CN113603793A - 一种新型冠状病毒的重组s蛋白、重组质粒、重组菌及制备外泌体药物或外泌体疫苗的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种新型冠状病毒的重组S蛋白、重组质粒、重组菌及制备外泌体药物或外泌体疫苗的应用，涉及疫苗技术领域。本发明所述重组S蛋白，包括刺突蛋白S的亚基S1和亚基S2，利用linker连接S1蛋白与S2蛋白，组成重组S蛋白，使各组分相互协调补充，具有良好的免疫原性、安全性和生物活性，能够诱导机体产生有效抗体，从而抑制新型冠状病毒的生长，可有效预防感染新冠病毒。本发明采用人工外泌体携带形式，将重组S蛋白电转入外泌体中，可改善所携带治疗剂的药代动力学和药效学特征，从而增强治疗效果，同时减少不良毒性和副作用，其具有广泛的细胞黏附分子，有助于穿透生物屏障。

Description

一种新型冠状病毒的重组S蛋白、重组质粒、重组菌及制备外 泌体药物或外泌体疫苗的应用
技术领域
本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒的重组S蛋白、重组质粒、重组菌及制备外泌体药物或外泌体疫苗的应用。
背景技术
COVID-19是一种由SARS-CoV-2(或2019-nCoV)感染引起的肺部疾病。SARS-COV-2具有高度传染性，主要通过黏膜传播。SARS-CoV-2与SARS病毒相似，均属于冠状病毒，但其碱基序列和结构与SARS病毒不同。
现有的疫苗制作包括传统疫苗(减毒活疫苗、灭活疫苗)、亚单位疫苗、病毒载体疫苗、核酸疫苗等。其中，亚单位疫苗是利用微生物(抗原)的某种表面结构成分诱导机体产生不含核酸的抗体的一种疫苗。这些结构可以包括某些多糖、蛋白质或表位，但它们不包括整个病原体。在亚单位疫苗的基础上，负载纳米粒子形成纳米疫苗，这也是疫苗设计的一种流行方式。但是新冠病毒传染性极强，致病性高，全病毒结构的疫苗并不能保证其安全性，可能使接种对象产生无效抗体。无效抗体的产生往往对应对病毒感染不能起到有利作用，甚至会导致依赖性感染增强现象和增强呼吸系统疾病等副作用，而单一蛋白的疫苗可能没有很好的免疫原性。因此目寻找一个能方便长期免疫以及长久预防的疫苗方法迫在眉睫。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒的重组S蛋白、重组质粒、重组菌及制备外泌体药物或外泌体疫苗的应用，制作方法简单、易于纯化，安全性高，疫苗可较快的应用于临床试验。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种新型冠状病毒的重组S蛋白，所述重组S蛋白的组成包括刺突蛋白S的亚基S1和刺突蛋白S的亚基S2。
优选的，所述重组S蛋白还包括若干个连接所述亚基S1和亚基S2的linker，所述linker的氨基酸序列为GGGGS。
本发明还提供了上述重组S蛋白的构建方法，包括以下步骤：利用若干个所述linker，将所述亚基S1编码的氨基酸序列的5’端与所述亚基S2编码的氨基酸序列的3’端进行连接。
本发明还提供了一种表达上述重组S蛋白的重组质粒，所述质粒以 pET-28a为基础质粒。
优选的，将上述重组S蛋白的编码基因插入所述pET-28a的NheⅠ和 EcorV之间。
本发明还提供了一种表达上述重组S蛋白的重组菌，所述重组菌以大肠杆菌为基础菌。
本发明还提供了上述重组S蛋白或利用上述重组菌得到的重组S蛋白在制备外泌体药物或外泌体疫苗中的应用。
