CN1936014B - H5亚型高致病性禽流感病毒血凝素蛋白及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种H5亚型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白，属于生物技术领域，特别是涉及一种H5亚型禽流感病毒基因抗原蛋白。本发明提供一种能有效检测致病致死率极高的禽流感H5亚型的HA抗体的H5亚型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白。本发明首先将pUCM-TH5HA质粒由BamH I、EcoRV双酶切，得到的pPIC9K质粒由EcoR I线性化，再经T₄连接酶连接获得质粒pPIC9K-H5HA；用SalI线性化pPIC9K-H5HA重组质粒，经过一系列工作后即得到H5HA抗原蛋白。本发明表达量高、特异性强、易于纯化、具有完整的空间构象等特点完全符合ELISA快速检测试剂盒的鉴定要求。

Description

H5亚型高致病性禽流感病毒血凝素蛋白及其制备方法

技术领域：

本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种AIV亚型抗原蛋白——H5HA蛋白。

背景技术：

禽流感(Avian Influenza，AI)是由A型流感病毒引起的一种家禽和野禽的感染和/或疾病综合征。AIV具有高度变异性，基于血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)两种表面抗原的抗原性不同，可分为不同的亚型，目前已发现HA亚型15个、NA亚型9个。根据流感病毒核蛋白(Nucleoprotein，NP)和基质蛋白(Matrix proteins，M)抗原性的不同，将流感病毒分为三个血清型，即A、B、C型(或称甲、乙、丙型)，各型之间可以通过AGP试验、补体结合试验等检测区分。所有AIV均为A型流感病毒。

自Perroncito于1878首次报道在意大利发生禽流感、1959年发生高致病性禽流感以来，全球至少有23次大规模的暴发与流行，每次都造成重大经济损失。目前世界许多国家和地区均有本病的暴发和流行。该病被世界动物卫生组织(OIE)规定为A类传染病。我国也将其列为一类动物疫病。1997年香港禽流感事件中，H5N1 AIV首次突破种间障碍直接感染人并引起人死亡，打破了自然条件下仅有 H1、H2、H3亚型流感病毒可以感染人的常规，由此赋予了AIV全新的公共卫生意义。2003年末至2004年初，在韩国、日本、泰国、越南、中国大陆、中国台湾等国家和地区先后暴发了禽流感，毒株为H5N1亚型。2005年我国青海又发生了H5N1的感染，再次引起全世界对AI的广泛关注。

禽流感是严重威胁养禽业发展的病毒性烈性传染病。我国是世界第一养禽大国，养禽总量达100亿羽，近年，禽流感的发生与流行，在我国已造成了巨大的经济损失和严重的社会影响，尤其1997和1999年出现了禽流感病毒(AIV)直接感染人的事件，2003年末至2004年初，先后在东南亚国家和地区爆发了禽流感。2004年亚洲有53人感染禽流感病毒，41人死亡，禽流感引起全世界的广泛关注乃至恐慌。禽流感的公共卫生意义更引起世人的震撼和关注，其防制已直接关系到我国养禽业的持续稳定发展和人民的身体康。因而早期快速诊断和免疫抗体监测是禽流感防制的关键，具有重要意义。

目前，国内外对AIV早期诊断技术和检测技术的研究均取得了不同程度的进展。禽流感H5、H7、H9亚型多重实时荧光RT-PCR检测试剂盒在深圳研制成功；台湾中兴大学研发检测H5及H7抗体的酵素免疫吸附反应(ELISA)快速检验套组法，已可应用于大量血清检体筛检；汕头大学医学院、香港大学医学院联合流感研究中心与厦门大学合作研制出世界首个禽流感病毒H5N1快速诊断药盒试剂盒；韩国研制出一种可迅速确诊禽流感的简易诊断盒。同时，禽流感疫苗的研制也在广泛进行之中。这说明AIV的早期诊断、检测及防治方法的研究 已引起世界范围的关注。

对禽流感的诊断，目前主要有检查鸡血清抗体、禽流感病毒分离鉴定、核酸检测等方法。而直接检测禽流感病毒抗原的方法的，目前还没有相关研究。鉴于目前国内已开始广泛使用AIV灭活苗，检测血清抗体诊断本病已不可能；病毒分离需要接种敏感动物或培养细胞，存在耗时长、操作繁琐等缺点；免疫荧光需要荧光显微镜等设备，而且结果判断存在主观性；RT-PCR方法要求提取组织RNA，技术要求较高，不适于基层实验室操作。此外，上述方法均不便于进行大批量样品的检测，难以满足当前禽流感疫情发展的需要。酶联免疫吸附试验(ELISA)具有敏感、准确、快速、简单等其它方法无法比拟的优点，而该方法建立的瓶颈在于是否有大量具生物活性的、特异性的抗原蛋白。

