CN102618557B - 一种重组禽黄病毒e蛋白及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组禽黄病毒E蛋白及其应用，涉及基因工程领域。该方法是通过基因克隆表达技术，获取禽黄病毒重组E蛋白。以重组E蛋白为包被抗原建立起间接ELISA方法检测禽黄病毒抗体。目前该方法是国际上首次利用重组禽黄病毒E蛋白建立检测禽黄病毒抗体的ELISA方法，具有成本低、特异性强、灵敏度高等优点，可用于判断临床家禽体内禽黄病毒特异性抗体水平及自然感染的情况。本发明还提供了该重组禽黄病毒E蛋白在制备单抗、多抗、疫苗及蛋白芯片中的应用。
Description
技术领域：
本发明涉及基因工程领域。具体涉及一种重组禽黄病毒E蛋白及其应用。
背景技术：
禽黄病毒（Avian Flavivirus）是2010年中国新发现的一种可引起家禽产蛋下降、采食量下降、生长迟缓及死亡的黄病毒属病毒。国内已有多位学者报道该病毒对鸭、鹅、鸡等家禽均有致病力（黄欣梅，李 银，赵冬敏等. 新型鹅黄病毒JS804毒株的分离与鉴定.江苏农业学报，2011,27（2）：354-360；Jingliang Su，Shuang Li， Xudong Hu，et al. Duck egg-drop syndrome caused by BYD virus, a new Tembusu-related Flavivirus. PLoS One. 2011, 6(3)；腾巧泱，颜丕熙，张旭等. 一种新的黄病毒导致蛋鸭产蛋下降及死亡. 中国动物床染病学报，2010,18（6）：1-4； 陈仕龙，陈少莺，王劭等. 一种引起蛋鸡产蛋下降的新型黄病毒的分离与初步鉴定.福建农业学报，2011，26（2）：170-174）。作为一种新发疫病，该病可造成种(蛋)家禽产蛋量大幅降低甚至绝产，商品肉用家禽大批死亡，给家禽尤其是鸭鹅养殖业造成重大的经济损失。基因序列分析结果表明：禽黄病毒与黄病毒属Ntaya病毒群的坦布苏病毒（Tembusu virus）亲缘关系最高。
目前，禽黄病毒感染诊断方法主要有病毒分离法、RT-PCR、套式RT-PCR和基于TaqMan探针的实时荧光定量PCR。这些方法特异性强、敏感性好，但是这些方法均需昂贵的仪器设备和试剂，且要求操作人员技术熟练。不仅不便进行大批量的临床样品的检测，而且不利于基层单位的使用和推广。血清学检测抗体可用间接ELISA方法，用纯化的全病毒作为包被抗原存在病毒培养产量低、纯化困难，生产成本太高等缺点，不利于商品化诊断试剂盒的研究和开发。
病毒的囊膜蛋白（E蛋白）是黄病毒属病毒表面最重要的结构蛋白，全长500个氨基酸左右，与病毒的嗜细胞性、毒力、血清特异性、膜融合等生物活性密切相关，是引起宿主保护性免疫反应的主要抗原。因此E蛋白可以作为检测抗体的诊断抗原应用于该病毒的血清学检测。
本发明选取禽黄病毒的囊膜蛋白（E蛋白）基因，通过克隆表达，以纯化的E蛋白作为包被抗原，采用间接ELISA模式，研制出检测禽黄病毒血清抗体方法。该方法操作简单，耗时短，成本低，高通量。
发明内容：
技术问题
本发明的目的是提供一种用基因工程方法生产，可为禽黄病毒感染后特异IgG抗体检测提供成本低、特异性好的抗原，即重组禽黄病毒E蛋白。
本发明的第二个目的是提供一种重组禽黄病毒E蛋白在检测禽黄病毒感染或免疫后特异IgG抗体中的应用。
本发明的第三个目的是提供一种重组禽黄病毒E蛋白在制备单抗、多抗、疫苗及蛋白芯片中的应用。
技术方案
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种编码禽黄病毒E蛋白的重组基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。同时提供了由该重组基因序列编码的重组禽黄病毒E蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
一种重组禽黄病毒E蛋白的表达载体，它是将SEQ ID NO:1所示的重组基因序列插入到质粒pET-32a中得到的重组质粒pET-32a-E，其质粒图谱如附图1所示。将表达载体pET-32a-E导入大肠杆菌中，得到表达重组禽黄病毒E蛋白的工程菌株。
用IPTG诱导含有表达载体pET-32a-E的工程菌进行蛋白表达，表达产物通过包涵体的提取、变性、纯化、复性，得到可以作为检测抗原的纯化重组禽黄病毒E蛋白。
本发明所建立的检测禽黄病毒感染后特异IgG抗体间接ELISA方法，是将重组禽黄病毒E蛋白基因克隆至表达载体pET-32a中，在大肠杆菌中表达，表达蛋白经包涵体的提取、变性、纯化、复性后用作抗原，用于间接ELISA检测动物血清抗体。
用重组禽黄病毒E蛋白制备的检测禽黄病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒。该试剂盒用于间接ELISA检测动物血清抗体，操作方法包括如下步骤：
1. 包被：用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液稀释包被抗原包被96孔ELISA板（丹麦NUNC公司），检测孔重组禽黄病毒E蛋白包被量为4.375μg/孔，在4℃条件下过夜包被，甩干后用PBST（0.05M pH7.4 PBS +0.05%吐温-20，下同）洗涤2次；
