CN104391112A - 检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白及elisa试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白，是表达牛副流感病毒3型NP基因C'端rNc蛋白的重组大肠菌BL21/pGEX-NP2，其特征在于：rNC蛋白为NP基因C'端编码区的330bp编码的第391-500位氨基酸，其重组质粒为表达NP基因C'端编码区为330碱基的原核表达质粒；其是以一种重组大肠杆菌菌株，即可以特异性表达牛副流感病毒3型NP的C'端rNc蛋白为抗原，能有效地进行病毒感染和疫苗免疫后的诊断。

Description

检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白及ELISA试剂盒
技术领域
本发明涉及一种检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白及ELISA试剂盒，特别是涉及一种以表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌 BL21/ pGEX-NP2在试剂盒中的应用，属于动物病毒学与动物传染病学检测技术领域。
背景技术
副流感病毒（PIV）系单股负链RNA病毒目、副粘病毒科、副粘病毒亚科，是一类不分节段的单股负链RNA 病毒，可感染多种动物（包括人在内）。已报道的感染宿主有人、牛、犬、禽、猴、家兔、鼠、马、羊、雪貂、虎等某些野生动物。牛副流感病毒3型(Bovine parainfluenza virus 3, BPIV3)是引起牛和其它反刍动物急性呼吸道疾病的主要病毒。最近几年BPIV3 在我国内蒙、黑龙江、山东等地普遍流行。BPIV3 引起的病症为牛副流行性感冒，又称“运输热”，是一种急性接触性传染病，病毒对牛的致病力不强，但在其他继发性细菌（特别是多杀性巴氏杆菌或溶血性巴氏杆菌）及外界诱因（特别是长途运输中受寒、饥饿、拥挤、气候恶劣等）的联合作用下，则可产生严重呼吸道症状，甚至可引起病牛的死亡。同时，BPIV3 和牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）一起构成了牛呼吸道综合征(Bovine respiratory disease complex, BRDC)的主要病原。目前，牛呼吸道综合征是引起世界范围内的饲养牛发病和死亡的主要原因，严重危害着世界的养牛业。随着我国加入 WTO 以后，畜牧产品交易频繁，该病在我国养牛业发达地区广泛流行。临床预防和治疗中对该病还没有安全、高效的疫苗和药物，随着我国人民生活水平的提高，奶牛和肉牛养殖业的迅猛发展，养牛成为我国农民致富的手段之一，同时国内大型养牛企业也加大了牛养殖的投入，频繁的运输等因素使牛群发生BRDC的比率也随之上升。国外对牛群的BRDC监测和防制一直非常重视，实行严格的检疫、建立BPIV3感染阴性种群作为防制BRDC发生的有效措施，同时加强对健康牛群和可疑牛群的血清学监测，有针对性采取不同措施，减少BPIV3的感染和BRDC的发生，为牛群养殖创造良好的条件。因此，对养殖群体定期进行抗体阳性动物筛选，不断淘汰请群或者制定合适的综合防御措施，避免动物群的感染发病，广泛而深入地开展BPIV3感染的流行病学调查，进行BPIV3检测技术的研究，研制和开发BPIV3抗体和抗原监测试剂盒，为国内的BPIV3的防治提供技术支撑。
BPIV3的诊断目前主要依靠传统的分离病毒检测、免疫荧光检测和分子生物学检测方法，酶联免疫吸附试验（ELISA）用于BPIV3的诊断仍处于研究阶段。由于ELISA更适合短时间内检测大批量的血清样品，具有较好的特异性和较高的灵敏度，发展了ELISA、Dot-ELISA和阻断ELISA等几种方法。ELISA方法还有方便、易操作，利于在基层兽医部门和大型养殖区进行现地检测等优点。BPIV3 N蛋白为核衣壳蛋白(NP)，由约515个氨基酸组成，是病毒核衣壳的主要成份。NP编码基因为病毒的保守序列。 NP含有两个结构域，一个是N端结构域，与RNA结合，高度保守；另一个是C端结构域，裸露于装配完成后的核衣壳表面，含有对蛋白酶敏感的磷酸化位点和抗原结合位点，与负链RNA病毒基因组模板的活性有着密切关系。BPIV3 NP的C端与BPIV3抗体具有良好的反应原性，可以用于BPIV3感染和疫苗免疫后的诊断。因此，选择BPIV3 NP的C端保守序列，构建表达工程菌株，用表达的重组蛋白作为抗原，可建立检测牛副流感病毒3型抗体的间接ELISA诊断方法。
迄今为止，还没有检索到检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA 试剂盒的专利，特别是核心试剂制备方法和制备该核心试剂的生物材料。
 
发明内容
本发明目的之一在于提供一种检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白，是表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌 BL21/ pGEX-NP2，是以一种重组大肠杆菌菌株，即可以特异性表达牛副流感病毒3型NP的C'端rNc蛋白为抗原，能有效地进行病毒感染和疫苗免疫后的诊断。
本发明另一个目的是重组大肠杆菌菌株在制备牛副流感病毒3型抗体试剂盒中的应用。
