得到流感疫苗（即本发明实施例中的禽流感融合蛋白三价疫苗）。具体方法可包括如下步骤：

1）将佐剂灭菌，得到灭菌后佐剂；

2）将上述重组融合蛋白溶液稀释后混匀，得到抗原溶液；

3）将所述抗原溶液与所述灭菌后佐剂混匀，得到混合液；

4）搅拌所述混合液，在终止搅拌前加入硫柳汞，混匀，即可得到流感疫苗（即本发明实施例中的禽流感融合蛋白三价疫苗）。

所述1）中，所述灭菌的条件具体可为115℃高压灭菌30～40min。

所述2）中，所述重组融合蛋白溶液稀释前还包括如下步骤：将发酵液离心（如8000r/min离心5min），得到上清液；用滤膜（如0.22μm滤膜）对所述上清液进行过滤，得到滤液；用膜包将所述滤液浓缩（如浓缩10倍），得到浓缩液；将所述浓缩液用PBS换液，得到所述重组融合蛋白溶液。

所述3）中，所述佐剂可为水性佐剂，优选桑米特SummitA004。

所述4）中，所述搅拌的条件具体可为6000r/min搅拌30min。

所述硫柳汞的终浓度具体可为0.005%。

所述流感疫苗中融合蛋白的有效成分浓度不低于100μg/ml。

上述流感疫苗在制备预防和/或治疗流感病毒的产品中的应用也属于本发明的保护范围。

上述任一所述应用或产品中，所述流感病毒可为禽流感病毒；所述禽流感病毒具体包括H5N1亚型、H7N9亚型、H9N2亚型。

术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，所述开读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，并且以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，其包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。

术语“重组载体”意指线性的或环状的DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸，并且所述多核苷酸与提供用于其表达的调控序列可操作地连接。所述重组载体包含本发明的多核苷酸，其连接于一个或多个调控序列，例如启动子和转录和翻译终止信号，所述调控序列指导所述多肽在表达宿主中产生。多种核苷酸和调控序列可以结合在一起以产生重组载体，所述重组载体可以包括一个或多个方便的限制位点以允许在这些位点插入或取代编码多肽的多核苷酸。可供选择的是，可以通过在适当的用于表达的载体中插入包含所述多核苷酸的核酸构建体或多核苷酸来表达所述多核苷酸。在制备表达载体的过程中，将编码序列置于载体中，从而将该编码序列与适当的调控序列可操作地连接以供表达。重组载体可以是任何载体（例如，质粒或病毒），其能够方便地进行重组DNA步骤，并且能够产生多核苷酸的表达。载体的选择将通常依赖于载体与将引入该载体的重组细胞的相容性。载体可以是线状或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即，作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如，质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以含有任何用于确保自复制的手段；或者，载体可以是一种当被引入重组细胞中时，整合到基因组中并且与整合了该载体的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入重组细胞基因组的完整DNA，或可以使用转座子。

所述载体优选地含有一个或多个选择性标记，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞。所述载体优选含有元件，其允许载体整合入重组细胞基因组或载体在细胞中独立于基因组的自主复制。为了整合入重组细胞基因组，载体可依赖编码多肽的多核苷酸的序列或用于通过同源或非同源重组整合入基因组的任何其它载体元件。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组整合入宿主细胞基因组染色体中的精确位置。为了增加在精确位置整合的可能性，整合元件应含有足够数量的核酸，如100至10000碱基对，400至10000碱基对，和800至10000碱基对，其与相应的目标序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可为任何序列，其与宿主细胞基因组中的目标序列同源。此外，整合元件可为非编码或编码的多核苷酸。另一方面，可以将载体通过非同源重组整合到重组细胞的基因组中。为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，其使载体能够在重组细胞中自主地复制。复制起点可以是介导自主复制的任何质粒复制子，其在细胞中发挥功能。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指能够使质粒或载体体内复制的多核苷酸。

可以将多于一个拷贝的本发明的多核苷酸插入重组细胞以增加多肽的产生。多核苷酸拷贝数的增加可通过如下方法获得：将至少一个额外拷贝的序列整合入宿主细胞基因组，或将可扩增的选择性标记基因包括于多核苷酸，其中可通过在合适的选择剂存在下培养细胞来选择含有选择性标记基因的扩增拷贝，且由此含有多核苷酸的额外拷贝的细胞。用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的。

术语“重组细胞”意指任何细胞类型，所述细胞类型对于使用包含本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体的转化、转染、转导等是易感的。术语“重组细胞”涵盖任何亲本细胞的后代，其由于在复制中发生的突变而不同于亲本细胞。

所述重组细胞，其包含本发明的多核苷酸可操作地连接于一个或多个指导本发明多肽的产生的调控序列。将包含多核苷酸的构建体或载体导入重组细胞，使所述构建体或载体如前所述作为染色体整体或者作为自复制的染色体外载体维持。术语“重组细胞”包括亲本细胞的任何后代，其由于复制过程中发生的突变而不同于亲本细胞。细胞的选择将在很大程度上依赖于编码多肽的基因及其来源。重组细胞可以是在本发明的多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如，原核(或真)核细胞。

本发明的有益效果：

1、本发明采用具有完善翻译后修饰功能的中国仓鼠卵巢细胞（chinesehamsterovary，CHO）表达系统制备得到三价禽流感亚单位疫苗，与其它表达系统相比，该系统具有如下优点：拥有完备的翻译后加工过程，包括糖基化、羟基化，使表达的外源真核基因产物能够保持其天然结构及活性，且使表达产物分泌到胞外，有利于外源蛋白的分离纯化。有效克服了其他表达系统表达产物在体内半衰期短、病毒颗粒形成低且不均匀以及免疫原性差的缺陷。

2、本发明构建得到可以分泌表达H5N1亚型、H7N9亚型、H9N2亚型中的HA1颈环部分蛋白抗原以及H7N9亚型骨架重组融合蛋白的克隆细胞株，其融合蛋白抗原表达量较高，且经分离纯化所获得的重组融合蛋白能和对应血清结合，免疫SPF鸡产生的中和抗体持平目前市面产品。另外，融合表达的蛋白组装成的功能结构蛋白更大更均匀，其体内半衰期更长、免疫效果更好，抗原免疫用量更少，有助于减少多次注射疫苗后的应激反应。

本发明利用CHO表达系统，将编码禽流感病毒H5N1亚型和H9N2亚型的HA1劲头部分融合禽流感病毒H7N9亚型的HA1上表达，辅助表达禽流感病毒H7N9亚型的HA2、NA和M2骨架蛋白，通过筛选得到高效表达重组融合蛋白的阳性克隆细胞株并进行发酵罐高密度发酵，表达产物以融合蛋白形式存在发酵液中，浓缩纯化后得到重组融合蛋白。进一步的，在重组融合蛋白中加入佐剂，研制成一种三价禽流感亚单位疫苗。该禽流感亚单位疫苗可用于预防禽H5N1亚型、H7N9亚型、H9N2亚型流感病毒，具有生产成本低，不需要鸡胚培养病毒，对环境安全，不会有散毒风险且一次发酵生产能预防3种流感病毒的优点。