2. 封闭：封闭液为含1%牛血清白蛋白（BSA ）的PBST，300μL/孔，37℃条件下封闭2小时后甩干，用PBST洗涤3次；
3. 血清作用条件：血清样品稀释液为PBST，将待检血清样品及阳性和阴性对照用血清做400倍稀释，每孔加入100μL，37℃条件下孵育1小时后甩干，用PBST洗涤3次；
4. 酶标二抗作用条件：
a. 检测鸭血清抗体：将辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭抗体（美国KPL公司）用PBST做400倍稀释，100μL/孔，37℃条件下孵育1小时后甩干，用PBST洗涤3次；
b. 检测鸡血清抗体：将辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡抗体（购自美国EarthOx公司）用PBST做5000倍稀释，100μL/孔，37℃条件下孵育1小时后甩干，用PBST洗涤3次；
5. 底物显色：TMB底物（购自武汉博士德公司）100μL/孔，37℃条件下作用10 min，再加入2 M硫酸100μL/孔，终止反应。
6. 读数：采用酶标仪吸光度450nm下读取数据。
7. 结果判定标准：当参考阳性血清OD值≥0.75，参考阴性血清OD值＜0.25，同时参考阴性血清OD值/参考阳性血清OD值＜0.2，表明阴阳性对照成立。以待检样本OD值与参考阴性血清OD值的比值S/N≥2.1判为阳性。
参考血清的确定：参考阳性血清为经禽黄病毒免疫获得的鸡/鸭阳性血清（OD450nm值≥0.75）；参考阴性血清为经筛选获得的SPF鸡/鸭阴性血清（OD450nm值＜0.2）；
所述的重组禽黄病毒E蛋白可以在制备单抗、多抗、疫苗或蛋白芯片中得到应用。
有益效果
1. 本发明选择原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒进行融合表达并纯化以制备抗原，解决了禽黄病毒纯化困难的问题。
2. 本发明首次利用分子生物学基因克隆表达技术，获取禽黄病毒重组E蛋白，以该重组蛋白为抗原建立起间接ELISA。重组E蛋白为非全病毒抗原，安全性好，不含无关杂蛋白，不与其它病毒阳性血清发生交叉反应。具有良好的抗原性，因此具有很高的特异性和敏感性。
3. 本发明建立的检测禽黄病毒感染后特异IgG抗体间接ELISA方法，成本低廉、操作简便、快速，尤其适合批量样品的检测，填补了国内外空白。
附图说明
图1是表达质粒pET-32a-E的构建流程图；
图2是禽黄病毒E基因的RT-PCR扩增产物电泳分析图，其中1表示E基因RT-PCR扩增产物，M表示DL2000标准分子量；
图3是表达质粒pET-32a-E酶切鉴定图，图中1、2分别表示两个阳性菌的酶切鉴定结果，M表示DL2000标准分子量；
图4是诱导表达蛋白的SDS-PAGE分析图，其中M表示蛋白分子质量标准，1~7分别表示重组菌pET-32a-E诱导前、诱导1h、2h、3h、4h、5h、6h的蛋白图，8表示空载体pET-32a诱导对照；
图5是重组禽黄病毒E蛋白纯化电泳图，其中M表示蛋白分子质量标准，1表示空载体pET-32a诱导对照，2表示重组菌pET-32a-E诱导6h的蛋白图，3表示pET-32a-E诱导菌裂解后上清，4表示pET-32a-E诱导菌裂解后沉淀，5表示纯化的重组E蛋白。
具体实施方式：以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围。
实施例1 重组禽黄病毒E蛋白的制备
1.1 特异性引物设计与合成
应用Primer Premier5.0引物分析软件，根据GenBank收录禽黄病毒JS804株全基因序列（GenBank登录号：JF895923）中E基因序列，设计了一对特异性引物，在上游引物中设有BamHⅠ限制性内切酶位点，在下游引物中设有EcoRⅠ限制性内切酶位点，预计扩增片段长度为1444bp。引物序列为：上游引物：5′-GTGGATCCATGCAGAACCGAGAC-3′(SEQ ID NO:3)，下游P2：5′-GTGAATTCAATGGATCTGTCCCT-3′(SEQ ID NO:4)。上、下游引物均由南京金斯瑞公司合成。
1.2 禽黄病毒E基因的克隆
使用Axygen公司的体液病毒总RNA提取试剂盒，直接从感染禽黄病毒JS804株（黄欣梅，李 银，赵冬敏等. 新型鹅黄病毒JS804毒株的分离与鉴定.江苏农业学报，2011,27（2）：354-360）的BHK21细胞（上海晶科生物有限公司）中提取RNA，操作按试剂盒说明书进行。
以随机引物（大连宝生物公司）为反转录引物，对所提取的RNA进行反转录合成cDNA。反转录体系为：病毒RNA 11.5 μL， 5×AMV Buffer 4.0 μL， dNTP（10.0mmol/μL）2.0 μL，随机引物1.0 μL， RNase inhibitor（20U / μL）0.5μL， AMV 反转录酶（10U / μL）1.0 μL，共20.0μL，将上述反应混合物于离心机上稍作离心，然后在PCR仪（TaKaRa公司）上42℃反应1h，94℃加热5min停止反应。
