CN103773803A - 表达猪o型口蹄疫病毒vp1蛋白的重组牛副流感病毒载体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体pcDNA-NM09-VP1，其特征在于：以BPIV3NM09株提取的RNA为模板，通过RT-PCR分段扩增出病毒全长基因组，牛副流感病毒全长cDNA经第一次的修饰，即在P和M之间引入AgeI，便于外源抗原基因片段的插入替换；经第二次的修饰，即修饰性插入异源病毒的抗原多肽是猪O型口蹄疫病毒的VP1蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO1，核苷酸序列为SEQIDNO2。为进一步开发防控猪口蹄疫的基因工程重组疫苗和研究牛副流感病毒3型毒力因子以及分子致病机理奠定基础，其具有复制能力。

Description

表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体

技术领域  

本发明涉及一种表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体，特别是一种表达猪口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因的重组牛副流感病毒3型载体的构建方法和重组病毒的生物学特性，属于分子生物学和病毒学领域。

背景技术  

副流感病毒对不同种类的动物而言，由于自然宿主范围的限制性，毒力是减弱的。因此，可以将异源性病毒保护性抗原基因插入到减毒的副流感病毒中，以此为载体表达异源性病毒的保护性抗原，以 BPIV3 为载体表达人呼吸道合胞体病毒的保护性抗原，即可保持 BPIV3 在人体内的弱毒性，又可以维持人呼吸道合胞体病毒保护性抗原在人体内的免疫原性(Haller et al., 2003)。作为病毒载体的副流感病毒不仅具有能在宿主细胞内高效繁殖的能力，而且能够通过鼻腔内免疫途径达到高效感染的效果，有效地诱导局部体液免疫抗体的产生和细胞免疫产生的保护性免疫应答。作为载体的副流感病毒感染宿主细胞后，只在细胞质中增殖，不会造成宿主细胞的死亡和损伤，其遗传物质也不会整合到宿主细胞基因组中，因此不会造成宿主细胞的变异(Ambrose et al., 1995)。副流感病毒的基因组为单股负链不分阶段的 RNA，各基因片段相互不重叠。其表达是以单个独立的 mRNA 单位进行。所以其基因间的区域便于外源基因的插入和调节，并有利于外源基因稳定性的维持。

典型的副流感病毒基因组复制模式为：病毒 RNA 聚合酶在基因起始(gene start，GS)和基因终止(gene end，GE)信号的指导下，从病毒基因组 RNA 3’末端依次对病毒基因组进行复制。GS和 GE 指导每个基因的转录起始和终止产生单个 mRNA，构成了基因的上下游限制区(Takeda and Yanagi, 2006)。病毒启动子存在于基因组 RNA 的 3’端，每个基因的 GS 和 GE 限制区通常由不超过 200 个核苷酸的短序列组成(De et al., 1990)，所以顺式作用信号比较短。副流感病毒作为病毒载体表达外源性抗原的关键是转录单元的构建，构建方法是将获得的完整外源基因开放式阅读框的 cDNA 片段两端分别加上副流感病毒基因片段间特有的 GS 和 GE 信号序列，具体操作方法是在 GS 和 GE 信号序列两端分别加上和副流感病毒载体插入位点相适应的酶切位点。通过酶切、连接等一系列操作将此转录单元插入到副流感病毒载体中。在拯救的重组病毒中，外源基因象病毒本身的基因组一样作为独立的 mRNA 被表达(王曲直等, 2008)。外源基因片段必须插到基因间的非编码区，或第一个基因的引导序列之后，才能得到有效表达(Ammayappan et al., 2010)。副流感病毒基因组象其它副黏病毒亚科的病毒基因组一样的，长度必须是 6 的整数倍，才能高效复制(Skiadopoulos et al., 2003)，这种现象称为 “6 碱基原则”，因此，插入外源基因片段的长度和组成必须符合“6 碱基原则”，只有这样插入的基因才能得到有效表达(Nagai and Kato, 2004; Skiadopoulos et al., 2003)。以牛副流感病毒 3 型为载体表达人呼吸道合胞体病毒蛋白对预防人类呼吸道疾病有重要意义，以 BPIV3 为载体通过反向遗传操作系统将人呼吸道合胞体病毒G和F基因插入到其基因组中HN 基因的下游，通过免疫学检测结果表明人呼吸道合胞体病的 G 和 F 基因都能够在重组病毒内高水平表达，均能被细胞膜上的受体所识别，并被细胞蛋白酶水解酶准确水解，发挥生物学活性，并且不影响载体基因的表达(Crowe, 1995; Haller et al., 2003; Schmidt et al., 2001；王曲直等, 2008)。外源糖蛋白基因可以为病毒载体带来新的功能，如抗原重组病毒表达的外源糖蛋白掺入到载体病毒颗粒中，抗原嵌合病毒依赖这些外源糖蛋白代替缺失的载体糖蛋白发挥功能，从而显示出新的生物学特性。 

发明内容    

本发明的目的在于提供一种表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体，其重组表达猪口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因的新型基因工程载体，为牛副流感病毒3型作为新型基因工程疫苗载体提供技术支持；为进一步开发防控猪口蹄疫的基因工程重组疫苗和研究牛副流感病毒 3 型毒力因子以及分子致病机理奠定基础。  