技术内容：

本发明提供一种能有效检测致病致死率极高的禽流感H5亚型的HA抗体的H5亚型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白。

本发明首先将pUCM-TH5HA质粒由BamH I、EcoRV双酶切，经补平后回收得到目的片段；pPIC9K质粒由EcoR I线性化，两端分别补平、去磷后回收；将以上回收产物经T₄连接酶连接后即获得目的质粒pPIC9K-H5HA；再用Sal I线性化pPIC9K-H5HA重组质粒，线性化后将其电转化至GS115感受态中，再在MD平板中培养，而后挑取单个菌落于YPD培养基中复苏，提重组体基因组进行PCR鉴定，筛选出的阳性菌株于BMGY培养基中摇菌，离心后转至BMMY培养基中开始甲醇诱 导，产物离心后取上清，加入饱和硫酸铵沉淀蛋白，收集蛋白进行进一步纯化即得到H5HA抗原蛋白。

由上述方法所获得的H5亚型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白SEQ ID NO：1。

本发明的优点和积极效果为：

本发明开展了利用毕赤酵母真核表达系统表达制备用于HPAIV

ELISA快速检测的抗原蛋白的研究。由于HA具有免疫原性，为保护性抗原，其诱导的相应抗体称血凝抑制抗体，能抑制血凝现象和中和病毒的感染性，为保护性抗体，所以本发明以H5HA为研究对象，成功获得了针对H5HA抗体的抗原蛋白，经SDS-PAGE、间接ELISA检测，具良好生物活性。其表达量高、特异性强、易于纯化、具有完整的空间构象等特点完全符合ELISA快速检测试剂盒的鉴定要求。

1、发明得到的抗原蛋白，一方面可检测机体内AIV抗体；另一方面可辅助AIV检测工具的研制并为AIV新型基因工程疫苗的研制奠定了基础。

2、发明中所涉及的抗原蛋白，针对致病性最高的AIV亚型(H5HA)之一，针对性强，具有很重要的实践意义。

3、发明中所涉及的抗原蛋白，利用毕赤酵母真核表达系统，除具有良好的生物活性外，还可大量表达及纯化，易于产业化。

4、至今国内还没有利用酵母表达系统进行AIV亚型的表达，因此，本发表有极高的创新性。

附图说明：

图1是本发明pPIC9K-H5HA质粒构建图；

图2是本发明H5HA抗原蛋白真核表达及制备模式图。

具体实施方式：

本发明首先将pUCM-TH5HA质粒由BamH I、EcoRV双酶切，经补平后回收得到目的片段；pPIC9K质粒由EcoR I线性化，两端分别补平、去磷后回收；将以上回收产物经T₄连接酶连接后即获得目的质粒pPIC9K-H5HA；再用SalI线性化pPIC9K-H5HA重组质粒，线性化后将其电转化至GS115感受态中，28℃条件下再在MD平板中培养2～3天，而后挑取单个菌落于YPD培养基中复苏，提重组体基因组进行PCR鉴定，筛选出的阳性菌株于BMGY培养基中28℃条件下摇菌16～18h，离心后转至BMMY培养基中开始甲醇诱导，产物离心后取上清，加入饱和硫酸铵沉淀蛋白，使硫酸铵终浓度达到70％，收集蛋白进行进一步纯化即得到H5HA抗原蛋白。

由上述方法所获得的H5亚型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白SEQ ID NO：1。

下面叙述本发明的实施方法：

1、方法

1.1分子生物学常规的基因操作

大肠杆菌感受态细胞的制备与转化、质粒的提取及限制性内切酶消化、DNA

片段的回收、线性DNA片段的连接、重组质粒的筛选与鉴定、PCR扩增反应、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白印迹实验参照金冬雁、黎 孟枫等译《分子克隆实验指南》第二版，科学出版社(1992)相关章节进行。