以cDNA为模板进行PCR扩增，反应体系为：10×PCR Buffer 2.5 μL、MgCl2 （25mol/L）1.5μL、dNTP（2.5mol/L） 2.0μL、上、下游引物各1.0 μL、模板（cDNA）2.5μL、Ex Taq酶（5U/μL）0.25 μL、加水补足至25.0μL。混匀后置PCR仪（TaKaRa公司）中，PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环，然后72℃延伸10min。
取10μL PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳后，紫外线下观察目的条带大小约为1444bp，与预期相符（如图2所示）。切下目的条带，用胶回收试剂盒（Axygen公司）将目的基因回收纯化，并与pMD18-T克隆载体（大连宝生物公司）连接成重组质粒pMD18-T-E，转化大肠杆菌DH5α感受态细菌，涂于含有氨苄青霉素的LB培养基上，37℃温箱培养12-16 h。挑取单菌落扩大培养，用质粒提取试剂盒（Axygen公司）提取质粒，用BamHⅠ、EcoRⅠ进行双酶切鉴定，挑选阳性重组质粒送南京金斯瑞公司进行基因序列测定。
1.3 表达载体pET-32a-E的构建及鉴定
表达质粒构建过程如附图1所示。表达载体pET-32a质粒购自Novagen公司。用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ分别酶切重组质粒pMD18-T-E和pET32a质粒，用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，用胶回收试剂盒（Axygen公司）分别切胶回收pET-32a线性质粒和大小约为1444bp的E基因目的片段。用T4 DNA连接酶将E基因与pET-32a线性质粒进行连接，然后将连接产物转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，涂布于含氨苄青霉素的固体LB平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落接种于含氨苄青霉素的液体LB培养基中，振荡培养后提取质粒，经双酶切鉴定筛选阳性质粒pET-32a-E（如图3所示）。
1.4 重组表达载体pET-32a-E在大肠杆菌中的诱导表达
将鉴定正确的含有阳性重组质粒pET-32a-E菌落接种于含100 μg/mL 氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，将培养的菌液按1:100的比例接种于含100 μg/mL 氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.4～0.6左右，加入IPTG，使终浓度为1mM，进行诱导表达，分别收集0h、1h、2h、3h、4h、5h、6h的菌液各1mL，离心收集菌体，用12%SDS-PAGE进行分析。对pET-32a空质粒转化的BL21菌也以相同条件诱导，作为对照。结果表明重组蛋白分子量约为70 kD，与预期结果相符，以诱导后6h表达量最大（如图4所示）。
离心收集诱导培养50 mL的菌体重悬于细胞裂解液（50mM Tris-Cl，2 mM EDTA，100mM NaCl，pH 8.0）中，在冰浴中超声波破碎细菌，功率50W，超声10sec、间隔10sec，40个循环，12000 rpm离心5min，分别收集碎菌上清和沉淀，12%SDS-PAGE分析表达蛋白在菌体中的分布。结果表明重组蛋白以包涵体形式存在（如图5所示）。
1.5 重组禽黄病毒E蛋白的纯化
按1∶100比例将培养过夜的含有pET-32a-E的BL21菌接种到新的含100 μg/mL 氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养至OD600=0.4～0.6左右，加入IPTG，使终浓度为1mM，诱导表达6h，5000 rpm离心5min收集细菌，将每克湿菌重悬于3 mL细胞裂解液（50mM Tris-Cl，2 mM EDTA，100mM NaCl，pH 8.0）中。加入终浓度为1.0mg/mL溶菌酶，37℃作用30min。在冰浴中超声波破碎细菌（300W，工作10s、间隔10s，80个循环）。12, 000 rpm离心15min后弃上清。用包涵体洗涤缓冲液（50mM Tris-Cl，10 mM EDTA，100mM NaCl，0.5% Triton X-100，pH 8.0）洗涤沉淀3次。12, 000 rpm离心10min收集包涵体沉淀。取包涵体参照Novagen公司High-Affinity Ni-NTA Resin试剂盒说明书进行蛋白纯化。取回收蛋白质样品加2×SDS凝胶上样缓冲液煮沸处理5 min后，进行SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，经薄层扫描鉴定纯度为95%。（如图5所示）。
1.6 纯化后重组禽黄病毒E蛋白的复性
将纯化的蛋白在4℃条件下分别在含6M、4M、2M、1M尿素的PBS缓冲液及PBS缓冲液中依次进行透析，每8h更换1次透析液。复性结束后置于－20℃保存。复性后蛋白样品采用分光光度仪测定蛋白质浓度为2.1mg/mL。