本发明的技术方案是这样实现的：一种表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体，其特征在于：以BPIV3 NM09株提取的 RNA 为模板，通过RT-PCR 分段扩增出病毒全长基因组，各个基因片段克隆到 PCR-Blunt 载体并测序，利用生物信息学软件 DNAstar 中的 SeqMan 对各片段进行拼接，获得BPIV3 NM09全基因序列。利用 DNAstar 软件中的 SeqBuilder和在线分析软件 NEBcutter，对 BPIV3 NM09 株全基因组序列进行酶切位点分析，找到合适的酶切位点进行连接，并分别在基因组N端和 C 端分别引入锤头状核酶结构（HamRz）和丁肝病毒核酶结构（HdvRz）；根据pCR-Blunt 载体和 pcDNA3.1(+)载体上的多克隆位点次序，将各个 BPIV3 NM09 株基因片段按照限制性内切酶确定的先后顺序依次亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)上，构建获得 BPIV3 NM09 株全长cDNA 克隆pcDNA-NM09；为了能插入表达外源基因，在P和M蛋白基因间引入酶切位点AgeI，外源基因表达单位插入该酶切位点，将猪O型口蹄疫病毒的VP1核苷酸序列以表达盒形式插入全长，获得pcDNA-NM09-VP1全长质粒；脂质体转染法将纯化的全长质粒pcDNA-NM09-VP1及辅助质粒 pcDNA-NP, pcDNA-P 和 pcDNA-L 共转染 BHK细胞，在MDBK细胞上盲传，经RT-PCR、FA或IFA鉴定，成功获得rBPIV3-VP1病毒。 

具体的构建过程如下：1）以牛副流感病毒3型NM09株的cDNA基因组为基础构建的动物病毒表达载体；2）由hCMV强启动子、锤头状核酶结构（HamRz）、修饰的牛副流感病毒NM09株的全长cDNA、丁肝病毒核酶结构（HdvRz）及表达载体pcDNA3.1骨架组成的体内转录真核表达载体；3）修饰的牛副流感病毒cDNA，包含牛副流感病毒NM09株的核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、膜蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素和神经氨酸酶（HN）、大蛋白（L）以及基因间的连接桥和修饰区；4）牛副流感病毒全长cDNA经第一次的修饰，即在P和M之间引入Age I，便于外源抗原基因片段的插入替换；即修饰性插入异源病毒的抗原多肽是猪O型口蹄疫病毒的VP1蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO 1。 

所述的牛副流感病毒全长cDNA在通过第二次的修饰，即在P和M之间插入异源病毒的抗原多肽；修饰性插入异源病毒的抗原多肽是猪O型口蹄疫病毒的VP1蛋白，其核苷酸序列为SEQ ID NO 2。 

所述的异源病毒的抗原多肽由一个基因转录单元编码。 

所述的基因转录单元包含ATG起始密码子、猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白全基因序列、终止密码子TAA及两端的酶切位点。 

所述的表达载体为pcDNA3.1，作为辅助功能的重组表达质粒，分别为pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L，N、P、L为牛副流感3型的三个结构蛋白基因。 

本发明的积极效果是：其建立了牛副流感病毒 3 型 NM09株反向遗传操作系统，以其为载体表达猪O型口蹄疫病毒VP1基因，转染拯救获得重组病毒，为进一步开发防控猪口蹄疫的基因工程重组疫苗和研究牛副流感病毒 3 型毒力因子以及分子致病机理奠定基础，其具有复制能力。 

附图说明    

图1为BPIV3基因组全长 cDNA 构建策略图。

图2为重组病毒rBPIV3-NM09的RT-PCR试验鉴定图 

M.DNA Marker DL2000; 1.细胞对照;2. 重组病毒rBPIV3-NM09。

图3为重组病毒rBPIV3-NM09的直接免疫荧光鉴定图 

A. 接种重组病毒rBPIV3-NM09的MDBK细胞；B. MDBK细胞对照。

图4 为重组病毒rBPIV3-NM09感染MDBK细胞的一步生长曲线图。 

图5为重组BPIV3-VP1基因组全长 cDNA 示意图。 

图6为表达猪O型口蹄疫病毒VP1基因重组病毒rBPIV3-NM09-VP1的RT-PCR鉴定图，M. DNA Marker DL2000; 1,2. 检测的RT-PCR产物1644bp。 

图7为表达猪O型口蹄疫病毒VP1基因重组病毒rBPIV3-NM09-VP1的免疫荧光鉴定图。 

图8为表达猪O型口蹄疫病毒VP1基因重组病毒rBPIV3-NM09-VP1感染MDBK细胞的一步生长曲线图。 

图9为重组病毒rBPIV3-NM09-VP1的RT-PCR鉴定猪O型口蹄疫病毒VP1的mRNA结果图，M. DNA Marker DL2000; 1,2,3. 重组病毒F1,F3,F5代的RT-PCR产物710bp。 

具体实施方式

下面通过附图和实施例对本发明做进一步的描述： 

实施例1： BPIV3反向遗传操作系统的建立

1．材料和方法

1.1 材料

牛副流感3 型病毒NM09株为中国农业科学院特产研究所分离鉴定保存； MDBK、BSR 细胞由中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学国家重点实验室（省部共建）购买并保存；MDBK、BSR细胞在含有10% FBS(Gibco BRL)的DMEM(Gibco BRL)培养基中培养单层；病毒在2% FBS的DMEM维持液中增殖；Trizol Reagent、Pfx DNAPolymerase、Zero Blunt PCR Cloning Kit、质粒pcDNA3.1（+）和转染试剂LipofectamineTM2000 Reagent均购自Invirtrogen 公司；T4 DNA 连接酶和限制性内切酶均购置 NEB；TaKaRa Taq DNA 聚合酶、dNTP Mixture、随机引物、DL15000 Marker 均购自大连宝生物技术工程有限公司；M-MLV 反转录酶、RNase 抑制剂均购自 Promega；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；大肠杆菌 DH5α菌株感受态细胞由实验室保存；DMEM 购自 Gibco 公司；马血清购自Hyclone公司；BPIV3直标FITC抗体为VMRD产品，荧光显微镜为leicaDM IRB，购自leica公司。

