CN101985630B - 表达高致病性禽流感病毒h5亚型血凝素蛋白的重组嗜酸乳杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明涉及表达高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白的重组嗜酸乳杆菌，属于生物技术基因工程领域。本发明成功构建了高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素重组乳酸杆菌表达质粒pLEM415-PHA1，并成功电击转化入嗜酸乳杆菌4356。高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白在重组嗜酸乳杆菌4356内可以被成功表达，经Western-blot验证具有良好的抗原性。重组嗜酸乳杆菌4356有望开发成预防高致病性禽流感的基因工程口服疫苗。

Description

表达高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白的重组嗜酸乳杆菌

一、技术领域

本发明涉及表达高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白的重组嗜酸乳杆菌，属于生物技术基因工程领域。具体讲涉及高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素表达性质粒pLEM415-PHA1的构建、重组嗜酸乳杆菌4356菌株的获得以及高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白的表达与鉴定。

二、背景技术

几个世纪以来，乳酸杆菌作为重要的益生菌已广泛地应用于食品及饮料加工业，以乳酸杆菌作为发酵菌的食品工业所创造出的经济价值占全球总的发酵类食品的20％。数千年，乳酸杆菌被人类大量食用，没有引起任何的健康问题；同时乳酸杆菌可以作为抗原递送载体诱导黏膜免疫应答和全身免疫应答，这引起了研究者们极大的兴趣。这对于开发新型口服疫苗，提供了广阔的空间。

1乳酸杆菌对黏膜免疫的影响

乳酸杆菌是人体和动物肠道中一种正常的益生菌，具有多种生理功能，如控制肠道感染、增加某些食物的营养价值、控制血清胆固醇水平、改善乳糖代谢、诱导体内特异性及非特异性免疫应答以及抗肿瘤活性等功能，在科学界越来越显示出强大的生命力。作为一种重要的益生菌，多年来乳酸杆菌被大量用于食品的制造业，如干酪、酸乳酪和干腊肠。数千年来人们大量的消费这些食品，从未引起任何的健康问题。作为口服疫苗，乳酸杆菌还具有很好的安全性。因此，乳酸杆菌非常适宜作为安全的口服疫苗和其他病原体的抗原递送载体。

进入胃肠道中的乳酸杆菌具备抗胆汁酸和在胃肠道中持续存在的能力，与一般微生物抗原一样。乳酸杆菌在诱导黏膜免疫应答时或是经过小肠上皮之间的微皱褶细胞(microfold cell，M细胞)，或者通过上皮下的树突状细胞(dendritic cell，DC)进入固有层，激活Th2淋巴细胞，产生大量的白介素(IL)-5。后者是有效的IgA刺激因子，可激活B细胞，分泌IgA，IgA与肠黏膜上皮产生的分泌片段结合，形成黏膜表面抗体sIgA(分泌型IgA)，阻止致病菌的吸附和入侵。许多乳酸杆菌由于抗酸、抗胆汁盐特性，能够顺利通过胃和回肠，大量存在于小肠和大肠的上游处。乳酸杆菌进入胃肠道后可持续诱导局部细胞免疫和体液免疫，并具有减少变态反应、增强肠道屏障功能和治疗自身免疫病等功能。

乳酸杆菌能显著增加肠道中非特异性和特异性抗体水平。对0-6个月健康新生儿的研究发现，肠道内的乳酸杆菌和双歧杆菌定植的时间越早，外周血中IgA细胞出现得就越早；随着肠内乳酸杆菌和双歧杆菌数目的增加，外周血中的IgA细胞的数量也增加；轮状病毒导致的腹泻婴儿中，喂食乳酸杆菌株后可使病程减短，病情减轻；减毒的Salmonellatyphi感染小鼠后，如果口服含有L.acidophilus发酵乳，小鼠体内针对S.typhi的血清总IgA水平均升高。乳酸杆菌还可明显促进小肠中细胞免疫反应，如乳酸杆菌能增强肠上皮淋巴细胞细胞毒活性，诱导产生多种淋巴因子；激发固有层CD4⁺细胞产生干扰素；增强单核-吞噬细胞的吞噬作用，从而杀灭肠道病毒和肠道内的其他细菌。小鼠口服含有大量乳酸杆菌的Kefir奶后，可以协助特异性抗原提高小肠特异性黏膜免疫反应。乳酸杆菌中含有大量未甲基化的CpG DNA，脂磷壁酸(1ipoteichoic acids，LTA)和肽聚糖。通常些物质可与Toll样受体(Toll 1ike receptors，TLRs)结合，刺激先天免疫系统产生应激反应。所以口服乳酸杆菌对增强小肠特异和非特异性免疫应答均具有重要作用。