本发明的技术方案是这样实现的：一种表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌 BL21/ pGEX-NP2，其特征在于：rN-C蛋白为NP基因C'端编码区的330bp 编码的第 391-500位氨基酸，其重组质粒为表达NP基因C'端编码区为 330碱基的原核表达质粒；其具体的构建过程如下：
(1)克隆牛副流感病毒3型NP的C'端的DNA 片段:以分离的牛副流感病毒3型基因组为模板RNA ，通过RT-PCR 方法扩增得到N基因C' 端330bp 片段(含可表达的330bp) ，经测序分析确定该序列碱基无错配，该cDNA 序列与牛副流感病毒3型全基因组在Genebank 中 (登录号: JQ063064) 对应序列完全相同；
(2) 构建原核表达载体pGEX-NP2: 将牛副流感病毒3型NP的C'端的DNA 片段与克隆载体pCR-blunt(购于Invitrogen)连接，经限制性内切酶酶切鉴定无误后，将该序列定向插入原核表达载体pGEX-6p-1 (购于宝生物工程(大连)有限公司)的BamH I和Sal I多克隆位点；
(3) 重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/ pGEX-NP2的构建:将步骤(2) 所述的原核表达载体pGEX-NP2转化至大肠杆菌BL21 感受态细胞( Escherichia coli BL21 购自北京全式金生物技术有限公司)，经氨苄青霉素抗性筛选得到阳性重组菌株；
(4) 牛副流感病毒3型NP的C'端片段在大肠杆菌BL21 中的表达：将步骤(3) 所述的重组大肠杆菌Escherichia coli BL2 1/ pGEX-NP2在含50mg/ml氨苄青霉素(Amp) 抗性的LB 液体培养基中培养，经异丙基硫代- ?-O 半乳糖昔(IPTG) 诱导，Western-blot 分析，证实该重组大肠杆菌可以特异性地表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白，表达的蛋白以分泌上清的形式存在于大肠杆菌BL21 中，且具有免疫学活性；
(5) 牛副流感病毒3型阴、阳性标准血清的制备:选择阴性健康犊牛作为免疫动物。用制备的牛副流感病毒3型细胞培养物，灭活后与佐剂混合，分3次免疫28～35日龄的健康牛（最后一次不加佐剂），当ELISA检测效价达到1:600以上时，颈部动脉无菌采血，获得的血液分离血清，即为合格的标准阳性血清。将健康阴性牛经颈动脉采血，即为标准阴性血清。在所制备的阴、阳性标准血清中加入0.01% 硫柳汞防腐，过滤除菌，无菌分装。
2、一种表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌 BL21/ pGEX-NP2在快速检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA 试剂盒中的应用。
3、根据权利要求2所述的快速检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA 试剂盒，其特征在于：包括盒体、包被有已纯化的表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNP2蛋白作为抗原的酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、羊抗牛 IgG酶标二抗、样品稀释液、底物显色 A 液、底物显色 B 液、终止液和洗涤液；以特异性表达牛副流感病毒3型NP的C'端rNc蛋白的重组大肠杆菌菌株为抗原，用牛副流感病毒3型阴、阳性标准血清为抗体，通过方阵滴定实验确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度，以方阵滴定确定的抗原最佳浓度包被酶标板，进行该ELISA 检测方法各最适反应条件的确定:封闭液的确定、样品稀释液的确定、血清最佳反应时间的确定、酶标抗体反应时间的确定、底物最佳反应时间的确定。
本发明的积极效果是：（1）生物安全性高，其原核表达载体pGEX-6P-1 是分子生物学中常用表达载体，没有生物危险性，在此基础上构建的原核表达载体pGEX-NP2也没有任何生物危险性。重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/ pGEX-NP2是将原核表达载体pGEX-NP2转化至大肠杆菌BL21 感受态细胞后经氨苄青霉素抗性筛选获得，不具生物危险性。本发明所用的抗原酶标板是用牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白包被的，制备过程中不涉及牛副流感病毒3型，因此没有牛副流感病毒3型逃逸、扩散的潜在危险。
（2）生产成本低，其牛副流感病毒3型ELISA抗体检测试剂盒所需抗原是牛副流感病毒3型NP基因 C'端表达蛋白rNc蛋白。该蛋白可以通过重组大肠杆菌Escherichia coli BL21 / pGEX-NP2在体外大量表达，适合大规模的生产，具有广泛的应用前景。
（3）牛副流感病毒3型抗体检测试剂盒，临床上检测牛副流感病毒3型可采用常规的病毒分离鉴定和中和试验，不但步骤较为繁琐费时，且试验结果可重复性不高。而本发明从血清学方面检测牛副流感病毒3型抗体，利用“抗原-抗体-抗抗体”结合原理，能快速、准确、安全地诊断牛副流感病毒3型感染。可用于临床大规模的检测，有利于提前预防牛群发生BRDC。