实施例2 以重组禽黄病毒E蛋白建立间接ELISA
取纯化后重组禽黄病毒E蛋白做包被抗原建立间接ELISA，采用方阵法摸索间接ELISA最佳蛋白包被浓度、血清稀释浓度以及ELISA最佳反应条件。最终确定条件如下：
1. 包被：以包被缓冲液（0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6）将纯化的重组E蛋白稀释至工作浓度，加入96孔酶标板，每孔100μL。重组禽黄病毒E蛋白包被量为4.375μg/孔，在4℃条件下过夜包被，甩干后用PBST（0.05M pH7.4 PBS +0.05%吐温-20）洗涤2次；
2. 封闭：封闭液为含1%牛血清白蛋白（BSA ）的PBST，每孔加入300μL，37℃条件下封闭2小时后甩干，用PBST洗涤3次；
3. 血清作用条件：血清样品稀释液为PBST，将待检血清样品及阳性和阴性对照血清做400倍稀释，每孔加入100μL，37℃条件下孵育1小时后甩干，用PBST洗涤3次；
4. 酶标二抗作用条件：
a. 检测鸭血清抗体：将辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭抗体用PBST做400倍稀释，100μL/孔，37℃条件下孵育1小时后甩干，用PBST洗涤3次；
b. 检测鸡血清抗体：将辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡抗体用PBST做5000倍稀释，100μL/孔，37℃条件下孵育1小时后甩干，用PBST洗涤3次；
5. 底物显色：每孔加入100μL TMB底物，37℃条件下作用10 min，再加入2 M硫酸100μL/孔，终止反应。
6. 读数：采用酶标仪吸光度450nm下读取数据。
7. 参考血清的确定：参考阳性血清为经禽黄病毒免疫获得的鸡/鸭阳性血清（OD450nm值≥0.75）；参考阴性血清为经筛选获得的SPF鸡/鸭阴性血清（OD450nm值＜0.2）。
8. 结果判定标准：当参考阳性血清OD值≥0.75，参考阴性血清OD值＜0.25，同时参考阴性血清OD值/参考阳性血清OD值＜0.2，表明阴阳性对照成立。以待检样本OD值与参考阴性血清OD值的比值S/N≥2.1判为阳性。
因禽黄病毒可感染鸡、鸭、鹅、小鼠等不同宿主，采用针对不同动物的酶标二抗可检测相应动物体内的禽黄病毒抗体。
实施例3间接ELISA方法性能检测实验
3.1 特异性试验
用重组禽黄病毒E蛋白建立的间接ELISA方法分别检测新城疫、禽流感、减蛋综合征、传染性喉气管炎、传染性法氏囊病、鸡传染性支气管炎等阳性血清，每个样本做2个重复，进行交叉反应性测定，结果均为阴性，表明该方法与上述病毒抗体无交叉反应。
3.2 重复性试验
板内重复试验：以抗原最适浓度包被的同一块酶标板对5份阳性样品和5份阴性样品重复检测4次，并设立标准阳性和标准阴性血清对照，；
板间重复试验：用4块抗原最适浓度包被好的酶标板，在相同条件下的不同时间内对5份阳性样品和5份阴性样品进行检测，每块板均设立标准阴、阳性血清对照；
分别测定其变异系数CV%（CV＝SD/X×100%，SD：标准差，X：算术平均值）。结果表明，板内板间变异系数均小于5%，说明此方法的重复性良好。
3.3敏感性试验
抗原按最佳包被浓度和条件进行包被，将禽黄病毒阳性血清分别做1∶100～1∶12 800 倍比稀释，按最适反应条件进行间接ELISA。结果显示，1∶6 400 稀释后仍可检测为阳性，说明此方法敏感性较高。
3.3 对比试验
目前市场上暂无检测禽黄病毒抗体的检测试剂盒。琼脂扩散试验(AGP)以纯化的禽黄病毒为抗原可以用来检测相应的抗体，准确性较好。但AGP存在病毒纯化困难、敏感性低等缺点。应用建立的间接ELISA 方法与琼脂扩散试验比较，对80 份来自江苏、安徽等地鸭血清样品进行检测，检测结果见表1，两者的阳性符合率为100 %，阴性符合率为94.74 %，总符合率为52.50 %。
表1 与琼脂扩散试验（AGP）对比
| 阳性 | 阴性 | 总数 | |
| AGP | 24 | 56 | 80 |
| 间接ELISA | 61 | 19 | 80 |
| 符合数 | 24 | 18 | 42 |
| 符合率（%） | 100.00 | 94.74 | 52.50 |
SEQ ID NO:1禽黄病毒E基因
cagaaccgag actttgttga gggagtgaat ggtgttgagt ggatcgatgt cgttctggaa 60
ggaggcccat gtgtgaccat tacggcaaaa gacaggccga ccatagacgt caagatgatg 120
aacatggagg ctacggaatt agcggttgtg agatcttact gctatgagcc gagagtgtcg 180
gacgtgacga cagaatccag atgcccaacc atgggagagg ctcataatcc caaggcaact 240
tatgctgaat acatatgcaa aaaagatttt gtggacaggg gttggggcaa tggctgtggc 300
ttgtttggaa aggggagcat acagacatgt gccaagtttg actgcacaaa gaaagcagaa 360