2口服黏膜免疫研究进展

口服黏膜免疫方法简便、安全，不仅在黏膜局部和其他黏膜组织产生免疫应答，还可引起全身性体液免疫应答，多年来受到国内外免疫学家的密切关注。目前儿童广泛口服的脊髓灰质炎糖丸就是一个消化道黏膜免疫成功的例子。脊髓灰质炎口服疫苗的应用，使全球小儿麻痹发病得到有效控制，为口服疫苗的研制与应用起到了指导作用。但是在实践中，口服疫苗经过消化道时常受到消化液的降解，疫苗很容易被破坏，影响免疫力的效果，使消化道黏膜免疫方法的应用和推广受到限制。近年来疫苗递送系统成为研究传染病防御领域新技术的热点之一。尤其是细菌活载体疫苗因具有培养方便，外源基因容量大，刺激细胞免疫力强等优点具有巨大的应用潜力。细菌载体疫苗是新兴现代疫苗的重要发展方向，所谓细菌载体疫苗是将所需的编码病原菌特异性抗原的DNA片段插入减毒的病原菌或者共生菌中，让其表达所编码的抗原，以期达到预防一种或多种疾病的目的。通过活菌载体递送疫苗抗原不仅可刺激肠道局部免疫应答，又可针对特异性抗原产生特异性免疫应答，使机体可以获得全面的保护力。

以前的研究表明一些减毒细菌可作为疫苗抗原的载体，如沙门氏菌、弱毒李斯特菌等。国外学者以减毒沙门氏菌为载体在真核细胞中成功表达了lacZ基因、绿色荧光蛋白(GFP)基因、HIV-gp140基因、李斯特菌溶血素基因等。沙门氏菌为载体传递DNA疫苗还能存在潜在危险性。首先，减毒细菌可能存在毒力返强的危险；其次，质粒DNA可能会整合到宿主细胞基因组，从而引起调控细胞生长的基因紊乱、原癌基因和抑癌基因的表达失控、体细胞癌变、细胞转型等一系列问题。此外，减毒细菌对一些老弱病残个体可能有潜在致病性。因此，选择理想的疫苗抗原载体是建立生物学新技术的关键。理想的输送抗原的载体应该是能够在体内较长时间存在，本身对机体既安全又能产生持续免疫力的一些微生物。

乳酸杆菌是安全的益生菌，利用一些乳酸杆菌在胃肠道、泌尿、生殖系统中或黏膜部位黏附存活且无病原性等特点，开展活菌口服疫苗和黏膜疫苗载体的研究，日益受到了广泛的重视。理想的疫苗载体系统能够把表达的外源性蛋白抗原分泌到细胞外，外源蛋白在细菌中的表达在生物技术上一直是一个挑战。乳酸杆菌的一些菌株具有S层(S-layer)，由单一的蛋白亚单位组成规则排列的类晶格结构。与大肠杆菌相比，乳酸杆菌仅有一层细胞膜，目的蛋白可在S层蛋白信号肽的引导下直接分泌到细胞外，从而容易获得目的蛋白。将目的抗原与乳酸杆菌S层蛋白信号肽序列融合，将其克隆于乳酸杆菌表达质粒启动子下游，通过电转化可以获得稳定表达抗原的乳酸杆菌。虽然一些革兰氏阴性菌也具有S层，但革兰氏阴性菌存在一定缺点，如在大肠杆菌中，重组蛋白易被内毒素污染并易以不溶的包涵体形式在细胞质中堆积；乳酸杆菌则能稳定的将异源性重组蛋白表达于细胞外。但是前几年乳酸杆菌的遗传和分子生物学研究进展较为缓慢，主要是由于乳酸杆菌的转化系统研究的不够深入。

3高致病性禽流感(HPAIV)保护性抗原-血凝素(HA)