附图说明

图1为pCHO1.0空载体和重组载体pCHHA3372的酶切验证结果。其中，1为pCH01.0空载体酶切结果；2和3为重组载体pCHHA2370酶切结果。

图2为测序正确载体酶切验证。其中，1为PCHO1.0载体；2为融合HA基因；3为骨架M基因。

图3为CHO细胞转染前和转染后的细胞形态。A为转染前细胞形态，B为转染后细胞形态。

图4为筛选的单克隆细胞系的显微镜观察结果。

图5为CHO细胞株表达融合蛋白检测结果。1、2、3、4、5均为浓缩上清结果。其中，3号细胞HA、M2、NA蛋白都正确表达。

图6为融合蛋白发酵液纯化电镜结果。

图7为H579抗体检验抗原琼扩图。1为禽H7阳性血清，2为法氏囊阳性血清，3为H5阳性血清，4为H9阳性血清，5为腺病毒阳性血清，6为培养基阴性对照，7为发酵液。

图8为不同免疫部位解剖结果。A为右腿注射0.3ml第7天；B为右腿注射1ml第21天；C为未免疫对照；D为颈背部注射0.3ml第14天；E为颈背部注射1ml第21天；F为未免疫颈背部对照。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的CHO细胞购自中国科学院干细胞库（上海）并由本申请发明人驯化悬浮。下述实施例中的PCHO1.0载体购自北京擎科生物技术有限公司，基因按哺乳动物密码子优化。下述实施例中的酶类及其他生化试剂如下：内切酶、连接酶是TaKaRa公司的产品，重组酶是全式金生物的产品，质粒提取试剂盒是天根生物的产品，其它均为国产试剂。下述实施例中的无血清培养基是Gibco™公司的产品。

实施例1、重组融合蛋白及其编码基因序列的设计

本发明的重组融合蛋白包括流感蛋白（HA融合蛋白）和流感骨架蛋白（M2-NA融合蛋白）。具体蛋白质位点如表1所示。

流感蛋白：本发明将禽流感H5N1亚型HA1片段、禽流感H9N2亚型的HA1片段与禽流感H7N9亚型的HA1片段和HA2片段进行融合，得到序列1所示的基因片段，其编码序列2所示的蛋白质（序列1第19-3360位为序列2的编码基因序列）。其中，序列1第19-90位为信号肽的编码基因序列，序列1第91-912位为禽流感H5N1亚型HA1片段的编码基因序列，序列1第913-957位为连接肽1的编码基因序列，序列1第958-1680位为禽流感H9N2亚型HA1片段的编码基因序列，序列1第1681-1725位为连接肽2的编码基因序列，序列1第1726-2691位为禽流感H7N9亚型HA1片段的编码基因序列，序列1第2692-3357位为禽流感H7N9亚型HA2片段的编码基因序列。

流感骨架蛋白：本发明将禽流感H7N9 亚型M2片段和NA片段进行融合，得到序列3所示的基因片段，其编码序列4所示的蛋白质（序列3第13-2358位为序列4的编码基因序列）。其中，序列3第13-84位为信号肽的编码基因序列，第85-840位为H7N9亚型M2片段的编码基因序列，序列3第841-888位为HIS标签连接肽3的编码基因序列，序列3第889-2355位为H7N9亚型NA片段的编码基因序列。

上述序列1和序列3均按鼠类密码子偏好性设计，由北京擎科生物公司合成。

表1、融合蛋白质设计及其蛋白质位点

实施例2、重组融合蛋白的制备

一、重组融合蛋白表达载体的构建

1、重组载体pCHHA3372的构建

将pCHO1.0载体的AVRII识别位点间的片段替换为序列1所示的DNA分子，得到重组载体pCHHA3372。对重组载体pCHHA3372进行测序，并将测序正确的载体进行酶切验证（图1）。

2、重组载体pCHO1.0HA-M2-NA的构建

将重组载体pCHHA3372的ECORV识别位点间的片段替换为序列3所示的DNA 分子，得到重组载体pCHO1.0HA-M2-NA。对重组载体pCHO1.0HA-M2-NA进行测序，并将测序正确的载体进行酶切验证（图2）。

二、重组细胞CHO的获得

1、转染前一天，将CHO细胞以合适的细胞密度接种到T25孔培养板上，待细胞达到2×10⁶的融合时进行转染。

2、将步骤一获得的重组载体pCHO 1.0HA-M2-NA经pvul酶切后，得到线性化质粒pCHO1.0HA-M2-NA。

1 3、配制溶液1和溶液2。溶液1（总体积250μl）：240μl无血清培养基+10μllipofectamine 2000，温育5min。溶液2（总体积250μl）：225μl无血清培养基+25μl（4μg）重组质粒（线性化质粒pCHO1.0HA-M2-NA）。

4、将溶液1与溶液2混合，室温下放置20min。

5、将培养板中的细胞用无血清培养基冲洗两遍后加入2ml无血清培养基。

6、将溶液1与溶液2的混合液逐滴加入孔中，摇动培养板，轻轻混匀；在37℃，5%CO₂中温育。

7、6小时后更换含有血清的全培养基，在37℃，5%CO₂中温育，48～72h后检测转染水平。

转染前和转染后的细胞形态如图3所示。

三、克隆筛选

2待细胞生长24小时后，换到CHO S SFM II培养基（Invitrogen，货号：31033020，不含次黄嘌呤或胸苷，含5%胎牛血清）换液加压。当有大量死细胞直接换液继续加压继续培养，直至阳性克隆长出。待细胞阳性单克隆长至合适大小，用110ul枪头在显微镜下挑克隆。将所有克隆挑至96孔板中在培养箱中培养，待克隆长至铺满80%孔底，取上清进行SDS-PAGE检测，筛选表达量高的阳性单克隆细胞株。筛选的单克隆细胞系在显微镜下的观察结果如图4所示。

四、细胞悬浮驯化

将初筛蛋白表达高的阳性单克隆细胞株转移至48孔板中培养（所用培养基为CHOSSFM II培养基），细胞长满后传到6孔板，最后在T25细胞培养瓶中进行扩大培养。取2/3细胞液氮冻存保存，取部分细胞传到6孔板中抽调血清悬浮驯化适应培养，连续培养6代，要求细胞不结团，生长和加血清没有明显生长变换趋势即驯化成功。最终获得稳定且重组融合蛋白表达量最高的阳性单克隆悬浮细胞株（图5），并将其作为种子细胞用于生产。

五、稳定细胞株的发酵流加培养

1、制备种子液

准备1000ml烧坏，内装2/3杯37℃的温水。从液氮中取出冻存管，迅速置于温水中并不断搅动，使冻存管中的冻存物（种子细胞）在1分钟之内融化。打开冻存管，将细胞悬液吸到15ml离心管中。向离心管中加入10ml CHO SSFM II培养基，轻柔吹打均匀，1000rpm离心10分钟，弃上清液，收集沉淀。向沉淀细胞中加入15ml CHO SSFM II培养基后将细胞转移至125ml细胞三角培养瓶（带透气盖）中，37℃、5%CO₂中培养48～72h，得到种子液，检测细胞生长情况。根据实际生长趋势传代扩繁需要的种子液体积，控制细胞活率95%以上。