1.2重组BPIV3全长cDNA克隆的构建 

BPIV3病毒接种MDBK细胞收获的病毒液按常规方法(Trizol法)提取病毒基因组RNA；图1所示整个基因组依据酶切位点分成 7 个末端部分重叠的片段（S1，S2.1，S2.2，S3.1，S3.2，S4.1，S4.2）进行RT-PCR扩增，PCR法在S1 的 5’端引入Nhe I 限制性内切酶位点和HamRz核酶序列，S4.2 的 3’端引入HdvRz 核酶序列和Not I限制性内切酶位点。扩增片段克隆至pCR-Blunt 载体并经序列测定确定序列与病毒RNA序列一致。利用相邻片段重叠部分的限制性酶切位点连接组装成完整的BPIV3基因组cDNA,并克隆在转录载体pcDNA3.1的NheI和NotI之间，得到BPIV3的全长 cDNA 克隆 pcDNA-NM09。转录载体上的CMV启动子和BGH多腺苷酸化信号之间序列在宿主细胞T7 RNA聚合酶的作用下得到转录，并且全基因组cDNA 序列的 5'端和 3'端引入的具有自我剪切功能的核酶 cDNA 作为顺式作用元件，使复制和转录水平均具有精确的病毒基因组 RNA 序列，从而提高病毒拯救效率。

1.3辅助质粒的构建 

按照上述方法，通过NheⅠ和 NotⅠ限制性酶切位点分别将BPIV3的NP、P、L 基因ORF cDNA克隆在pcDNA3.1载体的CMV启动子下游，构建获得表达NP 、P和L蛋白的辅助质粒pcDNA-NP，pcDNA-P和pcDNA-L。

  

表1 引物设计

 

扩增cDNA名称	引物序列	引入的酶切位点和序列	扩增位置
				S1.1	GCTAGC TGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCTATAGTCACCAAACAAGAGAAGAGACTTG	Nhe I 和锤头状核酶序列（Hammerhead ribozye, HamRz）	—
S1-F	ACCAAACAAGAGAAGAGACTTGCTTG		1
				S1-R	TGAGGATGTTCCAGGATGTGAT		2678
S 2.1-F	ATACAGGAGAACCAACAAGAGC		2610
				S 2.1-R	ACCCTTGTGATTTCAATTGATG		4702
S 2.2-F	ATACAGGAGAACCAACAAGAGC		4643
				S 2.2-R	ACCCTTGTGATTTCAATTGATG		7467
S 3.1-F	TCTTATTACCCAGGGCTGTCAA		7423
				S 3.1-R	TCCTATGAAGCTCTTATAATAA		9998
S 3.2-F	GTACGGATCAAATTCTGCCATA		9935
				S 3.2-R	CTTTCATCCGTAACTGATCCAA		12304
S 4.1-F	GACAGGAATAGCATCATTAAGG		12251
				S 4.1-R	CAGATACTTAATTGCAGTTTTC		13685
S 4.2-F	TCAAATCATTCCCATCAACTGT		13630
				S 4.2-R	ACCAAACAAGAGAAAAACTCTG		15456
S5.1	GCGGCCGC CGCCCTCCCTTAGCCATCCGAGTGGACGTGCGTCCTCCTTCGGATGCCCAGGTCGGACCGCGAGGAGGTGGAGATGCCATGCCGACCCACCAAACAAGAGAAAAACTCTGTTTG	Not I和HdvRz序列	—
				NP-F	GCCTGCTAGCATGCTGAGTCTATTTGACAC	Nhe I	101
NP-R	GGGCGGCCGCTTAGTTGTTTCCGAATGCA	Not I	1668
				P-F	AGAAGCTAGCCACAACTCAATCAACCCAAG	Nhe I	1750
P-R	TTGCGGCCGCTTGACCTTTGTCTGGTTGTT	Not I	3603
				L-F	GAGCGCTAGCCAGGAGAAATGGACACCGAATC	Nhe I	8622
L-R	TCTGGCGGCCGCTGTTCTGTTTGTTGTATCTGTA	Not I	15377

注：黑色字体代表酶切位点，下划线字母为 HamRz 和 HdvRz 序列

1.4 病毒拯救及扩增

转染前一天，将BHK细胞以4×10⁵个细胞/孔的细胞密度接种到 35mm 6 孔板中，待细胞生长至80%～90%单层时；采用脂质体介导法进行转染，转染体系按 invitrogen LipofectamineTM2000 Reagent 说明书进行，质粒按 pcDNA-NM09:pcDNA-NP:pcDNA-P:pcDNA-L 为 1:2:4:0.1，总质量为4μg 的量共转染BHK细胞，37℃，5% CO₂温箱内培养 5～6 h，更换含有8%马血清的全培养基，37℃，5% CO2 温箱内培养48h后，转染细胞上清转移到生长了24h的MDBK 细胞单层上，培养4-6天，冻融细胞和上清，取300μL细胞悬液继续接种MDBK 细胞单层，进行盲传，并在显微镜下观察 细胞病变；待出现细胞病变时，收获细胞悬液，作为种毒保存于-70℃。拯救获得的具有感染性的BPIV3的重组病毒命名为rBPIV3-NM09。