血凝素是构成流感病毒囊膜纤突的主要成分之一，为75KD的糖蛋白。HA在病毒吸附及穿膜的过程中起关键作用，可刺激机体产生中和抗体。HA在感染过程中能否被水解为HA1和HA2两条肽链是病毒感染细胞的先决条件。近年的研究证明：HA参与病毒宿主谱的识别，在决定病毒宿主范围方面起重要作用；也是禽流感病毒抗原变异和病毒致病力的主要决定因素。HA由4个片段编码，是典型的I型糖蛋白。它含有4个结构区域：信号肽(前导序列)、胞浆域、跨膜域和胞外域。用免疫学和生物学方法研究证明，HA在细胞内质网合成，合成后由内质网运送到高尔基体，最后到达细胞膜，嵌入胞膜的脂质双层，在病毒出芽释放时被带到病毒囊膜上。HA在运送过程中经过不断的修饰，如将N一葡萄糖昔寡糖加到天门冬酞胺残基上。有些寡糖加上去后还经过进一步修饰。这样形成的单体HA分布在内质网上，在向高尔基体运送过程中，由二硫键连接并折叠形成一定的形伏，随后形成三聚体，由高尔基体运送到细胞膜。HA产生后到其发挥作用时，还经过几个切割加工过程，包括N端信号肤的切除及HA1的产生。N端的信号肤大约有16个氨基酸残基组成，其作用是识别内质网，HA合成后信号肽酶将这一短肽切除，因此成熟的HA不含信号肽。另一个加工过程是将HA切割成两条多肽链，产生HA1和HA2。切割时去掉一个或多个氨基酸残基，这与宿主细胞及毒株的毒力有关。HA1和HA2的分子量分别为39KD和27KD，两条肽链被一个二硫键连在一起，再加上分子内的一些二硫键及其他非共价键的相互作用，使HA形成一定的立体结构。

HA是位于病毒囊膜表面的一种糖蛋自，可诱导机体产生中和抗体，为HPAIV中最为重要的保护性抗原。它不仅可诱导特异性抗体的产生，而且还可刺激机体产生细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应。抗HA的抗体可以通过干扰病毒与唾液酸受体的结合或者病毒囊膜与内吞体膜的融合过程从而中和病毒的感染，因而它一向成为禽流感疫苗研究工作中的热点，并且在评价疫苗免疫效力时往往也是将HA抗体水平作为一项重要的参考指标。目前HA基因已成功地研制出多种类型的基因工程疫苗，并且它们在抵抗同一HA亚型的病毒攻击方面显示了良好的保护力。

近年来，国内外大量学者，通过腺病毒、大肠杆菌、毕赤酵母等成功表达过HA，而且表达的蛋白具有良好的免疫原性，却因为提纯蛋白方法过于繁琐，大大限制了HA抗原在疫苗中应用。另外构建表达HA的重组病毒，用此重组病毒作为疫苗，虽可以在动物体内复制并不断表达出HA蛋白，但禽流感病毒主要是通过呼吸道、消化道感染而传播的，病毒不容易寄生于呼吸消化黏膜处。而乳酸杆菌就定植在呼吸消化道黏膜处，因此以乳酸杆菌为递送表达系统，对研制禽流感口服疫苗，为预防禽流感开辟一条全新的黏膜免疫途径具有重要的意义。

三、发明内容

技术问题

本发明成功构建了高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素重组型乳酸杆菌表达质粒pLEM415-PHA1，并获得重组嗜酸乳杆菌4356。高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白在重组嗜酸乳杆菌4356内可以被成功表达，经Western-blot验证具有良好的抗原性。重组嗜酸乳杆菌4356有望开发成预防高致病性禽流感的基因工程口服疫苗。

技术方案

本发明涉及表达高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白重组嗜酸乳杆菌，该重组嗜酸乳杆菌4356菌株，属于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。

其构建方法包括：

(1)高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素HA1，其序列为SEQ ID NO.1；乳酸脱氢酶(LDH)的启动子基因P，其序列为SEQ ID NO.4。其克隆过程如下：

设计启动子引物P1、P2：

P1 5’-TAAGGTACCTACTGAGAAGTTGCTC-3’

P2 5’-TAACTCGAGGCCGACGAGGATAACT-3’