2、发酵培养

3准备0.51L种子液（密度为2.0×10⁵个/mL）接入含有5L CHO S SFM II培养基的10L发酵罐中，在转速为80r/min，pH为7.2，培养温度为37℃的条件下发酵培养，每天计数，观察细胞状态，当发酵第5天左右细胞密度达到3.5×10⁵时每天补加补料培养基（CHO CDEfficientFeed™ A 营养添加剂，货号：A1023401）400ml，连续补加7天，当细胞活率低于80%时，停止补加补料培养基，1天后停止发酵。发酵过程中用维持发酵罐30%溶氧水平，溶氧不够时后期转速可以提高到100rpm，CO₂和NaHCO₃控制pH7.2，细胞发酵变化过程如表2所示。

表2、CHO细胞发酵生产HA融合蛋白和M2-NA融合蛋白发酵参数

六、重组融合蛋白的处理

1、发酵液粗品获得

发酵液8000r/min离心5min获得上清液，先用0.22μm滤膜进行过滤，然后选用膜包浓缩10倍，再用5倍体积PBS换液，得到原液（发酵液粗品）。该原液与商品化的H5、H7、H9灭活阳性血清均能形成琼扩线（图7），且不与法氏囊、新城疫以及培养基空白对照反应，说明该表达成分中含有H5H9H7抗原成分，且H7琼扩条带粗，与其含有完整病毒骨架蛋白有关。

2、蛋白纯化方法建立

发酵液8000r/min离心5min获得上清液，先用0.22μm滤膜进行过滤，得到滤液，然后用buffer A（20mM PB，0.2M NaCl，20mM咪唑；pH7.2）平衡纯化柱子后用滤液上样，上样后用含2%曲拉通114的buffer A冲洗至吸光值走势不再降低平滑时再用不含曲拉通114的buffer A冲洗10倍柱体积，最后用buffer B（20mM PB，0.2M NaCl，250mM咪唑；pH7.2）洗脱后再用PBS透析，得到纯化后的重组融合蛋白溶液。纯化后的重组融合蛋白溶液10000倍稀释后进行电镜检测，结果显示纯化后的重组融合蛋白溶液中可检测到VLPS（图6）。

七、重组融合蛋白安全性检测

1、蛋白含量检测

用BCA法测定纯化后的重组融合蛋白溶液中的蛋白含量为1.37mg/ml。该蛋白用0.22μm滤膜无菌过滤，备用。

2、无菌检验

无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行，应无菌生长。取步骤1获得的无菌过滤液加入TSB培养基中37℃培养，实验结果未见培养基浑浊分层出现。

3、内毒素测定

按凝胶法测定纯化后的重组融合蛋白溶液中的内毒素含量。

结果表明：纯化后的重组融合蛋白溶液中的内毒素含量为0.0075EU/ml，小于0.015EU/ml，符合疫苗要求。

实施例3、禽流感融合蛋白三价疫苗的制备

1、将水性佐剂桑米特SummitA004（漯河桑米特生物科技有限公司）在配苗罐中经115℃高压灭菌30～40min，冷却至室温备用。

2、将检验合格的流感融合蛋白病毒样颗粒原液（实施例2步骤六的1中获得的原液）适当稀释后混匀，得到抗原溶液。

3、将抗原溶液与灭菌后水性佐剂按照质量比为4:1的比例混匀，得到混合液，将混合液以6000r/min搅拌30min，在终止搅拌前加入终浓度为0.005%的硫柳汞，充分混匀，即得到本发明的禽流感融合蛋白三价疫苗（H5亚型+H7亚型+H9亚型），其中，融合蛋白浓度为100μg/ml。

本发明经过纯化3批发酵蛋白，分别按照上述方法共制备得到3批禽流感融合蛋白三价疫苗，分别记作批号201601、201602、201603。

实施例4、禽流感融合蛋白三价疫苗安全性实验

一、样品准备

试验用SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，实验地点为中海制药动物房。

二、试验方法

1、一次剂量接种的安全实验

1）对7日龄SPF鸡一次单剂量接种安全实验

取3批禽流感融合蛋白三价疫苗，每批7日龄SPF鸡10只。

将禽流感融合蛋白三价疫苗分别在颈背部皮下和大腿部肌肉进行注射，每只每点注射0.3ml。注射后观察28日，记录鸡的精神、饮食状况，并于注射后14、21、28日，从每组中每次取3只解剖，观察注射部位变化。

2）对14日龄SPF鸡一次单剂量接种安全实验

取3批禽流感融合蛋白三价疫苗，每批14日龄SPF鸡10只。

将禽流感融合蛋白三价疫苗分别在颈背部皮下和大腿部肌肉进行注射，每只每点注射0.5ml。注射后观察28日，记录鸡的精神、饮食状况，并于注射后14、21、28日，从每组中每次取3只解剖，观察注射部位变化。

2、单剂量重复接种安全实验

1）对7日龄SPF鸡重复剂量接种安全实验

取3批禽流感融合蛋白三价疫苗，每批7日龄SPF鸡10只。

将禽流感融合蛋白三价疫苗分别在颈背部皮下和大腿部肌肉进行注射，每只每点注射0.3ml。14日以后再重复部位注射0.3ml。注射后观察28日，记录鸡的精神、饮食状况，并于注射后14、21、28日，从每组中每次取3只解剖，观察注射部位变化。

2）对14日龄SPF鸡重复剂量接种安全实验

取3批禽流感融合蛋白三价疫苗，每批14日龄SPF鸡10只。

将禽流感融合蛋白三价疫苗分别在颈背部皮下和大腿部肌肉进行注射，每只每点注射0.5ml。14日以后再重复部位注射0.5ml。注射后观察28日，记录鸡的精神、饮食状况，并于注射后14、21、28日，从每组中每次取3只解剖，观察注射部位变化。

3、一次超剂量接种的安全实验

1）对7日龄SPF鸡一次超剂量接种安全实验

取3批禽流感融合蛋白三价疫苗，每批7日龄SPF鸡10只。

将禽流感融合蛋白三价疫苗分别在颈背部皮下和大腿部肌肉进行注射，每只每点注射1ml。以10只注射生理盐水的SPF鸡作为对照，接种前各组称重，14日以后各组称重比较。注射后观察28日，记录鸡的精神、饮食状况，并于注射后14、21、28日，从每组中每次取3只解剖，观察注射部位变化。

2）对14日龄SPF鸡一次超剂量接种安全实验

取3批禽流感融合蛋白三价疫苗，每批14日龄SPF鸡10只。

三、实验结果

1、一次单剂量接种安全结果

对7日龄和14日龄SPF鸡进行的一次单剂量不同接种途径的安全实验结果显示，注射后观察28日，实验组的鸡未见精神和饮食异常（表3），注射14、21、28日解剖显示，注射部位无硬结、脓肿、溃烂等异常发生；且皮下和肌肉注射吸收无差异。

表3、一次单剂量接种安全性结果

2、单剂重复接种安全结果

对7日龄和14日龄SPF鸡进行的一次单剂量重复不同接种途径的安全实验结果显示，注射后观察28日，实验组的鸡未见精神和饮食异常结果（表4），在第2次注射后14、21、28日解剖显示，注射部位无硬结、脓肿、溃烂等异常发生；且皮下和肌肉注射吸收无差异。