1.2重组表达质粒pPIC9K-H5HA的构建

pUCM-TH5HA质粒由BamH I、EcoRV双酶切，经补平后回收得到目的片段；pPIC9K质粒由EcoR I线性化，两端分别补平、去磷后回收；将以上回收产物经T₄连接酶连接后即获得目的质粒pPIC9K-H5HA。

1.3酵母感受态细胞的制备

挑取巴斯德毕赤酵母菌GS115单个菌落至5ml YPD液体培养基中，30℃振摇过夜。次日转接到500ml新鲜YPD培养基中，30℃振摇培养至OD₆₀₀＝1.3～1.5。于4℃2500r/min离心5分钟，收集菌体。用冰预冷的无菌去离子水悬浮，洗涤2次，再用冰预冷的无菌1M的山梨醇洗涤一次，最后取沉淀用1/500体积冰预冷的无菌1M的山梨醇悬浮，制备成酵母感受态细胞，即可用于转化。

1.4重组工程菌的制备

将构建的重组表达质粒pPIC9K-H5HA用Sal I线性化，取5～20μg线性化的重组表达质粒与刚刚制备的GS115感受态细胞混合，用加样器将样品滴加于0.2cm电转杯两电极间，冰浴5min，用ECM830电转仪于电压300V，电容25μF，电阻200Ω条件下电转化。电击后，立即加入1ml 1M冰浴冷山梨醇，混匀，取200～600μl菌液涂布于MD选择平板上，30℃孵育2～3天，挑取单个菌落YPD扩菌后用玻璃珠法提取酵母基因组，以所提基因组为模板PCR扩增，挑选外源基因整合入酵母基因组内的阳性菌，然后对这些菌进行甲醇诱导表达，挑 选高表达菌株，同时对培养基和表达时氧饱和度等条件进行优化。

上游引物：5’-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3；

下游引物：5’-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3’。

1.5酵母工程菌株的甲醇诱导分泌表达

接种单个阳性菌株或甘油菌(-20℃保存)于100mlYPD培养基中，28～30℃，250rpm振荡培养约16～18h，5000rpm离心10min收菌，用100ml BMGY培养基重悬，28～30℃，250rpm摇瓶培养，使OD₆₀₀达到2～6(约16～18h)，离心收集菌体，沉淀用5～10倍体积的BMMY培养基重悬，28～30℃，250rpm继续振荡培养2～6d，并于诱导表达起始后，每隔24小时补加甲醇至总体积的0.5～1.0％，每隔24h取出1ml样品用于测试表达量。

1.6外源基因表达产物的SDS-PAGE分析

将工程酵母菌在BMMY培养基中培养一定时间后，5000rpm离心10min收集菌体和培养基上清，菌体采用直接煮沸裂解法在Loadingbuffer中裂解菌体蛋白，培养基上清中的表达蛋白装入透析袋中，先在PBS中4℃透析24h，用PEG20000进行10倍浓缩后，再在PBS中进行透析12h，取出浓缩产物与2倍Loading buffer等量混合，与裂解的酵母菌菌体蛋白一起进行SDS-PAGE，分析目的蛋白的表达。

1.7间接酶联免疫吸附试验(间接ELISA)

依据中华人民共和国国家标准(GB/T18936-2003)《高致病性禽流感诊断技术》中间接酶联免疫吸附试验方法，对所表达抗原进行测定。过程如下：除A1、B1、C1和D1孔不加样品，留做空白调零，pPIC9K 空载体表达产物和H5HA标准抗原分别作为阴性对照和阳性对照外，其余孔取1∶400稀释的被检蛋白，每孔100μl包被板，将加样位置做好记录。倒掉孔内包被液，用PBS洗三次。加入H5HA标准血清，将反应板盖好盖子后置37℃环境下作用30min。倒掉孔内液体，在吸水纸上空干，每孔加满洗液，静置1～2min后倒掉，空干，再重复洗2次。除A1、B1、C1和D1孔外，其他每孔加碱性磷酸酶标记的抗鸡二抗100μl，盖好盖子后置37℃环境下作用30min。用上述同样的方法再洗涤三次，加入底物使用液(碱性磷酸酶缓冲液中加入BCIP/NBT混合液)，每孔90μl，置室温避光显色2～3min，加入中止液(浓硫酸11.1ml+蒸馏水88.9ml)，每孔90μl，使其终止反应。用酶标仪测定每个孔在490nm波长的光密度值(即OD₄₉₀值)，OD≥0.2者判定为阳性，0.18≤OD＜0.2需重复测试1次，若仍在此范围则判为阳性，OD＜0.18者判定为阴性。