1.5 直接免疫荧光检测拯救的重组毒 

MDBK细胞接种于96孔板中，待生长至70-%～80%单层时，将rBPIV3种毒液按照感染复数MOI为0.01感染MDBK细胞，48h后，弃掉培养上清，PH值7.2-7.4的PBS洗涤细胞2-3次，甲醇：丙酮=1：3的固定液（预冷）室温固定细胞20 min。用FITC标记的BPIV3单抗作用30min，PBS洗涤后荧光显微镜下观察结果。

2 结果 

2.1 为了构建BPIV3基因组全长cDNA克隆，通过RT-PCR获得了覆盖整个基因组的7个cDNA片段，并利用相邻片段重叠区的限制性内切酶位点连接获得15456nt的完整cDNA克隆，在全长cDNA片段5’端和3’端分别引入了HamRz和HdvRz，构建成表达BPIV3 NM09株cDNA克隆的pcDNA-NM09。

2.2 从cDNA克隆拯救的感染性rBPIV3-NM09 

为了从克隆的cDNA中拯救感染性rBPIV3-NM09，以pcDNA-NM09和表达BPIV3 NP、P和L蛋白的辅助质粒共转染BHK细胞。在MDBK细胞上盲传2代，显微镜下观察细胞病变；出现细胞病变后收获的细胞悬液作为重组病毒rBPIV3-NM09 F1代。按照方法1.4将重组病毒传2代。进一步RT-PCR（图2）和序列分析结果表明，F3代拯救获得的重组病毒基因组cDNA与转染的pcDNA-NM09序列一致，与预期相符。结果表明，通过反向遗传操作技术，利用BPIV3 NM09株cDNA克隆成功拯救获得具有感染性的牛副流感病毒rBPIV3-NM09。

2.3 直接免疫荧光检测重组病毒 

为了进一步鉴定上述拯救的重组病毒，以rBPIV3-NM09感染MDBK细胞，48h后，利用BPIV3直标抗体进行直接免疫荧光检测，结果rBPIV3-NM09感染细胞显示阳性荧光信号（图3A），而对照细胞则显示荧光信号为阴性（图3B）。结果表明，通过反向遗传系统操作技术，用BPIV3基因组cDNA克隆成功拯救获得具有感染性的rBPIV3-NM09。

实施例2 重组病毒与野生型病毒在MDBK细胞上的生长动力学比较 

将实施例1中制备的重组病毒rBPIV3-NM09和亲本毒BPIV3 NM09株分别按MOI为0.01接种于生长过夜、密度约为70%～80%单层MDBK细胞，37℃孵育1.5h后，换含有8%马血清的DMEM完全培养基，37℃，5% CO₂温箱内培养，分别收获感染后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h的细胞；将收集的上述不同时间段的重组病毒rBPIV3-NM09和亲本毒BPIV3 NM09病毒液冻融2次后，进行10倍倍比稀释，分别取100μL各稀释度病毒液接种于铺在96孔板、生长过夜、密度约为70%～80%单层MDBK细胞，37℃孵育1.5h后，换含有8%马血清的DMEM完全培养基，37℃，5% CO₂温箱内培养，每个稀释度8个重复；感染后底5天显微镜下观察细胞病变，计算各时间段收获的重组病毒rBPIV3-NM09和亲本毒BPIV3 NM09的病毒滴度（TCID₅₀），以评价两种病毒在MDBK细胞上的生长动力学特点。

结果显示，通过反向遗传技术拯救的重组病毒rBPIV3-NM09和亲本毒的生长滴度在相近时间达到峰值，生长动力学曲线无明显差异，见图4。 

实施例3 表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的基因的重组牛副流感病毒的构建和生物学活性 

1 1．材料和方法

1.1 材料

牛副流感3 型病毒NM09株为中国农业科学院特产研究所分离鉴定保存； MDBK、BSR 细胞由中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学国家重点实验室（省部共建）购买并保存；MDBK、BSR细胞在含有10% FBS(Gibco BRL)的DMEM(Gibco BRL)培养基中培养单层；病毒在2% FBS的DMEM维持液中增殖；Trizol Reagent、Pfx DNAPolymerase、Zero Blunt PCR Cloning Kit、质粒pcDNA3.1（+）和转染试剂LipofectamineTM2000 Reagent均购自Invirtrogen 公司；T4 DNA 连接酶和限制性内切酶均购置 NEB；TaKaRa Taq DNA 聚合酶、dNTP Mixture、随机引物、DL15000 Marker 均购自大连宝生物技术工程有限公司；M-MLV 反转录酶、RNase 抑制剂均购自 Promega；凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自爱思进生物技术（杭州）有限公司；大肠杆菌 DH5α菌株感受态细胞由实验室保存；DMEM 购自 Gibco 公司；马血清购自Hyclone公司；BPIV3直标FITC抗体为VMRD产品，鼠抗猪O型口蹄疫VP1蛋白抗血清为中国农业科学院特产研究所吉林省特种经济动物分子生物学国家重点实验室（省部共建）制备并保存。荧光显微镜为leicaDM IRB，购自leica公司。质粒pMD-FM-VP1为中国农业科学院特产研究所特种经济动物分子生物学国家重点实验室（吉林省省部共建）构建并保存，其中含有猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白编码区基因cDNA序列。

1.2 表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的基因的重组牛副流感病毒基因组全长cDNA克隆的构建。 