表4、单剂重复接种安全结果

3、超剂量接种安全结果

对7日龄和14日龄SPF鸡进行的一次超剂量不同接种途径的安全实验结果显示，注射后观察28日，实验组的鸡未见精神和饮食异常（表5），在第2次注射后14、21、28日解剖显示，注射部位无硬结、脓肿、溃烂等异常发生；且皮下和肌肉注射吸收无差异结果如图8。

表5、超剂重复接种安全结果

对超剂量注射的7日龄和14日龄SPF鸡，连同对照组鸡，在注射前和注射后14日分别计重，并对各组增重进行比较，结果见表6，结果显示注射14日内，免疫组和对照组无明显差异，表明融合病毒样颗粒对鸡无不良影响。

表6、7日龄鸡注射超剂量疫苗前后体重变化

实施例5、禽流感融合蛋白三价疫苗对蛋鸡产蛋性能影响

实验材料：200日龄蛋鸡购自华都峪口禽业有限责任公司，实验地点为中海制药动物房。

实验方法：将200日龄蛋鸡随机分4组。每组100只，饲养2周后，每批禽流感融合蛋白三价疫苗经过腿部肌肉注射100只鸡，注射剂量为0.3ml，以100只注射生理盐水的蛋鸡作为对照。统计免疫前后每日产蛋数的变化，连续观察4周，即免疫前1周和免疫后3周。

实验结果见表7-表11。从实验结果来看，各组注射前平均产蛋率为92.9%～93.4%。注射后略有下降但很快恢复正常水平，注射后3周平均产蛋率为92.3%～93.1%，与免疫前持平，无明显差别，说明本发明的禽流感融合蛋白三价疫苗对蛋鸡无不良反应。

表7、注射前1周产蛋情况统计结果

表8、注射第1周产蛋情况统计结果

表9、注射第2周产蛋情况统计结果

表10、注射第3周产蛋情况统计结果

表11、各组鸡注射疫苗前后平均周产蛋率变化结果

实施例6、禽流感融合蛋白三价疫苗效力实验

实验材料：试验用SPF鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，实验地点为中海制药动物房。

实验方法：取3批禽流感融合蛋白三价疫苗分别于颈背部皮下和大腿肌肉免疫21日龄SPF鸡10只，以10只注射生理盐水的SPF鸡作为对照。免疫后21日每只鸡采血分离血清，分别测定H5N1、H7N9、H9N2亚型的抗体效价，并采用H9N2亚型JL毒株E2代进行攻毒，攻毒方法：采用静脉注射0.2ml（含10^7.0EID50）。攻毒后第5日采集鸡的喉头和泄殖腔试子，将同一只鸡的取样混合作为一个样品接种10日龄SPF鸡蛋5枚，每枚0.2ml。孵化观察5日，测定HA效价，以5枚中至少有枚胚囊液HA效价不低于1:16判为感染。

实验结果：采用3批禽流感融合蛋白三价疫苗进行免疫效力测定，血清抗体效力结果显示3批禽流感融合蛋白三价疫苗均具有免疫保护效果。以普通H9N2亚型流感为模型攻毒，结果显示3批禽流感融合蛋白三价疫苗都获得对H9N2亚型病毒的保护，而对照组全部发病且8只死亡（表12）。

表12、流感抗体效价和病毒分离率

注：表中抗体效价为H5N1亚型、H7N9亚型、H9N2亚型的抗体效价平均值。

实施例7、禽流感融合蛋白三价疫苗免疫效果

实验方法：取3批禽流感融合蛋白三价疫苗分别免疫不同日龄SPF鸡，颈背部皮下免疫7日龄SPF鸡每只0.3ml，共40只，免疫21日龄SPF鸡每只0.5ml，共40只，以40只不免疫SPF鸡作为对照。7日龄鸡免疫后7日、14日、21日、28日、2个月、3个月、4个月和5个月分别从各免疫组抽取10只，连同对照组，分别采血，测定血清中H5N1、H7N9、H9N2亚型的抗体效价，并在免疫后的第4个月后以H9N2亚型流感为模型进行攻毒保护实验（具体步骤同实施例6）。21日龄鸡免疫后7日、14日、21日、28日、2个月、3个月、4个月、5个月分别从各免疫组抽取10只，连同对照组，分别采血，测定血清中H5N1、H7N9、H9N2亚型的抗体效价，并在免疫后的第6个月后以H9N2亚型流感为模型进行攻毒保护实验（具体步骤同实施例6）。

实验结果见表13和表14。

免疫7日龄SPF鸡从监控结果来看，融合蛋白中H9N2亚型HI抗体效价在免疫后21-28日达到高峰，可以达到9～9.1 Log2，免疫4个月缓慢下降到7.0～7.4 Log2，均没有低于现在全病毒灭活疫苗6.0Log2标准。H5N1亚型HI抗体效价在免疫后21～28日达到高峰，可以达到8.4～9.2 Log2，免疫4个月缓慢下降到7.0～7.4 Log2，均没有低于现在全病毒灭活疫苗6.0Log2标准。H7N9亚型HI抗体效价在免疫后21～28日达到高峰，可以达到9～9.7 Log2，免疫4个月缓慢下降到7.0～7.4 Log2，均没有低于现在全病毒灭活疫苗6.0Log2标准。在免疫后的第4个月后用H9流感进行攻毒实验，结果表明：免疫组未分离到活病毒，而对照组可以100%分离到病毒，且80%死亡。

免疫21日龄SPF鸡从监控结果来看，融合蛋白中H9N2亚型HI抗体效价在免疫后21～28日达到高峰，部分可以达到8.7～9.1 Log2，免疫4个月后缓慢下降到7.0～7.1 Log2，均没有低于现在全病毒灭活疫苗6.0Log2标准。H5N1亚型HI抗体效价在免疫后21～28日达到高峰，可以达到9～9.5 Log2，免疫4个月缓慢下降到7.0～7.4 Log2，均没有低于现在全病毒灭活疫苗6.0Log2标准。H7N9亚型HI抗体效价在免疫后21～28日达到高峰，可以达到9-9.7 Log2，免疫4个月缓慢下降到7.0～7.4 Log2，均没有低于现在全病毒灭活疫苗6.0Log2标准。在免疫后第6月用H9流感进行攻毒实验，结果表明，免疫组未分离到活病毒，而对照组可以100%分离到病毒，且80%死亡。

上述结果说明本发明的禽流感融合蛋白三价疫苗可以达到全病毒一样的免疫效果。

表13、7日龄SPF鸡免疫后抗体监测

表14、21日龄SPF鸡免疫后抗体监测

实施例8、禽流感融合蛋白三价疫苗对子代保护效果

实验材料：试验用SPF种鸡购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，实验地点为中海制药动物房。

实验方法：取禽流感融合蛋白三价疫苗免疫种鸡，在21日龄和开产前各免疫一次，颈背部皮下免疫SPF种鸡60只，每只0.3ml，以60只未免疫SPF种鸡作为对照。测定并监控免疫组与对照组SPF种鸡加强免疫后28日、3个月、4个月和5个月的血清中的H5N1、H7N9、H9N2亚型的抗体效价，以及种蛋孵化的雏鸡子代在7日龄、14日龄、21日龄、28日龄的母源抗体效价。