本发明还提供了一种预防新冠病毒感染的外泌体药物或外泌体疫苗，所述外泌体药物或外泌体疫苗的制备原料包括外泌体和上述重组S蛋白或利用上述重组菌得到的重组S蛋白。
优选的，所述外泌体药物或外泌体疫苗的剂型包括喷雾剂。
本发明还提供了上述外泌体药物或外泌体疫苗的制备方法，包括以下步骤：将上述重组S蛋白或利用上述重组菌得到的重组S蛋白与外泌体混合后，进行电转导，离心收集沉淀，得所述外泌体药物或外泌体疫苗。
有益效果：本发明提供了一种新型冠状病毒的重组S蛋白，包括刺突蛋白S的亚基S1和亚基S2，亚基S1主要负责受体的识别，并介导病毒与宿主细胞的受体结合。亚基S2可把整个S蛋白固定在细胞膜上，介导病毒-宿主细胞以及病毒-细胞膜的融合。本发明利用linker连接S1蛋白与S2蛋白，组成重组S蛋白，使各组分相互协调补充，具有良好的免疫原性、安全性和生物活性，能够诱导机体产生有效抗体，从而抑制新型冠状病毒的生长，可有效预防感染新冠病毒。
本发明采用人工外泌体携带形式，将重组S蛋白电转入外泌体中，可改善所携带治疗剂的药代动力学和药效学特征，从而增强治疗效果，同时减少不良毒性和副作用，同时，其具有广泛的细胞黏附分子，有助于穿透生物屏障。本发明的制备方法简单、易于纯化，安全性高，疫苗可较快的应用于临床试验。
附图说明
图1为喷鼻式疫苗盒；
图2为本发明实施提供的外泌体带新冠突喷雾疫苗免疫小鼠产生的抗重组S蛋白抗体柱状图；
图3为本发明实施提供的外泌体带新冠突喷雾疫苗免疫小鼠后第二周小鼠体内产生的免疫应答图。
具体实施方式
本发明提供了一种新型冠状病毒的重组S蛋白，所述重组S蛋白的组成包括刺突蛋白S的亚基S1和刺突蛋白S的亚基S2。
本发明所述重组S蛋白还包括若干个连接所述亚基S1和亚基S2的linker，所述linker的氨基酸序列为GGGGS。在本发明实施例中所述linker 的数量优选为3，但是不能仅将其认定为本发明的保护范围。
在本发明中，所述亚基S1和亚基S2均来源于刺突蛋白S，亚基S1主要负责受体的识别，并介导病毒与宿主细胞的受体结合。亚基S2可把整个 S蛋白固定在细胞膜上，介导病毒-宿主细胞以及病毒-细胞膜的融合。本发明利用linker连接S1蛋白与S2蛋白，组成重组S蛋白，使各组分相互协调补充，具有良好的免疫原性、安全性和生物活性，能够诱导机体产生有效抗体，从而抑制新型冠状病毒的生长，可有效预防感染新冠病毒。本发明所述亚基S1和亚基S2的核苷酸序列均已在NCBI上公开，其中亚基S1的 Acession：MW532093.1，GeneID：1964576795；亚基S2的Acession： MW532094.1，GeneID：1964576812。
本发明还提供了上述重组S蛋白的构建方法，包括以下步骤：利用若干个所述linker，将所述亚基S1编码的氨基酸序列的5’端与所述亚基S2编码的氨基酸序列的3’端进行连接。
本发明对所述连接的方法并没有特殊限定，优选包括PCR扩增或人工直接合成。
本发明还提供了一种表达上述重组S蛋白的重组质粒，所述质粒以 pET-28a为基础质粒。
本发明优选采用双酶切的方法构建所述重组质粒，更优选包括将上述重组S蛋白的编码基因插入所述pET-28a的NheⅠ和EcorV之间。
本发明还提供了一种表达上述重组S蛋白的重组菌，所述重组菌以大肠杆菌为基础菌。
本发明优选利用CaCl2法将所述重组质粒转化到细胞如大肠杆菌中，通过单克隆筛选获得稳定表达的重组细胞株(重组菌)。本发明对所述单克隆筛选的方法并没有特殊限定，优选包括：(a)在6孔板培养皿内种植约5 ×104细胞CO2孵箱培养24小时。