附图说明
图1为本发明的技术路线。
图2为牛副流感病毒NP基因C'端扩增条带和表达载体pGEX-NP2酶切及PCR检测的电泳图。A：NP 基因片段的PCR产物，泳道1为 DL 2000 DNA Marker，泳道2为PCR产物；B：M为DL 2000 DNA Marker；1,2: pGEX-NP2的BamH I、Sal I单酶切图；3: pGEX-NP2阳性重组质粒；4: pGEX-NP2重组质粒PCR鉴定。
图3为牛副流感病毒NP基因C'端蛋白诱导表达的SDS-PAGE 图。
泳道1：经诱导的BL21/ pGEX-NP2转化子诱导上清蛋白；泳道2 :提取的BL21/pGEX-NP2 转化子诱导全菌;泳道3 :诱导的BL21/pGEX-NP2 转化子诱导沉淀;泳道4 :BL21/ pGEX-6p-1空载体转化子诱导全菌；泳道M :Protein Marker。
图4为牛副流感病毒NP基因C'端蛋白的Western-blot 分析。
M为Protein Marker；泳道1为BL21/pGEX-NP2转化子；
图5为pGEX-NP2蛋白IPTG浓度(mmol/mL)诱导优化。
M. Protein Ladder；泳道1-8: 1.4、1.2、1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1；泳道9: empty vector control
图6为PGEX-NP2蛋白T、Time诱导条件优化。
M. 蛋白质量标准；1-3:4h、6h、8h；4、8. empty vector control;5-7:23℃、30℃、37℃。
图7为纯化的牛副流感病毒NP基因C'端蛋白的SDS-PAGE分析。
泳道1是经纯化后重折叠上清中的NP基因C'端蛋白；泳道2为纯化后重折叠沉淀；M为Protein Marker。
图8为抗原最佳包被条件优化。
图9为最佳封闭液的优化。
图10为最佳封闭时间的优化。
图11为抗原包被浓度与被检血清稀释度的优化。
图12为检验血清工作时间的确定。
图13为酶标复合物最佳工作浓度的优化。
图14为酶标复合物工作时间的优化。
图15为底物显色时间的优化。
图16为对PCR扩增条件进行优化选择。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的描述：如图1所示，
实施例1：表达诊断抗原重组质粒pGEX-NP2的构建及重组抗原蛋白表达鉴定
1  材料
1.1主要试剂
MDBK细胞购自中国兽医药品监察所。DMEM培养基、犊牛血清购自美国Invitrogen公司。LA Taq DNA聚合酶、dNTP、BamH I、Sal I为TaKaRa产品。琼脂糖、LB液体培养基和固体培养基，0.25%考马斯亮兰染色液，氨苄青霉素（Amp）。
病毒与质粒
牛副流感病毒3型NM09株第4代（BPIV3 NM09 F4）为实验室分离鉴定保存。原核表达载体pGEX-6P-1购自Invitrogen公司。
方法
2.1  BPIV3 NM09毒株的培养  以0.25％胰蛋白酶消化MDBK细胞，加入含6％小牛血清的DMEM生长液分装克氏瓶静止培养，24h贴壁后换为含2％犊牛血清的DMEM维持液。待细胞形成单层后，倾去培养液。将冻干的BPIV3 NM09种毒以维持液稀释后，取10 ml加于细胞单层上37℃吸附30min，补加100 ml维持液，37℃继续培养。
病毒RNA提取  将病毒培养物反复冻融三次，取病毒原液300 μl，加Trizol（购自Invitrogen公司）700 μl，剧烈摇晃数次，加入200 μl三氯甲烷，于4℃，12 000 g离心5min，小心抽取上层液体，置于微量离心管中，加入等量的异丙醇，混匀，于-20℃保存备用。未接毒的MDBK细胞RNA也以同法制备。
引物的设计与合成  引物序列见表1，引物由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。
引物的合成与PCR
用随机引物作为反转录引物，利用禽源反转录酶（AMV）进行反转录，合成cDNA。反应体系如下：
模板RNA                            5.5μl（1μg）
5 X AMV buffer                    4μl
dNTP Mix（10 mmol/L）   2μl 
RNase Inhibitor                      0.5μl（20U）
随机引物（50 pmol）          1μl
AMV RT-XL                         1μl（5U）
灭菌去离子水    定容至20 μl
在微量离心管内调制上述反应液，轻轻搅拌，室温下放置10 min后移入42℃恒温槽中，保温1 h。然后，在冰水中冷却2min，所得的反应液用于PCR反应。
按常规方法对PCR扩增条件进行优化选择。对NP基因部分片段进行扩增。扩增各段反应参数如下：
模板cDNA                                  2 μl（约1μg）
10X PCRbuffer                           10 μl
dNTP Mix（各2.5 mmol/L）     4 μl 