实验结果：SPF种鸡在21日龄和开产前各免疫一次禽流感融合蛋白三价疫苗，加强免疫5个月后H5N1、H7N9、H9N2亚型的抗体效价分别达到8.2（Log2）、8.0（Log2）和8.5（Log2），均达到疫苗要求保护标准（表15），种鸡的抗体可以经过卵黄传递给子代，种鸡免疫6个月产生种蛋孵化的雏鸡14日前也均达到母源抗体保护标准（表16）。

表15、种鸡免疫的不同时间段测定抗体效价

表16、子代不同日龄的抗体效价

序列表

<110> 北京中海生物科技有限公司

<120> 一种重组禽流感三价疫苗及其制备方法与应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3372

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ctcgagaagc ttgccaccat gggcaaggtg ctgaggggcc agatcgtgca gggcgtggtg 60

tggctgctgc tggtgaccgg cgcccagggc caccaccacc accaccacct gctgaacttc 120

gacctgctga agctggccgg cgacgtggag agcaaccccg gccccctgga ggtgctgttc 180

cagggcaacc tgaacggcgt gaagcccctg atcctggagg actgcagcgt ggccggctgg 240

ctgctgggca accccatgtg cgacaagttc ctgaaggtga gcgagtggag ctacatcgtg 300

gagaagacca accccgccaa cgacctgtgc taccccggcg acttcaacga ctacgaggag 360

ctgaagcacc tgctgagcag ggtgaacagg ttcgagaaga tcgagatcat ccccaagagc 420

cactggagca accacaacac cagcggcgtg agcagcgcct gcagctacct ggagaacccc 480

agcttcttca ggaacgtggt gtggctgacc aagaagaaca acacctaccc ccccatcaag 540

gtgaactaca ccaacgccag ccagaaggac ctgctgatcc tgtggggcat ccaccacccc 600

aacaacgagg ccgagcagaa gatcatctac cagaacctga acacctacgt gagcgtgggc 660

accagcaccc tgaaccagag gctggtgccc aagatcacca ccaggcccaa ggtgaacggc 720

cagagcggca ggatcgactt cttctggacc atcctgaagc ccaacgacac catcaacttc 780

gacagcaacg gcaacttcat cgcccccaag tacgcctaca agatcgtgaa gaagggcgac 840

agcgccatca tgaagagcgg cctggagtac ggcgactgca acaccaagtg ccagaccccc 900

atcggcgcca tcggcggcgg cggcagcggc ggcggcggca gcggcggcgg cggcagctgc 960

gccaccagcc tgggccaccc cctgatcctg gacacctgca ccgtggaggg cctgatctac 1020

ggcaacccca gctgcgacct gctgctggag ggcagggagt ggagctacat cgtggagagg 1080

cccagcgccg tgaacggcct gtgctacccc ggcaacgtgg agaacctgga ggagctgagg 1140

agcctgttca gcagcgccag gagctaccag aggatccaga tcttccccga caccatctgg 1200

aacgtgagct acaacggcac cagcaaggcc tgcagcgaca gcttctacag gagcatgagg 1260

tggctgaccc agaagaacaa cgcctacccc atccaggacg cccagtacac caacaaccag 1320

ggcaagaaca tcctgttcat gtggggcatc aaccaccccc ccaccaacac cgtgcagacc 1380

aacctgtaca ccaggaccga caccaccacc agcgtggcca ccgaggagat caacaggatc 1440

ttcaagcccc tgatcggccc caggcccctg gtgaacggcc tgatgggcag gatcgactac 1500

tactggagca tcctgaagcc cggccagacc ctgaggatca agagcgacgg caacctgatc 1560

gccccctggt acggccacat cctgagcggc gagagccacg gcaggatcct gaagaccgag 1620

ctgaagaggg gcagctgcac cgtgcagtgc cagaccgaga agggcggcct gaacaccacc 1680

ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcgacaa gatctgcctg 1740

ggccaccacg ccgtgagcaa cggcaccaag gtgaacaccc tgaccgagag gggcgtggag 1800

gtggtgaacg ccaccgagac cgtggagagg accaacatcc ccaggatctg cagcaagggc 1860

aagaggaccg tggacctggg ccagtgcggc ctgctgggca ccatcaccgg ccccccccag 1920

tgcgaccagt tcctggagtt cagcgccgac ctgatcatcg agaggaggga gggcagcgac 1980

gtgtgctacc ccggcaagtt cgtgaacgag gaggccctga ggcagatcct gagggagagc 2040

ggcggcatcg acaaggaggc catgggcttc acctacagcg gcatcaggac caacggcgcc 2100

accagcgcct gcaggaggag cggcagcagc ttctacgccg agatgaagtg gctgctgagc 2160

aacaccgaca acgccgcctt cccccagatg accaagagct acaagaacac caggaagagc 2220

cccgccctga tcgtgtgggg catccaccac agcgtgagca ccgccgagca gaccaagctg 2280

tacggcagcg gcaacaagct ggtgaccgtg ggcagcagca actaccagca gagcttcgtg 2340

cccagccccg gcgccaggcc ccaggtgaac ggcctgagcg gcaggatcga cttccactgg 2400

ctgatgctga accccaacga caccgtgacc ttcagcttca acggcgcctt catcgccccc 2460

gacagggcca gcttcctgag gggcaagagc atgggcatcc agagcggcgt gcaggtggac 2520

gccaactgcg agggcgactg ctaccacagc ggcggcacca tcatcagcaa cctgcccttc 2580

cagaacatcg acaacagggc cgtgggcaag tgccccaggt acgtgaagca gaggagcctg 2640

ctgctggcca ccggcatgaa gaacgtgccc gagatcccca agggcaggcg cggcggcctg 2700

ttcggcgcca tcgccggctt catcgagaac ggctgggagg gcctgatcga cggctggtac 2760

ggcttcaggc accagaacgc ccagggcgag ggcaccgccg ccgactacaa gagcacccag 2820

agcgccatcg accagatcac cggcaagctg aacaggctga tcgccaagac caaccagcag 2880

ttcgagctga tcgacaacga gttcaacgag gtggagaagc agatcggcaa cgtgatcaac 2940

tggaccaggg acagcatcac cgagatgtgg agctacaacg ccgagctgct gatcgccatg 3000

gagaaccagc acaccatcga cctggccgac agcgagatgg acaagctgta cgagagggtg 3060

aagaggcagc tgagggagaa cgccgaggag gacggcaccg gctgcttcga gatcttccac 3120

aagtgcgacg acgactgcat ggccagcatc aggaacaaca cctacgacca caggaagtac 3180

agggaggagg ccatgcagaa caggatccag atcgaccccg tgaagctgag cagcggctac 3240

aaggacgtga tcctgtggtt cagcttcggc gccagctgct tcatcctgct ggccatcgtg 3300

atgggcctgg tgttcatctg cgtgaagaac ggcaacatga ggtgcaccat ctgcatctaa 3360

gaattcggta cc 3372

<210> 2

<211> 1113

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Gly Lys Val Leu Arg Gly Gln Ile Val Gln Gly Val Val Trp Leu