ggcaggattg tgcagaagga aaacgtccag tttgaagttg cagttttcat acatggttcc 420
acggaagcga gcacctacca caattattca gcccagcagt cgctgaaaca tgccgctaga 480
ttcgttataa cgcccaaaag tcccgtctac accgctgaga tggaggatta tggtaccgtc 540
acactcgaat gtgaaccccg atctggggtt gacatggggc aattctatgt ctttaccatg 600
aacacaaaaa gctggcttgt taacagagac tggtttcatg atctcaactt accatggaca 660
gggtcatcag cggggacgtg gcaaaacaaa gagtcattga tagaatttga ggaggcccac 720
gccaccaaac aatcagtggt ggctttggca tcacaagaag gagccctcca tgcagcattg 780
gcgggagcta ttccagtgaa gtactctgga agcaaattgg aaatgacctc aggtcatctt 840
aaatgcaggg ttaaaatgca gggtttgaag ctgaaaggaa tgacctaccc gatgtgtagc 900
aatacatttt ccctagtgaa gaatcctacc gacactgggc atggcactgt cgtggtggaa 960
ttgtcttatg caggtaccga tgggccctgt agagttccca tatccatgtc ggcagatctg 1020
aatgacatga caccagttgg acgcttgata acagtcaacc catacgtgtc gacctcctcc 1080
acgggtgcca agataatggt ggaagtggaa cctccattcg gggattcatt catcttagta 1140
ggaagtggaa aaggacagat caggtaccag tggcatagaa gtgggagcac aattggaaaa 1200
gcttttacgt caacactcaa aggagcacaa aggatggttg ctttgggtga cactgcatgg 1260
gattttggct cagttggggg tgtactcact tccattggga aaggcattca tcaggttttc 1320
ggctcagcat ttaaaagctt atttggagga atgtcatgga ctactcaagg catgttgggg 1380
gcactgctat tgtggatggg gctgaatgca agggacagat ccatt 1425
SEQ ID NO:2禽黄病毒E蛋白氨基酸序列
GlnAsnArgAspPheValGluGlyValAsnGlyValGluTrpIle
1 5 10 15
AspValValLeuGluGlyGlyProCysValThrIleThrAlaLys
20 25 30
AspArgProThrIleAspValLysMetMetAsnMetGluAlaThr
35 40 45
GluLeuAlaValValArgSerTyrCysTyrGluProArgValSer
50 55 60
AspValThrThrGluSerArgCysProThrMetGlyGluAlaHis
65 70 75
AsnProLysAlaThrTyrAlaGluTyrIleCysLysLysAspPhe
80 85 90
ValAspArgGlyTrpGlyAsnGlyCysGlyLeuPheGlyLysGly
95 100 105
SerIleGlnThrCysAlaLysPheAspCysThrLysLysAlaGlu
110 115 120
GlyArgIleValGlnLysGluAsnValGlnPheGluValAlaVal
125 130 135
PheIleHisGlySerThrGluAlaSerThrTyrHisAsnTyrSer
140 145 150
AlaGlnGlnSerLeuLysHisAlaAlaArgPheValIleThrPro
155 160 165
LysSerProValTyrThrAlaGluMetGluAspTyrGlyThrVal
170 175 180
ThrLeuGluCysGluProArgSerGlyValAspMetGlyGlnPhe
185 190 195
TyrValPheThrMetAsnThrLysSerTrpLeuValAsnArgAsp
200 205 210
TrpPheHisAspLeuAsnLeuProTrpThrGlySerSerAlaGly
215 220 225
ThrTrpGlnAsnLysGluSerLeuIleGluPheGluGluAlaHis
230 235 240
AlaThrLysGlnSerValValAlaLeuAlaSerGlnGluGlyAla
245 250 255