以上述BPIV3全长分段S2片段的克隆作为中间载体，通过PCR法在BPIV3基因组全长cDNA的3635-3640nt进行碱基定点突变，引入AgeI限制性内切酶位点，利用Pas I酶切点，再将突变的S2片段重新插入回pcDNA-NM09全长cDNA克隆，获得BPIV3重组转录载体pcDNA-NM09-AgeI(P/M)；再以pMD-FM-VP1为模板,通过RT-PCR在口蹄疫病毒VP1基因的编码区5’端和3’端分别引入AgeI限制性内切酶识别位点及起始密码子和终止密码子，另外在VP1基因的编码区5’端引入BPIV3自身聚合酶蛋白L识别的转录终止序列（AATTAAGAAAAA）及转录起始序列（AGGATAAAAG）。扩增基因克隆Blunt载体测序鉴定后，获得穿梭载体质粒Blunt-VP1。用AgeI处理全长质粒pcDNA-NM09-AgeI(P/M)和穿梭载体质粒Blunt-VP1，将VP1基因插入P和M之间，鉴定正向克隆，获得pcDNA-NM09-VP1。 

表 2 引物设计 

扩增cDNA名称	引物序列
		AgeI-F	TCACCGGTATGCATCGAATCAAACG
AgeI-R	CATACCGGTGATCTCTGATTGATTGTC
		FM-VP1-F	GCACCGGTCAGCGAATTAAGAAAAACTTAGGATAAAAGATGACCACTTCGACG
FM-VP1-R	GTACCGGTTTAGTCCGCGGTTACAAGGACTGCTTTACAGGT

黑体表示酶切位点AgeI。

1.3病毒的拯救及扩增 

转染前一天，将BHK细胞以4×10⁵个细胞/孔的细胞密度接种到 35mm 6 孔板中，待细胞生长至80%～90%单层时；采用脂质体介导法进行转染，转染体系按 invitrogen LipofectamineTM2000 Reagent 说明书进行，质粒按 pcDNA-NM09-VP1:pcDNA-NP:pcDNA-P:pcDNA-L 为 1:2:4:0.1，总质量为4μg 的量共转染BHK细胞，37℃，5% CO₂温箱内培养 5～6 h，更换含有8%马血清的全培养基，37℃，5% CO2 温箱内培养48h后，转染细胞上清转移到生长了24h的MDBK 细胞单层上，培养4-6天，冻融细胞和上清，取300μL细胞悬液继续接种MDBK 细胞单层，进行盲传，并在显微镜下观察细胞病变；待出现细胞病变时，收获细胞悬液，作为种毒保存于-70℃。拯救获得的具有感染性的BPIV3的重组病毒命名为rBPIV3-NM09-VP1。

1.4免疫荧光检测拯救的重组毒 

MDBK细胞接种于96孔板中，待生长至70-%～80%单层时，将rBPIV3-NM09-VP1种毒液按照感染复数MOI为0.01感染MDBK细胞，48h后，弃掉培养上清，PH值7.2～7.4的PBS洗涤细胞2-3次，甲醇：丙酮=1：3的固定液（预冷）室温固定细胞20 min。用FITC标记的BPIV3单抗作用30min，PBS洗涤后荧光显微镜下观察结果；用1：50倍稀释的鼠抗猪O型口蹄疫VP1蛋白高免血清为一抗，作用30min，PBS洗涤后加入1：1000倍稀释的FITC标记的兔抗鼠二抗，作用30min，PBS洗涤后荧光显微镜下观察结果。

1.5重组病毒与野生型病毒在MDBK细胞上的生长动力学比较 

将制备的重组病毒rBPIV3-NM09-VP1和亲本毒BPIV3 NM09株分别按MOI为0.01接种于生长过夜、密度约为70%～80%单层MDBK细胞，37℃孵育1.5h后，换含有8%马血清的DMEM完全培养基，37℃，5% CO₂温箱内培养，分别收获感染后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h的细胞；将收集的上述不同时间段的重组病毒rBPIV3-NM09-VP1和亲本毒BPIV3 NM09病毒液冻融2次后，进行10倍倍比稀释，分别取100μL各稀释度病毒液接种于铺在96孔板、生长过夜、密度约为70%～80%单层MDBK细胞，37℃孵育1.5h后，换含有8%马血清的DMEM完全培养基，37℃，5% CO₂温箱内培养，每个稀释度8个重复；感染后底5天显微镜下观察细胞病变，计算各时间段收获的重组病毒rBPIV3-NM09-VP1和亲本毒BPIV3 NM09的病毒滴度（TCID₅₀），以评价两种病毒在MDBK细胞上的生长动力学特点。

2 结果 

2.1表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的基因的重组牛副流感病毒基因组全长cDNA克隆的构建

为了构建表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的基因的重组牛副流感病毒基因组全长cDNA克隆，以BPIV3全长分段S2片段的克隆质粒作为中间载体，在BPIV3 cDNA的3635-3640nt进行碱基定点突变，引入AgeI限制性内切酶位点，在Age I酶切位点插入5’端引入BPIV3自身聚合酶蛋白L识别的GE和GS的O型FMDV VP1基因，构建成表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的基因的重组牛副流感病毒基因组全长cDNA克隆pcDNA-NM09-VP1（图5）。序列信息见序列表，（从5’端到3’端）901-958为HamRz序列；959-17147 为BPIV3与插入的VP1基因序列，其中4647-5285为VP1核苷酸序列；17148-17235为HdvRz序列。