1 5 10 15

Leu Leu Val Thr Gly Ala Gln Gly His His His His His His Leu Leu

20 25 30

Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly

35 40 45

Pro Leu Glu Val Leu Phe Gln Gly Asn Leu Asn Gly Val Lys Pro Leu

50 55 60

Ile Leu Glu Asp Cys Ser Val Ala Gly Trp Leu Leu Gly Asn Pro Met

65 70 75 80

Cys Asp Lys Phe Leu Lys Val Ser Glu Trp Ser Tyr Ile Val Glu Lys

85 90 95

Thr Asn Pro Ala Asn Asp Leu Cys Tyr Pro Gly Asp Phe Asn Asp Tyr

100 105 110

Glu Glu Leu Lys His Leu Leu Ser Arg Val Asn Arg Phe Glu Lys Ile

115 120 125

Glu Ile Ile Pro Lys Ser His Trp Ser Asn His Asn Thr Ser Gly Val

130 135 140

Ser Ser Ala Cys Ser Tyr Leu Glu Asn Pro Ser Phe Phe Arg Asn Val

145 150 155 160

Val Trp Leu Thr Lys Lys Asn Asn Thr Tyr Pro Pro Ile Lys Val Asn

165 170 175

Tyr Thr Asn Ala Ser Gln Lys Asp Leu Leu Ile Leu Trp Gly Ile His

180 185 190

His Pro Asn Asn Glu Ala Glu Gln Lys Ile Ile Tyr Gln Asn Leu Asn

195 200 205

Thr Tyr Val Ser Val Gly Thr Ser Thr Leu Asn Gln Arg Leu Val Pro

210 215 220

Lys Ile Thr Thr Arg Pro Lys Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Ile Asp

225 230 235 240

Phe Phe Trp Thr Ile Leu Lys Pro Asn Asp Thr Ile Asn Phe Asp Ser

245 250 255

Asn Gly Asn Phe Ile Ala Pro Lys Tyr Ala Tyr Lys Ile Val Lys Lys

260 265 270

Gly Asp Ser Ala Ile Met Lys Ser Gly Leu Glu Tyr Gly Asp Cys Asn

275 280 285

Thr Lys Cys Gln Thr Pro Ile Gly Ala Ile Gly Gly Gly Gly Ser Gly

290 295 300

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Cys Ala Thr Ser Leu Gly His

305 310 315 320

Pro Leu Ile Leu Asp Thr Cys Thr Val Glu Gly Leu Ile Tyr Gly Asn

325 330 335

Pro Ser Cys Asp Leu Leu Leu Glu Gly Arg Glu Trp Ser Tyr Ile Val

340 345 350

Glu Arg Pro Ser Ala Val Asn Gly Leu Cys Tyr Pro Gly Asn Val Glu

355 360 365

Asn Leu Glu Glu Leu Arg Ser Leu Phe Ser Ser Ala Arg Ser Tyr Gln

370 375 380

Arg Ile Gln Ile Phe Pro Asp Thr Ile Trp Asn Val Ser Tyr Asn Gly

385 390 395 400

Thr Ser Lys Ala Cys Ser Asp Ser Phe Tyr Arg Ser Met Arg Trp Leu

405 410 415

Thr Gln Lys Asn Asn Ala Tyr Pro Ile Gln Asp Ala Gln Tyr Thr Asn

420 425 430

Asn Gln Gly Lys Asn Ile Leu Phe Met Trp Gly Ile Asn His Pro Pro

435 440 445

Thr Asn Thr Val Gln Thr Asn Leu Tyr Thr Arg Thr Asp Thr Thr Thr

450 455 460

Ser Val Ala Thr Glu Glu Ile Asn Arg Ile Phe Lys Pro Leu Ile Gly

465 470 475 480

Pro Arg Pro Leu Val Asn Gly Leu Met Gly Arg Ile Asp Tyr Tyr Trp

485 490 495

Ser Ile Leu Lys Pro Gly Gln Thr Leu Arg Ile Lys Ser Asp Gly Asn

500 505 510

Leu Ile Ala Pro Trp Tyr Gly His Ile Leu Ser Gly Glu Ser His Gly

515 520 525

Arg Ile Leu Lys Thr Glu Leu Lys Arg Gly Ser Cys Thr Val Gln Cys

530 535 540

Gln Thr Glu Lys Gly Gly Leu Asn Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly

545 550 555 560

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Ile Cys Leu Gly His

565 570 575

His Ala Val Ser Asn Gly Thr Lys Val Asn Thr Leu Thr Glu Arg Gly

580 585 590

Val Glu Val Val Asn Ala Thr Glu Thr Val Glu Arg Thr Asn Ile Pro

595 600 605

Arg Ile Cys Ser Lys Gly Lys Arg Thr Val Asp Leu Gly Gln Cys Gly

610 615 620

Leu Leu Gly Thr Ile Thr Gly Pro Pro Gln Cys Asp Gln Phe Leu Glu

625 630 635 640

Phe Ser Ala Asp Leu Ile Ile Glu Arg Arg Glu Gly Ser Asp Val Cys

645 650 655

Tyr Pro Gly Lys Phe Val Asn Glu Glu Ala Leu Arg Gln Ile Leu Arg

660 665 670

Glu Ser Gly Gly Ile Asp Lys Glu Ala Met Gly Phe Thr Tyr Ser Gly

675 680 685

Ile Arg Thr Asn Gly Ala Thr Ser Ala Cys Arg Arg Ser Gly Ser Ser

690 695 700

Phe Tyr Ala Glu Met Lys Trp Leu Leu Ser Asn Thr Asp Asn Ala Ala

705 710 715 720

Phe Pro Gln Met Thr Lys Ser Tyr Lys Asn Thr Arg Lys Ser Pro Ala

725 730 735

Leu Ile Val Trp Gly Ile His His Ser Val Ser Thr Ala Glu Gln Thr

740 745 750

Lys Leu Tyr Gly Ser Gly Asn Lys Leu Val Thr Val Gly Ser Ser Asn

755 760 765

Tyr Gln Gln Ser Phe Val Pro Ser Pro Gly Ala Arg Pro Gln Val Asn

770 775 780

Gly Leu Ser Gly Arg Ile Asp Phe His Trp Leu Met Leu Asn Pro Asn

785 790 795 800

Asp Thr Val Thr Phe Ser Phe Asn Gly Ala Phe Ile Ala Pro Asp Arg

805 810 815

Ala Ser Phe Leu Arg Gly Lys Ser Met Gly Ile Gln Ser Gly Val Gln

820 825 830

Val Asp Ala Asn Cys Glu Gly Asp Cys Tyr His Ser Gly Gly Thr Ile

835 840 845

Ile Ser Asn Leu Pro Phe Gln Asn Ile Asp Asn Arg Ala Val Gly Lys

850 855 860

Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln Arg Ser Leu Leu Leu Ala Thr Gly Met

865 870 875 880

Lys Asn Val Pro Glu Ile Pro Lys Gly Arg Arg Gly Gly Leu Phe Gly

885 890 895

Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly

900 905 910

Trp Tyr Gly Phe Arg His Gln Asn Ala Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala

915 920 925

Asp Tyr Lys Ser Thr Gln Ser Ala Ile Asp Gln Ile Thr Gly Lys Leu

930 935 940

Asn Arg Leu Ile Ala Lys Thr Asn Gln Gln Phe Glu Leu Ile Asp Asn

945 950 955 960

Glu Phe Asn Glu Val Glu Lys Gln Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr

965 970 975

Arg Asp Ser Ile Thr Glu Met Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Ile

980 985 990

Ala Met Glu Asn Gln His Thr Ile Asp Leu Ala Asp Ser Glu Met Asp

995 1000 1005

Lys Leu Tyr Glu Arg Val Lys Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Glu

1010 1015 1020

Asp Gly Thr Gly Cys Phe Glu Ile Phe His Lys Cys Asp Asp Asp Cys

1025 1030 1035 1040

Met Ala Ser Ile Arg Asn Asn Thr Tyr Asp His Arg Lys Tyr Arg Glu

1045 1050 1055

Glu Ala Met Gln Asn Arg Ile Gln Ile Asp Pro Val Lys Leu Ser Ser

1060 1065 1070

Gly Tyr Lys Asp Val Ile Leu Trp Phe Ser Phe Gly Ala Ser Cys Phe

1075 1080 1085

Ile Leu Leu Ala Ile Val Met Gly Leu Val Phe Ile Cys Val Lys Asn

1090 1095 1100

Gly Asn Met Arg Cys Thr Ile Cys Ile

1105 1110

<210> 3

<211> 2370

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aagcttgcca ccatgggcaa ggtgctgagg ggccagatcg tgcagggcgt ggtgtggctg 60

ctgctggtga ccggcgccca gggcatgagc ctgctgaccg aggtggagac ctacgtgctg 120

agcatcatcc ccagcggccc cctgaaggcc gagatcgccc agaggctgga ggacgtgttc 180

gccggcaaga acgccgacct ggaggccctg atggagtgga tcaagaccag gcccatcctg 240

agccccctga ccaagggcat cctgggcttc gtgttcaccc tgaccgtgcc cagcgagagg 300

ggcctgcaga ggaggaggtt cgtgcagaac gccctgaacg gcaacggcga ccccaacaac 360

atggacaagg ccgtgaagct gtacaagaag ctgaagaggg agatgacctt ccacggcgcc 420

aaggaggtgg ccctgagcta cagcaccggc gccctggcca gctgcatggg cctgatctac 480

aacaggatgg gcaccgtgac cgccgagggc gccctgggcc tggtgtgcgc cacctgcgag 540

cagatcgccg acgcccagca caggagccac aggcagatgg ccaccaccac caaccccctg 600

atcaggcacg agaacaggat ggtgctggcc agcaccaccg ccaaggccat ggagcagatg 660

gccggcagca gcgagcaggc cgccgaggcc atggaggtgg ccagccaggc caggcagatg 720

gtgcaggcca tgaggaccgt gggcacccac cccaacagca gcaccggcct gaaggacgac 780

ctgatcgaga acctgcaggc ctaccagaac aggatgggcg tgcagctgca gaggttcaag 840

caccaccacc accaccaccg ccgccgccga caccaccacc accaccacat gggcaaggtg 900

ctgaggggcc agatcgtgca gggcgtggtg tggctgctgc tggtgaccgg cgcccagggc 960

atgaacccca accagaagat cctgtgcacc agcgccaccg ccatcatcat cggcgccatc 1020

gccgtgctga tcggcatcgc caacctgggc ctgaacatcg gcctgcacct gaagcccggc 1080

tgcaactgca gccacagcca gcccgagacc accaacacca gccagaccat catcaacaac 1140

tactacaacg agaccaacat caccaacatc cagatggagg agaggaccag caggaacttc 1200

aacaacctga ccaagggcct gtgcaccatc aacagctggc acatctacgg caaggacaac 1260

gccgtgagga tcggcgagag cagcgacgtg ctggtgacca gggagcccta cgtgagctgc 1320

gaccccgacg agtgcaggtt ctacgccctg agccagggca ccaccatcag gggcaagcac 1380

agcaacggca ccatccacga caggagccag tacagggccc tgatcagctg gcccctgagc 1440

agccccccca ccgtgtacaa cagcagggtg gagtgcatcg gctggagcag caccagctgc 1500

cacgacggca agagcaggat gagcatctgc atcagcggcc ccaacaacaa cgccagcgcc 1560

gtggtgtggt acaacaggag gcccgtggcc gagatcaaca cctgggccag gaacatcctg 1620

aggacccagg agagcgagtg cgtgtgccac aacggcgtgt gccccgtggt gttcaccgac 1680

ggcagcgcca ccggccccgc cgacaccagg atctactact tcaaggaggg caagatcctg 1740

aagtgggaga gcctgaccgg caccgccaag cacatcgagg agtgcagctg ctacggcgag 1800

aggaccggca tcacctgcac ctgcagggac aactggcagg gcagcaacag gcccgtgatc 1860

cagatcgacc ccgtggccat gacccacacc agccagtaca tctgcagccc cgtgctgacc 1920

gacaacccca ggcccaacga ccccaacatc ggcaagtgca acgaccccta ccccggcaac 1980

aacaacaacg gcgtgaaggg cttcagctac ctggacggcg ccaacacctg gctgggcagg 2040

accatcagca ccgccagcag gagcggctac gagatgctga aggtgcccaa cgccctgacc 2100

gacgacagga gcaagcccat ccagggccag accatcgtgc tgaacgccga ctggagcggc 2160

tacagcggca gcttcatgga ctactgggcc gagggcgact gctacagggc ctgcttctac 2220

gtggagctga tcaggggcaa gcccaaggag gacaaggtgt ggtggaccag caacagcatc 2280

gtgagcatgt gcagcagcac cgagttcctg ggccagtgga actggcccga cggcgccaag 2340

atcgagtact tcctgtaaga attcggtacc 2370

<210> 4

<211> 781

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 4

Met Gly Lys Val Leu Arg Gly Gln Ile Val Gln Gly Val Val Trp Leu

1 5 10 15

Leu Leu Val Thr Gly Ala Gln Gly Met Ser Leu Leu Thr Glu Val Glu

20 25 30

Thr Tyr Val Leu Ser Ile Ile Pro Ser Gly Pro Leu Lys Ala Glu Ile

35 40 45

Ala Gln Arg Leu Glu Asp Val Phe Ala Gly Lys Asn Ala Asp Leu Glu

50 55 60

Ala Leu Met Glu Trp Ile Lys Thr Arg Pro Ile Leu Ser Pro Leu Thr

65 70 75 80

Lys Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu Thr Val Pro Ser Glu Arg