上游引物（50 pm）                 1 μl
下游引物（50 pm）           1 μl
灭菌无离子水                     定容至100 μl
如图16所示。
2.5  表达载体的构建
利用限制性内切酶BamH I和Sal I双酶切表达载体和PCR产物，回收NP2和同样处理的pGEX-6P-1原核表达载体，然后将二者进行连接，转化至BL21（DE3）感受态菌。碱裂解法小量提取质粒，PCR鉴定法及单酶切筛选阳性重组质粒，将阳性质粒命名为pGEX-NP2。将鉴定为阳性的质粒送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序。
表达NP2重组宿主菌株的保存
将2.5中经过鉴定的阳性菌株接种到50 ml的LB培养基中，置于37℃摇床过夜摇菌，然后按照每管400 μl与40%甘油按照1:1比例加入到灭菌的1.5 ml微量离心管中，置于-70℃保存。
基因部分片段的诱导表达
将测序正确的两种阳性重组质粒按照常规方法转入感受态BL21(DE3)中，分别挑取大小适中饱满的阳性单菌落接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床摇菌过夜。均取部分菌液保种放于-80℃留用，各取100ul菌液接种于新鲜的含有氨苄青霉素抗性的5ml液体LB培养基中，37℃、200rpm摇菌大约5h，摇到菌液OD600nm值为0.8-1 时加入IPTG（1mol/ml）5μl，使其终浓度为0.1mmol/L，放于37℃、200rpm/min继续诱导6h。各取诱导菌液1ml，12000rpm离心1min，弃上清；用PBS清洗菌体后离心，弃上清；加入80μl PBS、20μl 5×SDS loading buffer、1μlβ-巯基乙醇，放于沸水中煮10min，8000rpm离心15min。取15μl于12%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳分析，设未诱导重组菌和诱导的PGEX-6P-1空载体菌做对照。具体操作按分子克隆试验指南所述进行。电泳完毕后，用0.25％考马斯亮兰染色液染色2h，用脱色液脱色后，观察电泳结果，蛋白质大小参照蛋白分子量标准。
结果
3.1  BPIV3 NP基因的鉴定
3.1.1  BPIV3 NM09株NP基因部分片段的RT-PCR扩增的结果
以接种NM09株病毒的MDBK细胞进行病毒RNA的提取，进行反转录，以得到的cDNA为模板进行PCR均扩增出特异性片段，与预期结果相符（如图2A），水对照组没有扩增出条带。因此初步确定已获得NP基因部分片段（330bp）。
3.1.2  重组表达质粒的鉴定结果
将以上扩增的NP基因片段克隆到pGEX-6P-1中，所得重组质粒经BamH I、Sal I酶切均线性化（图2B）。PCR检测能够扩增到目的条带330bp。进一步测序显示，插入表达载体的NP编码的基因与GenBank上登录的BPIV3（NM09株）NP基因进行序列比较，同源性分析表明，二者核苷酸序列同源性为100%。表明重组表达质粒构建成功，命名为pGEX-NP2。
3.1.3 重组表达蛋白的SDS-PAGE鉴定
pGEX-NP2（BL21）重组菌经1mmol/L IPTG，37℃诱导5h后，进行SDS-PAGE检测，可见NP基因获得了融合表达，融合蛋白rNc的相对分子量约为38kDa。而含空质粒pGEX-6P-1的E.coli BL21（DE3）只有26kDa的GST蛋白表达，如图3。
    3.2  表达NP蛋白重组宿主菌株的保存
40ml鉴定的阳性菌株，0.5ml/管分装保存于-70℃，作为菌种。
 
实施例2 重组抗原蛋白的免疫原性分析- Western-b1ot 分析
为分析表达物rNc的免疫学活性，按上所述方法进行SDS-PAGE电泳，电泳后的凝胶，不经染色，直接用Bio-RAD 公司Mini Trans-B1ot E1ectrophoretic Cell转印装置将蛋白转印到硝酸纤维素滤膜(NC膜)上，以恒压15V，电转印15-20min。转印结束后，将NC膜于PBS-T中漂洗3min，再将NC加有封闭液(5%全脂牛乳),室温平缓摇动2h 或4℃过夜。然后弃封闭液，将膜取出，经PBS-T 漂洗3次，每次5min。PBS-T稀释(体积比1 :100) 的一抗(牛抗BPIV3标准血清)，在摇床上室温孵育1h，PBS-T洗6 次，每次5min，加入PBS-T稀释(体积比1: 5000) 的二抗(羊抗牛IgG-HRP)，在摇床上室温孵育1h，PBS-T洗6 次，每次5min ，最后再用PBS漂洗2 次，加入以0. 01mol/L Tris-Cl (pH7.6) 配制的底物溶液(DAB-H2O2 ) 显色，一旦出现蛋白带，立即用ddH2O 终止，即可观察并照相。结果如图4所示，在38KD 处出现特异性条带，表明rNc具有良好的免疫原性。
实施例3 最佳诱导物浓度及最佳诱导时间和最佳诱导温度的确定
从平皿上挑取单个重组大肠杆菌菌落至5mL LB 培养基，加氨苄青霉素(Amp)至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养至混浊(约8h) ，放4℃冰箱过夜。取该菌液按体积比1: 100 于液体LB 培养基中扩大培养，同时加氨苄青霉素(Amp)至终浓度为50μg/mL 。分装至5 支细菌培养瓶中(5mL/瓶)，置37℃摇床培养约3h 至OD600~0.6，加入诱导剂异丙基硫代白-0一半乳糖昔(IPTG) 至终浓度分别为0.2 、0.4 、0.6 、0.8 和1. 0 mmol/L，继续培养3. 5h 后，等量取样进行SDS-PAGE 分析。确定诱导剂IPTG 的最佳浓度为0.8 mmol/L 。
