CN112076313B - 一种口蹄疫亚单位疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种口蹄疫亚单位疫苗及其制备方法和应用。本发明首先确定了两种作为口蹄疫疫苗抗原来源的我国口蹄疫O型和A型流行病毒；其次获得了分别或同时含有上述两种病毒结构蛋白VP0、VP3和VP1的口蹄疫亚单位疫苗；所述的口蹄疫亚单位疫苗全保护免疫剂量可低至单组份20μg/头份，且分别或同时对我国多株代表性O型口蹄疫流行毒或A型口蹄疫流行毒具有免疫保护作用。

Description

一种口蹄疫亚单位疫苗及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种口蹄疫亚单位疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus，FMDV)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，口蹄疫病毒属(Aphthovirus)。口蹄疫病毒粒子无囊膜，呈二十面体对称，由结构蛋白VP0、VP3和VP1组成，其中VP0蛋白由VP4和VP2组成。该病毒主要感染猪、牛、羊等偶蹄动物，具有传播快、感染致病性强等特征。口蹄疫病毒有七个血清型(O、A、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3和C型)，各型之间无交叉保护反应，相当于防控7种不同的动物疫病。我国口蹄疫流行历史久远，当前主要流行O型和A型。据国家口蹄疫参考实验室监测，我国O型口蹄疫主要有4个流行毒：中国古典拓扑型毒株(CATHAY topotype)、泛亚毒株(PanAsiastrain)、缅甸-98毒株(Mya-98strain)和印度-2001(Ind-2001strain)等；A型主要流行东南亚-97毒株(Sea-97stian)。同一时期，存在多个流行毒株，给我国口蹄疫防控带来巨大压力。
在我国，采取以预防为主的综合防控策略防控口蹄疫，对口蹄疫易感动物接种灭活疫苗是最常用的免疫措施。所述的灭活疫苗是口蹄疫田间毒株经病毒培养系统大量扩增、灭活、乳化等工艺制成，为控制我国口蹄疫的大流行起到了重要作用。但是，传统的灭活疫苗存在生产环节散毒的风险，且有些田间流行毒因自然属性限制，难以驯化为疫苗种毒。更为重要的是，我国现有口蹄疫流行毒株复杂、多变，传统灭活疫苗难以应对。以O型Mya-98毒株为例，该毒株自2010年传入我国，造成我国口蹄疫大流行。O型口蹄疫灭活疫苗代表种毒(O/Mya98/BY/2010株)为控制Mya-98疫情大流行作出了重要贡献。但是，在免疫压力、境外毒株持续传入等多重因素作用下，O型Mya-98病毒发生快速变异，现有O型Mya-98毒株与2010年初流行毒株(如疫苗株O/Mya98/BY/2010)的VP1核苷酸序列差异近10％，流行毒株与疫苗毒株抗原关系(r值)也呈现下降趋势，甚至发现r值低于0.3的田间流行毒，超出了OIE疫苗匹配推荐范围。
口蹄疫各血清型之间不能交叉免疫保护，加之国内同时存在多种O型口蹄疫流行毒株，现有口蹄疫疫苗无法同时对以上4个谱系O型流行毒株(尤其是变异毒株)以及A型流行毒株提供高效的保护作用，亟需采用抗原组合的方式解决上述问题。
亚单位疫苗的研制与应用，为解决口蹄疫免疫防疫问题提供了思路。口蹄疫病毒结构蛋白负责组装病毒衣壳，决定抗原特异性，是病毒重要的抗原成份。与小RNA病毒科的其它病毒相似，口蹄疫病毒三种结构蛋白VP0、VP3和VP1在体外混合后，一部分会自行装配形成空衣壳，其形态、结构与真实病毒粒子相同或相似，保有病毒粒子空间构象和免疫原性，但不含病毒核酸，无法进行复制，也不具有感染性。口蹄疫病毒空衣壳含有病毒的特异性抗原表位，能模拟天然病毒对宿主细胞的感染，有效刺激机体产生很强的免疫应答，是更加安全有效的疫苗候选者。
发明内容
本发明首次研制出分别或同时针对我国O型口蹄疫4个主要谱系流行毒和A型口蹄疫流行毒具有广泛交叉保护作用的高效口蹄疫亚单位疫苗。首先，通过血清交叉中和试验，筛选中意外地发现O/17002对我国O型口蹄疫流行毒具有广泛交叉中和作用，并以该毒株作为疫苗抗原来源毒株，以O/17002毒株三种结构蛋白VP0、VP3和VP1构建O型口蹄疫亚单位疫苗；其次，以A型口蹄疫流行毒株A/GDMM/2013作为疫苗抗原来源毒株，以A/GDMM/2013毒株三种结构蛋白VP0、VP3和VP1构建A型口蹄疫亚单位疫苗；并将上述两种疫苗混合制备了同时对多种O型口蹄疫流行毒和主要A型口蹄疫流行毒具有广泛交叉中和作用口蹄疫亚单位疫苗。
具体发明内容为：
一种口蹄疫亚单位疫苗，所述口蹄疫亚单位疫苗包括O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP0、VP1、VP3，和/或A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP0、VP1、VP3；其中，所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
优选地，所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP0的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP0的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示。
优选地，所述口蹄疫亚单位疫苗包括O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物，和/或A型口蹄疫病毒结构蛋白组合物；其中所述O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物包括O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP0、VP1、VP3；所述A型口蹄疫病毒结构蛋白组合物包括A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP0、VP1、VP3。
优选地，所述口蹄疫亚单位疫苗还包括佐剂。
优选地，所述佐剂为化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂、植物类免疫佐剂、生化类免疫佐剂中的一种或几种。
本发明发现，将所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的118位赖氨酸突变为精氨酸，和/或将所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的210位赖氨酸突变为精氨酸；和/或将所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的118位赖氨酸突变为精氨酸，和/或将所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的209位赖氨酸突变为精氨酸后提高了口蹄疫亚单位疫苗的体内稳定性和保护效力。
具体发明内容为：
在上述亚单位疫苗的基础上，将所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1第210位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；和/或将所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3第118位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQID NO：9所示；和/或将所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1第209位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQID NO：15所示；和/或将所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/CHA/2013结构蛋白VP3第118位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