SEQ ID No.1  猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白氨基酸序列。 

SEQ ID No.2  猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白核苷酸序列。 

2.2 从cDNA克隆拯救感染性rBPIV3-NM09-VP1 

为了从克隆的cDNA中拯救感染性rBPIV3-VNM09-P1，以pcDNA3.1-NM09-VP1及表达BPIV3 NP、P和L蛋白的辅助质粒共转染BHK细胞。在MDBK细胞上盲传2代，显微镜下观察细胞病变；出现细胞病变后收获的细胞悬液作为重组病毒rBPIV3-NM09-VP1的F1代。按照方法1.4将重组病毒传2代。进一步RT-PCR(图6)和序列分析结果表明，F3代拯救获得的重组病毒基因组cDNA与转染的pcDNA-NM09-VP1序列一致，与预期相符。结果表明，通过反向遗传操作技术，利用BPIV3 NM09株基因组cDNA克隆成功拯救获得具有感染性的表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白基因的重组牛副流感病毒rBPIV3-NM09-VP1。

2.3免疫荧光检测重组病毒 

为了进一步鉴定上述拯救的重组病毒，以rBPIV3-NM09-VP1感染MDBK细胞，48h后，利用BPIV3直标抗体进行直接免疫荧光检测，结果rBPIV3-NM09-VP1和亲本毒感染细胞均显示阳性荧光信号，而对照细胞则显示荧光信号为阴性；用1：50倍稀释的的鼠抗猪O型口蹄疫VP1蛋白高免血清为一抗，1：1000倍稀释的FITC标记的兔抗鼠高免血清为二抗，进行间接免疫荧光检测，结果表明，rBPIV3-NM09-VP1感染细胞显示荧光信号阳性（图7A），而亲本毒感染细胞和正常对照细胞荧光信号阴性（图7B）。通过反向遗传系统操作技术，用BPIV3基因组cDNA克隆成功拯救获得具有感染性的rBPIV3-NM09-VP1。

实施例4 重组病毒与野生型病毒在MDBK细胞上的生长动力学比较 

以实施例3制备的重组病毒rBPIV3-NM09-VP1和亲本毒BPIV3 NM09株分别按MOI为0.01接种于生长过夜、密度约为70%～80%单层MDBK细胞，37℃孵育1.5h后，换含有8%马血清的DMEM完全培养基，37℃，5% CO₂温箱内培养，分别收获感染后12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h的细胞；将收集的上述不同时间段的重组病毒rBPIV3-NM09-VP1和亲本毒BPIV3 NM09病毒液冻融2次后，进行10倍倍比稀释，分别取100μL各稀释度病毒液接种于铺在96孔板、生长过夜、密度约为70%～80%单层MDBK细胞，37℃孵育1.5h后，换含有8%马血清的DMEM完全培养基，37℃，5% CO₂温箱内培养，每个稀释度8个重复；感染后底5天显微镜下观察细胞病变，计算各时间段收获的重组病毒rBPIV3-NM09-VP1和亲本毒BPIV3 NM09的病毒滴度（TCID₅₀），以评价两种病毒在MDBK细胞上的生长动力学特点。

结果显示，通过反向遗传技术拯救的重组病毒rBPIV3-NM09-VP1和亲本毒的生长滴度在相近时间达到峰值，生长动力学曲线无明显差异，见图8。 

实施例5 外源蛋白VP1表达检测 

为了评价重组病毒rBPIV3-NM09-VP1在MDBK细胞内表达VP1的稳定性，将F1、F3和F5这3个代次重组病毒rBPIV3-NM09-VP1按MOI为0.01接种于生长过夜、密度约为70%~80%单层MDBK细胞，37℃感作1h后，加入含有8%马血清的DMEM培养液，5%CO₂ 、37℃温箱内培养，4天后收集细胞和上清，提取RNA，利用Oligo dT进行反转录，并用FM-VP1-F/R进行PCR，扩增VP1基因。结果显示，各代次的重组病毒rBPIV3-NM09-VP1在MDBK细胞内均能高效地表达猪O型口蹄疫病毒的VP1基因，见图9。

本研究是以毒力较弱的牛副流感病毒BPIV3的cDNA建立反向遗传操作系统，对我国BPIV3的致病机制及免疫研究提供强大的技术支持。另外，该病毒的基因排列特性支持外源基因在编码蛋白间的插入，使其成为研究基因重组基因工程疫苗的优势活病毒载体，其复制能力强，在细胞内滴度可达10⁹，使插入的外源基因能够高水平表达，获得优良的抗原。 

另外，动物实验表明（数据未显示），本发明通过反向遗传技术救获的野生型rBPIV3和重组病毒rBPIV3-NM09-VP1对非本动物均无明显致病性，并且携带猪O型口蹄疫病毒的VP1基因的重组病毒rBPIV3-NM09-VP1可诱导与口蹄疫灭活疫苗相当的中和抗体，能够起到良好的保护作用。 

外源基因的插入可能对重组BPIV3的复制、增殖能力产生显著影响。外源基因的插入位置还可能对其表达水平产生显著影响，一般认为，外源基因的插入位置越接近基因组3’端，其表达水平越高，但有些外源免疫蛋白，特别是一些病毒囊膜糖蛋白，表达后可装配于病毒粒子的表面，过高的表达有可能影响到重组病毒在体内的感染、复制、甚至遗传稳定性。综合考虑各方面因素，本研究选择P—M之间插入猪O型口蹄疫病毒的VP1基因，构建表达VP1的重组BPIV3基因组cDNA克隆质粒pcDNA-NM09-VP1，经转染BHK-21细胞，拯救获得的野生型rBPIV3和表达猪O型口蹄疫病毒的VP1基因的重组病毒rBPIV3-NM09-VP1。rBPIV3和rBPIV3-NM09-VP1均具有良好的MDBK细胞生长适应性及遗传性；VP1蛋白在rBPIV3-NM09-VP1感染的MDBK细胞中能得到稳定、高效的表达，表明BPIV3具有作为活病毒疫苗载体的潜力和良好的应用前景。 