5’端分别引入KpnI和XhoI限制性内切酶酶切位点(下划线为酶切位点)，TAA为保护碱基。以质粒pRV85为模板，常规PCR克隆乳酸脱氢酶启动子P。

设计高致病性禽流感病毒血凝素HA1引物HAF1、HAR2：

HAF1 5’-TAACTCGAGAAAATGGAGAAAATAGTGCTTC-3’

HAR2 5’-TAAGATATCCTACAATCTGAACTCACAAATT-3’

5’端分别引入XhoI和EcoRV限制性内切酶酶切位点，(下划线为酶切位点)，TAA为保护碱基。以质粒pCI-H₅HA为模板，常规PCR克隆高致病性禽流感血凝素基因HA1。

(2)重组型表达质粒pLEM415-PHA1的构建

利用酶切连接技术，分别将乳酸脱氢酶启动子P和高致病性禽流感血凝素HA1目的片段连接在大肠-乳酸杆菌穿梭质粒pLEM415(有文献报道，属非专利公开发放生物材料)上，得到重组型表达质粒pLEM415-PHA1；采用限制性内切酶KpnI、XhoI、EcoRV，分别用双酶切验证重组型质粒pLEM415-PHA1。

(3)电转化重组嗜酸乳杆菌4356菌株，属于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。

将构建的重组型表达质粒pLEM415-PHAl采用电击转化的方法，转化嗜酸乳杆菌4356。我们分别采用了甘氨酸、溶菌酶或氨苄抗生素不同处理方案制备嗜酸乳杆菌4356感受态，并探索了菌液浓度、甘氨酸以及电击电压对电击转化效率的影响。将重组嗜酸乳杆菌4356，进行SDS-PAGE电泳分析和Western Blotting验证。

有益效果

1本试验构建的重组型表达质粒pLEM415-PHA1是目前国内外第一个高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素乳杆菌表达质粒。

2试验证明，我们只有采用甘氨酸处理的方案才能获得重组嗜酸乳杆菌4356菌株。我们获得最优电转方案：用1％甘氨酸的培养基扩培嗜酸乳杆菌4356，当菌液浓度OD₆₀₀＝0.8时收集菌体，在电压为2.1KV、电阻200Ω、电容25uf的电击参数下电击转化，将获得最高转化率为4.1×10³CFU/μg DNA。

3本发明成功构建了高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素重组型乳酸杆菌表达质粒pLEM415-PHA1，并获得重组嗜酸乳杆菌4356。高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白在重组嗜酸乳杆菌4356内可以被成功表达，经Western-blot验证具有良好的抗原性。重组嗜酸乳杆菌4356有望开发成预防高致病性禽流感的基因工程口服疫苗。

4本发明构建了乳酸杆菌递送表达系统，可插入各种抗原、活性肽和药物等，有利于开发各种重组乳酸杆菌疫苗，为乳酸杆菌在动物黏膜免疫以及口服基因工程活疫苗等方面的研究奠定基础。下面结合附图及具体实施技术对本发明做进一步说明。

四、附图说明：

图1：乳酸脱氢酶启动子P的PCR扩增结果凝胶电泳图DNA Marker DL2k

图2：禽流感血凝素基因HA1PCR扩增结果凝胶电泳图DNA Marker DL2k

图3：构建的重组型表达质粒pLEM415-PHA1示意图

图4：重组型表达质粒pLEM415-PHA1酶切验证电泳图

图5：扩培液中甘氨酸浓度与电击转化效率之间的关系

图6：菌液浓度与电击转化效率之间的关系

图7：电击电压与电击转化效率之间的关系

图8：重组嗜酸乳杆菌4356(含质粒pLEM415-PHA1)PCR扩增凝胶电泳图

图9：重组嗜酸乳杆菌4356(含质粒pLEM415-PHA1)革兰氏染色图

图10：重组嗜酸乳杆菌4356的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳图)

图11：重组嗜酸乳杆菌4356表达产物westen-blot(免疫印迹图)

五、具体实施方式

1重组型表达质粒pLEM415-PHA1的构建

下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。具体涉及的材料和试剂如下：

质粒pRV85由比利时Sigrid C.J.De Keersmaecker惠赠，文献：Sigrid C.J.DeKeersmaecker and Kristien Braeken.Flow Cytometric Testing of Green FluorescentProtein-Tagged Lactobacillus rhamnosus GG for Response to Defensins.[J]APPLIED ANDENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY，July 2006，p.4923-4930》；