优选地，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQID NO：6所示，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ IDNO：10所示，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQID NO：16所示，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
优选地，所述口蹄疫亚单位疫苗包括O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物，和/或A型口蹄疫病毒结构蛋白组合物；其中将所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1第210位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQID NO：5所示；和/或将所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3第118位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；和/或将所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1第209位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；和/或将所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3第118位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
优选地，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQID NO：6所示，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ IDNO：10所示，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQID NO：16所示，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
优选地，所述口蹄疫亚单位疫苗还包括佐剂。
优选地，所述佐剂为化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂、植物类免疫佐剂、生化类免疫佐剂中的一种或几种。
本发明还提供了一种口蹄疫亚单位疫苗在制备预防或防治口蹄疫制品中的应用。
本发明还提供了一种口蹄疫亚单位疫苗的制备方法，所述方法为：将O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP0、VP1、VP3，和/或A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP0、VP1、VP3乳化即得。
优选地，所述方法包括：
(1)：制备纯化获得O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物，乳化即得口蹄疫亚单位疫苗；其中，所述O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物包括O型口蹄疫病毒株O/17002的结构蛋白VP0、VP1、VP3；
和/或(2)：制备纯化获得A型口蹄疫病毒结构蛋白组合物，乳化即得口蹄疫亚单位疫苗；其中所述A型口蹄疫病毒结构蛋白组合物包括A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013的结构蛋白VP0、VP1、VP3；
和/或(3)：将(1)中的O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物与(2)中的A型口蹄疫病毒结构蛋白组合物混合后，乳化即得口蹄疫亚单位疫苗。
优选地，所述口蹄疫病毒样颗粒的制备方法为：
设计编码融合标签蛋白基因序列THS，其中T为翻译起始区核苷酸序列，H为编码含组氨酸标签的核苷酸序列，S为编码含酿酒酵母小泛素样修饰蛋白(SUMO)的核苷酸序列，所述THS的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示；
将所述的融合标签蛋白基因序列THS分别与编码O型口蹄疫病毒株O/17002和/或A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP0、VP3和VP1的基因串联，分别形成融合目标蛋白基因序列THS-O/VP0、THS-O/VP3、THS-O/VP1，和/或THS-A/VP0、THS-A/VP3、THS-A/VP1；
通过分子克隆技术将所述三段融合目标蛋白基因序列同时克隆入原核表达载体pET30a，获得重组表达质粒pET-O/FMDV-VP310，和/或pET-A/FMDV-VP310；
将所述的重组表达质粒pET-O/FMDV-VP310和/或pET-A/FMDV-VP310分别转化大肠杆菌，获得基因工程菌，将所述基因工程菌进行发酵培养，诱导表达带有融合标签蛋白的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3、VP1，和/或A型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3、VP1；
破碎基因工程菌菌体后，回收上清液，亲和色谱层析分离纯化获得带有融合标签蛋白的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3、VP1混合物，和/或A型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3、VP1混合物；
酶切去除所述混合物中的融合标签蛋白后，再用亲和色谱层析分离纯化获得O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物和/或A型口蹄疫病毒结构蛋白组合物。
优选地，将所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1第210位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；和/或将所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3第118位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；和/或将所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1第209位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；和/或将所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3第118位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
优选地，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQID NO：6所示，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ IDNO：10所示，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQID NO：16所示，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