1.8表达条件的优化

根据毕赤酵母诱导表达时的特点，通过不同的溶解氧(95％、85％、75％、65％、55％)、培养时间(2d、3d、4d、5d)、甲醇浓度(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5.％)、转瓶转数(100、150、200、250)和pH值(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0)来优化表达条件。

1.9酵母转化子遗传稳定性分析

分别将阳性酵母转化子进行10个周期的菌体扩增和诱导表达，进行PCR鉴定及表达检测，分析外源基因是否丢失。

2、结果分析

2.1重组表达质粒pPIC9K-H5HA的构建

酶切鉴定图见说明书附图1，从图中可见，重组质粒pPIC9K-H5HA经Kpn I单酶切后，正向连接应出现8800、1600、612三条带，反向连接应出现8300、2100、612三条带；经Sac I单酶切后，正向连接应出现9000、2000两条带，反向连接应出现9500、1500两条带；经Sal I单酶切后线性化。证明构建正确。

2.2酵母重组子的PCR鉴定

PCR扩增结果见说明书附图2，从图中可见，GS115/pPIC9K-H5HA转化子扩增出1.9kb大小的带，正好与目的基因H5HA加分泌信号的大小相当，证明我们的目的基因已整合入酵母基因组中。

2.3表达产物的SDS-PAGE

将经筛选的转化子接种BMGY和BMMY培养基诱导表达后，表达上清用70％硫酸铵沉淀，取沉淀溶于原1/10体积的PBS(PH7.4)中，取样进行SDS-PAGE，其结果见说明书附图3。从说明书附图3可以看出，GS115/pPIC9K-H5HA转化子诱导产物在62kDa处出现与预计大小相符条带。

2.4表达条件优化结果

经系列优化，最终确定目标蛋白最佳表达条件是大于80％的溶解氧、1％甲醇诱导、培养4d、摇瓶转速大于200rpm、培养基pH值为6.0。最高表达量达培养液上清中可溶性蛋白的17％，约为47.9mg/L。

2.5遗传稳定性分析

将构建的酵母工程菌GS115/pPIC9K-H5HA接种在YPD液体培养基 和BMMY培养基中传代10次后，进行目的基因的PCR扩增和表达产物的检测。结果表明，酵母工程菌具有良好的遗传稳定性，能在多次传代后的酵母工程菌染色体中扩增出目的基因片段，用甲醇诱导后可在培养液上清中检测到目的蛋白的表达。

2.6间接ELISA实验结果

经ELISA检测，GS115/pPIC9K-H5HA表达产物测定值OD₄₉₀≥0.2，可判定为阳性；GS115/pPIC9K表达产物测定值OD₄₉₀＜0.18，可判定为阴性。证明所制备抗原蛋白具良好生物活性，能特异地中和H5HA抗体。

3、结论

通过以上方法实施，成功获得重组质粒pPIC9K-H5HA、酵母重组子GS115/pPIC9K-H5HA，并经甲醇诱导后可获得目的抗原蛋白H5HA，具生物学活性，可特异性地中和H5HA抗体。在甲醇诱导过程中，其表达条件不断优化可增加表达产物的产量。同时发现酵母转化子遗传稳定性较强。综上所述，本发明成功获得具有生物活性的H5HA抗原蛋白，其将在抗体检测、AIV基因工程疫苗的研制及AIV抗原检测制品的研制中均体现出重要的开发利用价值，其高效性和稳定性还为产业化制备提供良好前景。

序列表 

<110>金宁一 

<120>H5亚型高致病性禽流感病毒血凝素基因抗原蛋白 

<160>2 

<170>PatentIn version 3.2 

<210>1 

<211>1707 

<212>DNA 

<213>Avian 

<221>CDS 

<222>(1)..(1707) 