85 90 95

Gly Leu Gln Arg Arg Arg Phe Val Gln Asn Ala Leu Asn Gly Asn Gly

100 105 110

Asp Pro Asn Asn Met Asp Lys Ala Val Lys Leu Tyr Lys Lys Leu Lys

115 120 125

Arg Glu Met Thr Phe His Gly Ala Lys Glu Val Ala Leu Ser Tyr Ser

130 135 140

Thr Gly Ala Leu Ala Ser Cys Met Gly Leu Ile Tyr Asn Arg Met Gly

145 150 155 160

Thr Val Thr Ala Glu Gly Ala Leu Gly Leu Val Cys Ala Thr Cys Glu

165 170 175

Gln Ile Ala Asp Ala Gln His Arg Ser His Arg Gln Met Ala Thr Thr

180 185 190

Thr Asn Pro Leu Ile Arg His Glu Asn Arg Met Val Leu Ala Ser Thr

195 200 205

Thr Ala Lys Ala Met Glu Gln Met Ala Gly Ser Ser Glu Gln Ala Ala

210 215 220

Glu Ala Met Glu Val Ala Ser Gln Ala Arg Gln Met Val Gln Ala Met

225 230 235 240

Arg Thr Val Gly Thr His Pro Asn Ser Ser Thr Gly Leu Lys Asp Asp

245 250 255

Leu Ile Glu Asn Leu Gln Ala Tyr Gln Asn Arg Met Gly Val Gln Leu

260 265 270

Gln Arg Phe Lys His His His His His His Arg Arg Arg Arg His His

275 280 285

His His His His Met Gly Lys Val Leu Arg Gly Gln Ile Val Gln Gly

290 295 300

Val Val Trp Leu Leu Leu Val Thr Gly Ala Gln Gly Met Asn Pro Asn

305 310 315 320

Gln Lys Ile Leu Cys Thr Ser Ala Thr Ala Ile Ile Ile Gly Ala Ile

325 330 335

Ala Val Leu Ile Gly Ile Ala Asn Leu Gly Leu Asn Ile Gly Leu His

340 345 350

Leu Lys Pro Gly Cys Asn Cys Ser His Ser Gln Pro Glu Thr Thr Asn

355 360 365

Thr Ser Gln Thr Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Asn Glu Thr Asn Ile Thr

370 375 380

Asn Ile Gln Met Glu Glu Arg Thr Ser Arg Asn Phe Asn Asn Leu Thr

385 390 395 400

Lys Gly Leu Cys Thr Ile Asn Ser Trp His Ile Tyr Gly Lys Asp Asn

405 410 415

Ala Val Arg Ile Gly Glu Ser Ser Asp Val Leu Val Thr Arg Glu Pro

420 425 430

Tyr Val Ser Cys Asp Pro Asp Glu Cys Arg Phe Tyr Ala Leu Ser Gln

435 440 445

Gly Thr Thr Ile Arg Gly Lys His Ser Asn Gly Thr Ile His Asp Arg

450 455 460

Ser Gln Tyr Arg Ala Leu Ile Ser Trp Pro Leu Ser Ser Pro Pro Thr

465 470 475 480

Val Tyr Asn Ser Arg Val Glu Cys Ile Gly Trp Ser Ser Thr Ser Cys

485 490 495

His Asp Gly Lys Ser Arg Met Ser Ile Cys Ile Ser Gly Pro Asn Asn

500 505 510

Asn Ala Ser Ala Val Val Trp Tyr Asn Arg Arg Pro Val Ala Glu Ile

515 520 525

Asn Thr Trp Ala Arg Asn Ile Leu Arg Thr Gln Glu Ser Glu Cys Val

530 535 540

Cys His Asn Gly Val Cys Pro Val Val Phe Thr Asp Gly Ser Ala Thr

545 550 555 560

Gly Pro Ala Asp Thr Arg Ile Tyr Tyr Phe Lys Glu Gly Lys Ile Leu

565 570 575

Lys Trp Glu Ser Leu Thr Gly Thr Ala Lys His Ile Glu Glu Cys Ser

580 585 590

Cys Tyr Gly Glu Arg Thr Gly Ile Thr Cys Thr Cys Arg Asp Asn Trp

595 600 605

Gln Gly Ser Asn Arg Pro Val Ile Gln Ile Asp Pro Val Ala Met Thr

610 615 620

His Thr Ser Gln Tyr Ile Cys Ser Pro Val Leu Thr Asp Asn Pro Arg

625 630 635 640

Pro Asn Asp Pro Asn Ile Gly Lys Cys Asn Asp Pro Tyr Pro Gly Asn

645 650 655

Asn Asn Asn Gly Val Lys Gly Phe Ser Tyr Leu Asp Gly Ala Asn Thr

660 665 670

Trp Leu Gly Arg Thr Ile Ser Thr Ala Ser Arg Ser Gly Tyr Glu Met

675 680 685

Leu Lys Val Pro Asn Ala Leu Thr Asp Asp Arg Ser Lys Pro Ile Gln

690 695 700

Gly Gln Thr Ile Val Leu Asn Ala Asp Trp Ser Gly Tyr Ser Gly Ser

705 710 715 720

Phe Met Asp Tyr Trp Ala Glu Gly Asp Cys Tyr Arg Ala Cys Phe Tyr

725 730 735

Val Glu Leu Ile Arg Gly Lys Pro Lys Glu Asp Lys Val Trp Trp Thr

740 745 750

Ser Asn Ser Ile Val Ser Met Cys Ser Ser Thr Glu Phe Leu Gly Gln

755 760 765

Trp Asn Trp Pro Asp Gly Ala Lys Ile Glu Tyr Phe Leu

770 775 780

Claims

1.重组融合蛋白，所述重组融合蛋白由HA融合蛋白和M2-NA融合蛋白组成；

所述HA融合蛋白的氨基酸序列如序列2所示；

所述M2-NA融合蛋白的氨基酸序列如序列4所示的蛋白质。

2.与权利要求1所述的重组融合蛋白相关的生物材料，所述生物材料为下述B1）-B5）中至少一种：

B1）编码权利要求1所述重组融合蛋白的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：编码所述HA融合蛋白的核酸分子为如下X1）或X2）所示的基因：

X1）序列1第19-3360位所示的DNA分子；

Y1）序列3第13-2358位所示的DNA分子；

4.权利要求1所述重组融合蛋白的制备方法，包括如下步骤：使编码权利要求1中所述HA融合蛋白的核酸分子和编码权利要求1中所述M2-NA融合蛋白的核酸分子在生物或生物细胞中进行表达，得到所述重组融合蛋白。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：将编码所述HA融合蛋白的核酸分子和编码所述M2-NA融合蛋白的核酸分子导入CHO细胞，得到重组细胞；将所述重组细胞进行发酵培养，得到所述重组融合蛋白。

6.权利要求1所述的重组融合蛋白或权利要求2或3所述的生物材料或按照权利要求4或5所述方法制备得到的重组融合蛋白在制备预防流感病毒的产品中的应用；所述流感病毒为H5N1亚型、H7N9亚型、H9N2亚型禽流感病毒。

7.一种流感疫苗，其活性成分为权利要求1所述的重组融合蛋白或权利要求2或3所述的生物材料或按照权利要求4或5所述方法制备得到的重组融合蛋白。

8.根据权利要求7所述的流感疫苗，其特征在于：所述流感疫苗还包括佐剂。

9.权利要求7或8所述流感疫苗在制备预防流感病毒的产品中的应用；所述流感病毒为H5N1亚型、H7N9亚型、H9N2亚型禽流感病毒。