  

参考文献

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                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  中国农业科学院特产研究所

       华威特（北京）生物科技有限公司

 <120>  一种重组表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的牛副流感病毒3型载体

 <130>  2014

 <160>  1    

 <170>  PatentIn version 3.5

 <210>  1

<211>  21272

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  1

gacggatcgg gagatctccc gatcccctat ggtcgactct cagtacaatc tgctctgatg       60

ccgcatagtt aagccagtat ctgctccctg cttgtgtgtt ggaggtcgct gagtagtgcg      120

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aaacataacg gaaatattta ctacttcgac agttgaccaa tatgatattt atgatctact     7500

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 ttctatatca tacaatatcc aaggcaagga gtggtatatt cctcttccca accatatcat     7680

gactaaagga gcttttctag gaggtgctga tattaaagaa tgcatagagg cattcagcag     7740

ttatatatgt ccttctgatc caggttttat cttaaatcat gagatagaga attgtttatc     7800

aggtaatata acacaatgtc ctaagactgt tgttacatca gatgtggtac cacgatatgc     7860

atttgtgaat ggtggattaa ttgcaaactg tataacaaca acatgcacat gcaatggaat     7920

cgacaataga atcaatcaat cacctgatca gggaataaaa atcataacat ataaagaatg     7980

tcaggtaatc ggtataaatg gaatgttatt caataccaat agagagggaa cattagcaac     8040

ctatacattt gataacatca tattaaataa ctctgttgca cttaatccaa ttgacatatc     8100

tatggaactc aacaaggcaa aattggaatt ggaagaatcg aaggaatgga taaaaaaatc     8160

aaatcacaaa ctggattctg ttggaagttg gtatcaatct agtgcaacag tcaccataat     8220

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 ataccataga attcaagggg gaaaacaaga agacaaaaac aatgaaccgt atgtactaac     8340

 aagtagaaaa taagatcata catgattcaa tataaaaaat ataaaaaact taggaacaaa     8400

 gttgctcaac acagcagcaa caagcaaacc agaaggcaac acaaagacaa caccaaactc     8460

aaaaatggaa tactggaaac acacaaacag cacaaaagaa accaacaatg aatccggaac     8520

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catatcaata atattatcag tcatttttat aatgatattg attaacttaa ttcaagagaa     8640

 caatcataat aaattaatcc tgcaggaaat tagaaaagaa ttcgcagcaa tagacaccaa     8700

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tctcacgatt cagagtcatg ttcaaaacta tattccacta tcattgacac aacaaatgtc     8820

agatctcaga aaatttatca acgatctaac aaataaaaga gaacatcaag aagtgccaat     8880

acaaagaatg actcatgata gaggtataga acctctaaat ccagacaatt tctggagatg     8940

tacatctggt aacccatcat tgacaagtag tcctaagata aggttaatac ccgggccagg     9000

tttattagca acatccacta ctgtaactgg ctgtattaga atcccatctt ttgtaatcaa     9060

taacctaatc tatgcttaca cctctaatct tattacccag ggctgtcaag atatagggaa     9120

atcttaccaa gtactacaaa tagggataat taccataaat tcagatctag tacctgattt     9180

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attattgaac acagatgttt atcagttatg ctcaaccccg aaagttgacg aaagatcaga     9300

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tataacaaca aggtttacaa ataataatat aacgtttgac aaaccttatg cagctttata     9420

tccatcagta ggaccaggaa tatattataa gggtaaagtt atattcctcg gatatggagg     9480

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ttctattatc gttgttgata agggtataga tacaactttt agcttaaggg tgtggactat     9660

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atacatatat actagatcca caagttggca tagcaaatta caattagggg taattgacat     9780

ttctgattat aataatataa gaataaattg gacttggcat aatgtactat cacggccagg     9840

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tgatgcatat ccattaaatc catcggggag tattgtatcc tccgtcattc ttgattcaca     9960

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acataatatc attattagaa ccgcttgcat tatcgcttat tcagactcac gacccagtca    11220

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ttaaagaatc aacaatagat gaagtagcag aaattttctc tttcttccgg acttttggac    11400

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tagttgaagt gtttatagca gatagtaagt ttgatcccca tcaagtatta gattatgtag    11880

aatcaggata ttggttagat gatcctgaat ttaatatttc atatagttta aaggagaaag    11940

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tattatcaga aacattatta gcgaataaca tagggaaatt cttccaagag aatgggatgg    12060

ttaaagggga aattgaacta cttaagagac taacaacaat atccatgtct ggggttccac    12120

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ttactgcaat ggttcaagga gacaatcaag ccatagctgt tactacaaga gtacctaata    12660

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tattggggta tgtatgttca attttcaaaa atatccaaca attgtatata gcgcttggaa    13020

tgaatataaa tccaaccata actcaaaata ttagagatca atatttcagg aatattcatt    13080

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gatttataaa agcaaatttg ttagaccgag gtgtcctcta cagaattatg aatcaagaac    13260

caggcgagtc ttctttttta gattgggctt cagatccata ttcatgtaac ttaccacaat    13320

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attctcttac tggaatcagg aatgccatag ctgggatgtt ggatacaaca aaatcactga    13560

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tatatacttg ggcatttggg aatgacgaaa tatcctggat agaagcatca cagattgcac    14100

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tcaaaacatt tggggggtta ctcgtgaatc aatttgcata tactctttat ggattaaaaa    14820

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attgtggagt tttaaatcct atttatggtc ctaataccgc tggtcaggat caagttaagc    15000