LeuHisAlaAlaLeuAlaGlyAlaIleProValLysTyrSerGly
260 265 270
SerLysLeuGluMetThrSerGlyHisLeuLysCysArgValLys
275 280 285
MetGlnGlyLeuLysLeuLysGlyMetThrTyrProMetCysSer
290 295 300
AsnThrPheSerLeuValLysAsnProThrAspThrGlyHisGly
305 310 315
ThrValValValGluLeuSerTyrAlaGlyThrAspGlyProCys
320 325 330
ArgValProIleSerMetSerAlaAspLeuAsnAspMetThrPro
335 340 345
ValGlyArgLeuIleThrValAsnProTyrValSerThrSerSer
350 355 360
ThrGlyAlaLysIleMetValGluValGluProProPheGlyAsp
365 370 375
SerPheIleLeuValGlySerGlyLysGlyGlnIleArgTyrGln
380 385 390
TrpHisArgSerGlySerThrIleGlyLysAlaPheThrSerThr
395 400 405
LeuLysGlyAlaGlnArgMetValAlaLeuGlyAspThrAlaTrp
410 415 420
AspPheGlySerValGlyGlyValLeuThrSerIleGlyLysGly
425 430 435
IleHisGlnValPheGlySerAlaPheLysSerLeuPheGlyGly
440 445 450
MetSerTrpThrThrGlnGlyMetLeuGlyAlaLeuLeuLeuTrp
455 460 465
MetGlyLeuAsnAlaArgAspArgSerIle
470 475
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种重组禽黄病毒E蛋白及其应用
<130> 0
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1425
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 重组禽黄病毒E基因
<222> (1)..(1425)
<223>
<400> 1
cagaaccgag actttgttga gggagtgaat ggtgttgagt ggatcgatgt cgttctggaa 60
ggaggcccat gtgtgaccat tacggcaaaa gacaggccga ccatagacgt caagatgatg 120
aacatggagg ctacggaatt agcggttgtg agatcttact gctatgagcc gagagtgtcg 180
gacgtgacga cagaatccag atgcccaacc atgggagagg ctcataatcc caaggcaact 240
tatgctgaat acatatgcaa aaaagatttt gtggacaggg gttggggcaa tggctgtggc 300
ttgtttggaa aggggagcat acagacatgt gccaagtttg actgcacaaa gaaagcagaa 360
ggcaggattg tgcagaagga aaacgtccag tttgaagttg cagttttcat acatggttcc 420
acggaagcga gcacctacca caattattca gcccagcagt cgctgaaaca tgccgctaga 480
ttcgttataa cgcccaaaag tcccgtctac accgctgaga tggaggatta tggtaccgtc 540
acactcgaat gtgaaccccg atctggggtt gacatggggc aattctatgt ctttaccatg 600
aacacaaaaa gctggcttgt taacagagac tggtttcatg atctcaactt accatggaca 660
gggtcatcag cggggacgtg gcaaaacaaa gagtcattga tagaatttga ggaggcccac 720
gccaccaaac aatcagtggt ggctttggca tcacaagaag gagccctcca tgcagcattg 780
gcgggagcta ttccagtgaa gtactctgga agcaaattgg aaatgacctc aggtcatctt 840
aaatgcaggg ttaaaatgca gggtttgaag ctgaaaggaa tgacctaccc gatgtgtagc 900
aatacatttt ccctagtgaa gaatcctacc gacactgggc atggcactgt cgtggtggaa 960
ttgtcttatg caggtaccga tgggccctgt agagttccca tatccatgtc ggcagatctg 1020