以0.8 mmol/L IPTG 诱导重组大肠杆菌进行表达，在诱导后4h、6h和8h取样100 μL，进行SDS-PAGE分析，确定最佳诱导时间为6h ，结果见图5。
在22℃、30℃、37℃条件下，以0.8 mmol/L IPTG 诱导6h，进行SDS-PAGE分析，30℃条件下诱导的重组菌经超声裂解后在沉淀与上清中均有表达，且表达量较高。因此确定pGEX-NP2（BL21）最佳诱导温度为30℃，该温度下，重组蛋白表达形式为部分可溶性，利于柱吸附纯化，结果见图6
实施例4  NP基因C'端蛋白rNc蛋白的大量诱导及纯化
将含有重组质粒pGEX-NP2的BL21菌种在含氨苄青霉素（Amp+）的LB琼脂平板上划线，37℃培养过夜，从平皿上挑取单个菌落，接种于含Amp+的5mL LB液体培养基中，至终浓度为50μg/mL，37℃摇床培养至混浊(约8h) ，放4℃冰箱过夜。第二天取该菌液2mL加入200mL LB/ Amp培养基中，置于37℃摇床培养至OD600为0.6～0.7时，加入诱导剂IPTG至终浓度1mmol/L，再置于30℃摇床振摇培养4h，收获细菌。将诱导的菌体4℃、8000rpm离心收集后，以PBS(pH 7.2) 洗涤菌体一次。然后根据Thermo Scientific柱式B-PER GST融合蛋白纯化试剂盒说明书提取NP基因C'端蛋白rNc 蛋白。其中在用1×Binding buffer 重悬菌体时加入溶菌酶(购自北京天为时代科技公司)至终浓度为100μg/mL ，加1/100 体积的10% Trition X-100 ，置室温摇床培养30min，再将样品置冰上进行超声波(频率30kHz ，100% 振幅，间歇频率0.6，超声时间12min)破碎至溶液不再粘稠，在用1×Elute buffer 洗脱后，需转至处理好的透析袋中，于TE 溶液(pH 8.0) 透析去3d （每天换3次) ，进行纯化蛋白的重折叠，取出立即使用或分装至1.5mL 管，-80℃保存备用。
实施例5纯化的表达蛋白rNc的SDS-PAGE 检测和Western-blot 分析
SDS-PAGE 检测：取实施例4 所纯化并重折叠的蛋白rNc 10μL ，加入8μL 的2×SDS上样缓冲液（100mmol/L Tris. HCl (pH 6.8) , 4% SDS (电泳级)，0.2%台盼蓝，20% 甘油）和1μL二硫苏糖醇(DTT)，充分重悬，水浴煮沸3-5min ，然后置冰浴上5min，上样电泳。参照J.萨姆布鲁克等[美]， <<分子克隆实验指南)) ，科学出版社， 2003 年，第三版介绍的方法制备分离胶和集层胶，加入1×Tris-甘氨酸电泳缓冲液，取处理好的样品上样，120V 电泳1.5-2h。取下凝胶，考马斯亮蓝R250 染色液染色2h，SDS-PAGE 脱色液脱色2h，观察照相，如图7所示，在纯化重折叠上清可见38KD 大小的纯化蛋白，沉淀内只有少量目的蛋白。按照实施例2进行Western-blot分析纯化的蛋白rNc具有良好的反应原性。
实施例6 牛副流感病毒3型NM09株标准阳、阴性血清的制备
l标准阳性血清的制备及检验
1.1 制造用动物  应用来自无牛副流感病毒感染的地区，用美国IDEXX公司的BPIV3抗体检测试剂盒检测，BPIV3抗体为阴性的28～35日龄健康易感犊牛。使用前隔离观察7日。
1.2 免疫  经颈部肌肉注射，分3次接种牛副流感病毒3型NM09株灭活疫苗，2 ml/次，每次间隔14日。末次接种后7日，用常规方法采血，待血液凝固后置于37℃温箱放置2h，再置于2～8℃放置1h，然后将析出的血清置于离心瓶中，8 000 r/min离心15～20min，无菌分离血清，定量分装。用NP蛋白抗原和待检阳性血清进行检测，血清经1:100倍稀释后，OD450＞1.0，P/N＞5，若测得的效价不足，可适当增加接种剂量和次数。
1.3 分装  将检验合格的阳性血清加入0.01% 叠氨铀防腐，并充分摇匀，定量分装，2 ml/瓶，置于-80℃保存备用。
1.4 敏感性检验  将制备的阳性血清按照1:50、1:100、1:200、1:300稀释，同时设空白对照，用ELISA试剂盒检测。每个稀释度S/P值≥0.289；同时，当阳性血清稀释至1:100时，OD450≥0.6。
2标准阴性血清的制备及检验
2.1  制造用动物  应选用来自无牛副流感3型感染的地区，用美国IDEXX公司的BPIV3抗体检测试剂盒检测，BPIV3抗体为阴性的健康牛。
2.2  血清制造  用常规方法采血，待血液凝固后置于37℃温箱放置2h，再置于2～8℃放置1h，然后将析出的血清置于离心瓶中，8 000 r/min离心15～20min，无菌分离血清，加入0.01% 叠氮铀防腐，定量分装，将上清置于-80℃保存备用。
2.3  分装  将检验合格的阴性血清定量分装，2 ml/瓶，置于-70℃保存。
2.4  特异性检验  对牛副流感病毒3型NP蛋白抗原呈阴性反应（OD450＜0.3）。
实施例7  牛副流感病毒3型间接ELISA方法的优化
1方法
1.1 抗原最佳包被条件的确定