本发明的有益效果是：①首先，本发明提供了一种基于免疫效力高、抗原匹配性好、能同时对多种田间流行毒株提供有效保护的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白基因VP0、VP3和VP1构建的O型口蹄疫亚单位疫苗，所述亚单位疫苗最小全保护免疫剂量可低至20μg/头份，且对我国O型口蹄疫流行毒具有广泛交叉保护作用；②其次，本发明提供了一种基于免疫效力高、对我国田间流行毒株提供有效保护的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白基因VP0、VP3和VP1构建的A型口蹄疫亚单位疫苗，最小全保护免疫剂量可低至20μg/头份；③将所述的O型口蹄疫亚单位疫苗和A型口蹄疫亚单位疫苗混合制备的口蹄疫亚单位疫苗，O/A两种组份最小全保护免疫剂量分别可低至20μg/头份，且对我国多种O型口蹄疫流行毒和主要A型口蹄疫流行毒具有广泛交叉保护作用。
附图说明
图1本发明所得的O型口蹄疫病毒样颗粒透射电镜观察结果；
图2O型口蹄疫病毒结构蛋白优化前后亚单位疫苗免疫猪中和抗体应答结果；
图3本发明所得的A型口蹄疫病毒样颗粒透射电镜观察结果；
图4A型口蹄疫病毒结构蛋白优化前后亚单位疫苗免疫猪中和抗体应答结果；
图5O型口蹄疫病毒结构蛋白优化后的亚单位疫苗免疫猪后中和抗体应答结果；
图6A型口蹄疫病毒结构蛋白优化后的亚单位疫苗免疫猪后中和抗体应答结果；
图7O/A二价口蹄疫亚单位疫苗免疫猪后中和抗体应答结果；
具体实施方式
以下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，这些实施例是用于说明本发明而不限于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件做进一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
以下实施例中所述的实验获得生物安全许可和口蹄疫实验室活动许可：
中国农业科学院兰州兽医研究所根据生物安全3级实验室(BSL-3)和口蹄疫相关生物安全的相关要求，经兰州兽医研究所生物安全委员会、实验动物伦理委员会、中国农业科学院生物安全委员会、兰州兽医研究所实验动物伦理委员会、兰州兽医研究所生物安全委员会逐级上报，获得农业部关于开展高致病性FMDV病原及动物研究许可，并已在农业农村部备案，符合国家生物安全等级的要求。
A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013、O型口蹄疫病毒株O/17002来自国家口蹄疫参考实验室-中国农业科学院兰州兽医研究所。
本发明中相关术语的说明及解释：
术语“大肠杆菌表达系统”是指由大肠杆菌(菌株)与载体组成，其中大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的，在此举例但不限于：BL21(DE3)，BL21(DE3)pLysS，B834(DE3)，BLR(DE3)，JM109，XL1Blue，ER2566，Rosetta，GI698，优选BL21(DE3)。
术语“载体”是指可将某编码蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可以通过转化，转导或者转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。举例来说，载体包括：质粒；噬菌体；柯斯质粒等。
本发明将口蹄疫病毒结构蛋白VP3，VP1，VP0(为VP4和VP2的基因融合)进行串联共表达，所述串联共表达是指把多个基因插入到同一个载体中共表达。串联共表达顺序包括但不限于VP3-VP1-VP0，可以为VP3，VP1，VP0之间的各种组合以及VP1，VP2，VP3，VP4之间的各种可能组合，例如可以是VP1-VP3-VP0的串联顺序，VP3-VP0-VP1的串联顺序，VP1-VP0-VP3的串联顺序，VP3-VP1-VP2-VP4的串联顺序，VP4-VP2-VP3-VP1的串联顺序等，优选VP3-VP1-VP0的串联顺序。
术语“疫苗”是指能够在动物中提供保护性应答的生物制剂，其中所述疫苗已经被递送并且不能造成严重疾病。本发明的疫苗是遗传工程改造的，包括：由O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP0、VP3和VP1组合的O型口蹄疫亚单位疫苗；由A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP0、VP3和VP1组合的A型口蹄疫亚单位疫苗；由O型口蹄疫亚单位疫苗和A型口蹄疫亚单位疫苗组合的O/A二价口蹄疫亚单位疫苗。
本发明的疫苗，进一步任选地包含一种或多种佐剂，赋形剂，载体和稀释剂。佐剂可以任何合适的佐剂，化学类免疫佐剂如氢氧化铝、弗氏佐剂、矿物油、司盘等；微生物类免疫佐剂如分枝杆菌、BCC、脂多糖、胞壁酰二肽、胞肽、脂溶性蜡质D、短小棒状杆菌；植物类免疫佐剂多为从植物或大真菌中提取的多糖类，如茯苓多糖、红花多糖、中草药类等。而生化类免疫佐剂如胸腺肽、转移因子、白细胞介素等。优选的佐剂可以是纳米佐剂生物佐剂，白介素、干扰素等。
本发明的疫苗也可用于联合疫苗，如与其他动物疫苗联合，制备二联苗、三联苗。
本发明的病毒亚单位疫苗优选采用肌肉注射方式免疫动物。疫苗可以单次免疫，或可采用“初免-加强”方式，达到刺激机体产生更高水平抗体或达到延长保护期目的。例如，易感动物在第一次免疫后，可以在一段时间(例如1个月)之后加强免疫。此外，结合生产实际，也可以进行第三次或更多次加强免疫，例如免疫后2-3个月加强免疫、6个月加强免疫或一年2-3次免疫等。
实施例1O型口蹄疫亚单位疫苗
一、O型口蹄疫结构蛋白组合物制备
1、口蹄疫病毒结构蛋白重组表达载体的构建
(1)设计由下述原件串联组成的编码融合标签蛋白的基因序列THS，其中T为翻译起始区核苷酸序列，H为编码含组氨酸标签的核苷酸序列，S为编码含酿酒酵母小泛素样修饰蛋白(SUMO)的核苷酸序列；所述THS的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示。
(2)将上述THS基因序列分别与编码O/17002毒株结构蛋白基因VP0、VP3、VP1按顺序串联，形成三段融合基因序列THS-VP0、THS-VP3和THS-VP1。其中所述编码O/17002毒株结构蛋白基因VP0、VP3、VP1包括以下四种情况：
①未经任何处理的编码O/17002毒株结构蛋白VP0、VP3、VP1的基因，所述O/17002毒株结构蛋白VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述O/17002毒株结构蛋白VP1的氨基酸如SEQ ID NO：3所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；所述O/17002毒株结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示；
②将编码O/17002毒株结构蛋白VP1进行突变，所述突变为：将结构蛋白VP1的210位赖氨酸的密码子突变为编码精氨酸的密码子，突变后的VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；而O/17002毒株结构蛋白VP0和VP3未经任何处理；
③将编码O/17002毒株结构蛋白VP3进行突变，所述突变为：将结构蛋白VP3的118位赖氨酸的密码子突变为编码精氨酸的密码子，突变后的VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，而O/17002毒株结构蛋白VP0和VP1未经任何处理；