质粒pLEM415由法国Michel Fons惠赠：文献：Michel Fons and Timothee Hege.Isolation and Characterization of a Plasmid from Lactobacillus fermentum ConferringErythromycin Resistance.[J]PLASMID 37，199-203(1997)；

质粒pCI-H₅HA由中国哈尔滨兽医研究所陈化兰惠赠，文献见：张芳芳、姜永萍、刘光亮等，表达禽流感病毒H5HA、H7HA基因DNA疫苗的免疫原性研究[J].中国预防兽医学报Vol.28，No.1Jan.2006》；

嗜酸乳杆菌4356(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)；E.coli JM109(购自大连宝生物，Takara)。

试剂：rTaq酶，pMD19-T载体，Agarose Gel DNA Purification Kit，内切酶Xho I，Kpn I，Cla I等均购自TAKARA公司；甘氨酸、溶菌酶和氨苄青霉素均购自OMEGA公司

1.1乳酸脱氢酶(LDH)启动子P和高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素HA1目的片段的获得，设计启动子引物P1；P2。

P1 5’-TAAGGTACCTACTGAGA AGTTGCTC-3’

P2 5’-TAACTCGAGGCCGACGAGGATAACT-3’

5’端分别引入KpnI和XhoI限制性内切酶酶切位点(下划线为酶切位点)，TAA为保护碱基。以质粒pRV85为模板，常规PCR克隆乳酸脱氢酶启动子P。如图1：可知PCR成功克隆252bp的乳酸脱氢酶的启动子。

设计禽流感病毒H5亚型血凝素HA1引物HAF1；HAR2。

HAF1 5’-TAACTCGAGAAAATGGAGAAAATAGTGCTTC-3’

HAR2 5’-TAAGATATCCTACAATCTGAACTCACAAATT-3’

5’端分别引入XhoI和EcoRV限制性内切酶酶切位点，(下划线为酶切位点)，TAA为保护碱基。以质粒pCI-H₅HA为模板，如图2可知：PCR成功克隆988bp的高致病性禽流感H5亚型血凝素基因HA1。

1.2乳酸脱氢酶启动子P和高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素HA1基因序列分析

按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明，回收纯化目的片段P和HA1，分别连接在pMD19-T(购自大连宝生物，Takara)载体上，转化大肠杆菌，经测序及核苷酸序列分析后，利用酶切连接技术，分别将启动子P和血凝素HA1目的片段，连接在质粒pLEM415上，得到重组型表达质粒pLEM415-PH1。如示意图3所示：启动子P和血凝素HA1依次连接到质粒pLEM415(有文献报道，属非专利公开发放生物材料)上，得到重组型表达质粒pLEM415-PHA1。

1.3重组型表达质粒pLEM415-PHA1的验证

同时采用限制性内切酶KpnI、XhoI、EcoRV，酶切验证重组型质粒pLEM415-PHA1。如图4可知：1为重组型表达质粒pLEM415-PHA1，经KpnI、Xhol和EcoRV酶切；得到252bp的启动子P和988bp为血凝素HA1以及6331bp的载体骨架；2为质粒pLEM415经XhoI单酶切获得的6331bp的载体骨架。

2重组高致病性禽流感血凝素嗜酸乳杆菌4356的获得：

为了可以获得重组高致病性禽流感血凝素的嗜酸乳杆菌4356(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)为受体菌株，将构建的重组型表达质粒pLEM415-PHA1采用电击转化的方法，转化嗜酸乳杆菌4356。在此，我们分别采用了甘氨酸、溶菌酶或氨苄抗生素不同处理方案制备感受态。试验证明，我们只有采用甘氨酸处理的方案才能获得重组菌株，其它的不同处理方案，电击转化始终未能成功。在确定甘氨酸制备感受态的方案中，我们优化了嗜酸乳杆菌4356的电转条件，最终获得最高转化率为4.1×10³CFU/μg DNA的转化子。