取重组牛副流感病毒3型NP（BPIV3-NP）蛋白按照测量的浓度首先用25mmol/L碳酸盐缓冲液（pH值9.6）稀释抗原浓度至0.96μg/ml，包被酶标板（100 μl/孔），包被条件分别为37℃ 2h 后4℃过夜、37℃ 1h 后4℃过夜、4℃过夜，甩净板中的液体，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板4次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，然后，取0.5％BSA（用含0.2％ Tween-20、pH值 7.4的PBS稀释）封闭2h，最后取标准阳性血清和标准阴性血清按照ELISA方法进行检测。
1.2 最佳封闭液与封闭时间的确定
取重组牛副流感病毒3型NP（BPIV3-NP）蛋白按照测量的浓度首先用25mmol/L碳酸盐缓冲液（pH值9.6）稀释抗原浓度至0.96μg/ml，包被酶标板（100 μl/孔），置于4℃，包被过夜后，甩净板中的液体，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板4次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，然后，取0.5％BSA、1％BSA、5%脱脂牛乳进行封闭，封闭不同时间，最后取标准阳性血清和标准阴性血清按照ELISA方法进行检测。
1.3 最佳抗原包被浓度与被检血清最佳稀释度的确定
取BPIV3-NP蛋白从61.2ug/ml作为起始，倍比稀释（即2-1），最终将抗原稀释至0.478μg/ml，包被酶标板（100μl/孔），每个稀释度做8个重复，包被过夜后，甩净板中的液体，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板4次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，然后，用1.3.2中优化的封闭液条件进行封闭。甩净板中的液体，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板5次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，取标准阳性血清和标准阴性血清进行检测，标阳和标阴的血清稀释梯度为1:320、1:640、1:1280、1:2560等依次倍比稀释。按照ELISA方法进行。
1.4  检验血清工作时间的确定
取BPIV3-NP蛋白按照1.3.3中优化的抗原浓度包被酶标板，包被过夜后，甩净板中的液体，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板4次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，然后，用1.3.2中优化的封闭液条件进行封闭。甩净板中的液体，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板5次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，取标准阳性血清和标准阴性血清，按1.3.3中优化的条件进行稀释，然后加入到酶标板上，工作时间为1h、1.5h、2h，标准阳性血清和标准阴性血清样本做2个重复，按照ELISA方法进行。
1.5 酶标抗体（HRP标记的抗牛抗体）工作浓度的确定
取BPIV3-NP按照1.3.3中优化的抗原浓度包被酶标板，包被过夜后，甩净板中的液体，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板4次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，然后，用1.3.2中优化的封闭液条件进行封闭。甩净板中的液体，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板5次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，按1.3.3中优化的条件进行稀释，然后加入到酶标板上，检测血清工作时间按照1.3.3中优化的时间进行。检测血清作用时间完毕后，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板5次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，加入酶标抗体，工作浓度分别为1：2000、1:5000、1:8000、1:1000、1:15000，标准阳性血清和标准阴性血清样本做2个重复。按照ELISA方法进行。
1.6酶标抗体（抗猪IgG-HRP）工作时间的确定