<400>1 

atg gag aga ata gtg ctt ctt ctt gca ata gtc agt ctt gtt aaa agt    48 

gat cag att tgc att ggt tac cat gca aac aac tcg aca gag cag gtt    96 

gac aca ata atg gaa aag aac gtt act gtt aca cat gcc caa gac ata    144 

ctg gaa aag aca cac aac ggg aag ctc tgc gat cta gat gga gtg aag    192 

cct cta att ttg aga gat tgt agt gta gct gga tgg ctc ctc gga aac    240 

cct atg tgt gac gaa ttc atc aat gtg ccg gaa tgg tct tac ata gtg    288 

gag aag gac agt cca gcc aat gac ctc tgt tac cca ggg gat ttc aac    336 

gac tat gaa gaa ctg aaa cac cta ttg agc aga ata aac cat ttt gag    384 

aaa att cag atc atc ccc aaa agt tct tgg tcc aat cat gaa gcc tca    432 

tca ggg gtg agc tca gca tgt cca tac aat ggg aag ccc tcc ttt ttc    480 

aga aat gtg gta tgg ctt att aaa aag aac agt gca tac cca aca ata    528 

aag agg agc tac aat aat acc aac caa gaa gat ctt ttg gta ctg tgg    576 

ggg att cac cat cct aat gat gcg gca gag cag aca aaa ctc tat caa    624 

aac cca acc acc tat att tcc gtt gga aca tca aca cta aac ctg aga    672 

ttg gtc cca aaa ata gct act aga tcc aaa gta aac ggg caa agt gga    720 

aga ata gag ttc ttc tgg aca att tta aaa ccg aat gat gcc atc aat    768 

ttc gag agt aat ggg aat ttc att gct cca gaa tat gca tac aaa att    816 

gtc aag aaa ggg gac tca gca att atg aaa agt gaa ttg gaa tat ggt    864 

aac tgc aac acc aag tgt caa act cca atg ggg gcg ata aac tct agt    912 

atg cca ttc cac aac ata cac cct ctc acc atc ggg gaa tgc ccc aaa    960 

tat gtg aaa tca aac aga tta gtc ctt gcg act ggg ctc aga aat acc    1008 

cct cat aga gag aga aga aga aaa aag aga gga cta ttt gga gct ata    1056 

gca ggt ttt ata gag gga gga tgg cag gga atg gta gat ggt tgg tat    1104 

ggg tac cac cat agc aat gag cag ggg agt gga tac gct gca gac aaa    1152 

gaa tcc gct caa aag gca ata gat gga gtc acc aat aag gtc aac tcg    1200 

atc att gac aaa atg aac act cag ttt gag gcc gtt gga cgg gaa ttt    1248 

aat aac tta gaa agg agg ata gaa aat tta aac aag aag atg gaa gac    1296 

gga ttc cta gat gtc tgg act tat aat gct gaa ctt ctg gtt ctc atg    1344 

gaa aat gag agg act cta gac ttt cat gac tca aat gtc agg aac ctt    1392 

tac gac aag gtc cga cta cag ctt agg gat aat gca aag gag ctg ggt    1440 

aat ggt tgt ttc gag ttc tat cac aaa tgt gat aat gaa tgt atg gaa    1488 

agt gta aaa aac gga acg tat gac tac ccg cag tat tca gaa gaa gca    1536 

aga cta aac aga gag gaa ata agt gga gta aaa ttg gaa tca atg gga    1584 

act tac caa ata ctg tca att tat tca aca gtg gcg agt tcc cta gca    1632 

ctg gca atc atg gta gct ggt cta tct tta tgg atg tgc tcc aat gga    1680 

tcg tta cag tgc aga att tgc atc taa                                1707 

Claims (2)

1.一种H5亚型高致病性禽流感病毒血凝素蛋白的制备方法，其特征在于：首先将含有如序列表中SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的pUCM-TH5HA质粒由BamH I、EcoRV双酶切，经补平后回收得到目的片段；pPIC9K质粒由EcoR I线性化，两端分别补平、去磷后回收；将以上回收产物经T₄连接酶连接后即获得目的质粒pPIC9K-H5HA；再用SalI线性化pPIC9K-H5HA重组质粒，线性化后将其电转化至GS115感受态中，再在MD平板中培养，而后挑取单个菌落于YPD培养基中复苏，提重组体基因组进行PCR鉴定，筛选出的阳性菌株于BMGY培养基中摇菌，离心后转至BMMY培养基中开始甲醇诱导表达，诱导表达条件是大于80％的溶解氧、1％甲醇诱导、培养4天、摇瓶转速大于200rpm、培养基pH值为6.0，产物离心后取上清，加入饱和硫酸铵沉淀蛋白，收集蛋白进行进一步纯化即得到HSHA抗原蛋白。

2.由权利要求1的方法制备得到H5亚型高致病性禽流感病毒血凝素蛋白。 

Images