2.1扩培液中甘氨酸浓度与电击转化效率之间的关系：如图5可知：在含有1％甘氨酸乳酸杆菌培养基内处理的菌株中，菌株的转化率最高。

2.2菌液浓度与电击转化效率之间的关系：如图6可知：在菌液浓度OD₆₀₀＝0.8时，菌株的转化率最高。

2.3电击电压与电击转化效率之间的关系：如图7可知：在电击电压为2.1KV时，菌株的转化率最高。

结合以上甘氨酸、菌液浓度和电击电压对电击转化效率的影响，我们获得最优电转方案为：在含1％甘氨酸乳酸杆菌培养基内扩培，当菌液浓度达到OD₆₀₀＝0.8收集菌体，再分别用洗涤缓冲液和电击缓冲液来洗涤重悬菌体，低温加入质粒，电击转化(其中电压为2.1KV、电阻200Ω、电容25uf)，立刻放入复苏培养基内，37℃复苏4h，涂红霉素抗性乳酸杆菌抗性平板，60-72h可见阳性菌落长出，验证阳性菌落。

3重组高致病性禽流感血凝素嗜酸乳杆菌4356的验证

红霉素抗性乳酸杆菌固体平板培养基筛选电击转化液，48-72h可见阳性菌落，培养阳性菌落并提取质粒，经PCR验证，重组高致病性禽流感血凝素嗜酸乳杆菌4356内均含有高致病性禽流感H5亚型血凝素基因HA1(988bp)，如图8可知：均为含有重组型表达质粒pLEM415-PHA1的重组高致病性禽流感血凝素嗜酸乳杆菌4356阳性菌株1-5为重组嗜酸乳杆菌4356革兰氏染色如图9所示。

4重组高致病性禽流感血凝素嗜酸乳杆菌4356的SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)

我们对重组嗜酸乳杆菌4356超声破碎处理，经SDS-PAGE电泳分析目的蛋白血凝素HA1表达情况。蛋白电泳如图10可知：重组嗜酸乳杆菌4356(含质粒pLEM415-PHA1)与空质粒对照菌株嗜酸乳杆菌4356(含pLEM415)相比，可见39kDa差异蛋白产生(箭头所示)。

5目的蛋白HA1的Western-blot分析

对表达产物进行Western-blot分析，结果与H5N1亚型禽流感阳性血清呈现阳性反应，如图11可知：重组嗜酸乳杆菌4356(含质粒pLEM415-PHA1)与空质粒对照菌株嗜酸乳杆菌4356(含pLEM415)相比，在39KDa处有一条明显的蛋白印迹带，且无非特异性条带出现，证明重组乳酸杆菌表达产物是血凝素蛋白，并且具有较好的抗原性。

应用

本发明涉及表达高致病性禽流感病毒(HPAIV)H5亚型血凝素(HA1)蛋白的重组嗜酸乳杆菌4356菌株，有望成为一种高致病性禽流感口服乳酸杆菌基因工程疫苗；同时为开展乳酸杆菌黏膜免疫递送活载体的研究提供了技术方案。

Claims (2)

1.高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白的重组表达质粒，是由以下方法构建而成：

(1)高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素HA1，其序列为SEQ ID NO.1；乳酸脱氢酶LDH的启动子基因P，其序列为SEQ ID NO.4，其克隆过程如下：

设计启动子引物P1、P2：

P1 5’-TAAGGTACCTACTGAGAAGTTGCTC-3’

P2 5’-TAACTCGAGGCCGACGAGGATAACT-3’

5’端分别引入KpnI和XhoI限制性内切酶酶切位点，TAA为保护碱基，以质粒pRV85为模板，常规PCR克隆乳酸脱氢酶启动子P；

设计高致病性禽流感病毒血凝素HA1引物HAF1、HAF2：

HAF1 5’-TAACTCGAGAAAATGGAGAAAATAGTGCTTC-3’

HAR2 5’-TAAGATATCCTACAATCTGAACTCACAAATT-3’

5’端分别引入XhoI和EcoRV限制性内切酶酶切位点，TAA为保护碱基，以质粒pCI-H5HA为模板，常规PCR克隆高致病性禽流感血凝素基因HA1；

(2)重组表达质粒pLEM415-PHA1的构建

利用酶切连接技术，分别将乳酸脱氢酶启动子P和高致病性禽流感血凝素HA1目的片段连接在大肠-乳酸杆菌穿梭质粒pLEM415上，得到重组表达质粒pLEM415-PHA1；采用限制性内切酶KpnI、XhoI、EcoRV，分别用双酶切验证。

2.用权利要求1所述重组表达质粒电转化获得的表达高致病性禽流感病毒H5亚型血凝素蛋白的重组嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)4356菌株。

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