④将编码O/17002毒株结构蛋白VP1和VP3同时进行突变，所述突变为：将结构蛋白VP1的210位赖氨酸的密码子突变为编码精氨酸的密码子，并将结构蛋白VP3的118位赖氨酸的密码子突变为编码精氨酸的密码子；突变后的VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；突变后的VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示；而O/17002毒株结构蛋白VP0未经任何处理。
(3)由华大基因生物科技有限公司合成三段优化后的融合基因片段，并通过分子克隆技术将上述片段按VP0、VP3、VP1的顺序克隆入同一个pET30a载体，鉴定序列正确后获得重组表达质粒pET-O/FMDV-VP031；
(4)将上述pET-FMDV-VP031质粒转化至感受态大肠杆菌BL21(DE3)，涂布于卡那霉素抗性的固体LB培养基，37℃静置培养10-12小时至单菌落清晰可辨。挑取单菌落至4mL含卡那霉素抗性的液体LB培养基的试管，37℃，220转/分振荡培养12小时，从中取1mL菌液于-80℃保存。
2、口蹄疫病毒结构蛋白的原核表达
(1)从-80℃冰箱中取出带有重组质粒pET-O/FMDV-VP031的大肠杆菌菌种，接入卡那霉素抗性的50mL的LB液体培养基，250rpm，37℃，培养约12小时后，转接入1L的LB液体培养基中，37℃培养，等OD600值达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.5mM的IPTG，16℃过夜诱导蛋白表达。
(2)校正发酵罐(德国赛多利斯CT5-2发酵罐)pH电极，配制4L培养基装入发酵罐，121℃灭菌30min，校正溶氧电极，以灭菌后未通气前为零点，以发酵时通气后未接种前初始搅拌速度100rpm时为100％。
(3)第二天将400mL种子液接入发酵罐中，温度37℃，pH值7.0，手动调节搅拌速度及通气量，维持溶氧在40％以上。流加补料，将50％葡萄糖按30mL/小时的速度流加培养。通过调节转速，控制发酵罐内溶氧在30％-40％。培养至菌浓度达到OD600大约15左右时，将培养温度降至16℃加入终浓度0.5mM的IPTG诱导培养12小时。终菌液浓度OD600大约为45左右时下罐，离心收集菌体大约300g。
3、带SUMO标签的口蹄疫病毒结构蛋白的亲和色谱纯化
按1g菌体对应10mL裂解液(20mM Tris，20mM咪唑，400mM NaCl，pH7.5)的比例重悬菌体，使用均质机以700bar压力破碎菌体2次。30,000g离心1h，取上清，通过12％SDS-PAGE电泳检测，上清用0.45μm孔径滤膜过滤后，用镍亲和柱(HisTrap FF，GE Health care LifeSciences)进行纯化。
缓冲液：20mM Tris，0.4M NaCl，pH8.0；
洗脱液：20mM Tris，0.4M NaCl，500mM咪唑，pH8.0。
样品为1.4L经过0.45μm孔径滤膜过滤后的经匀浆机破碎后的大肠杆菌菌体上清。
洗脱程序为：样品流穿后，缓冲液洗脱杂蛋白，洗脱液洗脱带SUMO标签的口蹄疫病毒结构蛋白(VP0，VP3，VP1)产物。
4、去除SUMO标签的口蹄疫病毒衣壳蛋白的亲和色谱纯化
取步骤3中三种带SUMO标签的口蹄疫病毒结构蛋白的洗脱样品，在4℃用SUMO酶酶切12小时，将酶切后的含有口蹄疫病毒结构蛋白的溶液流穿镍柱(HisTrap FF，GE Healthcare Life Sciences)，收集流穿液。SUMO标签结合于镍柱，不含SUMO标签的口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP1和VP3在流穿液中。
5、口蹄疫病毒结构蛋白自组装的形态学检测
收集步骤4中含有口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP1和VP3的流穿液于组装缓冲液(50mM Tris-HCl，500mM NaCl，pH7.6)中，4℃过夜后透射电镜观察口蹄疫病毒结构蛋白的自组装，仪器为FEI透射电镜。口蹄疫病毒结构蛋白组合物经亲水化处理后，1％UF染色20秒，固定于超薄炭铜网，进行电镜观察。结果如图1所示，通过透射电镜可观察到大量半径约为20nm左右的颗粒，大小均匀，呈现为空心形态，和自然的口蹄疫病毒粒子相似，病毒三种结构蛋白成功自组装，并且VP3和VP1结构蛋白的氨基酸点突变，并不影响O/17002病毒结构蛋白的自组装。制备的口蹄疫病毒结构蛋白组合物分别命名为O/17002(VP0，VP3，VP1基因均未突变)、Re/O/17002/K3118R(VP3基因突变)、Re/O/17002/K1210R(VP1基因突变)、Re/O/17002/K3118R+K1210R(VP3和VP1基因同时突变)。
二、O型口蹄疫亚单位疫苗免疫猪中和抗体应答检测
分别将实施例1中获得的口蹄疫病毒结构蛋白组合物O/17002、Re/O/17002/K3118R、Re/O/17002/K1210R、Re/O/17002/K3118R+K1210R以相同抗原剂量配制疫苗后进行猪体免疫，免疫后于0、7、14、21、28天分别采血，分离血清进行中和抗体滴度检测。试验结果如图2所示，以所述O/17002毒株结构蛋白基因VP0、VP3、VP1构建的O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物O/17002、Re/O/17002/K3118R、Re/O/17002/K1210R、Re/O/17002/K3118R+K1210R在动物免疫后均能产生较高水平的中和抗体，其中将O/17002毒株结构蛋白基因VP3和VP1分别或同时突变后构建的O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物Re/O/17002/K3118R、Re/O/17002/K1210R、Re/O/17002/K3118R+K1210R在动物免疫后能够产生更高水平的中和抗体，提高了O型口蹄疫亚单位疫苗的体内稳定性和保护效力。
三、O型口蹄疫亚单位疫苗免疫血清交叉中和试验
用Re/O/17002/K3118R+K1210R配制的口蹄疫亚单位疫苗免疫猪，获得口蹄疫亚单位疫苗的高免阳性血清。将所获得的高免血清分别与国家口蹄疫参考实验室保存的O/Mya98、O/PanAsia、O/Ind-2001和O/Cathay等4种主要流行变异毒株进行病毒中和试验，具体毒株包括以下10个：BY/2010(Mya98)、13152(Mya98)、14064(Mya98)、15126(PanAsia)、16045(Mya98)、17016(Mya98)、17002(Mya98)、17009(Ind-2001)、17042(Ind-2001)、18074(Cathay)，根据r值(r≤1)判断交叉中和效果，其中r值越高，交叉中和作用越好。试验结果如表1所示，通过血清交叉中和试验结果显示，本发明提供的O型口蹄疫亚单位疫苗对我国O型口蹄疫流行毒具有广泛交叉中和作用。
表1O型口蹄疫亚单位疫苗血清交叉中和试验结果
Figure BDA0002699803680000101
实施例2 A型口蹄疫亚单位疫苗
一、A型口蹄疫结构蛋白组合物制备
A型口蹄疫结构蛋白组合物制备过程同实施例1中O型口蹄疫病毒样颗粒的制备过程。其中，所述A/GDMM/2013毒株结构蛋白VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；所述A/GDMM/2013毒株结构蛋白VP1的氨基酸如SEQ ID NO：13所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示；所述A/GDMM/2013毒株结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：18所示；所述A/GDMM/2013毒株结构蛋白VP1突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示，核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；所述A/GDMM/2013毒株结构蛋白VP3突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示，核苷酸序列如SEQ IDNO：20所示。获得重组表达质粒为pET-A/FMDV-VP031。