(b)准备3ml培养基，加入Polybrene，终浓度为6～8μg/ml。将制备好的适量病毒颗粒加至上述培养基，轻吹混匀。去除旧的培养基，加入含病毒培养基。
(c)病毒感染后24小时，用新鲜的完全培养基替换含有病毒的培养基，继续培养48小时。
(d)换用含最优浓度氨苄西林的培养基。根据细胞敏感性不同，以后每隔3～5天换用新鲜的含有氨苄西林的培养基，以替换含大量死细胞的培养基。待抗性细胞长满以后，细胞转入10cm培养皿，同时，留一部分细胞在原来的60mm平皿内，待细胞长满后，收获细胞，在蛋白或mRNA水平鉴定基因过表达或敲低效率。
本发明所述Polybrene的配制，优选包括：用0.9％的NaCl溶解Polybrene 干粉(浓度为10mg/ml)，高压灭菌，可以在4℃稳定存放1年，也可冻存于-20℃。干粉可以在4℃稳定存放数年。本发明所述氨苄西林的配制，优选包括：取1g氨苄西林溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
在本发明中，在得到所述重组菌后，优选还包括诱导所述重组菌表达所述重组S蛋白，更优选采用IPTG诱导的方法促进所述重组菌表达分泌所述重组S蛋白。本发明所述IPTG诱导的方法优选包括：将所述重组菌接种于 50μg/ml氨苄西林的溶菌肉汤培养基(LB)中，37℃，160rpm摇菌过夜，按1～4％的接种量将所述重组菌接种于LB/kam培养液中，200～300rpm摇菌至OD600为0.5～0.7时，加入IPTG诱导剂使其终浓度为0.1～0.8mM，诱导4～6 小时后，2000～4000g在2～6℃离心5～15min，去上清，10％乙酸(1g细胞糊 +5ml 10％(体积/体积)乙酸)，14000rpm下离心取上清。将乙酸液置于冰浴下50～55W超声5～20遍，超声20～40s、停20～40s，直至菌液不粘稠， 10000～12000g 3～5℃离心10～20min，去上清，得Rostta(DE3)pET28a-S1-S2 基因工程菌包涵体。
本发明在得到所述Rostta(DE3)pET28a-S1-S2基因工程菌包涵体后，优选还包括纯化，所述纯化时，由于目的基因中有His标签，因此选用镍柱金属螯合层析柱，取上清液、利用20mmol/L咪唑洗涤、250mmol/L洗脱以及透析换液，提纯蛋白。本发明在进行所述纯化前，优选还包括使用包涵体溶解液对包涵体蛋白进行溶解，所述包涵体溶解液优选包括Tris缓冲液、NaCl 溶液和尿素，所述Tris缓冲液和NaCl溶液的摩尔浓度比为5:4，所述尿素的的摩尔浓度为8mol/L。
本发明还提供了上述重组S蛋白或利用上述重组菌得到的重组S蛋白在制备外泌体药物或外泌体疫苗中的应用。
本发明采用人工外泌体携带形式，可改善所携带治疗剂的药代动力学和药效学特征，从而增强治疗效果，同时减少不良毒性和副作用，同时，其具有广泛的细胞黏附分子，有助于穿透生物屏障。
本发明还提供了一种预防新冠病毒感染的外泌体药物或外泌体疫苗，所述外泌体药物或外泌体疫苗的制备原料包括外泌体和上述重组S蛋白或利用上述重组菌得到的重组S蛋白。
本发明所述外泌体的获得方法，优选包括：将接种密度为1×10个/孔的 Caco-2细胞于DMEM培养基中培养21天；将1μg/mg脂多糖溶于DMEM 培养基中，接着加入上述培养的Caco-2细胞中培养2h，得肠炎模型细胞；将0.5mg/ml铁皮石斛葡甘聚糖溶于DMEM培养基中，接着加入上述得到的肠炎模型细胞进行培养，收集细胞上清，离心1min除细胞沉淀，得上清液；将得到的上清液进行超速离心，取沉淀即得所述外泌体。