aatgacatga caccagttgg acgcttgata acagtcaacc catacgtgtc gacctcctcc 1080
acgggtgcca agataatggt ggaagtggaa cctccattcg gggattcatt catcttagta 1140
ggaagtggaa aaggacagat caggtaccag tggcatagaa gtgggagcac aattggaaaa 1200
gcttttacgt caacactcaa aggagcacaa aggatggttg ctttgggtga cactgcatgg 1260
gattttggct cagttggggg tgtactcact tccattggga aaggcattca tcaggttttc 1320
ggctcagcat ttaaaagctt atttggagga atgtcatgga ctactcaagg catgttgggg 1380
gcactgctat tgtggatggg gctgaatgca agggacagat ccatt 1425
<210> 2
<211> 475
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<221> 重组禽黄病毒E蛋白氨基酸序列
<222> (1)..(475)
<223>
<400> 2
Gln Asn Arg Asp Phe Val Glu Gly Val Asn Gly Val Glu Trp Ile Asp
1 5 10 15
Val Val Leu Glu Gly Gly Pro Cys Val Thr Ile Thr Ala Lys Asp Arg
20 25 30
Pro Thr Ile Asp Val Lys Met Met Asn Met Glu Ala Thr Glu Leu Ala
35 40 45
Val Val Arg Ser Tyr Cys Tyr Glu Pro Arg Val Ser Asp Val Thr Thr
50 55 60
Glu Ser Arg Cys Pro Thr Met Gly Glu Ala His Asn Pro Lys Ala Thr
65 70 75 80
Tyr Ala Glu Tyr Ile Cys Lys Lys Asp Phe Val Asp Arg Gly Trp Gly
85 90 95
Asn Gly Cys Gly Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ile Gln Thr Cys Ala Lys
100 105 110
Phe Asp Cys Thr Lys Lys Ala Glu Gly Arg Ile Val Gln Lys Glu Asn
115 120 125
Val Gln Phe Glu Val Ala Val Phe Ile His Gly Ser Thr Glu Ala Ser
130 135 140
Thr Tyr His Asn Tyr Ser Ala Gln Gln Ser Leu Lys His Ala Ala Arg
145 150 155 160
Phe Val Ile Thr Pro Lys Ser Pro Val Tyr Thr Ala Glu Met Glu Asp
165 170 175
Tyr Gly Thr Val Thr Leu Glu Cys Glu Pro Arg Ser Gly Val Asp Met
180 185 190
Gly Gln Phe Tyr Val Phe Thr Met Asn Thr Lys Ser Trp Leu Val Asn
195 200 205
Arg Asp Trp Phe His Asp Leu Asn Leu Pro Trp Thr Gly Ser Ser Ala
210 215 220
Gly Thr Trp Gln Asn Lys Glu Ser Leu Ile Glu Phe Glu Glu Ala His
225 230 235 240
Ala Thr Lys Gln Ser Val Val Ala Leu Ala Ser Gln Glu Gly Ala Leu
245 250 255
His Ala Ala Leu Ala Gly Ala Ile Pro Val Lys Tyr Ser Gly Ser Lys
260 265 270
Leu Glu Met Thr Ser Gly His Leu Lys Cys Arg Val Lys Met Gln Gly
275 280 285
Leu Lys Leu Lys Gly Met Thr Tyr Pro Met Cys Ser Asn Thr Phe Ser
290 295 300
Leu Val Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Val Glu
305 310 315 320
Leu Ser Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Arg Val Pro Ile Ser Met
325 330 335