取BPIV3-NP按照1.3.3中优化的抗原浓度包被酶标板，包被过夜后，甩净板中的液体，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板4次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，然后，用1.3.2中优化的封闭液条件进行封闭。甩净板中的液体，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板5次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，按1.3.3中优化的条件进行稀释，然后加入到酶标板上，检测血清工作时间按照1.3.3中优化的时间进行。检测血清作用时间完毕后，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板5次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，加入酶标抗体，工作时间为1h、1.5h、2h，标准阳性血清和标准阴性血清样本做2个重复。按照ELISA方法进行。
1.7 底物作用时间的确定
取BPIV3-NP蛋白按照1.3.3中优化的抗原浓度包被酶标板，包被过夜后，甩净板中的液体，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板4次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，然后，用1.3.2中优化好的封闭液条件进行封闭。甩净板中的液体，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板5次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，按1.3.3中优化的条件进行稀释血清，加入到酶标板上，按照1.3.2中优化的条件孵育，用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板5次，200 μl/孔，每次2min，用力甩净酶标板中的液体，加入酶标抗体，按照1.3.5中优化的条件加入酶标抗体。用含0.2％ Tween-20的PBS（pH值 7.4）洗板5次，200 μl/孔，每次2min，甩净酶标板中的液体，加入底物TMB，置于37℃作用。取P/N值较大，即标准阳性血清OD值/标准阴性血清的OD值较大作为本试剂盒所使用的底物显色时间。标准阳性血清和标准阴性血清样本做2个重复，本试验确定的底物显色时间为37℃作用10、15、20min。
1.8 优化条件的判定   P/N=（标准阳性OD450值）/（标准阴性OD450值）
1.9 临界值判定  当N<0.5，P>2.1*N时，临界值=X+2SD其中X为阴性血清数据平均值，SD为标准方差。
2 结果
2.1抗原最佳包被条件的确定
取P/N值最大的抗原包被条件作为本试剂盒所使用的最佳包被条件。37℃1h后4℃过夜、37℃2h后4℃过夜包被效果没有4℃包被过夜效果明显。本试验确定最佳包被条件为4℃过夜包被，结果见表2和图8，数据为2个实验重复。
2.1  最佳封闭液与封闭时间的确定
取P/N值最大（P/N值＝13.77）的封闭液作为本试剂盒所使用的最佳封闭液。5%脱脂奶粉封闭、0.5%BSA封闭都没有1%BSA封闭效果理想。取P/N值最大的封闭时间作为本试剂盒所使用的最佳封闭时间。1%BSA封闭2h、1%BSA封闭1.5h没有1%BSA封闭1h效果理想。本试验确定最佳封闭液与封闭时间为含有0.2％ Tween-20的PBST稀释的1％BSA（pH值 7.4）37℃封闭1h。见表3和图9、表4和图10，数据为2个实验重复。
                  
2.2  最佳抗原包被浓度与被检血清最佳稀释度的确定
取P/N值相对较大，标准阳性血清OD值较大，而标准阴性血清的OD值较小，作为本试剂盒所使用的最佳抗原包被浓度与被检血清最佳稀释度。本试验确定的最佳抗原包被浓度为2μg/ml，被检血清最佳稀释度为1:1280倍。见表5和图11。
2.3  血清工作时间的确定
取P/N值相对较大，标准阳性血清OD值较大，而标准阴性血清的OD值较小，作为本试剂盒所使用的血清工作时间为1h。见表6和图12
2.4酶标复合物（抗牛IgG-HRP）工作浓度的确定
取P/N值相对较大，标准阳性血清OD值较大，而标准阴性血清的OD值较小，作为本试剂盒酶标复合物（抗牛IgG-HRP）工作浓度，为8000倍稀释。见表7和图13。
2.5 酶标复合物（抗牛IgG-HRP）工作时间的确定
取P/N值相对较大，标准阳性血清OD值较大，而标准阴性血清的OD值较小对应的酶标复合物工作时间，作为本试剂盒所使用的酶标复合物工作时间，为2h。见表8和图14。
2.6 底物显色时间的确定
取P/N值相对较大，标准阳性血清OD值较大，而标准阴性血清的OD值较小，作为本试剂盒所使用的底物显色时间为37℃ 10min。见表9和图15。
2.6  临界值的判定
2.6.1  ELISA抗体检测试剂盒检测已知阴、阳血清的OD值，见表10、表11。
2.6.2  数据分析结果
经商品化牛副流感病毒3型ELISA抗体检测试剂盒检测的牛50份阴性血清用表达蛋白包被后检测，均值为0.26008，SD值为0.014701，所以临界值为0.26008+2*0.014701=0.289482，也即临界值为0.289。
 
实施例8牛副流感病毒3型ELISA抗体检测试剂盒特异性试验
3批试剂盒检测48份疑似有交叉反应的参考血清，检测结果全部为阴性（表12～14）。说明该试剂盒具有较好的特异性，可以用于牛副流感病毒3型抗体的临床检测。
实施例9 牛副流感病毒3型ELISA抗体检测试剂盒敏感性试验