本发明所述外泌体药物或外泌体疫苗的剂型优选包括喷雾剂，采取喷雾形式，无需注射、操作简便，可适用于公共场所，避免了注射类疫苗后会发生注射部位疼痛、红肿的不良反应。
本发明还提供了上述外泌体药物或外泌体疫苗的制备方法，包括以下步骤：将上述重组S蛋白或利用上述重组菌得到的重组S蛋白与外泌体混合后，进行电转导，离心收集沉淀，得所述外泌体药物或外泌体疫苗。
本发明所述电转导优选包括：取10μg外泌体加入200μl电缓冲液中，装于EP管，标记A管；将10nmol所述重组S蛋白与200μl电缓冲液，装于1.5ml的EP管，标记B管；混合A管和B管中的液体，转移至预冷的电击杯中，置于冰上；随后进行电转导。
本发明所述电转导的参数优选参考GenePulserXceTM。
本发明在所述电转导结束后，优选置于-4℃冷置，并利用超速离心法重新提取外泌体，得到外泌体药物或外泌体疫苗。本发明所述超速离心法包括 14000rpm下离心。
本发明所述外泌体疫苗中，以人工外泌体为佐剂，所述重组S蛋白与外泌体的比例优选为1：10～1000mg/ml。
利用本发明所述方法制备得到的外泌体药物或外泌体疫苗，重组S蛋白被外泌体的脂质双层膜包裹，位于膜内。
下面结合实施例对本发明提供的一种新型冠状病毒的重组S蛋白、重组质粒、重组菌及制备外泌体药物或外泌体疫苗的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
1.1在Uniprot蛋白数据库中找到新冠病毒的S1、S2的氨基酸，以S1 蛋白的5’序列和S2蛋白的3’用柔性(linker)3相连接。
1.2将重组S蛋白编码基因的5’和3’端以NheⅠ以及EcorV进行酶切，利用T4连接酶pET-28a质粒连接，转化进感受态细胞中，获得重组质粒，通过单克隆筛选获得稳定表达的重组S蛋白的阳性菌落。
1.3将上述细胞株扩大培养，进行分泌表达和纯化，获得纯化的重组的新冠病毒重组S蛋白。
1.31将重组S蛋白的细胞株接种于50μg/ml氨苄西林的溶菌肉汤培养基(LB)中，37℃，160rpm摇菌过夜，按3％的接种量将基因工程菌菌落接种于LB/kam培养液中，300rpm摇菌至OD600为0.5～0.7时，加入IPTG诱导剂使其终浓度为0.4mM，诱导4～6小时后，3000g在4℃离心10min，去上清，10％乙酸(1g细胞糊+5ml 10％v/v乙酸)，14000rpm下离心沉淀。
1.32将乙酸液置于冰浴下55W超声12遍，超声30s、停30s，直至菌液不粘稠，11000g4℃离心15min，去上清，得Rostta(DE3)pET28a-S1-S2基因工程菌包涵体。
1.4由于目的基因中有Hs标签，利用镍柱金属螯合层析柱，取上清液、利用20mmol/L咪唑洗涤、250mmol/L洗脱以及透析换液，提纯蛋白。
1.5制备重组S蛋白疫苗
利用电转导方法将重组S蛋白导入外泌体中，取10μg外泌体加入200 μl电缓冲液中，装于EP管，标记A管，将上述重组S蛋白加入200μl电缓冲液，装于1.5ml的EP管，标记B管。随后，混合A、B管中的液体，转移至预冷的电击杯中，置于冰上，保证重组S蛋白与A管溶液的质量体积比为1：500mg/ml。随后进行电转，结束后，-4℃冷置。超速离心法重新提取外泌体，得到重组S蛋白外泌体药物(图1)。
实施例2
2.1将实施例1制备的外泌体带新冠突喷雾疫苗用于皮下免疫小鼠试验