Ser Ala Asp Leu Asn Asp Met Thr Pro Val Gly Arg Leu Ile Thr Val
340 345 350
Asn Pro Tyr Val Ser Thr Ser Ser Thr Gly Ala Lys Ile Met Val Glu
355 360 365
Val Glu Pro Pro Phe Gly Asp Ser Phe Ile Leu Val Gly Ser Gly Lys
370 375 380
Gly Gln Ile Arg Tyr Gln Trp His Arg Ser Gly Ser Thr Ile Gly Lys
385 390 395 400
Ala Phe Thr Ser Thr Leu Lys Gly Ala Gln Arg Met Val Ala Leu Gly
405 410 415
Asp Thr Ala Trp Asp Phe Gly Ser Val Gly Gly Val Leu Thr Ser Ile
420 425 430
Gly Lys Gly Ile His Gln Val Phe Gly Ser Ala Phe Lys Ser Leu Phe
435 440 445
Gly Gly Met Ser Trp Thr Thr Gln Gly Met Leu Gly Ala Leu Leu Leu
450 455 460
Trp Met Gly Leu Asn Ala Arg Asp Arg Ser Ile
465 470 475
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 用于扩增禽黄病毒E基因的上游引物：
<222> (1)..(23)
<223>
<400> 3
gtggatccat gcagaaccga gac 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<221> 用于扩增禽黄病毒E基因的下游引物：
<222> (1)..(23)
<223>
<400> 4
gtgaattcaa tggatctgtc cct 23
Claims (6)
1.一种编码禽黄病毒E蛋白的重组基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种重组禽黄病毒E蛋白，其特征在于，该蛋白由权利要求1所述的重组基因序列编码，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
3. 一种重组禽黄病毒E蛋白的表达载体，其特征在于，该表达载体是将SEQ ID NO:1所示的重组基因序列插入到质粒pET-32a中得到的重组质粒pET-32a-E。
4.一种表达重组禽黄病毒E蛋白的工程菌株，其特征在于，该菌株含有权利要求3所述的表达载体pET-32a-E，宿主菌为大肠杆菌BL21（DE3）。
5.用权利要求2所述重组禽黄病毒E蛋白制备的检测禽黄病毒IgG抗体的间接ELISA试剂盒。
6.按照权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的操作方法包括如下步骤：
(1) 包被：用pH9.6的0.05M碳酸盐缓冲液稀释包被抗原包被96孔ELISA板，检测孔重组禽黄病毒E蛋白包被量为4.375μg/孔，在4℃条件下过夜包被，甩干后用PBST洗涤2次；
(2) 封闭：封闭液为含1%BSA 的PBST，300μL/孔，37℃条件下封闭2小时后甩干，用PBST洗涤3次；
(3) 血清作用条件：血清样品稀释液为PBST，将待检血清样品及阳性和阴性对照血清做400倍稀释，每孔加入100μL，37℃条件下孵育1小时后甩干，用PBST洗涤3次；
(4) 酶标二抗作用条件：
a. 检测鸭血清内抗体：将辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭抗体用PBST做400倍稀释，100μL/孔，37℃条件下孵育1小时后甩干，用PBST洗涤3次；
b. 检测鸡血清内抗体：将辣根过氧化物酶标记的兔抗鸡抗体用PBST做5000倍稀释，100μL/孔，37℃条件下孵育1小时后甩干，用PBST洗涤3次；
(5) 底物显色：TMB底物100μL/孔，37℃条件下作用10 min，再加入2 M硫酸100μL/孔，终止反应；
(6) 读数：采用酶标仪吸光度450nm下读取数据；
(7) 参考血清的确定：参考阳性血清为经禽黄病毒免疫获得的鸡/鸭阳性血清OD450nm值≥0.75；参考阴性血清为经筛选获得的SPF鸡/鸭阴性血清OD450nm值＜0.2；
(8) 结果判定标准：当参考阳性血清OD值≥0.75，参考阴性血清OD值＜0.25，同时参考阴性血清OD值/参考阳性血清OD值＜0.2，表明阴阳性对照成立；以待检样本OD值与参考阴性血清OD值的比值S/N≥2.1判为阳性。
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| 猪圆环病毒2型抗体检测间接ELISA方法的建立;丛丽媛 等;《中国兽医学报》;20080831;第28卷(第8期);第893页 * |
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