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tggaaggagc gataggtaaa tcagaagaaa ctgtcttaca tgaacattat agtattatta    16080

ggattacata tttaattggg gatgatgacg ttgttctagt atcaaaaatt ataccaacta    16140

tcactccgaa ctggtctaaa atactctatt tatataaatt gtattggaaa gatgtaagta    16200

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aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacagttacc    20280

aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca tccatagttg    20340

cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct ggccccagtg    20400

ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca ataaaccagc    20460

cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc atccagtcta    20520

ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg cgcaacgttg    20580

ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct tcattcagct    20640

ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa aaagcggtta    20700

gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta tcactcatgg    20760

ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc ttttctgtga    20820

ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg agttgctctt    20880

gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa gtgctcatca    20940

ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg agatccagtt    21000

cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc accagcgttt    21060

ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg gcgacacgga    21120

aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat cagggttatt    21180

gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata ggggttccgc    21240

gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tc                                  21272

 

<210>  2

<211>  213

<212>  PRT

<213>  Foot and Mouth Disease Virus

 <400>  2

 Thr Thr Ser Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Ala Thr Val Glu

1               5                   10                  15     

 Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Ala Gln Arg Arg His His Thr Asp Val

            20                  25                  30         

 Ser Phe Ile Leu Asp Arg Phe Val Lys Val Thr Pro Lys Asp Ser Ile

        35                  40                  45             

  Asn Val Leu Asp Leu Met Gln Ala Pro Ser His Thr Leu Val Gly Ala

    50                  55                  60                 

  Leu Leu Arg Thr Ala Thr Tyr Tyr Phe Ala Asp Leu Glu Val Ala Val

65                  70                  75                  80 

 Lys His Glu Gly Asp Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu Ala

                85                  90                  95     

 Ala Leu Asp Asn Thr Thr Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro Leu

            100                 105                 110        

 Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala Thr

        115                 120                 125            

 Val Tyr Asn Gly Asn Cys Lys Tyr Thr Gly Gly Pro Leu Pro Asn Val

    130                 135                 140                

  Arg Gly Asp Leu Gln Val Leu Ala Pro Lys Ala Ala Arg Pro Leu Pro

145                 150                 155                 160

 Thr Ser Phe Asn Tyr Gly Ala Ile Lys Ala Thr Arg Val Thr Glu Leu

                165                 170                 175    

 Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu

            180                 185                 190        

Ala Val His Pro Ser Ala Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro

        195                 200                 205            

  Val Lys Gln Ser Leu

    210            

 

<210>  3

<211>  639

<212>  DNA

<213>  Foot and Mouth Disease Virus

 <400>  3

accacttcga cgggcgagtc ggctgacccc gtgactgcca ccgttgagaa ctacggcggc       60

gagacacagg cccagaggcg ccaccacaca gacgtctcat tcatattgga cagatttgtg      120

aaagtcacac caaaagactc aataaatgta ttggacctga tgcaggctcc ctcccacacc      180

ctagtagggg cgctcctccg cactgctact tactatttcg ctgatctaga ggtggcagtg      240

aaacacgagg gggaccttac ctgggtgcca aatggggcac ctgaagcagc cttggacaat      300

accaccaacc caacggcgta ccacaaggcg ccgcttaccc ggcttgcatt accctacacg      360

gcaccacacc gtgttttggc caccgtttac aacgggaact gcaaatacac cgggggcccg      420

ctgcccaacg tgagaggcga tctccaagtg ctggctccga aggcagcgag gccgctgcct      480

acttctttca actacggtgc catcaaagcc actcgggtga cagaactgtt gtaccgcatg      540

aagagggccg agacgtactg tcctcggccc ctcttggctg ttcacccgag tgcggccaga      600

cacaaacaga aaatagtggc acctgtaaag cagtccttg                             639

 

 

Claims (5)

1.一种表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体，其命名为pcDNA-NM09-VP1。

2.一种表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体，其特征在于具体的构建过程如下：1）以牛副流感病毒3型NM09株的cDNA基因组为基础构建的动物病毒表达载体pcDNA-NM09；2）由hCMV强启动子、锤头状核酶结构（HamRz）、修饰的牛副流感病毒NM09株的全长cDNA、丁肝病毒核酶结构（HdvRz）及表达载体pcDNA3.1骨架组成的体内转录真核表达载体；3）修饰的牛副流感病毒cDNA，包含牛副流感病毒NM09株的核衣壳蛋白（NP）、磷蛋白（P）、膜蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素和神经氨酸酶（HN）、大蛋白（L）以及基因间的连接桥和修饰区；4）牛副流感病毒全长cDNA经第一次的修饰，即在P和M之间引入Age I，便于外源抗原基因片段的插入替换，获得pcDNA-NM09-AgeI(P/M)；5）牛副流感病毒全长cDNA经第二次的修饰，即在P和M之间插入外源抗原基因转录单元，其氨基酸序列为SEQ ID NO1，核苷酸序列为SEQ ID NO 2。

3.根据权利要求2所述的一种表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体，其特征在于所述的异源病毒的抗原多肽由一个基因转录单元编码。

4.根据权利要求3所述的一种表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体，其特征在于所述的基因转录单元包含ATG起始密码子、猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白全基因序列、终止密码子TAA及两端的酶切位点。

5.根据权利要求2所述的一种表达猪O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组牛副流感病毒载体，其特征在于所述的表达载体为pcDNA3.1，其中辅助功能的重组表达质粒pcDNA-N、pcDNA-P、pcDNA-L中N、P、L为牛副流感3型的三个结构蛋白基因。

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