将6～8周龄雌性BALB/c小鼠分为2组(疫苗颗粒组、阴性对照组)，每组8只小鼠，分别经鼻吸入。将疫苗溶解在体积为200μL的PBS中。每隔两周从小鼠尾部进行取血，分离血清进行抗体检测。血清样本在-20℃保存至使用。
间接ELISA法检测免疫小鼠血清中Delta特异性IgG抗体水平和抗体滴度。以20μg/ml的S1或者S2蛋白包被ELISA板，4℃过夜。用0.05％的 PBST洗三次，1％BSA-PBST封闭液封闭，室温孵育1h。0.05％PBST洗5 遍，加入200μl稀释后的血清(1：1000稀释)，37℃孵育2h；PBST洗5遍，加入HRP-羊抗小鼠IgG(1：100稀释)，200μl/孔，室温孵育1h；PBST洗5 遍，加入200μl底物液，室温避光孵育20分钟显色后，加50μl终止液终止，在OD450读数。
如图2所示，实验组OD450高于对照组。结果表明，本发明所述外泌体带新冠突喷雾疫苗免疫小鼠后，在小鼠体内诱生了高水平的新型冠状病毒特异性血清IgG，显著高于对照组。
2.2细胞因子检测
采用ELISA取小鼠脾细胞进行测定的小鼠实验组脾脏细胞CD4+T细胞、CD8+T细胞显著增加，IL-2也有显著变化，结果如图3所示与对照组相比显著增加。结果表明，在本发明所述外泌体带新冠突喷雾疫苗的刺激下，小鼠产生了强烈的细胞免疫应答。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种新型冠状病毒的重组S蛋白，其特征在于，所述重组S蛋白的组成包括刺突蛋白S的亚基S1和刺突蛋白S的亚基S2。
2.根据权利要求1所述重组S蛋白，其特征在于，所述重组S蛋白还包括若干个连接所述亚基S1和亚基S2的linker，所述linker的氨基酸序列为GGGGS。
3.权利要求1或2所述重组S蛋白的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：利用若干个所述linker，将所述亚基S1编码的氨基酸序列的5’端与所述亚基S2编码的氨基酸序列的3’端进行连接。
4.一种表达权利要求1或2所述重组S蛋白的重组质粒，所述质粒以pET-28a为基础质粒。
5.根据权利要求4所述重组质粒，其特征在于，将权利要求1或2所述重组S蛋白的编码基因插入所述pET-28a的NheⅠ和EcorV之间。
6.一种表达权利要求1或2所述重组S蛋白的重组菌，所述重组菌以大肠杆菌为基础菌。
7.权利要求1或2所述重组S蛋白或利用权利要求6所述重组菌得到的重组S蛋白在制备外泌体药物或外泌体疫苗中的应用。
8.一种预防新冠病毒感染的外泌体药物或外泌体疫苗，其特征在于，所述外泌体药物或外泌体疫苗的制备原料包括外泌体和权利要求1或2所述重组S蛋白或利用权利要求6所述重组菌得到的重组S蛋白。
9.权利要求8所述外泌体药物或外泌体疫苗，其特征在于，所述外泌体药物或外泌体疫苗的剂型包括喷雾剂。
10.权利要求8或9所述外泌体药物或外泌体疫苗的制备方法，包括以下步骤：将权利要求1或2所述重组S蛋白或利用权利要求6所述重组菌得到的重组S蛋白与外泌体混合后，进行电转导，离心收集沉淀，得所述外泌体药物或外泌体疫苗。
CN202111011946.4A 2021-08-31 2021-08-31 一种新型冠状病毒的重组s蛋白、重组质粒、重组菌及制备外泌体药物或外泌体疫苗的应用 Pending CN113603793A (zh)

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