电镜结果如图3所示，通过透射电镜可观察到大量半径约为20nm左右的颗粒，大小均匀，呈现为空心形态，和自然的口蹄疫病毒粒子相似，病毒三种结构蛋白成功自组装，并且VP3和VP1结构蛋白的氨基酸点突变，并不影响A/GDMM/2013病毒结构蛋白的自组装。制备的口蹄疫病毒结构蛋白组合物分别命名为A/GDMM/2013(VP0，VP3，VP1基因均未突变)、Re/A/GDMM/2013/K3118R(VP3基因突变)、Re/A/GDMM/2013/K1209R(VP1基因突变)、Re/A/GDMM/2013/K3118R+K1209R(VP3和VP1基因同时突变)。
二、A型口蹄疫亚单位疫苗免疫动物中和抗体应答检测
A/GDMM/2013、Re/A/GDMM/2013/K3118R、Re/A/GDMM/2013/K1209R、Re/A/GDMM/2013/K3118R+K1209R以相同抗原剂量配制疫苗后进行猪体免疫，免疫后于0、7、14、21、28天分别采血，分离血清进行中和抗体滴度检测。试验结果如图4所示，以所述A/GDMM/2013毒株结构蛋白基因VP0、VP3、VP1构建的O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物A/GDMM/2013、Re/A/GDMM/2013/K3118R、Re/A/GDMM/2013/K1209R、Re/A/GDMM/2013/K3118R+K1209R在动物免疫后均能产生较高水平的中和抗体，其中将A/GDMM/2013毒株结构蛋白基因VP3和VP1分别或同时突变后构建的A型口蹄疫病毒结构蛋白组合物Re/A/GDMM/2013/K3118R、Re/A/GDMM/2013/K1209R、Re/A/GDMM/2013/K3118R+K1209R在动物免疫后能够产生更高水平的中和抗体，提高了A型口蹄疫亚单位疫苗的体内稳定性和保护效力。
实施例3口蹄疫亚单位疫苗动物免疫攻毒评价
将实施例1所制备的口蹄疫结构蛋白组合物Re/O/17002/K3118R+K1209R与等量206佐剂混合，获得O型口蹄疫亚单位疫苗；将实施例2所制备的口蹄疫结构蛋白组合物Re/A/GDMM/2013/K3118R+K1209R与等量206佐剂混合，获得A型口蹄疫亚单位疫苗；将实施例1所制备的口蹄疫结构蛋白组合物Re/O/17002/K3118R+K1209R与施例2所制备的口蹄疫结构蛋白组合物Re/A/GDMM/2013/K3118R+K1209R等量混合，再加入等量206佐剂混合，获得O/A二价口蹄疫亚单位疫苗。
1.中和抗体检测
选择经筛选口蹄疫病毒抗体阴性的实验猪，10周龄。分别用上述三种口蹄疫亚单位疫苗进行免疫。免疫方式为肌肉注射，免疫剂量分三个梯度，分别为20、60、180μg/头份。免疫后分别于0、7、14、21、28天采颈部静脉血，分离血清，保存待检。
(1)本发明研制的O型口蹄疫亚单位疫苗(Re/O/17002/K3118R+K1209R与等量206佐剂混合)免疫中和抗体应答结果如图5所示，经口蹄疫病毒结构蛋白组合物Re/O/17002/K3118R+K1209R配制的疫苗，免疫猪体后，机体产生中和抗体应答，免疫28天时达到抗体高峰；最低剂量20μg/头份免疫后，即可诱导机体产生高滴度的中和抗体，证明该口蹄疫病毒结构蛋白组合物制备的基因工程疫苗具高效的免疫保护力。
(2)本发明研制的A型口蹄疫亚单位疫苗(Re/A/GDMM/2013/K3118R+K1209R与等量206佐剂混合)免疫中和抗体应答结果如图6所示，经口蹄疫病毒结构蛋白组合物Re/A/GDMM/2013/K3118R+K1209R配制的疫苗，免疫猪体后，机体产生中和抗体应答，免疫28天时达到抗体高峰；最低剂量20μg/头份免疫后，即可诱导机体产生高滴度的中和抗体，证明该口蹄疫病毒结构蛋白组合物制备的基因工程疫苗具高效的免疫保护力。
(3)本发明研制的O/A二价口蹄疫亚单位疫苗(Re/O/17002/K3118R+K1209R与等量Re/A/GDMM/2013/K3118R+K1209R以及等量206佐剂混合)免疫中和抗体应答结果如图7所示，经O/A二价口蹄疫亚单位疫苗免疫猪体后，机体产生中和抗体应答，免疫28天时达到抗体高峰；最低剂量20μg/头份免疫后，即可诱导机体产生高滴度的中和抗体，证明该口蹄疫病毒结构蛋白组合物制备的基因工程疫苗具高效的免疫保护力。
2.攻毒实验
(1)本发明研制的O型口蹄疫亚单位疫苗(Re/O/17002/K3118R+K1209R与等量206佐剂混合)经猪体免疫攻毒试验评价，对照组3头动物在口蹄疫O型流行毒17016攻毒后第4天，全部发病；3个不同剂量免疫组的动物在口蹄疫O型流行毒17016攻毒后，没有一头发病，实现对我国O型口蹄疫代表流行毒O/17016攻毒全保护，证明该口蹄疫病毒结构蛋白组合物具有优秀的免疫保护力，结果见表3。
表3 O型口蹄疫亚单位疫苗免疫攻毒结果
Figure BDA0002699803680000121
Figure BDA0002699803680000131
表注：
+：猪鼻吻部出现典型水泡样病变；
左前、右后：猪左前蹄、右后蹄出现典型水泡样病变；
四蹄：猪四蹄均出现典型水泡样病变。
(2)本发明研制的A型口蹄疫亚单位疫苗(Re/A/GDMM/2013/K3118R+K1209R与等量206佐剂混合)经猪体免疫攻毒试验评价，对照组3头动物在口蹄疫A型流行毒A/GDMM/2013攻毒后第4天，全部发病；3个不同剂量免疫组的动物在口蹄疫A型流行毒A/GDMM/2013攻毒后，没有一头发病，实现对我国A型流行毒A/GDMM/2013攻毒全保护，证明该口蹄疫病毒结构蛋白组合物具有优秀的免疫保护力，结果见表4。
表4 A型口蹄疫亚单位疫苗免疫攻毒结果
Figure BDA0002699803680000132
Figure BDA0002699803680000141
表注：
+：猪鼻吻部出现典型水泡样病变；
左前、右后：猪左前蹄、右后蹄出现典型水泡样病变；
四蹄：猪四蹄均出现典型水泡样病变
(3)本发明研制的O/A二价口蹄疫亚单位疫苗(Re/O/17002/K3118R+K1209R与等量Re/A/GDMM/2013/K3118R+K1209R混合后，再与等量206佐剂混合)经猪体免疫攻毒试验评价，对照组3头动物在口蹄疫O型流行毒17016攻毒后第4天，全部发病，对照组另外3头动物在口蹄疫A型流行毒A/GDMM/2013攻毒后第5天，全部发病；3个不同剂量免疫组的动物分别在口蹄疫O型流行毒17016和A型流行毒A/GDMM/2013攻毒后，没有一头发病，实现对我国O型口蹄疫代表流行毒O/17016和A型口蹄疫代表流行毒A/GDMM/2013攻毒全保护，证明该口蹄疫病毒结构蛋白组合物具有优秀的免疫保护力。结果见表5。
表5 O/A二价口蹄疫亚单位疫苗免疫攻毒结果
Figure BDA0002699803680000142
Figure BDA0002699803680000151
表注：
+：猪鼻吻部出现典型水泡样病变；
左前、右后：猪左前蹄、右后蹄出现典型水泡样病变；
四蹄：猪四蹄均出现典型水泡样病变。
上述实例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人是能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变换或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种口蹄疫亚单位疫苗及其制备方法和应用
<160> 21
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 303
<212> PRT
<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
<400> 1
Gly Ala Gly Gln Ser Ser Pro Ala Thr Gly Ser Gln Asn Gln Ser Gly