将10份牛副流感病毒3型阳性血清倍比稀释后，分别对实验室试制的牛副流感病毒3型ELISA检测试剂盒进行敏感性试验，结果试制的3批ELISA试剂盒对阳性参考血清检出阳性的最大稀释倍数均为200～300倍（表15～17），表明试制的试剂盒具有良好的敏感性。ELISA阳性参考血清的阳性最高稀释度为1:300。具有较高的敏感性。
实施例10 牛副流感病毒3型ELISA抗体检测试剂盒重复性
用3批实验室试制的牛副流感病毒3型ELISA抗体检测试剂盒分别检测已知背景清晰血清8份，其中阳性血清4份，阴性血清4份。结果显示，批内变异系数CV%分别在3.92%～6.90%，3.95%～11.78%和4.46%～13.42%（表18～20）；批间变异系数在3.24%～6.92%之间（表21）。批内和批间检测结果重复性良好，说明该试剂盒制造工艺和检验方法可靠，具有良好的可重复性，适合产业化和临床检测要求。
实施例11 本发明的牛副流感病毒3型ELISA抗体检测试剂盒与中和间接免疫荧光试验符合率的比较
应用该ELISA试剂盒对临床采集的100份血清样品进行检测，同时利用间接免疫荧光试验方法进行同步检测，进而比较牛副流感病毒3型ELISA抗体检测试剂盒与免疫荧光方法的符合率（结果见表22，23）。可见两种方法检测样品的阳性符合率为87%，阴性符合率为91.7%。总符合率为89.35%。结果表明，该检测方法可准确评价血清中牛副流感病毒抗体的水平。
实施例12 本发明的牛副流感病毒3型ELISA抗体检测试剂盒的重复性试验
用3批实验室试制的牛副流感病毒3型ELISA抗体检测试剂盒分别检测已知背景清晰血清8份，其中阳性血清4份，阴性血清4份。结果显示，批内变异系数CV%分别在3.92%～6.90%，3.95%～11.78%和4.46%～13.42%（表24～26）；批间变异系数在3.24%～6.92%之间（表27）。批内和批间检测结果重复性良好，说明该试剂盒制造工艺和检验方法可靠，具有良好的可重复性，适合产业化和临床检测要求。
实施例14 本发明试剂盒的临床应用
应用本发明的牛副流感病毒ELISA抗体检测试剂盒，检测从全国7个省份采集的256份血清样品，结果阳性血清有55份，阳性率21.47%。表明本发明的试剂盒适合于对临床采集的大量样品进行快速检测，能准确评估牛群中牛副流感病毒的感染情况，具有广阔的应用前景。

Claims (3)

1.检测牛副流感病毒3型抗体的表达蛋白，是表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌 BL21/ pGEX-NP2，其特征在于：rNC蛋白为NP基因C'端编码区的330bp编码的第391-500位氨基酸，其重组质粒为表达NP基因C'端编码区为 330碱基的原核表达质粒；其具体的构建过程如下：
(1)克隆牛副流感病毒3型NP的C'端的DNA 片段:以分离的牛副流感病毒3型基因组为模板RNA，通过RT-PCR 方法扩增得到N基因C'端330bp 片段含可表达的330bp ，将牛副流感病毒3型NP的C'端的330bp片段与克隆载体pCR-blunt连接，经限制性内切酶酶切鉴定后，通过测序分析确定该序列碱基无错配，该cDNA 序列与牛副流感病毒3型全基因组在Genebank 中登录号: JQ063064 对应序列完全相同；
(2) 构建原核表达载体pGEX-NP2:将上述测序准确的克隆质粒内的牛副流感病毒3型NP的C'端的330bp片段定向插入原核表达载体pGEX-6p-1的BamH I和Sal I多克隆位点之间；
(3) 重组大肠杆菌Escherichia coli BL21/ pGEX-NP2的构建:将步骤(2) 所述的原核表达载体pGEX-NP2转化至大肠杆菌BL21 感受态细胞，经氨苄青霉素抗性筛选得到阳性重组菌株；
(4) 牛副流感病毒3型NP的C'端330bp片段在大肠杆菌BL21中的表达：将步骤(3) 所述的重组大肠杆菌BL21/ pGEX-NP2在含50mg/ml氨苄青霉素Amp 抗性的LB 液体培养基中培养，经异丙基硫代- ?-O 半乳糖昔IPTG 诱导，Western-blot 分析，证实该重组大肠杆菌可以特异性地表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白，重组蛋白大小为38KD，以分泌上清的形式存在于大肠杆菌BL21中，且具有良好的免疫学活性。
2.一种表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白的重组大肠菌 BL21/ pGEX-NP2在快速检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA 试剂盒中的应用。
3.根据权利要求2所述的快速检测牛副流感病毒3型抗体的ELISA 试剂盒，其特征在于：包括盒体、包被有已纯化的表达牛副流感病毒3型NP基因 C'端rNc蛋白作为抗原的酶标板、阴性标准血清、阳性标准血清、羊抗牛 IgG酶标二抗、样品稀释液、底物显色 A 液、底物显色 B 液、终止液和洗涤液；以表达的牛副流感病毒3型NP的C'端rNc蛋白为抗原，用牛副流感病毒3型阳性标准血清为抗体，通过方阵滴定实验确定抗原最佳包被浓度和血清最佳稀释度，以方阵滴定确定的抗原最佳浓度包被酶标板，进行该ELISA 检测方法各最适反应条件的确定:封闭液的确定、样品稀释液的确定、血清最佳反应时间的确定、酶标抗体反应时间的确定、底物最佳反应时间的确定。
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