1 5 10 15
Asn Thr Gly Ser Ile Ile Asn Asn Tyr Tyr Met Gln Gln Tyr Gln Asn
20 25 30
Ser Met Asp Thr Gln Leu Gly Asp Asn Ala Ile Ser Gly Gly Ser Asn
35 40 45
Glu Gly Ser Thr Asp Thr Thr Ser Thr His Thr Thr Asn Thr Gln Asn
50 55 60
Asn Asp Trp Phe Ser Lys Leu Ala Ser Ser Ala Phe Ser Gly Leu Phe
65 70 75 80
Gly Ala Leu Leu Ala Asp Lys Lys Thr Glu Glu Thr Thr Leu Leu Glu
85 90 95
Asp Arg Ile Leu Thr Thr Arg Asn Gly His Thr Thr Ser Thr Thr Gln
100 105 110
Ser Ser Val Gly Ile Thr Tyr Gly Tyr Ala Thr Ala Glu Asp Phe Val
115 120 125
Ser Gly Pro Asn Thr Ser Gly Leu Glu Thr Arg Val Ile Gln Ala Glu
130 135 140
Arg Phe Phe Lys Thr His Leu Phe Asp Trp Val Thr Ser Asp Pro Phe
145 150 155 160
Gly Arg Cys His Leu Leu Glu Leu Pro Thr Asp His Lys Gly Val Tyr
165 170 175
Gly Ser Leu Thr Asp Ser Tyr Ala Tyr Met Arg Asn Gly Trp Asp Val
180 185 190
Glu Val Thr Ala Val Gly Asn Gln Phe Asn Gly Gly Cys Leu Leu Val
195 200 205
Ala Met Val Pro Glu Leu Cys Ser Ile Glu Arg Arg Glu Leu Phe Gln
210 215 220
Leu Thr Leu Phe Pro His Gln Phe Ile Asn Pro Arg Thr Asn Met Thr
225 230 235 240
Ala His Ile Lys Val Pro Phe Val Gly Val Asn Arg Tyr Asp Gln Tyr
245 250 255
Lys Val His Lys Pro Trp Thr Leu Val Val Met Val Val Ala Pro Leu
260 265 270
Thr Val Asn Thr Glu Gly Ala Pro Gln Ile Lys Val Tyr Ala Asn Ile
275 280 285
Ala Pro Thr Ser Val His Val Ala Gly Glu Phe Pro Ser Lys Glu
290 295 300
<210> 2
<211> 909
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
<400> 2
ggagccgggc aatccagtcc ggctactggg tcgcagaacc agtcaggcaa caccgggagt 60
atcatcaaca attactacat gcagcagtac cagaactcca tggacaccca acttggtgac 120
aacgctatca gcggaggctc caatgaggga tccacggata caacctccac ccacacaacc 180
aacactcaga acaatgactg gttttcaaag ctggccagct ctgccttcag cggtcttttc 240
ggcgccctcc tcgccgataa gaaaactgag gagaccaccc ttctcgaaga ccgcatcctc 300
accacccgga acggacacac cacctcgaca acccagtcga gtgttggcat aacgtacggg 360
tacgcgacag ctgaggattt tgtgagcggg ccaaacactt ctggtcttga gaccagagtt 420
atccaagcgg aacggttctt caaaacccac ctgttcgact gggtcaccag tgatccgttc 480
ggacggtgtc acttgttaga gctcccgact gatcacaaag gtgtctacgg cagcctgacc 540
gactcatacg cctacatgag aaacggttgg gacgttgagg ttaccgctgt ggggaaccag 600
ttcaacggag gctgcctact agtggccatg gtgcctgaac tttgttccat cgagcggaga 660
gagctgttcc agcttacgct cttcccccac cagttcatca acccccggac gaacatgaca 720
gcccacatca aggtgccctt tgttggcgtc aaccgttacg atcagtacaa agtacacaag 780
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<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
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Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Ile Gln Arg Arg His His Thr Asp Val
20 25 30
Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Gly Pro Ile
35 40 45
Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Ala Pro Pro His Thr Leu Val Gly Ala
50 55 60
Leu Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val
65 70 75 80
Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala
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Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu
100 105 110
Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr
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Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Thr Gly Gly Pro Leu Pro Asn Val
130 135 140
Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Pro Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro
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Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu
165 170 175
Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu
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<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
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Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Ile Gln Arg Arg His His Thr Asp Val
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Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Ala Pro Pro His Thr Leu Val Gly Ala
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<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
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<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
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<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
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Gly Lys Ala Glu Gln Asp Thr Leu Val Val Ser Val Ser Ala Gly Lys
195 200 205
Asp Phe Glu Leu Arg Leu Pro Ile Asp Pro Arg Ala Gln
210 215 220
<210> 20
<211> 663
<212> DNA
<213> 口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus)
<400> 20
gggatcgtgc cggtcgcttg ctcggacggg tacggtggcc tggtgacaac agaccccaaa 60
acagctgacc ctgcttacgg tatggtgtac aacccaccca ggaccaatta ccctgggcgg 120
tttacaaatt tgttggatgt ggcagaggcg tgccccacct tcctctgttt cgacgacggg 180
aaaccgtata tcgtgacaag gacggacgag caacgcctct tagccaagtt tgacctctct 240
cttgctgcaa agcacatgtc aaacacctac ctgtcaggga tagcacagta ctacgcacag 300
tactctggca ccatcaattt gcacttcatg tttactggtt ccactgactc acgcgcccgc 360
tacatggtgg cgtacgttcc acccggagtg gaaacgccac cggacacgcc tgagaaggct 420
gcacactgca tccacgcaga atgggacacg ggcctaaatt ccaaattcac cttttcaatc 480
ccgtacgtat ctgctgcaga ctacgcgtac acagcgtctg acgaggcaga aacgacaaac 540
gtacagggat gggtctgcat ctaccaaatt acccacggga aggccgaaca agacactctg 600
gtcgtgtcgg ttagcgccgg caaagacttc gagctgcgcc tccccattga cccccgtgcg 660
caa 663
<210> 21
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aataattttg tttaacttta agaaggagat atacatatgg gcagcagcca tcatcatcat 60
catcacggca gcggcctggt gccgcgcggc agcgctagca tgtcggactc agaagtcaat 120
caagaagcta agccagaggt caagccagaa gtcaagcctg agactcacat caatttaaag 180
gtgtccgatg gatcttcaga gatcttcttc aagatcaaaa agaccactcc tttaagaagg 240
ctgatggaag cgttcgctaa aagacagggt aaggaaatgg actccttaag attcttgtac 300
gacggtatta gaattcaagc tgatcagacc cctgaagatt tggacatgga ggataacgat 360
attattgagg ctcacagaga acagattggt ggt 393

Claims (15)

1.一种口蹄疫亚单位疫苗，其特征在于，所述口蹄疫亚单位疫苗包括O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP0、VP1、VP3，和A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP0、VP1、VP3；其中，所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP0的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示。
2.如权利要求1所述的口蹄疫亚单位疫苗，其特征在于，所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP0的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：8所示；所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP0的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示，所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQID NO：14所示，所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ IDNO：18所示。
3.如权利要求1所述的口蹄疫亚单位疫苗，其特征在于，将所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1第210位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；和/或将所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3第118位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；和/或将所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1第209位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；和/或将所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3第118位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
4.如权利要求3所述的口蹄疫亚单位疫苗，其特征在于，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
5.如权利要求1所述的口蹄疫亚单位疫苗，其特征在于，所述口蹄疫亚单位疫苗包括O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物，和A型口蹄疫病毒结构蛋白组合物；其中所述O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物包括O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP0、VP1、VP3；所述A型口蹄疫病毒结构蛋白组合物包括A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP0、VP1、VP3。
6.如权利要求5所述的口蹄疫亚单位疫苗，其特征在于，将所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1第210位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；和/或将所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3第118位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；和/或将所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1第209位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；和/或将所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3第118位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
7.如权利要求6所述的口蹄疫亚单位疫苗，其特征在于，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
8.如权利要求1-7任一所述的口蹄疫亚单位疫苗，其特征在于，所述口蹄疫亚单位疫苗还包括佐剂。
9.如权利要求8所述的口蹄疫亚单位疫苗，其特征在于，所述佐剂为化学类免疫佐剂、微生物类免疫佐剂、植物类免疫佐剂、生化类免疫佐剂中的一种或几种。
10.权利要求1-7任一所述的口蹄疫亚单位疫苗在制备预防或防治口蹄疫制品中的应用。
11.一种如权利要求1所述口蹄疫亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法为：将O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP0、VP1、VP3，和A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP0、VP1、VP3乳化即得。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)：制备纯化获得O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物，乳化即得口蹄疫亚单位疫苗；其中，所述O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物包括O型口蹄疫病毒株O/17002的结构蛋白VP0、VP1、VP3；
(2)：制备纯化获得A型口蹄疫病毒结构蛋白组合物，乳化即得口蹄疫亚单位疫苗；其中所述A型口蹄疫病毒结构蛋白组合物包括A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013的结构蛋白VP0、VP1、VP3；
(3)：将(1)中的O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物与(2)中的A型口蹄疫病毒结构蛋白组合物混合后，乳化即得口蹄疫亚单位疫苗。
13.如权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述口蹄疫病毒结构蛋白组合物的制备方法为：
设计编码融合标签蛋白基因序列THS，其中T为翻译起始区核苷酸序列，H为编码含组氨酸标签的核苷酸序列，S为编码含酿酒酵母小泛素样修饰蛋白(SUMO)的核苷酸序列，所述THS的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示；
将所述的融合标签蛋白基因序列THS分别与编码O型口蹄疫病毒株O/17002和A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP0、VP3和VP1的基因串联，分别形成融合目标蛋白基因序列THS-O/VP0、THS-O/VP3、THS-O/VP1，和THS-A/VP0、THS-A/VP3、THS-A/VP1；
通过分子克隆技术将所述三段融合目标蛋白基因序列同时克隆入原核表达载体pET30a，获得重组表达质粒pET-O/FMDV-VP310，和/或pET-A/FMDV-VP310；
将所述的重组表达质粒pET-O/FMDV-VP310和pET-A/FMDV-VP310分别转化大肠杆菌，获得基因工程菌，将所述基因工程菌进行发酵培养，诱导表达带有融合标签蛋白的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3、VP1，和/或A型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3、VP1；
破碎基因工程菌菌体后，回收上清液，亲和色谱层析分离纯化获得带有融合标签蛋白的O型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3、VP1混合物，和/或A型口蹄疫病毒结构蛋白VP0、VP3、VP1混合物；
酶切去除所述混合物中的融合标签蛋白后，再用亲和色谱层析分离纯化获得O型口蹄疫病毒结构蛋白组合物和/或A型口蹄疫病毒结构蛋白组合物。
14.如权利要求11-13任一所述的制备方法，其特征在于，将所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1第210位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；和/或将所述O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3第118位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；和/或将所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1第209位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；和/或将所述A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3第118位赖氨酸突变为精氨酸，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示。
15.如权利要求14所述的制备方法，其特征在于，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示，所述突变后的O型口蹄疫病毒株O/17002结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示，所述突变后的A型口蹄疫病毒株A/GDMM/2013结构蛋白VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示。
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